Protein Saflaştırma: Kromatografik Teknikler

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1 Kromatografik Teknikler (Uygulama Örnekli)

Doç. Dr. Münir TUNCER

ÖNSÖZ Başta biyoloji bölümleri olmak üzere, temel tıp bilimleri, biyokimya bölümleri, çevre ve gıda mühendisliği bölümleri; eczacılık, veterinerlik ve ziraat fakülteleri de dâhil olmak üzere, temel fen bilimlerinin hemen her alanından bilim insanları proteinlerin saflaştırılması ve karakterizasyonu ile ilgili çalışmalarını sürdürmektedirler. Bu çalışmaların sonucu olarak da son zamanlarda, ister doğal ister rekombinant proteinlerle ilgili olsun, Ülkemizde bazı çalışmalar giderek artmaktadır. Fakat bu çalışmaların yapılması esnasında yararlanılabilecek Türkçe bir kaynağın olmadığı da dikkat çekmektedir. Bu nedenle, proteinlerin saflaştırılmasında kullanılan kromatografik teknikleri teorik ve pratik olarak açıklayan bu kitabın hazırlanması gerekli görülmüştür. Bu Kitabın devamı niteliğinde olan Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler’in yazımı ise devam etmekte olup, en kısa zamanda sizlere ulaştırılması için gayret gösterilmektedir. Özellikle lisansüstü öğrencilerinin yanı sıra, lisans öğrencileri ve araştırmacılara da yararlı olacağını umduğum bu kitap 11 bölümden oluşmaktadır. Kitabın ilk bölümünde proteinlerin saflaştırılması ile ilgili temel bilgilere yer verildikten sonra, takip eden bölümlerde ise hem düşük basınçlı hem de yüksek basınçlı kromatografi tekniklerinin temel prensipleri ele alınmıştır. Daha sonraki bölümlerde ise proteinlerin saflaştırılmasında ve karakterizasyonunda sıklıkla kullanılan her bir kromatografi tekniği, uygulama örnekleri ile birlikte ayrı ayrı ele alınmıştır. Kitabın hazırlanması ve basılması aşamasında gösterilen tüm özene karşın, kitapta bazı hataların da olabileceğini; bu tür hataların hoşgörü ile karşılanmasını ve eleştirilerin tarafıma iletilmesini bekler, kitabın genç meslektaşlarıma, öğrencilere ve hayatı “protein” olan bilim insanlarına yararlı olmasını dilerim. E-posta: [email protected] Mersin, 2008

Doç. Dr. Münir TUNCER

Bu kitabın hazırlanması süresince, Onlar için ayırmam gereken zamanlardan kısmak durumunda kaldığım çocuklarım; Merve ve A. Oğuzhan’a …

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

İÇİNDEKİLER

SAYFA NO:

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER 1.1. Giriş ……………………………………………………………………………………………..… 1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım ……………………………………………….... 1.2.1. In Vivo Çalışmalar ……………………………………………………………………... 1.2.2. In Vitro Çalışmalar ……………………………………………………………………... 1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır? …………………………………………………...……….. 1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler ………………………………………………...……... 1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması ………………………………. 1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi ………………………………………………………….. 1.5.2. Katalitik Bölge İnaktivasyonunun Önlemesi ………………………………………... 1.5.3. Proteolitik Parçalanmanın Önlenmesi ……………………………………………….. 1.6. Proteinlerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) ….………………………………………………... 1.6.1. Nükleik Asitler ve Lipitlerin Uzaklaştırılması ………………………………………... 1.7. Ön-fraksiyonlama Prosedürleri ve Yoğunlaştırma …………………………………….......... 1.7.1. Çöktürme (Presipitasyon) ....……………………………………………………….…. 1.7.2. Ultrafiltrasyon ……………………………………………………….……………….…. 1.7.3. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisi ………………………..……………………….…. 1.7.4. Kuru Formdaki Sephadex G-25 İlavesi ………………………………………….….. 1.7.5. Diyaliz ve Liyofilizasyon ……………………………………………………………..… 1.8. Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması …………………………………………..…........... 1.8.1. İnklüzyon Cisimleri ……………………………………………………………..……… 1.8.2. Etiketleme ………………………………………………………………………..…….. 1.9. Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler …………………………………………..…..……. 1.10. Saflaştırma Prosedürlerinin Takibi ……………………………………………………….…..

1 2 4 4 5 6 6 7 7 8 9 11 12 14 17 19 19 20 20 20 21 23 25

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ 2.1. Giriş ……………………………………………………………………..………........................ 2.2. Dağılma Katsayısı ……………………………………………………..………........................ 2.3. Kromatografinin Mantığı ……………………………………………...………........................ 2.4. Kolon Kromatografisinin Kullanımı ………………………………...…………....................... 2.5. Kromatografi Terminolojisi ……………………………………………………....................... 2.6. Kromatografi Sistemleri ……………………………………………..…………....................... 2.7. Kolon Kromatografisinin Parametreleri ……………………………..…………..................... 2.8. Kromatografik Sistemlerde Çözünürlük ……………………………..………….................... 2.8.1. Kapasite Faktörü ………………………………………………………...................... 2.8.2. Verimlilik ……………………………………………………..……….......................... 2.8.3. Seçicilik ……………………………………………………...…………....................... 2.9. Kuantifikasyon, İnternal ve Eksternal Standartlar ……………………..……….................... 2.10. Kromatografik Sistemlerin Seçimi …………………………………..………........................

27 27 28 29 31 32 32 34 36 36 38 39 40

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ (LPLC) 3.1. Giriş …………………………………………………………………………….......................... 3.2. Kullanılan Kolonların Özellikleri …………………………………….…………...................... 3.3. Destek Materyalleri (Matriksler) ……………………………………….………...................... 3.4. Durgun Fazlar …………………………………………………………..………...................... 3.5. Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………................................. 3.6. Paketlenmiş Kolonun Kontrolü ………………………………………..………...................... 3.7. Örnek Materyalinin Hazırlanması …………………………………..…………...................... 3.8. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ……………………………………..…………....................... 3.9. Örneğin Kolondan Elüsyonu ………………………………………..…………....................... 3.10. Dedektörler ve Fraksiyonların Toplanması ………………………..…………....................

43 44 45 46 47 48 50 51 53 56

4. YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) 4.1. Giriş ………………………………………………………………..……………........................ 4.2. HPLC’nin Avantaj ve Sınırlamaları ………………………………….…………..................... 4.3. HPLC Sistemleri ………………………………………………………………......................... 4.4. Matriksler ve Durgun Fazlar ………………………………………….………........................

59 59 60 61

i

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

4.5. HPLC Kolonları ……………………………………………………………….......................... 4.6. HPLC Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………....................... 4.7. HPLC Hareketli Fazları …………………………………………….…………........................ 4.8. HPLC Pompaları ………………………………………………..……………......................... 4.9. Örnek Hazırlama ………………………………………………..……………......................... 4.10. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ………………………………..……………........................ 4.11. Örneklerin Elüsyonu …………………………………………..……………......................... 4.12. Detektörler ……………………………………………………...……………........................ 4.12.1. Refraktif İndeks Dedektörleri ………………………..……………......................... 4.12.2. UV/Vis Spektrofotometrik Dedektörler …………………….………..................... 4.12.3. Flouresans Dedektörleri ……………………………………………....................... 4.12.4. Konduktivite Dedektörleri …………………………………………......................... 4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler ………………………………………........................ 4.13. HPLC Uygulamaları ………………………………………………………….........................

63 66 67 68 71 72 74 76 80 82 87 88 88 89

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC) 5.1. Giriş ……………………………………………………………..…….……...…........................ 5.2. GFC’nin Temel Prensipleri .......……………………………….…….…………....................... 5.3. Matriksler …………………………………………………….……….……….......................... 5.4. Deneysel Parametreler …………………………………………..…….………....................... 5.5. Moleküllerin Davranış Özellikleri …………………………….…….…………........................ 5.6. Deneysel Koşulların Dizaynı ………………………………………….………........................ 5.6.1. Performans ………………………………………………….…………....................... 5.6.2. Matriks Seçimi …………………………………………...….…………....................... 5.6.2.1. Deneyin Amacı …………………………………..…………......................... 5.6.2.2. Ayrıştırılacak Olan Moleküllerin Özellikleri …........................................... 5.6.2.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 5.6.3. Kromatografi Koşullarının Seçimi ……………………………………...................... 5.6.3.1. Kolon Seçimi ………………………………………………........................... 5.6.3.2. Akış Oranı …………………………………………………........................... 5.6.3.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 5.6.3.4. Hareketli Faz ……………………………………...………............................ 5.6.3.5. Optimizasyon ……………………………………………….......................... 5.7. Jel Filtrasyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………….…………..................... 5.7.1. Jelin Hazırlanması ……………………………………….……………...................... 5.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Dengelenmesi ………………….………….................... 5.7.3. Örneğin Kolona Yüklenmesi ……………………………….…………...................... 5.7.4. Elüsyon …………………………………………………….…………......................... 5.7.5. Kolonun Temizlenmesi ………………………………….……………....................... 5.7.6. Kolonun ve Jellerin Korunması ………………………….……………..................... 5.8. GFC Uygulama Örnekleri ……………………………………………………………...............

91 91 93 93 95 98 98 100 100 102 103 103 103 105 105 108 108 109 109 111 111 111 111 113 114

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ (IEC) 6.1. Giriş ………………………………………………………………….…………......................... 6.2. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Teorisi ……………………….…………...................... 6.3. İyon-değiştirici Matriksler ………………………………………….…………......................... 6.4. Fonksiyonel Yüklü Gruplar ……………………………………….……………...................... 6.5. Kapasite ……………………………………………………………………….......................... 6.6. Deneysel Koşulların Dizaynı …………………………………………...………..................... 6.6.1. İyon-değiştiricinin Seçimi ……………………………………...………..................... 6.6.1.1. Ayrıştırma İşleminin Özgül Gereksinimleri ……….………....................... 6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri ………………....................... 6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları ……..................... 6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı ………………………………….............................. 6.6.2.1. Başlangıç pH’sının Seçilmesi …………………………………................... 6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi ……………….................... 6.6.2.3. Tampon Seçimi …………………………………….…………...................... 6.7. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………………….................... 6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı ……………………………………………….....................

117 117 119 120 121 122 122 122 124 124 125 125 129 130 133 133

ii

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

6.7.2. İyon-değiştiricinin Miktarı ve Kapasitesi ……………………………….................... 6.7.2.1. Kullanılabilir ve Dinamik Kapasitenin Belirlenmesi ………….................... 6.7.3. İyon-değiştiricinin Hazırlanması ………………………………………..................... 6.7.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü …………………………………….................... 6.7.5. Örnek Materyalinin Hazırlanması ve Yüklenmesi …………………….................... 6.7.6. Elüsyon …………………………………………………….....………......................... 6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ……………….………................... 6.9. IEC Uygulama Örnekleri ……………………………………………..………..........................

133 133 136 137 137 137 140 141

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ (KROMATOFOKUSİNG) 7.1. Giriş ……………………………………………………………………………........................ 7.2. Odaklama Kromatografisinin Mekanizması ..................................................................... 7.2.1. pH Gradientinin Oluşturulması ............................................................................ 7.2.2. Proteinlerin Davranışları ...................................................................................... 7.2.3. Odaklama Etkisi .................................................................................................. 7.3. Materyaller ve Ekipmanlar ............................................................................................... 7.4. Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler ..................................................................................... 7.5. Deneysel Koşulların Dizaynı ........................................................................................... 7.5.1. Jel ve Tampon Seçimi ........................................................................................ 7.5.2. İyon-Değiştiricinin Miktarı .................................................................................. 7.5.3. Jelin Hazırlanması ............................................................................................. 7.5.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü .................................................................... 7.5.5. Örnek Materyalin Hazırlanması ve Yüklenmesi ................................................. 7.5.6. Elüsyon .............................................................................................................. 7.6. Polybuffer ve Amfolitlerin Proteinden Ayrıştırılması ....................................................... 7.7. Denatüre Edici Ajanların Varlığında Kromatofokusing ................................................... 7.8. Odaklama Kromatografisi Uygulamaları ..........................................................................

145 146 146 147 148 149 150 153 153 153 153 153 154 154 155 156 156

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ (AC) 8.1. Giriş ……………………………………………………………………………........................ 8.2. Affinite Kromatografisinin Temel Prensipleri ………………………………....................... 8.3. Materyaller …………………………………………………………….………....................... 8.3.1. Matriks Materyalleri …………………………………………..……….................... 8.3.2. Ligand Seçimi ve Ayırıcı-Kol ……………………………......………..................... 8.3.3. Ligandın Matrikse Bağlanması …………………………….…………................... 8.3.4. Reaksiyona Girmeyen Reaktif Grupların Bloke Edilesi ..................................... 8.3.5. Bağlama Verimliliğinin Taranması ..................................................................... 8.4. Pratik Prosedürler ……………………………………………………..………...................... 8.5. Affinite Kromatografisinin Uygulamaları …………………………..…………..................... 8.6. İmmünoaffinite Kromatografisi ........................................................................................ 8.6.1. Temel Prensipler ................................................................................................ 8.6.2. Poliklonal Antikorların (Antisera) Üretimi ............................................................ 8.6.2.1. Poliklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları ................................... 8.6.3. Monoklonal Antikorların Üretimi .......................................................................... 8.6.3.1. Monoklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları ................................ 8.6.4. İmmünoglobilinlerin Serumdan Fraksiyonlanması .............................................. 8.6.5. Antikorların Tutuklanması ve Proteinlerin Elüsyonu ........................................... 8.7. Grup-Özgüllüğü Göstern Ligandlarla Affinite Kromatografisi ……………………............ 8.7.1. Lektin Affinite Kromatografisi ……………………………….………...................... 8.7.1.1. Konkanavalin A (Con A) ....................................................................... 8.7.1.2. Lentil Lektin .......................................................................................... 8.7.1.3. Wheat Germ Lektin ................................................................................ 8.7.1.4. Helix pomatia Lektin ............................................................................. 8.7.2. Boya-Ligand Affinite Kromatografisi ………………………..……….................... 8.7.2.1. Boya Kolonlarından Proteinlerin Elüsyonu .......................................... 8.7.2.2. Boya Adsorbentlerinin Temizlenmesi ve Korunması ........................... 8.7.3. Heparin Affinite Kromatografisi ……………………………..………..................... 8.7.4. Kalmodulin Affinite Kromatografisi ………………………….………....................

159 160 162 162 162 164 166 167 167 169 169 169 170 173 173 177 178 179 180 180 181 182 182 182 183 184 185 185 186

iii

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

8.7.5. Nükleotid Affinite Kromatografisi …………………………………….................... 8.7.5.1. Poli–U Affinite Kromatografisi ……………………………....................... 8.7.5.2. Poli–A Affinite Kromatografisi ……………………………....................... 8.7.5.3. 5’ AMP ve 2’5’ ADP Affinite Kromatografisi ……………........................ 8.7.6. Protein-A ve Protein-G ile Affinite Kromatografisi ……………............................ 8.7.6.1. Protein-A Affinite Kromatografisi …………………………....................... 8.7.6.2. Protein-G Affinite Kromatografisi …………………………...................... 8.7.7. Küçük Ligandlar ile Affinite Kromatografisi ………………………….................... 8.7.7.1. Benzamidin Affinite Kromatografisi ………………………...................... 8.7.7.2. Lizin Affinite Kromatografisi ………………………………....................... 8.7.7.3. Arjinin Affinite Kromatografisi ……………………………........................ 8.8. Metal Şelat Affinite Kromatografisi …………………………………..………..................... 8.8.1. Matriks Materyalleri ........................................................................................... 8.8.2. Kolonun Hazırlanması ve Dengelenmesi ........................................................... 8.8.3. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ve Elüsyonu .................................................... 8.9. Kovalent Kromatografisi …………………………………………….………........................ 8.10. Affinite Kolonlarının Rejenerasyonu ve Saklanması .....................................................

187 187 188 188 189 189 190 191 191 192 192 193 193 193 194 195 197

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ (HIC) 9.1. Giriş ………………………………………………………………….………........................... 199 9.2. HIC’nin Temel Prensipleri ……….…….…….................................................................... 200 9.3. HIC’yi Etkileyen Faktörler …………………………………………………………………….. 201 9.4. HIC ile RPC’nin Karşılaştırılması ……………………………………………………............ 203 9.5. HIC Adsorbentleri …………………………………………………………………………….. 204 9.6. Deneysel Koşulların Dizaynı …………………………………………...………................... 205 9.6.1. Stratejik Noktalar …………………………………………………………………….. 205 9.6.2. HIC Jelinin Seçimi …………………………………………………………………… 206 9.6.3. Tarama Deneyleri ……………………………………………………………………. 207 9.7. Hidrofobik İnteraksiyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ………………................... 208 9.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı ………………………………………………................... 208 9.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü ……………………………………................. 208 9.7.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması ………………………………………………….. 208 9.7.4. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ……………………............................................ 210 9.7.5. Elüsyon …………………………………………………….....………...................... 210 9.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ……………….………................ 213 9.9. HIC Uygulama Örnekleri ..…………………………………………..………........................ 213 9.9.1. HIC’nin Amonyum Sülfat Çökeltmesi ile Birlikte Kullanılması ………........……… 213 9.9.2. HIC’nin IEC ile Birlikte Kullanılması ………………………………………………… 213 9.9.3. HIC’nin GFC ile Birlikte Kullanılması ……………………………………………….. 215 9.9.4. Tek-adımda Saflaştırma Tekniği Olarak HIC ……………………………………… 215 10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ (RPC) 10.1. Giriş ………………………………………………………………….………............................ 217 10.2. RPC’nin Temel Prensipleri ……………………….……...................................................... 217 10.3. RPC Adsorbentleri ……………………………………………………………………………… 220 10.3.1. RPC Matriksleri ………………………………………………………………………… 220 10.3.2. RPC Ligandları ………………………………………………………………………… 222 10.4. RPC’de Çözünürlük ……………………………………………………………………………. 223 10.4.1. Bağlama Kapasitesi …………………………………………………………………… 224 10.5. Deneysel Koşulların Dizaynı ………………………………………………………………….. 224 10.5.1. Kolon Uzunluğu ................................................................................................... 224 10.5.2. Hareketli Fazın Akış Oranı .................................................................................. 225 10.5.3. Kromatografik İşlemin Gerçekleştirildiği Sıcaklık ................................................. 225 10.5.4. Hareketli Fazın Kompozisyonu ............................................................................ 226 10.5.5. Gradient Elüsyonu …………………………………………………………………….. 228 10.5.6. RPC’nin Kullanım Amacı ..................................................................................... 229 10.5.6.1. Tuz Giderimi ............................................................................................ 229 10.5.6.2. Yüksek Çözünürlüklü Saflaştırma ........................................................... 230 10.5.6.3. Büyük-Ölçekli Preparatif Saflaştırma ..................................................... 230

iv

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

10.5.6.4. Saflaştırma İşleminin Basamakları .......................................................... 230 10.6. RPC’nin Gerçekleştirilmesi ............................................................................................... 233 10.6.1. Kolon Materyalinin Seçimi ................................................................................... 233 10.6.1.1. Uygulamanın Gereksinimleri ................................................................... 233 10.6.1.2. Örnek Bileşenlerinin Moleküler Kütleleri ................................................. 234 10.6.1.3. Örnek Bileşenlerinin Hidrofobisiteleri ...................................................... 234 10.6.1.4. Örnek Bileşenlerinin Sınıfı ....................................................................... 235 10.6.2. Hareketli Faz Seçimi ............................................................................................ 235 10.6.2.1. Organik Çözücü ...................................................................................... 235 10.6.2.2. pH ........................................................................................................... 236 10.6.2.3. İyon-eşleştirme Ajanları .......................................................................... 238 10.6.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması ....................................................................... 239 10.6.4. Hareketli Fazın Hazırlanması ............................................................................. 240 10.6.4.1. Hareketli Fazın Depolanması ................................................................. 240 10.6.4.2. Organik Çözücünün İmhası .................................................................... 241 10.6.5. Dedeksiyon ........................................................................................................... 241 10.6.5.1. Hayalet Pikler .......................................................................................... 241 10.6.5.2. Hareketli Fazın Dengelenmesi ................................................................ 242 10.6.6. Kolonun Dengelenmesi ....................................................................................... 242 10.6.7. Elüsyon Koşulları ................................................................................................ 243 10.6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ..................................... 244 10.7. RPC Uygulama Örnekleri ................................................................................................. 245 10.7.1 Doğal Olarak Sentezlenen Peptidler ve Proteinler .............................................. 246 10.7.1.1. Trombosit-Türevli Büyüme Faktörünün Saflaştırılması ......................... 247 10.7.2. Rekombinant Peptidler ve Proteinler .................................................................. 248 10.7.2.1. İnklüzyon Cisimlerinin Saflaştırılması .................................................... 249 10.7.2.2. Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörünün Saflaştırılması ...... 249 10.7.3. Kimyasal Olarak Sentezlenen Peptidler .............................................................. 249 10.7.3.1. Fosforile PDGF α-reseptör-türevli pY574α Peptidinin Saflaştırılması .... 250 11. İNCE TABAKA ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ 11.1. Giriş …………………........................................................................................................ 11.2. Temel Prensipler ………………………………………………………………….................... 11.3. İnce-tabakaların Hazırlanması ………………………………………………….................... 11.4. Örneğin Uygulanması …………………………………………………………...................... 11.5. TLC Tankları ve Plakanın Geliştirilmesi …………………………..…………….................. 11.6. Kesiksiz Plaka Geliştirme ………………………………………….……………................... 11.7. Analitlerin Belirlenmesi ……………………………………………..…………...................... 11.8. Kâğıt Kromatografi (PC) …………………………………………..…………….................... 11.8.1. Temel Prensipler ……………………………………………...………….................. 11.8.2. Deneysel Prosedür ……………………………………………………….................

253 253 254 255 257 259 260 261 261 262

Ek-1: Amonyum sülfat ile çökeltme tablosu .............................................................................. 263 KAYNAKLAR ........................................................................................................................... 265

v

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

vi

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

SEMBOLLER VE KISALTMALAR

ε

Kromoforun molar ekstinksiyon sabiti (molar absorbtivite)

α

Seçicilik faktörü

β

Volümetrik faz oranı

ΔE

Deneysel dalga boyundaki absorbans değişimi

½h

Pikin yarı yüksekliği

a

Gaus pikinin birinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği

A

Absorbans

a

Gaus pikinin birinci yarısının alanı

A280

280 nm’deki absorbans

Af

Asimetri faktörü

APMSF

4-Aminofenil-metilsülfonil florid

AS

Adsorbent yüzey alanı

AUFS

Tam ölçek sapma absorbans birimi (Absorbance Units for Full-Scale Deflection)

b

Gaus pikinin ikinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği

b

Gaus pikinin ikinci yarısının alanı

BSA

Bovin serum albümin

C

Protein derişimi (mg mL-1)

CDI

N,N’-karbonildiimidazol

CM

Analitin hareketli faz içindeki derişimi

Cp

Enzim preparatındaki toplam protein yoğunluğu

CS

Analitin sabit faz içindeki derişimi

d

Küvetin ışık yolu (cm)

D

Örnek molekülünün diffüzyon kat sayısı

dA

Analitin yükleme noktasından (orijin) olan uzaklığı

Da

Dalton

dm

TLC’de solvent (hareketli faz) ucunun, orijin noktasından olan uzaklığıdır

DMSO

Dimetil sülfoksid

E

Standart protein solüsyonunun (1 mg ml-1) 280 nm’deki absorbansı

EDTA

Etilendiamin tetra asetik asit

EGTA

Etilen glikol tetra asetik asit

ELISA

Enzim-linked immünosorbent assay

ES

Enzim-substrat kompleksi

ETE

Eelektroforetik titrasyon eğrisi

FAB

Hızlı atom bombardımanı

FC

Mobil fazın akış oranı (mL dk-1)

FPLC

Hızlı protein sıvı kromatografisi

FSH

Folikül stimüle edici hormon

GFC

Jel filtrasyon kromatografisi

GLC

Gaz-sıvı kromatografisi

vii

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

GlcNAc

N-asetilglikozamin

h

Pik yüksekliği

H

Kuramsal levha yüksekliği

HETP

Kuramsal levhaya yüksek denge

HIC

Hidrofobik interaksiyon kromatografisi

HMW

Yüksek moleküler kütleli standart proteinleri

HPLC

Yüksek performans sıvı kromatografisi

HPTLC

Yüksek performanslı TLC

I

Dedektör küvetinden geçen ışın şiddeti

IEC

İyon değiş-tokuş kromatografisi

Io

Dedektör küvetine gönderilen ışın şiddeti

IR

İnfrared

k

Kapasite (alıkonma) faktörü

K

Toplam bağlama sabiti

kat

Katal (1 kat = 6 x 107 U ve 1 U = 1,7 x 10-8 kat’dır).

Kav

Ortalama dağılma kat sayısı

Kd

Kromatografide dağılma kat sayısı

kDa

Kilodalton

KTE

Kromatografik titrasyon eğrisi

L

Kolonun yatak uzunluğu

L

Ligand

LH

Luteinizing hormon

LMW

Düşük moleküler kütleli standart proteinleri

LPLC

Düşük basınç sıvı kromatografisi

M

Kolona yüklenen bileşiklerin kütlesi

MPLC

Orta basınç sıvı kromatografisi

Mr

Göreceli moleküler kütle

MS

Mas (kütle) spektrofotometre

MW

Moleküler kütle (ağırlık)

N

Kuramsal levha sayısı

n

Pik kapasitesi

ODS

Oktadesilsilan

OS

Oktasilan

PAGE

Poliakrilamid jel elektroforezi

PC

Kâğıt Kromatografi

PEG

Polietilenglikol

pHI

İzoelektrik pH

pI

İzoelektrik nokta

PMSF

Fenil-metilsülfonil florid

R

Dedektör tepkime değeri

Rf

Gecikme faktörü (retantion factor)

viii

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

RI

Refraktif indeks

RIA

Radioimmünoassay

RID

Refraktif indeks dedektörü

RPC

Ters-faz kromatografi

RP-HPLC

Ters-faz HPLC

RS

Çözünürlük

s

Grafik kaydedicinin hızı (cm dk-1)

SDS

Sodyum dodesil sülfat

SDS-PAGE

Sodyum dodesil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforezi

SFE

Süperkritik sıvı ekstraksiyonu (Supercritical Fluid Extraction)

t

Örnek molekülünün göç zamanı

t’R

Düzeltilmiş elüsyon zamanı

TFCK

Tosilfenilalanilklorometilketon

TLC

İnce tabaka kromatografisi

to

Kolondan transit geçen bir analitin elüsyon zamanı

tR

Bir analitin kolondan elüsyonu (alıkonma) için geçen süre (= analite ait pikin tepe noktası = Ve)

U

Enzim ünitesi

ū

Hareketli fazın kolon boyunca lineer akış oranı

UV

Ultra Viole

V

Hacim (mL)

Vα

İlk pikin elüsyon hacmi

V’R

Düzeltilmiş elüsyon hacmi

VD

Farklı moleküler büyüklüklere ve Kd değerlerine sahip iki madde için elüsyon hacimlerindeki fark

Vi

Kd değeri 1’e eşit olan molekül için kullanılabilir olan matriks içindeki mobil fazın hacmi

Vis

Görünür (visable) dalga boyu

VM

Kolondan transit geçen analitlerin elüsyon hacmi veya kolon içindeki mobil fazın toplam hacmi

Vmax

Reaksiyon hızının maksimum değeri

Vo

Kolon materyalleri dışında kalan hareketli fazın hacmi; GFC için boşluk hacmi (enzimatik reaksiyonlar için reaksiyonun başlangıç hızı)

VR

Bir analitin kolondan elüsyon (alıkonma) hacmi (= analite ait pikin tepe noktası = te)

VS

Durgun faz hacmi

Vsep

Kolon yatağının ayrıştırma hacmi

Vt

Kolon yatak hacmi

Vω

Son pikin elüsyon hacmi

w

Gaus pikinin yükselme noktasındaki (0,607) genişliği (2σ) veya TLC’de leke genişliği

w0,5

Gaus pikinin yarı yüksekliğinin genişliği

wB

Gaus pikinin taban genişliği (4σ) ix

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

x

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

1.1. Giriş İster akademik amaçlı çalışmalar için, isterse endüstriyel ve klinik uygulamalar için olsun, proteinlerin elde edildiği kaynaklar oldukça farklıdır. Protein kaynaklarının başlıca gruplarını ise mikroorganizmalar, bitkiler, hayvan dokuları ve rekombinant proteinler oluşturmaktadır. Protein kaynaklarının bu kadar farklı ve çeşitli olmasına rağmen, bu kaynaklardan elde edilen proteinler ister doğal isterse rekombinant olsunlar, genellikle benzer saflaştırma protokolleri ve teknikleri ile saflaştırılırlar (Şekil 1.1). Özgül bir proteinin saflaştırılması için uygulanacak prosedürler ise basit tek-adımlı çöktürmeden (presipitasyon), büyük-ölçekli üretim proseslerine kadar değişebilmektedir. Genellikle istenilen saflıktaki bir ürünün elde edilmesi için birden fazla saflaştırma basamağının uygulanması gerekmektedir. Başarılı ve randımanlı bir protein saflaştırma çalışmasının anahtarı ise en uygun tekniğin seçimine, seçilen tekniğin optimizasyonuna ve verimi artırmak ve saflaştırma protokolünün basamak sayısını minimuma indirmek için seçilen tekniklerin mantıklı bir şekilde kombinasyonuna bağlıdır. Özgül bir proteinin saflaştırılması için takip edilecek protokolün ve uygulanacak tekniklerin detayı ise bazı faktörlere bağlı olarak belirlenebilir. Bu faktörler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Hedef proteinin kaynağı ve proteinin kaynaktaki lokasyonu (intrasellüler, membrana-bağlı veya ekstrasellüler). ii. Hedef proteinin ekspresyon düzeyi. iii. Hedef proteinin fizikokimyasal özellikleri. iv. Saflaştırmanın amacı. Başlangıç materyalinde bulunan kirleticilerin (kontaminantların) çeşitliliği ve derişimleri ise örnek materyalinin elde edildiği kaynağa bağlı olarak değişecektir. Şayet, saflaştırılmak istenen hedef protein intrasellüler bir protein ise protein kaynağından bu proteini de içeren ham özütün elde edilmesi için seçilecek olan hücre parçalama yöntemi, protein kaynağının özelliklerine bağlı olmalıdır. Hedef proteinin intrasellüler ya da ekstrasellüler olmasına bağlı olarak, ham özütün önsaflaştırılmasında ve yoğunlaştırılmasında uygulanacak yöntemler de değişecektir. Bunun yanı sıra, hedef proteinin ekspresyon düzeyi de saflaştırma protokolü üzerinde etkili olacaktır. Örneğin, hedef proteinin ekspresyon düzeyinin düşük olması durumunda, çok fazla miktarda protein kaynağının özütlenmesi ve daha sonra da elde edilen protein özütünün kromatografik ayrıştırması (seperasyonu) için önemli bir oranda yoğunlaştırılması gerekebilir. Bunun aksine, şayet hedef proteinin ekspresyon düzeyi yüksekse, ham protein özütünün yoğunlaştırılmasına gerek kalmayabilir. Hedef proteinin fizikokimyasal özelliklerinin saflaştırma protokolü üzerine bir etkisinin olacağı ise gayet açıktır. Çünkü, protein karışımlarındaki protein moleküllerinin fraksiyonlanmasında, bu moleküllerin çözünme özelliği, moleküler büyüklüğü, yüzey hidrofobisitesi

2

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ve elektriksel yükü gibi fizikokimyasal özelliklerindeki farklılıklardan yararlanılmaktadır. Ham özütlerden bazı rekombinant proteinlerin saflaştırılması gerektiği durumlarda ise hedef proteinin saflaştırılmasında yardımcı olmak amacı ile, protein mühendisliği teknikleri kullanılarak bu proteine oldukça belirgin bir fizikokimyasal özellik kazandıran bir etiket (işaret) bağlanabilir. Bu etiket ise bu rekombinant proteinin diğer kirleticilerden çok daha kolay olarak ayrıştırılmasında kullanılabilir (bkz. kısım 1.8.2). Protein üretimi (kaynak aracılığı ile veya kaynak içinde)

Proteinlerin kaynaktan özütlenmesi

Yoğunlaştırma / Ön-saflaştırma

Yüksek çözünürlüklü kromatografik teknikler ile saflaştırma

Şekil 1.1: Protein saflaştırmada takip edilen genel bir protokol şeması. Bu protokolden farklı yaklaşımların izlenmesi de elbette mümkündür.

Saflaştırma protokolü üzerine etkisi olan diğer önemli bir faktör ise saflaştırmanın amacıdır. Şayet hedef proteinin saflaştırılması, tamamı ile akademik bir amaçla yapılıyorsa, bu durumda en önemli amaç, genellikle proteinin homojen olarak elde edilmesi olmaktadır. Bu durumda, homojen (saf) bir protein solüsyonunun elde edilmesi için gereken basamakların sayısı, prosedürün süresi, son-ürünün maliyeti ve verimliliği gibi konular ikinci planda kalmaktadır. Şayet hedef protein ticari bir uygulama amacı ile saflaştırılıyorsa, bu durumda saflaştırma prosedürünün maliyeti ve teknik faktörler çok daha önemli olmaktadır. Bunun yanı sıra hedef proteinin saflık derecesi, gerekli olan minimum düzeyde olacaktır. Saflaştırılmak istenen proteinin miktarı veya istenilen saflık derecesi de saflaştırma protokolünü etkileyecektir. Akademik amaçlı çalışmalarda, saflaştırılmış olan proteinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalarının yapılabilmesi için genellikle birkaç yüz miligram ile 1 g arasında saf protein yeterli olmaktadır. Bunun aksine, ticari bir uygulamada kullanılmak amacı ile saflaştırılmış olan proteinlere daha fazla miktarlarda gereksimin duyulmakta ve saflık düzeyleri ise uygulama amaçlarına göre değişmektedir (Tablo 1.1). Tablo 1.1: Saf bir proteinin, akademik veya ticari amaçla kullanılması durumunda gerekli olan miktarı (Boyer,

2000). Amaç

Miktar

Kütle spektrofotometre çalışması

ng-μg düzeyinde (saf)

Protein dizileme/elektroforetik analiz

μg düzeyinde (saf)

Genel fonksiyon/fizikokimyasal çalışmalar

mg-g düzeyinde (saf)

Uygulama-araştırmaları için özel ticari proteinler

yüzlerce mg – 100 g (orta saflıkta)

In vitro diyagnostik testler için ticari enzim/antikor

g-kg düzeyinde (orta/yüksek saflıkta)

In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Gauchers hastalığı gibi düşük-insidentli hastalıkların tedavisi

yüzlerce g – 10 kg düzeyinde (yüksek saflıkta)

In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Diyabet ve hemofili gibi yüksek-insidentli hastalıkların tedavisi

10 kg – yüzlerce kg düzeyinde (yüksek saflıkta)

Büyük miktarlarda endüstriyel uygulamalar

>1000 kg düzeyinde (genellikle ham)

Gıda sanayi uygulamaları için/ile süt-türevi proteinlerin üretimi

>100 000 kg düzeyinde (farklı saflıkta)

1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım Protein çalışmalarında, genellikle kompleks bir karışımdan özel bir proteinin saflaştırılması gerekmektedir. Analitik ayrıştırmalarda amaç, proteinlerin tanımını ve küçük miktarda da olsa varlığını belirlemektir. Bu amaçla yapılan çalışmalarda, genellikle saflaştırılması gerçekleştirilen

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

3

proteinin geri-kazanılması gerekmez. Preparatif ayrıştırmalarda ise temel amaç, hedeflenen proteinin mümkün olduğunca saf olarak elde edilmesi ve maksimum düzeyde geri-kazanılmasıdır. Proteinin saf olarak elde edilmesi ise, daha sonra yapılacak olan fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin belirlenmesi için gereklidir. İstenilen proteinin ayrıştırılması ve saflaştırılması için analitik mi yoksa preparatif ayrıştırma tekniğinin mi kullanılacağı ise genellikle, preparatif tekniğin çok fazla miktarda örneğe ihtiyaç duyması ve büyük oranda geri-kazanımını gerektiren tekniklerin kullanılmasını gerektirmesine bağlı olarak belirlenir. Analitik ayrıştırma metodu genellikle, aranan proteinin karışım içerisinde bulunup bulunmadığının kalitatif olarak belirlenmesini sağlayan, kestirme bir yol olarak kullanılmaktadır. Bir karışım içerisinde aranan bileşiğin varlığından şüpheleniliyorsa, analitik ayrıştırma işlemi esnasında bu bileşik ile aynı davranan ve özellikleri bilinen bir bileşik (standart) kullanılır (bkz. kısım 2.9). Böylece, standart ile aranmakta olan bileşiğin asseyi (reaksiyon testi), yüksek çözünürlük gösteren bir teknik aracılığı ile aynı şartlar altında ve aynı muamele ile yapıldığında, standart bileşik muhtemelen aranan bileşik ile aynı davranışı gösterecektir. Bu teknik ise, aranmakta olan bileşiğin saflaştırma işlemleri sonrasında yapısal özelliklerini belirlemek için yapılan fiziksel metotların da gerekliliğini ortadan kaldıracaktır. Şayet, biyolojik materyallerde aranmakta olan bileşiğin kendine özgü bazı özellikleri varsa, bu bileşiğin kantitatif olarak tanımlanmasını sağlamak ve derişimini belirlemek için izolasyon ve saflaştırma (pürifikasyon) gibi ön-işlemlere gerek olmayabilir. Aranmakta olan bileşiğin kendine özgü özelliklere sahip olması, bunların enzim aktivite tayinlerinin (assey) ham özütlerden, intakt hücrelerden ve organellerden de yapılmasına olanak sağlamaktadır. Şayet, aranmakta olan bileşik, kendine özgü bazı özelliklere sahip değilse ya da bu özellikler henüz bilinmiyorsa, bu molekülün analizinin yapılmadan önce saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan yöntemler ise hedef bileşiğin bir miktarının kaybına yol açmaktadır. Bu nedenle, saflaştırma işlemlerinde uygulanacak olan prosedürlerin sayısının mümkün olduğunca minimumda tutulması gerekmektedir. Aynı zamanda, saflaştırma işlemlerinde kullanılacak yöntemlerin, çok az miktardaki örneklerle çalışılması durumunda dahi, yüksek oranda çözünürlük sağlaması amaçlanmaktadır. Bileşiklerin ayrıştırılmasında, yüksek çözünürlük sağlayan teknikler ise genellikle az miktardaki örneklerle sağlanabildiği için, fazla miktardaki örneklerin uygulanmasına elverişli değildirler. Preparatif ayrıştırma işlemlerinde, normal prosedürlerin ilk basamağı yüksek ayrıştırma kapasitesine sahip bir metot olmasına rağmen, bu metot genellikle düşük çözünürlükte olmaktadır. Çöktürme, diyaliz, adsorbsiyon, sıvı-sıvı kromatografisi ve dağılma (partisyon) kolon kromatografisi gibi tekniklerin her birisinin bir diğerine göre avantajı bulunmakta ve belki de fazla miktardaki örnekler ile çalışma olanakları sunmaktadırlar. İyon değiş-tokuş, jel filtrasyon ve affinite kromatografisi, HPLC ve preparatif jel elektroforezi gibi yüksek çözünürlük sağlayan metotlardan bazıları ise daha sonraki aşamalarda saflaştırma işleminin son aşaması olarak kullanılabilmektedir. Saflaştırma işlemi esnasında kullanılan yöntemlerden çoğu, saflaştırılmaya çalışılmakta olan molekülün özelliklerinden yararlanılarak seçilmektedir. Bu nedenle, hedef molekülün özelliklerinin çoğunun kullanılmasına izin veren yöntemlerin seçilmesi, bir önceki saflaştırma yöntemine oranla molekülün saflığını biraz daha artırabilmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan kromatografik teknikler ise daha sonraki bölümlerde ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. Bir proteini saflaştırmak istediğimizde, teorik olarak birden fazla metodun kullanılması mümkün olabilir, fakat bu metotlardan birisini tercih etmek durumunda kaldığımızda ise pratikte en uygun olan metodu seçmek gerekmektedir. Saflaştırılmak istenen proteinin ayrıştırılmasında kullanılacak yöntem seçilirken, birkaç kriterin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Bu kriterler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir:

4

Doç. Dr. Münir TUNCER

i.

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Ayrıştırma işlemi, analitik mi yoksa preparatif amaçlı mı olacak? Buna bağlı olarak, metodun çözünürlüğü ve kapasitesi göz önünde bulundurulmalıdır.

ii. Hedef proteinlerin çözünme özelliği, göreceli moleküler kütlesi ve elektriksel yükü gibi özellikleri göz önüne alınmalıdır. iii. Özel muameleler esnasında hedef proteinin kararlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. iv. Literatür taraması yapılarak, başarılı şekilde uygulanmış olan saflaştırma yöntemleri göz önüne alınmalıdır. v. Uygulanacak yöntem için gerekli olan materyal ve deneyimin varlığı dikkate alınmalıdır. vi. Uygulanacak olan saflaştırma metodunun maliyeti dikkate alınmalıdır. Saflaştırma işlemine başlamadan önce, kullanılacak yöntemler incelenerek karar verilir fakat, bu arada projenin amacına uygun olan yöntemin seçilmesi kadar, elde var olan araç-gereçler de dikkate alınmalıdır. Saflaştırılmak istenen molekül ise ya in vivo ya da in vitro olarak bulunmaktadır. Buna rağmen, in vivo ve in vitro modeller arasındaki farklılıkları belirlemek oldukça zordur. In vivo tekniklerde genellikle mikroorganizmalar, multisellüler organizmalar ve bitkilerin tamamı, hayvanların tamamı ya da bu hayvanların organları kullanılmaktadır. 1.2.1. İn vivo Çalışmalar In vivo olarak biyokimyasal deneylerde, bütün bir bitkinin veya hayvanın kullanılması, hücre kültürü gibi yöntemlere alternatif olarak oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Hayvanlar, medikal veya klinik amaçlı çalışmalar için oldukça yaygın olarak kullanıldıkları gibi, tarımsal ve hayvancılık alanında; aşıların, antikorların ve hormonların üretiminde; kimyasal tanımlamaların yeterli olmadığı durumlarda ise ilaçların veya diğer biyolojik materyallerin test edilmelerinde kullanılmalarının yanı sıra, toksikoloji çalışmalarında da sıklıkla kullanılmaktadırlar. Hayvanlarla yapılan biyokimyasal çalışmaların çoğu yabancı maddelerin, ksenobiyotiklerin (ilaçlar ve besin katkı maddeleri gibi) metabolizmasının incelenmesi yönünde olmakla birlikte, elde edilen sonuçlar doğrultusunda, “bazı maddelerin insan üzerinde kullanılmadan önce klinik deneylerinin tamamlanmış olması”, gereği ile de hayvanlar kullanılmaktadır. Fareler, ratlar ve Gine domuzları ise üretim maliyetlerinin düşüklüğü ve denek olarak kullanımlarının kolaylığı nedeniyle, biyokimyasal çalışmalarda en çok kullanılan deney hayvanlarıdırlar. Bunun yanı sıra tavşanlar, kediler, köpekler, Marmoset maymunları ve babunlar da biyokimyasal deneylerde kullanılırlar. Son zamanlarda, bütün bir hayvanın deney amaçlı kullanılmasına olan tepkiler ve bu laboratuvar hayvanlarının yetiştirilmesi için gerekli olan harcamaların yani maliyetin yüksekliği, başka alternatif deney yöntemlerinin araştırılmasını zorunlu kılmıştır. Bunun için temel yaklaşım ise mümkün olan ve uygulanabilen durumlarda, bütün bir hayvanın yani in vivo deneylerin yerine in vitro deney koşullarının gerçekleştirilmesidir. 1.2.2. İn vitro Çalışmalar In vitro çalışmaları, biyolojik olarak üretilen materyallerin yapay, fiziksel ve kimyasal ortamlarda inkübasyonuna dayanır. In vitro terimi, enzim preparasyonları, izole edilmiş organeller, intakt mikroorganizmalar ve hayvan ve bitkilerin parçalanmış kısımları için de kullanılmaktadır. In vitro çalışmalarda ortam koşulları, hücrelerin, doku ve organ kültürlerinin, hayvan ve bitiklerin minimum düzeyde büyümeyi, farklılaşmayı ve gelişmeyi sağlayacak şekilde seçilebilir. Hücre ve doku kültürü metotlarının özel avantajı ise diğer bulaşıcı hücreler tarafından oluşturulan biyokimyasal ve fizyolojik sınırlamaları azaltmasıdır. Bu yaklaşım, biyolojik bilimlerde oldukça geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Bu yöntemin en temel avantajı ise, hücre kültürlerinde hücrenin gelişme potansiyelinin araştırılmasına olanak sağlamasıdır. In vitro deneysel çalışmalarının

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

5

eleştiriye açık olan tek noktası ise, belki de in vitro koşulların gerektiği gibi tam olarak hücrelerin ihtiyaç duyduğu şekilde hazırlanamama ihtimalinin olmasıdır. 1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır? “Don’t waste clean thinking on dirty enzymes” E. Rocker. Efraim Rocker’ın “Temiz düşüncelerinizi kirli enzimler üzerine heba etmeyin” anlamındaki sözü, enzimoloji araştırmaları için oldukça yol göstericidir. Bu deyimin açıklaması ise, bir enzimin bir maddeyi-substratı başka bir maddeye-ürüne nasıl dönüştürdüğünü detaylı olarak incelemek için yapılan çalışmalar, ta ki bu enzim hücre özütünü oluşturan diğer kirleticilerden ve enzimlerden ayrıştırılmadığı sürece, zaman kaybından başka bir şey değildir. Çünkü, bir karaciğerin, bir maya hücresinin veya bakteriyel hücrenin parçalanması sonucunda binlerce farklı enzim serbest kalmaktadır. Sadece bir enzimi, diğer enzimlerin bulunmadığı bir aşamaya kadar saflaştırabildiğimizde (homojen saflık) garanti olarak söyleyebiliriz ki, A maddesinin B maddesine dönüştürülmesi tek bir enzim tarafından katalizlenmektedir. Bu nedenle, sadece bu aşamadan sonra, yani bir enzimi saf olarak elde ettikten sonra, saflaştırılmış olan enzimin nasıl çalıştığını ve fizikokimyasal özelliklerini tam olarak öğrenebiliriz. Bir enzimi saflaştırmak için harcanan emeğin karşılığı ise, 1930’lu yıllarda Otto Warburg tarafından yayınlanan makalelerde ortaya konmuştur. O. Warburg’un Berlin-Dahlem’de (Almanya) bulunan laboratuvarlarında yapılan saflaştırma çalışmaları sonucunda, çok sayıda enzim saflaştırma teknikleri ortaya konmuş ve saflaştırılan enzimler ile solunum ve glikoz fermantasyonunda rol alan anahtar enzimler ile vitaminlerin rolleri açıklığa kavuşturulmuştur. Warburg’un çalışmaları ise 20. yüzyılın başında, Edward Büchner’in kaza eseri olarak, intakt hücrelerin bulunmadığı bir ortamda “sukrozun etanole dönüştüğünü” keşfetmesi ile ileri sürdüğü enzim fikrini daha da kuvvetlendirmiştir. İntakt hücre içermeyen ortamlardaki enzimatik reaksiyonun keşfedildiği ilk gözlemden sonraki yıllarda ise mayalardaki alkolik fermantasyon, kaslardaki glikolizis, ateş böceklerindeki lüminisans veya DNA replikasyonu gibi hücresel fonksiyonların moleküler temelleri ortaya konmuştur. Bu gözlemden sonra, hücre özütlerinin fraksiyonlanması sonucunda, enzim veya enzimler izole edilerek saf halde elde edilmeye ve bu enzimlerin fonksiyonları ortaya konmaya başlanmıştır. Saf halde elde edilen enzimlerin, katalitik fonksiyonlarını yerine getirmelerini, regülatör sinyallere karşı nasıl cevap verdiğini ve hücre içerisinde nasıl bir form ve yapıda olması gerektiğini belirleyen enzim yapısı üzerinde çalışmalar yapılabilmiştir. Çalışılmakta olan enzim preparasyonları içerisinde, hedef olan enzimin %1’i kadar dahi başka bir enzimin bulunması, reaksiyon ortamında milyonlarca yabancı molekülün oluşmasına yol açabilmektedir. Genellikle bu tipteki kirleticiler, predominant olarak tek tipte değilse ve çalışılmakta olan bileşik ile oldukça yüksek olarak aktif değilse, herhangi bir problem oluşturmayabilir. Bütün bu nedenlerin yanı sıra, saf olarak elde edilmiş proteinlerin amino asit dizilimleri (sekansları) belirlendikten sonra, bu proteinlerin sentezinden sorumlu olan genlerin izolasyonu için gerekli olan problar in vitro olarak sentezlenebilir. İn vitro koşullarda sentezlenen problar ise özgül proteinlerin sentezinden sorumlu olan genlerin izolasyonunda kullanılabilir. Ayrıca, proteinlerin biyolojik aktivitelerinden sorumlu olan üç-boyutlu yapılarının araştırılmasında, saflaştırılarak amino asit dizilimleri belirlenmiş olan proteinlerden yararlanılabilir.

6

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler Bir proteinin fiziksel ve biyolojik özelliklerinin belirlenmesi için öncelikle bu proteinin saf olarak elde edilmesi gerekmektedir. Bir proteinin saflaştırılmasının başarılması ise öncelikle, proteinin biyolojik matriksinden serbest bırakılması (bkz. kısım 1.6) ve uygun bir fraksiyonlama prosedürü ile diğer proteinlerden seçici olarak ayrıştırılması ile sağlanabilir. Proteinin saflaştırılması için kullanılacak prosedürlerin adaptasyonu ise 3 faktöre bağlı bulunmaktadır: i. Nitelik: Saflaştırılacak olan proteinin kullanılma amacı, proteinin saflık derecesinin belirlenmesinde önemli bir etkendir. Bu nedenle, aktivite çalışmalarında %100 saflıkta protein preparasyonlarına gereksinim duyulmazken, proteinin primer yapısının belirlenmesi amacı ile yapılan çalışmalarda kullanılan protein preparasyonlarının homojen saflıkta (%100) olması gerekmektedir (bkz. Tablo 1.1). Bunun yanı sıra aktivite çalışmaları, proteinin biyolojik fonksiyonlarının korunmasını, bu nedenle de denatürasyonunun ve proteolizizinin minimuma indirilmesini gerektirirken, protein yapısına ilişkin çalışmalar denatüre proteinlerle de yapılabilmektedir. ii. Nicelik: Çalışmanın amacına uygun olarak, ne kadar saf proteine ihtiyaç duyulduğu (bkz. Tablo 1.1), bir proteinin saflaştırılması için kullanılacak olan metotların seçimini etkilemektedir. Bazı saflaştırma teknikleri, yüksek hacimli ve yüksek protein derişimli örneklerin uygulanmasına izin veren yüksek kapasiteli teknikler iken, bu tekniklerin bazıları ise sınırlı kapasitelere sahiptirler. Amonyum sülfat ile çöktürme ve adsorbsiyon kromatografisi gibi yüksek kapasiteli teknikler, saflaştırma prosedürünün erken aşamalarında kullanılırken, jel filtrasyon kromatografisi gibi düşük kapasiteli teknikler ise saflaştırma prosedürünün sonuna doğru kullanılmaktadır. iii. Maliyet: İyon değiş-tokuş kromatografisi materyalleri ve affinite kromatografisi için gerekli olan durgun fazların maliyeti, özellikle büyük-ölçekli uygulamalar için sınırlayıcı bir faktör olabilir. Bunun aksine, bu materyaller genellikle yüksek çözünürlüğe sahip olmaları nedeni ile bir proteinin saflaştırılması için gerekli adımların sayısını oldukça azaltabilirler. 1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması Özellikle enzimler başta olmak üzere, proteinlerin saflaştırılması ile uğraşan her araştırmacının başlıca problemi, proteinlerin doğal kaynaklarından özütlenmesinden başlayarak saflaştırılmasına kadar olan her aşamada enzimatik veya biyolojik aktivite kaybı ile karşı karşıya kalmalarıdır. Bunun başlıca nedeni ise proteinlerin, özütleme ve saflaştırma prosedürleri esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile denatürasyona neden olan faktörlere karşı maruz kalmalarıdır. Ekstrasellüler proteinler ise doğaları gereği çok değişik çevresel faktörlerin varlığında dahi aktivitelerini göstermek üzere dizayn edilmiş olduklarından, kısmen de olsa denatürasyona neden olan faktörlere karşı daha dayanıklıdırlar. Fakat intakt bir hücre içerisindeki doğal çevre, proteinlerin özütlenmesi ve saflaştırılması esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile proteinlerin içinde bulundukları çevreden oldukça farklıdır. Çözünebilir intrasellüler proteinler ise ister sitoplazmada (genellikle, en az 100 mg mL-1) isterse organellerde (mitokondri matriksinde 400 mg mL-1’ye kadar ulaştığı hesaplanmıştır) bulunsunlar, bulundukları ortamda oldukça yoğun protein çorbaları halinde bulunmaktadırlar. Bu proteinlerin bulundukları ortamlardaki oksijen derişimi ise genellikle oldukça düşük, hatta sıfırdır. Bunun yanı sıra sitoplazma ve organellerde, yüksek indirgeme potansiyelinin korunması amacıyla glutatyon gibi oldukça farklı indirgeyici ajanlar da bulunmaktadır. Bu ortamlarda, metabolitlerin de oldukça yüksek miktarlarda bulunması, belki de proteinlerin kararlılıklarını olumlu olarak etkilemektedir. Doğal protein kaynaklarından intrasellüler proteinlerin elde edilmesi için hücreler parçalandıklarında ise proteinler bu koruyucu çevreden uzaklaşmakta, muhtemelen oksijen ile tam olarak doymuş bulunan ekstraksiyon tamponu içinde seyrelmekte ve intakt hücre içerisinde, lizozomlarda ayrı olarak bulunan proteolitik enzimlerin de serbest kalması

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

7

ile bu enzimlerin etkilerine maruz kalmaktadırlar (bkz. kısım 1.5.3). Bu nedenlerle, doğal kaynaklarından özütlenen proteinlerin denatüre olarak biyolojik aktivitelerinin kaybına yol açan farklı tehditler bulunmaktadır. Bu tehditlerin başlıcaları ise aşağıdaki şeklide sıralanabilir: i. Denatürasyon. ii. Enzimlerin aktif bölgelerinin inaktivasyonu. iii. Proteoliziz ve polipeptidlerin diğer modifikasyonları. 1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi Proteinlerin, özütleme ve saflaştırma prosedürleri esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile denatürasyona neden olan faktörlere karşı olan duyarlılıkları ise farklılık göstermektedir. Şayet, proteinlerin denatürasyonuna neden olan temel faktörün ne olduğu biliniyorsa, proteinlerin bu faktöre maruz kalması önlenerek, proteinlerin denatürasyonu önlenebilir. Proteinlerin denatürasyonuna neden olan başlıca faktörler ise aşırı pH koşulları, sıcaklık (<40 °C), organik çözücüler, deterjanlar, ağır metaller, katotrofik tuzlar ve H bağları ile hidrofobik etkileşimleri yıkan diğer ajanlardır. İntakt bir hücre içerisindeki doğal pH, genellikle 6-8 aralığında bulunmaktadır. Bu nedenle, proteinlerin doğal kaynaklarından özütlenmesi sırasında kullanılacak olan tamponların pH değerlerinin 6-8 aralığında olması veya proteinlerin elde edileceği doğal kaynağın gerçek hücre içi pH’sına mümkün olduğunca yakın olması, proteinlerin pH nedeni ile denatürasyonunu önleyecektir. Hayvan hücrelerinin çoğunda, 37 ºC’deki hücre içi fizyolojik pH 7,0-7,5 aralığındadır. Tampon bileşenlerinin tamponlama kapasiteleri üzerinde sıcaklığın etkisinin bulunması nedeni ile hayvan hücrelerinin 0 ºC’deki fizyolojik pH’sı ise 7,0’den ziyade 8,0’e daha yakındır. Proteinlerin sıcaklık nedeni ile denatürasyonu ise belirli bir sıcaklık değerinden sonra oldukça hızlı gerçekleşmektedir. Örneğin, sıcaklıkta meydana gelecek olan 10 ºC’lik bir artış, proteinlerin 20-40 misli denatürasyonu ile sonuçlanabilmektedir. Fakat özellikle sıcakkanlı memelilerden elde edilen proteinler başta olmak üzere, proteinlerin çoğu, tampon pH’sının fizyolojik pH’ya oldukça yakın olarak seçilmesi durumunda, 40 ºC’nin altındaki sıcaklıklarda oldukça az denatüre olmaktadırlar. Bunun yanı sıra, proteinlerin elde edildikleri doğal kaynaklar, soğuk-su balıkları ve psikrofil bakteriler gibi organizmalardan oluşuyorsa, bu durumda elde edilen proteinlerin oda sıcaklığında dahi denatüre olabileceklerini de unutmamak gerekir. Protein moleküllerinin bir arada tutulmasını sağlayan hidrofobik güçlerin zayıflamasına yol açması nendi ile bazı proteinler ise soğukta dahi denatüre olabilmektedirler. Bu nedenle, protein örneklerinin genellikle buz üzerinde tutulmaları önerilse de, buz üzerinde tutulan örneklerin saflaştırma amacı ile fraksiyonlanmasına geçilmeden önce, bu örneklerin sıcaklıklarının oda sıcaklığına getirilmeleri gerekebilir. Genel bir kural olarak ise proteinler, kendi normal fizyolojik sıcaklıklarının 10 ºC üzerindeki sıcaklıklarda dahi kararlıdırlar. Fakat bu proteinler, doğal fizyolojik koşullarından farklı olan çevresel koşullara (özellikle özütlenmiş olan membran proteinleri ile birlikte) maruz kaldıklarında ise kararlılıklarını koruyamamakta, hatta fizyolojik sıcaklıklarının altındaki sıcaklıklarda dahi denatüre olabilmektedirler. 1.5.2. Katalitik Bölge İnaktivasyonunun Önlemesi Enzimlerin aktif bölgelerinin modifikasyonu nedeni ile meydana gelen enzim inaktivasyonunun önlenmesi ise çok daha zordur. Şayet enzimlerin yapısında yer alan kofaktörler biliniyorsa bu kofaktörlerin kaybı, kofaktörün tekrar enzim preparatına eklenmesi ya da kullanılan tamponların içine ilave edilmesi ile engellenebilir. Kaybolan kofaktörlerin enzime yeniden kazandırılması için ise enzimatik aktivitenin ölçülmesinden önce, bir ön-inkübasyonun yapılmasını gerektirebilir. Apoenzimlerin kararlılıkları ise her zaman holoenzimlerin kararlılıklarından daha

8

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

düşük olmadığı için, ön-inkübasyon işlemi ile kaybolan aktivitenin büyük bir kısmı geri kazanılabilmektedir. Enzimatik aktivitenin kaybolmasına yol açan çok daha ciddi bir problem ise enzimin maruz kaldığı çevresel koşullar nedeni ile aktif bölgede meydana gelen kovalent modifikasyonlardır. Bir enzimin aktif bölgesi ise enzimin katalitik aktivitesinden sorumlu olan ve anormal derecede reaktif olan amino asit kalıntılarını içermektedir. Fakat aktif bölgede yer alan amino asit kalıntıları, aynı zamanda kovalent modifikasyonlara karşı da oldukça duyarlıdırlar. Aktif bölgede yer alan amino asit kalıntılarının en belalısı ise sisteindir. Aktif bölgede yer alan sülfidril kalıntıları ise oksidasyona oldukça eğilimli olan iyonlaşmış formda olabilmektedirler. Normalde, hücre içerisinde iken bu grupların oksidasyona karşı korunması, hücre içeriğinin indirgeyici ortamı ve hücre içerisinde bulunun diğer sülfidril-içeren moleküller tarafından sağlanmaktadır. Sülfidril gruplarının daha yüksek bir oksijen derişimine maruz kalması durumunda ise sülfidril gruplarının akıbeti birkaç şekilde sonuçlanabilmektedir: i. Disülfid bağlarının (–S–S–) oluşması. ii. Kısmi oksidasyon ile sülfinik asit (–SOH) oluşumu. iii. Geri-dönüşümsüz olarak sülfonik asite (–SO2H) oksitlenmesi. iv. Metal iyonları ile reaksiyona girmesi. Disülfid bağlarının oluşması ise yakın çevrede başka bir sülfidril grubunun bulunmasını ve oksidasyon prosesini gerektirir. Disülfid bağlarının oluşumu ise oksijen moleküllerini aktive ederek sülfidril grupları ile kompleks oluşturmasını sağlayan divalent bir iyon sayesinde oldukça hızlandırılabilmektedir. Örnek materyal içerisindeki protein moleküllerinin sülfidril gruplarının korunması ise iki yoldan birisi ile sağlanabilir: a. Örnek materyal içerisinde bulunan bütün (ağır) metal iyonları, EDTA (0,1-0,2 mM) gibi bir şelatör yardımı ile karışımdan uzaklaştırılır. b. Örnek materyali içerisine, β-merkaptoetanol (5-20 mM) veya dithiothreitol (0,5-1 mM) gibi sülfidril-içeren ajanlar eklenebilir. Saflaştırma işlemleri, genellikle protein örneklerinin seyreltilmiş solüsyonlarının elde edilmesi ile sonuçlanır. Ne yazık ki, özellikle saflaştırılmış olan proteinlerin seyreltik solüsyonları, ya protein alt-birimlerine ayrılması nedeni ile ya da proteinlerin içinde bulundukları tüplerin yüzeylerine adsorbsiyonu nedeni ile çoğunlukla kararlı değildirler. Proteinlerin tüp yüzeylerine adsorbsiyonu, silikonlu tüplerin kullanılması ile ya da Triton X-100 veya Tween 20 gibi deterjanların düşük derişimlerinin eklenmesi ile minimuma indirilebilir. Proteinlerin alt-birimlerinin ayrılması ise gliserol (%10-40, v/v), glukoz veya sukroz ya da bazen BSA (Bovin Serum Albümin) eklenmesi ile engellenebilir. Protein solüsyonlarının 0-4 °C arasında depolanması da bu problemlerin önlenmesinde yardımcı olmaktadır. Uzun süreli depolama işlemleri ise yüksek derişimli amonyum sülfat içeren ortamlarda yapılabilir (ticari enzim preparatlarının çoğunlukla amonyum sülfat içinde temin edilmesinin nedeni de budur). 1.5.3. Proteolitik Parçalanmanın Önlenmesi Bütün proteinler, özellikle tüm hücrelerin lizozomlarında bulunan endopeptidaz ve ekzopeptidaz enzimlerinin proteolitik aktivitelerine karşı duyarlı olmakla birlikte, proteinlerin bu enzimlere karşı olan duyarlılık dereceleri proteinden proteine değişmektedir. Denatüre proteinlerin tamamının proteazlara karşı olan duyarlılıkları eşit olmasına rağmen, doğal proteinlerin proteazlara karşı olan duyarlılıkları farklılıklar göstermektedir. Bu nedenle, proteolitik parçalanmayı minimum düzeyde tutmak için gerekli önlemler, saflaştırma prosedürleri ile birlikte alınmalıdır. Bir protein preparasyonunun proteaz aktivitesi, proteolitik aktiviteye duyarlı olan bir proteinin veya hidroliz

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

9

edildiğinde, renkli ya da radyoaktif bir bileşiğin serbest kaldığı peptidin kullanılması ile belirlenebilir. Bu amaçla kullanılan azokazein, hidroliz edildiğinde küçük, boya-işaretli peptidlerin oluşmasına yol açmaktadır. Aynı amaçla 125I ile işaretli insülin B zinciri de kullanılmaktadır. Enzim saflaştırma prosedürlerinde kullanılmak amacı ile oldukça çok sayıda proteaz inhibitörleri de bulunmaktadır. Bu proteaz inhibitörlerinin her birisi ise serin proteaz, sistein proteaz, aspartik proteaz ve metalloproteazlar gibi, belli proteaz tipleri için özgüldürler. En yaygın proteaz inhibitörleri ise şunlardır: i.

Di-izopropil fosfofloridat (DPF). Bu proteaz inhibitörü, buharlaşma özelliğinde olduğu için oldukça tehlikelidir. Çünkü buharlaşan DPF molekülleri insanlarda sinir iletiminde oldukça önemli olan ve bir serin hidrolaz olan asetil kolin esteraza saldırmaktadır.

ii.

Fenil-metilsülfonil florid (PMSF) (kimotripsin, tripsin ve trombin gibi serin proteazlar ve papain gibi tiyol proteazlar için inhibitördür).

iii.

4-Aminofenil-metilsülfonil florid (APMSF) (kimotripsin, tripsin ve trombin gibi serin proteazlar için inhibitördür).

iv.

Benzamidin-HCl (kimotripsin, tripsin ve trombin gibi serin proteazlar için inhibitördür).

v.

Tosilfenilalanilklorometilketon (TFCK) (bütün serin proteazlar için inhibitördür).

vi.

İyodoasetat (sistein proteazlar için inhibitördür).

vii.

Sistatin (sistein proteazlar için inhibitördür).

viii. Pepstatin A, funguslar ve Streptomyces spp. tarafından üretilen ekstrasellüler bir polipeptiddir (pepsin, renin, katipsin D ve kimosin gibi asit ve aspartik proteazlar için inhibitördür). ix.

EDTA (aktivite için demir ve çinko gibi divalent metal iyonlarına gereksinim duyan metalloproteazlar için inhibitördür).

x.

EGTA (metalloproteazlar için inhibitördür; örneğin kalsiyum).

xi.

1,10-Fenanthrolin (metalloproteazlar için inhibitördür).

xii.

Amastatin (ekzopeptidazlar için inhibitördür).

xiii. Bestatin (ekzopeptidazlar için inhibitördür). xiv. Leupeptin (papain, plazmin ve katipsin B gibi serin ve tiyol proteazlar için inhibitördür). xv.

Aprotinin (plazmin, kallikrein, tripsin ve kimotripsin gibi serin proteazlar için inhibitördür).

Protein saflaştırma prosedürleri esnasında proteaz inhibitörlerinin kullanımı, iki yoldan birisi ile yapılabilir. Birincisinde, saflaştırma prosedürleri boyunca protein preparasyonu içerisinde inhibitörün etkili bir derişimi bulundurulabilir. Bu durumda, amonyum sülfat ile çöktürme ile jel filtrasyonu gibi bazı saflaştırma tekniklerinin kaçınılmaz olarak inhibitörü, saflaştırılmakta olan proteinden ayıracağı da göz önünde bulundurulmalıdır. İkinci alternatif yol ise, başlangıçtaki ham protein preparatından proteazların seçici olarak uzaklaştırılmasıdır. Bu ise en iyi şekilde inhibitör(ler)ün tutuklanmış ligand olarak kullanıldığı affinite kromatografisi ile başarılabilir. 1.6. Proteinlerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) Her türlü protein saflaştırma protokolünün ilk adımı, hedef proteinin kaynak organizmadan özütlenmesini (ekstraksiyonunu) içerir. Ekstraksiyon prosesinin kompleksliği ise büyük bir oranda, hedef proteinin intrasellüler mi yoksa ekstrasellüler mi olduğuna bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle, saflaştırılmak istenen proteinin çözünmüş formunu da içermesi gereken özütün elde edilmesi için kullanılacak prosedür, istenilen proteinin hücresel lokalizasyonuna bağlı olarak belirlenir. Mikroorganizmaların fermentasyonu veya hayvan hücre kültürleri ile üretilen proteinlerin çoğu kültür ortamına salınmaktadırlar. Dolayısıyla, fermantasyon sıvısında, kültür sıvısında veya

10

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

serumda bulunan ekstrasellüler proteinler, santrifüj veya filtrasyon yöntemi ile katı materyallerden ve hücrelerden kolayca ayrılabilir. Bu durumda hedef protein, hücrelerden ve katı materyallerden arındırılmış olan süzüntü veya filtrat içerisinde, genellikle oldukça seyreltik olarak bulunmaktadır. Mikrobiyal hücrelerden intrasellüler proteinlerin özütlenmesi gerektiği durumlarda, öncelikle fermentasyon sıvısından mikrobiyal hücrelerin toplanması gerekir. Fermentasyon sıvısından toplanan mikrobiyal hücreler daha sonra, daha yoğun bir hücre süspansiyonu oluşturacak şekilde uygun bir tampon veya su içerisinde yeniden süspanse edilirler. Mikrobiyal hücrelerin yeniden süspanse edilmesi ise genellikle basit bir karıştırma ile sağlanabilmesine rağmen, bazı durumlarda çok daha şiddetli mekanik bir karıştırma işleminin uygulanması gerekebilir. Mikrobiyal hücrelerin orijinal fermentasyon sıvısına oranla daha küçük bir hacim içerisinde yeniden süspanse edilmesi ise bu hücrelerin parçalanması sonucunda elde edilen homojenizatlardan elde edilecek olan protein özütlerinin, daha sonraki saflaştırma prosedürleri esnasında daha kolay kullanılmasına yardımcı olacaktır. Bitki ve hayvan dokularından elde edilen proteinler ise doğal olarak, genellikle intrasellüler kökenlidirler. Bu nedenle, bitki ve hayvan dokusu kaynaklı intrasellüler hücre özütlerinin hazırlanması da öncelikle, uygun bitki ve hayvan dokularının toplanmasını gerektirmektedir. Örneğin, folikül stimüle edici hormon (FSH) ve luteinizing hormon (LH)’ların saflaştırılmak istenmesi durumunda hipofiz bezinin, kan proteinlerinin çalışılması durumunda kan dokusunun veya karaciğer ve böbreklerde buluna enzimlerin ve diğer proteinlerin çalışılması durumunda ise bu organların toplanması gerekmektedir. Şayet saflaştırma işlemine, protein özütlerinin hazırlanmasından hemen sonra başlanmayacaksa, protein özütleri dondurularak saklanmalıdır. İntrasellüler proteinler ve ökaryotların organellerinde bulunan proteinler de hücre parçalama yöntemleri ile özütlenebilir. Hedef proteinin elde edileceği kaynağa bağlı olarak, çeşitli hücre ve doku parçalama teknikleri bulunmaktadır (bkz. Tablo 1.2). Organel proteinlerinin saflaştırılması gereken durumlarda ise organellerin parçalanmadan önce hücrelerden intakt olarak izole edilmesi ve daha sonra izole edilen intakt organellerden protein özütlerinin elde edilmesi daha avantajlıdır. Böylece hazırlanmış olan organel özütü içerisinde, hücre sitoplazmasından ve diğer organellerin parçalanması sonucunda serbest kalan kirleticilerin sayısı da azaltılmış olacaktır. Tablo 1.2: Farklı dokuların ve hücrelerin parçalanması için kullanılan teknikler. Hücre liziz metodu

Doku tipi

Bıçakla homojenizasyon

Hayvan ve bitki dokularının çoğu

Elle (Dounce) homojenizasyon

Yumuşak hayvan dokuları

Sonikasyon

Hücre süspansiyonları

French basınç çemberi

Bakteri, maya ve bitki hücreleri

Öğütme (alemimyun veya kum)

Bakteri ve bitki hücreleri

Cam küre ile vorteksleme

Hücre süspansiyonları

Enzimatik parçalama

Bakteriler ve mayalar

Deterjanla liziz

Doku kültür hücreleri

Organik çözücüyle liziz

Bakteriler ve mayalar

Ozmotik şok

Eritrositler ve bakteriler

Dondurma-çözündürme

Kararlı proteinler

Protein özütlerinin hazırlanmasında en çok problemle karşılaşılan özütleme işlemi ise membrana-bağlı proteinlerin ekstraksiyonudur. Çünkü, membrana-bağlı proteinler basit hücre

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

11

parçalama teknikleri ile elde edilemezler. Bu tip proteinler fosfolipidler ile ilişkili olduklarından, proteinlerin özütlenebilmesi için öncelikle lipid-protein komplekslerinin ayrılması gerekmektedir. Sadece membran yüzeyine bağlı olan ekstrinsik membran proteinlerinin serbest bırakılması, genellikle ya 1 M NaCl ile iyonik derişimin artırılması ya da dondurma-çözündürme ile sağlanabilmektedir. Membran içerisine gömülü olan intrinsik membran proteinlerinin serbest bırakılması ise en iyi şekilde ya SDS gibi bir deterjan ile ya da bütanol gibi bir organik çözücü ile muamele edilerek başarılmaktadır. Bu yöntemlerin hepsinde de proteinlerin denatürasyonunu ve proteolizizini minimum düzeye indirgemek için gerekli önlemler alınmalıdır. İntrasellüler proteinlerin elde edilmesi amacı ile hazırlanan hücre homojenizatlarından, ham protein özütlerinin hazırlanması için homojenizat içerisinde kalmış olan intakt hücreler ve hücre kalıntılarının uzaklaştırılması ise santrifügasyon ya da seçici-geçirgen membranlardan filtre edilerek sağlanabilir. Bu teknikler aynı zamanda, hücre kültür ortamlarından hücrelerin uzaklaştırılarak ekstrasellüler protein özütlerinin elde edilmesinde de kullanılmaktadır. 1.6.1. Nükleik Asitler ve Lipitlerin Uzaklaştırılması Bazı durumlarda, saflaştırma işlemine başlamadan önce protein özütleri içerisindeki nükleik asitlerin uzaklaştırılması veya parçalanması gerekli olabilir. Hücre homojenizatlarından protein özütlerinin hazırlanması sırasında serbest kalan oldukça fazla miktardaki nükleik asitler, genellikle özütün viskozitesini artırmaktadır. Özütün viskozitesinin yüksek olması ise özellikle endüstriyel uygulamalarda, örnek materyalin prosesini zorlaştırmaktadır. Nükleik asit içeriği nedeni ile viskozitesi oldukça yüksek olan hücre homojenizatlarından, hücre ve hücre kalıntılarının uzaklaştırılması sırasında bazı ilave tedbirlerin alınması gerekmektedir. Örneğin, böyle viskoz bir homojenizattan hücre kalıntılarının uzaklaştırılması, daha yüksek bir santrifüj kuvvetinde ve daha uzun bir periyotta sağlanabilir. Şayet hücre ve hücre kalıntılarının temizlenmesi için bir filtrasyon sistemi kullanılıyorsa, nükleik asitler nedeni ile meydana gelen aşırı viskozite hem sistemin akış oranını hem de performansını olumsuz yönde etkileyecektir. Homojenizasyon sırasında nükleik asitlerin serbest bırakılması nedeni ile viskozitede meydana gelen artış ise daha çok prokaryot hücre homojenizatlarında görülmektedir. Çünkü prokaryotların DNA’ları, ökaryotlarda olduğu gibi bir membran içerisinde (çekirdek zarı) değil de sitoplazma içerisinde serbest olarak bulunmaktadırlar. Saflaştırma prosedürlerinin hepsinde nükleik asitlerin protein özütlerinden uzaklaştırılması için özgül bir adımın kullanılmasına gerek yoktur. Böyle bir adımın kullanılması ya da kullanılmaması, nükleik asitlerden kaynaklanan viskozite artışının ölçüsüne ve saflaştırma işlemleri sonucunda elde edilecek olan protein ürününün ne amaçla kullanılacağına bağlıdır. Örneğin, terapötik amaçlı kullanılacak olan bir proteinin saflaştırılması durumunda, protein özütlerinden nükleik asitlerin tamamı ile uzaklaştırılması çok önemlidir. Proteinlerin saflaştırılması sırasında, protein özütlerinde bulunan nükleik asitlerin etkili bir şekilde uzaklaştırılması ise çöktürme veya nükleazların kullanılması ile enzimatik olarak başarılabilir. Nükleik asitlerin net yükleri negatif olduğundan, ekstraksiyon solüsyonlarındaki DNA ve RNA moleküllerinin uzaklaştırılması, uzun-zincirli katyonik bir polimer olan polietilenimin ile sağlanabilmektedir. Polietilenimin, nükleik asitlerle çözünmeyen kompleksler oluşturduklarından dolayı, santrifüjleme veya filtrasyon esnasında diğer hücre kalıntıları ile birlikte ekstraksiyon solüsyonlarından ayrılabilirler. Terapötik amaçlı kullanılacak olan proteinlerin saflaştırılması sırasında ise nükleik asitlerin uzaklaştırılması için polietilenimin kullanılması önerilmemektedir. Bunun edeni ise polietilenimin kullanılan preparasyonlarda, bulunması muhtemel olan çok küçük miktardaki reaksiyona girmemiş polietilenimin monomerleridir. Çünkü bu monomerler kanserojenik olabilirler. Böyle bir durumda şayet polietilenimin kullanılmışsa, daha sonraki saflaştırma

12

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

prosedürleri sırasında protein solüsyonlarından polietilenimin polimerlerinin ve monomerlerinin etkili bir şekilde ve tamamen uzaklaştırıldığının gösterilmesi gerekmektedir. Protein özütlerinden nükleik asitlerin uzaklaştırılması, bu polimerlerin parçalanmasını katalizleyen nükleaz enzimleri ile de başarılabilmektedir. Gerçekte ise protein saflaştırma prosedürleri sırasında, protein özütlerinden nükleik asitlerin uzaklaştırılmasında nükleazların kullanılması, oldukça popüler bir metot haline gelmiştir. Bunun nedenleri ise metodun verimliliği ve ucuzluğunun yanı sıra, diğer kimyasal çöktürücülerin (presipitantların) çoğundan farklı olarak nükleaz preparasyonlarının zararsız olması ve son-ürün olan protein üzerine olumsuz bir etkisinin bulunmamasıdır. Bazı hücre ve doku tipleri ise (özellikle hayvansal orijinli olanlar) oldukça önemli bir miktarda lipit içermektedirler. Bu nedenle, bir protein özütündeki lipit tabakasının saflaştırma işlemine başlanmadan önce uzaklaştırılması, (i) bir kirletici olması ve (ii) daha sonraki saflaştırma işlemlerini olumsuz olarak etkileyebileceği (örneğin, kromatografi kolonunun tıkanmasına yol açarak) nedeni ile gereklidir. Ham protein özütlerindeki lipit tabakalarının uzaklaştırılması ise solüsyonun, cam yününden veya gözenek çapı oldukça küçük olan bir bezden geçirilmesi ile sağlanabilir. 1.7. Ön-fraksiyonlama Prosedürleri ve Yoğunlaştırma Protein saflaştırma prosedürlerinin çoğunun ilk aşamalarında, hedef protein oldukça seyreltik olarak bulunmaktadır. Bu nedenle, oldukça fazla hacimlerdeki örnek materyalleri ile çalışılmak durumundadır. Bu durum, özellikle mikrobiyal fermentasyon sıvıları veya hayvan hücre kültür sıvıları içerisine salgılanan proteinlerle çalışıldığında doğrudur. Bu nedenle, seyreltik protein özütlerinin daha sonraki saflaştırma aşamalarında rahat bir şekilde kullanılabilmesi için yoğunlaştırılması gerekmektedir. Kompleks, heterojen bir karışım içerisindeki herhangi bir proteini yoğunlaştırmaya yarayan birkaç prosedür bulunmaktadır. Bu prosedürler, göreceli olarak ucuz, çabuk ve basit olarak herhangi bir proteinin derişimini, kirletici proteinlerden de kısmen ayırarak (kısmi bir saflaştırma sağlayarak) sağlamaktadırlar. Bu prosedürler iyi birer metot olmalarına rağmen, ne yazık ki bu prosedürlerin kullanımı ile ilgili genel bir kural bulunmamaktadır. Bir protein için ideal olan bir prosedür basamakları, başka bir protein için başarısız olabilir, hatta o proteinin denatürasyonuna yol açabilir. Bu ise proteinlerin yapılarındaki ve dolayısı ile kararlılıklarındaki küçük, fakat önemli olan farklılıkların bir sonucudur. Bu nedenle, pratikte başarılı bir protokolün geliştirilmesi denemeyanılma yoluyla elde edilebilir. Deneme-yanılma ile başarılı bir protokolün geliştirilmesi için ise çok sayıda küçük-ölçekli pilot uygulamaların yapılması gerekmektedir. Pilot uygulamaların başarısı ise hem saflaştırılmak istenen hedef enzimin aktivitesinin belirlenmesi için hem de toplam protein miktarının belirlenmesi için özgül ve duyarlı metotların bulunmasına bağlıdır. Daha önce de bahsedilmiş olan nedenlerden dolayı, yüksek kapasiteli prosedürler saflaştırma protokolünün ilk aşamalarında uygulanırken, düşük kapasiteli prosedürler protokolün son aşamalarında uygulanır. Her bir fraksiyonlama işlemi, karışım içerisinde bulunan proteinleri bir seri fraksiyonlara ayırır. Bu fraksiyonların her birisi ise hem saflaştırılmakta olan enzim aktivitesinin ünitesi bakımından hem de toplam protein miktarı bakımından test edilir. Başarılı bir fraksiyonlama, bir fraksiyonun yüksek özgül (spesifik) aktivitesi ve dolayısı ile saflaştırma-misli ve yüksek verimi ile belirlenir: Verim =

Fraksiyon içerisindeki enzim miktarı (ünitesi) Orijinal preparasyondaki enzim miktarı (ünitesi)

Saflaştırma-misli =

(1.1)

Fraksiyonun özgül aktivitesi Orijinal preparasyonun özgül aktivitesi

(1.2)

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

13

Bir fraksiyon içerisinde bulunan enzim miktarı, bu enzimin kütlesel birimi ya da mol’ü olarak değil de, bu enzim tarafından katalizlenen reaksiyonun hız birimi (ünitesi) ile ifade edilir. Bir enzim ünitesi (U) ise tanımlanmış koşullar altında (optimum pH, ısı, substrat derişimi v.s) 1 dakikada, 1 μmol substratı ürüne dönüştüren (veya 1 μmol ürün oluşmasını sağlayan) enzim miktarı olarak tanımlanmaktadır. Enzim aktivitesinin uluslararası ölçeklendirme birimine göre tanımlanması ise, tanımlanmış koşullar altında 1 saniyede, 1 mol substratı ürüne dönüştüren enzim miktarı şeklindedir. Bu tanımlamanın birimi ise katal (kat) olarak verilmektedir ve 1 kat = 6 x 107 U ve 1 U = 1,7 x 10-8 kat’dır. Özellikle substratları, göreceli moleküler kütleleri bilinmeyen makromoleküller olan bazı enzimler için (amilaz, pepsin, RNaz, ve DNaz gibi) bu enzim ünitelerinin her ikisi de (ne U ne de kat) kullanılamamaktadır. Böyle durumlarda ise genellikle, substratın fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki gözlenebilir değişiklikler dikkate alınarak, enzimatik aktivitenin ünitesi keyfi olarak tanımlanır. Bir fraksiyondaki enzimin saflığı ise o enzimin özgül aktivitesi ile tanımlanır. Özgül aktivite ise eşitlik 1.3’de verildiği gibi, bir preparasyondaki toplam enzim aktivitesinin, o fraksiyondaki toplam protein miktarına oranı ile tanımlanır: Özgül aktivite =

Fraksiyondaki toplam enzim aktivitesi Fraksiyondaki toplam protein miktarı

(1.3)

Bir enzimin ünitesinin ölçülmesi, kesin temel kinetik kavramların varlığına ve uygun bir analitik prosedürün bulunmasına bağlıdır. Proteinlerin, özütleme ve saflaştırma prosedürleri esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile denatürasyona neden olan faktörlere karşı olan duyarlılıkları ise farklılık göstermektedir. Özellikle sıcaklığa (<40 °C), deterjanlara, ağır metallere ve uç noktalardaki pH koşullarına karşı proteinlerin duyarlılığı oldukça farklıdır (bkz. kısım 1.5). Proteinlerin bu faktörlere karşı olan farklı duyarlılıkları ise proteinlerin saflaştırılmasında kullanılabilmektedir. Özellikle saflaştırma prosedürlerinin ilk aşamalarında, bu farklılıklardan yararlanmaya dayanan saflaştırma teknikleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğal proteinlerin çözünme özellikleri ise özellikle çözücünün pH’sı tarafından etkilenmektedir (bir proteinin çözünme özelliği, o proteinin izoelektrik noktasında minimumdur). Bu nedenle düşük sıcaklıkta, çözücü ortama amonyum sülfat gibi tuzların veya aseton ve bütanol gibi organik çözücülerin eklenmesi, proteinlerin çözünürlüğünü düşürmektedir. Proteinlerin bu özelliklerinin çok küçük farklılıklarından dahi fraksiyonlama ve saflaştırma prosedürlerinde yararlanılmaktadır. Merkaptoetanol, glutatyon (indirgenmiş formu) ve ditiothreitol gibi kükürt içeren bileşikler ise genellikle, sülfidril gruplarının oksidasyonunu önlemek amacı ile ham protein preparatlarına katılmaktadır (bkz. kısım 1.5.2). Çünkü denatürasyonun başlamasına yol açan sülfidril gruplarının oksidasyonu, ham protein preparatlarının elde edildiği hücrelerin parçalanmasını takiben hemen meydana gelebilmektedir. Laboratuvar-ölçekli çalışmalarda, protein özütlerinin yoğunlaştırılmasında fraksiyonlanmasında kullanılan en yaygın metotlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i.

Çöktürme (tuz, organik çözücü, v.b).

ii. Ultrafiltrasyon. iii. İyon değiş-tokuş kromatografisi. iv. Diafiltrasyon. v. Liyofilizasyon (sıvının vakum altında uzaklaştırılması). vi. Kuru formdaki Sephadex G-25 ilavesi.

ve

14

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

1.7.1. Çöktürme (Presipitasyon) Ham protein özütlerinden hedef proteinin çökelmesi sağlanarak fraksiyonlanması, nötral tuzlar, organik çözücüler ve yüksek moleküler kütleli polimerler gibi ajanlar kullanılarak veya protein solüsyonunun pH’sının ya da sıcaklığının belirli bir değere ayarlanması ile başarılabilir. Çökelmesi sağlanan proteinler ise orijinal protein özütlerinden genellikle santrifügasyon veya filtrasyon metodu ile uzaklaştırılarak, daha küçük hacimdeki taze tamponlar içinde yeniden çözündürülürler. Böylece, hem proteinlerin fraksiyonlanması hem de aynı zamanda yoğunlaştırılması birlikte sağlanmış olur. Bu amaçla kullanılan yöntemler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Tuz ile fraksiyonlama: Protein solüsyonlarına küçük miktarlarda nötral tuzların eklenmesi, genellikle solüsyon içerisindeki proteinlerin çözünürlüğünü artırır (salting-in). Buna rağmen, protein solüsyonları içerisindeki nötral tuz derişiminin optimal bir düzeyi aşması durumunda ise solüsyon içerisindeki proteinlerin kararsızlıklarına yol açarak, bu proteinlerin çökelmesine neden olmaktadır. Bu nedenle, tuz ile fraksiyonlamada uygun bir tuz, ekstraksiyon solüsyonuna adım adım (kademeli olarak) eklenir. Pratikte ise su içerisinde oldukça çözünür olması, yüksek saflıkta temin edilebilir olması, ucuz olması ve proteinlerin yapıları üzerinde yıkıcı etkilerinin bulunmaması, hatta bazı proteinlerin kararlılığını olumlu yönde etkilemesi nedeniyle, amonyum sülfat en çok kullanılan tuzdur. Protein solüsyonuna her tuz ekleme işleminden sonra, eklenen tuzun tamamı ile eridiğinden ve homojen bir solüsyon oluşturduğundan emin olunmalıdır. Tuz eklenmesinden sonra çökelen proteinler ise santrifügasyon yöntemi ile uzaklaştırılarak, taze tampon içerisinde yeniden çözündürülürler ve toplam protein miktarı ve enzim aktivitesi için test edilirler. Tuz ile fraksiyonlama işleminin her aşaması, protein denatürasyonunu minimumda tutmak için 0-10 °C arasında gerçekleştirilir. Özgül bir proteinin çökelmesi (salting-out), normalde amonyum sülfat derişiminin dar bir aralığında gerçekleşmektedir. Bunun anlamı ise bir protein solüsyonuna amonyum sülfatın kademeli olarak eklenmesi durumunda, her hangi bir proteinin bu çözelti içinde oluşturduğu protein-protein agregasyonu, aniden protein-su ve protein-tuz etkileşimlerinden (interaksiyonlarından) daha baskın hale gelir. Bunun nedeni ise çözeltiye eklenen amonyum sülfatın, bir proteinin yüzeyinde bulunan hidrofobik grupları saran su tabakasını uzaklaştırması ve su tabakası uzaklaşan hidrofobik grupların ise protein agregasyonuna ve sonuçta proteinin çökelmesine neden olmasıdır. Bu nedenle, bir proteinin hidrofobik gruplara sahip olması, çöktürmenin temelini oluşturmaktadır. Bu tip gruplara sahip olmayan proteinler ise amonyum sülfat ile çöktürülemezler. Amonyum sülfat ile fraksiyonlamanın başarılı bir sonucu ise Şekil 1.2’de gösterilmektedir. Belirli bir derişimin elde edilebilmesi için 0 °C’da 1 L protein özütüne eklenmesi gereken amonyum sülfat miktarının (gram, g) hesaplanmasında kullanılan formül ise eşitlik 1.4’de verilmektedir (bkz. Ek-1): 515 (S2 -S1) g=

100 - 0,27 S1

(1.4)

Eşitlik 1.4’de ise S1, amonyum sülfatın başlangıç derişimi; S2, son derişimdir. Bu formülde, solüsyona amonyum sülfat eklenmesi nedeni ile hacimde meydana gelen değişiklik de dikkate alınmıştır. ii. Organik çözücüler ile fraksiyonlama: Organik çözücüler ile fraksiyonlamanın temeli, etanol, aseton, dietileter, isopropanol ve bütanol gibi organik çözücülerin sulu solüsyonları içinde, proteinlerin farklı oranlarda çözünmesine dayanmaktadır. Organik çözücüler bir ortamın dielektrik yükünü düşürdüklerinden, yüklü protein molekülleri arasındaki ilgiyi artırırlarken proteinlerin su ile olan etkileşimlerini azaltırlar. Bu nedenle, organik bir çözücü içerisindeki proteinin çözünürlüğü azalmaktadır.

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

15

Şekil 1.2: Bir enzim preparasyonunun amonyum sülfat ile fraksiyonlanması.

Organik çözücü ile fraksiyonlamanın temel prensibi, amonyum sülfat ile fraksiyonlamanın temel prensibinin tersidir. Organik çözücü ile fraksiyonlamada, bir proteindeki hidrofobik gruplar organik çözücü molekülleri tarafından korunmakta ve iyonik gruplar baskın (dominant) hale gelmektedir. Amonyum sülfat ile fraksiyonlamada ise amonyum sülfat derişimine paralel olarak, hidrofobik grupların açığa çıkması sağlanmaktadır. Sulu organik çözücüler, çökelmenin yanı sıra denatürasyona da neden olabileceği için bu fraksiyonlama prosedürü -10 ile -20 °C arasında gerçekleştirilmek zorundadır ve her bir fraksiyonun sıcaklığı oda ısısına ulaşmadan önce taze tampon içerisinde yeniden çözündürülmelidir. Ne yazık ki, bu tip önlemler dahi bazı denatürasyonların önüne geçememekte ve bunun sonucu olarak da organik çözücü ile fraksiyonlama, amonyum sülfat ile fraksiyonlamadan farklı olarak proteinlerin biyolojik aktivitelerinin kaybı ile sonuçlanmaktadır. Organik çözücüler ile fraksiyonlamada uygulanan prosedür, amonyum sülfat ile fraksiyonlamada uygulanan prosedüre benzemektedir. Protein solüsyonunun 1 L’sine eklenecek olan organik çözücünün hacmi (V) ise eşitlik 1.5 ile hesaplanır: 1000 - (P2 -P1) V=

(1.5)

100 - P2

Eşitlik 1.5’de ise P1, organik çözücünün başlangıç yüzdesi; P2 ise istenilen organik çözücü yüzdesidir. Organik çözücüler ile fraksiyonlamanın, amonyum sülfat ile fraksiyonlamaya göre pratik avantajlarından birisi ise organik çözücünün protein solüsyonuna eklenmesi nedeni ile meydana gelen yoğunluk değişiminin, protein çökeltilerinin kolayca dibe birikmesine neden olmasıdır. iii. Organik polimerler ile fraksiyonlama: Organik polimerler ile fraksiyonlama, organik çözücüler ile fraksiyonlamaya benzemektedir. Fakat, protein çökelmesinin sağlanması için organik polimerlerin daha düşük derişimlerde kullanılması gerekmektedir. Çünkü, protein solüsyonuna organik bir polimerin eklenmesi, solüsyonun viskozitesini oldukça artırmakta ve bunun sonucunda da çökelen proteinlerin solüsyondan geri kazanımı oldukça zor olmaktadır. Çökelen proteinler ise normal olarak, santrifügasyon veya filtrasyon yöntemi ile ayrılabilmektedir. Bu amaçla en sık kullanılan polimerler ise göreceli moleküler kütleleri 6-20 kDa arasında olan, iyonik-olmayan polietilen glikol (PEG)’dür. Maksimum protein çökeltmesi ise genellikle son derişimi %30 olan PEG ile başarılmaktadır.

16

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

iv. Denatürasyon fraksiyonlaması: Denatürasyon fraksiyonlamasında proteinlerin ısıya karşı olan duyarlılıklarının farklılığından yararlanılır. Saflaştırılacak olan proteinin denatüre olduğu sıcaklık tespiti, küçük-çaplı ön deneylerle belirlenebilir. Saflaştırılmak istenen proteinin denatürasyon sıcaklığı belirlendikten sonra, ısıya daha duyarlı olan kirletici proteinlerin elemine edilmesi için protein karışımı, hedef proteinin kritik denatürasyon derecesinin 5-10 °C altındaki bir sıcaklıkta 15-30 dakika ısıtılır. Denatüre olan ve protein karışımında bulunması istenmeyen kirletici proteinler ise santrifüjleme ile uzaklaştırılabilir. Bir enzimin substratının, ürününün veya kompetitif inhibitörünün enzim ile birlikte bulunması, çoğunlukla enzimin kararlılığını sağlamakta ve enzimin normaldekinden daha yüksek sıcaklıklarda denatüre olmasına yol açmaktadır. Benzer şekilde, farklı proteinlerin denatürasyonları uç noktalardaki pH (<3 ve >10) değerlerinde de farklılıklar göstermektedirler. Araştırılmakta olan proteinin aşırı pH koşullarına karşı olan duyarlılığı, yine küçük-çaplı denemelerle belirlenebilir. İstenilen proteinin çökeltilmesi için kritik pH derecesi belirlendikten sonra, bütün protein özütünün pH’sı, bu kritik pH’nın 1 pH biriminden az olmayacak şekilde ayarlanır. Uygulanan pH’ya çok daha duyarlı olan kirletici proteinler, bu pH değerinde çökeleceklerinden, ekstraksiyon çözeltisinin santrifüjlenmesi ile bunlar uzaklaştırılabilir. v. İzoelektrik çökeltme ile fraksiyonlama: Bu tip fraksiyonlamanın temelini ise proteinlerin kendi izoelektrik noktalarında minimum çözünürlüğe sahip olmaları oluşturmaktadır. Bir proteinin izoelektrik noktasının eşit olduğu pH’da, bu proteinin taşımakta olduğu pozitif ve negatif elektriksel yüklerin sayısı birbirine eşittir ve bu nedenle, moleküller arası itme minimum düzeyde iken molekül içi etkileşimler maksimum düzeydedir. Moleküller arası itmenin minimum, molekül içi etkileşimlerin maksimum düzeyde olması ise çözünmeyen protein agregatlarının oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu tekniğin uygulaması ise iki yoldan birisi ile yapılabilir: a. Birincisinde, protein çözeltisinin pH’sı, özütten uzaklaştırılmak istenen kirletici proteinlerin çökelmesine neden olacak şekilde ayarlanırken, saflaştırılmak istenen hedef proteinin çökelmesi önlenmelidir. b. İkincisinde ise protein özütünün pH’sı, saflaştırılmak istenen hedef proteinin izoelektrik noktasına (pI) göre ayarlanarak, hedef proteinin çökelmesi sağlanırken kirleticilerin çökelmesi önlenmelidir. Pratikte ise çökelen proteinin ister istemez denatüre olması nedeni ile daha çok birinci yöntem tercih edilmektedir. vi. İmmünopresipitasyon: İmmünopresipitasyon yönteminde özgül bir proteine karşı geliştirilmiş olan antikorların kullanılması gerekmektedir. Bu metodun uygulanması ise 3 adımda gerçekleştirilmektedir: a. Birinci adımda, hedef proteine özgül olarak bağlanan antikorlar, ham hücre özütlerine ilave edilerek hedef proteinler ile antikorların kompleks (protein-antikor) oluşturması sağlanır. b. İkinci adımda ise protein-antikor kompleksinin kütlesini artırarak, hücre özütünden çökeltmenin kolayca sağlanabilmesi için karışıma kimyasal olarak fiske edilmiş olan Staphylococcus aureus hücreleri ilave edilir. S. aureus hücreleri ise protein-A aracılığı ile antikorların Fc fragmentleri ile kompleks oluşturarak, protein-antikor-bakteri komplekslerinin kütlelerinin artmasını sağlar. S. aureus hücreleri yerine alternatif olarak, bu bakteriden izole edilen protein-A moleküllerinin Sepharose gibi matrikslere kovalent olarak bağlanması ile elde edilen (tutuklu protein-A) katı matriksler de kullanılabilir (bkz. kısım 8.7.6.1). Sepharose-protein-A matriksi, ham hücre özütlerinden protein-antikor komplekslerinin ayrılmasında kullanılır. c. Son adımda ise S. aureus hücreleri kullanılmış ise kütlesi artırılmış olan kompleksler santrifügasyon yöntemi ile şayet, Sepharose-protein-A matriksi kullanılmış ise yıkama işlemi ile

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

17

hücre kalıntılarının ve antikorlara özgül olarak bağlanmayan proteinlerin uzaklaştırılması ile hedef proteinlerin elde edilmesi sağlanır. S. aureus hücreleri ise kimyasal olarak fiske edildikten sonra, immünopresipitasyon amacı ile kullanılmadan önce yıkanmalıdır. Yıkama işlemi ile hasarlı hücrelerin veya zayıf olarak fiske edilmiş olan hücrelerin uzaklaştırılması sağlanır. Şayet Sepharose-protein-A matriksi kullanılacaksa, matriks kullanılmadan önce üretici firmanın talimatları doğrultusunda şişirilmelidir (bkz. kısım 5.7.1). 1.7.2. Ultrafiltrasyon Hem laboratuvar hem de endüstriyel-ölçekli uygulamalarda, protein solüsyonlarının hızlı ve güvenli bir şekilde yoğunlaştırılmasında kullanılan diğer bir metot ise ultrafiltrasyondur (Şekil 1.3). Fermentasyon sıvılarından veya hücre kültür sıvılarından, hücrelerin ve hücre kalıntılarının filtrasyonunda kullanılan filtrelerin gözenek çapları, genellikle 1-10 μm aralığındadır. Bu tipteki filtreler, hücre ve büyük katı materyallerin sıvılardan ayrılmasını sağladıkları halde, protein gibi makromoleküllerin ayrılmasında yetersiz kalmaktadırlar. Bu nedenle, ultrafiltrasyonda kullanılan ultrafiltrelerin gözenek çapları ise genellikle 1-20 nm arasında değişmektedir. Bu tipteki ultrafiltreler ise küçük moleküler kütleli protein moleküllerini dahi sıvılardan ayrıştırma kapasitesine sahiptirler. Ticari olarak bulunan ultrafiltrelerin gözenek çapları ise 1-300 kDa arasındaki molekülleri tutma kapasitesindedirler. Protein özütlerinin yoğunlaştırılmasında ve özüt içindeki küçük kirleticilerin uzaklaştırılarak kısmen saflaştırılmasında kullanılan ultrafiltrelerin moleküler kütle seçicilikleri ise genellikle 3, 10, 30, 50 ve 100 kDa’dur.

Şekil 1.3: Laboratuvar-ölçekli yoğunlaştırma ve moleküler ayrıştırma amacı ile kullanılan farklı hacimlerdeki ultrafiltrasyon hazneleri.

Ultrafiltreler, geleneksel olarak selüloz asetat veya selüloz nitrattan imal edilmiş olsalar da son zamanlarda, polivinil klorid ve polikarbonat gibi materyallerden yapılmış ultrafiltreler de ticari olarak bulunmaktadır. Polivinil klorid ve polikarbonat gibi plastik-temelli ultrafiltreler ise selüloztemelli olanlara oranla, daha iyi fiziksel ve kimyasal kararlılığa sahiptirler. Ultrafiltrelerin yapımında kullanılan materyallerde aranan önemli özelliklerden birisi, bu materyallerin protein adsorblama özelliklerinin oldukça düşük olma zorunluluğudur. Burada vurgulanması gereken önemli bir özellik ise, ultrafiltrelerin yapımında kullanılan materyal ne olursa olsun bu filtrelerin gözenek çapları

18

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

uniform değildir. Bu filtrelerde, ortalama gözenek çapından oldukça büyük sapma gösteren gözenekler de bulunmaktadır. Bu tipteki filtreler için belirtilen moleküler kütle seçicilik sınırları ise gözenek çaplarının nominal dağılımına uygun olarak belirtilmektedir. Bu nedenle, protein özütlerinin yoğunlaştırılmasında kullanılan ultrafiltrelerin moleküler kütle seçicilik sınırları, hedef proteinin moleküler kütlesinin 5 kDa veya daha da altında olacak şekilde seçilmelidir. Bu arada, ultrafiltrelerin moleküler kütle seçicilik sınırlarının globüler proteinlere göre belirlenmiş olduğunu, bu nedenle, hedef proteinin şeklinin ultrafiltrasyon özelliklerini etkileyebileceğini de unutmamak gerekmektedir. Dolayısıyla, hedef proteinin globüler yapısını kaybederek uzaması veya özellikle glikolizasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar da proteinin ultrafiltrasyon özelliklerini etkilemektedir. Laboratuvar-ölçekli bir çalışmada ise ultrafiltrasyon genellikle, ticari olarak değişik hacimleri bulunan (3, 10, 50, 200, 400 mL) manyetik karıştırmalı hazneler ile gerçekleştirilmektedir (bkz. Şekil 1.3). Ultrafiltrasyon haznesi, Şekil 1.4’de gösterildiği gibi birleştirildikten sonra, yoğunlaştırılacak protein solüsyonu hazne içine transfer edilir. Örnek solüsyonunu içeren hazneye bir gaz basıncının (genellikle azot) uygulanması ise membrandan yeterli bir akışın sağlanması için yeterlidir. Yoğunlaştırma işlemi süresince karıştırma işlemine devam edilmesi ise membran yüzeyinde makromoleküllerin bir tabaka oluşturmasını (kek) önleyerek, ultrafiltrenin gözeneklerinin açık kalmasını sağlamakta ve aynı zamanda, moleküllerin sıvı içerisinde homojen olarak dağılmasına yardımcı olarak akış oranının zamana bağlı olarak belirgin bir şekilde düşmesini engellemektedir. Ultrafiltrasyon, hem kullanılmakta olan ultrafiltrenin moleküler kütle seçicilik sınırından küçük olan moleküllerin (örneğin, su, tuzlar ve küçük moleküler kütleli bileşikler) filtreden geçişine izin vererek kısmi bir saflaştırma yapılmasını, hem de protein solüsyonunun yoğunlaştırılmasını sağlamaktadır. Bu nedenle ultrafiltrasyon, bir kromatografik işlem sonucunda elde edilen seyreltik fraksiyonların yoğunlaştırılmasında veya iyon-değiş tokuş kromatografisi sonucunda elde edilen fraksiyonlardan tuzların uzaklaştırılmasında veya tamponların değiştirilmesinde de kullanılabilmektedir.

Şekil 1.4: Bir ultrafiltrasyon haznesini oluşturan parçalar: 1, hazne kapağı; 2. hazne; 3, membran desteği; 4, hazne tabanı; 5, güvenlik haznesi; 6, karıştırma aparatı; 7, kapak contası; 8, membran destek contası; 9, basınçlı gaz giriş aparatları; 10, silikon tüp.

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

19

Özellikle örnek miktarının çok küçük olduğu durumlarda ise normal ultrafiltrasyon ünitelerinden farklı olarak daha küçük hacimli (1-2 mL) ve tek-kullanımlık (dispozubıl) olan ultrafiltrasyon tüpleri de mevcuttur. Bu tüplerde yer alan ultrafiltrasyon membranlarının moleküler kütle seçicilikleri de normal ultrafiltrasyon ünitelerinde olduğu gibi değişik olabilmektedir. Bu tüpler ile örnek materyallerinin yoğunlaştırılması veya örnekten tuzların uzaklaştırılması ve tampon değiştirme işlemi ise santrifüj aracılığı ile sağlanmaktadır. 1.7.3. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisi Proteinlerin net elektriksel yükleri, içinde bulundukları tamponun pH değerine bağlı olarak ya pozitif ya negatif ya da sıfırdır (zwitter iyon). Protein moleküllerinin bu özelliklerinden yararlanılarak, uygun bir iyon-değiştirici matriksin, pH’nın ve iyonik kuvvetin kullanılması ile proteinlerin yoğunlaştırılması ve fraksiyonlanarak ayrıştırılması sağlanabilir (bkz. 6. Bölüm). İyon değiş-tokuş kromatografisi, protein özütlerinin yoğunlaştırılmasında ve kısmen saflaştırılmasında etkili ve göreceli olarak ucuz bir metot olarak kullanılmaktadır. Bu metotta, hedef proteinin belirli bir pH’daki ve iyonik kuvvetteki net yüküne bağlı olarak kullanılacak olan iyon-değiştirici matriks seçilir. Örneğin, belirlenen koşullar altında hedef proteinin net elektriksel yükü pozitif ise bu durumda kullanılacak olan iyon-değiştirici matriks bir katyon-değiştirici, proteinin net elektriksel yükü negatif ise anyon-değiştiricidir. Bu metot, özellikle fermentasyon sıvılarından, hücre kültür sıvılarından ve hücre homojenizatlarından hücrelerin ve hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasından sonra elde edilen seyreltik protein özütlerinin fraksiyonlanmasında ve yoğunlaştırılmasında kullanılmaktadır. Protein özütünün pH’sı ve iyonik kuvveti, hedef proteinin net bir negatif ya da pozitif elektriksel yük kazanacak şekilde ayarlandıktan sonra, solüsyon üzerine uygun bir iyon-değiştirici matriks (bkz. kısım 6.3) doğrudan eklenir. İyon-değiştirici matrikse adsorblanan proteinlerle birlikte matriks, santrifügasyon yöntemi ile solüsyondan ayrılabilir. Solüsyondan ayrılan iyon-değiştirici matriks, matriks partiküllerinin geçişine izin vermeyecek gözenek çapına sahip bir filtre kağıdının yerleştirilmiş olduğu huni üzerine aktarılır. İyon-değiştirici matrikse adsorblanmış olan proteinler ise yüksek derişimde tuz (0,5 M NaCl veya KCl) içeren uygun bir tamponun kullanılması ile matriksten ayrılarak elüe edilirler. Protein içeren elüsyonlar toplanarak gerekli testlere tâbi tutulur. Hedef proteini içeren elüsyonlar ise daha sonraki saflaştırma işlemleri için kullanılır. İyon-değiştirici matriks ise rejenere edilerek (bkz. kısım 6.8) yeniden kullanılabilir. Bu metotla, protein özütlerinde bulunan ve iyon-değiştirici matrikse bağlanmayan veya bağlanmasına rağmen hedef proteinin elüsyonu için gereken koşullarda iyon-değiştiriciden elüe olmayan, çok sayıdaki kirletici uzaklaştırılmış olmaktadır. Protein özütlerinin temizlenmesi için önceden uygulanmış olan yöntemlerle uzaklaştırılamayan lipitler ve/veya karbonhidratların yanı sıra, kısmen denatüre olmuş veya agregat oluşturmuş protein yapıdaki kirleticiler de uzaklaştırılmış olmaktadır. Ham protein özütlerinin temizlenmesi ise daha sonra uygulanacak olan saflaştırma teknikleri esnasında kolon materyallerinin kirlenmemesi ve kolon içerisinde mikrobiyal büyümenin önlenmesi açısından oldukça önemlidir. 1.7.4. Kuru Formdaki Sephadex G-25 İlavesi Seyreltik protein özütleri üzerine kuru formdaki Sephadex G-25’in (veya anoloğu) eklenmesi, jel partiküllerinin şişmesine yol açar. Jel partiküllerinin hidrasyonu esnasında, protein özütündeki su molekülleri jel partiküllerinin iç kısımlarına girer. Fakat protein molekülleri, jel matriksinin içine giremeyecek kadar büyük olduklarından, jeli saran fakat hacmi orijinal solüsyona oranla azalmış olan sıvı içerisinde kalacakları için etkili bir şekilde yoğunlaştırılmış olurlar. Diğer tekniklerin aksine, protein özütlerine kuru formdaki Sephadex G-25’in eklenerek yoğunlaştırılması, özellikle endüstriyel uygulamalar için uygun değildir. Büyük-ölçekli uygulamalarda, protein özütlerinin

20

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

yoğunlaştırılmasında çökeltme, iyon değiş-tokuş kromatografisi veya ultrafiltrasyon daha uygun olmaktadır. 1.7.5. Diyaliz ve Liyofilizasyon Genellikle protein preparatlarının tamponlarını değiştirmek amacıyla uygulanan diyaliz yöntemi, higroskopik bir maddenin kullanılması (örneğin, PEG veya Sephadex) durumunda yoğunlaştırma amacı ile de kullanılabilmektedir. Diyaliz yönteminde kullanılan diyaliz tüpleri, tüp içerisindeki proteinlerin geçişine izin vermezken solüsyon sıvısının geçişine izin vermektedir. Büyük hacimli protein preparatlarının diyalizi zaman kaybına neden olduğundan, örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını sağlamak ve tamponunu değiştirmek amacıyla ultrafiltrasyon yönteminin (bkz. kısım 1.7.2) kullanılması önerilmektedir. Zaman kaybının önemli olmadığı durumlarda ise diyaliz, hem örnek materyallerinin yoğunlaştırılması hem de tamponlarının değiştirilmesi amacıyla kullanılabilir. Liyofilizasyon ise protein solüsyonlarının yoğunlaştırılması ve depolanması amacıyla sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Liyofilizasyonda ise solüsyon sıvısının süblümleşerek ortamdan uzaklaştırılması ve böylece örnek materyalinin yoğunlaştırılması sağlanmaktadır. 1.8. Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması Rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen proteinler de genellikle rekombinant olmayan proteinlerin saflaştırılması için geliştirilmiş olan ayrıştırma teknikleri ile saflaştırılırlar. Gerçekte ise rekombinant proteinlerin saflaştırılması, hedef proteinin yüksek düzeylerde ekspresyonunun (ifadesinin) sağlanabilir olması nedeni ile daha az sayıda basamak içeren saflaştırma protokolleri ile gerçekleştirilebilir. Hedef rekombinant proteinin ekspresyon düzeyinin yüksek olması, ham protein özütü içerisindeki hedef proteinin oranının, kirleticilere oranla daha yüksek olmasına yol açacaktır. Bu nedenle, saflaştırma protokolünün ilk aşamalarında uygulanan, ham protein özütlerinin yoğunlaştırılması için gereken adımları azaltacak ya da tamamen ortadan kaldıracaktır. Bunun yanı sıra, şayet rekombinant protein, konakçı organizmanın doğal proteinleri tarafından sergilenmeyen belirgin bir fizikokimyasal özelliğe sahipse, bu proteinin saflaştırılması çok daha kolay olabilir. Örneğin, hiper termofil organizmalardan E. coli gibi mezofilik bir organizmaya klonlanmış olan aşırı termofil bir proteinin rekombinant olarak üretilmesi durumunda, bu proteinin saflaştırılması çok daha kolay olabilmektedir. Çünkü, aşırı termofil rekombinant proteini de içeren ham protein özütü, 70-80 °C’da birkaç dakika süreyle inkübe edildiğinde, E. coli’nin doğal proteinlerinin tamamı denatüre olarak çökelecektir. Çökelmiş olan proteinler ise santrifüjlenerek uzaklaştırıldığında, geriye kalan solüsyon içerisinde oldukça yüksek bir oranda saflaştırılmış olan rekombinant protein kalacaktır. Rekombinant proteinlerin konakçı organizma tarafından üretildikten sonra saflaştırılmasını kolaylaştırmak amacıyla kullanılan en etkili iki yöntem ise: (i) rekombinant proteinlerin inklüzyon cisimleri oluşturmasını sağlamak ve (ii) saflaştırmada kullanılabilecek bir etiketin rekombinant proteine eklenmesidir. 1.8.1. İnklüzyon Cisimleri İnklüzyon cisimlerinin oluşturulmasında, konakçı hücrenin (örneğin, E. coli) sitoplazmasında sentezlenen rekombinant proteinlerin, sitoplazma içerisinde çözünmeyen bir agregat (inklüzyon cisimleri veya refraktil cisimleri) oluşturması sağlanmaktadır. Bunun yanı sıra, inklüzyon cisimlerinin kısmi olarak katlanmış ara-ürünlerden oluştuğuna, dolayısı ile inklüzyon cisimlerinin ne tamamı ile doğal ne de tamamı ile katlanmamış proteinlerden oluştuğuna inanılmaktadır. İnklüzyon cisimleri ise büyük bir oranda rekombinant proteinlerden oluşmakla birlikte, toplam kütlesinin %15 kadarı kirletici proteinlerden (bu örnekte, E. coli dış membran proteinleri ve RNA polimeraz gibi)

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

21

oluşmaktadır. Rekombinant proteinlerin E. coli sitoplazmasında neden inklüzyon cisimleri oluşturduğunun nedeni ise henüz tam olarak anlaşılabilmiş değildir. İnklüzyon cisimlerinin oluşumuna katkıda bulunan muhtemel faktörler ise şu şekilde sıralanabilir: • Rekombinant proteinin sitoplazmada oldukça yüksek bir lokal derişimde bulunması, özgül olmayan bir çökelmenin meydana gelmesine yol açıyor olabilir. • Şaperon moleküllerinin (proteinlerin katlanmasını sağlayan enzimler) yetersiz olması nedeni ile kısmi olarak katlanmış ara-ürünler çökelti oluşturmaktadırlar. • Sitoplazmanın indirgeyici çevresi nedeni ile disülfid köprülerinin oluşumu engellenmektedir. • Konakçı hücre olan E. coli’de post-translasyonel modifikasyon enzimlerinin (ökaryotik) bulunmaması nedeni ile proteinlerin kararlılığı düşük olmaktadır. Buna rağmen, inklüzyon cisimlerinin oluşumu tamamı ile negatif bir fenomen olmayıp, oldukça yoğun olmaları nedeni ile düşük santrifüj kuvvetlerinde (500-1000 g) dahi kolayca çökelerek solüsyonlardan ayrılabilmektedirler. Bu özelliklerinden yararlanılarak inklüzyon cisimleri oluşturan rekombinant proteinler, ham protein özütlerinden kolayca ayrılarak kısmi olarak saflaştırılabilirler. İnklüzyon cisimlerini içeren çökelti ise taze tampon içerisinde yeniden süspanse edilerek, inklüzyon cisimleri ile birlikte çökelmiş olan hücre kalıntılarından temizlenmesi amacı ile birkaç defa yıkanır. İnklüzyon cisimleri ile birlikte bulunan hücre kalıntılarının (örneğin, hücre duvarına bağlı olan proteazlar, kolon materyalinin tıkanmasına yol açabilecek hücre kalıntıları ve lipopolisakkaritler gibi) uzaklaştırılması ise daha sonraki saflaştırma prosedürleri esnasında bazı problemlere neden olmamaları açısından önemlidir. İnklüzyon cisimleri hücre kalıntılarından arındırıldıktan sonra, denatüre edici ajanlar kullanılarak çökelmiş olan polipeptidlerin çözünmesi sağlanır. İnklüzyon cisimlerini oluşturan polipeptidlerin denatürasyonu ise üre, guanidin hidroklorür, SDS gibi deterjanlar veya organik çözücülerin kullanılması ile sağlanabildiği gibi, alkali pH’da inkübasyon ile de sağlanabilmektedir. İnklüzyon cisimlerinin çözünmesi sağlandıktan sonra, denatüre edici ajan diyaliz, seyreltme veya diafiltrasyon gibi yöntemlerle yavaş yavaş ortamdan uzaklaştırılır. Bu durumda, proteinlerin doğal ve biyolojik olarak aktif olan konfigürasyonlarını kazanmalarını sağlayan katlanma koşullarının uygulanması gerekmektedir. Rekombinant proteinlerin renatürasyonu sağlandıktan sonra, şayet gerekiyorsa, normal protein saflaştırma teknikleri kullanılır. Proteinlerin renatürasyonu için gerekli olan koşullar ise proteinden proteine değişmektedir ve yüksek bir oranda aktivitenin gerikazanılması, her zaman garanti olmamaktadır. Bu durum, yüksek moleküler kütleli proteinlerin renatürasyonlarının oldukça kompleks birer proses olmaları nedeni ile özellikle antikorlar ve faktör VIII gibi büyük moleküller için doğrudur. Bu nedenle, yüksek moleküler kütleli proteinler rekombinant teknolojisinden ziyade hücre kültür teknikleri ile daha başarılı olarak üretilerek saflaştırılabilirler. 1.8.2. Etiketleme Günümüzde gen mühendisliği sayesinde hedef rekombinant proteine, özgül peptid veya protein etiketlerinin eklenmesi de mümkün olmaktadır. Hedef proteine eklenecek olan etiket, etiketin eklenmiş olduğu rekombinant hibrit proteinin saflaştırılmasında kolaylık sağlayan bazı fizikokimyasal özellikler taşıyacak şekilde seçilmektedir. Etiket eklenmiş hibrit bir molekülün sentezi, etiketin sentezinden sorumlu olan DNA dizisinin, hedef proteinin sentezinden sorumlu olan DNA dizisinin bir ucuna eklenmesi ile başarılmaktadır (Şekil 1.5). Etiketlerin özelliklerinden yararlanılarak, hibrit proteinlerin hızlı ve tek bir adımda saflaştırılmasında iyon değiş-tokuş, hidrofobik interaksiyon veya affinite kromatografileri başarılı bir şekilde kullanılmaktadır.

22

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 1.5: Rekombinant proteinin saflaştırılmasını kolaylaştırmak amacı ile etiket eklenmesi. Hedef rekombinant proteini kodlayan gen, etiketi kodlayan DNA dizisi ile birleştirilir. Etiket ise kısa bir amino asit dizisinden oluşabileceği gibi bütün bir proteinden de oluşabilmektedir. Ekspresyonu gerçekleştirilen hibrit protein molekülü ise etiket için özgül olan bir kolon materyali kullanılarak affinite kromatografisi ile kirleticilerden ayrılarak saflaştırılır. Saflaştırılan hibrit proteine bağlı bulunan etiket ise proteaz ile uzaklaştırılarak orijinal rekombinant protein elde edilir. Rekombinant protein ise ya hibrit halinde iken doğru olarak katlanmalıdır ya da etiketin uzaklaştırılmasından sonra doğru olarak katlanmalıdır.

Bir proteinin C-terminaline poliarjinin (veya polilizin) etiketinin eklenmesi, o proteinin kuvvetli bir pozitif yüke sahip olmasına yol açar. Böyle bir hibrit protein ise katyon değiş-tokuş kromatografisi ile kolayca saflaştırılabilir (bkz. 6. Bölüm). Bu yaklaşımla farklı interferonlar ve ürogastronlar saflaştırılmış bulunmaktadır. Rekombinant proteinlerin etiketlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem ise hidrofobik amino asitlerden oluşan bir dizinin (etiketin) hedef proteine eklenmesidir. Hidrofobik amino asitlerden oluşan etiket nedeni ile meydana gelen hibrit protein, oldukça kuvvetli bir hidrofobik özellik kazandığından, hidrofobik interaksiyon kromatografisi ile kolayca saflaştırılabilmektedir (bkz. 9. Bölüm). Benzer şekilde polihistidin etiketi taşıyan hibrit bir rekombinant protein ise metal şelat kromatografisi ile kolayca saflaştırılabilir (bkz. kısım 8.8). Affinite kromatografisi ile hibrit rekombinant proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan etiketler de bulunmaktadır. Örneğin, protein-A’nın sentezinden sorumlu olan gen, etiket olarak hedef proteinin sentezini kodlayan gene veya cDNA’ya eklenebilir. Etiket olarak kullanılan protein-A’yı bağlayan IgG’nin ligand olarak kullanılması durumunda, etiket (protein-A) içeren hibrit rekombinant protein affinite kromatografisi ile saflaştırılabilir (bkz. kısım 8.7.6.1). Rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında kolaylık sağlaması amacı ile kullanılan bazı etiketler ise Tablo 1.3’de verilmektedir. Bayrak (flag) olarak adlandırılan sentetik bir peptid ise özel olarak geliştirilmiş bir immünoaffinite etiketidir. Bu immünoaffinite etiketi, proteaz enterokinaz tarafından özgül olarak kırılan bir bölge taşımaktadır. Bayrak peptidine özgül olarak bağlanan monoklonal antikorlar da

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

23

geliştirilmiş bulunmaktadır. Bayrak peptidine özgül olarak bağlanan bu monoklonal antikorların kolon matriksine tutuklanarak ligand olarak kullanılması durumunda, bayrak-protein hibridini içeren protein özütü kolona yüklendiğinde, bu karışımdaki hibrit moleküller bayrak aracılığı ile özgül olarak liganda bağlanacaklardır. Kirletici proteinlerin kolondan elüsyonundan sonra, elüsyon koşulları değiştirilerek liganda bağlanmış olan bayrak-protein moleküllerinin elüsyonu gerçekleştirilerek saflaştırılması sağlanabilir. Ayrıca, farklı enzimlerin saflaştırma etiketi olarak kullanıldığı çalışmalar da bulunmaktadır. Bu enzimlerden en popüler olanı ise β-galaktozidazdır. Tablo 1.3: Rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında kolaylık sağlaması amacı ile kullanılan bazı etiketler. Etiket

Saflaştırma tekniği

Kırma

Poliarjinin (C-ter)

Katyon değiş-tokuş (bkz. 6. Bölüm)

Karboksipeptidaz B

Polihistidin (N-Ter)

Metal Affinite (bkz. kısım 8.8)

Yok

HDHDH (His-Asp)n (N-Ter)

Metal Affinite (bkz. kısım 8.8)

Renin

Protein A (N-Ter)

IgG kolonu (bkz. kısım 8.7.6.1)

Kimyasal

GST-transferaz (N-Ter)

GSH kolonu

Trombin

Maltoz-bağlama (N-Ter)

Amiloz kolonu

Faktör Xa

Hibrit proteinlerin (etiket-protein) saflaştırılmasından sonra gerçekleştirilmesi gereken diğer önemli bir adım ise etiketin proteinden uzaklaştırılmasıdır. Etiketin proteinden uzaklaştırılması ise özellikle saflaştırılmış olan proteinin terapötik amaçlı kullanılması durumunda oldukça önemlidir. Çünkü, etiketin kendisi immünojenik olabilmektedir. Etiketin uzaklaştırılması ise genellikle, ya kimyasal ya da enzimatik bir reaksiyonla olmaktadır. Bunun başarılması ise etiketin, proteine bağlanma noktasındaki dizisinin özgül bir proteaz veya kimyasal reaksiyon ile kırılacak şekilde dizayn edilmiş olmasını gerektirir. Etiketin uzaklaştırılması için ise özgül dizilerden kırma yapan endopeptidaz tripsin, faktör Xa ve enterokinaz gibi proteazlar kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra, karboksipeptidaz A gibi ekzopeptidazlar da zaman zaman kullanılmaktadır. Genel olarak endopeptidazlar uzun etiketlerin uzaklaştırılması amacı ile kullanılırlarken, ekzopeptidazlar ise daha çok kısa etiketlerin uzaklaştırılması amacı ile kullanılmaktadırlar. Örneğin bir ekzopeptidaz olan karboksipeptidaz A, bir proteinin C-terminalindeki amino asit kalıntılarını lizin, arjinin veya prolin kalıntısına rastlayıncaya kadar teker teker uzaklaştırır. Özgül peptid bağlarının kimyasal olarak kırılması ise siyanojen bromid veya hidroksilamin gibi kimyasalların kullanılmasına bağlıdır. Etiketlerin uzaklaştırılmasını sağlayan birkaç metot olmasına rağmen, bu metotlardan bazılarının sakıncaları da bulunmaktadır. Bu metotlardan beklenen başarı, etiketin uzaklaştırılmasından sonra hedef proteinin intakt olarak kalmasına bağlıdır. Bu nedenle hedef protein, etiketin uzaklaştırılmasında kullanılan metot tarafından özgül olarak kırılacak bir bağ içermemelidir. Bunun yanı sıra, kimyasal metotlar genellikle yüksek sıcaklık veya pH gibi oldukça sert koşullar altında gerçekleştirilmektedir. Böyle koşullar ise genellikle proteinin normal fonksiyonlarını olumsuz olarak etkilemektedirler. Etiketlerin proteolitik olarak uzaklaştırılmasından elde edilen verimlilik ise genellikle %100’ün altında olmaktadır. Ayrıca, etiketin seçici olarak proteinden kırılmasından sonra, etiketin protein solüsyonundan ayrılması gerekmektedir. Bunun için ise belki de başka bir kromatografik adım gerekmektedir. 1.9. Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler Daha önce kısım 1.7’de ele alınan ön-fraksiyonlama prosedürleri, genellikle hedef proteininin özgül aktivitesinin çok az miktarda artırılması ile sonuçlanır. İstenilen proteinin daha yüksek oranlarda saflaştırılması ve en sonunda da homojen saflıkta elde edilebilmesi için daha yüksek

24

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

çözünürlük sağlayan tekniklerin kullanılması gerekmektedir. Bu tekniklerin çoğu ise kromatografik yöntemleri içermekle birlikte, preparatif elektroforez tekniği de bu amaçla kullanılabilmektedir. Protein saflaştırmada kullanılan farklı kromatografik yöntemlerin temel özellikleri ise Tablo 1.4’de özet halinde verilmektedir. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi (HIC) ve kovalent kromatografisi ise özgül olarak proteinlerin saflaştırılması amacı ile geliştirilmiş olan kromatografi yöntemleridir. Her türlü saflaştırma protokolünün en temel özelliklerinden birisi, çalışmanın boyutudur. Geleneksel protein saflaştırma yöntemlerinde amaç, saflaştırılmış olan proteinin birincil, ikincil ve üçüncül yapılarını çalışmanın yanı sıra, biyolojik özelliklerinin belirlenmesine yetecek kadar, miligram düzeyinde saf protein eldesine yöneliktir. Son zamanlarda ise bu amaç, moleküler biyoloji tekniklerinin de devreye girmesi nedeni ile, bir proteinin sentezinden sorumlu olan genin probunu hazırlamak amacıyla, bu proteinin bir kısmının amino asit dizisini elde etmeye yetecek kadar proteinin saf olarak elde edilmesi şekline dönüşmüştür. Bir proteinin yapısal ve biyolojik özelliklerinin detaylı olarak çalışılması ise izole edilen genin üzerinde yapılmaktadır. Bu tip bir çalışma ise saflaştırılmış olan proteinin çok az bir miktarı ile (mikrogram düzeyinde) yürütülebilmektedir. Sinir faktörlerinin, büyüme faktörlerinin ve diğer regülatör proteinlerin izolasyonu da çok küçük miktarlardaki örneklerle yapılabilmektedir. Bu iki farklı miktardaki (miligram ve mikrogram düzeyindeki) örneklerle çalışmada uygulanacak olan prosedürler de tabii ki oldukça farklı olacaktır. Genel olarak söyleyecek olursak, küçük-boyutlu örneklerle çalışıldığında tekniğin maliyeti sınırlayıcı bir faktör olmayacağı için, örneğin affinite kromatografisi, protokolün erken aşamalarında kullanılabilir. Tablo 1.4: Protein saflaştırmada sıklıkla kullanılan kromatografik tekniklerin genel özellikleri. Teknik

Kullanılan özellik

Kapasite

Çözünürlük

Detay

Hidrofobik interaksiyon

Hidrofobisite

Yüksek

Orta

9. Bölüm

İyon değiş-tokuş

Yük

Yüksek

Orta

6. Bölüm

Affinite

Biyolojik fonksiyon

Orta

Yüksek

8. Bölüm

Boya-affinite

Yapı ve hidrofobisite

Orta

Yüksek

Kısım 8.7.2

Kromatofokusing

Yük ve pI

Yüksek-Orta

Yüksek-Orta

7. Bölüm

Kovalent

Tiyol gruplar

Orta-Düşük

Yüksek

Kısım 8.9

Metal şelat

İmidazol, tiyol, triptofan grup

Orta-Düşük

Yüksek

Kısım 8.8

Jel filtrasyon

Moleküler boyut

Orta

Düşük

5. Bölüm

Herhangi bir proteinin saflaştırılması için uygulanacak teknikleri genel olarak veren bir protokol bulunmamaktadır. Hidrofobik interaksiyon ve iyon değiş-tokuş kromatografilerinin her ikisinin de yüksek kapasiteli teknikler olması ve göreceli olarak daha ucuz olmaları nedeni ile bu kromatografi teknikleri genellikle, ham özütün fraksiyonlanmasından hemen sonra kullanılırlar. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi, proteinin yüzeyindeki hidrofobik grupların açığa çıkmasını sağlaması nedeni ile amonyum sülfat içeren protein preparasyonlarına da uygulanabilmektedir (bkz. 9. Bölüm). Saflaştırma protokolünün dizaynı yapılırken, saflaştırılmak istenen proteinin farklı özelliklerinden kademeli olarak yararlanmayı sağlayan tekniklerin kullanılmasına özen gösterilmelidir. Aynı zamanda saflaştırma protokolünde kullanılan bir tekniğin son-ürününün bir sonraki teknik için uygun bir başlangıç materyali oluşturmasına da dikkat edilmelidir. Saflaştırma işlemleri sırasında kullanılan tekniklerin verimi ile saflaştırma-oranı arasındaki dengenin korunmasına da özen gösterilmelidir. Örneğin, her birisinin verimi %75 olan 4 farklı saflaştırma prosedürü arkası arkasına uygulansa, uygulanan bu 4 farklı prosedür sonunda genel verim %31

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

Doç. Dr. Münir TUNCER

25

olacaktır. Bu prosedürler sonucunda elde edilen proteinin saflık derecesi yüksek ise böyle bir sonuç genellikle kabul edilebilir, fakat değilse, protokolün yeniden düzenlenmesi gerekmektedir. Sürekli-akış elektroforezi ise özellikle çok fazla miktarda protein içeren preparatlar için uygundur. Örneğin, kandan özgül proteinlerin izolasyonu yapılmak istendiğinde veya E. coli ve maya hücrelerinden klonlanmış bir genin ürünü olan proteinin ayrıştırılmasında, sürekli-akış elektroforezi uygulanabilmektedir. Elektroforezin diğer formları ise, kompleks protein karışımlarını ayrıştırma yeteneğine sahip olmasına rağmen, göreceli olarak daha yavaş olması ve proteinlerin denatürasyonuna yol açması nedeni ile bazı dezavantajlara sahiptirler. Minyatür elektroforez sistemleri ise, bu sistemlerin yavaş olma dezavantajını ortadan kaldırmak amacı ile kullanılmaktadır. Bir proteinin sentezinden sorumlu olan genin izolasyonu için gerekli olan probların hazırlanması amacı ile gerçekleştirilen protein saflaştırma işlemlerinde ise proteinin biyolojik aktivitesinin korunmasına gerek duyulmadığından, bu tip çalışmalarda saflaştırma işlemi denatüre edici koşullarda yapılabilmektedir. Bu amaçla geliştirilmiş olan saflaştırma teknikleri ise hızlı protein sıvı kromatografisi (Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC) olarak adlandırılmaktadır. Özellikle membran proteinleri başta olmak üzere, proteinlerin tek bir adımda saflaştırmasını sağlaması nedeni ile ters-faz FPLC, bu amaçla yapılan çalışmalarda son zamanlarda oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Tipik olarak ortalama partikül çapları 30 μm’den az olan ve C8, C18, fenil veya siyanojen gruplar içeren silika-temelli kolon materyalleri ise sulu asetonitril veya isopropanol temelli hareketli fazlarla birlikte, 210-220 nm’de ölçüm yapabilen UV detektörleri ile kullanılmaktadır. Trifloroasetik asit, heptaürobutirik asit, trietilamonyum fosfat ve piridinium format gibi bileşiklerin ortamda bulunması ise proteinlerin hareketli faz içindeki çözünürlüklerinin artmasına yardımcı olmakta ve çözünürlüğü artırmaktadır. Bu tip kromatografi ile çalışılan proteinlerin çoğu denatüre olmakta ve/veya uygulanan koşullar nedeni ile disosiye olmaktadırlar fakat, dizileme çalışmaları için bu değişiklikler kabul edilebilmektedir. Şayet proteinin biyolojik aktivitesinin korunması önemli ise HIC veya IEC’ye dayalı, yüksek verimli FPLC tekniklerinin kullanılması tercih edilmelidir. 1.10. Saflaştırma Prosedürlerinin Takibi Kısım 1.7’de de ana hatları ile kısaca özetlendiği gibi, protein saflaştırma protokolünün gelişmesi, her bir prosesten sonra fraksiyonun özgül aktivitesinin ve saflaştırma kat-sayısının belirlenmesi ile takip edilir. Bunu başarmak için ise hem toplam protein miktarının belirlenmesi hem de enzimin aktivitesinin belirlenmesi için duyarlı test metotlarının bulunması gerekmektedir. Çok küçük miktarlardaki örneklerle çalışıldığı durumlarda ise protein miktarının ve aktivitesinin belirlenmesi daha da zor olabileceğinden, daha özgül ve duyarlı olan tekniklerin kullanılması için sistemin yeniden kurulması gerekebilir. Bu tekniklerden en yaygın olarak kullanılanlardan iki tanesinden birisi jel elektroforezine, diğeri ise Western blotlama tekniğinin de kullanıldığı, proteinlere karşı yüksek affinite gösteren antikorların kullanılmasına dayanmaktadır. Protein örneklerinin çalışılmasında muhtemelen en çok kullanılan teknik SDS-PAGE yöntemidir. PAGE tekniği ise basit olmasının yanı sıra, tekrarlanabilir sonuçlar vermesi ve yüksek çözünürlüğe sahip olması nedeni ile sıklıkla kullanılmaktadır. Bu teknik aynı zamanda, kompleks protein karışımlarının ayrıştırılmasında da kullanılabilmektedir. Örneklerin elektroforezinden sonra jel, trikloroasetik asit ve/veya sülfosalisilik asit ile muamele edilerek tespit edilir, Coommasie Brilliant Blue gibi bir boya ile boyandıktan sonra, dansitometre ile taranarak her bir protein bandının kantitatif ölçümü yapılabilir. Dansitometreden elde edilen verilerin değerlendirilmesi sırasında, proteinlerin hepsinin eşit olarak boyanmaması nedeni ile gerekli önlemler alınmalıdır.

26

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

SDS-PAGE sonucunda elde edilen jellerdeki proteinlerin kantitatif analizlerinde kullanılan alternatif bir metot ise Western blotlama tekniğidir. Western blotlama tekniğinde ise jel üzerindeki proteinler elektroforetik olarak nitroselüloz bir plaka üzerine aktarılırlar (elektroblotlama). Nitroselüloz membran üzerine aktarılan proteinler ise ya boya-bağlama prosedürü ile ya da immünoradyometrik assey prosedürü, ELISA veya flouresans immünoassey gibi immünokimyasal bir yöntemle belirlenebilir. İmmünokimyasal yöntemde, nitroselüloz membran üzerine aktarılan protein için oldukça özgül olan antikorlar (özellikle monoklonal antikorlar) kullanılarak, proteinlerin antikorlara karşı olan affinitelerinden yararlanılır. Nitroselüloz membran üzerine transfer edilen protein ise buradan kesilerek alınır ve doğrudan amino asit dizileyicisine (sekansır) yerleştirilebilir. Blotlama tekniğinin diğer bir alternatifi ise immünoelektroforez yöntemidir. Proteinlerin saflaştırılmasında ve analizinde kullanılan elektroforetik teknikler ise “Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler” adı ile ayrı bir cilt olarak yayına hazırlanmaktadır. Bir proteinin mutlak saflıkta olup olmadığının belirlenmesi ise saflaştırılmak istenen proteinle hemen hemen aynı özelliklere sahip olan kirletici proteinlerin de çok az miktarlarda dahi olsa bulunabilmesinden dolayı oldukça zordur. SDS-PAGE üzerindeki tek bir bant veya ultrasantrifüj tekniğinde elde edilen keskin bir protein bandı, saflığın bir göstergesi olsa da, mutlak saflığın (homojenitenin) olduğu anlamına gelmeyebilir. Bir protein preparatının mutlak saflıkta olduğundan emin olabilmek için, bu tip çalışmalar değişik deneysel koşullar altında tekrarlanmalıdır. Proteinin sabit kimyasal kompozisyonu (amino asit içeriği, elementel analizi), çözünürlüğü ve spektroskopik özellikleri proteinin saflığının belirlenmesi için yapılacak ilave çalışmalardır ve saflığın belirlenmesi için iyi birer indikatördürler. Bir proteinin saf olarak elde edilip edilmediğinin en iyi göstergesi ise oldukça uzun ve zor bir proses olmasına rağmen, proteinin kristal formunun elde edilmesidir.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

2.1. Giriş Biyoteknologların ve biyokimyacıların çoğu, kariyerlerinin belirli bir aşamasında biyomoleküllerin saflaştırılarak, biyofiziksel özelliklerinin tanımlanması gibi bir çalışmanın içinde bulunmuşlardır. Modern biyoteknolojik endüstrinin gelişmesi ile birlikte oldukça yüksek saflıktaki farmosötik proteinlere olan ihtiyaç da artmıştır. Bu gereksinmelerin bir sonucu olarak, kromatografik sistemler üzerine olan araştırmalar da artmış ve sonuçta daha ekonomik, kapasitesi yüksek ve yüksek verimlilikte ürün veren kromatografik sistemler geliştirilmiştir. Biyomoleküllerin ayrıştırılmasını ve fraksiyonlanmasını sağlayan kromatografik sistemlerin geliştirilmesinde ise bu moleküllerin farklı biyofiziksel özelliklerinden yararlanılmıştır. Kompleks biyolojik materyallerden özgül bir biyomolekülün saflaştırılması veya bu kompleks yapının analizi, çoğu zaman tek bir kromatografik işlemle istenilen ölçülerde başarılamamaktadır. Bu nedenle, kromatografik sistemler genellikle birbiri ardına kullanılarak istenilen saflıktaki proteinlerin elde edilmesi başarılabilmektedir. Kullanılan kromatografik yöntemler ise biyomoleküllerin farklı özelliklerinden yararlanmaya yönelik seçilmelidir. Örneğin, biyomoleküllerin saflaştırılmasında moleküllerin büyüklüklerinden (jel filtrasyon), hidrofobisitelerinden (HIC veya RPC), moleküllerin net elektriksel yüklerinden (iyon değiş-tokuş kromatografisi) veya biyolojik aktivitelerinden (affinite kromatografisi) yararlanılabilir. Bu bölümde ise kromatografik tekniklerin genel özellikleri üzerinde durulmaktadır. Takip eden bölümlerde ise öncelikle düşük basınç sıvı kromatografisi (LPLC) ve yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC)’nin genel özellikleri incelendikten sonra, proteinlerin saflaştırılmasında ve diğer biyomoleküllerin analizinde sıklıkla kullanılan kromatografik teknikler detaylı olarak ele alınmaktadır. 2.2. Dağılma Katsayısı Bütün kromatografi çeşitlerinin temelini, analitlerin dağılma (partisyon) ve dağılma kat sayıları (Kd) oluşturmaktadır. Dağılma kat sayısı, bir bileşiğin birbirine karışmayan iki faz arasında kendiliğinden dağılmasını ifade eder. Bir analitin A ve B gibi, birbirine karışmayan iki faz arasındaki dağılma kat sayısı ise belirlenen bir sıcaklıkta sabittir. Dağılma kat sayısı olan Kd ise aşağıdaki şekilde formüle edilir: Kd =

Analitin A (durgun) fazındaki derişimi Analitin B (mobil) fazındaki derişimi

Etkili dağılma kat sayısı terimi ise analitin toplam miktarının, diğer fazda bulunan derişimden ayrı olarak bir fazda bulunan toplam miktarı olarak tanımlanır. Gerçekte ise dağılma kat

28

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

sayısı, iki fazda bulunan hacimlerin oranı ile çarpılır. Şayet bir analitin A ve B fazları arasındaki dağılma kat sayısı 1 ise ve bu analit, 10 mL A ve 1 mL B’de dağılmış ise her iki fazdaki derişimleri de aynı olacaktır. Fakat, analitin A fazındaki toplam miktarı B fazındakinden 10 kat daha fazla olacaktır. Temelde bütün kromatografik sistemler katı, jel, sıvı veya katı-sıvı karışımından oluşan ve sabit olan bir durgun fazdan ve durgun faz boyunca hareket eden sıvı veya gaz olan hareketli (mobil) fazdan oluşurlar. Durgun ve hareketli fazların farklı şekillerde seçilmesi ise ayrıştırılacak olan bileşiğin (analit) farklı dağılma kat sayılarına sahip olmasına yol açmaktadır. Bu ise şu yöntemler ile başarılmaktadır: i. Durgun katı faz ile hareketli sıvı faz arasında bir adsorbsiyon dengesinin oluşturulması (adsorbsiyon kromatografisi, hidrofobik interaksiyon kromatografisi). ii. Durgun sıvı faz ile hareketli sıvı veya gaz faz arasında bir dağılma dengesinin oluşturulması (partisyon kromatografisi, ters-faz kromatografisi, iyon-eşleştirme kromatografisi, kiral kromatografi, gaz-sıvı kromatografisi, karşı-akım kromatografisi). iii. Sabit iyon-değiştirici ve hareketli elektrolit faz arasında bir iyon-değiştirme dengesinin oluşturulması (iyon değiş-tokuş kromatografisi, kromotofokusing). iv. Gözenekli durgun faz içerisindeki sıvı faz ile hareketli sıvı faz arasında bir dengenin oluşturulması (jel filtrasyon kromatografisi). v. Durgun tutuklanmış bir ligand ile sıvı hareketli faz arasında bir dengenin oluşturulması (affinite kromatografisi, immünoaffinite kromatografisi, lektin affinite kromatografisi, metal-şelat kromatografisi, boya-ligand kromatografisi, kovalent kromatografisi). Pratikte ise özel bir kromatografik ayrıştırma çalışmasında, bu yöntemlerden iki veya daha fazlasının arkası arkasına uygulanması oldukça yaygındır. 2.3. Kromatografinin Mantığı Kromatografik ayrıştırma, temelde üç farklı yöntemin uygulanması ile başarılabilir: i. Kolon kromatografisi: Kolon kromatografisinde uygun bir matrikse (inert, çözünmeyen destek materyali) tutturulan durgun faz, cam veya metal bir kolon içerisine doldurularak paketlenir ve hareketli faz bu kolondan yer çekimi etkisiyle, peristaltik bir pompa yardımıyla ya da gaz basıncı ile geçirilir. Bu yöntem, kromatografi tekniklerinden en çok uygulanan yöntemdir. ii. İnce tabaka kromatografisi (TLC): TLC’de durgun faz, uygun bir matrikse bağlanarak cam, plastik veya metal alüminyum tabaka üzerine ince bir katman oluşturacak şekilde kaplanır. Hareketli faz ise horizontal veya vertikal olarak tutulan TLC tabakasını kapiller aksiyon ile bir boydan bir boya geçer. Bu kromatografi yöntemi ise fazla sayıdaki örneklerin aynı anda uygulanmasına izin vermesi nedeniyle, kolon kromatografisine göre bazı pratik avantajlara sahiptir. iii. Kâğıt kromatografisi: Kâğıt kromatografisinde durgun sıvı faz, bir kâğıt tabakasındaki selüloz fibrilleri tarafından desteklenir. Kâğıt kromatografisinde de TLC’de olduğu gibi hareketli faz, kâğıt tabakasını yer çekimi etkisiyle veya kapiller aksiyon ile bir boydan bir boya geçer. Kâğıt kromatografisi, kromatografi tekniklerinin en eski yöntemlerinden biri olup, bugün birkaç ciddi biyokimyasal uygulamalar için kullanılmakta ve hâlâ kromatografinin temel prensiplerini kavratmak amacı ile de birçok öğrenci laboratuvarlarında gösterilmektedir.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

29

2.4. Kolon Kromatografisinin Kullanımı Bir kolon kromatografisinin prensibini anlayabilmek için şöyle bir varsayımdan yola çıkalım. Cam bir kolonun 5 cm’lik kısmı katı, granüler bir durgun faz ile doldurulmuş olsun. Granüler destek materyalinin arasında kalan boşlukları dolduran hareketli sıvı fazın hacmi ise Şekil 2.1’de gösterildiği gibi kolonun her 1 cm’si için 1 mL olsun. Şayet bu kolona 1 mL’lik sıvı faz içerisinde 16 μg bileşik yüklenirse, yüklenmiş olan bu 1 mL’lik sıvı faz, A pozisyonunu alacak şekilde kolondan aşağıya doğru hareket ettikçe kolon içinde bulunana sıvı fazın 1 mL’si kolonun tabanından dışarıya atılacaktır. Şayet eklenmiş olan bileşiğin dağılma katsayısı 1 ise bu bileşik, katı (durgun) ve sıvı (hareketli) faz arasında eşit olarak dağılacaktır (adım 1). Bu aşamadan sonra kolona ikinci bir 1 mL hareketli faz eklenirse, kolonun A bölümündeki hareketli faz aşağıdaki B bölümüne doğru hareket edecek ve bu hareket esnasında 8 μg bileşiği de kendisi ile birlikte B bölümüne taşıyacaktır. Bileşiğin 8 μg’ı ise A bölümünde kalacaktır (adım 2). Kolonun hem A, hem de B bölümünde bulunan bileşiğin yeniden dağılımı gerçekleşecek ve her bölmede (A ve B) bulunan 8 μg bileşiğin yarısı (4 μg) sıvı, diğer yarısı da katı faz arasında dağılacaktır. Kolona eklenecek üçüncü 1 mL’lik hareketli faz ise kolonun A bölmesindeki sıvı fazın B’ye, B’deki sıvı fazın ise C bölgesine geçmesine sağlayacak ve bileşiğin dağılımı 3. adımda gösterildiği şekilde olacaktır. Kolona eklenecek dördüncü 1 mL’lik hareketli faz ise bileşiğin 4. adımda gösterildiği şekilde dağılmasına neden olacaktır. Eklenecek olan beşinci 1 mL’lik hareketli faz ise bileşiğin 5. adımda gösterildiği şekilde dağılmasına neden olacaktır.

Şekil 2.1: Kolon kromatografi ile ayrıştırmanın temel prensibi.

Şekil 2.1’den de açıkça görüldüğü gibi, göreceli olarak küçük sayıdaki bir dengeden sonra kolona yüklenmiş olan bileşik, kendisini simetrik olarak bir bant içerisinde dağıtmaktadır. Buradaki tek bir bileşiğin dağılmasında olduğu gibi birisinin dağılma katsayısı 1 olan, diğerininki ise 100 olan iki ayrı bileşik içeren bir karışım kolona yüklendiğinde, bu iki bileşik hemen farklı bantlara ayrılacaklardır. Gerçek bir kromatografi kolonunda ise kolondaki hareketli faz, sabit bir akış oranı ile kolona yeni hareketli fazın eklenmesi ile birlikte, kolon materyalini geçerek aşağıya doğru hareket edecektir ve bunun sonucu olarak da çok fazla sayıda denge oluşacaktır. Sıvı hareketli fazın kullanıldığı tipik bir kolon kromatografi sistemi ise bir kolondan, bir hareketli faz (elüsyon sıvısı) rezervuarından ve dağıtma sisteminden (pompa); ayrıştırılmış olan bileşikleri belirlemeye yarayan bir dedektörden, bir kaydediciden ve bir fraksiyon toplayıcıdan oluşur (Şekil 2.2).

30

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Dedektör ve kaydedici, kolondan ayrılan hareketli faz içerisinde bulunan bileşiklerin (analitlerin) UV absorbsiyonu gibi fiziksel parametrelerinin devamlı olarak kaydedilmesini sağlar. Grafik kaydedicide ise hareketli sıvı faz içerisinde kolondan ayrılan her bileşik, ayrı bir pik olarak kaydedilir. Fraksiyon toplayıcı ise zaman veya hacim ayarlı olarak, kolondan gelen sıvı fazı farklı tüplere toplar ve böylece bileşiklerin fraksiyonlanmasını ve daha sonraki analizler için kullanılmasını sağlar.

Şekil 2.2: Kolon kromatografi ekipmanları. (a) Basit bir kolon kromatografisi. (b) Çok daha geliştirilmiş olan bir kolonun yapısı. (c) Bir kolon kromatografi sisteminde yer alan ekipmanlar.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

31

2.5. Kromatografi Terminolojisi Kromatografi terminolojisi, yıllarca süren çalışmaların bir sonucu olarak gelişmiş olmakla birlikte, ancak 1950’li yılların sonuna doğru kromatografik bir yönteme ait karakteristik terimlerin bir standart haline getirilmesi ile oluşturulmuştur. Kromatografi terminolojisine ait terimler ise şematik olarak Şekil 2.3’de gösterilen bir kromatogram üzerinde açıklanmaktadır. Kromatografik yöntemlere ait farklı terimler aşağıdaki şekilde tanımlanmaktadırlar: Temel-çizgi: Kolondan sadece hareketli fazın ayrıldığı durumlarda dedektör tarafından algılanan ve kromatogramda görülen her hangi bir parçadır. Pik tepe noktası: Bir bileşiğe ait pikin en yüksek noktasıdır. Bu nedenle bir pikin tepe noktası, o pike ait elüsyon zamanına veya elüsyon hacmine eşittir. Dolayısıyla, bir pikin tepe noktası = tR = VR’dir. Enjeksiyon noktası: Kolona örneğin yüklenmiş olduğu zaman ya da kolona örneğin yüklenmiş olduğu pozisyon noktasıdır. Ölü nokta: Kolona tutunmayarak, kolondan transit geçen bir analitin oluşturduğu pikin tepe noktasının pozisyonudur. Ölü zaman (to): Enjeksiyon noktası ile ölü nokta arasındaki zamandır. Diğer bir deyişle, enjeksiyon noktası ile kolona tutunmayarak, kolondan transit geçen bir analitin oluşturduğu pikin tepe noktası arasındaki zamandır. Hareketli faz hacmi (ölü hacim) (VM): Enjeksiyon noktası ile ölü nokta arasında, kolondan geçen hareketli fazın hacmidir. Bu nedenle, VM = FC to’dır. Burada FC ise hareketli fazın akış oranıdır (mL dk–1). VM, kolon içerisindeki toplam hareketli fazın hacmi olduğundan matriksin dışındaki hareketli fazın (Vo) ve matriksin içindeki hareketli fazın (Vi) toplamına eşittir. Dolayısıyla VM = Vo + Vi’dir.

Şekil 2.3: Bir kromatogramın terminolojisi.

32

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Boşluk hacmi (Vo): Jel filtrasyon kromatografisinde kolon matriksini oluşturan jel materyalinin dışındaki hareketli fazın hacmidir (bkz. Şekil 5.4). Elüsyon (alıkonma, gecikme) süresi (tR): Enjeksiyon noktası ile bir pikin tepe noktası arasında geçen süredir. Uygulanan deneysel koşullar altında her bir analitin elüsyon süresi karakteristiktir. Elüsyon (alıkonma, gecikme) hacmi (VR): Enjeksiyon noktası ile bir pikin tepe noktası arasında kalan sürede kolondan geçen hareketli fazın hacmidir. Bu nedenle, VR = FC tR’dir. Uygulanan deneysel koşullar altında her bir analitin elüsyon hacmi de analite özgüdür. Düzeltilmiş elüsyon süresi (t’R): Ölü nokta ile bir pikin tepe noktası arasındaki zamandır. Düzeltilmiş elüsyon hacmi (V’R): Ölü nokta ile bir pikin tepe noktası arasında kalan süre içerisinde kolondan geçen hareketli fazın hacmidir. Bu nedenle, V’R = VR – VM = FC (tR – to)’dır. Pik yüksekliği (h): Pikin tepe noktası ile pikin alt kısmında geometrik olarak oluşturulan temel-çizgi arasında kalan mesafedir. Pik genişliği (w): Pik yüksekliğinin 0,607 noktasında bir pikin iki kenarı arasındaki mesafedir. Gaus dağılım kuralına uygunluk gösteren bir pikin bu yükseklikte ölçülen pik genişliği 2σ’ya eşittir. Bu nedenle, bu noktada ölçülen pik genişliği, kromatografi teorisi ile bir anlam ifade etmektedir. Yarı yükseklikte pik genişliği (w0,5): Bir pikin yüksekliğinin yarı mesafesindeki iki kenarı arsındaki mesafedir. Pik taban genişliği (wB): Geometrik olarak üretilmiş olan pik tabanı ve pikin kenarlarından çizilen tanjantın kesişme noktaları arasındaki mesafedir. Gaus dağılım kuralına uyan pikler için pikin taban genişliği 4σ’ya eşittir. Bu nedenle pik taban genişliği, kromatografi teorisi ile bir anlam ifade etmektedir. 2.6. Kromatografi Sistemleri Sıvı kolon kromatografisi ise ayrıştırma işlemi boyunca kolona uygulanan basınca bağlı olarak alt-sınıflara ayrılır: i. Düşük basınç sıvı kromatografisi (LPLC): Durgun fazın oluşturduğu direnç nedeniyle, hareketli sıvı fazın akışının zorlaşması nedeniyle akışı kolaylaştırmak üzere kolona 5 bar (1 bar = 14,5 lbf in–2 = 0,1 MPa)’dan az basınç uygulanan kromatografi yöntemidir. ii. Orta basınç sıvı kromatografisi (MPLC): Bu kromatografi yönteminde ise kolona uygulanan basınç 6-50 bar arsındadır. iii. Yüksek basınç sıvı kromatografisi (HPLC): Bu kromatografi yönteminde ise kolona uygulanan basınç 50 bar’dan fazladır. 2.7. Kolon Kromatografisinin Parametreleri Kolona yüklenmiş olan analitlerden her birisinin, kolondan ayrılarak oluşturduğu pikin tepe noktası, bu analitin elüsyon zamanını (tR) verir. Tanımlanmış olan kromatografik koşullar altında ise her bir analitin tR değeri karakteristiktir. Analitin kolona yüklenmesinden sonra kolondan ayrılması için, kolondan ayrılan hareketli sıvı fazın hacmi ise o bileşiğin elüsyon hacmini veya kolonda alıkonma hacmini (VR) verir. Bir analitin elüsyon hacmi (VR) ve elüsyon zamanı (tR) ise kolondaki hareketli sıvı fazın akış oranına (Fc ) bağlıdır: VR = tR Fc

(2.1)

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

33

Hareketli fazın akış oranı ise kolonun boyutları, kolon materyalini oluşturan partiküllerin fiziksel karakteristikleri (partikül büyüklüğü, şekli, porositesi) ve hareketli fazın viskozitesine bağlıdır. Sıvı partisyon kromatografi kolonu için elüsyon hacmi, durgun fazın hacmine (VS), ayrıştırılacak olan analitlerin durgun ve hareketli fazlar arasındaki dağılma katsayılarına (Kd) ve kolon materyalinin hareketli faz hacmine (VM) bağlıdır. Kolon materyalinin boşluk hacmi ise kolon içerisindeki durgun fazın arasındaki ve kenarlarındaki boşluğun hacmidir. VR = VM + Kd VS

(2.2)

Adsorbsiyon kolon kromatografisinde ise VS, adsorbent yüzey alanı (AS) ile yer değiştirir. Herhangi bir kromatografik sistemle etkili bir şekilde ayrıştırılan moleküller zamanla, aynı kromatografik sistemin kullanılması durumunda dahi kromatografiden kromatografiye farklı elüsyon zamanlarında (tR) elüe edilebilirler. Bu farklılıkların temel nedenleri ise operasyondaki akış oranının, hareketli fazın veya diğer parametrelerin değişmesidir. Böyle durumlarda ise kapasite faktörünün (k) tanımlanması ile operasyondaki farklılıkların giderilmesi sonucunda alıkonma zamanlarının normalleştirilmesi sağlanabilir. Herhangi bir birimi olmayan kapasite faktörü, analitin durgun faz içinde geçirdiği zamanın hareketli faz içerisinde geçirdiği zamana göreceli olarak ölçümüdür.

k=

C S VS C M VM

= Kd

VS VM

(2.3)

Burada CS, analitin sabit faz içerisindeki; CM ise hareketli faz içerisindeki derişimidir. VS’nin VM’ye oranı ise volümetrik faz oranı (β) olarak adlandırılır. Böylece, k = Kd β’dır. Kapasite faktörü ise, gerçekte elüsyonu yapılacak olan bir analitin, kolonda tutulmayan veya sabit faz arasında dağılma göstermeden kolonu terk eden (k = 0) başka bir analite göre (göreceli olarak), kolondan elüsyonu için gereken ek sürenin (veya hacmin) ölçümüdür. Böylece: k=

tR - to

=

to

VR - VM

(2.4)

VM

Burada to, kolondan transit olarak geçen, yani sabit fazda dağılım göstermeyen, bir analitin kolondan geçiş zamanıdır. to ise kolonun yatak uzunluğu (L) tarafından belirlenir ve hareketli fazın kolon boyunca lineer akış oranı olan ū ise eşitlik 2.5 ile belirlenir: _ u=

L to

(2.5)

Kolon performansını karakterize eden kapasite faktörü (k) ise birçok sıvı kromatografi çalışmasında tanımlama amacıyla belirtilmektedir. Gaz-sıvı kromatografide ise pratik olarak to veya VM değerlerinin ölçümü zor olduğundan, kapasite faktörü ender olarak belirtilmektedir. Birçok nedenden dolayı, kabul edilebilir bir sıvı kromatografi sisteminin k değerleri 1 ile 10 arasında bulunmaktadır. Daha önce de bahsedildiği gibi her bir analit, kolon içerisinde hareket ederken bu analitin fazlar arasındaki dağılımının ortalaması Gauss dağılım yasasına uygun bir bant oluşturur (Şekil 2.4,a). Böyle bir pikin tabanın genişliği ise dört standart sapmanın (4σ) ve değişken olarak (σ2) pik genişlemesinin uzantısı olarak alınır. Simetrik Gauss pikleri için pikin tabanının genişliği ise 4σ’ya eşittir ve pikin yükselme noktasındaki (0,607 noktasındaki) genişliği (w) ise 2σ’ya eşittir (Şekil 2.4,a).

34

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 2.4: (a) Tamamı ile ayrılma gösteren iki bileşiğin kromatogramı ve kolonda kalma sürelerinin hesaplanması. (b) Tam olarak ayrışmamış iki bileşiğin oluşturduğu bileşik pik. (c) Kuyruklama gösteren bir bileşiğin kromatogramı.

Kromatografik ayrıştırmalarda genellikle iki piki birbirinden tamamen ayırmak mümkün olmamaktadır. Piklerin birbirinden tam olarak ayrılmaması ise bileşik piklerin oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bileşik piklerin analizi için ise, birbirinden ayrılmayan iki bileşiğin pik karakterlerinin birbirini etkilemediğini farz etmek gerekmektedir (Şekil 2.4,b). Bazı durumlarda ise pik, ya ön kısımda bir uzama ya da arka kısımda bir uzama (kuyruklama) göstermesi nedeniyle asimetriktir (Şekil 2.4,c). Pikin asimetrik olmasının nedenleri arasında, analitin çok fazla miktarda kolona yüklenmiş olması, kolonun iyi paketlenmemiş olması, örneğin kolona iyi yüklenmemiş olması ve destek materyali ile kolona yüklenen solüsyondaki analit arasında bir etkileşimin olması gibi çok sayıda neden sayılabilir. 2.8. Kromatografik Sistemlerde Çözünürlük

Bu kısımda kolon kromatografisi ile ayrıştırma üzerine etkili olan teorik parametreler incelenmektedir. Bütün kromatografik yöntemlerde kromatografinin sonuçları, ilgilenilen pikler arasındaki çözünürlükle ifade edilmektedir. Çözünürlük ise iki pikin tepe noktaları arasındaki uzaklığın, iki pikin ortalama taban genişliklerine oranı olarak ifade edilmektedir (Şekil 2.5). Bu durumda, elüsyon hacimleri ile piklerin taban genişlikleri aynı birim ile ölçülmelidir. Pik çözünürlüğü (RS), piklerin özelliğine bağlı olup, aşağıdaki şekilde hesaplanır: RS =

2 (VRB - VRA)

(2.6)

wBA + wBB

veya RS =

2 (tRB - tRA) wBA + wBB

(2.7)

Burada VRA ve VRB, sırasıyla A ve B piklerinin elüsyon hacimlerini; tRA ve tRB ise aynı piklerin elüsyon sürelerini; wBA ve wBB ise sırasıyla A ve B piklerin taban genişliklerini ifade etmektedir.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

35

Şekil 2.5: İki pik arasındaki çözünürlüğün tanımlanması. RS, çözünürlük; VRA, A pikinin tepe noktasının elüsyon hacmi; VRB, B pikinin tepe noktasının elüsyon hacmi; wBA, A pikinin taban alan genişliği; wBB, B pikinin taban alan genişliği.

Çözünürlük (RS), iki pik arasındaki göreceli ayrılmanın bir ölçüsü olduğundan, şayet kromatografik prosesin daha ileri bir optimizasyonu gerekiyorsa, bu optimizasyon için çözünürlük değerinden yararlanılabilir. Şayet, Şekil 2.6,a’da görüldüğü gibi RS = 1 ise bunun anlamı, her bir pikin %98 oranında geri-kazanımı ile A ve B molekülleri %98 oranında saf olarak ayrıştırılmış demektir. Bu saflıktaki bir ayrıştırma ise kantitatif analiz için uygun olmaktadır. Bu durumda A ve B moleküllerine ait piklerin alanı yaklaşık olarak eşit olmakta ve Gaus dağılım yasasına uymaktadır. Şayet, Şekil 2.6,b’de görüldüğü gibi RS ≥ 1,5 ise bunun anlamı, her bir pikin %100 oranında saflaştırıldığını göstermektedir. Burada şunun unutulmaması gerekir ki, şayet kullanılan örnek materyali A ve B moleküllerine ilaveten başka moleküller de içeriyorsa iki pikin %100 olarak ayrılmış olması demek, bileşiklerin de saf olduğu anlamına gelmez. Çünkü bu piklerin her birisi, belki de kullanılan ayrıştırma parametreleri ile birbirinden ayrılamayan bir seri bileşiği de içermektedirler.

Şekil 2.6: Farklı çözünürlükteki ayrıştırma sonuçları.

Bir kromatografik sistemle, iki analitin ayrıştırılmasında başarılabilen çözünürlük, kolon kromatografisini kontrol eden en önemli üç parametre olan seçicilik faktörünün (α), kuramsal levha sayısının (N, verimlik) ve kapasite faktörünün (k) çarpımına orantılıdır. Bu nedenle, çözünürlüğün (RS) analitik ifadesi ise eşitlik 2.8’deki gibidir:

36

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

RS =

N 4

Verimlilik

(

α-1 ) α

(

k2 ) 1 + k2

(2.8)

Seçicilik Kapasite

Burada α, seçicilik faktörü; k2, ikinci pike ait kapasite faktörü ve N, kuramsal levha sayısıdır. Bu nedenle, kromatografik bir sistemin çözünürlüğünün iyi olup olmadığı: (i) kapasite faktörü, (ii) verimlilik ve (iii) seçicilik fonksiyonları ile belirlenir. 2.8.1. Kapasite Faktörü Kapasite faktörü veya alıkonma faktörü (k) bir bileşiğin kolon içerisindeki kalma süresinin bir ölçüsü olup, kolonun yükleme kapasitesi (mg örnek mL–1) veya iyonik kapasite (mmol mL–1) ile karıştırılmamalıdır. Kapasite faktörü ise her bir pik için ayrı ayrı hesaplanır. Örneğin, Şekil 2.7’deki 1. pikin kapasite faktörü (k) eşitlik 2.9 ile hesaplanır:

k=

VR1 - Vt1 Vt1

(2.9)

İyon değiş-tokuş kromatografisi ve kromotofokusing gibi adsorbsiyon tekniklerinde deneysel koşulların, piklerin alıkonma hacimlerinin Vt’den oldukça fazla olmasını sağlayacak şekilde seçilebilmesi nedeni ile yüksek kapasite faktörlerine sahip olabilirler. Bu durum, jel filtrasyon kromatografisinde bütün piklerin elüsyon hacmi (Vt –Vo) içinde elüe edilmesinin zorunlu olması nedeni ile bir zıtlık oluşturmaktadır.

Şekil 2.7: Hipotetik bir kromatogram. Vo, boşluk hacmi; VR1, birinci pikin elüsyon hacmi; VR2, ikinci pikin elüsyon hacmi; Vt1, birinci pikin toplam hacmi; wB1, birinci pikin taban genişliği; wB2, ikinci pikin taban genişliği.

2.8.2. Verimlilik

Verimlilik, kolon içerisinde pik genişlemesine ve piklerin üst üste örtüşmesine (bileşik pikler) neden olan diffüzyon etkisinin bir ölçüsüdür. Bu nedenle verimlilik, hareketli ve durgun fazların fiziksel özellikleri ve kolonun paketlenme kalitesi tarafından etkilenmektedir. Bir kromatografi yatağında zon genişlemesine neden olan temel faktör, örnek moleküllerinin düşey diffüzyonudur. Düşey diffüzyon etkisinin minimuma indirilmesi ise hem hareketli fazdaki, hem de sabit fazdaki düşey diffüzyon mesafelerini mümkün olduğu kadar azaltmakla sağlanabilir. Düşey diffüzyon mesafesini kısaltmak ise pratikte, oldukça küçük partikül boyutlarına (3-15 μm) sahip küresel

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

37

matrikslerin kullanılması ile sağlanabilmektedir. Bu nedenle en yüksek verimlilik, analitik ve mikropreparatif uygulamalar için geliştirilmiş olan 3 μm çapa sahip, porsuz MiniBeads gibi kolon materyalleri ile elde edilmektedir. Verimlilik üzerine etkili olan ikinci temel faktör ise iyi bir deneysel tekniktir. Kötü olarak, düzensiz paketlenmiş kromatografi materyalleri ve hava kabarcıkları ise kanal oluşumuna, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açmaktadır. İyi bir ayrıştırmanın gerçekleştirilmesi ise iyi paketlenmiş bir kolonla sağlanabildiğinden, istenilen performansın elde edilmesi, kolonun paketlenme kalitesiyle orantılı olarak artmaktadır. Bu etkilere bağlı olarak kolon verimliliği, özgül bir deneyde kullanılan kolonun kuramsal levha sayısı (N) olarak ifade edilmektedir. Çünkü kromatografi kolonlarının, bileşiklerin, sıvı ve katı faz arasında tam bir denge oluşturabildiği yeterli alanlara sahip ve birbirine bitişik çok sayıdaki zonlardan oluştuğu kabul edilir. Bu zonlardan her birisi ise kuramsal levha olarak adlandırılır. Burada şunu unutmamak gerekir ki, adından da anlaşılacağı üzere gerçekte kolon yatağı içerisinde bu tipte levhalar yoktur. Bu var sayım bize, kolonda gerçekleşen ayrıştırma prosesinin nasıl çalıştığını anlamamıza yardımcı olmak içindir. Kuramsal levhaların kolon içerisindeki uzunluğu ise levha yüksekliği (H) olarak isimlendirilir ve bir uzunluk boyutuna sahiptirler. Kolonun çok daha hassas olması ise kolonda bulunana kuramsal levhaların sayısının fazlalığına bağlıdır. Kuramsal levhaların sayısının (N), dağılma katsayısı 1 olan bir analitin dağılımını nasıl etkilediği ise Şekil 2.8’de gösterilmektedir. Özel bir analitin elüsyonunda kullanılan kuramsal levhaların sayısı (N) ise eşitlik 2.10 veya eşitlik 2.11 ile verilir: tR 2 N = 16 ( w ) B

(2.10)

veya tR 2 N = 5,545 ( w ) 0,5

(2.11)

Bu eşitliklerde wB, pik tabanının genişliği olup 4σ’ya eşittir ve w0,5 ise pikin yarı yüksekliğinin genişliği olup 2,355σ’ya eşittir.

Şekil 2.8: Kuramsal levha sayısının (N) bir bileşik üzerine etkisi.

N’in gözlenen değeri, akış oranı ve örnek yükleme gibi deneysel faktörlere bağlı olduğu için eş koşullarda karşılaştırmaların yapılabilmesi için oldukça önemlidir. İyon değiş-tokuş kromatografisinde ise verimlilik, matriks ile etkileşim göstermeyen aseton gibi maddelerin kullanılması ile izokratik koşullarda ölçülür. N değeri ise, grafik kaydediciden elde edilen grafik

38

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

kağıdındaki verilerden veya bilgisayar kontrollü kaydedicilerden hesaplanabilmektedir. Levha sayısı (N), basitçe kolon uzunluğunun (L) artırılması ile artırılabilir fakat, bu artışın da bir limiti bulunmaktadır. Çünkü, kolon uzunluğunun artırılmasına orantılı olarak, analitin kolonda kalma süresi ve pikin genişliği de artmaktadır. Buna ilaveten, pikin yüksekliği ise N’in kare kökü kadar azalmaktadır. N, kolon verimliliğinin bir ölçüsü olmasına rağmen bir kuramsal levhaya yüksek denge (HETP) olarak da adlandırılan levha yüksekliği (H) ise farklı koşullar altında, kolon operasyonunun karşılaştırılması gibi amaçlar için oldukça kullanışlıdır. HETP ise eşitlik 2.12’deki gibi gösterilebilir: HETP =

L N

=H

(2.12)

Özgül bir kromatografik sistem tarafından ayrıştırılan piklerin maksimum sayısı ise pik kapasitesi (n) olarak adlandırılır. Pik kapasitesi ise ilk (Vα) ve son (Vω) piklerin elüsyon hacmine ve levha sayısına bağlıdır ve eşitlik 2.13 ile hesaplanır: N ( ln

n=1+

16

Vω Vα

)

(2.13)

Pik kapasitesi ise kabul edilebilir ayrıştırma zamanı ve belirleme (dedeksiyon) duyarlılığı ile tanımlanır. Pratikte ise pik kapasitesinin artırılması, sıvı kromatografide olduğu gibi ya gradient elüsyon prosedürü ile (bkz. kısım 3.9) ya da gaz-sıvı kromatografisinde olduğu gibi sıcaklık ayarı ile sağlanır. 2.8.3. Seçicilik

Seçicilik faktörü (α), bir kromatografi sisteminin, yapısal olarak birbiri ile ilgili olan bileşikleri ayrıştırma yeteneğinin bir ölçüsüdür. Seçicilik faktörü ise eşitlik 2.14 kullanılarak kromatogramlardan hesaplanabilir:

α=

k2 k1

=

VR2 -Vo VR1 -Vo

=

VR2

(2.14)

VR1

Çözünürlüğün tanımlanmasında ise iyi bir seçicilik, yüksek bir verimlilikten daha önemli bir faktördür (Şekil 2.9). Çünkü, çözünürlük (RS) ile seçicilik arasındaki ilişki lineer olduğu halde, çözünürlük ile verimlilik arasındaki ilişki ¼ oranındadır. Bunun anlamı ise izokratik koşullarda çözünürlüğün iki katına çıkarılması için verimliliğin dört-kat atırılması gerektiğidir. İyon değiş-tokuş kromatografisinde seçicilik, sadece matriksin yapısına ve iyonik grupların sayısına değil, aynı zamanda pH ve iyonik güç gibi deneysel koşullara da bağlıdır.

Şekil 2.9: Çözünürlük üzerine seçicilik ve verimliliğin etkisi.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

39

2.9. Kuantifikasyon, İnternal ve Eksternal Standartlar

Kolon elüsyon sıvısı (eflüent), dedektörler aracılığı ile piklerin elde edilmesi için incelendiğinde, kolona yüklenmiş olan analitlerden her birisine ait olan pikin alanı, genellikle elüsyon sıvısında bulunan analitin miktarı ile orantılıdır. Piklerin alanları ise pik yüksekliğinin (h) ve pikin yarı yükseklik genişliğinin (w0,5) ölçülmesi ile hesaplanabilir. Bir pike ait h ve w0,5 değerlerinin ölçümünün sonucu ise pikin alanına eşit olarak alınır. Buna alternatif olarak, grafik kağıdı üzerinde bulunan piklerin her birisi ayrı ayrı kesilerek tartılır ve tartım sonuçları ile elüsyon sıvısı içerisindeki analitlere ait piklerin alanları arasında doğrusal bir orantı olduğu kabul edilir. Bu prosedür, piklerin karmaşık olduğu ve/veya fazla sayıda analitin analizinin yapıldığı durumlarda ise oldukça karmaşık ve zaman alıcıdır. Pik alanlarının hesaplanması ise günümüzde, daha da geliştirilmiş olan bilgisayar programları ile çok daha hızlı ve hassas olarak yapılabilmektedir. Ayrıca, analitlerin kolonda kalma sürelerini ve pik alanlarını standartlara göre hesaplayan, dolayısı ile göreceli kolonda kalma sürelerini ve göreceli pik alanlarını hesaplamaya yarayan bilgisayar destekli kromatografi sistemleri de son derece geliştirilmiş bulunmaktadır. Bu sayede, herhangi hedef bir analite ait verileri, daha önce kullanılan standartlara ait verilerin kaydedildiği veri bankasıyla kıyaslayarak, bu analitin tanımlamasının ve miktarının belirlenmesi de mümkün olabilmektedir. Standartlar için elde edilen veri ise aynı zamanda, kromatografi sisteminde meydana gelebilecek hataların düzeltilmesi için de kullanılabilir. Bu tipteki hatalar ise dedektörlerin özeliklerinden ya da kolonun ayrıştırma etkinliğinden kaynaklanabilir. Dedektörden kaynaklanan problemlerin başında ise dedektör sinyalinin zamanla dereceli olarak değişmesinden kaynaklanan temel-çizgi (baseline) sürüklenmesi ve genellikle, dedektör operatörünün dedektörü çok yüksek bir hassasiyete ayarlamasından veya elektriksel bir hatadan kaynaklanan, dedektör sinyalinin ciddi anlamda çok kısa bir zaman içinde dalgalanmasından kaynaklanan temel-çizgi gürültüsüdür (bkz. kısım 4.12). Yeni pik alanı belirlendiğinde, elüsyon sıvısındaki analitin tanımlanması için bekli de, analitin saf formunun bilinen miktarlarının aynı koşullar altında kromatografisi ile elde edilen kalibrasyon eğrisinin kullanımı ile bu yeni pik oluşumuna neden olan analitin miktarı belirlenebilir. Kromatografik koşullardaki değişimlerin ve yapılacak olan ön ekstraksiyon işlemlerinin analit üzerindeki etkilerinin görülmesi için bir internal standart bileşik kullanılmalıdır. İnternal standart ise fiziksel özelikleri mümkün olduğunca analit ile aynı olan ve kromatografik işlem sonucunda analite yakın pik veren fakat, analitten farklı olan bir bileşiktir. Standart olarak kullanılacak olan bileşiğin bilinen bir miktarı, mümkün olduğunca ekstraksiyon işlemlerinin daha başında iken örneğe katılmalıdır. Böylece, analit için uygulanacak bütün ön işlemlere standart bileşiğin de maruz kalması sağlanmış olur. Analiz esnasında, standart bileşikte meydana gelebilecek olan herhangi bir kayıp, analitin de aynı miktarda kayba uğradığının bir göstergesi olacaktır. Sabit miktardaki internal standart bileşiğe ait olan pikin alanı ise, hem kalibrasyon verisindeki hem de analizi yapılan örnekteki piklerin her birisi için göreceli pik alan oranı’nın hesaplanmasında kullanılmaktadır. Bu nedenle kalibrasyon eğrisi, göreceli pik alan oranına karşı, bilinen miktardaki analitin grafiğinin çizilmesi ile elde edilir. Sonuçta, elde edilen bu grafik, örnek içerisinde bulunan ve test edilecek olan analitin miktarının hesaplanmasında kullanılabilir. İnternal standarda alternatif bir prosedür ise bir eksternal standart kullanılmasıdır. Bu metotta ise standart bileşik, örnek içerisine, örneğin kolona yüklenmesinden hemen önce katılır ve standart eklenmiş örnek ile analizi yapılacak olan analiti içeren örnek (standart içermeyen) ayrı ayrı kolona yüklenerek kromatografik ayrıştırma gerçekleştirilir. Bu metotta, standart bileşik ve analit farklı zamanlarda kolona yüklenerek ayrıştırma yapıldığı için, analitin ekstraksiyonu esnasında meydana gelebilecek olan değişimlerin kalibrasyonunu gerektirmez. Bu metot ise analitin test

40

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

örneğinden geri-kazanımının hemen hemen kantitatif olduğu durumlarda ve dedektör sapmasında kısa dalgalanmaların olmadığı durumlarda geçerlidir. 2.10. Kromatografik Sistemlerin Seçimi

Biyofiziksel özellikleri bilinen bileşiklerin ayrıştırılması için kullanılabilecek olan kromatografi sistemlerini belirli bir noktaya kadar mantıklı olarak seçmek mümkündür (Şekil 2.10). Fakat, kromatografik tekniklerle biyomoleküllerin saflaştırılmasında, hangi kromatografik tekniklerin kullanılacağının seçilmesi kadar, seçilen tekniklerin hangi sıra ile uygulanacağı da saflaştırmanın hızı, kolaylığı ve verimi açısından oldukça önemlidir. Kromatografik tekniklerin çoğu, ayrıştırılacak olan bileşiklerin fiziksel özelliklerinin faklılığından yararlanılarak gerçekleştirilmektedir. Bu duruma istisna oluşturan tek kromatografi tekniği ise affinite kromatografisidir. Çünkü, affinite kromatografisinin temelini biyomoleküllerin özgül ligand-bağlama özellikleri oluşturmaktadır. Şayet bir molekülün ayrıştırılmasında affinite kromatografisi uygulanabiliyorsa sonuç büyük bir ihtimalle başarılı olacaktır. Buharlaşma özelliğinde

Gaz-sıvı sistem

Buharlaşma özelliği yok

ÖRNEK

Biyolojik özgüllük

Affinite kromatografisi

Çözünürlük Hidrofobik Jel Filtrasyonu

Farklı moleküler kütle

Organik çözelti

Farklı fonksiyonel gruplar

Adsorbsiyon Kromatografisi

Hidrofilik

Homolog serileri

Normal faz partisyon sistemi

Sulu çözelti

Farklı molaeküler kütle

Jel Filtrasyonu

Zayıf iyonik Kuvvetli iyonik veya polar İyon-Eşleştirme

Ters-faz partisyon sistemi

İyon değiş-tokuş kromatografisi

Şekil 2.10: Kromatografik sistemlerin seçimi.

Saflaştırma planının başında, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarı, dilüsyonu ve kirletici sayısı ve miktarı, genellikle maksimum düzeyde olacaktır. Bu nedenle, saflaştırma planının başında uygulanacak olan kromatografik yöntemin yüksek kapasiteli olması, yüksek seçicilik göstermesi ve yoğunlaştırma etkisinin bulunması, daha sonra uygulanacak olan kromatografik sistemler için bir avantaj oluşturmaktadır. i. Buharlaşma özelliğine sahip olan bileşikler en iyi şekilde GLC ile ayrıştırılırlarken, organik solventler içerisinde çözünen, buharlaşmayan bileşikler ise genellikle en iyi şekilde ya adsorbsiyon ya da normal faz sıvı kromatografisi ile ayrıştırılırlar. ii. Şayet bileşikler farklı fonksiyonel gruplara sahiplerse, polar-olmayan (non-polar) solventler ile silika üzerinde adsorbsiyon kromatografisi muhtemelen en iyi çözüm olacaktır. iii. Bir homolog serisindeki düşük polariteli bileşikleri ayrıştırmak için ise normal faz sıvı sistemleri tercih edilebilir.

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

41

iv. Şayet suda çözünen bileşikler iyonik-olmayan (non-iyonik) veya zayıf iyonikseler ters-faz sıvı kromatografisi tercih edilmelidir. Bu sistemde ise bir hidrokarbon gibi polar-olmayan bir durgun faz, su/asetonitril veya su/metanol karışımı gibi polar bir hareketli fazla birlikte kullanılmalıdır. v. Suda çözünen ve kuvvetli iyonik olan bileşikler ise en iyi şekilde, ya anyon ya da katyon değiştirici matrikslerin kullanıldığı iyon değiş-tokuş kromatografileri ile yarıştırılırlar. vi. Moleküler kütleleri bakımından farklı olan bileşikler ise en iyi şekilde jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırılırlar.

Bir biyokimyasal çalışma için hangi sıvı kromatografi sistemi seçilmiş olursa olsun, LPLC veya HPLC sisteminin kullanılmasına karar verirken, birçok faktörün göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Bu faktörlerin başında ise aparatların bulunup bulunmaması, maliyeti, ayrıştırma işleminin boyutu ve ayrıştırma işleminin kalitatif mi yoksa kantitatif mi olacağı gelmektedir. Günümüzde ise hızlı, doğru ve hassas sonuçlar vermesi nedeni ile HPLC sistemlerinin kullanımına yönelik eğilimler oldukça artmış bulunmaktadır. Özellikle ters-faz HPLC, oldukça gelişmekte olan bir tekniktir. HPLC tekniklerinin FPLC aracılığı ile proteinlerin ayrıştırılmasında kullanılması ise özellikle protein denatürasyonunun bir problem oluşturmadığı durumlarda, çabuk ve güçlü bir tekniktir. Özellikle kalitatif çalışmalar için, TLC’nin basitliğinin yanı sıra, aynı anda standartlar da dahil olmak üzere çok sayıda örneğin çalışılmasına olanak sağladığı için bu kromatografi tekniği de cazibesini korumaktadır. Buna eşit olarak, kapiller gaz kromatografisindeki gelişmeler de buharlaşan bileşiklerin ayrıştırılmasında bu sistemin hızlı ve duyarlı bir sistem olmasına yol açmıştır.

42

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ (LPLC)

3.1. Giriş

Kromatografi tekniğinin klasik bir formu olan adsorbsiyon kromatografisi, 8 Mart 1903 tarihinde Mikhail Semenovich Tswett tarafından, Warsaw Doğal Bilimler Derneği Kongresinin Biyoloji seksiyonunda sunulan bir bildiri ile bilim dünyasına tanıtılmıştır1. Bu nedenle sıvı kromatografinin kaşifi olarak, Rus bilim adamı M.S. Tswett kabul edilmektedir. Tswett daha sonraki yıllarda yayınlamış olduğu çalışmalarında2, bitki pigmentlerinin ayrıştırılması ile ilgili çalışma sonuçlarını duyurmuştur. Bu çalışmalarında Tswett, durgun faz olarak tebeşir (kalsiyum karbonat) ile doldurulmuş bir kolon ve hareketli faz olarak eter kullanmıştır. Tswett, yaptığı çalışmalara dayanarak “chromato” (renk) ve “graphy” (yazma) kelimelerinden “kromatografi” terimi türeterek böylece bu terimi ilk defa kullanan kişi de olmuştur. Bu kromatografi tekniği, adsorbentler olarak bilinen katı materyallerin, molekülleri yüzeylerinde tutabilme yetenekleri prensibine dayanır. Adsorpsiyon, van der Waals ve hidrojen bağı tipindeki iyonik-olmayan çekim kuvvetleri ile özelleşmiş adsorpsiyon bölgelerinde meydana gelir. Bu bölgeler, moleküller arasında ayrım yapabilir. Adsorpsiyon kromatografisinde bu bölgeler, göreceli etkileşim güçlerine bağlı olarak, karışım içerisinde bulunan elüent moleküllerini ya da analitleri bağlar. Elüentin kolondan sürekli geçmesiyle, analitlerin bağlanma güçlerindeki farklılıklar, analitlerin ayrışmasını sağlar. Belirli bir analitin bağlanma gücü ise o analitin yapısındaki fonksiyonel gruplara bağlıdır. Hidroksil ve aromatik gruplar adsorpsiyon yüzeyi ile etkileşimi artırırken, farklı boyuttaki alifatik gruplar bu etkileşimi çok az etkilemektedirler. Genel olarak adsorpsiyon kromatografisinde, adsorpsiyon bölgesi ile molekülün tümünün değil de sadece özel bir grubunun etkileşmesi nedeni ile özgül grupların varlığı, basit moleküler boyuttan çok daha önemlidir. Tswett, yaptığı ayrıştırma çalışmalarının prosesini tanımlarken, bu metodun geniş bir uygulama alanı bulabileceği tahmininde de bulunmuştur. Kromatografik tekniklerin günümüzdeki uygulamalarına bakıldığında ise bu tahminin ne kadar yerinde olduğu da anlaşılmaktadır. Çünkü günümüzde, kromatografik sistemlerin dünya çapındaki yıllık ticaret hacmi milyar dolarlarla ifade edilmektedir. Bunun başlıca nedeni ise neredeyse bütün biyoteknoloji ve farmosötik sanayindeki biyomoleküllerle ilgili araştırmalarda, üretimde, analizde ve kalite kontrolünde özellikle HPLC olmak üzere, kromatografik sistemlerin kullanılıyor olmasıdır. Kromatografik sistemlerin uygulanmasında ise kolona uygulanan basnıca bağlı olarak farklı kromatografi sistemleri bulunmaktadır (bkz. kısım 2.6). Bu sistemler arasında düşük basınç (LPLC)

1 2

“On a New Category of Adsorption Phenomena and Their Application to Biochemical Analysis.” Tswett M (1906) Physikalisch-chemische Studien über das Chlorophyll. Die Adsorptionen. Ber Deutsch Bot Ges 24: 316– 323.

44

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ve yüksek basınç (HPLC) sıvı kromatografileri ise en yaygın olarak kullanılan kromatografik sistemlerdir. Bu nedenle, çeşitli kromatografik tekniklerin incelenmesine geçmeden önce bu bölümde LPLC’nin, bir sonraki bölümde ise HPLC’nin temel prensipleri üzerinde durulmaktadır. Düşük basınç sıvı kromatografilerinde (LPLC), durgun fazın oluşturduğu direnç nedeniyle hareketli sıvı fazın akışını güçleştirmesinden dolayı, akışı kolaylaştırmak üzere kolona 5 bar (1 bar = 0,1 MPa)’dan az bir basınç uygulanmaktadır. Uygulanan basıncın HPLC sistemlerinde uygulanan basınca oranla oldukça düşük olması nedeni ile LPLC’de kullanılan destek materyallerinin ve kolonların fiziksel özelliklerinde de bazı farklılıklar bulunmaktadır. Bu bölümde ise düşük basınçlı sıvı kromatografilerinin kullanıldığı saflaştırma tekniklerinde kromatografik sistemin bazı genel özellikleri üzerinde durulmaktadır. 3.2. Kullanılan Kolonların Özellikleri

Kolon kromatografilerinde iyi bir sonucun elde edilmesi sadece doğru bir kolon materyalinin seçilmesine değil, seçilmiş olan kolon materyalinin paketleneceği kolonun özelliklerine ve jelin kolona paketlenmesinin kalitesine de oldukça bağlıdır. Bu nedenle, kolonun yapımında kullanılacak malzeme, biyomoleküllerin kararlılığını koruyacak özelliklerde ve kolon yüzeyine özgül-olmayan (non-spesifik) bağlanmaları minimum düzeyde tutacak özelliklerde olmalıdır. Ayrıca, kolon yatağında herhangi bir kontaminasyonun veya tıkanmanın olması durumunda, kolon performansının yeniden restore edilebilmesi için yatak desteğinin kolayca değiştirilebilecek şekilde dizayn edilmiş olması gerekmektedir. LPLC’de kullanılan cam kolonlar, kolon destek materyalinin boşluk hacmini minimumda tutmak için, durgun fazı mümkün olduğu kadar kolon tabanına yakın tutmalıdırlar. Böylece, kolon materyali içerisinde ayrılmış olan analitlerin, kolon materyalinden ayrıldıktan sonra elüsyonu sırasında birbirine karışmasına yol açabilecek kolon yatak desteği altındaki boşluk, minimuma indirilmiş olur. Aynı şekilde, örnek materyalinin ve elüsyon sıvısının kolona uygulandığı uç da, uygulanan örneğin ve elüsyon sıvısının kolon yatağının üzerine eşit bir şekilde dağılmasını sağlayacak şekilde dizayn edilmelidir (Şekil 3.1). Ticari kolonlar ise ya kolon tabanının üzerine yerleştirilmiş olan cam yapıdaki gözenekli bir tabakaya sahiptirler ya da durgun faza desteklik görevi de yapan naylon yapıdaki gözenekli filtreyi tutmaya yarayan uygun bir parçaya sahiptirler. Ticari kolonlar için durgun faza destek oluşturacak daha ucuz alternatif metotlar ise az miktardaki cam yününün minimum miktarda kuartz kumu veya cam küreler ile birlikte tıkaç olarak kullanılmasıdır. Fakat, cam yününden veya kaba cam filtrelerden yapılmış yatak destekleri, kısa zamanda tıkanmalara neden olduğu için ve temizlenmelerinin oldukça zor olması nedeni ile önerilmemektedir.

Şekil 3.1: Kromatografi kolonuna tipik olarak bir örneğin yüklenmesi.

Kapiller tüpler ise normal olarak, kolondaki hareketli fazın yani elüsyon sıvısının dedektör ve/veya fraksiyon toplayıcılara iletilmesini sağlar (bkz. Şekil 2.2). Bazı kromatografik ayrıştırma sistemleri için ise ayrıştırma işlemi sırasında kolonun sıcaklığının sabit tutulması zorunludur. Kolon

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

45

sıcaklığının sabit tutulması ise en kolay yoldan ceket sistemine sahip olan kolonların kullanılması ile başarılır. Böylece, istenilen sıcaklığa ayarlanmış olan bir su banyosundaki su, kolonu saran ceket içerisine pompalanarak kolonun sıcaklığı istenilen sıcaklık sınırları içerisinde tutulabilir. Daha gelişmiş tekniklerde ise kolon, ya bir ısı bloğu içerisine yerleştirilmiş ya da termostat ile kontrol edilen bir fırın içerisine yerleştirilmiş olabilir. 3.3. Destek Materyalleri (Matriksler)

Matriks, durgun fazı desteklemek amacıyla kullanılan materyaldir. Belirli bir durgun faz için matriks seçimi, sabit fazın kromatografide başarıyla kullanılması açısından büyük önem taşır. Bir matrikste bulunması gereken özellikler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: •

İyi bir akış sağlamalı ve kolon boyunca meydana gelebilecek basınç düşmelerini minimize edebilmesi için yüksek mekaniksel kararlılığa sahip olmalıdır.

•

Kimyasal kararlılığı iyi olmalıdır.

•

Kolon materyalinin yatak hacmini küçültmek için, durgun fazın bağlanmasını sağlayan, yoğun fonksiyonel gruplara sahip olmalıdır.

•

Değişik partikül boyutları aralığında kullanılabilir olmalıdır.

•

Bazı kromatografilerde porlu yapıda matrikslerin kullanılması gerektiğinden, matriks porları doğru boyut ve şekilde olmalıdır.

•

Analitlerin seçici olmayan adsorbsiyonlarını minimize etmek için matriks yüzeyi inert olmalıdır.

Pratikte kullanılan en yaygın altı matriks ise şunlardır: 1. Agaroz: D-galaktoz ve 3,6-anhidro-L-galaktoz birimlerinden oluşmuş bir polisakkarittir (Şekil 3.2). Dallanmış polisakkarit zincirlerinin 2,3-dibromopropanol gibi ajanlarla çapraz-bağ yapması sonucunda, pH 3-14 aralığında kararlı jeller meydana gelir. Bu jellerin akış özellikleri iyi olmasına ve hidrofilik özellikleri yüksek olmasına rağmen, kurumalarına izin verilirse yapıları geri dönüşümsüz olarak bozulabilir. Sepharose ve Bio-Gel A ise bu jellere örnektir. (a)

Agaroz O

OH CH2OH O

O

O OH O

O OH D-Galaktoz

3,6-Anhidro-L-galaktoz

Şekil 3.2: Agaroz tipi jellerin (a) moleküler ve (b) jel yapısı.

46

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

2. Selüloz: Glikoz birimlerinin β-1-4 glikozid bağlarıyla bağlanması sonucunda oluşan bir polisakkarittir. Epiklorohidrin ile çapraz-bağ yaparak kolon matriksi olarak kullanılır. Çapraz-bağ sayısı ise matriksin por boyutunu belirler. Boncuk, mikrogranüler ve fibröz formlarda kullanıldığında pH kararlılığı ve akış özellikleri iyi olup, oldukça hidrofiliktirler. 3. Dekstran: α-1-6 bağlı glikoz birimlerinden oluşmuş bir polisakkarittir. Epiklorohidrin ile çapraz-bağ yaparak matriks olarak kullanılabilir, ancak asit hidrolizine karşı selüloz matrikslere oranla daha duyarlıdırlar. Dekstran, pH 12’ye kadar kararlı ve hidrofiliktir. Dekstran temelli matriksin ticari örneğini ise Sephadex oluşturur. 4. Poliakrilamid: Akrilamidin N,N’-metilen-bisakrilamid ile çapraz bağlanmasıyla oluşan bir polimerdir. pH 2-11 aralığında karalı olan akrilamid matriksin ticari örneğini ise Bio-Gel P oluşturur. 5. Polistiren: Stirenin divinilbenzenle çapraz-bağlanmasıyla oluşan bir polimerdir (Şekil 3.3). Polistiren matriksler, bütün pH aralıklarında kararlıdırlar. Jel filtrasyon ve iyon değiş-tokuş kromatografilerinde polistiren matriksler çoğunlukla kullanılırlar. Hidrofilik özellikleri ise diğer matrikslere oranla nispeten düşüktür.

Şekil 3.3: Polistiren/divinil benzen polimerinden oluşturulmuş küresel matriksin ışık mikroskobundaki görüntüsü.

6. Silika: Tipik bir adsorbent olan ve ortosilisik asitten oluşturulan silika, polimerik bir materyaldir. Silikanın yüzeyinde bulunan silanol (Si-OH) grupları ise bu polimere hidrofilik özellik kazandırır. Hafif asidik olan bu gruplar, analit veya elüentin polar fonksiyonel grupları ile etkileşir. Silikanın farklı ticari preparasyonlarında farklı topolojilerde (düzenlemelerde) bulunan bu silanol grupları, bu grupların farklı ayrıştırma özelliklerine sahip olmasını sağlar. Triklorometilsilan ile muamele edilerek fazla silanol grupları uzaklaştırılabilir. Silika matriksler ise pH 3-8 aralığında kararlıdırlar. Silika matrikslere oldukça benzeyen bir materyal ise porlu cam’dır. Porlu camın por büyüklükleri ise kontrollü olarak ayarlanabilmektedir. Porlu cam ise kimyasal olarak inerttir, fakat silika matriksler gibi pH 8’in üzerinde çözünme eğilimindedirler. 3.4. Durgun Fazlar

Durgun fazın kimyasal yapısı, uygulanacak olan kromatografik yönteme bağlıdır. Durgun fazların tüm detayları ise daha sonra ilgili kromatografi bölümlerinde ele alınmaktadır. Durgun fazların birçoğu, belirli bir şekil ve boyut aralığında matrikslere tutturulmuş olarak ticari halde bulunabilmektedir. Durgun fazların şekil ve boyut özellikleri, akış oranını ve çözünürlük karakterini etkilediğinden önemli özelliklerdir. Partikül boyutu büyüdükçe akış oranı artar; bunun aksine partikül boyutu küçüldükçe yüzey alanı/hacim oranı artar ve buna bağlı olarak da çözünürlük gücü artar. Pratikte ise her iki faktörün bir dengesi oluşturulmalıdır. En iyi paketleme ise küresel partiküllerle yapılır ve kullanılan durgun fazların çoğu küresel veya küresele yakın şekillerdir. Partikül boyutu ise genellikle ağ boyutu (mesh size) ile ifade edilir. Ağ boyutu ise bir elekte, bir inçte (~2,5 cm) yer alan açıklıkların bir ölçüsüdür. Bu nedenle, ağ boyutu büyüdükçe partikül boyutu küçülür. Kolon materyallerinde genellikle 100-120 ağ boyutu rutin olarak kullanılmasına rağmen, daha yüksek çözünürlük gerektiren çalışmalarda 200-400 ağ boyutu kullanılır.

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

47

3.5. Kolonun Paketlenmesi

Bütün kolon kromatografisi yöntemlerinde en önemli adımlardan birisi, kolonun paketlenme aşamasıdır. Çünkü kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. Bunun yanı sıra kolon kromatografisinde kullanılan matrikslerin mekaniksel dayanıklılıkları aynı derecede olmayabilir. Örneğin, jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan Sephacryl HR, Superdex ve Superose gibi jel materyalleri, Sephadex G serisi ve Sepharose CL ve B serilerine göre daha dayanıklıdırlar. Bu nedenle, dayanıklı olan jel materyallerinin paketlenmesi bir peristaltik pompa aracılığı ile sağlanan yüksek akış oranı altında gerçekleştirilebilir. Kolon kromatografisinde kullanılan matriksler ya kuru formda ya da önceden şişirilmiş formda temin edilirler. Şayet kullanılacak olan durgun faz materyali kuru formda temin edilmişse, paketlenmeden önce şişirilmesi gerekmektedir. Durgun fazların şişirilme yöntemleri ise ilgili kromatografik bölümlerde ele alınmaktadır. Kolon materyali önceden şişirilmiş ve kullanıma hazır olarak temin edilmişse gerekli seyreltmeden sonra paketleme işlemine geçilir. Jel matrikslerinin paketlenmesinde takip edilmesi gereken adımlar ise şu şekilde sıralanabilir: 1. Jel matriksi kolon içerisine dökülmeye uygun olacak şekilde seyreltilir. Böylece durgun faz ve hareketli fazdan oluşan bir süspansiyon (şerbet) elde edilir. Elde edilen şerbetin yoğunluğunun fazla olması, jel materyalinin kolon içerisine dökülmesi sırasında hava kabarcıklarının oluşmasına neden olur. Bu nedenle şerbetin yoğunluğu, jelin çökelmesi durumunda %75 jelden oluşacak bir süspansiyon şeklinde hazırlanmalıdır. Elde edilen jel süspansiyonunun gazı vakumlanarak alınmalıdır. Şayet jel materyalinin şişirilmesi kaynamakta olan su banyosunda yapılmışsa, vakumlamaya gerek yoktur. Paketleme işlemine başlanmadan önce jel süspansiyonunun sıcaklığı, kolonun kullanılacağı sıcaklığa ulaşmalıdır. 2.

Kolon bir laboratuvar sporuna dik olarak yerleştirilir. Kolonun bulunduğu yer, doğrudan güneş ışığı almamalıdır. Aksi halde kolonda meydana gelebilecek ısı değişikliği, kolon materyali içerisinde hava kabarcıklarının oluşmasına yol açacaktır. Kolon materyalinin seyreltilmesi için kullanılan hareketli fazın gazının alınmış olması ve ceket sistemine sahip olan kolonların kullanılması da ani sıcaklık değişimleri nedeni ile meydana gelebilecek etkilerin önlenmesinde yardımcı olacaktır.

3. Kolonun alt kısmında bulunan yatak destek filtresi altındaki ölü boşlukta hava kabarcığının kalmadığından emin olunmalıdır. Bu nedenle, jel materyali kolona doldurulmaya başlanmadan önce yatak destek filtresi altındaki ölü hacim su veya hareketli faz ile doldurulur. Daha sonra kolon çıkışı kapatılarak jel materyalinin kolona dökülmesine geçilir. 4. Kolon, hafifçe bir yana doğru eğilerek uygun şekilde süspansiyonu hazırlanmış olan jel materyali kolonun iç cidarı buyunca kolona dökülür. Dökme işlemi tamamlanır tamamlanmaz kolon tekrar dik bir pozisyona getirilmelidir. Jel materyalinin kolona doldurulmasında kullanılabilecek alternatif bir yol ise kolonun dik olarak bulunduğu pozisyonda doldurulmasıdır. Bu metotta jel süspansiyonunun kolona doldurulması, cam bir baget yardımı ile yapılır (Şekil 3.4,a). Şayet hazırlanmış olan jel şerbetinin hacmi, doldurulacak olan kolonun hacminden fazla ise kolonun tek bir partide doldurulması gerektiği için kolonun üst kısmına eklenebilen bir jel rezervuarının kullanılması uygun olacaktır (Şekil 3.4,b). Jel materyal süspansiyonunun yoğunluğunun aşırı derecede düşük olması ise kötü paketlenmiş bir kolonun elde edilmesine yol açacaktır. 5. İstenilen yatak yüksekliği (kolon içerisindeki jel materyalinin yani durgun fazın yüksekliği) elde edilinceye kadar şerbet kolona ilave edilir. Gerekli olan yatak yüksekliği elde edilince, jel yatağının üst kısmında kalan boşluk kolonun tepe noktasında 1 cm aşağıda olacak şekilde

48

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

hareketli faz ile doldurulur. Düzenli bir sedimentasyonun oluşması için kolon çıkışı açılarak hareketli fazın kolon boyunca akması sağlanır ve kolon materyali tamamen kolon içinde yerleşinceye kadar buna devam edilir.

Şekil 3.4: (a) Cam bir baget yardımı ile kolonun paketlenmesi. (b) Jel rezervuarı aracılığı ile bir kolonun paketlenmesi (Anonymous, 1998).

6. Kolona hareketli faz ilavesi veya örnek uygulaması sırasında, paketlenmiş materyalin yüzeyini bozmamak amacıyla, kolon yüzeyine bir filtre kağıdı veya gözenekli naylon veya yapay ipek yerleştirilebilir. Bazı ticari kolonlarda, hem kolon materyalinin yüzeyini bozmamak hem de hareketli fazın kolon materyali yüzeyine taşınması için kılcal bir boru aracılığı ile geçit sağlayan bir adaptör ve bir piston bulunur (bkz. Şekil 3.1). Kolon bir kez hazırlandıktan sonra hiç bir yerinin kurumasına izin verilmemelidir. Bu amaçla kolon yüzeyinde her zaman bir hareketli faz tabakası bulundurulur. İdeal bir kolon için, kolon yüksekliğinin kolon çapına oranı ve toplam yatak hacmi için genel değerler vermek çok zordur. Her iki parametre de kolonda ayrıştırılacak materyalin miktarını etkiler ve bu nedenle, bu parametrelerin belirlenmesi pratikte deneme-yanılma yoluyla saptanır. Örneğin jel filtrasyon kromatografisinde kolon yüksekliğinin kolon çapına oranı 10:1-20:1’e kadar olan değerler uygundur. 3.6. Paketlenmiş Kolonun Kontrolü

Bir kolonun paketlendikten sonra, paketlemenin kalitesi kontrol edilmelidir. Bu amaçla paketlenmiş olan cam kolonun arkasına yerleştirilen bir ışık kaynağından gelen ışığın, kolon yatağından geçen miktarı ölçülerek kolon yatağının düzenli olarak paketlenip paketlenmediği ve hava kabarcıklarının kalıp kalmadığı belirlenebilir. İyon-değiştirici materyallerle paketlenmiş olan kolonlarda, kolon yatağının düzenli olup olmadığının kontrol edilmesi amacıyla boyaların kullanılması durumunda ise oldukça dikkatli olunmalıdır. Çünkü boyaların çoğu oldukça kuvvetli yüklü gruplar taşımaktadırlar. Örneğin Blue Dextran 2000, anyon-değiştiricilere oldukça sıkı bir şekilde bağlanmaktadırlar. Paketlenmiş olan kolon yatağının kontrol edilmesi, bir test bileşiğinin kolona yüklenerek kuramsal levha sayısının (N) veya levha yüksekliğinin (H) hesaplanması ile daha kolay bir yoldan yapılabilir. Bu hesaplamaların yapılabilmesi için seçilen test bileşiğinin, kolon materyali ile etkileşim göstermemesi ve jelin iç kısımlarına kadar girebilmesi için ise düşük moleküler kütleye sahip olması gerekmektedir. Bu amaçla %1 (v/v)’lik aseton, aynı zamanda UV-absorbsiyonu ile de kolayca belirlenebilmesi nedeni ile bütün kromatografi materyalleri ile kullanılabilecek iyi bir test bileşiğidir. Test bileşiği kolona yüklenirken, yüklenen test bileşiğinin oluşturduğu zonun dar olmasını sağlamak amacıyla, mümkün olduğu kadar küçük hacimde yüklenmelidir. Optimal bir sonucun elde

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

49

edilmesi için, yaklaşık 30 μm çapındaki bir kolon materyali ile paketlenmiş olan kolona yüklenecek olan örnek materyal hacmi, kolon yatak hacminin ≤ %0,5’i kadar; ortalama 100 μm çapındaki bir kolon materyali ile paketlenmiş olan kolona yüklenecek olan örnek materyal hacmi ise kolon yatak hacminin ≤ %2’si kadar olmalıdır. Aynı zamanda, zonların ön ve arka kısımlarının dengeye ulaşmaması nedeni ile meydana gelen zon yayılmasını azaltmak için hareketli fazın lineer akış oranının düşük tutulması gerekmektedir. Bu amaçla, yaklaşık 30 μm çapındaki bir kolon materyalinin kullanıldığı durumda akış oranı 30-60 cm s–1, 100 μm çapındaki bir kolon materyalinin kullanıldığı durumda ise akış oranı 15-30 cm s–1 olmalıdır. Kuramsal levha sayısının (N) ve levha yüksekliğinin (H) hesaplanmasında ise aşağıdaki eşitlikler kullanılır: tR 2 N = 5,54 ( w ) 0,5

VR 2 N = 5,54 ( w 0,5 )

veya

H=

L N

(3.1)

(3.2)

Burada tR, örneğin yüklendiği andan örnek molekülünün oluşturduğu pikin tepe noktasına kadar olan süreyi; VR, örneğin yüklendiği andan örnek molekülün oluşturduğu pikin tepe noktasına kadar olan elüsyon hacmini; w0,5, örneğin oluşturduğu pikin yarı yükseklikteki genişliğini (Şekil 3.5); L, kolon yatağının yüksekliğini göstermektedir. tR, VR ve w0,5 değerlerinin ölçümü uzunluk (mm) veya hacim (mL) olarak yapılabilir fakat, bu parametrelerin hepsi de aynı birim ile ifade edilmelidir.

Şekil 3.5: Paketlenmiş olan bir kolonun test edilmesi için asetonun kullanılması durumunda elde edilen tipik bir UV kromatogramından H ve Af değerlerinin hesaplanması.

Kromatografik sistemlerde genel bir kural olarak H değeri, kullanılan kolon materyalinin ortalama partikül çapının 2-3 misli kadar olmalıdır. Örneğin, kullanılan kolon materyalinin ortalama partikül çapı 30 μm olduğu bir durumda H = 0,009-0,018 cm, 90 μm olduğu bir durumda H = 0,0180,027 cm olmalıdır. Paketlenmiş olan kolon yatağının dengeli bir şekilde paketlenip paketlenmediğini test etmede kullanılan diğer önemli bir parametre ise asimetri faktörü (Af)’dür: Af =

b a

(3.3)

Burada a, pikin %10 yüksekliğindeki birinci yarısının genişliğini; b ise pikin %10 yüksekliğindeki ikinci yarısının genişliğini ifade etmektedir (bkz. Şekil 3.5).

50

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Af değeri, mümkün olduğunca 1’e yakın olmalıdır. Kısa kolonlar için kabul edilebilir Af değeri 0,80-1,80 olabilirken; daha uzun olan jel filtrasyon kromatografilerinde bu değer 0,70-1,30 arasında olabilir. Kromatografi sonucunda elde edilen piklerin başlangıç kısmında meydana gelen bir uzama genellikle kolon materyalinin çok sıkı olarak paketlendiğine işaret ederken, pik kuyruklanması ise genellikle kolon materyalinin çok gevşek olarak paketlendiğine işaret etmektedir. Kolon yatağının dengelenmesi: Paketlenmiş olan kolon materyali, örnek bileşiklerinin ayrıştırılması için kullanılmadan önce, kolon yatak hacminin en az iki-misli hacimdeki başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmelidir. Kolonun dengelenmesi sırasında, kolona gönderilen hareketli faz ile kolondan ayrılan hareketli fazın değiştirilebilen-iyon derişimi, kondüktivitesi ve PH’sı, karşılaştırılmalıdır. Genellikle, kolondan ayrılan hareketli fazın pH’sını ölçmek bu amaç için yeterli olmaktadır. 3.7. Örnek Materyalinin Hazırlanması

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin derişimi, kompozisyonu, hacmi ve viskozitesi gibi parametreler iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. i. Örnek materyalinin derişimi: Kromatografi kolonuna uygulanacak olan örnek materyalinin miktarı, kullanılan kolon materyalinin dinamik kapasitesine ve arzu edilen çözünürlüğe bağlı olarak değişmektedir. En iyi çözünürlüğün elde edilebilmesi için ise kolona yüklenecek olan örnek materyalinin, paketlenmiş olan kolon materyalinin gösterdiği dinamik kapasitesinin %10-20’sini aşmaması önerilmektedir. Kromatografik tekniklerde kullanılan kolon materyallerinin dinamik ve kullanılabilir kapasitelerinin hesaplanması ile ilgili metodoloji ise kısım 6.7.2.1’de verilmektedir. ii. Örnek materyalinin kompozisyonu: Örnek materyalinin iyonik kompozisyonu, başlangıç tamponunun iyonik derişimi ile aynı olmalıdır. Şayet örnek materyali ile başlangıç tamponunun iyonik derişimleri aynı değilse, örnek materyalinin iyonik derişimi Sephadex G-25 gibi bir jel filtrasyon materyalinden geçirilerek, diyaliz edilerek, diafiltrasyon veya yoğun başlangıç tamponu ilavesi ile değiştirilebilir. iii. Örnek materyalinin hacmi: Örnek materyalinin hacmi, kullanılan kolon materyalinin tipine ve miktarına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, ayrıştırma işlemi iyon değiş-tokuş kromatografisi ile gerçekleştirilecekse örnek materyalinin hacmi çok da önemli değilken, jel filtrasyon kromatografisinde örnek materyalin hacmi iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi için oldukça önemlidir. Bu nedenle, örnek materyalinin hacmi ile ilgili konular ilgili kromatografik sistemlerin incelendiği kısımlarda yeniden ele alınmaktadır. iv. Örnek materyalinin viskozitesi: Örnek materyalinin viskozitesi, kolona yüklenecek olan örnek miktarını sınırlayabilir. Örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, zonların kararsız olmasına ve düzensiz akış profillerine yol açar. Bu durumda kritik olan değişken ise örnek materyalinin viskozitesinin hareketli fazın viskozitesine olan göreceli değeridir. Yaklaşık göreceli viskozite ise aynı hacimdeki örnek materyalinin ve hareketli fazın bir pipetten boşalma süreleri ile tahmin edilebilir.

Şayet örnek materyali, yüksek bileşik derişimi nedeni ile çok viskoz ise başlangıç tamponu ile seyreltilebilir. Nükleik asit kontaminasyonu nedeni ile meydana gelen yüksek viskozite ise polietilenimin veya protamin sülfat gibi poli-katyonik bir makromolekül ile çökeltme yolu ile giderilebilir. Nükleik asit nedeni ile meydana gelen viskozite, aynı zamanda endonükleazların kullanılması ile de düşürülebilir. Fakat bu tipteki katkı bileşiklerini içeren işlemler, endüstriyel

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

51

uygulamalarda çok da ilgi çekici bulunmamaktadırlar. Çünkü endüstriyel proseslerde son-ürün içerisinde bu tip katkı maddelerinin bulunmadığı kanıtlanmak zorundadır (bkz. kısım 1.6.1). v. Örnek materyalinin partikül içeriği: Bütün kromatografi formlarında iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi ve kolon ömrünün uzun olması, kolona yüklenen örnek materyalinin bazı özel maddelerden yoksun olmasına bağlıdır. Bu nedenle, “kirli” örnek materyallerin kolona yüklenmeden önce filtrasyon veya santrifügasyon ile temizlenmesi oldukça önemlidir. Örnek materyallerinin temizlenmesi, özellikle MiniBeads (3 μm), MonoBeads (10 μm), SOURCE (15 ve 30 μm) ve Sepharose High Performance (34 μm) gibi küçük partikül boyutuna sahip kolon materyalleri ile çalışılırken çok daha önemlidir.

Örnek materyalinin filtrasyonunda kullanılacak filtrelerin kalitesi ise kromatografide kullanılacak olan matriksin partikül boyutuna bağlıdır. Örneğin, 90 μm çapındaki partiküllerden oluşan bir matriks ile yapılacak olan kromatografide, örnek materyalinin filtrasyonunda 1 μm gözenek çapına sahip filtrelerin kullanılması yeterli olabilir. Fakat 3, 10, 15, 30 ve 34 μm partikül boyutuna sahip olan matrikslerin kullanılması durumunda, örnek materyalinin filtrasyonunda kullanılacak olan filtrelerin gözenek çapı 0,45 μm olmalıdır. Steril filtrasyonun veya ekstra temizlikte örnek materyallerinin elde edilmesi gerektiği durumlarda ise 0,22 μm gözenek çapına sahip filtreler kullanılmalıdır. Örnek materyali ise filtrasyondan sonra temiz görünmeli ve görünür şekilde lipidik kontaminasyon içermemelidir. Şayet, kolona yüklenen örnek materyalleri bulanık olursa kolonun ömrü, çözünürlüğü ve kapasitesi düşer. Örnek materyalleri, 10 000 g’de 5 dk süre ile santrifüjlenerek de hazırlanabilir. Bu metod, örnek materyalinin hazırlanması için ideal bir yöntem olmamakla birlikte, örnek materyal hacminin çok düşük olması durumunda veya örnek bileşiklerinin filtreye özgül olmayarak adsorblanması durumunda uygun olabilir. Lipid, tuz v.b. bileşikleri içeren ham örnek preparasyonları ise ayrıştırmanın yapılacağı ana kolondan önce yer alan, uygun ölçülerdeki Sephadex G-25 gibi matriks içeren bir jel filtrasyonundan geçirilerek temizlendikten sonra doğrudan ana kolona yükleme yapılabilir. Bu durumda, aynı anda hem örnek materyalinin temizlenmesi hem de ayrıştırmanın yapılacağı analitik kolona yüklemenin yapılması sağlanmış olur. 3.8. Örneklerin Kolona Yüklenmesi

Kolona hareketli faz ilavesi veya örnek uygulaması sırasında, paketlenmiş materyalin yüzeyini bozmamaya dikkat edilmelidir. Çünkü kolon yatağının yüzeyinde meydana gelecek bir bozulma nedeniyle oluşan düzensiz akış, hareketli fazın kolon boyunca da düzensiz olarak akmasına neden olacaktır. Kolon yatağının yüzeyinin bozulmasını önlemek amacıyla, yatak yüzeyinin üzerinde küçük bir hareketli faz tabakasının bulunması yararlı olmaktadır. Böylece, hareketli faz akışı nedeni ile yatak yüzeyinde oluşan türbülansın etkisi ile yatak yüzeyinin bozulması önlenebilir. Kolon boyunca hareketli fazın düzensiz olarak akışına neden olan bazı durumlar ise Şekil 3.6’da gösterilmektedir. Hazırlanmış olan kolonun üzerine örnek materyalinin yüklenmesi ile ilgili birkaç metot bulunmaktadır: i. Doğrudan kolon yatağının üzerine yükleme: Örnek materyalinin kolona yüklenmesinde en basit metot olan bu yöntemde önce, kolon materyalinin üst kısmında yer alan hareketli fazın bir kısmı, kolon yatağını bozmadan bir forsept yardımı ile emilerek alınır. Daha sonra, kolon yatağının üzerinde kalan az miktardaki hareketli faz, kolonun alt çıkış vanası açılarak hareketli fazın kolon yatağı boyunca akmasına izin verilerek, kolon yatağının üst kısmında kalan hareketli fazın kolon yatağının içerisine sızması sağlanır. Kolon yatağının üst kısmında yer alan hareketli faz, kolon

52

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

yatağının içine sızdığında kolon çıkış vanası kapatılır. Bu aşamadan sonra örnek materyali, bir pipet yardımı ile kolon yatağının yüzeyini bozmadan kolona yüklenir. Yüklenen örneğin kolon yatağı içerisine geçmesini sağlamak için kolon çıkış vanası yeniden açılarak, bir miktar hareketli fazın kolondan çıkmasına izin verilir ve örnek materyali, kolon yatağına geçtiğinde çıkış vanası tekrar kapatılır. Örnek materyalinin kolon yatağı içerisine geçmesi sağlandıktan sonra, çok az miktarda hareketli faz, aynı yöntemle kolona yüklenir. Böylece, kolon cidarındaki çok az miktardaki örnek kalıntılarının da kolon yatağına geçmesi sağlanır. Bu işlemden sonra kolon yatağının üzerine, yatak yüzeyini bozmadan, yatak yüzeyinden 2-5 cm yukarıya ulaşacak şekilde bir miktar daha hareketli faz eklenir. Daha önceden hazırlanmış olan hareketli fazı içeren rezervuar ise kolona bağlanarak, kolon yatağının üst kısmında yer alan hareketli fazın seviyesi (2-5 cm) korunur. Bu metot, oldukça basit ve en az sayıda ekipmana gereksinim duymasına rağmen, hassas bir şekilde uygulanması gerekmektedir. Metodun uygulanması sırasında kolon yatak yüzeyinin bozulması, örnek materyalinin dengesiz olarak yüklenmesine ve bantların karışmasına yol açmaktadır.

Şekil 3.6: Örneğin kolona yüklenmesinde karşılaşılan bazı problemler. (a) İdeal örnek yükleme: akış dengeli olarak kolon yatağının yüzeyine yayılmaktadır. (b) Camdan yapılmış gözenekli filtrenin bir kenarındaki boşluk nedeni ile bu boşluktan daha fazla sıvının akması sonucunda, kolon yatağının yüzeyine sıvı akışı düzensiz olarak gerçekleşmektedir. (c) Tüpten damlayan sıvının kolon yatağının yüzeyinde oluşturduğu çukurluk nedeni ile kolonun merkezindeki sıvı akışı daha fazla olmaktadır. (d) c’deki problem, kolon yatağının üzerinde bir miktar hareketli fazın bulundurulması sonucunda, hareketli fazın akışı ile meydana gelen türbülans engellenerek çözülebilir. (e) Örnek materyalinin içinde partiküllerin bulunması, yatak yüzeyinde tıkanıklığa neden olur. Bu durumda kolonun bir kenarında bir çukurluk meydana gelirse, bütün hareketli faz bu çukurluk boyunca akacağından oldukça düzensiz bir akış ve bunun sonucunda da çok kötü bir ayrıştırma gerçekleşir. Bu durumu önlemek için örnek materyali kolona yüklenmeden önce santrifüjlenmeli veya filtreden geçirilmelidir (Scopes, 1994).

ii. Örnek viskozitesinin artırılması: Alternatif bir metotta ise kolona örnek materyalinin yüklenmesinden önce ve sonra, kolon yatak yüzeyinin açığa çıkmasını sağlamak amacıyla kolondan bir miktar hareketli fazın akıtılmasından kaçınmak için, örnek materyalinin yoğunluğu artırılabilir. Örnek materyalinin yoğunluğunun artırılması ise örnek üzerine, genellikle %1 (w/v)’lik sukroz eklenmesi ile sağlanır. Yoğunluğu artırılmış olan örnek materyali, kolon yatağının üzerinde yer alan hareketli faza ilave edildiğinde doğal olarak çökerek, kolon yatağının yüzeyine yerleşecektir. Hareketli fazın kolondan akmasına izin verildiğinde ise yoğunluğu artırılmış olan örnek materyali, kolayca kolon yatağının içerisine geçmektedir. Bu metotla örnek materyalinin kolona yüklenmesi, başarılı bir sonuç vermektedir. Çünkü, yoğunluğu artırmak için kullanılan sukroz, örnek materyalinin kolondan elüsyonunu ve daha sonraki analizlerini etkilememektedir. iii. Bir adaptör aracılığı ile yükleme: Üçüncü bir metotta ise örnek materyalinin doğrudan kolon materyalinin yüzeyine aktarılmasını sağlayan bir adaptör (Şekil 3.7,a), kılcal bir boru ve/veya şırınga (Şekil 3.7,b) ya da peristaltik bir pompa kullanılabilir. Ayrıca, fazla miktarda örnek materyalinin yüklenmesi gerektiği durumlarda, bir vana aracılığı ile kolona bağlanabilen değişik

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

53

kapasitelere sahip örnek yükleme ilmeklerinin (loop) kullanılması da mümkündür. Önceden paketlenmiş olan kolonlara örnek materyallerinin yüklenmesi her zaman bu yöntemle yapılmalıdır. Bunun yanı sıra diğer kolonların çok sık kullanılması durumunda, örnek materyalinin bir adaptör aracılığı ile yüklenmesi kolonun kullanımı açısından oldukça güvenlidir. Örnek materyalinin bir adaptör aracılığı ile yüklenmesi ise kolondan elde edilen verim ve çözünürlük göz önünde bulundurulduğunda, burada verilen örnek yükleme metotları arasında en iyi sonucu vermektedir.

Şekil 3.7: (a) Bir adaptör ve (b) bir şırınga aracılığı ile örnek materyalinin kolona yüklenmesi (Anonymous, 1998).

Hangi metotla örnek yüklemesi yapılırsa yapılsın, kolonun fazla miktarda örnekle yüklenmemesine özen gösterilmelidir. Aksi halde düzensiz bir ayrıştırma işlemi gerçekleşir. Aynı zamanda örneği, mümkün olduğunca çok az miktardaki hareketli faz ile karıştırarak yüklemek, kromatografinin başlangıcında materyalin sıkı bir bant oluşturmasını da önlemektedir. 3.9. Örneğin Kolondan Elüsyonu

Yüklenen örnek içerisindeki bileşikler, hareketli fazın kolondan sürekli olarak geçmesi sonucunda birbirlerinden ayrılırlar. Ayrılmış olan bileşiklerin kolondan alınması ise elüsyon olarak adlandırılmaktadır. Elüsyon işlemi esnasında hareketli fazın kolondan akış oranının sabit tutulması zorunludur. Hareketli fazın akış oranının sabit tutulması ise en kolay yoldan yer çekimi ile sağlanabilir. Yer çekimi etkisi ile hareketli fazın akış oranının ayarlanması, kolondan daha yukarıda bulunan ve hareketli fazı içeren rezervuar seviyesi ile hareketli fazın kolondan çıktığı uç arasındaki yükseklik farkının ayarlanması ile oluşturulan potansiyel basınç sayesinde sağlanabilir. Bu amaçla kullanılan rezervuarlar ise açık erlenler ve beherler gibi sıradan kaplar değildirler. Çünkü, rezervuar içerisindeki hareketli fazın seviyesi, kolondan elüsyon işleminin ilerlemesi ile birlikte zamana bağlı olarak alçalır. Rezervuardaki hareketli fazın seviyesinin düşmesi ise rezervuar ile hareketli fazın kolondan çıkış ucu arasındaki potansiyel basıncın, başlangıç anındaki basınca oranla düşmesine neden olacaktır ve buna bağlı olarak da hareketli fazın akış oranı sabit kalmayıp değişecektir (azalacaktır). Bu problem ise rezervuardaki hareketli faz ile hareketli fazın kolondan çıkış ucu arasındaki basıncı sabit tutan ve özel olarak dizayn edilmiş olan Mariotte erleninin kullanılması ile giderilmektedir (bkz. Şekil 2.2,a). Fakat, Mariotte erleninin kullanılması ve elüsyon işleminin bütün bir gece boyunca devam etmesi durumunda ise hareketli faz rezervuarındaki (Mariotte erlenindeki) sıvının biterek, kolonun kurumasını önlemek için bazı önlemlerin alınması gerekmektedir. Oysa ki hareketli faz akışının peristaltik bir pompa ile sağlandığı sistemlerde böyle bir problem yoktur. Çünkü, peristaltik pompa zaman ayarlı bir güç kaynağına bağlanarak, saat ayarlı bir prize takılarak

54

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

veya pompayı kontrol eden bir fraksiyon toplayıcıya bağlanarak, istenilen bir süre sonunda durdurulabilir. Mariotte erleninin kullanılması durumunda ise böyle bir olanak olmadığı için hareketli fazın biterek kolonun kuruması güvenlik ilmeği ile önlenebilir. Güvenlik ilmeği ise ya kolon çıkışından sonra (Şekil 3.8,a) ya da kolon girişinden önce (Şekil 3.8,b) oluşturularak, Mariotte erlenindeki hareketli faz belirli bir süre sonra bitse dahi kolon boyunca hareketli fazın akışını durdurarak, kolonun kurumasını ve kolon içerisine havanın girmesini engellemektedir. Güvenlik ilmeğinin kolon çıkışından sonra oluşturulması durumunda, kolondan çıkan tüpün uç kısmı kolon seviyesinin yukarısında olacak şekilde ayarlanmalıdır. Böylece, kolon içerisine girmekte olan hareketli fazın seviyesi çıkış tüpünün seviyesine indiğinde akış duracaktır. Şayet güvenlik ilmeği kolon girişinden önce oluşturulmuşsa, bu durumda kolon çıkış tüpünün ucu, güvenlik ilmeğinin en alt kısmından biraz yukarıda olmalıdır. Böylece kolon içerisine girmekte olan hareketli fazın seviyesi, çıkış tüpünün seviyesine indiğinde akış yine duracak ve kolonun kuruması önlenmiş olacaktır.

Şekil 3.8: Güvenlik ilmeğinin oluşturulması. (a) Güvenlik ilmeği kolondan sonra, (b) kolondan önce oluşturulmuştur (Anonymous, 1998).

Hareketli fazın akış oranını sabit tutmak için kullanılan Mariotte erleninin alternatifi ise çok daha etkili bir sonuç veren peristaltik pompanın kullanılmasıdır. Peristaltik pompalar arasında en çok kullanılanı ise dönen tipte olanlarıdır (Şekil 3.9). Peristaltik pompalar ise hareketli sıvı fazı, silikon veya polivinilklorid tüpler aracılığı ile istenilen akış oranında kolona göndermektedirler. İstenilen akış oranının belirlenmesi için, pompaların ve çapları bilinen tüplerin kalibrasyonlarının yapılması zorunludur. Pompaların kullanımı sırasında kolon içindeki basıncın artarak, kolon materyalinin sıkışmasına ve bunun sonucu olarak da kolon yapısının bozulmamasına dikkat edilmelidir. Kolondan örnek materyalinin elüsyonu sırasında, tek bir hareketli fazın kullanılması ise izokratik elüsyon olarak adlandırılır. Buna rağmen, birçok durumda hareketli fazın ayrıştırma

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

55

gücünü artırmak için, bu fazın pH’sını, iyonik derişimini veya polaritesini sürekli olarak değiştirmek gerekmektedir. Bu tipteki uygulamaların yer aldığı elüsyon ise gradient elüsyonu olarak adlandırılmaktadır. İzokratik ve gradient elüsyonlarının uygulamaları ise ilgili oldukları kromatografik bölümlerde daha detaylı olarak incelenmektedir.

Şekil 3.9: Düşük basınçlı sıvı kromatografisinde genellikle kullanılmakta olan basit bir peristaltik pompanın şematik yapısı.

Uygun bir gradientin oluşturulması ise iki hareketli fazın (tamponun) kolona girmeden önce, uygun oranlarda karıştırılması ile sağlanır. Gradientin hazırlanması ise ya ticari olarak bulunan gradient karıştırıcılar (Şekil 3.10,a) ile ya da daha basit olarak şu şekilde başarılabilir: İki solüsyon, farklı iki hazneye konulur. Bu haznelerden birisi alıcı diğeri ise verici’dir.

Şekil 3.10: (a) Farklı hacimlerdeki gradient karıştırıcılar. (b) Gradient elüsyonu için kullanılabilecek basit bir gradient modeli. (c) Kromatografi çalışmalarında yaygın olarak kullanılan gradient tipleri.

56

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Alıcı hazne, bir ucundan kolona veya peristaltik pompaya bağlanırken diğer ucundan da bir vana aracılığı ile verici hazneye bağlanır (Şekil 3.10,b). Alıcı haznede bulunan solüsyonun bir kısmı kolona girmeye başladığında, verici haznede bulunan solüsyonun bir kısmı da alcı hazneden ayrılan solüsyonun yerini alır ve burada bir karıştırıcı aracılığı ile karıştırılır. Verici haznede bulunan solüsyonun, alıcı haznede bulunan solüsyona göre göreceli pH’sı, iyonik kuvveti veya polaritesi ise gradient oluşumunun yönünü belirleyecektir. Buna ilaveten, iki haznein göreceli çapı ve şekli ise gradientin zamana bağlı olarak lineer olarak mı (doğrusal), konveks olarak mı, yoksa konkav olarak mı değişeceğini belirler (Şekil 3.10,c). Çok daha gelişmiş olan sistemlerde ise iki farklı solüsyon, önceden belirlenmiş akış oranlarında, faklı iki pompa aracılığı ile bir karıştırma haznesine gönderilerek, burada karıştırıldıktan sonra kolona gönderilmektedir (bkz. kısım 4.11). Konveks gradient uygulamaları kromatografinin başlangıcında çok daha iyi ayrıştırma verirken, konkav gradient uygulamaları ise kromatografinin sonunda çok daha iyi ayrıştırma vermektedirler. 3.10. Dedektörler ve Fraksiyonların Toplanması

Kromatografi uygulaması ile kolon içerisinde ayrılmış olan analitler, kolondan çıkan elüent içerisinde bulunduklarından, bu analitlerin varlığını belirlemek gerekmektedir. Renkli olan analitlerin belirlenmesi göz ile tespit edilebilirken, renksiz olan bileşiklerin belirlenmesi için alternatif metotların bulunması zorunludur. Elüent içerisindeki analitlerin belirlenmesi, temel olarak ultraviyole absorbsiyonuna, flouresans spektroskopisine, elüentin refraktif indeksindeki değişikliğine veya bir radyoaktif emisyon atomunun varlığına bağlı olabilir (bkz. kısım 4.12). Bunların yanı sıra çok daha basit olarak, analitin oksidasyon veya redüksiyonuna bağlı olarak bir elektrokimyasal dedektör aracılığı ile de analitlerin belirlenmesi yapılabilmektedir (bkz. kısım 4.12.5). Biyokimyasal analizlerde, muhtemelen en yaygın olarak kullanılan dedektörler UV dedektörleridir. Bu dedektörlerden en iyi olanları ise 190-220 nm ve 260-280 nm dalga boylarında, proteinlerin belirlenmesine ve kuantifikasyonuna izin verenleridir (bkz. kısım 4.12.2). Kullanılabildikleri takdirde flouresans dedektörler, genellikle çok daha hassas sonuçlar vermektedirler, fakat bu tip dedektörler hareketli faz içindeki kirleticilere karşı çok daha duyarlıdırlar (bkz. kısım 4.12.3). Spektrofotometrik dedektörlerin hepsinde de çok küçük bir internal hacme (tipik olarak 8 mm3) sahip olan akışlı-küvetler (bkz. Şekil 4.10) kullanılmaktadır. Çalışılacak olan analiti içeren elüentin diğer bileşikleri içeren elüentlerden ayrılarak, istenilen analitin daha sonraki çalışmalarda kullanılabilmesi için ise elüentin fraksiyonlara ayrılması gerekmektedir. Elüentin fraksiyonlara ayrılması ise iki yöntemle yapılabilir: i. Kolondan gelen elüent sürekli olarak taranarak, istenilen analiti içeren fraksiyon toplanır. ii. Kolondan gelen elüent küçük hacimlere (1-10 mL) ayrılarak toplanır ve daha sonra, her fraksiyon istenilen analit için test edilir. Aranan analiti içeren fraksiyonlar ise birleştirilir.

Ticari olarak çok fazla çeşitlilikte fraksiyon toplayıcılar mevcuttur. Bu fraksiyon toplayıcılar, her bir tüp içerisine belirli bir hacimdeki elüenti toplamak üzere dizayn edilmişlerdir. Tüplere elüentlerin toplanması ise istenilen hacimdeki elüentin bir tüpte toplanmasından sonra, sıradaki boş tüpün otomatik olarak yer değiştirmesi ile sağlanmaktadır. Fraksiyon toplayıcılar ile tüplere toplanacak olan elüentin hacmi ise birkaç yoldan birisi ile belirlenir. Bu sistemlerden birisi, her bir tüp içerisinde önceden belirlenen hacimde elüent toplamayı sağlayan bir sifon ya da buna benzer bir sistemle çalışmaktadır. Diğer bir sistemde ise her bir tüpte toplanacak olan elüenti damla sayısına göre belirleyen elektronik bir sistem bulunmaktadır. Fakat bu sistemin az da olsa bazı sakıncaları bulunmaktadır. Bu sistemin kullanıldığı bir kromatografide, şayet elüentin kompozisyonu değişirse (örneğin, gradient elüsyonunda) buna bağlı olarak, bu elüentin yüzey gerilimi ve dolayısı ile damla hacmi de değişmektedir. Bu değişiklikler sonucunda ise her bir tüpte toplanan damla sayısı aynı olmakla birlikte hacimde değişiklikler olabilecektir. Diğer bir alternatif

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

57

fraksiyon toplama yönteminde ise her bir tüpe, sabit bir zaman aralığında elüentin toplanması sağlanmaktadır. Bu durumda ise şayet, kromatografi süresince hareketli fazın akış oranı değişirse, buna bağlı olarak tüplerde toplanan elüentlerin hacimleri de değişecektir. Fakat, akış oranının değişmesi ender rastlanan bir durum olduğu için pratikte en çok kullanılan fraksiyon toplayıcılar, sabit-zamanlı olarak toplama yapanlardır.

58

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

4. YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC)

4.1. Giriş

HPLC (High Performance Liquid Chromatography), biyoteknoloji ve farmosötik endüstrisi alanında yapılan çalışmaların araştırma aşamasından kalite kontrol ve onaylama aşamasına kadar olan bütün aşamalarında, moleküllerin tanımlanmasında, karakterizasyonunda ve saflaştırılmasında oldukça yaygın olarak kullanılan bir kromatografi tekniğidir. HPLC’nin bu kadar yaygın olarak kullanılmasının nedenlerinden birisi, sıvı içerisinde çözünün moleküllerin ayrıştırılmasını ve saflaştırılmasını sağlayan eşiz bir kromatografi tekniği olmasıdır. Bunun yanı sıra, 1970’li yıllardan günümüze kadar HPLC alanında kaydedilen gelişmelere paralel olarak, araştırma konularının temel amacı moleküllerin saflaştırılması ve karakterizasyonu olan biyoteknoloji ve biyokimya alanında da oldukça önemli ilerlemelerin kaydedilmesine yol açmıştır. HPLC, çözünme özelliği gösteren proteinlerden drog (ilaç ve ilaç etken maddeleri) maddelerine kadar oldukça geniş bir molekül sınıfının saflaştırılması ve analizi için çok geniş bir ayrıştırma tekniği sunmaktadır. Elektriksel olarak yüklü fonksiyonel gruplar içeren birimlerden oluşan proteinler ve nükleik asitler gibi büyük biyomoleküllerin (103 ile 106 Da) ayrıştırılması bir sıvı içerisinde gerçekleştirilmek zorundadır. Bu nedenle, 1950’li yılların sonuna doğru geliştirilmiş olan sıvı kromatografinin ilk uygulamaları, nükleik asitlerin ayrıştırılmasını amaçlamış olsa da daha sonraki sıvı kromatografi teknikleri proteinlerin ve nükleik asitlerin ayrıştırılması amacı ile geliştirilmiştir. Günümüzde ise HPLC, amino asitler, peptidler, proteinler, karbonhidratlar, nükleik asitler ve lipitler gibi çok farklı gruptaki moleküllerin analizinde kullanılan başlıca kromatografik teknik olmuştur. HPLC, yaklaşık olarak 30 yıllık bir teknik olmasına rağmen, kısa bir gelecekte bu tekniğin yerini alabilecek çok az sayıda rakip teknoloji bulunmaktadır. Biyoteknoloji ve farmosötik sanayinde biyomoleküllerin karakterizasyonu ve saflaştırılmasında HPLC’nin yaygın olarak kullanılması, bu konudaki bilgi birikiminin her geçen gün artmasına yol açmıştır. Bu nedenle bu bölümde, proteinlerin saflaştırılmasında ve analizinde HPLC tekniğinin kullanılması durumunda, göz önünde bulundurulması gereken temel prensipler üzerinde durulmaktadır. 4.2. HPLC’nin Avantaj ve Sınırlamaları

Daha önce verilmiş olan eşitlik 2.1 ve eşitlik 2.8’den de görülebileceği gibi kromatografi kolonunun ayrıştırma gücü, kolon uzunluğu ve birim uzunluk başına düşen kuramsal levha sayısının artmasıyla artar. Buna rağmen, kolon uzunluğunun artması piklerin genişlemesine neden olduğundan, ancak belirli bir limite kadar kolonun uzunluğu artırılabilir. Kuramsal levha sayısı durgun fazın yüzey alanıyla ilişkili olduğundan, durgun fazın partikül boyutu küçüldükçe, daha iyi ayrıştırma sağlanır. Ancak, kolon içindeki durgun fazın partikül boyutu küçüldükçe, hareketli fazın akmasına karşı koyan direnç de artar ve buna bağlı olarak, akma direnci büyür. Akma direncinin

60

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

büyümesi ise kolon içinde durgun fazın matriks yapısını bozabilecek bir geri-basıncın oluşmasına yol açar, böylece elüent akışı yavaşlar ve kolonun ayrıştırma gücü azalır. Yaklaşık 30 yıl kadar önce, kolon kromatografisi teknolojisinde bu basınca karşı dayanıklı, küçük partikül boyutlu durgun fazların kullanılabilirliğini sağlayan bir gelişme sağlanmıştır. Adsorbsiyon, dağılma (partisyon), iyon değiş-tokuş, jel filtrasyon ve affinite kromatografilerinde oluşturulan bu gelişmeler, daha hızlı ve daha iyi ayrıştırmanın sağlanması ile sonuçlanmış ve bunun sonucu olarak da son zamanlarda HPLC kullanımı artmıştır. HPLC tekniğinin yaygın olarak kullanılmasını sağlayan avantajlar ise şu şekilde sıralanabilir: • Hızlı olması (LPLC’de saatler süren bir ayrıştırma prosesi, HPLC ile dakikalara indirgenmiştir). • Yüksek çözünürlük sağlaması. • Yüksek duyarlılık sağlaması (femtogram-nanogran düzeyinde). • Tekrarlanabilirlik (±%1). • Yüksek oranda geri-kazanım. • Doğruluk. • Otomasyon. • Paslanmaz çelik kolonların uzun süre tekrar tekrar kullanılabilmesi.

HPLC tekniğinin sunmuş olduğu bütün bu avantajlara rağmen, bu tekniğin yaygın olarak kullanılmasını sınırlayan bazı faktörler de bulunmaktadır: • Sistemin maliyeti. • Sistemin kompleks olması. • Bazı bileşikler için duyarlılığın düşük olması. • Bazı durumlarda seri analizin zor olması. • Kolon materyaline geri-dönüşümsüz olarak adsorblanan bileşiklerin belirlenememesi. • Elüsyonları birlikte olan bileşiklerin belirlenmesindeki zorluklar. 4.3. HPLC Sistemleri

HPLC sistemlerini oluşturan ekipmanlar, Şekil 4.1’de şematize edildiği gibi bir hareketli faz rezervuarı, pompa, enjeksiyon valfi, kolon, dedektör, veri kaydedici sistem ve fraksiyonların toplanması arzu edildiği durumlarda ise bir fraksiyon toplayıcıdan meydana gelmektedir. Böyle bir sistemin en önemli parçasını ise, örnek moleküllerinin ayrıştırılmasının gerçekleştirileceği yer olan kolon oluşturmaktadır. Kolon içerisine paketlenmiş olan gözenekli durgun faz materyallerinin partikül çapları oldukça küçük (3-10 μm) olduğundan, kolon boyunca hareketli fazın akışı yüksek basınç sağlayan bir pompa aracılığı ile gerçekleştirilmektedir. Kromatografik proses ise örnek materyalinin, örnek yükleme valfi aracılığı ile kolona yüklenmesi ile birlikte başlamaktadır. Örnek moleküllerinin ayrıştırılması ise kolon boyunca moleküllerin ve hareketli fazın pompalanması esnasında gerçekleşmektedir. Ayrıştırılması gerçekleşmiş olan moleküller ise hareketli faz ile birlikte kolonu terk ederek (elüe olarak) dedektör tarafından dar bir bat (veya pik) olarak belirlenecektir. Kolondan elüsyonu gerçekleşen moleküllerin dedektör aracılığı ile belirlenmesi ise önemlidir. Elüsyonu gerçekleşen moleküllerin seçici veya genel olarak belirlenmesi ise kullanılan dedektörün tipine bağlıdır. Kolondan elüe olan her bir molekül için dedektörde meydana gelen sapma, bir grafik kaydedici veya bilgisayar ekranında görüntülenir ve böylece kromatografik ayrıştırmanın kromatogramı elde edilmiş olur. Ayrıştırılması gerçekleştirilen moleküllerin toplanması isteniyorsa, elüentin belirli hacimlerde veya zaman aralıklarında toplanmasını sağlayan bir

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

61

fraksiyon toplayıcı kullanılmalıdır. Kromatografik verilerin toplanması, saklanması ve analizi için ise genellikle bilgisayarlar kullanılmaktadır.

Şekil 4.1: İzokratik bir HPLC sistemini oluşturan ekipmanlar.

4.4. Matriksler ve Durgun Fazlar

LPLC’de olduğu gibi HPLC sistemlerinde de ayrıştırmanın yapıldığı kolonlar iki fazdan oluşmaktadır: durgun (katı) faz ve hareketli (sıvı) faz. HPLC sistemlerinde sıvı-sıvı kromatografileri ve yumuşak jellerin (agaroz gibi) kullanıldığı ender durumlarda, ayrıştırılması yapılacak olan örnek molekülleri kullanılan durgun faz partikülleri içerisine girebilirler. HPLC uygulamalarının büyük bir çoğunluğunu oluşturan diğer kromatografi sistemlerinde ise kullanılan durgun fazlar katı formda olduklarından, ayrıştırılması yapılacak olan örnek moleküllerinin durgun faz partikülleri içerisine girmesine izin vermezler. Dolayısıyla, bu tip HPLC uygulamalarında, kromatografik ayrıştırma prosesinde sadece durgun faz yüzeyleri rol almaktadırlar. Bu nedenle, HPLC kolonlarında kullanılan durgun fazlar birer adsorbent olarak değerlendirilmektedirler. Buna bağlı olarak, HPLC ile ayrıştırmanın temeli yüzey etkileşimine dayandığından, iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi, kullanılan matriksin adsorbsiyon yüzeyine bağlıdır. Bu nedenle LPLC’de kullanılan jel yapıdaki kolon materyallerinin aksine, HPLC’de kullanılan kolonlar için adsorbsiyon yüzey alanları geliştirilmiş olan katı formdaki kolon matriksleri (durgun fazlar) kullanılmaktadır. HPLC kolonlarında kullanılan matrikslerin ise 3 tipi mevcuttur: i. Mikro-gözenekli matriksler: Genellikle, 5-10 μm çapında olan, stiren-divinilbenzen gibi oldukça fazla oranda çapraz-bağ içeren polimer, silika veya zirkonia temelli olan partiküller arasında mikroporlar, dallanmış olarak bulunurlar (Şekil 4.2,a). ii. Pelliküler (yüzeysel gözenekli) matriksler: Gözenekli partiküller, cam kürecikleri gibi yaklaşık 40 μm çapındaki inert bir katı çekirdek üzerine kaplanırlar. iii. Bağlı fazlar: Durgun faz, silika gibi inert bir destek üzerine kimyasal olarak bağlanmıştır. HPLC kolonlarında en yaygın kullanılan destek materyali ise küresel olan ve partikül çapları 1,5 ile 10 μm arasında değişen porlu silika jellerdir (Şekil 4.2,b). Silika temelli destek materyallerinin porlu olanları olduğu gibi porsuz ve partikül çapı 1,5 μm olanları da mevcuttur.

62

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 4.2: HPLC kolonlarının paketlenmesinde kullanılan (a) mikro-gözenekli silika ve (b) küresel silika matriksleri.

Silika temelli matrikslerin tek dezavantajı ise pH değeri 7,5’in üzerinde olan sulu solüsyonlarda kolaylıkla çözünür olmasıdır. Bu nedenle, pH değeri 9 olan bir hareketli fazın 1 saatten fazla bir süre bu tip kolonlara gönderilmesi durumunda, silikanın tamamı ile çözünerek kolondan akması sonucunda kolon tamamen boşalabilmektedir. Şayet kullanılacak hareketli fazın pH değeri 7,5’in üzerinde olması gerekiyorsa, bu durumda en iyi alternatif stiren-divinilbenzen temelli olan matrikslerdir. Çünkü bu matriksler silika temelli matrikslere oranla daha geniş bir pH aralığında kararlı oldukları gibi aktif polar gruplara da sahip değildirler. Fakat stiren-divinilbenzen temelli matrikslerin de bazı dezavantajları bulunmaktadır. Çapraz-bağ derecesine bağlı olarak stiren-divinilbenzen temelli matriksler farklı solventler içerisinde şişebilirler veya büzülebilirler. Şişme ise polimerin por yapısının değişmesine, hatta bazı örnek moleküllerinin polimer içinde sıkışmasına yol açabilmektedir. Aynı zamanda, polimer yapısında yer alan ve polarize olabilen benzen halkaları nedeni ile kesin özgüllük de gösterebilmektedir. Bütün bu matrikslerde bulunması gereken özellikler ise şu şekilde sıralanabilir: • Partikül büyüklüğü 3-10 μm arasında olmalıdır. • Partikül büyüklüklerinin dağılımı mümkün olduğunca küçük olmalıdır, genellikle ortalama partikül büyüklüğünün %10’unu aşmamalıdır. • Porların büyüklüğü 7-30 nm arasında olmalıdır. • Adsorbent yüzey alanları 50-200 m2 g–1 olmalıdır. • Bağlı faz yoğunluğu (birim yüzey başına düşen adsorbsiyon bölgesinin sayısı) 1 nm2 alanda 1 ile 5 arasında olmalıdır. Bu durumda matriks yüzeyine bağlanan ligand tipine göre adsorbsiyon, normal faz (–OH, –NH2) veya ters-faz (C8, C18, Phenyl) ve hatta anyon (–NH4+) veya katyon (–COO–) değiştirici olabilmektedir.

Sıvı kolon kromatografilerinin sınıflandırılmasında çok farklı kriterler kullanılmaktadır. Şayet bu sınıflandırma, kullanılan durgun fazın doğal özelliklerine ve ayrıştırma prosesine bağlı olarak yapılacak olursa sıvı kolon kromatografisinin beş faklı tipi ortaya çıkmaktadır: i. Adsorbsiyon kromatografisi: Adsorbsiyon kromatografisinde kullanılan durgun fazlar, bir adsorbenttir (silika jel veya diğer silika temelli matriksler gibi) ve ayrıştırma, adsorbsiyondeadsorbsiyon adımlarının tekrarlanmasına bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Adsorbsiyon kromatografisi için değişik boyutlarda olabilen silika ve alüminyum gibi adsorbentler, mikrogözenekli veya pelliküler formlar olarak kullanılabilirler. Pelliküler sistemler genellikle yüksek verimliliğe sahiptirler fakat, düşük örnek kapasiteli sistemler olmaları nedeniyle, mikro-gözenekli destekler daha çok tercih edilmektedir. Adsorbsiyon kromatografisinin uygulanması ise durgun faz ve hareketli fazın göreceli polaritelerine bağlı olarak iki şekilde olmaktadır: a. Normal-faz kromatografisi (NPC): Normal faz sıvı kromatografisinde durgun faz olarak, doğal olarak kuvvetli polar olan silika jeller veya bir alkil nitril ya da bir alkil amin gibi polar bir bileşik

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

63

kullanılırken, hareketli faz olarak n-hekzan veya tetrahidrofuran gibi bir polar-olmayan solvent kullanılır. Böylece kolona yüklenmiş olan örnek molekülleri arasında polar olanlar, kolon materyali üzerinde adsorblanarak daha az polar olan moleküllere göre, kolon içerisinde daha uzun kalacaklardır. b. Ters-faz kromatografisi (RPC): Ters-faz sıvı kromatografisi ise NPC’nin tersidir. Bu nedenle, RPC’de durgun faz olarak oktasilan (OS) veya oktadesilsilan (ODS) gibi bir polar-olmayan (hidrofobik) bileşik kullanılırken; hareketli faz olarak ise su/asetonitril veya su/metanol gibi polar bir çözücü kullanılır. Bu durumda ise kolona yüklenmiş olan örnek materyalindeki polar-olmayan moleküllerin elüsyonu, polar olanlara oranla daha sonra gerçekleşecektir. ii. İyon değiş-tokuş kromatografisi: İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan matrikslerin yüzeyine, ayrıştırılması yapılacak olan molekülün net elektriksel yükünün aksi bir elektriksel yüke sahip fonksiyonel gruplar bağlanır. Bu nedenle, iyon değiş-tokuş kromatografisi iyonik veya iyonlaşabilen moleküllerin ayrıştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz. 6. Bölüm). HPLC için uygun olan çok sayıda ve farklı tipte iyon-değiştirici kolon materyalleri mevcuttur. Bu iyon-değiştirici materyallerde, çapraz bağlı, mikro-gözenekli polisitiren reçineleri yaygın olarak kullanılır. Bağlı-faz yapıda iyon-değiştiriciler olan pelliküler reçineler de mevcuttur. Bunlar, çapraz bağlı silikon ağına kovalent olarak bağlanmışlardır. Bu reçineler, sıkı (dayanıklı) reçineler olarak sınıflandırılırlar ve analiz sırasında oluşan yüksek basınca dirençlidirler. iii. Jel filtrasyon kromatografisi: Jel filtrasyon kromatografisinde moleküllerin ayrıştırılması, moleküler büyüklüklerine bağlı olarak gerçekleştirildiğinden (bkz. 5. Bölüm), durgun faz olarak genellikle farklı gözenek büyüklüğüne sahip olabilen gözenekli silika, cam, polisitiren veya polivinilasetat küreleri kullanılmaktadır. Bunlar, genellikle elüsyon için organik bir çözücünün kullanıldığı sistemlerde kullanılırlar. Sephadex veya Bio-Gel P gibi yarı-sert jeller ve Sepharose ve Bio-Gel A gibi yumuşak jeller, sadece düşük basınçlara dirençli olduklarından HPLC’de pek kullanılmazlar. iv. Partisyon (dağılma) kromatografisi: Partisyon kromatografi sistemlerinde ise durgun faz, ya inert mikro-gözenekli destek materyaline ya da pelliküler destekler üzerine kaplanabilir. Desteğin sıvı fazla kaplanmasının dezavantajlarından birisi ise sıvı fazın kullanılan hareketli faz ile yıkanarak kaybolmasına yol açabilmesidir. Bu problemi ortadan kaldırmak için, destek materyali silika olan, bağlı fazlar geliştirilmiştir. v. Affinite kromatografisi: Affinite kromatografisi ile ayrıştırmada kullanılan matriksler, jel filtrasyonu ile ayrıştırmada kullanılan destek materyallerine benzer. Ayırıcı (spacer) kol ve ligand, geleneksel düşük basınç affinite kromatografisinde kullanılanlara benzer şekilde, bu desteklere kimyasal olarak tutturulur (bkz. kısım 8.3.2). Tablo 4.1’de ise HPLC’de yaygın olarak kullanılan bazı destek materyalleri verilmektedir. 4.5. HPLC Kolonları

HPLC’de kullanılan kolonlar (Şekil 4.3) genellikle paslanmaz çelikten yapılmış, 5,5 x 107 Pa basınca dayanıklı kolonlardır. Genellikle 10, 15 ve 25 cm uzunluğunda, 4 veya 4,6 mm iç-çapa sahip kolonlar, örnek kapasitesi, hareketli faz tüketimi, kromatografinin hızı ve çözünürlüğü arasında ideal bir dengenin oluşturulmasını sağladığı için en çok kullanılan HPLC kolonlarıdır. Çoğunlukla bu ölçülerdeki kolonlar kullanılmasına rağmen, daha küçük mikro-çaplı kolonlar (1-2 mm çapında) da mevcuttur. HPLC’de kullanılan kolonların iç-çapları, sadece kolona yüklenecek örnek materyal miktarını ve hareketli fazın akış oranını etkiler. Genel bir kural olarak, moleküllerin aynı elüsyon zamanlarında elüe edilebilmesi için bir kolonun iç-çapı iki-kat artırıldığında, hareketli fazın akış oranını dört-kat (kolon iç-çapının karesi kadar) artırmak gerekmektedir. Bu durumda, kolona yüklenecek olan örnek materyal miktarı da aynı oranda artırılabilir. Bunun aksine, kolonun

64

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

iç-çapı iki-kat düşürüldüğünde ise hareketli fazın akış oranı ve örnek materyal miktarı ise dört-kat azaltılır. Örneğin, 4,6 mm iç-çapa sahip bir kolona, 10 μL örnek materyalinin yüklenerek, akış oranının 1 mL dk–1 olarak seçildiği koşullarda geliştirilen bir metodu, 1 mm iç-çapa sahip bir kolon için adapte etmek isteyelim. Bu durumda hareketli fazın akış oranını 4,62 = 21,16 defa azaltmak (~ 47 μL dk–1), yüklenecek örnek materyal miktarını ise ~ 0,5 μL’ye düşürmek gerekecektir. Böyle bir analizin yapılabilmesi ise ancak özel bir pompanın ve mikro-enjektörün kullanılması durumunda gerçekleştirilebilir. Bu arada unutulmaması gereken önemli bir nokta ise özellikle kolonun iç-çapının düşürülmesi durumunda, dedektörün akışlı-küvet kapasitesinin de tutarlı olmasına dikkat edilmelidir. Tablo 4.1: HPLC durgun fazlarının bazı örnekleri. Kromatografik ayrıştırma prensibi

Ticari ismi

Durgun fazın özelliği

Destek tipi

Adsorbsiyon

Partisil C8 Corasil Pellumina Partisil MikroPak A1

Oktasilan Silika Alüminyum Silika Alüminyum

Porlu Pelliküler Pelliküler Mikroporlu Mikroporlu

Partisyon

Bondapak-C18/Corasil μBondapak-C18 ULTRApak TSK ODS μBondapak-NH2 ULTRApak TSK-NH2

Oktadesilsilan (ODS) Oktadesilsilan Oktadesilsilan Alkilamin Alkilamin

Pelliküler Porlu Porlu Porlu Porlu

Partisil-SAX MikroPak-NH2 Partisil-SCX AS Pellionex-SAX Zipak-WAX Perisorb-KAT

Kuvvetli baz Zayıf baz Kuvvetli asit Kuvvetli baz Zayıf baz Kuvvetli asit

Porlu Porlu Porlu Pelliküler Pelliküler Pelliküler

Bio-Glas Styragel Superose Fractogel TSK

Cam Polisitiren-divinilbenzen Agaroz Polivinilklorid

Sert katı Yarı katı Yumuşak jel Yarı katı jel

İyon değiş-tokuş

Jel filtrasyonu

Normal HPLC kolonları 2 mL dk–1’lık bir akış oranı sağlarken, mikro-çaplı kolonlar 0,05-0,20 mL dk ’lık bir akış oranı sağlarlar. Fakat HPLC ile ayrıştırılması yapılan moleküllerin toplanması gerekiyorsa (preparatif-ölçekli), daha büyük boyutlardaki kolonların kullanılması gerekebilir. Bu durumda, 100 mL dk–1’lık akış oranı sağlayan, iç-çapı 25 mm olan preparatif kolonlar da mevcuttur. HPLC’de kullanılan en iyi kolonlar ise kolon materyalinin çok iyi bir şekilde paketlenmesini sağlamak amacı ile iç cidarı sırlanmış olan kolonlardır. –1

Şekil 4.3: Değişik boyutlardaki HPLC kolon örnekleri.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

65

Kolona paketlenen kolon materyalini, kolon içerisinde alıkoymak için kolonun uç kısımlarına paslanmaz çelik veya teflondan yapılmış, gözenekli tıkaçlar yerleştirilir. Bu tıkaçların, elüsyon sıvısının kolonda düzenli akışını sağlayabilmesi için homojen olması gereklidir. Sıvı dağılma (partisyon) kromatografisi ve iyon değiş-tokuş kromatografisi gibi bazı kromatografik ayrıştırmalarda ise kolon sıcaklığının oda sıcaklığının biraz üzerinde tutulması (60 °C’a kadar) genellikle bir avantaj sağlamaktadır. Bir HPLC kolonu alırken göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktör, kolonun iyi bir şekilde paketlenip paketlenmediğini tahmin etmektir. Bir kolonun paketlenme kalitesi ise o kolondan beklenen verimliliğin altında bir verimlilik elde edilmesi sonucunda anlaşılır. Beklenenden düşük bir verimlilik veren kolon ise gevşek olarak paketlenmiş anlamına gelmektedir. Kolon materyalinin gevşek olarak paketlenmesi, kolonun kullanılması sırasında uygulanan basınç nedeni ile kolon materyalinin sıkışması sonucunda, kolonun üst kısmında bir boşluk oluşmasına yol açacaktır. Kolonun üst kısmında oluşacak böyle bir boşluk ise bir karıştırma haznesi olarak iş görecek ve bunun sonucunda da kolonun verimliliği bariz bir şekilde düşecektir. Burada en önemli sorun ise bir HPLC kolonundan nasıl bir verimliliğin beklenmesi gerektiğidir. Bir kolonun verimliliğini etkileyen temel faktörler ise şu şekilde sıralanabilir: • Kolonun uzunluğu. • Kolon materyalinin partikül büyüklüğü. • Kolon materyalinin şekli. • Kolon materyalinin partikül büyüklük dağılımı.

Bütün bu parametreler kolonda meydana gelecek geri-basıncı da etkileyecektir. Kolon materyalinin partikül boyutlarının dağılımının geniş olması, kolonun verimliliğini düşürmekte ve geribasıncı artırmaktadır. Kolon materyalinin düzensiz şekillerde olması ise her zaman düşük verimlilikle sonuçlanmaktadır. Fakat, ticari olarak bulunun HPLC kolonlarında kullanılan matriksler çoğunlukla küreseldirler. Bu nedenle, ticari bir HPLC kolonu satın alınırken göz önünde bulundurulması gereken en önemli iki parametre, kolonun uzunluğu ve kolon materyalinin partikül boyutu olmalıdır. Çünkü, bir kolonun verimliliği ve kolonda oluşan geri-basınç, kolonun uzunluğu ile orantılıdır. Bunun anlamı ise kolon uzunluğunu istediğiniz kadar artıramazsınız. Kromatografi ile ayrıştırılması yapılacak örnek materyalindeki moleküllerin iyi bir çözünürlük vermesi, bizim için çok daha önemlidir. Çözünürlük ise √N ile orantılı olduğundan (bkz. eşitlik 2.8), kolon uzunluğunu ve verimliliğini iki-misli artırmak demek çözünürlüğün 1,4-misli artırılması ile sonuçlanırken, kolon ters-basıncının da iki-misli artması ile sonuçlanması demektir. Bu durumu daha iyi anlayabilmek için Tablo 4.2’yi inceleyelim. Tablo 4.2: Farklı uzunluklardaki kolon verimliliklerinin karşılaştırılması. Kolon no

Kolon uzunluğu (cm)

Verimlilik

Özgül verimlilik

10

Partikül çapı (μm) 3

1

11,111

3

2

10

5

10,526

1,9

3

15

5

13,636

2,2

4

25

5

15,625

3,2

5

25

10

10,280

2,5

Özgül verimlilik, her bir kuramsal levha başına düşen partikül sayısıdır. Diğer bir deyişle özgül verimlilik, tek bir ayrıştırma adımının gerçekleştirilmesi için gerekli olan partikül sayısıdır.

66

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Dolayısıyla, iyi bir kolon verimliliğinin sağlanmasında bu sayının mümkün olduğu kadar düşük olması gerekir. Tablo 4.2’den de görüldüğü gibi, 2. 3. ve 4. kolonlar aynı partikül büyüklüğündeki kolon materyali ile paketlenmiş olmasına rağmen kolon uzunlukları farklıdır. Bu durumda ideal olarak, bu kolonların verimliliklerinin kolon uzunluğu ile orantılı olarak artması beklenir. Fakat gerçekte ise bu kolonların verimliliklerine bakıldığında, verimliliğin kolon uzunluğu ile orantılı olarak artmadığı görülmektedir. Çünkü, kolon uzunluğu 10 cm’den 25 cm’ye, 2,5-kat artırılmasına rağmen (2. ve 4. kolon) bu kolonlarla elde edilen verimlilik ancak 0,5-kat artmıştır. Özgül verimlilik değerinin ise mümkün olduğunca düşük olması gerekirken, bu kolonların özgül verimlilik değerlerinde de bir artış (1,9’dan 3,2’ye) meydana gelmiştir. Kolon uzunluğunun 2,5-kat artmasına rağmen verimliliğin ancak 0,5-kat artmasının nedeni ise kolon materyalinin paketlenme prosedürüdür (bkz. kısım 4.6). Genel olarak iyi paketlenmiş HPLC kolonları oldukça dayanıklı olup, kolon materyaline zarar verecek kuvvetli asidik veya bazik solüsyonlar kullanılmadığı ve kolona sık sık yüklenen örnek materyali kirli olmadığı sürece, kolonun ayrıştırma özelliklerinde bir kayıp olmadan uzun bir süre kullanılması mümkündür. Bazı durumlarda ise kolon henüz yeni iken, belirli koşullar altında standart bileşikleri içeren bir karışımın kromatografisi yapılarak elde edilen kromatogramın saklanması mantıklı bir davranış olmaktadır. Çünkü, kolonun uzun süre kullanılması veya saklanmasından sonra elde edilen sonuçlar şüphe uyandıracak olursa, standart bileşiklerden oluşan karışım önceki koşullarda yeniden kolona yüklenerek yeni bir kromatogram elde edilir. Böylece, aynı koşullarda aynı bileşikler için elde edilen kromatogramlar karşılaştırılarak, kolonun özelliklerinin değişip değişmediği hakkında fikir edinilebilir. 4.6. HPLC Kolonun Paketlenmesi

Özel kolon materyalleri ile paketlenmiş, özel yapı ve boyutlarda ticari HPLC kolonları mevcuttur. Çoğu araştırmacı ise daha ucuz olduğundan, kendi kolonunu kendi doldurmayı tercih etmektedir. Fakat kullanılan kolonların iç-çapları oldukça dar olduğundan, HPLC kolonlarının paketlenmesi için özel becerinin ve ekipmanların olması gerekmektedir. Çeşitli kolon paketleme yöntemleri vardır. Bu paketleme yöntemleri, paketlenecek materyalin yapısına ve partikül boyutuna bağlı olarak belirlenir. Kolon paketlemede en önemli nokta, çatlak veya kanallı olmayan, iyi sıkıştırılmış düzgün bir durgun faz yatağı oluşturmaktır. Sert katılar ve sıkı jeller, paketleme işlemi sırasında partiküllere zarar vermeden mümkün olduğu kadar yoğun olarak yüklenmelidir. Kolonun paketlenmesinde en çok kullanılan teknik ise yüksek basınçlı şerbet tekniği’dir. Bu teknikte, yoğunluğu, paketleme yoğunluğuna eşit olan bir çözücü ile paketleme materyalinin bir süspansiyonu (şerbet) hazırlanır. Çıkış ucunda gözenekli bir tıkaç bulunan kolonun içine yüksek basınçta (genellikle 600 bar’lık sabit basınçta) hızla şerbet pompalanır. Paketleme prosesinin başlangıcında boş kolon içerisine gönderilen şerbet, sabit basıncın etkisi ile kolon boyunca çok hızlı olarak hareket etmektedir ve bu hızlı akış nedeni ile meydana gelen türbülansın etkisi ile kolon materyali, kolonun çıkış ucunda yoğun ve uniform olarak dağılan bir yatak oluşturmaktadır. Fakat paketleme prosesi devam ettikçe, kolon içersinde kademeli olarak yükselmeye başlayan yatak, akışa karşı olan direnci de artırmaya başlar. Paketleme prosesinin sabit basınçta yapılıyor olması ve paketleme materyali olarak kullanılan porlu silika partiküllerinin daha yüksek basınçta parçalanması nedeni ile basıncı daha fazla artırma şansımız da bulunmadığı için, paketleme prosesinin ilerleyen safhalarında şerbetin akış oranı düşmeye başlar. Düşük akış oranında ise kolon materyali, yoğun ve uniform bir yatak oluşturamadığından kolon yatağının üst kısmı taban kısmına göre çok az da olsa daha gevşek olmaktadır. Kolon yatağının tabanı ile üst kısmı arasındaki bu farklılık ise kolon uzunluğu arttıkça daha da belirgin hale gelmektedir.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

67

Tek bir kuramsal levha başına 2 ile 2,5 partikülün düştüğü paketlemeler, kolon paketlemede optimum verimlilik olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, kullanılan kolon matriksinin partikül çapı 3 μm ise 10 cm veya daha kısa kolonların, matriks çapı 5 μm ise 15 cm civarındaki kolonların, matriksin partikül çapı 10 μm ise 25 cm’lik kolonların kullanılması gerekmektedir. Çok daha uzun kolonların kullanılması ise kolon uzunluğuyla orantılı olarak geri-basıncın artmasına neden olurken, verimlilikte fazla bir avantaj sağlamayacaktır. Optimum olarak hazırlanan durgun faz yatağı, daha sonra hareketli fazın kolondan geçirilmesi ile kullanıma hazır hale getirilir. Paketlemede sıkı jeller kullanıldığında, yüksek basınç altında kolona paketlenmeden önce bunların çözücü içerisinde şişirilmesi gerekir. Yumuşak jeller ise basınç altında paketlenemez ve bunların LPLC’deki kolon paketleme (bkz. kısım 3.5) şekline benzer bir şekilde paketlenmesi gerekir. 4.7. HPLC Hareketli Fazları

HPLC sistemlerinde hareketli faz rezervuarları olarak, genellikle cam şişeler kullanılmaktadır. HPLC sistemleri üreten firmalar, genellikle özel kapaklı olan bu şişelerle birlikte teflon tüpleri, hareketli fazın filtre edilmesini sağlayan filtreleri ve hareketli faz içerisindeki çözünmüş gazın uzaklaştırılması için gerekli olan temizleme gazını (helyum) da sistemle birlikte sağlamaktadırlar. Herhangi bir ayrıştırma tekniğinde kullanılacak olan hareketli fazın seçimi, uygulanacak ayrıştırmanın tipine bağlıdır. Bu nedenle, HPLC’de kullanılan hareketli fazlar oldukça değişken olmasına rağmen, bu hareketli fazların sahip olması gereken bazı temel özellikler bulunmaktadır. Bu özellikler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: • Saf olarak temin edilebilmelidir. • Dedektör ile uyumlu olmalıdır. • Örnek moleküllerinin çözünmesine izin vermelidir. • Viskozitesi düşük olmalıdır. • Kimyasal olarak inert olmalıdır. • Ucuz olmalıdır.

HPLC sistemlerinde kullanılacak bütün çözücüler, kullanılmadan önce özellikle filtrelerden geçirilerek temizlenmelidir. Çünkü, çözücü içindeki safsızlıklar kolonu ve dedektör sistemini olumsuz yönde etkileyebilmektedirler. Bu durum, özellikle 200 nm’nin altında absorbansın ölçüldüğü durumlarda çok etkilidir. HPLC sistemlerinde kullanılmak üzere saflaştırılmış olan çözücüleri ticari olarak elde etmek de mümkündür. HPLC sistemlerinde saf, ticari çözücüler kullanılsa dahi, bu çözücüleri kolona pompalamadan önce mutlaka 1-5 μm gözenek çapına sahip olan mikro-filtrelerden geçirmek gerekmektedir. HPLC sistemlerinde kullanılan hareketli fazların pompalanmasında en çok karşılaşılan problem ise hareketli fazın çözünmüş gazlardan arındırılması (gazsızlaştırma)dır. Bu nedenle, HPLC sistemlerinde kullanılan bütün çözücüler, kullanılmadan önce gazsızlaştırılmalıdır (çözücü içindeki çözünmüş hava giderilmelidir). Aksi taktirde, pompalar içinde gaz sıkışması meydana gelebileceği gibi yüksek basıncın etkisi ile çözünmüş olan gazlar kolon çıkışında veya dedektörde basıncın düşmesi ile gaz kabarcıklarına dönüşerek, hareketli fazın akışında ani kaymalara neden olabilir. Mikroskobik hava kabarcıkları nedeni ile meydana gelen ani kaymalar ise hareketli fazın akış debisini etkileyerek, kolon çözünürlüğünün değişmesine yol açabilecek heterojen bir akışın oluşmasına yol açabilir. Ayrıca, bu mikroskobik hava kabarcıkları sürüklenerek daha büyük hava kabarcıklarının oluşmasına ve elüsyon sıvısının sürekli olarak kontrol edilmesini sağlayan akışlıküvetlerin hava ile dolmasına yol açabilir.

68

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Hareketli fazlarda gaz kabarcıklarının oluşmasına neden olan en önemli problem ise özellikle su olmak üzere, polar çözücülerde çözünen ve havadan kaynaklanan oksijendir. Bu nedenle gaz sıkışması, hareketli faz olarak özellikle sulu metanol ve etanolün kullanıldığı durumlarda meydana gelme eğilimindedir. Gazsızlaştırma ise farklı birkaç yolla gerçekleştirilebilir. Bu yollar arasında, çözücüyü ısıtmak, manyetik karıştırıcıyla şiddetli bir şekilde karıştırmak, vakumlamak, ultrasonikasiyona tâbi tutmak ve çözücü içinden helyum gazı geçirmek bulunmaktadır. Çözünmüş gazın uzaklaştırılması için su içeren hareketli fazların helyum ile yıkandıktan sonra, yine helyum içeren koşullarda depolanması ise su içeren hareketli fazlardaki gazın giderilmesi için yeterli olmadığı belirlenmiştir. Bu nedenle, bu tip hareketli fazlara vakum uygulandıktan sonra helyum altında depolanması önerilmektedir. 4.8. HPLC Pompaları

Hareketli fazın dağıtımı için kullanılan pompalama sistemleri, HPLC sistemlerinin en önemli özelliklerinden biridir. Çünkü, sıkı bir şekilde paketlenmiş olan durgun faz boyunca hareketli fazı akışının sağlanması için hareketli fazın zorlanması, bu nedenle de yüksek bir basıncın uygulanması gerekmektedir. Özellikle çok küçük partikül çapına sahip kolon materyalleri ile paketlenmiş kolonların kullanılması durumunda, hareketli fazın çok daha yüksek bir basınç ile kolona pompalanması gerekmektedir. Küçük partikül çapına sahip kolon materyallerinin, yüksek çözünürlük sağlaması, analizlerin çok daha hızlı olarak gerçekleştirilmesini sağlaması ve örnek yükleme kapasitesini artırması gibi çok fazla avantajı bulunmakla birlikte, bütün ayrıştırma işlemlerinde bu tip materyallerin kullanılmasına gerek olmayabilir. Bu nedenle, daha büyük partikül çapına sahip kolon materyallerinin kullanılabileceği durumlarda ve özellikle de sınırlı bütçeler ile maksimum basınç sağlayan pompaların alınmasına gerek olmayabilir. Pompalar arasındaki farklılıklardan birisi de akış oranındaki kararlılıktır. Analitik kromatografilerde ise genellikle, oldukça kararlı akış oranlarına gerek duyulmamaktadır. Buna rağmen, pompanın jel filtrasyon kromatografisinde de kullanılması planlanıyorsa, bu durumda oldukça kararlı akış oranı sağlayan pompalara gereksinim olacaktır. Pompaların sağladığı akış oranlarının kararlılıkları ise genellikle pompaların fiyatına bağlı olarak değişebilmektedir. Çok daha sofistike olan pompalarda ise harici bir elektronik kontrol paneli bulunmaktadır. Bu kontrol panelleri ise pompaların fiyatının yükselmesine neden olmasına rağmen, elektronik olarak kontrol edilen gradient elüsyonlarının uygulanması ya da otomosyon durumunda, bulunması zorunlu olan bir pompa özelliğidir. Şayet izokratik elüsyon uygulanacaksa pompada bulunan elektronik kontrol paneli, pompanın maliyetini artırmaktan başka bir işe yaramayacaktır. İyi bir pompalama sisteminde bulunması gereken özellikler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: • En az 5 x107 Pa basınçla çıkış sağlamalı. • Dedektörün çalışmasını etkileyebilecek basınç değişimlerine yol açmamalı. • Akış kapasitesi en az 0,01-10 mL dk–1; preparatif ayrıştırmalar için ise 100 mL dk–1 olmalı. • Akış oranı kararlılığındaki sapma kısa bir süre için de olsa %1’i aşmamalı. • Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılacaksa, akış oranındaki kararlılık sapması %0,2’yi aşmamalıdır.

HPLC sistemlerinde kullanılan basınç pompaları ise temelde iki sınıfa ayrılmaktadır: sabitbasınç pompaları ve sabit-akış pompaları. Sabit-basınç pompaları ise sadece HPLC kolonlarının paketlenmesinde (bkz. kısım 4.6) kullanıldığından, burada bu pompalara kısaca değinilecektir. Sabit-akışlı pompalar ise her türlü HPLC sistemlerinde çok daha yaygın olarak kullanıldıklarından, bu kısımda daha çok bu tip pompalar üzerinde durulacaktır.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

69

i. Sabit-basınç pompaları: Sabit-basınç pompalarının en önemli avantajı, basitliği ve kolon boyunca sabit (dalgalanmasız) bir basınç oluşturmaları nedeniyle pürüzsüz bir temel-çizginin oluşmasına yol açmalarıdır. Ancak, sıcaklık veya hareketli faz kompozisyonunda meydana gelen değişiklikler nedeni ile hareketli faz viskozitesinin değişmesi durumunda akış oranı değişebilir. Ayrıca kolon geçirgenliğinin azalması, akış oranının da azalmasına yol açar ve bunu gidermek için pompa yetersiz kalır. Bu pompalar gazın yüksek basınçla pompa içine girmesi ve bu gazın da pompa haznesindeki çözücüyü kolona hareket ettirmesiyle çalışmaktadırlar. Gazla elüsyon sıvısı arasında bir ara çözücü kullanılması, çözünmüş gazın direk elüsyon sıvısı içine girerek analiz sırasında problemlere yol açma olasılığını azaltır. Bu tip pompalar ise daha çok kolonların paketlenmesinde kullanılmakta olup, modern sıvı kromatografi tekniklerinde nadiren kullanılmaktadırlar. ii. Sabit-akış pompaları: Sabit-akış pompalarının genel olarak iki tipi bulunmaktadır: (a) resiprokal pistonlu pompalar ve (b) şırınga-tipi (sabit yer-değiştirici) pompalar. Sabit-akış pompalarının en çok kullanılan formu ise resiprokal pistonlu pompalardır. Bu her iki pompa sisteminin de sunduğu temel avantaj ise kolon içerisindeki değişikliklerden (hareketli fazın viskozitesindeki değişiklik ve kolonun bloke olması gibi) etkilenmeksizin, kolon boyunca sabit bir akış oranı sağlamalarıdır. Bu pompaların sağlamış olduğu sabit akış oranı nedeni ile aynı örnek materyalinin elüsyon hacimleri ve pik alanları, her kromatografi sonucunda tekrarlanabilir olmaktadır. Ayrıca, bütün sabit-akış pompalarında, kromatografik sistem içerisinde bir basınç değişikliği olduğu taktirde, pompanın otomatik olarak durmasını sağlayan bir kısa devre mekanizması vardır.

Resiprokal pistonlu pompalar sonsuza kadar (maalesef ülkemizde olduğu gibi elektrikler sık sık kesilmezse) hareketli faz akışını sağlayabilirlerken, şırınga-tipi pompalarda ise şırınga hacminin tamamı boşaldığında yeniden doldurulması gerekmektedir. Bunun yanı sıra, şırınga-tipi pompaların resiprokal pistonlu pompalara göre avantajı ise, hareketli fazın akış oranında ve basınçta bir dalgalanma oluşturmamalarıdır. Bu nedenle, mikro-HPLC uygulamalarında şırınga-tipi pompaların kullanılması durumunda μL dk–1 düzeylerinde sabit akış oranlarının sağlanması mümkündür. a. Resiprokal pistonlu pompalar: Resiprokal pistonlu pompaların tek-pistonlu ve çiftpistonlu olmak üzere iki farklı tipi bulunmaktadır (Şekil 4.4). Resiprokal pistonlu pompalarda hareketli fazın kolonlara girişini sağlayan piston, motor krank miline bağlı olarak çalışır ve hareketli fazın kolona girişi ve çıkışı, tek yönlü çek-valfler aracılığı ile kontrol edilir. Bu tip pompalarda krank miline bağlı olan piston geriye doğru çekildiğinde, hareketli faz rezervuarından bir miktar sıvı giriş çek-valfi aracılığı ile hazneye emilir. Hareketli fazın hazneye emilmesi, giriş çek-valfinin üzerinde bulunan safir bilyenin emme kuvvetinin etkisi ile yukarıya kalkması ve hareketli faz girişinin açılması ile gerçekleşir. Bu esnada emme kuvvetinin etkisi ile çıkış çek-valfindeki safir bilye ise hazneden hareketli faz çıkışını engelleyecek şekilde, çıkış kanalını kapatmaktadır. Piston, krank milinin dönmesine bağlı olarak ileri doğru hareket ettiğinde ise hareketli faza uygulanan basınç nedeni ile giriş çek-valfindeki bilye aşağıya doğru bastırılarak hareketli faz girişini kapatmakta, fakat oluşan basınç nedeni ile çıkış çek-valfinin bilyesi yukarı doğru kalkarak haznedeki hareketli fazın kolona gönderilmesini sağlamaktadır. Pistonun bu dönüşümlü hareketi sonucunda hareketli faz rezervuarında bulunan sıvı düzenli olarak kolona pompalanır.

Tek-pistonlu resiprokal pompaların (Şekil 4.4,a) temel dezavantajı ise hareketli fazın emilmesi ve kolona gönderilmesinin tek bir piston tarafından gerçekleştirilmesi nedeni ile hareketli faz akışında, küçük dalgalanmalar oluşturmasıdır. Bu nedenle, hareketli faz akışındaki dalgalanma etkisini azaltmak için sisteme genellikle dalgalanma tamponları yerleştirilir.

70

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 4.4: (a) Tek-pistonlu ve (b) çift-pistonlu resiprokal pompalarının şematik yapısı.

Sabit ve neredeyse dalgalanmasız bir hareketli faz akışının sağlanması ise çift-pistonlu resiprokal pompalar ile başarılmış bulunmaktadır. Çift-pistonlu resiprokal pompalarda ise her iki pistonun hareketi de aynı motor tarafından çevrilen, tek bir eksantrik krank mili aracılığı ile sağlanmaktadır (Şekil 4.4,b). Böylece eş zamanlı olarak, pistonlardan birisi hareketli faz rezervuarından emme yaparken, diğer piston hareketli faz haznesindeki sıvıyı kolona pompalamaktadır. Bunun sonucu olarak, her bir piston tarafından oluşturulan hareketli faz akışındaki dalgalanma, birbiri üzerine örtüşerek, kolona gönderilen hareketli faz akışındaki dalgalanma minimuma indirilmektedir. Bu tip pompaların sunduğu diğer avantajlar ise hareketli faz rezervuarında yeterince hareketli faz bulunduğu sürece, başında beklemeye gerek kalmadan uzun bir süre hareketli fazın kolona pompalanabilmesine olanak sunması ve kolay temizlenmesidir. Buna rağmen, resiprokal pistonlu pompaların çek-valfleri en zayıf parçalarıdır. Çek-valfler, kolayca kontamine olarak veya tıkanarak pompanın görev yapmasını engelleyebilir. Bu nedenle, son zamanlarda bu riski azaltmak için ikili, hatta üçlü çek-valfe sahip çift-pistonlu resiprokal pompalar geliştirilmiştir. Üçlü çek-valf bulunduran çift-pistonlu resiprokal pompalarda, birinci piston (düşük basınç pistonu olarak adlandırılır) hareketli faz rezervuarından sıvı emerken ikinci piston (yüksek basınç pistonu olarak adlandırılır) hareketli fazı kolona göndermektedir. Bu nedenle birinci piston, ikinci pistona ait hareketli faz haznesini oldukça hızlı bir şekilde (pompanın bir döngüsünün 1/100’ü kadar bir zamanda) doldurmaktadır. İkili çek-valf bulunduran çift-pistonlu resiprokal pompalarda ise pistonların hacimleri farklıdır. Bu tip pompalarda küçük hacimli olan birinci piston, hareketli fazı kolona gönderirken, aynı anda daha büyük hacimli olan ikinci piston ise hareketli faz rezervuarından sıvı emmektedir. b. Şırınga-tipi pompalar: Şırınga-tipi pompalar, hareketli faz taşıyan tek bir silindire sahiptirler. Silindir içindeki hareketli fazın kolona gönderilmesi ise piston aracılığı ile olmaktadır. Piston hareketi ise motor tarafından sağlanmakta olup, bu tip pompalar dalgalanmasız bir akış sağlamaktadırlar. Bunun yanı sıra şırınga-tipi pompaların sunduğu diğer avantajlar ise oldukça yüksek basınç sağlamaları (~5400 bar = 540 MPa) ve çek-valf içermediği için diğer pompalara oranla daha az bakım gerektirmeleridir. Bunun yanı sıra şırınga-tipi pompaların dezavantajları olarak, gradient oluşturmadaki sınırlı kapasiteleri ve hareketli faz haznesinin (şırınganın) sınırlı hacimde olması sayılabilir. Şırınga-tipi pompalar, HPLC teknolojisinin ilk yıllarında yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen günümüzde, ancak SCF ve akış oranının 1-100 μL dk–1 olduğu mikrokolon kromatografilerinde kullanılmaktadır. Çünkü, 20 mL rezervuar kapasitesine sahip olan şırınga-tipi kolonlar, rezervuarı yeniden doldurmak için pompanın durdurulmasına gerek kalmadan mikrokolon kromatografilerinde bütün bir gün boyunca kullanılabilmektedirler.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

71

4.9. Örnek Hazırlama

Karışım halindeki bileşiklerin ayrıştırılması amacı ile kromatografik tekniklerin dizayn edilmesi, örneklerin kromatografi sistemine yüklenmeden önce bir ön-temizleme işleminden geçirilmeyeceği anlamına gelmez. Özellikle HPLC ile kantitatif analizlerin yapıldığı durumlarda, analizi yapılacak olan bileşik plazma, idrar, hücre homojenizatları veya mikrobiyal kültür sıvıları gibi kompleks bir karışım içerisinde bulunuyorsa, bu tip örneklerin bir ön-işlemden geçirilmesi gerekmektedir. Bir hücre homojenizatından bileşiklerin özütlenmesi ve saflaştırılması ise oldukça karmaşık ve çok adımlı bir işlemdir. Protein saflaştırma ile ilgili olan temel prensipler ise daha önce 1. Bölüm’de ele alınmıştır. Örneğin, biyolojik sıvılardaki drogların analizi gibi bazı analizler için örnek materyalin hazırlanması, diğer tipteki analizlere oranla oldukça kolaydır. En kolay ve yaygın olarak kullanılan temizleme metodu ise solvent ekstraksiyonudur. Bu metodun temeli ise düşük kaynama noktasına sahip olan dietileter veya diklorometan gibi suda çözünmeyen (su ile homojen olarak karışmayan) solventlerle, organik bileşiklerin sulu çözeltilerden genellikle ekstrakte edilmesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu teknik, aynı zamanda bileşiklerin farklı fazlar arasındaki dağılma kat sayılarının farklılık göstermesi prensibinin uygulamasına da bir örnek oluşturmaktadır. Asitler ve bazlar gibi zayıf elektrolitler olan organik bileşikler, pKa değerlerine bağlı olarak iyonize veya iyonize-olmamış (non-iyonize) formlarda bulunurlar ve pH’nın daha üstün gelmesini sağlarlar. Bileşiklerin bir organik çözücü içerisinde ekstraksiyonunun sağlanması için genellikle iyonlaşmayan formlar gerektiğinden, örneği içeren solüsyonun pH’sı uygun bir şekilde ayarlanmalıdır. Dietileten ve diklorometan gibi organik çözücüler, aynı zamanda önemli miktarda suyu da ekstrakte etmektedirler. Ekstrakte edilen suyun ise genellikle uzaklaştırılması gerekmektedir. Ekstraktın içerisindeki suyun uzaklaştırılması ise ekstraktın kurutulmak amacı ile buharlaştırılmasından (azot altında veya vakumla) önce, amonyum sülfat veya magnezyum sülfat gibi susuz bir tuzun ilavesi ile gerçekleştirilir. Kurutulan ekstrakt ise daha sonra metanol veya asetonitril gibi uygun bir solvent içerisinde yeniden çözdürülerek, kromatografik ayrıştırma amacı ile kullanılır. Bu solvent ekstraksiyon prosedürü ise özgül bir molekülün seçici olarak ekstraksiyonunu sağlamaktan uzaktır ve genellikle ng mL–1 veya daha az derişimlerdeki bileşiklerin HPLC ile analizlerinin yapılmasında tatmin edici sonuçlar vermemektedir. Fakat, iyon-eşleştirme tekniği ile birlikte kullanıldığında ise bazen daha iyi sonuçlar verebilmektedir. Solvent ekstraksiyonuna alternatif bir metot ise katı faz ekstraksiyonu’dur. Katı faz ekstraksiyonunun solvent ekstraksiyonuna göre avantajı ise bu yöntemin bir kromatografi yöntemi olması nedeniyle, çok daha yüksek oranda seçicilik göstermesidir. Test solüsyonu, HPLC için kullanılan matrikslere (bkz. kısım 4.4) benzer ve göreceli olarak büyük partiküllerden oluşan silikaya bağlı, durgun fazla paketlenmiş küçük bir tek-kullanımlık kolondan (birkaç mm uzunluğunda) geçirilir. Kolon materyali, araştırılmakta olan analiti seçici olarak adsorblarken diğer bileşiklerin kolon materyaline adsorblanmadan kolondan geçmesini sağlar. Hangi tip bağlı-silika durgun fazın kullanılacağına karar verilirken, özelikle üzerinde düşünülmelidir. Test örneği, deproteinize edilmek amacı ile trikloroasetik asit, perklorikasit veya asetonitril gibi bir organik çözücüyle muamele edilmelidir. Böylece, analitin protein bağlama fırsatı minimuma indirilmiş olur. Aynı zamanda test solüsyonunun pH’sı da analitin kolonda tutunmasını maksimize etmek için ayarlanmalıdır. Test solüsyonu kolondan geçirildikten sonra, ya basit yer çekimi desteği ile ya da elüsyon rezervuarına hafif bir vakum uygulaması ile kolon, su ile yıkanır. Su ile yıkamayı takiben, kolon matriksine adsorblanmış olan analitin elüsyonu ise metanol veya asetonitril gibi bir organik çözücü ile sağlanır. Elüsyonu sağlanan analitin solüsyondan tekrar geri elde edilmesi için elüsyon sıvısının buharlaştırılarak (azot altında veya vakumla) analitin kuru formunun elde edilmesi gerekeceğinden, analitin elüsyonu için mümkün olduğunca minimum miktarda elüsyon çözücüsü kullanılmalıdır. Kuru olarak elde edilen analit ise kromatografik analizden önce, minimum hacimdeki

72

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

uygun bir çözücü içinde yeniden çözündürülür. Katı faz ekstraksiyon tekniğinin çok sayıdaki test örneklerinin seri şekilde uygulanabildiği birkaç ayrı formu ticari olarak bulunmaktadır. Özellikle kompleks karışımlar içerisindeki çok düşük derişimlerdeki analitlerin HPLC ile analizinin yapılması için, örneklerin hazırlanmasında kullanılan çok daha gelişmiş bir teknik ise kolon değiştirme tekniğidir. Bu teknikte, test solüsyonu, katı faz ekstraksiyonu tekniğindekine benzer tipteki kısa bir ön-kolona yüklenir. Yüklenen örnekteki test analiti kolon materyaline adsorbe olduktan ve kirleticiler kolondan yıkandıktan sonra, analit uygun bir organik çözücü ile kolondan elüe edilir ve elüsyon sıvısı doğrudan bir analitik HPLC kolonuna transfer edilir. Teknik olarak bunu başarmak pek de kolay değildir ve birkaç pompanın yanı sıra, değiştirme vanalarının kullanılmasını da gerektirmektedir. Bu nedenle, diğer tekniklere oranla pahalı bir tekniktir. Bu tekniğin temel problemlerinden birisi ise ön-kolondan analitik kolona gönderilen analitle birlikte olumsuz etkilere sahip olan bazı bileşiklerin de bulunma olasılığıdır. Şayet analizi yapılacak olan analitin, önkolondan elüsyonu yapılmadan önce, olumsuz etkiye sahip olan bileşiklerin elüsyonu yapılmamışsa yani, ön-kolondan analitik kolona transfer edilen elüsyon sıvısı sadece analit içermiyorsa, bu olumsuz etki gösteren bileşikler de analitik kolona gideceğinden, kolonun ayrıştırma gücü düşecektir. Yine de bu teknik, çok sayıda oldukça zor olan ayrıştırmaları başarmıştır. Son yıllarda, kromatografik yöntemler için örnek hazırlamada yeni yaklaşımlar araştırılmaktadır. Süperkritik sıvı ekstraksiyonu (Supercritical Fluid Extraction, SFE) olarak adlandırılan teknik, CO2 gibi gazların kritik koşullar altında sıvı olarak bulunabildiği gerçeğini ortaya çıkarmıştır. CO2 için bu kritik koşullar ise 31,1 oC ve 7,38 MPa’dır. Bu koşullarda sıvı formda bulunan CO2 ise hekzan ile karşılaştırıldığında, düşük polariteli davranmakta ve ekstraksiyon solventi olarak kullanılabilmektedir. Ekstraktların fiziksel koşullarını değiştirerek, CO2 tekrar gaz haline dönüştürülebilir ve böylece, ekstrakte edilen analitlerin geri eldesi de kolaylaştırılmış olur. SFE tekniğinin laboratuvarlarda genel bir teknik olarak kullanılması ise bu teknik üzerinde yapılan daha ileri düzeydeki araştırmaların sonuçlarının olumlu ya da olumsuz olmasına bağlıdır. Analitlerin kolonöncesi veya kolon-sonrası türevlendirilmesi tekniği ise belki de analitlerin kromatografik olarak ayrıştırılmasında ve belirlenmesinde çok daha iyi imkanlar sunmaktadır. Türevlendirme ise Tablo 4.3’de verilen ayıraçları kullanarak, analitlerin ayrıştırma ve belirlenmesini geliştirmek amacı ile yapılmaktadır. 4.10. Örneklerin Kolona Yüklenmesi

Örneklerin HPLC kolonlarına doğru olarak yüklenmesi, başarılı bir ayrıştırmanın gerçekleştirilmesini etkileyen önemli bir faktördür. HPLC kolonlarına örnek yüklemek için üç metot bulunmaktadır: i. Doğrudan kolona yükleme: Bu metotlardan birincisi olan doğrudan kolon üzerine yükleme, ya örneğin doğrudan doğruya kolon materyali üzerine ya da kolon materyalinin hemen üzerinde bulunan ve inert materyal içeren tapaya enjeksiyonunu sağlayan bir mikro-şırınganın kullanımını gerektirmektedir. Bu metotla örneğin enjeksiyonu, kolon sisteminin basınç altında olduğu zaman yapılabildiği gibi bazı sistemlerde pompanın kapatılmasını da gerektirebilir. Pompanın kapatılması gerektiği durumlarda kolon basıncı, atmosferik basınca yakın bir değere düştüğü zaman örnek enjeksiyonu yapılır ve daha sonra pompa yeniden çalıştırılır. Pompanın kapatılarak yapıldığı örnek enjeksiyonu ise duran-akış enjeksiyonu (stop-flow injection) olarak adlandırılır. ii. Enjeksiyon valfi aracılığı ile yükleme: Örnek yüklemede kullanılan ikinci metotta ise 6 çıkışlı bir enjeksiyon valfi’nin kullanılması nedeniyle, kolon basıncının düşürülmesi gerekmemektedir (Şekil 4.5,a). Çünkü, örnek materyalinin yüklenmesi için enjeksiyon valfinin

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

73

vanası, pompadan gelen hareketli fazı 1. ve 2. çıkışlar üzerinden kolona gönderecek şekilde ayarlanmış olduğundan, örnek yükleme ilmeği devre dışı kalmaktadır. Tablo 4.3: Kolon-öncesi ve kolon-sonrası türevlendirme ayıraçlarının örnekleri. Analit

Ayıraç

A. Kolon Öncesi UV ile belirleme Alkoller, aminler, fenoller

3,5-Dinitrobenzoil klorid

Amino asitler, peptidler

Fenilizotiosiyanat, dansil klorid

Karbonhidratlar

Benzoil klorid

Karboksilik asit

1-p-Nitrobenzil-N,N’-diizopropilizoürea

Yağ asitleri, fosfolipidler

Fenasil bromid, naftasil bromid

Elekrokimyasal belirleme Aldehidler, ketonlar

2,4-Dinitrofenilhidrazin

Aminler, amino asitler

o-Fitalaldehid, florodinitrobenzen

Karboksilik asitler

p-Aminofenol

Flüoresan belirleme Amino asitler, aminler, peptidler

Dansil klorid, dabsil klorid, fluorescamine, o-fital aldehid

Karboksilik asitler

4-Bromometil-7-metoksikoumarin

Karbonil bileşikleri

Dansilhidrazin

B. Kolon Sonrası UV ile belirleme Amino asitler

Ninhidrin

Karbonhidratlar

Orsinol ve sülfirik asit

Penisillin

İmidazol ve cıva klorür

Flüoresan belirleme Amino asitler

o-Fitalaldehit

Şekil 4.5: HPLC enjeksiyon valfi. (a) Enjeksiyon valfinin 3. çıkışından, bir mikro-şırınga ile örnek materyali sabit hacimli olan örnek yükleme ilmeğine enjekte edilir. Örnek yükleme ilmeğinin hacimden daha fazla örnek materyali enjekte edildiğinde ise örneğin fazlası 5. çıkış aracılığı ile atık haznesine gitmektedir. Bu pozisyonda ise pompadan gelen hareketli faz, 1. ve 2. çıkışlar aracılığı ile kolona gönderilmektedir. (b) Hareketli fazın akış yönü 1. ve 6. çıkışlar aracılığı ile örnek yükleme ilmeğinden geçerek kolan yönüne kaydırılır. Böylece, pompa basıncında ve hareketli fazın akış oranında bir değişiklik yapılmadan, örnek materyalinin kolona yüklenmesi sağlanır.

74

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Örnek yükleme ilmeği ise örnek ile doldurulan, sabit hacimli (60 nL ile birkaç mL), basınca dayanıklı bir metal tüpten ibarettir. Yüklenecek olan örnek materyalinin hacmi çok büyük olduğunda ise uzun ve dar bir iç-çapa sahip olan örnek yükleme ilmekleri, kısa ve geniş iç-çapa sahip olanlara tercih edilmelidir. Çünkü, uzun ve dar olan örnek yükleme ilmeklerinin bant-genişlemesine olan etkileri, kısa ve geniş olanlarınkine oranla çok daha azdır. Örnek yükleme ilmeği örnek materyali ile doldurulduktan sonra, enjeksiyon valfinde bulunan vana uygun pozisyona çevrilerek, pompadan gelen hareketli fazın yönü örnek yükleme ilmeğinden geçecek şeklide ayarlanır (Şekil 4.5,b). Böylece pompadan gelen hareketli faz, 1. 6. 3. ve 2. çıkışlar aracılığı ile örnek yükleme ilmeğinde bulunan örnek materyalini kolona taşırken, hareketli fazın akış oranında ve kolon basıncında bir değişiklik olmadan örnek kolona yüklenmiş olur. iii. Otomatik enjektörler aracılığı ile yükleme: Çok daha sofistike olan HPLC sistemlerinde ise örneklerin kolona yüklenmesini sağlayan otomatik örnek yükleme enjektörleri bulunmaktadır. Otomatik örnek yükleme enjektörleri sayesinde çok sayıdaki örnek materyali (örneğin, kalite kontrol ve droglar), özellikle veri-işleme sistemlerinin de bulunduğu sistemlerle, operatörün müdahalesine gerek kalmadan seri bir şekilde analiz edilebilmektedir. Özellikle kromatografik proses süresince araştırmacının bulunamaması (örneğin gece boyunca) gibi durumlarda, hareketli faz seçimi, akış oranı ve sıcaklık gibi kromatografik parametrelerin optimizasyonu için yapılan çalışmalarda, otomatik örnek yükleme enjektörleri zorunlu olmaktadır. Günümüzde ise çalışma prensipleri farklı olan otomatik örnek yükleme enjektörleri bulunmasına rağmen, bunların hepsinin de ortak yönü, önceden programlanan hacimde ve zamanda örnek materyallerinin kolona yüklenmesini sağlamalarıdır.

Sera, idrar, plazma veya deproteinize tüm kan gibi saflıktan oldukça uzak kompleks örneklerin tekrar tekrar HPLC kolonuna yüklenmesi, zamanla kolonun çözünürlük gücünün kaybolmasına yol açabilir. Bu gibi olumsuz gelişmeleri önlemek için, genellikle enjeksiyon valfi ile analitik kolon arasına bir koruyucu kolon eklenmektedir. Koruyucu kolon ise analitik kolon ile aynı iç-çapta olup, yine analitik kolondaki kolon materyali ile aynı veya benzer bir materyal ile paketlenmiş, kısa (1-2 cm) bir kolondur. Koruyucu kolondaki materyal ise örnek içinde bulunan istenmeyen kirletici materyalleri tutmaya yarar ve belirli aralıklarla çıkartılarak değiştirilir. 4.11. Örneklerin Elüsyonu

Bütün sıvı kromatografilerde, örnek materyalinin kolondan elüsyonu için uygulanan izokratik elüsyonlar (bkz. kısım 6.7.6), tek bir çözücü veya sabit oranlarda karıştırılmış iki veya daha fazla çözücü kullanılarak tek bir pompa ile yapılabilir. Gradient elüsyonunda (bkz. kısım 6.7.6) ise genellikle, en az iki çözücüyü önceden belirlenen oranda dağıtan ayrı pompalar kullanılır. Gradient elüsyonlarında kromatografi boyunca hareketli fazın kompozisyonu değişmektedir. Hareketli faz derişimindeki değişiklik ise zamana bağlı olarak ya lineer olarak meydana gelmektedir ya da lineer değildir. Zaman bağlı olarak, hareketli faz derişimindeki değişikliğin lineer olmadığı durumda, bu değişiklik ya konkav ya da konveks bir grafikle açıklanmaktadır (bkz. Şekil 3.10). HPLC sistemlerinde ise hareketli fazı oluşturan sıvıların karıştırılmasını sağlayan enstrümanlar, aynı zamanda otomatik olarak gradient elüsyonunun yapılmasını da sağlamaktadırlar.

HPLC sistemlerinde ise gradient elüsyonunun uygulanmasına izin veren ve hareketli faz karışımının elde edilmesini sağlayan iki temel metot bulunmaktadır: yüksek-basınçta karıştırma ve düşük-basınçta karıştırma. i. Yüksek-basınçta karıştırma: Yüksek-basınçta karıştırma sistemlerinde, hareketli faz karışımını oluşturan her çözücüyü ayrı ayrı pompalayan farklı pompalar bulunmaktadır (Şekil 4.6). Bu pompaların çıkışı bir karıştırma haznesine (pompalardan gelen iki giriş ve kolona giden bir çıkış

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

75

nedeni ile genellikle “T” olarak da isimlendirilir) bağlıdır. Böylece iki farklı pompa tarafından sağlanan çözücü, karıştırma haznesinde karıştıktan sonra hareketli faz olarak kolona gönderilmektedir. Bu durumda karıştırma işlemi, pompaların sağladığı basınç altında gerçekleşmektedir. Hareketli fazı oluşturan çözücülerin hangi oranlarda karıştırılacağı ve hareketli fazın akış oranının ne olacağı ise pompaların hızlarının kontrol edilmesini sağlayan, elektronik bir program aracılığı ile sağlanmaktadır. Yüksek-basınçta karıştırma sistemlerinde, ikiden fazla çözücünün karıştırılması gerektiği durumlarda ise solvent sayısına bağlı olarak pompa sayısı da artmaktadır. Bu durumda pompaların her birisi, bağlı oldukları çözücüyü programlanan oranlarda karıştırma haznesine göndermektedir.

Şekil 4.6: Yüksek-basınçta karıştırma sisteminin şematik yapısı.

Yüksek-basınçta karıştırma sistemlerinin avantajları arasında ise kontrolün çok hassas olarak sağlanabilmesi, hareketli faz karışımının %0,1 hata payı ile tekrar üretilmesine olanak sağlamsı, derişim değişimlerine karşı hızlı tepkime vermesi ve şayet izokratik elüsyonda farklı pompaların kullanılması gerekiyorsa, her pompanın ayrı ayrı kullanılmasına izin vermesi sayılabilir. Bunun yanı sıra, yüksek-basınçta karıştırma yöntemi ile gradient oluşturmanın, aşağıda belirtildiği gibi bazı dezavantajları da bulunmaktadır: • Çözücüler özel bir karıştırma haznesinde karıştırılıyor olsa dahi, çözücülerin tam olarak karışması sağlanamamaktadır. • Hareketli faz oluşturmak amacıyla karıştırılan HPLC çözücülerinin çoğu, bazı durumlarda %20’ye varan oranlarda, toplam hacmi değiştirmektedir. • Çözücü A veya çözücü B’nin %0-10 aralığındaki karışımı, genellikle zayıf olmaktadır. • Yüksek-basınçta karıştırma iki, hatta bazı durumlarda üç pompanın kullanılmasını gerektirdiğinden sistemin toplam maliyetini yükseltmektedir. ii. Düşük-basınçta karıştırma: Düşük-basınçta karıştırma sistemlerinde çözücülerin karıştırılması, çözücüler pompaya girmeden önce bir karıştırma haznesinde oluşturulmaktadır. Bu nedenle çözücülerin karıştırılması, düşük-basınçta meydana gelmekte ve karıştırma haznesinden gelen hareketli fazın kolona pompalanması ve hareketli fazın akış oranı tek bir pompa aracılığı ile sağlanmaktadır (Şekil 4.7). Hareketli fazı oluşturan çözücülerin karıştırma haznesine gönderilme oranları ise selenoid valfler aracılığı ile sağlanmaktadır. Selenoid valfler ise kontrol sisteminden gelen sinyallere uygun olarak, belirli sürelerle açılırlar ve çözücülerin karıştırma haznesine girmesine izin verirler. Karıştırma haznesinde karıştırılan çözücüler ise pompa aracılığı ile kolona gönderilir. Bazı sistemlerde ise karıştırma haznesi bulunmamaktadır. Karıştırma haznesinin bulunmadığı sistemlerde ise selenoid valfler aracılığı ile belirlenen oranlarda gönderilen çözücüler, bir karıştırma bağlantısı aracılığı ile doğrudan doğruya pompaya gönderilmekte, pompadan da kolona gönderilmektedir.

76

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 4.7: Düşük-basınçta karıştırma sisteminin şematik yapısı.

Düşük-basınçta karıştırma sistemlerinin temel avantajı ise tek bir pompa aracılığı ile iki veya daha fazla çözücünün karıştırılmasına izin vermesi nedeni ile sistemin genel maliyetini ve bakım masraflarını düşürmesidir. Yüksek-basınçta karıştırma sistemleri, hareketli fazı oluşturan çözücülerin karışımının çok hassas olarak ayarlanabilmesine izin vermesine rağmen, günümüzde HPLC sistemlerinde gradient oluşturmak için en çok tercih edilen sistem ise düşük-basınçta karıştırma sistemleridir. 4.12. Dedektörler

Modern sıvı kromatografi sistemlerinin gelişmesindeki en büyük paylardan birisi de, kolonu terk eden hareketli fazın sürekli olarak taranmasına izin veren akışlı-küvetlere sahip dedektörlerin icadı olmuştur. Kolondan ayrılan hareketli fazın refraktif indeksinin sürekli olarak taranmasında bu tip bir dedektörün ilk defa kullanılması ise 1940 yılında, Tiselius’un araştırma grubu tarafından İsveç’te gerçekleştirilmiştir. Günümüzde kullanılan sıvı kromatografi dedektörleri ise aynı dedektör ile hem analitik hem de preparatif çalışmaların yapılmasına olanak sağlamaktadırlar. Bu tip dedektörler, HPLC kolonlarına uygulanan materyal miktarı çoğunlukla çok küçük olduğundan, oldukça yüksek hassasiyete sahiptirler ve elüsyon sıvısı içindeki analiz edilecek her bir analitin düşük derişimlerine (nanogram) dahi tepkime verebilecek kararlılıktadırlar. Bunun yanı sıra modern dedektörlerin sunduğu diğer avantajlar arasında, bir moddan diğerine ve bir hareketli fazdan diğer bir hareketli faza dönüşümü, hızlı bir şekilde gerçekleştirebilmeleri sayılabilir. Özellikle HPLC sistemlerinde olmak üzere kromatografi sistemlerinde kullanılan dedektörler, sürekli akış koşulları altında kullanılırlar ve dedektör ile belirlenecek olan analitler, her zaman elüsyon sıvısı içerisinde çözünürler. Elüsyon sıvısındaki belirlenecek olan analitin dedektörde bulunan gerçek miktarı ise nanogram düzeyindedir. Fakat, eser miktarda bulunan analitlerin analizinin yapılması durumunda, dedektörde bulunan analit miktarları femtogram hatta tek bir molekül dahi olabilmektedir. Muhtemelen, HPLC’de analitlerin belirlenmesinde gelinen en büyük gelişme, HPLC ile kütle spektrofotometresi (MS) tekniklerinin birleştirilmiş olmasıdır. Böylece MS, en duyarlı, en seçici ve aynı zamanda en genel dedektör olarak kromatografik sistemlerde kullanılmaya başlanmıştır. Ne yazık ki MS’in HPLC ile kombine olarak, yaygın bir şekilde kullanılmasını sınırlayan en önemli faktör ise sistemin hâlâ çok yüksek olan maliyetidir. Bu nedenle, kromatografik sistemlerde MS gibi genel bir dedektörün kullanılması yerine daha farklı özelliklerdeki dedektörlerin kullanılması, sistemin maliyetini oldukça düşürmektedir. Operasyon prensiplerinden bağımsız olarak, HPLC sistemlerinde kullanılan ideal bir dedektörün sahip olması gereken özellikler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: • Düşük sürüklenme ve gürültü düzeyine sahip olmalıdır (Bu özellik, özellikle eser miktardaki analitlerin analizlerinin yapıldığı durumlarda oldukça önemlidir).

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

77

• Yüksek duyarlılıkta olmalıdır. • Hızlı tepkime verebilmelidir. • Geniş lineer dinamik aralığına sahip olmalıdır (kuantifikasyonu kolaylaştırır). • Akışlı-küvetin dizaynı, ayrıştırılması gerçekleştirilmiş olan bantların yeniden karışmasını önleyecek şekilde olmalıdır. • Çözücü tipine, akış oranına ve sıcaklığına karşı duyarsız olmalıdır. • Operasyonu kolay ve güvenli olmalıdır. • Farklı bileşiklerin belirlenmesi için ayarlanabilir olmalıdır. • Moleküller için yıkıcı bir etkisi bulunmamalıdır. i. Gürültü ve sürüklenme: Moleküllerin ayrıştırılması ve analizinde HPLC sistemlerinin kullanılması durumunda, bizi zamana-bağlı prosesler ilgilendirmektedir. Bir bileşiğin kolondan ayrılması ve dedektör tarafından belirlenmesi, grafik kaydedicinin kaleminin temel-çizgiden sapması şeklinde kendisini gösterir. Bu durumda, grafik kaydedicide meydana gelen sapmanın gerçekte kolondan ayrılan bir bileşiğin belirlenmesinden mi yoksa, basınçta meydana gelen dalgalanma, hava kabarcığı veya hareketli fazın kompozisyonundaki değişme gibi yan etkilerden mi meydana geldiğini ayırt etmek önemli bir problem oluşturmaktadır. Şayet, bileşiklerin belirlenmesi sonucunda kaydedilen pikler belirgin bir şekilde büyükse, bu durumda bu pikleri ayırt etmek pek de zor olmamaktadır. Bunun yanı sıra, bileşiklere ait piklerin çok küçük olması durumunda kullanılan dedektör, gürültü ve sürüklenmelerden arındırılmış, oldukça düzgün bir temel-çizgi vermelidir. Temel-çizgi gürültüsü, elektrik sinyalindeki dalgalanmalar, lambanın kararsızlığı, sıcaklıkta meydana gelen dalgalanmalar ve diğer faktörler nedeni ile temel-çizginin, kısa süreli değişimler göstererek doğrusal bir hattan sapmasıdır (Şekil 4.8). Gürültü, genellikle gerçek kromatografik piklerden daha yüksek bir frekansa sahiptir. Gürültü, normal olarak bir pikin tepe noktasından bir sonraki pikin tabanı arasındaki mesafe olarak, “pikten pike” ölçülür. Bazı durumlarda ise gürültü, sabit bir zamanda meydana gelen gürültü piklerinin ortalaması olarak da alınmaktadır. Bir dedektör tarafından üretilen gürültü, o dedektörün duyarlılığını sınırlayan bir faktördür. Özellikle eser miktardaki bileşiklerin analizinin yapıldığı durumlarda, dedektör gürültüsünden kaynaklanan pikler ile bileşiklere ait piklerin ayırt edilmesi oldukça önemlidir. Niteliksel analizlerin yapıldığı durumlarda, gürültü pikleri ile bileşik piklerinin ayırt edilmesinde kullanılan pratik bir yaklaşım, gürültü/sinyal (molekül) piklerinin oranının en az 3 olmasıdır. Nicelik (miktar) analizlerinde ise bu oranın 10 olacak şekilde seçilmesi, eser miktardaki bileşiklerin %2’den az bir hata ile belirlenmesi ile sonuçlanmaktadır. Şekil 4.8’de verilen bir kromatogram parçasında, eser miktardaki bir bileşiğe ait pikin, dedektör duyarlılığının en yüksek olduğu durumda meydana gelen temel-çizgi gürültüsünden tereddütsüz olarak nasıl ayırt edilebileceği görülmektedir.

Dedektör sinyal dalgalanması ile ilişkili olan diğer bir parametre ise sürüklenmedir. Gürültü, temel-çizginin kısa-süreli olarak doğrusal hattan gösterdiği sapmalar olduğundan, bu sapmaların mümkün olduğunca küçük olması gerekmektedir. Dedektör tarafından üretilen gürültü ise genellikle 30 dakika veya 1 saat gibi belirli bir süre ölçülerek belirlenir. Şekil 4.8’de gösterilen sürüklenme ise genellikle dedektörün çalıştırıldığı andan itibaren, 1 saat içerisinde meydana gelen dedektör ısınmasıyla ilişkilidir. Sürüklenmenin azaltılması ise dedektörün kullanılmadan önce açılarak ısınmasının sağlanması ile mümkün olabilmektedir.

78

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 4.8: Dedektör gürültüsü ve sürüklenme.

ii. Duyarlılık: Sıvı kromatografi dedektörlerinin en önemli özelliklerinden birisi, dedektörün duyarlılığıdır. Dedektör duyarlılığı, analit derişimleri arasındaki oldukça küçük farklılıkları ayırt edebilme yeteneğinin bir ölçüsüdür. Bu nedenle bir dedektörün duyarlılığı, bilinen derişimlerdeki standart bir bileşiğe ait kalibrasyon eğrisindeki eğim ile belirlenir. Kalibrasyon eğrisindeki eğim ise ölçümlerin standart sapmasına bağlıdır. Bir bileşik için hazırlanan kalibrasyon eğrisinin yüksek olması, dedektörün duyarlılığının da yüksek olduğunu gösterir. Fakat, ölçümlerdeki standart sapmanın yüksek olması, dedektörün duyarlılığının da düşük olmasına yol açar.

Bir dedektörün duyarlılığı, dedektör tarafından belirlenebilen bileşiklerin minimum miktarı demek değildir. Dedektör tarafından belirlenebilen bileşiklerin minimum miktarı kromatografik koşullara bağlıdır. Kromatografi sırasında kolondan ilk olarak elüe olan bileşiklere ait pikler genellikle keskin olmasına rağmen, elüsyonları kromatografinin sonuna doğru gerçekleşen bileşiklere ait pikler genellikle geniş, hatta bu pikleri gürültü piklerinden ayırt etmek dahi zor olmaktadır. iii. Seçicilik: HPLC dedektörlerinde bulunması arzu edilen diğer bir özellik ise seçiciliktir. Seçici bir dedektör, ilgilenilmekte olan bileşiklerle birlikte elüe olan diğer bileşiklerden ziyade, sadece hedef bileşiğin görülmesine izin verir. Refraktif indeks dedektörleri ise seçicilikleri neredeyse hiç bulunmayan dedektörlerin bir örneğini oluşturmaktadır (bkz. kısım 4.12.1). Refraktif indeks dedektörlerinde her bileşik bir tepkimeye yol açmakta fakat, örnek moleküllerinin zayıf olarak çözündüğü durumlarda ise bileşiklerin ayırt edilmesinde bu dedektörler yetersiz kalmaktadır.

Fluoresans ve elektrokimyasal dedektörler ise yaygın olarak kullanılan dedektörler arasında en seçici olanlarıdır. Organik moleküllerin ise sadece %10 kadarı fluoresant özellikte olduğundan, fluoresant bir bileşik için özgül olan eksitasyon ve emisyon dalga boylarının seçilmesi ile sadece bu bileşiklerin belirlenmesi mümkündür. Genellikle, belirlenmenin çok daha seçici olması, sinyal gürültüsünün azalmasına ve duyarlılığın yükselmesine yol açmaktadır. iv. Tepkime: Dedektör tepkimesinin tanımı, dedektörün kütle-duyarlı (kütle değişimine) mı yoksa derişim-duyarlı (derişim değişimine) mı olduğuna bağlıdır. Kütle-duyarlı dedektörler için tepkime (R), (mV/kütle/birim zaman) eşitlik 4.1 ile belirlenmektedir:

R=

hw sM

(4.1)

Burada h, pik yüksekliği (mV); w, bir pikin 0,607 yüksekliğindeki pik genişliği (cm); M, kolona enjekte edilen bileşiklerin kütlesi ve s, grafik kaydedicinin hızıdır (cm dk–1). Derişim-duyarlı dedektörler için ise tepkime, mV/kütle/birim hacim olarak verilir ve eşitlik 4.2 ile belirlenmektedir:

R=

h w Fc sM

Burada ise Fc, hareketli fazın akış oranını (mL dk–1) göstermektedir.

(4.2)

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

79

Hareketli fazın özellikleri, dedektörün akışlı-küvetinin geometrisi gibi faktörlerin yanı sıra, bir dedektörün tepkimesi örnek materyal içersindeki bileşiklerin tipine de bağlılık göstermektedir. v. Lineer dinamik aralığı: Bir bileşiğin farklı iki derişimi için dedektörün verdiği tepkimelerin farkı, bu bileşiğin faklı iki derişimi arasındaki fark ile orantılı ise bu dedektörün tepkimesinin lineer olduğu söylenir. Böyle bir tepkime ise kalibrasyon eğrisinde, düz bir hat olarak görülür. Bir dedektörün lineer dinamik aralığı ise maksimum lineer tepkimenin, dedektör gürültüsüne bölünmesi ile belirlenir. Dedektörlerin çoğu ise maddelerin derişim artışının belirli bir sınırından sonra, lineer olarak tepkimesini kaybeder (Şekil 4.9). Dedektörlerin lineer tepkime verdikleri derişimlerin üst sınırları ise genellikle belirlenebilmektedir. Bu nedenle, kromatografik çalışmalarda örnek moleküllerinin tayini yapılırken, dedektörün lineer tepkime verdiği bu üst derişim sınırları göz önünde bulundurulmalıdır.

Şekil 4.9: A ve B bileşiklerine karşı bir dedektörün lineer tepkime aralığı.

vi. Akışlı-küvetin verimliliği: Verimli bir HPLC dedektörünün kalbi, dedektörün akışlıküvetidir. Şekil 4.10’da verimliliği oldukça iyi olan modern bir akışlı-küvetin şematik yapısı görülmektedir. Işın demetinin akışlı-küvetin merkezinde odaklanması, optik mercekler aracılığı ile sağlanmaktadır. Işın demetinin akışlı-küvetin merkezine odaklanmasının nedeni ise akışlı-küvete giren ve çıkan sıvının neden olduğu türbülans, akış nedeni ile meydana gelen sürüklenme, sıcaklık veya refraktif indeks değişikliklerinin, akışlı-küvetin merkezinde minimum olmasıdır. Kısa ve geniş akışlı-küvetler, maksimum enerjinin yayılmasını garantilemekte ve küvet-sonrası toplama lensleri, akışlı-küvetteki ışığın tamamını fotodedektöre odaklamaktadır.

Şekil 4.10: Verimliliği oldukça iyi olan modern bir akışlı-küvetin şematik yapısı.

80

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Modern sıvı kromatografi sistemleri, kısa bir sürede oldukça yüksek çözünürlük sağlamaktadırlar. Örneğin, kuramsal levha sayısı (N) 10 000, uzunluğu 15 cm olan bir kolon kullanıyorsak, 2 dakika içerisinde elüe olan bir bileşiğin (akış oranı 1 mL dk–1 olduğunda, bu bileşiğin elüsyon hacmi 2 mL olacaktır) oluşturacağı pikin genişliği ideal olarak 80 μL olacaktır. Bu durumda kullanılan akışlı-küvetin hacmi 20 μL olduğunda, bu pik üzerinde dört ayrı okuma yapmış sayılacağız. Bu ise bir pikin şeklini doğru olarak tanımlamak için yeterli olmayacak ve pik genişlemesine yol açacaktır. Akışlı-küvetlerin diğer önemli bir özelliği ise kırılma (refraksiyon) etkisini dengelemeleridir. Örnek materyalinde bulunan bileşikler akışlı-küvetten geçerlerken, elüsyon sıvısının kompozisyonunu çok az olarak değiştirirler. Elüsyon sıvısının kompozisyonunun değişmesi ise kırılma katsayısının da değişmesine yol açar. Bu durumda şayet akışlı-küvete gönderilen ışın demeti paralel değilse, kırılmadaki değişme ışın saçılmasının da değişmesine yol açarak, bariz bir adsorbsiyon okumasına katkı sağlayacaktır. Ne yazık ki dedektörlerde kullanılan akışlı-küvetlerin çok azı, elüsyon sıvısının kırılma katsayısındaki değişiklikten kaynaklanan bu etkiyi telafi edecek şekilde tasarlanmıştır. • Şayet akışlı-küvetin hacmi, pikin hacminin 1/10’undan daha büyükse veya akışlı-küvetin geometrisi optimize edilmemişse, bariz bir pik genişlemesi görülür. • Bir bileşiğe ait pikin alanı, kolona yüklenen örnek materyal içindeki bu bileşiğin miktarı ile orantılı olduğundan, pik genişlemesi pikin yüksekliğinin düşmesine yol açacaktır. Akışlıküvetin geometrisi optimize edildiği halde, küvet hacminin büyük olması nedeni ile meydana gelen bariz bir pik genişlemesi durumunda, pik yüksekliğinde belirgin bir düşme görülmeyebilir. • Pik genişlemesinin bir sonucu olarak çözünürlük düşebilir ve üst üste örtüşen pikler oluşabilir. • Şayet akışlı-küvetin geometrisi optimize edilmemişse, pik kuyruklanması görülebilir (bkz. Şekil 2.4,c). Pik kuyruklanmasının görülmesi ise elüsyon sıvısında birikinti zonlarının oluştuğuna işaret etmektedir.

Son 30 yıl içerisinde, sıvı kromatografide kullanılmak amacı ile farklı algılama prensiplerine dayalı olarak oldukça fazla sayıda dedektör geliştirilmiştir. Buna rağmen, bu dedektörlerden sadece 12 kadarı sıvı kromatografilerinde analiz amacı ile verimli bir şekilde kullanılabilmektedir. Bu 12 dedektörden en çok kullanılan 5 tanesi ise sıvı kromatografide kullanılan dedektörlerin yaklaşık %95’ini oluşturduğundan, bundan sonraki kısımlarda bu dedektörler üzerinde durulmaktadır. Bu beş dedektör ise refraktif indeks dedektörleri, UV/Vis spektrofotometrik dedektörler, fluoresans dedektörler, kondüktivite dedektörleri ve elektrokimyasal dedektörlerdir. 4.12.1. Refraktif İndeks Dedektörleri

HPLC sistemlerinde kullanılan refraktif indeks dedektörleri (RID) genel bir dedektördür. RID’leri ile analitlerin belirlenme prensibi, kolondan ayrılarak akışlı-küvetten geçen elüsyon sıvısının refraktif (kırılma) indeksindeki değişikliğin ölçülmesine dayanmaktadır. Hareketli faz ile referans küveti arasındaki refraktif indeks (RI) farklılığı ne kadar büyük olursa, ışın demetindeki sapma da o kadar büyük olacaktır. Bu nedenle, hareketli faz ile referans örnek arasındaki refraktif indeks farklılığı ne kadar büyük olursa, dedektörün duyarlılığı da o kadar büyük olmaktadır. Diğer taraftan, oldukça kompleks karışımların kolona yüklenmesi durumunda ise referans olarak kullanılan örnek, geniş bir refraktif indeks aralığına sahip bileşenlerden oluşabilir ve bu bileşenlerden bazılarının refraktif indeks değerleri, hareketli fazın refraktif indeksi ile aynı veya oldukça yakın olabilir. Bu durumda, hareketli fazdaki bileşiklerin belirlenmesi oldukça zor, hatta olanaksız olabilmektedir.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

81

RID’lerinin kullanıldığı durumlarda, hareketli fazın kompozisyonunda her hangi bir değişiklik yapıldığında, dedektörün yeniden dengelenmesi zorunludur. Bu nedenle, özellikle gradient elüsyonlarının uygulandığı analizlerde, hareketli fazın kompozisyonu sürekli olarak değiştiği için, refraktif indeks dedektörlerinin kullanılması neredeyse olanaksızlaşmaktadır. Refraktif indeks dedektörlerinin çok sayıda dezavantajları bulunmasına rağmen, özellikle iyonik-olmayan bileşiklerin, UV absorbansı veya fluoresant özellik göstermeyen bileşiklerin analizinde oldukça kullanışlıdırlar. Örneğin, karbonhidratların analizinde RID’leri yaygın olarak kullanılmaktadır. Çünkü, karbonhidratlar UV absorbsiyonu göstermediği gibi fluoresant özelliğe de sahip değildirler. Bir analitin refraktif indeksi ise o analitin derişiminin bir ölçüsüdür. Bu nedenle, analitin derişiminde meydana gelen bir değişiklik, RI değerinde de değişiklikle sonuçlanacaktır. Bu yüzden, sıvı kromatografisinde kullanılan refraktif indeks dedektörleri, RI değerindeki 10-7’lik bir değişikliğe (0,1 μmol’lük bir derişim değişikliğine) karşı dahi duyarlı olmalıdır. Hareketli faz içerisinde hava kabarcıklarının bulunması, çözücü kompozisyonunun değişmesi, çözücünün iyi karışmamış olması ve kolon akması ise temel-çizgi sürüklenmesinin oluşmasına katkıda bulunacaktır. Hareketli faz basıncında meydana gelen ~1 bar’lık bir değişme, RI biriminde 1 x 10-6; sıcaklıkta meydana gelecek olan 1 °C’lık değişiklik ise 600 x 10-6’lık bir değişime yol açmaktadır. Bu nedenle, özellikle sıcaklık olmak üzere, bu parametrelerin her ikisinin de kontrol altında tutulması oldukça önemlidir. Refraktif indeks dedektörlerinin yüksek duyarlılıkla çalışmalarını sağlamak için bu dedektörler 0,01 °C hassaslığındaki termostatlarla kontrol edilen büyük bir metal ısı bloğu içerisinde kullanılabilirler. Günümüzde ise ticari olarak bulunan refraktif indeks dedektörlerinin iki tipi bulunmaktadır: (i) saptırmalı refraktif indeks dedektörleri ve (ii) yansıtmalı refraktif indeks dedektörleri. Bu dedektörlerin her iki tipinde de çift-hazneli akışlı-küvetler kullanılmaktadır. Bu akışlı-küvetlerin bir haznesinde hareketli fazın sürekli olarak karşılaştırılmasında kullanılan referans örnek bulunurken, diğer hazne ise hareketli fazın sürekli olarak aktığı haznedir. i. Saptırmalı refraktif indeks dedektörleri: Saptırmalı refraktif indeks dedektörlerinin optik yapısı, şematik olarak Şekil 4.11’de görülmektedir. Bu tip dedektörler, refraktometrenin sapma prensibine göre çalışmaktadırlar. Işın demetindeki (genellikle akkor lambadan gelen) sapmada meydana gelen değişiklik ise referans haznesinde bulunan örneğe göre, hareketli faz haznesindeki elüsyon sıvısının sürekli olarak akması nedeni ile meydana gelen refraktif indeks değişikliğinden kaynaklanmaktadır. Akışlı-küvet içerisinde örnek bulunmadığı zaman, gönderilen ışın demeti her iki hazneden de doğrudan geçerek fotodedektör (genellikle fotorezistör) üzerine odaklanmaktadır. Akışlı-küvetin hareketli faz haznesinden elüsyon sıvısı geçmeye başladığında ise kırılma (refraksiyon) açısında meydana gelen değişiklik, ışın demetini normal düzleminden saptırır. Işın demetinde meydana gelen sapma ise dedektör üzerine düşen foton akımında bir değişikliğe neden olur. Dedektöre düşen foton akımındaki değişiklik ise dedektörün dengeden sapmasına yol açar. Dedektörde meydana gelen sapma (sapmanın derecesi ise derişimde meydana gelen değişikliğe bağlıdır) ise bir grafik kaydedici tarafından kaydedilir.

Saptırmalı refraktif indeks dedektörlerinin dezavantajları arasında, göreceli olarak daha düşük duyarlılığa sahip olmalarının yanı sıra, akışlı-küvetlerin iç yüzeylerinde biyofilm tabakası oluştuğunda ya da tıkandığında, temizlenmesi veya değiştirilmesi için çıkartılmalarının pek de kolay olmaması yer almaktadır. Bu tip dedektörlerin avantajları ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: • Analitlere karşı genel bir tepkime vermesi. • Akışlı-küvet içerisindeki hava kabarcıklarına ve kirlere karşı duyarlılığının düşük olması. • Refraktif indeks (RI) aralığı 1000’den 1750’ye kadar olan geniş bir aralık, kolayca dengelenebilen tek bir akışlı-küvet ile sağlanabilmektedir.

82

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 4.11: Saptırmalı refraktif indeks dedektörünün optik şeması.

ii. Yansıtmalı refraktif indeks dedektörleri: Frensel prensibine göre çalışan refraktif indeks dedektörleri ise göreceli olarak oldukça ender bulunmakta ve artık üretimleri yapılmamaktadır. Frensel prensibine göre çalışan yansıtmalı refraktif indeks dedektörlerinin optik yapısı ise şematik olarak Şekil 4.12’de görülmektedir. Bu tip dedektörlerde ışın demeti, fotosel içinde yer alan sıvıcam ara-yüzeyi tarafından yansıtılmaktadır. Hareketli faz, akışlı-küvette bulunan hareketli faz haznesine girdiğinde, ışın demetinin farklı bir açıda kırılmasına yol açar. Işın demetinin farklı bir açıda kırılması ise fotorezistöre gönderilen ışın demetinde bir sapmanın meydana gelmesine neden olur. Fotorezistöre gönderilen ışın demetindeki sapma ise bir elektrik sinyalinin oluşmasına yol açar. Burada da saptırmalı refraktif indeks dedektörlerinde olduğu gibi, referans haznesindeki sinyal ile hareketli faz haznesindeki sinyal farklılığı, grafik kaydediciye veya veri toplama sistemine bir pik olarak aktarılır.

Şekil 4.12: Yansıtmalı (Frensel-tipi) refraktif indeks dedektörünün optik şeması.

Yansıtmalı refraktif indeks dedektörlerinin en önemli avantajı ise oldukça yüksek duyarlılığa sahip olmalarıdır. Bu yüksek duyarlılığın nedeni ise belirli bir RI aralığında, optik parçaların daha yüksek bir derişim sinyalinin elde edilmesini sağlamasıdır. Bu tip dedektörlerin diğer avantajları arasında ise oldukça küçük hacimlerdeki akışlı-küvetler kullanılarak, hareketli faz akış oranının aşırı düşük olduğu durumlarda dahi kullanılabilir olması, akışlı-küvetlerinin kolay değiştirilebilir ve ucuz olması sayılabilir. Bütün bu avantajlara rağmen yansıtmalı refraktif indeks dedektörlerinin bazı dezavantajları da bulunmaktadır. Bu dezavantajlar arasında, akış oranındaki ve basınçtaki dalgalanmalara karşı oldukça duyarlı olması en önemlileridir. Ayrıca, çözücünün RI değerinin düşük veya yüksek olmasına bağlı olarak prizmanın değiştirilmesi ve solvent değişikliklerinde, optik yolun manüel olarak ayarlanması gerekmektedir. 4.12.2. UV/Vis Spektrofotometrik Dedektörler

Kimyasal bileşiklerin çoğu, elektromanyetik alan ile bir etkileşim göstermektedirler. Elektromanyetik radyasyonun ışınları dedektörün akışlı-küvetinden geçtiğinde, akışlı-küvette bulunan bileşikler ile ışın arasındaki etkileşim nedeni ile ışının yoğunluğunda bir değişiklik meydana gelmektedir. HPLC sistemlerinde kullanılan optik dedektörlerin çoğunun çalışma prensibi ise ışının yoğunluğunda meydana gelen bu değişikliğin şiddetinin ölçülmesine dayanmaktadır.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

83

Kimyasal bileşikler tarafından absorbe edilen radyasyon, radyasyonun dalga boyuna ve kimyasal bileşiğin fonksiyonel gruplarına bağlıdır. UV radyasyonu, kimyasal bileşiklerin paylaşılmamış (bağ oluşturmamış) elektronlarının enerji seviyelerinin yükselmesine ve enerji seviyesi yükselen elektronların daha üst enerji seviyelerine sıçramasına veya kimyasal bileşiklerde çift bağların bulunması (π elektronları) durumunda bu bağların titreşimine ya da fonksiyonel grupların (>CO, >CS, –N=O ve –N≡N) rotasyonuna neden olur. Dedektörün akışlı-küvetinden geçen ışının yoğunluğu ise bu ışının enerjisi, akışlı-küvetteki kimyasal bileşiklerin elektronlarının veya fonksiyonel gruplarının transisyonuna (geçişine) neden olduğu için düşer. Lambert-Beer kanununa göre absorblanan radyasyonun miktarı, akışlı-küvet içindeki kimyasal bileşiğin derişimi ve küvetin ışık yolu ile orantılıdır. Elektromanyetik spektrum ise Tablo 4.4’de görüldüğü gibi birkaç bölgeye ayrılmaktadır. Tablo 4.4: Elektromanyetik spektrumun bölgeleri. Bölge İnfrared (IR)

Dalga boyu (λ) 2 500 - 50 000 nm.

Yakın infrared

800 - 2 500 nm

Visible (görünür)

400 – 800 nm

Ultra Viole (UV)

190 – 400 nm.

Spektroskopide kullanılan elektromanyetik spektrumlar ise IR, Vis. ve UV bölgeleridir. Sıvı kromatografide hareketli faz olarak kullanılabilecek oldukça az sayıda saydam (transparant) polar sıvı olduğundan, IR spektrofotometreler sıvı kromatografide oldukça sınırlı kullanım alanına sahiptirler. UV/Vis spektrofotometreler (genellikle, 200-600 nm) ise sıvı kromatografide en yaygın kullanılan dedektörlerdir. Çünkü, organik moleküllerin analizlerinin çoğu UV/Vis dedektörlerle yapılabilmektedir ve yayınlanmış olan HPLC çalışmalarındaki analizlerin neredeyse %70’inde UV/Vis dedektörler kullanılmıştır. Absorbans (A) ise içerisinde örnek materyalinin bulunduğu küvete gönderilen ışık şiddetinin (Io), küvetten geçen ışık şiddetine (I) oranının logaritmasına eşittir (bkz. Eşitlik 4.3). Bu nedenle absorbans, Lambert-Beer kanununa uygun olarak, molar absorbtivite (molar ekstinksiyon katsayısı, ε), bileşiğin kalınlığı (örneğin, küvetin ışık yolu, d) ve bileşiğin molar derişimi (C) ile ilişkilidir.

A = log (

Io I

) =εdC

(4.3)

HPLC sistemlerinde kullanılan dedektörlerin fotodedektörleri, aslında küvetten geçen ışık şiddetini, yani I değerini ölçmektedirler. Fakat, elektronik sistemler bu sinyali bileşiğin derişimi ile orantılı olan absorbansa (A) dönüştürürler. Kromatogramın ordinatı ise dedektör sinyalini temsil eder ve genel olarak dedektör sinyali, küvet içerisindeki kimyasal bileşiğin derişimi ile orantılıdır. UV dedektörlerinin kullanılması durumunda bir absorbans birimi (A), küvete gönderilen ışığın şiddetinde %90 azalmanın olmasına karşılık gelmektedir. Molar absorbtivite (aynı zamanda molar ekstinksiyon katsayısı, ε, olarak da adlandırılır) ise 1 cm ışık yoluna sahip bir küvet içerisindeki, 1 M’lık bileşiğin absorbansıdır. Molar absorbtivite ise dalga boyuna ve kromatografik koşullara (çözücü, pH ve sıcaklık gibi) bağlıdır. Fakat özgül bir dalga boyunda bir bileşiğin molar absorbtivitesi sabittir (Tablo 4.5). Elüsyon sıvısı içerisindeki analitlerin belirlenmesi için kullanılan UV/Vis. spektroskopik dedektörler, 190 nm dalga boyuna kadar olan absorbansları ölçebilir ve bu dedektörlerin tam-ölçek sapma absorbans birimi (Absorbance Units for Full-Scale Deflection; AUFS) 0,001’e kadar düşüktür. Dalga boyu tarama dedektörleri ise her bir analitin absorbsiyon spektrumunun tamamını

84

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

kaydedebildiğinden, identifikasyon olanağı da sağlar. Böyle ölçüm fırsatları ise ya elüsyon sıvısının geçici olarak akışının durdurulması ile ya da diod-array tekniklerinin kullanılması ile sağlanabilir. Sıvı kromatografisinde kullanılan UV/Vis spektroskopik dedektörler ise (i) sabit dalga boylu dedektörler, (ii) değişken dalga boylu dedektörler ve (iii) diod-array dedektörleri olmak üzere 3 gruba ayrılmaktadır. Tablo 4.5: Farklı bileşiklerin özgül dalga boylarındaki molar absorbtiviteleri. Dalga boyu (nm)

Molar ekstinksiyon (ε)

Asetilid

Adı

–C = C

Kromofor

175-180

6000

Aldehid

–CHO

210

1500

Amin

–NH2

Azo

–N = N–

Bromid

–Br

Karboksil Disülfid

195

2800

285-400

3-25

208

300

–COOH

200-210

50-70

–S–S–

194

5500

Ester

–COOR

205

50

Eter

–O–

185

1000

Keton

>C = O

195

1000

Nitrat

–ONO2

270

12

Nitril

–C = N

160

–

Nitrit

–ONO

220-230

1000-2000

Nitro

–NO2

210

Kuvvetli

i. Sabit dalga boylu dedektörler: Dalga boyunun değiştirilmesine izin vermeyen dedektörler sabit dalga boylu dedektörler olarak adlandırılırlar. Bu tip dedektörler diğer tipteki dedektörlere oranla oldukça ucuz olmakla birlikte, belirli dalga boylarında çalışmaya izin vermesi nedeni ile geniş çaplı kullanıma müsait değildirler. Sabit dalga boylu dedektörlerde ışık kaynağı olarak, cıva buharlı lambalar kullanılmaktadır. Çünkü, düşük-basınçlı cıva buharlı lambalar, 253,7 nm dalga boyunda oldukça yoğun ışık sağlarlar. Bu tip bir ışık kaynağı tarafından yayılan diğer dalga boylarındaki ışınların filtreler aracılığı ile süzülmesi sonucunda, 254 nm dalga boyunda, kararlı ve oldukça duyarlı dedektörler üretilmektedir (Şekil 4.13). Bu tip dedektörler ile nanogramdan daha düşük miktardaki aromatik halka taşıyan bileşiklerin belirlenmesi sağlanabilmektedir. Bu tip dedektörlerde dalga boyu olarak 254 nm’nin seçilmesinin nedeni ise cıvalı lambanın oluşturduğu ışık yoğunluğunun büyük bir kısmının 254 nm dalga boyundaki ışınlardan oluşması ve ayrıca, UV absorbe eden bileşiklerin çoğunun bu dalda boyunda bir absorbans göstermeleridir. ii. Değişken dalga boylu dedektörler: İstenilen dalga boyuna ayarlanarak, bileşiklerin belirlenmesine izin veren dedektörler değişken dalga boylu dedektörler olarak adlandırılırlar (Şekil 4.14).

Değişken dalga boylu dedektörler özellikle üç nedenden dolayı tercih edilmektedirler: • Uygun dalga boyu seçilerek, absorbsiyon özelliğine sahip bir bileşiğin en duyarlı şekilde belirlenmesine olanak sağlar. • Farklı örnek bileşenleri farklı dalga boylarında en iyi absorbansa sahiptirler, bu nedenle operasyonun sabit bir dalga boyunda gerçekleştirilmesi, sistemin duyarlılığının azalmasına yol açar. • Dedektörün gelişmişlik derecesine (modeline) bağlı olarak dalga boyu değişikliği, manüel olarak veya hafızaya kaydedilerek zamana bağlı olarak değiştirilebilir.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

85

Şekil 4.13: Sabit dalga boylu dedektörlerin şematik yapısı.

Şekil 4.14: Değişken dalga boylu dedektörlerin şematik yapısı.

iii. Diod-array dedektörler: Değişken dalga boylu UV dedektörlerinin diğer bir tipi ise diodarray dedektörleridir (Şekil 4.15). Bu dedektörler, elüsyon sıvısı akışlı-küvetlerden geçerken değişik dalga boylarındaki absorbans taramalarının ve istenilen dalga boylarındaki absorbans değerlerinin hassas olarak ölçülmesine izin vermektedirler. Diod-array dedektörleri, 0,01 saniyede birçok dalga boyunda ya da bütün dalga boylarında elüsyon sıvısının absorbansının sürekli olarak ölçülmesine olanak sağladıklarından, analitlerin elüsyon zamanlarına bağlı olarak tanımlanmasının yanı sıra, analitlere ait kalitatif bilgilerin elde edilmesini de sağlamaktadırlar (Şekil 4.16).

Şekil 4.15: Diod-array dedektörlerin şematik yapısı.

86

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Diod-array dedektörlerinin en önemli iki avantajı ise: • Analitlerin analizinde seçilmesi gereken en doğru dalga boyunun seçilmesini sağlamasıdır. Özellikle belirli bir analitin, farklı dalga boylarındaki molar absorbtivitelerine ait bilgi yoksa diod-array dedektörlerden elde edilen veriler analiz için çok önemlidir. • İkinci önemli avantajı ise piklerin saflığı ile ilgilidir. Çünkü, normal UV dedektörleri ile elde edilen pikler, bu piklerin oluşmasından sorumlu olan analitlerin sayısı (iki, hatta daha fazla) hakkında bir fikir vermez (bkz. Şekil 4.16). Böyle bir durumda, bir pikin tek bir analite mi, yoksa birden fazla analite mi ait olduğuna karar vermek için, farklı dalga boylarındaki absorbans oranlarının hesaplanması oldukça yayarlı olmaktadır.

Şekil 4.16: Dihidropiridin kalsiyum kanalını bloke eden lasidipin ve metabolitlerinin HPLC ile ayrıştırılması. Kolon: ODS Hypersil. Elüent: %1’lik formik asit ile pH’ı 3,5’e asitleştirilmiş Metanol/asetonitril/su (%66, %5, %29, vol.). Akış oranı: 1 mL dk–1. Kolon sıcaklığı: 40 °C. (a) Diod-array dedektör tarafından (b) UV dedektör tarafından kaydedilmiş kromatogramlar (Wilson ve Walker, 1995).

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

87

4.12.3. Fluoresans Dedektörleri

Sıvı kromatografi sistemleri ile birlikte kullanılan modern dedektörler arasında muhtemelen en hassas olanları fluoresans dedektörleridir. Fluoresans dedektörler ile örnek küveti içerisinde bulunan ve fluoresant özellik gösteren, tek bir molekülün dahi belirlenebilmesi mümkündür. Tipik olarak UV’yi kuvvetli absorbe eden bir bileşiğin belirlenmesinde fluoresans dedektörlerin duyarlılığı, UV dedektörlerin duyarlılığına oranla 10-1000 defa daha hassastır. Fluoresans dedektörleri, diğer optik dedektörlere göre oldukça özgül ve seçicidirler. Bu nedenle, örnek materyalleri içindeki özgül bir fluoresant bileşiğin belirlenmesinde fluoresans dedektörlerinin kullanılması, bir avantaj oluşturmaktadır. Daha kısa dalga boyundaki enerji ile uyarılmış olan, fakat daha yüksek dalga boyunda radyasyon yayan fonksiyonel gruplara sahip bileşikler ise fluoresant bileşikler olarak adlandırılırlar. Genellikle, fluoresant bileşikler tarafından yayılan ışın, bileşiğe gönderilen uyarıcı ışınına göre dik bir açı oluşturacak şekilde ölçülmektedir (Şekil 4.17).

Şekil 4.17: Tipik bir fluoresans dedektörün optik şeması.

Kimyasal bileşiklerin ise kabaca %10’u fluoresant özellik göstermektedirler. Özelikle aromatik bileşiklerde konjuge pi-elektronlarının bulunması, bu bileşiklerin oldukça yoğun fluoresant aktivite göstermelerine yol açmaktadır. Ayrıca, karbonil gruplarına sahip alifatik ve alisiklik bileşikler ile konjuge çift-bağ içeren bileşikler de daha az yoğunlukta olmakla birlikte fluoresant özelliklere sahiptirler. Fluoresans yoğunluğu ise hem uyarıcı ışının hem de yayılan ışının dalga boyuna bağlıdır. Bu sayede fluoresans dedektörleri, diğer bileşikler tarafından yayılan fluoresans ışınlarının yayılması baskılanarak, bazı bileşiklerin seçici olarak belirlenmesine de olanak sağlamaktadır. Örneğin, herhangi bir bileşik, uyarıcı ışınının dalga boyu 280 nm, yayılan ışının dalga boyu 340 nm olduğunda belirlenebilirken, bu koşullarda fluoresant özellik göstermeyen diğer bileşikler dedektör tarafından belirlenemeyecektir. Modern fluoresans dedektörlerin çoğu ise monokromatörler aracılığı ile hem uyarıcı hem de yayılan ışınların dalga boylarının kontrol edilmesine ve dalga boylarının hızlı bir şekilde değiştirilmesine olanak sağladığından, örnek materyali içerisindeki fluoresant bileşiklerin tamamının belirlenmesine izin vermektedirler. UV absorbsiyonunun, fluoresans ve elektrokimyasal dedektörlerin duyarlılığının önemli bir ölçüde artırılması ise türevlendirme (derivatizasyon) teknikleri ile mümkün olabilmektedir. Türevlendirme tekniğinde ise analit, ya kolona yüklenmeden önce ya da kolondan elüsyonunun yapılmasından sonra kimyasal türevlere dönüştürülür. Analitlerin kimyasal türevlerinin bazı özellikleri ise Tablo 4.3’de verilmektedir.

88

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

4.12.4. Kondüktivite Dedektörleri

Elekrolitik kondüktivite dedektörlerinde, kolon elüsyon sıvısının kondüktivitesi sürekli olarak ölçülmekte ve akışlı-küvet içerisinde analitin bulunması, kondüktivitenin değişmesi ile belirlenmektedir. Kondüktivite dedektörlerinde kullanılan akışlı-küvetler ise oldukça küçük hacimli kapillerden oluşmakta olup, bu kapillere iki elektrot bağlanmıştır (Şekil 4.18). Akışlı-küvet içerisinden akmakta olan kolon elüsyon sıvısı ile birlikte analitler küvete girdiğinde, elüsyon sıvısının kondüktivitesi değişmekte ve bu değişiklikler sürekli olarak kaydedilmektedir. Kondüktivite dedektörlerinin tepkimesi ise oldukça geniş bir aralıkta derişim ile doğru orantılı olduğundan, uygun kalibrasyonların önceden yapılması durumunda dedektör çıkış sinyalinin kuantifikasyonuna da izin vermektedirler. Bu dedektörlerle en iyi sonuçlar ise izokratik elüsyonların yapıldığı kromatografik çalışmalarla sağlanmaktadır. Çünkü, gradient elüsyonlarının yapıldığı durumlarda hareketli fazın gradientinin değişmesine paralel olarak, temel-çizgide kaymalar meydana gelmektedir. Bu tip dedektörler iyon değiş-tokuş kromatografilerinde başarılı bir şekilde kullanılabilmesine rağmen yeterince kabul görmüş değildirler.

Şekil 4.18: Tipik bir kondüktivite dedektörünün akışlı-küvetinin şeması.

4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler

Elektro-aktif bileşikler için seçici olan elektrokimyasal dedektörlerin hassasiyeti ise potansiyel olarak oldukça yüksektir. Elektrokimyasal dedektörlerin prensipleri birbirine benzeyen iki tipi mevcuttur: amperometrik ve kolometrik. Bu tip dedektörlerde akışlı-küvete, birisi kararlı bir yer değiştirici (karşıt) elektrotu (Ag/AgCl veya calomel) diğeri ise polarlaşabilirliği oldukça yüksek olan bir hareket (çalışma) elektrotu olmak üzere iki elektrot bağlanır (Şekil 4.19).

Şekil 4.19: Tipik bir elektrokimyasal dedektörünün akışlı-küvetinin şeması.

4. HPLC

Doç. Dr. Münir TUNCER

89

Hareket elektrotuna, analit akışlı-küvet boyunca geçtikçe, elektrot yüzeyindeki moleküllerin oksitlenmesini veya redüklenmesini ve sonuçta iki elektrot arasında bir akım akışının oluşumunu sağlayacak seviyede sabit bir gerilim (potansiyel) uygulanır. Yer değiştirici elektrota uygulanan gerilim (potansiyel) ise oluşan akımın kaydedicide tam ölçekli bir sapma meydana getirmesine yeterli olmaktadır. Hidrokarbonlar, aminler, amidler, fenoller, di- ve triazinler, fenotiazinler, kateşolaminler ve kuinolinler oksitlenebilen bileşiklerdir. Olefinler, esterler, ketonlar, aldehitler, eterler, azo ve nitro bileşikleri ise redüklenen bileşiklerdir. Hareketli fazda ise tâbi ki dedektörde tepkime oluşturacak bileşikler bulunmalıdır. Elektrokimyasal dedektörler ise özellikle kateşolaminlerin, vitaminlerin ve antioksidantların asseyinde kullanılır. 4.13. HPLC Uygulamaları

HPLC tekniğinin çok geniş uygulama alanına sahip olması, hızlı olması ve yüksek duyarlılık göstermesi nedeni ile bu teknik, kromatografik yöntemler arasında en çok kullanılan teknik olmaya başlamıştır. Öyle görünmektedir ki, her türlü biyomolekülün asseyi ve ayrıştırılması HPLC ile gerçekleştirilebilmektedir. Oligopeptidlerin ve proteinlerin ayrıştırılmasında ise HPLC çok etkili bir şekilde kullanılabilmektedir. Proteinlerin ayrıştırılması için geliştirilen ekipmanlar ise sonuçta hızlı protein sıvı kromatografi (Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC) tekniğinin doğmasına yol açmıştır. FPLC’nin tek bir tekniği olmayıp, bu teknik temelde ters-faz, affinite, jel filtrasyon, hidrofobik interaksiyon, iyon değiş-tokuş kromatografisi ve kromotofokusing tekniklerine bağlıdır. Mikro-çaplı, iç cidarı cam ile sırlanmış, paslanmaz çelikten yapılmış kolonlar 10 dk gibi çok kısa bir zamanda, çok küçük miktarlarda örneklerin kullanılmasına ve ayrıştırılmasına izin vermektedirler. Bu teknik, proteinlerin tripsin ile parçalanması ve mikroorganizmaların kültür sıvıları gibi çok kompleks karışımların doğrudan kolona yüklenmesine izin vermektedir. Fakat ne yazık ki, hücre özütlerinden elde edilen protein karışımlarının bu teknik ile çalışılmasına başlanmadan önce, bir ön filtrasyondan geçirilmesine gereksinim duyulmaktadır.

90

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC)

5.1. Giriş

Jel filtrasyon kromatografisi (Gel Filtration Chromatography; GFC) ilk uygulanmaya başlanmasından itibaren binlerce enzim, polisakkarit, nükleik asit, protein ve diğer biyomoleküllerin saflaştırılmasında kullanılmıştır. Jel filtrasyon kromatografisinin başarısı, kısmen çalışılmakta olan makromoleküllerin özgül doğal yapılarına, kısmen de ayrıştırma tekniği olarak jel filtrasyon kromatografisinin uygulama kolaylığına ve güvenilirliğine bağlıdır. Biyolojik makromoleküller, çevresel koşullarda in vivo olarak meydana getirilen küçük değişikliklerle kontrol edilerek, özel fonksiyonları yerine getiren maddelerin bir sınıfını oluştururlar. pH, metal iyonlarının derişimi ve kofaktörler gibi ortam koşullarında meydana gelebilecek değişiklikler ise çalışılmakta olan biyomoleküller üzerinde oldukça önemli etkilere sahiptirler. Bu nedenle, biyomoleküllerin ayrıştırılması esnasında bu faktörleri ayrı ayrı kontrol etmeye izin veren ılımlı ayrıştırma tekniklerinin bulunması gerekmektedir. Bu ılımlı ayrıştırma koşullarını sağlayan tekniklerden birisi de jel filtrasyon kromatografisidir. Çünkü jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırma işlemi, ayrıştırılması yapılacak olan molekülün özelliklerine göre zorunlu olan iyonların veya kofaktörlerin, deterjanların ve ürenin varlığında; yüksek veya düşük iyonik kuvvette ve istenilen sıcaklıkta ayrıştırma yapmaya olanak sağlamaktadır. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan matriks materyallerinin oldukça kararlı olması ve deneysel koşullar altında biyopolimerlere karşı inert olması, bu ayrıştırma tekniğinin protein saflaştırmada oldukça yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Bunun yanı sıra jel filtrasyon kromatografisinin uygulanması için gerekli olan aparatlar oldukça basit olup, ilk uygulamalarda dahi oldukça iyi bir ayrıştırma ve verim elde edilebilmektedir. 5.2. GFC’nin Temel Prensipleri

Moleküllerin, molekül boyutlarına ve şekillerine dayalı olarak ayrılması, çeşitli porlu materyallerin moleküler elek olarak kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Muhtemelen bu gibi materyallerin en yaygın olarak kullanılanları, üç-boyutlu porlardan oluşan bir ağ sistemine sahip olan ve bu nedenle, bu materyallere jel özellikleri veren bir grup organik yapıdaki polimer bileşiklerdir. Jel filtrasyonu terimi, çeşitli büyüklüklere sahip moleküllerden oluşan bir karışımdaki moleküllerin, jel materyallerinin kullanılmasıyla ayrılması işlemini tanımlamak için kullanılır. Aynı zamanda, porlu cam granülleri de moleküler elekler olarak kullanılmakta olup, kontrollü-porlu cam kromatografi terimi, bu ayrıştırma tekniğini tanımlamak için ortaya çıkmıştır. Ekslüsyon (dışlama) veya permisyon (geçirgenlik) kromatografisi terimleri ise moleküler elekler kullanılarak yapılan bütün moleküler ayrıştırma proseslerini tanımlamaktadır. Bu kısımda ise genel olarak, prensiplerinin ve uygulamalarının en iyi biçimde yayınlanmış olmasından dolayı jel filtrasyon kromatografisi üzerinde durulmaktadır. Fakat bu arada unutulmamalıdır ki, kontrollü-porlu cam kromatografisi de GFC ile birlikte kullanılan en yaygın tekniklerden birisidir.

92

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Jel filtrasyon kromatografisinin temel prensibi oldukça basittir. Moleküllerin ayrıştırılması için kullanılacak olan uygun bir hareketli faz (tampon), matriks (jel) veya porlu-cam granülleri ile paketlenmiş bir kolondan ibarettir. Ayrıştırılması yapılacak olan molekülü içeren örnek materyal karışımı, bir bant oluşturacak şekilde hareketli faz ile dengelenmiş olan kolon yatağının üst kısmına yüklenir. Yüklemeyi takiben kolonun üst kısmından hareketli faz eklendikçe, örnek zonu kolon yatağının içerisine doğru hareket eder. Örnek zonunun kolon yatağı içerisine doğru hareket etmesi ile birlikte jel materyali arasındaki gözeneklere (porlara) diffüze olamayacak kadar büyük olan moleküller, jel materyalinin ara boşluklarından geçecek ve kolondan dışarıya atılan elüsyon sıvısında (elüentte) ilk olarak bu moleküller belirlenecektir. Daha küçük moleküller ise gözenekli jel materyalinin içindeki ve dışındaki hareketli faz arasında dağılacaklar ve gözenekler arasına diffüze olacaklardır. Bu nedenle gözeneklerin içerisine girebilen küçük moleküller, kolonun içerisinden daha yavaş bir hızda geçeceklerdir. Bundan dolayı, kolondan ayrılan elüent içinde en son olarak en küçük moleküller yer alacaktır. Böyle bir jel filtrasyon kolonunda bahsedilen bu üç basamak, diyagramatik olarak Şekil 5.1’de verilmektedir.

Şekil 5.1: Jel filtrasyon ile ayrıştırmanın diyagramatik olarak gösterilmesi.

Jel tarafından absorbe edilen ve bir molekül için kullanılabilir olan hareketli fazın miktarı, bir dereceye kadar jel partiküllerinin porositesine ve molekülün büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle jel kolonundaki bir molekülün dağılımı, yalnızca bu molekül için kullanılabilir olan hareketli fazın toplam hacmi tarafından belirlenir. Hareketli fazın toplam hacmini ise jel partiküllerinin hem içindeki (iç hareketli faz) hem de dışındaki (dış hareketli faz) hareketli fazın miktarı oluşturur. Verilen bir jel tipi için ise özgül bir molekülün, iç hareketli faz ve dış hareketli faz arasındaki dağılma kat sayısı, Kd, bu molekülün moleküler büyüklüğünün bir fonksiyonudur. Şayet bir molekül, jel partiküllerindeki gözeneklere giremeyecek kadar büyükse ve iç hareketli fazın tamamen dışında kalıyorsa Kd = 0 olacaktır. Bunun aksine şayet molekül, jel partiküllerindeki gözeneklerin içerisine (iç hareketli faza) girebilecek kadar küçükse Kd = 1 olacaktır. Her bir jel partikülünün gözenek (por) büyüklüğünün farklılığından dolayı, ara boyutlardaki moleküller için uygun olabilen ve olmayan bir miktar iç hareketli faz olacaktır. Dolayısıyla, örnek içerisindeki faklı büyüklükteki moleküllerin Kd değerleri 0 ile 1 arasında değişecektir. Bunun sonucu olarak da bir jel filtrasyon kolonunda, birbirine oldukça yakın moleküler büyüklüğe sahip olan moleküllerin ayrıştırılmasını olanaklı kılan faktör, Kd değerlerinin bu iki limit (0 ve 1) arasındaki değişimidir. Farklı göreceli moleküler büyüklüklere ve Kd değerlerine sahip iki molekül için, K’d ve K’’d, elüsyon hacimlerindeki fark, VD, aşağıda gösterildiği gibi eşitlik 5.1’den türetilebilir:

VD = (K'd - K''d ) Vi

(5.1)

Burada Vi, Kd değeri 1’e eşit olan molekül için kullanılabilir olan jel partikülleri içerisindeki hareketli fazın hacmidir.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

93

Pratikte ise kolonun zayıf paketlenmesi gibi nedenlere bağlı olarak, ideal davranıştan sapmaların olduğu durumlarda, örnek hacmini VD değerinin altına indirgemek yerinde olur. Çünkü, örnek hacmi ile iç jel hacmi arasındaki oran, hem ayrıştırmanın keskinliğini hem de örneğin seyrelme derecesinin her ikisini birden etkilemektedir. Jel filtrasyon kromatografisi, tek bir cins hareketli fazın kullanımını ve izokratik elüsyonu gerektirir. Elüsyon sıvısındaki analitlerin belirlenmesi ise genellikle, UV absorbsiyon spektrofotometre dedektörleri ile yapılmaktadır. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan kolonlar, diğer tipteki kromatografi kolonlarına oranla daha uzundurlar (bkz. kısım 3.2). Böylece hem durgun fazın hacmi, hem de durgun faz içindeki boşluğun (porların) toplam hacmi artırılmış olur. 5.3. Matriksler

Jel filtrasyon kromatografisinin ilk yıllarında kullanılan dekstran, poliakrilamid ve agaroz matrikslerinin en büyük dezavantajı, bu matrikslerin yumuşaklığı olmuştur. Kromatografi esnasında uygulanan ozmotik basınç da dahil olmak üzere, çok küçük basınçlar dahi bu matrikslerin biçiminin bozulmasına, düzensiz paketlemeye ve hareketli fazın akışının zayıf olmasına neden olmaktadır. Kontrollü-porlu cam matrikslerin kullanımı için yapılan girişimler ise bu tür matrikslerin adsorbsiyon etkilerinden dolayı pek de başarılı olmamıştır. Kontrollü-porlu cam matrikslerin en büyük avantajlarından birisi ise bu matrikslerin sertliğidir. Bu nedenle, paketlemede ve akış oranında, jel matrikslere göre daha az problemlerle karşılaşılmaktadır. Porlu cam matrikslerin adsorbsiyon etkilerinin de üstesinden gelinebilir. Fakat, son zamanlardaki gelişmelerle, jel yapıdaki matrikslerin de porlu cam matrikslerin sunduğu sertlik avantajını sağlaması başarılmıştır. Günümüzde ise jel filtrasyon kromatografisinde yaygın olarak kullanılan jeller (matriksler) çapraz-bağlı dekstranlar (Sephadex), agaroz (Sepharose, Superose ve Bio-Gel A), akrilamid (Trisacryl), poliakrilamid (Bio-Gel P), poliakriloilmorfin (Enzocryl Gel), dekstran-akrilamid (Sephacryl HR), vinil polimer (Fractogel TSK HW-S, Toyopearl TSK HW-M ve TSK HW-C), selüloz (Matrex Cellufine) ve polistiren (Bio-Beads S)’dir. Dekstran temelli jel materyallerinin por büyüklükleri çapraz-bağlar aracılığı ile çok dikkatli olarak ayarlanırken, agaroz temelli olan jellerin por büyüklükleri ise uygun koşullar altında kendiliğinden jelleşmesi ile sağlanmaktadır (bkz. kısım 3.3). Karışım halindeki (kompozit) jeller ise önceden hazırlanmış matrikslerin üzerine ikinci bir polimerin eklenmesi ile elde edilebilir. Örneğin Sephacryl, çapraz-bağlı allil dekstran ile N,N’-metilen bisakrilamid karışımından, Superdex ise oldukça yüksek oranda çapraz-bağ içeren agaroz jel matriksine dekstran zincirlerinin kovalent olarak bağlanması ile elde edilen kompozit birer jeldirler. Superdex jellerin yüksek oranda fiziksel ve kimyasal kararlılık göstermesinin nedeni, jelin yapısındaki agaroz matriks tarafından sağlanırken, materyalin jel filtrasyon özelliği ise dekstran zincirleri tarafından belirlenmektedir. HPLC için uygun olan kolon materyalleri ise daha önce Tablo 4.1’de verilmiş olup, LPLC için uygun olanların bazı örnekleri ise Tablo 5.1’de verilmektedir. 5.4. Deneysel Parametreler i. Örnek materyalinin özellikleri: İyi bir sonucun elde edilebilmesi için, ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin özelliklerinden ayrı olarak, örnek materyalinin sahip olması gereken özellikler, örnek materyalinin viskozitesi ve hacmidir. Örnek materyalinin hacmi, kullanılacak olan kolonun büyüklüğünü etkilerken, viskozitenin ise hidrodinamik kararsızlığa yol açacak kadar yüksek olmaması zorunludur. Örnek materyalinin derişiminden kaynaklanan viskozite, üst sınır olarak kullanılabilir (bkz. kısım 5.6.3.3). Örnek materyalinin pH’sı, iyonik kuvveti ve kompozisyonu ise ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin büyüklükleri ve kararlılıkları üzerine bir etkisi olmadığı sürece önemli değildir ve kullanılan jel materyalinin izin verdiği sınırlar arasında seçilebilir.

94

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Tablo 5.1: LPLC için uygun olan bazı jel matriksleri. Polimer

Dekstran

Agaroz

Poliakrilamid

Vinil

Kompozit (dekstranpoliakrilamid)

Ticari İsim Sephadexb G10 G15 G25 G50 G75 G100 G150 G200 Sepharosb 2B 4B 6B Superoseb 12 HR 6 HR Bio-Gelc A-0,5m A-5m A-15m A-50m A-150m Bio-Gelc P2 P4 P6 P10 P30 P60 P100 P150 P200 P300 Fractogel TSKd HW-40 HW-55 HW-65 HW-75 Sephacrylb S-100 HR S-200 HR S-300 HR S-400 HR Superdexb 30 75 200

Fraksiyonlama aralığıa ( Mr, kDa) < 0.7 <1,5 1-5 1,5-30 3-80 4-150 5-300 5-600 10-4 000 60-20 000 70-40 000 1-300 5-5 000 10-500 10-5 000 40-15 000 100-50 000 1 000-150 000 0,1-1.8 0,8-4 1-6 1,5-20 2.5-40 3-60 5-100 15-150 30-200 60-400 0,1-10 1-700 50-5 000 500-50 000 1-100 5-250 10-1500 20-8 000 <10 3-70 10-600

a

Globüler moleküller için tanımlanmıştır. Moleküler kütle aralıkları ise tek-zincirli nükleik asitler için yaklaşık olarak aynı b c Bio-Rad olmakla birlikte, fibrilli proteinler ve çift-zincirli DNA için daha küçüktür. Amersham Pharmacia Biotech. d Laboratories. Merck/Toyo-Soda.

ii. Kolon parametreleri: Jel filtrasyon kolonunun en önemli özelliği, jel materyalinin kolona nasıl paketlenmiş olduğudur. Şayet jel materyali düzgün bir şekilde paketlenmiş ise örnek materyal zonu, kolon boyunca hareket ettikçe genişlemeyecek ve sonuçta iyi bir sonuç elde edilecektir. Şayet kolon düzgün bir şekilde paketlenmemişse, bu kolondan iyi bir sonuç elde etmeyi beklemek hayalden öteye bir şey olmayacaktır.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

95

Kolonun uzunluğu (cm) ise hem çözünürlüğü, hem de örnek moleküllerinin elüsyonu için geçen zamanı (elüsyon zamanı) etkileyeceği için oldukça önemlidir. Bu nedenle çözünürlük, moleküllerin elüsyon zamanları ve kolon uzunluğu arasındaki ilişki, eşitlik 5.2’de verildiği gibi doğru orantılı olarak değişmektedir: Çözünürlük Elüsyon zamanı

α α

Kolon uzunluğu Kolon uzunluğu

(5.2)

Kolonun hacmi (mL), ise yükleme kapasitesinin doğrudan ölçüsünü verir ve örnek materyalinin hacmine bağlı olarak seçilir. iii. Hareketli fazın özellikleri: Jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırma, sadece ayrıştırılacak olan moleküllerin büyüklüklerine bağlı olduğundan, ayrıştırma mekanizması için hareketli fazın bileşiminin bir önemi bulunmamaktadır. Bu nedenle kullanılacak olan hareketli fazın bileşimi, deneysel çalışmanın genel özelliklerine uygun olarak seçilebilir. Genellikle hareketli faz olarak, çalışılmakta olan moleküllerin kararlılığını ve biyolojik aktivitelerini koruyan, iyonik kuvveti ve pH’sı iyi tanımlanmış olan tamponlar kullanılmaktadır. Örnek molekülleri ile jel matriksi arasında istenmeyen etkileşimlerin oluşmasını önlemek amacı ile genellikle 150 mM veya daha yüksek iyonik kuvvetteki tamponlar kullanılmaktadır. iv. Elüsyon koşulları: Jel filtrasyon kromatografisinin uygulanması esnasında göz önünde bulundurulması gereken diğer önemli bir parametre ise hareketli fazın akış oranıdır. Hareketli fazın akış oranı ise sadece ayrıştırma hızını değil, aynı zamanda kolondan elde edilen çözünürlüğü de etkiler. Genel olarak, en azından büyük moleküller için, hareketli fazın akış oranının düşük olması çözünürlüğü artırır. Hareketli fazın akış oranı basitçe hacimsel olarak, örneğin mL dk–1, ölçülür. Fakat, farklı hacimlerdeki kolonlardan elde edilen sonuçların karşılaştırılması durumunda, lineer satıh akış oranının, örneğin cm s–1, ölçülmesi daha kullanışlıdır: Lineer satıh akış oranı (cm s -1) =

Hacim akış oranı (ml dk -1) x 60 Kolonun enine kesit alanı (cm 2)

(5.3)

Bu yolla tanımlanmış olan akış oranı ise basitçe, lineer akış oranı olarak ifade edilir. Akış oranının etkisi göz önünde bulundurulduğu sürece, aynı lineer akış oranlarında elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir. 5.5. Moleküllerin Davranış Özellikleri

Jel filtrasyon kromatografisinin sonuçları genellikle, örnek moleküllerinin elüsyon hacimleri ile birlikte elüsyon sıvısı içerisindeki derişim değişikliklerini de içeren bir elüsyon profilini gösteren grafik halinde ifade edilir (Şekil 5.2). Protein ve nükleik asitlerin yanı sıra, diğer tipteki örnek moleküllerinin çalışıldığı birçok durumda, kolondan ayrılan hareketli faz içersindeki moleküllerin belirlenmesi UV spektrofotometre aracılığı ile yapılmaktadır. Kolondan ayrılan hareketli faz, sürekli olarak UV spektrofotometre ile taranarak sonuçlar bir grafik kaydediciye aktarılır ve kromatogram elde edilir. Böylece, elüsyon sıvısı içerisindeki moleküllerin pozisyonları ve derişimlerinin belirlenmesi sağlanmış olur. Elde edilen kromatogramdan ise istenilen molekülün elüsyon hacmi (VR) hesaplanabilir. Elüsyon hacminin belirlenmesi için ise farklı kriterler kullanılmaktadır: • Kolona çok küçük hacimdeki (elüsyon hacmi ile karşılaştırıldığında ihmal edilebilecek kadar küçük) bir örnek materyalinin yüklenmesi durumunda, kromatogramda görülen pikin tepe noktasının pozisyonu elüsyon hacmi olarak alınabilir (Şekil 5.3,a).

96

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

• Şayet örnek materyal hacmi, elüsyon hacmi ile kıyaslandığında ihmal edilemeyecek kadar büyükse, elüsyon hacmi olarak, örnek materyal hacminin yarısı ile pikin tepe noktası arasında kalan kısım alınır (Şekil 5.3,b). • Şayet, kolona yüklenen örnek materyalin hacmi oldukça büyükse (kromatogramda bir plato veriyorsa) bu durumda elüsyon hacmi olarak, örnek materyalinin kolona yüklendiği noktadan elüsyonun pikinin başlangıç noktasının yarı yüksekliğine kadar olan kısım alınır (Şekil 5.3,c). Bu kriter ise genellikle plato vermeyen örnek materyaller için yanlış olarak uygulanmaktadır.

Şekil 5.2: Jel materyali olarak Sephadex G-25’in kullanıldığı bir uygulamada, selülozun asetoliziz ve hidrolizizi sonucunda elde edilen oligosakkarit karışımının kromatogramı. Piklerin üzerinde bulunan rakamlar polimerizasyon derecelerini göstermektedir (Flodin ve Aspberg, 1961).

Şekil 5.3: Elüsyon hacminin (VR) ölçülmesi. (a) Örnek materyal miktarı kolon yatak hacmi ile kıyaslandığında ihmal edilebilecek kadar küçüktür. (b) Örnek materyal miktarı kolon yatak hacmi ile kıyaslandığında ihmal edilemeyecek kadar büyüktür. (c) Örnek materyal kromatogramda bir plato vermektedir (Anonymous, 1998).

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

97

Jel filtrasyon kromatografisinde moleküller, normalde simetrik bir pik oluşturacak şekilde elüe edilirler. Bu nedenle moleküllerin elüsyon hacimleri, bu metotlarla kolaylıkla belirlenebilir. Pratikte ise çok daha gelişmiş olan kriterler nadiren kullanılmaktadır. Örnek moleküllerinin davranışlarını belirlemek için elüsyon hacmi tek başına yeterli değildir. Çünkü moleküllerin elüsyon hacimleri, kolon yatak hacmi (Vt) ve kolonun paketlenme özelliklerine bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle bir molekülün elüsyonu, diğer partisyon kromatografilerindekine analog olarak en iyi şekilde dağılma kat sayısı (Kd) ile belirlenebilir. Jel materyalinin gözenekleri arasına giremeyecek kadar büyük olan bir molekülün elüsyon hacmi, o kolonun boşluk hacmine (Vo) eşit olacaktır. Jel filtrasyon kromatografisinde ise durgun fazın hacmi (VS), jel partiküllerinin gözenekleri içerisinde bulunan hareketli fazın hacmine (Vi) eşittir. Bu nedenle, hareketli faz ve durgun faz arasında serbestçe dağılabilen bir molekülün elüsyon hacmi, kolon yatak hacmi (Vt) ile boşluk hacmi (Vo) arasındaki farka eşittir. Böylece Kd, bir molekülün diffüzyonu için kullanılabilir olan durgun faz kısmını temsil etmektedir. Pratikte ise bu yolla belirlenmiş olan durgun faz hacmini tanımlamak oldukça zordur. Durgun faz hacminin belirlenmesi, genellikle 23Na gibi radyoaktif iyonların elüsyon hacimleri belirlenerek yapılmaktadır. Kav değerinin elde edilmesi durumunda ise VS yerine Vt-Vo teriminin kullanılması çok daha güvenli olmaktadır:

Kav =

(VR - Vo) (Vt - Vo)

(5.4)

Vt-Vo, her türlü örnek molekülü için erişilmez olan jeli oluşturan maddelerin hacmini de içerdiği için Kav, gerçek bir dağılım kat sayısını göstermez (Şekil 5.4). Bunun yanı sıra, her bir jel için bir örnek materyalinin derişiminden veya örnek moleküllerinin özelliklerinden bağımsız olarak Kav/Kd arasındaki oran sabittir. Kd değeri gibi, kolon yatağının boyutlarından ve paketlenme özelliklerinden bağımsız olarak moleküllerin davranışını belirleyen Kav değeri kolayca belirlenebilir. Kolonun paketlenme kalitesine bağlı olarak değişen ve elüsyon davranışının normalleştirilmesi için kullanılan terimler arasındaki yaklaşık ilişkiler ise Şekil 5.5’de verilmektedir.

Şekil 5.4: Vt ve Vo’nun diyagramatik olarak gösterilmesi. Burada Vt-Vo’nun jeli oluşturan maddelerin hacmini de içerdiğine dikkat edilmelidir.

Moleküllerin, özellikle de proteinlerin, kütlelerinin veya büyüklüklerinin belirlenmesinde jel filtrasyon kromatografisinin kullanımına ilişkin veriler Hagel (1989) tarafından oldukça detaylı olarak verilmiş bulunmaktadır. Pratikte ise birbirine oldukça benzer moleküler şekil ve yoğunluktaki bir seri bileşiğin Kav değerleri ile moleküler kütlelerinin (MW) logaritmaları arasında sigmoidal bir ilişki olduğu belirlenmiştir. Her hangi bir jel materyali için bu yolla elde edilmiş olan kalibrasyon eğrileri ise genellikle seçicilik eğrisi olarak adlandırılır ve Kav ile log MW arasındaki ilişki ise oldukça geniş bir aralık içinde lineer olarak kalmaktadır. İdeal bir jel filtrasyon kromatografisinden elüe edilen moleküllerin Kav değerleri ise 1’den büyük, 0’dan küçük olmamalıdır. Şayet Kav değeri 1’den

98

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

büyükse bu, jel materyali ile moleküller arasında bir çeşit adsorbsiyonun oluğunu gösterir. Şayet kalibrasyondan sonra Kav değeri 0’dan küçükse bunun anlamı, jel materyalinin iyi paketlenmediği ve kolon yatağında kanallaşmaların olduğudur ki, bu durumda kolonun yeniden paketlenmesi gerekmektedir.

Şekil 5.5: Elüsyon davranışının normalleştirilmesi için kullanılan terimler arasındaki ilişkiler (Anonymous, 1998).

5.6. Deneysel Koşulların Dizaynı 5.6.1. Performans

Jel filtrasyon kromatografisinde de diğer kolon kromatografilerinde olduğu gibi kromatografinin performansı çözünürlük, ayrıştırma zamanı ve kapasite gibi bazı parametrelere bağlıdır. i. Çözünürlük: Ayrıştırma çalışmalarının yapıldığı kromatografik yöntemlerin hepsinde temel amaç, ilgilenilmekte olan moleküllerin uygun bir şekilde fraksiyonlanmasının sağlanmasıdır. Kromatografik yöntemlerde çözünürlük ve çözünürlüğü kontrol eden en önemli parametreler olan kapasite faktörü, verimlilik ve seçicilik ise detaylı olarak kısım 2.8’de ve bu kısmı takip eden altkısımlarında incelenmiştir. Bunun yanı sıra, jel filtrasyon kromatografisinin uygulandığı çalışmalarda çözünürlüğü artırmanın bazı yolları da bulunmaktadır. Bunlardan başlıcaları arasında daha uzun bir kolonun kullanılması, daha küçük partikül büyüklüğüne ve/veya daha yüksek seçiciliğe sahip jel materyalinin kullanılması, örnek materyalin hacminin küçültülmesi ve akış hızının düşürülmesi sayılabilir. Buna rağmen, yüksek bir çözünürlüğün elde edilmesini sağlayan deneysel koşullar genellikle deneyin diğer amaçları ile bir çelişki oluşturduğundan, genel amaçları

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

99

sağlayan deney koşullarının dikkatli bir şeklide tasarlanması gerekmektedir. Patrikte ise en yüksek düzeyde çözünürlüğün elde edilmesine gereksinmenin duyulmadığı durumlarda, deneysel koşulların dizaynının en yüksek çözünürlüğü verecek şekilde seçilmesine gerek yoktur. ii. Ayrıştırma zamanı: Jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırma işlemi, birkaç dakikadan başlayıp uzun saatlere kadar değişebilmektedir. Bu değişikliğin temel nedenleri arasında ise ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin ayrıştırılmasındaki zorluklar, jel matriksinin özellikleri, kolonun uzunluğu ve hareketli fazın akış oranı yer almaktadır. Çözünürlüğün artırılmasını sağlayan faktörler, aynı zamanda ayrıştırma zamanının da uzamasına yol açtığından, hız ve çözünürlük arasında her zaman bir denge oluşturulmalıdır. iii. Kapasite: Başarılı bir şekilde fraksiyonlanması istenen örnek materyalinin miktarı, örnek materyalinin hacmine ve derişimine bağlıdır. Örnek materyalinin derişimi ve hacmi ise çözünürlüğü farklı olarak etkilemektedir: a. Örnek materyalinin derişimi: Örnek materyal içerisindeki protein derişiminin çözünürlük üzerine doğrudan olan etkisi oldukça küçüktür. Bununla birlikte, orta yoğunluktaki nükleik asit ve polisakkarit solüsyonları dahi hareketli faza oranla oldukça viskoz olabilirler ve çözünürlüğün dramatik bir şekilde düşmesine yol açabilirler. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılabilecek olan örnek materyallerinin derişimi ise kısım 5.6.3.3’de verilen viskozite sınırları arasında olduğu sürece kolona yüklenebilir. Örnek materyallerinin kolona yüklenmeden önce yoğunlaştırılması ise prosedürün preparatif kapasitesini artırmanın basit ve etkili bir yoludur. b. Örnek materyalinin hacmi: Jel filtrasyon kromatografisinin kullanıldığı ayrıştırma çalışmalarında çözünürlük, örnek materyal hacminin kolon yatak hacmine olan oranına bağlıdır. Örnek materyal hacminin kolon yatak hacmine oranının yüksek olduğu sistemlerden elde edilen çözünürlük, bu oranın çok daha küçük olduğu durumlardakine oranla daha düşüktür (Şekil 5.6). İyi bir çözünürlüğün elde edilebilmesi için önerilen örnek materyal hacmi ise ticari olarak kullanılan jel materyallerine göre değişmektedir (Tablo 5.2). Örnek materyal hacmi, jel materyalinin partikül büyüklüğü ve çözünürlük arasındaki ilişki ise Hagel (1985) tarafından açıklanmıştır. Buna rağmen, jel filtrasyon kromatografisinin uygulandığı ayrıştırma çalışmalarında kolona yüklenecek olan örnek materyalinin gerçek miktarı ise sadece deneysel çalışmalar sonucunda belirlenebilir.

Şekil 5.6: Örnek hacminin elüsyon profili üzerine etkisi. (a) Teorik olarak sıfır hacme rağmen diffüzyon, piki (b)’dekine benzer şekilde bir hacme dağıtmaktadır. (c) Örnek hacmi idealden fazladır ve daha büyük bir elüsyon hacmi oluşturmaktadır. (d) Örnek hacmi idealden çok daha fazladır ve elüsyon hacmi, moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılmasını sağlayamayacak kadar fazladır (Scopes, 1994).

100

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Tablo 5.2: İyi bir çözünürlük için kolona yüklenmesi önerilen örnek materyal hacminin kolon yatak hacmine oranları. Jel materyali

Önerilen örnek hacmi (%Vt)

Sephadex

%2-5

Sepharose

%2-5

Sepharose CL

%2-5

Sephacryl HR

%1-2

Superdex (prep gade)

%1-2

Superose (prep gade)

%1-2

Superdex

%0,5

Superose

%0,5

iv. Prosesin gereksinimleri: Jel filtrasyon kromatografisinin büyük-ölçekli olarak uygulandığı durumlarda, kullanılan metodun oldukça ekonomik olma zorunluluğu nedeni ile sadece istenilen çözünürlüğün elde edilmesi yeterli değildir. Üretim prosesinde jel filtrasyon kromatografisinin performansı konusunda göz önünde bulundurulması gereken önemli parametrelerden birisi de verimlilik veya bir saatte kolon yatak hacmi başına işlenen örnek materyalin miktarı (g mL yatak–1 s–1)’dır. Çözünürlüğü yeterli bir düzeyde tutmak kaydıyla, belirli hacimdeki bir jel kolonunun verimliliği ise örnek materyalinin derişimini, örnek materyal hacmini ve akış oranını artırarak sağlanabilir. Maksimum verimliliği sağlayan deneysel koşullar ise ancak sistematik olarak yapılan denemeler sonucunda elde edilebilir.

Jel filtrasyon kromatografisinin, laboratuvar-ölçeğinden üretim aşamasına yani büyük-ölçekli uygulamalarına geçiş oldukça kolaydır. Bu amaçla 2 500 litre yatak hacmine sahip olan jel kolonları tatmin edici sonuçlar verecek şekilde kullanılabilmektedir. Küçük-ölçekli uygulamalardan büyükölçekli uygulamalara geçilirken, kolon yatak yüksekliği, lineer akış oranı ve örnek materyalin derişimi sabit tutulmalı fakat, örnek materyal hacmi ve volümetrik akış oranı ise kolon yatak hacminin artış oranında artırılmalıdır. v. HPLC jel filtrasyon kromatografisi: HPLC sistemlerinin kullanıldığı durumlarda ise jel materyalleri ve ekipmanlar, çözünürlük ve hız arasında mümkün olan en iyi kombinasyonu verecek şekilde özel olarak dizayn edilirler. Çözünürlüğün kaybolmasının temel nedeni zon genişlemesi olduğundan, HPLC kolonlarında örnek materyalinin dağılmasını önleyen her türlü önlem alınmaktadır. Bu nedenle, küçük partikül çaplı jel materyalleri kullanılarak en yüksek verimliliğe sahip, küçük boyutlardaki kolonlar içerisine paketlenirler. Bu kolonlara yüklenen örnek hacimlerinin küçük olması, dedektörlerin ve diğer ekipmanların özel olarak dizayn edilmesi sayesinde kompleks örnek materyalleri dahi bir saat içerisinde fraksiyonlanabilmekte ve oldukça iyi sonuçlar elde edilebilmektedir. 5.6.2. Matriks Seçimi

Uygun bir jel materyalinin seçiminde göz önünde bulundurulması gereken iki faktör bulunmaktadır: deneyin amacı ve ayrıştırılmak istenen molekülün büyüklüğü. Bazı durumlarda ise uygun bir jel materyalinin seçiminde, ayrıştırılmak istenen moleküllerin veya örnek materyalinin diğer karakteristik özelliklerini de göz önünde bulundurmak gerekebilir. 5.6.2.1. Deneyin Amacı

Jel filtrasyon kromatografisinin kullanıldığı çalışmalarda amaç, ya analitik ya da preparatif metotların kullanılmasını gerektirir. Örnek materyallerinin saflığının belirlenmesi ve moleküllerin göreceli moleküler kütlelerinin belirlenmesi gerektiği durumlarda analitik yöntemler kullanılırken,

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

moleküllerin doğal yapılarının ve biyolojik aktivitelerinin korunarak, gerçekleştirilmek istendiği durumlarda ise preparatif metotlar kullanılmaktadır.

101

saflaştırılmalarının

A. Analitik Metotlar

Analitik uygulamalarda sistem değiştirilmediği sürece, jel filtrasyon kolonuna uygulanan örnek materyalinden her defasında aynı sonucun ve verimliliğin elde edilmesi beklenir. Bu nedenle, analiz koşulları altında mükemmel denecek kadar kararlı bir yatak oluşturan jel materyalinin seçilmesi oldukça önemlidir. Bu amaçla Sephacryl HR, Superdex veya Superose gibi jel materyalleri ile önceden paketlenmiş olan kolonlar, hem verimlilik hem de sonuçların tekrarlanabilirliği açısından analitik çalışmalar için oldukça uygundur. En yüksek çözünürlüğün elde edilmesi ile sonuçlanan maksimum verimliliğin sağlanması için önceden paketlenmiş olan kolonların kullanımı önerilmektedir. Şayet kolonlar laboratuvarda paketlenecekse, kararlı ve iyi paketlenmiş bir yatak oluşturmak için gerekli olan hassasiyetin gösterilmesi gerekmektedir (bkz. kısım 5.7.2). i. Saflığın belirlenmesi: Örnek materyallerinin saflığının belirlenmesi amacı ile jel filtrasyon kromatografisinin kullanılması durumunda, genellikle hedef protein ile bilinen kirletici proteinler arasında maksimum çözünürlüğün elde edilmesi zorunludur. Jel materyalleri arasındaki küçük seçicilik farklılıkları, çözünürlük üzerinde oldukça önemli olabilir. Bu nedenle, kullanılacak olan jel materyaline karar verilmeden önce, farklı jel materyalleri ile ön-çalışmaların yapılması optimum sonuçların elde edilmesi açısından oldukça önemlidir. ii. Moleküler kütlenin belirlenmesi ve moleküler kütle dağılım analizi: Moleküler kütlenin belirlenmesi amacı ile jel filtrasyon kromatografisi kullanılabilir. Bu durumda hedef molekülün tahmini moleküler kütlesi, seçilen jel materyalinin seçicilik eğrisinin lineer parçası içerisinde kalması ve kalibrasyon standartlarının ortasında bulunması gerekir. Şayet hedef molekülün moleküler kütlesi hakkında bir tahminde bulunamıyorsak, bu durumda Sephacryl HR gibi geniş fraksiyonlama aralığına sahip bir jel materyalinin kullanılması çok daha uygun olacaktır. Aynı zamanda, moleküler kütle dağılım analizlerinin yapıldığı çalışmalarda da geniş fraksiyonlama aralığına sahip bir jel materyalinin kullanılması önerilmektedir. Şayet gerekli ise farklı fraksiyonlama aralığına sahip jel materyalleri aynı kolon içerisinde beraber veya iki ya da daha fazla kolon serileri halinde kullanılabilir. iii. Bağlanma dengesi: Bağlanma dengelerinin araştırıldığı çalışmalarda, reaksiyona girmiş (bağlanmanın gerçekleştiği) olan bileşiklerin ayrılması istenir. Birçok uygulamada ise bağlanmanın gerçekleşmiş olduğu moleküller diğer moleküllere oranla daha büyük olduğundan, kullanılacak olan jel materyalinin seçimi de daha kolaydır. Örneğin, protein ve küçük moleküller arasındaki bağlanma dengelerinin araştırılmasında Sephadex G-25 uygun bir jel materyalidir. B. Preparatif Metotlar

Hedef moleküllerin doğal yapılarının ve biyolojik aktivitelerinin korunarak, ayrıştırılmalarının jel filtrasyon kromatografisi ile gerçekleştirilmek istendiği durumlarda ise preparatif metotlar kullanılmaktadır. i. Grup ayrıştırmaları ve tuzların uzaklaştırılması: Örnek materyal içerisinde bulunan tuzların uzaklaştırılması veya örnek materyalin tamponunun değiştirilmesi gibi grup ayrıştırmalarının yapıldığı durumlarda, jel filtrasyon kromatografisi için kullanılacak olan jel materyalinin seçimi çok daha kolaydır. Çünkü, ayrıştırılması yapılacak olan iki grup bileşik (hedef moleküller ve tuzlar ya da tampon bileşenleri) arasındaki moleküler farklılık oldukça büyüktür ve bu nedenle, iyi bir çözünürlüğün sağlanması çok da zor değildir. Bu amaçla, büyük moleküler kütleye sahip olan hedef moleküllerinin, boşluk hacmi (Vo) içerisinde (Kav = 0) elüe olmasına izin veren bir

102

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

jel materyali seçilmelidir. Bu seçim, aynı zamanda hedef moleküllerinin kolonda daha kısa süre kalmasını sağlamanın yanı sıra, zon genişlemesini minimumda tutarak, örnek materyalinin daha fazla seyrelmesini de önleyecektir. Örnek materyal içerisinde bulunan daha küçük moleküler kütleye sahip olan bileşikler ise (tuzlar) neredeyse kolon yatağının toplam hacmine (Vt) yakın bir hacimde elüe olacaklardır (Kav ≈ 1). Yaklaşık 5 kDa kadar küçük moleküller için dahi iyi bir ayrıştırma kapasitesine sahip olması nedeni ile örnek materyallerden tuzların giderilmesi için yapılan uygulamaların çoğu için Sephadex G-25 Fine, iyi bir jel materyalini oluşturmaktadır. Şayet kullanılan jel materyalinin biyolojik veya radyo-aktif kontaminasyon riski varsa, kullanılan materyallerdeki tehlikeyi azaltmak için tekkullanımlık kolonlar kullanılmalıdır. Tek-kullanımlık kolonlar, aynı zamanda çok sayıda örnek materyalinin muamele edilmesi gerektiği durumlarda da kullanılabilir. ii. Preparatif fraksiyonlama: Proteinlerin ve diğer biyomoleküllerin saflaştırılmasında, jel filtrasyonu kullanılarak moleküllerin büyüklüklerine göre fraksiyonlanması birçok çalışmanın doğal bir parçasını oluşturmaktadır. Tam olarak hangi tip jel materyalinin seçileceği ise deneysel çalışmanın amacına bağlıdır. Burada ise genellikle jel filtrasyon kromatografisinin uygulandığı prosesler ana hatları ile ele alınarak, bir fikir verilmek istenmektedir.

Jel filtrasyon kromatografisi, genellikle saflaştırma prosedürünün ilk aşamalarında kullanılarak, örnek materyal içerisinde bulunan ve daha sonraki çalışmalar için problem oluşturabilecek büyük moleküler kütleli kontaminatların uzaklaştırılmasını amaçlamaktadır. Bunun yanı sıra, saflaştırma prosedüründe kullanılacak olan daha sonraki kromatografik sistemler için örnek materyalinin iyonik kompozisyonu, pH’sı ve iyonik kuvveti de ayarlanmış olur. Jel filtrasyon kolonuna uygulanacak olan örnek materyali göreceli olarak ham olacağından, jelin yağlardan ve/veya protein kirleticilerden temizlenmesi oldukça önemlidir. Aynı zamanda örnek materyalinin hacmi göreceli olarak daha büyük olacağından, büyük bir yatak hacmine gereksinim duyulabilir. Örnek materyal içerisinde proteazların veya hedef molekülleri parçalayabilen diğer enzimlerin de bulunma ihtimali olduğundan, kromatografinin yüksek akış oranında gerçekleştirilmesini gerekli kılabilir. Bu gibi durumlarda ise Sephacryl HR serisi gibi bir jelin kullanılması önerilmektedir. Saflaştırma prosedürünün daha sonraki aşamalarında ise örnek materyalin kompozisyonu daha basit olacağından, geriye kalmış olan kirleticilerin uzaklaştırılması için yüksek performanslı jel materyallerinin kullanılması gerekebilir. a. Dimerlerin ve agregatların uzaklaştırılması: Dimerlerin ve agregatların eleminasyonunu sağlamak için kullanılacak olan jel materyali, ilgilenilmekte olan monomerik moleküllerin elüsyonunu kromatogramın sonuna doğru sağlayacak bir seçiciliğe sahip olmalıdır. Bu amaçla Superdex, Superose veya Sephacryl HR gibi yüksek çözünürlüklü jel materyalleri kullanılabilir. b. Degredasyon ürünlerinin ve eksik moleküllerin uzaklaştırılması: Kirleticilerin moleküler büyüklüklerinin, hedef molekülünkinden daha küçük olduğu biliniyorsa, seçilecek olan jel materyali hedef moleküllerin elüsyonunu kromatogramın başında sağlayacak şekilde olmalıdır. Örneğin, hedef moleküllerin moleküler büyüklükleri 50-100 kDa aralığında olduğu bir durumda, Sephacryl S-100 HR veya Superdex 75’in kullanılması önerilebilir. 5.6.2.2. Ayrıştırılacak Olan Moleküllerin Özellikleri i. Komponentlerin moleküler kütleleri: Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılacak olan jel materyalinin seçimini etkileyen en önemli faktör, ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin moleküler kütleleridir. Bu nedenle seçilen jel materyali, hedef moleküllerin moleküler büyüklüklerini ayrıştırma aralığına sahip olmak zorundadır. Hedef moleküllerin ayrıştırılmasını sağlayacak olan jel

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

103

materyallerinin seçiminde ise farklı jel materyallerinin seçicilik eğrilerinden yararlanılabilir (bkz. Tablo 5.1). ii. Ayrıştırılacak olan biyomoleküllerin tipi: Ayrıştırılması yapılmak istenen DNA, RNA, protein, peptid, oligopeptid ve polisakkarit gibi farklı molekül sınıfları, oldukça farklı moleküler şekillere sahip olabileceklerinden dolayı, aynı moleküler büyüklükte olsalar dahi bu moleküllerin jel materyallerindeki davranışları çok farklı olmaktadır. Faklı jel materyallerine ait seçicilik eğrilerinden yararlanılarak, ayrıştırılması yapılacak olan molekül sınıfı için en uygun olan jel materyali seçilmelidir. 5.6.2.3. Örnek Materyalinin Özellikleri i. Örnek materyal miktarı: Örnek materyalinin miktarının büyük olması daha büyük bir kolon yatağına gereksinim göstereceğinden, jel materyalinin seçimi üzerine olan etkisi dolaylıdır. Bu nedenle seçilecek olan jel materyali, yeterince büyük yatak hacimleri oluşturulduğunda dahi ekonomik olarak kullanılabilmelidir (bkz. kısım 5.6.3.1). ii. Hareketli faz: Bazı örnek materyalleri, sınırlı çözünürlüğe veya kararlılığa sahip proteinleri veya başka biyomelekülleri içermektedir. Bu nedenle, bu tip örnek materyallerinin pH’sının veya diğer koşullarının değiştirilmesi, biyomoleküllerin inaktivasyonu ve hatta çökelmesi ile sonuçlanabilmektedir. Şayet örnek materyali jel filtrasyon kolonunun içinde çökelti oluşturursa, muhtemelen geri-dönüşümsüz olarak, kolon tıkanacaktır ve örnek materyalin kaybına yol açacaktır. Bu nedenle çalışma koşulları, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin çözünmesini ve karalılıklarını sağlayan sınırlar içerisinde olmalıdır.

Hareketli fazın bileşimi, ayrıştırılması yapılacak olan biyomoleküllerin yapısını değiştirme ihtimalinin bulunmadığı ya da jelin kakarlılığını değiştirmediği sürece, jel materyalinin seçimini etkilemez. Membran bileşenleri gibi düşük çözünürlüğü sahip olan proteinlerin çözünürlüğünü artırmak için özellikle deterjanlar oldukça kullanışlıdırlar. Bununla birlikte deterjanların jelin por yapısı üzerine bir etkisinin olmadığı bilinmektedir. 6 M guanidin hidroklorür veya üre gibi disosiasyon tamponları içeren hareketli fazın kullanıldığı durumlarda jel filtrasyon kromatografisi, moleküler kütlelerin belirlenmesinde oldukça kullanışlıdır. Bunun yanı sıra, guanidin hidroklorür, üre ve deterjan içeren tamponlar içerisinde proteinler ve polipeptidlerin üç-boyutlu yapıları bozulduğundan, moleküller daha geniş bir konfigürasyona sahip olmaktadırlar. Bu nedenle, bu moleküllerin globüler halinde iken kullanılan jel materyalinden daha geniş por aralıklarına sahip olan jel materyalinin (örneğin, Sephacryl HR, Sepharose CL veya Superose) seçilmesi gerekmektedir. 5.6.3. Kromatografi Koşullarının Seçimi 5.6.3.1. Kolon Seçimi

Jel filtrasyon kromatografisinden en iyi sonucun elde edilebilmesi için kullanılacak olan kolonun seçiminde gerekli hassasiyetin gösterilmesi zorunludur. i. İdeal özellikler: Jel filtrasyon kromatografisi, ister laboratuvar ölçeğinde, ister pilot uygulamada, isterse endüstriyel üretiminde kullanılsın, uygun şekilde dizayn edilmiş bir kolonun kullanılması gerekmektedir (bkz. kısım 3.2). Kolonun hem giriş hem de çıkış noktalarındaki ölü hacim, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Basit kolonların çoğu büyük bir ölü hacme sahip olduğundan, bu tip kolonların kullanımından mümkün olduğunca sakınılmalıdır. Yatak desteği olarak kaba cam tıkaçların veya cam yününün kullanıldığı kolonlar ise kısa sürede tıkandıkları, temizlenmelerinin zor olması ve doğru olmayan sonuçların elde edilmesine yol açtıklarından, uzun süreli kullanımlar için kesinlikle önerilmemektedir.

104

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Günümüzde ticari olarak bulunan kolonlar ise kararsız biyomoleküllerin bozulmasına yol açmayacak olan maddelerden üretilmektedir. Aynı zamanda, bu tip kolonların parçalarına ayrılması ve temizlenmesi de oldukça kolaydır. Bunun yanı sıra iyi bir kolonda bulunması gereken özellikler şu şekilde sıralanabilir: • Kolon çıkışının ölü hacmi, kolon hacminin %0,1’inden daha küçük olmalıdır. Böylece ayrıştırılması gerçekleşmiş olan biyomoleküllerin çıkış esnasında yeniden karışması ve seyrelmesi minimuma indirilmiş olur. • Kolon çıkışında bulunan yatak destek materyali, uniform bir akış sağlama özelliğinde olan materyalden imal edilmiş olmalıdır. • Örnek materyalin yüklenmesi için kullanılan adaptörlerin eklenmesine müsait olmalıdır. ii. Basınç ve çözücü direnci: Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılacak olan kolonlar, kromatografinin gerçekleştirileceği basınca ve kullanılacak hareketli fazın özelliğine göre birkaç sınıfa ayrılabilir. Ticari olarak bulunan kolonların bir kısmı (örneğin, Amersham Pharmacia Biotech tarafından üretilen XK serisi,) her türlü tamponun hareketli faz olarak kullanıldığı kromatografilerde 5 bar’a kadar olan basınca dayanıklıdır. Bunun yanı sıra, yine Amersham Pharmacia Biotech tarafından üretilen C serisi kolonlar ise 1 bar’a kadar olan laboratuvar uygulamaları için uygundur. Organik çözücülerin hareketli faz olarak kullanıldığı durumlarda ise SR serisi (Amersham Pharmacia Biotech) gibi kolonların kullanılması önerilmektedir. iii. Kolon boyutları: Jel filtrasyon kromatografisinde ayrılmış olan iki zonun çözünürlüğü, kolon uzunluğunun karekökü oranında artar (bkz. Eşitlik 5.2). Bu nedenle, analitik fraksiyonlamalarda en iyi çözünürlüğün elde edilmesi için uzun kolonlar kullanılmalıdır. Bunun yanı sıra, yatak yüksekliği 1 m’den yüksek olan kolonlar nadiren kullanılmaktadır. Şayet, çok yüksek bir yatağın kullanılmasının gerekliliğine karar verilmişse, etkili yatak yüksekliği, geri-dönüşümle (Şekil 5.7) ya da bir seri halinde birleştirilmiş olan kolonların kullanılması ile artırılabilir.

Şekil 5.7: Geri-dönüşümle etkili kolon yatak yüksekliğinin artırılması. Hareketli faz rezervuarı ve örnek yükleme adaptörü, geri-dönüşüm esnasında kapalı olan V-3 vanasına bağlıdır. Kolon çıkışı ise kolon girişine V-4 vanası aracılığı ile bağlıdır. Aynı zamanda yükleme ve elüsyon V-4 vanası aracılığı ile yapılır. V-4 vanası, kolondan gelen elüsyon sıvısını dedektöre ve fraksiyon toplayıcıya göndermek için de kullanılır.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

105

Jel filtrasyon kromatografisinin analitik amaçlı kullanılması durumunda, genellikle 1 cm iççapa sahip olan kolonların kullanılması tatmin edici bir sonucun elde edilmesini sağlamaktadır. Genel olarak kullanılacak olan kolonun uzunluğu istenilen çözünürlüğe, kolonun çapı ise örnek materyalinin hacmine bağlı olarak seçilir (bkz. kısım 5.6.3.3). Grup ayrıştırmasının yapıldığı durumlarda ise kısa kolonlar genellikle tatmin edici bir sonuç vermektedirler. Bu durumda, 50 cm’den az olan yatak yüksekliğindeki kaba (Coars) jel materyallerinin (örneğin, Sephadex) kullanılması yeterli olmaktadır. Fine ve Superfine jel materyallerinin, kısa yatak uzunluğu oluşturacak şekilde kullanılması durumunda da benzer ayrıştırmalar için iyi bir çözünürlük sağlanabilmektedir. 5.6.3.2. Akış Oranı

Jel filtrasyon kromatografisinde uygulanan genel koşullar altında çözünürlük, akış oranının artmasına bağlı olarak düşer, yani akış oranı ile çözünürlük arasındaki ilişki ters orantılıdır. Laboratuvar-ölçekli jel filtrasyon kromatografisinde, proteinler için maksimum çözünürlüğün elde edilmesi için gerekli olan optimum akış oranı 5 mL cm–2 s–1’dir. Bunun yanı sıra, genellikle bu değerlerden 5 defa daha hızlı akış oranları altında da fena sayılmayacak değerlerde çözünürlüklerin elde edilmesi de mümkün olmaktadır. Maksimum çözünürlük, uzun bir kolonun kullanılması ve akış oranının düşük olması durumunda gerçekleşirken, kromatografinin en kısa zamanda tamamlanması ise kısa bir kolonun kullanılması ve akış oranının yüksek olması durumunda sağlanır. Bu nedenle, hem çok iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi hem de kromatografinin çok kısa bir sürede tamamlanması aynı anda mümkün olmamaktadır. Küçük partiküllü jel materyallerinin kullanılması, verimliliğin artmasına yol açarak yüksek bir çözünürlüğün elde edilmesini sağlamaktadır. Fakat, genellikle örnek materyal kapasitesinin düşmesi pahasına, daha yüksek bir akış oranının kullanılmasına izin verebilir. Şayet uzun bir kolon ile düşük akış oranında pikler iyi bir şekilde ayrılıyorsa, kromatografinin hızlı olmasından ziyade daha uzun bir sürede fakat, çok daha iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi tercih edilebilir. Akış oranı artırılarak daha kısa bir kolon kullanılabilir veya alternatif olarak, daha fazla örnek materyali yüklenebilir. Preparatif amaçlı kromatografilerde, daha yüksek bir akış oranının sağladığı avantaj (ve buna bağlı olarak daha hızlı bir ayrıştırmanın gerçekleşmesi) genellikle çözünürlüğün kaybedilmesine tercih edilebilir. Jel materyallerinin mekanik özellikleri tarafından belirlenen akış oranları ise üretici firmalar tarafından her bir jel materyali için verilmektedir. 5.6.3.3. Örnek Materyalinin Özellikleri i. Örnek materyal miktarı: Analitik amaçlı ve fraksiyonlanması zor olan örnek materyallerinin kullanıldığı durumlarda dahi maksimum çözünürlüğün elde edilmek istenmesi halinde, kolona yüklenmiş olan örnek materyalinin oluşturduğu başlangıç zonu, kolon uzunluğuna oranla oldukça dar olmalıdır. Bu nedenle, kolona yüklenecek olan örnek materyal miktarının, kolon yatak hacminin %0,5-5’i arasında olması önerilmektedir (bkz. Tablo 5.2). Daha düşük oranlardaki örnek miktarı ise normalde çözünürlüğü artırmamaktadır.

Grup ayrıştırması ve bazı fraksiyonlama deneylerinin yapıldığı çalışmalarda piklerin ayrışması çok iyi olduğunda, örnek materyal miktarını artırarak deneysel dizaynın iyileştirilmesi mümkündür. Jel filtrasyon kromatografisinin kaçınılmaz bir sonucu olan örnek materyalinin seyrelmesini minimum düzeyde tutmak için, ayrıştırma sınırları içerisinde kalmak koşulu ile maksimum hacimdeki örnek materyali kolona yüklenmelidir. Şayet, örnek materyalinin kolon boyunca aşağıya doğru hareketi esnasında zon genişlemesi meydana gelmiyorsa, kolona

106

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

yüklenecek olan örnek materyal miktarı, kolon yatağının ayrıştırma hacmi (Vsep) kadar olabilir (Şekil 5.8):

Vsep =

VRB

VRA

(5.5)

Bununla birlikte, girdap diffüzyonu, durgun faz ile hareketli faz arasında dengenin oluşmamış olması ve kolon yatağı içerisindeki düşey diffüzyon nedeni ile örnek materyal zonlarında her zaman bir genişleme olmaktadır. Bu nedenle örnek materyal miktarı, her zaman ayrıştırma hacminden daha küçük olmak zorundadır.

Şekil 5.8: Farklı hacimlerdeki örnek materyallerinin elüsyon eğrileri. (a) En küçük hacimdeki örnek materyalinin elüsyon eğrisi. (b) Zon genişlemesinin olmadığı durumda, maksimum hacimdeki örnek materyalinin tam olarak ayrıştırılmasını sağlayan elüsyon eğrisi. (c) Deneysel koşullar altında tam bir ayrıştırmanın elde edilmesi için kolona yüklenmesi gereken maksimum örnek materyal miktarına ait elüsyon eğrisi. Taralı kısımlar, zon genişlemesinin olmadığı durumlarda elde edilmesi gereken elüsyon profillerini göstermektedir (Anonymous, 1998).

Tuzların giderilmesi ve örnek materyalin tamponunun değiştirilmek istendiği durumlarda ise kolon yatak hacminin (Vt) %30 kadarı örnek yüklenebilir. Böylece, örnek materyalinin seyrelmesi minimum düzeyde tutulur ve üstelik iyi bir ayrıştırma elde edilir. Tuzlardan arındırılmış olan örnek materyalinin tamamının geri-kazanılmak istendiği durumlarda ise kolona yüklenecek olan örnek miktarının, kolon yatak hacminin %15-20’si arasında olması önerilmektedir. PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) kolonlarının kullanıldığı küçük-ölçekli rutin tuz giderme çalışmalarında ise kolona yüklenen örnek miktarı maksimum 2,5 mL ile sınırlı tutulduğunda, yüklenen örneğin tamamını 3,5 mL (seyrelme faktörü 1,4) solüsyon içerisinde geri-kazanmak mümkün olmaktadır (Şekil 5.9). Örnek materyalindeki tuzların giderilmesi amacı ile bir sistemin optimize edilmesi sırasında gerekli olan jel materyali, uzun ve ince olan bir kolondan ziyade kısa ve geniş bir kolon içerisine paketlenmelidir. Böylece, kısa kolonlardan elde edilen akış oranının daha yüksek olması nedeni ile tuzdan arındırılmış olan örnek materyalinin geri-kazanımı, daha kısa sürede gerçekleşmektedir. ii. Örnek materyalin kompozisyonu: Lineer partisyon izotermi nedeni ile jel filtrasyon kromatografisi, örnek materyal içerisinde bulunan bileşiklerin moleküler kütlelerinden büyük oranda bağımsızdır. Buna rağmen, örnek moleküllerin çözünürlüğüne ek olarak, örnek materyalinin

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

107

viskozitesi, genellikle kolona yüklenecek olan örneğin derişim limitini etkilemektedir. Örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, kolon yatağı içerisinde zonların dengesiz olarak dağılmasına ve düzensiz bir akış oranının elde edilmesine yol açar. Bu durum ise oldukça geniş ve dalgalı zonların oluşmasına yol açar. Örnek materyalinin kritik viskozite limiti ise hareketli fazın viskozitesine olan göreceli değeridir. Bu durum ise Şekil 5.10’da farklı viskozitelerdeki hemoglobin ve NaCl örneklerinin elüsyon profilleri ile açıklanmaktadır.

Şekil 5.9: Albümin solüsyonundan tuz giderimi. PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) kolonu distile su ile dengelenmiştir. Örnek materyali 2,5 mL NaCl (0,5 M) solüsyonu içerisinde insan serum albümininin (25 mg) çözündürülmesi ile oluşturulmuştur. Kolona yüklenmiş olan albüminin %95,3’ü 3,5 mL’lik elüsyon sıvısı içerisinde geri-kazanılmıştır. Elüsyon sıvısının (3,5 mL) tuz içeriği ise orijinal örnek materyalindekinin %2’sidir (Anonymous, 1998).

Şekil 5.10: Farklı viskozitelerdeki hemoglobin ve NaCl örneklerinin ayrıştırılmasının gerçekleştirildiği elüsyon profilleri. (a) Viskozitesi en düşük olan, (b) orta olan ve (c) en yüksek olan örnek materyallerinin ayrışma profilleridir. Deneysel koşullar, örnek materyallerinin viskozitelerini artırmak amacı ile dekstran eklenmesinin dışında, birbirinin aynıdır. (Akış oranını düşürmek ise ayrıştırma kalitesini artırmayacaktır), (Anonymous, 1998).

108

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Pratikte ise örnek materyalin göreceli viskozitesi, hareketli fazın viskozite değerinin yaklaşık 2 katından fazla olmamalıdır. Bu değer ise sulu bir tamponun hareketli faz olarak kullanıldığı durumda 70 mg mL–1’lik protein çözeltisinin viskozitesine denk gelmektedir. Örnek materyalin ve hareketli fazın yaklaşık göreceli viskozite değerleri ise hem örnek materyalinin hem de hareketli fazın aynı hacimlerinin bir pipetten boşalma zamanları karşılaştırılarak hesaplanabilir. 5.6.3.4. Hareketli Faz

Jel filtrasyon kromatografisi ile elde edilen çözünürlük üzerine, hareketli faz kompozisyonunun doğrudan bir etkisi bulunmamaktadır. Tamamı ile yüksüz olan bileşiklerin elüsyonu ise hareketli faz olarak distile suyun kullanılması ile sağlanabilir. Yüklü moleküllerin elüsyonunda ise örnek moleküllerinin jel materyali ile olabilecek muhtemel etkileşimlerini önlemek ve pH’yı kontrol altında tutmak için genellikle 20 mM’dan düşük olmayan Tris-HCl ve sodyum fosfat gibi tamponlar kullanılmaktadır (Sephadex ve Sepharose için en az 20 mM; Sephacryl HR için 150 mM). Bu amaçla NaCl kullanılabilir. Bunun yanı sıra, bazı proteinlerin düşük iyonik kuvvetteki solüsyonlarda çökeldiklerini de unutmamak gerekmektedir. Şayet, jel filtrasyon kromatografisi sonucunda elde edilen ürün liyofilize edilecekse amonyum asetat, amonyum karbonat veya etilendiamin asetat gibi uçucu tamponlar hareketli faz olarak kullanılabilir. Tuzların giderilmesi amacı ile gerçekleştirilen jel filtrasyon kromatografisinde ise ayrıştırma hacmi o kadar büyüktür ki, genel olarak, yüklü moleküller dahi hareketli faz olarak su ile muamele edilebilir. Örnek materyal içerisinde bulunan tuzların tamamı ile uzaklaştırılması ise mümkün değildir. Jel filtrasyon kromatografisinde hareketli faz seçerken göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktör ise seçilen hareketli fazın örnek molekülleri üzerine ne gibi etkilerinin olabileceğidir. Seçilen hareketli fazın pH’sı ve iyonik kuvveti, guanidin hidroklorür ve üre gibi disosiasyon maddelerinin bulunması veya deterjanların varlığı, örnek moleküllerinin konfigürasyonlarının değişmesine, proteinlerin alt-birimlerine ayrılmasına, enzim ve kofaktörlerin ayrılmasına, hormonların ve taşıyıcı proteinlerin ayrılmasına yol açabilir. Bu nedenle hareketli faz seçiminde, bu gibi olası etkilerin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. 5.6.3.5. Optimizasyon

Jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırma esnasında karşılaşılan problemlerin her birisi birbirinden farklı olduğu için, ayrıştırma işleminin optimize edilmesi ancak çok dikkatli bir deney ile sağlanabilir. Ayrıştırma esnasında göz önünde bulundurulması gereken bazı faktörler ise burada, model olarak alınan A, B ve C proteinlerinin davranışları ile hipotetik olarak açıklanmaya çalışılacaktır. A ve B proteinlerinin ayrıştırılması, hareketli faz akış oranının en düşük olduğu durumda gerçekleşmektedir. Buna rağmen, bu ayrıştırma işlemi önemli bir ölçüde çözünürlük kaybına yol açmadan daha hızlı gerçekleştirilemez. C proteini ise B’den çok iyi bir şekilde ayrılmaktadır (Şekil 5.11,a). Optimizasyonun birinci adımında, akış oranı yükseltilerek C proteininin B’den ayrılması için gereken süre yaklaşık 30 saatten 2,5 saate indirgenir (Şekil 5.11,b). Çözünürlük (RS) ise hâlâ 2,25’dir. RS = 1 için gerekli olan kolon yatak yüksekliği (L2) ise eşitlik 5.6’dan hesaplanabilir:

L2 =

L1 RS1

(5.6)

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

109

Burada L1 ve L2 sırasıyla birinci ve ikinci kolonların yatak uzunlukları; RS1 ise birinci kolondan (L1) elde edilen çözünürlüktür. Bu örnekte L1 = L2 = 85 cm’dir. Kolon yatak uzunluğunun 85 cm’den 19,5 cm’ye indirilmesi durumunda ise hâlâ C proteini B’den yeterli bir çözünürlükte ayrılabilmektedir (Şekil 5.11,c). Bu durumda C ve B proteinlerinin ayrıştırılması, akış oranının 24,5 mL cm–2 s–1 olduğu 19,5 cm kolon yatak uzunluğundaki bir kolonla elde edilebilmektedir. Bunun yanı sıra C ve B proteinlerinin ayrıştırılması için gereken süre yaklaşık 30 saatten 35 dk’ya inmiştir.

Şekil 5.11: A, B ve C model proteinlerinin ayrıştırılması için jel filtrasyon kromatografisinin optimizasyonu (Anonymous, 1998).

5.7. Jel Filtrasyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi

Jel filtrasyon kromatografisinin uygulanması, iyi paketlenmiş bir kolon elde edildikten sonra oldukça kolaydır. Şayet iyi paketlenmiş bir kolonun kullanılması ve korunması için gerekli hassasiyet gösterilirse, bu kolondan aylar boyunca güvenilir sonuçların alınması mümkündür. 5.7.1. Jelin Hazırlanması i. Şişirilmiş formdaki jellerin kullanıma hazırlanması: Sephacryl HR, Superdex, Superose ve Sepharose gibi jel materyalleri, koruyucu olarak %20 etanol içeren solüsyonlar halinde önceden şişirilmiş olarak kullanıma hazır şekilde satılmaktadırlar. Önceden şişirilmiş formdaki jel materyalleri, temin edildikleri hali ile kolona boşaltılamayacak kadar yoğun olduklarından, istenilen

Doç. Dr. Münir TUNCER

110

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

yoğunluktaki jel süspansiyonlarının elde edilmesi için uygun hareketli faz ile seyreltilmelerinin yapılması gerekebilir (bkz. kısım 3.5). ii. Kuru formdaki jellerin kullanıma hazırlanması: Sephadex G serisi gibi bazı jel materyalleri ise kuru formda temin edilebilirler. Bu tip jel materyalleri paketlemeden önce mutlaka şişirilmelidir. Kuru formdaki jel materyallerinin tamamen şişirilmesi, oda sıcaklığında 3-72 saatte tamamlanmasına rağmen, kaynamakta olan bir su banyosunda ise 1-5 saat sürmektedir. Kuru formdaki jel materyallerinin kaynamakta olan su banyosu içerisinde şişirilmesi, aynı zamanda jelin havasının alınmasını da sağlamaktadır. Kuru formdaki jel materyallerinin şişirilmesi esnasında matriksin yapısına zarar vermesi nedeni ile aşırı karıştırmadan (örneğin, manyetik karıştırmadan) sakınılmalıdır. Kuru formdaki jel materyallerinin şişirilmesi, gereken miktardaki materyalin tartılarak hareketli faz ile karıştırılması ile yapılır. Şişirme periyodu boyunca sıvı kısım dökülerek taze başlangıç tamponu ile birkaç defa yıkama yapılmalıdır. iii. Jel materyallerinin organik çözücüler ile kullanıma hazırlanması: Sephacryl HR, Superdex, Superose ve Sepharose CL gibi bazı jel solüsyonlarındaki su ise değişik organik çözücüler ile değiştirilmek istenebilir. Sepharose jellerin kararlılığı ise sadece H bağları aracılığı ile sağlandığından, bu materyalin birçok çözücü ile kullanılması uygun değildir. Buna rağmen Sepharose CL, birçok organik çözücü ile birlikte güvenli bir şekilde kullanılabilmektedir. Ayrıca Sephacryl HR’nin jel hacmi, organik çözücü içerisine transfer edildiğinde %15 kadar küçülebilir.

Jel solüsyonu içerisindeki suyun istenilen organik çözücü ile yer değiştirdiğinden emin olmak için transfer işlemi, bir seri halinde hazırlanmış organik çözücü içerisine dereceli olarak yapılmalıdır. Örneğin, jel materyalini doğrudan doğruya saf bir çözücüden (A) başka bir saf çözücüye (B) transfer etmek yerine, jel materyali önce %70A/%30B içerisine, sonra %30A/%70B içerisine ve en sonunda da saf B içerisine transfer edilmelidir. Şayet A ve B birbirine karışmıyorsa, bu durumda transfer işlemi bir ara çözücü aracılığı ile yapılmalıdır (Şekil 5.12): 1. İstenilen miktardaki jel, Buchner hunisine aktarılır ve sulu kısmın fazlası hafif vakum uygulanarak uzaklaştırılır. 2. Bir sonraki çözücünün birinci serisi (bkz. Şekil 5.12), jel üzerine eklenerek hafifçe karıştırılarak jelin süspanse olması sağlanır. 3. Çözücünün fazlası hafif vakum uygulanarak uzaklaştırılır ve aynı çözücü içerisinde jel yeniden süspanse edilir. 4. Bu işlemler serinin bir sonraki çözücüsü ile tekrarlanır. 5.

İki defa daha jelin süspanse edilmesini takiben istenilen çözücü kompozisyonuna kadar işlemler tekrarlanır.

Su

Etanol Dimetilformamid Dioxane Dimetil sülfoksid Aseton

Kloroform, Dikloroetan, Diklorometan, Tetrahidrofuran, n-Heptan, Etil asetat, Toluen Şekil 5.12: Organik çözücülerin değiştirilmesinde takip edilmesi önerilen yol.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

111

Jel materyalinin istenilen organik çözücü içerisine transferinden sonra, paketleme işlemi normal yoldan yapılabilir (bkz. kısım 5.7.2). Akış oranı ise kullanılan hareketli fazın viskozitesine bağlı olacaktır. Bunun yanı sıra, dimetil sülfoksid (DMSO) gibi bazı çözücüler, Sepharose CL’nin H bağlarının kırılmasına yol açarak jelin yapısı yumuşatmakta ve bunun sonucu olarak da akış oranının çok fazla düşmesine neden olmaktadır. 5.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Dengelenmesi

Jel filtrasyon kromatografisinde en önemli adımlardan birisi, kolonun paketlenme aşamasıdır. Çünkü, kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak incelenmiştir. 5.7.3. Örneğin Kolona Yüklenmesi

Jel filtrasyon kromatografisinde iyi bir çözünürlüğün elde edilmesinde kolonun paketlenme kalitesi kadar etkili olan diğer bir faktör ise örnek materyalinin kolona yüklenmesidir. LPLC veya HPLC sistemlerinde jel filtrasyon kromatografisinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar ve dikkat edilmesi gereken özellikler ise sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak incelenmiştir. 5.7.4. Elüsyon

Jel filtrasyon kromatografisinde örnek moleküllerin kolondan elüsyonu izokratik elüsyon yöntemi ile yapılmaktadır (bkz. kısım 3.9). Hareketli fazın kolon boyunca akışı, hidrostatik basınç farkı veya peristaltik bir pompa yardımıyla kontrol edilebilir. Çalışmaların tekrarlanması veya rutin olarak yapılan preparatif çalışmalarda, hareketli fazın akış oranının tekrarlanabilir ve doğru olarak kontrol edilmesi oldukça önemlidir. Akış oranının her defasında aynı kalmasını sağlamanın en kolay ve pratik yolu ise bir peristaltik pompa kullanmaktır. Peristaltik pompanın bulunmadığı koşullarda ise yer çekimi etkisinden yararlanılarak, Mariotte erleni aracılığı ile düzenli bir akış oranının elde edilmesi de mümkündür (bkz. kısım 3.9). 5.7.5. Kolonun Temizlenmesi i. Genel temizleme: Jel materyalleri ile paketlenmiş olan kolonlar belirli bir süre kullanıldıktan sonra, kolon yatağı içerisinde çökelen proteinlerin ve diğer kirleticilerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Kolonun temizlenmeye ihtiyaç duymasının belirtileri ise kolon yatak yüzeyinde renkli bir tabakanın oluşması, kolonun çözünürlük özelliklerinin kaybolması veya geribasıncın artmasıdır. Geri-basıncın artması ise hareketli fazın kolon yatağı boyunca akış oranını etkileyecektir. Bir kolonun kirlendikten sonra temizlenmesinden daha iyi bir çözüm ise kolonun kirlenmemesi için gereken önlemlerin önceden alınmasıdır.

HPLC sistemlerinde kullanılan hareketli fazların ve örnek materyallerinin fitle edildikten sonra kullanılmak zorunda olması, bu sistemle kullanılan kolonların kirlenmesi sonucunda ortaya çıkan problemleri de azaltmaktadır. Tamponların çoğu mikrobiyal büyüme için iyi birer ortam olduklarından, kromatografi sistemlerinde kullanılan tamponlar taze olmalıdır. Kolonun temizlenmesi için kullanılan solüsyonlar da kullanılmadan önce filtreden geçirilmelidir. Temizleme işleminden sonra kolon tekrar kullanılmadan önce kolon hacminin 2-3 misli hareketli faz ile yeniden dengelenmelidir. Jel materyallerinin temizlenmesinde kullanılan bileşikler ise jelin tipine göre değişmektedir. Örneğin, jellerin temizlenmesinde en yaygın olarak kullanılan solüsyonlar iyonik-olmayan deterjan

112

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

solüsyonları (%1) ve NaOH solüsyonlarıdır. Jel materyalleri ile paketli olan kolonlar, kolon hacminin 1-2 misli hacimdeki bu solüsyonlar ile yıkanabilir. Bunun yanı sıra NaOH’ın derişimi Sephadex G serisi jeller için 200 mM; Sepharose CL için 500 mM; Sephacryl HR için 200-500 mM olarak kullanılabilir. ii. Özgül kirleticilerin temizlenmesi: Genel temizleme metotları ile arzu edilen sonuç alınamadığı takdirde, özgül kirleticilerin uzaklaştırılması için farklı solüsyonların kullanılması gerekebilir. Kirletici cinsine bağlı olarak farklı temizleme metotlarının uygulanması gerektiğinde, elimizde bulunan solüsyonlar arasından en güvenilir olanı seçmekle işe başlayabiliriz. Şayet seçilmiş olan solüsyonla sonuç alamazsak, bir diğer alternatifi denemeliyiz. Bazı temizleme solüsyonlarının viskozitesi ise normal tampon solüsyonlarının viskozitesinden çok daha yüksek olduğundan, temizleme esnasında maksimum uygulanabilir basıncın aşılmaması için özen gösterilmelidir. Farklı cinsteki kirleticilerin temizlenmesi için uygulanacak prosedürler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: 1. Hidrofilik proteinlerin ve peptidlerin temizlenmesi • Kolon, örnek materyalinin hazırlanması sırasında kullanılan solüsyon (örneğin, ekstraksiyon solüsyonu, deterjan v.b) ile bir gece boyunca düşük akış oranında yıkanır. • Kolon, %30-50’lik asetik asit solüsyonu ile bir gece boyunca, 1 mL dk–1’lık aşık oranında yıkanır. • Kolon, 100 mM asetik asit ve 500 mM NaCl içerisinde 1 mg mL–1 pepsin içeren solüsyon ile doldurularak, oda sıcaklığında bir gece veya 37 °C’da 1 saat bekletilir. Muamele sonucunda kolonda enzim kalmaması için dikkatlice yıkanmalıdır. 2. Hidrofobik proteinlerin ve peptidlerin temizlenmesi: Bu tip moleküller genellikle etanol (%24), asetonitril (%30) gibi organik çözücüler içerisinde çözünürler. Kirleticilerin en iyi şekilde çözünmesini sağlayan organik çözücü biliniyorsa, bu çözücü ile düşük akış oranında, kolon gece boyunca yıkanmalıdır. 3. Nükleik asitlerin temizlenmesi: DNA ve RNA molekülleri, düşük iyonik kuvvetteki solüsyonlarda çok iyi çözünürler. Bu nedenle, kolonun temizlenmesinde düşük iyonik kuvvetteki tamponlar (örneğin, 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8) 24 saat süreyle düşük akış oranında kullanılabilir. • RNA: RNA molekülleri, NaOH (100 mM - 2 M, 1 saat) ile hidrolize edilerek, kolon daha sonra su ile yıkanır veya ribonükleaz I solüsyonu (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 içerisinde 1 mg mL–1 ribonükleaz içeren solüsyondan 2 mL) ile 37 °C’da 2 saat muamele edildikten sonra 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8) ile yıkanır. • DNA: DNA molekülleri, deoksiribonükleaz I solüsyonu (100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 içerisinde 1 mg mL–1 deoksiribonükleaz içeren solüsyondan 2 mL) ile 37 °C’da 2 saat muamele edildikten sonra, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8) ile yıkanır. Enzimatik hidrolizin kullanılması durumunda, yıkama sonrasında kolon içerisinde enzim kalıntısının bulunmadığından emin olunmalıdır. 4. Lipidlerin temizlenmesi: Kolonlardan lipidlerin uzaklaştırılması için kolon, %0,2-1’lik NP-40 veya Lubrol gibi iyonik-olmayan deterjanları içeren asidik veya bazik solüsyonlar ile gece boyunca 0,1 mL dk–1 akış oranında yıkanır. Daha sonra kolondan deterjanların uzaklaştırılması için etanol veya metanol ile yıkama yapılır.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

113

5.7.6. Kolonun ve Jellerin Korunması i. Mikrobiyal büyümenin önlenmesi: Paketlenmiş olan kolonların kullanılması esnasında, kolon materyali içerisinde mikrobiyal büyümenin olması nadiren meydana gelmektedir. Yine de paketlenmiş kolonların mikroorganizmalarla kontamine olmasını önlemek amacı ile bazı tedbirlerin alınması gerekmektedir. Çünkü, kolon materyali içerisinde meydana gelen mikrobiyal büyüme, kolona yüklenmiş olan örnek materyali için tehlikeli olabileceği gibi, paketlenmiş olan kolon materyalinin kromatografik özelliklerini de olumsuz olarak etkileyerek, hareketli faz akışının düzensiz olmasına yol açabilir. Jel materyallerin depolanması esnasında mutlaka bir anti-mikrobiyal ajan eklenmelidir. Eklenmiş olan anti-mikrobiyal ajanın elüsyonu ise, örnek materyalinin kolona yüklenmeden önce, kolon materyalinin dengelenmesi için yapılan yıkama sırasında gerçekleştirilebilir. En çok kullanılan anti-mikrobiyal ajanlar ise şunlardır: • Chlorhexidine: Chlorhexidine (örneğin, Hibitane) %0,002, oldukça etkili bir anti-mikrobiyal ajandır. Çok az madde ile uyumsuzluk göstermektedir fakat, Sepharose ile kullanılması önerilmemektedir. Klor veya sülfat iyon derişimlerinin çok fazla olduğu durumlarda ise depolama sırasında çökelme meydana gelebileceği için Hibitane kullanılmamalıdır. • Kloroform, bütanol ve tolüen: Bu organik çözücüler jel partiküllerinin büzüşmesine neden olduğu için Sephadex G-100, G-150 ve G-200 ile kullanılması önerilmemektedir. Bunun yanı sıra, bu organik çözücüler ancak çok derişik olduklarında etkili olabilmektedirler. Aynı zamanda bu çözücüler, kromatografi ekipmanlarının plastik parçaları içerisine nüfuz ederek bu parçaların yumuşamasına yol açmakta ve solüsyonları anti-mikrobiyal korumasız bırakmaktadırlar. Okside edici maddeler ise anti-mikrobiyal ajan olarak kullanılmamalıdır. • Etanol (%20): Bazı jel materyalleri %20’lik etanol süspansiyonu içerisinde temin edilmektedirler. Bu nedenle, kullanılmış jellerin depolanması sırasında bu solüsyonlar bakteriyostatik ajan olarak da kullanılabilmektedirler. • Fenil cıva tuzları: Asetat, borat ve nitrat gibi fenil cıva tuzları (%0,001-0,01) ise sadece zayıf bazik solüsyonlarda etkilidirler. • Sodyum azid: Sodyum azid (NaN3) anti-mikrobiyal ajan olarak %0,02-0,05 oranında oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Sodyum azid, protein ve karbonhidratlarla önemli sayılacak bir etkileşim oluşturmadığı gibi, bu moleküllerin kromatografik davranışlarını da değiştirmemektedir. Bunun yanı sıra sodyum azid, proteinlerin flouresans işaretlemesini etkilemekte, anthron reaksiyonu vermekte ve bazı enzimleri inhibe etmektedir. • Sodyum hidroksit: Sodyum hidroksit (10 mM) etkili bir bakteriyostatik ajandır. Daha yüksek derişimlerde ise (100-500 mM) Pseudomonas gibi dirençli bakterilere karşı dahi iyi bir dezenfektandır. Sodyum hidroksit ile muamele, endotoksinlerin inaktivasyonuna neden olmakta ve birçok durumda kolon içerisinde çökelmiş maddelerin çözünmesine yol açmaktadır. Sodyum hidroksitin düşük toksisitesi ise örnek materyal ile kontaminasyon riskini azaltması nedeni ile bir avantaj oluşturmaktadır. Bunun yanı sıra, Sopharose ve Sephacryl HR’nin depolanması için kullanılması önerilmemektedir. • Thimerosal: Thimerosal (etilmerküritiyosalisilat, örneğin Merthiolat) %0,005, ise zayıf asidik solüsyonlarda çok daha etkilidir. Sephacryl HR ile kullanılması önerilmemektedir. • Triklorobütanol: Triklorobütanol (örneğin, Chloretone) %0,05, sadece zayıf asidik solüsyonlarda etkilidir. ii. Kullanılmamış jellerin depolanması: Kullanılmamış olan jel materyalleri +4 °C ile +25 °C arasında depolanmalıdır. Şişirilmiş olan jeller ise buz kristallerinin jelin yapısını bozmasına yol açacağı için asla dondurulmamalıdır.

114

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

iii. Kullanılmış jellerin depolanması: Kullanılmış olan jel materyalleri ise sodyum azid (%0,05) veya etanol (%20) gibi uygun bir anti-mikrobiyal ajanın varlığında, pH 6-8, +4 °C ile +8 °C arasında depolanmalıdır. İster kullanılmış olsun ister henüz kullanılmamış olsun, şişirilmiş olan jel materyallerinin donmasına izin verilmeleridir. Çünkü donma esnasında meydana gelen buz kristalleri, kolon materyallerinin yapılarının bozulmasına yol açabilmektedir. iv. Paketlenmiş kolonların depolanması: Paketlenmiş olan kolonlar ise uygun bir antimikrobiyal ajanın varlığında, +4 °C ile +8 °C arasında depolanmalıdır. Superdex, Superose, Sephacryl ve Sepharose materyalleri ile paketlenmiş kolonların depolanmasında, sodyum azid (%0,05) veya etanol (%20) kullanılabilir fakat, Sephadex G serisi ile paketlenen kolonlar için sadece sodyum azid (%0,05) önerilmektedir.

Kısa dönem saklama için ise (örneğin bir günlüğüne) kolon sisteme bağlı bırakılarak, bakteriyel büyümenin önlenmesi için düşük akış oranında yıkamaya devam edilmelidir. Şayet, paketlenmiş olan kolonun uzun süre saklanması isteniyorsa, kolon yatağı depolama solüsyonu ile yeniden dengelenmeden önce temizlenmelidir. Şayet depolama solüsyonu olarak %20’lik etanol kullanılacaksa, etanol/su karışımının iyice karıştırılması ile solüsyonun gazı alınmalı ve kolonun depolanmadan önce dengelenmesine düşük akış oranı ile başlanmalıdır. Aynı zamanda etanol/su karışımının viskozitesi, normal hareketli fazın viskozitesinden daha yüksek olduğu için dengeleme sırasında geri-basınç da kontrol edilmelidir. Kolonun depo solüsyonu ile dengelenmesinden sonra, kolon sistemden ayrılarak kolonun çıkış vanası kapatılır, kolonun giriş hortumu ise %20 etanol içeren ve parafilmle kapatılmış olan bir tüp içerisine daldırılır. Böylece kolonun kuruması da önlenmiş olur. 5.8. GFC Uygulama Örnekleri i. Saflaştırma (pürüfikasyon): Jel filtrasyon kromatografisinin temel uygulaması, biyolojik makromoleküllerin moleküler büyüklüklerindeki farklılıklara bağlı olarak, ayrıştırılmasını ve fraksiyonlanmasını sağlamasıdır. Virüsler, proteinler, enzimler, hormonlar, antikorlar, nükleik asitler ve polisakkaritlerin hepsi de uygun jellerin veya cam-granüllerin kullanılması ve iyi bir sonucun elde edilmesi için kromatografik koşulların optimize edilmesi sonucunda ayrılmış ve saflaştırılmışlardır. Şekil 5.13’de gösterilmekte olan peptidlerin ayrıştırılması, bu tip çalışmalardan sadece birisini göstermektedir. Jel filtrasyon kromatografisinin gerçekleştirilmesinin kolay olması, geri-kazanımın oldukça yüksek olması, elüsyon koşullarındaki seçeneklerin oldukça geniş olması ve kromatografi sonucunda elde edilen verilerin yorumlanmasının oldukça basit olması gibi nedenlerle bu kromatografi tekniği, her türlü saflaştırma çalışmalarında kullanılabilmektedir. ii. Göreceli moleküler kütlenin belirlenmesi: Jel filtrasyon kromatografisi ile doğal veya denatüre globüler proteinlerin moleküler kütlelerinin veya büyüklüklerinin belirlenmesi, elektroforetik tekniklerin aksine oldukça geniş deneysel koşullar altında (pH, iyonik kuvvet, sıcaklık, moleküllerin doğal yükleri v.b) gerçekleştirilebilmektedir. Globüler proteinlerin elüsyon hacimleri, büyük oranda bu moleküllerin göreceli moleküler kütleleri (Mr) tarafından belirlenir. Oldukça fazla sayıdaki örneğin kullanılarak yapıldığı çalışmalar sonucunda, bu moleküllerin elüsyon hacimlerinin, yaklaşık olarak Mr’nin logaritmasının lineer fonksiyonu olduğu gösterilmiştir. Jel filtrasyon kromatografisi, proteinlerin ve polipeptidlerin doğal konfigürasyonlarını bozarak bu moleküllerin tesadüfi-kıvrımlar oluşturmasına ve böylece, moleküllerin yapısal farklılıklarını minimuma indirgeyen üre veya guanidin hidroklorür gibi ajanların varlığında gerçekleştirilmesi ise özellikle moleküler kütlelerin belirlenmesinde oldukça kullanışlıdır. Bundan dolayı, benzer şekillere sahip ve Mr’leri bilinen proteinlerin kullanılarak elde edildiği kalibrasyon eğrilerinin oluşturulması, ham preparatlarda dahi diğer proteinlerin Mr değerlerinin tahmin edilebilmesini olanaklı kılmaktadır (Şekil 5.14).

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

115

Şekil 5.13: IgG3’ün Fd’ fragmentinin sitrokinillenerek tamamı ile indirgenmiş ve 14C’la alkillenmiş triptik parçalanmasının Sephadex G-50 Fine ile paketlenmiş kolon ile jel filtrasyonu (Michaelsen ve ark., 1977).

Şekil 5.14: Denatürasyon koşulları altında proteinlerin Sepharose CL-6B ile doldurulmuş kolondaki elüsyon profilleri. Pikler: 1, Blue Dextran; 2, BSA; 3, Tavşan IgG H zinciri; 4, α-Kimotripsinojen; 5, Sitokrom c; 6, İnsülin; 7, İnsülünün B zinciri; 8, DNP-ala (Ansari ve Mage, 1977).

Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan kolonların kalibrasyonları yapıldıktan sonra, uzun bir süre hem moleküler kütlelerin belirlenmesinde hem de ayrıştırma çalışmalarında kullanılabilir. Bu nedenle, her çalışma için kolonun yeniden doldurulması ve kalibrasyonu için gerekli olan çalışmaların tekrar tekrar yapılmasını da önlemektedir. Örneğin, Şekil 5.14’de verilen kromatogram, Ansari ve Mage (1977) tarafından aynı kolonun elüsyon profilinde hiçbir değişiklik olmadan, 6 M guanidin hidroklorür varlığında moleküler kütle tayini için 10 ay süre ile kullanılması ile elde edilmiştir. Moleküler kütlelerin belirlenmesi için gerekli olan şeyler ise uygun bir jel materyali ile iyi paketlenmiş bir kolon ve bu kolonun kalibrasyonu için gerekli olan protein standartlarıdır. Protein standartları ise HMW ve LMW olmak üzere (13,7-669 kDa) ticari olarak temin edilebilmektedir. iii. Solüsyon derişimi: Yüksek Mr’li maddelerin solüsyonlarına kuru formdaki Sephadex G25 eklenmesi ile yoğunlaştırılabilir. Su ve düşük Mr’li maddeler, şişen jel tarafından absorblanırken yüksek Mr’li maddeler, solüsyonun içerisinde kalırlar. Sephadex’in solüsyona eklenmesinden 10

116

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

dakika sonra jel, santrifüjlenerek uzaklaştırılırken, derişimi artırılmış fakat pH’sı ve iyonik kuvveti değiştirilmemiş olan solüsyon içerisinde yüksek Mr’li bileşikler kalır. iv. Tuzların uzaklaştırılması: Proteinlerin ve diğer biyolojik makromoleküllerin büyüklükleri, tuzlarınkinden ve diğer küçük maddelerinkinden oldukça büyük olduğu için, örnek materyallerinin içerisindeki tuzların uzaklaştırılmasında jel filtrasyon kromatografisi oldukça başarılı olarak kullanılmaktadır. Örneğin amonyum sülfatın, protein preparasyonlarından ve iyon değiş-tokuş kromatografi kolonlarından elüe edilen fraksiyonlardan tuzun uzaklaştırılmasında Sephadex G-25 ile paketlenmiş bir kolon kullanılarak, yüksek Mr’li bileşikler tuzlardan arındırılabilir. Çünkü yüksek Mr’li maddeler, boşluk hacimle birlikte hareket ederken, düşük Mr’li bileşikler, hareketli ve durgun fazlar arasında dağılır, dolayısıyla kolon içerisinde daha yavaş hareket ederler. Bu yöntemle tuzların uzaklaştırılması metodu, diyaliz yönteminden daha hızlı ve etkilidir.

Jel filtrasyon materyalleri ile tuzların veya küçük uzaklaştırılmasını kapsayan çalışmalar şu şekilde sıralanabilir:

moleküllerin

solüsyonlardan

• Tampon değişimi: Enzimatik reaksiyon, assey ve diğer analitik prosedürler, örnek materyalinin pH’sının, iyonik kompozisyonunun ve kuvvetinin kesin olarak ayarlanmasını gerektirebilir. Bunun yanı sıra, örnek materyalinin iyon değiş-tokuş kromatografisine, hidrofobik interaksiyon kromatografisine, affinite kromatografisine veya diğer sıvı kromatografi tekniklerine uygulanmadan önce gerekli olan pH, iyonik kompozisyon ve kuvveti de jel filtrasyon kromatografisi ile ayarlanmış olur. • Fenolün uzaklaştırılması: Nükleik asit preparasyonlarından fenolün uzaklaştırılmasında jel filtrasyon kromatografisi kullanılır. • Nükleotidlerin ayrılması: DNA dizileme çalışmaları sırasında serbest nükleotidlerin intakt DNA’dan ayrıştırılmasında jel filtrasyon kromatografisi kullanılır. • İşaretli bileşiklerin uzaklaştırılması: Proteinlerin işaretlenmesinde kullanılan 125I ve fenilizotiyosiyanat (FITC) gibi bileşiklerin serbest olanlarının solüsyonlardan uzaklaştırılması için jel filtrasyon kromatografisi kullanılır. • Reaksiyonların durdurulması: Makromoleküller ile küçük moleküler kütleye sahip olan reaktantlar arasındaki reaksiyonlar, jel filtrasyon kromatografisi ile bu bileşiklerin ayrılması sağlanarak durdurulabilir. • Ürünlerin uzaklaştırılması: Bir enzimatik reaksiyon sonucunda meydan gelen ürünler ya da kofaktörler ve inhibitörler, jel filtrasyon kromatografisi ile ayrılabilir. • Fenol red uzaklaştırılması: İyon değiş-tokuş kromatografisinden önce, kültür filtratlarında bulunan fenol redin uzaklaştırılması amacı ile jel filtrasyon kromatografisi kullanılabilir. v. Protein bağlama çalışmaları: Jel filtrasyon kromatografisi, bir ligandı protein gibi bir makromoleküle geri-dönüşümlü olarak bağlama çalışmalarında yaygın olarak kullanılan yöntemlerden birisidir. Bu yöntem, reseptör proteinler üzerine yapılan çalışmaları da içerir. Bir protein/ligand karışımı, önceden karışım içindeki ligand derişimi ile aynı derişime sahip bir solüsyonla dengelenmiş jel içeren bir kolona uygulanır. Örnek, bir tamponla standart olarak elüe edilir ve kolondan gelen elüsyon sıvısında ligand ve proteinin derişimleri belirlenir. İlk fraksiyonlar bağlanmamış ligand içereceklerdir, ama ardışık olarak proteinin ortaya çıkışı toplam ligand miktarında artışla sonuçlanır. Eğer deney bir seri ligand derişimleri ile tekrarlanırsa uygun bağlanma sabitleri hesaplanabilir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ (IEC)

6.1. Giriş

Adsorbsiyon kromatografisi, kromatografi matriksi üzerine tutuklanmış ligandlar ile sıvılar içerisinde çözünmüş olan farklı moleküller arasındaki etkileşime dayalı bir kromatografi yöntemidir. Makromoleküllerin başarılı bir şekilde ayrıştırılmasında kullanılan ilk kromatografi tipi ise iyon yüklü moleküller ile kromatografi matriksi üzerine kovalent olarak bağlanmış olan zıt yüklü moleküller arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Bu nedenle, iyon değiş-tokuş kromatografisinin (Ion Exchange Chromatography, IEC) temeli, zıt yüklü partiküller arasındaki çekime dayanmaktadır. Birçok biyolojik materyalin, örneğin amino asitlerin, polipeptidlerin, proteinlerin, nükleik asitlerin ve polinükleotidlerin iyonize olabilen grupları vardır. Bu moleküllerin net yüklerinin ne yönde olacağı ise Handerson-Hasselbach eşitliği doğrultusunda, bu moleküllerin pKa değerleri ile içinde bulundukları tamponun pH’larına bağlıdır. Bu nedenle, bu tip moleküllerin ayrıştırılmasında ve saflaştırılmasında muhtemelen en sık kullanılan kromatografi tekniği, iyon değiş-tokuş kromatografisidir. İyon değiş-tokuş kromatografisinin başarılı bir şekilde uygulanmasının en temel nedenleri arasında, oldukça geniş bir uygulama alanına sahip olması, yüksek çözünürlük sağlaması, kapasite yüksekliği ve uygulama basitliğinin yanı sıra, metodun kontrol edilebilir olması sayılabilir. Bu bölümde ise iyon değiş-tokuş kromatografisinin temel prensipleri üzerinde durulmakta olup, ticari olarak bulunan bazı kolon materyallerinin özellikleri incelenmektedir. Bunun yanı sıra, farklı biyolojik materyallerin iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılmasına ilişkin bazı örnekler yer almakla birlikte, özgül saflaştırma işlemleri için literatürlere baş vurulması önerilmektedir. 6.2. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Teorisi

İyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırmanın temeli, çözelti içerisinde bulunan yüklü moleküller ile kolon matriksine kovalent olarak bağlı bulunan zıt yüklü moleküller arasında, geridönüşümlü bir adsorbsiyonun oluşmasına dayanır. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırma işlemleri genelde, iyon-değiştirici kolon materyalleri ile paketlenmiş kolonlarda yürütülür. İyon değiş-tokuş kromatografi uygulamaları, birbirinden ayrı beş adımdan oluşmaktadır (Şekil 6.1): i. Kolon materyalinin dengelenmesi: Bu adımda iyon-değiştiricinin (kolon materyalinin), ayrıştırılmak istenilen molekülleri bağlamasını sağlamak için, ortamın pH ve iyonik kuvveti dengelenerek, başlangıç koşullarına getirilmesi sağlanır. Bu dengeleme sonucunda, kolon materyali üzerinde kovalent olarak bağlı bulunan iyon değiştirici gruplar, değiştirilebilen-iyonlar (genellikle klor veya sodyum gibi basit anyonlar veya katyonlar) ile ilişki halindedirler.

118

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ii. Örneğin yüklenmesi ve adsorbsiyonu: Bu adımda, dengelenmiş olan kolon materyali üzerine örnek yüklenir ve yüklenen örnek, hareketli faz ile iyon-değiştiricinin matriks yapısı boyunca değişim bölgesine diffüze olur. Bu aşamada örnek içerisindeki uygun yüklü moleküller, değiştirilebilen-iyonlarla yer değiştirerek, kolon matriksine geri-dönüşümlü olarak bağlanırlar. Kolon matriksine bağlanmayan moleküller ise kolonun dengelenmesinde ve örneğin yüklenmesinde kullanılan hareketli faz (yıkama tamponu) ile birlikte kolonu terk ederler.

Şekil 6.1: İyon değiş-tokuş kromatografisinin temel prensibi (tuz gradienti ile elüsyon).

iii. Moleküllerin elüsyonu: Kolon materyaline geri-dönüşümlü olarak bağlanmış olan yüklü moleküllerin kolondan elüsyonu, elüsyon tamponunun pH’sının değiştirilmesi veya iyonik kuvvetinin artırılması ile başarılabildiği gibi, affinite elüsyonu ile de başarılabilir. Affinite elüsyonunda ise kolona, iyon-değiştiriciye olan affinitesi, yüklü olan molekülün affinitesinden daha fazla olan bir iyonun yüklenmesi ile başarılır. Bu olayın çok ani bir biçimde ve bir denge prosesi şeklinde oluştuğu düşünülmektedir. Şekil 6.1’de gösterilen 3. adımda, kolon materyaline iyonik olarak bağlı bulunan yüklü moleküllerin de-adsorbsiyonu, elüsyon sıvısı içerisindeki tuz derişiminin dereceli olarak artırılması ile sağlanmıştır. Tuz derişiminin kademeli olarak artırılması ise yüklü moleküllerin bağlanma derecelerine bağlı olarak, bu moleküllerin sırası ile kolondan elüsyonunu sağlamaktadır. Yani, kolon materyaline bağlanmış olan molekülün oldukça yüksek oranda elektriksel yük ile yüklenmiş olması, bu molekülün iyon-değiştiriciye çok daha sıkı bir şekilde bağlanmasına yal açacaktır. Bu nedenle, iyon-değiştiriciye sıkı bir şekilde bağlanan bu molekülün elüsyonu, daha zayıf olarak bağlanan moleküle oranla, daha yüksek tuz derişiminin uygulandığı noktada gerçekleşecektir. Bunun sonucu olarak da, kolon materyaline en zayıf bağlanan yüklü moleküllerin elüsyonu en önce, en kuvvetli bağlanan moleküllerin elüsyonu ise en sona gerçekleşecektir. iv. Kolon materyalinin temizlenmesi: Uygulanan elüsyon koşullarına rağmen, kolondan ayrılmayan moleküllerin kolondan elüsyonu sağlanır. v. Kolon materyalinin rejenerasyonu: Kolon materyalinin ve kolonun yeniden kullanılması için başlangıç koşullarına getirilmesi yani yeniden dengelenmesidir.

İyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırmanın temeli, farklı moleküllerin farklı iyonik yüklere sahip olmaları, yük yoğunluklarının faklı olması ve yüklerin moleküller üzerindeki dağılımlarının farklı olması nedeni ile iyon-değiştirici ile farklı derecelerde etkileşim göstermelerine dayanmaktadır. Yüklü moleküller ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimler ise ortamın iyonik kuvvetinin ve pH’nın değiştirilmesi gibi faktörlerle kontrol edilebilmektedir. İyon değiş-tokuş

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

119

kromatografisi, örneğin tek bir yüklü amino asit bakımından dahi farklı olan iki protein molekülünün ayrıştırılmasını sağlayan, güçlü bir ayrıştırma tekniğidir. Bu nedenle, biyomoleküllerin yük özelliklerindeki farklılıklar, bu kromatografi tekniğinin uygulanmasında oldukça önemli bir yere sahiptir. İyon değiş-tokuş kromatografisinin uygulanmasında araştırmacı, ilgilenilen bileşiklerin ayrıştırılmasında iki yoldan birisini takip edebilir. Bunlardan birincisinde, ilgilenilen bileşiklerin kolon materyaline bağlanması sağlanırken, kirleticilerin kolonu terk etmesi sağlanmaktadır. İkincisinde ise kirleticilerin kolon materyaline bağlanması sağlanırken, ilgilenilen bileşiklerin kolonu terk etmesi sağlanabilir. Bu yöntemlerden daha sıklıkla kullanılanı ise birincisidir. Çünkü birinci yöntem, hem ilgilenilmekte olan bileşiklerin yoğunlaştırılmasına, hem de daha etkili bir fraksiyonlamanın yapılmasına imkan sunmaktadır. Bileşiklerin kolon materyaline bağlanmasını (ya da serbest kalmasını) sağlayan koşullar ise deneysel koşulların dizaynı (bkz. kısım 6.6) adı altında daha detaylı olarak incelenmektedir. Bileşiklerin, kolon materyaline bağlanmasını sağlayan iyon değişim etkisinin yanı sıra, diğer bazı bağlanma tipleri de meydana gelebilir. Bu bağlanma tipleri ise genellikle, van der Waals kuvvetleri ve polar-olmayan etkileşimler olup, etkileri ise oldukça küçüktür. 6.3. İyon-değiştirici Matriksler

İyon değiş-tokuş kromatografileri, değişik iyonik grupların kovalent olarak bağlanmış olduğu matriksler kullanılarak yapılabilir. Matrikslere kovalent olarak bağlanan iyonik gruplar ise ya pozitif yüklü ya da negatif yüklüdürler (Şekil 6.2). Bu nedenle iyon-değiştiricilerin, katyon- ve anyondeğiştirici matriksler olmak üzere iki tipi bulunur. Katyon-değiştirici matriksler, negatif yüklü fonksiyonel gruplara sahiptirler ve bunlar, pozitif olarak yüklü katyonları çekerler. Bu iyondeğiştiriciler aynı zamana, asidik iyon-değiştirici matriksler olarak da adlandırılırlar. Çünkü bunların negatif yükleri, asidik grupların iyonizasyonu sonucu oluşur. Anyon-değiştirici matriksler ise pozitif yüklü fonksiyonel gruplara sahiptirler ve bu gruplar, negatif yüklü anyonları çekerler. Genellikle pozitif yükler, protonların bazik gruplarla birleşmesi sonucu oluştuğundan, aynı zamanda bu tipteki iyon-değiştiricilerini tanımlamak için bazik iyon-değiştirici matriksler terimi de kullanılır.

Şekil 6.2: İyon-değiştirici tipleri.

Kullanılan matriksler ise inorganik bileşiklerden, sentetik reçinelerden veya polisakkaritlerden elde edilebilmektedir (bkz. kısım 3.3). Dolayısıyla, en sık kullanılan matriksler polistiren, selüloz ve agaroz temelli olan matrikslerdir. Matriksin karakteristik özellikleri ise kromatografinin verimliliğini, kapasitesini ve örnek moeküllerinin geri-kazanımı gibi özelliklerinin yanı sıra, mekanik dayanıklılığını ve akış özelliklerini de etkilemektedir. Matriksin yapısı, aynı zamanda biyomoleküllere karşı olan davranışı ve biyolojik aktivitenin korunması üzerine de etkili olmaktadır. İyon değiş-tokuş kromatografisinde ilk kullanılan matriksler ise sentetik reçineler olmuştur. Bu reçineler ise de-mineralizasyon, su arıtma ve atıklardan minerallerin geri-kazanılması gibi amaçlar

120

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

için geliştirilmiştir. Bu tipteki iyon-değiştiriciler, oldukça yoğun iyonik gruplar taşıyan hidrofobik polimer matrikslerinden ibaret olup, küçük iyonlar için oldukça yüksek kapasitelere sahiptirler. Fakat düşük geçirgenliklerinden dolayı bu tip matriksler, proteinlere ve diğer makromoleküllere karşı düşük kapasiteye sahiptirler. Buna ilaveten, oldukça yoğun olarak yüklü gruplar taşımaları nedeni ile çok sıkı bağlanmalara neden olmakta ve matriksin hidrofobik özelliği nedeni ile de kararsız olan biyolojik bileşiklerin denatürasyonuna yol açabilmektedirler. Bu nedenle, bu tip matrikslerin harika akış özelliklerine ve küçük iyonlar için yüksek kapasitelerine rağmen, bu tipteki iyon-değiştiriciler, biyomoleküllerin saflaştırılmasında uygun olmamaktadırlar. Biyolojik bileşiklerin ayrıştırılması amacı ile kullanılabilecek ilk iyon-değiştiriciler ise Peterson ve Sober (1956) tarafından geliştirilen selüloz iyon-değiştiriciler olmuştur. Selülozun hidrofilik özelliği nedeni ile bu tipteki iyon-değiştiriciler, proteinlerin denatürasyonuna çok daha az neden olmaktadırlar. Fakat, ne yazık ki selüloz iyon-değiştiricilerin çoğu düşük kapasiteye (aksi halde selüloz su içerisinde çözünür hale gelmektedir) ve selülozun düzensiz şekli nedeni ile de zayıf akış kapasitesine sahiptirler. Bu problemlerin üstesinden gelebilmek için ise ilk etapta çapraz-bağlı dekstran (Sephadex), agaroz (Sepharose CL-6B) ve selüloz (DEAE Sephacel) temelli iyondeğiştirici matriksler geliştirilmiştir. Bu iyon değiştirici matriksler küresel formda ve oldukça porlu yapıda olduklarından, hem matriksin akış özelliklerinin hem de makromoleküller için kapasitelerinin artırılması sağlanmıştır. Daha sonraları jel teknolojisindeki gelişmelere paralel olarak, Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow ve Sepharose Big Beads gibi oldukça yüksek oranda çapraz-bağlı agaroz temelli matriksler ve MonoBeads, MiniBeads ve SOURCE gibi sentetik polimer matriksler geliştirilmiştir. Bu modern matriksler ise iyon değiş-tokuş kromatografilerinin hem analitik hem de preparatif amaçlı olarak oldukça hızlı, yüksek kapasiteli ve yüksek çözünürlüklü birer kromatografi tekniği olarak kullanılmasına yol açmıştır. Günümüzde ise mikropreparatif veya analitik ayrıştırmalar için aşırı derecede yüksek çözünürlük sağlayan MiniBeads gibi porsuz, polimer matriksler de bulunmaktadır. İyon-değiştirici matrikslerin örnekleri ise Tablo 6.1’de verilmektedir. HPLC için uygun olan ve çok çeşitli iyonik gruplar içeren, bağlı fazda iyon-değiştiricilerini ise günümüzde pelliküler ve porlu formlarda bulmak mümkündür. Polistiren, porlu silika veya hidrofilik poli-eter kökenli olan porlu iyon-değiştirici çeşitleri ise proteinlerin ayrıştırılmasında özel bir öneme sahiptirler. Bu iyondeğiştiriciler ise 5-25 μm partikül çaplarına sahiptirler. HPLC iyon-değiştiricilerinin çoğu ise 60 °C’a kadar kararlıdırlar. Kolon sıcaklığındaki artış, hareketli fazın viskozitesini düşüreceğinden ve bunun soncunda da ayrıştırma verimini artıracağından, ayrıştırma işlemi çoğunlukla bu sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir. 6.4. Fonksiyonel Yüklü Gruplar

İyon değiş-tokuş kromatografisinin temel kaidesini, matrikse kovalent olarak bağlı bulunan fonksiyonel yüklü gruplar oluşturmaktadır. Fonksiyonel iyonik gruplar ise, her ikisi de geniş pH değerlerinde tamamen iyonize olmalarından dolayı güçlü iyon-değiştiriciler olarak adlandırılan sülfonat (–SO–3) ve dördüncül amonyum (–N+R3) ile yine her ikisi de dar pH değerleri aralığında iyonize olmalarından dolayı zayıf iyon-değiştiriciler olarak adlandırılan karboksilat (–COO–) ve dietilamonyum (–H+N(CH2–CH3)2)’dur (bkz. Tablo 6.1). Güçlü ve zayıf terimleri ise fonksiyonel grupların pH’ya bağlı olarak iyonlaşma özelliklerini belirtmekte olup, bu fonksiyonel grupların oluşturdukları iyonik bağların kuvveti ile bir ilgisi bulunmamaktadır. Güçlü iyon-değiştiricilerin bazı özellikleri ise şu şekilde sıralanabilir: i. Güçlü iyon-değiştiricilerdeki fonksiyonel grupların geniş pH aralıklarında iyonlaşabilmesinden dolayı, iyon-değiştiricideki yüklerin kaybolmasına bağlı olarak meydana gelen

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

121

örnek yükleme kapasitesindeki düşme, güçlü iyon-değiştiricilerinde hem yüksek hem de düşük pH değerlerinde meydana gelmez. Tablo 6.1: Çoğunlukla kullanılmakta olan iyon-değiştirici örnekleri. Tipi Zayıf asidik (Katyon-değiştirici) Kuvvetli asidik (Katyon-değiştirici)

Zayıf bazik (Anyon-değiştirici)

Matriks

Fonksiyonel grup

Agaroz Selüloz Dekstran Poliakrilat

CH2–O−COO– CH2–O−CH2COO–

Karboksi Karboksimetil

Selüloz Dekstran Polistiren

CH2–O−SO3− CH2–O−CH2SO3− CH2–O−CH2CH2CH2SO3−

Sülfo Sülfometil Sülfopropil

Agaroz Selüloz Dekstran Polistiren

+

CH2–O−CH2CH2N H3 CH2–O−CH2CH2N+H(CH2CH3)2 +

Selüloz Kuvvetli bazik (Anyon-değiştirici)

Fonksiyonel grup adı

Dekstran

CH2–O–CH2N (CH3)3 CH2–O−CH2CH2N+(CH2CH3)3

Trimetilaminometil Trietilaminoetil

+ CH2 O CH2N(CH3)3

Dimetil-(2-hidroksietil) aminometil

CH2CH2OH + CH2 O CH2CH2N(CH2CH3)2

Polistiren

Polietilenimin Aminoetil Dietilaminoetil

Dietil-(2-hidroksipropil) aminoetil

CH2CHCH3 OH

ii. İyon-değiştirici ile örnek molekülleri arasında çok basit bir etkileşim mekanizması mevcuttur. iii. Kolon materyalinin (matriksin) yük özelliği, pH’daki değişimlere bağlı olarak değişmeden kalabildiği için, güçlü iyon-değiştiricilerinin kullanıldığı kromatografi çalışmalarında ayrıştırma koşullarının kontrol altında tutulması çok daha kolaydır. Bu nedenle güçlü iyon-değiştiricileri, elektroforetik titrasyon eğrilerinden (bkz. kısım 6.6.2.1) elde edilen verilerin çalışılmasında oldukça idealdirler. 6.5. Kapasite

Bütün iyon-değiştiricilerin toplam iyonik kapasitesi, değiştirilebilen-iyonları tutma yeteneğinin kantitatif bir ölçüsü olarak ifade edildiğinden oldukça önemli bir özelliktir. Kapasite, toplam iyonik kapasite, kullanılabilir kapasite veya dinamik kapasite olarak da ifade edilebilir. Toplam iyonik kapasite, iyon-değiştiricilerin kuru formlarının her bir gramında veya sulu reçinelerinin (şişirilmiş formlar) her bir birim hacminde bulunan iyonlaşmış fonksiyonel grupların sayısı veya değiştirilebilen-iyonların sayıları olarak tanımlanır. Toplam iyonik kapasite, kuvvetli bir asit veya baz ile titrasyon yoluyla ölçülebilir. Belirlenmiş deneysel koşullar altında, bir iyon-değiştiriciye bağlanan proteinin gerçek miktarı ise iyon-değiştirici materyalin (jelin) kullanılabilir kapasitesi olarak tanımlanır. Dolayısıyla, hemoglobin gibi keyfi olarak seçilmiş bir molekül için mümkün olan kapasiteyi ifade etmek için, kullanılabilir kapasite tanımı kullanılır. Şayet tanımlanmış olan deneysel koşullar, jelin

122

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

kullanılmasının mümkün olduğu durumlarda akış oranını da içeriyorsa, iyon-değiştiriciye bağlanan proteinin miktarı, o iyon-değiştiricinin dinamik kapasitesini ifade eder. Kullanılabilir ve dinamik kapasite: (i) proteinin özelliklerine, (ii) iyon-değiştiricinin özelliklerine ve (iii) seçilmiş olan deneysel koşullara bağlıdır. i. Proteinin özellikleri: Bir iyon-değiştirici matriksin kullanılabilir ve dinamik kapasitesi, matrikse bağlanan proteinin moleküler büyüklüğü ve yük/pH ilişkisi tarafından belirlenir. Bu nedenle bir iyon-değiştiricisinin kapasitesi, proteinden proteine değişmektedir. İyon değiş-tokuş kromatografisi için porlu bir matriksin kullanıldığı durumda, porların içerisine girebilecek kadar küçük olan bir protein için belirlenen kullanılabilir kapasite, porların içerisine giremeyecek kadar büyük olan ve dolayısıyla sadece matriksin yüzeyindeki fonksiyonel iyonik gruplarla ilişki kurabilen bir protein için belirlenen kullanılabilir kapasiteden daha yüksek olacaktır. Aynı şekilde, iyon değiştokuş kromatografisinde protein ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimin iyonik olması nedeniyle, iyon-değiştiricinin kullanılabilir ve dinamik kapasitelerinin belirlenmesinde proteinin yük/pH ilişkisi de önemli bir kriterdir. Bu nedenle, protein yüzeyindeki net yük yoğunluğunun iyon-değiştiriciye bağlanmasını sağlayacak şekilde olmasını sağlayan tampon koşullarının seçilmiş olması gerekmektedir. ii. İyon-değiştiricinin özellikleri: İyon-değiştirici matrikslerin yapıları da, herhangi bir protein için kullanılabilir kapasitesinin belirlenmesinde etkilidir. Bu nedenle, kullanılabilir kapasite üzerinde matriksin geçirgenlik limiti, tipi ve fonksiyonel iyonik grupların sayısı önemli bir özellik oluşturur. Yüksek kullanılabilir kapasiteli iyon-değiştirici jelller ise makro-porlu ve geniş pH aralıklarında iyonik özelliklerini koruyabilen, oldukça yoğun fonksiyonel gruplar taşıyan matrikslerin kullanılması ile sağlanabilir. Porsuz matriksler ise porlu olanlara oranla daha düşük kapasiteye sahipken, daha kısa yüzey diffüzyonu nedeni ile daha yüksek verimliliğe sahiptirler. iii. Seçilmiş olan deneysel koşullar: Bir iyon-değiştiricinin gözlenen kapasitesini etkileyen deneysel koşullar ise pH, tamponun iyonik kuvveti, değiştirilebilir-iyonun özelliği, akış oranı ve sıcaklıktır. Dinamik kapasite ise akış oranının artmasıyla ters orantılı olarak azaldığı için, akış oranı dinamik kapasitenin belirlenmesinde özel bir öneme sahiptir. Bu nedenle, farklı iyon-değiştiricilerin kullanılabilir kapasiteleri karşılaştırılırken, bu özellikler her zaman göz önünde bulundurulmalıdır.

Bir iyon-değiştirici için kullanılabilir ve dinamik kapasitelerin belirlenmesi ile ilgili metodoloji ise kısım 6.7.2.1’de ele alınmaktadır. 6.6. Deneysel Koşulların Dizaynı 6.6.1. İyon-değiştiricinin Seçimi

Her türlü ayrıştırma için tek bir iyon-değiştiricinin kullanılması, mükemmel bir sonucun elde edilmesini sağlamaz. Bu nedenle, iyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılacak olan matriksin ve fonksiyonel iyonik grupların seçiminde; (i) ayrıştırma işleminin özgül gereksinimleri, (ii) örnek bileşiklerinin moleküler büyüklükleri (iii) örnek bileşiklerinin kararlılığı ve izo-elektrik noktaları gibi bazı kriterlerin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. 6.6.1.1. Ayrıştırma İşleminin Özgül Gereksinimleri i. Ayrıştırmanın şekli: Şayet ayrıştırma işlemi, kolon kromatografisi ile değil de yığın (batch) şeklinde uygulanacaksa, matriksin akış ve paketlenme özelliği çok da önemli olmadığından, bu durumda ekonomik ve yüksek kapasiteye sahip olması nedeni ile Sephadex temelli iyon-değiştiriciler kullanılabilir. Büyük-ölçekli uygulamalarda ise STREAMLINE’ın kullanılması, hem tatmin edici bir sonucun elde edilmesini sağlamakta hem de ekonomik olmaktadır.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

123

ii. Örnek materyalin miktarı: Bir iyon-değiştiricinin seçilmesinde önemli bir parametre de, ayrıştırılmada kullanılacak olan örnek materyalin miktarıdır. Laboratuvar-ölçekli saflaştırma çalışmaları için genellikle her türlü iyon-değiştiriciler kullanılabilmekle birlikte, büyük-ölçekli saflaştırma çalışmalarında ise SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow, Sepharose Big Beads veya STREAMLINE gibi kolon materyalleri kullanılmaktadır. iii. İstenilen çözünürlük: Bir iyon-değiştirici seçilirken, seçilen iyon-değiştiricinin sağlayacağı çözünürlüğün derecesi de oldukça önemlidir. Normalde analitik veya yarı-analitik ayrıştırmalarda yüksek çözünürlük gerekmektedir. Bunun aksine, preparatif çalışmalarda ise kullanılan iyondeğiştiricinin kapasitesi ve hızı daha önemli olduğundan, çözünürlük daha az önem kazanmaktadır.

İyon değiş-tokuş kromatografisinde çözünürlük, kullanılan kolon materyalinin seçiciliğine ve verimliliğine bağlıdır. Maksimum seçicilik ise örnek materyalindeki moleküller tarafından tölare edilebilen her pH’da kullanılmaları nedeni ile genellikle, Q veya S/SP gibi kuvvetli iyon-değiştirici grupları içeren jellerden birisinin seçilmesi ile başarılabilir. Maksimum verimlilik ise küçük partiküllü matrikslere dayalı bir jelin seçilmesi ile sağlanabilir. Bu nedenle, partikül büyüklüklerine ve potansiyel verimliliklerine bağlı olarak, bazı kolon materyalleri şu şekilde sıralanabilir: MiniBeads (3 μm) > MonoBeads (10 μm) > SOURCE 15 (15 μm) > SOURCE 30 (30 μm) > Sepharose High Performance (34 μm) > Sepharose Fast Flow / Sepharose CL-6B / Sephacel (90 μm) > Sephadex (40-125 μm, kuru formda) > STREAMLINE / Sepharose Big Beads (200 μm). Bu nedenle, SMART, FPLC ve HPLC sistemlerinde MiniBeads, MonoBeads ve SOURCE 15 gibi iyon-değiştiricilerinin kullanılması durumunda en yüksek çözünürlük elde edilebilirken, standart kolonlarla en yüksek çözünürlük ise SOURCE 30 ve Sepharose High Performance gibi iyon-değiştiricilerinin kullanılması ile elde edilebilir. iv. Proses zamanı: Belirli bir zaman diliminde ne kadar materyalin prosesten geçirileceği genellikle, kolon materyalinin kapasitesi ve akış özellikleri ile kolonun büyüklüğü tarafından belirlenir. Günümüzde ise makromoleküller için oldukça yüksek kapasiteye sahip iyon-değiştiriciler bulunmakla birlikte, bu kolon materyallerinin akış özellikleri oldukça farklılıklar göstermektedirler. Bu nedenle, SMART sistemlerle yapılacak mikropreparatif kromatografilerde MiniBeads gibi optimum akış özelliklerine sahip kolon materyalleri tercih edilirken, HPLC ve FPLC sistemlerinde MonoBeads ve SOURCE 15; laboratuvar- ve endüstriyel-ölçekli preparatif ayrıştırmalarda ise SOURCE 30, Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow ve Sepharose Big Beads gibi kolon materyalleri tercih edilmektedir. SOURCE gibi iyon-değiştirici kolon materyalleri uniform büyüklükteki küresel taneciklerden oluştuğu için, bu tip kolon materyalleri paketlendiğinde oldukça düşük basınç düşmeleri meydana gelmektedir. Bu nedenle, özellikle birbirine çok yakın ürünlerin ayrılması amacıyla endüstriyel çaptaki uygulamalar için ideal bir materyaldir. v. Ölçek: Genellikle büyük-ölçekli ayrıştırma işlemlerine geçmeden önce, örnek bileşenlerinin ayrılması için gerekli optimum koşulların belirlenmesi amacı ile küçük-ölçekli iyon değiş-tokuş kromatografisi uygulanır. Bu nedenle, küçük bir kolon ile başarılan ayrıştırma işlemlerinin kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemlerine de uygulanmasına izin veren bir iyondeğiştiricinin seçilmesi oldukça önemlidir. vi. Tekrarlanabilirlik: Kolon kromatografisinde sonuçların tekrarlanabilirliği, kolon içerisine paketlenmiş olan materyalin özelliklerinin ayrıştırma ve rejenerasyon işlemleri boyunca değişmeden kalmasına bağlıdır. Bu nedenle, bir iyon-değiştirici ile paketlenmiş olan kolondan elde edilen sonuçların tekrarlanabilir olması için seçilen kolon materyalinin yatak hacminde, pH ve iyonik kuvvet değişimlerine bağlı olarak bir değişikliğin meydana gelmemesi gerekmektedir. Bu amaçla MiniBeads, MonoBeads, Sepharose Fast Flow ve Sepharose Big Beads gibi daha sıkı olan iyondeğiştiricilerin seçilmesine özen gösterilmelidir.

124

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri

Örnek bileşiklerinin fonksiyonel yüklü gruplara ulaşması, iyon-değiştiricinin örnek bileşikleri için olan kullanılabilir kapasitesi tarafından belirlenir. Ticari olarak bulunan iyon-değiştiricilerin, Sephadex temelli olanlar hariç, hepsi de 1 x 106 Da moleküler büyüklüğe sahip olan globüler moleküller için dahi geçirgenlik özelliğine sahiptirler. Sterik faktörler, her bir bileşik için ayrı olan iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesini etkilediğinden, sadece yüklü bileşiklerin ayrılmasını etkilerler. Bir iyon-değiştirici seçilirken, seçilen iyon-değiştiricinin ayrılacak olan yüklü bileşikler üzerine jel filtrasyon etkisi gösterebileceği ihtimalini göz önünde bulundurmak gereksizdir. Yüklü olan örnek molekülleri, her zaman elüsyon tamponunu oluşturan bileşiklerden daha büyük olmalarına rağmen, elüsyon tamponunun bileşiklerinden daha hızlı hareket edemezler. Çünkü, yüklü olan örnek molekülleri elüsyon tamponunun bileşiklerinden hızlı hareket etseler dahi, gelmiş oldukları noktada kolon koşulları bu moleküllerin kolon matriksine yeniden bağlanmasını sağlayacak koşullardadır. Sadece yüklü olmayan örnek molekülleri, jel filtrasyon kromatografisinde olduğu gibi, moleküler büyüklüklerine uygun olarak fraksiyonlanacaklardır. Bu yüksüz moleküller ise kolon materyaline bağlanmış olan yüklü örnek moleküllerinin elüsyonu için uygulanacak olan gradientten önce, izokratik elüsyon sırasında kolondan ayrılacaklardır. Ticari olarak bulunan farklı iyon-değiştirici materyallerin geçirgenlik limitleri ise üretici firmalar tarafından belirtilmektedir. Moleküler büyüklüğü bilinmeyen örneklerle çalışıldığı durumlarda ise geçirgenlik limitleri oldukça yüksek olan MonoBeads ve Sepharose temelli iyon-değiştiricilerin tercih edilmesi bir avantaj oluşturmaktadır. 6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları

Birçok biyolojik bileşik, özellikle proteinler, sadece oldukça dar pH aralıkları içinde kararlıdırlar. Dolayısıyla, seçilecek olan iyon-değiştirici, bu aralıklarda ayrıştırma yapabilmek zorundadır. Genellikle, eğer örnek molekül, izoiyonik (izoelektrik) noktasının altındaki bir pH’da net pozitif yüklü ve çok daha kararlı haldeyse, bir katyon-değiştirici kullanılmalıdır. Bununla beraber, şayet molekülün en kararlı olduğu hal, ona net bir negatif yük verecek şekilde, molekülün izoiyonik noktasının üstündeyse, bu durumda bir anyon-değiştirici kullanılmalıdır (Şekil 6.3).

Şekil 6.3: Proteinlerin net yükleri pH’ya bağlı olarak değişir.

Buna rağmen verilen bu örnekte protein, kakarlılığını ancak pH 5-8 arasında koruduğundan, bu durumda bir anyon-değiştiricinin kullanılması gerekmektedir. Çok geniş pH aralığında kararlı olabilen moleküllerin ayrıştırılmasında ise her iki tipteki iyon-değiştirici materyaller kullanılabilir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

125

Güçlü ve zayıf iyon-değiştiriciler arasındaki seçim, aynı zamanda örneğin kararlılığına ve pH’nın örnek molekülün yükü üzerindeki etkisine dayanır. İyonizasyon için çok yüksek veya zayıf pH ihtiyacı gösteren zayıf elektrolitler, sadece geniş pH aralığında çalışabilen iyon-değiştirici materyaller gibi güçlü değiştiricilerle ayrılabilirler. Bunun aksine, güçlü elektrolitler için ise, örnek moleküllerinin denatürasyonuna daha az neden olmaları, zayıf yüklü safsızlıkları (kirleticileri) bağlayamamaları ve artırılmış elüsyon karakteristiklerini içeren bir takım nedenlerden dolayı, zayıf iyon-değiştiriciler daha avantajlıdırlar. Her ne kadar iyon-değiştiricinin çapraz-bağ yapma derecesi, iyon değişim mekanizmasını etkilemese de, iyon-değiştirme kapasitesini etkiler. Bu nedenle, örnek bileşiğin göreceli moleküler kütlesi ve dolayısıyla boyutu, hangi özgül iyon-değiştiricinin kullanılması gerektiğini belirler (bkz. kısım 6.6.1.3). 6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı 6.6.2.1. Başlangıç pH’sının Seçilmesi

Başlangıç tamponunun pH’sı, örnek moleküllerin iyon-değiştiriciye bağlanmasını sağlayacak şekilde, uygun yüklere sahip olmasını sağlayacak bir değerde seçilmelidir. Bu nedenle kullanılacak tamponun pH’sı, örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye yeterli miktarda bağlandığından emin olmak için, anyon-değiştiricinin kullanıldığı durumlarda ayrıştırılacak bileşiğin izoelektrik noktasının en az 1 pH birimi üstünde, katyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda ise molekülün izoelektrik noktasının en az 1 pH birimi altında olmalıdır. İyon-değiştiriciye bağlanmış olan bileşikler ise genellikle, 100 mM’lık iyon kuvveti altında, kendi izoelektrik noktalarının yaklaşık 0,5 pH biriminde iyon-değiştiricilerden ayrılmaya (disosiye olmaya) başlarlar. Günümüzde ise farklı protein moleküllerinin izoelektrik noktalarını gösteren detaylı tabloları bulmak mümkündür. Bu tablolar yardımıyla, iyon değiş-tokuş kromatografilerinin dizaynı yapılabilir. Şayet, çalışılmakta olan proteinin izoelektrik noktası hakkında herhangi bir bilgiye sahip değilsek, başlangıç pH’sını belirlemek için değişik yöntemler kullanılabilir: i. Başlangıç pH’sının seçilmesinde test-tüp metodu: Şayet çalışılmakta olan proteinin izoelektrik noktası bilinmiyorsa, bu durumda başlangıç pH’sını belirlemek için basit bir deney yapılabilir:

1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır. 2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, farklı pH’lardaki 500 mM’lık, 10 mL tampon (iyon değiş-tokuş kromatografisi için kullanılan tamponlar için kısım 6.6.2.3’e bakınız) ile 10 defa yıkanarak dengelenir. Kullanılan tamponun pH değerleri ise anyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda 5-9 arasında, katyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda ise 5-8 arasında olmalı ve tüpler arasındaki pH değişimi, 0,5 birimlik aralıklarla ayarlanmalıdır. 4. Her bir tüpteki jel, aynı pH değerindeki fakat daha düşük iyonik kuvvetteki (Sephadex için en düşük iyonik kuvvet 5 mM, Sepharose ve Sephacel için ise 10 mM) 10 mL tampon ile 5 defa yıkanarak dengelenir. 5. Her bir tüpe sabit miktarda örnek materyali ilave edilir. 6. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 7. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 8. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, örnek molekül için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,a’daki gibi olabilir.

126

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 6.4: İyon değiş-tokuş kromatografisi için başlangıç koşullarının seçilmesinde test-tüp metodu.

İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılacak tamponun pH’sı, örnek moleküllerinin iyondeğiştiriciye bağlanmasına izin vermeli fakat, aynı zamanda bileşiklerin iyon-değiştiriciden ayrılmasını sağlayan pH değerine de mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Şayet seçilen tamponun pH değeri, bileşiklerin iyon-değiştiriciden ayrılmasını sağlayan pH değerinden çok yüksek veya çok düşük ise bu durumda, moleküllerin elüsyonu çok daha zor olacağından, çok yüksek tuz derişimlerinin kullanılması gerekebilir. Bu durumda Şekil 6.4,a’daki hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküllerin iyon-değiştiriciye bağlanması ve elüsyonlarının daha düşük tuz derişimlerinde yapılabilmesi için başlangıç tamponunun pH’sı 7,0 olmalıdır. ii. Başlangıç pH’sının seçilmesinde elektroforetik titrasyon eğrisi (ETE): Örnek molekülün izoelektrik noktası hakkındaki bilgi, başlangıç koşullarının seçilmesi hakkında oldukça önemli ipuçları sunmasına rağmen bu bilgi, örnek molekül üzerindeki yüklerin pH’ya bağlı olarak nasıl değiştiği (bkz. Şekil 6.3) hakkında ya da hangi pH veya iyon-değiştirici ile maksimum çözünürlüğün sağlanabileceği hakkında bilgi vermez.

Elektroforetik titrasyon eğrisi (Şekil 6.5), pH gradientinden oluşan bir ortamda bir molekülün yük/pH arasındaki ilişkisinin belirlenmesini sağladığından, iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılacak olan moleküller için uygun koşulların belirlenmesinde oldukça önemlidir.

Şekil 6.5: Tavuk göğüs kası proteininin elektroforetik titrasyon eğrisi (Haff ve ark., 1983).

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

127

Bir örnek molekülünün elektroforetik titrasyon eğrisi, örnek molekülünün, pH gradientine dik açılı olarak horizontal agaroz veya poliakrilamid plaka jelleri üzerinde elektroforezi ile elde edilebilir (Protein moleküllerinin elektroforetik olarak saflaştırılmasında ve analizinde kullanılan elektroforez yöntemleri ise “Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler” adı ile yayına hazırlanmaktadır). Jelin pH gradienti ise örnek yüklemeden önce izoelektrik odaklama ile oluşturulur. Bir örnek molekülünün elektroforetik titrasyon eğrisinin belirlenmesinde takip edilen adımlar ise Şekil 6.6’da şematik olarak verilmektedir.

Şekil 6.6: Elektroforetik titrasyon eğrisinin belirlenmesinde takip edilen başlıca adımlar (Anonymous, 1995).

Örnek moleküllerinin pH gradientine dikey olarak elektroforezi, her bir örnek molekülünün pH’ya bağlı olarak net yükünün farklı olması nedeniyle, bu moleküllerin göreceli elektroforetik hareketlilikleri de farklı olmaktadır. Örnek moleküllerinin göreceli elektroforetik hareketliliklerinin farklılığı nedeni ile her bir örnek molekülü için özgül olan bir seri eğri oluşmaktadır. Her bir örnek molekülüne ait eğrinin örnek yükleme hattını kestiği pH değeri ise o molekülün net yükünün sıfır olduğu pH’sını, yani izoelektrik noktasını göstermektedir. Bir karışım içerisindeki örnek moleküllerinin maksimum çözünürlüğü, kullanılmakta olan özgül pH’daki her bir örnek molekülünün yüküne bağlı olarak, seçilen iyon-değiştirici tipinde elde edilen titrasyon eğrileri arasındaki maksimum ayrıştırmanın gerçekleştiği pH’da elde edilmesi beklenir. Kullanılmakta olan bu özgül pH’da, örnek moleküllerinin elektroforetik hareketliklilerinin farklılığı ve buna bağlı olarak da net yükleri arasındaki farklılık en fazla olmaktadır. Bu prensip ise Şekil 6.7’de örneklendirilmiştir. Örnek moleküllerinin ayrıştırılması için bu koşulların uygulanmaya konmadan önce, gösterilmiş olan pH’daki proteinin kakarlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Şayet, örnek moleküllerinin pozitif olarak yüklü bulundukları pH’da (örneğin, moleküllerin izoelektrik noktalarının altında) maksimum ayrışmanın meydana geldiği gözleniyorsa, maksimum çözünürlük, katyon-değiştirici materyallerin kullanılması ile sağlanabilir. Şayet ilgilenilmekte olan örnek moleküllerinin negatif olarak yüklü oldukları pH’da (örneğin, moleküllerin izoelektrik noktalarının üstünde), moleküllerin elektroforetik hareketlilikleri arasında büyük farklılıklar gözlenirse, bu durumda bir anyon-değiştirici materyal kullanılmalıdır. Şayet, örnek moleküllerinin titrasyon eğrilerinin maksimum ayrışması, örnek yükleme noktasında (örneğin, örnek moleküllerinin izoelektrik noktalarında) gerçekleşiyorsa, bu durumda maksimum çözünürlük, kromotofokusing tekniği (bkz. 7. Bölüm) ile sağlanabilir. pH’nın ölçülmesi ise yüzey elektrotlarının kullanılması ile yapılabileceği gibi, jelde pH gradientinin oluşturulması amacıyla elektroforezin birinci boyutu gerçekleştirilirken, izoelektrik noktaları bilinen standart proteinlerin jelin alt ya da üst kısmına dar bir bant şeklinde yüklenmesi ile

128

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

de belirlenebilir. Elektroforezin birinci boyutundan sonra jel, ikinci boyut için elektroforeze tâbi tutulmadan önce, jelin izoelektrik noktaları bilinen standart proteinleri içeren kısmı jelden ayrılarak boyanır ve her bir standart proteinin lokasyonu belirlenir. İkici boyut elektroforezinden sonra, pH değerlerinin belirlenmesi için izoelektrik noktaları bilinen standart proteinleri içeren ve boyanmış olan parça, jelin kesilen kısmına yeniden eklenir.

Şekil 6.7: Elektroforetik titrasyon eğri analizine dayalı olarak kolon materyalinin seçimi (Anonymous, 1995).

Titrasyon eğrilerinin Coomassie Blue gibi genel bir protein boyası ile boyanması, örnek moleküllerinin izoelektrik noktaları çok net olarak belirlenmediği sürece, özgül bir protein için yük/pH ilişkisi hakkında bir bilgi vermez. Herhangi bir örnek proteini için pozitif bir tanımlamanın yapılabilmesi için ise zymogram analizi (Şekil 6.8) veya immünofiksasyon gibi özgül bir belirleme tekniğinin kullanılması gerekmektedir. Elektroforetik titrasyon eğrisindeki her bir eğri, her bir örnek molekülünün farklı pH değerlerindeki yük derecelerini yansıttığından bu eğriler, kolona yüklenmiş olan moleküllerin elüsyonlarının hangi sıra ile olacakları hakkında bir tahminin yapılmasına da olanak vermektedirler. Belirli bir pH değerinde en düşük elektroforetik hareketlilik gösteren molekül, aynı zamanda en düşük yük kapasitesine de sahip olacağından bu molekülün elüsyonu, gradient elüsyonu sırasında ilk önce gerçekleşecektir. Benzer şekilde, en fazla elektroforetik hareketliliğe sahip olan molekülün yük kapasitesi de en yüksek olacağından bu molekül, zıt yüklü olan kolon materyaline en sıkı bağlanan molekül olacaktır. Bunun sonucunda da bu molekülün elüsyonu, gradient elüsyonunda en sona gerçekleşecektir. Buna rağmen, bir molekülün elektroforetik hareketliliği, o molekülün net yüküne bağlı iken, iyon değiş-tokuş kromatografisindeki davranışı ise molekülün yüzeyindeki net yüküne bağlıdır. Bu nedenle, titrasyon eğrilerine bakarak moleküllerin elüsyon sıralarını %100 doğru tahmin etmek mümkün değildir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

129

Şekil 6.8: Tavuk göğüs kasının elektroforetik titrasyon eğrisinde kreatin kinaz aktivitesinin zymogram tekniği ile belirlenmesi (Haff ve ark., 1983).

iii. Başlangıç pH’sının seçilmesinde kromatografik titrasyon eğrisi (KTE): Hızlı ayrıştırma yapmaya izin veren iyon-değiştirici tipleri için, anyon- veya katyon-değiştiricinin seçilmesi ve optimal başlangıç pH’sının belirlenmesinde kromatografik titrasyon eğrileri kullanılabilir. Özgül bir tuz gradientinde, herhangi bir molekülün kolonda alıkonması, o molekülün net yüküne ve yük yoğunluğuna bağlıdır. Molekülün net yükü ve yük yoğunluğu ise molekülün içinde bulunduğu elüsyon sıvısının pH’sına bağlıdır. Bu nedenle kromatografik titrasyon eğrisi temelde, tampon sıvısının pH’sı ile molekülün kolonda alıkonması arasındaki ilişkiye bağlıdır.

Kromatografik titrasyon eğrilerini elde etmenin metodolojisi ise oldukça basittir. Ayrıştırılacak olan örnek molekülleri, aynı tuz gradienti kullanılarak değişik pH değerlerindeki anyon- ya da katyon-değiştirici materyallerle kromatografiye tâbi tutulurlar. Şekil 6.9’da, kolon materyali olarak bir katyon-değiştirici (a, b ve c) ve bir anyon-değiştiricinin (d, e ve f) kullanılması sonucunda A, B ve C moleküllerinin aynı tuz gradientinde, fakat farklı pH’lardaki kromatogramları verilmektedir. Bu kromatogramlardan yararlanarak, her bir pik için elüsyon tuz derişimi, elüsyon zamanı veya elüsyon hacminin pH’ya göre grafiği çizilir. Bu grafik ise Şekil 6.9’da görüldüğü gibi bir eğri serisi verecektir. Elde edilen eğri serisinin analizi ise, iki veya daha fazla bileşenden oluşan karışım halindeki bileşiklerin maksimum çözünürlükle ayrıştırılmasını sağlayan pH’yı ve iyon-değiştiricinin tipini işaret edecektir. 6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi

Katyon- veya anyon-değiştirici ile kullanılacak olan uygun başlangıç tamponun pH’sı seçildikten sonra, önemli olan diğer bir seçim de zayıf ve kuvvetli iyon-değiştirici materyaller arsında bir seçimin yapılmasıdır. Maksimum çözünürlüğün uç noktadaki bir pH’da elde edildiği ve örnek moleküllerinin de bu uç noktadaki pH’da kararlı olduğu durumlarda, seçilmesi gereken iyondeğiştirici bariz bir şekilde kuvvetli iyon-değiştirici olacaktır. Fakat protein moleküllerinin büyük bir çoğunluğunun izoelektrik noktalarının 5,5 ile 7,5 arasında olduğu da dikkate alındığında, bu proteinlerin saflaştırılmasında hem zayıf hem de kuvvetli iyon-değiştiricilerin kullanılabileceğini görülmektedir. Kuvvetli iyon-değiştirici materyallerin kullanılmasının sunduğu bazı avantajlar ise daha önce kısım 6.3’de ele alınmıştır.

130

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 6.9: Kromatografik titrasyon eğrileri (açıklama için metgne bakınız).

6.6.2.3. Tampon Seçimi

İyon değiş-tokuş kromatografisinde iyon-değiştirici materyalin seçimi kadar, göz önünde bulundurulması gereken başka parametreler de bulunmaktadır. Bu parametreler: (i) kullanılacak tamponun pH’sı ve iyonik kuvveti, (ii) tampon bileşenlerinin seçimi ve (iii) şayet, endüstriyel-ölçekte kullanılacaksa, tamponun maliyetidir. i. Kullanılacak tamponun pH’sı ve iyonik kuvveti: İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılacak olan tamponun pH seçimi, kısım 6.6.2.1’de detaylı olarak incelenmiştir. Genelde,

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

131

anyon-değiştiricilerle birlikte Tris, piridin ve alkilaminler gibi katyonik tamponlar; katyondeğiştiricilerle birlikte de asetat, barbiturat ve fosfat tamponları gibi anyonik tamponlar kullanılmaktadır. Başlangıç tamponunun iyonik kuvveti ise kullanılan tamponun tamponlama özelliğine bağlı olarak değişmektedir. İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılabilecek bazı tamponlar ve bu tamponların tavsiye edilen başlangıç derişimleri ise Tablo 6.2’de verilmektedir. Tablo 6.2: İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılabilecek tamponlar. a) Katyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tamponlar pKa (25 °C)

pH aralığı

2,00

1,5-2,5

2,88

Adı

Derişim (mM)

dpKa / °C

Değiştirilebilen-iyon

Malik asit

20

Na+

2,38-3,38

Malonik asit

20

Na+ / Li+

3,13

2,63-3,63

Sitrik asit

20

3,81

3,6-4,3

Laktik asit

50

3,75

3,8-4,3

Formik asit

50

+0,0002

Na+ / Li+

4,21

4,3-4,8

Bütanedioik asit

50

-0,0018

Na+

4,76

4,8-5,2

Asetik asit

50

+0,0002

Na / Li

5,68

5,0-6,0

Malonik asit

50

7,20

6,7-7,6

Fosfat

50

-0,0028

Na+

7,55

7,6-8,2

HEPES

50

-0,0140

Na+ / Li+

8,35

8,2-8,7

BICINE

50

-0,0180

Na+

Na+

-0,0024

Na+

+

+

Na+ / Li+

b) Anyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tamponlar pKa (25 °C)

pH aralığı

4,75

4,5-5,0

N-Metil piperazin

20

-0,015

Cl¯

5,68

5,0-6,0

Piperazin

20

-0,015

Cl¯ / HCOO¯

5,96

5,5-6,0

L-Histidin

20

6,46

5,8-6,4

bis-Tris

20

6,80

6,4-7,3

bis-Tris propan

20

7,76

7,3-7,7

Trietanolamin

20

-0,020

Cl¯ / HCOO¯

8,06

7,6-8,0

Tris

20

-0,028

Cl¯

8,52

8,0-8,5

N-Metil-dietanolamin

50

-0,028

SO2 / Cl / CH3COO

8,88

8,4-8,8

Dietanolamin

20-50*

-0,025

Cl¯

8,64

8,5-9,0

1,3-Diamino-propan

20

-0,031

Cl¯

9,50

9,0-9,5

Etanolamin

20

-0,029

Cl¯

9,73

9,5-9,8

Piperazin

20

-0,026

Cl¯

10,47

9,8-10,3

1,3-Diamino-propan

20

-0,026

Cl¯

11,12

10,6-11,6

Piperadin

20

-0,031

Cl¯

12,33

11,8-12,0

Fosfat

20

-0,026

Cl¯

*

Adı

Derişim (mM)

dpKa / °C

Değiştirilebilen-iyon

Cl¯ -0,017

Cl¯ Cl¯

¯

¯

Dietanolamin pH 8,4 olarak kullanıldığında 20 mM, pH 8,8 olarak kullanıldığında ise 50 mM.

¯

132

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Çözelti içerisinde bulunan proteinlerin yapısal kararlılığında tuzların önemli bir rol oynadığı da düşünülürse, kullanılan tamponun iyonik kuvvetinin, proteinlerin denatürasyonunu veya çökelmesini önleyecek bir derişimde olması oldukça önemlidir. Kullanılacak olan tamponun başlangıç iyonik kuvvetinin ne olacağına ise test-tüp metoduyla karar verilebilir. Bu metodun uygulanması ise aşağıdak şekilde gerçekleştirilir: 1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır. 2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, seçilmiş olan pH’daki 500 mM’lık, 10 mL tampon ile 10 defa yıkanarak dengelenir. 4. Her bir tüpteki jel, sabit pH’da (örneğin, pH 7) fakat NaCl derişimi 50 mM aralıklarla değişen (Sephadex için 50-500 mM arası NaCl, Sepharose ve Sephacel için ise 10-300 mM arası NaCl) 10 mL tampon ile 5 defa yıkanarak dengelenir. 5. Her bir tüpe sabit miktarda örnek ilave edilir. 6. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 7. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 8. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, örnek molekül için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,b’deki gibi olabilir. Bu hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküllerin iyondeğiştiriciye bağlanması için tamponun başlangıç iyonik kuvveti en fazla 150 mM, moleküllerin elüsyonu için kullanılacak tamponun iyonik kuvveti ise en az 300 mM olmalıdır. Tamponun doğru başlangıç pH’sı ve iyonik gücü ise örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye bağlanmasına izin verecek kadar olmalıdır. Buna eş olarak, moleküllerin daha sonraki elüsyonları için, başlangıçta elüsyona etki edebilecek en düşük iyonik güce sahip bir tampon kullanılmalıdır. Bu uygulama ise başlangıçta en az sayıda istenmeyen maddenin iyon-değiştiriciye bağlanmasını ve daha sonra da bu kirleticilerin maksimum miktarda kolonda kalmasını sağlar. Bir kolona uygulanabilecek örnek miktarı ise kolonun ölçülerine ve iyon-değiştiricinin kapasitesine bağlıdır. Genellikle, eğer kromatografinin uygulanması (moleküllerin kolondan elüsyonu) süresince başlangıç tamponu kullanılacaksa (izokratik elüsyon) örnek hacmi, kolon yatak hacminin %1-5’i kadar olmalıdır. Bununla beraber, şayet moleküllerin kolondan elüsyonu için gradient elüsyonu kullanılacaksa, seçilen başlangıç koşulları nedeniyle bütün örnek molekülleri iyon-değiştiriciye kolonun en üst kısmında bağlanır. Bu durumda örnek hacmi önemli değildir ve büyük hacimdeki seyreltik örnek solüsyonları kolona yüklenebilmektedir. ii. Tampon bileşiklerinin seçimi: Şayet tampon iyonları, iyon-değiştirici materyalin fonksiyonel gruplarına zıt bir yük taşıyorsa, yüklü olan bu tampon bileşikleri iyon değiş-tokuş prosesinde rol alacaklar ve lokal pH’nın değişmesine yol açacaklardır. Bu nedenle, iyondeğiştiricideki fonksiyonel yüklü gruplarla aynı tipte yüklü olan tampon bileşiklerinin kullanılması tercih edilmektedir. Bu kuralın tâbi ki bazı istisnaları da bulunmaktadır. Örneğin fosfat tamponları, genellikle anyon-değiştirici materyallerle en çok kullanılan tampon olarak literatürde sıkça yer almaktadır. Bunun yanı sıra, tampon iyonlarının kullanılan kolon matriksindeki fonksiyonel iyonik gruplarla etkileşim gösterdiği durumlarda, örnek materyalinin kolona yüklenmeden önce sistemin dengelendiğinden emin olmak için özel bir çaba gösterilmelidir. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılmak istenen örnek materyali dondurularak-kurutulmuş ise bu durumda uçucu tamponların kullanılması bir avantaj oluşturmaktadır. Uçucu olan bazı tampon örnekleri ise Tablo 6.3’de verilmektedir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

133

Tablo 6.3: Uçucu tamponlar. pH

Adı

Değiştirilebilen-iyon

2,0

Formik asit

H+

2,3-3,5

Piridin / Formik asit

HCOO¯

3,0-5,0

Trimetilamin / Formik asit

HCOO¯

3,0-6,0

Piridin / Asetik asit

CH3OO¯

4,0-6,0

Trimetilamin / Asetik asit

CH3COO¯

6,8-8,8

Trimetilamin / HCl

Cl¯

7,0-8,5

Amonyak / Formik asit

HCOO¯

8,5-10,0

Amonyak / Asit

CH3COO¯

7,0-12,0

Trimetilamin / CO2

CO3¯

7,0-12,0

Trietilamin / CO2

CO3¯

7,9

Amonyum bikarbonat

HCO3¯

8,0-9,2

Amonyum karbonat / amonyak

CO3¯

8,5-10,5

Etanolamin / HCl

Cl¯

8,9

Amonyum karbonat

CO3¯

6.7. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi 6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı

İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan kolonlar, kromatografi sisteminin düşük basınç altında mı, yoksa yüksek basınç altında mı gerçekleştirileceği göz önünde bulundurularak seçilir. Düşük basınç ve yüksek basınç altında gerçekleştirilen kromatografi sistemlerinde kullanılan kolonların özellikleri ise sırasıyla kısım 3.2 ve kısım 4.5’de ele alınmış olmakla birlikte, iyon değiştokuş kromatografisinde kullanılan kolonlar genellikle kısa kolonlardır. İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tipik bir kolonun yatak yüksekliği genellikle 5-15 cm’dir. Bu tipteki küçük-ölçekli uygulamalarda ayrıştırma için gerekli olan optimum koşullar belirlendikten sonra, kolon boyutları uygun ölçülerde artırılarak kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemleri için uygulanabilir. 6.7.2. İyon-değiştiricinin Miktarı ve Kapasitesi

Kullanılacak olan iyon-değiştirici materyalinin miktarı, kromatografiye tâbi tutulacak örnek materyalin miktarına ve kullanılan iyon-değiştiricinin örnek molekülleri için olan kullanılabilir veya dinamik kapasitesine bağlıdır. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile en iyi çözünürlüğün elde edilebilmesi için, kolon materyalinin kullanılabilir veya dinamik kapasitesinin %10-20’den fazlasının kullanılmaması tavsiye edilmektedir. Fakat elde edilen çözünürlüğün yeterli görüldüğü durumlarda bu oran aşılabilmektedir. Her bir özgül iyon-değiştiricinin kullanılabilir ve dinamik kapasitesi ise örnek moleküllerine, kullanılan tamponun pH ve iyonik kuvvetine bağlı olarak değişmektedir. 6.7.2.1. Kullanılabilir ve Dinamik Kapasitenin Belirlenmesi

Bir iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesi, başlangıç tamponunun pH’sının belirlenmesinde (bkz. kısım 6.6.2.1) ve örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye bağlanması ve elüsyonu için gereken iyonik kuvvetin belirlenmesinde (bkz. kısım 6.6.2.3) olduğu gibi, test-tüp metodu (bkz. Şekil 6.4,c) ile belirlenebilir: 1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır.

134

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, uygun pH’daki (örneğin pH 7) ve uygun iyonik kuvvetteki (örneğin 100 mM), 10 mL tampon ile 10 defa yıkanarak dengelenir. 4. Her bir tüpe, seri dilüsyonu hazırlanmış olan ve bilinen miktarda protein içeren sabit hacimlerde protein örneği ilave edilir. 5. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 6. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 7. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, protein derişimi için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,c’deki gibi olabilir. Şekil 6.4,c’deki hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküller için iyon-değiştiricinin 1,5 mL’si veya 0,1 g kuru formu için kullanılabilir kapasitesi ≤50 μg olmalıdır. Bir iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesini belirlemenin çok daha gerçekçi bir yolu için ise dinamik bir metodun kullanılması önerilmektedir (kullanılabilir ve dinamik kapasite tanımları için ise kısım 6.5’e bakınız). Dinamik kapasitenin belirlenmesinde kullanılması gereken ekipman tipleri ise Şekil 6.10’da gösterilmektedir. Dinamik kapasitenin belirlenmesinde, FPLC sistemleri de kullanılabilmektedir.

Şekil 6.10: Bir iyon-değiştiricinin dinamik kapasitesinin belirlenmesi için kurulan deney düzeneğinde yer alan ekipmanlar.

Dinamik kapasitenin belirlenmesi için belirli bir miktardaki jel (genellikle, 1 cm yatak yüksekliği verecek miktar yeterlidir) kolona paketlenir. Paketlenen kolon, kolondan gelen elüsyon sıvısının pH’sı başlangıç tamponunun pH’sı ile aynı oluncaya kadar yeterli miktardaki başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenir. Kolona paketlenmiş olan jelin hacmi ise kolonun iç-çapından ve jelin yatak yüksekliğinden yararlanılarak hesaplanır. Önceden paketlenmiş olan ticari, hazır kolonların kullanıldığı durumlarda ise kolondaki jel miktarı üretici firma tarafından tanımlanarak kolon ile birlikte sağlanmaktadır.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

135

Başlangıç tamponu içerisinde bulunun protein örneği (1-5 mg mL–1), örnek yükleme vanası aracılığı ile kolona yüklenir. Kolonun tamamı ile yüklendiğinden emin olmak için, kaydedici ibresinin tam ölçek değerinin %50’sine ulaşıncaya kadar örnek yükleme işlemine ara verilmemelidir (%0, başlangıç tamponunun neden olduğu sapma; %100, elüsyon sıvısının protein içerdiği zamanki sapma). Yeterli miktarda örneğin yüklendiğinden emin olduktan sonra vana, tekrar başlangıç tamponunun kolona gönderilmesini sağlayacak pozisyonuna çevrilir. Başlangıç tamponu ile yıkama işlemine, kolondan gelen tampon içerisinde neredeyse hiç protein kaydedilmeyinceye kadar (yaklaşık %0 ibre sapmasına kadar) devam edilir (Şekil 6.11).

Şekil 6.11: Dinamik kapasitenin belirlenmesi amacı ile Şekil 6.10’daki deney düzeneğinden elde edilen grafik.

Yıkama fazından sonra kolon materyaline adsorblanmış olan proteinlerin elüsyonu, basamaklı gradient uygulaması (örneğin, 2 M NaCl) ile iyonik kuvvetin veya pH’nın değiştirilmesi ile gerçekleştirilir. Fraksiyonların toplanmasına ise elüsyon sıvısının UV-absorbsiyonu, maksimum sapmanın %2’sinin üzerine düşünceye kadar devam edilir. Toplanan fraksiyonlar ise birleştirilerek, birleştirilmiş olan fraksiyonların UV-absorbansı ölçülür. Seçilmiş olan akış oranı altında, kolona adsorblanmış olan proteinin maksimum miktarı (A), eşitlik 6.1. ile hesaplanır: A=CV

(6.1)

Eşitlik 6.1’de C, birleştirilmiş olan fraksiyonlardaki protein derişimi (mg mL–1); V, birleştirilmiş olan fraksiyonların toplam hacmidir (mL). C = A280 /E

(6.2)

Eşitlik 6.2’de ise A280, 1 cm ışık yoluna sahip küvetin kullanılması durumunda solüsyonun 280 nm’deki absorbansı; E, yine 1 cm ışık yoluna sahip küvetin kullanılması durumunda standart protein solüsyonunun (1 mg mL–1) 280 nm’deki absorbansıdır. Kolonun protein kapasitesi ise eşitlik 6.3 ile hesaplanır: Kapasite = A / jel hacmi

(6.3)

Bu hesaplamada, kolon materyaline adsorblanmış olan protein elüsyonunun %100 olarak gerçekleştirildiği var sayılmaktadır. Bu durum ise kolona yüklenen protein miktarı ile kolondan gerikazanılan protein miktarı karşılaştırılarak kontrol edilebilir.

136

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

6.7.3. İyon-değiştiricinin Hazırlanması

Uygun iyon-değiştiricinin ve başlangıç tamponunun seçiminden sonra, örnek molekülleri paketlenmiş olan kolona yüklenmeden önce, kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi gerekmektedir. Ticari olarak bulunan iyon-değiştiriciler kuru formda, önceden şişirilmiş formda veya paketlenmiş formda temin edilebilirler. Kuru formda temin edilen Sephadex gibi iyon-değiştiricilerin hazırlanması, şişirilmiş formda satılan veya önceden paketlenmiş olan iyondeğiştiricilerin hazırlanmasından farklıdır. i. Şişirilmiş formdaki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: Sepharose temelli iyon-değiştiriciler, DEAE-Sephacel ve SOURCE gibi bazı iyon-değiştiriciler önceden şişirilmiş olarak kullanıma hazır şekilde satılmaktadırlar. Bu tipteki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması için, jelin içinde bulunduğu sıvı alınarak jelin çökelmesinden sonra oluşturduğu hacminin %75’ine karşılık %25 başlangıç tamponu ilave edilir. Şayet çok fazla miktardaki iyondeğiştiricinin dengelenmesi için zayıf bir tamponun kullanılması gerekiyorsa, bu durumda önce iyon-değiştiricinin doğru pH’daki ve 10 kuvvetindeki tampon ile dengelenmesi daha sonra da normal kuvvetteki başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi gerekmektedir. ii. Paketlenmiş İyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: MiniBeads, MonoBeads, Sepharose Fast Flow ve Sepharose High Performance gibi bazı iyon-değiştiricileri ise önceden paketlenmiş olarak temin edilebilmektedirler. Bu tipteki önceden paketlenmiş kolonların kullanıma hazırlanması için paketleme solüsyonu içerisindeki %20’lik etanolü uzaklaştırmak amacıyla kolonun, kolon hacminin 5-misli kadar bir başlangıç tamponu ile yıkanması yeterlidir. iii. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: Sephadex gibi kuru formda temin edilen iyon-değiştiricileri ise paketlemeden önce şişirilmelidir. Kuru formdaki iyondeğiştiricilerin şişirilmesi ise kromatografide kullanılacak olan uygun pH’daki tampon ile yapılmalıdır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin tamamen şişirilmesi, oda sıcaklığında 1-2 gün, kaynamakta olan su banyosunda (pH 7) ise yaklaşık 2 saat sürmektedir. Kuru formdaki iyondeğiştiricilerin yüksek sıcaklıkta şişirilmesi, aynı zamanda jelin havasının alınmasını da sağlamaktadır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin şişirilmesi esnasında matriksin yapısına zarar vermesi nedeni ile distile su kullanılmasından ve aşırı karıştırmadan (örneğin, manyetik karıştırmadan) sakınılmalıdır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin şişirilmesi, gereken miktardaki materyalin tartılarak başlangıç tamponu ile karıştırılması ile yapılır. Şişirme periyodu boyunca sıvı kısım dökülerek taze başlangıç tamponu ile birkaç defa yıkama yapılmalıdır. Yıkama işlemi, jelin çökelmesinden sonra oluşan süzüntünün dökülerek uzaklaştırılması yerine, jelin bir miktar şişirilmesinden sonra Büchner hunisi kullanılarak da yapılabilir. iv. Alternatif değiştirilebilen-iyonlar: Şayet, iyon-değiştirici materyaller firmalar tarafından temin edilen değiştirilebilen-iyonlardan (örneğin, Na veya Cl dışında) başka bir iyonla kullanılacaksa, aşağıdaki prosedür kullanılmalıdır:

1. İstenilen miktardaki iyon-değiştirici, kullanılacak olan yeni değiştirilebilir-iyonun tuzunu içeren 0,5-1,0 M’lık çözeltisi içerisinde süspanse edilir. 2. Jel çökeldikten sonra sıvı kısım dökülür. 3. Çökelen jel, kromatografi deneyinde kullanılacak olan başlangıç tamponu içerisinde yeniden süspanse edilir. Jelin tekrar çökelmesine izin verilerek başlangıç tamponu ile birkaç defa yıkanır.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

137

6.7.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi iyon değiş-tokuş kromatografisinde kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak incelenmiştir. 6.7.5. Örnek Materyalinin Hazırlanması ve Yüklenmesi

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin derişimi, kompozisyonu, hacmi ve viskozitesi gibi parametreler iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak incelenmiştir. Bunun yanı sıra iyon değiş-tokuş kromatografisinde örnek materyalinin hacmi, kullanılan elüsyon tipine göre değişmektedir. Örnek materyalinin hacmi: Şayet iyon değiş-tokuş kromatografisinde elüsyon, başlangıç tamponu ile gerçekleştirilecekse (izokratik elüsyon) örnek materyalinin hacmi önemlidir ve bu durumda örnek materyalinin hacmi, kolon yatak hacminin %1 ile %5’i arasında olmalıdır. Şayet bileşiklerin kolondan elüsyonunda gradient uygulaması kullanılacaksa, başlangıç koşulları ayrıştırılmak istenen bütün önemli moleküllerin kolonun üst tarafında adsorblanacak şekilde seçilmelidir. Bu durumda, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin hacminden ziyade, örnek materyalinin kütlesi çok daha önemlidir. Bunun anlamı ise jel filtrasyon kromatografisi gibi başka bir kromatografik uygulamadan elde edilen birleştirilmiş fraksiyonlar ve hücre kültür sıvıları gibi seyreltik solüsyonların büyük hacimleri, yoğunlaştırılmadan doğrudan doğruya kolona yüklenebilir demektir. Bu anlamda iyon değiş-tokuş kromatografisi, bileşiklerin fraksiyonlara ayrılmasının yanı sıra örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır.

Şayet, örnek materyalinin içerisinde bulunan kirleticilerin kolon materyaline adsorblanması ve ilgilenilmekte olan bileşiklerin ise kolona tutunmadan elüsyon sıvısı ile birlikte kolondan ayrılması isteniyorsa, bu durumda örnek materyalinin hacmi kirletici miktarından çok daha az önem kazanır. Bu koşullar altında, saflaştırılmış olan bileşiklerin derişimi gerçekleştirilemeyeceği gibi diffüzyon etkisi ile bir miktar seyrelme de meydana gelecektir. LPLC veya HPLC sistemlerinde iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak incelenmiştir. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek, örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. 6.7.6. Elüsyon i. İzokratik elüsyon: Şayet başlangıç koşullarının seçimi, sadece örnek materyalinin içinde bulunan kirleticilerin kolon materyaline adsorblanmasını sağlarken, ilgilenilmekte olan moleküllerin kolon materyaline adsorbalanmadan kolondan doğrudan doğruya elüe olmasını sağlayacak şekilde seçilmiş ise elüsyon koşullarının değiştirilmesine gerek yoktur. Aynı şekilde, şayet örnek molekülleri, başlangıç koşulları altında farklı şekilde kolonda alıkonuyorsa ve ayrıştırılabiliyorsa, yine elüsyon koşullarının değiştirilmesine gerek yoktur. Bu tipteki elüsyon prosedürü ise izokratik elüsyon olarak adlandırılmaktadır. İzokratik elüsyonun gerçekleştirildiği kromatografilerde ise kolon kromatografisi başlangıç koşullarının altında yürütülmektedir. İzokratik elüsyon, gradient oluşturmak için bir gradient karıştırıcıya gereksinme duyulmaması ve şayet izokratik elüsyonla,

138

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

kolon materyaline adsorblanmış olan örnek moleküllerinin tamamının elüsyonu gerçekleştirilebiliyorsa, kolonun rejenerasyona gereksinim duymaması nedeni ile daha kullanışlı olabilir. ii. Gradient elüsyonu: Örnek moleküllerinin ayrıştırılması ve kolondan elüsyonu, genellikle, tamponun pH’sının veya iyonik derişiminin ya da muhtemelen her ikisinin de lineer olarak değiştirilmesi ile başarılmaktadır. Tampon pH’sının veya iyonik derişiminin lineer olarak değiştirilmesi, örnek moleküllerinin kolon materyaline adsorblanmasını sağlayan fonksiyonel yüklü gruplara karşı olan affinitelerini seçici olarak düşürmektedir. Örnek moleküllerinin fonksiyonel yüklü gruplara olan affinitelerinin seçici olarak azalması ise örnek moleküllerinin kolondan farklı zamanlarda elüe olmasına yol açmaktadır. Bu tipteki elüsyon ise gradient elüsyonu olarak adlandırılmaktadır. İyon değiş-tokuş kromatografisinde gradient elüsyonu, izokratik elüsyondan çok daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, gradient elüsyonu daha detaylı olarak incelenecektir.

İyon değiş-tokuş kromatografilerinde kullanılan iyon-değiştiricinin tipine bağlı olarak, uygulanan gradientin yönü de değişmektedir. Bu nedenle genellikle, anyon-değiştiricilerle azalan pH gradienti ve artan iyonik derişim gradienti uygulanırken; katyon-değiştiriciler için ise pH ve iyonik derişim gradientlerinin her ikisi de artan gradient şeklinde uygulanır. Örnek materyalinde bulunan moleküllerin kolon materyaline olan affiniteleri, genellikle farklıdır. Bu affinite farklılıklarından dolayı, hareketli faz olarak kullanılan tamponun pH’sında veya iyonik derişiminde meydana gelen bir değişiklik, örnek moleküllerinin farklı zamanlarda elüsyonuna ve bunun sonucu olarak da örnek moleküllerinin birbirlerinden ayrılmalarına yol açmaktadır. Gradient elüsyonunun uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı pH veya iyonik derişim gradientleri şeklindedir. Gradient elüsyonu, zonların keskinleşmesine neden olduğu için genellikle elüsyon esnasında geliştirilmiş çözünürlükle sonuçlanmaktadır. Fakat lineer gradientler, düşük pik kuyruklanması ile daha iyi çözünürlük verme eğilimindedirler (bkz. kısım 2.7). Buna rağmen, gradient elüsyonunun uygulanmasında farklı metotlar kullanılabilmektedir: a. pH gradienti ile elüsyon: Şekil 6.3’de de gösterildiği gibi bir molekülün net yükü, molekülün bulunduğu ortamın pH’sına bağlıdır. Bu nedenle, bir molekülün bulunduğu ortamın pH’sını o molekülün izoelektrik noktasına doğru değiştirmek, molekülün net yükünün sıfıra doğru yaklaşmasına ve sonuçta izoelektrik noktasındaki pH değerinde ise net yükünün sıfır olmasına yol açmaktadır. Bir molekülün net yükü sıfıra doğru yaklaştıkça, o molekülün iyon-değiştiriciye olan affinitesi azalmakta ve sonuçta adsorblanmış olduğu kolon materyalinden ayrılarak kolondan elüe olmaktadır (Şekil 6.12). Proteinlerin çoğu, kendi izoelektrik noktaları civarında minimum çözünürlüğe sahip olduklarından, kolon içerisindeki protein moleküllerinin çökelerek kolon içinde kalmamaları için gerekli önlemlerin alınması gerekmektedir. Bu amaçla, kromatografinin gerçekleştirilmesi esnasında kullanılacak olan pH ve iyonik derişimde, örnek moleküllerinin çözünürlüğü önceden test edilmelidir.

pH gradientinin uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı gradient şeklinde gerçekleştirilir: • Lineer pH gradienti: Pratikte, kolon materyaline adsorblanmış olan protein moleküllerinin elüsyonunda lineer pH gradientinin uygulanması, genellikle iyi bir sonuç vermemektedir. Bunun nedeni ise çok yüksek bir tamponlama kapasitesinin bulunmaması durumunda, proteinler elüe olduklarında, aniden çok yüksek pH değişikliklerinin olmasıdır. pH’da meydana gelen ani değişikliklerin nedeni ise sabit bir iyonik kuvvette, lineer bir pH gradientinin oluşturulmasının oldukça zor olmasıdır. Proteinlerin elüsyonu sırasında pH’da meydana gelen yüksek değişiklik sonucunda ise ayrıştırılması yapılacak olan proteinler arasında çok az bir ayrışma meydana gelmektedir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

139

Şekil 6.12: Haemosiyanin fraksiyonlarının DEAE-Sepharose CL-6B ile ayrıştırılması. Örnek, sodyum fosfat tamponu (100 mM, pH 6,8) içerisinde kolona yüklenmiş ve elüsyon, azalan pH gradienti ile gerçekleştirilmiştir. pH değişikliğ kesikli çizgi (-----) ile gösterilmiştir (Lamy ve ark., 1979).

Lineer pH gradientlerinin oluşturulması ise iki farklı pH’daki tamponların, lineer hacim oranlarında karıştırılması ile elde edilemez. Çünkü, karışım sonucunda oluşan sistemlerin tamponlama kapasiteleri pH’ya bağlıdır. Göreceli olarak daha lineer pH gradientlerinin oluşturulması ise, daha dar pH aralıklarında (maksimum 2 pH birimi) sağlanabilir. Bunun için aynı tamponun iki ayrı solüsyonu hazırlanır. Fakat bu solüsyonlardan birisinin içeriği, tamponun pKa değerinin 1 pH birimi altında, diğerininki ise 1 pH birimi üstünde ayarlandıktan sonra, bu iki solüsyonun karıştırılması ile göreceli olarak daha lineer pH gradienti oluşturulur. Lineer pH gradienti ile yüksek çözünürlükte bir elüsyonun gerçekleştirilmesi ise tamponlama kapasitesini maksimuma çıkaran tampon sistemlerinin ve kuvvetli iyon-değiştiricilerin kullanılması ile sağlanabilir. Bu elüsyon tekniği ise kromatofokusing olarak adlandırılan ve kendi adı ile anılan bir kromatografi tekniğinin doğmasına yol açmıştır (bkz. 7. Bölüm). • Basamaklı pH gradienti: Basamaklı pH gradienti, hem gradientin oluşturulması açısından kolaydır hem de sonuçların tekrarlanabilirliği açısından, lineer pH gradientine göre daha uygundur. pH gradientleri aynı zamanda iyonik derişim gradientleri ile birlikte de kullanılabilirler. b. İyonik derişim gradienti ile elüsyon: Düşük iyonik kuvvette, moleküllerin iyondeğiştiricinin yüzeyindeki fonksiyonel iyonik gruplara karşı olan affinite rekabetleri minimumdur. Minimum affinite rekabetlerinin sonucu olarak da moleküller, iyon-değiştiriciye çok sıkı olarak bağlanırlar. İyonik kuvvetin artırılması ise moleküllerin, fonksiyonel yüklü gruplar için olan affinite rekabetlerini artırırken, moleküller ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimin azalmasına yol açar. Moleküller ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimin azalması ise moleküllerin elüsyonu ile sonuçlanır. Örneğin, E. coli tarafından üretilen β-galaktozidaz enziminin izolasyonunda, NaCl derişim gradienti kullanılmaktadır (Şekil 6.13).

İyonik derişim gradientinin uygulanması da pH gradientinde olduğu gibi ya lineer ya da basamaklı gradient şeklinde gerçekleştirilir: • Lineer iyonik derişim gradienti: İyon değiş-tokuş kromatografisinde en sık kullanılan elüsyon tipi, hazırlanmasının kolaylığı ve tekrarlanabilirliği nedeni ile lineer iyonik derişim gradientidir (bkz. Şekil 6.13,a). Farklı iyonik derişimdeki iki tampon, ki bu tamponlardan birisi başlatıcı (verici haznede bulunan) diğeri ise sonlandırıcı (alıcı haznede bulunan) tampon olarak adlandırılır, lineer olarak değişen hacim oranlarında karıştırıldığında, iyonik derişim de lineer olarak değişmektedir. Sonlandırıcı tampon, başlatıcı tampon ile aynı tampon tuzlarından ve pH’dan oluşabilir fakat, derişimi daha yüksektir veya NaCl gibi ilave tuz içerebilir.

140

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 6.13: E. coli β-galaktozidazının (a) lineer ve (b) basamaklı NaCl gradienti ile ayrıştırılması. Tampon-A: 50 mM MES, pH 6,0, 1 mM MgCl2 ve 1 mM DTT’den oluşmaktadır. Lineer gradient: 30 mL tampon-A içerisinde 0-1 M NaCl ile; basamaklı gradient ise NaCl’ün 3 mL tampon-A içerisindeki 0-0,25 M, 6 mL tamponA içerisindeki 0,25 M, 7 mL tampon-A içerisindeki 0,3 M, 6 mL tampon-A içerisindeki 1 M olarak uygulanması ile gerçekleştirilmiştir. Tuz derişimi kesikli çizgi (-----) ile gösterilmiştir. Kullanılan kolon: Mono Q HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1 (Motorin ve ark., 1987).

• Basamaklı iyonik derişim gradienti: Basamaklı iyonik derişim gradienti, aynı tamponun farklı iyonik derişimlerindeki solüsyonlarının arkası arkasına bir seri oluşturacak şekilde kullanılması ile oluşturulur (bkz. Şekil 6.13,b). Basamaklı iyonik derişim gradientinin uygulanması teknik açıdan oldukça kolay olduğu gibi preparatif uygulamalarda oldukça yüksek çözünürlük de sağlamaktadır. Basamaklı iyonik derişim gradientinin uygulanmasında, basamakların hangi aralıklarla seçileceği ve pH veya iyonik derişimin aniden değişmesi nedeni ile elüe olan bileşiklerin birbirlerine oldukça yakın olabileceği de göz önünde bulundurularak, sonuçların değerlendirilmesinde dikkatli olunmalıdır. Elüsyon pikleri, keskin başlangıç hatlarına sahip olmakla birlikte, çoğunlukla birden fazla bileşik içermeleri nedeni ile kuyruklanmalar göstermektedirler. Şayet tampon değişiklikleri çok erken uygulanırsa, pik kuyruklanmaları yalancı piklerin oluşmasına da yol açabilmektedir. Bu nedenlerden dolayı, örnek bileşikleri hakkında bir fikir edinmek ve uygulanacak basamakları belirlemek amacı ile örnek bileşiklerinin ayrılmasında basamaklı gradientten önce, lineer gradientin kullanılması önerilmektedir. 6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması i. Rejenerasyon: Paketlenmiş olan kolon, her bir kullanımdan sonra, iyon-değiştiricinin orijinal fonksiyonunu geri-kazandırmak amacı ile rejenere edilmelidir. Rejenerasyon, kolon materyaline bağlı kalmış olan moleküllerin kolondan uzaklaştırılması amacı ile her kromatografi işleminden sonra kolonun, iyonik derişimi yaklaşık 2 M’a kadar olan tampon ile yıkanması ile sağlanır. Genellikle 2 M’lık tuz derişimi, iyon-değiştiricinin fonksiyonel yüklü gruplarına bağlanmış olan bütün moleküllerin uzaklaştırılması için yeterli olmaktadır. Rejenerasyon için kullanılan tuz ise iyon-değiştirici materyalin yeniden dengelenmesini sağlamak için değiştirilebilen-iyon (örneğin Na+ veya Cl–) da içermelidir.

Zamana bağlı olarak, kolon materyaline bağlanmış olan kirleticilerin birikmesini önlemek amacı ile kolon, belirli aralıklarla daha sert koşullarda temizlenmelidir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

141

ii. Kolonun temizlenmesi: Yerinde-temizleme olarak adlandırılan proses ile kolon sisteminde daha önceki kullanımlar nedeni ile kolon materyaline sıkı bir şekilde bağlanmış, çökelmiş veya denatüre olmuş bileşiklerin uzaklaştırılması amaçlanmaktadır. Bazı uygulamalarda, denatüre olmuş proteinler, lipoproteinler ve lipitler gibi bazı bileşikler, kolonun rejenerasyonu sırasında kolondan elüe olmak yerine, kolon yatağı içerisinde kalabilirler. Bu tipte kolon yatağı içerisinde kalan bileşikler zamanla kolonda biriktikleri zaman, kolonun ayrıştırma özelliklerini olumsuz yönde etkileyebilirler. Şayet, kolon yatağında yoğun bir kirlenme meydana gelmiş ise bu kirlenme aynı zamanda, kolonun tıkanmasına yol açarak, geri-basıncın artmasına neden olabilir. Geri-basıncın artması ise hareketli fazın kolon yatağı boyunca akış oranını etkileyecektir.

Bir kolonun yerinde-temizlenmesi için gereken protokol ise örnek materyalinin içinde bulunan kirleticilerin tipine göre dizayn edilir. Örneğin, NaOH, kolon yatağı içerisinde çökelmiş proteinlerin ve lipitlerin geri-dönüşümsüz olarak çözünür hale getirilmesi için iyi bir temizleme ajanıdır. Ayrıca NaOH, çözücülerin (%70 etanol veya %30 isopropanol) veya deterjanların (örneğin, 1 M asetik asit içinde %0,5 iyonik-olmayan deterjan) kullanıldığı temizleme metotları ile birlikte de kullanılabilmektedir. iii. Sanitizasyon: Kolon yatağında bulunan mikroorganizmaların inaktivasyonunu sağlamak için ise kolon materyalinin sanitizasyonu gerekmektedir. Sanitizasyon ise kolonun bir sanitizasyon ajanı ile yıkanması ile sağlanır. Böylece, kolondan elüe edilmiş olan örnek proteinlerinin mikroorganizmalarla kontamine olma riski azaltılabilir. Günümüzde ise kromatografik sistemlerin sanitizasyonunda en sık kullanılan metod, kolon yatağının NaOH ile yıkanmasıdır. NaOH ise hem kolon yatağının sanitizasyonu için iyi bir ajanıdır, hem de kolon yatağının temizlenmesini sağlamaktadır. iv. Sterilizasyon: Sanitizasyon ile aynı anlamda olmayan sterilizasyonda, kolon sistemi içerisinde bulunan bütün mikroorganizmaların öldürülmesi veya elemine edilmesi amaçlanmaktadır. v. Kolonun ve kolon materyalinin korunması: Kolon materyali içerisinde meydana gelen bakteriyel veya mikrobiyal büyüme, kolona yüklenmiş olan örnek materyali için tehlikeli olabileceği gibi paketlenmiş olan kolon materyalinin kromatografik özelliklerini de olumsuz olarak etkileyerek, hareketli faz akışının düzensiz olmasına yol açabilir. İyon-değiştirici materyallerin depolanması esnasında mutlaka bir anti-mikrobiyal ajan eklenmelidir. Eklenmiş olan anti-mikrobiyal ajanın elüsyonu ise, örnek materyali kolona yüklenmeden önce, kolon materyalinin dengelenmesi için yapılan yıkama sırasında gerçekleştirilebilir. Anti-mikrobiyal ajan olarak anyon-değiştirici materyaller için kolon, 200 mM’lık asetat içerisinde %20 etanol ile dengelenirken; katyon-değiştirici materyaller için kolon, 10 mM’lık NaOH içerisinde %20 etanol ile dengelenir.

Kullanılmış olan iyon-değiştiriciler ise uygun bir anti-mikrobiyal ajanın varlığında, +4 °C ile +8 °C arasında depolanmalıdır. İster kullanılmış olsun ister henüz kullanılmamış olsun, kolon materyallerinin donmasına izin verilmemelidir. Çünkü donma esnasında meydana gelen buz kristalleri, kolon materyallerinin yapılarının bozulmasına yol açabilmektedir. 6.9. IEC Uygulama Örnekleri

İyon değiş-tokuş kromatografisi, uygulanmaya başlandığı 1960’lı yıllardan bu yana biyomoleküllerin saflaştırılmasında ve fraksiyonlanmasında temel kromatografik metotlardan birisi olmuştur. Bu nedenle iyon değiş-tokuş kromatografisi, biyomoleküllerin fonksiyonlarını anlamamıza önemli bir katkı sağlamıştır. Bu kısımda ise iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılarak fraksiyonlanmış olan bazı biyomoleküllere örnekler verilmektedir. Özgül bir biyomolekülün ayrıştırılarak saflaştırılması için gerekli kromatografik yöntemin ve koşulların seçiminde ise literatür taraması yapılarak, başarılı bir şekilde uygulanmış olan ayrıştırma yöntemleri göz önüne alınmalıdır.

142

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

i. Enzimler: Enzimler gibi biyoaktif proteinlerin saflaştırılmasında, biyomoleküllerin homojen olarak saflaştırılması kadar, aktivitenin geri-kazanılması da oldukça önemlidir. Günümüze kadar yapılmış olan çalışmalar sonucunda, binlerce enzimin saflaştırılmış olarak elde edilmesinde iyon değiş-tokuş kromatografisi oldukça önemli bir rol oynamıştır. Şekil 6.14’de ise Trichoderma reesei tarafından üretilen selülaz enziminin iki adımında saflaştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanımı görülmektedir.

Şekil 6.14: Trichoderma reesei tarafından üretilen selülaz enziminin iki adımında saflaştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanımı. (a) Örnek materyal: Tampon-A içerisinde 500 μL (2,5 mg) ham T. reesei selülazı. Kolon: Mono Q HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,6. Tampon-B: Tampon-A + 0,5 M NACl. Gradient: 4 dk %0 B; 21 dk %0-40 B; 15 dk %40-100 B. (b) Örnek materyal: (a)’daki 3. pik. Kolon: Mono S HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM asetat, pH 3,6. Tampon-B: Tampon-A + 0,2 M NACl. Gradient: 26 dk %0-100 B. (Anonymous, 1995).

ii. İzoenzimler: Normalde bir enzimin izomerleri, aynı moleküler büyüklüğe sahiptirler. Bu nedenle, izoenzimlerin ayrıştırılması jel filtrasyon kromatografisi ile başarılamaz. Buna rağmen izomerlerin amino asit kompozisyonlarındaki tek bir amino asit farklılığı dahi bu izomerlerin çok küçük dahi olsa farklı yük özelliklerine sahip olmasını sağlar. Farklı yük özelliklerine sahip izoenzimler ise iyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılabilirler (Şekil 6.15).

Şekil 6.15: Lösemili bir hücreden N-asetil β-D-glukozaminidaz enziminin izomerlerinin anyon değiş-tokuş kromatografisinde NaCl gradienti ile ayrıştırılması (Scott ve ark., 1987).

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

143

Hematolojik malignansinin tanımlanmasında N-asetil β-D-glukozaminidaz, çok sık araştırılmış bir enzimdir. Akut lemfoblastik lösemi vakalarında ise “intermediate 1 form” olarak adlandırılan bir izoenzim rapor edilmiştir (Scott ve ark., 1987). Önceleri sadece izoelektrik odaklama tekniği ile bileşenlerinin belirlenebildiği, fakat kromatografik yöntemlerde tek bir pik olarak görülen bu enzimin izomerleri, yüksek çözünürlüklü iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanılması ile ayrıştırılabilmiştir (bkz. Şekil 6.15). iii. İmmünoglobülinler: İmmünoglobülinlerin ayrıştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinden sıklıkla yararlanılmaktadır. Şekil 6.16’da, karın boşluğu sıvısından fare monoklonal IgG1’in saflaştırılması görülmektedir.

Şekil 6.16: Karın boşluğu sıvısından fare monoklonal IgG1’in iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılması. Örnek materyal: Fare karın boşluğu sıvısı (15 mL). Kolon: XK 16/10. Jel: Q Sepharose High –1 Performance. Akış oranı: 2 mL dk . Tampon-A: 50 mM TEA, pH 8,0. Tampon-B: Tampon-A + 0,35 M NACl. Gradient: 20 dk %0 B; 140 dk %0-70 B; 40 dk %100 B. (Anonymous, 1995).

iv. Polipeptidler: İyon değiş-tokuş kromatografisi, her türlü biyomoleküllerin ayrıştırılmasında kullanılabildiği için polipeptidler ve amino asitler gibi moleküllerin ayrıştırılmasında da sıklıkla kullanılan bir kromatografi tekniğidir. Bu nedenle, Şekil 6.17’de görüldüğü gibi iyon değiş-tokuş kromatografisi, siyanojen bromid içeren kollajen fragmentlerinin ayrıştırılmasında olduğu gibi peptidlerin ayrıştırılmasında da kullanılmaktadır.

Şekil 6.17: Kollajen tip-1’in α-zincirlerinden CNBr-peptid fragmentlerinin ayrıştırılması. Örnek materyal: 2 mL Tampon-A içerisinde 36 mg. Kolon: XK 16/10. Jel: SP Sepharose High Performance. Akış oranı: 3 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM HCOOH, 2 M Üre, pH 3,8. Tampon-B: Tampon-A + 1 M NaCl. (Anonymous, 1995).

144

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Amino asitlerin ayrıştırılması (örneğin, bir protein hidrolizatında) genellikle güçlü, asidik katyon-değiştiricilerle sağlanır. Örnek materyali içindeki bütün değişik amino asit tiplerinin kolon materyaline tamamen bağlanmasını sağlamak amacı ile örnek materyalinin kolona yüklenmesi, pH 1-2’de gerçekleştirilir. pH ve iyonik derişimi artırarak yapılan gradient elüsyonu, amino asitlerin sıra ile elüe edilmesi ile sonuçlanır. Asidik amino asitler olan aspartik ve glutamik asit, ilk başta elüe olurlar; bunu takiben glisin ve valin gibi nötral amino asitler elüe olurlar. Lizin ve arjnin gibi temel amino asitler ise net pozitif yüklerini pH 9-11 değerine kadar yitirmediklerinden en son olarak elüe olurlar. Bu prensipler ise otomatik amino asit analizatörlerinin temel çalışma prensibini oluşturmaktadır. Peptid haritalama çalışmalarında ise iyon değiş-tokuş kromatografisinin, ters-faz kromatografiyi tamamlayıcı olarak kullanılması, her iki tekniğin de yüksek çözünürlük sağlamasına rağmen, ayrıştırma parametrelerinin farklı olması nedeni ile bir avantaj oluşturmaktadır. v. Nükleik asitler ve nükleotidler: Nükleik asitler ve polinükleotidler, yüklü moleküller olmaları nedeni ile iyon değiş-tokuş kromatografisi ile fraksiyonlanarak saflaştırılabilirler. Örneğin, plazmid DNA’larının ayrıştırılmasında kullanılan geleneksel CsCl gradienti içinde santrifüjleme yöntemi yerine, pBR322 plazmidinin bakteriyel kültürlerden ayrıştırılmasıında anyon değiş-tokuş kromatografisi kullanılmıştır (Şekil 6.18). Anyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılması yapılan pBR322 plazmidinin elektroforetik saflığının, ligasyondaki davranışının ve transformasyonunun ise CsCl gradient yöntemi ile elde edilen plazmid ile aynı olduğu belirlenmiştir. Bunun yanı sıra, CsCl gradient yöntemi ile plazmid ayrıştırması yaklaşık 8 saat sürmesine rağmen, kromatografik yöntemle ortalama 1 saat sürmektedir.

Şekil 6.18: pBR322 plazmid DNA’sının iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılması. Örnek materyal: 400 mL bakteriyel kültür sıvısına karşılık gelen 2 mL pBR322 alkalin özütü. Kolon: HiLoad 16/10 Q Sepharose High Performance. Tampon-A: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,7 M NaCl, pH 8,0. Tampon-B: 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,85 M NaCl, pH 8,0. Akış oranı: 5 mL dk–1. (Anonymous, 1995).

Polipeptidlerin iyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılması prensibine benzer şekilde, DNA molekülünün restriksiyon enzimleri ile parçalanması sonucunda meydana gelen fragmentler, hatta her bir nükleotid dahi bu kromatografik teknikle ayrıştırılabilmektedir.

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ (KROMATOFOKUSİNG)

7.1. Giriş

Protein moleküllerinin yüzeyindeki elektriksel yükler, proteinleri saflaştırmada kullanılan stratejilerin ve metotların dizaynında yararlanılan özgül özelliklerinden birisini oluşturmaktadır. Proteinlerin elektriksel yüklerine dayalı olarak ayrıştırılması, tamamı ile proteinlerin amino asit kompozisyonuna ve dizilimine bağlı olan asit-baz özelliklerine dayalıdır. Protein moleküllerinin yüzeyindeki elektriksel yükler ise proteinlerin içinde bulunduğu solüsyonun pH’sı tarafından etkilenmektedir. Düşük veya asidik pH’da proteinlerin çoğu net pozitif elektriksel yüke sahip olma eğiliminde iken, yüksek veya bazik pH’da ise net elektriksel yükleri genellikle negatiftir. Hem pozitif hem de negatif elektriksel yüke sahip olan proteinler ise elektriksel alanda hareket etmektedirler. Buna rağmen, proteinler belirli bir pH’da net bir elektriksel yük taşımazlar ve bu durumda iken elektriksel alanda hareket etmezler. Bir proteinin net bir elektriksel yük taşımadığı pH değeri ise o proteinin izoelektrik pH’sı veya izoelektrik nokta’sı (pI) olarak adlandırılmaktadır. Protein moleküllerinin elektriksel yük özellikleri, proteinin içinde bulunduğu solüsyonda yer alan değiştirilebilir-iyonların protein moleküllerine bağlanmasına da izin vermektedir. Aynı şekilde, elektriksel olarak yüklü bir protein molekülü de proteinin net yükünün zıttı bir yüke sahip olan reçinelerin yüzeyine veya herhangi bir destek materyaline bağlanmaktadır. Protein moleküllerinin elektriksel yük taşıma özellikleri, elektriksel olarak yüklü olan proteinlerin, elektriksel alanda göç etmeleri ve protein molekülleri arasında meydana gelen veya protein molekülleri ile reçineler arasında oluşan elektrostatik etkileşimler, protein saflaştırma ve karakterizasyonunda oldukça güçlü birer teknik olan elektroforez ve iyon değiş-tokuş kromatografilerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Proteinlerin izoelektrik pH’larından ise proteinlerin saflaştırılması amacı ile geliştirilmiş olan izoelektrofokusing ve kromatofokusing tekniklerinde yararlanılmaktadır. Bu nedenle, özellikle protein saflaştırma işlemleri için daha yeni bir kromatografi tekniği olan kromatofokusing, prensipte izoelektrik odaklamaya (izoelektrofokusing) benzemektedir. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile kromatofokusing veya izoelektrofokusing tekniği, ilk defa Sluyterman ve arkadaşları tarafından 1978 yılında tanımlanmıştır. Bu araştırmacılar, iyi bir tamponlama kapasitesine sahip olan bir iyon-değiştirici jel (bkz. kısım 6.3) ile paketlenmiş kolon boyunca pH gradienti oluşturulmasını amaçlamışlardır. Bir kolon içerisindeki pH gradienti ise bir kolon içerisinde oluşturulan tuz gradientine benzer mantıkla oluşturulabilir (bkz. kısım 7.2.1). Proteinlerin kolondan elüsyonu sırasında oluşturulan pH gradientinin non-lineer olması durumunda, kromatogramın bazı bölgelerinde çözünürlük oldukça zayıf olmaktadır. Bu nedenle, optimal bir çözünürlük için elüsyon esnasında lineer pH gradientinin oluşturulması gerekmektedir. Lineer bir pH gradientinin oluşturulması ise hem elüsyon tamponunun hem de iyon-değiştirici jelin, geniş bir pH aralığı boyunca düzenli bir tamponlama kapasitesine sahip olmasını gerektirmektedir.

146

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şayet, iyon-değiştirici jele bağlanmış olan proteinin elüsyonunda böyle bir pH gradienti kullanılmış ise kolondan proteinlerin elüsyonu, bu proteinlerin izoelektrik sıralarına göre olacaktır. Bu proses esnasında ise bir odaklama etkisi meydana gelecek ve bunun sonucunda da bantlarda bir keskinleşme, derişim ve farklı pI noktalarına sahip olan proteinlere ait piklerde de çözünürlüğün artmasına yol açacaktır. 7.2. Odaklama Kromatografisinin Mekanizması 7.2.1. pH Gradientinin Oluşturulması

İyon değiş-tokuş kromatografisinde pH gradienti, normalde bir gradient karıştırıcı kullanılarak oluşturulabilir. Azalan bir pH gradienti için, gradient karıştırıcının alıcı haznesi yüksek pH değerindeki bir başlangıç tamponu ile doldurulurken, verici hazneye ise daha düşük pH değerine sahip olan sınırlayıcı tampon eklenir (bkz. kısım 3.9 ve kısım 6.7.6). Alıcı hazneden çıkan solüsyon kolona gönderildikçe, verici haznedeki düşük pH’lı sınırlayıcı tamponun daha fazlası alıcı hazneye geçer ve kolondan ayrılan elüsyonun pH’sı dereceli olarak düşer (Şekil 7.1,a). Buna rağmen, sabit bir iyonik kuvvette, lineer bir pH gradientinin oluşturulması oldukça zordur (bkz. kısım 6.7.6). Kromatofokusingde, lineer bir pH gradientinin oluşturulması amacı ile pH 5-10 arasında oldukça geniş bir titrasyon aralığına sahip bir anyon-değiştirici ile birlikte, amfolitler olarak adlandırılan polimerik tamponlar kullanılmaktadır. Böylece, kolona paketlenmiş olan iyon-değiştirici jel üzerindeki yüklü grupların tamponlama kapasitesinden yararlanılarak, iyon değiştiricinin elüsyon tamponu ile titrasyonu sonucunda kolon içerisinde otomatik olarak pH gradienti oluşturulmaktadır. İyon-değiştirici jel üzerindeki yüklü grupların tamponlama kapasitesinden yararlanılarak, kolon içerisinde pH gradientinin oluşturulması ise Şekil 7.1,b’de diyagramatik olarak görülmektedir.

Şekil 7.1: (a) İyon değiş-tokuş kromatografisi ve (b) kromatofokusing esnasında, pH gradientinin oluşmasının diyagramatik açıklaması.

Örnek bir pH gradientinin oluşturulmasına ise pH 9-6 gradientinin oluşturulmasını verebiliriz. Azalan bir pH gradienti için kolonun pH’sının, elüsyon sıvısının pH’sından yüksek olması gerekir. İyon-değiştirici üzerinde bazik bir tamponlama grubuna gereksinim duyulacağından, kolon materyali olarak bir anyon-değiştirici jel seçilmelidir. Anyon-değiştirici jel olarak ise PBE 118, PBE 94, DEAE-BioGel A, DEAE-Toyopearl 650 M gibi jeller seçilebilir (bkz. kısım 7.3). Burada ele alınan örnek için ise PBE 94 jelinin seçilmesi uygun olacaktır. Kolon içerisine paketlenmiş olan PBE 94 materyali, önce pH 9’a dengelenir. Gradient karıştırıcıdaki sınırlayıcı

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

147

tampona denk gelen elüsyon tamponunun pH değeri ise 6 olacak şekilde ayarlanır. Bu elüsyon tamponu ise elektriksel olarak farklı yüklere sahip olan oldukça fazla sayıda türler içeren bir polimerik tampon olmalıdır. Elüsyon sıvısı içerisindeki farklı yüklere sahip olan bu türler kolondan aşağıya doğru hareket ettikçe, en asidik olan bileşikler bazik olan anyon-değiştiriciye bağlanırlar. Elüsyon işleminin ilk aşamalarında kolondan ayrılan solüsyonun pH değeri ise başlangıç pH’sına yakındır (Şekil 7.2,a). Elüsyon işlemi ilerledikçe (Şekil 7.2,b ve c), kolona daha fazla polimerik tampon eklendikçe, kolonun her bir noktasının pH’sı da dereceli olarak düşer. Elüsyonun son adımında ise (Şekil 7.2,d) neredeyse kolonun tamamı elüsyon tamponu ile dengeye ulaşacağından, kolondan ayrılan elüsyon sıvısının pH değeri, kolonun üst kısmından eklenen polimerik (elüsyon) tamponun pH değerine eşit olacaktır. Kolondan ayrılan elüsyon sıvısında meydana gelen pH gradienti ise Şekil 7.2,e’de görülmektedir.

Şekil 7.2: PBE 94 ile paketlenmiş bir kolonda, elüsyon tamponu olarak Polybuffer 96 kullanılarak oluşturulan pH gradienti (pH 9-6). (a), (b), (c) ve (d) elüsyon prosesinin farklı aşamalarını temsil etmektedir. (e) Elüsyon hacmine bağlı olarak, kolondan ayrılan elüsyon sıvısının pH değeri.

7.2.2. Proteinlerin Davranışları

Bir protein molekülü üzerindeki elektriksel yükler, bu proteinin izoelektrik noktasına ve proteinin içinde bulunduğu solüsyonun pH’sına bağlıdır. Bu nedenle, kromatofokusing prosesi esnasında pH gradientinin meydana gelmesi ile birlikte, örnek materyali içerisinde bulunan protein moleküllerinin elektriksel yük durumları da sürekli olarak değişmektedir. Böylece, azalan pH gradientinde bir protein molekülünün elektriksel yükü negatiften nötrale, nötralden ise pozitife değişmektedir. Pozitif olarak yüklü fonksiyonel gruplar taşıyan bir kolon materyali (anyon-değiştirici) ile paketlenmiş olan bir kolon, yüksek pH değerine sahip olan bir başlangıç tamponu ile dengelendiğinde ise örnek materyali içerisinde yer alan ve negatif olarak yüklü olan protein molekülleri jele adsorblanacaklardır. Daha düşük bir pH değerine sahip olan elüsyon tamponu kolondan geçirildiğinde ise kolon içerisinde bir pH gradienti meydana gelecek ve protein moleküllerinin elektriksel yükleri değişecektir. Kolonda meydana gelen pH gradienti kolonun alt kısımlarına doğru ilerledikçe, proteinlerin bulundukları çevrenin pH’sı, proteinlerin izoelektrik noktalarına eşit ya da daha küçük olduğunda ise proteinler, adsorblanmış oldukları jelden ayrılacaklardır. Jelden ayrılan proteinler ise elüsyon sıvısının akışı ile birlikte kolonun altına doğru

148

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

göç edeceklerdir. Buna rağmen, protein molekülleri elüsyon sıvısı ile birlikte kolonun altına doğru göç ederlerken, kolonun tepe noktasından itibaren proteinlerin içinde bulunduğu çevrenin pH değeri de artmaktadır (Şekil 7.3). Böylece, kolon boyunca pH gradientinin oluşması esnasında elüsyon tamponu ile birlikte göç eden proteinin bulunduğu çevrenin pH’sı, proteinin izoelektrik noktasından daha büyük olduğunda ise proteinin elektriksel yükü tekrar tersine dönerek jele yeniden adsorblanacaktır. Bu proses, proteinin izoelektrik noktasının çok az altındaki bir pH’da, proteinin elüe olmasına kadar sürekli olarak tekrarlanacaktır. Örnek materyali içinde bulunan ve farklı izoelektrik noktalarına sahip olan protein molekülleri ise jele adsorblanmadan önce, kolon boyunca farklı mesafelerde hareket edeceklerdir. Bu protein moleküllerinin elüsyonu ise izoelektrik noktalarının sırasına göre gerçekleşecektir (Şekil 7.3). Akış oranı

Göç oranı Protein A

+

+

+ + + + +

6

+ + +

+

Protein C

Protein B

+ 7

+

+ pH

+ + + + + + 8

+

+

+

+

9

Şekil 7.3: Protein moleküllerinin kromatofokusingdeki davranışları. Elüsyon esnasında pH, kolonun tepe noktasından altına doğru artmaktadır. pH gradientinde, kendi izoelektrik noktalarından daha büyük bir pH’da bulunan proteinler negatif olarak yüklü olduklarından jele bağlanmaktadırlar. Kendi izoelektrik noktalarından daha düşük bir pH’da bulunan proteinler ise pozitif olarak yüklü olduklarından jel tarafından itilmektedirler. Kendi izoelektrik noktalarına eşit bir pH’da bulunan proteinler ise nötral olduklarından, ne jele adsorblanırlar ne de jel tarafından itilirler. Buradaki protein A’nın hipotetik pI = 6,5; protein B’nin pI = 7,5; protein C’nin pI = 8,5’dir. Kesikli oklar, hareketli fazın akış oranı ile pI noktalarındaki proteinlerin göç hızlarını temsil etmektedir.

7.2.3. Odaklama Etkisi

Kolona yüklenmiş olan örnek materyalinin oluşturduğu zonun arkasında bulunan protein molekülleri, düşük pH’lı elüsyon tamponu ile ilk olarak titre edilecekler ve yük durumlarının değişmesi nedeni ile adsorblanmış oldukları jel tarafından itileceklerdir. Bunun sonucunda da elüsyon tamponunun akış oranının hızlı olması nedeni ile, örnek zonunun ön kısmına taşınacaklardır. Örnek zonunun ön kısmına göç eden moleküller ise daha yüksek bir pH ile karşılaşacaklardır. Daha yüksek bir pH’da ise bu proteinlerin elektriksel yükü pozitiften nötrale, nötralden ise negatife dönüşecektir. Protein moleküllerinin yükü tekrar negatife dönüştüğünde ise jele adsorblanacaklar ve tekrar örnek zonunun arkasında kalacaklardır. Örnek materyalinde bulunan protein moleküllerinin, örnek zonunun bir arkasında bir önünde yer alması ise bu proteinlerin oluşturdukları bantların kolondan elüsyonu gerçekleşinceye kadar devamlı olarak daralmasına yani odaklamaya (fokusing) yol açmaktadır. Ayrıca, proteinlerden oluşan bir karışımda her bir protein molekülü, kendisinin izoelektrik noktası doğrultusunda elüe olacağından, bu elüsyon prosesi sırasında kolonun üstünden daha fazla proteinin eklenmesi sonucunda, yeni eklenen protein molekülleri otomatik olarak başlangıçta eklenen protein moleküllerinden aynı olanlara yetişecektir (Şekil 7.4). Çünkü, daha önce yüklenmiş olan örnek içerisindeki proteinler kendi izoelektrik pH’larına geldiğinde, elüsyon sıvısının içinde elüsyon sıvısının akış oranı ile aynı hızda göç eden moleküllere göre çok daha yavaş hareket edeceklerdir. Bu nedenle, sonradan yüklenen örnek içerisindeki proteinler aynı izoelektrik noktaya

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

149

sahip olan birinci yüklemedeki proteinlere yetişeceklerdir. Dolayısıyla hiçbir zararlı etki oluşturmadan, odaklama etkisi meydana gelecek ve kolona büyük hacimlerin uygulanmasını olanaklı kılacaktır. Bundan dolayı kromatofokusing tekniği, yüksek bir kapasiteye sahiptir. Kromatofokusing, izoelektrik noktalarında bariz farklılıklar olması koşuluyla, oldukça kompleks olan protein karışımlarının ayrıştırılması için iyi bir çözünürlük sağlar. Çok benzer izoelektrik noktalarına sahip olan proteinler ise çok zayıf olarak ayrıştırılırlar. Akış oranı

+

+

+

+

+ + + + + +

6

+ 7

+

+ pH

+ + 8

+ + + + +

+

+

+

9

Şekil 7.4: Kromatofokusingin odaklama etkisi. Örnek zonunun arka kısmında bulunan proteinler jelin yüklü grupları tarafından itildiği için örnek zonunun önündeki moleküllere göre daha hızlı göç ederler. Şayet, birinci örneğin yüklenmesinden sonra, aynı proteini içeren ikinci bir örnek kolona yüklenirse, ikinci örnekteki proteinler birinci örnektekileri yakalayarak beraber elüe olacaklardır. Şayet birinci örnek yükleme işleminden sonra, kolona pI daha yüksek olan bir protein yüklenirse bu durumda ikinci yüklenen örnek birinci örnek zonunu geçerek daha önce elüe olacaktır. Kesikli oklar, hareketli faz ve bu faz ile birlikte göç eden pozitif yüklü proteinlerin hızı ile pI noktalarındaki proteinlerin göç hızlarını temsil etmektedir.

7.3. Materyaller ve Ekipmanlar i. İyon-değiştirici jeller: Prensipte, uygun tamponlama kapasitesine sahip olan her türlü uygun iyon-değiştirici jeller kullanılabilmektedir. Seçilen iyon-değiştirici jel suda, tuz solüsyonlarında, organik çözücülerde, denatüre edici ajanların varlığında ve çalışılan pH aralıklarında kararlı olmalıdır. Ayrıca, jel partikülleri yüksek akış oranını sağlayacak şekilde homojen olmalı ve kolon yatak hacminde değişikliklerin meydana gelmemesi için yeterince sert olmalıdır. Seçilen jel, 110-120 °C’da otoklavlanarak steril edilebilmeli, amfolitler ile özgül-olmayan etkileşimler oluşturmamalı ve uç noktalardaki pH değerlerinde hem kimyasal hem de fiziksel olarak kararlı olmalıdır.

Genellikle, geleneksel LPLC kolonlarında anyon-değiştirici olarak Polybuffer exchanger (PBE) 94 ve PBE 118, Sepharose CL, QAE-Sephadex A-25, DEAE-BioGel A ve DEAE-Toyopearl 650 M kullanılmaktadır. FPLC ve HPLC için ise sırasıyla Mono P ve SynChropak AX-300 ve AX500 kullanılmaktadır. Artan pH gradienti için (düşük veya asidik bir pH ile başlanarak) ise SPSephadex C-25 veya CM-BioGel A gibi uygun bir katyon-değiştirici kullanılabilir. İyon-değiştirici jellerin iyon-değiştirme kapasiteleri ise üretici firmalar tarafından belirtilse de arzu edilen pH aralıklarında kapasitenin deneysel olarak belirlenmesi tavsiye edilmektedir (bkz. kısım 6.7.2.1). ii. Tamponlar: Kromatofokusing tekniğinde birisi kolon materyalini dengelemek ve paketlemek için gerekli olan “başlangıç tamponu”, diğeri ise kolon jeline adsorblanmış olan protein moleküllerinin elüsyonu için gerekli olan “elüsyon tamponu” olmak üzere iki tampona gereksinim duyulmaktadır. Paketlenmiş ve dengelenmiş olan kolon boyunca pH gradientinin oluşturulmasını ise elüsyon tamponu sağlamaktadır. Başlangıç tamponu olarak, genellikle 20-30 mM amin tamponları kullanılmaktadır. Elüsyon tamponu olarak ise başlıca Polybuffer 74 ve Polybuffer 96 kullanılmaktadır. Bu tamponlar ise katyonik ve amfoterik türleri içermekte olup, ya tek başlarına ya da amfolitlerle birlikte en yaygın kullanılan tamponlardır. Asidik polimerik tamponların çoğu, jel

150

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

üzerindeki bazik Polybuffer-değiştirici (PBE) gruplarına bağlanarak, çevredeki H+ iyonlarını artırmakta ve pH’yı düşürmektedir. pH’nın düşmesi ise protein moleküllerinin daha fazla pozitif olarak yüklenmesine yol açar ve sonuçta, proteinlerin adsorblanmış oldukları jelden ayrılmasını sağlar. Azalan kromatofokusingde pH gradientinin üst limiti, başlangıç tamponunun pH’sı tarafından belirlenirken alt limiti, elüsyon tamponunun pH’sı tarafından belirlenmektedir. Nadir olarak da kullanılsa, kolon materyali olarak bir katyon-değiştiricinin kullanılması durumunda ise artan kromatofokusing için bu durumun tersi doğrudur. Lineer bir pH gradientinin elde edilebilmesi için, kullanılan her iki tamponun da çalıştıkları pH aralığındaki tamponlama kapasitelerinin benzer olması gerekmektedir. Başlangıç tamponunun pH değeri genellikle arzu edilen pH değerinin 0,4 pH birimi üzerinde ayarlanır. Böylece başlangıç tamponu ile elüsyon tamponunun kondüktivitesindeki küçük farklılıklar nedeni ile elüsyonun başladığı anda meydana gelen pH dalgalanmasının önüne geçilebilir. Farklı pH aralıklarında gerçekleştirilen kromatofokusing prosesleri için geliştirilmiş olan başlangıç ve elüsyon tamponlarının bir listesi ise Tablo 7.1’de verilmektedir. iii. Kolonlar: Değişik üretici firmalar tarafından üretilen oldukça değişik özelliklerde kolon ve kolon aparatlarını ticari olarak bulmak mümkündür. Kromatofokusing için 20 x 1 cm’den 60 x 1 cm’ye kadar olan açık kolonlar kullanılabilir (bkz. kısım 3.2). İyon değiş-tokuş kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi gibi diğer kromatografik yöntemlerde kullanılan kolonlar, çözünürlükte belirgin bir değişiklik olmadan kromatofokusing için de kullanılabilmektedir. iv. Peristaltik pompalar: Sabit bir akış oranının sağlanabilmesi için kompak, tek kanallı olan ve gradient oluşturma özelliği olmayan bir pompaya gereksinim duyulmaktadır. Kullanılan peristaltik pompa, iyi bir çözünürlüğün sağlanabilmesi için gerekli olan düşük akış oranını sağlayabilmeli ve geri-akışı (geri-kaçırma) minimum düzeyde olmalıdır. v. Dedeksiyon: Proteinlerin, nükleik asitlerin ve peptidlerin 280 nm ve 254 nm’de dedeksiyonu için duyarlı, tercihen çift-ışınlı bir UV dedektör kullanılabilir. Kullanılan dedektör uygun bir akışlı-küvete sahip olmalıdır. Alternatif olarak her bir fraksiyonun absorbansı da ölçülebilir. Kromatografik sistemlerde kullanılan dedektörler ve fraksiyonların toplanması ise kısım 3.10 ve kısım 4.12’de daha detaylı olarak ele alınmaktadır. 7.4. Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler

Diğer kromatografik tekniklerde olduğu gibi kromatofokusing tekniğinde de çözünürlük, elüe edilen bandın genişliği ile tanımlanır (bkz. kısım 2.8). Elüe edilen bandın oluşturduğu pikin genişliği ise birçok değişkene bağlı olup, kromatofokusing de bu değişkenler optimize edilebilir. Kromatofokusing ile herhangi bir proteinin optimum olarak ayrıştırılmasını etkileyen en önemli faktörler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Gradientin eğimi: Sığ bir pH gradienti çok daha iyi bir çözünürlük sağlamaktadır. Sığ bir pH gradientinin elde edilmesi ise yavaş ve sabit bir pH değişimi veren, düşük tampon derişimlerinin kullanılması ile sağlanabilir ve böylece, pikler arasında çok iyi bir ayrıştırma sağlanır. pH gradientinin düzgün olması ise aynı zamanda pH birimi açısından çok daha dar olan bant genişliği ile sonuçlanmaktadır. Buna rağmen, pH gradientinin çok fazla sığ olması ise elüsyonu yapılan proteinlerin elüsyon sıvısı içerisindeki derişimlerinin çok düşük olmasına neden olmaktadır. Deneysel olarak yapılan çalışmalar sonucunda, kolon yatak hacminin 10-15 misli hacmindeki pH gradientinin iyi bir sonuç verdiği belirlenmiştir. ii. Tamponlar: Kromatofokusing ile ayrıştırılması yapılan proteinlerin çoğu, polimerik tamponlar ile başarılmıştır (bkz. Tablo 7.1). Buna rağmen, polimerik tamponların yerine geleneksel tampon bileşenlerinin uygun karışımları da kullanılabilmektedir. Örneğin, başlangıç tamponu ve

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

151

elüsyon tamponu bileşenleri bakımından aynı olabilir. Fakat, bu tamponlardan başlangıç tamponunun pH değeri, kullanılan tamponun üst pH limitinde iken, elüsyon tamponunun pH değeri ise alt limitte olmalıdır. Tablo 7.1: Farklı pH aralıklarında kromatofokusing için kullanılan tamponlar ve jel materyalleria. pH aralığı

Jel

10,5-9d PBE 118 10,5-8

PBE 118

10,5-7

PBE 118

9-8f

PBE 94

9-7

PBE 94

9-6

PBE 94

8-7

PBE 94

8-6

PBE 94

8-5h

PBE 94

7-6

PBE 94

7-5

PBE 94

7-4

PBE 94

6-5

PBE 94

6-4

PBE 94

5-4

PBE 94

a b c d e f g h

Başlama tamponu

pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolaminCH3COOH pH 8,3; 25 mM Tris-HCl pH 8,3; 25 mM TrisCH3COOH pH 8,3; 25 mM TrisCH3COOH pH 7,4; 25 mM İmidazolCH3COOH pH 7,4; 25 mM İmidazol-HCl pH 7,4; 25 mM İmidazol-HCl pH 6,2; 25 mM Histidin-HCl pH 6,2; 25 mM Histidin-HCl pH 5,5; 25 mM Piperazin-HCl

Yaklaşık hacim Toplam (kolon hacmi olarak) hacim c Ölü hacim Gradient hacmi

Elüsyon tamponu

Seyrelme faktörüb

–

–

–

–

–

1:45

1,5

11,5

13,0

1:45

2,0

11,5

13,5

1:45

1,5

10,5

12,0

1:10

2,0

12,0

14,0

1:10

1,5

10,5

12,0

1:13

1,5

9,0

10,5

1:13

3,0

9,0

12,0

1:10

2,0

8,5

10,5

1:13

3,0

7,0

10,0

1:8

2,5

11,5

14,0

1:8

2,5

11,5

14,0

1:10

2,0

8,0

10,0

1:8

2,0

7,0

9,0

1:10

3,0

9,0

12,0

e

pH 8,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 7,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 8,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 7,0; PBg 96-HCl pH 6,0; PB 96HC3COOH pH 7,0; PB 96-HCL pH 6,0; PB 96CH3COOH pH 5,0; PB 96 (%30) + PB 74 (%70)CH3COOH pH 6,0; PB 96CH3COOH pH 5,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl pH 5,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl

Bütün tamponlar kullanılmadan önce gazları giderilmelidir. Verilen seyrelme faktörleri kritik değildir ve en iyi koşullar deneysel olarak belirlenebilir. Gradient hacmi için verilen değerler yaklaşıktır ve seçilen koşullara göre değişebilir. pH 9 ile sonlanan gradientler, Pharmalyte pH 8-10,5’in pH değerinin üzerinde olduğu için önerilmemektedir. PH: Pharmalyte için kullanılmış olan kısaltmadır. PBE 94 ve Polybuffer 96 gibi PBE 118 ve Pharmalyte pH 8-10,5 de bu aralığı kapsamaktadır. PB: Polybuffer için kullanılmış olan kısaltmadır. Karıştırma en iyi sonucu vermektedir. Tek başına kullanıldığı zaman Polybuffer 74, Polybuffer 96’dan daha iyi çalışmaktadır.

iii. İyon-değiştirici jellerin yükü: İyon-değiştirici ile bunu çevreleyen bileşenler arasında optimal bir yük farklılığının olması, izoelektrofokusingde elektriksel alan kuvvetinin zonların keskinleşmesine katkıda bulunduğu gibi, kromatofokusingde de zonların keskinleşmesine yol açmaktadır. Oldukça yüksek bir oranda dallanma gösteren Polybuffer exchanger (PBE) jelleri ise iyi bir odaklama sağlamaktadırlar. Buna ilaveten, iyonik kuvvet ve bunun sonucu olarak da tampon

152

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

derişimi düşük olmalıdır. Düşük derişimli bir tampon aynı zamanda, şayet pH gradienti kolon içerisinde oluşturulacaksa, sığ bir pH gradientinin elde edilmesini sağlar. iv. Kolonun paketlenmesi: Kolonun paketlenmesi esnasında meydana gelen herhangi bir düzensizlik, çözünürlük üzerine bariz bir etki göstermektedir. Özellikle kromatofokusing tekniğinde ayrıştırılması yapılan moleküllerin oluşturduğu bantlar aşırı derecede dar olduğundan, kolonun paketlenmesinde meydana gelen hatalar, çözünürlük üzerinde çok daha belirgin olumsuz etkilere sahiptir. Bu nedenle, kolonun oldukça düzenli olarak paketlenmiş olması (bkz. kısım 3.5) ve başlangıç tamponu ile eşit bir şekilde dengelenmiş olması gerekmektedir. v. İyonlar: Normal olarak kullanılan değiştirilebilen-iyon olan Cl– dışında, diğer monovalent iyonlar da kullanılabilir. Fakat, seçilen bu anyonların pKa değerleri, pH gradientinin en düşük seviyesinin en az 2 pH birimi altında olması oldukça önemlidir. Bikarbonat iyonları ise pH gradientinde dalgalanmalara neden olmaktadır. Bu nedenle, kromatofokusingde kullanılacak olan tamponların hepsinin kullanılmadan önce gazı alınmalıdır. Koşullara bağlı olarak atmosferik CO2, pH 5,5-6,5 aralığında bir platoya neden olabilir. Bu etkiler ise gradientin pH 6 ile sonlandığı Polybuffer 96’da çok daha belirgin olduğundan, Polybuffer 96 ile birlikte yer-değiştirici iyon olarak asetatın kullanılmasından kaçınılmalıdır. Diğer yandan, asetatın pKa değerinin Polybuffer 74’ünkinden çok daha yüksek olması nedeni ile Polybuffer 74 ile birlikte yer-değiştirici iyon olarak asetatın kullanılması da önerilmemektedir. vi. Kolon uzunluğu: Kısa kolonlarla iyi bir sonuç elde edilebilmesine rağmen, aynı iç-çapa sahip olan daha uzun kolonlarla, çok daha yüksek çözünürlükte sonuçlar elde edilmektedir. Buna rağmen, oldukça uzun olan kolonların (50 cm’den daha uzun) kullanılması durumunda ise elüsyon zamanı oldukça uzun sürmektedir. Bu nedenle, 20-30 cm uzunluğundaki kolonların kullanılması çok daha uygun bulunmuştur. vii. Akış oranı: Teorik olarak, akış oranının çözünürlük üzerine bariz bir etkisinin olmaması gerekmektedir. Buna rağmen, pratikte ise akış oranının oldukça düşük olması durumunda, çözünürlükte bariz bir artmanın olduğu belirlenmiştir (Şekil 7.5). İlgilenilmekte olan proteinin elüsyonuna yakın bir zamana kadar daha yüksek bir akış oranı kullanılabilir. Daha sonra ise akış oranı yaklaşık olarak 10-kat düşürülerek, hedef proteinin elüsyonu sağlanabilir ve daha sonra, akış oranı tekrar ilk hızına ayarlanabilir.

Şekil 7.5: Standart bir protein karışımının iki farklı akış oranındaki elüsyonu. Ayrıştırma koşulları; jel: PBE 118; kolon: Pharmacia SR 10/50; kolon yatak yüksekliği: 30 cm; örnek: 5 mL elüsyon tamponu içinde sitokrom c (5 mg), ribonükleaz (8 mg) ve lentil lektin (10 mg); elüsyon: başlangıç tamponu olarak trietilamin-HCl (25 mM, pH 11); elüsyon tamponu olarak ise 0,0075 mmol/pH birimi/mL Pharmalyte pH 8-10,5, pH 8,0 olacak şekilde dengelenmiştir. Lineer akış oranı: (a) 15 cm s–1; (b) 117 cm s–1 (Anonymous, 2001b).

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

153

7.5. Deneysel Koşulların Dizaynı

İzoelektrik odaklama (IEF) gibi kromatofokusing de, çalışılan pH aralığında (pH 3-11) izoelektrik bir noktaya sahip olan ve suda-çözünebilen bütün amfoterik moleküllerin ayrıştırılması için uygun bir kromatografi tekniğidir. Bu nedenle kromatofokusing, proteinlerin ve peptidlerin ayrıştırılması için ideal bir kromatografi tekniğidir. Kromatofokusing deneylerinin doğru olarak planlanması, diğer kromatografik sistemlerin planlanmasına benzemektedir. Bir kromatofokusing deneyinin planlanmasında göz önünde bulundurulması gereken kritik noktalar ise takip eden altkısımlarda ele alınmaktadır. 7.5.1. Jel ve Tampon Seçimi

Kromatofokusing için her türlü anyon-değiştirici jeller ve tamponların yanı sıra, kromatofokusing için dizayn edilmiş olan Polybuffer ve Polybuffer exchanger (PBE) jelleri seçilebilir (bkz. Tablo 7.1). Şayet hedef proteinin izoelektrik noktası biliniyorsa, optimal bir çözünürlüğün elde edilebilmesi için pH gradientinin 1/3 ile 1/2’sinde hedef proteinin elüsyonu sağlanacak şekilde pH gradientinin aralığı seçilebilir. Şayet hedef proteinin izoelektrik noktası bilinmiyorsa, proteinin izoelektrik noktası izoelektrofokusing tekniği ile veya iyon-değiştirici kullanılarak (bkz. kısım 6.6.2.1) basit bir deneyle belirlenebilir. İzoelektrik noktası bilinmeyen bir örnek ile çalışıldığında ise proteinlerin çoğunun pI değerleri 7-4 aralığında olduğundan, pH gradientinin aralığı pH 7-4 olarak seçilebilir. Şayet hedef proteinin pI değeri 4’den küçükse, bu protein kolona bağlanmadan elüsyon sıvısı ile birlikte kolondan ayrılacağı için kolayca elde edilebilir. Diğer yandan, şayet hedef proteinin pI değeri 7’nin üzerinde ise bu protein kolon materyaline bağlanacağından dolayı, elüsyonu kolay olmayacaktır. Böyle bir durumda ise alternatif olarak Polybuffer 96 ve PBE 94 kullanılarak, pH gradientinin aralığı pH 9-4 olarak seçilebilir. Hedef proteinin pI değeri, kullanılan pH gradientinin üst limitinden büyük olduğu durumlarda yani, jele adsorblanarak pH gradienti ile kolondan elüsyonu gerçekleştirilemeyen proteinler ise bir tuz solüsyonu ile elüe edilmelidirler. Kolon ise başlangıç tamponu ile yeniden dengelenirken, örnekler yeni bir tampon ile dengelenmelidir. Bu nedenle, hedef proteinin pI değerinin önceden biliniyor olması, bu tip problemleri önlemektedir. 7.5.2. İyon-Değiştiricinin Miktarı

Kullanılacak olan jelin miktarı, örnek materyalinin miktarına, yapısına, kirleticilere ve arzu edilen çözünürlüğün derecesine bağlıdır. Kromatofokusing ile gerçekleştirilen ayrıştırma işlemlerinin çoğu için 200 mg protein içeren örnek materyali için 20-30 mL’lik kolon yatak hacmi yeterli olmaktadır. Burada şunun unutulmaması gerekmektedir ki çözünürlük, kullanılan örnek materyalinin fazla miktarda olmasına bağlıdır. Ayrıca, kullanılacak olan jelin tam miktarı, deneysel çalışmadan elde edilmek istenen çözünürlüğe de bağlı olacağından, gerekli olan jel miktarı ancak deneysel çalışma ile belirlenebilir. 7.5.3. Jelin Hazırlanması

İyon-değiştirici jeller, örnek materyalinin yüklenmesinden önce mutlaka başlangıç tamponu ile dengelenmelidir. Kromatofokusingde kullanılabilecek uygun başlangıç tamponlarının listesi ise Tablo 7.1’de verilmektedir. İyon-değiştirici materyaller ise kolona paketlenmeden önce dengelenebileceği gibi paketlendikten sonra, kolon içerisinde de dengelenebilirler. Kolon materyallerinin hazırlanması ve dengelenmesi ise kısım 6.7.3’de daha detaylı olarak ele alınmıştır. 7.5.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi kromatofokusingde de kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü, kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede

154

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak incelenmiştir. Buna rağmen, iyon-değiştirici jellerle paketlenmiş bir kolonun kontrol edilmesinde kullanılacak boyaların seçiminde çok dikkatli olunmalıdır. Çünkü, boyaların çoğu kuvvetli bir şekilde elektriksel yük taşıdıklarından, kolon materyaline sıkı bir şekilde bağlanabilirler. Bu nedenle, kolonların kontrol edilmesi için önerilebilecek en iyi işaret moleküllerinden birisi bovin sitokrom c’dir. Çünkü sitokrom c, renkli olmasının yanı sıra kolaylıkla temin edilebilmekte ve kuvvetli bazik (pI = 10,5) bir protein olduğundan, jel tarafından itilerek kolondan kolaylıkla elüe olmaktadır. 7.5.5. Örnek Materyalin Hazırlanması ve Yüklenmesi

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin derişimi, kompozisyonu, hacmi ve viskozitesi gibi parametreler iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak ele alınmaktadır. Bunun yanı sıra, örnek materyalinin içinde bulunan proteinlerin sayısına bağlı olarak değişkenlik gösterse de, yaklaşık olarak 10 mL jel için 100 mg proteinin yüklenmesi uygundur. Yüklenecek olan örnek materyalinin hacmi ise kritik bir önem arz etmediğinden, hedef proteinin kolondan elüsyonu gerçekleşmeden öncesine kadar örnek materyalinin hepsi yüklenmelidir (bkz. kısım 7.2.3). Buna rağmen, örnek materyalinin hacminin kolon yatak hacminin yarısını geçmemesi en iyisidir. Örnek materyali tuz içermemeli ve kolona yüklenmeden önce, ya başlangıç tamponu ile ya da elüsyon tamponu ile dengelenmelidir. Örnek materyalinin hacminin 10 mL’den fazla olması durumunda, örneğin düzenli bir tabaka şeklinde kolona yüklenmesini garantilemek için ise kolon yatağının üst kısmına, 1-2 cm yüksekliğinde Sephadex G-25 Coarse tabakasının ilave edilmesi önerilebilir. LPLC veya HPLC sistemlerinde kromatofokusing tekniğinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak ele alınmaktadır. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek, örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. Örneklerin kolona yüklenmesinden önce kolona 5 mL elüsyon tamponu gönderilmeli, sonra örnek yüklenmeli (başlangıç veya elüsyon tamponu içinde) ve daha sonra da tekrar elüsyon tamponu gönderilmelidir. Böylece, örnek materyali içinde bulunan proteinlerin uç noktadaki pH değerleri ile karşı karşıya kalması engellenmiş olur. 7.5.6. Elüsyon

Kromatofokusing tekniğinde elüsyon işlemi esnasında, pH gradientinin kolon içerisinde otomatik olarak oluşması nedeni ile özel bir gradient aparatının kullanılmasına gerek yoktur. pH gradientinin üst limiti, kolonu dengelemekte kullanılan başlangıç tamponu tarafından belirlenirken, alt limiti ise elüsyon tamponu tarafından belirlenmektedir. Önerilen tampon kompozisyonları ise Tablo 7.1’de verilmektedir. Gradientin hacmi ise elüsyon tamponunun kuvveti tarafından belirlenmektedir. Tablo 7.1’de önerilen ölçüler ise gradientin pH limitleri arasındaki fark 3 pH birimi aralığında olacak şekilde ve kolon yatak hacminin 10-misli bir gradient hacmini verecek şekilde tasarlanmıştır. Tablo 7.1’den görülebildiği gibi genellikle, kolon yatak hacminin 1,5-3,0’ü kadar bir ölü hacim bulunmaktadır. Bu ölü hacim, elüsyon sıvısının pH değerinin düşmeye başlamasından önce kolondan geçen sıvının hacmidir. Bu nedenle, pH gradientinin oluşturulması için gereken elüsyon tamponunun hacmi, yaklaşık olarak kolon yatak hacminin 12,5 katıdır. Polybuffer ise pH gradientinin alt ve üst limitleri arasındaki farkın 3 pH biriminden daha geniş olması durumunda ise uygun değildir.

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

155

i. Akış Oranı: Elüsyon için seçilecek olan akış oranı, arzu edilen çözünürlüğe bağlı olarak değişmektedir. PBE jelleri çapraz-bağlı yapıda olduklarından, basınca karşı oldukça dayanıklıdırlar ve oldukça iyi bir akış oranı sağlamaktadırlar. Akış oranının ayrıştırma üzerine olan etkisi ise Şekil 7.5’de görülmektedir. Şekil 7.5’den de görülebileceği gibi akış oranının artması, çözünürlüğün bir miktar bozulmasına yol açsa da hâlâ yeterince iyi bir çözünürlük elde edilebilmektedir. Bu nedenle akış oranının belirli bir ölçüye kadar artırılması, arzu edilen çözünürlük sağlandığı sürece mümkün görülmektedir. Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda ise 30-40 mL s–1’lik lineer bir akış oranının mütemadiyen iyi bir çözünürlük sağladığı belirlenmiştir. ii. Dedeksiyon: Kolondan ayrılan elüsyon sıvısı içerisindeki proteinlerin belirlenmesi için sıvının 280 nm veya 254 nm’de taranması gerekmektedir. Polybuffer kullanılması durumunda ise bunların 254 nm’da hafif de olsa bir absorbans göstermeleri nedeni ile dikkatli olunmalı veya 254 nm’de tarama yapılmaktan kaçınılmalıdır. Elüsyon sıvısının protein içeriğinin taranmasına ilaveten, gradient oluşumunda bir anormalliğin olmadığından emin olmak için pH taraması da yapılmalıdır. iii. Rejenerasyon: Paketlenmiş ve kullanılmış olan bir kolon, yeniden paketlemeye gerek kalmadan birkaç defa kullanılabilir. Kolonun kullanılması esnasında kolon materyaline adsorbe olarak kolondan elüe olmayan proteinlerin kolondan uzaklaştırılması için kolon, kolon yatak hacminin 2-3 misli 1 M NaCl solüsyonu ile yıkanmalıdır. Kolon materyaline çok daha kuvvetli bağlanmış olan proteinler ise 100 mM HCl ile kolondan uzaklaştırılabilir. Şayet kolonun rejenerasyonu için HCl kullanılmış ise kolonun yıkanmasından sonra, en kısa zamanda kolon yeniden yüksek pH’ya dengelenmelidir. Daha sonra kolonun dengelenmesine başlangıç tamponu ile devam edilmeli ve bu işlem kolondan ayrılan sıvının başlangıç tamponu ile aynı olmasına kadar sürmelidir. 7.6. Polybuffer ve Amfolitlerin Proteinden Ayrıştırılması

Polybuffer ve amfolitler genellikle enzimatik reaksiyonları ve amino asit analizlerini etkilemez. Aynı zamanda, Coomassie Blue içeren metotlatla protein derişimlerinin belirlenmesini de etkilememektedirler fakat, bakır iyonları ile kompleks oluşturabildiklerinden protein derişimlerinin Lowry metodu ile belirlenmesi durumunda olumsuz etkileri bulunmaktadır. Protein fraksiyonları içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması için ise birkaç metot kullanılabilmektedir: i. Çökeltme: Protein örnekleri içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması için kullanılan yöntemlerden en kolayı amonyum sülfat ile çökeltmedir (bkz. kısım 1.7.1). Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılmak istendiği protein fraksiyonuna katı amonyum sülfat eklenerek (%80-100 satürasyon) protein moleküllerinin çökelmesini sağlamak amacı ile 1-2 saat süreyle bekletilir. Fraksiyon içerisindeki proteinler, kolondan kendi izoelektrik pH’larındaki elüsyon sıvısı içerisinde elüe olacaklarından, amonyum sülfat ile kolayca çökelti oluşturacaklardır. Çökelmiş olan proteinler ise santrifüj yöntemi ile toplandıktan sonra doygun amonyum sülfat çözeltisi ile birkaç defa yıkanır. Alternatif olarak, hedef proteini içeren fraksiyonlar bir diyaliz tüpüne aktarılarak, doymuş amonyum sülfat çözeltisine karşı diyalize tâbi tutulur. Amonyum sülfat ile çökeltme, hem fraksiyon içerisindeki proteinin yoğunlaştırılmasını, hem kararlılığını sağlaması hem de ucuz ve kolay bir metot olması nedeni ile avantajlıdır. ii. Jel Filtrasyonu: Protein fraksiyonları içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması, Sephadex G-75 kullanılarak jel filtrasyon kromatografisi ile de başarılabilmektedir (bkz. kısım 5.8). Şayet fraksiyon hacimleri yeterince küçükse, önceden Sephadex ile paketlenmiş ve tek-kullanımlık olan tuz-giderici kolonlar kullanılabilir. Şayet hedef proteinin moleküler kütlesi 15 kDa’dan küçükse, kısa kolonlar ile bu proteinlerin Polybuffer ve amfolitlerden ayrıştırılmasında bazı güçlüklerle karşılaşılabilir.

156

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

iii. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi: Octyl- veya Phenyl-Sepharose CL-4B kullanılarak, hidrofobik interaksiyon kromatografisi ile amonyum sülfat çökeltmesi birlikte kullanılabilir. Kromatofokusing uygulamasından elde edilen fraksiyonlara %80 düzeyinde doygunluk sağlayacak şekilde amonyum sülfat eklenerek, hidrofobik etkileşimlerin oluşması için ortam sağlanır. Bu uygulama, hedef proteinin çökelmesi ile sonuçlanabilir. Şayet böyle bir durumla karşılaşılırsa, çökelmiş olan protein santrifüjlenerek toplanabilir ve doymuş amonyum sülfat çözeltisi ile birkaç defa yıkanır.

Alternatif bir yöntem olarak, Phenyl-Sepharose CL-4B ile paketlenmiş ve %80 amonyum sülfat ile yıkanarak dengelenmiş olan kolona, amonyum sülfat eklenmiş olan örnek materyali yüklenebilir. Şayet bağlanma gerçekleşmez ise amonyum sülfat derişimi artırılmalı veya OctylSepharose CL-4B gibi çok daha hidrofobik bir jel denenmelidir. Örnek materyali içerisindeki 10 mg protein için yaklaşık olarak 1 mL jele gereksimin duyulmaktadır. Jel, kolon yatak hacminin 2-3 misli %80 doygunluktaki amonyum sülfat ile yıkanır ve daha sonra, düşük iyonik kuvvetteki uygun bir tampon ile elüsyon gerçekleştirilir. Şayet örnek materyali liyofilize edilecekse, amonyum asetat gibi buharlaşabilen uygun bir tampon kullanılmalıdır. Kolon materyaline kuvvetli bir şekilde bağlanmış olan moleküller ise etilen glikol gibi ajanlarla uzaklaştırılabilir. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi ise daha detaylı olarak 9. Bölümde ele alınmaktadır. iv. Affinite Kromatografisi: Fraksiyonlar içinde bulunan proteinler, protein moleküllerinin biyolojik özelliklerinden yararlanılarak Polybuffer ve amfolitlerden kolayca ayrılabilirler. Bu metotta, hedef proteini özgül olarak adsorblayan fakat, Polybuffer ve amfolitlerin kolondan akıp gitmesini sağlayan biyoselektif adsorbent içeren kolonlar kullanılmaktadır. Affinite kromatografisi ise daha detaylı olarak 8. Bölümde ele alınmaktadır. 7.7. Denatüre Edici Ajanların Varlığında Kromatofokusing

Kromatofokusing tekniği ile proteinlerin ayrıştırılması ve saflaştırılması üre, DMSO, etilen glikol gibi denatüre edici ajanların ve Nonidet P-40 (NP-40) ve Triton X-100 gibi iyonik-olmayan deterjanların varlığında dahi gerçekleştirilebilmektedir. Kromatofokusing tekniğinin bu tipteki disosiasyon ajanlarının varlığında dahi başarılı bir şekilde kullanılabilmesi, bu ajanların örnek materyal içindeki moleküller ile büyük oranda etkileşim göstermelerine bağlıdır. Örneğin, protein moleküllerinin çözünürlüğünü sağlamak için deterjanlar kullanıldığında, kritik misellenme derişimine (CMC) yaklaşan bir derişimde, protein molekülleri arasında birlik oluşabilir. Oldukça hidrofobik olan protein molekülleri için disosiasyon ve çözünürlük ise beklendiği kadar başarılı olmayabilir. Bu ise odaklama etkisini alt-üst eden bir dizi moleküler kompleks oluşumu ile sonuçlanabilir. Daha da önemlisi, bazı moleküller deterjan ile oldukça fazla miktarda sarılarak, kromatofokusing için gerekli olan elektriksel yüke bağlı etkileşimlerin etkili bir şekilde gerçekleşmesini engelleyebilir. Bu nedenle, örnek materyal içinde bulunan protein moleküllerine bağlı olarak, kullanılacak olan deterjanların derişimleri hakkında çok dikkatli olmak gerekmektedir. 7.8. Odaklama Kromatografisi Uygulamaları

Kromatofokusing tekniği, ayrıştırılmalarında oldukça fazla zorluklarla karşılaşılan βasetilheksozaminidaz izoenzimlerinin, fosfolipid transferaz enzimlerinin, fare ve insan αfoetoproteinlerinin, diğer serum proteinlerinin ve fare karaciğer histamin-N-metil transferaz enziminin (Şekil 7.6) saflaştırılmasında başarı ile kullanılmıştır. Kromatofokusing tekniği ile elde edilen çözünürlük, bazı ayrıştırma işlemlerinde preparatif izoelektrik odaklama (IEF) tekniğinin sunduğu çözünürlük kadar iyi olmaktadır. Bazı durumlarda ise diğer fizikokimyasal metotlarla ayrıştırılmaları başarılamayan proteinlerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilmesini sağlamaktadır.

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

157

Şekil 7.6: Fare karaciğer histamin-N-metil transferaz enziminin kromatofokusing elüsyon profili. Kısmi olarak saflaştırılmış olan protein (yaklaşık 130 mg protein) 5 mL Polybuffer 74, pH 3,5 içerisinde, önceden 25 mM pierazin-HCl, pH 5,5 ile dengelenmiş olan PBE 94 kolonuna (26 x 1,6 cm) yüklenmiştir. Proteinin elüsyonu ise –1 20 mL s akış oranı ile gerçekleştirilmiştir. 5 mL’lik hacimlerde toplanan fraksiyonlar ise pH („), histamin-Nmetil transferaz aktivitesi (z) ve Coommasie Brilliant Blue ile reaksiyonundan sonra 600 nm’deki absorbansları (o) için test edilmiştir (Wilson ve Walker, 1995).

Yapılan çalışmalar ise miyoglobin, karbonik anhidraz ve albümin gibi bilinen proteinlerden oluşan model karışımların, kromatofokusing tekniği ile çok iyi ayrıştırıldıklarını göstermiştir. Bunun yanı sıra, hemoglobin moleküllerinin genetiksel olarak değişikliğe uğraması sonucu görülen orak hücre anemili hastaların karboksihemoglobinlerinin oldukça dar bir pH aralığında (pH 8-7) fraksiyonlanabilmesi nedeni ile kromatofokusing, genetiksel bozukluklar nedeni ile hemoglobinlerde meydana gelen değişikliklerin çalışılması için çok uygundur. Örneğin, memeli kas hücrelerinin ekstraksiyonundan elde edilen ve oldukça kompleks olan protein karışımlarının diğer kromatografik yöntemlerle tek bir basamakta ayrıştırılmasını gerçekleştirmek zordur. Buna rağmen, bu tip örneklerin ayrıştırılması kromatofokusing tekniği ile tek bir adımda gerçekleştirilebilmektedir. Kompleks protein karışımlarının kromatofokusing yöntemi ile ayrıştırılması sonucunda oldukça iyi bir çözünürlük elde edilebilmesine rağmen, ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin diğer özelliklerinin kullanıldığı jel filtrasyonu veya affinite kromatografisi gibi diğer kromatografik tekniklerle kromatofokusingin tekniğinin kombinasyonu durumunda, çok daha iyi çözünürlükler sağlanabilmektedir. Kromatofokusing yönteminin çözünürlük gücünün oldukça yüksek olması, bu yöntemin diğer kromatografik yöntemlerle birlikte kullanılması durumunda, ayrıştırma protokolünün ya ortasında ya da sonunda kullanılmasının daha uygun olacağı anlamına gelmektedir.

158

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ (AC)

8.1. Giriş

Affinite kromatografisi (Affinity Chromatography; AC) ile saflaştırma, diğer kromatografi tekniklerinin çoğunda, elektroforezde ve santrifüj tekniklerinde olduğu gibi ayrıştırılacak olan moleküllerin fiziksel özelliklerine dayanmaması nedeniyle, bu tekniklere benzemez. Bu tekniklerin aksine affinite kromatografisinde, saflaştırılacak olan biyomoleküllerin biyolojik fonksiyonlarından veya kendilerine özgü kimyasal yapılarından yararlanılmaktadır. Bunun bir sonucu olarak da affinite kromatografisi teoride, kompleks biyolojik karışımlardan dahi tek bir işlemle, homojen saflıktaki materyallerin elde edilmesini sağlama özelliğindedir. Bu nedenle affinite kromatografisi, biyomoleküllerin saflaştırılmasında eşsiz bir konuma sahiptir. Affinite kromatografi tekniğinin kullanılmasına yaklaşık olarak 40 yıl kadar önce başlanmış olmasına rağmen, bu saflaştırma tekniği günümüzde birçok laboratuvarda biyolojik materyallerin ayrıştırılmasında rutin bir prosedür olarak kullanılmaktadır. Affinite kromatografisinin oldukça farklı olan biyomolekülleri ayrıştırmak için geliştirilmiş olan adaptasyonları ise bu tekniğin, diğer teknikler ile ayrıştırılması oldukça zaman israfına neden olan ve ayrıştırılması güç, hatta mümkün olmayan materyalleri ayrıştırmada ne kadar başarılı olduğunun da bir göstergesidir. Affinite kromatografisi, adsorbsiyon kromatografisinin bir tipidir. Bu teknikte, ayrıştırılacak olan biyomolekül, kolon materyaline (matriks) kovalent olarak bağlanarak tutuklanmış (immobilize edilmiş) bir bağlama materyaline (ligand) komplamenter olarak, özgül ve geri–dönüşümlü bir şekilde adsorbe edilmektedir. Saflaştırma ise genellikle tek bir adımda birkaç bin–kat artırılmakta ve saflaştırılmak istenen molekülün geri-kazanımı ise oldukça yüksek verimlilikte olmaktadır. Affinite kromatografisi aynı zamanda, çok fazla hacimlerdeki örneklerin kolona yüklenmesine izin vermesi nedeni ile yoğunlaştırma etkisi de göstermektedir. Affinite kromatografi tekniğinde ayrıştırma işleminin oldukça özgül olarak gerçekleşmesi, ayrıştırma işleminde etkileşim gösteren moleküllerin doğal özgüllüğünden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle affinite kromatografisi, kompleks biyolojik karışımlardan biyomoleküllerin saflaştırılmasını sağladığı gibi, aynı moleküllerin doğal ve denatüre olmuş karışımlarını içeren örneklerden, doğal yapıdaki moleküllerin ayrıştırılmasını da sağlamaktadır. Aynı zamanda affinite kromatografisi, çok az miktardaki biyolojik materyalleri, fazla miktardaki kirletici materyallerden ayrıştırmakta da kullanılmaktadır. Affinite kromatografisinin ilk uygulaması, 1971 yılında, amilazın seçici olarak çözünmeyen (insolubil) nişastaya adsorbsiyonu ile olmuştur. Fakat o yıllarda, kullanışlı bir matriksin sentezine ve bu matrikse ligandın kovalent olarak bağlanmasına izin veren kompleks organik kimya tekniklerinin geliştirilememiş olması, affinite kromatografisinin biyoloji laboratuvarlarında kullanılmasını uzun bir süre geciktirmiştir. 1967 Yılında ise Axen, Porath ve Ernback tarafından yayınlanan bir makalede, birincil amino grubu içeren moleküllerin, siyanojen bromid (BrCN) ile polisakkarit matrikslere bağlandığı rapor edilmiştir. Bu rapor, günümüzde rutin olarak kullanılan affinite kromatografisinin

160

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

başlangıcını temsil etmektedir ve BrCN aktivasyonu ile ligandların matrikse bağlanması, günümüzde de en yaygın metot olarak hâlâ kullanılmaktadır. Başlangıçta enzimlerin saflaştırılması için geliştirilmiş olan affinite kromatografisi, daha sonraları antikorların, antijenlerin, nükleotidlerin, nükleik asitlerin, DNA–bağlayıcı proteinlerin, immünoglobilinlerin, membran reseptörlerinin ve hatta hücrelerin ve hücre fragmentlerinin saflaştırılmasında kullanılmaya başlanmıştır. 8.2. Affinite Kromatogarfisinin Temel Prensipleri

Affinite kromatografisinin prensibi Şekil 8.1’de gösterilmektedir. Başarılı bir ayrıştırmanın sağlanabilmesi, biyoözgül bir ligandın (L) varlığına ve bu ligandın kolon materyaline (matriks) kovalent olarak bağlanmasına bağlıdır. Aynı zamanda, kolan materyaline kovalent olarak bağlanmış olan (tutuklu) ligandın, ayrıştırılacak olan biyomolekül (S) ile bağlanma affinitesinin korunması, kolonda tutunmayan kirleticilerin yıkanarak kolondan uzaklaştırılmasından sonra, liganda bağlanmış olan molekülün liganddan aktif formda ayrılmasını özgül olarak sağlayan bir metodun bulunması da oldukça önemlidir. Affinite kromatografisinin yaygın olarak kullanıldığı biyolojik materyaller ve bunların ligandları ise Tablo 8.1’de verilmektedir.

Şekil 8.1: Affinite kromatografisinin prensibi. L, ligand; S, biyomolekül; M, matriks.

Tablo 8.1: Affinite kromatografisinin yaygın olarak kullanıldığı biyomoleküller ve bunların ligandları. Ayrıştırılacak molekül

Ligand

Enzim

Substrat analoğu, inhibitör, kofaktör

Antikor

Antijen, virüs, hücre

Lektin

Polisakkarit, glikoprotein, hücre yüzey reseptörü, hücre

Nükleik asit

Komplementer baz dizilimi, histonlar, nükleik asit polimeraz, bağlama proteini

Hormon, vitamin

Reseptör, taşıyıcı protein

Hücre

Hücre yüzeyi özgül protein, lektin

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

161

Doğru deneysel koşullar altında, saflaştırılacak olan özgül biyomolekülü içeren kompleks karışım, genellikle sıradan bir kromatografi kolonuna paketlenmiş olan ve tutuklu ligand içeren kolon materyalinin üzerine eklendiğinde, sadece ligand için özgül olan biyomoleküller ligand ile bağlanacaktır. Dolayısıyla, ligand ile bağlanmayan bütün diğer bileşikler, hareketli faz ile kolondan yıkanarak ayrılacaktır. Liganda bağlanan özgül biyomolekül ise daha sonra özel şartların uygulanması ile ligandan ayrılır ve elüsyon sıvısı ile kolondan ayrılan bileşik toplanır (Şekil 8.2).

Şekil 8.2: Affinite kromatografisi ile bir enzimin saflaştırılmasının diyagramatik olarak gösterilmesi.

Metodun planlandığı gibi başarılı bir şekilde yapılabilmesi için, saflaştırılacak olan biyomolekülün yapısının ve biyolojik özelliklerinin ayrıntılı bir biçimde önceden bilinmesi gerekir. Saflaştırılacak olan biyomolekülün bir enzim olması durumunda ligand, bu enzimin bir substratı, geri-dönüşümlü olarak enzime bağlanan bir inhibitör veya allosterik aktivatör olabilir. Seçilen koşullar, normal olarak enzim–ligand bağlanmasının optimal olduğu koşullar olmalıdır. Metodun başarısı, enzim–ligand kompleksinin geri dönüşümlü olarak oluşumuna ve k+1 ve k–1 sabitlerinin birinci dereceden oranlarının sayısal değerlerine bağlı olduğundan enzim, sürekli olarak bir kolon materyaline kovalent olarak bağlı, çözünmeyen ligand üzerine eklendiğinde, enzim molekülleri bağlanmaya teşvik edilir ve kompleksin derişimi ve bağlanma artışının gücü ile dinamik bir durum gelişir. Örnek materyalinin kolona eklenmesi sırasında etkinlikteki daimi artıştan dolayı, kolon prosedürleri kesikli–tip metotlardan daima daha başarılıdır. Yine de affinite kromatografisinin uygulanmasına yönelik alternatif formlar geliştirilmiştir ve bu alternatif formlar, özellikle büyükölçekli çalışmalar için uygundurlar. Bu alternatif formaların içeriği ise aşağıdaki şekilde özetlenebilir: i. Affinite çökeltmesi: Ligand, daha sonra (örneğin, bir pH değişikliği ile) çöktürülebilecek, çözünebilir bir taşıyıcıya bağlanır. ii. Affinite ayrıştırması: Ligand, suda çözünebilen ve ligandın bağlanmasıyla tercihen saf sıvı fazla denge durumunda olan sıvı polimer faza ayrışan (PEG gibi) bir polimere bağlıdır.

Bütün durumlarda, etkin bir kromatografi için kompleksin birleşme sabitinin (Ka) 10–4–10–8 M aralığında olması gerekir.

162

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

8.3. Materyaller 8.3.1. Matriks Materyalleri

Her türlü kromatografik uygulamada, uygun matriksin seçimi en önemli adımı oluşturmaktadır. Affinite kromatografisi için ideal bir matriksin aşağıdaki karakteristik özelliklere sahip olması zorunludur: i. İnert: Ligandın kovalent olarak bağlanabileceği uygun ve yeterli kimyasal grupları içermelidir, fakat matriksin kendisi saflaştırma reaksiyonlarına katkıda bulunmamalıdır. ii. Kimyasal kararlılık: Saflaştırılacak olan makromolekülün liganda bağlanması ve daha sonra bu molekülün kolondan elüsyonu sırasında kullanılan çözücülere karşı kararlı olmalıdır. Ayrıca, ligandın matrikse bağlandığı koşullar altında da kararlı olmalıdır. iii. Hidrofilik: Özgül-olmayan etkileşimleri en aza indirgeyebilmek için diğer moleküllerle etkileşimi çok zayıf olmalıdır. iv. Gözenek yapısı: Matriksin bütün bölgeleri, örnek materyal içerisindeki moleküllerin çoğu için kullanışlı olmalıdır. Bazı matriksler sadece dış yüzeylerine bağlanmaya izin vermektedirler. Bu nedenle bu tipteki matriksler, büyük moleküller ve hücrelerin ayrıştırılmasında kullanışlıdırlar. İyi akış özellikleri sergilemelidir. v. Sertlik: Matriks, paketleme, elüsyon ve yıkama esnasındaki çözücünün akış basıncına karşı dayanıklı olmalıdır.

Pratikte uniform, küresel ve sert partiküller kullanılmaktadır. Matrikslerin en yaygın olanları ise çapraz-bağlı dekstranlar (Sephacryl S), agaroz (Sepharose, Bio–Gel A), poliakrilamid jeller (Bio–Gel P), polistiren (Bio–Beads S), selüloz, porlu cam ve silikadır. 8.3.2. Ligand Seçimi ve Ayırıcı–Kol

Affinite kromatografisi için seçilecek olan ligandın yapısı, iki faktör tarafından belirlenir. Bunlardan birincisi, ligand, ayrıştırılacak olan makromolekül için özgül ve geri–dönüşümlü olarak bağlama affinitesine sahip olmalıdır. İkincisi ise ligandın, makromolekülü bağlama kapasitesinde bir değişiklik oluşturmadan, matrikse bağlanmasını sağlayacak kimyasal olarak modifiye edilebilir gruplar içermelidir. Buna göre ligandın kimyasal yapısı, saflaştırılacak olan molekülün biyolojik özgüllüğünün önceden bilinmesi ile belirlenir. Pratikte, özel bir bileşiğe karşı tam bir özgüllük gösteren çok özel bir ligandın seçimi, genellikle mümkündür. Alternatif olarak, benzer kimyasal yapıya sahip, birbirleri ile çok yakın ilişkili olan bir grup bileşiği bağlayacak grup seçiciliği gösteren bir ligandın seçimi de mümkündür (Tablo 8.2). Son bahsedilen ligand tipine örnek olarak 5’AMP verilebilir. Bu molekül, birçok NAD+–bağımlı dehidrogenazı geri-dönüşümlü olarak bağlayabilir. Çünkü bu dehidrogenazlar NAD+ molekülünün bir parçasına yapısal olarak benzerdirler. Grup– özgüllüğü gösteren ligandların affinite kromatografisindeki kullanımları ise kısım 8.7’de daha detaylı olarak ele alınmaktadır. Ligand–makromolekül kompleksinin ayrılma (dissosiasyon) sabiti (KD) ise serbest solüsyonlarda 10–4–10–8 M arasında olmalıdır. Kompleksin ayrılma sabitinde rol alan etkileşimlerin değeri, örneğin bir enzim ve bu enzimin zayıf inhibitörü arasındaki bağlama reaksiyonunda olduğu gibi, 10–4 M’dan büyük ise (10-2 M gibi) başarılı bir affinite kromatografisi için bu ligand, oldukça zayıftır. Bunun aksine, şayet kompleksin ayrılma sabitinde rol alan etkileşimlerin değeri, örneğin bir hormon ve bu hormonun reseptörü arasındaki bağlama reaksiyonunda olduğu gibi, 10–8 M’dan küçük ise (10-9 M gibi) liganda bağlanmış olan hormonun, inaktive edilmeden kolondan başarılı bir şekilde elüsyonu, oldukça zordur. Kompleksin ayrılma sabitleri bu değerlerin dışında olduğu zaman, başarılı bir affinite kromatografisinin yapılabilmesi için geliştirilmiş olan metotlar ise ilgili

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

163

kısımlarda yeri geldikçe verilmektedir. Şayet, bağlama kompleksinin gücü hakkında önceden herhangi bir bilgi yoksa, bu durumda deneme–yanılma yolu ile en ideal kromatografi koşulları belirlenebilir. Tablo 8.2: Affinite kromatografisinde sıklıkla kullanılan grup–özgüllüğü gösteren ligandlar. Ligand

Affinite +

5’ AMP

Kofaktör olarak NAD içeren enzimler ve ATP–bağımlı kinazlar

2’,5’ ADP

Kofaktör olarak NADP+ içeren enzimler

NAD, NADP

Dehidrogenazlar

Kalmodulin

Kalmodulin–bağlama kinazları, fosfodiesterazlar, siklik ve diğer enzimler

Avidin

Biyotin–içeren enzimler

Yağ asitleri

Yağ asidi–bağlama proteinleri

Heparin

Lipoproteinler, lipazlar, koagülasyon faktörleri, DNA polimerazlar ve restriksiyon endonükleazlar, steroid reseptör proteinler, çok sayıdaki büyüme faktörleri

Protein A ve G

İmmünoglobulinler

Konkanavalin A

Terminal olarak α–D–mannopiranozil ve α–D–glukopiranozil içeren glikoprotein kalıntıları

Soya lektini

Glikoprotein içeren N–asetil–α–(veya β)– D–galaktopiranozil kalıntıları

Fenilboronat

Glikoproteinler

Poli–A

Poli–U dizilimi içeren RNA molekülleri, bazı RNA özgül proteinler

Poli-U

Poli–A dizilimi içeren RNA molekülleri, bazı RNA özgül proteinler

Histonlar

DNA molekülleri

Lizin

r–RNA, plazminojen, çift–zincirli DNA

Arjinin

Proteazlar ve prothrombin, prekallikrein ve clostripaini de içeren zimojenler

Benzamidin

Tripsin, ürokinaz, kallikrein ve prekallikreini de içeren proteazlar

Buğday germ lektini

N–asetil–D–glukozamin

Polimiksin

Endotoksinler

Blue B

Kinazlar, dehidrogenazlar, nükleik asit bağlama proteinleri

Cibacron Blue F3G–A

Nukleotid kofaktöre sahip olan enzimler, koagülasyon faktörleri, serum albumin

Biyomoleküllerin aktif bölgeleri ise genellikle molekülün üç–boyutlu yapısı göz önüne alındığında, molekülün iç kısımlarında yer almaktadır. Bu nedenle, enzim kofaktörleri gibi küçük ligandların doğrudan doğruya matriksin yüzeyine bağlanması, matriks ile liganda bağlanacak olan makromolekül arasındaki yapısal (sterik) engellemeden dolayı düşük verimlilikle sonuçlanmaktadır. Böyle durumlarda ise ligandın matrikse bağlanması esnasında, ligandın makromolekülü bağlama yeteneğinde bir değişikliğin olmaması için, genellikle ligand ile matriks arasına bir ayırıcı–kol koymak avantajlıdır. Böylece, ligandın matriks yüzeyinden uzaklaştırılması sağlanarak, ligand ile makromolekülün etkili bir şekilde bağlanması garantilenmiş olur (Şekil 8.3). Bu ayırıcı–kolların uzunlukları ise oldukça önemlidir. Şayet ayırıcı–kolun uzunluğu çok kısa ise, bu durumda ayırıcı–kol etkisiz olacağından ligand, örnek içerisindeki özgül makromolekülünü bağlayamayacaktır. Şayet ayırıcı–kolun uzunluğu çok fazla ise, ligand ile makromoleküller arasında özgül-olmayan etkileşimler meydana gelmekte ve ayrıştırmanın seçiciliğini düşürmektedir. O’Carra ve arkadaşları (1973), çok uzun ayırıcı–kolların örnek içindeki makromolekülleri hidrofobik etkileşimler ile bağladıklarını göstermişlerdir. Affinite kromatografisinde ise özgül-olmayan

164

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

hidrofobik etkileşimler istenmeyen bir durumdur. Bunun yanı sıra, tutuklu hidrofobik gruplar ile proteinlerin üzerindeki hidrofobik bölgeler arasındaki etkileşim, bu proteinlerin hidrofobisitelerindeki farklılıklardan yararlanılarak ayrıştırılmasını sağlayan hidrofobik interaksiyon kromatografisinin temelini oluşturmaktadır (bkz. 9. Bölüm). Ayırıcı–kolların boyları için optimum uzunluk ise 6–10 C atomu veya bunun eşdeğerinde bir mesafedir.

Şekil 8.3: Ayırıcı–kolların prensibi. (a) Ligand, doğrudan doğruya matrikse bağlanmıştır. (b) Ligand, bir ayırıcı–kol aracılığı ile matrikse bağlanmıştır.

Bazı durumlarda bu ayırıcı–kolun kimyasal yapısı, saflaştırma işleminin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bazı ayırıcı–kollar tamamen hidrofobiktir ve çok yaygın olarak da metilen gruplarından ibarettirler; diğerleri ise hidrofiliktir ve karbonil veya imido gruplarına sahiptirler. Sonuç olarak ayırıcı–kollar, küçük tutuklu ligandlar için çok daha önemlidir, fakat saflaştırılacak olan makromolekülü bağlama bölgeleri matriksten iyi bir şekilde uzaklaştırılabilen makromoleküler ligandlar için (örneğin, immünoaffinite kromatografisinde) gerekli değillerdir. Çok sayıda farklı ayırıcı–kollar kullanılmaktadır. Sıklıkla kullanılmakta olan ayırıcı–kollara verilebilecek bazı örnekler ise 1,6–diaminohekzan, 6–aminohekzanoik asit ve 1,4–bis–(2,3– epoksipropoksi)bütan’dır. Bu ayırıcı–kollar, ligandın bağlanabileceği ikinci bir fonksiyonel gruba sahip olmak zorundadırlar. Bu ikinci fonksiyonel gruba ligandın bağlanması ise genellikle, süksinik anhidrit ve suda çözünebilen karbodiimidin kullanımını gerektiren, organosentetik prosedürlerle gerçekleştirilir. Birçok agaroz, dekstran ve poliakrilamid tipteki destek materyali, acil kullanımlar için çeşitli ayırıcı–kollar ve ligandlarla önceden bağlanmış hazır şekilde, ticari olarak bulunabilir. Ligandların örnekleri ise Tablo 8.2’de verilmektedir. 8.3.3. Ligandın Matrikse Bağlanması

Ligandın, makromolekülle (antijen) geri-dönüşümlü olarak bağlanmasında rol almayan fakat, ligandı matrikse kovalent olarak bağlamada kullanılabilecek uygun kimyasal grupların en yaygın olanları ise –NH2, –COOH, –SH ve –OH (fenolik ve alkolik) gruplarıdır. Örneğin, amin (–NH2) grubu içeren bir enzim inhibitörü (ligand), bu amin grubu aracılığı ile matrikse tutturulduğunda, enzim ile özgül olarak bağlanabilme aktivitesini korur. Bunun yanı sıra, şayet inhibitörün yapısındaki amin grubu, bu inhibitörün enzimi ile bağlanma reaksiyonunda rol alıyorsa, inhibitörün matrikse tutturulması, enzim ile bağlanma reaksiyonunda rol almayan başka bir grup aracılığı ile gerçekleştirilir. Ligandın matrikse tutturulmasında kullanılabilecek gruplar hakkında herhangi bir bilginin olmadığı durumlarda ise sistematik deneme–yanılma yolları kullanılabilir. Ligandın matrikse bağlanmasında kullanılan en yaygın metot, matriksin önceden siyanojen bromid (BrCN) ile muamelesini gerektirir (Şekil 8.4,a). Reaksiyon koşulları ve ayıraçların göreceli oranları, her matriks molekülüne bağlanabilecek ligand molekülünün sayısını belirler. Alternatif ligand bağlama prosedürleri ise epoksilerin, N–hidroksisüksinimid esterlerinin, N,N’– karbonildiimidazolün (CDI), sülfonil kloridin, sodyum periodatın ve diklorotriazinlerin kullanımını

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

165

gerektirir (Şekil 8.4). Bu bağlama ayıraçları kullanılarak, önceden aktive edilmiş birçok matriksi ticari olarak bulmak mümkündür. Siyanojen bromid ile matriksin reaksiyonu, reaktif bir matriksin oluşumuyla sonuçlanır (Şekil 8.4,b). Bu reaktif matrikse ise ılımlı reaksiyon koşulları altında proteinler, nükleik asidler veya diğer polimerler, birincil amino grupları veya benzer nükleofilik grupları aracılığı ile ligand olarak (L) bağlanabilirler (Şekil 8.4,c). Siyanojen bromid, matriks üzerindeki OH grupları ile reaksiyona girer. Siyanojen bromid ile aktive edilmiş matrikslerde baskın aktif gruplar ise siyanat ester gruplarıdır. Aktive edilmiş siyanat ester grupları ise protein ve nükleik asit gibi ligandların (L) birincil amino grupları ile reaksiyona girerek izoüre bağlantısını oluşturur (Şekil 8.4,c). Örneğin, BrCN ile aktive edilmiş Sepharose 4B’ye insan hemoglobini bağlanarak, anti–hemoglobin antikorları fraksiyonlanmıştır. Bu fraksiyonlama prosesinde ise elüsyon, azalan pH ve artan asetik asit gradienti ile gerçekleştirilmiştir. (a)

M

(b)

OH + BrCN

M

O C N

M

O CH2 CH

(c)

+ NH2

M

O C NH

M

O CH2 CH CH2 NH-L

L

Siyanojen bromid

M

OH + H3C CH

CH2

CH2 O

OH

Epoksi O Cl

M

N

OH +

M

N

O

M

N

N

R N Cl Diklorotriazin

M

Cl

N

O

M

R

M

O SO2CH2CF3

O NH-L O

O

M

OH

HOOC

N

N

M M

O

C

N

N

R

OH + ClSO2CH2CF3 Tresilklorid

NH-L

N

N

N

M

M

O

C

NH-L

Karbonildiamidazol Matriksteki + fonksiyonel OH grupları

Aktivatör ajanları

Aktif Matriks (reaktif gruplar + içermektedir)

L-NH2

Tutuklu ligand (L)

Şekil 8.4: Affinite kromatografisinde ligandların (L) tutuklanması için kullanılan aktivasyon reaksiyonlarının bazı örnekleri.

Ligandın aktive matrikse bağlanması sırasında, ligandın sterik etkileri kadar ayırıcı-kolun özelliklerini de göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Ligandın küçük bir molekül olması durumunda, yüksek derişimlerde ligand kullanımı, matriks üzerindeki bazı aktif bölgelerin bloke edilmesine ve bunun sonucunda da bağlama verimliliğinin düşük olmasına yol açar. Aynı şekilde ligandın büyük bir molekülden oluşması durumunda ise ligand, çevresindeki aktif bölgeleri bloke ederek yine bağlama verimliliğinin düşük olmasına yol açar. Ayırıcı-kol ve ligand ise ayırıcı-kolun gereğinden uzun olması durumunda, ileri-geri dalgalanarak yine matriks üzerindeki bazı aktif bölgelerin bloke edilmesine yol açabilir. Bu nedenle genel bir kural olarak, aktif matrikse bağlanacak olan ligandın miktarının matrikse oranı: 10 mg ligand/1 mL jel olmalıdır. Bu oran aynı zamanda, moleküler kütlesi ortalama 50 kDa olan proteinler için de uygulanabilir. IgG (5 mg mL–1)

166

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ve IgM (1 mg mL–1) gibi daha büyük moleküller veya düşük ayrılma sabitine (KD) sahip olan moleküller için ise daha düşük miktarlar uygulanabilir. Ligand ve aktive matriks karıştırıldıktan sonra karışım, çalkalanarak karıştırılmalıdır. Karıştırma işleminde, manyetik karıştırıcıların kullanılmasından ise matriks yapısının bozulmasına yol açması nedeni ile kaçınılmalıdır. Verimli bir bağlama işleminin gerçekleştirilebilmesi için karışımı oluşturan bağlama tamponu (ligandı içermektedir) ile aktive matriksin oranı, yaklaşık 2:1 olmalıdır. Bu prosesler boyunca karışımın pH’sı, iyonik kuvveti ve iyon içeriği ise dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Bağlama reaksiyonu ise genellikle oda sıcaklığında 2-4 saatte, soğukta (4 °C) ise 16 saatte gerçekleştirilmektedir. Bağlama işleminin gerçekleştirileceği sıcaklık ve zaman ise ligandın çözünürlüğü ve işlem için sahip olunan zaman tarafından belirlenmektedir. Ligandın bağlanmasında optimum sonucun elde edilebilmesi için kullanılacak olan aktive matriksin yapısına bağlı olarak, üretici firmanın talimatları da kesinlikle göz önünde bulundurulmalıdır. Ligandın matrise bağlanması tek bir noktadan olabileceği gibi birden fazla noktadan da olabilir. Tek bir noktadan bağlanan liganda örnek olarak, ligandda bulunan tek bir primer aninin siyanojen bromid aracılığı ile matrikse bağlanması verilebilir. Bu tipteki bir bağlama, liganda en iyi esnekliği sağlamakta ve bu esneklik sayesinde ise ligand, antijenin aktif bölgesine en iyi şekilde ulaşabilmektedir. Tek noktadan bağlama ise sadece, ligand üzerinde bulunan ikincil ve üçüncül aminlerin bloke edilmesi sonucunda sağlanabilmektedir. Çoklu-noktadan bağlama ise tek noktadan bağlamaya göre daha kuvvetlidir ve bu nedenle, kolonun kullanılması esnasında ligandın kolondan akması çok daha az bir ihtimaldir. Buna rağmen, çoklu-noktadan bağlama, genellikle ligandın aktif bölgelerinin bloke olmasına yol açmaktadır. 8.3.4. Reaksiyona Girmeyen Reaktif Grupların Bloke Edilesi

Ligandın matriks ile inkübasyonundan sonra, ligandın fazlası uzaklaştırılır ve aktive matriksin reaksiyona girmeyen reaktif bölgeleri bloke edilir. Ligandın matrikse bağlanması sırasında matriksin reaktif bölgelerinin bazısı reaksiyona girmeden kalır. Reaksiyona girmeyen bu reaktif bölgeler ise örnek materyali içerisindeki hedef moleküller veya kirleticiler için özgül-olmayan potansiyel etkileşim bölgelerini oluştururlar. Bu nedenle, matriks üzerindeki reaksiyona girmeyen reaktif bölgelerin bloke edilmesi gerekmektedir. Bu bölgelerin bloke edilmesi ise en kolay yoldan, ya reaktif bölgelerin elektriksel yükünün aksi bir yüke sahip olan bileşiğin kullanılması ile ya da matrikse kovalent olarak bağlanması ile başarılabilir. Örneğin, bir ligandın aktive matrikse bağlanması için matriksin karboksil grubu (–COO–) ile ligandın amin grubundan (–NH2) yararlanılıyorsa, reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin bloke edilmesi Tris veya etanolamin solüsyonu (0,1–1 M) ile gerçekleştirilebilir. Aktive matrikse ligandın bağlanmasında matriksin amin grubundan (–NH2), ligandın ise karboksil grubundan (–COO–) yaralanılıyorsa, bu durumda reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin bloke edilmesi için ise asetik asit kullanılabilir. Aktive matriksin reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerini bloke etmek için kullanılan bileşiğin derişimi, matriks üzerinde bulunan reaktif bölgelerin derişiminden fazla olmalıdır. Bu amaçla, genellikle ligand derişiminin 5-10 misli bir derişimin kullanılması yeterli olmaktadır. Bu sayede matriks üzerindeki reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin tamamının bloke edilmesi garantilenmiş olur. Affinite kromatografisi ile iyi bir saflaştırmanın sağlanabilmesi için reaktif bölgeleri bloke etmekte kullanılan solüsyonun pH’sının kontrolü de kritik bir öneme sahiptir. Çok yüksek ya da çok düşük bir pH değeri, reaktif bölgelerin bloke edilmesini önleyebilir veya matriksin, hatta matrikse bağlanmış olan ligandın dahi yapısını bozabilir. Reaktif bölgelerin bloke edilmesi genellikle oda sıcaklığında 2-4 saat arasında gerçekleştirilir fakat, soğukta (4 °C) daha uzun zaman almaktadır.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

167

Reaktif bölgelerin bloke edilmesi tamamlandıktan sonra, fazla bileşiğin uzaklaştırılması için kolon materyali yıkanır ve örnek materyali yüklemeden önce kolon hacminin 5-10 misli başlangıç tamponu ile dengelenir. 8.3.5. Bağlama Verimliliğinin Taranması

Ligandın matrikse bağlanma miktarı, hem kolonun ayrıştırma verimliliğini hem de kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarını, yani kolonun kapasitesini ve dolayısı ile saflaştırılmış olan örneğin miktarını belirlemektedir. Matrikse bağlanmış olan ligandın miktarı ise birkaç yoldan belirlenebilir: i. Ligandın matrikse bağlanmadan önceki ve bağlandıktan sonraki UV absorbsiyonlarının farklılığı belirlenir: a. Protein yapıdaki ligandlar için A280 değeri en iyi sonucu vermektedir. Diğer yapıdaki ligandlar için ise en iyi sonucu veren özgül dalga boyları seçilmelidir. Örneğin, heme grubu içeren ligandlar için A405 kullanılabilir. Bu arada, seçilmiş olan dalga boyunda absorbsiyon gösteren tamponların (örneğin, dithiothreitol veya Tris tamponlarının yüksek derişimleri) kullanılmasından ise kaçınılmalıdır. b. Kolorimetrik protein asseyi yapılabilir. c. Flouresans dedeksiyon yöntemi kullanılabilir (kolorimetrik yöntemden daha hassastır). ii. Ligand içeren jelin bir kısmı uygun bir tampon içinde çözündürülerek, protein asseyi, toplan azot tayini veya amino asit analizi yapılır. iii. Aktivite testi yapılabilir (küçük bir bağlama deneyi). iv. Radyoaktif madde işaretli bir ligand kullanılır veya radioimmünoassay (RIA) testi yapılır (bu durumda radyoaktif madde içeren ligandın matrikse bağlanma oranının, radyoaktif madde içermeyen ligand ile aynı oranda olduğu varsayılmaktadır). 8.4. Pratik Prosedürler

Affinite kromatografisinin prosedürü, diğer sıvı kromatografi şekillerinde kullanılanlara benzerdir. Bununla birlikte, affinite kromatografisi ile ayrıştırmada en iyi metot, saflaştırılmak istenen her bir molekülün özelliğine göre farklı olacaktır. Buna rağmen, burada ise genel bir prosedürden bahsedilerek, özgül uygulamalar için bir fikir oluşturulması amaçlanmış ve bazı özgül uygulamalara ise ilgili kısımlarda daha detaylı olarak yer verilmiştir. Affinite kromatografisinin genel prosedürlerini içeren bir şema ise Şekil 8.5’de verilmektedir. Destek materyalinin tipine özel olarak, ligandla muamele edilmiş matriks, bir kolonun içerisine normal yollarla paketlenir. Kullanılacak tampon, ligand–makromolekül etkileşimi için gerekli olan (metal iyonları gibi) kofaktörleri içermelidir. Örnek materyali kolona yüklendikten sonra, özgül-olmayan bağlanmaları ve kirleticileri uzaklaştırmak için kolon, daha fazla tamponla yıkanır. Saflaştırılmakta olan bileşik, liganddan özgül veya özgül-olmayan elüsyon yöntemlerinin birisi ile uzaklaştırılabilir. Özgül-olmayan elüsyon, pH’da veya iyonik kuvvette meydana getirilecek bir değişimle elde edilebilir. Asetik asit veya amonyum hidroksit kullanılarak yapılan pH değiştirme elüsyonu, ligand ve/veya makromolekülde, ligand–makromolekül bağlanmasında kritik olabilecek grupların iyonizasyon bölgelerinde değişime neden olur. İyonik güçteki bir değişim, pH’daki değişim ile birlikte olmasına gereksinim olmadan, ligand–makromolekül etkileşiminin bozulmasına yol açtığı için makromolekülün elüsyonuna neden olur; bu amaç için genellikle 1 M NaCl kullanılır. Şayet elüsyon, bir pH değişimi ile elde edilmiş ise ve toplanan fraksiyonların pH’ları, protein denatürasyonuna neden olabilecek sınırlar içerisinde ise bu fraksiyonların pH’ları yeniden optimize

168

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

edilmelidir. Saflaştırılmak istenen hedef molekülün bir enzim olması durumunda ise affinite elüsyonu uygulanabilir. Bu durumda enzimin kolondan elüsyonunun sağlanabilmesi için yüksek derişimlerde substratın veya enzime geri-dönüşümlü olarak bağlanabilen bir inhibitörün, ya da enzimin tutuklanmış liganda olan affinitesinden daha fazla affinite gösterdiği ligandların, elüsyon sıvısı içerisinde kolona ilavesi gerekir. Neticede, saflaştırılan materyal, özgül elüsyon ajanları ile ya da yüksek derişimlerde tuzla kontamine olmuş tamponlar (hareketli fazlar) içinde bulunmaktadır ve saflaştırma tamamlanmadan önce, bunların jel filtrasyonu ve diyaliz gibi tekniklerle uzaklaştırılması gerekmektedir. Grup-özgül adsorbent var mı?

EVET

Uygun Ligand seçilir

Ligandın bağlanacağı uygun matriks seçilir

Ligand matrikse tutuklanır: -Jel şişirilir ve yıkanır -Ligand jele bağlanır -Gerekli ise fazlalık aktif gruoplar bloke edilir -Jel yıkanır

Jel uygun bir kolona paketlenir

Kromotografi ekipmanı kurulur

Paketlenen kolon 2-3 kolon hacmi tampon ile dengelenir

Örnek yüklenir

Bağlanmamış moleküller ve kirleticiler yıkanarak uzaklaştırılır

Liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu gerçekleştirilir

Fraksiyonlar diyalize tabi tutulur

Jel rejenere edilir

Ayrıştırma işleminin analizi yapılır

Deneysel koşullar optimize edilir

Şekil 8.5: Affinite kromatografisinin genel prosedürleri.

Gerekli ise jel şişirilir

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

169

8.5. Affinite Kromatografisinin Uygulamaları

Affinite kromatografisi ile çok geniş çeşitliliğe sahip, reseptör proteinleri ve immünoglobilinleri de içeren, enzimler ve diğer proteinler saflaştırılmıştır. Tekniğin uygulanabilirliği, sadece tutuklanmış ligandların bulunup bulunmadığı ile sınırlıdır. Affinite kromatografisinin temel prensipleri, nükleik asitlere kadar uzanmış olup, moleküler biyolojideki gelişmelere hatırı sayılır katkılarda bulunmuştur. Örneğin, poli–U Sepharose 4B üzerinde, selektif hibridizasyonla poli–A kuyruğuna sahip olan m–RNA’lar rutin olarak izole edilmektedir. Tutuklanmış tek–zincirli DNA’lar ise kendilerine komplementer olan RNA ve DNA moleküllerinin izolasyonunda kullanılabilir. DNA ve RNA moleküllerinin izolasyonu, kolonlardan elde edilebileceği gibi genellikle, nitroselüloz membranlar üzerinde tutuklanmış tek zincirli DNA veya RNA’lar (prob) kullanılarak da yapılmaktadır. Tutuklanmış nükleotidler, nükleik asit metabolizması için gereken proteinlerin izolasyonunda da kullanışlıdırlar (bkz. kısım 8.7.5). Affinite kromatografisinde önemli bir gelişme, heterojen bir hücre karışımının homojen popülasyonlar şeklinde ayrılmasında kullanılması ile ortaya çıkmıştır. Affinite kromatografisi ile hücrelerin ayrılmasında kullanılan tekniğin temeli, hücre yüzeylerinin antijenik özelliklerine veya hücre yüzeyi üzerindeki dışarıya uzanan karbonhidrat yapıların kimyasal yapısına veya bir özgül membran reseptörü–ligand etkileşimine dayanır. Affinite kromatografisinde kullanılan tutuklu ligandlardan protein-A; IgG’nin Fc bölgesi, bir lektin veya bir membran reseptörü için özgüldür (bkz. kısım 8.7.6.1). 8.6. İmmünoaffinite Kromatografisi

İmmünoaffinite kromatografisinde adsorbent olarak, sıklıkla immünoadsorbentler veya immünosorbentler olarak adlandırılan antikorlar veya antijenler kullanılmaktadır. Özellikle saflaştırılacak olan antijenin bilinen bir komplementer ligandının bulunmadığı durumlarda, monoklonal antikorlar bu tip antijenlerin saflaştırılmasında oldukça kullanışlı immünoadsorbentleri oluşturmaktadırlar. Günümüzde ise monoklonal antikorlara dayalı adsorbentler, geleneksel olan poliklonal antikorlara dayalı immünoadsorbentlerin yerini tamamen almış durumdadır. Buna rağmen, hem poliklonal hem de monoklonal antikorların kullanıldığı immünoadsorbentler bulunmaktadır. Bu immünoadsorbentler ise birbirine göre hem avantajlara hem de dezavantajlara sahiptirler. 8.6.1. Temel Prensipler

İmmünoaffinite kromatografisinin uygulanması için gerekli olan immünoadsorbentlerin elde edilmesi ve protein örneklerinin ayrıştırılması için gerçekleştirilmesi gereken temel adımlar aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. İmmünoadsorbentin elde edilmesi için matrikse bağlanacak olan ligandın (antikor) elde edilmesi için gerekli olan protein (antijen) diğer protein saflaştırma teknikleri ile saflaştırılır. Saflaştırılan protein ise bu proteinin elde edildiği kaynaktan evrimsel olarak farklı bir memeli hayvanın immünizasyonunda kullanılır. Monoklonal antikorların üretimi için genellikle fare (bkz. kısım 8.6.3), poliklonal antikorların üretimi için ise tavşan veya keçi kullanılır (bkz. kısım 8.6.2).

Alternatif olarak, hedef proteinin sentezinden sorumlu olan genin izolasyonu ve dizilenmesi sonucunda, bu proteinin yaklaşık 15 amino asitlik bir kısmı kimyasal olarak sentezlenir. Hedef proteinin 15 amino asitlik parçasının kimyasal olarak sentezlenmesi sırasında yapıya bir sistein eklenmesi ise kullanışlı olabilir. Çünkü peptid dizisine eklenen sistein, bu diziye bovin serum albümin veya karından ayaklı (omurgasız) hemosiyanininin eklenmesini kolaylaştırmak için reaktif bir kalıntıyı oluşturmaktadır. Bu işlemler sonucunda elde edilen konjugat ise antijen olarak kullanılır.

170

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ii. Antijene karşı antikorların üretilmesi sağlanır. Poliklonal antikor üretimi için kullanılan antijenin mümkün olduğunca saf olması önemlidir (bkz. kısım 8.6.2). Aksi takdirde, eser miktarda dahi olsa kirletici olarak bulunan diğer proteinlerin antijenitesi çok daha yüksek olabilir ve sonuçta karışık özgüllükte antikor üretimine yol açabilir. Monoklonal antikor üretimi (bkz. kısım 8.6.3) için kullanılacak olan antijenin saflığı ise şayet, uygun klonların seçimi için bir tarama prosedürü kullanılacaksa, göreceli olarak daha az önemlidir. Gerçekte ise tarama prosedürleri sonucunda kirletici proteinlere ait antikor klonlarının elemine edilebilmesi nedeniyle, %1 oranında hedef protein içeren antijenlere karşı geliştirilmiş olan monoklonal antikorlar izole edilebilmektedir. iii. Antikor, tavşan serumundan (poliklonal) çökeltme veya diğer yöntemlerle (bkz. kısım 8.6.4) kısmi olarak saflaştırılır. Antikorların saflaştırılmasını sağlayan daha iyi bir prosedür ise ters (revers) immünoaffinite kromatografisidir. Bu prosedürde, tutuklanmış antijeni içeren kolon materyali ile doldurulmuş olan kolona serum yüklenir. Serumdaki özgül antikorlar tutuklu antijenlerine tutunurken, serum ve diğer kirleticiler kolondan ayrılır. iv. Saflaştırılmış olan antikorlar ise bikarbonat/karbonat tamponu (pH 8-9) ile, aktive kolon matriksine (siyanojen bromid-, tosil-, vinilsülfon-aktive v.b) bağlanır (bkz. kısım 8.3.3 ve kısım 8.6.5). v. Saflaştırılmak istenen proteini içeren örnek materyalinin ham özütü (veya kısmi olarak saflaştırılmış olması tercih edilir) kolona yüklenir. Bağlanmamış materyallerin kolondan uzaklaştırılması için uygun bir tampon ile kolon yıkanır. vi. Hedef protein kolondan elüe edilir.

İmmünoaffinite kromatografisinin uygulanmasındaki bu basmaklar arasında en zor olanlarını ise i. ii. ve vi. basamaklar oluşturmaktadır. Burada ise i. basamağın, alternatif protein saflaştırma teknikleri ile başarıldığı var sayılarak, takip eden kısımlarda antikorların üretiminden başlamak üzere diğer basamaklar ele alınmaktadır. 8.6.2. Poliklonal Antikorların (Antisera) Üretimi Poliklonal antikor terimi, bir hayvansal organizma serumunda bulunan antikorların toplam popülasyonunu belirtmektedir. Bu kompleks antikor popülasyonu ise Tablo 8.3’de özetlenen beş farklı altsınıfı içermektedir. İmmünokimyasal yöntemlerde kullanılan antikorların çoğu, uygun antijeni içeren süspansiyon veya solüsyonların bir tavşana enjekte edilmesiyle oluşturulur veya tetiklenir (indüklenir). Uygun bir zaman sonra, aşılanmış olan tavşanın kulak posterior marjinal toplar damarından 5-50 mL kan alınır (kanatma). Alınan kanın 37 °C’da bir saat bekletilmesi sonucunda çökelmesi sağlanır. Oluşan pıhtı tüpten alınarak, 4 °C’da bekletilir ve böylece hacminin küçülerek 2-25 mL serumun daha elde edilmesi sağlanır. Elde edilen serum, santrifüjlenerek hücrelerden arındırılır. Santrifüjlenen serum, 56 °C’da 45 dakika inkübe edilerek, proteazların ve komplementlerin inaktivasyonu sağlanır. Daha sonra serum, küçük hacimlere bölünerek genellikle –20 °C’da depolanır. Kontrol serum ise aynı tavşanın aşılanmadan önceki kanından elde edilir. Koyun, keçi ve atlar ise daha fazla miktarda antiserum üretiminin gerektiği durumlarda kullanılmaktadır.

Kuvvetli bir antijenik bileşiği içeren fizyolojik solüsyon ile bir defa enjekte edilmiş bir tavşanın kanında, tespit edilebilir düzeyde antikor üretimi genellikle 10 gün sonra gerçekleşir. Antikor üretimi ise enjeksiyonun yapılmasından 15-20 gün sonra maksimum düzeye ulaşır ve daha sonraki birkaç hafta içindeyse serumdaki antikor üretimi düşmeye başlar. Bu birincil humoral immün cevap olup, çoğunlukla IgM antikorlarının üretimi ile sonuçlanır. İkincil humoral immün cevap ise aynı antijenin birinci enjeksiyonundan sonra oluşturduğu birincil humoral cevaptan herhangi bir zaman sonra, antijenin aynı hayvana yeniden enjekte edilmesiyle oluşturulabilir. İkincil humoral cevap ise

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

171

birinciye oranla, çok daha kısa bir zamanda gerçekleştirilebilmekte ve bazı durumlarda, yüksek orandaki antikor seviyesi ise enjeksiyondan sonraki üç günü takiben tespit edilebilmekte; maksimum seviyeye ise ikinci enjeksiyondan sonraki on günlük süre sonunda ulaşmaktadır. IgM antikorlarının seviyesi ise birincil humoral cevaptaki kadar olmakta, fakat IgG seviyesi ise birincil humoral cevaba oranla 3–10 kat daha artmaktadır. Aynı antijenin iki hafta aralıklarla tekrar tekrar enjeksiyonu ise hiperimmünize tavşanın meydana gelmesine neden olur. Hiperimmünize tavşanın serumu ise özgül IgG antikorlarını çok yaygın olarak bulundurmaktadır (1-5 mg özgül IgG cm-3). Tablo 8.3: İmmünoglobilin sınıflarının fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri. İmmünoglobilin sınıfı

IgG

IgM

IgA

IgD

IgE

Ağır zincir sembolü

γ

μ

α

δ

ε

Ağır zincir Mr (kDa)

50

70

55

65

65

γ2κ2

(μ2κ2)5; Ja

α2λ2, α2κ2

δ2κ2,

ε2κ2,

δ2λ2,

ε2λ2,

Moleküler kompozisyonu

γ2λ2

(μ2λ2)5; J

b

(α2λ2)2Sc ; J (α2κ2)2Scb; J

Fiziksel durumu

Monomer

Pentamer

Monomer

Monomer

Monomer

150

900

160-380b

180

200

Valans

2

5-10

2, 4a

2

2

Karbonhidrat içeriği (%)

3

12

7,5-10

12

12

Merkaptoetanole duyarlılık

_

+

_

_

_

Isı duyarlılığı (56 °C, 4 saat)

+

+

+

?

_

Komplement fiksasyonu

+

++

_

_

_

8-16

0,6-2

1-4

0,001

0,0003

23

5

6

3

2

Mr (kDa)

Normal serum düzeyi (mg cm–3) Yarı ömrü (gün) a b

J (Joining) zinciri: IgA ve IgM antikor moleküllerinin polimerizasyonunda rol alan bir polipeptiddir. Eksternal salgılarda dimer olarak, Sc ile gösterilen ikinci bir komponent bulundurur.

Zayıf antijenik bileşiklerin kullanılması durumunda, antiserumdaki özgül antikorların kolayca belirlenebildiği titre’ye ulaşılması için iki yaklaşım bulunmaktadır. Birincisi, ya inokülasyon miktarı ile ya da tavşana inoküle edilen antijenin tavşanda oluşturduğu antijen deposundan haftalar süren yavaş yavaş salınması ile antijene maruz kalan immün sistem süresi uzatılmalıdır. Antijen deposundan antijenin uzun süre yavaş yavaş salınması ise, partikül veya çökelti halindeki antijenin intramusküler, subkütanoz veya interdermal inokülasyonuyla başarılabilir. İkincisi ise bileşiğin antijenitesini artırmak için adjuvant kullanımıdır. Alüminyum potasyum sülfat ise tetanus ve difteri toksinleri gibi çözünebilir, proteinik antijenlerin birçok hayvansal organizma türüne inokülasyonundan önce, bu antijenlerin çökeltilmesinde kullanılan basit bir adjuvanttır. Bu teknik, antijenin yavaş yavaş serbest bırakılması ile sonuçlanan bir teknik olup, antijenin uzun süreli olarak enjeksiyonunu mimikri etmekte ve immün cevapta yer alan makrofajlar tarafından antijenin kolayca yakalanmasına ya da fagosite edilmesine neden olmaktadır. İnsan dışındaki türlerde en çok kullanılan bir adjuvant ise sıvı parafin gibi beyaz mineral yağların, mannid monooleat gibi bir emülsülfürün ve ısı ile öldürülmüş Mycobacterium

172

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

tuberculosis’in farmosötik bir karışımından oluşan Freund’un komple adjuvantı’dır. Genellikle, Freund’un komple adjuvantı’nın eşit bileşenlerinden ve antijen solüsyonundan oluşan karışım emülsiyonunun 1 cm3’ü 3 eşit parçaya bölünür ve her bir parça, tavşanın üç ayrı yerine inoküle edilir. Örneğin, üç eşit parçaya ayrılan emülsiyonun bir parçası subkütanoz olarak, diğer iki parçası ise tek bir büyük inokülasyon yerine iki ayrı bölgeye, arka bacak kaslarına inoküle edilebilir. Bu şekildeki bir inokülasyon, lenf nodlarının sayısını artırır ve böylece, emülsiyon damlacıkları içerisindeki antijen, lenfotik sistem kanalıyla ulaşacağı için potansiyel olarak aktif B-lenfositlerinin sayısını da artıracaktır. Emülsiyon damlacıklarındaki antijen, kan dolaşımına girdiğinde ise dalak ve kemik iliğindeki lenfositleri aktive edebilir. Emülsiyondaki antijen deposu, her inokülasyon bölgesinde kalma eğilimindedir, öldürülmüş tüberküloz basilleri ise inokülasyon bölgesinin retiküloendotelyal hücreler tarafından istila edilmesini stimüle etmektedir. Bu ise antijene karşı oluşturulan immün cevabın daha da artmasına yol açan granuloma* formasyonu ile sonuçlanmaktadır. İmmünokimyasal çalışmalar için antisera oluşturulduğunda ise kanatmanın yapılmasından önce, son bir inokülasyonun yapılması gerekmektedir. Fakat, bu son inokülasyonda kullanılacak olan Freund’un komple adjuvant’ında, tüberküloz basili bulunmamalıdır. Bu emülsiyonda tüberküloz basilinin bulunmaması ise sadece humoral immün cevabın stimüle edilmesine yol açacaktır. Muramil dipeptid (N-asetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamin) ise M. tuberculosis’den izole edilen ve suda eriyebilen bir peptidoglikan olup, en basit adjuvant-aktif bileşiktir. Bu bileşik, Freund’un komple adjuvantına karşı immün cevabın artırılmasına yol açar ve yağ-su emülsiyonundan ziyade, sulu çözelti halinde kullanılabilmektedir. Bakteriyel hücre duvarı bileşenlerinden olan glikopeptidlerin bir analoğu olan ve sentetik olarak sentezlenebilen glikozaminilmuramil peptidi ise immün cevabın modilatörü olarak kullanılabilmektedir. Freund’un komple adjuvantına karşı bir alternatif olan, antijenik-olmayan (non-antijenik), mikrometre büyüklüğündeki β-glukan partikülleri ise vücut ateşinin yükselmesine ve granuloma formasyonuna neden olmadan belirlenebilir bir immün cevap oluşturabilmektedir. Eritrositler veya öldürülmüş bakteriler gibi bazı antijenlerin, izotonik fizyolojik solüsyonlar içinde uygun memelilerin toplar damarı içerisine enjeksiyonu sonucunda, antikorların oluşturulması kolayca başarılabilir. Antiseraların oluşturulmasında, droglar ve peptid-olmayan hormonlar gibi heptanlar kullanılmadan önce, bunların affinite kromatografi materyallerinin hazırlanmasında olduğu gibi proteinler, polisakkaritler veya koyun eritrositleri gibi antijenik yapı ile birleştirilmeleri zorunludur. Antiserum oluşturulduktan sonra, fazla miktarda taşıyıcı makromoleküllerin veya eritrositlerin antiseruma ilavesi, antikorların taşıyıcı moleküllere veya eritrositlere çökelmesine neden olur ve solüsyon içinde sadece heptan için olan antikorların kalmasına neden olur. Daha sonra yapılan santrifüjleme işlemi ile de heptan için mono-spesifik olan antiserum uzaklaştırılır. 200 Dalton’dan çok daha küçük olan heptan dahi, bir memeli organizmada 6 farklı immünoglobilin molekülünün oluşmasını indükleyebilmektedir. Oluşan bu 6 farklı immünoglobilin molekülünün her birisinin amino asit dizisi, birbirinden farklıdır ve her birisi, heptanın yüzeyinin farklı parçaları ile kombine olma yeteneğindedir. Bu nedenle, protein gibi büyük antijenlerin, çok fazla sayıda immünoglobilinlerin oluşumuna neden olması ve oluşan bu immünoglobilinlerin her birisinin, antijenin yüzeyinin çok az farklı bir epitopu** ile bağlanması, şaşırtıcı gelmemektedir. Bu ise, bir antiserum ile minimum seviyede ortak bir yapısal özelliği taşıyan antijenlerin, çok az farklılıkla çapraz reaksiyonlar oluşturmasına yol açacaktır. Antijen yüzeyindeki epitoplar arasındaki *1.

Granuloma: Çevredeki sağlam dokuya oranla sertlik gösteren granulasyon dokusundan ibaret yumru şeklindeki oluşum. 2. Vücutta, bir yabancı cisme, harabiyete veya enfeksiyona karşı savunma reaksiyonu esnasında oluşan, özellikle histiosit ve lenfositlerin oluşturduğu doku, granülasyon dokusu. ** Epitop veya antijenik determinant: Antijen üzerinde bulunan ve kendisi için özgül olan antikor ile bağlanmasını sağlayan küçük bir bölge. Bu bölge, genellikle 1-6 monosakkaritten veya amino asit kalıntısından oluşan ve birbirine kovalent olarak bağlanma zorunluluğu olmayan bölgedir.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

173

etkileşimin sonucu olarak, farklı B lenfosit klonları tarafından her birisi bu epitop için özgül reseptörlere sahip olan farklı immünoglobilinler üretilecektir. Bu nedenle, oluşan antiserum poliklonal antiserum olarak adlandırılmaktadır. Böyle bir poliklonal antiserum içerisindeki her bir immünoglobilinin göreceli miktarı ise antijenin inokülasyon yoluna, türe ve inoküle edilen suşa ve inokülasyon sıklığına bağlıdır. Bu nedenle, antijen-özgül poliklonal antiserum üretiminin standardizasyonu oldukça zor olmaktadır. Çünkü, hayvansal organizmaların çoğu, çok farklı B lenfosit klonlarına sahiptirler. Bu lenfosit klonlarından her birisi, antijen yüzeyindeki farklı epitoplar ile reaksiyon göstermekte ve bu nedenle de B lenfositleri IgG üretimini indüklemekte veya indüklememektedir. Pratikte ise yıllarca çalışılmasına rağmen, poliklonal antiserumdan immünoglobilin moleküllerinin tek bir türünü içeren homojen popülasyonları elde etmek imkansızdır. Buna rağmen, ölümsüz hücre kültürleri ile B lenfositlerinin füzyonu sonucunda oluşturulan hibridomaların ve modern hücre biyolojisi tekniklerinin kullanılması sayesinde, monoklonal antikorların üretilmesine olanak sağlamıştır (bkz. kısım 8.6.3). 8.6.2.1. Poliklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları Avantajları: i. Antikor popülasyonu içerisinde çoklu alt-sınıflar ve yüksek affiniteli antikorlar bulunur. ii. Çoklu özgüllük gösteren antikorlar, antijenik determinantları (epitopları) sırsı ile tanıdıkları gibi konformasyonal olarak da tanırlar. iii. Bir protein için özgül olan antikorlar, çoklu determinantları da tanımalıdırlar (bu özellik, şayet gen ekspresyon bankaları için taranıyorsa özellikle önemlidir). iv. 2D-PAGE ile tek adımda kolayca saflaştırılan proteinler için oldukça özgül olan poliklonal antiseralar kolayca geliştirilebilir. v. İmmünopresipitasyonun kullanıldığı deneylerde uyumludur. Dezavantajları: i. İstenilen özgüllüğün elde edilebilmesi için immünojenin (antijenin) oldukça saf olması gerekmektedir. ii. Çoklu antijenik determinantların poliklonal antisera tarafından tanınması nedeni ile kompleks antijenlerin her bir domaininin çalışılması oldukça zordur. iii. Antikorların miktarı, immünize hayvanın hayatı ile sınırlıdır. iv. Antikorların affinitesi, özgüllüğü ve alt-sınıflarının değişmesi nedeni ile her kanatma ayrı ayrı karakterize edilmek zorundadır. 8.6.2. Monoklonal Antikorların Üretimi

Sağlıklı bir insanın serumundan fraksiyonlanan IgG’nin elektroforetik tekniklerle ayrıştırılması sonucunda, 105-106 farklı IgG molekülünün var olduğu bulunmuştur. Buna rağmen, miyolemal hastalıklardan muzdarip olan sağlıksız bir bireyin serumundan elde edilen IgG fraksiyonu ise çok daha az sayıda IgG molekülleri içermektedir ve bu moleküllerin büyük bir çoğunluğunu ise tek bir tip IgG molekülü oluşturmaktadır. Böyle bireylerin dolaşım sistemlerinde sirküle eden lenfositlerin çoğu, miyolema hücreleridir ki bunlar, neoplastik B lenfositlerinin tek bir klonunu içermektedirler. Normal B lenfositlerine benzemeyen miyolema hücreleri ise hızlı bir şekilde bölünmeye devam eder ve hiçbir antijenin stimüle etkisi bulunmadan tek bir tip immünoglobilin molekülünü salgılarlar. Normal B lenfositleri in vitro koşullarda birkaç saatten fazla

174

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

canlı kalamamalarına rağmen, miyolemalar diğer neoplastik hücreler gibi hücre kültür ortamlarında ölümsüz (immortal) olarak kalabilirler. Normal memeli hücreleri iki farklı yoldan DNA moleküllerini sentezlerler: i. De novo metabolik yolu ile nükleik asitler, pürin ve pirimidin bazlarından, deoksiriboz ve inorganik fosfattan oluşturulurlar. ii. Kurtarma metabolik yolunda ise, benzer nükleotidlerin dönüştürülmesi ile doğru nükleik asitlerin sentezi sağlanır.

De novo metabolik yolu ise aminopterin ile tamamen inhibe olmaktadır. HGPRT enzimi (hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz) içeren hücreler ise kurtarma metabolik yollunu kullanarak, aminopterin içeren besi ortamlarında canlı kalabilirler. Buna rağmen, kurtarma metabolik yolunun işletilerek canlılığın sürdürülebilmesi için ortama hipoksantin ve timidin eklenmek zorundadır. Bu maddelerin eklendiği besiyeri ise HAT besiyerleri (Hipoksantin, Aminopterin, Timidim) olarak adlandırılırlar. Böylece HAT besiyeri, HGPRT enzimi içeren hücrelerin, bu besiyerinde seçici olarak büyümelerini sağlarken; HGPRT içermeyen (HGPRT−) hücrelerin büyümelerini engelleyecektir. Fare miyolema hücrelerinin HGPRT− olan klonları seçilir ve bunlar HAT besiyerinde canlılıklarını sürdüremezler ve çoğalamazlar. HGPRT− olan miyolema klonları seçilirken bunların, istenmeyen immünoglobilinleri çok az miktarda veya hiç üretmeyenleri seçilmelidir. Günümüzde, monoklonal antikor üretiminde kullanılan standart metot ise Şekil 8.6,a’da verilmiştir. Uygun bir antijen ile aşılanmış olan farenin dalak hücreleri ise, duyarlı hale getirilmiş olan B lenfositlerinin süspansiyon kaynağı olarak kullanılır. İn vitro koşullarda büyüyen, duyarlı B lenfosit hücreleri ve HGPRT üreten miyolema hücreleri, füzyon oluşturmak amacıyla, hücrelere toksik olan %30-50 (w/v) polietilenglikol (PEG) içeren ortamda birkaç dakika süre ile karıştırılır. Daha sonra, bu füzyon karışımı ise HAT besiyeri içeren hücre kültür ortamlarına aktarılır. Lenfositler ve füzyon oluşturan lenfositler, in vitro koşullarda kültürlerinin yapılamamasından dolayı çok kısa bir sürede ölürler. Miyolema hücreleri ve füzyon oluşturmuş olan hücreleri ise HGPRT içermedikleri için HAT besiyerinde bulunan aminopterin tarafından zehirleneceklerdir. Sadece B lenfositleri ile HGPRT pozitif olan miyolema hücrelerinin füzyonları sonucunda oluşan hibridoma’lar bu ortamda canlı kalacaklardır. Çünkü, miyolema hücreleri, hibrit hücrelere in vitro koşullarda yaşama özelliğine aktarırken, B lenfositleri ise bu hibrit hücrelerin HAT besiyerlerinde üreyebilmeleri için gerekli olan HGPRT enzimini aktaracaklardır. 10-14 gün sonra ise kültür ortamında canlı kalan hücreler sadece hidridomalardan ibaret olacaklardır. Buna rağmen, bu hibridomaların birçoğu ya istenmeyen immünoglobilinleri üretebilir ya da hiçbir Ig üretmeyebilir. Ne yazık ki, bu hibridomalardan hiç Ig üretmeyenler, Ig üretenlere oranla çok hızlı büyümektedirler. Bu nedenle, hibridoma oluşumunu takip eden 7-14 gün boyunca, her bir kültürün devamlı olarak istenilen Ig’yi üretip üretmediğinin test edilmesi ve üretmeyenlerin elimine edilmesi gerekmektedir. Bunun yanı sıra, istenen ya da kullanışlı Ig üretenlerin ise alt-kültürleri hazırlanmalı ve proteinleri sıvı-azot içerisinde dondurularak saklanmalıdır. Aksi halde kültürlerin mikroorganizmalar ile kontaminasyonu sonucunda, aylarca sürdürülmüş olan çalışmalar boşa gidebilir. Son olarak, tek hücre klonları iki yoldan birisi ile elde edilir. Bu iki yoldan birincisi, kültürler dilüsyona tâbi tutularak, mikro-titre plakalarının her bir çukurunda tek bir hibridoma hücresinin bulunmasını sağlayacak şekilde, mikro-plaka çukurlarına dağıtımı yapılır. Mikro-titre plaka çukurlarına ekimi yapılan klonların büyümesini sağlamak için ise plakalardaki besi ortamlarının düzenli olarak makrofaj hücreleri gibi normal hücreleri içeren besleyici tabaka ile desteklenmesi gerekmektedir. Klonlar, tatmin edici düzeyde büyüdükten sonra, bu klonların özgül immünoglobilin üretimi için test edilmesi gerekebilir. Bu klonların özgül immünoglobilin üretiminin belirlenmesinde

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

175

ise radioimmünoassay (RIA) veya enzim-linked immünosorbent assay (ELISA) gibi son derece gelişmiş immünokimyasal teknikler kullanılmaktadır.

Şekil 8.6: Monoklonal antikorların üretimi. (a) Monoklonal antikor üretiminde en yaygın olarak kullanılan prosedür. (b) İlgilenilmekte olan özgül hibridomaların oluşum oranını artırmak için, B hücrelerinin antijen–özgül adezyon ile miyolema hücrelerine bağlanmasını sağlayan prosedür (Wilson ve Walker, 1995).

Tek hücreden oluşan klonların elde edilmesinde kullanılan ikinci yol ise, hibritlerin dilüsyonu yapıldıktan sonra yatık agara ekimleri yapılarak, tek bir klon halinde büyüyen hücrelerin gözlenmesi ve bu klonların pastör pipeti ile seçilmesi gerçekleştirilir. Pastör pipeti ile seçilen klonlar ise mikrotitre plakalarında büyütülür ve özgül immünoglobilinlerin üretimi için test edilir. Kullanışlı olan her bir klon ise daha ileri karakterizasyonlara tâbi tutularak, sıvı-azot içinde depolanabilirler.

176

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

İmmünoglobilin üretiminin doğru monoklonal antikoru üretip üretmediğinden emin olmak için, genellikle en az bir defa yeniden klonlama yapılmalıdır. Daha sonra, istenilen antikoru üreten hibridoma klonları seçilir ve bunlardan kullanılabilecek antikorların üretimi için iki yoldan birisi tercih edilir. Bu yollardan birincisinde hibridoma, in vitro koşullarda hücre kültürü ile çoğaltılır ki, bu iş pahalı ve yorucudur. Monoklonal antikorların elde edilmesinin ikinci yolu ise hibridoma hücrelerinin tek-hücre tümörü olarak büyüyebileceği uygun bir farenin peritonal (karın) boşluğunda kolayca büyüyebilen bir yere yerleştirmektir. İkinci metodun dezavantajı ise monoklonal antikorlar genellikle farenin karın boşluğu sıvısında bulunan diğer proteinler ile kontamine olur, fakat bu genellikle çok ender durumlar için önem arz etmektedir. Monoklonal antikor üretiminde kullanılan genel metodun en büyük dezavantajı ise, heterojen B lenfositlerinden oluşan hücre popülasyonu ile miyolema hücrelerinin oluşturduğu füzyonun, tamamen tesadüfi olmasıdır. Hibrit oluşumunu sağlayan füzyonun tesadüfi olması ise, hibritlerin çok fazla çeşitte immünoglobilinleri üretmesine, bundan dolayı da hibritlerin ayrı ayrı klonlar halinde büyütülmesi ve dolayısıyla immünoglobilinlerin test edilmesi için çok fazla zamana gereksinim duyulmaktadır. Şekil 8.6,b’de de gösterildiği gibi, sadece ilgilenilmekte olan antijene komplement immünoglobilinlerin üretimini gerçekleştirebilen B lenfositleri ile miyolema hücrelerinin füzyonunun gerçekleşmesini garantilemek için, alternatif prosedürlerin geliştirilmesine de çalışılmaktadır. Bu prosedürde ise kimyasal olarak miyolema hücrelerinin yüzeylerine biyotinin, ilgilenilmekte olan antijene ise avidinin bağlanması sağlanır. Avidin-antijen bileşiği ise, antijen ile immünize edilmiş bir farenin dalak hücrelerinden alınan lenfosit hücreleri ile karıştırılır. Bu karışımdaki avidin-antijen bileşiği ise özgül olarak sadece antijen reseptörlerini taşıyan B lenfositleri ile bağlanacaktır. Avidinantijen-B lenfositini içeren süspansiyon ise, miyolema (biyotinlenmiş) ve antijen-özgül B lenfositlerinin (antijen-avidin bileşiği içeren) biyotin-avidin-antijen köprüsü aracılığı ile bir arada tutulmasını garanti altına almaktadır. Daha sonra ise, bir arada bulunan miyolema-B-lenfositi hücre bileşiklerini içeren süspansiyon, bir elektriksel alana (4 kV cm–1, 5 saniye, 30 °C) maruz bırakılarak birbirine yakın olan hücreler arasında füzyon oluşumu sağlanır. Bu füzyonda ise miyolema hücreleri ile uygun immünoglobilinleri üretme yeteneğinde olan B lenfositlerinin füzyonu ile oluşan hibritlerin eldesi sağlanmaktadır. Elde edilen hibritler ise HAT besiyerine ekilerek, uygun hibritlerin seçimi yapılmakta ve daha önce tanımlandığı gibi klonlar oluşturulmaktadır. Monoklonal antikorların en büyük avantajı ise, aşırı güvenilir olmasıdır. Bu nedenle, her kim ki monoklonal antikorları kullanarak bir sonuç elde ederse bu sonuçların kesinliğini iddia edebilir. Buna rağmen, monoklonal antikorların üretimi için çok fazla zaman ve işçilik gerektiğinden maliyet de yüksek olmaktadır, maliyetin yüksek olması ise monoklonal antikorların ticari fiyatlarını da artırmaktadır. Poliklonal sera kullanımı ise monoklonal antikorların kullanılmasının çok farklı avantajlar sunmadığı her durumda kullanılmaktadır. Buna ilaveten, monoklonal antikorların çok özgül olarak, sadece tek bir epitopu tanıması ise bir dezavantajdır ve bu nedenle, poliklonal seralar çok daha fazla kullanılmaktadır. Monoklonal antikorların üretiminin pahalı ve zor olmasına rağmen birçok antijen, serum proteinleri, enzimler, hücre yüzey reseptörleri, hormonlar, droglar, tümör özgül antijenleri, virüsler ve farklılaşma antijenleri için monoklonal antikorlar hazırlanmıştır. Farklılaşma antijenleri için hazırlanan monoklonal antikorlar ise affinite kromatografisi ile hücre popülasyonlarından, T lenfositlerinin fonksiyonel alt-popülasyonları gibi hücreleri izole etmekte ve altsınıfları ayrıştırmakta, değer biçilemeyecek derecede faydalar sağlamaktadır. Monoklonal antikorların çok özgül olması ise bir klon tarafından üretilen ürünün (Ig) tek bir molekülü tanımasına neden olmaktadır. Böylece, monoklonal antikorlar daha önce bilinmeyen ya da tam olarak karakterize edilemeyen moleküllerin izole edilmesinde ve saflaştırılmasında oldukça verimli ve yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Monoklonal antikorların bazı sınırlayıcı özellikleri de bulunmaktadır. Çünkü, monoklonal antikorların sabit bölgeleri gibi değişken bölgeleri de monoklonaldır. Bu nedenle, monoklonal

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

177

antikorlar, antikorların potansiyel effektör fonksiyonlarının sınırlı bir sayısına sahiptirler. Örneğin, bütün monoklonal antikorlar komplement oluşturmaz, protein-A’yı bağlamaz veya antikora-bağlı hücre tarafından gerçekleştirilen sitotoksisiteyi gerçekleştiremez. Buna ilaveten, gerçekten de her özgüllükteki fare monoklonal antikorlarının üretimi oldukça kolay olmasına rağmen, bazı uygulamalar için tercih edilen insan monoklonal antikorlarının üretimi oldukça zordur. Monoklonal antikorlarda bazı sınırlamalara yol açan kalıtsal özelliklerin üstesinden gelmek için ise transfektoma’lar (transfekte hücre hatları) kullanılmaya başlanmıştır. Genetiksel olarak manipüle edilmiş antikor genlerinin, lenfosit hücrelerine transfeksiyonundan sonra, bu genlerin ekspresyonları gerçekleştirilmektedir. Heptanlara, tümör antijenlerine ve yardımcı T hücrelerinin CD4 antijenine karşı kısmi olarak monoklonal antikorların türler arasında sınırlamalar göstermesi nedeniyle de ilgili olan hibrit insan-fare antikorları üretilmiştir. Potansiyel olarak, bir antikora herhangi özgül bir bağlama özelliği, sentetik oligonükleotidlerin kullanılması ve bölge-kontrollü mutajenezis ile eklenebilmektedir. Daha da önemlisi, doğada hiç bulunmayan sabit bölgelere sahip antikorlar gibi istenilen effektör fonksiyona sahip antikorlar ve hatta enzimler gibi immünoglobilin olmayan proteinler de üretilmektedir. Hücre kültürlerinde 10-100 μg cm-3 fare hibridomaları üretilebilmektedir. Hem hücre kültür tekniğinin, hem de tek-hücre tümör kültürlerinin kullanımının büyük-çaplı üretimi ise gram hatta kilogram düzeyinde ürün elde edilmesini sağlamaktadır; fakat her ikisi de oldukça pahalı yöntemlerdir. Buna karşılık, E. coli ve S. cerevisiae hücreleri, Fab fragmentlerinin, muhtemelen de bütün bir antikor molekülünün ifadesini, birleştirilmesini ve sekresyonunu yapabilmektedirler. Gen mühendisliği uygulamalarında en çok kullanılan, genetik yapısı ve fizyolojik özellikleri çok iyi bilinen bu iki mikroorganizma ise, her türlü amaç için kullanılabilecek antikor fragmentlerinin üretiminde maliyeti düşürecek çalışmaların yapılmasında kullanılmaktadır. 8.6.3.1. Monoklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları Avantajları: i. Antikor oluşumunu sağlamak için kullanılan protein (antijen) preparatının saf olması zorunlu değildir. ii. Antikor oluşumu için genellikle fare kullanıldığından, gerekli olan antijen miktarı (50 μg) oldukça düşüktür. iii. Hedef proteinin farklı antijenik determinantlarına karşı farklı antikor tiplerinden oluşan çok fazla sayıda klon bulunabilir. Bu klonlar içerisinden düşük affiniteli bağlama kapasitesine (KD değeri 10–6–10–-8 M) sahip olan antikorlar tarama prosedürü esnasında seçilebilir. Bu antikorlar ise elüsyon esnasında karşılaşılan problemleri minimuma indirgemek için immünoaffinite kromatografisinin dizaynında kullanılır. iv. Uygun klon bulunduktan sonra, bu klonun sıvı-azot içinde depolanması nedeni ile sınırsız bir kaynak sağlanabilir. Klonun depolanabilmesi nedeniyle immünize edilen hayvanın ölümü, antikor üretimini sınırlamaz. Ayrıca, immortal hücre hatlarının teorik olarak geliştirilmiş olması nedeni ile çok fazla miktarda antikor elde edilebilir. v. Monoklonal antikorlar hemen hemen saf olduklarından, matriks üzerine tutuklanan antikorların tamamı hedef protein için özgüldür. vi. Molekülün fonksiyonel domaininin çalışılmasında özgül antikor kullanılabilir. Dezavantajları: i. Prosedür pahalı ve zaman alıcıdır. ii. Doku kültürü için çok iyi teknik cihazlara gereksimim duyulur.

178

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

iii. Antikor tarafından tanınan epitop, ilgilenilmekte olan antijen ile ilgisi bulunmayan birçok antijen tarafından paylaşılıyor olabilir. iv. Hibridoma hücre hatları ise genellikle kromozom kayıpları nedeni ile kararsızdırlar ya da bu hatlar doku kültürlerinin kontaminasyonu ile kaybedilebilirler. 8.6.4. İmmünoglobilinlerin Serumdan Fraksiyonlanması

Antikorların, kullanılmadan önce antiserumdan kısmi olarak ayrıştırılmasının gerçekleştirilmesi arzulanır. Bu amaçla, en çok kullanılan iki yöntem ise amonyum sülfat ile çökeltme (presipitasyon) ve DEAE (dietil amino etil) kromatografisidir. Bu iki yöntemin yanı sıra, immünoglobilinlerin saflaştırılmasında kullanılan farklı yöntemler de bulunmaktadır. Bu yöntemler ise genel özellikleri ile aşağıda sıralanmaktadır: i. Amonyum sülfat ile çökeltme: Amonyum sülfat ile fraksiyonlama, basit bir yöntem olmasına rağmen, antikorların kısmi olarak saflaştırılmasında verimliliği düşüktür. Bu amaçla, 40 mL doymuş amonyum sülfat (%77,7 w/v, (NH4)2SO4; pH 7,2-7,4) yavaş yavaş 60 mL seruma karıştırılarak ilave edilir. Amonyum sülfatın tamamının seruma eklenmesinden sonra, 1 saat daha karıştırma işlemine devam edilir ve karışım daha sonra, 5 000 g’de ve 22 °C’da 20-30 dakika santrifüjlenir. Santrifüjleme işlemi sonunda elde edilen çökelti (pellet) ise minimum hacimde saf su ile yeniden süspanse edilir. Elde edilen süspansiyon ise amonyum sülfatın uzaklaştırılması için diyalize veya jel filtrasyon kromatografisine (bkz. 5. Bölüm) tâbi tutulur. ii. Polietilen glikol ile çökeltme: γ-Globülinlerin (IgG) düşük çözünürlük özelliğinden PEG kullanılarak da yararlanılabilir. %50 PEG 6 000 solüsyonunun 0,1’lik hacmi seruma eklenir ve 30 dk karıştırılır ve karışım daha sonra, 5 000 g’de ve 22 °C’da 20-30 dakika santrifüjlenir. Santrifüjleme işlemi sonunda elde edilen çökelti (pellet) ise minimum hacimde saf su kullanılarak yeniden süspansiyon elde edilir. Elde edilen süspansiyon ise PEG’ün uzaklaştırılması için fraksiyonlama aralığı minimum 6 000 Da olan jel filtrasyon kromatografisine (bkz. 5. Bölüm) tâbi tutulur. iii. İzoelektrik çökeltmesi: Bu teknik özellikle IgM moleküllerinin fraksiyonlanması için uygundur ve çökeltme koşulları, üretilen antikorun özelliklerine bağlıdır. Örneğin, hibridoma kültür süzüntüsünden IgM moleküllerinin izoelektrik çökeltmesi ile büyük-ölçekli saflaştırılması, pH 5,0’de gerçekleştirilmektedir. Fakat, protein derişiminin artırılması ancak ultrafiltrasyondan (bkz. kısım 1.7.2) sonra sağlanabilmektedir. iv. İyon değiş-tokuş kromatografisi: Kolon materyali olarak DEAE-Sephacel’in kullanıldığı iyon değiş-tokuş kromatografisi ise IgG’nin diğer Ig’lerden ve serum proteinlerinden ayrıştırılmasını sağlar. Kromatografi için i. basamakta amonyum sülfat çökeltmesi ile elde edilen örnek, fosfat tampon çözeltisine karşı (0,1 M, pH 7,4) iyi bir şekilde diyalize tâbi tutulur. Bu arada kolon materyali yani jel, 1,6 x 20 cm ebatlarındaki bir cam kolona doldurularak jelin çökelmesi beklenir. Çökelmiş olan jel materyalinin üst yüzeyinin ise kolonun üst kısmından en az 2 cm aşağıda olmasına dikkat edilmelidir. Kolon materyalinin tam olarak çökelmesinden sonra ise kolon, kolon hacmimin 3-misli hacimdeki tampon ile yıkanarak kolonun dengelenmesi sağlanmalıdır. Dengelenmiş olan kolonun üstünde bulunan 2 cm’lik boşluğa ise amonyum sülfak çökeltmesi ile elde edilen ve diyalizlenmiş olan örnekten yükleme yapılır. Örneğin yüklenmesini takiben, kolondan fosfat tamponu ile Ig’lerin elüsyonuna başlanır ve elüsyon sıvısı 8 mL’lik fraksiyonlar halinde toplanır. İlk IgG piki (birinci pik) ise elüsyon fraksiyonlarından 8-10. tüplerden elde edilir. Kolonun fosfat tamponu ile yıkanması ise hiçbir pikin yer almadığı fosfat tamponunun absorbansına kadar (arka plan absorbansı) sürdürülür. Bu aşamadan sonra tampon değiştirilerek, içerisinde 50 mM NaCl içeren 200 mM fosfat tamponu kullanılır. İkinci tampon ile kolonun yıkanması ve fraksiyonların yine 8 mL’lik hacimlerde toplanması sonucunda, ikinci IgG piki (ikinci pik) yeni toplanan fraksiyonlardan yine 8-10. tüplerde belirlenir. İkinci IgG pikinin elde edilmesinden sonra, yine tampon çözelti değiştirilerek 100 mM NaCl içeren

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

179

200 mM fosfat tamponu kullanılır ve bu uygulamadan elde edilen fraksiyonlarda ise IgM piki gözlenir. IgM pikinin de elde edilmesinden sonra, fosfat tamponu içerisinde 0,5-1 M NaCl gradienti oluşturularak diğer serum proteinlerinin de kolondan elüsyonu gerçekleştirilir. Daha sonra ise kolon, kolon hacminin 3-misli bir hacimdeki 200 mM fosfat tamponu (pH 7,4) ile yıkanarak kolon materyali rejenere edilir. Bunu takiben, tekrar normal fosfat tamponu ile kolon yıkanır. Elde edilen fraksiyonlarda ise IgG varlığını belirlemek için SDS-PAGE ile analizleri yapılır. v. Hidrofobik kromatografi: γ-Globülinlerin çözünürlük özelliklerinin düşük olması, bu moleküllerin göreceli olarak hidrofobik karakterlerini yansıtmaktadır. Sodyum veya amonyum sülfat varlığında γ-globülinler birçok hidrofobik adsorbente bağlanırlar. Fakat, γ-globülinler için oldukça özgül ve yüksek derecede seçici olan hidrofobik adsorbent ise Porath tarafından tanımlanan Tjel’dir. T-jel ise divinil sülfone-aktive agaroza β-merkaptoetanolün bağlanmasından oluşmaktadır. Bu adsorbent, orijinal olarak diğer hidrofobik adsorbentlerin çalışılması sırasında kontrol amacı ile geliştirilmiştir. Fakat yapılan çalışmalarda kontrolün kendisinin, 0,5 M Na2SO4 varlığında γglobülinler için oldukça özgül bir adsorbent olduğu belirlenmiştir. Adsorbsiyondan sonra γglobülinlerin elüsyonu, düşük tuz içeren tamponlarla gerçekleştirilmektedir. Fraksiyonlar ise az miktarda da olsa Na2SO4 içerebileceğinden, fraksiyonlardaki sodyum sülfatın uzaklaştırılması gerekebilir. Bunun için ise diyaliz, ultrafiltrasyon veya jel filtrasyon kromatografisinden yaralanılabilir. vi. Affinite adsorbsiyonu: Staphylococcus aureus hücrelerinin dış kılıf proteini olan proteinA’nın selüloz disklere bağlanması ile IgG’nin ayrıştırılmasında affinite çökeltmesinin yanı sıra, affinite kromatografisi de kullanılmaktadır (bkz. kısım 8.7.6.1). Her bir havyan türü ise farklı Fc bölgelerine sahip olan çeşitli immünoglobilinler üretmektedirler. Örneğin IgG1, IgG2a, IgG2b ve IgG3 alt-sınıflarından oluşan fare immünoglobilinlerinin her birisi, Protein-A affinite kromatografisi ile farklı koşullarda elüe edilmektedirler. Bazı γ-globülünler ise Protein-A’ya iyi bir şekilde bağlanmazlar. Bu durumda ise Protein G kullanılmaktadır (bkz. kısım 8.7.6.2). 8.6.5. Antikorların Tutuklanması ve Proteinlerin Elüsyonu

İmmünoglobilin moleküllerinin agaroz matrikslerine bağlanması siyanojen bromid tekniği kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz. kısım 8.3.3). Antikorların tutuklanmış ligand olarak kullanılmasından sonra, viral orijinli membran proteinlerini de içeren çeşitli proteinlerin izolasyonları ve saflaştırılmaları da gerçekleştirilmiştir. Proteinlerin tutuklanmış antikora bağlanması, orta düzeyde tuz derişimleri içeren nötral bir tampon solüsyonu içerisinde elde edilir. Antijen–antikor kompleksi, genellikle oldukça yüksek bir affiniteye sahiptir. Antikora (liganda) bağlanan proteinlerin elüsyonu, proteinin antikora çok güçlü biçimde bağlanmasından dolayı (KD = 10–8–10–12 M), sıklıkla güçlü koşulların uygulanmasını gerektirir ve bu koşullar ise proteinin denatürasyonuna neden olabilir. Kolondan antijenlerin (protein) elüsyonunda ise antikorların (ligand) bozulmasını önlemek amacıyla pH değeri 2-3 olan (tipik olarak glisin-HCl) tamponlar kullanılır. Fakat elüsyon sıvısının pH değerinin düşük olması, genellikle elüe edilen antijenin bir enzim olması durumunda bu enzimin inaktivasyonuna yol açmaktadır. Alternatif olarak ise hepsi de denatürasyona sebep olan elüsyon prosedürleri, bir deterjanla birlikte veya tek başına yüksek tuz derişimlerinin kullanımını ve üre, SDS veya guanidin–HCl kullanımını içerir. Tiyosiyanat, perklorat, iodid, lityum bromid ve triflorasatat gibi yıkıcı ajanların 3 M’a kadar olan derişimlerinin kullanımı, denatürasyonu önleyebilir. Elüsyon koşullarının yıkıcı olması nedeni ile kolondan toplanan fraksiyonların hemen normal koşullara döndürülmesi gerekmektedir. Bu amaçla affinite kromatografisinden elüe edilen fraksiyonlar, doğrudan jel filtrasyon kromatografisine aktarılarak yıkıcı tuzların uzaklaştırılması sağlanabilir. Ayrıca çok

180

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

daha etkili bir uygulama ise antijeni de içeren adsorbentin, doğrudan jel filtrasyon kromatografisinin üzerine yerleştirildikten sonra elüsyonun ve tuz uzaklaştırma işleminin aynı anda yapılmasıdır. Optimal elüsyon koşulları ise her uygulamaya göre değişmektedir ve bu koşullar, moleküllerin adsorbente bağlanma gücü ve proteinlerin kakrlılığı tarafından belirlenir. Elüsyon ise genellikle örnek materyalinin yüklendiği akış yönünün ters yönünde gerçekleştirilir. Bu sayede, liganda çok kuvvetli olarak bağlanmış olan moleküllerin kolon boyunca bulunan ligandlarla yeniden etkileşim göstermesi önlenmiş olur. Soğuk distile su kullanılarak, başarılı bir elüsyonun yapıldığına dair çalışmalar da bulunmaktadır. Bu yöntemin esası ise ligand ile antijen arasındaki hidrofobik etkileşimin düşük sıcaklık ve düşük iyonik kuvvet nedeni ile zayıflatılmasına dayanmaktadır. İmmünoaffinite kromatografisi ile gerçekleştirilen ayrıştırma çalışmalarının her birisi çalışılmakta olan özgül proteinler için geliştirilmiş olmakla birlikte, yapılan özgül bir çalışmada bu yöntemlerin denenmesi yarar sağlayabilir.

Antijenlerin elüsyonunda kullanılan diğer bir yöntem ise elektroforez yöntemidir. Bu yöntemde ise antijenin yeteri kadar elektriksel yüke sahip olduğu bir pH’da, solüsyon içindeki antijenin küçük fragmentler halinde elektroforetik göçü sonucunda liganddan uzaklaşarak, fazla seyrelmeden denatürasyona neden olan tampondan uzaklaşması sağlanır. Çok daha farklı bir elüsyon yöntemi ise kırılabilir ayırıcı-kolların kullanılmasını içermektedir. Bu yöntemde ise ligand, agaroz matrikse bir fenil ester bağı aracılığı ile bağlanmaktadır. Fenil ester bağı ise imidazol-glisin tamponu (pH 7,4) ile kimyasal olarak kırılarak, ligand-antijen kompleksinin elde edilmesi sağlanmaktadır. Ne yazık ki bu yöntemle elde edilen kompleksteki ligand, antijenden ayrılamadığı gibi kolon materyali olan adsorbent ise ancak bir defa kullanılabilmektedir. 8.7. Grup–Özgüllüğü Gösteren Ligandlarla Affinite Kromatografisi 8.7.1. Lektin Affinite Kromatografisi

Lektinler havyanlar, bitkiler ve cıvık mantarlar tarafından üretilen ve özgül şeker kalıntıları ile geri–dönüşümlü olarak bağlanma yeteneğinde olan proteinler grubudur. Bu özellikleri nedeni ile lektinler, karbonhidratları dolayısı ile de glikoproteinleri bağlayabilmektedirler. Ayrıca, eritrositlerin ve kanserli hücrelerin aglütinasyonuna da neden olurlar. Bunun sonucu olarak da tutuklanmış lektinler, glikoproteinlerin, glikolipidlerin, polisakkaritlerin, hücresel partiküllerin, hücrelerin ve deterjanla–çözündürülmüş hücre membranı bileşenlerinin izolasyon ve ayrıştırılmasında değer biçilemez bir öneme sahiptirler. Lektinler aynı zamanda, malignant veya viral transfeksiyon nedeni ile oluşan variantların ve hücre gelişmesi süresince meydana gelen yüzey glikoproteinlerindeki değişikliklerin seviyesini ve/veya kompozisyonunu belirlemek için de kullanılmaktadır. Lektinlerin çoğu, tetramerik olan polimer yapılara sahiptirler. Lektinler, tek bir özgül sakkariti tanıdıkları durumda identik alt–birimlerden veya iki farklı sakkariti tanıdıkları durumda ise iki tipli alt–birimlerden oluşmaktadırlar. Lektinlerin hepsi 40–400 kDa arasında değişen göreceli moleküler kütleye (Mr) sahiptirler. Lektinlerin özgül sakkaritleri tanımaları ve bağlamaları, bu molekülleri, glikoproteinlerin ve özellikle de membran reseptör proteinlerinin saflaştırılmasında oldukça değerli kılmaktadır. Lektin kromatografisinde en yaygın kullanıma sahip olan lektinler, bol miktarda bulunmaları nedeni ile Legüminoz bitkilerden (bezelye, soya fasulyesi, keneotu tohumu) elde edilirler. Lektinler, yaygın olarak kullanılmakta olan tekniklerle agaroz matriksler üzerine tutuklanabilirler ve çoğunu günümüzde ticari olarak bulmak mümkündür (bunlardan bazılarının örnekleri ise aşağıda verilmektedir). Eğer bir glikoproteinin sakkarit bileşeninin yapısı bilinmiyorsa, ligand olarak tercih edilecek lektin, basit bir tarama prosedürü ile seçilir. Glikoproteinler tutuklu lektine bir kez bağlandığında, bu glikoproteinlerin elüsyonu birkaç yolla sağlanabilir. Bu elüsyon yolları, lektinin

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

181

affinite gösterdiği basit bir monosakkaritin kullanılarak yapılabildiği affinite elüsyonunu, glikoproteinle kompleks oluşturacak bir borat tamponunun kullanımını, dikkatlice yapılacak pH değişiminden (pH 3’ün altında veya pH 10’un üzerinde olmayacak şekilde) yararlanmayı veya ligandın hidrofobik etkileşimini indirgeyecek etilen glikol gibi bir ajanın kullanımını içerir. Lektin affinite kromatografisinin bir diğer çekici tarafı da, oldukça yüksek tuz derişimlerinin bulunduğu koşullarda da yürütülebilmesidir. Çünkü etkileşim, iyonik etkileşimlere dayanmamaktadır. Bundan dolayı, lektin affinite kromatografisi prensipte, preparatların tuz ile fraksiyonlanmasından sonra, doğrudan uygulanabilir. Hücrelerin dış membranların sakkarit bileşenlerinin faklı olması özelliğinden de yararlanılarak, lektin affinite kromatografisi hücre karışımlarının ayrılmasında da kullanılmaktadır. Çoğu lektin affinite kromatografisi ise sıradan LPLC kullanılarak yürütülmektedir. Tutuklanmış lektin içeren bazı kolon materyalleri ve bu materyallerin özellikleri ise takip eden alt-kısımlarda ele alınmaktadır. 8.7.1.1. Konkanavalin A (Con A)

Bir tür fasulyeden (jacbean) elde edilen konkanavalin A, tetramerik bir metalloprotein olup α– D–mannopiranozil, α–D–glukopiranozil ve yapısal olarak benzer kalıntıları taşıyan molekülleri bağlar. Konkanavalin A’ya bağlanacak olan şeker moleküllerinin, bu moleküle bağlanabilmesi için C3, C4 ve C5 pozisyonlarında –OH gruplarını bulundurması gerekmektedir. Con A Sepharose, konkanavalin A’nın BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Con A Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks, kolon hacminin en az 10-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Başlangıç tamponu ise nötral pH’da olmalı ve NaCl içermelidir (örneğin, 20 mM Tris–HCl; 500 mM NaCl; pH 7,4). Ayrıştırılacak olan moleküllerin konkanavalin A’ya bağlanması ise ortamda hem Mg2+ hem de Ca2+ iyonlarının bulunmasını gerektirmektedir. Kolon materyaline (konkanavalin A’ya) bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise başlangıç tamponu içerisinde α–D–metilmannozid veya α–D–metilglukozid’in 0–500 mM’lık lineer gradienti ile sağlanabilir. Konkanavalin A’ya adsorblanan moleküllerin çoğu, 100–200 mM arasında serbest kalmaktadır, fakat çok daha güçlü adsorblanan moleküllerin ayrılması için daha yüksek derişimler gerekebilir. Lipoproteinlerin Con A Sepharose ile ayrıştırılmasında ise elüsyon işlemi pH 9’da, glukoz, mannoz, metil α–D–glukozid ve metil α–D–mannozid’in sırasıyla uygulanması şeklinde başarılmaktadır. Konkanavalin A’ya çok güçlü bir şekilde adsorblanan moleküllerin elüsyonu ise düşük pH’daki tamponların kullanılmasıyla (pH 3’den aşağısı kullanılmamalıdır) veya borat tamponu (100 mM; pH 6,5) ile sağlanabilir (çünkü borat, bazı polisakkaritlerle kompleks oluşturmaktadır). Con A Sepharose ise aşağıda sıralanmakta olan amaçlar için kullanılabilecek, grup– özgüllüğü gösteren bir adsorbenttir: •

Glikoproteinlerin, polisakkaritlerin ve glikolipidlerin ayrıştırılması ve saflaştırılması.

•

Enzim–antikor komplekslerinin saflaştırılması.

•

Karbonhidrat–içeren bileşiklerin kompozisyonundaki değişikliklerin belirlenmesi. Örneğin, gelişme ve farklılaşma esnasındaki değişiklikler.

•

Deterjanla–çözündürülmüş hücre glikoproteinlerinin izolasyonu.

•

Membran veziküllerinin ayrıştırılması.

membran

bileşenlerinden,

hücre

yüzey

182

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

8.7.1.2. Lentil Lektin

Lens culinaris (mercimek)’den elde edilen ve bir hemaglutinin olan lentil lektin, α–D–glukoz ve α–D–mannoz kalıntılarını bağlamaktadır. Lentil Lektin Sepharose, lentil lektinin BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Lentil Lektin Sepharose da Con A Sepharose gibi genel olarak kullanılabilen grup–spesifik bir adsorbenttir. Lentil Lektin Sepharose, deterjanla–çözündürülmüş membran glikoproteinleri de dahil olmak üzere glikoproteinlerin, hücre yüzey antijenlerinin ve viral glikoproteinlerin saflaştırılmasında kullanılmaktadır. Lentil lektin, glikozil ve mannozil kalıntılarını konkanavalin A’ya oranla daha az özgüllükte ayırt edebilmektedir. Aynı zamanda lentil lektin, basit şekerleri konkanavalin A’ya oranal daha zayıf olarak bağlamaktadır. Lentil lektinin basit şekerleri bağlama gücü, sodyum deoksikolatın %1’lik derişimine kadar devam etmektedir. Bu nedenle Lentil Lektin Sepharose, özellikle deterjanla– çözündürülmüş membran proteinlerinin saflaştırılmasında oldukça önemlidir. Lentil Lektin Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks kolon hacminin en az 10-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Başlangıç tamponunun pH değeri ise 3–10 aralığında olmalı ve EDTA gibi metal şelat ajanlarını içermemelidir. Dengelenmiş olan kolona yüklenmiş olan ve kolon materyaline (lentil lektine) bağlanmamış olan moleküllerin ve kirleticilerin elüsyonu, kolonun yatak hacminin 10-misli kadar başlangıç tamponunun kolondan geçirilmesi ilse sağlanır. Bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise metil α–D–mannozid veya glikozid gibi kompetitif inhibitörleri içeren (100–200 mM) tampon ile sağlanabilir. 8.7.1.3. Wheat Germ Lektin

Wheat germ lektin (buğday tohum lektini), N–asetil–glikozaminil kalıntılarını bağlamaktadır. Wheat Germ Lektin Sepharose ve Agaroz Wheat Germ Lektin ise glikoproteinlerin ve polisakkritlerin saflaştırılmasında kullanılan grup–spesifik adsorbentlerdir. Bu kolon materyallerinin her ikisine de buğday tohum lektininin bağlanması, BrCN metodu ile gerçekleştirilmiştir. Wheat Germ Lektin materyalleri hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks kolon hacminin en az 5-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Bağlanmış olan moleküllerin çoğunun elüsyonu, N–asetilglikozamin (GlcNAc) içeren (100–500 mM) tampon ile lineer veya basamaklı gradient uygulaması şeklinde sağlanabilir. 8.7.1.4. Helix pomatia Lektin

Bir salyangoz olan Helix pomatia’dan elde edilen lektin, N–asetil–α–D–galaktozaminil kalıntılarını bağlamaktadır. Altı identik (eş) veya oldukça benzer olan alt–gruptan meydana gelen bu lektinin moleküler kütlesi ise 79 kDa’dur. Bu alt–gruplardan her birisi ise bir tane zincir–içi disülfid bağı, bir tane de karbonhidrat–bağlanma bölgesi içermektedir. Alt–gruplar ise ikili gruplar (dimer) oluşturacak şekilde birbirlerine disülfid bağları ile bağlanmıştır ve molekülün doğal yapısı ise bu üç dimer grubun, kovalent-olmayan etkileşimlerle bir arada tutulmasından oluşmaktadır. Helix pomatia Lektin Sepharose ise adından da anlaşıldığı gibi, Helix pomatia’dan elde edilen lektinin BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiştir. Bu kolon materyali ise özellikle T–lenfositleri olmak üzere, hücre preparatlarında kullanılmaktadır. Hücrelerin affinite kromatografisi ise genellikle oda sıcaklığında ve metabolik bir inhibitör olan sodyum azid varlığında (%0,02 w/v) gerçekleştirilir. Sodyum azidin hücrelere zarar verebileceği göz önünde tutularak, hücrelerin bu inhibitöre uzun süre maruz kalmamasına özen gösterilmelidir. Ayrıca hücrelerin, hücresel bütünlüğünün korunması için en ideal sıcaklık, tampon kompozisyonu gibi parametrelerin de iyi ayarlanması gerekmektedir.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

183

Helix pomatia Lektin Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki materyal kolon hacminin en az 5-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Bağlanmamış olan hücreler ve kirleticiler, kolon hacminin en az 20-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak uzaklaştırılabilir. Bağlanmış olan hücrelerin ve moleküllerin özgül elüsyonu ise ya liganda ya da hedef molekül veya hücreye kompetitif (yarışmacı) olan ajanların kullanılması ile sağlanabilir. 8.7.2. Boya–Ligand Affinite Kromatografisi

Grup–spesifik ligandların özel bir grubunu ise boyalar oluşturmaktadır. Boyaların ligand olarak kullanılması ise 1960’lı yıllarda, Amersham Pharmacia Biotech Fine Chemicals (Uppsala, İsveç) firması tarafından Cibacron Blue F3G-A olarak bilinen mavi bir boyanın, yüksek moleküler kütleli çözünür agaroza bağlanarak, jel filtrasyon kromatografisinde boşluk hacminin belirlenmesi amacı ile markır (işaret) olarak kullanılması sonucunda başlamıştır. Bu markır ile yapılan çalışmalar sonucunda ise maya hücrelerinden elde edilen pürivat kinazın, jel filtrasyon kromatografisine uygulanması esnasında enzimin boşluk hacmi içinde elüe edilmesi, oldukça şaşırtıcı gelmiştir. Pürivat kinazın kolonun boşluk hacmi içerisinde elüe edilmesi ise bu molekülün beklendiğinden daha fazla bir moleküler kütleye sahip olduğuna işaret etmektedir. Fakat, pürivat kinaz ile birlikte markır kolona yüklenmediğinde ise pürivat kinazın, kolonun boşluk hacminden sonra elüe edildiği belirlenmiştir. Pürivat kinaz, ayrıştırmadan sonra markırın uzaklaştırılması zorunlu olsa da, jel filtrasyon kromatografisine önce markırsız olarak, daha sonra ise markır ile birlikte kolona yüklenerek izole edilmiştir. Böylece, pürivat kinazın boyaya bağlandığı ortaya çıkmıştır. Blue dekstranın, standart affinite kromatografisi metotları ile agaroza bağlanması sonucunda ise yeni bir adsorbent tipi üretilmiştir. Pürivat kinazla yapılan çalışmalar ile aynı yılda yapılmış olan başka bir çalışma sonucunda ise yine maya kaynaklı olan fosfofruktokinaz enziminin de pürivat kinaza benzer davranışlar gösterdiği belirlenmiştir. Takip eden yıllarda ise özellikle dehidrogenazlar olmak üzere, diğer enzimlerin de bu boyaya karşı affinite gösterdiği belirlenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda ise hem konjuge halkalar, hem de iyonik gruplar içeren sentetik bazı triazin boyaların, bazı proteinleri bağlama yeteneğinde oldukları belirlenmiştir. Bundan dolayı, affinite kromatografisinde ligand olarak kullanılan boyaları tanımlamak için pseudo–ligandlar terimi kullanılmıştır. Etkileşimin özgül olmamasından dolayı, özel bir proteinin herhangi bir boya–ligandına bağlanıp bağlanmayacağını önceden kestirmek mümkün değildir. Fakat, ligand–bağlayıcı domainlerin hem iyonik hem de hidrofobik güçler yoluyla etkileşimi ortaya çıkardığı düşünülmektedir. Boyaların proteinleri bağlama özelliğine sahip olması, bu boyaların triazin metodu ile Sepharose 4B gibi matrikslere bağlanarak boya–ligandlarının oluşturulmasına, bu nedenle de proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmalarına yol açmıştır. Tekniğin çekici tarafları ise boyaların ucuz olması, yaygın olarak kullanılmakta olan kolon materyallerine kolayca bağlanabilmesi ve oldukça kararlı olmalarıdır. En yaygın kullanılan boyalar ise Cibacron Blue F3G–A ve Procion Red H-E3B’dir (Şekil 8.7). Bu boyalar, NAD+ ve NADP+ gibi doğal olarak oluşan kofaktörlere yapısal olarak benzeyen bazı özelliklere sahiptirler. Bu yapısal özellikleri sayesinde boyalar, kinazlar, dehidrogenazlar, karboksipeptidaz G, plazminojen, plazminojen aktivatörleri ve adanilil–içeren (NAD+ ve NADP+ de dahil) maddelere gereksinim duyan diğer enzimler gibi, çok sayıdaki proteini bağlama yeteneğine sahiptirler. Özel bir proteinin ayrıştırılması için kullanılacak olan boyanın seçimi, deneysel olarak elde edilir ve deneme–yanılma yoluyla belirlenir. Bu amaçla, hedef proteinin hangi tip boya ligandına bağlandığını taramak amacı ile çoklu-boya tarama kitleri geliştirilmiş bulunmaktadır. Bu tip tarama kitlerden ilki olan ve Amicon firması tarafından üretilen kit Cibacron Blue F3G-A, Procion Turquoise H-A, Procion Green H-E4BD, Procion Red H-E3B ve Procion Yellow H-A olmak üzere beş boya

184

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

içermektedir. Daha sonraları ise çok daha fazla sayıda boya içeren tarama kitleri geliştirilmiş bulunmaktadır. Tutuklanmış nükleotid ligandlarının yerine, tutuklanmış boya ligandlarını kullanmanın ise bazı avantajları bulunmaktadır. Bu anvantajlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Boya ligandları, birkaç seri jel hazırlama zahmetine katlanmadan, birkaç grup proteinin saflaştırılmasında kullanılabilecek çok yönlü bir kullanıma sahiptirler. ii. Adsorbentin kimyasal kararlılığı sayesinde tekrar tekrar kullanılabilirler. iii. Depolama süresince aktivite kaybı problem değildir. O

(a) Cibacron Blue F3G-A

NH2

SO3

R1 NH

N NH

O

R2

N

NH N

R1 = H veya SO3Na

SO3

R2 = SO 3Na veya H

M

O

SO3 O3S N N

N

(b) Procion Red H-E3B

N

O3S

SO3

HO OH

NH

NH N

NH N

M M

SO3

N

N

O3S

O

NH

N N OH

Şekil 8.7: Matrikse bağlanarak ligand oluşturan Cibacron Blue F3G–A ve Procion Red H-E3B’nin kimyasal yapıları.

8.7.2.1. Boya Kolonlarından Proteinlerin Elüsyonu

Cibacron Blue F3G-A ve Procion Red H-E3B’nin triazin metodu ile agaroz matrikslere kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş olan kolon materyalleri, ticari olarak bulunmaktadır. Önceden şişirilmiş olarak veya toz halinde temin edilen bu kolon materyalleri hazırlanarak kolona paketlendikten sonra, kolonun dengelenmesi için başlangıç tamponu ile yıkanır. Proteinlerin tutuklu boyaya tutturulması ise genellikle pH 7–8,5’da sağlanır. Hazır hale gelen kolona örnek materyal yüklendikten sonra, liganda bağlanmayan moleküllerin ve kirleticilerin kolondan uzaklaştırılması için yıkama işlemine bir süre daha devam edilir. Bazı proteinler, boyaların yapısal olarak nükleotid kofaktörlere benzemelerinden dolayı, boyalarla biyosipesifik olarak kombine olurlar. Albümin, lipoproteinler, kan pıhtılaşma faktörleri ve interferon gibi bazı proteinler ise elektroforetik ve/veya hidrofobik etkileşimler aracılığı ile aromatik anyonik boyalara daha az özgül olarak bağlanmaktadırlar. Biyospesifik olarak adsorblanan

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

185

proteinlerin elüsyonu, düşük derişimlerde serbest kofaktör içeren tamponların lineer veya basamaklı gradient şeklinde uygulandığı affinite elüsyonu ile başarılabilir. Enzimlerin çoğunun elüsyonu, düşük derişimlerde (genellikle 1–20 mM) kofaktörlerin kullanılması ile sağlanabilmektedir. Genel olarak, çok daha az özgül olarak adsorbe edilen proteinlerin elüsyonu için ise daha yüksek derişimlerde kofaktör veya NaCl veya KCl tuzu (1 M’dan az) içeren tamponların kullanılması gerekmektedir. Elüsyon, pH değişimi ile de başarılabilmektedir. İnterferon gibi daha az özgül olarak adsorblanan proteinlerin elüsyonu, üre ve potasyum izotiyosiyanat gibi daha etkili ajanların kullanıldığı tamponlar ile sağlanmaktadır. Elüsyon için dioksan (%10’a kadar) ve etilen glikol (%50’ye kadar) gibi polariteyi azaltan ajanlar da kullanılabilmektedir. 8.7.2.2. Boya Adsorbentlerinin Temizlenmesi ve Korunması

Kolonun kullanılmasından sonra bazı proteinler elüe olmadan kolonda kalabilir. Ayrıca, kolon içerisinde bakteriyal büyümenin önlenmesi için kolon kullanıldıktan hemen sonra temizlenmelidir. Kolonun alkali ile muamele edilmesi, genellikle kolonda kalan bu proteinleri uzaklaştırmaktadır. Daha iyi bir temizleme sağlamak için ise 0,5 M NaOH içerisinde 6 M ürenin kullanılması sonucunda, denatüre olmuş proteinlerin dahi kolondan uzaklaştırılması sağlanabilir. Fakat, kuvvetli bir temizleyici olan alkali-üre solüsyonunun kolon içerisinde fazla kalmamasına özen gösterilmelidir. Aksi halde Agaroz matriksin parçalanmasına yol açacaktır. Yaklaşık olarak alkali-üre yıkama solüsyonunun yarısı kolon boyunca akıtıldıktan sonra, seyreltik NaCl (örneğin, 10 mM) içeren tamponla bol miktarda yıkanır ve en son olarak da kolonun bir sonraki kullanıma hazır olması için başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi sağlanır. Şayet kolon uzun süre saklanacaksa, kolon depolanmadan önce 10 mM sodyum azid içeren hafif alkali fosfat tamponu ile yıkanmalıdır. Uzun süre depolandıktan sonra, kolonun yeniden kullanmadan (ve en iyisi her kullanımdan) önce seyreltik bir alkali tampon ile yıkanması, kolon materyalinden ayrılmış olan boyanın uzaklaştırılmasına yardımcı olmaktadır. Cibacron Blue F3GA’nın agaroz matriksten en az aktığı pH ise yaklaşık olarak 10 olarak belirlenmişse de bu boyanın, pH 4-11 aralığında minimum akma gösterdiği belirlenmiştir. Asit muamelesi ise agaroz matriksin hidrolizine yol açtığından önerilmemektedir. Cibacron Blue F3G-A’nın Trisacryl matrikste ise pH 1-9 aralığında neredeyse hiç akma göstermediği belirlenmiştir. Boya kolonlarının çoğu defalarca kullanılabilir. Fakat, kolona uygulanan örnek materyalinin ham özütlerden doğrudan elde edilmesi, kolonun ömrünü azaltabilir. Bu nedenle, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin yüklemeden önce amonyum sülfat çökeltmesi veya filtrasyon ile temizlenmesi, kolonun ömrünü uzatmaya yardımcı olabilir. 8.7.3. Heparin Affinite Kromatografisi

Heparin, oldukça fazla çeşitlilikteki biyomolekülleri bağlama yeteneğine sahip, yüksek oranda sülfatlanmış glikozaminoglikan molekülüdür. Heparin tarafından bağlanan moleküller ise enzimler (palamut hücre proteazları, lipoprotein lipaz, koagülasyon enzimleri süperoksid dismutaz), serin proteaz inhibitörleri (anti–trombin III, proteaz neksinler), büyüme faktörleri (fibroblast büyüme faktörü, Schwann hücre büyüme faktörü, endotelyal hücre büyüme faktörü), ekstrasellüler matriks proteinleri (fibronektin, vitronektin, laminin, trombospondin, kollojenler), nükleik asit–bağlama proteinleri [başlama (δ) faktörleri, uzama faktörleri, restriksiyon endonükleazlar, DNA ligaz, RNA polimeraz], hormon reseptörleri (östrojen ve androjen reseptörleri) ve lipoproteinlerdir. İmmobilize heparin, proteinlerle temel olarak iki şekilde etkileşim göstermektedir: i. Affinite ligandı olarak: Örneğin heparinin, büyüme faktörleri ve anti–trombin III ile olan etkileşimi bu tiptedir.

186

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ii. Katyon–değiştirici olarak: Heparinin yüksek oranda anyonik sülfat gruplarına sahip olması nedeni ile örneğin, heparinin nükleik asit–bağlama proteinleri ile olan etkileşimi bu tiptedir. Bu etkileşimde heparin, polianyonik olan nükleik asitlerin yapısı gibi davranmaktadır.

Heparin Sepharose CL–6B, domuz intestinal mukozasından elde edilen heparinin, BrCN metodu ile çapraz–bağlı agaroza kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. HiTrap Heparin ise heparinin, çapraz–bağlı matrikse N–hidroksisüksinimid metodu ile kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Ticari olarak toz halinde temin edilen Heparin Sepharose CL–6B, şişirildikten sonra kolona paketlenir ve 10 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7,3) ile yıkanarak kullanıma hazır hale getirilir. Şişirilmiş olan jel, 110–120 °C, pH 7,0’de 30 dk otoklavlanabilir. Proteinlerin özgül olarak heparine bağlanması ise fizyolojik pH’da gerçekleşir. Özgül-olmayan iyonik etkileşimlerin önlenmesi için, örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında kullanılan tamponun iyonik gücü en azından 150 mM olmalıdır (örneğin, 150 mM NaCl içeren 10 mM NaH2PO4, pH 7,3). Buna rağmen, şayet ayrıştırılmak istenen protein(ler) heparine katyon–değişimi ile bağlanıyorsa, bu durumda örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında kullanılan tamponun iyonik gücünün düşük olması gerekebilir. Kolona bağlanmamış olan moleküllerin ve kirleticilerin yıkanarak uzaklaştırılmasından sonra, özgül olarak bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu gerçekleştirilir. Şayet heparin, affinite ligandı olarak kullanılıyorsa, özgül olarak bağlanan moleküllerin elüsyonu, 1–5 mg mL–1 heparin içeren başlangıç tamponu ile gerçekleştirilebilir. Şayet heparin, katyon–değiştirici olarak kullanılıyorsa elüsyon, NaCl, KCl veya (NH4)2SO4 kullanılarak (maksimum 1,5–2 M) lineer veya basamaklı gradient uygulaması ile gerçekleştirilebilir. 8.7.4. Kalmodulin Affinite Kromatografisi

Kalmodulin, ATP’ye bağımlı enzimler olan adenilat siklaz ve siklik nükleotid fosfodiesteraz da dahil olmak üzere, enzimleri ve nörotransmisyonda rol alan çok sayıdaki proteinleri regüle eden, oldukça korunmuş bir proteindir. Bovin testiküler kalmodulinin BrCN metodu ile agaroz matrikse kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş olan Kalmodulin Sepharose 4B ise bu önemli moleküllerin daha ileri aşamalardaki çalışılmalarını yapabilmek amacı ile izolasyonlarında, oldukça verimli bir kolon materyali olarak kullanılmaktadır. Proteinlerin kalmodulin tarafından bağlaması ise kalmodulinin hidrofobik bölgelerinin proteinler ile olan etkileşimleri sonucunda gerçekleşmektedir. Kalmodulinin hidrofobik bölgelerinin ortaya çıkarılması ise Ca2+ iyonlarının, ayrı bir bölgede bulunan Ca2+–bağlama bölgelerine bağlanması sonucunda meydana gelen yapısal değişiklikle meydana gelmektedir. Şayet, enzimin substratı bulunuyorsa, proteinlerin kalmoduline bağlanması artırılabilir. Enzim–substrat– kalmodulin–Ca2+ kompleksinin daha dayanıklı olduğu belirlenmiştir. Kalmodulin affinite kromatografisinin verimini artırmak için, örnek materyal içindeki proteazlar mümkün olan en kısa sürede uzaklaştırılmalıdır. Çünkü, proteinlerin kalmodulin–bağlama bölgeleri genellikle, proteazlar için oldukça duyarlıdırlar. Örnek materyal içindeki serbest kalmodulin molekülleri ise örnek materyalinin kolona yüklenmesinden önce uzaklaştırılmalıdır. Bu işlem ise örnek materyalin, kalmodulin affinite kromatografisine uygulanmadan önce, Ca2+ iyonlarının bulunduğu hidrofobik interaksiyon kromatografisi (bkz. 9. Bölüm) veya iyon değiş–tokuş kromatografisi (bkz. 6. Bölüm) ile başarılabilir. Kalmodulin affinite kromatografisi için hazır duruma getirilen örnek, 2 mM CaCl ve 50–200 mM NaCl içeren ve bağlanma için iyi bir tampon olan 50 mM Tris–HCl, pH 7,5 ile kolona yüklenir. Bazı özgül-olmayan iyonik etkileşimlerin oluşması nedeni ile düşük tuz derişiminin (50–200 mM NaCl) kullanılması, bu tipteki bağlanmaları elemine etmek için önerilmektedir.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

187

Kalmoduline proteinlerin özgül olarak bağlanmaları, Ca2+ iyonlarının bulunmasına bağlı olduğundan, proteinlerin kolondan elüsyonu, Ca2+ iyonlarını bağlayarak kalmodulinin yapısının değişmesine yol açan şelat ajanları ile gerçekleştirilebilir. Şelat ajanları ile Ca2+ iyonlarının bağlanması, kalmodulinin proteinleri bağlamasını sağlayan yapısal değişikliğin ortadan kalkmasına ve bunun sonucu olarak da proteinlerin kolondan elüsyonuna yol açacaktır. Şelat ajanı olarak ise 2 mM EGTA kullanılması ideal olmakla birlikte EDTA da kullanılabilmektedir; fakat EGTA kadar verimli olmamaktadır. Ca2+ iyonlarının yer değiştirmesi, yüksek tuz derişimleri (örneğin, 1 M NaCl) ile de sağlanabilir, fakat tuzun elüsyon etkisi özgül değildir ve bu nedenle ilk tercih olarak kullanmaktan sakınılmalıdır. 8.7.5. Nükleotid Affinite Kromatografisi

Poli–U ve poli–A gibi oligonükleotidlerin ve 5’-AMP ve 2’5’-ADP gibi nükleotidlerin tutuklanması ile elde edilmiş kolon materyallerinin kullanılması ile bazı nükleik asitlerin ve proteinlerin, affinite kromatografisi ile ayrıştırılarak saflaştırılması ise günümüzde oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı nükleotidlerin ligand olarak kullanılması sonucunda, farklı tipte nükleotid affinite kromatografi materyalleri bulunmaktadır. Bu materyaller ve kullanıldığı alanlarla birlikte özgül özellikleri ise takip eden alt-kısımlarda ele alınmaktadır. 8.7.5.1. Poli–U Affinite Kromatografisi

Poli–U Sepharose 4B, uzun bir poli–U zincirinin (yaklaşık 100 nükleotid uzunluğunda) BrCN metodu ile Sepharose matriksine kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Bu kolon materyaline, poli–U dizisine affinitesi olan m–RNA ve diğer nükleik asitler veya proteinler, özgül ve geri–dönüşümlü olarak bağlanmaktadırlar. Tutuklu Poli–U dizilimi ile m–RNA arasındaki etkileşim, neredeyse bütün m–RNA moleküllerinin karakteristik bir özelliği olan poli–A kuyrukları ile poli–U dizilimi arasındaki baz eşleşmesi sonucunda oluşan hibridizasyona dayanmaktadır. m–RNA molekülleri çok kısa poli–A kuyruklarına sahip olsalar dahi, poli–U ligandlarının kullanıldığı affinite kromatografileri yüksek oranda verimlilikle sonuçlanmaktadır. Poli–U Sepharose 4B matriksinin yok denecek kadar özgülolmayan adsorbsiyon göstermesi nedeni ile bu matriks, iyi bir akış oranı ve kısa bir sürede saf m– RNA moleküllerinin elde edilmesini sağlamaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan Poli–U Sepharose 4B, NaCl solüsyonu (100 mM; pH 7,5) ile şişirildikten sonra cam filtreden geçirilerek yıkanır (her bir gram kuru matriks için 100 mL). Jel daha sonra uygun bir kolona paketlenir ve aynı orandaki elüsyon tamponu ile yıkandıktan sonra, başlangıç tamponu ile dengelenir (%25 formamid içinde 700 mM NaCl; 50 mM Tris–HCl; 10 mM EDTA; pH 7,5). Poli–U affinite kromatografisine uygulanacak polizomal örnekler, ribonükleazların inhibisyonunu sağlamak amacı ile deterjan solüsyonları (%1 lauroyl–sarcosine; 30 mM EDTA) içinde hazırlanmalıdır. Bunun yanı sıra, diğer ribonükleaz inhibitörleri de kullanılabilir. Örnek materyal 5-kat seyreltildikten sonra kolona yüklenir. Kirleticilerin uzaklaştırılması için kolon, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanır. Poli–U ligandı ile m–RNA arasındaki biyospesifik etkileşim, H bağları aracılığı ile sağlandığından, m–RNA moleküllerinin elüsyonu da H bağlarını kıran her türlü koşulda sağlanabilir. Formamid, poli–U:poli–A hibridi arasındaki H bağlarını kırarak etkili bir ayrılma sağlamaktadır. Alternatif elüsyon prosedürü olarak sıcaklığın artırılması da kullanılabilir. m–RNA moleküllerinin elüsyonu için kullanılan tampon ise %90 formamid içinde hazırlanan, deterjan içeren bir solüsyondur (10 mM potasyum fosfat; 10 mM EDTA; %0,2 lauroyl–sarcosine; pH 7,5). m–RNA

188

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

moleküllerinin elüsyonu ise 254 nm’de UV spektrofotometresi ile takip edilebileceği gibi çok daha hassas olarak radyoaktif işaretleme ile de takip edilebilir. 8.7.5.2. Poli–A Affinite Kromatografisi

Poli–A Sepharose 4B, uzun bir poli–A zincirinin (yaklaşık 100 nükleotid uzunluğunda) BrCN metodu ile Sepharose matriksine kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Bu kolon materyaline, poli–A dizisine affinitesi olan m–RNA–bağlama proteinleri, viral RNA ve DNA’ya bağımlı aktivite gösteren RNA polimeraz gibi oldukça farklı moleküller, özgül ve geri– dönüşümlü olarak bağlanmaktadırlar. Poli–A Sepharose 4B, çok fazla sayıdaki molekül grubunun ayrıştırılmasında kullanılabileceği nedeni ile tek bir optimum prosedürün tanımlanması mümkün değildir. Buna rağmen, burada verilen metot diğer uygulamalar için bir temel oluşturmaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan Poli–A Sepharose 4B, NaCl solüsyonu (100 mM; pH 7,5) ile şişirildikten sonra uygun bir kolona paketlenir. Paketlenen jel, önce 100 mM NaCl solüsyonu (her bir gram kuru matriks için 100 mL) ile daha sonra da formamid tamponu ile (%90 formamid içinde 10 mM fosfat; 10 mM EDTA; pH 7,5) yıkanır. Yıkanan jel, kolon yatak hacminin 5-misli başlangıç tamponu ile dengelenir. Poli–A Sepharose 4B’nin dengelenmesi için kullanılacak başlangıç tamponları ise protein ve nükleik asit örneklerine uygun olarak hazırlanmalıdır. Protein örnekleri için kullanılabilecek başlangıç tamponu, bağlanmanın sağlanması amacı ile düşük iyonik kuvvetli olmalıdır (örneğin, 10 mM Tris–HCl; pH 7,4). Şayet gerek varsa, düşük moleküler kütleli kükürt (tiyol) bileşikleri, EDTA ve metal iyonları eklenebilir. Nükleik asit örnekleri için kullanılabilecek başlangıç tamponu, proteinlerin bağlanmasını en aza indirgediği için yüksek iyonik kuvvetli olmalıdır. Ribonükleazları inhibe etmek için ise lauroyl–sarcosine veya başka bir uygun ajan kullanılabilir. Bu amaçla, %25 formamid içinde hazırlanan 700 mM NaCl; 50 mM Tris–HCl; 10 mM EDTA; pH 7,5 uygun olmaktadır. Poli–A ligandları ile proteinlerin saflaştırılmasında dikkate alınması gereken diğer bir husus ise şayet, örnek materyal nükleik asitleri içeriyorsa, örneğin kolona yüklenmeden önce RNaz ile muamele edilmesidir. Çünkü, nükleik asitler poli–A ligandına bağlanarak kolonun verimliliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Bunun bir sonucu olarak da, nükleik asit içeren örneklerle, nükleik asit içermeyen örneklerin elüsyon profilleri faklı olacaktır. Bu nedenle, nükleik asit içeren örnekler kolona yüklenmeden önce, RNaz ile muamele edilmelidir. Protein örneklerinin kolondan elüsyonu ise iyonik kuvvetin artırılması, formamid ile muamele, pH’nın indirgenmesi, SDS veya 7 M guanidin HCl ile muamele yöntemleri ile sağlanabilir. Nükleik asitlerin kolondan elüsyonu ise formamid ile muamele, sıcaklığın artırılması ve iyonik kuvvetin artırılması gibi, H bağlarını bozacak koşulların uygulanması ile başarılabilmektedir. 8.7.5.3. 5’ AMP ve 2’5’ ADP Affinite Kromatografisi

5’-AMP Sepharose 4B ve 2’5’-ADP Sepharose 4B, sırasıyla NAD+ (NAD+–bağımlı dehidrogenazlar ve ATP–bağımlı kinazlar) ve NADP+ (NADP+–bağımlı dehidrogenazlar ve NADP+’e affinitesi olan diğer enzimler) kofaktörlerine gereksinim duyan enzimleri ayrıştırmada kullanılan, grup–özgüllüğü gösteren adsorbentlerdir. 5’-AMP ve 2’5’-ADP ligandları, bu adsorbentlere bağlanan enzimler tarafından gereksinim duyulan doğal kofaktörlerin yapısal analoglarıdırlar. 5’-AMP Sepharose 4B ve 2’5’-ADP Sepharose 4B materyallerinin her ikisi de, enzimler ile maksimum biyospesifik etkileşimin sağlanabilmesini garantilemek amacı ile 6 C uzunluğunda ayırıcı–kollara sahiptirler.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

189

Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyalleri şişirildikten sonra, fosfat tamponu ile cam filtreden geçirilerek yıkanır (100 mM; pH 7,0; her bir gram kuru matriks için 100 mL). Yıkanmış olan jel, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Özgül olarak liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu ise seçici elüsyon koşullarının uygulanması ile sağlanır. Seçici elüsyon koşullarının uygulanması ise adsorbente bağlanan her bir enzimin hem tutuklu ligand için hem de elüent içindeki kofaktörler, substratlar, inhibitörler veya effektörler için göstereceği affinitenin farklı olmasından dolayı mümkündür. Tutuklu nükleotidlere bağlanan enzimlerin elüsyonu ise biyospesifik affinite elüsyonu, iyonik kuvvet gradient elüsyonu, pH gradient elüsyonu ve sıcaklık gradient elüsyonu ile yapılabilmektedir. Bunun yanı sıra, kofaktörlerin ve okside edilmiş substratların ve substrat analoglarının veya inhibitörlerin varlığında, dehidrogenazlar ile oluşturulmuş üçlü komplekslerin oluşturulması da kullanılabilir. Örneğin, NAD+ ve piruvat kullanılarak, laktat dehidrogenazın elüsyonu gerçekleştirilmiştir. 8.7.6. Protein-A ve Protein-G ile Affinite Kromatografisi

Bakteriyel kaynaklı olan protein-A (Staphylococucus aureus) ve protein-G (Streptococcus), özgül olarak poliklonal ve monoklonal IgG–tipi antikorlarının Fc bölgelerini bağlarlar. Protein-A ve protein-G’nin tutuklu formları ise monoklonal IgG–tipi antikorların saflaştırılması, poliklonal IgG’lerin izolasyonu ve fraksiyonlanması ve immün komplekslerinin izolasyon ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar. 8.7.6.1. Protein-A Affinite Kromatografisi

Staphylococucus aureus hücrelerinin dış membranından izole edilen protein-A, çok sayıdaki memeli türünden elde edilen IgG moleküllerinin Fc fragmentleri ile etkileşim göstermektedir (Tablo 8.4). Domuz, köpek ve kediden elde edilen bazı poliklonal IgM ve IgA moleküllerinin protein-A ile fraksiyonlanmasının yanı sıra, IgM ve IgA içeren monoklonal antikorlar da protein-A için affinite göstermektedirler. Bunun yanı sıra protein-A, insan IgG alt–sınıflarından 1, 2, ve 4’ü bağlamakta, fare IgG alt–sınıfları için ise farklı bağlama affiniteleri göstermektedir. İnsan kaynaklı immünoglobilinlerden protein-A ile en reaktif olanı IgG olsa da, bazı diğer tipteki immünoglobilinlerin de protein-A ile bağlandığı bilinmektedir. İnsan ağız sütü immünoglobilini olan IgA’nın yanı sıra, insan miyolema IgA2 de protein-A ile etkileşim göstermekte, fakat IgA1 göstermemektedir. Ayrıca, bazı insan monoklonal IgM, normal ve makroglobulinamik seralardan elde edilen IgM’ler de protein-A’ya bağlanmaktadır. Protein-A sentezinden sorumlu olan genin klonlanması sonucunda, bu proteinin oldukça farklı formları bulunmaktadır. Protein-A’nın çapraz–bağlı agaroz matrikse BrCN metodu ile kovalent olarak bağlanması ile Protein-A Sepharose, N–hidroksisüksinimid metodu ile agaroz matrikse kovalent olarak bağlanması ile de HiTrap Protein-A ve Protein-A Superose kolon materyalleri elde edilmiştir. Fizyolojik pH ve iyonik kuvvette çok sayıdaki türün IgG molekülleri ve bunların alt–sınıfları protein-A’ya bağlandığından, başlangıç tamponu olarak sodyum fosfat (10 mM), NaCl (150 mM), pH 8, kullanılabilir. Paketlenmiş olan kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanmasından sonra, kolona yüklenen örnek materyali içindeki kontaminatların ve bağlanmamış moleküllerin uzaklaştırılması için kolonun, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanması gerekir. Liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu ise kuvvetli elüsyon koşullarında gerçekleştirilir. Kolon materyali ise pH 2–11 arasında dayanıklı olup, yüksek derişimlerdeki üre, guanidin HCl ve SCN–, CCl3COO– veya I– gibi yıkıcı tuzların nötral solüsyonlar içinde uygulanmasını tölare edebilmektedir. Bu nedenle elüsyon, genellikle pH 3 olan 1 M asetik asit, 100 mM glisin–HCl

190

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

tamponu veya 3 M potasyum izotiyosiyanat ile başarılmaktadır. Elüsyon koşullarının oldukça dramatik olmasından dolayı, elüe edilen fraksiyonları yaklaşık nötral pH’da toplamaya yarayacak daha yumuşak çözücüler (birkaç damla, 1 M Tris–HCl; pH 9,0) içinde toplamak gerekebilir. Tablo 8.4: Protein-A ve protein-G’nin farklı türlere ait IgG moleküllerini bağlama kuvvetleri*. Tür

Protein A

Protein G

Tavuk

–

–

İnek

+

++

Köpek

++

+

Keçi

+

++

Gine domuzu

++

+

–

++

İnsan IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

++ ++ – ++

++ ++ ++ ++

Fare

+

+

Domuz

++

++

Tavşan

++

++

Rat

–

+

Koyun

–

++

At

*Proteinlerin antikorları bağlama şiddeti: ++ güçlü; + orta; – zayıf veya hiç.

Daha duyarlı antikorların izolasyonlarının yapıldığı durumlarda ise özgül ayrılmayı sağlayan, daha yumuşak elüsyon metotlarının kullanılması tercih edilmelidir. IgG’nin Fc fragmentlerindeki tirozin kalıntılarının protein-A ile etkileşime katıldığı bilinmektedir. Bu nedenle, elüsyon için glisiltirozin kullanılabilir. Elüsyon sırasında ise elüentin (oda sıcaklığında, 2 M NaCl; pH 7,0 içinde 100 mM glisiltirozin) akış yönü, yıkama tamponunun akış yönünün tersine çevrilir. Elüsyon sonrası toplanan IgG fraksiyonlarındaki tuz ise çeşitli yöntemlerle uzaklaştırılmalıdır. IgG’nin deformasyonuna yol açan elüsyon koşulları yüksek verimlilikle sonuçlanmasına rağmen, çok daha ılımlı olan özgül elüsyon koşulları ile saflaştırılan IgG moleküllerinin denatüre olmadıkları görülmektedir. 8.7.6.2. Protein-G Affinite Kromatografisi

Protein-A gibi protein-G de, IgG’lerin Fc bölgelerini bağlamaktadır. Buna rağmen, proteinG’ye sıkı bir şekilde bağlanan poliklonal IgG’lerin sayısı daha fazlardır ve adsorbsiyon, oldukça geniş bir pH aralığında gerçekleşmektedir. Farklı alt–sınıflara ait IgG’lerin bağlanması dikkate alındığında, protein-G’nin, insana (toplam IgG popülasyonunun yaklaşık %8’ini oluşturan IgG3’de dahil) ve fareye (fare IgG1’de dahil) ait bütün IgG alt–sınıflarını, standart tampon koşullarında eşit olarak bağladığı görülmektedir. Protein-A’ya ya hiç bağlanmayan ya da çok zayıf bağlanan koyun, inek ve at IgG’lerinin yanı sıra, rat IgG2a ve IgG2b, tutuklu protein-G ile saflaştırılabilmektedir. Antikorların çoğu ise Fab bölgeleri aracılığı ile zayıf bir affinite ile de olsa protein-G ile etkileşim göstermektedirler. İnsan miyolema IgM, IgA veya IgE’lerinin bazılarının ise protein-A ile bağlandıkları halde, protein-G ile bağlanmadıkları görülmektedir.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

191

Streptococcus üyelerine ait protein-G geninin, E. coli’ye klonlanması ile üretilen rekombinant protein-G’nin üç tipi kullanılarak, Amersham Pharmacia Biotech tarafından HiTrap Protein-G, Protein-G Sepharose ve Protein-G Superose kolon materyalleri üretilmiştir. Bu kolon materyallerinde kullanılan rekombinant protein-G, doğal protein-G’nin albümin–bağlama bölgesinin genetiksel olarak çıkarılması ile elde edilmiş ve böylece, ligandın albümin ile olan istenmeyen reaksiyonları ve proteazlar ile degredasyonu önlenmiştir. Protein-G ligandları ise iki tane IgG bağlama domaini içermektedir. Bu rekombinant protein-G moleküllerinin kullanılması ile de farklı özelliklerde kolon materyalleri hazırlanmıştır. Örneğin, GammaBind G Sepharose ve GammaBind Plus Sepharose bu tipteki rekombinant protein-G’lerin ligand olarak kullanıldığı kolon matriksleridir. GammaBind G Sepharose matriksinde kullanılan protein-G’nin moleküler kütlesi 22 kDa olup, albümin–bağlama domainine sahip değildir ve proteazlar ile degredasyona dirençli olan bu protein, BrCN metodu ile matrikse bağlanmıştır. Bu rekombinant protein-G de E. coli’de üretilmiştir. Bu rekombinant protein, iki tane IgG–bağlama “B–domainleri” ve yüklü bir “C–bölgesine” sahiptir. C–bölgesi ise IgG bağlamada rol almayıp, 10 lizin kalıntısından oluşmaktadır. GammaBind Plus Sepharose matriksinde kullanılan protein-G’nin ise moleküler kütlesi 15 kDa olup, albümin–bağlama domainine sahip değildir, iki tane IgG–bağlama bölgesine sahiptir ve E. coli’de üretilmiş olan bu protein maleimid metodu ile matrikse bağlanmıştır. Çok sayıdaki türün IgG molekülleri ve bunların alt–sınıfları, fizyolojik pH ve iyonik kuvvete protein-G’ye bağlanmaktadır. Fizyolojik koşullara yakın bir bağlama (başlangıç) tamponu olarak, sodyum fosfat (10 mM), NaCl (150 mM), EDTA (10 mM), pH 7, kullanılabilir. Paketlenmiş olan kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanmasından sonra, kolona yüklenen örnek materyal içindeki kirleticilerin ve bağlanmamış moleküllerin uzaklaştırılması için kolonun, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanması gerekir. Liganda bağlanan IgG’lerin elüsyonu ise örnek materyalinin orijinine bağlı olarak, pH’nın 3–2,5 değişimi ile sağlanabilir. Örneğin, elüsyon sıvısı olarak amonyum hidroksit ile elüsyon pH’sına ayarlanmış, 500 mM asetik asit (pH 3–2,5) kullanılabilir. Elüsyon koşullarının oldukça dramatik olmasından dolayı, elüe edilen fraksiyonları yaklaşık nötral pH’da toplamaya yarayacak daha yumuşak çözücüler (birkaç damla, 1 M Tris–HCl; pH 9,0) içinde toplamak gerekebilir. 8.7.7. Küçük Ligandlar ile Affinite Kromatografisi 8.7.7.1. Benzamidin Affinite Kromatografisi

Sentetik bir inhibitör olan para–benzamidinin epoksi metodu ile matrikse kovalent olarak bağlanması (Şekil 8.8) ile elde edilmiş olan Benzamidin Sepharose, tripsin ve tripsin–benzeri proteazların yanı sıra, ürokinaz ve prekallikrein gibi zimojenlerin ayrıştırılmasında kullanılmaktadır. Bu kolon materyali, hem özgül bir proteazın izolasyonunda “pozitif” affinite kromatografisi için, hem de protein ya da peptid preparasyonlarından (örneğin, monoklonal antikor preparasyonları veya triptik parçalama) proteolitik aktivitenin uzaklaştırılması için “negatif” affinite kromatografisi olarak kullanılabilmektedir. Epoksi metodu ile matrikse bağlanmış olan ligand (Şekil 8.8), uzun bir hidrofilik ayırıcı–kolun yanı sıra, kararlı eter ve alkilamin bağları içermektedir. Süspansiyon halinde ticari olarak temin edilebilen kolon materyali, uygun bik kolona paketlenerek yıkanıp, dengelendikten sonra örnek materyal, 500 mM NaCl içeren Tris–HCl (50 mM, pH 8,0) tamponu içinde kolona yüklenir. Bağlanma, optimal olarak 4 °C’da gerçekleşirse de oda sıcaklığında da iyi sonuç vermektedir. Benzamidin–enzim etkileşiminin ekzotermik olması ve enzimatik aktivitenin baskılanması nedeni ile proteinlerin liganda bağlanması, düşük sıcaklıklarda daha iyi sonuç vermektedir. Yüklemeyi takiben, özgül-olmayan bağlanmaların ve kirleticilerin uzaklaştırılması için kolon yıkanır. Özgül

192

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

olarak liganda bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise, rakip (yarışmacı) olarak elüsyon sıvısına serbest para–benzamidin ilavesi ile yapılabilir.

M

O

CH2

CH

CH2

O

(CH2)4 O CH2

OH

CHOH CH2 NH

H2N

C

NH

Şekil 8.8: Benzamidin ligandının kimyasal yapısı.

8.7.7.2. Lizin Affinite Kromatografisi

Lizin Sepharose, L–lizinin BrCN metodu ile kovalent olarak matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Lizin ise matrikse, α–amino (–NH2) grubu aracılığı ile bağlandığından, hem ε–amino hem de α–karboksil (–COOH) grupları kromatografi esnasında örnek moleküller ile etkileşime katılmak üzere serbesttirler. Grup–özgüllüğü gösteren bir adsorbent olan Lizin Sepharose ile plazminojen ve plazminojen aktivatörlerinin izolasyonu, r–RNA moleküllerinin ayrıştırılması ve çift–zincirli DNA moleküllerinin saflaştırılması yapılabilmektedir. Ayrıştırma prosesinin mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, elektrostatik ve stereoözgül etkilerin her ikisi de izolasyona katkıda bulunmaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyali 15 dakika su veya 100 mM NaCl içeren tampon (nötral pH’ya yakın) içinde şişirildikten sonra, aynı solüsyon ile yıkanır. Yıkanmış olan jel, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Daha sonra ise bağlı moleküllerin elüsyonu örnek materyale uygun bir metotla gerçekleştirilir. Lizin içeren tampon ile özgül elüsyon ise bazı durumlarda daha uygun olabilir. 8.7.7.3. Arjinin Affinite Kromatografisi

Arjinin Sepharose, L–arjininin BrCN metodu ile kovalent olarak matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Matrikse bağlanmış olan ligand (Şekil 8.9), uzun bir hidrofilik ayırıcı– kolun yanı sıra, kararlı eter ve alkilamin bağları içermektedir. Arjinin ise matrikse, α–amino (–NH2) grubu aracılığı ile bağlandığından, hem guanidino hem de α–karboksil (–COOH) grupları kromatografi esnasında örnek moleküller ile etkileşime katılmak üzere serbesttirler. Grup–özgüllüğü gösteren bir adsorbent olan Arjinin Sepharose ile serin proteazların; prekallikrein, protrombin, plazminojen ve plazminojen aktivatörlerini içeren zimojenlerin saflaştırılması yapılabilmektedir. Süspansiyon halinde ticari olarak bulunan kolon materyali, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Daha sonra ise bağlı moleküllerin elüsyonu, özgül-olmayan elüsyon metodu ile gerçekleştirilebilir. Arjinin içeren tampon ile özgül elüsyon ise bazı durumlarda daha uygun olabilir.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

M

O

Doç. Dr. Münir TUNCER

CH2

CH

CH2

O

193

(CH2)4 O

OH

CH2 CHOH CH2 NH CH COO CH2

CH2 CH2

NH NH

C NH2

Şekil 8.9: Arjinin ligandının kimyasal yapısı.

8.8. Metal Şelat Affinite Kromatografisi

İlk defa 1975 yılında Porath ve arkadaşları tarafından uygulanan metal şelat affinite kromatografisi, günümüze kadar yavaş yavaş da olsa geliştirilerek protein saflaştırma tekniklerinden birisi olarak kullanılmaktadır. Cu2+, Zn2+, Hg2+ veya Cd2+ gibi tutuklanmış metal iyonlarının ya da Fe2+, Co2+, Ni2+ veya Mn2+ gibi geçiş (transisyon) metal iyonlarının, histidin kalıntılarının imidazol gruplarıyla, sistein kalıntılarının sülfidril gruplarıyla ve triptofan kalıntılarının ise indol gruplarıyla oluşturduğu reaksiyonlarla, proteinleri ve peptidleri seçici olarak tutuklu metal liganda bağlamak için kullanılan özel bir affinite kromatografisi şeklidir. Bu kromatografi şekli, özellikle poli–histidin, poli–sistein veya poli–triptofan füzyonları oluşturulmuş olan rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında oldukça önemlidir (bkz. kısım 1.8.2). Metalloproteinler ise genellikle, kolon içerisindeki metal iyonlarını yakalama eğiliminde olduklarından, metal şelat affinite kromatografisi ile saflaştırmak için uygun materyaller değildirler. Bu teknikle saflaştırılmış olan proteinler arasında ise tekniğin ilk uygulaması olan Zn-TED kolonu ile serumdan α2makroglobülünlerin ayrıştırılması ve Fe3+-IDA kolonu ile kas özütlerinden fosforilaz ve laktat dehidrogenaz enzimlerinin ayrıştırılması yer almaktadır. Bunun yanı sıra, metal şelat affinite kromatografisi ile ayrıştırılması gerçekleştirilen proteinler arasında fibrinojen, süperoksit dismutaz ve histon olmayan nüklear proteinleri içeren bir grup protein de sayılabilir. 8.8.1. Matriks Materyalleri

Genellikle, bir iminodiasetat (IDA), tris(karboksimetil)–etilendiamin (TED) veya nitrilo triasetik asitin (NTA) kovalent olarak bağlandığı agaroz matriksleri, metal ligandların tutuklanmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Şekil 8.10). Metal şelat affinite kromatografisi için gerekli olan kolon materyalleri ise hem HPLC (HiTrap Chelating ve Chelating Superose) hem de LPLC (Chelating Sepharose) için bulunmaktadır. Bu kolon materyalleri, iminodiasetik asitin hidrofilik bir ayırıcı–kol oluşturacak şekilde, epoksi metodu ile çapraz–bağlı agaroz matrikse bağlanması ile elde edilmişlerdir ve pH 2–14 arasında kullanılabilirler. 8.8.2. Kolonun Hazırlanması ve Dengelenmesi

Ticari olarak temin edilen kolon materyalleri şelatlanmış metal içermediklerinden, bu matriksler kullanılmadan önce arzu edilen metal iyonu ile yüklenmelidirler. Kolon materyalinin metal iyonları ile yüklenmesi ise genellikle, 50 mM uygun metal tuzunu (ZnCl2, CuSO4 v.b.) içeren su ile kolonun yıkanması şeklinde gerçekleştirilir. Metal iyonları ile yüklenmiş olan matriks ise örnek materyalinin yüklenmesinden önce, fazla metal iyonlarının kolondan uzaklaştırılması için başlangıç tamponu ile yıkanmalıdır. Ayrıca, zayıf olarak bağlanmış metal iyonlarının aktif olarak kolondan uzaklaştırılması gerektiği durumlarda ise 1-10 mM imidazol veya 500 mM glisin gibi zayıf kompleks oluşturan ajanlarla kolonun yıkanması gerekebilir.

194

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

OH IDA

M

O CH2 CH

CH2 N

CH2COO CH2COO

CH2COO N

OH NTA

M

O CH2 CH

CH2COO

CH

CH2COO

CH2CH2N

OH TED

M

O CH2 CH

CH2 N

CH2COO M CH2COO

CH2COO

Şekil 8.10: İmmobilize metal iyon şelatör ligandlarından üç tipinin yapısı. IDA, iminodiasetat; NTA nitrilo triasetik asit; TED tris(karboksimetil)–etilendiamin. Her üç tipte de metal iyon şelatör ligandlarının matrikse bağlama işlemi Şekil 8.4’de gösterilen epoksi aktivasyon yöntemi ile yapılmaktadır.

8.8.3. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ve Elüsyonu

Örnek materyal ise başlangıç tamponu içinde çözünmelidir. İyi bir bağlanmanın elde edilmesi için ise nötral veya hafif alkali pH’daki tamponların kullanılması gerekmektedir. Bu amaçla kullanılabilecek tamponlar ise tris asetat (50 mM), sodyum fosfat (20–50 mM) ve Tris–HCl (20–50 mM)’dir. Tris–HCl, bağlanmayı azaltma eğiliminde olduğundan bu tampon, sadece metal–protein affinitesinin oldukça yüksek olduğu durumlarda kullanılmalıdır. Başlangıç tamponunda yüksek derişimlerde tuz veya deterjanların bulunması, normalde proteinlerin bağlanmasını etkilemez. Bu nedenle, yüksek tuz derişimleri istenmeyen iyon–değişimi etkisinin önlenmesi için yüksek iyonik gücün (örneğin, 0,5–1 M NaCl) oluşturulmasına katkıda bulunurlar. Proteinin kolon içerisindeki tutuklanması, proteinin liganda tutturulmasına izin vermeye yetecek kadar ve liganda bağlanmamış kontaminatların elüsyonu sırasında ise proteinin kolonda alıkonmasını sağlayacak kadar kararlı, ortak bir bağın oluşturulması ile sağlanır. Kirleticilerin kolondan yıkanmasından sonra, metal–liganda bağlanan proteinin elüsyonu, birkaç yolla sağlanabilir. Bu yolların hepsinde de iyonik etkileşimlerin baskılanmasını sağlamak amacı ile elüsyon tamponu 0,5–1 M NaCl içermelidir. Bağlı moleküllerin özgül elüsyonu, ya hedef molekül ile ya da ligand ile yarışmacı (rakip) olan ajanların gradient şeklinde kolona uygulanması ile sağlanabilir. Amonyum klorid (0–150 mM), imidazol (0–50 mM) veya histamin ve glisin gibi, şelatlanmış metal için affinitesi olan diğer maddelerin artan derişimlerdeki gradientleri de kullanılabilir. EDTA (50 mM) veya diğer kuvvetli şelatlayıcılar ise metal iyonlarını ve kolona sıkıca bağlanmış olan materyallerin tamamının elüsyonuna neden olacağından, genellikle farklı proteinlerin ayrıştırılmasını sağlamazlar. Moleküllerin bağlama bölgelerindeki yüklü grupların iyonizasyon derecesi ise pH tarafından kontrol edildiği için, bağlı moleküllerin özgül-olmayan elüsyonu, pH gradienti ile sağlanabilir. Dolayısıyla, protein–metal kompleksinin zayıflatılmasıyla ya da elüsyon tamponunun iyonik gücünün artırılması ile proteinlerin elüsyonu gerçekleştirilebilir. pH değişimi ile bağlı moleküllerin ligandan ayrılması, pH’nın lineer gradient ya da basamaklı olarak düşürülmesi ile sağlanabilir. Proteinlerin çoğunun elüsyonu, pH 6,0 ile 4,2 arasında gerçekleştiğinden, pH gradientinin 7,0–4,0 arasında uygulanması normal bir sonuç vermektedir. Özgül-olmayan elüsyon koşullarının oldukça yıkıcı olmasından dolayı, elüsyonu yapılan fraksiyonların nötralizasyonunu sağlayacak daha ılımlı

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

195

tamponlar içinde toplanması veya tuzların uzaklaştırılması için uygun tekniklerin kullanılması gerekebilir. 8.9. Kovalent Kromatografisi

Bu kromatografi şekli, sülfidril (–SH) grubu içeren proteinlerin ve peptidlerin, disülfit grubu (S–S) içeren tutuklanmış bir ligandla etkileşiminden yararlanılarak ayrılması için, özel olarak geliştirilmiştir. Kovalent kromatografisi aynı zamanda, solid–faz peptid sentezi sırasında sentezi tamamlanmış olan peptidleri, sentezi tamamlanmamış olanlardan ayrıştırmada, civalanmış polinükleotidlerin tutklanmasında ve izolasyonunda, enzim tutuklamada ve affinite kromatografisi için başka adsorbentlerin sentezinde kullanılmaktadır. Kovalent kromatografide, izole edilecek olan sülfidril–içeren molekül, kovalent olarak kromatografik adsorbente bağlanır. Bunun başarılması ise izolasyonu yapılacak olan molekülün sülfidril gruplarının seçici olarak, sülfidril–disülfid değişimleri aracılığı ile karışık disülfid bağlarının oluşumu yoluula, sülfürlenerek aktive edilmiş matrikslere bağlanmasını gerektirir. Ayrıştırılacak olan moleküllerin sülfidril grupları ile matriksin sülfidril grupları arasındaki bağlanma geri–dönüşümlü olduğundan, kirleticiler ve matrikse bağlanmayan moleküller kolondan uzaklaştırıldıktan sonra, disülfid bağlarının indirgenmesi ile moleküllerin elüsyonu sağlanabilir. Kovalent kromatografisinin prensibi, Şekil 8.11’de şematize edilmiştir. Kovalent kromatografi için yaygın olarak kullanılan matriksler ise Activated Thiol Sepharose ve Thiopropyl Sepharose’dur. Bu adsorbentlerin her ikisi de sülfidril içeren moleküller ile ılımlı koşullar altında veya denatüre edici ajanların varlığında, kendiliğinden (spontane) ve geri–dönüşümlü olarak reaksiyona girmektedir. Activated Thiol Sepharose, 2,2’–dipiridil disülfid (aynı zamanda 2,2’–ditiyopiridin olarak da bilinmektedir) ve glutatyonun önceden BrCN ile aktive edilmiş matrikse bağlanması ile elde edilmiştir (Şekil 8.12,a). Hidrofilik glutatyon kalıntısı ise ayırıcı–kol olarak görev yapmaktadır. Thiopropyl Sepharose ise 2–tiyopiridilin kimyasal olarak kararlı bir eter köprüsü ile agaroz matrikse bağlanması ile elde edilmiştir (Şekil 8.12,b). Bu matriksteki 2–hidroksipropil kalıntısı ise hidrofilik bir ayırıcı–kol olarak görev yapmaktadır. Kovalent kromatografisi ile ayrıştırılarak saflaştırılmak istenen proteinler, disülfid formunda sistein kalıntıları içeriyorsa, bu disülfid köprüleri proteinler kolona yüklenmeden önce (örneğin, 2– merkaptoetanol kullanılarak veya alternatif yöntemlerle) indirgenmeli, böylece protein ile 2,2’– dipiridil disülfid aktivasyonu sağlanmalıdır. Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyali, pH 7,0 olan uygun bir tampon (kükürt, ağır metal veya indirgeyici ajanları içermeyen) içinde şişirildikten sonra, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Başlangıç tamponu olarak, NaCl içeren (100-500 mM) Tris–HCl, fosfat veya asetat gibi basit bir tampon kullanılır. Şayet gerekli görülürse, proteinlerin denatüre olmasını ve bütün sülfidril gruplarının reaksiyon için ulaşılabilir olmasını garantilemek amacı ile üre (8 M) veya guanidin HCl (6 M) eklenebilir. Kovalent kromatografi esnasında kullanılan bütün tamponlar ise serbest sülfidril gruplarının oksidasyonunu önlemek amacı ile havası alınmış tamponlar olmalıdır. Katalitik ağır metal iyonlarının uzaklaştırılması için ise EDTA (1 mM) kullanılabilir. Dengelenmiş olan kolona örneğin yüklenmesi ve elüsyonu sırasında ise genellikle akış hızının düşük olması (5–10 mL s–1) kolonun verimliliğini olumlu olarak etkilemektedir. Sülfidril içeren proteinle ligand arasındaki reaksiyon sırasında, 2–tiyopiridin serbest bırakılır (Şekil 8.11,b). Bu proses, 343 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak takip edilebilir. Dolayısıyla, saflaştırılmak istenen proteinin absorbsiyonunun takip edilmesini de olanaklı kılmaktadır. Protein, matrikse kovalent olarak tutturulduktan sonra, sülfidril içermeyen kirleticilerin elüsyonu gerçekleştirilir ve tepki vermeyen tiyopiridil grupları ise 4 mM ditiyotreitol veya 2–merkaptoetanol kullanılarak kolondan uzaklaştırılır. Daha sonra ise kolon matriksine kovalent olarak bağlı bulunan

Doç. Dr. Münir TUNCER

196

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

proteinlerin elüsyonu, nötral veya hafif alkali pH’da 20–50 mM ditiyotreitol, indirgenmiş glutathione veya sistein gibi sülfidril–içeren bir bileşikle yer değiştirilerek serbest bırakılır (Şekil 8.11,c). En son olarak matriks, 2,2’–dipiridil disülfit ile reaksiyona sokularak rejenere edilir (Şekil 8.11,d). Metod birçok proteinin saflaştırılmasında başarılı bir şekilde uygulanmıştır, fakat maliyeti ve diğer kromatografik tekniklere kıyasla rejenerasyon basamağının zor olması, kovalent kromatografinin kullanılmasını sınırlamaktadır. Bununla beraber, saflıktan çok uzak protein preparasyonlarına uygulanabilmektedir. N (a)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

OH İmmobilize 2'-piridil ligandı

P

SH

Sülfidril içeren molekül H N

N (b)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

+

P

S

HS

OH Kovalent olarak liganda bağlanan protein

Tiyone formu 2-Tiyopiridin 343 nm'de belirlenebilir

i. Bağlanmamış proteinler ve kontaminantların yıkanması ii. 4 mM ditiyothreitol ile reaksiyona girmeyen tiyopiridil grupları uzaklaştırılır iii. 20-50 mM ditihiothreitol ile bağlı proteinlerin elüsyonu

(c)

M

O

CH2

CH

CH2 SH +

OH

P SH Kolondan elüe edilen saf protein N

N S

S

2,2'-Dipiridil disülfid N (d)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

OH Rejenere edilmiş ligand

Şekil 8.11: Kovalent kromatografinin prensibi. (a)

M

NH CH

(CH2)2 C

NH CH

O

CO

COOH

CH2

S

S N

NHCH2COOH (b)

M

O

CH2 CH OH

CH2

S

S N

Şekil 8.12: (a) Aktive Thiol Sepharose’un ve (b) Thiopropyl Sepharose’un kısmi yapısı.

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

197

8.10. Affinite Kolonlarının Rejenerasyonu ve Saklanması

İmmünoaffinite kolonları yeniden kullanılmadan önce temizlenmelidir. Rejenerasyonun anlamı, kolon materyali içerisinde bir önceki kullanımdan kalmış olan bütün materyallerin uzaklaştırılması ve jelin başlangıç tamponu ile yeniden dengelenmesi demektir. Şayet jel içindeki bütün materyaller uzaklaştırılmazsa ve ligand uygun şekilde hazırlanmazsa, kolonun verimliliği düşecektir. Kolonun verimliliğinin düşmesi ise daha az örnek materyalinin bağlanması ve çözünürlüğün düşmesi ile sonuçlanacaktır. İmmünoaffinite jellerinin uygun şekilde korunması durumunda, bu jeller tekrar tekrar kullanılabilir. Jellerin kaç defa kullanılabileceği ise örnek materyaline, liganda ve elüsyon koşullarına bağlıdır. Jellerin temizlenmesinde ise ya özgül elüsyon sıvısının daha yüksek bir derişimi ya da sodyum klorür (0,5-1 M) gibi özgül-olmayan bir ajanın yüksek derişimleri kullanılabilir. Tuz derişiminin yükseltilmesi, genellikle özgül-olmayan bağlanmaların yanı sıra, özgül olarak bağlanmış olan, fakat elüsyon işlemi sırasında kolondan ayrılmayan bileşiklerin uzaklaştırılmasında da etkili olmaktadır. Kolonun rejenerasyonu sırasında, ligandın hasar görmemesi veya aktivitesinde bir değişikliğin olmaması için dikkatli olunmalıdır. Bazı durumlarda yüksek tuz derişimi, proteinlerin üçboyutlu yapısının değişmesine neden olabilmektedir. Bu nedenle, ligand şayet bir protein ise ligandın aktif bölgesi değişikliğe uğrayabilir ve bunun sonucu olarak da ligandın bağlama kapasitesi kısmen veya tamamen kaybolabilir ya da örnek molekül için olan affinitesini kaybedebilir. Bazı rejenerasyon prosedürleri ise neredeyse bütün jeller için yeterince naziktir. Amersham Pharmacia Biotech tarafından önerilen genel bir rejenerasyon prosedürü ise aşağıdaki şekildedir. Buna rağmen, kullanılan jel ile birlikte üretici firma tarafından bir rejenerasyon prosedürü öneriliyorsa öncelikle o prosedürün uygulanması gerekmektedir: i. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, 0,5 M NaCl içeren Tris-HCl (100 mM, pH 8,5) ile yıkanmalıdır. ii. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, 0,5 M NaCl içeren sodyum asetat tamponu (100 mM, pH 4,5) ile yıkanmalıdır. iii. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, başlangıç tamponu ile dengelenmelidir. Şayet kromatografi esnasında deterjan veya denatüre edici ajanlar kullanılmış ise bunlar da ilk yıkama tamponu içinde kullanılmalıdır.

Ayrıca, ligand kararlılığı için gerekli olan katyon ve anyonlar da rejenerasyon tamponu içine ilave edilmelidirler. Örneğin, Con A (bkz. kısım 8.7.1.1) üçüncül yapısını korumak için Ca2+ ve Mg2+ veya Mn2+ iyonlarına (1-10 mM) gereksinim duymaktadır. Affinite jellerinin saklanması, genellikle hazırlandıktan sonra kolaydır. Hazırlanmış olan jellerin ideal koşullarda saklanması ise matrikse bağlanmış olan ligandın özelliğine bağlıdır. Genel olarak ise jellerin saklanması 4 °C’de yapılmaktadır. Çünkü, bu sıcaklıkta bakteriyal büyümenin azaltılması sağlanarak hem matrikse hem de liganda zarar vermesi önlenmiş olur. Genel olarak bütün affinite matriksleri klorheksidin diglukonat (veya asetat), sodyum azid ve %20 etanol gibi antimikrobiyal ajanların varlığında saklanmalıdırlar. İster kullanılmış olsun ister henüz kullanılmamış olsun, kolon materyallerinin donmasına izin verilmemelidir. Çünkü donma esnasında meydana gelen buz kristalleri, kolon materyallerinin yapılarının bozulmasına yol açabilmektedir.

198

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ (HIC)

9.1. Giriş

Günümüzde, hidrofobik interaksiyon kromatografisi (Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC) olarak bilinen tekniğin temelini 1948 yılında Tiselius tarafından yayınlanan bir makale oluşturmaktadır. 1970’li yıllarda ise kolon materyali olarak kullanılan matrikslerin geliştirilmiş olması ve bu matrikslere arzu edilen ligandların bağlanabilmesi için geliştirilen teknikler, bu yıllara kadar ender olarak kullanılan hidrofobik interaksiyon kromatografisinin biyopolimerlerin saflaştırılmasında daha yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. 1970’li yılların başında yapılan çalışmalar sonucunda sentezlenen ilk HIC adsorbentleri, iyonik-hidrofobik karışımından oluşan bir karakteristik özellik göstermişlerdir. Daha sonraki yıllarda ise Porath ve arkadaşları (1973) ile Hijérten ve arkadaşları (1974), yüksüz hidrofobik adsorbentleri sentezlemişlerdir. Yüksüz olan bu hidrofobik adsorbentlerin protein bağlama kapasitelerinin ise doğal tuzların yüksek derişimlerinde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, adsorbente bağlanmış olan proteinlerin elüsyonlarının, kolonun tuz içermeyen bir tampon ile yıkanması veya elüentin polaritesinin düşürülmesi ile sağlanabildiği gösterilmiştir. HIC, protein moleküllerindeki hidrofobik bölgeleri açığa çıkarmak için amonyum sülfat gibi bir tuzla çökeltilmiş (bkz. kısım 1.7.1) bileşiklerin varlığında gerçekleştirilir. Bu sebeple HIC, genellikle protein çözeltisi içinde amonyum ve sülfat iyonlarının bulunmasını sağlayan, amonyum sülfat çökeltmesinden hemen sonra uygulanır. Protein örneğinin pH’sı, proteinin izoelektrik noktasına ayarlanarak, prosesin verimliliği artırılabilir. Proteinler durgun faza adsorplandıktan sonra, adsorplanmış olan proteinlerin elüsyonu farklı yöntemlerle seçici olarak gerçekleştirilir. Bu yöntemlerde ise iyonik şiddeti kademeli olarak düşüren ya da pH’yı dereceli olarak artıran (bu da proteinin hidrofobisini artırır) bir elüent kullanarak veya durgun faza karşı olan affinitesi proteininkinden daha güçlü olan bir yer-değiştirici kullanarak elüsyon gerçekleştirilebilir. Proteinlerin kolondan elüsyonu için Tween 20 ve Triton X-100 gibi deterjanlar, bütanol ve etilen glikol gibi alifatik alkoller ve bütilamin gibi alifatik aminler kullanılabilir. Bu elüsyon yöntemlerinden bazılarının, elüsyonu yapılacak olan proteinlerin denatürasyonuna yol açması ise HIC’de potansiyel problemlerden birisidir. HIC tekniğinde karşılaşılan başka bir pratik problem ise bu tekniğin bazı proteinler için iyi çalışıp, bazıları için çalışmamasıdır. Bu problemin çözümü ise ancak deneme çalışmalarının sonuçlanması ile giderilebilir. İyi tanımlanmış olan HIC adsorbentlerinin ticari olarak bulunabilmesi ise serum proteinleri, membrana-bağlı proteinler, nüklear proteinler, reseptörler, hücreler ve rekombinant proteinler gibi oldukça farklı biyomoleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilebilmesine yol açmıştır. Bu adsorbentler ise aynı zamanda enzimlerin ve lipozomların geri-dönüşümlü olarak tutuklanmaları için de kullanılabilmektedirler.

200

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

HIC matrikslerine proteinlerin adsorpsiyonunun prensibi, IEC ve GFC’ye komplementerdir. Bu nedenle HIC, proteinlerin saflaştırılması amacı ile takip edilen bir protokolde, genellikle IEC ve GFC ile bir kombinasyon oluşturacak şekilde kullanılabilmektedir (bkz. kısım 9.9). HIC aynı zamanda, protein moleküllerinin yapısal değişikliklerinin analizi amacı ile analitik bir araç olarak da kullanılabilmektedir. Ayrıca, minimum düzeyde ön-işlem görmüş olan örnek materyallerinin HIC için kullanılabilir olması, bu kromatografi tekniğinin geleneksel protein çökeltme teknikleri (bkz. kısım 1.7) ile kombinasyon halinde kullanılmasına da izin vermektedir. 9.2. HIC’nin Temel Prensipleri

Hidrofobik etkileşimler (interaksiyonlar), protein moleküllerinin üç-boyutlu yapılarının kararlılığını sağlayan en büyük güçlerden birisi olması nedeni ile biyolojik olarak oldukça önemli bir fenomendir. Hidrofobik etkileşimler, antijen-antikor ve enzim-substrat reaksiyonlarında rol almaktadır. Aynı zamanda, biyolojik membranları oluşturan lipit çift-tabakasının oluşturulmasında ve protein moleküllerinin membrana bağlanmasında da hidrofobik etkileşimlerin katkısı bulunmaktadır. Biyomoleküllerin yüzeysel hidrofobisitelerinden yararlanarak ayrıştırılmalarının sağlanabilmesi için ise hidrofobik interaksiyon kromatografisi geliştirilmiştir. Proteinlerin erişilebilir yüzey alanlarından en fazla %40-50’sinin non-polar olduğu bilinmektedir. Ilımlı tuz derişimlerinden yüksek tuz derişimlerine kadar çökeltme (salting-out) tuzlarını içeren koşullarda ise proteinlerin HIC adsorbentlerine bağlanmasında, protein yüzeyindeki polar-olmayan alanlar rol oynamaktadır. Tuz tarafından desteklenen bu etkileşimlerin kuvveti ise proteinlerin çökelme verileri ile HIC kolonundaki alıkonmaları arasındaki sıkı ilişkiden dolayı tahmin edilebilir. Fakat, proteinlerin çoğunun HIC kolonlarındaki alıkonma verilerinin her zaman hazır olmamasından dolayı, biyolojik örneklerdeki proteinlerden ilgilenilmekte olan hedef protein(ler)in bu verilerinin elde edilmesi gerekmektedir. Burada ise hidrofobik etkileşimlerin doğası hakkında kısa bir bilgi verildikten sonra, bu fenomene dayalı olarak gerçekleştirilen ayrıştırma tekniğinden bahsedilecektir. Hidrofobisite ise polar-olmayan bir bileşik ile su gibi polar bir çevre arasındaki itme olarak tanımlanabilir. Tek bir hidrofobik bileşik su içerisine konulduğunda, enerjitik olarak elverişsiz bir durum oluşur. Hidrofobik bileşik, çevredeki su moleküllerini düzenli bir yapı oluşturması için zorlar. Bu proses ise entropide bir düşme ile gerçekleşir. Şayet iki veya daha fazla polar-olmayan bileşik su içine konursa, bu bileşikler kendiliğinden agregat oluştururlar. Bu agregasyonun nedeni ise hidrofobik etkileşimlerdir. Hidrofobik etkileşimler ise entropinin artması nedeni ile enerjitik açıdan elverişlidir. Bu durum ise polar çevreye karşı daha az hidrofobik bölgenin maruz kalması sonucunda düzensizliğin artmasına yol açmaktadır. Hidrofobik etkileşimler ise ne hidrofobik grupların birbirine bağlanmasıdır, ne de kendi başlarına bir çekici güçtürler. Hidrofobik etkileşimler, polar çevreler tarafından polar-olmayan bileşikler üzerine oluşturulan zorlamadır. Hidrofobik etkileşimi oluşturan ise suyun moleküler yapısıdır. Bu bölümde ise özellikle proteinlerin saflaştırılması üzerinde durulmasına rağmen, biyomoleküllerin çoğunun belirli bir dereceye kadar hidrofobik özellik gösterdiğini de unutmamak gerekir. Proteinlerin yüzeysel hidrofobisiteleri, proteinlerin primer yapılarında yer alan polarolmayan amino asit kalıntılarının varlığıyla ilişkilidir. Proteinlerin yapısında yer alan ve hidrofobik özellikte olan amino asitler ise hidrofobisitesi en yüksekten en aza doğru triptofan, norlösin, fenilalanin, tirozin, lösin, valin, metionin ve alanin olarak sıralanmaktadır. Hidrofobik amino asit kalıntı grupları ise her bir proteine karakteristik özellikler verecek şekilde protein yüzeylerine dağılmışlardır. Hidrofobik etkileşimler, proteinlerin üçüncül ve dördüncül yapılarının kararlılığını sağlamaktadır. Buna ilaveten, hidrofobik amino asitlerin çoğu protein moleküllerinin dış yüzeyinde yer aldıklarından, doğal yapısında bulunan bir proteinin hidrofobisitesinin derecesi, bu amino asitler

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

201

tarafından belirlenmektedir. Sulu çözeltilerde ise proteinlerin yüzeyindeki hidrofobik bölgeleri, hidrofobik grupları etkin bir şekilde gizleyen, düzenli bir su molekülleri filmi ile kapatılmış durumdadır. Bu gruplar, su moleküllerini düzenli olarak tutabilen tuz iyonlarının ilavesi ile açığa çıkarılabilirler. Açığa çıkan hidrofobik gruplar ise daha sonra birbirleriyle etkileşir. Bu olay, amonyum sülfat ile çökeltmenin (salting-out) temelini oluşturmaktadır (bkz. kısım 1.7.1). HIC’de ise hidrofobik grupları açığa çıkararak, protein-protein etkileşmesini sağlamaktan ziyade, uygun bir matrikse bağlanmış hidrofobik gruplar aracılığı ile protein-matriks etkileşimi sağlanmaktadır. En yaygın olarak kullanılan durgun fazlar ise agaroz matrikse bağlanmış alkil (heksil, oktil) veya fenil gruplarıdır. Fenil Sepherose ve Fenil SPW, düşük basınçlı HIC’de kullanılan; Bio-Gel TSK Fenil ve Spherogel TSK Fenil ise HPLC’de kullanılan ticari adsorbentlerden bazılarıdır. 9.3. HIC’yi Etkileyen Faktörler

Bir HIC adsorbentinin seçilmesi ve HIC ile ayrıştırmanın optimizasyonu esnasında göz önünde bulundurulması gereken temel parametreler aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Ligand tipi ve yoğunluğu: Tutuklanmış olan ligand tipi (alkil veya aril), öncelikle HIC adsorbentinin protein bağlama seçiciliğini belirlemektedir. Genel olarak, düz-zincirli alkil (hidrokarbon) ligandları “saf” bir hidrofobik karakter göstermelerine rağmen, aril ligandları ise hem aromatik hem de hidrofobik etkileşimlerin her ikisinin de mümkün olduğu “karışık” bir davranış tarzı göstermektedirler. Aynı zamanda, matrikse bağlanmış olan ligand yoğunluğunun sabit olduğu bir durumda, alkil ligandların zincir uzunlukları artırıldıkça, HIC adsorbentlerinin protein bağlama kapasitelerinin de sabit bir oranda arttığı gösterilmiştir (Şekil 9.1,a). Yüklü HIC adsorbentleri ise hidrofobik etkileşimlere ilaveten, başka tarzlarda etkileşimler de göstermektedirler. Alkil veya aril ligandlar arasındaki seçim ise deneysel olarak yapılabilir ve her bir ayrıştırma problemi için ancak tarama yöntemi ile belirlenebilir.

HIC adsorbentlerinin protein bağlama kapasiteleri ise tutuklanmış olan ligand yoğunluğunun artırılması ile artmaktadır (Şekil 9.1,b). Ligand yoğunluğunun yeterince yüksek olduğu bir noktadan sonra, adsorbentin protein bağlama kapasitesinin sabit kaldığı (platoya ulaştığı) fakat etkileşim kuvvetinin arttığı görülmektedir. Böyle bir koşulda, adsorbente bağlanan proteinlerin elüsyonu ise proteinin liganda birden fazla noktadan bağlanmış olması nedeni ile zor olmaktadır.

Şekil 9.1: (a) Ligand yoğunluğunun aynı fakat alkil zincir uzunluklarının farklı olmasının, (b) ligand yoğunluğunun HIC adsorbentinin protein bağlama kapasitesi üzerine etkisi.

202

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ii. Matriks tipi: HIC matriksi olarak en çok kullanılan destek materyalleri, çapraz-bağlı agaroz ve sentetik ko-polimer materyaller gibi kuvvetli hidrofilik olan karbonhidratlardır. Ko-polimer bir destek materyalinin seçiciliği, aynı ligandın bağlanmış olduğu agaroz destek materyalinin seçiciliği ile aynı değildir. Ko-polimer bir destek materyalinin kullanılması sonucunda elde edilen sonucun benzerini, agaroz destek materyali ile elde edebilmek için adsorpsiyon ve elüsyon koşullarının modifiye edilmesi gerekebilmektedir. iii. Tuz derişimi ve tipi: Hidrofobik etkileşimleri suyun yapısı oluşturduğundan, şayet su içerisine tuz veya organik çözücüler eklenerek suyun yapısı değiştirilirse, hidrofobik etkileşimler de bu değişiklikten etkileneceklerdir. Genel olarak, iyonik kuvvetin artması, hidrofobik etkileşimleri de artırmaktadır. Bunun sonucu olarak, tuz derişiminin belirli bir limite kadar artması, protein bağlama kapasitesinin de hemen hemen lineer olarak artması ile sonuçlanmakta ve daha yüksek derişimlerde ise protein bağlama kapasitesi eksponansiyel olarak artmaya devam etmektedir (Şekil 9.2). Tuz derişimi, proteinlerin çökelme noktalarının üzerine yükseltildiğinde ise HIC adsorbentinin adsorpsiyon kapasitesinde belirgin bir artış görülmektedir. Bu fenomen ise muhtemelen proteinlerin kolon üzerinde çökelmesinden kaynaklanmaktadır. Fakat protein bağlama kapasitesinin artması, HIC adsorbentinin seçiciliği üzerinde negatif etki oluşturmaktadır.

Şekil 9.2: Kolon dengeleme tamponu içerisindeki tuz derişimine bağlı olarak, Phenyl Sepharose High Performans’ın protein bağlama kapasitesi (Anonymous, 1993).

Hem anyonlar hem de katyonlar, hidrofobik etkileşimleri en yüksek derecede olumlu olarak etkileyenlerden, en düşük düzeyde etkileyenlere doğru sıralanabilir. Anyonların bu sıralaması PO43– > SO42– > CH3COO– > Cl– > Br– > NO3– > ClO4– > I– > SCN– olarak; katyonların sıralaması ise NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ şeklindedir. Kuvvetli katotrofik tuzlar ise suyun yapısının bozulmasına yol açarak, hidrofobik etkileşimlerin kuvvetinin zayıflamasına neden olurken; anti-katotrofik tuzlar ise hidrofobik etkileşimlerin oluşması için uygun koşulları oluşturmaktadır. Suyun polaritesini değiştirmek amacıyla, organik çözücüler de sıklıkla kullanılmaktadır. iv. pH: Genel olarak pH’nın yükselmesi, hidrofobik etkileşimleri zayıflatmaktadır. Bunun nedeni ise muhtemelen yüklü grupların titrasyonunda meydana gelen artışa bağlı olarak, protein moleküllerinin hidrofilik özelliklerinin artmasıdır. Diğer taraftan, pH’da meydana gelen bir düşüş ise

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

203

hidrofobik etkileşimlerde görünür bir artış ile sonuçlanmaktadır. Bu nedenle, nötral pH’da HIC adsorbentine bağlanmayan proteinler, asidik pH’da bağlanmaktadırlar. Hjertén ve arkadaşları (1986) ise yapmış oldukları bir çalışmada, pH 8’in üzerinde ve/veya pH 5’in altında proteinlerin kolon içerisinde alıkonmalarının, pH 5-8,5 aralığına göre çok daha şiddetli bir şekilde değiştiğini belirlemişlerdir. Bu nedenle, HIC ile proteinlerin ayrıştırılmasının optimizasyonunda pH önemli bir ayrıştırma parametresi olup; özgül bir ayrıştırma işleminde Hjertén ve arkadaşlarının yapmış olduğu bu gözlemin uygulanabilirliğini kontrol etmekte fayda vardır. v. Sıcaklık: Su içerisindeki hidrofobik moleküllerin etkileşimleri için geliştirilmiş olan teorilere göre Hjertén (1976), proteinlerin HIC adsorbentlerine bağlanmasının entropi tarafından yürütüldüğünü [ΔG = (ΔH – TΔS) ~ –TΔS] öne sürmüştür. Bunun anlamı ise sıcaklık artışı ile etkileşimlerde de bir artışın meydana geldiğidir. İlginç olan ise hidrofobik etkileşimlerde rol alan van der Waals kuvvetlerinin de sıcaklık artışı ile birlikte artmasıdır. Buna rağmen, Visser ve Strating (1975) tarafından bu durumun tersi bir etki rapor edilmiştir. Bu da göstermektedir ki sıcaklığın HIC üzerine olan etkisi oldukça karmaşıktır. İki farklı çalışma sonucundaki bu tutarsızlık ise muhtemelen sıcaklığın, farklı protein moleküllerinin yapısal durumları ve sulu ortamlardaki çözünürlükleri üzerindeki farklı etkilerinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, oda sıcaklığında elde edilen bir sonucun, soğuk odada elde edilen bir sonuç ile (veya tersi) aynı olmayabileceğine dikkat etmek gerekmektedir. vi. Katkı maddeleri: Su ile karışabilen alkollerin, deterjanların ve katotrofik tuzların sulu çözeltilerinin düşük derişimleri, HIC’de ligand-protein etkileşimini zayıflatmakta ve adsorplanmış olan protein moleküllerinin desorpsiyonuna yol açmaktadır. Alkollerin ve deterjanların polarolmayan bölgeleri, HIC adsorbenti üzerindeki bağlanma bölgelerine adsorplanmak için protein molekülleri ile yarışırlar ve bunun sonucunda da adsorplanmış olan protein molekülleri adsorbentten ayrılırlar. Katotrofik tuzlar ise suyun düzenli yapısı ve/veya bağlı olan protein molekülleri üzerine etki ederler. Aynı zamanda, her iki tipteki katkı maddeleri de suyun yüzey gerilim kuvvetini düşürerek, hidrofobik etkileşimlerin zayıflamasına yol açmakta ve bunun sonucu olarak da ligand-protein komplekslerinin ayrılmasına neden olmaktadırlar.

Protein moleküllerinin elüsyonu sırasında, seçiciliği sağlamak amacı ile elüsyon tamponu içerisinde katkı maddeleri kullanılabilmektedir. Fakat bu durumda, bu tipteki kimyasal maddelerin yüksek derişimlerine maruz kalmanın bir sonucu olarak, protein moleküllerinin denatürasyona uğrama veya inaktive olma riskleri de bulunmaktadır. Buna rağmen, HIC adsorbentlerine oldukça kuvvetli bir şekilde bağlanmış olan proteinlerin kolondan temizlenmesi amacı ile katkı maddelerinin kullanılması oldukça etkili bir yöntemdir. 9.4. HIC ile RPC’nin Karşılaştırılması

Teorik olarak, hidrofobik interaksiyon kromatografi (HIC) ve ters-faz kromatografi (RPC) (bkz. 10. Bölüm) birbirine oldukça benzeyen sıvı kromatografi teknikleridir. Her iki kromatografi tekniği de, biyomoleküllerin yüzeylerindeki polar-olmayan (hidrofobik) bölgeler ile matrikse kovalent olarak bağlanmış olan hidrofobik ligandlar (alkil veya aril grupları) arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Buna rağmen, pratikte ise HIC ve RPC farklıdır. HIC matriksleri hidrofiliktir ve bu matrikslere kısa zincirli (C2-C8), polar-olmayan (hidrofobik) fenil veya oktil ligandlar kovalent olarak bağlanmıştır (bkz. Şekil 9.3). HIC matrikslerine bağlanan bu ligandların yoğunlukları, genellikle 10-50 μmol/mL jel’dir. HIC’de kullanılan hareketli faz ise genellikle sulu-tuz çözeltileridir. RPC’de kullanılan matriksler ise silikadır ve silika matrikslere bağlanmış olan ligandlar daha uzun n-alkil (C4-C18) zincirleridir. Silika matrikslere bağlanmış olan nalkil ligandların yoğunluğu ise birkaç yüz μmol/mL jel’dir. Kullanılan alkil zincirlerinin uzunlukları C4C18 arasında değişmekle birlikte, genellikle C8 (oktilsilil) ve C18 (oktadesilsilil) kullanılmaktadır.

204

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

RPC’de matriksin polaritesi, hareketli fazın polaritesinden daha düşüktür. RPC’de hareketli faz olarak genellikle su ve daha az polar olan bir organik değiştirici (modifikatör) karışımı kullanılmaktadır. HIC ile RPC arasındaki fark, bu iki kromatografik metotta kullanılan hareketli fazın polaritesine bağlı olarak belirlenmiştir. Matriksin silika, hareketli fazın ise hekzan gibi polar-olmayan bir çözücünün olduğu sistemler normal faz olarak adlandırılmıştır. Buna bağlı olarak, C8 veya C18 türevli silikadan oluşan durgun faza göre çok daha polar olan sulu-organik çözücülerin hareketli faz olarak kullanıldığı sistemler ise ters-faz olarak adlandırılmıştır. HIC matrikslerinin kullanılması durumunda ayrıştırma, genellikle denatürasyona yol açmayan sulu-tuz çözeltileri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. HIC’de örnek materyali, yüksek derişimde tuz içeren tampon içerisinde matriks üzerine yüklenir; elüsyon ise azalmakta olan tuz gradienti ile gerçekleştirilir. Ligand yoğunluğunun bir sonucu olarak, proteinlerin RPC adsorbentlerine bağlanmaları genellikle çok daha kuvvetli olmaktadır. Proteinlerin RPC adsorbentlerine daha kuvvetli bağlanmaları ise bu proteinlerin elüsyonu için polar-olmayan çözücülerin kullanılmasını gerektirmektedir. Bu nedenle RPC’de elüsyon, genellikle protein moleküllerinin denatürasyonuna yol açan sulu-organik çözücü karışımları ile gerçekleştirilmektedir. Bir proteinin doğal yapısında iken hidrofobik etkileşim gösterme yeteneği, o proteinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelere; yüzey hidrofobisitesi ise intak proteinin üçüncül ve dördüncül yapısına bağlıdır. Bu durumu ise proteinin birincil yapısına bağlı olan doğal hidrofobisitesinden ayırmak gerekmektedir. Protein moleküllerinin ayrıştırılması amacı ile hidrofobisitenin kullanılması durumunda, proteinin hidrofobisitesinin kaynağı olan proteinin üçüncül ve dördüncül yapısından kaynaklanan hidrofobisite ile proteinin birincil yapısından kaynaklanan hidrofobisite farklılığından yararlanılabilir. Bu nedenle, HIC ve RPC’de proteinlerin hidrofobisitesine yol açan bu iki farklı kaynaktan yararlanılmaktadır. HIC’de protein moleküllerinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelerden yararlanıldığı için ayrıştırma, protein moleküllerinin bütünlüğünün korunduğu koşullarda gerçekleştirilir. RPC’de ise protein moleküllerinin doğal (birincil yapısına bağlı olan) hidrofobisitelerinden yararlanıldığı için ayrıştırma, protein moleküllerinin neredeyse bütün hidrofobik gruplarının matriks ile etkileşime girmesini sağlayan (örneğin, denatürasyona yol açan) koşullarda gerçekleştirilmektedir. Bu nedenle RPC, özellikle sulu-organik çözücüler içerisinde kararlı olan peptidlerin ve düşük moleküler kütleli proteinlerin analitik ve preparatif ayrıştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz. 10. Bölüm). 9.5. HIC Adsorbentleri

Farklı üretici firmalar tarafından geliştirilmiş olan çeşitli HIC adsorbentleri bulunmaktadır. Örneğin, Amersham Pharmacia Biotech tarafından geliştirilmiş olan ve yaygın olarak kullanılan durgun fazlar, çapraz-bağlı agaroz matriks (bkz. Şekil 3.2) üzerine glisidil-eter aracılığı ile hidrofobik ligandların bağlanması ile oluşturulmuştur (Şekil 9.3). Hidrofobik ligandların matrikse bağlanmasında glisidil-eter metodunun kullanılması ise yüksüz adsorbentlerin elde edilmesi ile sonuçlandığından, protein moleküllerinin adsorbente bağlanmasının sadece hidrofobik etkileşimler ile olması sağlanmaktadır. Ligand olarak fenil grubunun kullanılması (Şekil 9.3,c), aynı zamanda ππ etkileşimleri için de bir potansiyel oluşturmaktadır. Hidrofobik ligandların matrikse bağlanmasında glisidil-eter metodunun kullanılması, ayırıcı-kolun kısa olmasına yol açmaktadır. Fakat, hidrofobik olan bu kısa zincirli ayırıcı-kolların etkisi, hidrofilik-OH grupları ile nötralize olması nedeni ile oldukça sınırlı olmaktadır. HIC için yaygın olarak kullanılan durgun fazlar ise çapraz-bağlı agaroz matrikse kovalent olarak bağlanmış alkil (heksil, oktil) veya fenil gruplarıdır. Hem LPLC hem de HPLC sistemleri ile HIC’de kullanılmak üzere farklı adsorbentler geliştirilmiş bulunmaktadır. Farklı üretici firmalar tarafından üretilen HIC adsorbentlerin başlıcalarını ise Fenil Sepherose, Fenil SPW, Butyl

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

205

Sepharose, Octyl Sepharose, Alkyl Superose, Phenyl Superose, Bio-Gel TSK Fenil ve Spherogel TSK Fenil oluşturmaktadır. OH (a)

M

O

CH2

CH

CH2 O

(CH2)3 CH3

Butyl Sepharose 4 Fast Flow

OH (b)

M

O

CH2

CH

CH2

O

(CH2)7 CH3

Octyl Sepharose CL-4B

OH (c)

M

O

CH2

CH

CH2 O

Phenyl Superose

OH (d)

M

O

CH2

CH

CH2

O

CH2 C(CH3)3

Alkyl Superose

Şekil 9.3: Çapraz-bağlı agaroz matrikse kovalent olarak bağlanmış olan farklı hidrofobik ligandlar.

9.6. Deneysel Koşulların Dizaynı

Bu kısımda, HIC ile proteinlerin ayrıştırılmalarının söz konusu olduğu birçok durumda geçerli olan deneysel metotlara yer verilmektedir. HIC’yi etkileyen faktörlerin sayısının oldukça fazla olması (bkz. kısım 9.3) nedeni ile hedef protein(ler)in seçici olarak saflaştırılmasını sağlayan uygun kromatografik parametrelerin her durum için ayrı ayrı optimize edilmesinde fayda vardır. 9.6.1. Stratejik Noktalar

Verimli bir ayrıştırma akım şemasının oluşturulması için en önemli noktalardan birisi, ayrıştırma adımlarının sayısını mümkün olduğunca minimumda tutmaktır. En az sayıda kromatografik ayrıştırma basamağı ile mümkün olan en yüksek saflıkta örneğin elde edilebilmesi için en mantıklı yaklaşım, ayrıştırılması yapılacak olan molekülün farklı yüzey özelliklerinden yararlanabilecek kromatografik tekniklerin bir kombinasyonunun kullanılmasıdır. Buna rağmen, ayrıştırma akım şemasında kullanılacak olan tekniklerin hangi sıra ile kullanılacağını dikkatli bir şekilde planlamak gerekmektedir. Birçok uygulamada HIC’nin, IEC ve GFC ile birlikte kullanılması oldukça verimlidir. Örneğin, ayrıştırılması yapılacak olan örnek materyalinin iyonik kuvvetinin yüksek olduğu durumda HIC’nin kullanılması mantıklı bir seçimdir. Ham biyolojik materyallerin çoğunun kondüktivite değerleri ise genellikle 15-30 mS/cm’dir. Bu nedenle, ayrıştırma basamağının ilk adımı olarak IEC yerine HIC’nin kullanılması cazip bir alternatif olmaktadır. Başlangıç materyalinin kondüktivitesinin yüksek olması, iyon-değiştirici materyalin bağlama kapasitesinin düşmesine yol açar. Bu nedenle, kondüktivitesi yüksek olan örnek materyallerinin IEC basamağından önce tuz-giderimi, diyafiltrasyon veya seyreltme gibi bazı yöntemlerle işlemden geçirilmesi gerekmektedir. Bunun aksine, kondüktivitesi yüksek olan bir örnek materyali için ilk adımda HIC kullanılırsa gerekli olan tek işlem, protein moleküllerinin HIC matriksine doğru olarak bağlanmasını sağlayacak yeterli tuzun eklenmesi olacaktır. İlk adımda HIC’nin kullanılması, IEC veya diğer adsorpsiyon teknikleri gibi, seyreltik örnek materyalinin önemli bir ölçüde yoğunlaştırılmasını da sağlayacaktır.

206

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Saflaştırma akım şemasında diğer önemli bir nokta ise genellikle saflaştırma işlemlerinin başında yer alan amonyum sülfat çökeltmesinden ve örnek elüsyonunun oldukça yüksek bir iyonik kuvvette gerçekleştirildiği IEC’den sonra, HIC’nin kullanılmasıdır. Bu durumda protein moleküllerinin HIC adsorbentine bağlanarak alıkonmasını sağlamak için gerekebilecek tek işlem ise örnek materyaline belki de bir miktar daha tuzun eklenmesi olacaktır. Benzer şekilde, HIC’den düşük iyonik kuvvetteki bir tampon ile elüe edilen örnek materyali, diyaliz veya tuz-giderme basamağına gerek kalmadan doğrudan doğruya IEC’ye uygulanabilir. 9.6.2. HIC Jelinin Seçimi

HIC’nin adsopsiyon basamağında, jel performansı (örneğin, seçicilik ve kapasite) üzerine tutuklanmış (immobilize) ligand tipinin, ligand yoğunluğunun, tuz tipinin ve derişiminin yanı sıra pH’nın önemli bir etkisi bulunmaktadır (bkz. kısım 9.3). Bunun da ötesinde, kullanılan matriksin tipi ve ligandın bağlanmasında kullanılan kimyasal yöntem de birçok proteinin kolon materyaline bağlanma ve elüsyon davranışları üzerine belirli bir dereceye kadar etki etmektedir. Ligand olarak oktil gruplarını içeren matrikslere bağlanmış olan kuvvetli hidrofobik proteinlerin elüsyonunun kolay olmaması nendi ile, karakterizasyonu yapılmamış bir protein için başlangıç jeli olarak fenil ligandlarını içeren matrikslerin seçilmesi genellikle en iyi seçimdir. Fenil ligandların hidrofobisitesi ise n-bütil ve n-pentil ligandların hidrofobisiteleri arasında yer almaktadır. Fenil ligandlar, π-π etkileşimleri aracılığı ile aromatik amino asit kalıntılarına bağlanmaktadır. Oktil-Sepharose CL-4B gibi oktil ligand içeren jeller ise zayıf hidrofobik proteinlerin ayrıştırılması için kullanılabilir. Aynı zamanda membran proteinlerinin ayrıştırılmaları için de oktil ligand içeren jeller kullanılabilir. Çünkü membran proteinlerinin çözünürlüğünü sağlamak amacı ile kullanılan deterjanların varlığında dahi oktil ligand içeren jeller, hidrofobik bağlama kapasitelerini korumaktadırlar. HIC jellerinin seçilmesi esnasında göz önünde bulundurulması gereken parametreler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Seçilecek olan HIC jeli, makul bir derecedeki düşük tuz derişiminde hedef proteini bağlamalıdır. Bu durum ise genellikle seçilen tuzun tipine bağlıdır. Örneğin, amonyum veya sodyum sülfat ile elde edilen sonucun NaCl ile elde edilebilmesi için NaCl derişimini, amonyum veya sodyum sülfat derişimine göre 4-kat artırmak gerekebilir. Tuz derişimi ise örnek materyal içinde bulunan diğer proteinlerin çökelmesine neden olan derişimin altında olmalıdır. Tarama çalışmaları için 1 M’lık amonyum sülfat iyi bir başlangıç noktası oluşturmaktadır. Şayet protein molekülleri (örneğin) 1 M’lık amonyum sülfat ile HIC jeline bağlanmazlarsa, bu durumda daha hidrofobik bir jel seçilmelidir. Doğru HIC jelinin seçilmesi ise genellikle, bağlama tamponu içerisindeki tuzun daha az tüketilmesine yol açmaktadır. Bu durum ise özellikle büyük-ölçekli saflaştırma proseslerinde hem ekonomik hem de çevresel avantajlar sağlamaktadır. ii. Kolon materyaline bağlanmış olan proteinin elüsyonu, tuz içermeyen tampon ile yapılabilmeli ve verimlilik yüksek (%75 veya daha fazla) olmalıdır. Şayet, proteinlerin elüsyonu için polar-olmayan çözücüler gerekiyorsa, daha az hidrofobik jellerin seçilmesi denenmelidir. iii. Adsorbsiyon aşamasında, seçiciliğin artırılması için hem başlangıç tamponunun pH’sından hem de kullanılacak olan tuz tipinden yararlanılabilir. Bunu başarmanın yolu ise farklı ligandların taranması aşamasında, değişik pH değerlerindeki ve farklı tipteki tuzlarla elde edilen adsorbsiyon verimliliklerinin kontrol edilmesinden geçmektedir. iv. Hidrofobik etkileşimlerin sıcaklığa bağlı olması nedeni ile metot geliştirme çalışmalarının, saflaştırmanın yapılacağı çalışma sıcaklığında gerçekleştirilmesi oldukça önemlidir.

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

207

9.6.3. Tarama Deneyleri

HIC’de tarama deneylerinin amacı, uygun HIC jelinin seçilerek, seçiciliğin optimizasyonunu sağlamak ve en önemli deneysel parametreleri kabaca belirleyebilmektir. Bu çalışmalar aynı zamanda, farklı koşullarda elde edilebilecek elüsyon profilleri hakkında da bilgi vermektedir. Tarama çalışmaları sonucunda elde edilebilecek tipik elüsyon profilleri ise Şekil 9.4’de görülmektedir. Tarama çalışmalarının gerçekleştirilmesi esnasında takip edilmesi gereken adımlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Üretici firmanın talimatlarına uygun olarak HIC jelleri, 1-10 mL yatak hacmi oluşturacak şekilde uygun kolonlara paketlenir. Alternatif olarak, HIC Media Test Kit (Amersham Pharmacia Biotech) gibi hazır ticari kitler de kullanılabilir.

Şekil 9.4: (a) Ürün elüsyonu gradientin erken aşamasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (b) Ürün elüsyonu gradientin sonuna yakın gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (c) Ürün elüsyonu gradientin ortasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (d) Ürün elüsyonu gradientin erken aşamasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir. (e) Ürün elüsyonu gradientin sonuna yakın gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir. (f) Ürün elüsyonu gradientin ortasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir (Anonymous, 1993).

208

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ii. Paketlenmiş olan kolon, kolon yatak hacminin 2-misli dengeleme tamponu-A (50 mM sodyum fosfat; 1 M amonyum sülfat; pH 7,0) ile yıkanarak dengelenir. Kolonun dengelenmesi esnasında akış oranı sabit olmalıdır (örneğin 100 cm s–1). iii. 1 M amonyum sülfat içeren ve pH’sı 7’ye ayarlanmış olan uygun miktardaki örnek materyali kolona yüklenir ve kolon hacminin 2-3-misli tampon-A ile yıkanır veya yıkama işlemine elüsyon sıvısının UV absorbansı, temel-çizgiye yaklaşıncaya kadar devem edilir. iv. Kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin elüsyonu, lineer ve tampon-B’nin (50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7,0) 0’dan %100’e kadar ulaşması ile azalan tuz gradienti ile gerçekleştirilir (Şekil 9.4). Toplam gradient hacminin ise kolon yatak hacminin 10-misli olması genellikle yeterli olmaktadır. 9.7. Hidrofobik İnteraksiyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi 9.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı

HIC’de kullanılan kolonlar da diğer kromatografik tekniklerde kullanılan kolonlar gibi kromatografi sisteminin düşük basınç altında mı yoksa yüksek basınç altında mı gerçekleştirileceği göz önünde bulundurularak seçilir. Düşük basınç altında gerçekleştirilen kromatografi sistemlerinde kullanılan kolonların özellikleri kısım 3.2’de ele alınmış olmakla birlikte, HIC’de kullanılan kolonlar genellikle kısa kolonlardır (bkz. kısım 4.5). HIC’de kullanılan tipik bir kolonun yatak yüksekliği genellikle 5-15 cm’dir. Bu tipteki küçük-ölçekli uygulamalarda ayrıştırma için gerekli olan optimum koşullar belirlendikten sonra, kolon boyutları uygun ölçülerde artırılarak kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemleri için uygulanabilir. 9.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi HIC’de kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak ele alınmıştır. Bunun yanı sıra HIC’de kullanılan kolonların, yüksek oranda çapraz-bağ içeren Sepharose Fast Flow gibi agaroz-temelli jeller ile paketlenmesi daha kolaydır. Çünkü HIC’de gerekli olan jel yatak yüksekliği, jel filtrasyon kromatografisinde gerekli olan yatak yüksekliğine oranla daha kısadır. 9.7.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin kompozisyonu, hacmi, viskozitesi ve derişimi gibi parametreler, iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak ele alınmıştır. i. Örnek materyalinin kompozisyonu: HIC’de örnek materyalinin hazırlanması için gereken işlemlerin sayısı, diğer kromatografik sistemler için hazırlanan örnek materyallerine uygulanan işlemlerin sayısına göre minimum düzeydedir. Çünkü HIC’de adsorbsiyon, yüksek tuz derişimlerinde gerçekleştirildiği için, örnek materyalinin kolona yüklenmeden önce tamponunu değiştirmek zorunlu değildir. Bu nedenle, HIC için örnek materyallerinin hazırlanması sırasında alınması gereken tek önlem, hedef moleküllerin adsorbsiyonunun sağlanabilmesi için yeterince tuz eklendiğinden ve şayet gerekli ise pH’nın ayarlandığından emin olmaktan ibarettir.

Şayet örnek materyaline eklenen tuz katı formda ise bölgesel olarak tuz derişiminin aşırı yoğun olması nedeni ile kısmi çökelme meydana gelebilir. Bu nedenle, yüksek tuz derişiminden

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

209

oluşan stok solüsyonların doğrudan örnek materyali üzerine eklenmesinden kaçınılmalıdır. Ayrıca örnek materyali içerisinde, guanidin hidroklorid ve üre gibi katotrofik ajanlar var ise örnek materyali kolona yüklenmeden önce, bu ajanların da uzaklaştırılması gerekmektedir. Çünkü bu ajanlar, hedef moleküllerin HIC jellerine bağlanmasını sağlayan hidrofobik etkileşimlerin oluşturulmasını kolaylaştırmak için kullanılan tuzların aksine davranmaktadırlar (bkz. kısım 9.3). Bazı ham örnek materyallerinde ise lipitler veya oldukça hidrofobik olan diğer bileşikler bulunabilir (bkz. kısım 1.6.1). Bu bileşikler ise HIC kolonu ile oldukça kuvvetli bir şekilde etkileşim oluşturarak, kolonun kapasitesini bloke edebilirler. Ayrıca, kolonun temizlenmesi ve rejenerasyonu esnasında bu bileşiklerin kolondan uzaklaştırılmaları da oldukça güç olabilir. Bu gibi durumlarda ise gerçekte kullanılacak olan HIC kolonundan hafifçe daha az hidrofobik olan bir kolonun, ön-kolon olarak kullanılması önerilmektedir. Böylece, örnek materyali gerçek HIC kolonuna girmeden önce lipit gibi kirleticilerin ön-kolon tarafından verimli bir şekilde tutulması sağlanabilmektedir. Kullanılacak olan ön-kolon ise en kuvvetli hidrofobik bileşikleri bağlarken, dengeleme koşulları altında hedef moleküllerin bu kolon materyaline bağlanmadan kolondan, geçmesine izin verecek şekilde seçilmelidir. ii. Örnek materyalinin hacmi: HIC bir adsorbsiyon yöntemi olduğundan başlama koşulları, örnek materyal içerisinde bulunan bütün önemli bileşiklerinin kolon yatağının üst kısmında adsorblanmasını sağlayacak şekilde seçilir. Bu durumda, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin hacminden ziyade, örnek materyalinin kütlesi çok daha önemlidir. Bunun anlamı ise jel filtrasyon kromatografisi gibi başka bir kromatografik uygulamadan elde edilen birleştirilmiş fraksiyonlar ve hücre kültür sıvıları gibi seyreltik solüsyonların büyük hacimleri, yoğunlaştırılmadan doğrudan doğruya kolona yüklenebilir demektir. Bu nedenle HIC, bileşiklerin fraksiyonlara ayrılmasının yanı sıra, örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır.

Bununla birlikte, örnek materyalinin tuz derişimi, kolonun dengelenmesinde kullanılan hareketli fazın tuz derişiminden düşükse, örnek materyalinin hacmi önem kazanmaktadır. Böyle durumlar ise yüksek tuz derişimi nedeni ile örnek materyal içinde bulunan bileşiklerin çökelmesinden kaçınılması gibi durumlarda meydana gelmektedir. Bu gibi durumlarda, yüksek hacimde örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında, kolon materyali ile etkileşimi en zayıf olan bileşiklerin kolondan elüsyonu başlayabilir. Etkileşimi en zayıf olan bileşiklerin yükleme esnasında kolondan elüsyonunu önlemek için ise büyük hacimdeki örnek materyali, birkaç parçaya ayrıldıktan sonra kolona yüklenir. Bu durumda, parçalara ayrılmış olan örnek materyalinin her bir parçasını kolona yükledikten sonra, hidrofobik etkileşimi artırmak ve erken elüsyonu önlemek için kolona dengeleme tamponunun ilavesi gerekir (Şekil 9.5). iii. Örnek materyalinin viskozitesi: Örnek materyalinin viskozitesi, kolona yüklenecek olan örnek miktarını sınırlayabilir. Örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, zonların kararsız olmasına ve düzensiz akış profillerine yol açar. Ayrıca, örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, özellikle partikül boyutunun küçük olduğu (örneğin, 10 μm) kolon matrikslerinin kullanıldığı durumlarda, geri-basıncın yükselmesine de yol açabilir. Bu durumda kritik olan değişken ise örnek materyalinin viskozitesinin, hareketli fazın viskozitesine olan göreceli değeridir.

Şayet örnek materyali, yüksek bileşik derişimi nedeni ile çok viskoz ise başlangıç tamponu ile seyreltilebilir. Nükleik asit kontaminasyonu nedeni ile meydana gelen yüksek viskozite ise polietilenimin veya protamin sülfat gibi poli-katyonik bir makromolekül ile çökeltme yolu ile giderilebilir. Nükleik asit nedeni ile meydana gelen viskozite, aynı zamanda endonükleazların kullanılması ile de düşürülebilir. Fakat bu tipteki katkı bileşiklerini içeren işlemler, endüstriyel uygulamalarda çok da ilgi çekici bulunmamaktadırlar. Çünkü endüstriyel proseslerde son-ürün içerisinde bu tip katkı maddelerinin bulunmadığı kanıtlanmak zorundadır (bkz. kısım 1.6.1).

210

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 9.5: HIC’de örnek materyal yükleme koşullarının etkisi. Kolon: 1 mL Alkil Superose HR 5/5. Akış oranı: 0,5 mL dk–1. Tampon-A: 100 mM sodyum fosfat, pH 7,0; 2 M amonyum sülfat. Örnek materyali: 0,9 M Amonyum sülfat içerisinde fare karın boşluğu sıvısı [500 μL anti-CEA MAB (IgG1)] (115 μL karın boşluğu sıvısına eşdeğer). (a) 500 μL hacmindeki örnek materyali bir seferde kolona yüklenmiştir. Bu durumda, kolon materyali ile en zayıf etkileşim gösteren albümin moleküllerinin elüsyonu, örneğin yüklenmesi sırasında başlamıştır. (b) Toplam 500 μL’lik örnek materyali, her biri 100 μL’den oluşan beş parçaya bölünmüş ve her bir parçanın yüklenmesinden sonra kolon 1,3 mL, 2 M amonyum sülfat ile dengelenmiştir (Anonymous, 1993).

iv. Örnek materyalinin partikül içeriği: Bütün kromatografi formlarında iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi ve kolon ömrünün uzun olması, kolona yüklenen örnek materyalinin bazı özel maddelerden yoksun olmasına bağlıdır. Bu nedenle, HIC kolonlarına yüklenecek olan örnek materyallerinin partikül içerikleri de diğer kromatografi tekniklerinde olduğu gibi oldukça önemlidir ve bu konu ise daha detaylı olarak kısım 3.7’de ele alınmıştır. 9.7.4. Örnek Materyalinin Yüklenmesi

LPLC veya HPLC sistemlerinde HIC’nin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak incelenmiştir. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktardı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. 9.7.5. Elüsyon

HIC kolonuna yüklenen biyomoleküllerin elüsyonu birkaç yolla gerçekleştirilebilir: i. Elüsyon tamponu içerisine değişik miktarlarda organik çözücülerin eklenmesi ile elüsyon (bkz. kısım 9.3): Bu durumda, elüsyon tamponu içerisine eklenecek olan organik çözücünün miktarının, hedef protein molekülleri üzerinde yıkıcı bir etkisinin olmadığından, yani hedef proteinlerin kullanılan organik çözücü miktarında kararlı olduğundan emin olmak gerekmektedir. Elüsyon tamponuna ilave edilen organik çözücüler ise kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin polaritesini veya yüzey gerilimlerini düşürmektedir. Proteinlerin polaritesinin veya yüzey gerilimlerinin düşmesi ise bileşiklerin HIC kolon materyaline bağlanma kuvvetlerini azaltmakta ve sonuçta kolona bağlanmış olan proteinlerin elüsyonuna yol açmaktadır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan organik çözücüler ise etilen glikol ve iso-propanol’dür. Bu organik

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

211

çözücüler, tuz içermeyen tampon içerisinde %40 etilen glikol veya %30 iso-propanol şeklinde kullanılırlar. Bazı uygulamalarda ise elüsyon tamponunun tuz derişimini lineer olarak düşürürken buna bağlı olarak, bu tipteki katkı maddelerinin derişimlerini ise lineer olarak artırmak avantajlı olabilmektedir. Bu son uygulama ise bazı durumlarda, HIC kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin elüsyonunda elde edilen ayrıştırma çözünürlüğünün artmasına da yol açabilmektedir. ii. Elüsyon tamponu içerisine nötral deterjanların (genellikle %1) eklenmesi ile elüsyon: Buna rağmen bazı deterjanlar, kolon materyaline oldukça kuvvetli bir şekilde bağlanabilmektedirler. Bu tip deterjanların kolondan yıkanarak tamamen uzaklaştırılabilmesi için ise yaygın olarak kullanılan organik çözücüler (örneğin etanol) yetersiz kalabilmektedir. Çok daha kötüsü ise bu tipteki deterjanları içeren HIC kolonlarının daha sonraki kullanımları esnasında, kolon kapasitesinin düşmesine yol açabilmesidir. Bu nedenle, protein moleküllerinin HIC kolonlarından elüsyonunda deterjanlar kullanılırken çok dikkatli olunmalıdır. iii. Lineer veya basamaklı olarak azalan tuz derişim gradienti ile elüsyon: Bu yöntem, protein moleküllerinin HIC kolonlarından elüsyonunda kullanılabilecek olan en güvenli metottur. Bu metodun uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı gradient uygulaması şeklindedir: a. Lineer gradient elüsyonu: Tarama çalışmaları esnasında ilk seçim, genellikle basit lineer gradient elüsyonu olmaktadır. Fakat yeterli deneyime sahip olunduğu durumlarda, çözünürlüğün yetersiz olduğu kromatogram bölgelerinde daha sığ bir gradientin oluşturulması avantaj sağlayabilmektedir. Bunun yanı sıra, çözünürlüğün iyi olduğu bölgelere ise dik bir gradient uygulanabilir (Şekil 9.6). Bu tipteki kompleks gradient uygulamaları ise aynı ayrıştırma işlemi esnasında, çözünürlük ile hızın kombinasyonunun sağlanması açısından maksimum esneklik sağlamaktadır.

Şekil 9.6: Kompleks gradient uygulamasının çözünürlük üzerine etkisi. (a) Lineer gradient uygulaması. (b) Kompleks gradient uygulaması.

Lineer bir gradientin toplam gradient hacminin artırılması ile (bu durumda gradient eğimi azalacaktır), kromatogramın bütün bölümünün çözünürlüğü artırılabilir (Şekil 9.7). Bu uygulama, kromatografinin ilk amacının mümkün olduğunca çok sayıdaki pikleri birbirinden ayrıştırmak olmadığı, fakat hedef protein moleküllerinin örnek materyal içinde bulunan diğer bileşiklerden izolasyonunun sağlanması olduğu preparatif çalışmalar için genellikle en iyi yaklaşım değildir. Gradient hacminin artırılması, aynı zamanda kromatografi işleminin sonuçlanması için gereken zamanı da artıracağı gibi, elüsyonu gerçekleştirilen fraksiyonların daha da seyreltik olmasına yol açacaktır.

212

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 9.7: Gradient eğiminin çözünürlük üzerine etkisi. (a) Eğimi daha dik olan bir lineer gradient uygulaması. (b) Eğimi daha sığ olan bir lineer gradient uygulaması.

b. Basamaklı gradient elüsyonu: Büyük-ölçekli preparatif uygulamalarda, genellikle basamaklı gradient elüsyonu tercih edilmektedir. Bunun başlıca nedenleri ise basamaklı gradientin uygulanmasının, lineer gradiente göre hem teknik olarak daha kolay olması hem de tekrarlanabilir olmasıdır. Bunun yanı sıra basamaklı gradient elüsyonu, hedef proteinin çok daha yoğun formda elüsyonunu sağlayabilmesi nedeni ile küçük-ölçekli ayrıştırma uygulamalarında da avantajlı olabilmektedir. Bu durumda, elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, hedef protein ile birlikte kolon materyaline çok daha sıkı olarak bağlanmış olan proteinlerin de elüsyonuna yol açmayacak şekilde tutulmalıdır.

Basamaklı gradient uygulamasının prensibi, hedef proteinlerin elüe oldukları bölgelerdeki çözünürlüğü artırmaktır. Şekil 9.8’de ise lineer gradient uygulaması ile iyi bir çözünürlüğün elde edilemediği elüsyon profiline karşılık, aynı hedef proteinlerin (gölgeli alan) 3-basamaklı bir gradient uygulaması sonucunda nasıl iyi bir çözünürlüğün sağlandığı görülmektedir.

Şekil 9.8: Elüsyon gradient tipinin çözünürlük üzerine etkisi. (a) Lineer gradient elüsyonu. (b) 3-basamaklı gradient elüsyonu.

Şekil 9.8,a’da elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti ve hacmi, hedef proteinlerine göre kolon materyaline daha zayıf olarak bağlanmış olan bütün bileşiklerin elüsyonu sağlanacak şekilde optimize edilmiştir. Elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti ve hacmi, kolon materyaline zayıf olarak bağlanmış olan bu kirletici bileşiklerin elüsyonunu sağlamaya yetecek kadar büyük olmalı, fakat hedef proteinlerin kirleticilerle birlikte elüe olmaya başladığı sınırı da aşmamalıdır. Şekil 9.8,b’de ise elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, hedef proteinin elüe olduğu noktaya yükseltilmiştir. Bu durumda ise elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, aşırı derecede seyrelmeye yol açmadan hedef proteinin elüsyonunu sağlayacak kadar kuvvetli olmalı; fakat kolon materyaline çok daha sıkı

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

213

bağlanmış olan kirleticilerin elüe olma sınırının da altında olmalıdır. Hedef proteinlerin kolondan elüsyonu sağlandıktan sonra, kolon içerisinde kalmış olan bütün bileşiklerin kolondan uzaklaştırılması için ise kolon, elüsyon kuvveti çok daha fazla olan elüsyon tamponu ile yıkanır. Bu durumda kolonun yıkanma süresi, elüsyon tamponunun elüsyon kuvvetinin derecesine bağlı olarak çok kısa bir süre tutabilir. 9.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması

Jel materyalleri ile paketlenmiş olan kolonlar belirli bir süre kullanıldıktan sonra, kolon yatağı içerisinde çökelen proteinlerin ve diğer kirleticilerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Kolonun temizlenmeye ihtiyaç duymasının belirtileri ise kolon yatak yüzeyinde renkli bir tabakanın oluşması, kolonun çözünürlük özelliklerinin kaybolması veya geri-basıncın artmasıdır. Geri-basıncın artması ise hareketli fazın kolon yatağı boyunca akış oranını etkileyecektir. Jel materyalleri ile paketlenmiş olan kolonların kullanıldıktan sonra, bir sonraki kullanıma hazırlanması için rejenerasyonu (bkz. kısım 6.8), temizlenmesi (kısım 5.7.5) ve korunması (bkz. kısım 5.7.6) ile ilgili temel konular ise daha önceki bölümlerde ele alınmıştır. 9.9. HIC Uygulama Örnekleri

HIC, proteinlerin saflaştırılması amacıyla uygulanan diğer kromatografi tekniklerinin bir tamamlayıcısı olarak araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Herhangi bir proteinin saflaştırılması için uygulanan prosedürlerin genel akım şeması ise doğal olarak seçilen ayrıştırma ekipmanlarına ve tekniklerine bağlıdır. Buna rağmen, seçilmiş olan ayrıştırma tekniklerinin hangi sıra ile kullanılacağı da oldukça önemlidir. Bu nedenle, takip eden alt-kısımlarda ise laboratuvar-ölçekli protein saflaştırma çalışmalarında, HIC’nin diğer kromatografi teknikleri ile kullanımının muhtemel kombinasyonlarına yer verilmektedir. 9.9.1. HIC’nin Amonyum Sülfat Çökeltmesi ile Birlikte Kullanılması

Protein saflaştırma prosedürlerinin erken aşamasında, kirletici proteinlerin çökeltilmesi amacı ile amonyum sülfat çökeltmesi kullanıldığında, bir sonraki basamak için HIC ideal bir tekniktir. Bu şekilde hazırlanmış bir örnek materyalindeki hedef proteinler, yüksek derişimde amonyum sülfat içeren süzüntü içerisinde yer almaktadır ve bu nedenle örnek materyal, doğrudan HIC kolonuna yüklenebilir. Bu durumda hedef proteinlerin saflaştırılması, aynı zamanda örnek materyal miktarının hacminin azalması yani yoğunlaştırma ile birlikte gerçekleşir. Örneğin, 125 kDa kütleye sahip olan ve tümörlü hücrelerin hareketini stimüle eden insan autotoksin’inin saflaştırılmasının ilk aşamalarında HIC kullanılmıştır (Stracke ve ark., 1992). Bu çalışmada, yoğunlaştırılmış hücre kültür sıvısının amonyum sülfat ile çökeltilmesi sonucunda elde edilen süzüntü, doğrudan Penyl Sepharose 4B kolonuna yüklenmiştir (Şekil 9.9). Elüsyon ise amonyum sülfat derişiminin azalan, etilen glikolün ise artan derişimlerinin kullanıldığı ikili gradient uygulaması ile gerçekleştirilmiştir. HIC uygulamasından toplanan autotoksin fraksiyonları ise daha sonraki saflaştırma basamaklarında affinite, jel filtrasyon ve iyon-değiş tokuş kromatografileri ile homojen saflıkta elde edilmiştir. 9.9.2. HIC’nin IEC ile Birlikte Kullanılması

Protein saflaştırma prosedürlerinde IEC’den sonra HIC’nin kullanılması yaygın bir uygulamadır. Her iki kromatografi tekniği de oldukça geniş bir uygulama alanına sahip olup, birbirinin tamamlayıcısı durumundadır. Daha da önemlisi, IEC kolonundan tuz gradienti ile elüe edilen örnek materyalinin, HIC kolonlarına yüklenmeden önce çok az bir ön-işlem gerektirmesidir. Bu nedenle, HIC kolonuna yüklenecek olan IEC fraksiyonlarına sadece gerekli miktarda tuzun eklenmesi yeterli olmaktadır.

214

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 9.9: İnsan autotoksininin HIC ile saflaştırılması. Kolon: Phenyl Sepharose 4B, 200 mL. Örnek materyal: A2058 melanoma hücre kültürün sıvısının (200 L) yoğunlaştırıldıktan sonra, amonyum sülfat çökeltmesinden (1,2 M) elde edilen süzüntü. Tampon-A: 50 mM Tris, pH 7,5; %5 (v/v) metanol; 1,2 M amonyum sülfat. Tampon-B: 50 mM Tris, pH 7,5; %5 (v/v) metanol; %50 (v/v) etilen glikol. Akış oranı: 1 mL dk–1. Dedeksiyon: A280 (kesiksiz çizgi) ve hareketlilik (daireler). Kemotaksi, 2202 Ultraskan lazer densitometre ile belirlenmiştir (Stracke ve ark., 1992).

Örneğin, memeli hücrelerinin nükleusunda oldukça düşük derişimlerde bulunan transkripsiyon faktörlerinin ayrıştırılmasında HIC kullanılmıştır (Flores ve ark., 1992). Flores ve arkadaşları yapmış oldukları bu çalışmada HeLa S100 hücre kültür özütünden 6 farklı transkripsiyon faktörünün μg düzeyinde saflaştırılması için bir saflaştırma şeması geliştirmişlerdir. Bu şemada, HIC ile IEC’nin birbirini tamamlayıcı seçici iki kromatografik yöntem olarak kullanılması gösterilmiştir. Transkripsiyon faktörleri olan TFIIF ve TFIIH, anyon değiş-tokuş kromatografi kolonundan (DEAE-Sephacel ve DEAE-5PW olmak üzere iki farklı kolon) ve katyon değiş-tokuş kromatografi kolonundan (Phosphocellulose ve Mono S) birlikte elüe edilmiş, fakat bu iki transkripsiyon faktörünün birbirinden tam olarak ayrıştırılması ise ancak Phenyl Superose ile gerçekleştirilmiştir (Şekil 9.10). Bu iki transkripsiyon faktörünün daha ileri safhalarda saflaştırılmasında ise diğer kromatografik teknikler kullanılmıştır.

Şekil 9.10: Memeli transkripsiyon faktörü TFIIH ve TFIIF’nin HIC ile ayrıştırılması. Kolon: Phenyl Superose HR 10/10. Örnek materyal: HeLa hücre kültür özütünün Phosphocellulose, DEAE-Sephacel, DEAE-5PW ve Mono S HR 10/10 kolonlarından ayrıştırılması gerçekleştirilmiş olan fraksiyonları. Tampon-A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,9; 0,1 M EDTA; %20 gliserol; 10 mM β-merkaptoetanol; 0,2 mM fenilmetilsülfonil florid; 1,4 M amonyum sülfat. Tampon-B: Amonyum sülfat içermeyen Tampon-A. Dedeksiyon: (Δ) TFIIF aktivitesi; (o) TFIIH aktivitesi (Flores ve ark., 1992).

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

215

9.9.3. HIC’nin GFC ile Birlikte Kullanılması

Adsorbsiyon kromatografisinin en önemli avantajlarından birisi, hedef moleküllerin saflığının artırılmasının yanı sıra, örnek materyal içerisinde bulunan kirletici proteinlerin hacminin azaltılmasını da sağlamasıdır. Bu nedenle, bir saflaştırma protokolünde HIC ve diğer adsorbsiyon kromatografi teknikleri, jel filtrasyon kromatografisine yüklenecek olan örnek materyalinin hacminin küçük olması nedeni ile genellikle GFC’den önce kullanılmaktadır. Örneğin, insan hipofiz prolaktini Roos ve arkadaşları (1979) tarafından Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan %50 etilen glikol ile basamaklı olarak saflaştırılmıştır (Şekil 9.11). Bu çalışmada ise örnek materyali GFC’na yüklenmeden önce, HIC ile 300 mL’den 45 mL’ye düşürülmüş ve prolaktinin geri-kazanımı %95 olarak gerçekleşmiştir. Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan toplanan pozitif fraksiyonlar ise daha ileri bir saflaştırmanın sağlanması için ikinci bir GFC kolonuna (Sephadex G-100) yüklenmiştir.

Şekil 9.11: İnsan hipofiz prolaktininin Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan elüsyonu (Roos ve ark., 1979).

9.9.4. Tek-adımda Saflaştırma Tekniği Olarak HIC

Genel olarak, kompleks bir biyolojik karışımdan “tek adımda” bir proteinin homojen saflıkta elde edilebilmesi için, oldukça yüksek özgüllüğe sahip affinite tekniklerinin kullanılması gerekmektedir (bkz. 8. Bölüm). Şayet bir proteinin saflaştırılması için HIC, IEC ve GFC gibi genel teknikler seçilirse, bu proteinin homojen saflıkta elde edilebilmesi için bu tekniklerden oluşan bir kombinasyonun kullanılması gerekmektedir. Bazı durumlarda ise saf bir ürünün elde edilmesi için, bu genel tekniklerden birsinin kullanılması yeterli olabilmektedir. Örneğin, fare monoklonal antikorlarının miligram düzeyinde saf olarak elde edilmesi bu duruma verilebilecek en iyi örneklerden birisini oluşturmaktadır (Şekil 9.12). Amersham Pharmacia Biotech firması tarafından gerçekleştirilen bu çalışmada kullanılan örnek materyal içerisindeki temel proteinlerden birisi olan IgG, Alkil Superose HR 5/5 ile tek adımda homojen olarak elde edilmiştir. Bu çalışma sonucunda IgG moleküllerinin her ikisinin de (IgG1 ve IgG2a) serum proteinleri olan albümin ve transferrinlerden arınık olduğu ise SDS-PAGE ve gümüş boyama teknikleri ile kontrol

216

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

edilmiştir. IgG moleküllerinin kolondan elüsyonu ise Şekil 9.12’den de açıkça görülebileceği gibi, faklı pozisyonlarda gerçekleşmiştir. Bunun yanı sıra, farklı antikorların ayrıştırılması için IgG için olan ayrıştırma koşullarının modifikasyonunun gerekebileceğini de unutmamak gerekir.

Şekil 9.12: Monoklonal antikorların tek adımda HIC ile saflaştırılması. Kolon: Alkil Superose HR 5/5. Örnek materyal: Monoklonal IgG1 (a) veya IgG2a (b) içeren 100 μL fare karın boşluğu sıvısı + 100 μL tampon-A. Tampon-A: 100 mM fosfat, pH 7,0; 2 M amonyum sülfat. Tampon-B: 100 mM fosfat, pH 7,0 (Anonymous, 1993).

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ (RPC)

10.1. Giriş

Adsorbsiyon kromatografisi, bir sıvı içinde çözünmüş olarak bulunan moleküller ile özel bir amaç için tasarlanmış olan ve kromatografi matriksine kovalent olarak bağlanmış olan ligandlar arasındaki kimyasal etkileşimlere bağlıdır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar sonucunda, biyomoleküllerin saflaştırılması amacıyla, bu moleküllerin elektriksel yüklerinden biyolojik affinitelerine kadar değişen çok sayıdaki özelliğinden yararlanmak için çok farklı tiplerdeki ligandlar, kromatografi destek materyalleri üzerine tutuklanmışlardır. Biyomoleküllerin preparatif kromatografisi için kullanılan adsorbsiyon tekniklerine önemli bir katkı ise ters-faz sıvı kromatografi (Revers Phase Chromatography; RPC) tekniğinin geliştirilmesi olmuştur. RPC’de hareketli faz içerisindeki çözünmüş moleküllerin, durgun faz matriksine tutuklanmış olan bir n-alkil hidrokarbona veya aromatik liganda bağlanması ise hidrofobik etkileşimler aracılığı ile gerçekleşmektedir. RPC, biyomoleküllerin ayrıştırılmasında ve saflaştırılmasında, hem analitik hem de preparatif uygulama alanları bulmuştur. Proteinler, amino asitler ve nükleik asitler gibi belirli bir dereceye kadar hidrofobik özellik taşıyan moleküllerin ayrıştırılması, RPC ile çok iyi bir çözünürlük ve gerikazanım sağlanarak gerçekleştirilebilmektedir. Buna ilaveten, hareketli faz içerisinde iyon-eşleştirici modifikatörlerin kullanılması, hidrofilik proteinler ve tamamı ile korunmasız olan oligonükleotidlerin de RPC ile ayrıştırılmasına izin vermektedir. Preparatif RPC ise amino asit dizilemesi amacı ile mikro-ölçekli protein saflaştırmadan, rekombinant proteinlerin saflaştırılması amacıyla uygulanan üretim-ölçekli saflaştırmalara kadar değişen ölçeklerde kullanılabilmektedir. Bu bölümde ise RPC’nin, biyomoleküllerin ayrıştırılması amacıyla kullanılması sırasında dikkat edilmesi gereken genel prensipler ve bazı uygulama örnekleri üzerinde durulmaktadır. Bu bölümde yer verilen konular ise RPC’nin preparatif uygulamaları ile sınırlandırılmış olup, daha çok proteinlerin ve amino asitlerin saflaştırılması üzerinde durulmaktadır. 10.2. RPC’nin Temel Prensipleri

RPC’nin ayrıştırma mekanizması, hareketli faz içerisindeki biyomoleküller ile kolon matriksi üzerine tutuklanmış olan ligandlar (durgun faz) arasındaki hidrofobik bağlanma etkileşimine bağlıdır. Hidrofobik bağlanma etkileşiminin nasıl gerçekleştiğine ilişkin mekanizma üzerinde henüz tam olarak anlaşmaya varılamamış olması nedeni ile hidrofobik bağlanma etkileşiminin doğasının kendisi ise sıcak bir tartışma konusudur. Fakat mantıklı olarak kabul gören varsayıma göre hidrofobik bağlanma, elverişli entropi etkisinin bir sonucudur. RPC’de kullanılan başlangıç hareketli fazı (tampon-A veya yıkama tamponu olarak da adlandırılır) bağlama koşullarının öncelikle sulu olmasından, hem biyomoleküllerin hem de kolon matriksine tutuklanmış olan ligandların etrafı yüksek derecede düzenlenmiş su yapısı ile sarılmaktadır (Şekil 10.1). Tampon-A içerisindeki biyomoleküller, tutuklanmış olan ligandlara bağlandığında ise biyomoleküllerin çözücüye maruz kalan hidrofobik bölgeleri minimuma düşmektedir. Bu nedenle, düzenlenmiş su yapısının derecesi azalmakta ve sistemin elverişli entropisi artmaktadır. Bundan dolayı, sistemin elverişli entropisi

218

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

artarken, düzenlenmiş su yapısının derecesi de azalmaktadır. Bu durumda, enerji açısından, hidrofobik kalıntıların (örneğin ligand ve biyomolekül) birleşmesi avantajlı olmaktadır.

Şekil 10.1: Hareketli faz içerisindeki proteinlerin tipik bir RPC materyali ile etkileşimi. Hidrofobik bölgelere yakın olan su moleküllerinin normal sudaki moleküllere göre daha düzenli yapıda olduğu varsayılmaktadır. Hidrofobik bölgelerin etkileşimi sonucunda sistemin toplam entropisinde bir artış meydana gelirken “yapısal suyun” bir bölümü yer değiştirmektedir.

Adsorbtif bir proses olan RPC’de ayrıştırmanın etkinleşmesi, deneysel tasarım ile sağlanan dağılma mekanizmasına bağlıdır. Hareketli faz içerisinde çözünmüş olan biyomoleküller, hareketli faz ile durgun faz arasında dağılarak bir denge oluştururlar. Çözünmüş olan biyomoleküllerin iki faz arasındaki dağılımı ise kolon materyalinin bağlama özelliklerine, biyomoleküllerin hidrofobisitesine ve hareketli fazın kompozisyonuna bağlıdır. Kromatografik işlemin uygulanması esnasında başlangıç koşulları, hareketli fazın içerisindeki biyomoleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlayacak şekilde seçilir. Bu durumda adsorbsiyon, çözünmüş olan biyomoleküllerin dağılımının %100 durgun fazda olması nedeni ile sistem, uç noktada (ekstrem) denge durumunda kabul edilir. Daha sonra ise hareketli faz kompozisyonu, durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin durgun fazdan ayrılarak, tekrar hareketli faza geçmesini sağlayacak şekilde modifiye edilir. Bu durumda ise durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin durgun fazdan ayrılarak, tekrar %100 hareketli faz içerisinde dağılmış olması nedeni ile sistem, yine uç noktada denge durumunda kabul edilmektedir. Biyomoleküllerin RPC ile ayrıştırılmasında ise genellikle, izokratik elüsyon yerine gradient elüsyonu uygulanmaktadır. Sulu koşullar altında kolon matriksinin yüzeyine kuvvetli bir şekilde adsorblanmış olan biyomoleküllerin matriksten ayrılması ise hareketli faza ilave edilen organik modifikatörler ile sağlanmaktadır. Kolon matriksine adsorblanmış olan her bir biyomolekülün matriksten de-adsorbsiyonu ise organik modifikatör derişiminin dar bir aralığında gerçekleşmektedir. Tipik bir biyolojik materyal örneği ise benzersiz adsorbsiyon özelliklerine sahip olan yüksek moleküler kütleli biyomoleküllerin yanı sıra, adsorbsiyon affiniteleri oldukça geniş bir aralıkta yer alan çok fazla sayı ve çeşitteki biyomoleküllerden oluşmaktadır. Bu nedenle, kompleks biyolojik materyal örneklerinin RPC ile ayrıştırılması, ancak gradient elüsyonu ile sağlanabilmektedir. Özetle, RPC ile biyomoleküllerin ayrıştırılması, hareketli faz içerisinde çözünmüş olarak bulunan ve hidrofobik olan durgun faza karşı değişik derecelerde hidrofobisitelere sahip olan biyomoleküllerin, geri-dönüşümlü olarak durgun faza adsorbsiyon/de-adsorbsiyonuna bağlıdır. RPC ile biyomoleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirildiği deneysel çalışmaların büyük bir çoğunluğu, Şekil 10.2’de gösterildiği gibi beş temel basamaktan oluşmaktadır. Bu basamaklar ise ana hatları ile şu şekilde özetlenebilir: i. Paketlenmiş olan kolonun dengelenmesi: Bütün kolon kromatografisi tekniklerinde olduğu gibi RPC’de de ilk adım, kolon materyali ile uygun bir şekilde paketlenmiş olan kolonun uygun bir pH, iyonik kuvvet ve polariteye (hareketli fazın hidrofobisitesi) sahip olan başlangıç hareketli fazı (tampon-A olarak adlandırılır) ile dengelenmesidir. Tampon-A’nın polaritesi ise asetonitril gibi organik modifikatörlerin bu faz içerisine ilavesi ile kontrol edilebilir. Bu amaçla

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

219

trifloroasetik asit gibi iyon-eşleştirici ajanlar da uygun olabilmektedirler. Kolonu dengelemekte kullanılan tampon-A’nın polaritesi ise kısmen hidrofobik olan biyomoleküllerin tampon içinde çözünmesini sağlayacak kadar düşük, fakat aynı zamanda biyomoleküllerin RPC matriksine (durgun faz) adsorblanmasını sağlayacak kadar da yüksek olması gerekmektedir (bkz. kısım 10.5.4). ii. Örnek materyalinin kolona yüklenmesi: Bu basamakta ise ayrıştırılması gerçekleştirilecek olan biyomolekülleri içeren örnek materyali, dengelenmiş olan kolona yüklenir (bkz. kısım 3.8 ve kısım 4.10). İdeal olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyali, birinci adımda kolonu dengelemek için kullanılan tampon-A içerisinde çözündürülür. Örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında, biyomoleküllerin durgun faza bağlanmasının optimum olduğu akış oranında yükleme yapılır. Örnek materyali tamamı ile yüklendikten sonra, durgun faza bağlanmamış olan biyomoleküllerin kolondan uzaklaştırılması için kolon yeniden tampon-A ile yıkanır. i. Başlangıç koşulları

M

ii. Biyomoleküllerin adsorbsiyonu

iii. Ayrılmanın başlaması

M

M

iv. Ayrılmanın sonu

M

v. Rejenerasyon

M

Şekil 10.2: Biyomoleküllerin ayrıştırılmasında RPC’nin kullanılması durumunda uygulanan başlıca deneysel basamaklar.

iii. Biyomoleküllerin elüsyonu: Bu basamakta ise durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin, durgun fazdan ayrılarak (de-adsorbsiyon) yeniden hareketli faza (elüsyon tamponu veya tampon-B) geçmesi ve böylece kolondan elüsyonu sağlanır. RPC kolonlarından biyomoleküllerin elüsyonu ise genellikle elüsyon tamponunun polaritesinin düşürülmesi ile sağlanır. Elüsyon tamponunun polaritesinin düşürülmesi ise bu faz içerisindeki organik modifikatörün yüzdesisin kademeli olarak artırılması ile sağlanır (bkz. kısım 10.6.7). Elüsyon tamponunun pH’sı ise genellikle elüsyon işleminin başından sonuna kadar aynı kalır. Elüsyon tamponunun polaritesinin dereceli olarak düşürülmesi (veya diğer anlamda, hidrofobisitesinin dereceli olarak artırılması) ise elüsyon işlemine çok az (≤%5) veya hiç organik modifikatör içermeyen %100 tampon-A ile başlanıp, organik modifikatörün oldukça yüksek bir derişimini (≥%95) içeren %100 tampon-B ile elüsyonun tamamlanması ile başarılır. Böylece elüsyon tamponunun polaritesindeki düşme dereceli olarak sağlanacağından, durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküller kendi hidrofobisitelerine uygun olan derecelerde elüe olacaklardır. iv. Kolonun temizlenmesi: Bu basamakta ise elüsyon işlemi sırasında kolondan ayrılmamış olan ve hâlâ durgun faza adsorblanmış olarak bulunan biyomoleküllerin kolondan uzaklaştırılması sağlanır. Bunun için ise kolon, genellikle %100’e yakın bir derişimdeki organik modifikatör ile yıkanır. Böylece kolon yeniden kullanılmadan önce, durgun faza adsorblanmış olan bütün moleküllerin kolondan uzaklaştırılması sağlanmış olur (bkz. kısım 10.6.8).

220

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

v. Kolonun rejenerasyonu: Bu basamakta ise temizlenmiş olan kolon, yeniden kullanım için tampon-A ile yıkanır. Böylece kolon içerisindeki tampon-B ve organik modifikatör kalıntılarının kolondan atılarak, kolonun yeniden dengelenmesi sağlanır (bkz. kısım 10.6.8).

RPC ile ayrıştırmanın temeli, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin hidrofobik özelliklerinin farklı olmasının bir sonucu olarak, bu moleküllerin bağlanma özelliklerinin farklılığına dayanmaktadır. Biyomoleküllerin ters-faz matriksine bağlanma dereceleri, başlangıç tamponunun hidrofobik özelliği manipüle edilmek suretiyle kontrol edilebilir. Çözünmüş bir molekülün hidrofobisitesini ölçmek zor olsa da, hidrofobik özellikleri açısından çok az da olsa farklılık gösteren moleküllerin ayrıştırılması kolayca sağlanabilmektedir. Ters-faz HPLC ise esnekliği ve sağladığı yüksek çözünürlükten dolayı çok yaygın olarak kullanılan kromatografik bir yöntemdir. RPC tekniği, biyomoleküllerin ayrıştırılmasında uygulanan koşullarda oldukça geniş bir esneklik sağlamaktadır. Bu esneklik nedeni ile ters-faz sıvı kromatografisinin uygulanmasında araştırmacılar birinci yol olarak, hedef moleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlarken kirletici moleküllerin ise kolona tutunmadan kolonu doğrudan terk etmesini sağlayan koşulları seçebilirler. Birinci yolun aksine, kirleticilerin durgun faza bağlanmasını sağlayan, fakat hedef moleküllerin ise kolondan doğrudan doğruya geçişine izin veren koşulları da seçebilirler. RPC uygulamalarında ise genellikle birinci alternatif olan hedef moleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlayan koşullar seçilmektedir. Çünkü bu yöntem, ayrıştırmanın yanı sıra hedef moleküllerini içeren örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır. Buna ilaveten, RPC kolonuna yüklenecek olan örnek materyalinin başlangıç derişimi kritik bir öneme sahip olmadığından, düşük derişime sahip örnek materyalinin kolona yüklenmesine de izin vermektedir. Bileşiklerin kolon materyaline adsorblanmasını (ya da serbest kalmasını) sağlayan koşullar ise deneysel koşulların dizaynı (bkz. kısım 10.5) adı altında daha detaylı olarak ele alınmaktadır. RPC matrikslerinin üzerine kovalent olarak tutuklanmış olan ve iyonlaşabilen kirleticiler nedeni ile bileşiklerin kolon materyaline adsorblanması, iyonik bağlar aracılığı ile de olabilmektedir. Hidrofobik ve iyonik bağların kombinasyonunun oluşturduğu bu etki ise karışık-tarz alıkonma davranışı olarak adlandırılmaktadır. İyonik etkileşimlerin engellenmesi için ise öncelikle çok sıkı bir denetimden geçirilerek üretilmiş olan, kaliteli RPC materyallerinin kullanılmasına özen gösterilmelidir. Ayrıca, kromatografi işlemi esnasında kullanılan hareketli faz koşullarının çok akıllıca seçilmesi ile de iyonik etkileşimler minimuma indirgenebilir. 10.3. RPC Adsorbentleri 10.3.1. RPC Matriksleri

Ters-faz sıvı kromatografisinin kolon materyallerini tanımlayan en kritik özellikleri, kromatografi matriksinin kimyasal kompozisyonu, partikül büyüklüğü, matriks üzerine tutuklanmış olan ligandların tipi, matriks üzerindeki ligand yoğunluğu, (şayet varsa) başlık grubunun kimyası ve matriksin gözenek büyüklüğüdür. Ters-faz kromatografi materyalleri, hidrofobik olan ligandların, porlu (gözenekli), çözünmeyen ve boncuk şeklinde olan bir matriks üzerine kimyasal olarak bağlanması ile elde edilmektedirler. Kullanılan matriksler ise hem kimyasal hem de mekaniksel olarak kararlı olmak durumundadırlar (bkz. kısım 3.3). Ticari olarak bulunan RPC matriksleri ise genellikle silika veya polistiren gibi sentetik organik polimerlerden oluşmaktadır (bkz. kısım 3.3). Şekil 10.3’de ise hidrofobik ligandların kimyasal olarak bağlanmış olduğu bazı silika materyallerinin yapısı görülmektedir. RPC materyali olarak ilk kullanılan polimer matriks ise silika olmuştur. RPC materyali ise orijinal olarak, küçük organik moleküllerin saflaştırılması amacı ile geliştirilmiş ve daha sonraları ise kimyasal olarak sentezlenmiş olan küçük moleküler kütleli peptidlerin saflaştırılmasında

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

221

kullanılmıştır. Silika ise düşük pH’da ve RPC’de tipik olarak kullanılan organik çözücülerin varlığında kararlılığını koruyan, gözenekli boncuklar şeklinde üretilmektedir.

M

O

Si

M

O O

Si O Si

Silanol grup kalıntısı

OH

Eter; silanol kaynağı CH3

M

O

Si

O

Si

(CH2)17 CH3 Oktadesil grup

CH3 CH3

M

O

Si

O

Si

CH2

CH3

C2 başlık grubu

CH3

Şekil 10.3: Silika-temelli RPC materyallerinin bazılarının tipik yüzey yapıları. RPC’de en yaygın kullanılan ligandlardan birisi ise hidrofobik oktadesil grubudur.

Silikanın, gözenekli ve fiziksel olarak kararlı olması ise yüksek kapasiteli ve verimliliği yüksek olan kolon materyallerinin hazırlanmasına izin vermektedir. Silika-temelli kolon matrikslerinin seçiciliği, büyük ölçüde ligandın özellikleri ve hareketli fazın kompozisyonu ile kontrol edilebilir olsa da, bu matrikslerin üretiminde kullanılan farklı prosedürler nedeni ile farklı ayrıştırma profilleri veren kolon materyalleri üretilmektedir. Silika jellerin kimyasal özellikleri ise farklı karbon zinciri uzunluklarına sahip olan ligandların, basitçe türevlendirilmesine izin vermektedir. Karbon içeriği, yüzey yoğunluğu ve tutuklanmış olan ligandların dağılımı ise sentez esnasında kontrol edilebilmektedir. Silika-temelli matrikslerin RPC materyali olarak kullanılmasındaki en önemli dezavantaj ise yüksek pH’larda, sulu solüsyonlardaki kararsızlığıdır. Bu nedenle, silika jel matrikslerinin çoğunun pH 7,5’in üzerindeki solüsyonlara uzun süre maruz bırakılmaması önerilmektedir. RPC materyali olarak, boncuk yapısındaki polistiren gibi sentetik organik polimerler de bulunmaktadır (Şekil 10.4). Polistiren ise geleneksel olarak, peptid sentezinde katı destek materyali olarak ve otomotize analizlerde, amino asitlerin ayrıştırılması için katyon değiş-tokuş kromatografi materyali olarak kullanılmıştır. Polistiren materyallerin en büyük avantajı ise özelikle kuvvetli asidik veya bazik koşullarda göstermiş oldukları mükemmel kararlılıklarıdır. Çünkü, silika jellerden farklı olarak polistiren, pH 1-12 aralığında kararlıdır. Bu nedenle, polistiren-temelli kolon materyallerinin kullanıldığı RPC uygulamalarında ayrıştırma, pH 7,5’in üzerinde gerçekleştirilebilir. Ayrıştırma işleminin pH 7,5’in üzerinde gerçekleştirilmesi ise biyomoleküllerin iyonizasyon derecelerinin çok daha fazla kontrol altına alınmasını sağlamakta ve bunun sonucu olarak da çok daha iyi bir alıkonma seçiciliği sağlanabilmektedir. Hidrofobik ligandlara sahip olan silika jellerin aksine, polistiren boncukların yüzeylerinin kendileri de oldukça kuvvetli hidrofobik olduğundan, türevlendirilmeden bırakıldıklarında hidrofilik bir yüzeye kaynarlar. RPC’de kullanılan bir kolon materyalinin gözenekliliği, bu materyalin biyomolekülleri bağlamak için kullanılabilir kapasitesini belirleyen önemli bir faktördür. Burada, kullanılabilir bağlama kapasitesinin; kapasite faktörü (k) olmadığına, fakat kolon materyalinin kendisinin gerçek bağlama kapasitesi olduğuna dikkat edilmelidir. Gözenek çapı yaklaşık olarak 10 nm olan kolon materyalleri, çoğunlukla küçük organik moleküllerin ve peptidlerin saflaştırılması için

Doç. Dr. Münir TUNCER

222

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

kullanılmaktadır. Gözenek çapı 30 nm veya daha büyük olan kolon materyalleri ise RPC’nin sert koşullarına dayanan rekombinant peptidlerin ve proteinlerin saflaştırılması için kullanılmaktadır. CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

Şekil 10.4: Polistiren-temelli RPC materyalinin kısmi yapısı.

10.3.2. RPC Ligandları

RPC materyallerinin seçiciliği, büyük ölçüde kolon matriksi üzerine bağlanmış olan ligand tipinin bir fonksiyonudur. Genel olarak, RPC uygulamalarında en yaygın kullanılan ligandlar ise lineer hidrokarbon zincirlerinden (n-alkil grupları) oluşan ligandlardır. Bu tip hidrokarbon ligandlardan bazılarının yapısı ise Şekil 10.5’de görülmektedir. CH3

(a)

M

O

Si

CH2 CH3

CH3 CH3

(b)

M

O

Si

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH3 CH3

(c)

M

O

Si

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

CH3

CH3

Şekil 10.5: Tipik olarak kullanılan n-alkil hidrokarbon ligandlar. (a) İki-karbon başlık grubu, (b) Oktil ligand, (c) Oktadesil ligand.

Torik olarak, herhangi bir özel uygulama için hangi ligandın en iyi sonuç vereceğini önceden tahmin etmek mümkün olmasa da, birinci kural olarak “oldukça hidrofobik olan bir biyomolekülün saflaştırılması için daha az hidrofobik olan bir ligandın kullanılması gerekmektedir”. Çok daha hidrofilik olan moleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilebilmesi için yeterli bağlanmanın sağlanabilmesi amacıyla, kuvvetli hidrofobik ligandların tutuklanmış olduğu kolon materyallerinin kullanılması gerekmektedir. Tipik olarak, kimyasal olarak sentezlenen peptidler ve oligonükleotidler çok daha hidrofobik olan C18 ligandları ile yeterince saflaştırılabilirler. Proteinler ve rekombinant

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

223

peptidler ise bu moleküllerin büyüklükleri nedeni ile hidrofobik moleküller olarak davranırlar ve çoğunlukla C18 ligandlarına kuvvetli bir şekilde bağlanırlar. Buna rağmen bu moleküller, C8 ligandları ile çok daha iyi saflaştırılırlar. Daha az hidrofobik olan sekiz-karbonlu alkil zincirleri ise bu ligandlara bağlanmış olan protein ve peptidlerin elüsyonunu sağlamak için daha düşük derişimlerde organik çözücüye gereksinim göstereceğinden, protein ve peptidlerin yapısını daha az bozacaktır. RPC’de kullanılan kolon materyallerinin ligand yapısına ilaveten, silika jelin yüzeyine tutuklanmış olan hidrokarbon ligandların yoğunluğu da bu kolon materyallerinin seçiciliklerini etkilemektedir. Bu nedenle, farklı partilerden elde edilmiş örnek materyallerinin RPC ile saflaştırılması esnasında tutarlı bir seçiciliğin sağlanabilmesi için silika yüzeylerinin kimyasal olarak türevlendirilmesinde tekrarlanabilir bir yöntemin kullanılması oldukça önemlidir. Hidrokarbon ligandların silika jellere tutuklanması ise silika jel yüzeyinde bulunan silanol grupları aracılığı ile gerçekleştirilir. Bu amaçla, silika jelin yüzeyinde bulunan silanol grupları ile ligandın klorotrialkilsilan formu reaksiyona sokularak, ligandın silika yüzeyine bağlanması sağlanır. Fakat bu tutuklama reaksiyonunda, C18 ve C8 ligandlarının oldukça büyük olması nedeni ile meydana gelen sterik engellemeler yüzünden, silika yüzeyinde bulunan silanol gruplarının tamamı doldurulamaz. Silika yüzeyinde türevlendirilmeden kalan silanol gruplarının ise biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında sıklıkla gözlenen karışık-tarzdaki iyon değiş-tokuş etkisinden sorumlu olduğuna inanılmaktadır. RPC esnasına gözlenen bu yan-etkinin indirgenmesi amacıyla ligandın tutuklanmasından sonra, silika yüzeyinde serbest kalan silanol gruplarının tamamının türevlendirilerek kapatılmasını sağlamak için silika, daha küçük olan alkilsilan (klorotrimetilsilan veya klorotrietilsilan) ayıraçları ile reaksiyona sokulur. Bu işlem ise son-başlıklama olarak adlandırılır. Son-başlıklama işlemi ise kolon materyalinin seçiciliğini etkilediğinden, kullanılan RPC kolon materyalinin iyi bir sonuç vermesi için son-başlıklama işleminin de tekrarlanabilir olması oldukça önemlidir. Silika jellerin türevlendirilmesine ilişkin reaksiyon ise Şekil 10.6’da görülmektedir. CH3

M

Si

OH +

Cl

Si CH3

CH3 (CH2)17 CH3

M

Si

O

Si

(CH2)17 CH3 +

HCl

CH3

Şekil 10.6: Monoklorodimetiloktadesilsilan kullanılarak silika jelin oktadesil zinciri (C18) ile türevlendirilmesi.

Kolon materyallerinin partikül büyüklükleri (partikülün çapı olarak ölçülür) ise kullanışlı bir kolonun paketlenebilmesi için önemli olan kolon yatak hacminin belirlenmesi ve saflaştırma işleminin verimliliği açısından oldukça önemlidir. Partikül büyüklüğü iri olan kolon materyalleri, kapasitesinin daha fazla olması ve yüksek akış oranında daha az basınca gereksinim göstermesi nedeni ile genellikle büyük-ölçekli preparatif ve endüstriyel üretim uygulamalarında kullanılır. Küçük-ölçekli preparatif ve analitik ayrıştırmalarda ise partikül çapı küçük olan kolon materyalleri kullanılmaktadır. Çünkü küçük partiküllü kolon materyallerinin sağladığı saflaştırma verimliliği daha yüksektir (bkz. kısım 2.8.2. ve kısım 2.8.3). Analitik ve küçük-ölçekli preparatif uygulamalarda genellikle 3-5 μm partikül çapına sahip kolon materyalleri kullanılırken, büyük-ölçekli preparatif uygulamalarda (pilot uygulama ve endüstriyel üretim) ise genellikle 15 μm veya daha büyük partikül çapına sahip olan kolon materyalleri kullanılmaktadır. 10.4. RPC’de Çözünürlük

Preparatif RPC uygulamalarında esas amaç, saflaştırılmış olan biyolojik materyalin gerikazanımının ve saflaştırma çözünürlüğünün yeterli bir düzeyde olmasıdır. Diğer sıvı kromatografi yöntemlerinde olduğu gibi, RPC’de çözünürlük ve çözünürlüğü kontrol eden en önemli parametreler

224

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

olan kapasite faktörü, verimlilik ve seçicilik ise detaylı olarak kısım 2.8’de ve bu kısmı takip eden alt-kısımlarında incelenmiştir. Bunun yanı sıra, kromatografik saflaştırma işleminin genelinin çözünürlüğü üzerine, hem kolon verimliliğinin yüksek olmasının hem de kolon materyalinin seçiciliğinin iyi olmasının önemi oldukça büyüktür. Buna rağmen, kromatografik deneylerde seçiciliği değiştirmek, verimliliği değiştirmekten daha kolaydır. Seçicilik, hareketli fazın kompozisyonunu ya da gradient şeklini değiştirmek gibi, kromatografik koşulları modifiye etmekle kolaylıkla değiştirilebilmektedir. 10.4.1. Bağlama Kapasitesi

RPC kolon materyalinin kullanılabilir bağlama kapasitesi, statik koşullar altında kolon materyalinin biyomolekülleri adsorblama yeteneğinin nicel bir ölçüdür. Dinamik bağlama kapasitesi ise özgül bir akış oranında, kullanılabilir bağlama kapasitesinin bir ölçüsüdür (bkz. kısım 6.7.2.1.). Preparatif çalışmalar için bu değerlerin her ikisi de oldukça önemlidir. Bir kolon materyaline bağlanacak olan biyomoleküllerin miktarı, kolon materyali üzenine tutuklanmış olan ligandların derişimi ile orantılıdır ve aynı zamanda, kolon materyaline adsorblanacak olan biyomoleküllerin tipine bağlıdır. Kullanılabilir ve dinamik bağlama kapasiteleri, saflaştırılacak olan biyomoleküllerin özgül kimyasal ve fiziksel özelliklerine, kolon materyalinin özelliklerine (örneğin, gözenekliliğine) ve biyomoleküllerin kolon materyaline bağlanması esnasındaki deneysel koşullara bağlıdır. Kolon materyalinin gözenekliliği, bağlama kapasitesini etkileyen önemli bir faktördür. Büyük gözenekli kolon materyallerinin hidrofobik olan yüzeylerinin tamamı biyomoleküllerin bağlanması için kullanılabilir. Küçük gözenekli kolon materyallerinin kullanılması durumunda, yüksek moleküler kütleye sahip olan biyomoleküller, kolon materyalinin dışında kalabilir ve bu durumda hidrofobik yüzeyin sadece küçük bir parçası kullanılmış olur. Maksimum bağlama kapasitesine gereksinim duyulduğunda, örnek materyali içinde bulunan hedef moleküllerin tamamının rahatça girebilecekleri gözenek büyüklüğüne sahip bir kolon materyali kullanılmalıdır. 10.5. Deneysel Koşulların Dizaynı

RPC uygulamalarında, deneysel koşulların dizaynında göz önünde bulundurulması gereken başlıca parametreler arasında kolon uzunluğu, hareketli fazın akış oranı, kromatografik işlemin gerçekleştirildiği sıcaklık, hareketli fazın kompozisyonu, gradient elüsyonu ve RPC’nin kullanım amacı bulunmaktadır. 10.5.1. Kolon Uzunluğu

RPC ile ayrıştırmada moleküler kütlesi büyük olan biyomoleküllerin çözünürlüğünün kolon uzunluğuna olan duyarlılığı, moleküler kütlesi küçük olanlara göre daha azdır. Proteinler, büyük peptidler ve nükleik asitler ise kısa kolonlarla iyi bir şekilde saflaştırılabilirler ve kolon uzunluğunu artırmak, bu moleküllerin çözünürlüğünü belirgin bir şekilde etkilememektedir. Peptidlerin parçalanması sonucunda oluşan bazı ürünler de dahil olmak üzere, küçük peptidlerin çözünürlüğü ise kolon uzunluğu artırılmak sureti ile daha da geliştirilebilir. Örneğin, karbokamidometil transferinin tipik parçalanması sonucunda oluşan ürünlerin RPC ile fraksiyonlanması sonucunda belirlenen piklerin sayısı, 5 cm uzunluğunda bir kolonun kullanılması durumunda 87; 15 cm’lik bir kolonun kullanılması durumunda 115; 25 cm’lik bir kolonun kullanılması durumunda ise 121 olarak belirlenmiştir. Yüksek kütleli biyomoleküllerin dağılma katsayıları ise hareketli fazın kompozisyonundaki çok küçük değişikliklere karşı dahi oldukça duyarlıdır ve bu nedenle, büyük biyomoleküller organik modifikatörün oldukça dar bir derişim aralığında kolon materyalinden ayrılmaktadırlar (deadsorbe

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

225

olmaktadırlar). Büyük moleküllerin kolonda alıkonma davranışlarının ise belki de kolon uzunluğundan etkilenmeyen bir açma/kapama mekanizması (örneğin, dağılma katsayısında meydana gelen büyük bir değişiklik) ile kontrol edildiği düşünülebilir. Organik modifikatör derişiminde meydana gelen çok küçük bir değişme, biyomoleküllerin dağılma katsayısında da çok küçük değişikliklere yol açmakta; kolon uzunluğunun artırılması ise çözünürlüğü artırmaktadır. RPC ile büyük biyomoleküllerin saflaştırılması esnasında gradient elüsyonunun kullanılması ise çözünürlük üzerine olan kolon uzunluğunun etkisini daha da azaltmaktadır. Biyolojik örneklerin çoğunun oldukça kompleks karışımlar olması ve bu tür karışımlarda yer alan biyomoleküllerin RPC kolon materyaline adsorblanmaları da oldukça değişkenlik göstermesi nedeniyle, iyi bir çözünürlüğün sağlanabilmesi için gradient elüsyonu gerekmektedir. Biyomoleküllerin adsorbsiyon affinitelerindeki bu çeşitlilik nedeni ile kolon materyaline adsorblanan moleküllerin tamamının kolondan elüe edilmesini garantilemek amacı ile elüsyonda kullanılan hareketli fazın elüsyon gücünün aralığı, oldukça geniş olmak zorundadır. Bu koşullar altında, özellikle gradient eğiminin normal olduğu koşullardan dik olduğu koşullara kadar, çözünürlük üzerinde kolon uzunluğunun kritik bir etkisi bulunmamaktadır. 10.5.2. Hareketli Fazın Akış Oranı

Küçük peptidler ve proteinlerin parçalanması sonucu oluşan ürünler de dahil olmak üzere, küçük moleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında, hareketli fazın akış oranının çözünürlüğü oldukça etkileyebileceği tahmin edilebilir. Buna rağmen, proteinler ve rekombinant peptidler gibi daha büyük biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında, hareketli fazın akış oranının çözünürlüğü etkilemediği görülmektedir. Gerçekte ise uzun kolonlar için tipik olarak kullanılan düşük akış oranı, belki de çözünürlüğü gerçekten düşürmektedir. Çünkü, büyük moleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında hareketli fazın akış oranının düşük olması, moleküllerin düşey diffüzyonunu artırmakta, bu da çözünürlüğü azaltmaktadır. Analitik deneylerde olmamasına rağmen, büyük-ölçekli preparatif RPC uygulamalarında, örnek materyalinin kolona yüklenmesi sırasında kullanılan akış oranı oldukça önemlidir. Çünkü kolon materyalinin dinamik bağlama kapasitesi, örnek materyalinin kolona yüklendiği akış oranına bağlı olarak değişecektir. Bir saflaştırma prosedüründe ölçek büyütülürken, örnek materyalinin kolona yüklenmesi sırasında olması gereken optimum akış oranını belirlemek için kolon materyalinin dinamik bağlama kapasitesi de tanımlanmalıdır. Dinamik bağlama kapasitesi ise kullanılan kolon materyalinin bir özelliği olup, kolon materyalinin biyomolekülleri bağlama prosesinin kinetiğini yansıtmaktadır. Bu adımın verimliliği, büyük-ölçekli preparatif bir saflaştırma prosedürünün sonuçları için oldukça önemlidir. 10.5.3. Kromatografik İşlemin Gerçekleştirildiği Sıcaklık

Özellikle kısa peptidler ve oligonükleotidler gibi düşük moleküler kütleli moleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında, sıcaklığın çözünürlük üzerine olan etkisi oldukça büyüktür. Kolon sıcaklığının yükseltilmesi ile birlikte, RPC’de kullanılan hareketli fazın viskozitesi düşmektedir. Saflaştırılacak olan moleküllerin hareketli faz ile durgun faz arasındaki kütle geçişi ise diffüzyonkontrollü bir prosestir. Bu nedenle, hareketli fazın viskozitesinin düşmesi genel olarak kütle geçişinin daha etkili olmasına yol açar ve buna bağlı olarak da çözünürlük artar. RPC kolonunun sıcaklığının artırılması, küçük kütleli moleküllerin yükseltilmiş sıcaklıklarda kararlı olmaları nedeni ile bu moleküllerin saflaştırma çözünürlüğünü de artırmaktadır.

226

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

10.5.4. Hareketli Fazın Kompozisyonu

Birçok durumda, RPC’de kullanılan hareketli faz yerine tampon terimi kullanılmaktadır. Buna rağmen, RPC’de kullanılan hareketli fazların genellikle düşük pH’daki kuvvetli asitlerle birlikte organik çözücülerin yüksek derişimlerini içermesi nedeniyle, hareketli faz solüsyonunun tamponlama kapasitesi oldukça düşüktür. Fizyolojik koşullara yakın çalışıldığı durumlarda ise yeterli tamponlama kapasitesi korunmalıdır. i. Organik çözücü: Organik çözücü (modifikatör), sulu hareketli fazın polaritesini düşürmek amacıyla bu faza eklenmektedir. RPC’de hareketli fazın polaritesinin düşürülmesi, bunun elüsyon kuvvetini yükseltir. RPC’de oldukça değişik çeşitlilikteki organik çözücüler kullanılabilmesine rağmen, patikte ise bu organik çözücülerden sadece birkaç tanesi rutin olarak kullanılmaktadır. En çok kullanılan organik çözücülerden iki tanesi ise asetonitril ve metanoldür. İsopropanol (2propanol) da kuvvetli elüsyon özellikleri nedeni ile kullanılabilir. Fakat bu çözücünün kullanımı, yüksek viskozitesinden dolayı kolon verimliğini düşürmesinden ve geri-basıncı artırmasından dolayı sınırlıdır. Asetonitril ve metanolün her ikisinin de viskozitesi ise isopropanolün viskozitesinden düşüktür (bkz. Tablo 10.1).

Bu organik çözücülerin her üçü de aslında UV ışınını geçirir. Bu özellik ise RPC kolonundan biyomoleküllerin elüsyonu esnasında genellikle UV detektörlerin kullanılması nedeni ile gerekli bir özelliktir. RPC ile peptidlerin saflaştırılmasında ise neredeyse her zaman asetonitril kullanılmaktadır. Peptidlerin çoğu UV spektrumunun sadece düşük dalga boylarını absorblarlar (tipik olarak 225 nm’den düşük). Asetonitril ise düşük dalga boylarında, yaygın olarak kullanılan diğer çözücülerin çoğuna göre daha düşük bir temel absorbans çizgisi sağlar. Herhangi bir biyomolekül için alıkonma veya kapasite faktörü (k), hareketli fazın polaritesinin bir fonksiyonudur. Biyomoleküllerin kolondan elüsyon sırası ise organik modifikatörün tipinin değiştirilmesi veya hareketli faza iyon-eşleştirme ajanlarının katılması ile değiştirilebilir. Elüsyon sırasındaki değişiklik ise organik çözücüler içerisinde denatüre olan proteinler için çok daha belirgindir. Proteinin denatürasyonu ise onun hidrofobisitesinde bir değişiklikle sonuçlanabilmektedir. ii. İyon baskılama: Peptidlerin ve proteinlerin iyonlaşabilen gruplar içermeleri nedeni ile bu biyomoleküllerin RPC kolonunda tutulması (alıkonması), hareketli faz pH’sı ile modifiye edilebilir. Bu moleküllerin iyonlaşma dereceleri ise hareketli fazın pH’sına bağlı olacaktır. RPC’de kullanılan silika-temelli kolon materyallerinin kararlılık özellikleri ise hareketli fazın pH değerinin 7,5’in altında olmasını zorunlu kılmaktadır. Peptid ve proteinlerin amino grupları ise pH 7,5’in altında yüklü hale gelmektedir. Buna rağmen, karboksilik asit grupları ise pH’nın düşmesi ile birlikte nötralize olmaktadırlar. RPC’de kullanılan hareketli faz ise genellikle trifloroasetik asit (TFA) veya ortofosforik asit gibi kuvvetli asitlerle hazırlanır. Hareketli fazdaki bu asitler ise düşük bir pH çevresinin oluşmasını ve bu çevrenin korunmasını sağlayarak, biyomoleküllerin asidik gruplarının iyonlaşmasını baskılamaktadırlar. Hareketli faz içerisindeki kuvvetli asitlerin derişimleri değiştirilerek biyomoleküllerin iyonlaşma, bunun sonucu olarak da kolonda alıkonma davranışları değiştirilebilir.

RPC’de iyon baskılamanın en büyük yararı, silika jel yüzeyinde kalan ve iyonlaşabilen silanol grupları nedeni ile meydana gelen karışık-tarzdaki alıkonma etkisinin ortadan kaldırılmasıdır. Karışık-tarzdaki alıkonma etkisinin belirtileri ise biyomoleküllerin kolonda kalma sürelerinin uzaması ve belirgin bir pik genişlemesi şeklinde gözlenir (Şekil 10.7). Karışık-tarzdaki alıkonma, silika yüzeyinde bulunan negatif yüklü silanol grupları ile biyomoleküllerin pozitif olarak yüklenen amino grupları arasındaki iyon değiş-tokuş etkileşiminden kaynaklanmaktadır. Silika-temelli RPC kolon materyallerinin yüzeyindeki silanol gruplarının ise iki temel kaynağı bulunmaktadır. Bunlardan

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

227

birincisi, jelin üretilmesi sırasında yetersiz bir son-başlıklama işleminin yapılmış olmasından kaynaklanmaktadır (bkz. kısım 10.3.2). Bu nedenle, RPC kolon materyalleri seçilirken karışıktarzdaki alıkonma etkisi oldukça düşük olan jellerin seçilmesi oldukça önemlidir. Silika yüzeyindeki iyonlaşabilen serbest silanol gruplarının ikinci nedeni ise kolon materyalinin eskimesidir. Silika jelin yüzeyi, kolon kullanıldığı sürece devamlı olarak aşınmakta ve bunun sonucunda da serbest silanol gruplarının ortaya çıkmasına yol açarak, kademeli olarak kolon performansının bozulmasına yol açmaktadır. Kolonun uzun süre sulu solüsyonlara maruz bırakılması ise kolonun eskimesini hızlandırmaktadır.

Şekil 10.7: Karışık-tarzdaki alıkonma davranışının tipik etkileri. Pik genişlemekte ve yamulmakta, elüsyon zamanı ise uzamaktadır.

RPC’de kullanılan tipik hareketli fazların düşük pH çevresi (genellikle pH 3,0’dan az) ise silika jelin yüzeyinde bulunan serbest silanol gruplarının iyonlaşmasını baskılamakta ve bunun sonucu olarak da karışık-tarz alıkonma etkisi ortadan kalkmaktadır. RPC’de kullanılan kolon materyallerinin polistiren-temelli veya diğer sentetik organik polimerler olması durumunda ise iyon baskılama gerekli değildir. Polistiren-temelli kolon materyalleri pH 1-12 aralığında kararlıdır ve hareketli fazın pH değerinin yüksek olduğu durumlarda, silika jellerde olduğu gibi karışık-tarz alıkonma etkisi göstermezler. iii. İyon-eşleştirme ajanları: Proteinler, peptidler ve oligonükleotidler gibi biyomoleküllerin alıkonma zamanları, hareketli faz içerisine iyon-eşleştirme ajanlarının eklenmesi ile değiştirilebilir. İyon-eşleştirme ajanları ise iyonik etkileşimler ile biyomoleküllere bağlanarak, bağlandıkları biyomoleküllerin hidrofobisitesinde değişikliğe yol açarlar. RPC’de kullanılan iyon-eşleştirme ajanlarının örnekleri ise kısım 10.6.2.3’de verilmektedir.

Saflaştırılacak olan hedef biyomoleküllerin iyonik karakterlerine ve hareketli fazın pH’sına bağlı olarak, hem anyonik hem de katyonik iyon-eşleştirme ajanları kullanılabilir (Şekil 10.8). Örneğin, peptidlerin saflaştırılması sırasında hareketli fazın pH değerinin 3,5’den az olduğu durumda, tipik olarak kullanılan iyon-eşleştirme ajanı trifloroasetik asittir. Nötral veya daha yüksek pH değerlerinde negatif bir yük taşıyan oligonükleotidler için ise tipik olarak kullanılan iyoneşleştirme ajanı trietilamindir.

228

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 10.8: İyon-eşleştirme ajanları ile (a) anyonik veya (b) katyonik iyon-çifti oluşumu. M, kolon materyali.

Bazı durumlarda ise biyomoleküllerin RPC materyaline bağlanması için hareketli faz içerisine iyon-eşleştirme ajanlarının katılması bir zorunluluktur. Örneğin, tritil gibi bir koruyucu grubun eklenmediği korumasız sentetik oligonükleotidlerin kolonda alıkonması için, hareketli faza trietilamin eklenmelidir. Trifloroasetik asit gibi uygun bir iyon-eşleştirme ajanının bulunmadığı durumlarda, kolon materyaline bağlanmanın ihmal edilebilir düzeyde olduğu hidrofilik peptidler için de aynı durum söz konusudur. Hareketli faz içerisindeki iyon-eşleştirme ajanının derişimi ise genellikle %0,1 ile %0,3 arasındadır. Hareketli faz içerisinde iyon-eşleştirme ajanlarının bulunmasından kaynaklanan potansiyel problemler ise iyon-eşleştirici ajanlar tarafından UV ışınının absorblanması ve organik modifikatör derişimi ile ekstinksiyon katsayısının değişmesidir. Bu problemler ise gradient elüsyonu esnasında, temel-çizginin ya yükselmesine ya da düşmesine neden olur. 10.5.5. Gradient Elüsyonu

Biyomoleküllerin preparatif RPC ile saflaştırılması sırasında kullanılan elüsyon metodu, gradient elüsyonudur. Proteinlerin ve peptidlerin preparatif RPC kolonundan elüsyonu için tipik olarak uygulanan gradient elüsyonu ise lineer ve ikili (örneğin, iki hareketli fazın kullanılması) elüsyondur. Gradient uygulamasının ya başlangıcında ya da sonunda fazladan çözünürlük gerektiren (özellikle çok-bileşenli örnek materyallerinin analizlerinin yapıldığı) analitik uygulamalarda ise ara sıra konveks ve konkav gradient elüsyonları da kullanılmaktadır (bkz. kısım 3.9 ve Şekil 3.10,c). Başlangıç hareketli fazındaki (tampon-A) organik çözücülerin derişimi ise son hareketli fazındakinden (tampon-B) daha düşüktür. Gradient ise organik modifikatörün yüzdesinde meydana gelen tam değişikliğinden bağımsız olarak, her zaman yüksek polariteden (su içeriği yüksek, organik modifikatör derişimi düşük) düşük polariteye doğru (su içeriği düşük, organik modifikatör derişimi yüksek) gelişmektedir. RPC’de gradient şekli (lineer gradient ve izokratik koşulların kombinasyonu), gradient eğimi ve gradient hacmi göz önünde bulundurulması gereken önemli parametrelerdir. Tipik olarak, kompleks örnek materyallerinin saflaştırılmasında RPC ilk defa kullanıldığında, optimum gradient şeklini tespit etmek amacıyla, başlangıç taramasında geniş bir gradient kullanılır. Başlangıç taraması tamamlandıktan sonra, hedef biyomoleküllerin saflaştırılması için gradient şeklinin optimizasyonu yapılabilir. Bu ise genellikle hedef biyomoleküllerin elüe edildiği bölgede gradient eğiminin düşürülmesi; bu bölgeden önce ve sonra ise gradient eğiminin yükseltilmesi ile sağlanır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

229

Gradient eğiminin seçimi ise kirletici moleküllerin elüsyonunun, hedef moleküllerin elüsyonuna ne kadar yakın olarak gerçekleştiğine bağlı olarak değişecektir. Genel olarak, gradient eğiminin düşürülmesi çözünürlüğü artırmaktadır. Buna rağmen, gradient eğiminin azalması, pik hacminin ve alıkonma zamanının artmasına yol açmaktadır. Kısa kolonlara uygulanan sığ gradient eğimi ise yüksek moleküler kütleye sahip olan biyomoleküller için genellikle optimaldır. Gradient eğimi ise genellikle, birim zamanda (% Tampon-B/dk) veya birim hacimde (% Tampon-B/mL) tampon-B’nin yüzde değişimi olarak tanımlanmaktadır. Bir kromatografi sisteminin programlanması zaman modunda yapıldığında, akış oranındaki değişikliklerin gradient eğimini ve bunun sonucu olarak da çözünürlüğü etkileyeceğini unutmamak gerekmektedir. Çözünürlük, aynı zamanda toplam gradient hacminden de (gradient zamanı x akış oranı) etkilenmektedir. Optimal değerlerin belirlenmesi deneysel olarak tanımlanmak zorunda olsa da, RPC’de birinci kural, kolon hacminin yaklaşık olarak 10-20 misli bir gradient hacmi ile elüsyona başlanmasıdır. Daha sonra ise çözünürlüğün optimize edilmesi amacıyla, gradient eğimi yükseltilebilir veya düşürülebilir. 10.5.6. RPC’nin Kullanım Amacı 10.5.6.1. Tuz Giderimi

Örnek materyallerinden tuzların giderilmesi, büyük moleküler kütleye sahip hedef moleküllerinden küçük moleküler kütleye sahip olan kirleticilerin ayrıştırılması amacıyla uygulanan rutin bir laboratuvar işlemidir. Bu işlem ise bazen tampon değiştirme olarak da adlandırılmaktadır. Tampon değiştirme amacıyla uygulanan ve kromatografik olmayan tekniklerin başında ise ultrafiltrasyon (bkz. kısım 1.7.2) ve diyaliz (bkz. kısım 1.7.5) yöntemleri gelmektedir. Tuz giderme işlemleri genellikle, iyon değiş-tokuş kromatografisi gibi diğer metotlarla elde edilmiş olan fraksiyonlardan tuzların giderilerek, örnek materyalinin hazırlanması amacıyla uygulanmaktadır. Jel filtrasyon kromatografisi ile protein ve nükleik asit örneklerinden tuzların giderilmesi için Sephadex G-25; küçük peptid örneklerinden tuzların giderilmesi için ise Sephadex G-10 yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz. kısım 1.7.4 ve kısım 5.6.2.1. Preparatif metotlar). Jel filtrasyon kromatografisi, kullanım kolaylığı ve biyomoleküllerin kararlılığını koruması nedeni ile örnek materyallerinden tuzların uzaklaştırılması amacıyla kullanılan önemli bir teknik olmasına rağmen, örnek materyalinin seyrelmesine yol açmaktadır. Proteinlerden, peptidlerden ve oligonükleotidlerden oluşan örnek materyallerindeki tuzların giderilmesi ise RPC ile güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Örnek materyallerinden tuzların giderilmesi amacıyla RPC tekniğinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin gerikazanılması sağlanmakta ve örnek hacmi küçük tutulabilmektedir. Böylece, tuz giderimi amacı ile jel filtrasyon kromatografisinin kullanılması durumunda ortaya çıkan örnek materyalinin seyrelmesi, RPC tekniğinde ortadan kalkmaktadır (Şekil 10.9). Örnek materyali, küçük bir RPC kolonundan geçirildiğinde örnek materyali içinde bulunan biyomoleküller kolon materyalinin yüzeyine bağlanırlar ve orada yoğunlaşırlar. RPC, GFC’den farklı olarak, bir adsorbsiyon tekniğidir ve örnek materyalinin hacmi sınırlayıcı bir faktör değildir. Bu nedenle RPC kolonları, örnek materyallerindeki tuzların giderilmesini sağlamanın yanı sıra, seyreltik olan büyük hacimli örnek materyallerinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır. Örnek materyalinin tamamı RPC kolonuna yüklendikten sonra, kolon materyaline bağlanmış olan biyomoleküllerin elüsyonu ise küçük hacimdeki, asetonitril gibi düşük polariteli bir hareketli faz ile gerçekleştirilir. Şayet elüsyon işleminde kullanılan çözücü, asetonitril gibi uçucu bir özelliğe sahipse, bu çözücü buharlaştırılır ve geriye kalan örnek materyali istenilen hacimdeki yeni tampon içinde çözündürülür.

230

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 10.9: (a) GFC ve (b) RPC ile örnek materyallerinden tuz giderimi. GFC’de büyük olan moleküllerin elüsyonu önce olmaktadır; tuzların elüsyonu için ise hareketli fazın değiştirilmesine gerek yoktur. RPC’de ise tuzların elüsyonu önce gerçekleşmektedir; kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin ve diğer moleküllerin elüsyonu ise daha-düşük polariteli bir hareketli fazın kullanılmasını gerektirir (Anonymous, 1999).

10.5.6.2. Yüksek Çözünürlüklü Saflaştırma

RPC, tipik olarak yüksek çözünürlük sağlayan bir kromatografi tekniği olarak kullanılabilmektedir. Buna rağmen, bazı uygulamalar RPC’nin sağladığı çözünürlük gücünü, bu tekniğin limitlerine doğru itmektedir. Bu gibi durumlar ise preparatif uygulamaların ara basamaklarında veya kompleks bir karışımdan yapısal olarak benzer moleküllerin saflaştırılması sırasında görülmektedir. Örneğin, enzimatik parçalamalar sonucunda meydana gelen özgül peptidlerin saflaştırılması veya oligonükleotid kirleticilerin çok olduğu kompleks bir karışımdan bazı oligonükleotidlerin saflaştırılması, bu gibi durumlara verilebilecek en iyi örneklerdir. Böyle durumlarda, oldukça fazla sayıdaki piklerin birbirinden ayrılmalarının sağlanması zorunlu olduğu gibi, daha sonraki analizler için yeterli miktarda örneğin geri-kazanılması da zorunludur. Tipik olarak, partikül büyüklükleri oldukça küçük olan 3 μm ve 5 μm çapındaki RPC kolon materyallerinin kullanılmasının yanı sıra, kromatografik işlemin gerçekleştirildiği sıcaklık, gradient eğimi ve hareketli faz kompozisyonu gibi detayların da itinalı bir şekilde dikkate alınması gerekmektedir. Kısa oligonükleotidler, parçalanmış protein parçacıkları (fragmentleri) ve kısa peptidler gibi saflaştırılacak olan biyomoleküllerin moleküler kütleleri çok daha küçük olduğunda ise çözünürlüğün en yüksek düzeye sağlanabilmesi için hareketli fazın akış oranı ve kolon uzunluğu gibi diğer faktörlerin de optimizasyonu gerekmektedir. 10.5.6.3. Büyük-Ölçekli Preparatif Saflaştırma

Sentetik oligonükleotidler, rekombinant peptidler ve proteinler gibi biyomoleküllerin RPC ile büyük-ölçekli olarak saflaştırılması, hem yüksek çözünürlüklü ayrıştırmanın sağlanmasını hem de saflaştırma protokolünün ölçeğinin büyütülebilmesini gerektirmektedir. Bu gibi durumlarda, küçük partiküllü bir RPC kolon materyalinin kullanılması ve daha sonra da benzer bir seçiciliğe sahip olan, fakat daha büyük bir partikül çapına sahip olan kolon materyalinin kullanılması ile saflaştırma protokolü optimize edilerek, ölçek büyütülür. RPC’de saflaştırma ölçeğinin büyütülmesinde kullanılan teknikler, iyon değiş-tokuş kromatografisinde olduğu gibi diğer kromatografik yöntemlerdeki ölçek-büyütme tekniklerine benzemektedir. 10.5.6.4. Saflaştırma İşleminin Basamakları

İster mikrobiyal, kimyasal veya doğal olsun isterse diğer kaynaklardan olsun, biyomoleküllerin kaynağı belirlendikten ve yeterli miktarda ham örnek materyali elde edildikten

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

231

sonra, hedef moleküllerinin ham örnek materyali içinde bulunan diğer kirleticilerden saflaştırılması gerekmektedir. Ham bir örnek materyalinden veya özütten (ekstrakttan) bir biyomolekülün saflaştırılabilmesi için, aslında üç temel fonksiyonel basamak bulunmaktadır. Bu basamaklar ise elde etme, ara saflaştırma ve cilalama olarak adlandırılır (Şekil 10.10). RPC de dahil olmak üzere saflaştırma protokolünün herhangi bir basamağında, herhangi bir saflaştırma tekniğinin uygunluğu, her zaman saflaştırılacak olan biyomolekülün özelliğine, hedef biyomolekülün saflaştırılması esnasında karşılaşılan özgül problemlere ve saflaştırılmış olan ürünün hedeflenen kullanım alanına bağlıdır. Başlangıç örnek materyali Gereksinim Doğrudan yükleme Ham örnek yükleme toleransı Yerinde temizleme

Saflaştırma Basamağı Elde etme

Ara Saflaştırma

Çözünürlük Tekrarlanabilirlik Yerinde temizleme

Cilalama Saf ürün

Şekil 10.10: Saflaştırma protokolünün basamakları.

i. Elde etme: Saflaştırma protokolünün ilk adımını, hedef biyomoleküllerin de içinde bulunduğu ham örnek materyalinin elde edilmesi oluşturmaktadır (bkz. kısım 1.6). Bu basamakta, örnek materyalinin hacmi genellikle çok büyük olmakta, katı partiküller veya viskoz materyaller içerebilmektedir. Elde etme basamağının amacı ise ham örnek materyali içerisinde bulunan hedef biyomoleküllerin iyi bir şekilde geri-kazanımını sağlamakla birlikte, hızlı bir şekilde bu moleküllerin izolasyonunu, derişimini ve kararlılığını sağlamaktır (Şekil 10.11).

Elde etme basamağının iyi bir çözünürlük sağlaması beklenemez; fakat yine de hedef biyomolekülleri, bu moleküllerden farklı özelliklere sahip olan kirletici moleküllerden izole etmesi istenir. Bu nedenle elde etme basamağı, yüksek çözünürlüklü bir saflaştırma basamağı olmaktan ziyade, grup ayrıştırmanın gerçekleştirildiği bir basamak olarak değerlendirilir. Sonuç olarak, başarılı bir elde etme basamağında zaman, kapasite ve geri-kazanım ise çözünürlükten çok daha önemlidir. RPC, sentetik peptidlerin ve sentetik oligonükleotidlerin elde edilmesi için uygun bir metot olarak kullanılabilmektedir. Buna rağmen, biyolojik kaynaklardan peptidlerin ve proteinlerin elde edilmesi için ise RPC çok daha az uygun bir metottur. Bunun nedeni ise biyolojik kaynaklardan elde edilen örnek materyalleri içersinde lipitlerin ve kuvvetli hidrofobik olan diğer moleküllerin de bulunmasıdır. Lipitler ve kuvvetli hidrofobik olan diğer moleküller ise RPC kolon materyaline oldukça sıkı olarak bağlandıklarından, hem kolon materyalinden uzaklaştırılmaları zordur hem de hedef moleküller için var olan dinamik bağlama kapasitesinin azalmasına neden olurlar. Buna ilaveten, küçük partiküllü RPC kolon materyallerinin çoğunun verimli bir şekilde kullanılabilmesi için kolonun tıkanmasını önlemek amacıyla, örnek materyali içerisindeki katı partiküllerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Böyle durumlarda ise hedef moleküllerinin elde edilmesi amacıyla, kolon materyallerinin partikül çaplarının 90 μm’den büyük olduğu IEC ya da HIC’nin kullanılması çok daha uygun olmaktadır.

232

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 10.11: Elde etme esnasındaki basamaklar.

ii. Ara saflaştırma basamağı: Ara saflaştırma basamağında hedef moleküllerin, örnek materyali içerisinde bulunan diğer proteinler, peptidler, nükleik asitler, endotoksinler ve virüsler gibi kirleticilerin çoğundan ayrıştırılmasına odaklanılmaktadır. Bu basamakta, kirletici moleküller ile hedef moleküller çoğunlukla yapısal ve fonksiyonel özellikleri açısından birbirlerine çok benzediklerinden, kullanılan saflaştırma tekniklerinin birbirine benzer olan molekülleri ayırt edebilme yeteneği oldukça önem kazanmaktadır. Bu basamakta en önemli faktörleri ise gerikazanım ve çözünürlük oluşturmaktadır. RPC ise yüksek çözünürlüğün elde edilebilmesini sağlayabilecek bir teknik olması nedeni ile saflaştırma protokolünün ara saflaştırma basmağında kullanılabilecek uygun bir kromatografik yöntem olmaktadır. iii. Cilalama: Saf bir ürünün hazırlanmasının son adımını ise cilalama oluşturmaktadır. Cilalama adımında, elde edilen saf ürün içerisinde buluna eser miktardaki kirleticiler uzaklaştırılmaktadır. Saflaştırılmış olan biyomolekül, bu ürünün kullanılacağı amaca uygun formda olmalıdır. Cilalama aşamasında bulunan kirletici moleküller çoğunlukla hedef moleküle oldukça benzemektedirler. Tipik olarak bulunan kirleticiler ise hedef biyomolekülün “dönüşümleri” ve yapısal varyantlardırlar. Yapısal varyantlar ise dimerleri, oligomerleri, agregatları, oksitlenmiş amino asitleri, proteaz tarafından kırpılmış molekülleri, deamine amino asitleri ve benzer molekülleri içermektedir. Bunların yanı sıra, saflaştırılmış olan ürün içerisinde mikro düzeyde başka moleküller de bulunabilir. Özel işleme tâbi tutulan uygulamalarda cilalama, aynı zamanda eser miktarda bulunan endotoksinlerin, virüslerin ve filtre ile tutulabilen diğer materyallerin de uzaklaştırılmasını sağlamaktadır.

Cilalama aşamasının amacı, iki adımdan az bir işlemle %99’dan fazla bir geri-kazanım ile %100 homojen saflıkta son-ürünün elde edilmesidir. Cilalama işlemi, özellikle dimerlerin ve agregatların uzaklaştırılması gerektiği durumlarda, jel filtrasyon kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Buna rağmen, hedef molekülün çok küçük varyantlarının ve mikro düzeydeki diğer moleküllerin uzaklaştırılması gerektiği durumlarda ise mükemmel bir çözünürlük sağlayan RPC tekniğinin kullanılması çok daha uygun olmaktadır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

233

10.6. RPC’nin Gerçekleştirilmesi

Takip eden alt-kısımlarda ise RPC’nin planlanması ve uygulanması için gerekli olan uygun durgun fazın, hareketli fazın ve gradient koşullarının seçilmesi gibi basamaklar üzerinde durulmaktadır. Ayrıca bu kısımlarda, örnek materyalinin hazırlanmasına, organik çözücülerin kullanılması esnasında dikkat edilmesi gereken hususlara ve potansiyel tehlikelere de değinilmektedir. 10.6.1. Kolon Materyalinin Seçimi

Herhangi bir biyomolekülün RPC ile başarılı bir şekilde saflaştırılabilmesi için uygun bir kolon materyalinin seçilmesi oldukça önemlidir. Bu nedenle, bir kolon materyalinin seçimi esnasında göz önünde bulundurulması gereken bazı kriterler bulunmaktadır. Bu kriterler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Uygulama ölçeği ve hareketli faz koşulları da dahil olmak üzere, uygulamanın gereksinimleri. ii. Örnek materyal bileşenlerinin moleküler kütleleri veya büyüklükleri. iii. Örnek materyal bileşenlerinin hidrofobisiteleri. iv. Örnek materyal bileşenlerinin sınıfı. 10.6.1.1. Uygulamanın Gereksinimleri i. Çözünürlük: Bir saflaştırma işleminde seçilecek olan kolon materyali, arzu edilen saflığın elde edilmesini sağlayacak özellikte olmalıdır. Peptid haritalamasında olduğu gibi, çok-bileşenli örnek materyallerinin fraksiyonlanmasının gerekli olduğu uygulamalar ise oldukça yüksek çözünürlüklere gereksinim duymaktadırlar. Sentetik peptidlerin saflaştırılması gibi preparatif RPC uygulamalarında ise örnek materyalinin üretim aşamasından doğrudan doğruya kolona yüklenmesi (üretimden-yükleme) söz konusu olduğu için, bu gibi durumlarda çözünürlükten ziyade, prosesin hızı ve kapasitesi önem kazanmaktadır.

RPC’de çözünürlük, hem kolonun seçiciliğine hem de verimliliğine bağlıdır. Özgül bir saflaştırma işlemi için ise seçicilik, tutuklanmış olan hidrofobik ligandın doğasına, silika matriksin türevlendirilmesinde kullanılan kimyasal işleme ve hareketli fazın kompozisyonu gibi kullanılan kromatografik koşullara bağlıdır. Bir RPC kolonunun maksimum verimliliği ise kolonun paketlenmesinde kullanılan prosese (bkz. kısım 3.5 ve kısım 4.6) ve kolon materyalinin partikül büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, partikül çapı en küçük olan kolon materyallerinin (örneğin, partikül çapı 3 μm olan μRPC C2/C18 gibi) verimlilikleri en yüksek olurken, partikül çapları büyüdükçe (örneğin, Sephasil Protein 12 μm; SOURCE 15RPC ve SOURCE 30 RPC) kolon materyallerin verimlilikleri de düşmektedir. ii. Saflaştırma ölçeği: Mikro-ölçekli saflaştırma için 3 μm veya 5 μm partikül çapına sahip olan kolon materyalleri (örneğin, μRPC C2/C18) ile paketlenmiş olan dar-çaplı kolonlar veya Sephasil C8 ve Sephasil C18 gibi SMART kolonlar kullanılmalıdır. Laboratuvar-ölçekli tipik saflaştırma işlemlerinde ise 5 μm partikül çapına sahip kolon materyalleri seçilebilir. Özellikle ham örnek materyallerinin doğrudan doğruya kolona yüklenmesi gerektiği durumlarda, şayet başarılı bir saflaştırma için yüksek bir pH veya silikaya alternatif bir seçicilik gerekiyorsa, 12 μm partikül çapına sahip veya SOURCE 15RPC gibi kolon materyallerinin kullanılması çok daha uygun olabilir.

Pilot- ve endüstriyel-ölçekli uygulamalar için ise her zaman daha büyük partikül çapına sahip olan kolon materyalleri seçilmelidir. Bu tip uygulamalar için ölçek-büyütme çalışmaları yapılırken, bu kolon materyallerinin eşdeğerleri olan ve daha küçük partikül çapına sahip olan kolon

234

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

materyalleri kullanılır. Örneğin, önceden paketlenmiş olan RESOURCE RPC kolonlarının seçiciliği, SOURCE 30RPC kolon materyalinin seçiciliğine benzerdir. iii. Hareketli faz koşulları: RPC matriksinin seçimi, kromatografide kullanılacak hareketli fazın kompozisyonuna da bağlılık göstermektedir. Şayet örnek materyali içerisinde bulunan biyomoleküllerin çözünürlüğü ya da kararlılığı, özgül bir çözücü sisteminin kullanılmasını gerektiriyorsa, bu durumda kullanılacak olan kolon materyalinin bu çözücü sistem içerisindeki kararlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, RPC sisteminde kullanılacak olan hareketli fazın pH değeri 7,5’in üzerinde olacaksa, bu durumda SOURCE RPC gibi polistiren-temelli matriksler kullanılmalıdır (bkz. kısım 10.3.1). iv. Üretimden-yükleme ve ölçekleme: Belirli bir zamanda işlenebilen örnek materyalinin miktarı (örneğin, üretimden-yükleme), kapasite, akış özellikleri ve kolon materyalinin paketlenmiş olduğu kolonun ölçüsü gibi özellikler ile tanımlanmaktadır. Büyük-ölçekli preparatif kromatografi uygulamalarında, üretimden-yükleme amacıyla SOURCE 15RPC, SOURCE 30RPC, Sephasil Protein 12 μm ve Sephasil Peptide 12 μm gibi kolon materyalleri ise HPLC koşulları için optimize edilmiş olup, kolaylıkla ölçek-büyütmeye izin vermektedirler. 10.6.1.2. Örnek Bileşenlerinin Moleküler Kütleleri

Örnek materyalini oluşturan komponentlerin tutuklanmış olan hidrofobik ligandlara erişebilirliği, özgül bir biyomolekül için RPC kolon materyalinin kullanılabilir kapasitesini belirlemektedir. Erişilebilirlik ise büyük ölçüde, kolon materyalini oluşturan boncukların gözenek büyüklüklerine ve hacimlerine bağlıdır. Moleküler kütleleri büyük olan biyomoleküllerin saflaştırılmak istendiği durumlarda, gözenek büyüklükleri iri olan RPC kolon materyalleri tipik olarak, gözenek büyüklükleri daha küçük olan RPC kolon materyallerine göre çok daha iyi bir kapasite ve çözünürlük sağlarlar. Genel olarak, proteinlerin saflaştırılması amacıyla gözenek büyüklükleri 30 nm veya daha büyük olan RPC kolon materyalleri önerilmektedir. Peptidlerin ve oligonükleotidlerin saflaştırılması için ise gözenek büyüklükleri 30 nm’den küçük olan RPC kolon materyalleri önerilmektedir. 10.6.1.3. Örnek Bileşenlerinin Hidrofobisiteleri

IEC ve GFC gibi diğer kromatografi tekniklerinden farklı olarak, RPC’de bir biyomolekülün alıkonma zamanının tahmin etmek, şayet imkansız değilse, oldukça güçtür. Standart peptidlerin çalışılması ile hidrofobisite faktörlerine bağlı olarak alıkonma zamanının tahmin edilmesine yönelik teşebbüsler ise birkaç çalışmanın konusunu oluşturmuştur. Sakamoto ve ark. (1988) tarafından gerçekleştirilen bu çalışmalardan birisi, bir algoritma sağlamaktadır. Bu algoritma ise proteolitik parçalanmaya tâbi tutulan protein örneklerinin alıkonma davranışları ile oldukça benzer bir mimikri göstermektedir. Bu türdeki çalışmalar ise genel olarak, bağlanma prosesinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Bir peptidin alıkonma zamanını etkileyen önemli parametrelerin ise peptidin amino asit dizisi ile birlikte, peptidin sahip olabileceği α-heliks ve β-plakalı tabaka gibi herhangi bir sekonder yapının kombinasyonu olduğu görülmektedir. Proteinler için ise üçüncül yapılarından dolayı, durum çok daha karmaşık hale gelmektedir. Bu nedenle, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin doğasına bağlı olarak, RPC kolon materyalinin seçimi deneysel olarak yapılmak zorundadır. Çözünürlük hakkında ise örnek materyalinin tutuklanmış olan liganda göre, göreceli hidrofobisitesinden yararlanılarak (örneğin, örnek materyalinin hidrofobisitesi yüksek, tutuklanmış olan ligandların hidrofobisitesi ise daha düşük) bazı tahminler yapılabilir. Dolayısıyla, çok daha hidrofobik olan biyomoleküllerin preparatif saflaştırmasında, C18 yerine C8 ligandına sahip olan bir kolon materyalinin kullanılması önerilmektedir.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

235

RPC matriksinin seçimini, hareketli fazın kompozisyonu da etkileyebilir. RPC’de kullanılacak olan hareketli fazın pH değerinin 7,5’in üzerinde olması gerektiği durumlarda ise SOURCE RPC gibi polistiren-temelli bir matriks kullanılmalıdır (bkz. kısım 10.3.1). Örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin kararlılığını korumak amacıyla, özgül bir çözücü sisteminin kullanılması gerektiği durumlarda ise bu çözücü sisteminde, matriksin kararlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. 10.6.1.4. Örnek Bileşenlerinin Sınıfı

RPC, birçok sınıftaki biyomoleküllerin saflaştırılması amacıyla kullanılmaktadır. RPC koşullarının genellikle oligonükleotidlerin ve peptidlerin kimyasal bütünlüğü üzerine olumsuz bir etkisinin olmaması nedeni ile proteinlerin kararlılıkları ve biyolojik aktiviteleri dikkatli bir şekilde sorgulanmalıdır. Polipeptidlerin hidrofobik yüzeylerle ve organik çözücülerle olan etkileşimleri genellikle üçüncül yapının bir miktar bozulmasına yol açar. Bir biyomolekülün üçüncül yapısının bozulması ise bu molekülün farklı bir konformosyonel yapıya sahip olması ile sonuçlanabilir ve bu farklı yapıdaki konformasyonların her birisi RPC materyali ile farklı bir şekilde etkileşim gösterebilir. İnsülin, büyüme hormonu, büyüme faktörleri ve daha birçok diğer rekombinant ve sentetik proteinlerin ve peptidlerin büyük-ölçekli olarak RPC ile sıkılıkla saflaştırılması, bu kromatografi yönteminin uygulanması esnasında meydana gelen denatürasyon problemlerinin üstesinden gelindiğine işaret etmektedir. Biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında meydana gelen yapısal bozulmalar ve bunun sonucu olarak da aktivitede meydana gelen kayıplar ise uygun muamele yöntemleri ile minimuma indirgenebilir. RPC ile saflaştırılmış olan proteinler, bu proteinlerin doğal yapılarını korudukları koşullara yeniden transfer edilerek kinetikleri geriye döndürülebilir. Bunun yanı sıra kompleks enzimler ve çok-bileşenli proteinler, küçük peptidlere veya oldukça kararlı ya da çapraz-bağlı proteinler göre, aktivitelerini daha fazla kaybetmektedirler. Buna rağmen bir protein veya peptid, birincil yapısının tanımlanması amacıyla saflaştırıldığında ise çökelme meydana gelmediği sürece, denatürasyon bir problem oluşturmamaktadır. Dolayısıyla RPC, protein ve peptidlerin amino asit dizilerinin belirlenmesi amacıyla hazırlanmasında oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. 10.6.2. Hareketli Faz Seçimi

Biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında kullanılan hareketli faz, genel olarak bir “tampon”, bir organik modifikatör ve seçiciliği etkilemek amacıyla, hareketli faza ilave edilen bir iyon-eşleştirme ajanından meydana gelmektedir. Hareketli fazı hazırlamakta kullanılan suda olduğu gibi, bütün organik çözücüler, tamponlama tuzları ve iyon-eşleştirme ajanları, kimyasal olarak oldukça yüksek saflıkta olmalı ve hiçbir metal iyonu içermemelidir. Kullanılan organik çözücülerin, tuzların ve suyun yeterli saflıkta olduğunu belirtmek amacıyla “HPLC kalitesi” ile işaretlenmiş olmalıdır. Hareketli faz içerisinde bulunabilcek herhangi bir kirletici, istenmeyen ekstra piklerin, hayalet piklerin ve saflaştırılmış olan biyomolekülleri kontamine ederek, kromatografiyi etkileyebileceğinden dolayı, preparatif RPC’de kimyasal saflık oldukça önemlidir. 10.6.2.1. Organik Çözücü

Organik çözücüler, hareketli fazın polaritesini düşürmek amacıyla bu faza ilave edilirler. Düşük pH’lı sulu bir solüsyon ile asetonitril gibi farklı polaritelere sahip olan iki çözücünün karıştırılması sonucunda, karışımı oluşturan orijinal bileşenlerin her ikisinin de polaritelerinden farklı olarak, orta polaritede bir çözücü elde edilebilir. Çözücü karışımının polaritesinin düşürülmesi ise RPC’de, bu çözücü karışımının elüsyon gücünü yükseltmektedir. RPC’de kullanılabilecek çok sayıda suya karışabilen organik çözücü bulunmaktadır, fakat pratikte ise bu organik çözücülerden

236

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

sadece birkaçı kullanılmaktadır. RPC’de yaygın olarak kullanılan organik çözücülerin bazı özellikleri ise Tablo 10.1’de verilmektedir. Tablo 10.1: RPC’de kullanılan bazı organik çözücüler. Kaynama noktası (ºC)

UV sınırı* (nm)

Viskozite (20 ºC’de cP)

Asetonitril

82

190

0,36

Etanol

78

210

1,20

Metanol

65

205

0,60

1-Propanol (n-Propanol)

98

210

2,26

Viskoz.

2-Propanol (izo-Propanol)

82

210

2,30

Viskoz.

Su

100

<190

1,00

Çözücü

Öneriler

Alkollerden daha çok denatüre edicidir. Toksiktir.

* HPLC kalitesindeki bu organik çözücülerin verilen dalga boylarındaki absorbansları yaklaşık olarak 1’dir.

Asetonitril ve metanol ise hem düşük viskoziteleri (sulu solüsyonlar ile karıştırıldığında dahi) hem de UV geçirgen olmaları nedeni ile en yaygın kullanılan organik çözücülerdir. 2-Propanol ise düşük polariteli olmasından dolayı bir avantaj sağlamaktadır ve bu nedenle de daha yüksek bir elüsyon gücüne sahiptir. 2-Propanol de UV geçirgen olup, aynı zamanda RPC kolonunun temizlenmesi için mükemmel bir çözücüdür. Buna rağmen, organik modifikatör olarak 2-propanolün kullanılması, hareketli fazın viskozitesinin artmasına yol açmaktadır. Yüksek viskoziteli hareketli faz ise hem biyomoleküllerin hareketli faz ile durgun faz arasındaki kütle transferini zayıflattığından, hem de orta şiddetteki akış oranlarından düşük şiddetteki akış oranlarına kadar geri-basıncı artırdığından dolayı arzu edilmemektedir. RPC’de kullanılacak olan organik çözücüler ise yüksek kalitede olmalıdır. Bu nedenle, RPC’de kullanılacak olan çözücülerin HPLC-kalitesinde olması ve kolonu tıkaması muhtemel olan küçük partiküllerin uzaklaştırılması amacı ile uygun filtrelerden geçirilmiş olması gerekmektedir. Bu tipteki çözücüler ise yeteri derecede kimyasal saflıkla birlikte, düşük dalga boyundaki UV ışınlarına karşı da oldukça iyi bir geçirgenlik sağlamaktadırlar. Elüsyon tamponundan kaynaklanan ve RPC kolonundan geri-kazanılmış olan biyomolekülleri içeren fraksiyonlar içerisinde bulunan organik çözücüler ise genellikle buharlaştırılarak uzaklaştırılır. Akrilik asit gibi geride kalan bazı organik kirleticiler ise biyomoleküllerin yapısal bütünlüklerine zarar verebilmektedirler. RPC uygulamalarının büyük bir çoğunluğunda, optimum belirleme (dedeksiyon) duyarlılığının sağlanması için (örneğin, proteinlerin önemli miktarlarda Trp veya Tyr içermeleri gerektiği gibi) tarama işleminin 220 nm’nin altındaki dalga boylarında yapılıyor olması nedeni ile UV geçirgenliği özellikle önemlidir. RPC’de kullanılacak olan bir organik çözücünün UV geçirgenlik sınırı ise ideal olarak 210 nm’nin altında olmalıdır. Böylece, içerisindeki organik modifikatör miktarının değiştiği gradient uygulamaları esnasında, çok daha iyi bir temel-çizgi kararlılığı sağlanacaktır. 10.6.2.2. pH

RPC ile biyomoleküllerin ayrıştırılması genellikle pH 2-4 aralığında, yani düşük pH’da gerçekleştirilmektedir (Tablo 10.2). RPC’nin düşük pH’da gerçekleştirilmesi ise hem örnek materyali içerisinde yer alan biyomoleküllerin iyi çözünmesi ile hem de bu biyomoleküllerin üzerindeki asidik grupların yanı sıra, silika matriks yüzeyindeki kalıntı silanol gruplarının da iyonik

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

237

baskılanması ile sonuçlanmaktadır. Trifloroasetik asit, heptaflorobutirik asit ve orto-fosforik asit gibi asitlerin %0,05-0,1 veya 50-100 mM derişimleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Amonyum asetat veya fosfat tuzları içeren hareketli fazlar ise pH’nın nötrale yakın olduğu durumlarda kullanılmaktadır (Tablo 10.2). Ayrıca, fosfat tamponlarının uçucu olmadığını da unutmamak gerekmektedir. Tablo 10.2: RPC’de farklı pH’larda kullanılan hareketli faz örnekleri Tampon

Yaklaşık pH

Hidroklorik asit

2-3

Fosforik asit

2-3

Trifloroasetik asit (TFA)

2-3

Trietilamonyumfosfat (TEAP)

6

Amonyum asetat

6-7

Sodyum hidroksit

12

Öneriler

Uçucu değil

Uçucu değil

Uçucu değil. Sadece organik polimer temelli durgun fazlarla

Polistiren-temelli RPC matriksleri ise (örneğin, SOURCE RPC) kromatografi işleminin, nötral pH’nın oldukça üzerindeki pH’larda da gerçekleştirilmesine izin vermektedirler. Kromatografinin daha yüksek pH değerlerinde gerçekleştirilmesi ise bazı avantajlar sağlamaktadır. Bu avantajların başlıcaları arasında ise seçicilik kontrolünün artması (Şekil 10.12), bazı durumlarda biyomoleküllerin çözünürlüklerinin artması ve aktif olan biyomoleküllerin veriminin artması sayılabilir. Bazik peptidler, düşük pH’lı RPC kolonlarından elüe edilirlerken genellikle kuyruklama gösterirler. Bu tip bazik peptidlerin çok daha iyi bir çözünürlükte saflaştırılabilmesi ise kolonun ve elüsyon koşullarının pH değerinin 8’in üzerinde olduğu durumlarda sağlanmaktadır.

Şekil 10.12: Angiotensin II ve angiotensin III’ün (a) pH 2 ve (b) pH 12’de ayrıştırılması. Kolon: RESOURCE RPC 3 mL (64 mm x 100 mm). Örnek materyal: Angiotensin II (0,25 mg mL–1), angiotensin III (0,25 mg mL–1). Tampon-A: (a) Su içerisinde %0,1 TFA, pH 2. (b) Su içerisinde 10 mM NaOH, pH 12. Tampon-B: (a) Su içerisinde %0,1 TFA, %60 asetonitril. (b) Su içerisinde 10 mM NaOH, %60 asetonitril. Gradient: 10 dk içerisinde %10-65 B. Akış oranı: 2 mL dk–1 (Anonymous, 1999).

238

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

pH’nın kontrol edilmesi amacıyla kullanılan asitler, bazlar veya tamponlama tuzları da 220 nm dalga boyunun altındaki UV ışınlarında geçirgen olmak zorunda oldukları gibi aynı zamanda, RPC’de kullanılan hareketli fazın düşük polarite koşullarında çözünür olmalıdırlar. RPC hareketli fazının hazırlanmasında kullanılan tampon tuzlarının ve asitlerin uçucu olması tercih edilmekle birlikte zorunlu değildir. Uçucu olan tampon bileşenleri ise biyomoleküller ile birlikte elüe edilen fraksiyonlardan buharlaştırılarak uzaklaştırılabilir. Şayet hareketli fazda uçucu olmayan tuzlar kullanılmış ise bu tuzların ultrafiltrasyon (bkz. kısım 1.7.2) ve diyaliz (bkz. kısım 1.7.5) gibi çeşitli tekniklerle uzaklaştırılması gerekmektedir. 10.6.2.3. İyon-Eşleştirme Ajanları

Hareketli faza genellikle eklenen üçüncü bileşen ise bir iyon-eşleştirme ajanıdır. Daha önce kısım 10.5.4’de de ele alındığı gibi iyon-eşleştirme ajanlarının, iyonik etkileşimler ile biyomoleküllere bağlandığı ve biyomoleküllerin hidrofobisitelerini artırarak, seçiciliği değiştirdiği düşünülmektedir. Gerçek bir yana, bazı RPC uygulamaları (sentetik oligonükleotidlerin saflaştırılması gibi) kesinlikle iyon-eşleştirme ajanlarının kullanılmasını gerektirmektedir. Bunların en büyük avantajı ise seçiciliği etkileyerek, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin tamamının iyi bir çözünürlükle saflaştırılmasını sağlamasıdır. Örnek bileşenlerinin alıkonma davranışları ise belki de kullanılan iyon-eşleştirme ajanının hem tipi hem de derişimi tarafından etkilenmektedir. Peptidlerin alıkonma zamanları üzerine farklı derişimlerdeki TFA’nın etkisi ise peptidin tipine (nötral, asidik veya bazik) bağlı olarak değişmektedir (Şekil 10.13).

Şekil 10.13: Anyonik bir iyon-eşleştirme ajanının (TFA) derişimine bağlı olarak (a) nötral, (b) bazik ve (c) asidik peptidlerin alıkonma zamanlarındaki değişiklikler. Kullanılan peptidlerin amino asit dizileri ise Tablo 10.3’de verilmektedir (Anonymous, 1999).

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

239

Tablo 10.3: Şekil 10.13’de kullanılan standart nötral, bazik ve asidik peptidlerin amino asit dizileri. Peptid

Tipi

Amino asit dizisi

1 2 3

Nötral Nötral Nötral

Trp Glu Glu

Val His Ala

Pro Trp Asp

Thr Ala Pro

Asn Tyr Asn

Val Gly Lys

Gly Leu Phe

Ser Gln Tyr

Glu Pro Gly

Ala Gly Leu

6 7 8

Bazik Bazik Bazik

Tyr Asn Arg

Arg Arg Pro

Pro Val Lys

Pro Tyr Pro

Gly Val Gln

Phe His Gln

Ser Pro Phe

Pro Phe Gly

Phe Asn Leu

Arg Leu Met

9 10

Asidik Asidik

Lys Trp

Gly Ala

Asp Gly

Glu Gly

Glu Asp

Ser Ala

Leu Ser

Leu Gly

Ala Glu

Phe Met

TFA gibi bazı iyon-eşleştirme ajanları, hareketli fazın pH’sının korunması üzerine de etki etmektedirler. Hareketli faz içerisindeki iyon-eşleştirme ajanlarının tipik derişimleri ise %0,01-0,1 veya 10-100 mM arasındadır. Yaygın olarak kullanılan bazı anyonik ve katyonik iyon-eşleştirme ajanları ise Tablo 10.4’de verilmektedir. RPC’de kullanılan iyon-eşleştirme ajanlarının da yeterince saf olması, 220 nm’den daha kısa dalga boyundaki UV ışınlarına karşı geçirgen olması ve hareketli fazın düşük polarite koşullarında çözünür olması gerekmektedir. Bütün bu özelliklere ilaveten, uçucu özellikte olan iyon-eşleştirme ajanlarının kullanılması ise kolondan geri-kazanılan örnek biyomoleküllerinin ilave bir tuz giderme işlemine tabii tutulmasını ortadan kaldıracaktır. Tablo 10.4: RPC’de yaygın olarak kullanılan bazı iyon-eşleştirme ajanları. Eşleşme iyonunun formülü

İyon-eşleştirme ajanı

Öneriler

Anyonik

Trifloroasetik asit (TFA)

CF3COO–

Düşük UV absorbansı. Uçucu, düşük pH –

Pentafloropropionik asit (PFPA) CF3CF2COO Heptaflorobutirik asit (HFBA)

CF3CF2 CF2COO

TFA’den daha hidrofobik. Uçucu, düşük pH –

TFA’den daha hidrofobik. Uçucu, düşük pH

–

Amonyum asetat

CH3COO

Fosforik asit

H2PO4– ; HPO42– ; PO43–

TFA’den daha az hidrofobik.

Katyonik

Tetrametilamonyum klorid

+

Tetrabütilamonyum klorid

+

Trietilamin

NH+(C2H5)3

N(CH3)4 N(C4H9)4

10.6.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması

Örnek materyalinin RPC kolonuna yüklenebilmesi için, öncelikle bu materyalin başlangıç hareketli fazı (tampon-A) içerisinde çözünebilir olması gerekmektedir. Şayet, örnek materyalinin başlangıç hareketli fazı içerisinde çözünmesi, biyomoleküllerin kararlılığı veya çözünürlük problemleri nedeni ile mümkün değilse, örnek materyalinin çözünürlüğünü artırmak amacıyla formik asit, asetik asit veya tuz eklenebilir. Örnek materyaline eklenen bu katkı maddeleri ise kolona yüklenen örnek materyalinin hacmi, kolonun hacmine oranla küçük olduğu sürece, biyomoleküllerin ayrıştırılması üzerinde bir etki göstermeyecektir. Çözünürlüğü sağlamak amacıyla örnek materyaline katılan bu katkı maddelerinin etkisi ise ancak kolona yüklenen örnek hacmi, kolonun hacmine oranla çok daha büyük olduğu durumlarda görülür. Bu etki ise kendisini, örnek materyalinin kolona yüklenmesinden hemen sonra, boşluk hacmi içerisinde bir veya iki ekstra pikin

240

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

gözlenmesi şeklinde gösterebilir. Örnek materyalinin başlangıç hareketli fazı (tampon-A) içerisinde çözündüğü ve hedef biyomoleküllerin kolon materyaline bağlandığı durumlarda ise kolona yüklenen örnek materyalinin hacminin genellikle kromatografi üzerine bir etkisi olmamaktadır. RPC bir adsorpsiyon tekniği olduğundan, oldukça büyük hacimlerdeki seyreltik örnek materyallerinin hem yoğunlaştırılması hem de saflaştırılması tek bir adımda gerçekleştirilebilmektedir. Örnek materyalinin, çözünmesi sağlandıktan hemen sonra kolona yüklenmesi ise oldukça önemlidir. Aksi halde, örnek materyali içerisindeki bileşenlerin oksidasyonu gibi istenmeyen yan reaksiyonlar oluşabilmektedir. RPC kolonlarına yüklenecek olan bütün örnek materyalleri ise kolona yüklenmeden önce 10 000 g’de 10 dk santrifüjlenmeli veya alternatif olarak 0,22 μm (veya 0,45 μm) gözenek çapına sahip olan steril filtrelerden geçirilmelidirler. Örnek materyalinin organik modifikatör içermesi durumunda ise kullanılacak olan filtrelerin bu organik çözücülere karşı dayanıklı olduğundan emin olunmalıdır. Örnek materyalinin özellikle kirli olduğu durumlarda ise çok daha iri partiküllü RPC materyallerinin kullanılması veya GFC ile bu kirlilik unsurlarının uzaklaştırılması sağlanabilir. Böylece çok daha değerli olan RPC kolonlarının kirlenmesi ve sonuçta niteliklerini kaybetmesi önlenmiş, kullanım ömürleri ise uzatılmış olur. Bazı kolonlar ise değiştirilebilir bir “koruyucu” kolona sahip olduklarından, örnek materyalinin içerisinde bulunan kirletici unsurların tutulmasını sağlayarak, saflaştırma işleminin gerçekleştirildiği esas kolonun kirlenmesini ve küflenmesini engeller. Örnek materyalinin kolona yüklenmesi sırasında çökelti oluşumu nedeni ile kolonun tıkanmasını önlemek açısından, örneğin çözünür formda kalmasını sağlamak oldukça önemlidir. Örnek materyalinin çökelmesini önlemek için ise kolonun aşırı yüklenmemesi ve yükleme işlemine başlamadan önce, örnek materyalinin iyice çözündüğünden emin olunmalıdır. 10.6.4. Hareketli Fazın Hazırlanması

Daha önce de sözü edildiği gibi, hareketli fazı hazırlamakta kullanılan bütün çözücüler ve katkı maddeleri HPLC-kalitesinde olmalı, şayet bu mümkün değilse, var olan en yüksek saflıkta olması gerekmektedir. Hareketli fazı hazırlamakta kullanılan çözücülerin ise gazlarının alınmış olması gerekmektedir. Bu işlem ise çözücülerin sonik su banyolarında 10-15 dk tutulması ile sağlanabileceği gibi alternatif olarak, manyetik bir karıştırıcı ile karıştırılması esnasında vakum uygulanarak veya helyum gazı ile köpürtülerek sağlanabilir. Katı maddelerin eklenmiş olduğu hareketli fazların tamamı ise kullanılmadan önce 0,22 μm’lik filtrelerden geçirilmeli ve böylece kolonun tıkanmasına yol açabilecek partiküllerin uzaklaştırılması sağlanmalıdır. Hareketli faza iyon-eşleştirme ajanlarının (örneğin, TFA) eklenmesi gerektiği durumlarda ise önce hareketli fazın gazı alınmalı, daha sonra ise iyon-eşleştirme ajanı eklenmelidir. Böylece, gaz alma işlemi sırasında iyon-eşleştirme ajanının derişiminde değişme olması engellenmiş olacaktır. 10.6.4.1. Hareketli Fazın Depolanması

Genel kural, her zaman taze hazırlanmış olan hareketli fazın kullanılmasıdır. Buna rağmen, şayet çözücüler depolanmak zorunda ise bu durumda buharlaşma nedeni ile çözücü kompozisyonunun değişmesini önlemek amacıyla, bu çözücülerin iyi kapatılmış olan şişelerde depolanması gerekir. Nötral pH’daki sulu solüsyonlar ise mikrobiyal büyüme riski nedeni ile 2-3 günden fazla depolanmamalıdır. Daha uzun süreli depolamalar ise 4 ºC’da yapılmalıdır. Soğuk odada veya buzdolabında depolanmış çözücülerin ise kullanılmadan önce, kromatografinin gerçekleştirileceği sıcaklığa ulaşmaları beklenmeli ve daha sonra gaz giderme işlemi uygulandıktan

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

241

sonra kullanılmalıdırlar. Bu işlem ise kromatografi sisteminde hava kabarcığı oluşma riskini azaltacaktır. 10.6.4.2. Organik Çözücünün İmhası

Biyomoleküllerin kromatografisinde kullanılan diğer kromatografik tekniklerde hareketli faz olarak kullanılan sulu tuz solüsyonlarından farklı olarak, RPC’de hareketli faz olarak sulu tamponlara ilaveten organik çözücüler de kullanılmaktadır. Bu nedenle RPC’ de kullanılan hareketli faz, zehirli bir kimyasal atık gibi ele alınmalı ve buna uygun olarak imha edilmelidir. Aynı itina kendisi bariz bir kimyasal kirletici olmamasına rağmen, iyon-eşleştirme ajanları olan TFA ve HFBA gibi katkı maddelerini içermesi nedeni ile metanol için de gösterilmelidir. Ticari amaçlı uygulamalarda ise hareketli fazı hazırlamak için çok daha fazla miktarlarda organik çözücülerin kullanılıyor olması nedeni ile atık hareketli fazın geri dönüşümünü sağlamak çok daha ekononik olmaktadır. Özellikle asetonitril başta olmak üzere, organik çözücülerin buharlarının solunmasından kaçınılması gerektiği gibi, cilt ile temasından da kaçınılmalıdır. Bu nedenle, hareketli fazın hazırlanması sırasında organik çözücüler ile çeker-ocakta çalışılmalıdır. Aynı önlemler ve dikkat, nötral ve bazik pH’larda bir iyon-eşleştirme ajanı olarak kullanılan trietilamin (TEA) gibi organik aminler ile çalışılırken de gösterilmelidir. Hidroklorik asit ve orto-fosforik asit gibi mineral asitlerle ve TFA, PFPA ve HFBA gibi perflorinli organik asitler ile çalışılırken de çok dikkatli olunmalı ve gerekli bütün önlemler alınmalıdır. Çünkü bu asitler ileri derecede deri yanıklarına neden olurlar ve bu asitlerin buharları da solunmamalıdır. Bu maddeler çok dikkatli ve güvenli bir şekilde taşınmalı, taşıyıcı kapların kapakları ise çok iyi havalandırılan çeker-ocaklarda açılmalıdır. Bu maddeler ile çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven, koruyucu gözlük gibi çok iyi koruyucu önlemler alınmalıdır. 10.6.5. Dedeksiyon

Optimum duyarlılık için minimum dedeksiyon limitinin sağlandığından emin olmak için yüksek saflıkta çözücülerin ve ayıraçların kullanılması zorunludur. Bütün organik çözücülerin ve iyoneşleştirme ajanları gibi katkı maddelerinin çoğu, UV ışınlarını absorblar ve bu nedenle dedeksiyon limiti, dedeksiyonun yapıldığı dalga boyuna bağlıdır. Triptofan ve tirozin gibi aromatik amino asitleri içermeyen kısa peptidlerin saflaştırılması esnasında, dedeksiyon işleminin 220 nm’nin altında gerçekleştirilmesi gerekir. Sentetik oligonükleotidler 250-260 nm arasındaki ışınları, proteinler ise 280 nm’deki ışınları absorblarlar. Kısa peptidlerin saflaştırılması esnasında ise dedeksiyonun daha kısa dalga boylarında yapılması gerektiğinden, genellikle çeşitli güçlüklerden bahsedilmektedir. 10.6.5.1. Hayalet Pikler

Düşük kaliteli hareketli faz bileşenlerinin neden oldukları yaygın problem ise “hayalet” olarak adlandırılır. Hareketli faz içerisinde bulunan eser miktardaki organik kirleticiler, RPC kolon materyaline bağlanabilir ve kolonun dengelenmesi ve örneğin kolona yüklenmesi aşamalarında kolon içerisindeki derişimleri artabilir. Organik modifikatörler ile kolon materyaline bağlanmış olan biyomoleküllerin kolondan elüsyonu esnasında ise kolona bağlanmış olan organik kirleticiler de kolondan ayrılarak bilinmeyen veya “hayalet” pikler olarak kromatogramda görülürler. Bir hayalet pikin büyüklüğü ise genellikle dengeleme zamanına ve hareketli faz içerisindeki organik kirleticinin düzeyine bağlı olacaktır. Hayalet pikler, kolona daha önce yüklenmiş olan, fakat elüsyonu tam olarak gerçekleştirilmemiş olan biyomoleküllerden de kaynaklanabilir. Şayet bir kolona belirli aralıklarla

242

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

birden fazla örnek materyali yükleniyorsa, bu durumda yüksek duyarlılıkta bir dedeksiyonun gerçekleştirilmesi için kontrol amacıyla örnek içermeyen bir kör gradienti uygulanmalıdır. 10.6.5.2. Hareketli Fazın Dengelenmesi

RPC kolonuna yüklenmiş olan biyomoleküllerin kolondan elüsyonu, hareketli faz içerisinde bir gradient oluşturularak gerçekleştiriliyorsa, genellikle temel-çizgi sürüklenmesi göze çarpar. Gradient içerisindeki hareketli faz B’nin oranının arttığı, tipik bir elüsyon işleminde ise temel-çizgi yaklaşık olarak lineer bir şekilde dereceli olarak yükselir veya alçalır (bkz. Şekil 10.12). Temel-çizgi sürüklenmesi, bir iyon-eşleştirme ajanından (veya kuvvetli asit bileşenlerinden) ya da kromatogramın tarandığı dalga boyunda belirgin bir absorbans gösteren bir organik modifikatörden kaynaklanıyor da olabilir. Başlangıç hareketli fazının (tampon-A) arka-plan absorbansı ise kolonun dengelenmesi esnasında düzeltilebilir. Elüsyon işlemi devam ettikçe, organik bileşiklerin oranı dereceli olarak artacak ve buna bağlı olarak da hareketli fazın kimyasal çevresi dramatik bir şekilde değişecektir. Gradientin ilerlemesi ile birlikte, elüsyon için kullanılan hareketli fazın çözücü karakteristiği değişeceği için, buna bağlı olarak tampon bileşenlerinin absorbsiyon özellikleri de değişecektir. Şayet bu durum gerçekleşirse, gradientin oluşmasına bağlı olarak hareketli fazın UV absorbsiyonunda dereceli bir artış (veya azalma) ve temel-çizgi sürüklenmesi görülecektir. Gradient oluşumu ise genellikle iki karıştırıcı pompadan gelen elektronik sinyal olarak belirtilir, fakat temel-çizgi sürüklenmesinin görülmesi ise gerçek bir “kimyasal” gradient oluşumunun daha iyi bir yansımasıdır. Temel-çizgi sürüklenmesi ise hareketli faz A ve B içerisinde, UV ışınlarını absorblayan iyoneşleştirme ajanlarının (veya tampon asitlerinin) farklı derişimlerini kullanarak bertaraf edilebilir. Böyle bir uygulamada, UV ışınlarını absorblayan iyon-eşleştirme ajanlarının veya tampon asitlerinin “derişimleri”, UV-absorbsiyon özelliklerine bağlı olarak dengelenir ve temel-çizgi yaklaşık olarak düz bir çizgi şeklinde elde edilebilir. Hareketli faz bileşenlerinin absorbsiyon özelliklerinin ise üretim partisine bağlı olarak değişebileceğinden ve her elüsyon işleminde koşulların az çok birbirinden farklı olacağından dolayı, herhangi bir çözücü sistemi için kesin öneriler vermek pratik olmayacaktır. Asetonitril içindeki TFA gradientlerindeki TFA derişimi, su içindeki TFA gradientlerindeki TFA derişimine göre %10-30 daha az olmalıdır. Buna rağmen, UV absorblayan bileşenlerin derişimlerinin dengesi ise denysel olarak bulunmalıdır. İki hareketli faz içerisindeki iyon-eşleştirme ajanlarının derişimleri arasındaki fark ise genellikle kromatogramı olumsuz yönde etkileyecek kadar büyük olmamaktadır. 10.6.6. Kolonun Dengelenmesi

RPC kolonları, uzun bir süre depolandıktan sonra veya hareketli faz koşulları belirgin bir şekilde değiştirildiği zaman yeniden kullanılmadan önce “koşullandırılmalı”dırlar. Koşullandırma sırasında kullanılacak olan hareketli fazın ise daha sonra kolonun kromatografi amacıyla kullanılması esnasında kullanılacak olan hareketli faz ile aynı olması gerekir. RPC kolonlarının çoğu için uygulanan genel koşullandırma prosedürü ise aşağıdaki şekildedir: i. Kolon, kolon hacminin yaklaşık 3-misli hareketli faz B ile kolonun özelliğine bağlı olarak, düşükten orta şiddetteki akış oranına kadar değişen akış oranında yıkanır. ii. Kolon hacminin 2-3 misli hacimdeki, %100 hareketli faz B’den %100 hareketli faz A’ya kadar değişen lineer gradient ile kolon, kolonun özelliğine bağlı olarak, düşükten orta şiddetteki akış oranına kadar değişen akış oranında yıkanır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

243

iii. Kolon, kolon hacminin en az 5-misli hacimdeki hareketli faz A ile dengelenir. Dengeleme işlemine, bütün monitör sinyalleri sabitleninceye kadar devam edilir. iv. Hareketli faz sistemi her değiştiğinde, hareketli faz içerisinde UV absorblayan herhangi bir kalıntının bulunup bulunmadığını kontrol etmek için bir kör uygulaması yapılmalıdır. Daha sonra, örnek materyalinin yüklenmesinden önce kararlı bir temel-çizgi elde edilinceye kadar, yine %100 hareketli faz A ile dengeleme işlemine devam edilir. 10.6.7. Elüsyon Koşulları

RPC kolonuna yüklenmiş olan biyomoleküllerin kolondan elüsyonu, ya basamaklı gradient uygulaması ya da lineer gradient uygulaması ile başarılabilir. Basamaklı gradient uygulaması (örneğin, %’leri farklı olan bir seri tampon-B ile izokratik elüsyon) tuz giderimi gibi uygulamalar için kullanışlıdır, fakat biyomoleküllerin birbirinden ayrıştırılarak saflaştırılmasını sağlamak için yüksek çözünürlüğe gereksinim duyulduğundan lineer gradient uygulaması gereklidir. Basamaklı gradient, aynı zamanda bu gradient sisteminin oluşturulması için daha az enstrümana gereksinim duyduğundan, arzu edilen çözünürlüğü sağladığı sürece üretim-ölçekli uygulamalar için idealdir. Buna ilaveten, basamaklı gradientin tekrarlanabilirliği lineer gradiente göre daha kolaydır. Herhangi bir uygulama için ideal gradient şekli ve hacmi ise deneysel olarak belirlenmek zorundadır. Genellikle, saflaştırılacak olan biyomoleküllerin elüsyonlarının nerede gerçekleştiğini belirlemek amacıyla, geniş aralıklı bir lineer gradient uygulanır. Başlangıç koşulları ise genellikle %10 veya daha az organik modifikatör içeren tampon-A ve %90 veya daha fazla organik modifikatör içeren tampon-B’den oluşmaktadır. Başlangıç gradienti olarak adlandırılan geniş aralıklı lineer gradientte kolon hacminin 10-30 misli hacimde %0 tampon-B’den %100 tampon-B’ye kadar ulaşan gradient uygulanır. Kolon hacmi 1 mL olan bir kolon için 1 mL dk–1’lık akış oranı uygulandığında, gradient eğimi %3-10 tampon-B dk–1’ya karşılık gelmektedir. Kolona örnek materyali yüklenmeden önce, kolonun paketlenmesinden veya hareketli fazdan kaynaklanabilecek kirleticiler nedeni ile temel-çizgide bir düzensizliğin olup olmadığını kontrol etmek amacıyla genellikle bir kör gradienti uygulanmalıdır. Gradient ise ya hacim ya da zaman modunda ölçülebilir. RPC’de ise hareketli faz akışındaki değişikliklerin (sabit gradient eğiminde) çözünürlük üzerine olan etkisinin çok az olduğu görülmektedir. Hareketli fazın akış oranının sabit olduğu durumlarda ise gradient eğiminin, kolonun çözünürlüğü üzerine olan etkisi oldukça belirgin olmaktadır. Başlangıç gradienti gerçekleştirildikten sonra, piklerin çözünürlükleri incelenerek çözünürlüğün daha da geliştirilip geliştirilmemesi gerektiğine karar verilir. Daha önce kısım 10.5.4’de de sözü edildiği gibi, hareketli fazın kompozisyonu ayarlanarak çözünürlüğü artırmak mümkündür. Fakat, çözünürlüğü artırmanın başka bir yolu daha bulunmaktadır: daha sığ bir gradient eğiminin uygulanması (Şekil 10.14). Gradient eğiminin düşürülmesi, yani sığlaştırılması ise ya gradient zamanının veya hacminin artırılması ile ya da bölmeli bir gradientin (Şekil 10.15) uygulanması ile başarılabilir. Büyük-ölçekli peptid veya protein saflaştırmada olduğu gibi, örnek materyal içerisindeki biyomoleküllerden sadece bir tanesi hedef molekülü oluşturuyorsa, bu durumda bölmeli-gradient uygulaması hem kullanılan hareketli faz miktarı açısından hem de zaman açısından çok daha ekonomik olmaktadır. Büyük protein moleküllerinin kolonda alıkonma zamanları ise hareketli faz polaritesindeki çok hahif değişikliklere karşı özellikle duyarlı olduğundan, proteinlerin saflaştırılması esnasında çözünürlüğü artırmak için sığ gradient uygulamaları özellikle kullanışlı olmaktadır.

244

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 10.14: Sentetik bir peptidin sabit akış oranındaki çözünürlüğü üzerine gradient eğiminin etkisi. (a) Gradient eğimi %0-60 tampon-B; (b) gradient eğimi %20-35 tampon-B. Örnek materyal: Sentetik peptid (AsnVal-Ile-Leu-Thr-Lys-Pro-Glu-Val-Ser-Glu-Gly-Thr-Glu-Val-Thr-Val-Lys). Kolon: Sephasil Peptide C18 5 μm ST 4,6/100. Tampon-A: %0,06 TFA, pH 2,5. Tampon-B: %0,055 TFA içerisinde %84 asetonitril. Akış oranı: 1 mL dk–1 (Anonymous, 1999).

Şekil 10.15: (a) Lineer gradient uygulaması ile (b) bölmeli-gradient uygulamasının karşılaştırılması. Gradient eğiminin daha dik olduğu A ve C bölümlerinde çözünürlük kaybolurken, gradient eğiminin daha sığ olduğu B bölümünde ise çözünürlük artmaktadır (Anonymous, 1999).

10.6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması i. Kolonun rejenerasyonu: Kolona yüklenmiş olan biyomoleküllerin elüsyonu esnasında kullanılmış olan gradientin son derişiminden bağımsız olarak, kolon içerisinde kalmış olan her türlü örnek materyal kalıntılarının kolondan uzaklaştırılması için kolon, kendi hacminin birkaç misli hacimdeki %100 tampon-B ile rejenere edilmelidir. Şayet örnek materyallerinin kolondan elüsyonu sırasında uygulanan gradient %100 tampon-B’den daha düşük bir düzeyde (örneğin, %60 tamponB’ye kadar) tamamlanmış ise bu durumda, %100 tampon-B ile dengeleme işlemine geçmeden önce, kolona uygulanan gradientin %100 tampon-B’ye kadar ulaşması sağlanır (bu örnekte %60 tampon-B’den %100 tampon-B’ye kadar). Daha sonra ise kolon, yeniden tampon-A ile dengelenir. Fakat, bu dengeleme işlemi sırasında doğrudan doğruya %100 tampon-B’den %100 tampon-A’ya geçilmez. Çünkü, hareketli fazın kompozisyonunun çok ani bir şekilde değişmesi kolon materyaline zarar verebilir. Bu nedenle tampon-B’den tampon-A’ya geçiş, %100 tampon-B ile başlayan ve %100 tampon-A ile biten lineer bir gradient uygulaması ile yapılmalıdır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

245

ii. Kolonun temizlenmesi: Özellikle partiküllü yapılar ve kolonun kirlenmesine yol açabilecek kirleticiler içeren örnek materyalleri ile çalışıldığı durumlarda, kolonun periyodik olarak temizlenmesi gerekmektedir. Kolonda geri-basıncın artması, çözünürlüğün kaybolması veya kolon yatağının üst kısmında renklenmenin görülmesi (cam kolonlar için), kolonun temizlenmesi gerektiğine işaret etmektedir. Özellikle silika-temelli RPC kolon materyallerinin kullanılması durumunda, pik genişlemesi nedeni ile çözünürlüğün kaybolması ise silika yüzeyinde silanol gruplarının bulunduğuna veya pH 7’nin üzerindeki hareketli fazların sık kullanılması nedeni ile matriksin eriyerek kolondan akması sonucunda kolon yatak hacminin üst kısmında bir boşluğun oluştuğuna işaret etmektedir. Silanol gruplarının oluşmasının başka bir nedeni ise kolonun normal kullanım ömrü içerisinde sulu organik çözücülere uzun süre maruz kalmasının doğal bir sonucu olarak, jelin kullanım ömrünü tamamlamasından da kaynaklanmaktadır. Serbest silanol gruplarının etkisi sonucunda çözünürlüğün düşmesi durumunda ise düşük pH’lı iyon baskılayıcı hareketli fazların kullanılması ile bu etki minimuma indirgenebilir.

Tipik bir RPC kolonunun temizlenmesinde takip edilecek adımlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: 1. Kolon, kolon hacminin birkaç misli hacimdeki %0,1 sulu TFA içeren tampon-A ile düşük akış oranında dengelenir. 2. Kolon, kolon hacminin yaklaşık 20-30 misli hacimdeki %100 tampon-A’dan %100 tamponB’ye değişen lineer bir gradient tamponu ile yıkanır. Buradaki tampon-B ise 2-propanol içerisinde %0,1 TFA’den oluşmaktadır. 3. Kolon, kolon hacminin birkaç misli hacimdeki %100 tampon-B ile dengelenir ve daha sonra başka bir gradient uygulaması ile kolon %100 tampon-A’ya geri getirilir. 4. Kolon, bir sonraki kromatografide kullanılacak olan başlangıç hareketli fazı ile dengelenmeden önce, kolon hacminin birkaç misli hacimdeki tampon-A ile dengelenir. Şayet bir sonraki kromatografide kullanılacak olan yeni başlangıç hareketli fazı (yeni tampon-A), %0,1 sulu TFA içeren tampon-A’dan oldukça farklı ise yeni hareketli fazın kolona tanıtılması lineer gradient uygulaması ile yapılmalıdır. 5. Polistiren-temelli kolon materyali (örneğin, SOURCE RPC) içeren kolonlar ise bu matrikslerin oldukça kararlı olmaları nedeni ile sodyum hidroksit (maksimum 0,5 M) gibi çok daha etkili olan kimyasal ajanlar ile temizlenebilir. iii. Kolonun ve kolon materyalinin korunması: Silika-temelli RPC kolon materyalleri, silikanın sulu ortamlarda özellikle kararsız olması nedeni ile sulu solüsyonlar içerisinde depolanmamalıdır. Bu nedenle silika-temelli kolon materyali içeren kolonlar ve matriksler, genellikle TFA veya başka hiçbir katkı maddesi içermeyen metanol gibi saf organik çözücüler içerisinde depolanırlar (asetonitril ise önerilmemektedir). Polistiren-temelli RPC matriksleri ise ya saf metanol ya da %20’lik metanol içerisinde depolanabilirler. 10.7. RPC Uygulama Örnekleri

Biyomoleküllerin saflaştırılmasında kullanılabilecek önemli tekniklerden birisi haline gelmiş olan RPC, orijinal olarak 1960’lı yıllarda küçük organik moleküllerin saflaştırılması amacıyla geliştirilmiştir. Son yıllarda HPLC tekniğine uygun kolon materyallerinin ve enstrümanlarının da geliştirilmiş olması nedeniyle RPC tekniği, peptidler, proteinler ve oligonükleotidler gibi biyomoleküllerin saflaştırılmasında kullanılmaya başlanmıştır. Araştırma laboratuvarlarında RPC ile biyomoleküllerin başarılı bir şekilde saflaştırılmasının sonucu olarak bu kromatografi tekniği, günümüzde sentetik peptidlerin yanı sıra rekombinant peptidlerin ve proteinlerin de saflaştırılması amacıyla endüstriyel-ölçeklerde kullanılmaktadır.

246

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

RPC, biyomoleküllerin saflaştırılması amacıyla, birkaç özgül uygulama hariç, tek başına bir saflaştırma tekniği olarak kullanılmaz. RPC, genellikle GFC veya IEC gibi diğer kromatografik tekniklerle bir kombinasyon halinde kullanılmaktadır. Buna rağmen, RPC ile birlikte hangi kromatografik tekniklerin kullanılacağı kadar, bu tekniklerin hangi sıra ile uygulanacağı da başarılı bir saflaştırma için kritik önem arz etmektedir. Saflaştırma protokolünün başında ise örnek materyalinin hacmi oldukça büyük, biyomoleküllerin derişimler ise düşük ve kirleticilerin oranı ve miktarı ise en yüksek düzeyde bulunmaktadır. Bu aşamada, genellikle yüksek kapasiteli, düşük çözünürlüklü kromatografik tekniklerin uygulanması ise aynı zamanda, örnek materyalinin derişiminin de artmasını sağlamaktadır. Saflaştırma protokolünün daha sonraki adımlarında ise her adımda daha da yüksek çözünürlük sağlayan kromatografi teknikleri uygulanmalıdır. Genel bir saflaştırma protokolünün oluşturulması ise saflaştırılacak olan biyomoleküllerin tipine bağlı olduğu kadar kaynağına da bağlıdır. RPC açısından gruplandırılabilir:

ise

bu

bölümde

üzerinde

durulan

moleküller

aşağıdaki

şekilde

i. Doğal olarak sentezlenen peptidler ve proteinler. ii. Rekombinant peptidler ve proteinler iii. Kimyasal olarak sentezlenen peptidler ve proteinler iv. Enzimatik parçalanma ürünü olan protein parçacıkları v. Kimyasal olarak sentezlenen oligonükleotidler.

Biyomoleküllerin bütün bu grupları ise bunların saflaştırılması açısından oldukça önemli olan bazı fizikokimyasal farklılıklara sahiptirler. Takip eden kısımlarda ise bu tip biyomoleküllerin saflaştırılmasına ait bazı örneklere yer verilmiştir. 10.7.1 Doğal Olarak Sentezlenen Peptidler ve Proteinler

Peptidler ve proteinler çok farklı amaçlar için bu moleküllerin doğal kaynaklarından saflaştırılırlar. Başlangıç örnek materyalinin kompleksliği nedeniyle biyomoleküllerin saflaştırılması, genellikle birbirinin tamamlayıcısı olan birkaç kromatografi tekniğinin bir seri halinde kullanılmasını gerektirmektedir. Peptidler ve proteinler genellikle doğal olarak çok küçük miktarlarda sentezlendiklerinden, yeterli miktarda saf ürünün elde edilebilmesi için çoğunlukla büyük miktarlarda başlangıç örnek materyaline gereksinim duyulmaktadır. Yüksek saflıkta biyomoleküllerin elde edilebilmesi için ise birkaç saflaştırma tekniğinin arkası arkasına kullanılması gerekmektedir. Biyomoleküllerin doğal kaynaklarından elde edilmesi esnasındaki temel amaç, örnek materyalinin hacmini küçültmek ve kirleticilerin büyük bir kısmını elemine etmek iken, daha sonraki adımlarda ise benzer karakteristik özelliklere sahip olan biyomolekülleri birbirinden ayrıştırmaktır. Saflaştırma protokolünün erken kromatografik aşamalarında düşükten orta performansa kadar olan kolon materyalleri kullanılarak, GFC ve IEC teknikleri uygulanmalıdır. Saflaştırma protokolünün son adımında ise yüksek performans RPC kullanılmalıdır. Şayet, gerekli olduğu takdirde bu teknik, yüksek performans GFC ile birleştirilebilir. Saflaştırma protokolünün çeşitli basamakları boyunca uygulanan her bir saflaştırma tekniğinin sağladığı saflık ise elektroforez tekniği ile taranabilir. Kompleks biyolojik kaynaklardan biyomoleküllerin saflaştırılmasında RPC tekniğinin kullanılması durumunda ise göz önünde bulundurulması gereken birkaç nokta vardır:

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

247

i. Birincisi, bir protein veya peptid molekülünün fonksiyonunun veya bu molekülün yapısı ile aktivitesi arasındaki ilişkinin çalışılması durumunda, saflaştırma prosedürü boyunca bu molekülün biyolojik aktivitesini koruduğundan emin olunmalıdır. Bu durum küçük proteinler ve peptidler için kritik bir problem değildir, fakat büyük proteinler RPC koşulları altında denatüre olma eğilimindedirler. Biyomoleküllerin biyolojik bütünlüklerinin korunmasını sağlamak için potansiyel denatüre edici koşullara maruz kalma süresi de dahil olmak üzere, uygun RPC materyalinin seçimi ve elüsyon koşulları optimize edilmelidir. ii. Doğal kaynaklardan elde edilen polipeptidler ile çalışılırken, proteazların varlığı bazı zorluklara yol açabilir. Bu durumda, hedef protein veya peptidlerin proteaz ile temas süresini azaltmak için saflaştırma basamaklarının ilk aşamalarında hızlı çalışılması önerilmektedir. Şayet, proteazlardan kaynaklanan problem ısrarla devam etmekte ise bu durumda tampona özgül kimyasal proteaz inhibitörleri ilave edilmelidir (bkz. kısım 1.5.3). iii. Doğal kaynaklardan elde edilen örnek materyalleri ile çalışılması durumunda karşılaşılabilecek üçüncü problem ise agregat oluşumudur. Neyse ki, RPC’de sıklıkla düşük polariteli hareketli fazlar kullanıldığından, fizyolojik pH koşullarındaki sulu tamponlarda iyi çözünmeyen polipeptidler bu hareketli fazlarda çözünmektedirler. Probleme neden olan çözülebilir agregatlar ise GFC ile ilgili monomerlerinden ayrılabilirler. 10.7.1.1. Trombosit-Türevli Büyüme Faktörünün Saflaştırılması

Dimerik trombosit-türevli büyüme faktörünün (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF; Mr 30 kDa) hızlı bir şekilde saflaştırılması için RPC kullanılmıştır. PDGF’nin saflaştırılmasında uygulanan ilk metotta IEC, ikinci saflaştırmada uygulanan RPC ile birleştirilmiştir. Daha ileri çalışmalar ise IEC’nin bu metottan çıkarılarak, tek adımlı daha basit bir yöntem ile PDGF’nin saflaştırılabileceğini göstermiştir. Domuz kanından elde edilen trombositlerin dondurma/çözündürme ile parçalanması sonucunda oluşan özüt, santrifüjlenerek temizlenir ve elde edilen süzüntü kendi hacminin 30-misli hacimdeki sodyum fosfat tamponu (10 mM; pH 7,4) içerisinde 1 gün boyunca diyalize tâbi tutulur. Diyalize tâbi tutulan özüt, bir defa daha santrifüjlenerek temizlendikten sonra, elde edilen temiz süzüntü RESOURCE RPC 3 mL kolonuna yüklenir. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyonu ise su içerisinde %0,1 TFA’dan asetonitril içerisindeki %0,1 TFA’ya değişen gradient uygulaması ile gerçekleştirilir (Şekil 10.16). PDGF ise görünüşe göre tek bir basit adımda, homojen saflıkta elde edilmektedir.

Şekil 10.16: Trombosit-türevli büyüme faktörünün (PDGF) RPC tekniği ile tek basamakta saflaştırılması. Örnek materyal: Trombosit-türevli büyüme faktörü içeren domuz trombosit özütü (10 mg/mL protein içermektedir). Kolon: RESOURCE RPC 3 mL (6,4 x 100 mm). Tampon-A: Su içerisinde %0,1TFA. Tampon-B: Asetonitril içerisinde %0,1 TFA. Gradient: 4 mL %0 tampon-B; 4-48 mL ise %0-60 tampon-B. Akış oranı: 2 mL dk–1 (370 cm s–1) (Anonymous, 1999).

248

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

10.7.2. Rekombinant Peptidler ve Proteinler

Protein ve peptidlerin doğal kaynaklarından izolasyonları sırasında karşılaşılan bazı problemler, bu biyomoleküllerin rekombinant tekniklerle üretilmesi ile aşılabilir (bkz. kısım 1.8). Bu yolla üretilen peptidler ve proteinler ise temel araştırmalar, diyagnostik ve terapötik amaçlı kullanılmaktadır. Rekombinant peptidler ve proteinlerin ekspresyonları ise vektörler aracılığı ile E. coli, maya, memeli hücreleri ve virüsler gibi konakçı organizmalara aktarılarak, bu konakçılar tarafından yapılabilmektedir (bkz. kısım 1.8). Vektör ise (plazmid veya kromozom) polipeptidleri kodlayan genlerin konakçı hücrelere aktarılmasını sağlayan araçlardır. Konakçı hücrenin üreme mekanizması ise arzu edilen rekombinant DNA molekülünün veya klonun çok sayıda kopyasını üretmektedir. Bu konakçıya aktarılmış olan geni taşıyan hücreler, yani doğru klonlar, büyütülür ve böylece arzu edilen peptidin veya proteinin ekspresyonunu sağlayan klonlar aracılığı ile sürekli bir kaynak elde edilmiş olur. Klon tarafından ekspresyonu yapılan peptid veya protein ise ya kültür sıvısında (ekstrasellüler) ya da hücre içerisinde (intrasellüler) bulunabilir. Ekstrasellüler protein veya peptidlerin saflaştırılması ise intrasellüler olanlara göre daha kolaydır ve genellikle proteazların etkisine maruz kalmazlar. İntrasellüler polipeptid ve proteinlerin saflaştırılması ise öncelikle, bu biyomoleküllerin liziz ile hücrelerden serbest bırakılması gerektiği için daha zordur. Şayet bir hücre içerisindeki polipeptidin derişimi oldukça yüksek ise çözünmeyen inklüzyon cisimlerinin oluşumu ile sonuçlanan bir çökelti meydana gelebilir. Bu inklüzyon cisimleri ise guanidin hidroklorid (6 M) gibi katotrofik ajanlar kullanılarak çözündürülmek ve daha sonra ise yeniden doğal yapılarına döndürülmek zorundadırlar. Şayet proteinlerin yeniden katlanmalarını sağlayan metotlar mevcut ise bunların inklüzyon cisimleri aracılığı ile üretilmeleri bazı avantajlar sağlamaktadır. Çünkü, bu inklüzyon cisimlerinin sadece santrifüjlenmesi, yıkanması ve çözündürülmesi ile göreceli olarak oldukça saf olan başlangıç örnek materyali elde edilebilmektedir (bkz. kısım 1.8.1). Böyle bir başlangıç örnek materyalinden daha yüksek saflıktaki protein ise ilave bir cilalama adımı ile elde edilebilmektedir. Ekstrasellüler rekombinant peptidlerin ve polipeptidlerin saflaştırılması ise yeterli derişimde bir başlangıç örnek materyalinin elde edilebilmesi için büyük hacimlerde kültür sıvısının kullanılmasını gerektirdiğinden daha karmaşıktır. Bu güçlük ise henüz daha genin klonlanması esnasında ilgili gene, protein-A (bkz. kısım 8.7.6.1), veya protein-G (bkz. kısım 8.7.6.2), glutatyon transferaz veya poliamino asit gibi özgül bir terminal dizinin eklenmesi ve böylece polipeptidin affinite kromatografisi ile saflaştırılmasını sağlayan bir etiketin eklenmesi ile aşılabilir (bkz. kısım 1.8.2). Böylece, etiket eklenmiş bir polipeptidin, etiket yardımı ile saflaştırılması ve yoğunlaştırılmasından sonra, şayet gerekli ise polipeptide bağlı olan etiket kimyasal veya enzimatik yolla kırılır ve rekombinant polipeptid son adımda RPC ile etiketten ayrıştırılarak saflaştırılır. İntrasellüler polipeptidlerin saflaştırılmasına başlanmadan önce, öncelikle bu polipeptidlerin hücre lizizi ile hücrelerden serbest bırakılması gerekmektedir (bkz. kısım 1.6). Hücre lizizi sonucunda elde edilen lizattan hücre kalıntıları temizlendikten sonra, öncelikle elde edilen özütteki endotoksinlerin, nükleik asitlerin ve lipit gibi potansiyel koagülasyon maddelerinin uzaklaştırılması amaçlanmaktadır (bkz. kısım 1.6.1). Ekstrasellüler rekombinant polipeptidlerde olduğu gibi, intrasellüler rekombinant polipeptidlere eklenmiş olan etiketler yardımı ile bu polipeptidlerin de saflaştırılması mümkündür. Şayet, bir etiket kullanılmamış ise bu durumda, saflaştırma protokolünün ilk aşamalarında IEC gibi örnek materyalindeki hedef polipeptidin saflaştırılmasının yanı sıra yoğunlaştırılmasını da sağlayan diğer kromatografi teknikleri kullanılmalıdır. Saflaştırma protokolünün son adımında ise hedef polipeptidin homojen saflıkta elde edilmesini sağlamak amacıyla, bazen yüksek performans GFC ile birlikte, RPC kullanılmaktadır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

249

Rekombinant polipeptidlerin saflaştırılması sırasında her bir adımda sağlanan saflık, analitik RPC, amino asit analizi, peptid haritalama, biyoassey veya poliakrilamid jel elektroforezi gibi tekniklerle kontrol edilebilir. 10.7.2.1. İnklüzyon Cisimlerinin Saflaştırılması

Daha önce kısım 1.8 ve kısım 10.7.2’de de sözü edildiği gibi, rekombinant proteinlerin çözünmesini ve katlanmasını sağlayan bir metot bulunduğu sürece, bu proteinlerin ekspresyonlarının çözünmeyen inklüzyon cisimleri halinde gerçekleştirilmesi, göreceli olarak daha saf başlangıç örnek materyallerinin elde edilmesini sağlamaktadır. Böyle bir örnek materyalinden ise hadef proteinin saflaştırılması, tek bir adımla gerçekleştirilebilmektedir. RPC ise örnek materyal içerisindeki endotoksinlerin uzaklaştırılmasında etkili bir teknik olduğundan, özellikle biyolojik sistemlerde kullanılacak olan proteinlerin ve peptidlerin saflaştırılması esnasında son adım olan cilalama aşamasında kullanılabilecek uygun bir kromatografi tekniğidir. Silika-temelli RPC adsorbentleri ile endüstriyel-ölçekli inklüzyon cisimlerinin saflaştırılmasında ise bazı problemler bulunmaktadır. Bu problemlerin başında ise silika-temelli RPC adsorbentlerinin bağlama kapasitelerinin düşük olması, kolayca kirlenmeleri ve rejenerasyonlarının neredeyse imkansız olması gelmektedir. Bu nedenlerle, silika-temelli RPC adsorbentleri içeren kolonlarda geri-basınç artmakta ve bunun sonucu olarak da ayrıştırma zamanı uzamakta ve geri-kazanım verimi düşmektedir. Silika-temelli bu adsorbentlerden kaynaklanan dezavantajlar ise özellikle endüstriyel-ölçekli uygulamalar için dizayn edilmiş olan SOURCE 30RPC gibi adsorbentlerin üretilmesi ile ortadan kaldırılmıştır. Bu tip RPC adsorbentlerinde ise geri-basınç düşük olmakla kalmayıp, aynı zamanda geri-kazanım verimi de yüksek olmaktadır. Ayrıca, kirlenmeye karşı da kolayca sanitize edilebilmektedirler. 10.7.2.2. Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörünün Saflaştırılması

Saccharomyces cerevisiae tarafından ekstrasellüler bir ürün olarak ekspresyonu gerçekleştirilen ve göreceli moleküler kütlesi 6 kDa olan rekombinant insan edpidermal büyüme faktörü (recombinant human Epidermal Growth Factor; rhEGF) için bir saflaştırma protokolü geliştirilmiştir. Bu saflaştırma protokolü, rhEGF moleküllerinin kültür sıvısından kazanılmasını, Q Sepharose High Performance ile IEC tekniğini ve Phenyl Sepharose 6 Fast Flow ile RPC tekniğini içermektedir. Bu protokoldeki ilk iki adım, rhEGF moleküllerinin saflaştırılması için oldukça verimli olup, geri-kazanma verimi iyidir. Buna rağmen, IEC uygulaması sonucunda elde edilen üründe hâlâ çok düşük miktarda da olsa hedef üründen ayrıştırılamayan kirleticiler bulunmaktadır. İnatçı olan bu kirleticiler ise cilalama aşamasında SOURCE 15RPC adsorbenti içeren RPC tekniğinin uygulanması ile uzaklaştırılabilmektedir (Şekil 10.17) ve sonuçta homojen saflıkta rhEGF elde edilmektedir. 10.7.3. Kimyasal Olarak Sentezlenen Peptidler

Amino asit kalıntılarının sayısı 20’den az olan peptidlerin sentezi, artık günümüzde rutin bir laboratuvar prosedürünü oluşturmaktadır. Bunun yanı sıra, 100’den daha fazla amino asit kalıntısından oluşan peptidlerin sentezi de mümkündür. Peptid sentezinde ise temelde iki farklı kimyasal yöntem kullanılmaktadır fakat, bu yöntemlerin her ikisi de son-ürün içerisinde benzer kirleticilerin bulunması ile sonuçlanmaktadır. Peptid sentezinin son-ürünü içerisinde bulunan kirleticiler ise amino asit delesyonları nedeni ile meydana gelen peptidlerden, amino asit dizilimi eksik olan peptidlerden ve modifiye amino asit kalıntılarını içeren peptidlerden oluşmaktadır. Ayrıca, kimyasal peptid sentezinin son-ürünü içerisinde, sentezlenen peptidin destek materyalinden

250

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

uzaklaştırılmasında kullanılan yöntemden kaynaklanan fenoller ve tiyoller gibi küçük organik kirleticiler de bulunmaktadır.

Şekil 10.17: SOURCE 15RPC adsorbenti ile rhEGF moleküllerinin endüstriyel-ölçekli preparatif saflaştırılması. Örnek materyal: Kısmi olarak saflaştırılmış 62,5 mL (10 mg rhEGF) örnek materyali. Kolon: RESOURCE 15RPC (35 x 100 mm). Tampon-A: Su içerisinde %0,05 TFA, %5 asetonitril. Tampon-B: Su içerisinde %0,05 TFA, %70 asetonitril. Gradient: %1,3 tampon-B dk–1. Akış oranı: 50 mL dk–1 (300 cm s–1) (Anonymous, 1999).

Amino asit kalıntılarının sayısı 20’den az olan sentetik peptidler, genellikle RPC tekniğinin kullanılması ile tek adımda istenilen saflıkta elde edilebilmektedirler. Saflığın takibi ise genellikle kütle spektrofotometresi ile analitik RPC adsorbentlerinin birlikte kullanılması ile yapılabilmektedir. RPC adsorbentinin seçimi ise seçilen adsorbentin, saflaştırılacak olan sentetik peptid için olan seçiciliğine ve saflaştırma ölçeğine uygun olarak yapılmaktadır. Mikrogram düzeyindeki saflaştırma işlemleri için 5 μm adsorbentleri iyi bir ayrıştırma sağlarken, daha büyük miktarlarda gerçekleştirilecek olan saflaştırma işlemlerinde ise verimli bir saflaştırmanın elde edilebilmesi için 15 μm veya 30 μm adsorbentleri seçilmelidir. Daha büyük sentetik peptidlerin saflaştırılması için ise RPC ile birlikte IEC gibi diğer saflaştırma teknikleri de kullanılmaktadır. 10.7.3.1. Fosforile PDGF α-reseptör-türevli pY574α Peptidinin Saflaştırılması

pY574α peptidi, 18 amino asit kalıntısından oluşan bir peptid olup, PDGF α-reseptörünün intrasellüler domaininin yapısal bir parçasıdır. pY574α peptidi, hücre lizatları içerisinde bulunan potansiyel sinyal transdüksiyon proteinlerinin affinite kromatografisi ile saflaştırılmasında ligand olarak kullanılmak amacıyla dizayn edilmiş ve kimyasal olarak sentezlenmiştir. RPC ile tek adımda pY574α peptidinin arzu edilen saflıkta saflaştırılması ile ilgili kromatogram ise Şekil 10.18’de görülmektedir. pY574α peptidi alkali koşullarda kolaylıkla çözünmesine rağmen, asidik koşullardaki çözünürlüğü düşüktür. Bu nedenle, pY574α peptidinin saflaştırılmasında alkali koşullar için uygun olmaması nedeni ile silika-temelli adsorbentler kullanılmaz. Dolayısı ile pY574α peptidinin RPC ile saflaştırılabilmesi için özellikle alkali koşullardaki RPC uygulamaları için üretilmiş olan SOURCE RPC gibi polistiren-temelli adsorbentler kullanılmaktadır.

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

251

Şekil 10.18: Fosforile PDGF α-reseptör-türevli pY574α peptidinin saflaştırılması. Sistem: Äkta Purifier.Örnek materyal: pY574α peptidi içeren 200 μl ham materyal. Kolon: RESOURCE 5RPC ST 4,6/150. Tampon-A: 100 mM NH4HCO3; pH 7,9. Tampon-B: %60 asetonitril. Gradient: %10-40 tampon-B; 75 mL. Akış oranı: 0,67 mL dk–1 (Anonymous, 1999).

252

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

11. İNCE TABAKA (TLC) VE KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ (PC)

11.1. Giriş

TLC, 1939 yılında Schraiber tarafından geliştirilerek uygulanmış olan bir kromatografi tekniğidir. İzmailov ile birlikte Kharkov Chemistry and Pharmacy Research İnstitute’de çalışan Schraiber, TLC tekniğini ilk olarak farmosötiklerin analizi için kullanmıştır. Schrabier’in, TLC tekniğinin kullanımına ait kendi sözleri şöyledir: “Bize öyle geliyor ki, sorbentin ince bir tabakası kâğıt bir şerit yerine kullanılabilir ve aynı zamanda öyle hissettik ki yassı tabaka, adsorbent kolonunun bir kesiti olarak düşünülebilir. Öyle inanıyoruz ki böyle bir plakada ayrıştırma işleminin gerçekleştirilmesi, prosesi belirgin bir ölçüde hızlandırmaktadır. Biz çalışmalarımızda, örneğimizin bir damlasını plaka üzerindeki adsorbent üzerine yükledik ve ayrışmanın dairesel zonlar halinde gerçekleştiğini gözledik. Plaka üzerinde ayrışan analitler ise flouresans özelliklerinden dolayı UV lambası altında görülür hale geldiler.” Schraiber’in yukarıdaki kendi sözlerinden de anlaşıldığı gibi bu araştırmacı, 1939 yılında sadece TLC tekniğini keşfetmekle kalmamış, aynı zamanda flouresans tekniğini de ayrışma indiktörü veya analitlerin belirlenmesinde de ilk olarak kullanan kişi olmuştur. Ne yazık ki Schraiber’in bu çalışması dikkate alınmamış olduğundan TLC tekniğinin 1951 yılında Kirchner tarafından yeniden keşfedildiği görülmüştür. TLC’nin faz sistemleri, temel olarak LC’de kullanılan faz sistemleri ile aynı olmasına rağmen, TLC için gerekli olan aparat LC için gerekli olanlardan çok daha basit ve bir o kadar da ucuzdur. Buna ilaveten, TLC ile aynı plaka üzerinde, aynı anda çok sayıda örnek çalışılabilir ve ayrıştırma işlemi LC’ye oranla çok daha kısa sürede gerçekleştirilir. Örneğin, bir TLC plakasına 60 kadar örnek aynı anda farklı noktalara yüklenerek analiz edilebilir. Bunun anlamı ise her bir örneğin analizinin tamamlanması için ortalama olarak 5 saniye harcanmış olmaktadır. TLC ile elde edilen çözünürlük ise LC ile elde edilen çözünürlüğe oranla oldukça düşüktür, fakat TLC tekniğinin çok daha ucuz olması nedeni ile yaygın olarak kullanılmaktadır. Gerçekte ise geçtiğimiz yıllar boyunca LC tekniği alanında gerçekleştirilen ilerlemelere rağmen, rutin analizler için TLC’nin kullanılması hâlâ devam etmektedir. Buna rağmen, sınırlı plaka kapasitesi nedeni ile çoklu bileşikleri içeren örneklerin ayrıştırılması TLC ile sağlanamaz. TLC’de bütün analitler plaka üzerinde bulunurken, LC’de ise analitler kolondan elüe edildiği için LC’nin bileşik kapasitesi, TLC’ye oranla çok daha büyüktür. 11.2. Temel Prensipler

Sabit faz cam, alüminyum veya plastik gibi ince ve yassı olan, uygun bir plakanın yüzeyi üzerinde oluşturulur. Sabit fazın çok ince olması nedeni ile, hareketli fazın sabit faz tabakası boyunca yüzey gerilimi ve kapiller faaliyeti sonucu ilerlemesi, bu akışa karşı olan direncin oldukça

254

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

küçük olması nedeni ile, hızlı bir şekilde gerçekleşecektir. Hareketli faz, tabaka boyunca bir uçtan karşıt uca doğru hareket ettikçe, tabaka üzerindeki analitler de sabit ve hareketli fazlar arasındaki dağılma katsayılarıyla (Kd) belirlenen oranlarda transfer edilmektedirler. Pratikte ise analitlerin dağılma prosesinin temeli adsorbsiyon, partisyon, iyon değiş-tokuşu veya geçirgenlik (jel filtrasyon) kromatografilerindeki temellere dayanabilir. Analitlerin plaka boyunca hareketi ise, ya hareketli fazın (solvent) tabakanın sonuna ulaşmasıyla kapiller hareket akışı durduğunda ya da tabakanın hareketli faz rezervuarından uzaklaştırılmasıyla sona erer. Analitin göçü ise eşitlik 11.1’de verilen alıkonma (gecikme) faktörü ile (Rf, retantion factor) ifade edilir: Rf =

Analitin yükleme noktasından olan uzaklığı

(11.1)

Solvent ucunun yükleme noktasından olan uzaklığı

Bir ince tabaka plakasının verimliliği ise eşitlik 11.2’de olguğu gibi, onun kuramsal levha sayısı (N) ve plaka yüksekliği (H) ile ifade edilir (bkz. kısım 2.1.8.2):

2

dA

N = 16

(11.2)

w

Burada dA, analitin yükleme noktasından (orijin) olan uzaklığını; w ise lekenin genişliğini ifade etmektedir (bkz. Şekil 11.8) ve plaka yüksekliği eşitlik 11.3 ile hesaplanmaktadır: H=

dA

(11.3)

N

Analit için kapasite faktörü (k) ise eşitlik 11.4 ile hesaplanır: k=

dm dA

=

1 - Rf Rf

(11.4)

Burada dm ise solvent (hareketli faz) ucunun, orijin noktasından olan uzaklığını ifade etmektedir. 11.3. İnce-tabakaların Hazırlanması

Durgun fazın genellikle su içerisinde bir süspansiyonu hazırlanarak elde edilen kıvamlı karışım (şerbet), 20 x 20 cm boyutlarındaki cam, plastik veya alüminyum levha üzerine bir uçtan başlayıp diğer uca doğru yayma işleminde kullanılan dağıtıcı yardımı ile çok ince ve uniform bir şekilde yayılır. Durgun fazın levha üzerindeki kalınlığı ise arzu edilen kromatografik ayrıştırmaya göre belirlenir. Analitik ayrıştırmalar için durgun fazın kalınlığı 0,25 mm’nin katları şeklinde ayarlanırken, preparatif ayrıştırmalar için ise bu kalınlık 2 mm’ye kadar çıkabilir. Durgun fazın adsorbsiyon kromatografisi için kullanıldığı durumlarda ise kalsiyum sülfat gibi bir bağlayıcı ajan, durgun fazın plakalar üzerine dökülmesinden önce karışıma eklenmelidir. Kalsiyum sülfat gibi bağlayıcı ajanlar ise adsorbentin plaka üzerine adezyonunu sağlamaktadır. İnce-tabaka geçirgenlik (jel) kromatografisi hariç (bkz. kısım 4.7), durgun faz şerbeti plakalar üzerine yayıldıktan sonra, plakaların durgun faz ile kaplanması için kurumaya bırakılır. Adsorbentlerin kullanıldığı durumlarda ise kurutma işlemi 100-120 °C’a ayarlanmış bir fırında yapılır. Bu işlem, aynı zamanda adsorbentin aktive edilmesini de sağlamaktadır. Ticari olarak çok farklı TLC plakaları, önceden hazırlanmış ve kullanıma hazır halde bulunmaktadır. Aynı zamanda poliamid tabaka olarak da bilinen, solventlere karşı dayanıklı ve diğer ince-tabaka plakalarından farklı olarak yarı-saydam olan polyester bir levhanın her iki yüzeyinin de poli-ε-kaprolaktam ile kaplanması ile elde edilen plakaların her iki yüzeyine de yükleme yapılabilmektedir. Bu plakalar

11. TLC ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

255

yarı-saydam olduklarından bir yüzeylerine standartların diğer yüzeylerine ise analizi yapılacak olan bileşiklerin yüklenerek kromatografi işleminin gerçekleştirilmesinden sonra, iki yüzeydeki analitlerin karşılaştırılmasına izin vermektedir. Bu plakalar, kromatografiden sonra hemen amonyak-aseton karışımı ile yıkanarak temizlenirlerse yeniden kullanılabilirler. Bu tipteki polyester plakalar, proteinlerin amino asit dizilimlerinin belirlendiği dansil-Edman metodunda da sıklıkla kullanılmaktadırlar. 11.4. Örneğin Uygulanması

Örnekler, plakanın bir ucundan 2-2,5 cm kadar yukarıya yüklenir. Örnekler, bir TLC plakasının üzerine, mümkün olduğunca en küçük alanı kaplayacak bir leke olarak yüklenmelidirler. Adsorbsiyon kromatografisinin yapıldığı durumlarda ise örnek yükleme noktasından örnek bileşiklerinin diffüzyonunun önlenmesi amacı ile örnek bileşikleri, içerisinde düşük Rf değer gösterdikleri çözücüler içerisinde hazırlanabilir. Normal TLC plakalarına her bir örnekten 1-2 μL’nin yüklenmesi yaygın bir uygulama olmakla birlikte, 5-7 μm çapındaki partiküllerle kaplı olan yüksek performanslı TLC (HPTLC) plakaları olarak adlandırılan plakaların kullanılması durumunda, bu plakalara maksimum olarak 100-200 nL örneklerin yüklenmesi mümkün olabilmektedir. İdeal olarak, HPTLC plakalarına örneğin yüklendiği lekeler dairesel olmalı ve çapları 1 mm’yi aşmamalıdır. Bu koşullar ise ancak birkaç nanolitre örneğin plaka üzerine yüklenmesi ile sağlanabildiğinden, analizi yapılacak olan örneklerin çoğunun plaka üzerine yüklenmeden önce yoğunlaştırılmasını gerektirmektedir. Örneklerin plaka üzerine yüklenmesi ise manüel olarak mikro-pipet veya mikro-şırıngaların kullanımı ile yapılabilir. Mikro-pipet ile plaka üzerine yüklenen çok küçük miktardaki örneğin çözücüsünün buharlaşmasına izin verildikten sonra, aynı işlem birkaç defa daha tekrarlanarak, plaka üzerine yeterli miktarda örneğin yüklenmesi sağlanabilir. Çözücünün uzaklaştırıldığı durumlarda ise buharlaşabilen ve ısıya-duyarlı olan bileşiklere karşı önlem alınmalıdır. Örneklerin plaka üzerine yüklenmesinde mikro-şırıngalar da kullanılabilir. Çok dikkatli olmak kaydıyla, örneğin plaka üzerine yüklenmesi esnasında, örnek yüklenen bölgenin ısıtılmasıyla solventin buharlaşması hızlandırılabilir. Bu sayede, aynı noktaya daha fazla miktarda örneğin yüklenmesi de sağlanmış olur. Bu amaçla, mikro-şırınga içerisindeki örnek çok yavaş olmak kaydıyla sürekli olarak plaka üzerine aktarılırken, aynı zamanda çözücünün buharlaşması için ısıtma işlemine devam edilir. Bu prosedür, bilgisayar kontrollü mikro-şırıngaların kullanılması ile otomotize edilebilir ve böylece, plaka üzerine hem daha fazla miktarda örneğin yüklenmesi hem de örnek lekelerinin fazla geniş olmaması sağlanmış olur. Günümüzde ise TLC plakalarının üzerine, örneklerin ayrı ayrı ya da çoklu gruplar halinde yüklenmesini sağlayan aparatlar mevcuttur. Bir örneğin otomatik olarak yoğunlaştırılmasını ve daha sonra plaka üzerine aktarılmasını sağlayan bu tip aparatlardan birisi Şekil 11.1’de şematik olarak gösterilmektedir. Bu aparat, ortasında vakum pompasına bağlantıyı sağlayan bir kanal ve üzerinde bir yarık bulunan plakadan ibarettir. Bu plakanın üzerine bir polimer membran yerleştirilir ve membranın içeriye doğru çökerek bir girinti oluşturması için vakum uygulanır. Uygulanan vakum nedeni ile yarığa doğru göçük oluşturan membranın bu çukurluğuna bir miktar örnek konularak çözücünün buharlaşması sağlanır. Bu işlem, TLC ile tatmin edici bir ayrıştırma işlemi için gerekli olan örnek miktarı membran üzerinde elde edilinceye kadar tekrarlanır. Bu prosedürde dikkat edilmesi gereken en önemli nokta ise membran üzerindeki örneğin kurumasına izin vermeden TLC plakasının üzerine aktarılmasıdır. Çünkü, kuruyan örneğin TLC plaksı üzerine aktarılması oldukça zordur, hatta kuruyan örnek tamamı ile membran üzerinde kalabilmektedir. Membran üzerinde yeteri kadar örnek yoğunlaştırıldığında, örnek hâlâ sıvı iken TLC plakası, durgun faz membrana temas edecek şekilde, membran üzerine kapatılır. TLC plakasının membran üzerine yerleştirilmesi

256

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

ile birlikte sisteme pozitif basınç verilerek, membran üzerindeki örneğin, yüzey gerilim kuvveti ve TLC plakasının durgun faz yüzeyinin adsorbent özelliği nedeni ile plaka üzerine geçmesi sağlanır. Örneğin transfer edildiği plaka ise daha sonra TLC tankına alınarak, plakanın geliştirilmesi tamamlanır.

Şekil 11.1: Örnek yoğunlaştırmaya ve TLC plakasına yüklemeye yarayan bir aparatın şematik yapısı ve çalışma prensibi.

Şayet, yarı-preparatif bir çalışma için daha fazla miktarda örneğe gereksinim duyuluyorsa, bu durumda örneklerin yüklenmesi leke şeklinde değil de bant şeklinde gerçekleştirilir. Örnek bantları ise ya yoğunlaştırma zonu’nun bulunduğu TLC plakalarının kullanılması ile ya da bant aplikatörleri’nin kullanılması ile oluşturulur. Yoğunlaştırma zonunun bulunduğu bir TLC plakasının şeması ise Şekil 11.2’de verilmektedir.

Şekil 11.2: Yoğunlaştırma zonu içeren bir TLC plakasının yapısı.

Yoğunlaştırma zonu yaklaşık olarak 2 cm genişliğinde olup, göreceli olarak silikanın daha iri partiküllerinden oluşmaktadır. Silikanın yoğunlaştırma zonundaki daha iri partikülleri ise göreceli olarak daha az yüzey alanına sahip olduğundan yoğunlaştırma zonu, normal geciktirme zonuna oranla daha düşük geciktirme kapasitesine sahiptir. Yoğunlaştırma zonu ve normal geciktirme zonu ise birbirine bitişik olarak, aynı plaka üzerine kaplanır. Normal geciktirme zonu, 5-7 mm çapındaki silika partiküllerinden oluştuğu için bu zondaki silika partiküllerinin yüzey alanları daha büyüktür ve bu nedenle, geciktirme kapasiteleri yoğunlaştırma zonuna oranla daha yüksektir. Birkaç mikrolitre veya daha fazla hacimdeki örneklerin birkaç tanesi, sırası ile TLC plakasının yoğunlaştırma zonunun ayrı bölgelerine yüklenebilir. Yükleme işleminden sonra, örnek solventinin buharlaşmasına izin verilerek, tekrar örnek yüklemesi yapılabilir. Böylece plaka üzerinde yeterli

11. TLC ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

257

miktarda örneğin bulunması sağlanır. Plaka üzerine yüklenmiş olan örnek, yoğunlaştırma zonu boyunca yayılarak geniş bir bant oluşturur. Örneklerin yüklenmiş olduğu plaka, TLC tankına alınarak geliştirilmeye başlandığında analitler, yoğunlaştırma zonunun düşük geciktirme kapasitesi nedeni ile bu zon boyunca çok hızlı bir şekilde ilerlerler ve yoğunlaştırma zonu ile normal geciktirme zonunun birleştiği ara-yüzeye ulaşırlar. Bu iki zonun birleştiği ara-yüzeyde ise analitler, keskin bir bant oluştururlar. Plakanın geliştirilmesi devam ettikçe analitler, geciktirme kapasitesi daha yüksek olan normal zonda birbirlerinden ayrılmaya başlarlar. Bu prosedürün başka avantajları da bulunmaktadır. Şayet örnekler, tuzlarla veya biyolojik polimerlerle kontamine ise bu kirleticiler, yoğunlaştırma zonunda tutuklanacaklardır. Böylece, kirleticiler plakanın normal ayrıştırma zonuna geçemeyeceklerinden dolayı analitlerin ayrıştırılması daha net olarak gerçekleşecektir. Bant aplikatörlerinin kullanımı ise daha farklıdır ve tamamen otomotize edilmiştir. Bu sistemde örnekler, örneğin yapısına ve oksidasyona karşı olan eğilimine bağlı olarak ya hava ya da azot içerisinde atomize edilirler. Bant uygulamalarında kullanılan bir atomizatörün şematik yapısı ise Şekil 11.3’de verilmektedir.

Şekil 11.3: Bant uygulamasında kullanılan bir atomizatörün şematik yapısı.

Bu sistemde mekanik bir kol üzerine yerleştirilmiş olan atomizatör, plaka üzerine örneklerin yüklenmesini sağlamak amacı ile plakanın bir kenarından diğer kenarına hareket ederek püskürtme yapabilmektedir. Atomizatörün hangi aralıklarda hareket edeceği ve plaka üzerine kaç örneğin yükleneceği ise genellikle bilgisayar kontrolündedir. Ayrıca aynı örnekten plaka üzerine ne kadar yükleneceği, yüklenen örneğin solventinin buharlaşması için bir sonraki yüklemeden önce ne kadar bekleyeceği, yani yükleme hızı da bilgisayarla kontrol edilebilmektedir. Örneklerin yeterli dozu plaka üzerine yüklendikten sonra plaka, normal prosedürle geliştirilir. 11.5. TLC Tankları ve Plakanın Geliştirilmesi

Analitlerin ayrıştırılması, genellikle içerisinde 1,5 cm derinlikte geliştirme solventi (hareketli faz) bulunan cam bir tank içerisinde gerçekleştirilir. Şekil 11.4’de iki basit TLC tankı şematik olarak gösterilmektedir. TLC tankı içerisine yerleştirilmiş olan TLC plakasının geliştirilmesi sırasında, plaka üzerindeki solventin (hareketli faz) buharlaşmasını önlemek amacı ile tank, kapaklı bir sistemden oluşmalıdır (bkz. Şekil 11.4,c). Çünkü, plakanın geliştirilmesi sırasında plaka üzerindeki solventin buharlaşması, solvent kompozisyonunun değişmesine neden olmaktadır. Kromatografi tankı içerisine yeterli miktarda solvent konduktan sonra tankın kapağı kapatılarak, en az 1 saat süreyle bekletilir. Böylece tank içerisindeki atmosfer, hareketli faz buharı ile doyurularak dengelenmiş olur. Tank içersindeki atmosferin hareketli faz buharı ile doyurulması amacı ile tankın iç duvarları veya duvarlarının bir kısmı, bazen filtre kağıdı ile kaplanır (bkz. Şekil 11.4,b). Tankın iç duvarına kaplanan filtre kağıdı, bir fitil görevi yaparak tankın tabanında bulunan solventi emer ve böylece buharlaşma için daha fazla yüzey oluşturulmuş olur. Tank içersindeki doygun solvent buharı, sadece plaka yüzeyinden meydana gelen buharlaşmayı önlemekle kalmaz, aynı zamanda yüzey de-aktivasyonu nedeni ile geciktirme mekanizmasını da kısmen kontrol eder.

258

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Sonuç olarak, dengeleme işleminin yapılmadığı durumlarda, solventin plaka üzerindeki yukarıya doğru olan kapiller hareketi düzenli olmaz ve bunun sonucu olarak da zayıf bir ayrıştırmanın elde edilmesine yol açar.

Şekil 11.4: TLC plakalarının geliştirilmesinde kullanılan (a) normal, (b) duvar kaplamalı kromatografi tankları ve (c) plakanın geliştirilmesi.

Hareketli faz içeren tank atmosferinin dengelenmesi sağlandıktan sonra, tank kapağı bir yana doğru kaydırılarak örneklerin yüklenmiş olduğu kısım hareketli faz içerisinde kalacak şekilde, plaka dikey olarak tank içerisine yerleştirilir. Daha sonra kapak yeniden kapatılarak, hareketli fazın plakanın üst kısımlarına doğru hareketi ile birlikte bileşiklerin de ayrıştırılması sağlanmış olur. Normal kromatografi tankına benzeyen başka bir tank tipinde ise (Şekil 11.5) tankın taban kısmında ayrı bir tekne yer alır. Bu tekne, solvent ile doldurularak tankın kapağı kapatılır ve tank içi atmosferin solvent buharı ile dengelenmesi sağlanır. Daha sonra, örneklerin yüklenmiş olduğu TLC plakası solventin bulunduğu tekneden ayrı olarak tank içerisine yerleştirilir ve plakanın solvent buharı ile dengelenmesi için birkaç dakika bekletilir. Dengelenen plaka daha sonra solvent teknesine aktarılarak normal geliştirme işlemi uygulanır.

Şekil 11.5: TLC plakasının geliştirilmeden önce solvent buharı ile doyurulmasında kullanılan tank sisteminin şematik yapısı.

11. TLC ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

259

TLC plakasının geliştirilmeden önce solvent buharı ile dengelenmesinin iki etkisi vardır (Şekil 11.6): i. Önceden dengelenmiş plakada solvent ucunun, önceden dengelenmemiş plakaya oranla daha ileride olduğu görülür. ii. Önceden dengelenmemiş plakada solventin önemli bir kısmı, geliştirme işleminin daha başlangıcında silika yüzey üzerine adsorblanır. Bu nedenle, ayrıştırılmış olan analitler solvent ucuna çok daha yakındırlar. Buna bağlı olarak, önceden doyurulmuş plaka üzerinde solvent ucunun daha hızlı hareket etmesinin görünen sonucu, analiz zamanında doyurulmamış olan plakadaki örnek yükleme noktalarının solvent ucuna daha yakın olması ile sonuçlanır.

Şekil 11.6: Plakanın geliştirilmeden önce solvent buharı ile dengelenmesinin, ayrıştırma kapasitesi üzerine olan etkisi.

Birçok durumda, önceden doyurulmuş plakanın gerçek ayrıştırma üzerine olan etkisi küçüktür fakat bu etki, birbirlerine çok yakın olarak ilerleyen analitlerin ayrıştırılmasında önemli bir farklılık meydana getirebilir. Dağılma ve adsorbsiyon ayrıştırmasının çözünürlüğünü artırmak amacı ile iki-boyutlu kromatografi kullanılabilir. Bu teknikte kromatografiye tâbi tutulacak materyal, plakanın bir köşesine doğru tek bir leke olarak yüklenir ve plakanın geliştirilmesi tek yönde yapıldıktan sonra plaka tanktan alınarak kurutulur. Kurutulan plaka, ayrıştırılacak olan bileşiklerin farklı Kd değerleri gösterdiği başka bir hareketli faz içerisinde, birinci kromatografi ile doksan derecelik açı yapacak şekilde eğilerek yeniden geliştirilir. TLC’nin en önemli avantajlarından birisi, ayrıştırma işleminin çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesidir. Bu süre ise genellikle 30 dk olmakla birlikte, çok ender durumlarda 90 dk’yı aşmaktadır. 11.6. Kesiksiz Plaka Geliştirme

Bir TLC plakasına yüklenmiş olan örneklerin normal olarak geliştirilmesi, plakanın fiziksel boyutları ile sınırlı kalmaktadır, fakat kesiksiz geliştirme tekniği olarak adlandırılan yöntemin uygulanması, özel ekipmanların kullanılmasını gerektirmektedir. Kesiksiz plaka geliştirme metodunda uygulanan düzenek ise şematik olarak Şekil 11.7’de gösterilmektedir.

260

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

Şekil 11.7: Kesiksiz TLC plaka geliştirmesinde kullanılan aparatın şematik yapısı.

Bu teknikte, örneklerin yüklenmiş olduğu plaka ters çevrilerek, durgun fazın bulunduğu yüzey aşağıya bakacak şekilde ikinci bir cam levha üzerine yatay olarak yerleştirilir. Örnek plakası ile cam levha arasına hareketli fazı, hareketli faz rezervuarından emerek, plakalar arasına transfer edecek olan bir fitil yerleştirilir. Hareketli fazın plaka üzerindeki hareketini etkileyen faktörlerin etkisinden kaçınmak için, plakaların geliştirilmesi sırasında sistem sıcaklığının sabit tutulması ve sistemin tamamının uygun bir ortam içinde tutulması önemlidir. Fitil aracılığı ile hareketli faz rezervuarından iki plaka arasına transfer edilen hareketli faz, normal TLC’de olduğu gibi yüzey gerilim kuvveti ve kapiller sistem aracılığı ile durgun faz boyunca plakanın ucuna kadar ulaşır. Örnek plakasının son ucunda küçük bir alan ise elektriksel olarak ısıya maruz bırakılarak buraya ulaşan hareketli fazın buharlaşması sağlanır. Bu sayede plaka boyunca hareketli fazın sürekli olarak ilerlemesi sağlanmış olur. Bu şekli ile kesiksiz-TLC, LC’nin levha şekilli bir formuna benzemektedir. Bu tekniğin önemi ise LC kolonunun bir simülasyonu olması nedeni ile neden ilk etapta LC’nin kullanılmadığı gerekçesi ile sorgulanabilir. 11.7. Analitlerin Belirlenmesi

Analitlerin belirlenmesi için birkaç farklı metot bulunmaktadır. Plakanın UV ışığı altında incelenmesi ile UV-absorbe eden veya flouresans özellik gösteren bileşiklerin pozisyonları belirlenebilir. Ticari olarak bulunan ince-tabaka adsorbentlerin çoğu, flouresans bir boya içermektedir. Flouresans boya içeren plakalar geliştirildikten sonra UV altında incelendiğinde, ayrıştırılmış olan bileşikler flouresans arka plana karşı mavi, yeşil veya siyah alanlar olarak görülmektedir. Şayet satüre olmamış (unsature) bileşikler araştırılıyorsa, plakanın geliştirildikten sonra iodin buharına maruz bırakılması kullanışlı olabilmektedir. Plakanın özgül renk ajanları ile spreylenmesi ise bazı bileşiklerin boyanmasına yol açmaktadır. Örneğin ninhidrin, amino asitlerin ve peptidlerin boyanmasına yol açarak; anilin ise heksoz karbonhidratların kahve, pentozların ise pembe olarak boyanmasını sağlayarak, bu bileşiklerin lokasyonlarının belirlenmesinde kullanılmaktadırlar. Şayet bileşikler radyoizotoplar ile işaretlenmiş ise plaka ya otoradyografiye maruz bırakılır ya da radyokromatograf tarayıcıda taranır. Otoradyografi sonucunda ise ayrıştırılmış olan bileşiklere ait olan lekeler, X-ışını filmi üzerinde siyah alanlar olarak belirlenir. Özgül olmayan, genel bir teknik ise plakaların %50 (v/v) sülfürik asit veya etanol içinde %25 (v/v) sülfürik asit ile spreylendikten sonra 110 °C’da fırınlanmasıdır. Fırınlama işlemi sonucunda bileşiklerin çoğu yanarak kömürleşmekte ve kahverengi lekeler olarak görülmektedir. Bahsedilen bu son metodun uygulanması sırasında ise sülfürik asit kullanımından dolayı çok dikkatli olmak gerektiğini de unutmamak gerekir. Bileşiklerin TLC üzerindeki hareketleri Rf değerlerine göre karakterize edilse de, bu değerler her zaman tekrarlanabilir değildir. Bu nedenle, bileşiklerin tanımlanmasında genellikle ayrıştırılacak olan bileşikler ile aynı plaka üzerinde yürütülen standart bileşikler kullanılmaktadır. Örnek materyali

11. TLC ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ

Doç. Dr. Münir TUNCER

261

ile birlikte aynı plakada yürütülen standart bileşiklerin plaka üzerinde aldıkları yol ile örnek bileşiklerin aldıkları yolların karşılaştırılması yapılarak bileşiklerin tanımlanması yapılmaktadır. Plaka üzerine yüklenen herhangi bir lekedeki bileşiklerin miktarı ise farklı yollarla belirlenebilir. Radyoizotop işaretli bileşiklerin kullanılması durumunda, bileşiklerin miktarlarının plaka-üzerinde doğrudan belirlenmesi, radyokromatograf taraması ile belirlenebilir veya daha genel olarak densitometre ile belirlenebilmektedir (bkz. Şekil 11.8). Bileşiklerin UV veya görünen ışık absorbsiyonlarını ölçen ve aynı zamanda bileşiklerin tanımlanmasında kullanılmak amacı ile bileşiğin absorbsiyon spektrumunu veren, hassas densitometreler ise ticari olarak bulunmaktadır. Bileşiklerin miktarlarının plaka-dışında belirlenmesi ise, bileşik lekelerinin etrafındaki durgun faz ile birlikte plakadan kazınarak uygun bir solvent içine alınmasından sonra, durgun fazın ortamdan uzaklaştırılması ile yapılabilir. Solüsyon içindeki bileşiğin miktarı ise yaygın olarak kullanılan kolorimetri veya flourometri gibi standart bir metotla belirlenebilir.

Şekil 11.8: (a) A-D bileşiklerini içeren bir karışımın TLC ile ayrıştırılması. (b) TLC ile ayrıştırılmış olan bileşiklerin densitometre sonuçları. Bu veriler ise bileşiklerin miktarlarının hesaplanmasında kullanılabilmektedir.

11.8. Kâğıt Kromatografi (PC) 11.8.1. Temel Prensipler

Kâğıt kromatografisinin prensibi, ince-tabaka kromatografisinin prensibine çok benzemektedir. Kromatografi kağıdının selüloz lifleri sabit faz için destek materyali gibi rol oynar. Sabit faz su, sıvı parafin gibi polar-olmayan bir materyal veya katı adsorbentin doyurulmuş partikülleri olabilir. Yavaş, orta hızlı ve hızlı gibi farklı hızlara sahip kromatografi kağıtları bulmak mümkündür. Diğer kromatografi kağıtları ise analizleri etkileyebilecek safsızlık kalıntılarını uzaklaştırmak için asitle yıkanmışlardır. Adsorbsiyon ve normal faz partisyon kâğıt kromatografisi için uygun kağıtları ticari olarak bulmak mümkündür. Ters-faz kromatografi kağıtları ise kullanılmadan hemen önce hazırlanmak zorundadırlar.

262

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

11.8.2. Deneysel Prosedür

İnce-tabaka kromatografisinde olduğu gibi (bkz. kısım 11.4) örneklerin kâğıt tabakaları üzerine yüklenmesinden sonra, kâğıt kromatografisinin gerçekleştirilmesi için iki metot bulunmaktadır: çıkışlı veya inişli. Her iki durumda da hareketli faz, kapaklı bir kromatografi tankı veya cam kavanoz içerisine konulduktan sonra, ortamdaki atmosferin solvent buharı ile doyuma ulaşmasına izin verilir. Çıkışlı metotta, uygulanacak olan prosedür kısım 11.4’de tanımlanmış olan ince-tabaka kromatografisindeki prosedür ile aynıdır. Örneklerin yüklenmiş olduğu noktalar ise solvent yüzeyinin hemen üzerinde olmalıdır ki, hareketli fazın kapiller etki ile kağıdın yukarısına doğru hareketi sırasında bileşiklerin ayrılması sağlanabilsin (bkz. Şekil 11.9,a).

Şekil 11.9: Kâğıt kromatografisinde (a) çıkışlı (b) inişli metodun şematik olarak gösterilmesi.

İnişli metotta ise örneklerin yüklenmiş olduğu noktaya yakın olan kâğıt ucu, tankın yukarı kısmında bulunan bir tekne içinde tutulur. Kromatografi kağıdının geri kalan kısmının ise tekneden aşağıya doğru düşey olarak sarkmasına izin verilir, fakat kağıdın bu kısmının tankın dibinde bulunan solvent ile temas etmesine izin verilmez (Şekil 11.9,b). Kromatografi işlemi başlatılacağı zaman, tankın üst kısmında bulunan tekneye hareketli faz eklenir. Tekne içindeki solvent aşağıya sarkan kâğıt boyunca yer çekimi ve kapiller etki nedeni ile ilerlerken, yükleme noktasındaki bileşikleri de taşıyarak ayrıştıracaktır. Uygulama kolaylığı nedeni ile çıkışlı kromatografi tekniği sıklıkla tercih edilen bir yöntem olmasına rağmen, inişli teknikte hareketli fazın hareketi daha hızlıdır. İki-boyutlu kromatografi, incetabaka kromatografisindeki mantıkla kâğıt kromatografi için de uygulanabilir. Kâğıt kromatografisi ile ayrıştırılmış olan analitlerin belirlenmesi ise TLC’deki ile aynıdır, fakat kağıdın parçalanmasına yol açtığı için sülfürik asit ile spreylemeden kaçınılmalıdır. Herhangi bir analitin tanımlanması ise o analitin Rf değeri ile yapılabilir. Günümüzde ise kâğıt kromatografisinin ciddi olarak kullanıldığı çok az sayıda biyokimyasal uygulama bulunmaktadır.

Ek 1: Amonyum Sülfat Presipitasyon Tablosu. 0°C’da 1 L solüsyona eklenecek olan amonyum sülfat miktarı (gram). Başlangıç Derişimi (%) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

5 27 0

10 55 27 0

15 84 56 28 0

20 113 85 57 28 0

25 144 115 86 58 29 0

30 176 146 117 88 59 29 0

35 208 179 149 119 89 60 30 0

40 242 212 182 151 121 91 61 30 0

45 277 246 216 185 154 123 92 62 31 0

Son derişim (%) 50 55 314 351 282 319 251 287 219 255 188 223 157 191 126 160 94 128 63 96 31 64 0 32 0

263

60 390 357 325 292 260 227 195 163 130 97 65 33 0

65 430 397 364 331 298 265 232 199 166 132 99 66 33 0

70 472 439 405 371 337 304 270 236 202 169 135 101 67 34 0

75 516 481 447 413 378 344 309 275 241 206 172 138 103 69 34 0

80 561 526 491 456 421 386 351 316 281 245 210 175 140 105 70 35 0

85 608 572 537 501 465 429 393 358 322 286 250 215 179 143 107 72 36 0

90 657 621 584 548 511 475 438 402 365 329 292 256 219 183 146 110 73 37 0

95 708 671 634 596 559 522 485 447 410 373 335 298 261 224 186 149 112 75 37 0

100 761 723 685 647 609 571 533 495 457 419 381 343 305 266 228 190 152 114 76 38 0

264

KAYNAKLAR 1. Anonymous (1993) Hydrophobic Interaction Chromatography: Principles and Methods. Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech p. 103. 2. Anonymous (1995) Ion ExchangeChromatography: Principles and Methods. Edition AA. Amersham Pharmacia Biotech p. 157. 3. Anonymous (1998) Gel Filtration: Principles and Methods. 8 th Edition. Amersham Pharmacia Biotech p. 103. 4. Anonymous (1999) Reversed Phase Chromatography: Principles and Methods. Edition AA. Amersham Pharmacia Biotech p. 85. 5. Anonymous (2001a) Affinity Chromatography: Principles and Methods. Edition AC. Amersham Pharmacia Biotech p. 156. 6. Anonymous (2001b) Chromatofocusing with Polybuffer and PBE Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech p. 85. 7. Ansari, A.A. and Mage, R.G. (1977). Molecular-weight estimation of proteins using Sepharose CL-6B in guanidine hydrochloride. J. Chromatogr. 140: 98-102. 8. Axen, R., Porath J. and Ernback, S. (1967). Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature. 214: 1302-1304. 9. Bao, J. and Regnier, F.E. (1991) Ultramicro enzyme assays in a capillary electrophoretic system. J. Chromatogr. 608: 217-224. 10. Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. (1991) Protein Methods. Wiley-Liss. New York. 11. Boyer, R. (2000) Modern Experimental Biochemistry. Third Edition. Benjamin Cummings. San Francisco. 12. Cazes, J. and Scott, R.P.W. (2002). Chromatography Theory. Marcel Dekker, Inc. New York. 475 p. 13. Chaplin, M.F. and Bucke, C. (1990) Enzyme Technology. Cambridge University Press. UK. 14. Chicz, R.M. and Regnier, F.E. (1990). High-Performance Liquid Chromatography: Effective protein purifiacation by various chromatograpic modes. Methods in Enzymology. 182: 392-421. 15. Cunico, R.L., Gooding, K.M. and Wehr, T. (1998) Basic HPLC and CE of Biomolecules. Bay Bioanalytical Laboratory. Inc. Richmond. Californis. USA. 16. Dennison, C. (1999) A Guide to Protein Isolation. Hingham, MA, USA. Kluwer Academic Publishers. 186 p. 17. Deutscher, M.P. (1990). Maintaining protein stability. In: Guide to Protein Purification. (Ed: Deutscher, M.P.). Methods in Enzymology. 182: 83-89. 18. Englard, S. and Seifter, S. (1990). Precipitation techniques. Methods in Enzymology. 182: 285-300. 19. Ettre, L.S. (2003). M.S. Tswett and the Invention of Chromatography. Milestones in Chromatography. LCGC North America. 21 (5): 458-467. 20. Fersht, A. (1985). Enzyme structure and mechanism. Second Edition. W.H. Freeman and Company. New York. 21. Flores, O., Lu, H. and Reinberg, D. (1992) Factors involved in specific transcription by mammalian RNA polymerase II. Identification and characterization of Factor II H. J. Biol. Chem. 267: 2786-2793. 22. Gianazza, E. and Righetti, P.G. (1980). Size and charge distribution of macromolecules in living systems. J. Chromatogr. 193:1-8.

266

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

23. Giri, L. (1990) Chromatofocusing. Methods in Enzymology. 182: 380-392. 24. Gorbunoff, M.J. (1990). Protein chromatography on hydroxyapatite columns. Methods in Enzymology. 182: 329-339. 25. Haeckel, R., Hess, B., Lauterborn, W. and Wurster, K. (1968). Purification and allosteric properties of yeast purivat kinase. Hoppe-Seyler’s Z. Phsiol. Chem. 349: 699-714. 26. Haff, L.A., Fagerstam, L.G. and Barry, A.R. (1983) Use of electrophoretic titration curves for predicting optimal conditions for fast ion exchange chromatography of proteins. J. Chromatogr. 266: 409-425. 27. Hagel, L. (1985) Effect of sample volume on peak width in high-performance gel filtration chromatography. J. Chromatogr. 324: 422-427. 28. Hagel, L. (1989) Gel filtration. In: Protein Punfication. Principles, high resolution methods, and application. (ed. J.-C. Janson and L. Rydén), VCH Publishers Inc., New York, Weinheim, Cambridge. pp 63-106. 29. Heiger, D.N. (1992) High performance capillary electrophoresis. p. 100-101, HewlettPackard, Waldbronn, Germany. 30. Hijertén, S. (1976) Hydrophobic interaction chromatography of proteins on neutral adsorbents, in: Methods of protein separation, vol. 2. Catsimpoolas, N., Ed., Plenum Publishing Corporatin, New York. 31. Hijertén, S., Rosengren, J. and Pahlman, S. (1974). Hydrophobic interaction chromatography. The synthesis and the use of some alkyl and aryl derivatives of agarose. J. Chromatog. 101: 281-288. 32. Hijertén, S., Yao, K., Eriksson, K.-O. and Johansson, B. (1986). Gradient and isocratic High Performance Hydrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarose columns. J. Chromatog. 359: 99-109. 33. Janson, J-C. and Rydén, L. (1998). Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. 2nd Ed. Wiley İnc. 34. Kennedy, R.M. (1990) Hydrophobic Chromatography. Methods in Enzymology. 182: 339343. 35. Kopperschläger, G., Freyer, R., Diezel, W. and Hofmann, E. (1968). Some kinetic and molecular properties of yeast phosphfructokinase. FEBS (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 1: 137-141. 36. Lamy, J., Lamy, J. and Weill, J. (1979) Arthropod hemocyanin structure: isolation of eight subunits in the scorpion. Arch. Biochem. Biophys. 193: 140-149. 37. Martin, J.L., Migus, A., Poyart, C., Lecarpentier, Y., Antonetti, A. and Orszag, A. (1982). Femtosecond photodissociation and picosecond recombination of O2 in myoglobin: A plausible explanation for the low quantum yield in MbO2. Biochemical and Biophysical Research Communications, 107: 803-810. 38. Motorin, Y.A., Wolfson, A.D., Tsygankov, A.Y. and Orlovsky, A.F. (1987) Rapid isolation of Escherichia coli β-galactosidase by fast protein liquid chromatography. J. Chromatogr. 393: 462-465. 39. Müller, W. (1986) Fractionation of DNA restriction fragments with ion exchangers for high performance liquid chromatography. European Journal of Biochemistry 155: 203212. 40. Murel, A., Vilde, S., Pank, M., Shevchuk, I. and Kirret, O. (1986). Chromatophoresis: A new approach to the theory and practice of chromatofocusing : II. Experimental verification. J. Chromatogr. 362: 101-112. 41. O'Carra, P., Barry, S. and Griffin, T. (1973). Spacer arms in affinity chromatography: the need for a more rigorous approach. Biochem. Soc. Trans. 1: 289-290.

KAYNAKLAR

Doç. Dr. Münir TUNCER

267

42. Olson, C.V., Reifsnyder, D.H., Canonva-Davis, E., Ling, V.T. and Builder, S.E. (1994) Preparative isolation of recombinant human insulin-like growth factor 1 by reversedphase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 675: 101-112. 43. Ostrove, S. (1990). Affinity chromatography: General methods. Methods in Enzymology. 182: 357-371. 44. Peterson, E.A. and Sober, H.A. (1956). Chromatography of Proteins. I. Cellulose Ion Exchange Adsorbents. J. Amer. Chem. Soc. 78: 751-755. 45. Pohl, T. (1990). Concentration of proteins and removal of solutes. Methods in Enzymology. 182: 68-83. 46. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. and Belfrage, G. (1975). Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 258: 598-599. 47. Porath, J., Maisano, F. and Belew, M. (1985). Thiophilic adsorption–a new method for protein fractionation. FEBS (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 185: 306-310. 48. Porath, J., Sundberg, L., Fornstedt, N. and Olson, I. (1973). Salting-out in amphiphilic gels as a new approach to hydrophobic adsorption. Nature, 245: 465-466. 49. Renlund, S., Erlandsson, I., Hellman, U., Silberring, J., Wernstedt, C., Lindström, L. and Nyberg, F. (1993) Micropurification and amino acid sequence of β-casomorphin-8 in milk from a woman with postpartum psychosis. Peptides 14: 1125-1132. 50. Roos, P., Nyberg, F. and Wide, L. (1979) Isolation of Human Pituitary Prolactin. Biochim. Biophys. Acta 588: 368-379. 51. Rossomando, E.F. (1990). Ion-Exchange Chromatography. Methods in Enzymology 182: 309-317. 52. Rossomando, E.F. (1998) HPLC in Enzymatic Analysis. Second Edition. Methods of Biochemical Analysis. Volume 38. John Wiley and Sons. Inc. New York. 53. Sadek, P.C., (2002) The HPLC Solvent Guide. 644 p., John Wiley and Sons Inc., Canada. 54. Sakamoto, Y., Kawakami, N. and Sasagawa, T. (1988) Prediction of peptide retention times. J. Chromatogr. 442: 69-79. 55. Scopes, R.K. (1994) Protein Purification: Principles and Practice. Third Edition. Springer. New York. 56. Scott, C.S., Patel, M., Stark, A.N. and Roberts, B.E. (1987) FPLC of leukaemia cell N-Acetil β-D-Hexosaminidases. Leukemia Res. 11: 437-444. 57. Sluyterman, L.A.A. and Elgersma, O. (1978). Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ionexchange columns: I. General principles. J. Chromatogr. 150: 17-30. 58. Sluyterman, L.A.A. and Wijdenes, J. (1978). ). Chromotofocusing: isoelectric focusing on ion exchange columns. II. Experimental verification. J. Chromatogr. 150: 31-44. 59. Sluyterman, L.A.A. and Wijdenes, J. (1981). Chromatofocusing III. The properties of a DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations. J. Chromatogr. 206: 429-440. 60. Smith, R.D., Udseth, H.R., Barinaga, C.J. and Edmonds, C.G., (1991) Instrumentation for high performance capillary electrophoresis-mass spectrometry. J. Chromatogr. 559: 197-208. 61. Snyder, L.R., Kirkland, J.J. and Glalch, J.L. (1997) Practical HPLC Method Developments. Second Edition. John Wiley and Sons. Inc. New York. 62. Stellwagen, E. (1990). Chromatography on immobilized reactive dyes. Methods in Enzymology. 182: 357-371. 63. Stellwagen, E. (1990). Gel filtration. Methods in Enzymology. 182: 317-328. 64. Stone, K.L., LoPresti, M.B., Crawford, J.M., DeAngelis, R. and Williams, K.R. (1991) Reversed-phase HPLC separation of sub-nanomole amounts of peptides obtained

268

Doç. Dr. Münir TUNCER

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

from enzymatic digests. In: High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation, Analysis and Conformation. (Eds. Mant C.T. and Hodges, R.S.) CRC Press, Boca Raton. pp 669-677. 65. Stoscheck, C.M. (1990). Quantitation of protein. Methods in Enzymology. 182: 50-68. 66. Stracke, M.L., Krutzsch, H.C., Unsworth, E.J., Arestad, A., Cioce, V., Schiffmann, E. and Liotta, L.A. (1992) Identification, purification and partial sequence analysis of Autotaxin, a novel motility-stimulating protein. J. Biol. Chem. 267: 2524-2529. 67. Stryer, L. (1998). Biochemistry. Third Edition. W.H. Freeman and Company. New York. 68. Tagliaro, F., Deyl, Z. and Miksik, I., (1998). Applications of HPLC/HPCE in Forensics. In: HPLC in Enzymatic Analysis. Rossomondo E.F. (Ed.) Second Edition, John Wiley & Sons Inc., Canada. pp. 164-206. 69. Tiselius, A. (1948). Adsorption separation by salting out. Arkiv for Kemi, Mineralogi Geologi 26B: 1-5. 70. Visser, J. and Strating, M. (1975). Separation of lipoamide dehydrogenase isoenzymes by affinity chromatography. Biochim. Biophys. Acta 384: 69-80. 71. Walsh, G. (2002). Proteins, Biochemistry and Biotechnology. Jonh Wiley & Sons, Ltd. England. 72. Warburg, O. and Christian, W. (1941) Isolierung und kristtallisation des Gärungs-fermentes Enolase. Biochem. Z. 310: 384-421. 73. Wilson, K. and Walker, J. (1995). Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 4. Edition. Cambridge University Press. UK.