Gallbladder and Biliary Tract Diseases

Gallbladder and Biliary Tract Diseases   

Gastroenterology and Hepatology Executive Editor J. Thomas LaMont, M.D. Chief, Division of Gastroenterology Beth Israel Hospital Boston, Massachusetts and Charlotte F. and Irving W. Rabb Professor of Medicine Harvard Medical School Boston, Massachusetts 1. Crohn's Disease, edited by Cosimo Prantera and Burton I. Korelitz 2. Clinical Gastroenterology in the Elderly, edited by Alvin M. Gelb 3. Biliary and Pancreatic Ductal Epithelia: Pathobiology and Pathophysiology, edited by Alphonse E. Sirica and Daniel S. Longnecker 4. Viral Hepatitis: Diagnosis • Treatment • Prevention, edited by Richard A. Willson 5. Gastrointestinal Infections: Diagnosis and Management, edited by J. Thomas LaMont 6. Gastroesophageal Reflux Disease, edited by Roy C. Orlando 7. Gallbladder and Biliary Tract Diseases, edited by Nezam H. Afdhal ADDITIONAL VOLUMES IN PREPARATION

  

Page i

Gallbladder and Biliary Tract Diseases edited by Nezam H. Afdhal Beth Israel Deaconess Medical Center Harvard Medical School Boston, Massachusetts

  

Page ii

ISBN: 0­8247­0311­1 This book is printed on acid­free paper. Headquarters Marcel Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York, NY 10016 tel: 212­696­9000; fax: 212­685­4540 Eastern Hemisphere Distribution Marcel Dekker AG Hutgasse 4, Postfach 812, CH­4001 Basel, Switzerland tel: 41­61­261­8482; fax: 41­61­261­8896 World Wide Web http://www.dekker.com The publisher offers discounts on this book when ordered in bulk quantities. For more information, write to Special Sales/Professional Marketing at the headquarters  address above. Copyright © 2000 by Marcel Dekker, Inc. All Rights Reserved. Neither this book nor any part may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, microfilming, and  recording, or by any information storage and retrieval system, without permission in writing from the publisher. Current printing (last digit): 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 PRINTED IN THE UNITED STATES OF AMERICA

  

Page iii

In Memoriam

This book is dedicated to the fond memory of Edward Weldon Moore, M.D., Ph.D. Ed died on Christmas Eve, 1999, following a long illness during which every  system failed except his infectious sense of humor. Ed was a peerless collaborator and close friend to most of the contributors to this book, and his uniquely creative  mind originated or stimulated many of the concepts presented here. Ed was born in Covington, Kentucky, and graduated with top honors from Vanderbilt University Medical School in 1955. From 1955 to 1960, he underwent  residency training on the Harvard Medical Service at Boston City Hospital and Lemuel Shattuck Hospital in Boston, and spent 2 years as a Clinical Associate at the  National Cancer Institute in Bethesda, MD. In 1960, he returned to the Shattuck Hospital as an NIH Research Fellow with Dr. Thomas Chalmers. From 1965 to  1970, he was Chief of Gastroenterology at the Shattuck Hospital and recipient of a Research Career Development Award from the NIH, the first of his many NIH  research grants. During the 1960s, he was a member of Dr. Franz Ingelfinger's famous GI Journal Club at Boston University. In 1970, Ed moved permanently to the  Medical College of Virginia in Richmond. There he became Director of Gastrointestinal Research and Professor of Medicine, Pathology, Physiology, and Biophysics,  ultimately becoming Emeritus in 1998.

  

Page iv

Ed was a most vibrant, inquisitive person, who never lost his boyish excitement about the mysteries of the universe, natural phenomena, electronics, animals, and  people. He loved gadgets and was co­developer of the calcium­ion electrode; his basement was filled with one of the largest private collections of miniature electric  trains in the United States, which he built entirely by himself. Ed's innate charm, warmth, and unbounded enthusiasm always made him fun and stimulating to be with, rendering him a consummate teacher. Besides his many  original publications and insightful review articles and book chapters, Ed was the heart and soul of the Undergraduate Teaching Project of the American  Gastroenterological Association for 2 years. This group produced over 30 sets of outstanding visual aids to assist medical faculty in the education of students and  trainees in fundamental pathophysiological concepts of gastrointestinal and liver diseases. In 1997, the AGA honored him for his many contributions by presenting him  with its Distinguished Educator Award. We mourn the loss of an irreplaceable colleague whose diverse scientific contributions—many of which are included in this book—will long outlive him. J. Donald Ostrow, M.D. It is a pleasure and an honor to be invited to join my long­standing friend and colleague Don Ostrow in dedicating this timely volume to Ed Moore, a uniquely creative  and charismatic medical investigator who died after a long battle with aspergillosis. In this book, Nid Afdhal has assembled the thoughts of the "best and the brightest"  to survey our current knowledge (and ignorance) of the pathophysiology of the biliary tract and gallbladder. If Ed had recovered from his debilitating illness, he surely  would have contributed a chapter that contained dazzling new insights. Some 15 years ago, Ed Moore, Don Ostrow, and I created a collaborative research program aimed at developing principles of calcium precipitation in bile. Over the  next decade, we met regularly in Ed's palatial country home to develop strategy and to discuss our latest research findings. We were supported by a large NIH grant  that Ed had orchestrated. Ed studied calcium binding to bile acid monomers and micelles, and worked on calcium entry into bile. Don joined forces with Pasupati  Mukerjee, a superbly talented colloid chemist, to define the ionization properties of bilirubin and the solubility product of the calcium salt relevant to pigment stone  formation. My laboratory studied calcium entry into bile as well as measuring the solubility products of the calcium salts of the natural conjugated and unconjugated bile  acids. This work was performed in collaboration with Karol Mysels, a legendary physical chemist, now deceased, and led to the development of the idea of "calcium­ sensitive ions" and calcium precipitation. Our trio soon became a quartet when Bob Rege joined the group. Ed acted as a theoretician and Bob did the experiments in the dog. Together they showed that  hepatic bile was supersaturated in calcium (carbonate), and that gallbladder mucosal acidification rendered bile unsaturated by increasing the bicarbonate/carbonate  ratio. Ed also revisited his long­standing interest in the Donnan equilibrium and, with Bob, showed that the concentration of calcium in bile could be explained by  application of this well­known physicochemical principle. Thus, the idea gradually emerged that because the paracellular junctions of both the canaliculus and the  biliary ductule were permeable to calcium, the activity of biliary calcium was rather constant. If this were the case, calcium precipitation in bile had to be explained  predominantly by an increase in the activity of the calcium­sensitive anion. Reno Vlahcevic, Ed's chief at Medical College of Virginia, made the classic finding of a diminished exchangeable bile acid pool in gallstone patients. He encouraged  Ed to share his long­standing interest in cholesterol gallstone formation. Ed created the classic Venn diagram that suggested that cholesterol gallstone formation results  from the simul­

  

Page v

taneous occurrence of cholesterol supersaturation, impaired gallbladder motility, and an excess of nucleation factors. He coined the term "beyond supersaturation,"  popularizing an idea that Tom Holzbach had advanced many years before. Ed stimulated Mitch Shiffman to perform detailed analyses of biliary lipid and electrolyte  composition in obese patients undergoing rapid weight loss after gastric bypass surgery. Ed developed the idea that the mucus layer played a key role in cholesterol  gallstone formation and began to collaborate with Nid Afdhal and his colleagues, most notably Gwynneth Offner, who were cloning the mucin genes and defining  mucin function. He also began experiments with cultured bile duct cells and gallbladder epithelial cells. Using the latter, he observed phospholipid transport perhaps by  lateral diffusion and raised the question as to the extent to which the gallbladder mucosa absorbed phospholipid as well as cholesterol. Ed's health began to decline about 5 years ago, and his productive hours became fewer each day. When he could work, his energies were absorbed in analyzing his  hospital bills, whose complexity and inscrutability often defied scientific logic. Abstracts were not translated into papers. His last grant application is replete with ideas  that need experimental verification. Ed's mission was to understand, to make the world laugh, and to debunk scientific pretense. His origins in rural Kentucky made him love the common man and detest  arrogance in any form. He had a deep knowledge of solution chemistry, electrophysiology, and transport phenomena, and he applied this unusual background to  advance biliary physiology. Ed's diverse contributions advanced the field greatly and stimulated many of us. He enriched our lives with his charm, warmth, and humor.  We shall all miss him deeply. Alan Hofmann, M.D., Ph.D.

  

Page vii

Preface The gallbladder and biliary tract are the "orphan organs" of the digestive system, falling between the realms of the solid­organ liver specialist and the hollow­organ  intestinal expert. This orphan status has led to the inclusion of the gallbladder in texts of both gastroenterology and hepatology, but no major comprehensive text has  been devoted to disorders of the gallbladder. With the recent advances in both the basic pathophysiology of gallbladder disease and the introduction of many new  treatment modalities, the time has come for the gallbladder to claim its place as a major organ in the digestive tract and to have a comprehensive text of its own. In addition, biliary tract disease remains the most expensive of all digestive diseases, with a total health care cost in the United States of over $7 billion. Gallstones are  the major cause of biliary disease, and the incidence of symptomatic stones is rising with our aging population. Major advances have occurred in our understanding of  the epidemiology and pathogenesis of gallstone disease; these can potentially be used as novel strategies for gallstone prevention. Such advances in the basic sciences  have been slow to translate into real clinical therapies, perhaps because of the advent and rapid rise of laparoscopic cholecystectomy. However, the management of  gallbladder and biliary disease is truly multidisciplinary, involving gastroenterologists, surgeons, endoscopists, and radiologists. Wherever possible, the team approach  to management and the concept of biliary centers are promoted within this book. In this book we have also attempted to translate advances in basic science into clinically relevant treatment and to bridge the gap between clinical disciplines. Parts I  and II focus on important physiological and pathophysiological principles, with a special emphasis on gallstones. The contributors represent the leading researchers in  gallbladder physiology, smooth muscle function, and lipid metabolism. Each chapter is written with a focus on new advances in our understanding of basic mechanisms,  with illustrations of how these may translate into clinical treatment for gallstones. In Parts III to V we focus on clinical disorders of the gallbladder and biliary tree with  input on management from surgeons, endoscopists, and radiologists. Where appropriate, a chapter on combined management highlights the areas in which a team  approach involving all disciplines is mandatory, as in the treatment of common duct strictures. New imaging techniques, such as magnetic resonance cholangiography  and endoscopic ultrasound, are discussed from both the radiologist's and endoscopist's perspective and their role in disease management is defined. Finally, this book will serve as a comprehensive text for both basic researchers and clinicians involved in the management of biliary tract disease. I hope it will spark

  

Page viii

further research and collaboration that will lead to better clinical treatment modalities for biliary diseases. When I was first approached about putting together a book on gallbladder and biliary diseases, I felt that there was little place for yet another clinical text in this field. I  envisioned a more ambitious volume, one that would integrate basic research with clinical advances and be relevant to multiple disciplines involved in biliary tract  disease. I would like to thank the many contributors who helped me create such a unique book with broad appeal. I apologize for all my harassing e­mails and phone  calls, and I hope you will all agree that the end product is worthy of your efforts. I would like to thank my teachers Tom LaMont and Diarmuid O'Donoghue, whose advice, friendship, and direction have helped me immeasurably in my career. I am  grateful to my father, who made me the physician and person I am today, and to my wife, Clare, who manages not only my career but also her own and those of our  two children, Sophie and Mo. Without all of your help and understanding, this book would not have become a reality. NEZAM H. AFDHAL, M.D.

  

Page ix

Contents Preface

vii

Contributors

xiii

Part I. The Normal Biliary System

 

1. Neurobiology of the Gallbladder Gary M. Mawe and Lee Jennings

1

2. Gallbladder Mucosal Function J. Henriette Klinkspoor and Sum P. Lee

21

3. Gallbladder Smooth Muscle Function and Its Dysfunction in Cholesterol  Gallstone Disease Piero Portincasa and Gerard P. vanBerge­Henegouwen

39

4. Canalicular Lipid Secretion James M. Crawford

65

5. Bile Ductal Secretion and Its Regulation Won Kyoo Cho

99

Part II. Pathogenesis of Gallstones

 

127

7. Pigment Gallstones Roger D. Soloway, Nyingi M. Kemmer, and Jinguang Wu

147

8. Hepatic Metabolism of Cholesterol, Bile Salts, and Phospholipids Douglas M. Heuman and Z. Reno Vlahcevic

165

  

6. Epidemiology, Risk Factors, and Pathogenesis of Gallstones Nezam H. Afdhal

Page x

9. Cholesterol Crystallization in Bile Fred M. Konikoff and Joanne M. Donovan

185

10. Gallbladder Mucin Gwynneth D. Offner

211

11. Role of Proteins in Cholesterol Crystallization in Bile A. Andre van den Berg and Albert K. Groen

235

12. Normal Gallbladder Motor Functions R. P. Jazrawi

251

13. Gallbladder Motility and Gallstones Ralph R. S. H. Greaves and Luke J. D. O'Donnell

275

14. The Role of Intestinal Transit R. Hermon Dowling

297

15. Calcium Salt Precipitation in Bile and Biomineralization of Gallstones Huguette Lafont and J. Donald Ostrow

317

16. Prevention of Gallstones Mitchell L. Shiffman

361

17. The Gallbladder and Biliary Tree in Cystic Fibrosis Michael P. Curry and John E. Hegarty

387

Part III. Management of Clinical Gallstone Disease

 

407

19. Endoscopic Ultrasound of the Gallbladder and Bile Ducts Brian R. Stotland

437

20. The Silent Gallstone William R. Brugge

447

21. Biliary Crystals, Microlithiasis, and Sludge Dieter Jüngst and Christoph von Ritter

455

22. Biliary Colic and Acute Cholecystitis Robert V. Rege

471

23. Laparoscopic Cholecystectomy A. C. T. Wan and A. Darzi

491

24. Overview of Nonsurgical Therapy of Gallstones Dominique E. Howard and Hans Fromm

521

25. Biliary Lithotripsy M. W. Neubrand and Tilman Sauerbruch

527

  

18. Selected Advances in Imaging of the Gallbladder and Bile Ducts Matthew Barish, Michael Blake, and Joseph T. Ferrucci

Page xi

26. Topical Contact Dissolution of Gallbladder Stones Salam F. Zakko

547

27. Common Bile Duct Stones Tony C. K. Tham and David R. Lichtenstein

567

Part IV. Gallbladder Disease

 

28. Acalculous Cholecystitis David Nunes

593

29. Gallbladder Cancer R. Montague Beazley

625

Part V. Diseases of the Bile Ducts

 

639

31. Primary Sclerosing Cholangitis John M. Vierling and Thomas D. Amankonah

659

32. Vanishing Bile Duct Syndrome P. Aiden McCormick and Niamh Nolan

705

33. Cholangiocarcinoma Steven A. Ahrendt and Henry A. Pitt

725

34. Ampullary Tumors Keith D. Lillemoe

755

35. Infections of the Bile Ducts Andrew P. Keaveny

773

36. Bile Duct Injuries Noel N. Williams and Daniel Kreisel

823

37. The Management of Benign and Malignant Biliary Strictures Laurence S. Bailen and Eric D. Libby

843

Index

875

  

30. Congenital and Cystic Diseases of the Biliary Tree David McAneny and James M. Becker

Page xiii

Contributors Nezam H. Afdhal, M.D., F.R.C.P.(I) Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts Steven A. Ahrendt, M.D., F.A.C.S. Department of Surgery, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin Thomas D. Amankonah, M.D. Department of Medicine, Cedars­Sinai Medical Center and UCLA School of Medicine, Los Angeles, California Laurence S. Bailen, M.D. Division of Gastroenterology, New England Medical Center, Boston, Massachusetts Matthew Barish, M.D. Department of Radiology, Boston Medical Center, Boston, Massachusetts R. Montague Beazley, M.D., F.A.C.S. Section of Surgical Oncology and Endocrine Surgery, Department of Surgery, Boston University School of Medicine,  Boston, Massachusetts James M. Becker, M.D. Department of Surgery, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts Michael Blake, M.D., F.R.C.P.(C) Department of Radiology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, Massachusetts William R. Brugge, M.D. Gastrointestinal Unit, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts Won Kyoo Cho, M.D. Department of Medicine—GI/Hepatology, Indiana University School of Medicine and The Richard L. Roudebush VA Medical Center,  Indianapolis, Indiana James M. Crawford, M.D., Ph.D. Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, University of Florida College of Medicine, Gainesville, Florida

  

Page xiv

Michael P. Curry, M.D. Liver Unit, St. Vincent's University Hospital, Dublin, Ireland A. Darzi, M.D., F.R.C.S., F.R.C.S.I., F.A.C.S. Academic Surgical Unit, Imperial College School of Medicine at St. Mary's, London, England Joanne M. Donovan, M.D., Ph.D. Department of Medicine, Harvard Medical School and Boston VA Medical Center, Boston, Massachusetts R. Hermon Dowling, M.D. Academic Gastroenterology Unit, The Guy's, King's College and St. Thomas's Medical and Dental School, London, England Joseph T. Ferrucci, M.D. Department of Radiology, Boston Medical Center, Boston, Massachusetts Hans Fromm, M.D. Department of Medicine, The George Washington University Medical Center, Washington, D.C. Ralph R. S. H. Greaves, M.B., B.S., M.R.C.P. St. Bartholomew's and the Royal London School of Medicine and Dentistry, London, England Albert K. Groen, Ph.D. Department of Gastroenterology, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands John E. Hegarty, M.D., F.R.C.P. Liver Unit, St. Vincent's University Hospital, Dublin, Ireland Douglas M. Heuman, M.D. Department of Medicine, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Dominique E. Howard, M.D. Department of Gastroenterology, The George Washington University Medical Center, Washington, D.C. R. P. Jazrawi, M.B., Ch.B., M.Sc., Ph.D. Department of Gastroenterology, Endocrinology and Metabolism, St. George's Hospital Medical School, London,  England Lee Jennings, Ph.D. Department of Clinical Services, Ilex Oncology, San Antonio, Texas Dieter Jüngst, M.D. Department of Medicine II, Klinikum Grosshadern, Ludwig­Maximilians­University, Munich, Germany Andrew P. Keaveny, M.B., M.R.C.P.I. Section of Gastroenterology, Department of Medicine, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts Nyingi M. Kemmer, M.D. Department of Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas J. Henriette Klinkspoor, Ph.D. Gastroenterology Section, Veterans Affairs Medical Center, Seattle, Washington Fred M. Konikoff, M.D., M.Sc. Department of Gastroenterology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, Tel Aviv, Israel

  

Page xv

Daniel Kreisel, M.D. Department of Surgery, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Huguette Lafont, Ph.D. INSERM U­476, Marseilles, France Sum P. Lee, M.D. Gastroenterology Section, Veterans Affairs Medical Center, Seattle, Washington Eric D. Libby, M.D. Division of Gastroenterology, New England Medical Center, Boston, Massachusetts David R. Lichtenstein, M.D., F.A.C.G. Section of Gastroenterology, Department of Medicine, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts Keith D. Lillemoe, M.D. Department of Surgery, The Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland Gary M. Mawe, Ph.D. Department of Anatomy and Neurobiology, The University of Vermont, Burlington, Vermont David McAneny, M.D. Department of Surgery, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts P. Aiden McCormick, M.D., F.R.C.P. Liver Unit, St. Vincent's University Hospital, Dublin, Ireland M. W. Neubrand, M.D. Medizinische Klinik and Poliklinik, Rheinische Friedrich­Wilhelms­University, Bonn, Germany Niamh Nolan, F.R.C.Path. Department of Pathology, St. Vincent's University Hospital, Dublin, Ireland David Nunes, M.B., B.Ch., F.R.C.P.I. Section of Gastroenterology, Department of Medicine, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts Luke J. D. O'Donnell, M.D., F.R.C.P.I. Department of Gastroenterology, Mayo General Hospital, Castlebar, Ireland Gwynneth D. Offner, Ph.D. Section of Gastroenterology, Boston University Medical Center, Boston, Massachusetts J. Donald Ostrow, M.D. Department of GI/Hepatology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands Henry A. Pitt, M.D., F.A.C.S. Department of Surgery, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin Piero Portincasa, M.D., Ph.D. Department of Internal Medicine, University Medical School, Bari, Italy Robert V. Rege, M.D. Department of Surgery, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, Texas

  

Page xvi

Tilman Sauerbruch, M.D. Medizinische Klinik and Poliklinik, Rheinische Friedrich­Wilhelms­University, Bonn, Germany Mitchell L. Shiffman, M.D. Hepatology Section, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Roger D. Soloway, M.D. Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas Brian R. Stotland, M.D. Endoscopic Ultrasound, Section of Gastroenterology, Department of Medicine, Boston University School of Medicine, Boston,  Massachusetts Tony C. K. Tham, M.D., F.R.C.P. Division of Medicine, Ulster Hospital, Belfast, Northern Ireland Gerard P. vanBerge­Henegouwen, M.D. Gastroenterology, University Hospital Utrecht, Utrecht, The Netherlands A. Andre van den Berg, M.D. Department of Gastroenterology, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands John M. Vierling, M.D., F.A.C.P. Department of Medicine, Cedars­Sinai Medical Center and UCLA School of Medicine, Los Angeles, California Z. Reno Vlahcevic, M.D. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Christoph von Ritter, M.D., Ph.D. Department of Medicine I, Vinzentimm Ruhpolding Hospital, Ruhpolding, Germany A. C. T. Wan, M.B., B.Ch., F.R.C.S.I. Academic Surgical Unit, Imperial College School of Medicine at St. Mary's, London, England Noel N. Williams, M.D., M.Ch., FR.C.S.I., F.R.C.S. Department of Surgery, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Jinguang Wu Department of Chemistry, Peking University, Beijing, People's Republic of China Salam F. Zakko, M.D., F.A.C.P. Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Connecticut Health Center, Farmington, Connecticut

  

Page 1

1—  Neurobiology of the Gallbladder Gary M. Mawe The University of Vermont, Burlington, Vermont Lee Jennings Ilex Oncology, San Antonio, Texas I—  Introduction Motility and absorption by the gallbladder are known to be influenced by circulating hormones such as cholecystokinin (CCK), secretin, gastrin, and pancreatic  polypeptide (1). Nevertheless, the gallbladder contains a well­defined ganglionated plexus, which lies at the outer surface of the muscularis, as well as two extensive  axonal plexuses, which lie within the muscularis and in the submucosa. In the bowel, motor and absorptive functions are influenced to a great extent by the enteric  nervous system (ENS), the intrinsic ganglionated plexuses of the gut (2–4); therefore, since the gallbladder develops as an extension of the fetal bowel, it seems  probable that the ganglionated neural plexus of the gallbladder plays a significant role in the motor and absorptive functions of the gallbladder. In order to understand  the physiology of the gallbladder, it is thus of great importance to determine how its nervous system is organized, what types of neurons it contains, the degree to which  it receives synaptic input from extrinsic sources (such as the central nervous system, prevertebral sympathetic ganglia, and the bowel), and to what extent, if any, the  effects of circulating hormones and inflammatory mediators on the gallbladder are transmitted by intrinsic neurons. Several lines of evidence indicate that the nervous system does indeed play a crucial role in the emptying and filling of the gallbladder. As described in this chapter,  CCK appears to act within the ganglia to cause the gallbladder to contract. Prostaglandins released during gallbladder inflammation can act pre­ and postsynaptically  in gallbladder ganglia, and the ganglia of the gallbladder are equipped with multiple neuronal subtypes, based on their expression of multiple neurotransmitters.  Furthermore, disruption of the neural input to the organ can lead to gallbladder malfunction. Clinical and experimental reports indicate that vagotomy results in an  increased incidence of gallstone formation, changes in the lithogenicity of bile, an increase in the resting volume of the gallbladder, hypotonia of the gallbladder with  biliary stasis, and impairment of gallbladder emptying following fatty meals (5). Until recently, the properties and roles of the neurons in the gallbladder wall were evaluated indirectly by using approaches such as measuring the effects of vagotomy  on gallbladder function and testing the effects of neural blockers on gallbladder emptying or gallbladder muscle strip tension. Over the past decade, efforts in this and a  few other laboratories have concentrated on elucidating the properties of the neurons that directly innervate the tissues of the gallbladder. This chapter includes a  summary of the morphological, neurochemical, and electrophysiological findings of the past few years. Furthermore, it includes a discussion of how the ganglionic  transmission can be modulated by neural, hormonal, and immune­mediated signals, and how this may influence gallbladder function in health and disease.

  

Page 2

II—  Properties of Gallbladder Ganglia A—  Morphological and Neurochemical Features of Gallbladder Ganglia 1—  General Morphology of Gallbladder Ganglia The gallbladder has a relatively simple structure consisting of a serosal layer, a layer of muscle (the muscularis), and a mucosal layer with an underlying lamina propria.  Each of these layers of the gallbladder has its own neural plexus interconnected with those of the other layers. The most obvious and well­defined plexus is the one  lying within the serosa. These neural plexuses of the gallbladder have been studied in many species including human, rhesus monkey, pig, dog, cat, marmoset, guinea  pig, North American opossum (Didelphis virginiana and Monodelphis domestica), Australian brush­tailed possum (Trichosurus vultecula), and mouse (6–15).  The neural plexus of the serosa consists of a ganglionated network of small, irregularly shaped ganglia—reminiscent of the ganglia of the submucosal plexus of the  intestine—connected by bundles of unmyelinated axons (Fig. 1A). These bundles of unmyelinated axons are contiguous with perivascular nerve bundles that follow the  extensive vascular network in this layer. The neural plexus of the muscularis is prominent in species such as the dog and human but is rather sparse in other species  such as the guinea pig and opossum. This plexus comprises interconnected nerve bundles that travel parallel to the direction of smooth muscle bundles. A rich network  of nerve fibers lies in the lamina propria, with branching nerve fibers that pass through the mucosa and are often in close apposition with epithelial cells. In some  species,

Figure 1 Human gallbladder ganglia. A. Photomicrograph of cholinesterase histochemical staining in a whole­mount preparation of the human gallbladder.  B. Immunoreactivity for neuropeptide Y in a ganglion that was attached to an interganglionic connective by a stem of nerve fibers, many of which are NPY­immunoreactive. C and D. Photomicrographs of a single field  demonstrating immunoreactivity for vasoactive intestinal peptide and substance P (SP). Note that most neurons are immunoreactive for both of these compounds but that some neurons are immunoreactive for VIP but not for SP (arrows) and one of the neurons is not immunoreactive for either peptide but is innervated by immunoreactive nerve fibers (arrowhead). Scale bars = 50  m.

  

Page 3

including human and Australian possum, this plexus contains occasional small ganglia that are ovoid or triangular in shape. The structure of gallbladder neurons has been studied by intracellular staining of individual neurons with horseradish peroxidase and neurobiotin (15–17). In guinea pig  and opossum, these neurons consist of a soma with one or two long processes, but no appreciable dendritic arborization. The axons of these neurons often pass from  their ganglion of origin into interganglionic connectives, where they travel for some distance before they terminate. Processes that surround or travel through adjacent  ganglia or run parallel with smooth muscle bundles often exhibit varicosities, suggesting of the possibility of interganglionic and neuromuscular communication.  However, these processes do not seem to project to para­ or perivascular networks, possibly indicating that gallbladder ganglion neurons do not play a major role in  modulating vascular tone within the organ. 2—  Ultrastructural Features of Gallbladder Ganglia The ultrastructural properties of the ganglionated plexus of the guinea pig gallbladder have been studied in ultrathin sections from conventional preparations and from  preparations containing horseradish peroxidase­filled neurons that were visualized with a diamino benzidine histochemical reaction (16). Neurons, glial cells, and a  compact neuropil (usually displaced to the periphery of the ganglion) are all surrounded by a connective tissue sheath and an outer layer of basal lamina to form a  gallbladder ganglion. Like the interiors of enteric ganglia, gallbladder ganglia are notably free of collagen, basal laminae, intercellular spaces, or blood vessels. The  neuropil consists of glial processes, unmyelinated axons, and nerve terminals that contain clear spherical and dense core vesicles. Despite a common lineage and the ultrastructural similarities described above, the ganglia and the interganglionic connectives of the gallbladder have significant  differences with those of the enteric nervous system. The neurons of the gallbladder have a similar morphology to parasympathetic neurons and are much simpler and  less diverse than those of the enteric nervous system. Furthermore, the unmyelinated axons in interganglionic connectives are individually ensheathed by Schwann cell  processes in a similar manner to nonenteric peripheral nerve bundles. 3—  Chemical Coding of Gallbladder Neurons In order to understand how gallbladder neurons can influence the physiological activity of a given organ, it is useful to identify the neurotransmitters, produced by the  neurons, that may potentially be released at several sites to drive, inhibit, and/or modify gallbladder actions. The chemical coding of gallbladder neurons has been  studied in several species, including the human, dog, guinea pig, and opossum. Certain characteristic trends as well as interspecies differences have emerged from  these studies. A diagram summarizing the expression patterns of neuroactive compounds in the gallbladder ganglion neurons of various species is shown in Figure 2. It is likely that all gallbladder neurons in all species are cholinergic since all express the essential biosynthetic precursor enzyme for acetylcholine, choline  acetyltransferase (ChAT) (Figs. 2 and 3A) (14). However, immunohistochemical studies have shown that gallbladder neurons synthesize additional neuroactive  compounds (see Figs. 1 to 3). To date, gallbladder neurons have been shown to express immunoreactivity for tachykinins, vasoactive intestinal peptide (VIP), nitric  oxide synthase (NOS), and either neuropeptide Y (NPY) in the guinea pig and human or, in the dog and opossum, galanin (14,18–20). Furthermore, pituitary  adenylate cyclase­activating peptide (PACAP) has also been reported in most neurons of the human gallbladder (21). Despite this melange of neuroactive compounds  expressed by gallbladder neurons, some species specificity does appear to be involved. Immunoreactivity for VIP has been demonstrated in human, dog, and guinea pig gallbladder neurons, although the distribution is slightly different among the species. In  the human

  

Page 4

Figure 2 Chemical coding in neurons in ganglia of the human, dog, and guinea pig gallbladder. Note the coexpression of neuroactive compounds that have excitatory (+) and inhibitory (­) effects on gallbladder smooth  muscle. ACh, acetylcholine; VIP, vasoactive intestinal peptide; NPY, neuropeptide Y; SP, substance P; NOS, nitric oxide synthase. (Modified from Ref. 14.)

and the dog, most of the neurons are immunoreactive for VIP, but only a small subset are VIP­positive in the guinea pig. Antibodies to substance P (SP) have  illustrated immunoreactivity in most gallbladder neurons of the human, dog, and guinea pig. Human and guinea pig gallbladder neurons express immunoreactivity for  NPY (Fig. 1B) in most neurons, but this pattern seems to be replaced with galanin in the dog (14,18,19). Gallbladder ganglia also comprise neurons that express nitric oxide synthase (NOS), the synthetic enzyme for nitric oxide. In all species that have been studied to  date—including the human (13,22), monkey (22), dog (13), opossom (13), guinea pig (13,23,24), gerbil (13), and mouse (25), neurons in the gallbladder express  NOS and/or NADPH­diaphorase (NADPH­DA) activity. In guinea pig gallbladder neurons, there is a one­to­one correlation between NOS immunoreactivity and  NADPH­DA activity (26), and these neurons also express VIP (Fig. 3C and D) (13). In the human, NOS immunoreactivity is expressed by a population of neurons  that is distinct from the VIP immunoreactive neurons (21) (Mawe and Talmage, unpublished observations). In addition to the diversity of neurotransmitter expression in neurons of gallbladder ganglia, there is also coexpression of neuropeptides in extrinsic sensory fibers.  Immunohistochemical studies in the human (13,22), dog (14), pig (27), guinea pig (12,18,28), Monodelphis domesticus opossum (14), and toad (29) failed to  identify neurons in the gallbladder wall that expressed immunoreactivity for calcitonin gene­related peptide (CGRP) but did describe abun­

  

Page 5

Figure 3 Guinea pig gallbladder ganglia. A and B. Photomicorgraphs of a single field demonstrating immunoreactivities for choline acetyltransferase and nitric oxide synthase in a guinea pig gallbladder ganglion. Immunoreactivities in this double­stained preparation illustrates the coexpression of ChAT and NOS in  a subset of gallbladder neurons. C and D. Photomicrographs of a single field demonstrating immunoreactivities for nitric oxide synthase (NOS) and vaso­active intestinal peptide (VIP) in a guinea pig gallbladder ganglion. All  NOS­immunoreactive neurons in the guinea pig gallbladder also express VIP.  E and F. In the wall of the guinea pig gallbladder, there is an abundance of extrinsic nerve fibers that are immunoreactive for both calcitonin gene­related  peptide (CGRP) and SP. The photomicrographs in E and F demonstrate immunoreactivities for SP and CGRP in the same field. Note the abundance of double­labeled varicose nerve fibers in he ganglion. Double­labeled  immunoreactive fibers are found in the paravascular plexus passing along a blood vessel in the bottom of the field. These fibers are believed to be extrinsic sensory fibers, since CGRP­immunoreactivity has never been demonstrated in  gallbladder neurons. Scale bars = 50  m.  (Figures C and D were adapted from Ref. 26.)

  

Page 6

dant CGRP­immunoreactive nerve fibers in the ganglionated plexus and in the paravascular plexus. In the human, dog, opossum, Australian possum, guinea pig, and  toad gallbladders, these fibers have been shown to coexpress SP­immunoreactivity (12,14,28) and they probably originate in sensory ganglia (Fig. 3E and F). Despite the wealth of information on neuroactive expression patterns in gallbladder ganglia, it remains difficult to explain the coexpression in terms of neural regulation.  In isolation, each of the putative neurotransmitters has been demonstrated to induce a response in the gallbladder. For instance, acetylcholine (1), SP (30–33), and  NPY (34) are known to contract gallbladder smooth muscle. On the other hand, VIP has been shown to relax precontracted gallbladder muscle (35–37). Nitric oxide  can relax the gallbladder (38,39) and, further, may play a role in modulating CGRP­induced relaxation (40). Together with the knowledge that all of the gallbladder  neurons are cholinergic, these patterns of expression of neuroactive compounds are somewhat perplexing, as they suggest the coexpression of excitatory and inhibitory  transmitters in single neurons and/or nerve fibers of all of these species. The question remains: How does coexpression of these various neuroactive compounds contribute to gallbladder function? Despite many years of investigation, it is  relatively unclear which neuroactive compounds are released during activation of the local gallbladder neuronal network. Electrical field stimulation of gallbladder  muscle strips induces contraction, suggesting that excitatory neuroactive compounds are released. However, this same mode of excitation in the presence of atropine  elicits relaxation or a reduction in tone, suggesting the concomitant release of inhibitory compounds. The preponderance of excitation over inhibition in these studies  may be related to the role of neural output to the muscle from the ganglia. Two major theories have been propose to explain how the gallbladder fills. One theory suggests that the gallbladder undergoes a passive filling between meals (1,41);  the other suggests that the gallbladder actively expands to draw hepatic bile into its lumen, much as a bellows draws in air as it is expanded (42,43). In order for the  gallbladder to act as a bellows, a potent inhibitory output from the ganglia of the gallbladder would be necessary to induce an active relaxation. The ostensibly  opposing outputs from individual gallbladder neurons that express excitatory and inhibitory compounds could be the following theoretical scenarios: (a) excitatory and  inhibitory neuroactive compounds are separately released from a given neuron in response to distinct inputs; (b) compounds with opposing actions are released onto  the same target sequentially, with one acting as a physiological antagonist of the other; or (c) both sets of compounds are coreleased but act on different targets. For  example, if acetylcholine, SP, and VIP were released together, acetylcholine and SP may act on the muscle to elicit a contraction, while VIP may act on epithelial  cells. Neuroactive compounds may also act on adjacent nerve terminals to modulate further release. Additional studies will be required to test these models. B—  Physiological Properties of Gallbladder Neurons 1—  Electrical Properties of Gallbladder Neurons The electrical properties of guinea pig, North American opossum, and human gallbladder neurons have been investigated using the intracellular recording technique  (15,17,44). Unlike the neurons that reside in the bowel, these neurons have relatively simple properties. Based on electrical properties, there appears to be only one  type of neuron in these ganglia, and it is fairly inexcitable. During long periods of recording, these neurons very rarely exhibit spontaneous action potentials. This  indicates that gallbladder neurons must receive excitatory inputs in order to release neurotransmitter onto their target tissues, which include smooth muscle and  epithelium. Under normal recording conditions, both guinea pig and human gallbladder neurons are relatively inexcitable, since they fire only one to three action potentials at the  onset of a

  

Page 7

depolarizing current pulse (Fig. 4A). Of the species studied to date, the properties of the action potential in guinea pig gallbladder neurons have been investigated most  extensively (17). The upstroke of the action potential is due to a tetrodotoxin­sensitive sodium conductance, although there is a contribution from an inward calcium  current that is revealed as a calcium spike in the presence of tetrodotoxin (TTX) and tetraethylammonium (TEA). The action potential is followed by an  afterhyperpolarization (AHP) of about 15 mV, which lasts about 170 ms and can be divided into an early and a late phase (Fig. 4B). The early and late phases of the  AHP are mediated by two different sequential calcium­activated potassium conductances. The early phase of the AHP is attenuated in the presence of TEA and is  likely to result from activation of large­conductance potassium channels (BK), whereas the latter phase of the AHP is sensitive to apamin and probably results from  activation of small­conductance potassium channels (SK). The late phase of the AHP contributes to the rapid adaptation of guinea pig gallbladder neurons,

Figure 4 Active electrical properties of guinea pig gallbladder neurons. A. Four consecutive overlapping traces showing the response of a gallbladder neuron to a prolonged depolarizing current pulse (250 ms, 0.2 nA). As is typical of guinea pig gallbladder neurons, the cell generated only one action potential at the onset of each current pulse. B. Response of a gallbladder neuron to a brief depolarizing current pulse (2 ms, 0.2 nA), illustrating a typical afterhyperpolarization (AHP). The AHP of gallbladder neurons is composed of early and late phases, indicated by arrows, that are sensitive to tetraethyl ammonium and apamin, respectively. C. Elimination of the last phase of the AHP by application of apamin (100 nM) to the bath converts gallbladder neurons from a phasic state, firing one action potential in response to a depolarizing current pulse, to a tonic state, generating a burst of action potentials throughout the duration of a depolarizing current pulse. Resting membrane potentials: A, ­mV; B, ­52 mV; C, ­52mV.  (From Ref. 26.)

  

Page 8

since suppression of this component of the AHP with apamin causes the cells to fire action potentials repetitively throughout the duration of a depolarizing current pulse  (Fig. 4C) (17). The properties of neurons of the North American opossum gallbladder are classified into two groups (15): adaptive neurons, responding to intracellular current pulses  with a short burst of action potentials, and rapidly adaptive neurons, responding to current pulses with a single action potential. The adaptive cells are more numerous,  making up about 70% of the population. Action potentials of neurons in these ganglia are tetrodotoxin­sensitive and are followed by a brief AHP lasting about 30 ms. 2—  Synaptic Events in Gallbladder Ganglia In the whole­mount preparations used to study the electrical properties of gallbladder neurons, synaptic inputs can be activated by stimulating interganglionic fiber  bundles or the nerve bundles that pass toward the gallbladder along the cystic duct. Synaptic inputs have been studied in guinea pig, opossum, and human gallbladder  preparations (15,17,44). Low­frequency stimulation of interganglionic nerve bundles results in the production of fast excitatory postsynaptic potentials (EPSPS) in gallbladder neurons  (15,17,44,45). Although subthreshold spontaneous fast synaptic events can occasionally be seen in recordings from guinea pig gallbladder neurons, fast EPSPs  typically require active stimulation, and the conversion from subthreshold to suprathreshold is dependent upon the magnitude of the stimulus. Fast EPSPs in the  gallbladder are blocked by the nicotinic receptor antagonist hexamethonium and are abolished when calcium is removed from the bathing solution. High­frequency stimulation (10 to 20 Hz) of interganglionic connectives results in the appearance of slow EPSPs in about 30% of guinea pig gallbladder neurons and  20% of neurons of the North American opossum (15,17). Slow EPSPs can also be significantly reduced with low­calcium/high­magnesium solutions and with  antagonists of the neurokinin 3 (NK­3) receptor, indicating the involvement of tachykinins in this response (46). A residual component of the slow EPSP in the  presence of an NK­3 antagonist may indicate the involvement of CGRP in the response (47). The slow EPSP is likely to involve an activation of a nonselective cation  conductance, since it has an estimated reversal potential near 0 mV. III—  Neural Inputs to Gallbladder Ganglia A—  Vagal Preganglionic Input to Gallbladder Ganglia Parasympathetic and enteric ganglia of the abdomen and pelvis receive preganglionic innervation from neurons located in the vagal motor complex or the sacral spinal  cord. Although these preganglionic neurons provide nicotinic, fast synaptic input to essentially all parasympathetic ganglion cells, most neurons of the enteric nervous  system—especially those in the jejunum, ileum, and colon—lack direct input from the central nervous system (48–50). As the intramural neurons of gallbladder ganglia  have a common lineage with those of the gut tube, it could not be taken for granted that vagal efferent nerve fibers represent the major source of the fast synaptic  inputs that are received by all gallbladder neurons. Stimulation of vagus nerves in vivo elicits gallbladder contraction or, in the presence of atropine, gallbladder relaxation (1,51,52). Complementary to these data,  morphological evidence has been obtained suggesting vagal innervation of the gallbladder. First, following retrograde dye application to the gallbladder, neurons of the  dorsal motor nucleus of the vagus become labeled (12). Second, immunohistochemical staining for choline acetyltransferase (ChAT), the biosynthetic enzyme of  acetylcholine, in whole­mount preparations of the gallbladder shows immunoreactive nerve fibers surrounding intramural neurons and in the paravascular plexus,  suggesting extrinsic cholinergic innervation (14). Although the evidence cited

  

Page 9

above does indeed suggest that there is a potent preganglionic parasympathetic innervation of the gallbladder, it verifies that gallbladder neurons typically receive vagal  input and that vagal efferent axons represent the principal source of fast excitatory synaptic input to these cells. In order to address this question, nerve bundles passing  to the gallbladder along the cystic duct were stimulated while recording from gallbladder neurons in order to activate synaptic inputs to gallbladder neurons that arise  from sources outside of the gallbladder (45). Experiments were conducted in control animals and in those following vagotomy. Electrical stimulation of the cystic  nerves in control animals resulted in the appearance of fast EPSPs in all neurons that were sensitive to hexamethonium and low calcium. In vagotomized animals, no  responses to cystic nerve stimulation were detected. Therefore, fast synaptic input to gallbladder neurons, unlike the enteric nervous system, is primarily from extrinsic  fibers from the vagus nerves. However, stimulation of intrinsic nerve fiber bundles in these vagotomized animals did result in the appearance of some fast EPSPS,  indicating that interganglionic communication among gallbladder neurons does exist. B—  Sympathetic Postganglionic Input to Gallbladder Ganglia Postganglionic sympathetic innervation of the gallbladder probably arises from the celiac ganglion, which in turn has preganglionic sympathetic innervation from neurons  in the thoracic spinal cord. Evidence that the sympathetic postganglionic neurons lie in the celiac ganglion has been obtained from retrograde tracer studies in which a  tracer injected into the gallbladder wall has been found to be transported to cell bodies lying in this ganglion (12). In order to confirm the presence of sympathetic  nerve fibers in the gallbladder, whole mount preparations have been examined for several sympathetic markers. Catecholamine histofluorescence (11,12,53), in  addition to imunoreactivity for tyrosine hydroxylase and dopamine  ­hydroxylase (12) can be observed in nerve fibers that are abundant in gallbladder ganglia can be  seen in peri­ and paravascular nerve fibers that follow blood vessels. Stimulation of sympathetic innervation of the gallbladder leads to a decrease in contractile tone (54–58). Interestingly, when sympathetic innervation is stimulated at a  subthreshold level, at which there is no effect on motility per se, there is a reduction in contraction in response to concurrent parasympathetic stimulation (58). This  observation suggests that norepinephrine released from sympathetic fibers has an inhibitory effect in gallbladder ganglia. In order to test this, electrical recordings have been obtained from gallbladder neurons while exposing them to norepinephrine. Within gallbladder ganglia, the  sympathetic postganglionic fibers have a presynaptic inhibitory effect on the release of acetylcholine (ACh) from vagal preganglionic terminals (Fig. 5B) (45,59).  Norepinephrine decreases the amplitude of fast EPSPs in a concentration­dependent manner, and it mediates this effect by acting on  2 adrenoreceptors. The action  of norepinephrine is mimicked by the  2 adrenoreceptor agonist clonidine and is suppressed by the  2 adrenoreceptor antagonist yohimbine. Release of endogenous  catecholamine stores, by tyramine application or by electrical stimulation of the vascular plexus, also causes a yohimbine­sensitive decrease in fast synaptic activity.  Therefore, the decrease in gallbladder tone that can be elicited by stimulation of the splanchnic nerves may be the result of a presynaptic inhibitory effect of  sympathetic nerves on the vagal terminals in gallbladder ganglia. On the basis of present data, it is possible that the decrease in gallbladder tone observed upon stimulation of splanchnic nerves is the result of norepinephrine  modulation of ACh release from vagal terminals in gallbladder ganglia. The physiological role for norepinephrine acting in this manner may be to facilitate gallbladder  filling by reducing tone and therefore increasing volume.

  

Page 10

Figure 5 Synaptic responses elicited by electrical stimulation of vagal inputs to gallbladder neurons are enhanced by CCK and are inhibited by norepinephrine. A. Subthreshold EPSPs are converted to suprathreshold events in the presence of CCK. B. EPSPsevoked by cystic nerve stimulation are reversibly suppressed in the presence of norepinephrine (NE). Each condition is represented by single even (A) or by an average of five consecutive events (B). (From Ref. 45.)

C—  Sensory Axon Reflexes in Gallbladder Ganglia Sensory innervation of the gallbladder has been examined primarily in the cat and guinea pig. In the guinea pig, retrograde tracing has established afferent cell bodies in  the nodose ganglion of the vagus and in dorsal root ganglia at the thoracic spinal level (12). In the cat, retrograde tracing has also demonstrated that afferent cell bodies  were found in dorsal root ganglia at the thoracocolumbar level (T2­L2) and in the nodose ganglion (60). In addition, the latter study indicated that the projections of  the afferent neurons from the dorsal root ganglia to the gallbladder probably travel in the lesser and greater splanchnic nerves, as splanchnicotomy or removal of the  celiac ganglion ipsilaterally decreased retrograde staining on the same side but not on the contralateral side. Immunoreactivity for SP and CGRP, indicative of afferent neurotransmitters, is present in nerves that pass along blood vessels in the gallbladder and in varicose axons  that are particularly abundant in the ganglia of the gallbladder (Fig. 3E and F) (12,14,28,32). Since neurons within the ganglionated plexus of the gallbladder do not  exhibit immunoreactivity for CGRP, the most likely source of the CGRP/SP immunoreactive fibers are the sensory neurons of the dorsal root and nodose ganglia  (12,14,18,28). Though the primary role of sensory afferent axons in the periphery may be to relay sensory information to the spinal cord and central areas, there is mounting evidence  that these nerves can also release neuropeptides from their peripheral processes to initiate reflex activity in response to local sensory stimuli. In the gallbladder, it has  been shown that application of capsaicin causes release of the sensory transmitters SP and CGRP, resulting in increased muscle tension (32). This may indicate that,  under certain conditions, afferent fibers can release neuroactive compounds, which might initiate gallbladder action in an attempt to maintain homeostasis. Alternatively,  it is possible that afferent neurotransmitter release may contribute to gallbladder inflammation, since release of neuroactive peptides from extrinsic sensory fibers is one  of the initial steps in toxin A­induced inflammation in the bowel (61). Both SP and CGRP have the ability to modulate the action of gallbladder smooth muscle. Calcitonin gene­related peptide activates an ATP­dependent potassium  channel that causes a hyperpolarization of the resting membrane potential (62) and a consequent relaxation of the muscle (63). Substance P, on the other hand, elicits a  dose­dependent contraction of gallbladder smooth muscle (30–33). In electrophysiological studies of guinea pig gallbladder neurons, application of tachykinins, CGRP, or capsaicin caused a prolonged depolarization together with an  enhancement

  

Page 11

Figure 6 Substance P causes a prolonged depolarization of guinea pig gallbladder neurons that is associated with an increase in excitability. A. Response of a gallbladder neuron to a brief pressure microejection of SP (0.1 mM; 500 ms; 10 PSI). Note the similarity between this response and the slow excitatory postsynaptic potential shown in Fig. 2B. B. Following application of SP, gallbladder neurons exhibit an increase in excitability, which is demonstrated by the generation of a burst of action potential during a depolarizing current pulse. Resting membrane potentials: A, ­54 mV; B, ­52 mV. (From Refs. 26 and 46.)

in excitability similar to the slow EPSP recorded in these preparations (Fig. 6) (46,64). This slow depolarization is caused by the activation of a nonselective cation  conductance. The effects of tachykinins on these intramural neurons have been studied in considerable detail. Rank­order potency of tachykinins in this preparation is  neurokinin B > neurokinin A > SP, which is suggestive of the activation of NK­3 receptors. Confirmation of this is provided by evidence that senktide, the NK­3  receptor agonist, is more potent than any of the naturally occurring tachykinins in eliciting a depolarization and that [Trp7, b­Ala8]­NKA (4–10), an antagonist of NK­ 3 receptors, shifts the concentration­effect curve for SP to the right and depresses both capsaicin­induced depolarizations and stimulus­evoked slow excitatory  postsynaptic potentials (46). Therefore, it is likely that tachykinins, and possibly CGRP released from sensory nerve terminals, mediate the slow EPSPs in gallbladder  ganglia. When sensory fibers are activated by extreme pressure or inflammatory agents, they could act locally as the afferent limb of a local reflex to facilitate ganglionic  transmission. D—  The Sphincter of Oddi Evidence seems to suggest a neuronal link between the gallbladder and the sphincter of Oddi (SO). In dogs, cats, and humans, in vivo distention or electrical  stimulation of the gallbladder results in a decreased motility, or flow resistance, in the SO (65–68). In the cat, this response was eliminated by TTX or application of  local anesthetics to the bile ducts (65). The mechanisms for the reflex between the gallbladder and the SO are unknown. Authors of these reports have suggested that  the reflex may involve a direct neural link between the gallbladder and the SO; however, these studies have not ruled out the possibility of a vagal reflex mechanism.

  

Page 12

E—  The Duodenum Early this century, DuBois and Kistler (69) reported that stimulation of the duodenal ampulla resulted in contraction of the gallbladder. Transection of the common bile  duct resulted in the elimination of the gallbladder contraction, but gallbladder responses to vagal stimulation and to the cut end of the bile duct persisted. On the basis  of these findings, it was proposed that a direct neural connection exists between the gut and the gallbladder and that these axons pass along the cystic duct via the  common bile duct. More recently, experiments involving retrograde tracing of dyes injected into the wall of the gallbladder, in the guinea pig and Australian possum,  demonstrated that neurons of the duodenal myenteric plexus and the ganglia of the SO project to the gallbladder (12,70). These data indicate that, in addition to being  regulated the central nervous system, the circuitry exists for the gallbladder to receive direct inputs from the bowel. The existence of a potential neural communication network between the gut and the gallbladder has not been investigated further. Questions remain about the targets  and origin of the gut­gallbladder projections and of the physiological relevance. At this point it is not known whether the projections from the gut have targets on  gallbladder epithelia, smooth muscle, or intramural ganglia. In the case of intramural ganglia, it is unlikely that these gut­gallbladder projections contribute to fast EPSPs  because these events are largely absent following vagotomy (45). It is possible that a gut­gallbladder projection could involve serotonin. There is a precedent for this in  terms of serotoninergic projections from the gut to the pancreas (71). In addition, nerve fibers immunoreactive for serotonin have been observed in gallbladder ganglia  (12), and serotonin has been demonstrated to cause a slow depolarization in gallbladder neurons that is associated with an increase in excitability (17). One potential physiological role of an excitatory neural pathway from the gut to the gallbladder would be to activate the gallbladder contractions that occur in  coordination with the migrating myoelectric complex. During the interdigestive period, the gallbladder undergoes periods of increased intraluminal pressure, in phase  with the migrating myoelectric complex, accompanied by a delivery of bile from the gallbladder to the lumen of the duodenum (1,72). It is thought that the migrating  myoelectric complex serves a ''housekeeping function." According to this model, increased motor activity would advance undigested food from the proximal bowel  toward the large intestines, and the associated delivery of bile into the intestinal lumen could facilitate the overall digestive process. IV—  Hormonal and Immune­Mediated Modulation of Gallbladder Neurotransmission A—  Cholecystokinin It is now many years since cholecystokinin (CCK) was identified as the principal contractile agent of the gallbladder following the ingestion of a meal (73). Since that  time, many studies have been carried out in an attempt to precisely identify the cellular target(s) of CCK in the gallbladder. Initial studies proposed that CCK acted on  gallbladder smooth muscle to initiate contraction, but is soon became apparent that a neuronal component was involved in this process. In recent years, evidence has  accumulated suggesting that, under physiological conditions, CCK acts in gallbladder ganglia to increase excitatory ganglionic output to smooth muscle and hence  cause contraction. Many studies have contributed to the concept that the action of CCK on the gallbladder involves a neural component. In in vivo experiments, it has been demonstrated  that gallbladder contractions elicited by feeding or by injection of postprandial concentrations of CCK can be attenuated by atropine, hexamethonium, TTX, and vagal  blockade (74–85). Similar observations have been reported in in vitro gallbladder experiments (86), and application of CCK to

  

Page 13

gallbladder strips in motility experiments can result in the release of ACh, presumably of neuronal origin (87–90). This body of work further reinforces the concept that  CCK acts through neural mechanisms as its principal mode of action. It is clear that CCK receptors do exist on gallbladder smooth muscle cells, but these receptors  may not normally play a role in gallbladder emptying. It is plausible that the neural effect described was a result of actions of CCK on vagal afferent fibers and/or vagal  terminals within gallbladder ganglia, since hexamethonium and vagal blockade disrupt the meal­ and CCK­induced gallbladder contraction (76,85).  Electrophysiological studies of gallbladder whole­mount preparations support this view. Direct studies of the actions of CCK in gallbladder ganglia have been conducted in the guinea pig (45,91) and the opossum (15) using intracellular electrophysiological  recording techniques. In both of these species, CCK has a profound presynaptic facilitatory effect on ganglionic transmission but does not have a direct effect on the  gallbladder neurons. Upon application of CCK, the amplitude of cholinergic fast EPSPs is increased, usually converting subthreshold EPSPs to suprathreshold EPSPs  (Fig. 5A) (15,91). CCK increases the quantal content (the amount of ACh released) by threefold without altering quantal size, but it does not alter the sensitivity of  these neurons to exogenously applied acetylcholine, indicating that CCK acts through a presynaptic mechanism (91). Most importantly, it has been shown that CCK is  quite potent in its ability to promote the release of ACh (Fig. 7). The concentration­effect relationship for CCK in gallbladder ganglia peaks at 1.0 nM and has a half­ maximal effective concentration (EC50) of 33 pM; the EC50 for the direct contractile effect of CCK on gallbladder muscle is   10 nM (Fig. 7) (91). In the presence of  10 pM CCK, which is within the range of postprandial serum levels of CCK (85), the peptide increases synaptic currents by about 20%. The nerve terminals that are  sensitive to CCK are from the vagus nerve, since synaptic responses to cystic nerve stimulation are sensitive to CCK and these inputs are eliminated following  vagotomy (45). B—  Prostaglandin E2 Prostaglandins, particularly prostaglandin E2 (PGE2), have been shown to be intimately associated with pathology of the gallbladder (92). Early studies employing  diseased human gallbladders demonstrated that both the mucosa and the muscularis of the organ produce high levels of PGE2 (94). Furthermore, a correlation  between severity of inflammation and PGE concentrations has been observed (93). In animal model studies, PGE2 has been shown to have two major effects: a dose  dependent contraction of the tissue (94) and a significant reversal in net fluid movement from absorption to secretion, including an increase in mucin secretion (95,96).  Several investigators have noted indirectly that PGE2 probably exerts its effects, at least in part, through the neural network resident within the organ (97–99). In order  to investigate this aspect further, intracellular recordings have been obtained from gallbladder neurons during PGE2 application (100). Prostaglandin E2 acted directly on gallbladder neurons to elicit a complex triphasic change in the resting membrane potential, and a decrease in the duration and  amplitude of the AHP. Each component of the triphasic response was concentration­dependent, was associated with a change in input resistance, and changed in  amplitude when the membrane potential was electronically increased or decreased. The predominant aspect of the triphasic change in resting membrane potential was  a long­lasting hyperpolarization. In addition to the direct effects of PGE2 on gallbladder neurons, PGE2 acted presynaptically to attenuate both fast and slow excitatory  synaptic responses. Long­lasting hyperpolarization of the neurons and suppression of fast and slow excitatory input would significantly decrease ganglionic output,  since gallbladder neurons need to be synaptically driven to generate action potentials. In human tissue (94,101) as well as animal models (102), gallbladder muscle  becomes desensitized to prostaglandins. With the contractile effect of prostaglandin diminished with time, chronic prostaglandin pro­

  

Page 14

Figure 7 The concentration of CCK present in the serum following a meal is high enough to act in gallbladder ganglia but too low to directly activate gallbladder muscle. Graphs represent the CCK­induced increase in synaptic current in the guinea pig gallbladder  and CCK­induced increase in tension of a guinea pig gallbladder muscle strip.  Traces demonstrate the concentration­dependence of the CCK­induced facilitation  of fast synaptic currents, elicited by fiber tract stimulation, in a guinea pig gallbladder ganglion. Each trace represents an average of five consecutive events. [From Ref. 103 and the data of Mawe (91), Harrington et al. (104), and Takahashi et al. (85).]

duction may contribute to gallbladder stasis by decreasing ganglionic output, therefore effectively denervating the tissue. V—  Concluding Remarks The ganglionated plexus of the gallbladder is a target of modulatory inputs to the gallbladder, including nerves, hormones, and immune mediators. A schematic diagram  depicting modulatory

  

Page 15

events in gallbladder ganglia is shown in Fig. 8. To release their neuroactive compounds onto the effector tissues of the organ, gallbladder neurons must be stimulated  to fire action potentials, and the major source of excitatory input to these cells is vagal preganglionic fibers. Modulating inputs that can up­ or downregulate the efficacy  of this nicotinic ganglionic transmission include CCK and norepinephrine, which have presynaptic excitatory and inhibitory effects on vagal terminals, respectively, and  sensory fibers that can release SP and CGRP in gallbladder ganglia to depolarize and increase the excitability of gallbladder neurons. Immune mediators such as  prostaglandin E2 may contribute to gallbladder hypomotility by hyperpolarizing gallbladder neurons and attenuating synaptic input. To be resolved in future studies is  how gallbladder neurons, which express acetylcholine plus an assortment of excitatory and inhibitory neuro­modulators, conduct clear signals to the smooth muscle  and epithelial cells of the gallbladder.

Figure 8 Schematic illustration of the modulatory events that occur in the ganglia of the gallbladder. Vagal preganglionic inputs provide the main driving force to gallbladder neurons by activating nicotinic receptors to elicit fast EPSPS. The efficacy of this connection can be up­ or downregulated by CCK and sympathetic inputs, respectively, which act on  presynaptic CCK­A and  2 receptors to alter the amount of ACh released by the vagus  nerves. An axon reflex exists in gallbladder ganglia in the form of sensory fibers that can release tachykinins and CGRP directly onto gallbladder neurons, resulting in their depolarization and increased excitability. Substance P and CGRP have both been shown to elicit prolonged depolarizations in gallbladder neurons, and slow EPSPs in gallbladder ganglia have been shown to be involve the release of tachykinins and the activation of neurokinin­3 receptors. Prostaglandin E2 causes a prolonged hyperpolarization of  gallbladder neurons as well as presynaptic inhibition of fast and slow EPSPS. Abbreviations: NE, norepinephrine; ACh, acetylcholine; CCK, cholecystokinin; CGRP, calcitonin gene­related peptide; NKA, neurokinin A; PGE2, prostaglandin E2. Numbers in  circles represent references that from which the information is derived. (Modified from Ref. 46.)

  

Page 16

Acknowledgments The studies performed in the Mawe laboratory have been supported by NIH grants DK 45410 and NS 26995. We thank the alumni members of the Green Mountain  Gallbag Company, including Erin Talmage, Wendy Pouliot, Ellen Cornbrooks, David Wells, Lei Zhang, Kirk Hillsley, Audra Kennedy, and Alex Gokin for their  contributions to many of the studies that have been described here. References 1. JP Ryan. Motility of the gallbladder and biliary tree. In: L. R. Johnson, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract. New York: Raven Press, 1987, pp 695–721. 2. M Costa, SJH Brookes. The enteric nervous system. Am J Gastroenterol 89:S129–S137, 1994. 3. MD Gershon, AL Kirchgessner, PR Wade. Functional anatomy of the enteric nervous system. In: L. R. Johnson, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract. New  York: Raven Press, 1994, pp 381–422. 4. JD Wood. Physiology of the enteric nervous system. In: L. R. Johnson, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract. New York: Raven Press, 1994, pp 423–482. 5. PA Pellegrini, MG Patti. Motility of the Gallbladder and Bile Ducts and the Kinetics of Bile Flow. Philadelphia: Saunders, 1981. 6. WF Alexander. The innervation of the biliary system. J Comp Neurol 72:357–370, 1940. 7. W Burnett, FW Gairns, P Bacsich. Some observations on the innervation of the extrahepatic biliary system in man. Ann Surg 159:8–26, 1964. 8. SD Sutherland. The intrinsic innervation of the gallbladder in Macaca rhesus and Cavia porcellus. J Anat 100:261–268, 1966. 9. SD Sutherland. The neurons of the gallbladder and gut. J Anat 101:701–709, 1967. 10. K Kyösola. Cholinesterases of the gall bladder. Histochemistry 50:337–346, 1977. 11. W Cai, G Gabella. Innervation of the gallbladder and biliary pathways in the guinea pig. J Anat 136:97–109, 1983. 12. GM Mawe, MD Gershon. Structure, afferent innervation, and transmitter content of ganglia of the guinea pig gallbladder: relationship to the enteric nervous  system. J Comp Neurol 283:374–390, 1989. 13. EK Talmage, GM Mawe. NADPH­diaphorase and VIP are co­localized in neurons of gallbladder ganglia. J Auton Nerv Syst 43:83–90, 1993. 14. EK Talmage, WA Pouliot, M Schemann, GM Mawe. Structure and chemical coding of human, canine and opossum gallbladder ganglia. Cell Tissue Res  284:289–302, 1996. 15. AJ Bauer, M Hanani, TC Muir, JH Szurszewski. Intracellular recordings from gallbladder ganglia of opossums. Am J Physiol 260:G299–G306, 1991. 16. EB Cornbrooks, WA Pouliot, GM Mawe. The structure of neurons and ganglia of the guinea pig gallbladder: light and electron microscopic studies. J Comp  Neurol 317:31–44, 1992. 17. GM Mawe. Intracellular recording from neurones of the guinea­pig gall­bladder. J Physiol (Lond) 429:323–338, 1990. 18. EK Talmage, WA Pouliot, EB Cornbrooks, GM Mawe. Transmitter diversity in ganglion cells of the guinea pig gallbladder: an immunohistochemical study. J  Comp Neurol 317: 45–56, 1992. 19. RD De Giorgia, TT Zittel, JE Parodi, JM Becker, FC Brunicardi, VLW Go, NC Brecha, C Sternini. Peptide immunoreactivities in the ganglionated plexuses and  nerve fibers innervating the human gallbladder. J Auton Nerv Sys 51:37–47, 1995. 20. JR Keast, JB Furness, M Costa. Distribution of certain peptide containing nerve fibres and endocrine cells in the gastrointestinal mucosa of five mammalian  species. J Comp Neurol 236:403–422, 1985.

  

Page 17

21. S Uemura, S Pompolo, JB Furness, KJ Hardy. Nitric oxide synthase in neurons of the human gall­bladder and its colocalization with neuropeptides. J  Gastroenterol Hepatol 12:257–265, 1997. 22. RD De Giorgio, JE Parodi, NC Brecha, FC Brunicardi, JM Becker, VLW Go, C Sternini. Nitric oxide producing neurons in the monkey and human digestive  system. J Comp Neurol 342:619–627, 1994. 23. GPS Siou, A Belai, G Burnstock. A developmental study of the localization of NADPH­diaphorase in the ganglionated plexus of the guinea­pig gallbladder. Cell  Tissue Res 276:61–68, 1994. 24. Z Grozdanovic, B Mayer, HG Baumgarten, G Bruning. Nitric oxide synthase­containing nerve fibres and neurones in the gall bladder and biliary pathways of the  guinea­pig. Neuroreport 5:837–840, 1994. 25. Z Grozdanovic, HG Baumgarten, G Bruning. Histochemistry of NADPH­diaphorase, a marker for neuronal nitric oxide synthase, in the periopheral autonomic  nervous system of the mouse. Neuroscience 48:225–235, 1992. 26. GM Mawe, EK Talmage, EB Cornbrooks, AP Gokin, L Zhang, LJ Jennings. Innervation of the gallbladder: structure, neurochemical coding, and physiological  properties of guinea pig gallbladder ganglia. Microsc Res Tech 39:1–13, 1997. 27. J Sand, H Tainio, I Nordback. Neuropeptides in pig sphincter of Oddi, bile duct, gallbladder, and duodenum. Dig Dis Sci 38:694–700, 1993. 28. LE Goehler, C Sternini, NC Brecha. Calcitonin gene­related peptide immunoreactivity in the biliary pathway and liver of the guinea­pig: distribution and  colocalization with substance P. Cell Tissue Res 253:145–150, 1988. 29. PJ Davies, G Campbell. The distribution and colocalization of neuropeptides and catecholamines in nerves supplying the gall bladder of the toad, Bufo marinus.  Cell Tissue Res 277:169–175, 1994. 30. LA Meldrum, JC Bojarski, J Calam. Effects of substance P and other neuropeptides on guinea­pig gallbladder muscle. Digestion 37:193–199, 1987. 31. C Dahlstrand, S Bjorck, R Edin, A Dahlstrom, H Ahlman. Substance P in the control of extrahepatic biliary motility in the cat. Regulatory Peptide 20:11–24,  1988. 32. CA Maggi, P Sannticioli, D Renzi, R Patacchini, C Surrenti, A Meli. Release of substance P­ and calcitonin gene­related peptide­like immunoreactivity and motor  response of the isolated guinea pig gallbladder to capsaicin. Gastroenterology 96:1093–1101, 1989. 33. YS Guo, P Singh, G Gomez, S Rajaraman, JC Thompson. Contractile response of canine gallbladder and sphincter of Oddi to substance P and related peptides  in vitro. Dig Dis Sci 34:812–817, 1989. 34. KD Lillemoe, TH Webb, HA Pitt. Neuropeptide Y: a candidate neurotransmitter for biliary motility. J Surg Res 45:254–260, 1988. 35. J Ryan, S Cohen. Effect of vasoactive intestinal polypeptide on basal and cholecystokinin induced gallbladder pressure. Gastroenterology 73:870–872, 1977. 36. JP Ryan, S Ryave. Effect of vasoactive intestinal polypeptide on gallbladder smooth muscle in vitro. Am J Physiol 234:E44–E46, 1978. 37. C Dahlstrand, A Dahlström, H Ahlman. Adrenergic and VIP­ergic relaxatory mechanisms of the feline extrahepatic biliary tree. J Auton Nerv Syst 26:97–106,  1989. 38. M Mourelle, F Guarner, X Molero, S Moncada, J Malagelada. Regulation of gall bladder motility by the arginine­nitric oxide pathway in guinea pigs. Gut 34:911– 915, 1993. 39. ML McKirdy, HC McKirdy, CD Johnson. Non­adrenergic non­cholinergic inhibitory innervation shown by electrical field stimulation of isolated strips of human  gall bladder muscle. Gut 35:412–416, 1994. 40. LW Kline, PKT Pang. Nitric oxide modulates the calcitonin gene­related peptide­induced relaxation in guinea pig gallbladder strips in vitro. Regul Pept 50:207– 212, 1994. 41. EA Shaffer. Gallbladder Disease. In: W. A. Walker and P. R. Dude, eds. Paediatric Gastroenterology. Philadelphiha: BC Becker, 1991, pp 1152–1170.

  

Page 18

42. RP Jazrawi, ML Petroni, N Prandini, C Paul, JA Adam, S Gullini, TC Northfield. Post­porandial gallbladder motor function: refilling and turnover of bile in health  and in cholelithiasis. Gastroenterology 109:582–591, 1995. 43. A Lanzini, RP Jazrawi, TC Northfield. Simultaneous quantitative measurements of absolute gallbladder storage and emptying during fasting and eating in humans.  Gastroenterology 92:852–861, 1987. 44. K Hillsley, LJ Jennings, GM Mawe. Neural control of the gallbladder: an intracellular study of human gallbladder neurons. Digestion 59:125–129, 1998. 45. GM Mawe, AP Gokin, DG Wells. Actions of cholecystokinin and norepinephrine on vagal inputs to ganglionic cells in guinea pig gallbladder. Am J Physiol  267:G1146–G1151, 1994. 46. GM Mawe. Tachykinins as mediators of slow EPSPs in guinea­pig gall­bladder ganglia: Involvement of neurokinin­3 receptors. J Physiol (Lond) 485:513–524,  1995. 47. AP Gokin, LJ Jennings, GM Mawe. Actions of calcitonin gene­related peptide in guinea pig gallbladder ganglia. Am J Physiol 34:G876–G883, 1996. 48. M Costa, S Brooks, S Waterman, R Mayo. Enteric neuronal circuitry and transmitters controlling intestinal motor function. In: G. E. Holle and J. D. Wood, eds.  Advances in the Innervation of the Gastrointestinal Tract. Amsterdam: Elsevier Science, 1992, pp 115–121. 49. JB Furness, M Costa. The Enteric Nervous System. New York: Churchill­Livingstone, 1987. 50. JD Wood. Electrical and synaptic behavior of enteric neurons. In: S. G. Schultz, ed. Handbook of Physiology. Bethesda, MD: American Physiological Society,  1989, pp 465–518. 51. C Dahlstrand. The vagal nerves and peptides in the control of extrahepatic biliary motility. Acta Physiol Scand 139:1–52, 1990. 52. WJ Dodds, WJ Hogan, JE Geenen. Motility of the biliary system. In: S. G. Schultz, ed. Handbook of Physiology. Bethesda, MD: American Physiological Society,  1989, pp 1055–1101. 53. Cai G Gabella. Catecholamine­containing cells in the nerve plexus of the guinea pig gallbladder. Acta Anat 119:10–17, 1984. 54. B Pallin, S Skoglund. Neural and humeral control of gallbladder emptying mechanism in the cat. Acta Physiol Scand 60:358–362, 1964. 55. CGA Persson. Adrenoceptor functions in the cat choledochoduodenal junction in vitro. Br J Pharmacol 42:447–461, 1971. 56. CGA Persson. Adrenergic, cholecystokinetic and morphine induced effects on extrahepatic biliary motility. Acta Physiol Scand (Suppl) 383:1–32, 1972. 57. CGA Persson. Dual effects of the sphincter of Oddi and gallbladder induced by stimulation of the right splanchnic nerves. Acta Physiol Scand 87:334–343, 1973. 58. T Yamasato, S Nakayama. Participation of the parasympathetic and sympathetic nerves in regulation of gallbladder motility in the dog. Acta Med Okayama  44:79–86, 1990. 59. GM Mawe. Noradrenaline acts as a presynaptic inhibitory neurotransmitter in ganglia of the guinea­pig gall­bladder. J Physiol (Lond) 461:378–402, 1993. 60. GA Iwamoto, TG Waldrop, JC Longhurst, GA Ordway. Localization of the cells of origin for primary afferent fibers supplying the gallbladder of the cat. Exp  Neurol 84:709–714, 1984. 61. CR Mantyh, TN Pappas, JA Lapp, MK Washington, LM Neville, JR Ghilardi, SD Rogers, PW Mantyh, SR Vigna. Substance P activation of enteric neurons in  response to intraluminal clostridium difficile toxin a in the rat ileum. Gastroenterol 111:1272–1280, 1996. 62. L Zhang, AD Bonev, GM Mawe, MT Nelson. Protein kinase A mediates activation of ATP­sensitive K+ currents by CGRP in gallbladder smooth muscle. Am J  Physiol 267: G494–G499, 1994.

  

Page 19

63. LW Kline, PKT Pang. Calcitonin gene related peptide relaxes cholecystokinin­induced contraction in guinea pig gallbladder strips in vitro. Can J Physiol  Pharmacol 70:1571–1575, 1992. 64. AP Gokin, LJ Jennings, GM Mawe. Actions of calcitonin gene­related peptide (CGRP) in guinea pig gallbladder ganglia. Am J Physiol 271:G876–G883, 1996. 65. A Thune, E Thorness, J Svanvik. Reflex regulation of flow resistance in the feline sphincter of Oddi by hydrostatic pressure in the biliary tract. Gastroenterology  91:1364–1369, 1986. 66. A Thune, L Jivegård, J Svanvik. Flow resistance in the feline choledocho­duodenal sphincter as studied by constant­pressure and constant­perfusion techniques.  Acta Physiol Scand 135:279–284, 1989. 67. A Thune, GTP Saccone, JP Scicchitano, J Toouli. Distension of the gall bladder inhibits sphincter of Oddi motility in humans. Gut 32:690–693, 1991. 68. AP Wyatt. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gallbladder. J Physiol 193:225–243, 1967. 69. FS DuBois, GH Kistler. Concerning the mechanism of contraction of the gallbladder in the guinea pig. Proc Soc Exp Biol Med 30:1178–1180, 1933. 70. RTA Padbury, JB Furness, RA Baker, J Toouli, JP Messenger. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the  Australian possum. Gastroenterology 104:130–136, 1993. 71. AL Kirchgessner, JE Pintar. Guinea pig pancreatic ganglia: projections, transmitter content, and the type­specific localization of monoamine oxidase. J Comp  Neurol 305:613–631, 1991. 72. Z Itoh, I Takahashi, M Nakaya, T Suzuki. Interdigestive function of the gallbladder in the dog. In: W. Y. Chey, ed. Functional Disorders of the Digestive Tract.  New York: Raven Press, 1983, pp 259–265. 73. AC Ivy, E Oldberg. A hormone mechanism for gallbladder contraction and evacuation. Am J Physiol 86:599–613, 1928. 74. KM Strah, TN Pappas, RL Melendez, HT Debas. Anticholinergic influence on exogenous and endogenous stimulation of gallbladder contraction.  Gastroenterology 88:1601A, 1985. 75. L Marzio, AM DiGiammarco, M Neri, F Cuccurollo, P Malfertheiner. Atropine antagonizes cholecystokinin and cerulein induced gallbladder evacuation in man: a  real time ultrasonographic study. Am J Gastroenterol 80:1–4, 1985. 76. N Hanyu, WJ Dodds, RD Layman, I Takahashi. Mechanism of cholecystokinin­induced contraction of the opossum gallbladder. Gastroenterology 98:1299– 1306, 1990. 77. MI Grossman. Gastrointestinal hormones: Spectrums of Actions and Structure­Activity Relations. Thorofare, NJ: Slack, 1975. 78. J Behar, P Biancani. Pharmacologic characterization of excitatory and inhibitory cholecystokinin receptors of the cat gallbladder and sphincter of Oddi.  Gastroenterology 92: 764–770, 1987. 79. J Behar, P Biancani. The effect of cholecystokinin and the octapeptide of cholecystokinin on the feline sphincter of Oddi and gallbladder. J Clin Invest 66:1231– 1239, 1980. 80. RS Fisher, E Rock, LS Malmud. Cholinergic effects on gallbladder emptying in humans. Gastroenterology 89:716–722, 1985. 81. L Gullo, L Bolondi, P Priori, P Casanova, G Labo. Inhibitory effect of atropine on cholecystokinin­induced gallbladder contraction in man. Digestion 29:209–213,  1984. 82. MJ Pozo, GM Salida, JA Madrid. Cholyecystokinin­induced gallbladder contraction is influenced by nicotinic and muscarinic receptors. 97:403–408, 1989. 83. KM Strah, TN Pappras, RL Melendez, HT Debas. Contrasting cholinergic dependence of pancreatic and gallbladder responses to cholecystokinin. Am J Physiol  250:G665–G669, 1986.

  

Page 20

84. I Takahashi, T Suzuki, I Aizawa, Z Itoh. Comparison of gallbladder contraction induced by motilin and cholecystokinin in dogs. Gastroenterology 82:419–424,  1982. 85. T Takahashi, D May, C Owyang. Cholinergic dependence of gallbladder response to cholecystokinin in the guinea pig in vitro. Am J Physiol 261:G565–G569,  1991. 86. EA Brotschi, J Pattavino, LF Williams Jr. Intrinsic nerves affect gallbladder contraction in the guinea pig. Gastroenterology 99:826–830, 1990. 87. T Yamamura, T Takahashi, M Kusunoki, M Kantoh, Y Ishikawa, J Utsunomiya. Cholecystokinin octapeptide­evoked [3H] acetylcholine release from guinea­pig  gallbladder. Neurosci Lett 65:167–170, 1986. 88. WM Yau, ML Youther. Modulation of gallbladder motility by intrinsic cholinergic neurons. Am J Physiol 247:G662–G666, 1984. 89. A Rakovska, K Milenov, A Bocheva. Effect of cholecystokinin octapeptide and somatostatin on the motility of guinea pig and canine gallbladder. Comp Biochem  Physiol 94C: 649–653, 1989. 90. JJ Galligan, PP Bertrand. ATP mediates fast synaptic potentials in enteric neurons. J Neurosci 14:7563–7571, 1994. 91. GM Mawe. The role of cholecystokinin in ganglionic transmission in the guinea­pig gallbladder. J Physiol (Lond) 439:89–102, 1991. 92. SI Myers, L Bartula. Human cholecystitis is associated with increased gallbladder prostaglandin I2 and prostaglandin E2 synthesis. Hepatology 16:1176–1179,  1992. 93. DL Kaminski, Y Deshpande, L Thomas, W Blank. Evaluation of the role of prostaglandins E and F in human cholecystitis. Prost Leukot Med 16:109–120, 1984. 94. JR Wood, SH Saverymuttu, AB Ashbrooke, IF Stamford. Effects of various prostanoids on gallbladder muscle. Adv Prost Thromb Res 8:1569–1571, 1980. 95. E Thornell, J Svanvik, JR Wood. Effects of intra­arterial prostaglandin E2 on gallbladder fluid transport, motility, and hepatic bile flow in the cat. Gastroenterology  16:1083–1088, 1981. 96. SP Lee, JT LaMont, MC Carey. Role of gallbladder mucus hypersecretion in the evolution of cholesterol gallstones: studies in the prairie dog. J Clin Invest  67:1712–1723, 1981. 97. L Jivegard, A Thune, J Svanvik. Intraluminal prostaglandin E2 affects gallbladder function by activation of intramural nerves in the anesthetized cat. Acta Physiol  Scand 132: 549–555, 1988. 98. K Nakata, Y Osumi, M Fujiwara. Prostaglandins and the contractility of the guinea pig biliary system. Pharmacology 22:24–30, 1981. 99. K Nakata, K Ashida, K Nakazawa, M Fujiwara. Effects of indomethacin on prostaglandin synthesis and on contractile response of the guinea pig gallbladder.  Pharmacology 23:95–101, 1981. 100. LJ Jennings, GM Mawe. PGE2 hyperpolarizes gallbladder neurons and inhibits synaptic potentials in gallbladder ganglia. Am J Physiol 274:G493–G502, 1998. 101. CA Kotwall, AS Clanachan, HP Baer, GW Scott. Effects of prostaglandins on motility of gallbladders removed from patients with gallstones. Arch Surg  119:709–712, 1984. 102. WC Chapman, GA Peterkin, WW LaMorte, LF Williams. Alterations in biliary motility correlate with increased gallbladder prostaglandin synthesis in early  cholelithiasis in prairie dog. Dig Dis Sci 34:1420–1424, 1989. 103. GM Mawe. Nerves and hormones interact to regulate gallbladder function. News in Physiological Sciences 13:34–90, 1998. 104. K Harrington, A Bomzon, KA Sharkey, JS Davison, EA Shaffer. Differential sensitivities of the sphincter of Oddi and gallbladder to cholecystokinin in the guinea  pig: their role in transsphincteric bile flow. Can J Physiol Pharmacol 70:1336–1341, 1992.

  

Page 21

2—  Gallbladder Mucosal Function J. Henriette Klinkspoor and Sum P. Lee Veterans Affairs Medical Center, Seattle, Washington I—  Introduction The association between bile and the gallbladder has been appreciated ever since the seventeenth century, when Diemerbroek wrote that bile enters the gallbladder to  "aquire greater strength and digestive power." This observation adequately expresses some of the main functions of the gallbladder. A great part of the hepatic bile  secretion enters the gallbladder, where it is stored and concentrated between meals. While in the gallbladder, the composition of hepatic bile is changed by absorption  and secretion by the gallbladder mucosa. Because of these storage and concentration functions, the gallbladder is one of several organs that are lined with an  epithelium whose proper function requires a lumen solution markedly different in composition from extracellular fluid. This bile solution is derived at considerable  metabolic expense by transport processes that take place in the hepatocytes of the liver. Bile is then concentrated in the gallbladder by an additional energy­consuming  process. Bile is likely to remain in the gallbladder for several hours until it is evacuated to the intestine, where it participates in digestive events. Because of the very low  level of most organic bile constituents in the fluids of the body, it is difficult to assess the concentration gradient of these constituents across the gallbladder wall.  However, gradients of at least 10,000:1 have been estimated. To maintain these gradients, the gallbladder wall must represent a barrier of considerable integrity. In  addition to restricting transepithelial diffusion of many substances, the gallbladder wall is also designed to facilitate net absorption of other substances in the  concentrative process. This requires high selectivity of the epithelium to passage of the individual bile constituents. The primary barrier regulating gallbladder  permeability is located in the epithelium rather than in the thicker subepithelial layers. Diamond (2) reviewed the early methods of studying gallbladder properties in  detail. These early studies on the gallbladder epithelium established that it is a relatively leaky epithelium. The range and the relevance of the physiological functions that the gallbladder serves are not clearly known. The contractile or motor function of the smooth muscle in  response to intestinal peptides, such as cholecystokinin, and regulation of hydrostatic pressure in the biliary tract are other important functions of the gallbladder.  Several other properties of the gallbladder mucosa have been investigated and discussed. It is thought to have a role in the acidification of bile by means of the  secretion of hydrogen ions, the absorption of cholesterol and other biliary lipids, as well as the absorption of bile pigments, amino acids, and sugars. In addition, the  gallbladder secretes mucous glycoproteins, immunoglobulins, fluid, and electrolytes when suitably stimulated. This chapter describes the role of the gallbladder mucosa  in modifying hepatic bile composition by means of its absorptive and secretory functions. Electrolyte and

  

Page 22

water absorption and secretion by the gallbladder will be discussed, as well as the regulation of this transport. Our current knowledge on the changes that occur in the  absorptive functions of the gallbladder during gallstone formation and other biliary diseases is summarized. Secretion and absorption of biliary lipids by the gallbladder  are discussed and, finally, the secretion of proteins and mucous glycoproteins by the gallbladder epithelium is examined. II—  Gallbladder Morphology Although the biliary apparatus is lined by the same columnar epithelium from a common embryonic origin, there are morphological and functional differences among the  terminal, intrahepatic, and extrahepatic cholangiocytes and the gallbladder epithelial cells. They also have different immunological markers (2). This single layer of  epithelial cells is able to subserve vectorial transport of water, electrolytes, and macromolecules between the internal milieu and the biliary lumen. It is usually assumed  that the transport properties of biliary epithelial cells vary according to their anatomic location. Intrahepatic biliary epithelial cells are mainly committed to secretion,  whereas gallbladder epithelial cells are thought to be specialized in absorption. However, it is now known that ductal and gallbladder epithelial cells are capable of  absorbing and secreting fluid and electrolytes. In addition, extrahepatic biliary epithelial cells are able to synthesize and secrete mucins by directed exocytosis. The  different transporting capacities of biliary epithelial cells are not associated with significant structural differences. Ultrastructural studies have shown that, apart from  their progressive increase in size along the biliary tract, all biliary epithelial cells exhibit similar but not identical morphological features. The most characteristic trait of  gallbladder epithelial cells is their high degree of structural polarization, evidenced by the asymmetrical distribution of their intracellular organelles and by the polarized  organization of their plasma membrane, divided into two distinct domains, respectively apical and basolateral. The apical membrane (facing the lumen) contains  microvilli, which are more or less prominent in different species. The basolateral membrane (facing the serosa) has a basal region that is anchored to the basement  membrane by hemidesmosomes and a lateral region that is frequently interdigitated with the membranes of the neighboring cells, lining a convoluted lateral intercellular  space. The two membrane domains are separated by tight junctions. Tight or occluding junctions join epithelial cells together to form a sheet, enabling them to have a  selective permeability barrier and preventing water­soluble molecules from leaking between the cells. Tight junctions also serve to prevent the entry of apical  membrane structures and proteins into the basolateral domain of the cell membrane, and vice versa (3). The subepithelial layer of the gallbladder contains connective tissue, smooth muscle, blood vessels, and the serosa. Transport across the epithelium in vivo occurs into  or from the underlying capillaries; the blood compartment functions as a sink for the transported water or solutes. Altered cell biological behavior of the gallbladder epithelium is believed to contribute to the pathogenesis of gallstones, hepatobiliary disease, cystic fibrosis, and  various other diseases including carcinogenesis. However, despite extensive research into the physiology and pathophysiology of the biliary tract, little is known about  the role of the gallbladder epithelium in the pathogenesis of biliary tract disease. In vitro techniques are required for the further study of the pathological and  physiological properties of the gallbladder wall and epithelium. Epithelial cell cultures represent one of the useful in vitro approaches. Several methods of monolayer  and three­dimensional cell culture of biliary epithelial cells from normal and pathological biliary tract are now available. In a recent review (4), several representative  models for the preparation and isolation of gallbladder epithelial cells and their use in monolayer and three­dimensional cell culture were discussed. Successful primary  and long­term culture of canine (5), mouse (6–8), bovine (9), and human (10–13) gallbladder epithelial cells has been reported. Tissue culture using explants, an  interesting alternative to cell culture, has mainly been used

  

Page 23

for physiological studies of the gallbladder, such as studies on the transport of water and electrolytes. III—  Water and Electrolyte Transport A—  NaCl Transport: Na+/H+ and Cl­/HCO­3 Exchange The main transport function of the gallbladder epithelium is the absorption of NaCl and water in near­isosmotic proportions. This results in concentration of the  impermeant components of bile in the lumen of the gallbladder. This involves apical membrane entry of Na+ and Cl­ and basolateral membrane extrusion of both ions.  The presence of Na+ in the lumen is necessary for fluid absorption, since bathing of the gallbladder in vitro in a balanced buffer solution that contains K+ substituted for  Na+, resulted in the complete cessation of net volume and electrolyte absorption. However, the requirement for Cl­ is not absolute. The precise mechanisms of net  entry of Na+ and Cl­ at the apical membrane are not fully agreed on, although it is accepted that entry is electroneutral, involving carrier­mediated cotransport or  countertransport. The following possibilities have been proposed: (a) NaCl cotransport; (b) NaKCl2 cotransport; (c) double Na+/H+,   anion exchanger was  recently demonstrated in the apical membrane of gallbladder epithelial cells, where it is possibly involved in the regulation of bicarbonate secretion into bile (15).  Another recent study demonstrated the presence of the CLC­3 Cl­ channel, a member of the CLC family of chloride channels, which includes several molecular  isoforms with tissue­specific distributions, in human gallbladder epithelium. Alterations in CLC­3 activity may alter epithelial Cl­ permeability and influence gallbladder  electrolyte and fluid transport (16). Although quantitatively less important than NaCl absorption, the gallbladder epithelium also secretes K+ and H+. For a long time it has been known that the pH in bile  declines in the gallbladder lumen. Acid secretion by the human gallbladder has important implications for gallstone formation, because the majority of gallstones contain  calcium carbonate and changes in the pH of bile are of critical importance in influencing the solubility of calcium in bile (17). Acid secretion by the gallbladder  epithelium could be due to either absorption of bicarbonate ions or a secretion of hydrogen ions. It has now been demonstrated that the human gallbladder mucosa  secretes hydrogen ions by means of an active Na+/H+ pump in the apical membrane. Using the Ussing chamber method, Plevris et al. (18) showed that viable human  gallbladder mucosa is capable of acidifying physiological solutions in vitro. The hydrogen concentration on the mucosal side of gallbladder tissue was observed to  increase, whereas simultaneously the hydrogen concentration in the serosal compartment decreased, suggesting a transfer of hydrogen ions from the serosal to the  mucosal side of the tissue. The concomitant decrease of bicarbonate concentration with increased   in the mucosal side, indicates that the acidification was not  simply due to an absorption of bicarbonate. Acidification was abolished when

  

Page 24 +

+

the gallbladder epithelium was exposed to sodium­free solution or in the presence of high concentrations of amiloride, a specific Na /H  transport inhibitor, in the  mucosal compartment, suggesting that hydrogen secretion in the human gallbladder depends on Na+/H+ antiport. The actual presence of a Na+/H+ exchanger in the  gallbladder epithelium has now been demonstrated. Mucosa of human gallbladder was found to contain mRNA of the NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger (19).  Subsequent studies failed to demonstrate the presence of mRNA for the NHE2 isoform in human gallbladder. In situ hybridization experiments demonstrated that the  NHE3 mRNA was strictly localized to the gallbladder epithelial cells. Synthesis of the NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger suggests that this isoform plays an  important role in water and electrolyte absorption by the gallbladder (20). Results showing that cAMP inhibits sodium absorption by the gallbladder (21) are  consistent with a major role of the NHE3 isoform, since it has been demonstrated that, unlike the NHE1 and NHE2 isoforms, NHE3 activity is decreased by an  increase in intracellular cAMP. Basolateral membrane Na+ exit is mediated by the Na+, K+­activated ATPase. The importance of Na+ transport was demonstrated by the use of ouabain to inhibit  Na+, K+­ATPase, which prevented net water flow. The activity of the Na+, K+­ATPase pump correlates directly with the rate of fluid transport. The basolateral  membrane also has a K+ conductive pathway, across which part of the K+ transported inward by the pump is recycled. The mechanism of Cl­ transport from cell to  basolateral solution has not been fully resolved but appears to result from both conductive transport and electroneutral KCl cotransport (14,22–24). A schematic  representation of gallbladder electrolyte and fluid transport is shown in Fig. 1. B—  Other Electrolyte Transporters Hepatobiliary complications in cystic fibrosis result predominantly from lesions of the biliary epithelium. These abnormalities affect the intrahepatic as well as the  extrahepatic bile ducts and the gallbladder. The protein cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), the gene product defective in cystic fibrosis,  functions as a cAMP activated chloride channel in the plasma membrane. As such, it may represent an important driving force for fluid transport across the gallbladder  epithelium. The CFTR protein was detected by immunolocalization in human gallbladder tissue sections and was found to be predominantly localized to the apical  membrane of the epithelial cells. RT­PCR was used to demonstrate the presence of CFTR mRNA in freshly isolated and cultured human gallbladder epithelial cells.  High levels of CFTR protein were maintained in gallbladder epithelial cells, as demonstrated by Western blotting and immunoprecipitation. Chloride efflux in these cells  could be stimulated by Ca2+­dependent pathways and more intensely by cAMP­dependent pathways. Vasoactive intestinal peptide and secretin stimulated chloride  efflux in vitro. The cAMP­mediated chloride efflux was inhibited by chloride channel inhibitors (25). Subsequent studies, using Western blotting, RT­PCR, and  Ussing­chamber experiments, revealed the presence of CFTR protein in normal cultured mouse gallbladder epithelial cells (6,8). However, gallbladders from CFTR(­ /­) knockout mice lacked the cAMP induced chloride current observed in normal gallbladders. In fluid transport measurements, normal and CFTR knockout  gallbladders were equally active in basal resorption. The addition of forskolin, which activates CFTR anion channel activity through the cAMP system, resulted in net  fluid secretion in the normal mouse gallbladders. In contrast, CFTR (­/­) gallbladders were unable to secrete fluid while a complete inhibition of resorption by forskolin  was observed. Therefore it was concluded that in normal mouse gallbladder epithelium, cAMP­induced fluid secretion involves simultaneous inhibition of apical sodium  chloride resorption and activation of CFTR (6,7). These findings indicate a potential role for CFTR in the pathophysiology of the gallbladder epithelium. In the small  intestine and the airway epithelium, CFTR has been shown to regulate sodium absorption, and CFTR (­/­) was associated with hyperabsorption of sodium (26).  Whether this applies to the gallbladder epithelium has not been studied.

  

Page 25

Figure 1 Ion transport systems in gallbladder epithelium. A model for isosmotic fluid resorption in the gallbladder as suggested by Reuss et al. for various species (23). Direction of fluxes observed in steady state are depicted. Apical membrane NaCl entry is via parallel   Na+/H+ and   dissociates as CO2 and H2O. Basolateral Na+ extrusion is via the Na+, K+­ATPase pump. Basolateral Cl­  exit is by KCl cotransport and a Cl­ conductive pathway, and apical Cl­ exit can occur  via the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). There are selective K+ channels in both membranes, but K+ recycles mostly at the basolateral border, which  has a much higher K+ conductance.

A recent immunohistochemical study revealed that besides the basolateral Na+, K+­ATPase membrane transporter and the apically located CFTR transporter, human  gallbladder epithelial cells also express the MDR­1 transporter on their apical membranes. Involvement of the MDR­1 transporter in fluid transport has been  postulated. Interestingly, CFTR and MDR­1 were found to be colocalized in the apical domain of all biliary cells, including gallbladder epithelial cells. This finding  contrasts with the fact that in most other epithelia, CFTR and MDR­1 show complementary patterns of expression. CFTR and MDR­1 are expressed predominantly  in secretory and absorptive cells, respectively. Their coexpression in the gallbladder, therefore, supports the notion that the gallbladder is capable of both secretory  and absorptive transport (15). C—  Water Transport Concentration within the gallbladder is a consequence of the removal of water from the lumen, and it is now accepted that this concentration of hepatic bile secreted  by the liver is a result of one of the highest rates of water absorption reported. The rate of fluid absorption has been

  

Page 26 2

measured in several species and ranges from 5 to 80 l/cm  per hour. Transport rates are higher in mammals than in other vertebrates. Water is absorbed in isosmotic  proportions, and this can occur against its electrochemical gradient. Water absorption by the gallbladder is always coupled to salt transport. The precise mechanism of  water transport is not known, but the predominant view is that the water flow is osmotically coupled to NaCl transport. It is believed that salt transport causes small  osmotic gradients across both cell membranes, making the cell interior hyperosmotic to the mucosal solution and hypoosmotic to the fluid in the lateral intercellular  spaces. The resulting elevation of the hydrostatic pressure in the lateral spaces causes the solution to flow towards the subepithelial space (22–24). D—  Regulation of Electrolyte and Water Transport Since many of the transport mechanisms accounting for baseline electrolyte and water transport in the gallbladder epithelium have now been characterized, recent  studies have focused on the regulation of transport. The rate of transepithelial ion absorption is the result of integrated activity of transporters in the apical and  basolateral cell membranes. A variety of mediators affect the rate of electrolyte and water transport by the gallbladder. Some of these could act to regulate gallbladder  water and electrolyte transfer under physiological conditions by modification of NaCl influx, active Na+ extrusion, and/or junctional permeability. In gallbladder epithelium, the best understood regulatory mechanisms involve intracellular factors such as pH, Ca2+, and cAMP. Changes in intracellular levels of these  and other agents mediate the effects of peptides, hormones, and neurotransmitters on salt transport. For example, secretin, glucagon, and vasoactive intestinal peptide  inhibit fluid absorption by the gallbladder mucosa, whereas cholecystokinin and gastrin are without effect. Of the regulatory peptides mentioned above, only VIP and  secretin are able to modify gallbladder fluid transport at physiological concentrations. Other peptides, however, may act to potentiate or inhibit the effects of other  regulatory factors. As discussed in detail below, prostaglandins play an important role in the regulation of water and electrolyte transport by the gallbladder epithelium.  They have also been shown to alter the normal process of water absorption and induce net secretion. Elevating intracellular cAMP levels decreases the rate of fluid  absorption by the gallbladder and, in some species, can elicit net secretion. A number of agents including prostaglandins, secretin, vasoactive intestinal peptide,  bradykinin, and vasopressin elevate cAMP levels, which suggests that this mechanism is responsible for the effect of these agents on salt and water transport. The  predominant effects of cAMP on gallbladder epithelial cells are exerted at the apical membrane and consist of activation and/or insertion of Cl­ channels, such as  CFTR and inhibition of the apical Na+/H+ exchanger and the apical   secretion. The current information available on the regulation of specific transporters and the  means by which regulation is integrated to determine the overall rate of fluid transport has been extensively reviewed (14,22–24,27). E—  Electrolyte and Water Transport during Gallstone Formation Recent studies suggest that increased absorption of electrolytes and water across the gallbladder epithelium occurs during the early stages of experimentally induced  gallstone formation. Moreover, altered transepithelial absorption has been implicated in the pathogenesis of both cholesterol and pigment gallstones. Increased  gallbladder absorption may play an important role, contributing to gallstone formation by increasing the concentration of absorbable constituents of bile. These  constituents may serve as either components of gallbladder sludge, a precursor of gallstones, or as pronucleating factors promoting cholesterol nucleation and growth.

  

Page 27

Ionic calcium has been suggested to serve as an important mediator of intestinal absorption. Moreover, calcium channel antagonists have also been documented to  alter intestinal water and electrolyte flux. Until recently, however, little information was available with respect to alterations in extracellular calcium or the effect of  calcium channel antagonists on gallbladder absorption. Gallbladder bile concentrations of total and ionized calcium have been reported to be increased in human beings  with gallstones and increased biliary calcium levels have been found in numerous experimental models of both cholesterol and pigment gallstones. Biliary calcium has  been suggested both to play a structural role in the formation of gallstones and to contribute to the nucleation of cholesterol crystals by serving as a pronucleating  agent. Therefore, Scheeres et al. (28) investigated whether extracellular calcium modulates gallbladder absorption. They demonstrated that in the rabbit gallbladder,  alterations in serosal extracellular calcium concentration did not significantly affect gallbladder absorption. The calcium channel antagonist verapamil, however,  significantly decreased gallbladder absorption, suggesting that calcium channels may mediate this process in the gallbladder. Changes in extracellular calcium were  demonstrated to affect ion transport across the gallbladder epithelium of the prairie dog, which has emerged as an important animal model for the study of human  cholesterol gallstone disease. Prairie dog hepatic and gallbladder bile compositions are similar to those of humans. Furthermore, prairie dogs maintained on a  cholesterol­rich diet develop cholesterol gallstones in a manner that recapitulates events known to occur in humans with cholelithiasis. The gallbladder epithelium of the  prairie dog is electrogenic and resembles that of humans. However, in contrast to gallbladders of most other species, the prairie dog gallbladder epithelium  simultaneously but independently absorbs Na+ and secretes Cl­ (29). Cates et al. demonstrated—by exposing gallbladders to dantrolene, which traps calcium within  intracellular organelles, and nickel, which prevents influx of extracellular calcium—that the effects of extracellular calcium on prairie dog gallbladder ion transport are  mediated by changes in intracellular calcium (30). Recently, apical and basolateral Ca2+ channels were demonstrated to be present in the gallbladder epithelium (31).  Further investigation into the pathophysiology of these cation channels should yield useful information regarding the control of calcium flux. Subsequent studies were aimed at elucidating the mechanism by which changes in intracellular calcium regulates gallbladder ion transport. Prairie dog gallbladders,  mounted in Ussing chambers were exposed to trifluoperazine, a potent agonist of Ca2+­calmodulin, a receptor protein in the Ca2+ messenger system. In addition, the  ion transport effects of increased extracellular calcium were determined in the presence of calmodulin inhibition. Inhibition of calmodulin resulted in an increase in net  Na+ and water absorption. The effects of trifluoperazine could be reversed by increasing luminal Ca2+; therefore it was concluded that Ca2+­calmodulin regulates basal  gallbladder absorption in the prairie dog gallbladder (32) (Fig. 2A). However, when the intracellular calcium concentration in prairie dog gallbladder was increased by  exposing the gallbladders to the calcium ionophore A23187, mucosal­to­serosal Cl­ flux was inhibited and serosal­to­mucosal flux of Na+ was stimulated, resulting in  increased net Cl­ secretion and decreased net Na+ absorption. A23187 converted gallbladder water absorption to secretion. The effect of A23187 was delayed by  pretreatment with indomethacin, suggesting a prostaglandin­dependent mechanism (33). This is the first study demonstrating that increased intracellular calcium  converts the gallbladder from its normal absorptive state to a secretory one. Next, the authors investigated whether protein kinase C is also essential in the regulation  of gallbladder ion transport in this model. Activation of protein kinase C by phorbol esters resulted in inhibition of Na+ absorption and a stimulation of Cl­ secretion by  the gallbladder epithelium. Similar effects were seen with serotonin, a hormone mediating its effects through the phosphoinositide/PKC pathway. Pretreatment of the  tissues with H­7, a very potent inhibitor of protein kinase C, blocked the inhibitory effect of phorbol esters on ion transport. Due to the changes in Na+ and Cl­  transport, mucosal­to­serosal water flux was diminished, while serosal­to­mucosal flux remained essentially the same, causing a change from net water absorption to  secretion (34) (Fig. 2B). It is apparent from these studies that intracellular calcium mediates its regulation of gallbladder ion transport through the Ca2+ calmodulin  complex and

  

Page 28

Figure 2 Role of Ca2+ in the regulation of ion transport in gallbladder epithelium. Regulation of basal  gallbladder absorption by calmodulin (CaM) in prairie dog gallbladder as suggested0160by Moser et al. (32). Effects of biliary Ca2+ are mediated by changes in intracellular Ca2+  ([Ca2+]i). In the presence of free Ca2+, calmodulin binds to inactive calmodulin­dependent  protein kinase (CaM­PK), converting it to the active Ca2+­calmodulin­bound form. Active    calmodulin­dependent protein kinase phosphorylates mucosal Na+/H+ and  exchange mechanisms, downregulating Na+ and Cl­ absorption (Fig. 2A). Mechanism of  protein kinase C (PKC)­induced inhibition of ion transport in prairie dog gallbladder  epithelium as proposed by Cates et al. (34). Agonist binds to its receptor and together they activate guanine nucleotide­binding protein (G protein), which stimulates phospholipase C  (PLC). Phospholipase C hydrolyzes membrane­bound phosphatidylinositol 4,5­bisphosphate  (PIP2) to produce inositol 1,4,5­triphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG).  1,4,5­Triphosphate then mobilizes Ca2+ from intracellular stores. Diacylglycerol binds to  the regulatory subunit of inactive protein kinase C, increasing its affinity for Ca2+ and  converting it to active protein kinase C. Active protein kinase C phosphorylates mucosal Na+/H+ and   exchangers, resulting in inhibition of mucosal­to­serosal fluxes of  Na+ and Cl­  (Fig. 2B).

  

Page 29

protein kinase C, the two major systems through which intracellular calcium carries out its second­messenger functions in many cell types. The results suggest that  Ca2+­calmodulin regulates gallbladder ion transport at basal intracellular calcium levels, whereas protein kinase C regulates transport at elevated calcium levels.  Therefore it can be hypothesized that changes in biliary calcium during gallstone formation might result in alterations in gallbladder absorption. This was investigated in a  study that sought to correlate gallbladder Na+ and Cl­ fluxes with biliary lipid composition during the various stages of gallstone formation. Prairie dogs were fed a  standard or cholesterol­rich diet for 4 to 21 days. Hepatic and gallbladder bile was analyzed for lipids and Ca2+. Animals were designated either precrystal, crystal, or  gallstone based on the absence or presence of crystals or gallstones, respectively. Gallbladders were then mounted in Ussing chambers and unidirectional Na+ and Cl­  fluxes were measured. Na+ absorption was found to be increased during the precrystal stage but decreased during the gallstone stage due to increased serosa­to­ mucosa flux and mucosa­to­serosa flux, respectively. Increased serosa­to­mucosa flux of both Na+ and Cl­ characterized the crystal stage. Biliary lipids (total bile  acids, phospholipids, and total lipids) increased progressively during various stages of gallstone formation and correlated positively with fluxes of Na+ and Cl­.  Although these correlations do not indicate the cause­and­effect relationships between biliary lipids and gallbladder ion transport, these relationships suggest that  individual biliary moieties may play an important role in regulating transport of specific ions during gallstone formation. Also a significant positive correlation between  Na+ and Cl­ fluxes and Ca2+ concentration was observed. It is possible that the increased concentrations of biliary lipids and Ca2+ directly modulate gallbladder ion  transport, thereby promoting gallstone formation (35). Transepithelial Na+ transport in prairie dog gallbladder occurs via Na+/H+ exchange at the apical membrane followed by extrusion at the basolateral membrane via  Na+, K+­ATPase. Gallstone formation is accompanied by a significant decrease in net Na+ absorption, due primarily to the increase in serosa­to­mucosa Na+ flux,  with loss of the normal Na+ gradient. This finding is consistent with the described downregulation of Na+, K+­ATPase in gallstone animals (29). F—  Absorption versus Secretion The gallbladder is conventionally regarded as an absorptive organ. However, studies by Igimi et al. (36), showed that the gallbladder secretes water and electrolytes  into the lumen during periods of digestion. They studied 35 patients who had recovered from a percutaneous trans­

  

Page 30

hepatic gallbladder drainage performed for acute cholecystitis. After an overnight fast, gallbladder bile was dark brown in color and had a wide scatter in the lipid  composition. Two hours after a meal, the gallbladder bile was opalescent white in color and had the composition of an extracellular fluid. This phenomenon was  uniformly observed in all patients. Using normal dog gallbladder epithelial cells, Igimi et al. studied sodium flux. Control cells were demonstrated to absorb sodium, but  the addition of secretin resulted in a reversal of sodium flux and net sodium secretion. The investigators concluded that secretion is a physiological function of the  gallbladder mucosa. They suggested that after feeding, neural and humoral factors induce active de novo secretion, thus producing a gallbladder bile that is opalescent  white with no lipids. These findings also challenge the accepted view of the origin of the pathological ''white bile." It is believed that white bile is the result of impaction  of gallstones into the cystic duct, with the pigments, lipids, and bile salts absorbed by the mucosa, leaving behind a whitish fluid. This study suggests that white bile  might be the result of active secretion and not the remnants of selective reabsorption. These observations were made in patients with patent bile ducts communicating with the gallbladder. Theoretically, the fluid could have come from the bile ducts, and  therefore the interpretation that this is de novo gallbladder secretion has been challenged (37). In a subsequent study, Glickerman et al. (38) investigated a patient with  multiple bile duct strictures whose gallbladder was excluded from the extrahepatic ducts. The patient required separate drainage of his gallbladder and common  hepatic duct, thus allowing separate yet simultaneous analysis of gallbladder and hepatic secretions. In doing so, the authors were able to confirm their previous  observation that the gallbladder produces a clear, colorless fluid. Although hepatic bile flow was continuous, gallbladder drainage was intermittent, occurring only after  meals, and the volume was variable. The gallbladder fluid was rich in protein, with mucin accounting for more than 60% of the protein. The fluid had no bilirubin, bile  salts, cholesterol, or phospholipids and had the ionic profile of an extracellular fluid. The secretion was found to be alkaline and contained abundant bicarbonate. In  addition to demonstrating that the gallbladder can be a secretory organ, these observations raise other issues concerning the pathophysiology of biliary tract disorders. IV—  Biliary Lipids An absorption of lipids by the gallbladder has been claimed. Several observations support such a contention. The guinea pig gallbladder was shown to absorb  significant amounts of cholesterol, bile acids, and phospholipids. Using model biles, the rate of cholesterol absorption was found to correlate with biliary saturation  rather than biliary cholesterol concentration. The absorption showed a linear increase as saturation increased and reached a maximum when model bile became  saturated with cholesterol. Metabolic inhibitors and colchicine, a microtubule inhibitor, reduced uptake and serosal secretion, demonstrating that the serosal secretion  is not simply a product of passive cholesterol exchange between bile and mucosa and mucosa and serosal fluid (39). The rate of cholesterol absorption exceeds that of  the other biliary lipids, which should render the gallbladder contents less saturated. The human gallbladder was also demonstrated to absorb cholesterol. Using in vitro  and in vivo experiments, it was shown that radioactive cholesterol from model bile and gallbladder bile enters the mucosal cells of human gallbladder (40,41). Infusion  of a mixture of bile acids and cholesterol into the damaged gallbladders of dogs resulted in an increased cholesterol concentration of the mixture and a decrease of the  bile acid concentration. And dietary cholesterol alters biliary as well as gallbladder mucosal cholesterol concentration. A selective absorption of cholesterol and  phospholipids within the gallbladder has been implied. However, the possible exchange of cholesterol between gallbladder and bile and the net movement of  cholesterol in one direction have not been studied. More recent studies suggest a bidirectional flux of cholesterol between biliary cholesterol carriers and gallbladder  epithelial cells. Hayashi et al. (42), using cultured dog gallbladder epi­

  

Page 31

thelial cells, demonstrated that cholesterol in the apical membrane bilayer of the epithelial cells exchanged readily with that in bile, but only in the presence of bile salts.  The rate of exchange was found to be dependent on the concentration and species of bile salts. The net gain of cholesterol (absorption) or net loss of cholesterol  (cytotoxicity) exhibited by the epithelial cells was regulated by the thermodynamic stability of cholesterol and the detergent effect of mixed micelles in bile. Therefore, it  cannot be excluded that the physicochemical composition of lipids in bile may modify the cellular function of the gallbladder epithelium by directly influencing the lipid  composition in the gallbladder mucosa. A bidirectional traffic of lipids may be the mechanism whereby the gallbladder epithelial cells can sense and respond to a  change in the chemical composition of its milieu. A net gain or loss of cholesterol in the membrane of the gallbladder epithelial cells may influence the fluidity of the  membrane and perturb intramembrane enzyme or receptor functions. A number of cell biological functions—such as fluid and electrolyte transport and mucin  secretion—may therefore be profoundly altered as a result. A recent study on the relative efficiencies of human gallbladder mucosal absorption of fluid and lipids in health and disease demonstrates the possible importance of  lipid absorption by the human gallbladder epithelium. Biliary lipids and pigment content were measured in fasting gallbladder bile samples obtained from gallstone­free  controls and from four study groups: multiple and solitary cholesterol gallstone patients and morbidly obese subjects with and without gallstones. Bile salts and pigment  content were found to be significantly greater in gallstone­free controls than in all other study groups, suggesting a more effective gallbladder mucosal fluid absorption  in controls. Correlation plot analyses of biliary lipids showed lower concentrations of phospholipids and cholesterol than expected from the index bile salt  concentrations. These findings were more pronounced in gallstone­free controls and were interpreted as evidence of more efficient gallbladder absorption of biliary  lipids in controls. The authors concluded that efficient gallbladder mucosal absorption of both fluid and lipids from bile is a normal physiological process that is often  seriously impaired during cholesterol gallstone disease (43). V—  Bile Pigments Because in normal function the gallbladder maintains a considerable concentration gradient of bile pigments across its wall, the permeability of the mucosa to these  organic substances is of some interest. Absorption of unconjugated bilirubin from bile proceeds much faster than absorption of the pigment in conjugated form.  Bilirubin absorption is not reduced by metabolic inhibitors even though fluid absorption is reduced. Absorption is linearly related to the concentration of the pigment in  the luminal solution, which indicates that loss of this pigment from the gallbladder proceeds by simple diffusion (44). VI—  Amino Acids and Sugars It has been demonstrated that there is active absorption of amino acids and sugar by the dog, guinea pig, and human gallbladder. The unidirectional transepithelial flux  of glycine from mucosa to serosa is severalfold greater than the oppositely directed flux, and tissue accumulation of glycine follows saturation kinetics. Lysine is  accumulated in the mucosa to a concentration 20 times that in bathing media, whereas the presence of another dibasic amino acid, arginine, inhibits the process.  Uptake of sugars and amino acids is remarkably reduced by tissue incubation in Na­free bathing solutions or by exposure to metabolic inhibitors or ouabain. The  present information suggests that the gallbladder mucosa has the capacity to conserve much of the sugar and amino acid present in hepatic bile by an active transport  mechanism (44).

  

Page 32

VII—  Mucins Among the major secretions of the gallbladder epithelium are mucous glycoproteins. Gallbladder mucin is presumed to act as a protective agent against molecules such  as the membrane toxic bile acids and lysophosphatidylcholine. However, besides having a protective function, gallbladder mucin has been reported to stimulate  cholesterol nucleation, crystal growth, and crystal aggregation. The role of gallbladder mucin in the pathogenesis of gallstones has been the subject of review (45) and  is also discussed in Chapter 10 of this volume. During the last few years a vast amount of new knowledge has been acquired about the regulation of mucin secretion by  the gallbladder epithelium as well as about the variety of mucin genes that are expressed in the gallbladder mucosa. A lot of this information has been the result of the  study of cultured gallbladder epithelial cells derived from different species. Several intracellular signaling pathways seem to be involved in the regulation of mucin  secretion. Besides the protein kinase A (cAMP) pathway (46), a calcium­dependent pathway, implicating Ca2+­calmodulin kinase II and protein kinase C, has been  described (47). Although different results have been reported, depending on the species studied, mucin secretion by the gallbladder epithelium seems to be stimulated  by a variety of substances. Compounds that cause an increase in intracellular cAMP (VIP, adrenaline, isoproterenol, prostaglandins) have been shown to cause an  increase in mucin secretion in the dog (46) and guinea pig gallbladder but not in the prairie dog. Whether an increase in cAMP also stimulates mucin secretion in human  gallbladder remains controversial. Prostaglandins, adrenaline, and isoproterenol were demonstrated to cause an increase in cAMP in one culture system (13), but  forskolin, secretin, and VIP did not significantly stimulate mucin secretion in another (47). Recently, the CFTR protein has also been implicated in the regulation of  mucin secretion by the gallbladder epithelium as well as other epithelia. Using a retroviral vector to overexpress the CFTR protein in cultured dog gallbladder epithelial  cells, Kuver et al. (48) demonstrated a fourfold increase in constitutive mucin synthesis and secretion by these cells. However, in a similar mouse model, no evidence  for a link between mucin secretion and CFTR activity was found. Agonists of cAMP stimulated chloride efflux in cultured mouse gallbladder epithelial cells, but  cAMP, Ca2+, and protein kinase C agonists did not cause an increase in mucin secretion by cultured mouse gallbladder epithelial cells (6). An increase in intracellular calcium stimulated mucin secretion in the guinea pig but not in the dog or prairie dog gallbladder. Bile salts were found to be stimulants of  mucin secretion in dog gallbladder (49). More recently, bile salts were demonstrated to also cause an increase in mucin secretion by human gallbladder epithelial cells  via a cytosolic calcium increase and Ca2+­CaM kinase II. Mucin secretion in these human gallbladder epithelial cells could be stimulated by ionomycin and phorbol  ester and was found to be predominantly regulated by a calcium­dependent pathway, implicating Ca2+­CaM kinase II and protein kinase C. ATP, UTP, UDP, and  ADP also stimulated mucin secretion, whereas extracellular adenosine had no effect, implicating P2u purinergic receptors (47). In recent years considerable advances  have been made in our knowledge of human mucin genes. Although analysis of their genomic organization is still in progress; the pattern of their expression in different  human mucosa is now fairly well established. However, little was known until recently about their expression in the biliary tree. Biliary epithelial cells are subjected to  an especially toxic environment; the bile. The role of biliary mucins is likely to ensure cytoprotection of these epithelial cells. Northern blot studies demonstrated the  presence of MUC1, MUC3, MUC4, MUC5AC, and MUC5B mRNAs in cultured human gallbladder epithelial cells, whereas MUC2 mRNAs were barely  detectable (50). Vandenhoute et al. (51) determined the pattern of expression of the different human mucin genes in gallbladder epithelial cells, intrahepatic bile ducts,  and liver by means of Northern blot and in situ hybridization. Biliary epithelial cells showed a strong mRNA expression of MUC3, MUC6, and MUC5B and a weak  expression of MUC1, MUC5AC, and MUC2. No expression of MUC4 and MUC7 was observed. Surprisingly, MUC3, which was the gene most strongly  expressed in the biliary tree, was also found in hepatocytes. Electron microscopy shows no indication that hepatocytes secrete mucin granules. This result suggests that  possibly

  

Page 33

MUC3 may not only be a secreted mucin but also might be anchored into the cell surface membrane and might have another role apart from mucus gel formation. VIII—  Proteins Electron microscopic studies have demonstrated a blood­to­bile transport pathway, which could represent a route of entry to the gallbladder lumen for various blood­ borne macromolecules. For example, horseradish peroxidase was shown to permeate the basement membrane and entered the lateral intercellular space, after which  there was a vesicular transport to the lumen. A selective reabsorption of proteins from bile by the gallbladder also has been suggested. An increased interest in the  ability of the gallbladder mucosa to absorb and secrete proteins is due to the possible role of proteins as pro­ or antinucleating factors in cholesterol crystallization. It  has been suggested that the nucleating factor for cholesterol in gallbladder bile is a protein other than mucous glycoprotein that is absorbed or degraded in the normal  gallbladder but not in the gallbladder harboring stones. On the other hand, the increased cholesterol nucleation might be due to an increased secretion of these  pronucleating proteins by the gallbladder mucosa. However, few proteins are synthesized in the biliary tract itself; the majority reflect the composition of serum  proteins. Based on the observation that there is delayed onset of cholesterol crystal nucleation in normal human gallbladder bile compared to model biles of similar  biliary lipid composition, it has been postulated that there are anti­nucleating factors in normal gallbladder bile. The role of pro­ and antinucleating proteins in the  pathogenesis of gallstone disease is reviewed in Chapter 9. Whether there is an increased protein content of bile in cholesterol gallstone patients, possibly due to  increased protein secretion by the gallbladder, is still a subject for discussion. Some groups have reported an increase in total protein concentration in the bile of  gallstone patients, whereas in other studies an increase in the glycoprotein fraction was observed. In contrast, other studies failed to demonstrate an increased protein  content of gallstone bile. However, the nucleating or antinucleating action of gallbladder proteins is of much greater interest than protein concentrations. Therefore,  studies on whether and how the gallbladder removes or adds pronucleating or antinucleating proteins to the bile are of great importance. But despite its potential  importance in stone formation, there are few studies on protein secretion and absorption by the human gallbladder. In an in vitro study on protein absorption and  secretion by the human gallbladder, both absorption of albumin and secretion of protein were demonstrated. The secreted proteins might come from serum proteins in  the vessels of the gallbladder or from the gallbladder mucosa. Unfortunately, the type of proteins secreted were not studied. No significant differences in water or  albumin transport rates or protein secretion rates were observed between gallbladders derived from control patients and cholesterol gallstone patients in this study  (52). As mentioned above, little information is available about which specific proteins are synthesized and secreted by the gallbladder epithelium (53). Recently, evidence  was presented to support the theory that the gallbladder is the predominant source of human bile IgA. Human bile contains immunoglobulins: IgG, IgM, and different  forms of IgA. In some species the liver has been attributed the special function of clearing IgA from the circulation and excreting it with the bile into the intestinal tract.  However, in humans the hepatobiliary transport of circulating IgA is much less important. In humans the amount of hepatic bile IgA delivered to the intestine averages  less than 1 mg/kg/day and interruption of bile flow does not lead to significant elevations of IgA in plasma. In addition, the biliary tract and gallbladder mucosa contain  immunoglobulin­producing cells. Thus, the biliary immunoglobulins are probably a mixture of molecules originating from distant sites and excreted by the liver and  immunoglobulins produced in the biliary tract. Indeed, a study on the sedimentation profiles of IgA and secretory component (SC) and the concentrations of IgA, IgG,  IgM, SC, and albumin in the gallbladder bile of adult human subjects without hepatobiliary disease, after an overnight fast, revealed an enrichment of bile with IgA and  IgM relative to albumin. These results suggest

  

Page 34

that a significant amount of IgA could have been added to bile during its storage in the gallbladder. Therefore, the gallbladder should be regarded as the predominant  source of bile IgA in humans (54). This could be an important finding, since biliary immunoglobulins have been implicated to play a role in the pathogenesis of  cholesterol gallstone disease. IX—  Arachidonic Acid Metabolites Arachidonic acid metabolites, or eicosanoids, are involved in a wide spectrum of hepatobiliary physiological functions and disease. Arachidonic acid is a  polyunsaturated fatty acid found in phospholipids in cell membranes. After inflammatory or other stimuli, it is converted to prostaglandins through the action of the  cyclooxygenase enzyme system or to leukotrienes through the action of lypoxygenase enzymes. Prostaglandins and leukotrienes are important mediators of  inflammation and are involved in numerous physiological activities and pathological disease states of the gallbladder. The role of arachidonic acid metabolites in biliary  physiology and disease has been reviewed (55). Prostanoids alter hepatic bile flow, with certain prostaglandins stimulating bile flow and others inhibiting bile flow.  Prostanoids are also involved in gallbladder contraction, they cause gallbladder contraction in some species and relaxation in other species, and they may be mediators  of cholecystokinetic hormone action. The inflamed gallbladder secretes rather than absorbs fluid. Prostaglandins have been demonstrated to alter the normal process of water absorption by the gallbladder  mucosa and induce net water secretion. For example, prostaglandin E2 inhibits fluid absorption and induces net secretion in some species. However, no information is  available to suggest that prostanoids stimulate gallbladder water absorption. Several hormones, such as secretin and vasoactive intestinal peptide, can stimulate  gallbladder mucosal water secretion, but we do not know of any hormones that enhance fluid absorption. Also, indomethacin, an inhibitor of cyclooxygenase activity,  has no effect on basal gallbladder absorptive function. In cholecystitis, the prostanoids may mediate the distention produced by mucosal fluid secretion and the contraction of the diseased gallbladder. The inflammatory  changes produced in various experimental models of cholecystitis can be prevented by cyclooxygenase inhibitors. Normal gallbladder mucosa and muscle tissue from cats, dogs, guinea pigs, opossums, and humans produce prostanoids, suggesting a role for prostaglandins in the  physiological functions of gallbladder mucosal water transport and muscle contraction. Human gallbladder mucosa was demonstrated to produce prostaglandin E as  well as prostaglandin F. The amount of prostaglandins produced by inflamed gallbladder muscle and mucosal cells was found to increase with the severity of the  inflammatory process (56). Cyclooxygenase inhibitors decrease gallbladder prostaglandin formation and are effective in producing relief of some of the symptoms of  gallbladder disease. Prostanoids have also been implicated in gallstone formation. Increased cholesterol in bile results in increased prostanoid and lysolecithin  formation, leading to the nucleation of cholesterol and subsequent gallstone formation (55). As described above, prostaglandins are also involved in the regulation of mucin secretion by the gallbladder mucosa, which can act as a nidus for stone formation. In  some studies, cyclooxygenase inhibitors were reported to prevent the formation of gallstones in experimental animals. In humans, the significance of anti­inflammatory  drugs in the prevention of gallstone formation is less clear. However, some studies seem to point at a possible inhibitory effect of drugs such as aspirin on mucin  secretion by the gallbladder mucosa (45). Most recently, Sterling et al. (57) tried to determine whether chronic use of nonsteroidal anti­inflammatory drugs (NSAIDS)  was associated with a reduction in the mucin content or affected the lipid composition of human gallbladder bile. They found that patients with gallstones had a  significantly greater concentration of gallbladder mucin in their gallbladder bile than patients without gallstones. Among gallstone patients, gallbladder mucin was  reduced in those patients with a history of chronic NSAID use. Also, chronic NSAID use was associated with a reduction in the cholesterol/phospholipid ratio of bile  in both patient groups.

  

Page 35

However, more research is needed to determine the exact role of prostaglandins in the pathogenesis of gallstone disease. In addition to prostaglandins, it has now been demonstrated that the gallbladder is able to synthesize and secrete a variety of signal molecules, such as cAMP and  cytokines. Mouse gallbladder epithelial cells produce mRNas for several cytokines such as TNF­ , IL­6, RANTES, macrophage inflammatory protein 2 (MIP­2)  and ICAM (58). Human gallbladder epithelial cells were demonstrated to secrete endothelin­1 (11), and both human and dog gallbladder epithelial cells express  iNOS (59,60). Taken together these findings suggest that gallbladder cells can serve a paracrine­autocrine function. X—  Summary In this chapter we have described the different functions served by the gallbladder mucosa. The main function of the gallbladder epithelium is the concentration of  hepatic bile. This is achieved by means of active absorption of water and electrolytes. Sodium and chloride are absorbed by the gallbladder by a double exchange  mechanism in which hydrogen and bicarbonate are excreted, resulting in acidification of bile. Water absorption occurs owing to osmotic coupling to sodiumchloride  transport. Absorption of water and electrolytes by the gallbladder epithelium is influenced by intracellular cAMP and calcium levels. In biliary disease, such as gallstone  formation, the transport function of the gallbladder can be dramatically altered, resulting in net secretion instead of absorption. Besides water and electrolytes, the  gallbladder also absorbs biliary lipids, such as cholesterol, and biliary pigments as well as proteins, amino acids, and sugars. Recent studies have demonstrated that the  gallbladder has a secretory function as well; gallbladder bile composition is modified by means of active fluid and electrolyte secretion by the gallbladder epithelium.  The gallbladder epithelium also secretes proteins and mucous glycoproteins. Arachidonic acid metabolites produced locally in the gallbladder have been found to  influence several of these absorptive and secretory functions. In conclusion, through its diverse functions of absorption and secretion, the gallbladder mucosa  dramatically influences the composition of bile, and, in its turn, the composition of bile can affect gallbladder mucosal function. Alterations in these functions will,  therefore, play an important role in the pathogenesis of biliary disease. References 1. Diamond JM. Transport Mechanisms in the Gallbladder. In: Hoffman JF, ed. Handbook of Physiology: Alimentary Canal. Washington DC: American Physiological  Society, 1968, pp 2451–2482. 2. Longnecker DS, Terhune PG. Carcinogenesis and pathology of carcinomas in the pancreas: comparison with the biliary tract. In: Sirici AE, Longnecker DS, eds.  Biliary and Pancreatic Ductal Epithelia: Pathobiology and Pathophysiology. New York: Marcel Dekker, 1996, pp 527–567. 3. Hopwood D, Ross PE. Biochemical and morphological correlations in human gallbladder with reference to membrane permeability. Microsc Res Tech 1997;  38:631–642. 4. Nakanuma Y, Katayanagi K, Kawamura Y, Yoshida K. Monolayer and three­dimensional culture and living tissue culture of gallbladder epithelium. Microsc Res  Tech 1997; 39:71–84. 5. Oda D, Lee SP, Hayashi A. Long term culture and partial characterization of dog gallbladder epithelial cells. Lab Invest 1991; 64:682–689. 6. Peters RH, French PJ, van Doorninck JH, Lamblin G. CFTR expression and mucin secretion in cultured mouse gallbladder epithelial cells. Am J Physiol 1996;  271:G1074–1083.

  

Page 36

7. Peters RH, van Doorninck JH, French PJ, Ratcliff R, Evans MJ, Colledge WH, Bijman J, Scholte BJ. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator  mediates the cyclic adenosine monophosphate­induced fluid secretion but not the inhibition of resorption in mouse gallbladder epithelium. Hepatology 1997; 25:270– 277. 8. Kuver R, Savard C, Nguyen TD, Osborne WRA, Lee SP. Isolation and long­term culture of gallbladder epithelial cells from wild­type and CF mice. In Vitro Cell  Dev Biol 1997; 33:104–109. 9. Plevris JN, Walker SW, Harrison DJ, Dhariwal A, Hayes PC, Bouchier IAD. Primary culture of bovine gallbladder epithelial cells. Gut 1993; 34:1612–1615. 10. Hoerl BJ, Vroman BT, Kasperbauer JL, LaRusso NF, Scott RE. Biological characteristics of primary cultures of human gallbladder epithelial cells. Lab Invest  1992; 66:243–250. 11. Housset C, Carayon A, Housset B, Legendre C, Hannoun L, Poupon R. Endothelin­1 secretion by human gallbladder epithelial cells in primary culture. Lab  Invest 1993; 69:750–755. 12. Auth MKH, Keitzer RA, Scholaz M, Blaheta RA, Hottenrot EC, Hermann G, Encke A, Markus BH. Establishment and immunological characterization of human  gallbladder epithelial cells. Hepatology 1993; 18:546–555. 13. Oda D, Eng L, Savard CE, Newcomer M, Haigh WG, Lee SP. Organotypic culture of human gallbladder epithelium. Exp Mol Pathol 1995; 63:16–22. 14. Reuss L, Stoddard JS. Role of H+ and HCO3­ in salt transport in gallbladder epithelium. Annu Rev Physiol 1987; 49:35–49. 15. Scoazec J­Y, Bringuier A­F, Medina JF, Martinez­Anso E, Veissiere D, Feldmann G, Housset C. The plasma membrane polarity of human biliary epithelial cells:  in situ immunohistochemical analysis and functional implications. J Hepatol 1997; 26:543–553. 16. Abedin ZR, Morgenstern KE, Roslyn JJ, Moser AJ, Abedin MZ. Chloride channel CLC3 is expressed by gallbladder epithelium: a potential regulator of Cl­  secretion (abstr). Gastroenterology 1998; 114:A514. 17. Gleeson D, Hood KA, Murphy GM, Dowling RH. Calcium and carbonate ion concentrations in gallbladder and hepatic bile. Gastroenterology 1992; 102:1701– 1716. 18. Plevris JN, Hayes PC, Harrison DJ, Bouchier IAD. Evidence of hydrogen ion secretion from human gallbladder in vitro. Gut 1992; 33:554–559. 19. Colombani V, Silviani V, Marteau C, Lerique B, Cartouzou G, Gerolami A. Presence of the NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger in human gallbladder. Clin  Sci Colch 1996; 91:209–212. 20. Silviani V, Gastaldi M, Planells R, Marteau C, Massacrier A, Cohen P, Cau P, Gerolami A. NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger in human gallbladder.  Localization of specific mRNA by in situ hybridization. J Hepatol 1997; 26:1281–1286. 21. Petersen KU, Wehner F, Winterhager JM. Na+/H+ exchange at the apical membrane of guinea pig gallbladder epithelium: properties and inhibition by cyclic  AMP. Pflugers Arch 1985; 4051:S115–S120. 22. Reuss L. Ion transport across gallbladder epithelium. Physiol Rev 1989; 69:503–545. 23. Reuss L, Segal Y, Altenberg G. Regulation of ion transport across gallbladder epithelium. Annu Rev Physiol 1991; 53:361–373. 24. Reuss L. Salt and water transport by gallbladder epithelium. In: Handbook of Physiology: The Gastrointestinal System. Bethesda, MD: American Physiological  Society, 1991, pp. 303–322. 25. Dray­Charier N, Paul A, Veissiere D, Mergey M, Scoazec J­Y, Capeau J, Brahimi­Horn C, Housset C. Expression of cystic fibrosis transmembrane  conductance regulator in human gallbladder epithelial cells. Lab Invest 1995; 73:828–836. 26. Greger R, Mall M, Bleich M, Ecke D, Warth R, Riedemann N, Kunzelmann K. Regulation of epithelial ion channels by the cystic fibrosis transmembrane  conductance regulator. J Mol Med 1996; 74:527–534.

  

Page 37

27. Svanvik J. Role of gallbladder in modifying hepatic bile composition. In: Tavoloni N, Berk PD, eds. Hepatic Transport and Bile Secretion: Physiology and  Pathophysiology. New York: Raven Press, 1993, pp 607–618. 28. Scheeres DE, Magnuson TH, Pitt HA, Bastidas JA, May CA, Lillemoe KD. The effect of calcium on gallbladder absorption. J Surg Res 1990; 48:547–551. 29. Roslyn JJ, Abedin MZ, Saunders KD, Cates JA, Strichartz SD, Alperin M, Fromm, M, Palant CE. Uncoupled basal sodium absorption and chloride secretion in  prairie dog (Cynomys ludovicianus) gallbladder. Comp Biochem Physiol 1991; 100A:335–341. 30. Cates JA, Saunders KD, Abedin MZ, Roslyn JJ. Intracellular calcium modulates gallbladder ion transport. J Surg Res 1991; 50:545–551. 31. Giurgiu DI, Karam JA, Madan AK, Roslyn JJ, Abedin MZ. Apical and basolateral Ca2+ channels modulate cytosolic Ca2+ in gallbladder epithelia. J Surg Res  1996; 63:179–184. 32. Moser AJ, Abedin MZ, Abedin ZR, Roslyn JJ. Ca2+ calmodulin regulates basal gallbladder absorption. Surgery 1993; 114:300–307. 33. Moser AJ, Abedin MZ, Cates JA, Giurgiu DI, Karam JA, Roslyn JJ. Converting gallbladder absorption to secretion: the role of intracellular calcium. Surgery  1996; 119:410–416. 34. Cates JA, Abedin MZ, Saunders­Kirkwood KD, Moser AJ, Giurgiu DI, Roslyn JJ. Protein kinase C regulates prairie dog gallbladder ion transport. Surgery  1995; 117:206–212. 35. Giurgiu DI, Saunders­Kirkwood KD, Roslyn JJ, Abedin MZ. Sequential changes in biliary lipids and gallbladder ion transport during gallstone formation. Ann  Surg 1997; 225:382–390. 36. Igimi H, Yamamoto F, Lee SP. Gallbladder mucosal function: studies in absorption and secretion in humans and in dog gallbladder epithelium. Am J Physiol.  1992; 263:G69–G74. 37. Sweeting JG. Does the gallbladder secrete? Gastroenterology 1993; 104:329–330. 38. Glickerman DJ, Kim MH, Malik R, Lee SP. The gallbladder also secretes. Dig Dis Sci 1997; 42:489–491. 39. Neiderhiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res 1976; 17:117–124. 40. Ross PE, Azman M, Hopwood D, Shepherd AN, Ransay A, Bouchier IAD. Lipid absorption by human gallbladder. Ann NY Acad Sci 1986; 463:344–346. 41. Ross PE, Butt AN, Gallacher C. Cholesterol absorption by the gallbladder. J Clin Pathol 1990; 43:572–575. 42. Hayashi A, Lee SP. Bi­directional transport of cholesterol between gallbladder epithelial cells and model bile. Am J Physiol 1996; 271:G410–414. 43. Gianni­Corradini S, Yamashita G, Nuutinen H, Chernosky A, Williams C, Hays L, Shiffman ML, Walsh RM, Svanvik J, Della­Guardia P, Capocaccia L,  Holzbach RT. Human gallbladder mucosal function: effects on intraluminal fluid and lipid composition in health and disease. Dig Dis Sci 1998; 43:335–343. 44. Rose RC. Absorptive Functions of the Gallbladder. In: Johnson LR, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract, 2nd ed. New York: Raven Press, 1987, pp  1455–1468. 45. Klinkspoor JH, Tytgat GNJ, Groen AK. Gallbladder mucin and cholesterol gallstones. Eur J Gastroenterol Hepatol 1993; 5:226–234. 46. Kuver R, Savard CE, Oda D, Lee SP. Prostaglandin E generates intracellular cAMP and accelerates mucin secretion by cultured dog gallbladder epithelial cells.  Am J Physiol 1994; 267:G998–G1003. 47. Dray­Charier N, Paul A, Combettes L, Bouin M, Mergey M, Balladur P, Capeau J, Housset C. Regulation of mucin secretion in human gallbladder epithelial  cells: predominant role of calcium and protein kinase C. Gastroenterology 1997; 112:978–990. 48. Kuver R, Ramesh N, Lau S, Savard CE, Lee SP, Osborne WRA. Constitutive mucin secretion linked to CFTR expression. Biochem Biophys Res Comm. 1994;  203:1457–1462.

  

Page 38

49. Klinkspoor JH, Kuver R, Savard CE, Oda D, Azzouz H, Tytgat GNJ, Groen AK, Lee SP. Model bile and bile salts accelerate mucin secretion by cultured dog  gallbladder epithelial cells. Gastroenterology 1995; 109:264–274. 50. Campion J­P, Porchet N, Aubert J­P, L'Helgoualc'h A, Clement B. UW­preservation of cultured human gallbladder epithelial cells: phenotypic alterations and  differential mucin gene expression in the presence of bile. Hepatology 1995; 21:223–231. 51. Vandenhoute B, Buisine M­P, Debailleul V, Clement B, Moniaux N, Dieu M­C, Degand P, Porchet P, Aubert J­P. Mucin gene expression in biliary epithelial  cells. J Hepatol 1997; 27:1057–1066. 52. Toth JL, Harvey PRC, Upadyha GA, Strasberg SM. Albumin absorption and protein secretion by the gallbladder in man and in the pig. Hepatology 1990;  12:729–737. 53. LaRusso NF. Proteins in the bile: how they get there and what they do. Am J Physiol 1984; 247:G199–G205. 54. Vuitton DA, Seilles E, Cause P. Gallbladder: the predominant source of bile IgA in man? Clin Exp Immunol 1985; 62:185–192. 55. Kaminski DL. Arachidonic acid metabolites in hepatobiliary physiology and disease. Gastroenterology 1989; 97:781–792. 56. Kaminski DL, Desphande YG, Westfall S, Herbold D. Evaluation of prostacyclin production by human gallbladder. Arch Surg 1989; 124:277–280. 57. Sterling RK, Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore EW. Effect of NSAIDs on gallbladder bile composition. Dig Dis Sci 1995; 40:2220–2226. 58. Savard CE, Blinman TA, Pandol SJ, Lee SP. Lipopolysaccharide stimulates cytokine production by mouse gallbladder epithelial cells (abstr). Gastroenterology  1998; 114:A1077. 59. Choi JW, Savard CE, Lee SP. Organotypic cultured dog gallbladder epithelial cells express inducible nitric oxide synthase (iNOS) like activity (abstr).  Gastroenterology 1996; 110:A1169. 60. Keavany AP, Offner GD, Afdhal NH. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is the principal isoform expressed in human gallbladder (abstr). Gastroenterology  1998; 114:A526.

  

Page 39

3—  Gallbladder Smooth Muscle Function and Its Dysfunction in Cholesterol Gallstone Disease Piero Portincasa University Medical School, Bari, Italy Gerard P. vanBerge­Henegouwen  University Hospital Utrecht, Utrecht, The Netherlands I—  Introduction At variance with other smooth muscle cells of the gastrointestinal tract, gallbladder musculature belongs to an organ in which a highly concentrated secretion, the bile is  collected. During cholesterol gallstone disease, cholesterol and cytotoxic bile salts can considerably increase in bile. Such potentially myotoxic substances are able to  interact with muscularis plasma membranes and to induce functional changes. An understanding of the mechanisms of gallbladder smooth muscle contractility in health  and disease is therefore of paramount importance to elucidate the steps leading to abnormal gallbladder motility in patients with cholesterol gallstones. The aim of this chapter is therefore to focus on the basic mechanisms of normal gallbladder contractility at a cellular level—its regulation and its inhibition. The cellular  abnormalities of smooth muscle cell function that occur during gallstone formation are discussed. II—  General Features of the Smooth Muscle Smooth muscle differs from skeletal muscle both structurally and functionally. The term smooth muscle cell indicates that the cell lacks the cross­striation pattern  typical for both cardiac and skeletal muscle cells (1). Rather, a main feature of the smooth cell is the presence of intracellular sarcomere­like, diagonally arranged units  of actin (thin filaments) and myosin (thick filaments). Smooth muscle cells are rather short in size (60 to 100  m in length by 3 to 10  m in width); compared to  skeletal muscle, smooth muscle contains less myosin, much more actin and little if any troponin. Actin, in particular, is the key constituent of thin filaments, whereas  myosin constitutes the thick filaments (2). The arrangement of contractile units of smooth muscle cells is shown schematically in Fig. 1 (2–4). An important feature of  smooth muscle cells is their extremely slow contraction. Still, smooth musculature can maintain the tone for prolonged periods with little energy expenditure, which, in  fact, is 10­2 to 10­3 of that of striated muscle cells. This is mainly caused by a low ATPase activity of myosin molecules,

  

Page 40

Figure 1 A. Diagonal arrangement of contractile units of actin and myosin filaments of the gallbladder smooth muscle cell. B. Contractile unit set at its maximal length. C. Sliding of actin and myosin filaments, which causes shortening of the cell and increase in contractile force. (Modified from Ref. 2.)

while tension is maintained or gives way to a very slow relaxation (so called latch) (2). However, the force developed by smooth musculature (expressed as force per  cm2 of fiber cross section) is comparable to that developed by skeletal musculature. The tension built up by smooth muscle cells is a function of the muscle length  before stimulation. The velocity of isotonic shortening is dependent on the load that the muscle has to move. Contractility is dependent on these two parameters (5). Functional coupling of smooth muscle cells is accomplished by conjunctions of the membranes in the form of gap junctions or nexuses, which are areas of low  resistance for the spread of excitation from one cell to another. Nerve axons enter the muscle bundles and release neurotransmitters from swellings along their length.  As these swellings are at some distance from single muscle cells, neurotransmitters probably act on only a few of these cells and their influence is transmitted from one  cell to the next. III—  Physiological Mechanisms of Gallbladder Smooth Muscle Contraction and Relaxation Several methods are employed to study gallbladder smooth muscle function in relation to contractility, as shown in Table 1. They span from receptor binding studies  using radioactive agonists, which act on plasma membranes or histological sections, to light microscopy or tensiometry, which investigate the contraction of isolated  muscle cells or muscle strips/whole gallbladder, respectively. Different agonists initiate contraction by interacting at the level of specific receptors in the plasma  membrane. A general overview of pathways that mediate agonist­induced contraction and relaxation and are discussed in detail are shown in Table 2.

  

Page 41 Table 1 Principal Methods to Study Gallbladder Smooth Muscle Cell Function in Vitro in Relation to Contractility Method

Tissue

Main information

Species

References

Radioimmunoassay

Plasma  membranes

Receptor binding

Animals, humans

18, 31–33

Autoradiography

Histological  section

Receptor binding

Animals, humans

34

Light microscopy

Isolated cells

Contractility (shortening)

Animals, humans

39, 43, 147, 193

Tensiometry

Strips

Spontaneous phasic  activity

Animals, humans

11, 34, 36, 53, 145,  152, 179, 194

 

 

Contractility and relaxation  (agonists, antagonists and  electric transmural field  stimulation)

 

 

 

Whole  gallbladder

Contractility

Animals

78, 195

Figures 2 and 3 schematically show the technique used for tensiometric studies of gallbladder smooth muscle cell strips in vitro and some representative results  obtained with two agonists. In general, gallbladder motility is under the neurohormonal control. The ultimate target organ is the smooth muscle cell of the gallbladder wall. The vagal nerve has a  stimulatory effect through release of acethylcholine (ACh), acting on muscarinic receptors. The sympathetic nervous system has an inhibitory effect through adrenaline  and noradrenaline on the  2­adrenergic receptor. In the postprandial period, gallbladder contraction is primarily mediated by the gastrointestinal hormone CCK (6), as  also shown by a number of studies using specific CCK­receptor antagonists (6–9). Figures 4 and 5 provide some insights into the pathways of smooth muscle  contraction and relaxation at the receptor and plasma membrane level and at the intracellular level. Table 2 reports the most important substances that have been  shown to induce gallbladder smooth muscle contraction and relaxation. The role of these substances is discussed in the following paragraphs. A—  Contraction The gallbladder smooth muscle exhibits a so­called myogenic tone (2) i.e., phasic spontaneous contractions followed by relaxation. This type of activity is best  documented in vitro when gallbladder strips are suspended in the organ bath. The contraction often lasts for seconds and can be maintained even after denervation and  even after pharmacological blockage of ganglion cells at the intramural level. At least two different patterns of spontaneous phasic contractions have been described in  vitro when smooth muscle strips are suspended in the organ bath: low­amplitude, high­frequency contractions (about 1.2 to 4.0 contractions per minute), and a high­ amplitude, low­frequency pattern (0.3 to 0.7 contractions per minute) (10–12). Spontaneous contractility can be detected in up to 90% of viable tissues from both  normal specimens as well as strips from gallstone­containing gallbladders. Gallbladder smooth muscle cells are grouped into branching bundles that are surrounded by connective tissue. In the gallbladder, the tunica muscularis is thick and  invested with an interlocked array of longitudinal and spiral smooth muscle fibers. Apparently, no difference in contractility is seen between longitudinal, circular, and  oblique axes strips (12). However, the sensitivity to both hormonal and neural stimulation increases from proximal (fundus) to distal (cystic duct) gallbladder  musculature, as seen in strips (12) and in isolated muscle cells (13).

  

Page 42 Table 2 Substances Influencing Gallbladder Contractility in Vitro Effect

Receptor(s)

Mechanism/notes

Contraction Cholecystokinin

CCKA > CCKB

Hormone, intestinal release

Cerulein

 

Drug (cholecystokinin­analogue)

Acetylcholine

Muscarinic M3 >> M1

Vagus

GRP, Substance K,  Substance P, ET­1, BRP,  PACAP

GRP, NK2, SP, ET­1, NMB,  NANC neuroendocrine and  paracrine transmission PACAP­1

Histamine, bradykinin,  prostaglandins, LTC4, 

H1, B2(B1), LTD4

From inflammatory cells

Motilin

Motilide receptors (?)

Hormone, intestinal release

Erythromycin, other  ''motilides"

 

Drugs/motilin analogues

Cisapride

Pro­cholinergic

Drug

Potassium chloride

Influx of extracellular Ca2+ Membrane depolarizing agent

LTD4

Relaxation Acetylcholine

Muscarinic M2

Vagus

Adrenaline,  Noradrenaline

b­adrenergic

Sympathetic nervous system

CGRP, PACAP, VIP, NT,  PHI, ST

CGRP, PACAP­2, VIP2,  NT, PHI

NANC neuroendocrine and  paracrine transmission

Histamine

H2

Inflammatory cells

NSAIDs

Inhibition of  prostaglandin synthesis

Drugs

Nitric oxide

Intracellular effect

NANC nerves

Bile salts

CCK receptor +  cholinergic nerves

Drugs, bile solutes

Key: BRP, bombesin­related peptides; B, bradykinin; CGRP, calcitonin­gene related peptide; ET­ 1, endothelin­1; GRP, gastrin­releasing peptide; H, histamine; LTD4, leukotrien D4 receptor; LT,  leukotriens; NMB, NMB­preferring receptor; NT, neurotensin; PACAP, pituitary adenylate  cyclase­activating peptide; PHI, peptide histidine isoleucine; VIP, vasoactive intestinal peptide.

These findings indicate that a proximal­to­distal biliary gradient exists which is an intrinsic property of smooth muscle cells; it is likely that this gradient acts to facilitate  gallbladder emptying in vivo. The complex mechanism of smooth muscle cell excitation­contraction coupling results from the initiation of signal transduction at the level of the plasma membrane and  activation of the contractile machinery at the intracellular level. The increase of cytosolic Ca2+ plays a key role in the contraction of smooth muscle cells; it depends on  influx of extracellular Ca2+ and/or release from intracellular Ca2+ stores (sarcoplasmatic reticulum). The final pathway is the activation of contractile proteins, actin, and myosin by phosphorylation of myosin light chain, independent of the source of the Ca2+ influx (14).  Ca2+ flux is regulated by both voltage­dependent Ca2+ channels (L­type and N­type Ca2+ channels) and receptor­operated Ca2+ channels. L­type channels are  predominant type in smooth muscle cells, whereas N­type channels are mainly found in intramural neurons. Both are activated by high

  

Page 43

Figure 2 Schematic representation of tensiometric studies of gallbladder smooth muscle strips in vitro. Strips are placed in the organ bath containing the plasma replacing solution. The force produced by contraction or the relaxation of strips in the presence agonist alone or with antagonists or in response to transmural electric field stimulation is measured using a transducer linked to a recording system. The dot (•) in the graph indicates the addition of single or cumulative concentrations of agonists in the bath; the symbol "W" indicates the washing time of the strip by fresh plasma­replacing solution.

membrane potentials. By contrast, receptor­operated Ca2+ channels are triggered by receptor binding by agonists rather than by membrane potential. In humans, intrinsic vagal nerve endings release ACh after inflow of Ca2+ through both L­ and N­type Ca2+ channels in the nerves (15). CCK induces a potent contraction of smooth muscle strips in vitro. CCK exerts its contractile effects mainly through interaction directly with receptors on gallbladder  muscle cells activating receptor­operated Ca2+ channels. Also, CCK can interact with cholinergic nerves (16) and can enhance ongoing nicotinic ganglionic  transmission by release of acetylcholine occurring in the serosal layer. It has been shown that gallbladder CCK receptors present in the human and cow are both N­ linked complex glycoproteins, with different carbohydrate domains and similar protein cores (17). Computer analysis of equilibrium­binding data in the musculature  suggest the presence of a single class of binding sites, which are similar in health and disease, with no apparent differences related to age, gender, or body habitus. The  molecular weight of human gallbladder muscularis CCK receptor is 85,000 to 95,000 (18). However, the effect of CCK is not only direct on smooth muscle but also  involves cholinergic pathways (6,19,20). ACh and the hormone CCK also induce contraction by both intracellular Ca2+ release and influx of extracellular Ca2+ through  voltage­dependent L­type Ca2+ channels. The Ca2+­channel antagonist verapamil can block this channel, whereas Bay­K8644, and L­type channel dihydropyridine  agonist, potentiates the action of this channel (21). Influx of extracellular Ca2+ and contraction is observed with the depolarizing agent potassium chloride, which acts on voltage­operated, receptor­dependent Ca2+  channels (22–24). At variance with the ACh­induced contraction, the CCK­induced contraction seems more de­

  

Page 44

Figure 3 Construction of agonist concentration­response curves as result of tensiometric  studies of gallbladder strips. A representative experiment obtained from one gallbladder of a patient with cholesterol gallstones is shown. In this case force is normalized to 100% maximal response obtained with each agonist. EC50 = concentration of agonist leading to 50% maximal observed response.  A. ACh (single concentrations are added to the bath ranging from 10­10 M  to 10­4 M. B. CCK­OP (cumulative concentrations are added to the bath ranging  from 10­11 M to 10­6 M).

pendent on intracellular Ca2+ (22,25). Experiments with histamine and strontium, which inhibit intracellular Ca2+ release from the sarcoplasmatic reticulum, support this  hypothesis (21,26,27). Other studies in humans given nifedipine, a dihydropyridine compound which inhibits Ca2+ influx through voltage­dependent Ca2+ channels  (28), suggest that, at least in part, stimulation with CCK is followed by influx of extracellular Ca2+ (29,30). Furthermore, the utilization of intracellular and extracellular  Ca2+ appears to be dose­dependent, since, in the guinea pig, high concentrations of CCK use more intracellular Ca2+ for contraction than low CCK concentrations do  (22). The whole process of smooth muscle cell activation takes place at the level of the plasma membrane, which therefore plays a pivotal role in the overall mechanism  leading to contraction or relaxation. We were the first to isolate smooth muscle cell plasma membranes from human gallbladder homogenates (31,32); these  preparations showed a reversible and saturable binding for radioactive CCK. Others have extended this work (17,18,33,34) and shown that CCK binding involves  two types of receptors, the CCKA­ and CCKB­receptors, which seem to have appeared early in the course of evolution (35). Alteration of the CCKA receptor, in  particular, is associated with abnormal contractility, which is a known risk factor for cholesterol gallstones (36). Transmural electric field stimulation of gallbladder strips induces frequency­dependent contractile responses through stimulation of the cholinergic nerves. A stimulus of  15 V, 1 ms for 10 s, range of 1 to 20 Hz, causes a prompt and sustained increase in tension, which is over as soon as the stimulation is discontinued (24). The  mechanism involves Ca2+ influx into nerve terminals and ACh release from nerve endings (37,38). While ACh is released from intrinsic postganglionic cholinergic  nerves, the contraction is regulated by L­ and N­type Ca2+ channels (15), which can be blocked by nifedipine and  ­conotoxin, respectively. The addition of potent  neural blockers such as tetrodotoxin or the cholinergic antagonist atropine abolishes the re­

  

Page 45

Figure 4 Schematic representation of pathways involved in gallbladder smooth muscle cell contraction and relaxation before activation of the intracellular machinery (for this, see Fig. 5). Key: (+), stimulation (contraction); (­), relaxation or inhibition of  contraction; , increase;  , decrease; ACh, acetylcholine; A, adrenaline; cAMP,  cyclic adenosine­mono­phosphate; cGMP, cyclic­guanosine­mono­phosphate;  CCK, cholecystokinin; DAG, Diacylglycerol; G, G protein; IP3,  inositol­1,4,5­tris­phosphate; M, muscarinic receptor, NANC,  non­adrenergic­non­cholinergic; NO, nitric oxide; NA, noradrenaline; PIP2,  phosphatidyl­inositol­4,5­bisphosphate; SR, sarcoplasmatic reticulum;  rocc, receptor­operated Ca2+ channels; vdcc, voltage­dependent Ca2+ channels.

sponses to electric field stimulation, proving that this type of contraction is indeed neurally mediated (10). The events associated with smooth muscle contraction at the intracellular level are also complex and are summarized in Fig. 5. The signal­transduction pathway  involves agonist binding to and activation of receptors linked to a class of membrane proteins, G protein (i.e., guanine nucleotide­binding protein). This step is followed  by intracellular hydrolysis of PIP2, (phosphatidyl­inositol­4,5­bisphosphate) into IP3, (inositol­1,4,5­tris­phosphate) and DAG (diacylglycerol) (39). These two  phosphoinositide metabolites have fundamental functions as intracellular messenger (2,3,39–41). IP3 initiates the release of Ca2+ from the sarcoplasmatic reticulum with  the formation of Ca2+­calmodulin complex. DAG activates the lipid­dependent protein kinase C (PKC); this step is followed by phosphorylation of some intracellular  proteins, increased sensitivity of actomyosin to intracellular Ca2+, and activation of L­type voltage­dependent Ca2+ channels (42). The concentration of CCK at the level of plasma membrane receptor seems to modulate the intracellular pathway differently. At least in humans, the IP3 pathway is  activated by high concentrations CCK, whereas low concentrations preferentially activate the PKC pathway (39). In the first case, in fact, the effect of IP3 on  calmodulin is strongly inhibited by the calmodulin antagonist CGS9343B but not by two PKC inhibitors, H­7 and chelerythrine (43).

  

Page 46

Figure 5 Schematic representation of intracellular pathway leading to contraction of the gallbladder smooth muscle. The key step is the phosphorylation of myosin. Key: aMLCK, active­myosin light chain kinase; ATP, adenosine­tri­phosphate; CAM,  calmodulin; DAG, diacylglycerol; iMLCK, inactive­myosin light chain kinase;  IP3, inositol­1,4,5­tris­phosphate; PIP2, phosphatidyl­inositol­4,5­bisphosphate;  PKC, protein kinase C; SR, sarcoplasmatic reticulum.

The human gallbladder contains both estrogen and progesterone receptors (44). Pregnancy strongly inhibits gallbladder contractility at the level of the G­protein  activation. CCK receptor binding, linked to Gi 3, is inhibited in pregnant guinea pigs, and this is most probably due to the action of progesterone. Oral contraceptives  that contain progestagens, however, do not seem to influence gallbladder motility (45). Studies in guinea pigs and in humans showed that the M3, (muscarinic) receptor  is the receptor involved in cholinergic neurotransmission of gallbladder directly on smooth muscle cell (46,47). In humans, however, the M1 muscarinic receptor plays a  prejunctional facilitatory role in muscle cell­receptor mediated contractility (47,48). Apart from the physiological mediators of gallbladder contractility, CCK and ACh,  a number of other hormones and substances have shown to exert contractile properties, at least in vitro. Their ultimate role in vivo, however, remains to be fully  elucidated both in health and disease. Gastrin­releasing peptide caused some contraction in guinea pig gallbladder, which was unaffected by the muscarinic blockers atropine or the CCKA receptor  antagonist loxiglumide (49). Substance K causes contraction through binding to the type 2 neurokinin receptor (NK2), which activates the PKC­dependent  intracellular pathway (50). Substance P (51) and endothelin­1 (52) both induce guinea pig gallbladder contraction. Bombesin­related peptides have a contractile effect  on guinea pig gallbladder through a GRP­ and a NMB­preferring receptor (53). The NANC­group neurotransmitter pituitary­adenylate­cyclase­activating­peptide  (PACAP) causes contraction through the PACAP­1 receptor by adenylate cyclase and phospholipase C as intracellular messengers (54). Peptide YY, which is  structurally related to pancreatic polypeptide, on the other hand, has not been shown to have any contractile effect in vitro or in vivo (55). Histamine has a stimulating effect on gallbladder contraction through the H1 receptor. The sensitivity of this receptor, however, declines with the severity of the  inflammation in the

  

Page 47

gallbladder (56). Prostaglandins have a direct contractile effect on gallbladder smooth muscle cell in vitro (57). Das et al. showed, however, that aspirin (which inhibits  the formation of prostaglandins) can correct the impaired gallbladder motility (58). The bradykinin B2 receptor and possibly also the bradykinin B1 receptor, stimulated  by bradykinin agonists, cause contraction in guinea pig gallbladder mediated through a cyclooxygenase pathway. This action is inhibited by indomethacin (59). This  contraction is fully dependent on extracellular Ca2+ influx; however, it is not related to PKC­dependet pathways (60). Instead, contraction caused by bradykinin  activates the intracellular phospholipase C pathway. Both C4 and D4 leukotriene cause contraction of guinea pig smooth muscle of the gallbladder through the LTD4  receptor. The intracellular increase of Ca2+ is fully dependent on intracellular Ca2+ stores (61). Motilin, a 22­amino acid peptide which is released from enterochromaffin cells of duodenum and upper jejunum, plays a key role in the regulation of the interdigestive  motility of the small intestine (62,63). There is a relation between plasma motilin, gallbladder emptying, and the migrating motor complex because gallbladder volume  decreases up to 30% when plasma motilin peaks in the fasting subject (64) and up to 18% after exogenous motilin infusion (65). Interestingly, the macrolide  erythromycin behaves as a motilin receptor agonist and stimulates gallbladder motility in vivo possibly through a cholinergic pathway (66–75). In a preliminary study,  motilin also showed a direct effect on human gallbladder strips in vitro (76), as did erythromycin (77). Cisapride, a prokinetic agent with procholinergic properties, has been shown to stimulate smooth muscle cells in both in vivo and in vitro studies (78–80). B—  Relaxation The essential step in smooth muscle relaxation is the lowering of the intracellular Ca2+ concentration by activation of specific Ca2+ pumps located in the cell membrane  and in the sarcoplasmatic reticulum (81). Whereas Ca2+ is sequestered into the sarcoplasmic reticulum by an ATP­driven Ca2+ pump, Ca2+ extrusion out of the cell is  achieved by Na+/Ca2+ exchange or by an ATP­dependent pump (82). These events are shown in Fig. 4. Cyclic nucleotides play an important role in smooth muscle  cell relaxation. Adrenergic inhibition of gallbladder smooth muscle cells is mediated by cAMP, which, in turn, activates a cAMP­dependent protein kinase (PKA).  This intracellular messenger has several effects that cause relaxation (2). Kline et al. showed that cAMP can relax previously contracted gallbladder in the bullfrog  (83). Earlier studies showed that both NO and cAMP relax vascular smooth muscle through a protein kinase related to K+ channels (84). cGMP acts as a second  messenger activating cGMP­dependent protein kinase (PKG), which has a similar role as PKA, inhibiting the actions of intracellular Ca2+ and stimulating reuptake of  Ca2+ (85). The inhibition of biliary flow seems to be mediated by activation of cholinergic interneurons or effector neurons (86). Maintenance of the inhibitory basal  tone in the prairie dog gallbladder is mainly mediated by inducible nitric oxide synthase (iNOS) (87). L­arginine, a NO­donor, can provoke a very significant increase  in gallbladder fasting and residual volumes and impairs gallbladder emptying (68,88). Whereas adrenergic inhibition of contractility cannot be induced by dopamine (89), several other adrenergic substances, like adrenaline and noradrenaline, induce  relaxation of the gallbladder through  ­adrenergic receptors (2,90). There are a number of NANC neurotransmitters, which have been shown to inhibit contraction in both animal and human studies. NANC relaxation implies a NO­ dependent pathway (10,91). Transmural electric field stimulation can also be used to induce relaxation of gallbladder muscle strips; this effect is NANC­modulated  and independent of other inhibitory pathways (10). This finding confirms that an important neurally mediated relaxation pathway operates in physiological state in the  gallbladder (92). On the other hand, one should take into account that gallbladder motility in cholesterol gallstone patients is modulated by NO and is negatively  influenced by a higher degree of scarification (93) due to chronic inflammation.

  

Page 48

Relaxation is achieved in the presence of calcitonin gene­related peptide, which increases cAMP (94). The previously mentioned NANC hormone PACAP can also  induce relaxation together with vasoactive intestinal peptide (VIP) through the VIP2/PACAP­2 receptor (95). Previous investigators showed that VIP has a relaxing  effect on CCK­induced contractions of Oncorhychus mykiss gallbladder, possibly related to adrenergic receptors (96). Neurotensin is another NANC substance  that seems to have a negative effect on gallbladder contractility in humans (97), whereas it has a contractile effect in guinea pig gallbladder (97). Peptide histidine  isoleucine has a relaxing effect on guinea pig smooth muscle cells (98). Although somatostatin and the synthetic analogue octreotide have an inhibitory effect on  gallbladder contraction in vivo (99), these molecules have not been shown to have a direct effect on gallbladder smooth muscle cell in vitro (100). Histamine has a relaxing effect through the H2 receptor, whereas it stimulates contraction through H1 (101). The NSAID indomethacin has been shown to give a  decrease in either tone or contractility by inhibiting prostaglandin synthesis both in vitro (102,103). However this is still controversial, since in clinical studies a  prokinetic effect of indomethacin has been reported by some (104) but not others (105). IV—  Mechanisms of Impaired Smooth Muscle Contractility and Relaxation The primum movens in cholesterol gallstone disease is excess cholesterol in bile due to hepatic hypersecretion (106,107). In predisposed individuals, bile chronically  supersaturated with cholesterol leads to precipitation (108,109) and aggregation of cholesterol crystals into stone(s) as well as changes of concentration and/or quality  of other biliary solutes (107,110–112). The gallbladder actively participates in these pathological events: it is able to absorb water from the incoming hepatic bile but  also biliary lipids from the lumen such as cholesterol (113), phospholipids (114,115), and small amounts of bile salts (116). The gallbladder also has secretory ability  and the production of mucin in cholesterol gallstone disease increases (117). Other factors are secreted into bile, such as immunoglobulins (mainly of the IgG class) by  inflammatory cells in the wall and aminopeptidase N by the gallbladder (118–120). Some of these events can influence one or several pathways of smooth muscle  function, and this can ultimately lead to impaired gallbladder motility (121). The importance of these factors in relation to smooth muscle function is discussed in the  following paragraphs. A—  Excess Cholesterol in Bile The gallbladder smooth muscle is a primary target of excess biliary cholesterol, which appears to have myotoxic properties. Although there is no significant difference  in basal cell length between muscle cells associated with cholesterol stones and muscle cells associated with "control" pigment stones (43), several functional defects of  the smooth muscle appear early during cholesterol gallstone disease. In the animal model of cholesterol cholelithiasis (ground squirrel and prairie dog), increased biliary  cholesterol saturation and appearance of cholesterol crystals and stones are associated with impaired gallbladder smooth muscle contractility to CCK both in vivo and  in vitro (122–124). In cholesterol gallstone patients, gallbladder muscle strips have weaker contractility in response to CCK than "control" strips from pigment stone  patients who do not have bile supersaturated with cholesterol (11,25,26,125,126). This is also the case when contractility is measured at microscopy in smooth  muscle cells isolated from gallbladders of animals fed a lithogenic diet or from cholesterol gallstone patients (43). By comparing gallbladders from gallstone patients  with "normal" gallbladders from organ­transplant donors, we found that smooth muscle contracts less even if the thickness of the muscle layer increases, as shown by  quantitative morphometry after cholecystectomy (127). In another study, gallbladder

  

Page 49

motility was first assessed by functional ultrasonography. After cholecystectomy we found that the gallbladder muscle layer was significantly thicker in patients with  defective gallbladder motility than in patients with preserved motility (1073 ± 76  m vs. 745 ± 75  m, respectively) (11). Since stone characteristics and inflammation  were comparable between the two groups, we speculated that a form of "hypertrophic leiomyopathy" occurs in response to one or more chronic insults in the  gallbladder, such as hypercholesterobilia, excess of toxic bile salts (see below), and/or mechanical injury (e.g., the presence of large stones). It must be emphasized  that proliferative changes observed in gallbladder smooth cells exposed to excess cholesterol have similarities with the proliferative ability of arterial myocytes during  atherogenesis (128). Impaired smooth muscle cell function in cholesterol gallstone disease might account for an important clinical finding—i.e., enlarged fasting and  postprandial gallbladder volumes in a subgroup of cholesterol gallstone patients (11,129–133). As discussed by Weisbrodt (5), it is likely that excess cholesterol in  bile leads to inadequate strength of the smooth muscle cell at normal length, resulting in less ejected bile and greater residual gallbladder volume. After adaptation  occurs, however, the smooth muscle cell stretches to a greater length in order to develop adequate force during gallbladder contraction; this adaptation, however, will  ultimately result in a greater fasting volume. This concept is summarized in Fig. 6. The relaxation pathways of the gallbladder smooth muscle might also be impaired in cholesterol gallstone patients. Gallbladder strips and cells isolated from cholesterol  stone patients show decreased relaxation to transmural electric field stimulation or relaxing agents, compared to pigment stone patients. The motility defect is  associated with decreased cellular cAMP production. Again, the defect seems to reside at the level of plasma membranes, since substances that circumvent the  membrane and directly activate intracellular mechanisms elicit similar responses in gallbladders from cholesterol and pigment stone patients (92). Decreased relaxation  in vitro might be linked to reduced gallbladder refilling as well as a reduced ente­

Figure 6 Putative events linking the impaired smooth muscle contractility in vitro with defective gallbladder motility in vivo in cholesterol gallstone disease.

  

Page 50

rohepatic circulation observed in vivo in patients at risk for cholesterol gallstones, thereby increasing the possibility of cholesterol crystals to develop and to precipitate  (134). Several studies point to the importance of hypercholesterobilia­dependent leiomyopathy as one of the important pathogenic factors in cholesterol gallstone disease.  Increased cholesterol content of bile leads to progressive impairment of gallbladder motility as seen in healthy subjects (135), in patients with cholesterolosis (25), and  in cholesterol gallstone patients (11,129–131,136). Increased gallbladder volume has been noted in early studies in guinea pigs (103) and mice (137,138) fed high  cholesterol diet. More recently, increased fasting gallbladder volume was also found in the +/+ strain of inbred mice that are genetically prone to develop  supersaturated bile, cholesterol crystals, and gallstones (139,140). Indeed, cholesterol molecules absorbed by the gallbladder mucosa can rapidly diffuse into the  muscle layer (107,113,141). Excess cholesterol molecules are removable from smooth muscle cells by esterification and storage; alternatively, they can diffuse back  into bile (142), since the gallbladder lacks lipoproteins for cholesterol export into blood (113). In cholesterol gallstone patients, however, backdiffusion of cholesterol  is greatly inhibited by chronically supersaturated bile (143). Although cholesterol molecules can be esterified by local cholesterol­acyltransferase (ACAT) (144), other  cholesterol molecules are incorporated into smooth muscle sarcolemma (145), leading to increased ratio of cholesterol to phospholipids in the membranes (146,147).  These events can ultimately affect several cellular functions (148), including, of course, contractility. As recently underlined by Apstein and Carey (107), a key concept is that unesterified cholesterol is toxic to smooth muscle cell plasmalemma by altering the physical  state and increasing rigidity (i.e., decreasing fluidity) of membrane phospholipids (149). In an elegant study, Yu et al. (146) showed that feeding a high cholesterol diet  to prairie dogs or adding cholesterol­enriched liposomes to isolated gallbladder smooth muscle cells increased cholesterol/phospholipid molar ratio by 90%; this  change was paralleled by a 58% decrease in contractility in response to CCK. The motility defects were reversed when smooth muscle cells were incubated for few  hours with cholesterol­free liposomes (146). Thus, it is possible that, at a very early stage (e.g., before chronic inflammation and fibrosis occur), the "functional"  motility defects of the smooth muscle will be reversible. The intriguing question is therefore if and to what extent this reversible process is relevant in humans. In vivo,  cholesterol supersaturation of bile can be reduced by oral ursodeoxycholate (120,150,151). We speculated that this would represent a possible way to reverse the  smooth muscle defect in cholesterol gallstone disease. Thus, we studied gallbladder strip contractility in a group of gallstone patients treated for 3 weeks preoperatively  with ursodeoxycholate in comparison with untreated patients. As expected, treated patients had a decreased cholesterol saturation index in their gallbladder bile. A  striking finding in this group, however, was the improved contractility to CCK and cholinergic stimulation by acetylcholine. Despite the fact that degree of inflammation  was mild, it was significantly lower in the patients treated with ursodeoxycholate (152). The motility defect of the smooth muscle in the gallbladder seems to be located at the plasmalemma level, somewhere between the receptor site and the intracellular  messengers of contraction. A "structural" change or damage to the CCK receptor itself cannot be ruled out (33,36), since the CCK receptor sensitivity of gallbladder  strips is either unchanged in cholesterol­fed animals compared to controls (124,153) or decreased in cholesterol gallstone patients compared to "control" pigment  gallstone patients (11). The intracellular machinery of contraction appears to be preserved if it is activated by intracellular messengers (26,147) or agents that are  receptor­independent (e.g., potassium chloride) (36). Moreover, the concentrations of smooth muscle contractile proteins (i.e., actin and myosin) do not change after  high cholesterol feeding of prairie dogs (153). Thus, functional defects of gallbladder smooth muscle might reside in the steps before G­protein activation (43,154,155) as result of cholesterol incorporation and  decreased membrane fluidity. This would lead to decreased mobilization of second messengers. It was indeed found that muscle cells from human gallbladders with  cholesterol and pigment stones have similar contraction in response to the intracellular messengers IP3 (26), DAG, and the G­protein

  

Page 51

activator GTPgS (147,156). By means of receptor binding studies, Xiao et al. recently found that gallbladder smooth muscle from cholesterol stone patients had  increased CCK binding affinity (Kd) but decreased binding capacity (Bmax) compared to smooth muscles from pigment stone patients. Again, these defects were  reversed by incubating smooth muscle cells with cholesterol­free liposomes, which remove excess cholesterol from the plasmalemma (157). The same impairment was  a found for the VIP binding to Gs  with another G­protein subunit (156). As a consequence of excess cholesterol in bile, defects in excitation­contraction coupling of  the gallbladder smooth muscle develop, such as impaired Ca2+ release from intracellular stores (143) and influx of extracellular Ca2+ through Ca2+ channels (158).  b Recently, Jennings et al. (159) used fixed cells and whole­mount preparations of the guinea pig gallbladder to measure cholesterol ester incorporation (via  ­methyl­ cyclodextrins conjugated to a fluorophore) by confocal microscopy. Interestingly, the incorporation of intracellular cholesterol was associated with alterations in ionic  conductance and action potentials as measured by the patch­clamp technique; this phenomenon might contribute as well to the genesis of impaired contractility of  gallbladder smooth muscle. B—  Innervation, Inflammation, and Biliary Bile Salt Composition A general overview of the mechanisms involved is given in Fig. 7. Neural innervation plays an important role in the gallbladder: vagal pathways maintain gallbladder  tone during fasting in concert with the gastrointestinal migrating motor complex (160–167), and vagal pathways also play a role postprandially (160). Whereas fasting  gallbladder volume increases and gallbladder emptying can deteriorate after vagotomy (168–170), highly selective vagotomy has a minor effect on gallbladder motility  (169). Spinal cord injury that abolishes sympathetic innervation of the gallbladder is associated with decreased fasting gallbladder volume but normal contractility  (171,172), although the incidence of biliary sludge can be higher. Factors linked to cholelithiasis, such as chronic inflammation of the gallbladder wall (173) or excess  toxic bile salts (see below), can adversely affect the intramural neurons of the gallbladder. Inflammatory changes in human gallbladders are associated with a significant  reduction in the number of stainable nerve fibers and ganglion cells (174) and with decreased contractility in response to neural stimulation (175). The chronic inflammatory response of the gallbladder in uncomplicated cholesterol gallstone disease is generally mild (11,33). However, absorption of excess  cholesterol from bile can produce very early inflammatory changes: in mice, the mucosa reacts to lithogenic diet within 48 h with increased mitotic index. Epithelial  hyperplasia is then noted after 2 weeks and before gallstones appear (137,138). As shown in the prairie dog, other early changes at the mucosal side in response to  increased lithogenic index of bile include inflammatory infiltrates, decrease in net sodium and water transport (176), and increased mucosal blood flow (177). In  humans and pigs, supersaturated bile (with excess deoxycholate) is followed by plasmacellular infiltration of the gallbladder wall and increased secretion of  immunoglobulins in bile (mainly IgG) (178). The hydrophobicity of the bile salts is another factor potentially influencing the function of gallbladder smooth muscle cells. Stolk et al. showed that the effect of bile  salts on gallbladder smooth muscle contractility correlate significantly with their relative hydrophobicity. Even very low concentrations of the hydrophobic bile salt  deoxycholate­inhibited ACh­induced contractility of human gallbladder strips in vitro. This was not the case with the hydrophilic ursodeoxycholate (179). In the guinea pig gallbladder, Xu and Shaffer (24) found that supraphysiological concentrations of tauro­conjugated bile salts directly inhibited stimulation by CCK and  the transmural electric field. The rank order of this inhibitory effect was from more to less hydrophobic bile salt (i.e., deoxycholate > chenodeoxycholate > cholate >>  m ursodeoxycholate). Most important was that premedication of strips with the hydrophilic ursodeoxycholic acid (50  M), a bile salt used for oral litholysis of  cholesterol gallstones, prevented the adverse effect of the

  

Page 52

Figure 7 Putative factors leading to impaired gallbladder smooth muscle contractility in cholesterol gallstone disease. On the left: excess biliary cholesterol leads to precipitation of cholesterol into crystals of various shapes [i.e., arcs, needles, tubules, spirals and plates (108,109)], damage of the gallbladder mucosa, lamina propria (inflammatory cells) and smooth muscle cells (incorporation of cholesterol into plasma membrane). On the right: effect of the hydrophobic bile salt deoxycholate at the level of the mucosa, smooth muscle cell, and intramural neurons. Under certain circumstances (e.g., litholytic therapy or cholestatic liver diseases), bile salts can also reach the gallbladder wall in high concentrations through the blood supply and serosal side.

other bile salts. This study clearly shows that bile salts have a direct dose­ and physicochemical­dependent adverse effect on gallbladder smooth muscle response.  Since both voltage­operated Ca2+ channels and muscarinic (M3) receptors gave a normal response, the authors could rule out an alteration of both intracellular  contractile machinery and intracellular Ca2+ release from sarcoplasmatic reticulum. Instead, the putative mechanisms might involve alterations of the CCK receptor at  various levels (e.g., binding, receptor loss, or impaired G­protein response) as well as defective intramural cholinergic transmission. The inhibitory effect of bile salts  might either be at the level of the axon (with decreased conduction of the action potential) or directly on the intrinsic cholinergic nerve endings (180). Interestingly, a  direct effect on smooth muscle contractility has also been shown in other organs such as the ileum (181) and in vascular smooth muscle (182). Would this bile salt­mediated inhibition of gallbladder smooth muscle function be relevant in vivo? Several studies support this hypothesis. Bile salts could reach the gallbladder smooth muscle from the lumen. This possibility has been shown in the guinea pig by Ostrow, who also showed that mucosal  damage was associated with enhanced bile salt luminal absorption (116). High levels of the hydrophobic cytotoxic bile salt deoxycholate are found in cholesterol  gallstone patients (109,116,183,184) as result of delayed intestinal transit time and increased bacterial deconjugation of primary bile salts (184–186). Also, bile salt  therapy for stone dissolution leads to elevated biliary urso­

  

Page 53

deoxycholate. This has been shown to increase fasting gallbladder volume (132,187,188) and to depress gallbladder emptying in vivo by some (132,188) but not all  studies (187,189). It is also possible that bile salts can reach gallbladder smooth muscle cells through the serosal side when serum levels increase (190), as in chronic  cholestatic liver diseases, which can be associated with gallstone disease (191) and impaired gallbladder emptying (192). Indeed, as shown by Stolk et al., it appears  that physiological amounts of bile salts in the serum as low as 10­7 M are sufficient to affect adversely gallbladder contractility (179). This possibility, however, seems  to be very remote or absent for the hydrophilic ursodeoxycholate (24,152,179). V—  Conclusions In recent years a major progress has been made in our understanding of gallbladder motility in human cholesterol cholelithiasis. Several studies in both humans and  cholesterol­fed animal models have focused on cellular and molecular events during the interaction of luminal signals with the gallbladder wall (mucosa and smooth  muscle). Thus, the interplay between contraction and relaxation of the gallbladder muscularis leads to appropriate gallbladder emptying and refilling during fasting and  in the postprandial state. The final outcome depends on the interaction between several neurohormonal signals and the muscle plasma membranes, from which  regulatory signals originate. Long­term exposure of the gallbladder wall to luminal factors during cholesterol lithogenesis, such as excess cholesterol and the cytotoxic bile salt deoxycholate, will  cause chronic inflammation of the mucosa and the lamina propria (178). In this context, the smooth muscle layer might react in several ways that ultimately lead to a  form of gallbladder leiomyopathy (11,127) and several functional defects involving the plasma membranes and signal transduction (11,25,26,43,125,126). This, in  turn, results in pathological contraction and/or relaxation of smooth musculature, impaired gallbladder motility, and gallbladder stasis, which is a key factor and an early  feature in the pathogenesis of cholesterol crystallization and gallstones. Acknowledgments The authors gratefully acknowledge K. J. van Erpecum and N. G. Venneman for helpful discussion during the preparation of this chapter. References 1. Weisbrodt NW. Regulation: nerves and smooth muscle. In: Johnson LR, ed. Gastrointestinal Physiology. 5th ed. St Louis: Mosby­Year Book, 1997, pp 325–332. 2. Ruegg JC. Smooth muscle. In: Greger R, Windhorst U, eds. Comprehensive Human Physiology. Berlin, Heidelberg: Springer­Verlag, 1996, pp 895–910. 3. Ruegg JC. Calcium in muscle contraction. 2nd ed. Berlin, Heidelberg, New York: Springer­Verlag, 1992. 4. Small JV, Squire JM. Structural basis of contraction in vertebrate smooth muscle. J Mol Biol 1972; 67:117–119. 5. Weisbrodt NW, Moody FG. Gallbladder contractility [Letter]. Gastroenterology 1992; 102:741–742. 6. Beglinger C, Hildebrand P, Adler G, Werth B, Harvey JR, Toouli J. Postprandial control of gallbladder contraction and exocrine pancreatic secretion in man. Eur J  Clin Invest 1992; 22:827–834. 7. Liddle RA, Gertz BJ, Kanayama S, Beccaria L, Coker LD, Turnbull TA, Morita ET. Effects of a novel cholecystokinin (CCK) receptor antagonist, MK­329, on  gallbladder

  

Page 54

contraction and gastric emptying in humans. Implications for the physiology of CCK. J Clin Invest 1989; 84:1220–1225. 8. Malesci A, De Fazio C, Festorazzi S, Bonato C, Valentini A, Tacconi M, Rovati L, Setnikar I. Effect of loxiglumide on gallbladder contractile response to cerulein  and food in humans. Gastroenterology 1990; 98:1307–1310. 9. Palasciano G, Portincasa P, Belfiore A, Baldassarre S, Albano O. Opposite effects of cholestyramine and loxiglumide on gallbladder dynamics in humans.  Gastroenterology 1992; 102:633–639. 10. McKirdy ML, McKirdy HC, Johnson CD. Non­adrenergic non­cholinergic inhibitory innervation shown by electrical field stimulation of isolated strips of human  gall bladder muscle. Gut 1994; 35:412–416. 11. Portincasa P, Di Ciaula A, Baldassarre G, Palmieri V, Gentile A, Cimmino A, Palasciano G. Gallbladder motor function in gallstone patients: sonographic and in  vitro studies on the role of gallstones, smooth muscle function and gallbladder wall inflammation. J Hepatol 1994; 21:430–440. 12. Bird NC, Wegstapel H, Chess­Williams R, Johnson AG. In vitro contractility of stimulated and non­stimulated human gallbladder muscle. Neurogastroenterol  Motil 1996; 8:63–68. 13. Severi C, Grider JR, Makhlouf GM. Functional gradients in muscle cells isolated from gallbladder, cystic duct, and common bile duct. Am J Physiol 1988;  255:G647–G652. 14. Washabau RJ, Wang MB, Dorst C, Ryan JP. Role of myosin light­chain phosphorylation in guinea pig gallbladder smooth muscle contraction. Am J Physiol 1994;  266:G469–G474. 15. Parkman HP, Pagano AP, Martin JS, Ryan JP. Electric field stimulation­induced guinea pig gallbladder contractions. Dig Dis Sci 1997; 42:1919–1925. 16. Schjoldager BT. Role of CCK in gallbladder function. Ann NY Acad Sci 1994; 713: 207–218. 17. Schjoldager B, Molero X, Miller LJ. Gallbladder CCK receptors: species differences in glycosylation of similar protein cores. Regul Peptides 1990; 28:265–272. 18. Schjoldager B, Molero X, Miller LJ. Functional and biochemical characterization of the human gallbladder muscularis cholecystokinin receptor. Gastroenterology  1989; 96: 1119–1125. 19. Hanyu N, Dodds WJ, Layman RD, Hogan WJ, Chey WY, Takahashi I. Mechanism of cholecystokinin­induced contraction of the opossum gallbladder.  Gastroenterology 1990; 98:1299–1306. 20. Brotschi EA, Pattavino J, Williams LF, Jr. Intrinsic nerves affect gallbladder contraction in the guinea pig. Gastroenterology 1990; 99:826–830. 21. Lee JK, Rhee PL, Kang TM, Kim J, Koh KC, Paik SW, Rhee JC, Choi KW. Calcium sources mediating human gallbladder smooth muscle contraction by  acetylcholine and cholecystokinin (abstr). Gastroenterology 1998; 114:A528. 22. Ryan JP. Calcium and gallbladder smooth muscle contraction in the guinea pig: effect of pregnancy. Gastroenterology 1985; 89:1279–1285. 23. Parkman HP, Pagano AP, Ringold MA, Ryan JP. Effect of modulating voltage­dependent calcium channels on cholecystokinin and acetylcoline­induced  contractions of the guinea pig gallbladder. Regul Peptides 1996; 63:31–37. 24. Xu QW, Freedman SM, Shaffer EA. Inhibitory effect of bile salts on gallbladder smooth muscle contractility in the guinea pig in vitro. Gastroenterology 1997;  112:1699–1706. 25. Behar J, Lee KY, Thompson WR, Biancani P. Gallbladder contraction in patients with pigment and cholesterol stones. Gastroenterology 1989; 97:1479–1484. 26. Behar J, Rhim BY, Thompson W, Biancani P. Inositol trisphosphate restores impaired human gallbladder motility associated with cholesterol stones.  Gastroenterology 1993; 104:563–568. 27. Renzetti LM, Wang MB, Ryan JP. Contribution of intracellular calcium to gallbladder smooth muscle contraction. Am J Physiol 1990; 259:G1–G5.

  

Page 55

28. Spedding M, Paoletti R. Classification of calcium channels and the sites of action of drugs modifying channel function. Pharmacol Rev 1992; 44:363–376. 29. Clas D, Hould FS, Rosenthall L, Arzoumanian A, Fried GM. Nifedipine inhibits cholecystokinin­induced gallbladder contraction. J Surg Res 1989; 46:479–483. 30. Jonderko K, Nowak A, Kasicka Jonderko A, Sliwinski Z, Kucio C. Effect of nifedipine on interdigestive gallbladder volume and postprandial gallbladder  emptying in man. Dig Dis Sci 1991; 36:1434–1440. 31. Portincasa P, Howard A, Murphy GM, Dowling RH. Cholecystokinin receptor binding by human gallbladder myocyte membranes (abstr). Gut 1986; 27:1261A. 32. Portincasa P, Murphy GM, Dowling RH, Palasciano G, Albano O. A method proposed for the preparation of plasma membranes from myocytes of human  gallbladders. In: Gorrod JW, Albano O, Papa S, eds. Molecular Aspect of Human Disease. London: Ellis Horwood, 1988, pp 241–249. 33. Upp JR, Jr, Nealon WH, Singh P, Fagan CJ, Jonas AS, Greeley GH, Jr, Thompson JC. Correlation of cholecystokinin receptors with gallbladder contractility in  patients with gallstones. Ann Surg 1987; 205:641–648. 34. Schjoldager B, Shaw MJ, Powers SP, Schmalz PF, Szurszewski J, Miller LJ. Bovine gallbladder muscularis: source of a myogenic receptor for cholecystokinin.  Am J Physiol 1988; 254:G294–G299. 35. Oliver AS, Vigna SR. CCK­A and CCK­B­like receptors in the gallbladder and stomach of the alligator (Alligator mississippiensis). Gen Comp Endocrinol  1997; 105:91–101. 36. Schneider H, Sanger H, Hanisch E. In vitro effects of cholecystokinin fragments on human gallbladders. Evidence for an altered CCK­receptor structure in a  subgroup of patients with gallstones. J Hepatol 1997; 26:1063–1068. 37. Matthews G. Neurotransmitter release. Annu Rev Neurosci 1996; 19:219–233. 38. Hess P. Calcium channels in vertebrate cells. Annu Rev Neurosci 1990; 13:337–356. 39. Yu P, De Petris G, Biancani P, Amaral J, Behar J. Cholecystokinin­coupled intracellular signaling in human gallbladder muscle. Gastroenterology 1994; 106:763– 770. 40. Bitar KN, Bradford BG, Putney JW, Makhlouf GM. Stoichiometry of contraction and Ca2+ mobilization by inositol­1,4,5­trisphosphate in isolated gastric smooth  muscle cells. J Biol Chem 1986; 261:16591–16596. 41. Pearson RK, Hadac EM, Miller LJ. Structural analysis of a distinct subtype of CCK receptor on human gastric smooth muscle tumors. Am J Physiol 1989;  256:G1005–G1010. 42. Masui H, Wakabayashi I. Preferential inhibition by ethanol of phorbol ester­induced smooth muscle contraction of guinea pig gallbladder. Life Sci 1998; 62:673– 678. 43. Chen Q, De Petris G, Yu P, Amaral J, Biancani P, Behar J. Different pathways mediate cholecystokinin actions in cholelithiasis. Am J Physiol 1997; 272:G838– G844. 44. Singletary BK, Van Thiel DH, Eagon PK. Estrogen and progesterone receptors in human gallbladder. Hepatology 1986; 6:574–578. 45. van der Werf SDJ, Van Berge­Henegouwen GP, Ruben AT, Palsma DM. Biliary lipids, bile acid metabolism, gallbladder motor function and small intestinal  transit during ingestion of a sub­fifty oral contraceptive. J Hepatol 1987; 4:318–326. 46. Eltze M, Konig H, Ullrich B, Grebe T. Contraction of guinea­pig gallbladder: muscarinic M3 or M4 receptors? Eur J Pharmacol 1997; 332:77–87. 47. Parkman HP, Pagano AP, Ryan JP. Subtypes of muscarinic receptors regulating gallbladder cholinergic contractions (abstr). Gastroenterology 1998; 114:A819. 48. Nelson DK, Glasbrenner B, Dahmen G, Riepl RL, Malfertheiner P, Adler G. M1 muscarinic mechanisms regulate intestinal­phase gallbladder physiology in  humans. Am J Physiol 1996; 271:824–830. 49. Liu F, Naruse S, Ozaki T, Sazi T, Kondo T, Toda Y. Effect of gastrin­releasing peptide (GRP) on guinea pig gallbladder contraction in vitro. J Gastroenterol  1995; 30:764–767.

  

Page 56

50. Yau WM. Mode of stimulation of gallbladder contraction by substance K. Am J Physiol 1990; 259:G838–G841. 51. Meldrum LA, Bojarski JC, Calam J. Effects of substance P and other neuropeptides on guinea­pig gall­bladder muscle. Digestion 1987; 37:193–199. 52. Moummi C, Gullikson GW, Gaginella TS. Effect of endothelin­1 on guinea pig gallbladder smooth muscle in vitro. J Pharmacol Exp Ther 1992; 260:549–553. 53. Parkman HP, Vozzelli MA, Pagano AP, Cowan A. Pharmacological analysis of receptors for bombesin­related peptides on guinea pig gallbladder smooth  muscle. Regul Pept 1994; 52:173–180. 54. Parkman HP, Pagano AP, Ryan JP. Dual effects of PACAP on guinea pig gallbladder muscle via PACAP­preferring and VIP/PACAP­preferring receptors. Am  J Physiol 1997; 272:1433–1438. 55. Lluis F, Fujimura M, Lonovics J, Guo YS, Gomez G, Greeley GH, Jr, Townsend CM, Jr, Thompson JC. Peptide YY and gallbladder contraction. Studies in vivo  and in vitro. Gastroenterology 1988; 94:1441–1446. 56. Lennon F, Feeley TM, Clanachan AS, Scott GW. Effects of histamine receptor stimulation on diseased gallbladder and cystic duct. Gastroenterology 1984;  87:257–262. 57. Andersson KE, Andersson R, Hedner P, Persson CG. Parallelism between mechanical and metabolic responses to cholecystokinin and prostaglandin E2 in  extrahepatic biliary tract. Acta Physiol Scand 1973; 89:571–579. 58. Das A, Baijal SS, Saraswat VA. Effect of aspirin on gallbladder motility in patients with gallstone disease: a randomized, double­blind, placebo­controlled trial of  two dosage schedules. Dig Dis Sci 1995; 40:1782–1785. 59. Falcone RC, Hubbs SJ, Vanderloo JD, Prosser JC, Little J, Gomes B, Aharony D, Krell RD. Characterization of bradykinin receptors in guinea pig gall bladder.  J Pharmacol Exp Ther 1993; 266:1291–1299. 60. Cabrini DA, Calixto JB. Characterization of des­Arg9­bradykinin­induced contraction in guinea­pig gallbladder in vitro. Eur J Pharmacol 1997; 331:31–38. 61. Freedman SM, Wallace JL, Shaffer EA. Characterization of leukotriene­induced contraction of the guinea­pig gallbladder in vitro. Can J Physiol Pharmacol 1993;  71:145–150. 62. Boivin M, Raymond MC, Riberdy M, Trudel L, St­Pierre S, Poitras P. Plasma motilin variation during the interdigestive and digestive states in man. J Gastrointest  Motil 1990; 2:240–246. 63. Vantrappen G, Janssens J, Peeters TL, Bloom SR, Christofides ND, Hellemans J. Motilin and the interdigestive migrating motor complex in man. Dig Dis Sci  1979; 24:497–500. 64. Stolk MFJ, van Erpecum KJ, Smout AJPM, Akkermans LMA, Jansen JB, Lamers CBHW, Peeters TL, vanBerge­Henegouwen GP. Motor cycles with phase  III in antrum are associated with high motilin levels and prolonged gallbladder emptying. Am J Physiol 1993; 264:G596–G600. 65. Luiking YC, Peeters TL, Stolk MFJ, Nieuwenhuijs VB, Portincasa P, Depoortere I, Van Berge­Henegouwen GP, Akkermans LMA. Motilin induces gall  bladder emptying and antral contractions in the fasted state in humans. Gut 1998; 42:830–835. 66. Catnach SM, Ballinger AB, Law AP, Nellans H, Fairclough PD. Dose­dependent stimulation of gallbladder contraction by intravenous erythromycin in man.  Aliment Pharmacol Ther 1993; 7:55–59. 67. Catnach SM, Fairclough PD, Trembath RC, O'Donnell LJ, McLean AM, Law PA, Wickham JE. Effect of oral erythromycin on gallbladder motility in normal  subjects and subjects with gallstones. Gastroenterology 1992; 102:2071–2076. 68. Fiorucci S, Distrutti E, Quintieri A, Sarpi L, Spirchez Z, Gulla N, Morelli A. L­arginine/nitric oxide pathway modulates gastric motility and gallbladder emptying  induced by erythromycin and liquid meal in humans. Dig Dis Sci 1995; 40:1365–1371.

  

Page 57

69. Fiorucci S, Distrutti E, Bassotti G, Gerli R, Chiucchiu S, Betti C, Santucci L, Morelli A. Effect of erythromycin administration on upper gastrointestinal motility in  scleroderma patients. Scand J Gastroenterol 1994; 29:807–813. 70. Fiorucci S, Bosso R, Morelli A. Erythromycin stimulates gallbladder emptying and motilin release by atropine­sensitive pathways. Dig Dis Sci 1992; 37:1678– 1684. 71. Fiorucci S, Scionti L, Bosso R, Desando A, Bottini P, Marino C, Morelli A. Effect of erythromycin on gallbladder emptying in diabetic patients with and without  autonomic neuropathy and high levels of motilin. Dig Dis Sci 1992; 37:1671–1677. 72. Jebbink MC, Masclee AAM, van der Kleij FG, Schipper J, Rovati LC, Jansen JB, Lamers CBHW. Effect of loxiglumide and atropine on erythromycin­induced  reduction in gallbladder volume in human subjects. Hepatology 1992; 16:937–942. 73. Masclee AAM, Ledeboer ML, Gielkens HAJ, van der Kleij FG, Jebbink MC, Lamers CBHW. Effect of erythromycin on gallbladder emptying in patients with  antrectomy or truncal vagotomy. Am J Gastroenterol 1995; 90:973–977. 74. Arienti V, Magri F, Boriani L, Maconi G, Bassein L, Baraldini M, Marzio L, Gasbarrini G. Effect of a single dose of oral erythromycin on gastric and gallbladder  emptying. Simultaneous assessment by ultrasound. Dig Dis Sci 1994; 39:1309–1312. 75. Masclee AA, Ledeboer ML, Gielkens HG, van der Kleij FG, Jebbink MC, Lamers CB. Effect of erythromycin on gallbladder emptying in patients with  antrectomy or truncal vagotomy. Am J Gastroenterol 1995; 90:973–977. 76. Yamasaki T, Chijiiwa K, Chijiiwa Y. Direct contractile effect of motilin on smooth muscle cells from human gallbladder. J Surg Res 1994; 56:89–93. 77. Peeters TL. The potentials of erythromycin derivatives in the treatment of gastrointestinal motility disorders. Z Gesamte Inn Med 1991; 46:349–354. 78. Koutsoviti­Papadopoulou M, Kounenis G, Batzias G, Elezoglou V. Effect of cisapride on the isolated guinea pig gall bladder and common bile duct. Gen  Pharmacol 1997; 29:863–867. 79. Nakayama S, Neya T, Yamasato T, Takaki M, Itano N. Effects of cisapride on the motility of the digestive tract in dogs and guinea pigs. Nippon Heikatsukin  Gakkai Zasshi 1985; 21:1–9. 80. Xu QW, Shaffer EA. Cisapride improves gallbladder contractility and bile lipid composition in an animal model of gallstone disease. Gastroenterology 1993;  105:1184–1191. 81. Schatzmann HJ. The calcium pump of the surface membrane and of the sarcoplasmic reticulum. Annu Rev Physiol 1989; 51:473–485. 82. Casteels R, Van Breemen C. Active and passive Ca2+ fluxes across cell membranes of the guinea­pig taenia coli. Pflugers Arch 1975; 359:197–207. 83. Kline LW, Zhang ML, Pang PKT. Cyclic AMP induces a relaxation response in the bullfrog Rana catesbeiana, but nitric oxide does not. J Exp Biol 1997;  200:2669–2674. 84. Archer SL, Huang JM, Hampl V, Nelson DP, Shultz PJ, Weir EK. Nitric oxide and cGMP cause vasorelaxation by activation of a charybdotoxin­sensitive K  channel by cGMP­dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:7583–7587. 85. Schultz KD, Bohme E, Kreye VA, Schultz G. Relaxation of hormonally stimulated smooth muscular tissues by the 8­ bromo derivative of cyclic GMP. Naunyn  Schmiedebergs Arch Pharmacol 1979; 306:1–9. 86. Rasmussen TN, Harling H, Rehfeld JF, Holst JJ. Calcitonin gene­related peptide (CGRP), a potent regulator of biliary flow. Neurogastroenterol Motil 1997;  9:215–220. 87. Keaveny AP, Offner GD, Afdhal NH. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is the principal isoform expressed in human gallbladder (abstr). Gastroenterology  1998; 114: A526. 88. Luiking YC, Weusten BLAM, Portincasa P, Van der Meer R, Smouth AJPM, Akkermans LMA. Effect of long­term oral L­arginine on esophageal motility and  gallbladder dynamics in healthy humans. Am J Physiol 1998; 37:G984–G991.

  

Page 58

89. Tankurt E, Apaydin S, Ellidokuz E, Igcl E, Guven H, I Simsek, O Gonen. The prokinetic effect of domperidone in gallbladder—not upon dopaminergic receptors.  Pharm Res 1996; 34:153–156. 90. Perrson CGA. Adrenoreceptors in the gallbladder. Acta Pharmacol Toxicol 1972; 31:177–185. 91. Greaves R, Miller J, O'Donnell L, McLean A, Farthing MJ. Effect of the nitric oxide donor, glyceryl trinitrate, on human gall bladder motility. Gut 1998; 42:410– 413. 92. Chen Q, Amaral J, Oh S, Biancani P, Behar J. Gallbladder relaxation in patients with pigment and cholesterol stones. Gastroenterology 1997; 113:930–937. 93. Sanger P, Schneider H, Hanisch E. Nonadrenergic noncholinergic regulation of gallstone containing and gallstone free human gallbladders. Zentralbl Chir 1997;  122:418–424. 94. Kline LW, Pang PKT. Cyclic AMP modulates part of the relaxant action of calcitonin gene­related peptide in guinea pig gallbladder strips. Regul Pept 1997;  72:55–59. 95. Haruma K, Wiste JA, Camilleri M. Effect of octreotide on gastrointestinal pressure profiles in health, functional and organic gastrointestinal disorders. Gut 1994;  35:1064–1069. 96. Aldman G, Holmgren S. VIP inhibits CCK­induced gallbladder contraction involving a beta­adrenoceptor mediated pathway in the rainbow trout, Oncorhynchus  mykiss, in vivo. Gen Comp Endocrinol 1992; 88:287–291. 97. Guo Y, Singh P, Upp JR, Jr, Thompson J. Species­specific effects of neurotensin on gallbladder contraction in vitro. Dig Dis Sci 1989; 34:21–26. 98. Yiangou Y, Christofides ND, Gu J, Piper PJ, Polak JM, Bloom SR. PHI­like immunoreactivity in the gallbladder and in vitro effect of porcine PHI on smooth  muscle of the gallbladder. FEBS Lett 1984; 175:307–312. 99. Hussaini SH, Pereira SP, Veysey MJ, Kennedy C, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. Role of gall bladder emptying and intestinal transit in the  pathogenesis of octreotide induced gallbladder stones. Gut 1996; 38:775–783. 100. Lonovics J, Devitt P, Rayford PL, Thompson JC. Actions of VIP, somatostatin, and pancreatic polypeptide on gallbladder tension and CCK­stimulated  gallbladder contraction in vitro. Surg Forum 1979; 30:407–409. 101. Jennings LJ, Salido GM, Pozo MJ, Davison JS, Sharkey KA, Lea RW, Singh J. The source and action of histamine in the isolated guinea­pig gallbladder.  Inflamm Res 1995; 44:447–453. 102. Schulz M, Hanisch E, Guldutuna S. In vitro contractility of the musculature of human gallbladders with and without gallstones—relevance of the prostaglandin  system for CCK regulated motoricity. Z Gastroenterol 1993; 31:376–387. 103. Brotschi EA, LaMorte WW, Williams LFJ. Effect of dietary cholesterol and indomethacin on cholelithiasis and gallbladder motility in guinea pig. Dig Dis Sci  1984; 29: 1050–1056. 104. O'Donnell LJ, Wilson P, Guest P, Catnach SM, McLean A, Wickham JE, Fairclough PD. Indomethacin and postprandial gallbladder emptying. Lancet 1992;  339:269–271. 105. Murray FE, Stinchcombe SJ, Hawkey CJ. Effect of indomethacin and misoprostol on fasted gallbladder volume and meal­induced gallbladder contractility in  humans. Dig Dis Sci 1992; 37:1228–1231. 106. Carey MC. Formation of cholesterol gallstones: the new paradigm. In: Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Trends in Bile Acid Research. Dordrecht, The  Netherlands: Kluwer, 1989, pp 259–281. 107. Apstein MD, Carey MC. Pathogenesis of cholesterol gallstones: a parsimonious hypothesis. Eur J Clin Invest 1996; 26:343–352. 108. Konikoff FM, Chung DS, Donovan JM, Small DM, Carey MC. Filamentous, helical and tubular microstructures during cholesterol crystallization from bile:  evidence that billiary cholesterol does not nucleate classic monohydrate plates. J Clin Invest 1992; 90:1156–1161.

  

Page 59

109. Portincasa P, van Erpecum KJ, Jansen A, Renooij W, Gadellaa M, vanBerge­Henegouwen GP. Behavior of various cholesterol crystals in bile from gallstone  patients. Hepatology 1996; 23:738–748. 110. Portincasa P, van Erpecum KJ, vanBerge­Henegouwen GP. Cholesterol crystallisation in bile. Gut 1997; 41:138–141. 111. Carey MC. Formation and growth of cholesterol gallstones: the new synthesis. In: Fromm H, Leushner U, eds. Bile Acids—Cholestasis—Gallstones: Advances  in Basic and Clinical Bile Acid Research. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer, 1996, pp 147–175. 112. Portincasa P. Gallbladder and Bile in Health and Gallstone Disease: The Role of Motility, Gallstones and Bile Lipid Composition. Ph.D. thesis. Utrecht, The  Netherlands: Utrecht University, 1995. 113. Neiderhiser DH, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res 1976; 17:117–124. 114. Neiderhiser DH, Morningstar WA, Roth H. Absorption of lecithin and lysolecithin by the gallbladder. J Lab Clin Med 1973; 82:891–897. 115. Purdum PP, Shamburek RD, Hylemon PB, Moore EW. Rapid phospholipid transfer across cultured human gallbladder epithelia. Gastroenterology 1992;  102:A871. 116. Ostrow JD. Absorption by the gallbladder of bile acid salts, sulfobromophtalein and iodipamide. J Lab Clin Med 1969; 74:482–494. 117. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1988; 95:508–523. 118. Harvey PRC, Upadhya GA, Strasberg SM. Immunoglobulins as nucleating proteins in the gallbladder bile of patients with cholesterol gallstones. J Biol Chem  1991; 266: 13996–14003. 119. Upadhya GA, Harvey PR, Strasberg SM. Effect of human biliary immunoglobulins on the nucleation of cholesterol. J Biol Chem 1993; 268:5193–5200. 120. van Erpecum KJ, Portincasa P, Eckhardt E, Go PMNYH, vanBerge­Henegouwen GP, Groen AK. Ursodeoxycholic acid reduces protein levels and their  nucleation­promoting activity in gallbladder bile. Gastroenterology 1996; 110:1225–1237. 121. LaMorte WW. Biliary motility and abnormalities associated with cholesterol cholelithiasis. Curr Opin Gastroenterol 1993; 9:810–816. 122. Doty JE, Pitt HA, Kuchenbecker SL, DenBesten L. Impaired gallbladder emptying before gallstone formation in prairie dog. Gastroenterology 1983; 85:168– 174. 123. Fridhandler TM, Davison JS, Shaffer EA. Defective gallbladder contractility in the ground squirrel and prairie dog during the early stages of cholesterol gallstone  formation. Gastroenterology 1983; 85:830–836. 124. Li YF, Moody FG, Weisbrodt NW, Zalewsky CA, Coelho JC, Senninger N, Gouma D. Gallbladder contractility and mucus secretion after cholesterol feeding  in the prairie dog. Surgery 1986; 100:900–904. 125. Yu P, Chen Q, Harnett K, Biancani P, Behar J. Impaired IP3 and DAG production in human gallbladder muscle with cholesterol stones (abstr).  Gastroenterology 1994; 107: A1220. 126. Shaffer EA, McOrmond P, Duggan H. Quantitative cholescintigraphy: assessment of gallbladder filling and emptying and duodenogastric reflux. Gastroenterology  1980; 79: 899–906. 127. Portincasa P, Mitra P, Maghsoudldoo M, Murphy GM, Dowling RH. An inegrated study of gallbladder (GB) motorfunction in gallstone patients (abstr). Gut  1987; 28:1395A. 128. DeCarvalho S. Atherosclerosis: I. A leiomyoproliferative disease of the arteries resulting from the breakdown of the endothelial barrier to potent blood growth  factors. Angiology 1995; 36:497–710. 129. Festi D, Frabboni R, Bazzoli F, Sangermano A, Ronchi M, Rossi L, Parini P, Orsini M, Primerano AM, Mazzella G, Aldini R, Roda E. Gallbladder motility in  cholesterol gallstone disease: effect of ursodeoxycholic acid administration and gallstone dissolution. Gastroenterology 1990; 99:1779–1785.

  

Page 60

130. van Erpecum KJ, vanBerge­Henegouwen GP, Stolk MFJ, Hopman WPM, Jansen JBMJ, Lamers CBHW. Fasting gallbladder volume, postprandial emptying  and cholecystokinin release in gallstone patients and normal subjects. J Hepatol 1992; 14:194–202. 131. Kishk SMA, Darweesh RMA, Dodds WJ, et al. Sonographic evaluation of resting gallbladder volume and postprandial emptying in patients with gallstones. AJR  1987; 148: 875–879. 132. Forgacs IC, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and UDCA on gallbladder emptying. Gastroenterology 1984; 87:299–307. 133. Pauletzki JG, Cicala M, Holl J, Sauerbruch T, Schafmayer A, Paumgartner G. Correlation between gallbladder fasting volume and postprandial emptying in  patients with gallstones and healthy controls. Gut 1993; 34:1443–1447. 134. Jazrawi RP, Pazzi P, Petroni ML, Prandini N, Paul C, Adam JA, Northfield TC. Postprandial gallbladder motor function: refilling and turnover of bile in health  and cholelithiasis. Gastroenterology 1995; 109:582–591. 135. van der Weft SD, vanBerge­Henegouwen GP, Palsma DM, Ruben AT. Motor function of the gallbladder and cholesterol saturation of duodenal bile. Neth J  Med 1987; 30:160–171. 136. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 137. Putz P, Willems G. Effect of a lithogenic diet on cell proliferation in the murine gallbladder epithelium. Digestion 1981; 22:16–23. 138. Wahlin T. Effects of lithogenic diets on mouse gallbladder epithelium: a histochemical, cytochemical and morphometric study. Virchows Arch B Cell Pathol  1976; 22:273–286. 139. Wang DQH, Paigen B, Carey MC. Phenotipic characterization of Lith genes determining susceptibility to cholesterol (Ch) gallstone formation in inbred mice  (abstr). Hepatology 1995; 22:289A. 140. Khanuja B, Cheah YC, Hunt M, Nishina PM, Wang DQ, Chen HW, Billheimer JT, Carey MC, Paigen B. Lith 1, a major gene affecting cholesterol gallstone  formation among inbred strains of mice. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:7729–7733. 141. Hayashi A, Lee SP, Savard C. Bidirectional transfer of cholesterol between gallbladder epithelial cells and bile. Am J Physiol 1996; 271:G410–G414. 142. Tilvis RS, Aro J, Stranberg TE, Lempinen M, Miettinen TA. Lipid composition of bile and gallbladder mucosa in patients with acalculous cholesterolosis.  Gastroenterology 1982; 82:607–615. 143. Metzger AL, Adler R, Heymsfield S. Diurnal variations in biliary lipid composition. N Engl J Med 1973; 288:333–336. 144. Sahlin S, Ahlberg J, Reihner E, Stahlberg D, Einarsson K. Cholesterol metabolism in human gallbladder mucosa: relationship to cholesterol gallstone disease and  effects of chenodeoxycholic acid and ursodeoxycholic acid treatment. Hepatology 1992; 16:320–326. 145. Xu QW, Shaffer EA. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal model of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology 1996;  110:251–257. 146. Yu P, Chen Q, Biancani P, Behar J. Membrane cholesterol alters gallbladder muscle contractility in prairie dogs. Am J Physiol 1996; 271:G56–G61. 147. Yu P, Chen Q, Harnett KM, Amaral J, Biancani P, Behar J. Direct G protein activation reverses impaired CCK signaling in human gallbladders with cholesterol  stones. Am J Physiol 1995; 269:G659–G665. 148. Brenner RR. Effect of unsaturated acids on membrane structure and enzyme kinetics. Prog Lipid Res 1984; 23:69–96. 149. Phillips MC. Cholesterol­phospholipid interactions and the exchangeability of cholesterol between membranes. In: PJ Quin, RJ Cherry, eds. Structural and  Dynamic Properties of Lipids and Membranes. Portland, OR: London, 1992, pp 103–118. 150. Portincasa P, van Erpecum KJ, Jansen A. Renooij W, Gadellaa M, vanBerge­Henegou­

  

Page 61

wen GP. Nucleation behavior of various cholesterol (xol) crystals in bile from gallstone patients (abstr). Gastroenterology 1995; 108:A1150. 151. Tint GS, Salen G, Shefer S. Effect of ursodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid on cholesterol and bile acid metabolism. Gastroenterology 1986;  91:1007–1018. 152. van de Heijning BJM, van de Meeberg P, Portincasa P, Doornewaard H, Hoebers FJP, van Erpecum KJ, vanBerge­Henegouwen GP. Effects of  ursodeoxycholic acid therapy on in vitro gallbladder contractility in patients with cholesterol gallstones. Dig Dis Sci 1999; 44:190–196. 153. Li YF, Weisbrodt NW, Moody FG, Coelho JU, Gouma DJ. Calcium­induced contraction and contractile protein content of gallbladder smooth muscle after  high­cholesterol feeding of prairie dogs. Gastroenterology 1987; 92:746–750. 154. Yu P, Harnett KM, Biancani P, De Petris G, Behar J. Interaction between signal transduction pathways contributing to gallbladder tonic contraction. Am J  Physiol 1994; 265:1082–1089. 155. De Petris G, Yu P, Biancani P, Behar J. GTP and inositol triphosphate restores the gallbladder contraction after CCK stimulation in prairie dogs fed a high  cholesterol diet (abstr). Gastroenterology 1993; 104:A359. 156. Xiao ZL, Chen Q, Amaral J, Biancani P, Behar J. Excess membrane cholesterol alters CCK­ and VIP­induced G protein activation in human gallbladders with  cholesterol tones (abstr). Gastroenterology 1998; 114:A861. 157. Xiao ZL, Chen Q, Amaral J, Biancani P, Jensen RT, Behar J. Excess membrane cholesterol alters CCK receptor binding affinity and capacity of human  gallbladder muscle (abstr). Gastroenterology 1998; 114:A86. 158. Yu P, De Petris G, Biancani P, Amaral J, Behar J. Abnormal calcium channel function in smooth muscle from human gallbladders with cholesterol stones.  Gastroenterology 1993; 104:A606. 159. Jennings LJ, Wei Xu Q, Nelson MT, Mawe GM. Cholesterol modulates guinea­pig gallbladder smooth muscle action potential characteristics (abstr).  Gastroenterology 1998; 114:A772. 160. Ryan JP. Motility of the gallbladder and biliary tree. In: Johnson LR, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract. New York: Raven Press, 1987, pp 695–722. 161. Itoh Z, Takahashi I. Periodic contractions of the canine gallbladder during the interdigestive state. Am J Physiol 1981; 240:G183–G189. 162. Itoh Z, Takeuki I, Aizawa I, Mori K, Taminato Y, Seino Y, Imura H, Yanaihara N. Changes in plasma motilin concentration and gastrointestinal contractile  activity in conscious dogs. Am J Dig Dis 1978; 23:929–935. 163. Toouli J, Bushell M, Stevenson G, Dent J, Wycherly A, Iannos J. Gallbladder emptying in man related to fasting duodenal migrating motor contractions. Aust N  Z J Surg 1986; 56:147–151. 164. Marzio L, Neri M, Capone F, Di Felice F, De Angelis C, Mezzetti A, Cuccurullo F. Gallbladder contraction and its relationship to interdigestive duodenal motor  activity in normal human subjects. Dig Dis Sci 1988; 33:540–544. 165. Qvist N, Oster Jorgensen E, Rasmussen L, Kraglund K, Pedersen SA. The relationship between gallbladder dynamics and the migrating motor complex in  fasting healthy subjects. Scand J Gastroenterol 1988; 23:562–566. 166. Nilsson BI, Svenberg T, Tollstrom T, Hellstrom PM, Samuelson K, Schnell PO. Relationship between interdigestive gallbladder emptying, plasma motilin and  migrating motor complex in man. Acta Physiol Scand 1990; 139:55–61. 167. Scott RB, Strasberg SM, El­Sharkawy TY, Diamant NE. Regulaton of the fasting enterohepatic circulation of bile acids by the migrating myoelectric complex in  dogs. J Clin Invest 1983; 71:644–654. 168. Takahashi I, Dodds WJ, Hogan WJ, Itoh Z, Baker K. Effect of vagotomy on biliary­tract motor activity in the opossum. Dig Dis Sci 1988; 33:481–489.

  

Page 62

169. Ao YF. Contractile function of the gallbladder after gastrectomy. Chung Hua Wai Ko Tsa Chih 1990; 28:386–389, 444. 170. Takahashi T, May DO. Cholinergic dependence of gallbladder response to cholecystokinin in the guinea pig in vivo. Am J Physiol 1991; 261:G565–G569. 171. Nino Murcia M, Burton D, Chang P, Stone J, Perkash I. Gallbladder contractility in patients with spinal cord injuries: a sonographic investigation. Am J  Roentgenol 1990; 154:521–524. 172. Tandon RK, Jain RK, Garg PK. Increased incidence of biliary sludge and normal gallbladder contractility in patients with high spinal cord injury. Gut 1997;  41:682–687. 173. Conte VP. Normal neuronal features of the human gallbladder and structural changes in cholelithiasis patients. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo 1989;  44:211–213. 174. Plevris JN, Harrison DJ, Bell JE, Bouchier IAD. The immunocytochemical characteristics of human gall bladder innervation. Eur J Gastroenterol Hepatol 1994;  6:151–158. 175. McKirdy ML, Johnson CD, McKirdy HC. Inflammation impairs neurally mediated responses to electrical field stimulation in isolated strips of human gallbladder  muscle. Dig Dis Sci 1994; 39:2229–2234. 176. Moody FG, Haley­Russell D, Li YF, Husband KJ, Weisbrodt NW, Dewey RB. The effects of lithogenic bile on gallbladder epithelium. Ann Surg 1989;  210:406–415, discussion 415–416. 177. Conter RL, Washington JL, Liao CC, Kauffman GLJ. Gallbladder mucosal blood flow increases during early cholesterol gallstone formation. Gastroenterology  1992; 102:1764–1770. 178. Sanabria JR, Upadhya A, Müllen B, Harvey PRC, Strasberg SM. Effect of deoxycholate on immunoglobulin G concentration in bile: studies in humans and pigs.  Hepatology 1995; 21:215–222. 179. Stolk MFJ, van de Heijning BJM, van Erpecum KJ, Verheem A, Akkermans LMA, vanBerge­Henegouwen GP. Effect of bile salts on in vitro gallbladder  motility: preliminary study. Ital J Gastroenterol 1996; 28:105–110. 180. Shaffer EA, Bomzon A, Lax H, Davison JS. The source of calcium for CCK­induced contraction of the guinea­pig gallbladder. Regul Pept 1992; 37:15–26. 181. Xu QW, Shaffer EA. The influence of bile salts on small intestinal motility in the guinea pig in vitro. Gastroenterology 1992; 103:29–35. 182. Bomzon A, Ljubuncic P. Bile acids as endogenous vasodilators. Biochem Pharmacol 1995; 49:177–183. 183. Berr F, Pratschke E, Fischer S, Paumgartner G. Disorders of bile acid metabolism in cholesterol gallstone disease. J Clin Invest 1992; 90:859–868. 184. Shoda J, He BF, Tanaka N, Matsuzaki Y, Osuga T, Yamamori S, Miyazaki H, Sjovall S. Increased deoxycholate in supersaturated bile of patients with  cholesterol gallstones disease and its correlation with de novo syntheses of cholesterol and bile acids in liver, gallbladder emptying, and small intestinal transit.  Hepatology 1995; 21:1291–1302. 185. Hussaini SH, Maghsoudloo M, Murphy GM, Petit R, Wass JAH, Dowling RH. Octreotide (OT) increases the proportion of deoxycholic acid in gallbladder  (GB) bile­the prime mover in the pathogenesis of octreotide­induced gallbladder stones (GBS)? (abstr). Gut 1992; 33:57S. 186. Xu QW, Scott RB, Tan DTM, Shaffer EA. Slow intestinal transit: a motor disorder contributing to cholesterol gallstone formation in the ground squirrel.  Hepatology 1996; 23:1664–1672. 187. Portincasa P, Di Ciaula A, Palmieri V, Velardi A, Van Berge­Henegouwen GP, Palasciano G. Tauroursodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid and gallbladder  motility in gallstone patients and healthy subjects. Ital J Gastroenterol 1996; 28:111–113. 188. Sylwestrowicz TA, Shaffer EA. Gallbladder function during gallstone dissolution: effect of bile acid therapy in patients with gallstones. Gastroenterology 1988;  95:740–748. 189. van Erpecum KJ, vanBerge­Henegouwen GP, Stolk MFJ, Hopman WP, Jansen JB, Lamers CBHW. Effects of ursodeoxycholic acid on gallbladder contraction  and cholecys­

  

Page 63

tokinin release in gallstone patients and normal subjects. Gastroenterology 1990; 99:836–842. 190. Williams CN. Bile acid metabolism and the liver. Clin Biochem 1976; 9:149–152. 191. Strom BL, West SL. The epidemiology of cholesterol gallstone disease. In: Cohen S, Soloway RD, eds. Gallstones. New York: Churchill Livingstone, 1985, pp  1–26. 192. Attili AF, Casale R, Di Lauro G, Festuccia V, Natali L, Pasqualetti P. Assessment of gallbladder motility in patients with alcoholic hepatic cirrhosis after a fatty  meal: a real­time ultrasonography study. Minerva Gastroenterol Dietol 1992; 38:45–48. 193. Severi C, Grider JR, Makhlouf GM. Identification of separate bombesin and substance P receptors on isolated muscle cells from canine gallbladder. J  Pharmacol Exp Ther 1988; 245:195–198. 194. Poston GJ, Singh P, Maclellan DG, Yao CZ, Uchida T, Townsend CM, Jr, Thompson JC. Age­related changes in gallbladder contractility and gallbladder  cholecystokinin receptor population in the guinea pig. Mech Ageing Dev 1988; 46:225–236. 195. Pomeranz IS, Davison JS, Shaffer EA. Direct determination of the contractility of the guinea pig gallbladder: a new in vivo model. Can J Physiol Pharmacol  1985; 63:1038–1042.

  

Page 65

4—  Canalicular Lipid Secretion James M. Crawford University of Florida College of Medicine, Gainesville, Florida I—  Introduction Bile is the primary excretory route for organic compounds whose water solubility is insufficient for elimination in urine. The primary organic constituents of bile are  shown in Table 1. Hepatic secretion of bile salts, phospholipids, and cholesterol into bile forms the basis for elimination of excess cholesterol and a wide variety of  endogenous and exogenous amphiphilic and hydrophobic compounds from the body. Bile salt secretion per se is necessary for promoting lipid digestion in the gut. The  coordinated secretion of bile salts, phospholipids, and cholesterol occurs at the hepatocyte canalicular membrane. This process is the result of molecular gradients  established by hepatocellular proteins, followed by the inexorable operation of biophysical principles governing the behavior of these three classes of compounds. In  this chapter, the structural and physical principles governing biliary lipid secretion are reviewed. II—  The Bile Canaliculus A—  The Hepatocyte In the mammalian liver, hepatocytes make up approximately 85% of all cells and are organized into cribriform, anastomosing sheets or ''plates" of hepatocytes  surrounded on two sides by the vascular sinusoids. Between abutting hepatocytes are bile canaliculi—channels 1 to 2 µm in diameter formed by grooves in the plasma  membranes of adjoining hepatocytes. Canaliculi are delineated from the vascular space by tight junctions running parallel to the axis of the bile canaliculi between  abutting hepatocytes. The plasma membranes of the bile canaliculus define the apical pole of hepatocytes; the entirety of the plasma membrane on the vascular side of the tight junctional  network is termed basolateral. Each hepatocyte possesses multiple apical canalicular domains (typically three) reflecting the multiple interfaces between hepatocytes  and their neighbors (1). Numerous hepatocellular microvilli protrude into the canalicular space (Fig. 1). Including the microvilli, the area of the canalicular plasma  membrane makes up about 12% of total surface area of the hepatocellular plasma membrane (1). When microvillar surface area is included, this amounts to an  astounding surface area of 760 cm2/cm3 of liver volume (2), equivalent to over 100 m2 in one human liver. (This is compared to 240 m2 of apical surface membrane  area in the human small intestine.) There frequently is a portion of the apical plasma membrane that laps over the tight junctional region of each cellular interface; this  appears as a flattened microvillus in cross­sectional images of canaliculi, yet it actually appears to be an intermittently continuous

  

Page 66 Table 1 Organic Solutes in Human Bile Solute

Concentration (mg/dL)

Bile salts

150–3500

Comment Amphiphilic steroid detergents

Phospholipid

28–810

Membrane phospholipid

Cholesterol

60–320

Water­insoluble steroid

Bilirubin conjugates

50–200

Water­soluble tetrapyrrole

Protein

 

  80

Water­soluble protein

<5

Water­soluble proteins

Lysosomal proteins

<5

Water­soluble proteins

Canalicular membrane proteins

6

Intrinsic membrane proteins

Plasma proteins­albumin, other

 

marginal ridge (3). Although not proven, it is tempting to speculate that this marginal ridge provides flap­valve resistance to backflow of fluid into the vascular space.  Intracellular actin and myosin filaments arranged circumferentially around the canaliculus help propel secreted bile along the canaliculi. The canalicular channels constitute the outermost reaches of the biliary tree; in the rat, they represent 0.22% of liver volume (2). Canalicular channels between  hepatocytes in the perivenular region of the hepatic parenchyma are the most upstream, farthest from inflowing blood (via the portal vein and hepatic artery radicles  within portal tracts) and farthest from outflowing bile (via portal tract interlobular bile ducts). Each anastomosing canalicular network spans a linear distance of  between 0.5 to 1.0 mm, which is the distance between terminal hepatic venules and portal tracts in the mammalian liver. The canalicular channels merge en route to the periportal region of the hepatic parenchyma, ultimately entering intermediate channels termed canals of Hering (Fig. 2).  Canals of Hering are transitional channels, composed of abutting hepatocytes and small bile duct cholangiocytes. The canals of Hering extend out from interlobular bile  ducts into the parenchyma, penetrating approximately one­third of the distance between portal tracts and effluent hepatic venules (4). Canals of Hering then coalesce,  penetrate the mesenchyme of the portal tract, and link up with interlobular bile ducts. On the basis of three­dimensional reconstruction of normal

Figure 1 Schematic of the apical surface of a hepatocyte. A small portion of the hepatocellular apical membrane is depicted, showing the tight junctions delimiting the canalicular surface from the lateral cellular surface and microvilli protruding into the canalicular lumen. An abutting hepatocyte forms the other half of the channel. The pericanalicular actin microfilament web is depicted; this plays a role in canalicular contractility.

  

Page 67

Figure 2 Schematic of canalicular microanatomy in the hepatic lobule. Bile canalicular channels between hepatocytes (far more than depicted) anastomose to enter into canals of Hering, which drain into interlobular bile ducts within portal tracts. Canals of Hering extend up to one­third of the distance between  portal tracts and terminal hepatic venules.

human liver, canaliculi feed into canals of Hering over an average radial sector of about 70 to 90° (5). The canals, in turn, are arranged around the interlobular bile duct  in roughly 10­µm steps. Although it is not yet known whether there is a random or spiral arrangement of the canals of Hering, the repeat distance for each canalicular  network is likely to be on the order of every 50 to 100 µm. Latex injection studies indicate that canals of Hering are accompanied by penetrating terminal venules of  the portal vein system (6). It therefore may be posited that the blood supply to the hepatic parenchyma is linked on a microscopic scale to the watershed for bile  formation. This concept is formalized in the termed cholehepaton (6), which denotes the smallest parenchymal unit responsible for hepatocellular metabolic function  and bile formation. B—  Structural Lipid Although there may be some contribution of epithelial cells lining the biliary tree to secretion and absorption of bile salts (7), hepatocytes are solely responsible for the  entry of phospholipid and cholesterol into bile. As biliary lipid must therefore enter bile from the canalicular pole of the hepatocyte, it is important to consider the  assembly of the canalicular plasma membrane. The physical structure of the hepatocyte canalicular membrane is unique in mammalian biology, in that it contains the highest mole per liter of cholesterol and  sphingomyelin and is the least fluid of cellular membranes (8). This renders the canalicular membrane highly resistant to the detergent action of bile salts within the  canalicular space. Phosphatidylcholine is the major glycerophospholipid in the canalicular membrane, along with lesser amounts of phosphatidylethanolamine,  phosphatidylserine, and phosphatidylinositol (Table 2). The molar ratios of cholesterol/phospholipid (0.70) and sphingomyelin/phosphatidylcholine (0.75) are higher  than in any other hepatocellular membrane. Cholesterol binds with strong affinity to sphingomyelin, imparting a high resistance to detergent dissolution. As  sphingomyelin is present in both hemileaflets of the canalicular membrane, interdigitation of the disparate acyl moieties of

  

Page 68 Table 2 Lipid Composition of Canalicular Membrane and Bile

 

  Species

% Molar composition Canalicular  membrane

Trivial name

Bile

PC

Phosphatidylcholine

 

35.5

90.0

PE

Phosphatidylethanolamine

 

23.8

4.4

 

PS

Phosphatidylserine

 

11.2

1.2

 

PI

Phosphatidylinositol

 

4.4

1.4

 

SPH

Sphingomyelin

 

22.1

2.7

Lipid classes

 

 

 

a

 

Class

 

 

C16:0

Palmitic acid

16:0/16:0

2.3

Trb

C16:1

Palmitoleic acid

16:0/16:1

0.6

0.6

 

C18:0

Stearic acid

16:0/18:0

0.4

 

C18:1

Oleic acid

16:0/18:1

6.9

8.2

 

C18:2

Linoleic acid

16:0/18:2

19.7

53.7

 

C20:0

Arachidic acid

16:0/20:4

16.2

14.7

 

C22:0

Behinic acid

16:1/18:2

0.5

0.5

 

C24:0

Lignoceric acid

18:0/18:1

1.1

0.3

 

C20:4

Arachidonic acid

18:0/18:2

15.0

9.9

18:0/20:4

18.7

2.7

18:1/18:2

2.5

2.2

15.6

7.0

Phosphatidylcholine fatty acyl species

 

>C20:4 Polyunsaturated fatty acids

 

 

 

 

a

(polyenes)

 

polyenes

Tr

 

Refers to fatty acyl groups in positions sn­1/sn­2. Tr = trace.  Source: Adapted from Refs. 76, 154, and 193. b

the sphingomyelin between the hemileaflets is possible. This, combined with the high cholesterol content, renders the canalicular membrane highly shear­resistant as  well. The localization of sphingomyelin is significant, in that sphingomyelin is located predominantly in the external hemileaflet of the bilayer (9). In most eukaryotic cells,  plasma membrane cholesterol is located mostly on the inner hemileaflet of the plasma membrane. However, since cholesterol exhibits a stronger affinity for  sphingomyelin­rich plasma membranes than other cellular membranes (10), one might suspect that cholesterol and sphingomyelin directly interact in the external  hemileaflet of the canalicular membrane. While we must state that the precise localization of cholesterol in the canalicular membrane is unknown, the canalicular  membrane is poised to place high quantities of cholesterol in direct contact with the canalicular lumen. A further consideration is the potential existence of cholesterol­rich and cholesterol­poor microdomains (10,11). Within a sphingomyelin:cholesterol­rich membrane,  the formation of microdomains of more fluid lipid within this plasma membrane bilayer is possible. Stable microdomains of fluid phosphatidylcholine can be formed at  25°C. As will be seen, the formation of transient but unstable microdomains at the physiological temperature of 37°C may be a critical step in enabling biliary lipid  secretion. Any excess cholesterol not bound by sphingomyelin within the surrounding bilayer will be capable of diffusing into the cholesterol­poor fluid microdomains.  This may have relevance to the efflux of cholesterol into bile and is discussed further on. There are four potential mechanisms for the delivery of structural membrane lipids to the canalicular membrane (12,13): (a) vesicular traffic, (b) monomeric exchange  through the

  

Page 69

action of cytosolic proteins, (c) lateral diffusion from the basolateral plasma membrane, and (d) transbilayer movement of lipid molecules between hemileaflets of the  canalicular membrane. Only the general features of hepatocellular membrane trafficking are known; the specifics of lipid delivery to the canalicular membrane of the  hepatocyte have not been worked out. There is an extensive and growing literature describing the vesicular trafficking of membrane proteins to the canalicular pole (14); structural lipid is a necessary  accompaniment of such traffic. Vesicle­mediated transcytosis from plasma to bile of bulk fluid and of proteins, such as albumin and IgA, necessitates the movement of  considerable amounts of membrane lipid from the basolateral to canalicular pole of the hepatocyte. Based on published quantitative data (15,16), one can calculate  that vesicles insert membrane lipid equivalent to 9% of the surface area of the canalicular membrane every minute (17). Such rates of delivery necessitate a robust  membrane retrieval mechanism, which is plausible given evidence for the presence of active canalicular membrane transporters in subapical vesicles (18). Membrane  retrieval must be highly selective, however, since the membrane proteins dipeptidyl peptidase IV and HA4 (an ectoATPase) are effectively retained within the  canalicular membrane, being retrieved for intracellular degradation at the rate of approximately 6 to 7% per day (19). The actual lipid composition of these intracellular  vesicles is not precisely defined, but they do not appear to be enriched in biliary phosphatidylcholines or in cholesterol. However ill defined, to date vesicular delivery of structural lipid appears to be the only mechanism operative for maintaining bulk canalicular membrane composition. A  case in point is the delivery of sphingomyelin. Studies with many cell types have provided extensive evidence that sphingomyelin is synthesized predominantly in the  Golgi apparatus (20,21) and delivered to the plasma membrane in sphingomyelin­containing vesicles (reviewed in Refs. 22 to 24). Notably, sphingomyelin is delivered  to the plasma membrane at rates comparable to protein delivery (t 1/2 = 20 to 30 min) (25), suggesting similar mechanisms of vesicular sorting and trafficking. In other  polarized cell types, delivery of sphingomyelin­containing vesicles to the apical pole is partially microtubule­dependent (26), implicating both vesicle­mediated  trafficking and other delivery mechanisms. Intriguing support for alternative pathways comes from the observation in CaCo­2 intestinal cells that disruption of protein  trafficking from the Golgi apparatus to the plasma membrane by either monensin or Brefeldin A did not abrogate sphingomyelin delivery but rather abolished specific  sorting mechanisms, leading to increased apical content of sphingomyelin following Brefeldin A treatment (26). In rat hepatocytes, while monensin and Brefeldin A  treatment completely disrupted protein transport from the Golgi apparatus, they did not disrupt sphingomyelin delivery (27). However, because isolated rate  hepatocytes do not retain their polarity, these experiments could not distinguish between basolateral and canalicular delivery mechanisms. Thus, the specifics of  sphingomyelin delivery to the canalicular membrane of hepatocytes remain unknown, although the use of new polarized cell systems (28) and techniques to identify  relevant proteins (29) may permit progress in this area. Vesicular trafficking of lipid does not account for the delivery of biliary phosphatidylcholine. First, despite evidence for assembly of biliary phosphatidylcholines in the  endoplasmic reticulum, no subcellular vesicle populations of these lipids have been identified (30). Second, biliary phosphatidylcholines are derived from the  endoplasmic reticulum (31,32) rather than from transcytosis of basolateral plasma membrane lipids. Third, the transport of newly synthesized phosphatidylcholine from  the endoplasmic reticulum to the plasma membrane is extremely rapid (t 1/2 < 1 min) and is ATP­independent and insensitive to inhibitors that disrupt protein traffic  (22). In contrast, monomeric exchange of lipid between cytosolic proteins and the canalicular membrane appears to have no role in the maintenance of canalicular structure  but may be critical for delivery of biliary phospholipid. As will be seen, transbilayer movement of such phospholipid then presents the appropriate molecules to the bile  canalicular lumen. Lateral diffusion presents an interesting dilemma in that tight junctions present a barrier to diffusion within the external hemileaflet but not the internal  hemileaflet (33). For structural phospholip­

  

Page 70 Table 3 Protein Content of Hepatocellular Membranes and Bile Organelle Protein mass (%)

Molecules of protein:  molecules of phospholipid

Endoplasmic reticulum

70%

1:23

Golgi apparatus

50%

1:40

Intracellular vesicles

25%

1:70

Canalicular membrane

45%

1:43

Bile

< 1%

1:>4000

ids, no evidence has been presented to suggest that lateral diffusion from basolateral to apical domains plays a role in maintaining canalicular membrane structure. As  discussed below, lateral diffusion may be critical for the delivery of sterol to bile. Consideration must also be given to the protein content of the hepatocyte canalicular membrane. As shown in Table 3, lipid membranes of the hepatocyte contain high  percentages of intrinsic protein. The endoplasmic reticulum, for example, is virtually saturated with protein at 70% protein (g protein/100 g). The canalicular membrane  is 45% protein, including many of the critical transport proteins for the secretion of biliary solutes (see Table 4). Notable is the extremely low content of canalicular  membrane proteins in bile. As discussed subsequently, the high rate of lipid secretion on the one hand and very low rate of membrane protein release on the other must  be accomplished by a highly selective mechanism. III—  Biliary Lipids A—  Bile Salts Bile acids are amphiphilic, detergent­like molecules synthesized in the liver from cholesterol (34). They possess one, two, or three hydroxyl groups on the steroid  moiety and a 5­carbon side chain that terminates in a carboxyl group. Hepatic amidation of the carboxyl group with the amino acids taurine or glycine converts these  molecules from free acids with a titratable carboxyl group to bile salts, which remain charged at physiological pH. The water solubility is thereby increased, enabling  bile salts to be extremely effective solubilizing agents within the Table 4 Proteins in the Human Hepatocyte Canalicular Membrane Pertinent to Biliary  Lipid Secretion Solute

Transport protein

Bile salts

BSEP: bile salt export pumpa

Phosphatidylcholine

MDR3: multi­drug­resistance P­ glycoprotein

Cholesterol

unknown

Chromosomal location 2q36 37q21

  b

Organic anions

MRP2: multi­drug­resistance protein

10q24

Amphiphilic basic or  cationic compounds

MDRI: multi­drug­resistance P­ glycoprotein

17q21

  BSEP; also referred to as sister gene of P­glycoprotein, or SPGP. MRP2; also known as canalicular multispecific organic anion transporter, or CMOAT.  Source: Based on Muller M, Jansen PLM. The secretory function of the liver: new  aspects of hepatobiliary transport. J Hepatol 28:344–354, 1998. a

b

  

Page 71

biliary tree and gut lumen. Their effectiveness as detergents also presents a danger: excessive accumulation of bile salts may have severe local consequences, since  these molecules are capable of disrupting lipid structure in cellular membranes as well (35). The synthesis of bile acids from cholesterol itself involves about 20 different  enzymes distributed among the endoplasmic reticulum, cytosol, mitochondria, and peroxisomes, as addressed elsewhere in this volume. Physiological conservation of bile salts is accomplished by the enterohepatic circulation, whereby intestinal reabsorption of bile salts (primarily in the ileum) returns bile  salts to the liver via the splanchnic circulation (36). Thus, the majority (>95%) of bile salts secreted into bile are taken up across the basolateral plasma membrane of  the hepatocyte from the sinusoidal space; the small remainder is derived from de novo hepatic synthesis. Bile salt uptake across the basolateral plasma membrane of  the hepatocyte is concentrative in that intracellular bile salt concentrations appear to be three­ to fourfold greater than in the 10­ to 50­ M concentrations found in  plasma (37,38). Uptake into the mammalian liver occurs primarily via a 49­kDa Na+/bile salt cotransporter [designated Ntcp (39); step la in Fig. 3], which utilizes the  sodium gradient established by the basolateral Na+, K+­ATPase. A phylogenetically older, Na+­independent transporter for bile salts may also be operative to some  extent in the mammalian liver, particularly in the immature individual (40). For the small portion of bile salts that is unconjugated in the gut by bacterial action and  returned to the liver as free bile acids and for bile salts that are less hydrophilic than the trihydroxycholates, diffusion across the basolateral plasma membrane bilayer  accounts for a portion of hepatocellular uptake (41). Following hepatocellular bile salt uptake from plasma, bile salts are avidly bound by cytosolic proteins (Fig. 3, step 1b) (42). The predominant binding proteins appear  to be 3 ­hydroxysteroid dehydrogenase in the rat (43) and a related protein, dihydrodiol dehydrogenase in the human (44). These cytosolic proteins are members of  a monomeric reductase gene family (44). Inhibition of bile salt binding to 3 ­hydroxysteroid dehydrogenase by indomethacin in the rat delays bile salt delivery to bile  (45–47), suggesting that binding to cytosolic protein facilitates rather than retards delivery to the canalicular membrane. Bile salts are known to interact with  intracellular organelles (48–53). They may even be transported into the lumina of the endoplasmic reticulum or trafficking vesicles through the action of a protein  transporter (54), in keeping with observations in other cell systems (55). Although a role for vesicular trafficking of bile salts was proposed some years ago (56), the  primary and perhaps only route of bile salt delivery to the canalicular pole of the hepatocyte appears to be cytosolic diffusion of protein­bound bile salts, with  reversible but nonvectorial interactions of bile salts with intracellular membranes (17). Information is not available on whether diffusion of either free bile salt monomers  or bile salt­protein complexes is potentially rate­limiting for transcellular transport, as has been implicated for other small molecules such as 3,5,3'­triiodothyronine  (57), dextrans (58), and fatty acids (59). B—  Phospholipids More than 90% of biliary phospholipid is phosphatidylcholine, in contrast to the lipid composition of the canalicular membrane (Table 2). A contrast holds also for the  fatty acyl species of the canalicular membrane and biliary phospholipid. Unlike the canalicular membrane, which contains a broad mixture of fatty acyl species (Table  2), biliary phosphatidylcholines are predominantly composed of palmitic, linoleic, and stearic acids, with palmitic (80%) or stearic (20%) acids esterified in the sn­1  positions and linoleic, oleic, and arachidonic acids (in rank order) in the sn­2 position (60). The biliary phospholipid species are more hydrophilic than the bulk lipids in  the canalicular membrane (34) and are more susceptible to elution from the membrane by bile salts (61). Moreover, phosphatidylcholine and sphingomyelin are  preferentially located in the exoplasmic hemileaflet of the canalicular membrane, phosphatidylethanolamine is evenly distributed, and phosphatidylserine and  phosphatidylinositol are exclusively in the endoplasmic hemileaflet (62). Any proposed mechanisms for delivery of biliary phos­

  

Page 72

Figure 3 Routes for bile salt (1), phosphatidylcholine (2), and cholesterol (3) delivery to bile. Bile salts are  taken up across the basolateral membrane via the sodium­dependent bile salt transporter, ntcp  (step 1a), and bind to intracellular proteins (step 1b). Delivery to the canalicular membrane is primarily via diffusion while bound to protein. Free bile salts are excreted into bile as monomers by specific transporters (step 1c). Biliary­type phosphatidylcholine appears to be delivered from  the endoplasmic reticulum primarily via binding to phosphatidylcholine transfer protein (PC­TP,  step 2a); a role for vesicular trafficking through the Golgi apparatus (step 2b), followed by apical vesicle trafficking (step 2c), cannot be excluded. Biliary cholesterol is derived primarily from cholesterol ester in the lipid core and free cholesterol in the surface monolayer of circulating lipoproteins. Lipoproteins such as LDL enter the cell via receptor­mediated endocytosis (step 3a,  see inset, which depicts the molecular structure of LDL). Lysosomal degradation of the lipoproteins releases free cholesterol, which may transfer to the canalicular plasma membrane by binding to cytosolic proteins such as sterol carrier protein 2 (SCP­2, step 3b). Alternatively, intracellular  distribution to the Golgi network (step 3c) may permit vesicular trafficking with sphingomyelin­rich  vesicles (step 2c). In the case of HDL, binding to the SR­BI scavenger receptor (not shown)  permits exchange of free cholesterol and cholesteryl esters to the basolateral plasma membrane (step 3d, see inset). Following the hydrolysis of cholesteryl esters by hepatic lipase, the free cholesterol may flip to the internal hemileaflet and diffuse laterally past the tight junctional region for entry into the canalicular plasma membrane domain. Intracellular structures and inset are drawn to scale. Bar = 2  m. Inset, bar = 2 nm.

pholipids to the canalicular membrane must be consistent with these striking differences in phospholipid classes and distribution between the canalicular membrane and  bile. Hepatic phosphatidylcholines may be derived from several sources: uptake of exogenous phospholipids from circulating lipoproteins; de novo synthesis via acylation of  glycero­3­phosphate to phosphatidic acid, dephosphorylation to form diglyceride, and reaction with CDP­choline to form phosphatidylcholine (the Kennedy  pathway), headgroup remodeling of existing glycerophospholipids, and deacylation of triglycerides to provide diglycerides. With the exception of one report (63),  exogenous phospholipids contained in circulating lipoproteins do not appear to contribute significantly to biliary phospholipids. [Liposomal phosphatidylcholines

  

Page 73

injected into the circulation as a pharmaceutical measure also are extensively degraded and altered by hepatocytes (64).] Synthesis of phosphatidylcholine de novo is  quantitatively small and contributes only about 3% to biliary phosphatidylcholine output (65) unless phosphatidylcholine synthesis is stimulated by experimental infusion  of biliary­type free fatty acids (66). Remodeling of other glycerophospholipids—such as N­methylation of phosphatidylethanolamine, base exchange, or  transesterification of lysolecithin—is not a significant contributor to biliary phosphatidylcholine synthesis (67). Rather, utilization of existing acylglycerides within the endoplasmic reticulum is the primary route for hepatic phosphatidylcholine synthesis (32). In particular,  deacylation of triglycerides is the major source of biliary phosphatidylcholine molecules (67). Endogenous hepatocellular stores of triglycerides appear to be sufficient,  since biliary phosphatidylcholine secretion is maintained in the absence of lipoprotein lipids. Compartmentation of biliary phosphatidylcholines within subcellular  membranes does not appear to be operative (67). Instead, subselection of phosphatidylcholines for delivery to the canalicular membrane appears to occur at the level  of intracellular trafficking. An answer to the enigma of how biliary phosphatidylcholines are delivered to the canalicular membrane in a highly specific bile salt­stimulated fashion has been  proposed by Cohen and colleagues (68). Phosphatidylcholine­transfer protein (PC­TP) is an abundant cytosolic protein, and generally is thought to promote  bidirectional molecular exchange between membranes (69). Cohen et al. demonstrated that PC­TP is highly efficient in the unidirectional transfer of  phosphatidylcholine molecules from model membranes of lipid composition matching that of the endoplasmic reticulum to model membranes mimicking the canalicular  membrane (Fig. 3, step 2a) (68). The transfer process is relatively specific for biliary­type phosphatidylcholine molecules. Moreover, it is markedly stimulated by the  presence of bile salts at the low micromolar concentrations thought to exist within the hepatocyte (step 1b). Realistic calculations indicate that PC­TP­mediated transfer can account for all the biliary phosphatidylcholine present in bile. An additional cytosolic lipid­binding  protein, sterol carrier protein 2 (SCP­2), may play a scavenger role in phosphatidylcholine delivery (70). While vesicular delivery of biliary­type phosphatidylcholine  via the Golgi apparatus may yet be operative (Fig. 3, steps 2b and 2c), transfer via PC­TP constitutes an attractive hypothesis for the highly efficient delivery of biliary­ type phosphatidylcholine molecules to the canalicular membrane. C—  Cholesterol In humans, daily dietary intake of cholesterol is estimated to be 0.3 to 0.5 g/day, and daily biosynthesis (much of it in the liver) is between 0.6 to 0.9 g/day, for a total  input of about 1.2 g/day (71). The predominant means by which the body eliminates excess cholesterol is via secretion into bile, either as free cholesterol or as bile  acids. Fecal loss of bile acids alone accounts for 0.2 to 0.6 g/day in humans (36), and biliary cholesterol secretion accounts for an additional 0.6 g/day. Sloughing of  the skin (0.085 g/day) and use for steroid hormone biosynthesis (0.05 g/day) round out the balance sheet (71). These numbers are given to make clear the importance  of the liver in general and the hepatocyte canalicular membrane in particular for maintenance of cholesterol homeostasis. Without effective mechanisms to eliminate  both bile salts and cholesterol in bile, our mammalian existence would crumble into atherosclerotic oblivion. The solubility of cholesterol in water is vanishingly small. As bile is an aqueous fluid, cholesterol must be solubilized by other agents. Bile salts alone increase the  aqueous solubility of cholesterol severalfold. The combined action of bile salts and phosphatidylcholine increases cholesterol solubility over a millionfold (72). Thus, it  is a biological tour de force that the canalicular membrane is capable of immense rates of secretion of monomeric bile salts (12 to 36 g/day in humans) (8); that bile salt  secretion "pulls" vesicles of phospholipid, presumably composed of phosphatidylcholine, out of the explasmic face of the canalicular membrane (73)

  

Page 74

at rates of 4 to 12 g/day (see below); and that these two processes permit the solubilization of cholesterol in bile and its effective elimination from the body at rates of  up to 0.6 g/day. It is no surprise that excess rates of cholesterol secretion predispose to its precipitation as cholesterol gallstones (74). Cholesterol is found almost exclusively in cell membranes. Despite the fact that intracellular membranes in the hepatocyte (particularly the endoplasmic reticulum and  mitochondria) possess a surface area 20­fold greater than that of the plasma membrane (1), 80% of cholesterol is in the plasma membrane (75). In the basolateral  membrane, the molar ratio of cholesterol to phospholipid is 0.41. It is 0.76 in the canalicular membrane (76), giving this membrane the highest molar content of any  hepatocyte membrane fraction. Cholesterol has a high affinity for membranes rich in sphingomyelin (10,77,78), and the sphingomyelin content of the canalicular  membrane also is higher than that of any other heptaocellular membrane (molar ratio 0.62 in the canalicular membrane and 0.25 in the basolateral membrane) (8). As  the canalicular domain of the hepatocyte occupies only 13% of the total plasma membrane surface area of the hepatocyte (1), most cholesterol still resides in the  basolateral plasma membrane. Nevertheless, the unique lipid composition of the canalicular membrane is in keeping with its key role in the elimination of cholesterol  into bile. As discussed below, most of the cholesterol secreted into bile is derived from circulating plasma lipoproteins (22,79), principally low­density lipoprotein (LDL),  intermediate­density lipoprotein (IDL), high­density lipoprotein (HDL), and chylomicron remnants, in that order (34). Newly synthesized cholesterol does not  contribute substantively to biliary cholesterol secretion (80,81). However, for that cholesterol which is newly synthesized in the liver, a greater proportion is secreted  into bile than into plasma (82). Lipoprotein cholesterol exists either as free cholesterol in the outer phospholipid monolayer or as cholesterol esters within the triglyceride core (83). Receptor­ mediated endocytosis appears to be the primary mechanism for uptake of LDL lipid and apoprotein (Fig. 3, step 3a); this cholesterol is largely reesterified for  secretion back into plasma as VLDL (84). Lysosomal hydrolysis of lipoprotein cholesteryl esters also generates free cholesterol (10,85,86). Rapid transit to the  basolateral and apical plasma membranes (75) implicates cytosolic trafficking via binding proteins, similar to that seen for phosphatidylcholine. A strong candidate is  sterol carrier protein­2 (SCP­2) (Fig. 3, step 3b) (87–89); this particularly may play a role for cholesterol delivery to bile (90). Trafficking via membranes (10),  including an as yet ill­defined sterol­rich organelle (91), has also been proposed. In particular, the synthesis of sphingomyelin within the Golgi apparatus (20,21) and its  delivery to the plasma membrane via vesicles (27,92,93) raises the possibility that cholesterol is preferentially delivered to the canalicular membrane via the Golgi  apparatus (Fig. 3, step 3c, followed by step 2c) in sphingomyelin­rich vesicles or membrane "rafts" (13,22–24,94,95). Cholesterol released from LDL degradation in  lysosomes does not appear to pass through the endoplasmic reticulum (10). As elucidated further on, plasma HDL may play a critical role in contributing cholesterol for biliary secretion. Free cholesterol and cholesteryl esters in HDL may  partition into the outer hemileaflet of the hepatocellular basolateral plasma membrane (Fig. 3, step 3d) (83,96–98). Cholesterol diffuses readily in the planar membrane  and may freely flip across the plasma membrane to the inner hemileaflet. From there, distribution among intracellular membranes occurs rapidly. Endogenously synthesized cholesterol is not likely to travel via vesicles, since inhibitors of vesicle trafficking, particularly microtubule inhibitors, do not affect its  movement (99). Endosomal recycling of sphingomyelin­rich membranes from the canalicular domain (24,95) may also act as scavengers for intracellular cholesterol, in  essence returning cholesterol that may have distributed to the cell interior to the plasma membrane (100). Considering that sphingomyelin synthesis can occur on the  inner hemileaflet of recycling endosomes (101), cholesterol might also reside on the inner hemileaflet and thereby be delivered to the canalicular membrane via  endosomal fusion in the correct topology for elution into bile. Despite the attractiveness of these various hypotheses for membrane trafficking of cholesterol, assiduous

  

Page 75

efforts to isolate cholesterol­carrying ''vesicles" from rat liver secreting excess amounts of cholesterol into bile have not been successful (102); a potential role for  intracellular delivery vesicles in humans has not been excluded (103). IV—  Lipid Secretion into Bile A—  Bile Salt Secretion into Bile Bile salts are secreted into the canalicular lumen against a considerable concentration gradient, which has been estimated at about 100­fold (38,104). The primary  transport protein is the bile salt export protein (bsep), formerly referred to as the "sister of P­glycoprotein" (spgp) (105). This is an ATP­independent transport protein  that is a member of the ABC­type transporter family. Physiological studies have demonstrated that canalicular membrane bile salt transport capacity mediated by this  protein is modulated by transhepatic bile salt flux. In humans, a 12­h fast followed by a meal leads to a two­ to sixfold increase in portal venous blood concentrations  and hepatic secretion of bile salts (106). In rats, exposure of the liver to increased bile salt flux increases the maximal hepatic secretory rate (107–109). While local  allosteric regulation may play some role (110), the major mechanism regulating canalicular membrane transport of bile salts is vesicular delivery of the relevant  transport proteins (17), presumably bsep. Apical membrane transport proteins appear to reside in a subapical storage/retrieval endocytic compartment (18,111).  Exposure of the liver to such stimuli as an osmotic load (112) or a bile salt load (113) stimulates the insertion of intracellular vesicles containing bile salt transport  proteins into the canalicular membrane; a decrement in bile salt flux leads to a decrease in transport capacity and protein content (113). The mechanisms for  upregulation appear to involve bile salt stimulation of cAMP­ and calcium­dependent intracellular signaling systems (114), with a possible additional role for direct  interaction of bile salts with hepatocellular membranes on the basis of hydrophobicity (115). B—  Phosphatidylcholine Secretion into Bile A hepatocellular delivery system for phosphatidylcholine utilizing cytoplasmic phosphatidylcholine transfer protein (PC­TP) will place phosphatidylcholine molecules  within the endoplasmic hemileaflet of the canalicular membrane (Fig. 4, steps 1a and 1b) (68). Although spontaneous "flipping" of phospholipid across membranes is  exceedingly slow (116), phospholipid translocase function has been identified both in microsomal (117) and canalicular membrane preparations (Fig. 4, step 2c)  (118). A major finding was the discovery that mice lacking the mdr2 P­glycoprotein gene product are essentially incapable of secreting phospholipid into bile (119).  Subsequent studies conclusively demonstrate that this P­glycoprotein acts as a phospholipid translocator (119–121). The mdr2 gene product may not be the only  mechanism for phospholipid translocation, as preliminary evidence has been presented that other gene products may play a similar role (122,123). Collectively, these  recent investigations implicate protein­mediated translocation of biliary phosphatidylcholine molecules from the endoplasmic to the exoplasmic hemileaflet of the  canalicular membrane as a key event in biliary phospholipid secretion (124). The next event in phospholipid secretion is thought to be one of two possibilities (Fig. 4): (a) the formation of vesicles budding from the external hemileaflet of the  canalicular membrane or (b) solubilization of phosphatidylcholine molecules from the external hemileaflet by bile salt micelles (125–127). The evidence for these two  possibilities is examined below. 1—  Vesicular Secretion Phospholipid vesicles are well documented in bile, both by ultrastructural and biophysical techniques (reviewed in Ref. 17). Reasoning that routine chemical fixation  was too slow to

  

Page 76

Figure 4 Schematic of canalicular phospholipid secretion, depicting (A) vesicular and (B) micellar secretion.  Intracellular bile salts interact with the endoplasmic reticulum membranes (step 1a), promoting the release of phosphatidylcholines and binding by cytosolic PC­TP (step 1b). PC­TP then deposits  individual molecules within the internal hemileaflet of the canalicular membrane (step 1c). The possibility of vesicular traffic via the Golgi apparatus (step 1d) has not been excluded. Regardless of delivery mechanism, the mdr2 P­glycoprotein "flips" phosphatidylcholine molecules from the  internal to the external hemileaflet (step 1e). Monomeric bile salts excreted into the lumen by specific transport proteins (step 2a) are capable of promoting vesiculation of biliary­type phosphatidylcholine  microdomains within the external hemileaflet of the canalicular membrane (panel A, step 2b). The zone of vesicle budding is 50% thicker than the surrounding canalicular membrane bilayer, but the molecular structure of this region is unknown. Alternatively, biliary­type phosphatidylcholines may  be extracted into mixed micelles (panel B, step 2c).

capture the vesiculation event, our laboratory prepared rat liver tissue for electron microscopy with an accelerated chemical fixation protocol and with ultrarapid in situ  cryofixation (73). By both techniques, phospholipid vesicles were present on the exoplasmic face of the canalicular membrane, and their presence was dependent  upon the cosecretion of physiological bile salts. A membrane barrier was always maintained, suggesting that bilayer exocytosis did not occur. Rather, a distinct zone of  fusion was observed between adherent vesicles and the canalicular membrane. Our findings are consistent with the hypothesis that phospholipid vesicles form from  microdomains of biliary­type phosphatidylcholine within the explasmic hemileaflet of the canalicular membrane (128). Quantitative estimates indicate that this  vesiculation mechanism can account for all phospholipid secreted into bile (73) and that this process elutes approximately 8% of the external hemileaflet surface area  into bile per minute (Fig. 5) (17). According to this hypothesis, three steps are required for canalicular phosphatidylcholine secretion: delivery to the canalicular membrane endoplasmic hemileaflet via  PC­TP­mediated cytosolic diffusion, protein­mediated translocation from the endoplasmic to the exoplasmic hemileaflet, and bile salt­dependent vesiculation of lipid  microdomains in the exoplasmic hemileaflet. This proposal is supported by physiological studies of two types. First, excessive secretion of amphiphilic organic anions  into the canalicular lumen along with bile salts "uncouples" phospholipid secretion from bile salt secretion [(129–132), see below]. This now appears to be due to the  binding of the cosecreted solutes with bile salts within the canalicular lumen, preventing bile salt back­extraction of phosphatidylcholine from the canalicular membrane  (30). Second, bile salt—induced secretion of phosphatidylcholine is enhanced by an in­

  

Page 77

Figure 5 Schematic of membrane dynamics at the canalicular pole of the hepatocyte. Transcytotic vesicular traffic, presumably passing through a subapical sorting compartment, delivers structural membrane lipid to the canalicular membrane at a rate of about 9% per minute (17). This vesicular traffic does not appear to contribute to biliary lipid secretion. Rather, deposition of phosphatidylcholine molecules via the action of PC­TP is involved, followed by proposed vesiculation  of the external hemileaflet of the canalicular membrane (see Fig. 4). Notably, the rate of phospholipid secretion into bile is computed as 8% of the external surface area of the canalicular membrane per minute (17).

creased intraluminal dwell time of bile salts (133) and by increased bile salt hydrophobicity (125). Considering that bile salts do not cross membrane bilayers (134),  secreted bile salts will interact only with phospholipids in the external hemileaflet. Finally, ultrastructural vesiculation of the canalicular membrane is present in wild­type  mice but is absent in mice lacking the mdr2 P­glycoprotein gene product (135). 2—  Micellar Extraction of Phospholipids Micellar solubilization of lipids from the hepatocyte canalicular membrane has long been suggested as the mechanism for biliary lipid secretion (126,136). Specifically,  luminal bile salts might induce the biliary secretion of lipids by direct solubilization of canalicular membrane lipids into mixed micelles (137). Evidence in favor of this  mechanism has been provided by studies in the secretory vesicle mutants of yeast, in which the mdr2 P­glycoprotein has been expressed (138). Phospholipid  translocation from the cytoplasmic to the luminal hemileaflet of isolated membrane vesicles is accomplished in an ATP­dependent fashion, in keeping with the  presumed function of the mdr2 P­glycoprotein. Importantly, the presence of the bile salt taurocholate within the lumen enhances mdr2 P­glycoprotein­dependent  translocation of phospholipid (139). As these isolated vesicles are no larger than 100 nm in diameter (P. Gros, personal communication, 1996), it is highly unlikely that  daughter vesicles could bud within the small interior space. Similar observations have been obtained with canalicular membrane vesicles isolated from rat liver (140);  again, the formation of daughter vesicles is highly unlikely. Rather, these data are interpreted as consistent with bile salt solubilization of phospholipid from the luminal  hemileaflet of the membrane vesicles in the form of mixed micelles. It is possible that both vesicular and micellar mechanisms of biliary lipid secretion may be operative simultaneously in vivo (120,124), as their operation ultimately will  be dictated by the physical properties of the canalicular membrane and the component lipid molecules in the membrane and in the biliary space. It remains unclear  whether micellization can achieve the specific extraction of biliary­type phospholipids and whether it is sufficiently rapid to explain the high rates of phospholipid  secretion. The phase behavior of biliary lipids at the

  

Page 78

low concentrations of bile salts present within the yeast secretory vesicles (about 55 to 63  M) dictates that vesicles, not micelles, will form under the experimental  conditions described (61,141). Moreover, the micellar secretion hypothesis is based on a single technique employing a fluorescent NBD­phosphatidylcholine analogue  (139,140). The vesicular secretion paradigm is supported not only by ultrastructural studies (73,135) but also by extensive biophysical studies of freshly secreted bile,  involving not only study of phosphatidylcholine secretion (61,142–144) but also of cholesterol secretion (145–147). 3—  Uncoupling of Phospholipid Secretion Regardless of whether a vesicular or micellar mechanism is operative for biliary phospholipid secretion (or whether both are involved), an interesting phenomenon of  lipid "uncoupling" from bile salt secretion can occur. Specifically, certain organic anions are able to inhibit the secretion of phospholipids and cholesterol dose­ dependently without influencing the secretion of bile salts (130). Only relatively hydrophilic organic anions induce uncoupling, and this effect is exerted only after their  secretion into the bile canaliculus (148). Thus, relatively hydrophilic organic anions—including ampicillin, bilirubin ditaurate, and sulfated taurolithocholate—inhibit  biliary phospholipid and cholesterol secretion; more hydrophobic organic anions such as indocyanine green and rose bengal do not. Interestingly, these physiological  effects correlate well with the high affinity of the hydrophilic organic anions for bile salt micelles (130,148). An attractive explanation for biliary lipid "uncoupling" is the proposal that organic anions secreted into the biliary space bind directly to luminal bile salts, thereby  preventing their micellization of canalicular membrane lipids by impairing the detergent activity of bile salts (149). This hypothesis was examined by Verkade et al.  (150) utilizing an in vitro system. Release of entrapped fluorescent carboxyfluorescein from small unilamellar vesicles composed of cholesterol/phosphatidylcholine was  examined as a function of medium bile salt and organic anion composition. Bile salt­induced release of fluorescence was reduced by certain organic anions. However,  the inhibitory effects did not correlate with the in vivo uncoupling effects of these organic anions, irrespective of the bile salt species used or the lipid composition of the  vesicles. Ultracentrifugation and dynamic light­scattering studies indicated that the organic anions did interact with mixed bile salt/phosphatidylcholine/cholesterol  micelles but did not directly inhibit micellization. Although these experiments do not elucidate the mechanism of the "uncoupling" phenomenon, they do not provide  supporting evidence for a micellization mechanism of biliary lipid secretion. 4—  Selectivity of Biliary Phospholipid Secretion A question present from the outset of biliary lipid studies is how selectivity for the phosphatidylcholine species present in bile is accomplished. The identification of the  mdr2 P­glycoprotein in mice and MDR3 P­glycoprotein in humans has permitted demonstration that this protein shows a high preference for translocation of  phosphatidylcholines from the inner to the outer hemileaflet of the canalicular membrane (151). The basis for subselection of fatty acyl species of phosphatidylcholines  remains unclear (152). However, in vitro analysis of phosphatidylcholine transfer between vesicles (68) and statistical analysis of in vivo biliary lipid secretion strongly  implicate cytoplasmic phosphatidylcholine transfer protein (PC­TP) as the basis for this specificity. In particular, the binding affinity of more fluid phosphatidylcholine  species for PC­TP largely explains the molecular species of phosphatidylcholine secreted into bile (69,153). Although a "subpool" of biliary­type phospholipid has  long been postulated (154), current evidence does not require that such a pool should exist. Rather, the action of PC­TP and mdr2 P­glycoprotein may be sufficient to  deliver the appropriate biliary phosphatidylcholines to the external hemileaflet of the canalicular membrane. The final basis for secretion of specific phosphatidylcholine species into bile remains unclear. If biliary phosphatidylcholines diffused widely within the external  hemileaflet, then only a micellar basis of bile salt­induced extraction might impart specificity. One must then

  

Page 79

postulate that the hydrophobicity of luminal bile salts dictates which phospholipid species are extracted (155). However, if transient microdomains of biliary­type  phosphatidylcholines developed in the external hemileaflet in the immediate vicinity of mdr2 P­glycoproteins, then either vesiculation or bile salt­induced micellar  extraction would explain the specificity of the final step in phospholipid secretion. C—  Cholesterol Secretion into Bile The literature on biliary cholesterol secretion is extensive and spans over three decades (156–158), with numerous contributions in recent years (82,159). Several  fundamental concepts have emerged, which are covered in greater detail elsewhere in this volume. First, a more hydrophobic bile salt pool promotes cholesterol  secretion into bile (158,160), presumably on the basis of enhanced solubilization of phospholipid/cholesterol mixed lipid structures within bile. Second, cholesterol  secretion occurs most efficiently when cosecreted with phospholipid, but it may also occur in the absence of phospholipid secretion, based on experiments with mdr2­ deficient mice (161). In the latter instance, the presence of very hydrophobic bile salts in the canalicular lumen appears to be sufficient for extraction of cholesterol  from the canalicular membrane in the form of bile salt:cholesterol mixed micelles. Third, the predominant source of cholesterol secreted into bile is plasma; cholesterol  newly synthesized within the hepatocyte does not contribute significantly to biliary secretion (80,162,163). Several key lines of investigation now provide insights into how biliary cholesterol secretion may occur. The first pertains to the basolateral plasma membrane HDL  scavenger receptor. When HDL particles encounter the liver, there is marked dyssynchrony in the hepatocellular internalization of HDL constituents, with selective  uptake of free cholesterol and cholesterol esters (9,164–166). This appears to occur without endocytosis or degradation of the lipoprotein particle. Recently, a cell  surface receptor was identified that was capable of mediating hepatocellular HDL binding. The candidate is from the family of scavenger receptor proteins that show  broad ligand specificities. Such proteins are capable of binding a wide variety of negatively charged molecules, such as anionic phospholipids, native and chemically  modified LDL, and even whole cells expressing aberrant negatively charged ligands. To date, three classes of scavenger receptors have been identified (A, B, and C),  which are widely distributed among tissues (167). Cloning of the murine homologue of the class B scavenger receptor type I (mSR­BI) complementary cDNA has  been achieved. Expression of mSR­BI in Chinese hamster ovary cells (CHO cells) confers the ability to bind HDL with high affinity and saturability, with subsequent  transfer of free cholesterol from HDL to the cells (168). Overexpression of mSR­BI in transgenic mice results in an 85% reduction in plasma cholesterol levels and a  doubling of biliary cholesterol output, without alteration in bile salt or phospholipid secretion rates (169). Protein expression is maximal in the liver. Notably, HDL  particles are not endocytosed directly but rather appear to bind reversibly to the mSR­BI scavenger receptor. These findings strongly suggest that the HDL scavenger receptor can play a major role in hepatic uptake of cholesterol from HDL (170,171). This interpretation is  corroborated by the finding in humans that dramatic reductions in circulating plasma LDL and VLDL cholesterol levels do not affect secretion rates of biliary  cholesterol (79). An unsolved issue is the actual mechanism for transfer of cholesterol from HDL to the hepatocyte. One hypothesis is that the SR­BI receptor brings  the HDL particle into close proximity to the hepatocellular plasma membrane, thus promoting exchange of free cholesterol over this short distance. Recent evidence  suggests that proximity is not sufficient to effect transfer; SR­BI directly facilitates transfer of lipid through interactions with its extracellular domain (172). This occurs  not only for free cholesterol but also for the considerable amount of cholesteryl ester contained within the HDL particle (173). In the latter instance, hydrolysis of  cholesteryl esters (and glycerolipids) is necessary to facilitate remodeling of the nascent HDL particle and release of free cholesterol (174). It is therefore notable that  hepatic lipase is found on both the sinusoidal endothelium

  

Page 80

and the microvilli of the hepatocellular basement membrane (175–177), exactly where it would be required by this proposed mechanism. Once deposited in the basolateral plasma membrane (Fig. 3, step 3d), free cholesterol may diffuse laterally along the bilayer. Diffusion in the exoplasmic hemileaflet is  restricted by the pericanalicular tight junctions (33), but diffusion in the endoplasmic hemileaflet is not. Thus, cholesterol may enter into the canalicular domain via the  endoplasmic hemileaflet and distribute between both hemileaflets. The distribution of cholesterol between the inner and outer hemileaflets of the canalicular membrane  is not known; it is possible (95) but not proven (10) that cholesterol will partition preferentially into the outer hemileaflet. Cholesterol entry into the canalicular  membrane via aqueous exchange and lateral diffusion may then contribute substantively to cholesterol secretion into bile (163,178–180), particularly for HDL free  cholesterol (181–183). These concepts have been supported by recent physiological evidence, using nonmetabolizable plant steroids as a model for biliary sterol secretion. Isolated rat livers  were perfused with VLDL, LDL, and HDL obtained from patients with hereditary phytosterolemia, which leads to markedly elevated levels of circulating plant sterols.  Biliary secretion of plant sterols was minimal during perfusion with VLDL or LDL, whereas with perfusion of HDL there was a marked increase in biliary sterol  secretion (184). The increase in biliary secretion occurred over 5 to 10 min, which is faster than that expected for conventional receptor­mediated endocytosis,  lysosomal degradation, and release of free cholesterol from within the cell. The mechanism for cholesterol entry into bile has not yet been elucidated. It has long been postulated that phospholipid and cholesterol enter bile simultaneously from  the canalicular membrane (126), despite different routes of delivery to the canalicular membrane (reviewed in Ref. 34). The concept of microdomain formation is  predicated on the existence of cholesterol­poor fluid patches of phosphatidylcholine in the canalicular membrane. Two mechanisms are possible for transfer of  cholesterol from the surrounding canalicular membrane to newly formed phospholipid vesicles (Fig. 6): (a) lateral diffusion within the exoplasmic hemileaflet into the  nascent vesicle while it is still attached and (b) transfer to free vesicles within the canalicular lumen via aqueous diffusion. The latter process is well documented in  model systems and is extremely rapid when the donor membrane is supersaturated with cholesterol (185) and when bile salts are present (186). That lateral diffusion  might be occurring is suggested by the intriguing observations in our ultrastructural work that (a) cryofixed vesicles were not circular in cross section but rather  ellipsoidal and (b) the long axis of adherent vesicles was perpendicular to the canalicular membrane (73). It is possible that lateral diffusion of cholesterol into the  external hemileaflet of a nascent vesicle from the surrounding canalicular membrane would "stiffen" the sides and decrease the lateral curvature; the apex of the forming  vesicle and the base would remain relatively free of cholesterol. Upon release of the vesicle into the lumen, cholesterol would redistribute, producing the circular  vesicular profiles observed by chemical fixation. The critical issue of cholesterol entry into bile remains unresolved (187) yet is central to the long­standing concept that  hepatic secretion of cholesterol­supersaturated bile contributes to the pathogenesis of gallstones (126). The low biliary output of intrinsic canalicular membrane  proteins that occurs under physiologic conditions (188,189) may also be due to lateral diffusion of proteins into nascent vesicles. V—  Consequences of Impaired Biliary Lipid Secretion A—  Cholestasis Cholestasis is defined as the systemic retention of biliary constituents as a result of failure of bile formation (reviewed in Ref. 35). Any substantive obstruction to bile  flow through the biliary tree results in systemic retention of biliary constituents. Extrahepatic causes include gallstone obstruction of the biliary tree, pancreatic cancer,  and bile duct stricture following cholecystectomy. Intrinsic bile duct diseases include primary biliary cirrhosis, primary scleros­

  

Page 81

Figure 6 Schematic of possible mechanisms for cholesterol secretion into bile. Cholesterol may exchange freely with intraluminal phospholipid vesicles by binding to aqueous bile salts within the lumen (step 1a). Alternatively, cholesterol may diffuse laterally from cholesterol­rich  regions of the canalicular membrane into nascent vesicles during their formation (step 1b).

ing cholangitis, and biliary atresia. In all of these instances, it is logical to presume that hepatocellular excretion of biliary lipid is impaired on the basis of obstruction to  bile flow. However, the inflammatory milieu induced by intra­ or extrahepatic obstruction has a profound effect on hepatocellular transport function, over and above  simple fluid blockage. Specifically, conditions as mundane as short­term obstruction of the common bile duct induce entry of potent proinflammatory substances,  especially gut­derived bacterial lipopolysaccharide, into the portal circulation. Lipopolysaccharide in particular, and the proinflammatory cytokines produced by an  inflamed biliary tree, are potent downregulators of hepatocyte transport function (190). Thus, obstructive cholestasis features not only a reduction or cessation in bile  flow but also intrinsic downregulation of hepatocyte bile secretion. The most prominent effect is an almost complete cessation of basolateral bile salt uptake by the  hepatocyte, mediated by NTCP (191). The canalicular membrane transporters listed in Table 4 are affected variably in obstructive or inflammatory cholestasis (192).  It is hypothesized that downregulation of NTCP function serves to protect hepatocytes from uptake and retention of potentially toxic bile salts while also substantially  shutting down bile formation (191). Nonobstructive cholestasis, in contrast, appears to involve hepatocellular dysfunction, which cannot necessarily be viewed as protective. In most instances, so­called  hepatocellular cholestasis is not the result of massive hepatocellular destruction. Rather, hepatocellular cholestasis is frequently the outcome of relatively innocuous  insults in which hepatic mass is maintained. Hepatocellular cholestasis can arise from a host of hepatic insults, as reviewed elsewhere (35). Inflammation­induced  cholestasis is exceedingly common, especially virus­ or drug­induced hepatitis, and results from intrinsic failure of living hepatocytes to secrete bile (190). Inflammation  emanating from inflamed sinusoids, inflamed portal tracts, or parenchymal foci of inflammation and hepatocyte destruction has a profound effect on adjacent living  hepatocytes. Hepatocytes are essentially hijacked into producing acute­phase reactants while losing the ability to secrete bile. The final common pathway of reduced  NTCP function, reduced

  

Page 82

bile salt uptake and near cessation of bile salt secretion across the canalicular membrane, is much the same as in obstructive cholestasis. While it is difficult to argue  that systemic retention of bile salts in the absence of obstruction is protective, reduced hepatocellular uptake of bile salts may nevertheless reduce total destruction of  hepatocytes and thereby permit recovery once the cholestatic agent is removed. 1—  Bile Salt Retention Experimentally, intravenous infusion of high doses of bile salts leads to hepatocellular cholestasis, presumably the result of breakdown in the integrity of the canalicular  membrane (193,194). However, such pure bile salt "toxicity" is unusual clinically, as the systemic consequences of cholestasis are the logical outcome of the properties  of the molecules retained. Within the peripheral blood, bile salt concentrations increase from their normal levels of 5  M or less to concentrations exceeding 300  M  (195,196). Although bile salts are water­soluble, as amphiphilic compounds they nevertheless may partition into body tissues such as the subcutis. A prominent feature  of severe bile salt retention is pruritus, an intense itching sensation of the skin. In some patients with chronic cholestasis, as from primary biliary cirrhosis, the pruritus  may be so severe as to generate suicidal thoughts. However, it is not clear that the pruritus is simply the outcome of dermal irritation. There is extensive evidence that  pruritus arises from central nervous system activation of the opioid signaling network (197). Bile salts do not cross the blood­brain barrier, and transport proteins are  in place to export into the cerebrospinal fluid those bile salts that do enter the brain substance (Peter Meier­Abt, personal communication, 1998). Thus, the  mechanisms causing the pruritus of cholestasis remain unclear. 2—  Phospholipid Retention It is reasonable to posit that there are no detrimental consequences of systemic retention of phosphatidylcholine. This phospholipid is a normal constituent of  hepatocytes, and mice defective in the canalicular mdr2 P­glycoprotein exhibit no ultrastructural abnormalities of their bile canaliculi (James Crawford, personal  observation, 1997). 3—  Cholesterol Retention In contrast, systemic retention of cholesterol cannot be considered innocuous, despite the fact that it, too, is a normal constituent of mammalian membranes. Marked  elevations of circulating cholesterol bound to lipoproteins lead to sequestration of cholesterol in virtually every body tissue. A prominent physical sign of cholesterol  retention is xanthomas—subcutaneous collections of macrophages filled with cholesteryl esters. Curiously, atherosclerosis is not a prominent feature of chronic  cholestatic diseases, suggesting that as yet poorly understood mechanisms are in place for minimizing the detrimental effects of cholesterol retention on vascular  structure. Shedding of keratinocytes and enterocytes from the skin and gut, respectively, are woefully inadequate as mechanisms for cholesterol loss. Fecal loss of  secreted bile salts (about 2.5 g/day) and of free cholesterol (about 3 g/day) constitutes the only effective mechanism for maintaining cholesterol homeostasis. Attempts  to downregulate cholesterol biosynthesis or enhance cholesterol bioconversion to bile salts do not satisfactorily prevent marked elevations in systemic cholesterol  levels. These futile efforts underscore the central role of bile formation in cholesterol homeostasis. One may speculate that the development of other hepatic  complications, such as the hepatic encephalopathy of end­stage primary biliary cirrhosis, precludes full expression of the systemic consequences of long­term  cholesterol retention. B—  Inherited Diseases of Bile Secretory Function Elucidation of inherited defects in canalicular transporter function has been one of the most exciting areas of hepatic biology in recent years. Excellent reviews are  available elsewhere

  

Page 83

(198,199) and are addressed elsewhere in this volume. Mention must be made of the inherited defect in MDR3, responsible for phosphatidylcholine secretion into  bile. In the original report of the mdr2 (­/­) knockout mice, a histological cholangitis developed over several months of life, followed eventually by the development of  hepatocellular carcinomas (119). Dietary feeding of the hydrophilic bile acid ursodeoxycholic acid greatly reduced the hydrophobicity of the ambient bile acid pool and  led to marked improvement in liver histology and animal longevity (200). It is postulated that the inability of bile salts to extract phosphatidylcholine from the  hepatocellular canalicular membrane produces excessive concentrations of free bile salts that are not bound up in mixed micelles with phospholipid. This, in turn, leads  to detergent­induced toxicity of the downstream biliary tree and hence a chemical cholangitis (124). Human patients with an autosomal recessive inherited defect in MDR3 also develop severe cholestatic liver disease, with portal tract­based inflammation, fibrosis, and  bile duct damage, which strikingly resembles the disease of the murine mdr2­deficient mice (201,202). This disease, now designated progressive familial intrahepatic  cholestasis type 3 (PFIC­3), features elevated serum levels of gamma glutathione transpeptidase, an enzyme of the canalicular plasma membrane and apical  membranes of the bile duct cholangiocytes. Thus, regardless of mechanism, in both mouse and human the continued secretion of bile salts without phospholipid into  bile leads to a relentless cholangiodestructive disease. At the very least, this points out the fact that, outside of the hepatocyte canalicular membrane itself, there is no  other plasma membrane in the body that can maintain its integrity in the face of mM concentrations of detergent bile salts. VI—  Future Directions A—  Unresolved Issues in Proposed Phospholipid Vesicle Formation Important questions remain in understanding biliary lipid secretion by hepatocytes. For the vesicular secretion paradigm, these are as follows: 1—  Microdomains The formation of lipid microdomains within lamellar membranes is an important general phenomenon in biology (203–205). It is unknown whether transient  cholesterol­poor microdomains of biliary phospholipid actually exist in the exoplasmic hemileaflet of the canalicular membrane. There is both thermodynamic and  kinetic evidence that fluid microdomains of cholesterol­poor phospholipid can coexist with less fluid cholesterol­rich membrane domains, particularly when the  cholesterol­rich region contains sphingomyelin, a lipid for which cholesterol exhibits a particular affinity (206–210). Importantly, the preferential interaction of  cholesterol with sphingomyelin is retained even when phosphatidylcholine enters into the monolayer (211). Lateral diffusion of phospholipid into the cholesterol­rich  membrane regions is restricted and exceedingly slow (212), leading to relative immiscibility of cholesterol­rich and cholesterol­poor microdomains (213). The action of  a canalicular membrane phospholipid translocator (118) might promote the creation of transient focal domains of biliary­type phosphatidylcholine in the exoplasmic  hemileaflet, the diameter of which is likely to fall between 50 and 100 nm on the basis of in vitro model studies (213). To date, conventional techniques such as freeze­ fracture (214) impart too long a fixation time to permit capture of transient microdomains. Ultrarapid cryofixation followed by freeze­fracture has not been successful  in identifying microdomains (Lukas Landmann, personal communication). The ability to document such events will be an important test of the vesicular secretion  hypothesis.

  

Page 84

2—  Vesicle Formation How might vesicles form from the exoplasmic hemileaflet? Monomeric bile salts are readily capable of partitioning into membranes and interact preferentially with more  fluid lipid domains, such as those composed of biliary­type phosphatidylcholines (61). Since bile salts are several hundredfold more concentrated within the canalicular  lumen than within the cell, the exoplasmic hemileaflet of the canalicular membrane will be the primary site into which bile salts partition (215). Membrane "solubilizing"  bile salts remain exclusively in the exoplasmic hemileaflet of the membrane, as transmembrane "flip­flop" of fully ionized bile salts does not occur (134,216).  Asymmetrical accumulation of phosphatidylcholine and of bile salt molecules will generate a localized increase of the lateral pressure gradient in the exoplasmic leaflet  of the membrane. Focal ''bulging" may also be accentuated by interactions of sphingomyelin molecules across the lipid bilayer, imparting shear resistance to the  surrounding sphingomyelin­rich canalicular membrane (217). Bile salt­mediated instability of the phospholipid bilayer structure (68,218) may promote restructuring of the hemileaflet microdomain, whereby phospholipid head  groups reorient into a newly formed unilamellar vesicle, as occurs in the phosphatidylcholine surface monolayer of circulating lipoproteins (219,220). Such dramatic  reorganization of membrane structure, and transient departure from a conventional bilayer structure, can occur without compromising membrane integrity (221). The  small quantities of phosphatidylethanolamine present in the external hemileaflet are known to promote lamellar­to­inverted hexagonal­phase transitions in monolayers  (222). Inverted hexagonal phases of phosphatidylcholine are predicted by the phase diagram for bile formation (223). The possibility of inverted hexagonal­phase  microdomains within the external hemileaflet of the canalicular membrane is an intriguing component of the vesicular secretion paradigm (159). One part of the hypothesis for cholesterol entry into nascent vesicles described earlier is the lateral diffusion of cholesterol into fluid phosphatidylcholine domains. It is  therefore interesting to note that small amounts of cholesterol in a phospholipid layer can actually "soften" the lipid layer rather than making it more rigid (224).  Moreover, the presence of bile salts within the canalicular lumen will also reduce the affinity of cholesterol for sphingomyelin, further increasing the likelihood of  cholesterol release into bile (225). How might water and solutes enter the interior of nascent vesicles? Water permeability through pure lipid bilayers is considerable and increases as membrane fluidity  increases and cholesterol content decreases (226). In addition, water permeability increases at the boundaries between different lipid phases in membranes (227,228).  Bile salts can induce marked increases (up to 500 Da) in both water and solute permeability through cholesterol­poor membranes without solubilization of the bilayers  (229,230). We postulate that water enters nascent vesicles through the bile salt­perturbed fluid microdomains of cholesterol­poor buds of biliary phosphatidylcholines.  As newly released vesicles would undergo almost immediate osmotic collapse in the absence of interior solutes (231), luminal solutes (such as the inorganic salts  normally present in bile) also may be swept into the interior of forming vesicles. Does canalicular motility contribute to vesicle formation? Regular contractions of bile canaliculi have been documented both in vitro and in vivo (232,233) and are  mediated by the pericanalicular cytoskeleton of actin and myosin II. Membrane deformations destabilize membrane structure (234), and it is possible that contractile  motions of the canalicular membrane further promote the formation of biliary vesicles. What are the alterations in vesicles following their secretion into bile? Vesicle dissolution appears to be a normal, dynamic process occurring during the brief residence  time of lipid vesicles within the bile canalicular lumen. Bile salt­induced vesicle dissolution in vitro results in progressive diminution in the size of membrane vesicles as  lipid is progressively dissolved (61,235). This phenomenon has also been observed in quasielastic light­scattering measurements of living hepatocyte couplets, whereby  increasing intraluminal bile salt concentrations at first promote the elaboration of lipid vesicles but then induce dissolution of the same vesicles

  

Page 85

within the canalicular lumen (104). Dynamic alterations in vesicular size and shape have been noted in human biles (236). 3—  Canalicular Phospholipid "Flippases" Low rates of phospholipid secretion may be observed transiently even in mice lacking the mdr2 gene (135), and gene products other than the mdr2 locus are capable  of conferring phospholipid translocation across membranes (237–240). Identification of all the proteins involved is necessary to gain a full understanding of biliary  phospholipid secretion (240). B—  Lipoprotein X Obstructive cholestasis leads to the appearance of an abnormal lipoprotein in plasma, designated lipoprotein X, or LpX (241). In contrast to normal plasma  lipoproteins, LpX is a unilamellar vesicle with an aqueous lumen (242). To test the hypothesis that LpX originates as a biliary vesicle that is regurgitated in bile, Oude  Elferink and colleagues examined the elaboration of LpX in mice deficient for mdr2 (243). In wild­type mice, bile duct ligation led to a dramatic increase in plasma  cholesterol and phospholipid concentrations, contained largely as LpX particles 40 to 100 nm in diameter. There was a complete absence of LpX in mdr2 (­/­) mice.  Transgenic insertion of the MDR3 human homologue of mdr2 restored the presence of LpX during bile duct ligation. Besides demonstrating that the plasma  concentration of this protein during obstructive cholestasis is determined by the activity of the canalicular phospholipid translocator, these findings raise the intriguing  possibility that biliary lipid may be regurgitated into plasma in a vesicular form not unlike that elaborated in bile. It remains to be seen whether such regurgitation is  transcellular (via reverse transcytosis of cargo vesicles) or paracellular (across disrupted tight junctions). It is also unclear whether LpX lipid vesicles might form de  novo at the basolateral membrane. The extracellular concentrations of bile salts in plasma are 100­fold less than those in the lumen of the bile canaliculus, and it is the  presumed action of detergent bile salts that completes the canalicular vesiculation process. C—  Cholesterol Delivery to Bile By far the most critical issue is elucidation of the exact mechanisms by which cholesterol is delivered to bile and how such delivery is regulated. In humans, the lack of  correlation between circulating levels of plasma cholesterol and biliary cholesterol secretion rates has frustrated efforts to link atherosclerosis and cholesterol gallstone  disease into a coherent concept of pathogenesis (244). Nevertheless, recent progress in elucidating the genetic underpinnings of cholesterol gallstone disease (see  Chapter 6) are providing great promise for gaining an coherent understanding of the genetic basis for these two diseases (245,246). Moreover, characterization of  hepatocellular uptake mechanisms, especially by the SR­BI scavenger receptor, may provide a direct causal link between the pathobiology of atherosclerosis and the  regulation of hepatic cholesterol secretion into bile (247). VII—  Conclusion The rapid progress in the genetic, molecular, and structural basis of hepatocellular biliary lipid secretion has enabled a more comprehensive understanding of this  complex event (248). While there are many details to verify or disprove, it is reasonable to state that "the source of the bile" has been identified.

  

Page 86

Acknowledgments This work was supported by National Institutes of Health grant R01­DK53512. The graphic artwork of Aleta R. Crawford is gratefully acknowledged. References 1. ER Weibel, W Staubli, HR Gnagi, FA Hess. Correlated morphometric and biochemical studies on the liver cell: I. Morphometric model, stereological methods, and  normal morphometric data for rat liver. J Cell Biol 42:68–91, 1969. 2. B Hornstein, L Stammler, L Bianchi, L Landmann. Ethinylestradiol increases volume and decreases sinusoidal membrane surface in the rat liver: a stereological  analysis. Hepatology 16:217–223, 1992. 3. JD Vial, FR Simon, AM Mackinnon. Effect of bile duct ligation on the ultrastructural morphology of hepatocytes. Gastroenterology 70:85–92, 1976. 4. R Saxena, ND Theise, JM Crawford. Microanatomy of the liver: exploring the hidden interfaces. Hepatology 30:1339–1346, 1999. 5. ND Theise, R Saxena, BC Portmann, SN Thung, H Yee, L Chiriboga, A Kumar, JM Crawford. The canals of Hering and hepatic stem cells in humans.  Hepatology 30:1425–1433, 1999. 6. W Ekataksin, K Wake. New concepts in biliary and vascular anatomy of the liver. Prog Liv Dis 15:1–30, 1997. 7. KN Lazaridis, L Pham, P Tietz, PA Marinelli, PC DeGroen, S Levine, PA Dawson, NF LaRusso. Rat cholangiocytes absorb bile acids at their apical domain via  the ileal sodium­dependent bile acid transporter. J Clin Invest 100:2714–2721, 1997. 8. D Schachter. The hepatocyte plasma membrane: organization and differentiation. In: Arias IM, Boyer JL, Fausto N, Jakoby WB, Schachter DA, Shafritz DA, eds.  The Liver: Biology and Pathobiology, 3rd ed. New York: Raven Press, 1994, pp 145–154. 9. CJ Fielding, PE Fielding. Molecular physiology of reverse cholesterol transport. J Lipid Res 36:211–228, 1995. 10. L Liscum, KW Underwood. Intracellular cholesterol transport and compartmentation. J Biol Chem 270:15443–15446, 1995. 11. F Schroeder, JR Jefferson, AB Kier, J Knittel, TJ Scallen, WG Wood, I Hapala. Membrane cholesterol dynamics: cholesterol domains and kinetic pools. Proc  Soc Exp Biol Med 196:235–252, 1991. 12. A Van Helvoort, G Van Meer. Intracellular lipid heterogeneity caused by topology of synthesis and specificity in transport. Example: Sphingolipids. FEBS Lett  369:18–21, 1995. 13. P Verkade, K Simons. Lipid microdomains and membrane trafficking in mammalian cells. Histochem Cell Biol 108:211–220, 1997. 14. G Ihrke, GV Martin, MR Shanks, M Schrader, TA Schroer, AL Hubbard. Apical plasma membrane proteins and endolyn­78 travel through a subapical  compartment in polarized WIF­B hepatocytes. J Cell Biol 141:115–133, 1998. 15. BF Scharschmidt, JR Lake, EL Renner, V Licko, RW Van Dyke. Fluid phase endocytosis by cultured rat hepatocytes and perfused rat liver: implications for  plasma membrane turnover and vesicular trafficking of fluid phase markers. Proc Natl Acad Sci USA 83: 9488–9492, 1986. 16. JR Lake, V Licko, RW Van Dyke, BF Scharschmidt. Biliary secretion of fluid­phase markers by the isolated perfused rat liver: role of transcellular vesicular  transport. J Clin Invest 76:676–689, 1985. 17. JM Crawford. The role of vesicle­mediated transport pathways in hepatocellular bile secretion. Semin Liver Dis 16:169–190, 1996.

  

Page 87

18. RPJ Oude Elferink, CTM Bakker, H Roelofsen, E Middelkoop, R Ottenhoff, M Helin, PLM Jansen. Accumulation of organic anion in intracellular vesicles of  cultured rat hepatocytes is mediated by the canalicular multispecific organic anion transporter. Hepatology 17:434–444, 1993. 19. LJ Scott, AL Hubbard. Dynamics of four rat liver plasma membrane proteins and polymeric IgA receptor: rates of synthesis and selective loss into the bile. J Biol  Chem 267: 6099–6106, 1992. 20. D Jeckel, A Karrenbauer, R Birk, RR Schmidt, F Wieland. Sphingomyelin is synthesized in the cis Golgi. FEBS Lett 261:155–157, 1990. 21. AH Futerman, B Stieger, AL Hubbard, RE Pagano. Sphingomyelin synthesis in rat liver occurs predominantly at the cis and medial cisternae of the Golgi  apparatus. J Biol Chem 265:8650–8657, 1990. 22. PJ Trotter, DR Voelker. Lipid transport processes in eukaryotic cells. Biochim Biophys Acta 1213:241–262, 1994. 23. JC Mclntyre, RG Sleight. Mechanisms of intracellular membrane lipid transport. Curr Topics Mem 40:453–481, 1994. 24. M Koval, RE Pagano. Lipid recycling between the plasma membrane and intracellular compartments: transport and metabolism of fluorescent sphingomyelin  analogues in cultured fibroblasts. J Cell Biol 108:2169–2181, 1989. 25. NG Lipsky, RE Pagano. Intracellular translocation of fluorescent sphingolipids in cultured fibroblasts: endogenously synthesized sphingomyelin and  glucocerebroside analogues pass through the Golgi apparatus en route to the plasma membrane. J Cell Biol 100:27–34, 1985. 26. G Van Meer, W Van't Hof. Epithelial sphingolipid sorting is insensitive to reorganization of the Golgi by nocodazole, but is abolished by monensin in MDCK cells  and by brefeldin A in Caco­2 cells. J Cell Sci 104:833–842, 1993. 27. Y­J Shiao, JE Vance. Sphingomyelin transport to the cell surface occurs independently of protein secretion in rat hepatocytes. J Biol Chem 268:26085–26092,  1993. 28. G Ihrke, EB Neufeld, T Meads, MR Shanks, D Cassio, M Laurent, T Schroer, RE Pagano, AL Hubbard. WIF­B cells: an in vitro model for studies of  hepatocyte polarity. J Cell Biol 123:1761–1775, 1993. 29. MMP Zegers, KJM Zaal, D Hoekstra. Functional involvement of proteins, interacting with sphingolipids, in sphingolipid transport to the canalicular membrane in  the human hepatocytic cell line, HepG2. Hepatology 27:1089–1097, 1998. 30. HJ Verkade, RJ Vonk, F Kuipers. New insights into the mechanism of bile acid­induced biliary lipid secretion. Hepatology 21:1174–1189, 1995. 31. GM Patton, JM Fasulo, SJ Robins. Origin of bile lecithins: evidence for extensive remodeling and a novel pathway of synthesis. Gastroenterology 104:A970,  1993. 32. GM Patton, JM Fasulo, SJ Robins. Hepatic phosphatidylcholines: evidence for synthesis in the rat by extensive reutilization of endogenous acylglycerides. J Lipid  Res 35:1211–1221, 1994. 33. G Van Meer, K Simons. The function of tight junctions in maintaining differences in lipid composition between the apical and the basolateral cell surface domains  of MDCK cells. EMBO J 5:1455–1464, 1986. 34. MC Carey, JT LaMont. Cholesterol gallstone formation: 1. Physical­chemistry of bile and biliary lipid secretion. Prog Liv Dis 10:139–163, 1992. 35. RM Green, JM Crawford. Hepatocellular cholestasis: pathobiology and histological outcome. Semin Liver Dis 15:372–389, 1995. 36. MC Carey, WC Duane. Enterohepatic circulation. In: Arias IM, Boyer JL, Fausto N, Jakoby WB, Schachter D, Shafritz DA, eds. The Liver: Biology and  Pathobiology, 3rd ed. New York: Raven Press, 1994, pp 719–767. 37. FJ Suchy. Hepatocellular transport of bile acids. Semin Liver Dis 13:235–247, 1993. 38. MH Nathanson, JL Boyer. Mechanisms and regulation of bile secretion. Hepatology 14:551–566, 1991.

  

Page 88

39. PJ Meier. The bile secretory polarity of hepatocytes. J Hepatol 9:124–129, 1989. 40. JL Boyer, B Hagenbuch, M Ananthanarayanan, FJ Suchy, B Stieger, PJ Meier. Phylogenic and ontogenic expression of hepatocellular bile acid transport. Proc  Natl Acad Sci USA 90:435–438, 1993. 41. RW Van Dyke, JE Stephens, BF Scharschmidt. Bile acid transport in cultured hepatocytes. Am J Physiol 243:G484–G492, 1982. 42. A Stolz, H Takikawa, M Ookhtens, N Kaplowitz. The role of cytoplasmic proteins in hepatic bile acid transport. Annu Rev Physiol 51:161–176, 1989. 43. A Stolz, L Hammond, H Lou, H Takikawa, M Ronk, JE Shively. cDNA cloning and expression of the human hepatic bile acid­binding protein: a member of the  monomeric reductase gene family. J Biol Chem 268:10448–10457, 1993. 44. H Lou, L Hammond, V Sharma, RS Sparkes, AJ Lusis, A Stolz. Genomic organization and chromosomal localization of a novel human hepatic dihydrodiol  dehydrogenase with high affinity bile acid binding. J Biol Chem 269:8416–8422, 1994. 45. H Takikawa, A Stolz, N Kaplowitz. Cyclical oxidation­reduction of the C3 position on bile acids catalyzed by rat hepatic 3a­hydroxysteroid dehydrogenase: I.  Studies with the purified enzyme, isolated rat hepatocytes, and inhibition by indomethacin. J Clin Invest 80:852–860, 1987. 46. H Takikawa, JC Fernandez­Checa, J Kuhlenkamp, A Stolz, M Ookhtens, N Kaplowitz. Effect of indomethacin on the uptake, metabolism and excretion of 3­ oxocholic acid: studies in isolated hepatocytes and perfused rat liver. Biochim Biophys Acta 1084:247–250, 1991. 47. H Takikawa, Y Sugiyama, JC Fernandez­Checa, J Kuhlenkamp, M Ookhtens, N Kaplowitz. Evidence that interference with binding to hepatic cytosol binders  can inhibit bile acid excretion in rats. Hepatology 23:1642–1649, 1996. 48. FA Simion, B Fleischer, S Fleischer. Subcellular distribution of bile acids, bile salts and taurocholate binding sites in rat liver. Biochemistry 23:6459–6466, 1984. 49. FA Simion, B Fleischer, S Fleischer. Two distinct mechanisms for taurocholate uptake in subcellular fractions from rat liver. J Biol Chem 250:10814–10822,  1984. 50. MA Goldsmith, S Huling, AL Jones. Hepatic handling of bile salts and protein in the rat during intrahepatic cholestasis. Gastroenterology 84:978–986, 1983. 51. FJ Suchy, WF Balistreri, J Hung, P Miller; SA Garfield. Intracellular bile acid transport in rat liver as visualized by electron microscope autoradiography using a  bile acid analogue. Am J Physiol 245:G681–G689, 1983. 52. Y Lamri, A Roda, M Dumont, G Feldmann, S Erlinger. Immunoperoxidase localization of bile salts in rat liver cells: evidence for a role of the Golgi apparatus in  bile salt transport. J Clin Invest 82:1173–1182, 1988. 53. JM Crawford, S Barnes, RC Stearns, CL Hastings, JJ Godleski. Ultastructural localization of a fluorinated bile salt in hepatocytes. Lab Invest 71:42–51, 1994. 54. C Alves, P Von Dippe, M Amoui, D Levy. Bile acid transport into hepatocyte smooth endoplasmic reticulum vesicles is mediated by microsomal epoxide  hydrolase, a membrane protein exhibiting two distinct topological orientations. J Biol Chem 268:20148–20155, 1993. 55. S Ruetz, AE Lindsey, CL Ward, RR Kopito. Functional activation of plasma membrane anion exchangers occurs in a pre­Golgi compartment. J Cell Biol  121:37–48, 1993. 56. JM Crawford, CA Berken, JL Gollan. Role of the hepatocyte microtubular system in the excretion of bile salts and biliary lipid: implications for intracellular  vesicular transport. J Lipid Res 29:144–156, 1988. 57. BA Luxon, RA Weisiger. A new method for quantitating intracellular transport: application to the thyroid hormone 3,5,3'­triiodothyronine. Am J Physiol  263:G733–G741, 1992. 58. K Luby­Phelps. Physical properties of cytoplasm. Curr Opin Cell Biol 6:3–9, 1994. 59. RA Weisiger. Cytoplasmic transport of lipids: role of binding proteins. Comp Biochem Physiol [B] 115B:319–331, 1996.

  

Page 89

60. DW Hay, MC Carey. Chemical species of lipids in bile. Hepatology 12(suppl):6S–16S, 1990. 61. DE Cohen, M Angelico, MC Carey. Structural alterations in lecithin­cholesterol vesicles following interactions with monomeric and micellar bile salts: physical­ chemical basis for subselection of biliary lecithin species and aggregative states of biliary lipids during bile formation. J Lipid Res 31:55–70, 1990. 62. JA Higgins, WH Evans. Transverse organization of phospholipids across the bilayer of plasma­membrane subfractions of rat hepatocytes. Biochem J 174:563– 567, 1978. 63. I Portal, T Clerc, V Sbarra, H Portugal, A­M Pauli, H Lafont, B Tuchweber, I Yousef, F Chanussot. Importance of high­density lipoprotein­phosphatidylcholine  in secretion of phospholipid and cholesterol in bile. Am J Physiol 264:G1052–G1056, 1993. 64. HJ Verkade, JTP Derksen, A Gerding, GL Scherphof, RJ Vonk, F Kuipers. Differential hepatic processing and biliary secretion of head­group and acyl chains of  liposomal phosphatidylcholines. Biochem J 275:139–144, 1991. 65. SJ Robins, H Brunengraber. Origin of biliary cholesterol and lecithin in the rat: contribution of new synthesis and preformed hepatic stores. J Lipid Res 23:604– 608, 1982. 66. SJ Robins, JM Fasulo, VF Robins, GM Patton. Utilization of different fatty acids for hepatic and biliary phosphatidylcholine formation and the effect of changes in  phosphatidylcholine molecular species on biliary lipid secretion. J Lipid Res 32:985–992, 1991. 67. GM Patton, JM Fasulo, SJ Robins. Evidence that hepatic triglycerides provide acylglycerides for synthesis of bile phosphatidylcholines. Am J Physiol  267:G1028–G1034, 1994. 68. DE Cohen, MR Leonard, MC Carey. In vitro evidence that phospholipid secretion into bile may be coordinated intracellularly by the combined actions of bile  salts and the specific phosphatidylcholine transfer protein of liver. Biochemistry 33:9975–9980, 1994. 69. KWA Wirtz. Phospholipid transfer proteins. Annu Rev Biochem 60:73–99, 1991. 70. AN Leonard, DE Cohen. In vitro evidence that sterol carrier protein 2 may provide a scavenger pathway for phosphatidylcholine secretion into bile. Hepatology  22:295A, 1995. 71. Vlahcevic ZR, Hylemon PB, Chiang JYL. Hepatic cholesterol metabolism. In: Arias IM, Boyer JL, Fausto N, Jakoby WB, Schachter DA, Shafritz DA, eds. The  Liver: Biology and Pathobiology. New York: Raven Press, 1994, pp 379–389. 72. MC Bourgès, DM Small, DG Dervichian. Biophysics of lipid associations: III. The quaternary systems lecithin­bile salt­cholesterol­water. Biochim Biophys Acta  144:189–201, 1967. 73. JM Crawford, G­M Möckel, AR Crawford, SJ Hagen, VC Hatch, S Barnes, JJ Godleski, MC Carey. Imaging biliary lipid secretion in the rat: ultrastructural  evidence for vesiculation of the hepatocyte canalicular membrane. J Lipid Res 36:2147–2163, 1995. 74. JT LaMont, MC Carey. Cholesterol gallstone formation: 2. Pathobiology and pathomechanics. Prog Liv Dis 10:165–191, 1992. 75. RG Sleight. Intracellular lipid transport in eukaryotes. Annu Rev Physiol 49:193–208, 1987. 76. J Rosario, E Sutherland, L Zaccaro, FR Simon. Ethinylestradiol administration selectively alters liver sinusoidal membrane lipid fluidity and protein composition.  Biochemistry 27:3939–3946, 1988. 77. PD Thomas, MJ Poznansky. Cholesterol transfer between lipid vesicles: effect of phospholipids and gangliosides. Biochem J 251:55–61, 1988. 78. MB Sankaram, TE Thompson. Interaction of cholesterol with various glycerophospholipids and sphingomyelin. Biochemistry 29:10670–10675, 1990. 79. CG Hillebrant, B Nyberg, K Einarsson, M Eriksson. The effect of plasma low density lipoprotein apheresis on the hepatic secretion of biliary lipids in humans. Gut  41:700–704, 1997.

  

Page 90

80. J Scheibner, M Fuchs, E Hörmann, G Tauber, EF Stange. Biliary cholesterol secretion and bile acid formation in the hamster: the role of newly synthesized  cholesterol. J Lipid Res 35:690–697, 1994. 81. K Empen, K Lange, EF Stange, J Scheibner. Newly synthesized cholesterol in human bile and plasma: quantitation by mass isotopomer distribution analysis. Am J  Physiol 272:G367–G373, 1997. 82. RHJ Bandsma, F Stellaard, RJ Vonk, GT Nagel, RA Neese, MK Hellerstein, F Kuipers. Contribution of newly synthesized cholesterol to rat plasma and bile  determined by mass isotopomer distribution analysis: bile­salt flux promotes secretion of newly synthesized cholesterol into bile. Biochem J 329:699–703, 1998. 83. E Schnitzer, D Lichtenberg. Re­evaluation of the structure of low density lipoproteins. Chem Phys Lipids 70:63–74, 1994. 84. Glickman RM, Sabesin SM. Lipoprotein metabolism. In: Arias IM, Boyer JL, Fausto N, Jakoby WB, Schachter DA, Shafritz DA, eds. The Liver: Biology and  Pathobiology. New York: Raven Press, 1994, pp 391–414. 85. DR Voelker. Lipid transport pathways in mammalian cells. Experientia 46:569–579, 1990. 86. MP Reinhart. Intracellular sterol trafficking. Experientia 46:599–611, 1990. 87. L Puglielli, A Rigotti, AV Greco, MJ Santos, F Nervi. Sterol carrier protein­2 is involved in cholesterol transfer from the endoplasmic reticulum to the plasma  membrane in human fibroblasts. J Biol Chem 270:18723–18726, 1995. 88. L Puglielli, A Rigotti, L Amigo, L Nunez, M Santos, AV Greco, F Nervi. Evidence for the involvement of sterol carrier protein (SCP­2) in a rapid, microtubule­,  and Golgi­independent transport of newly­synthesized cholesterol to bile. Gastroenterology 108: A1150, 1995. 89. MT Vanier, P Pentchev, C Rodriguez­Lafrasse, R Rousson. Niemann­Pick disease type C: an update. J Inherit Metab Dis 14:580–595, 1991. 90. L Puglielli, A Rigotti, L Amigo, L Nufiez, AV Greco, MJ Santos, F Nervi. Modulation of intrahepatic cholesterol trafficking: Evidence by in vivo antisense  treatment for the involvement of sterol carrier protein­2 in newly synthesized cholesterol transport into rat bile. Biochem J 317:681–687, 1996. 91. Y Lange, TL Steck. Cholesterol­rich intracellular membranes: a precursor to the plasma membrane. J Biol Chem 260:15592–15597, 1985. 92. T Babia, JW Kok, M Van der Haar, R Kalicharan, D Hoekstra. Transport of biosynthetic sphingolipids from Golgi to plasma membrane in HT29 cells:  involvement of different carrier vesicle populations. Eur J Cell Biol 63:172–181, 1994. 93. W Van't Hof, G Van Meer. Lipid polarity and sorting in epithelial cells. Curr Topics Mem 40:539–563, 1994. 94. R Bittman, CR Kasireddy, P Mattjus, JP Slotte. Interaction of cholesterol with sphingomyelin in monolayers and vesicles. Biochemistry 33:11776–11781, 1994. 95. D Allan, K Kallen. Transport of lipids to the plasma membrane in animal cells. Prog Lipid Res 32:195–219, 1993. 96. VN Schumaker, ML Phillips, JE Chatterton. Apolipoprotein B and low­density lipoprotein structure: implications for biosynthesis of triglyceride­rich lipoproteins.  Adv Prot Chem 45:205–248, 1994. 97. J Sines, R Rothnagel, M Van Heel, JW Gaubatz, JD Morrisett, W Chiu. Electron cryo­microscopy and digital image processing of lipoprotein(a). Chem Phys  Lipids 67–68: 81–89, 1994. 98. R Van Antwerpen, JC Gilkey. Cryo­electron microscopy reveals human low density lipoprotein substructure. J Lipid Res 35:2223–2231, 1994. 99. L Urbani, RD Simoni. Cholesterol and vesicular stomatitis virus G protein take separate routes from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane. J Biol  Chem 265:1919–1923, 1990.

  

Page 91

100. Y Lange, F Strebel, TL Steck. Role of the plasma membrane in cholesterol esterification in rat hepatoma cells. J Biol Chem 268:13838–13843, 1993. 101. M Koval, AH Futerman, RE Pagano. Sphingomyelin synthesis in endosomal compartments. Trends Cell Biol 5:148–149, 1995. 102. ID Roman, A Thewles, R Coleman. Fractionation of livers following diosgenin treatment to elevate biliary cholesterol. Biochim Biophys Acta Lipids Lipid Metab  1255:77–81, 1995. 103. HA Ahmed, RP Jazrawi, PM Goggin, J Dormandy, TC Northfield. Intrahepatic biliary cholesterol and phospholipid transport in humans: effect of obesity and  cholesterol cholelithiasis. J Lipid Res 36:2562–2573, 1995. 104. G Möckel, S Gorti, RK Tandon, R Tanaka, MC Carey. Microscope laser light scattering spectroscopy of vesicles within canaliculi of rat hepatocyte couplets.  Am J Physiol 269:G73–G84, 1995. 105. T Gerloff, B Stieger, B Hagenbuch, J Madon, L Landmann, J Roth, AF Hofmann, PJ Meier. The sister of P­glycoprotein represents the canalicular bile salt  export pump of mammalian liven. J Biol Chem 273:10046–10050, 1998. 106. B Angelin, I Bjorkhem, E Einarsson, S Ewerth. Hepatic uptake of bile acids in man: fasting and post­prandial concentrations of individual bile acids in portal  venous and systemic blood serum. J Clin Invest 70:724–731, 1982. 107. RD Adler, FJ Wannagat, RK Ockner. Bile secretion in selective biliary obstruction: adaptation of taurocholate transport maximum to increased secretory load in  the rat. Gastroenterology 73:129–136, 1977. 108. JB Watkins, CD Klaassen. Effect of repeated oral administration of taurocholate on hepatic excretory function in rat. J Pharmacol Exp Ther 218:182–187,  1981. 109. FR Simon, EM Sutherland, M Gonzalez. Regulation of bile salt transport in rat liver: evidence that increased maximum bile salt secretory capacity is due to  increased cholic acid receptors. J Clin Invest 70:401–411, 1982. 110. J Graf, M Rupnik, G Zupancic, R Zorec. Osmotic swelling of hepatocytes increases membrane conductance but not membrane capacitance. Biophys J  68:1359–1363, 1995. 111. H Roelofsen, CTM Bakker, B Schoemaker, M Heijn, PLM Jansen, RPJ Oude Elferink. Redistribution of canalicular organic anion transport activity in isolated  and cultured rat hepatocytes. Hepatology 21:1649–1657, 1995. 112. D Häussinger, F Schliess. Cell volume and hepatocellular function. J Hepatol 22:94–100, 1995. 113. M Arrese, M Pizarro, N Solis, L Accatino. Adaptive regulation of hepatic bile salt transport: role of bile salt hydrophobicity and microtubule­dependent vesicular  pathway. J Hepatol 26:694–702, 1997. 114. H Roelofsen, CJ Soroka, D Keppler, JL Boyer. Cyclic AMP stimulates sorting of the canalicular organic anion transporter (MRP2/cMoat) to the apical domain  in hepatocyte couplets. J Cell Sci 111:1137–1145, 1998. 115. JM Crawford, DCJ Strahs, AR Crawford, S Barnes. The role of bile salt hydrophobicity in hepatic microtubule­dependent bile salt secretion. J Lipid Res  35:1738–1748, 1994. 116. JD Jones, TE Thompson. Mechanism of spontaneous, concentration­dependent phospholipid transfer between bilayers. Biochemistry 29:1593–1600, 1990. 117. JM Backer, EA Dawidowicz. Reconstitution of a phospholipid flippase from rat liver microsomes. Nature 327:341–343, 1987. 118. F Berr, PJ Meier, B Stieger. Evidence for the presence of a phosphatidylcholine translocator in isolated rat liver canalicular plasma membrane vesicles. J Biol  Chem 268: 3976–3979, 1993. 119. JJM Smit, AH Schinkel, RPJ Oude Elferink, AK Groen, E Wagenaar, L Van Deemter, CAAM Mol, R Ottenhoff, NMT Van der Lugt, MA Van Roon, et al.  Homozygous disruption of the murine mdr2 p­glycoprotein gene leads to a complete absence of phospholipid from bile and to liver disease. Cell 75:451–462, 1993.

  

Page 92

120. RPJ Oude Elferink, R Ottenhoff, M van Wijland, JJM Smit, AH Schinkel. Regulation of biliary lipid secretion by mdr2 P­glycoprotein in the mouse. J Clin Invest  95:31–38, 1995. 121. RPJ Oude Elferink, R Ottenhoff, M van Wijland, CMG Frijters, C van Nieuwkerk, AK Groen. Uncoupling of biliary phospholipid and cholesterol secretion in  mice with reduced expression of mdr2 P­glycoprotein. J Lipid Res 37:1065–1075, 1996. 122. M Fuchs, MC Carey, DE Cohen. Functional reconstitution of a liver specific long­chain phosphatidylcholine transmembrane translocator. Gastroenterology  108:A1067, 1995. 123. G­A Kullak­Ublick, PJ Meier, B Hagenbuch, F Berr, B Steiger. Expression einer kanalikulären phosphatidylcholin­flippase der rattenleber in Xenopus laevis­ oozyten (abstr). German Association for the Study of the Liver, 2:52, 1995. 124. RPJ Oude Elferink, GNJ Tytgat, AK Groen. The role of mdr2 P­glycoprotein in hepatobiliary lipid transport. FASEB J 11:19–28, 1997. 125. R Coleman, K Rahman. Lipid flow in bile formation. Biochim Biophys Acta 1125:113–133, 1992. 126. DM Small. The formation of gallstones. Adv Intern Med 16:243–264, 1970. 127. CF Higgins. To flip or not to flip? Curr Biol 4:259–260, 1994. 128. DJ Cabral, DM Small. Physical chemistry of bile. In: Schultz SG, Forte JG, Rauner BB, eds. Handbook of Physiology, Section 6: The Gastrointestinal System.  Vol. 3: Salivary, Gastric, Pancreatic, and Hepatobiliary System. Bethesda, MD: American Physiological Society, 1989, pp 621–622. 129. MD Apstein, AR Russo. Ampicillin inhibits biliary cholesterol secretion. Dig Dis Sci 30:253–256, 1985. 130. HJ Verkade, MJ Wolbers, R Havinga, DRA Uges, RJ Vonk, F Kuipers. The uncoupling of biliary lipid from bile acid secretion by organic anions in the rat.  Gastroenterology 99:1485–1492, 1990. 131. F Kuipers, JPT Derksen, A Gerding, GL Scherphof, RJ Vonk. Biliary lipid secretion in the rat: the uncoupling of biliary cholesterol and phospholipid secretion  from bile acid secretion by sulfated glycolithocholic acid. Biochim Biophys Acta 922:136–144, 1987. 132. MJ Monte, RA Parslow, R Coleman. Inhibitory action of cyclobutyrol on the secretion of biliary cholesterol and phospholipids. Biochem J 266:165–171, 1990. 133. HJ Verkade, H Wolters, A Gerding, R Havinga, V Fidler, RJ Vonk, F Kuipers. Mechanism of biliary lipid secretion in the rat: a role for bile acid­independent  bile flow. Hepatology 17:1074–1080, 1993. 134. F Kamp, JA Hamilton. Movement of fatty acids, fatty acid analogues, and bile acids across phospholipid bilayers. Biochemistry 32:11074–11086, 1993. 135. AR Crawford, AJ Smith, VC Hatch, RPJ Oude Elferink, P Borst, JM Crawford. Hepatic secretion of phospholipid vesicles in the mouse critically depends on  mdr2 or MDR3 P­glycoprotein expression. J Clin Invest 100:2562–2567, 1997. 136. R Coleman. Biochemistry of bile secretion. Biochem J 244:249–261, 1987. 137. IM Yousef, MM Fisher. Can J Biochem 54:1040–1056, 1976. 138. S Ruetz, P Gros. Phosphatidylcholine translocase: A physiological role for the mdr2 gene. Cell 77:1071–1081, 1994. 139. S Ruetz, P Gros. Enhancement of mdr2­mediated phosphatidylcholine translocation by the bile salt taurocholate: implications for hepatic bile formation. J Biol  Chem 270:25388–25395, 1995. 140. AT Nies, Z Gatmaitan, IM Arias. ATP­dependent phosphatidylcholine translocation in rat liver canalicular plasma membrane vesicles. J Lipid Res 37:1125– 1136, 1996. 141. SU Egelhaaf, P Schurtenberger. Shape transformations in the lecithin­bile salt system: from cylinders to vesicles. J Phys Chem 98:8560–8573, 1994. 142. DE Cohen, M Angelico, MC Carey. Quasielastic light scattering evidence for vesicular secretion of biliary lipids. Am J Physiol 257:G1–G8, 1989.

  

Page 93

143. DE Cohen, MR Fisch, MC Carey. Principles of laser light­scattering spectroscopy: applications to the physiochemical study of model and native biles.  Hepatology 12(suppl): 113S–122S, 1990. 144. DE Cohen, MC Carey. Physical chemistry of biliary lipids during bile formation. Hepatology 12(suppl):1435–1485, 1990. 145. GJ Somjen, Y Merikovsky, P Lelkes, T Gilat. Cholesterol­phospholipid vesicles in human bile: an ultrastructural study. Biochim Biophys Acta 879:14–21, 1986. 146. GJ Somjen, T. Gilat. A non­micellar mode of cholesterol transport in human bile. FEBS Lett 156:265–268, 1983. 147. GJ Somjen, T Gilat. Contribution of vesicular and micellar carriers to cholesterol transport in human bile. J Lipid Res 26:699–704, 1985. 148. HJ Verkade, R Havinga, A Gerding, RJ Vonk, F Kuipers. Mechanism of bile acid­induced biliary lipid secretion in the rat: effect of conjugated bilirubin. Am J  Physiol 264:G462–G469, 1993. 149. G Yamashita, S Tazuma, G Kajiyama. Effects of organic anions on biliary lipid secretion in rats. Importance of association with biliary lipid structures. Biochem J  286:193–196, 1992. 150. HJ Verkade, MAC De Bruijn, MA Brink, H Talsma, RJ Vonk, F Kuipers, AK Groen. Interactions between organic anions, micelles and vesicles in model bile  systems. Biochem J 320:917–923, 1996. 151. AJ Smith, JLPM Timmermans­Hereijgers, B Roelofsen, KWA Wirtz, WJ van Blitterswijk, JJM Smit, AH Schinkel, P Borst. The human MDR3 P­glycoprotein  promotes translocation of phosphatidylcholine through the plasma membrane of fibroblasts from transgenic mice. FEBS Lett 354:263–266, 1994. 152. RD Shamburek, CC Schwartz. Selective composition of biliary phosphatidylcholines is affected by secretion rate but not by bile acid hydrophobicity. J Lipid Res  34:1833–1842, 1993. 153. WW LaMorte, ML Mooker, S Kay. Determinants of the selection of phosphatidylcholine molecular species for secretion into bile in the rat. Hepatology  28:631–637, 1998. 154. T Kawamoto, T Akino, M Nakamura, M Mori. Metabolism of individual molecular species of phosphatidylcholine in the liver subcellular membranes and bile.  Biochim Biophys Acta 619:35–47, 1980. 155. H Miyake, S Tazuma, G Kajiyama. Bile salt hydrophobicity modulates subselection of biliary lecithin species in rats depleted of bile salt pool. Dig Dis Sci  43:921–926, 1998. 156. HO Wheeler, KK King. Biliary excretion of lecithin and cholesterol in the dog. J Clin Invest 51:1337–1350, 1972. 157. NF LaRusso, NE Hoffman, AF Hofmann, TC Northfield, JL Thistle. Effect of primary bile acid ingestion on bile acid metabolism and biliary lipid secretion in  gallstone patients. Gastroenterology 69:1301–1314, 1975. 158. K Einarsson, SM Grundy. Effects of feeding cholic acid and chenodeoxycholic acid on cholesterol absorption and hepatic secretion of biliary lipids in man. J  Lipid Res 21:23–34, 1980. 159. CMG Frijters, AK Groen, RPJO Elferink. MDR2 P­glycoprotein­mediated lipid secretion and its relevance to biliary drug transport. Adv Drug Deliv Rev  25:201–215, 1997. 160. LE Bilhartz, JM Dietschy. Bile salt hydrophobicity influences cholesterol recruitment from rat liver in vivo when cholesterol synthesis and uptake are constant.  Gastroenterology 95:771–779, 1988. 161. RPJ Oude Elferink, R Ottenhoff, M van Wijland, CMG Frijters, C van Nieuwkerk, AK Groen. Uncoupling of biliary phospholipid and cholesterol secretion in  mice with reduced expression of mdr2 P­glycoprotein. J Lipid Res 37:1065–1075, 1996. 162. SJ Robins, JM Fasulo, PD Lessard, GM Patton. Hepatic cholesterol synthesis and the secretion of newly synthesized cholesterol in bile. Biochem J 289:41–44,  1993.

  

Page 94

163. SJ Robins, JM Fasulo, MA Collins, GM Patton. Evidence for separate pathways of transport of newly synthesized and preformed cholesterol into bile. J Biol  Chem 260:6511–6513, 1985. 164. E Bravo, KM Botham, MA Mindham, PA Mayes, T Marinelli, A Cantafora. Evaluation in vivo of the differential uptake and processing of high­density  lipoprotein unesterified cholesterol and cholesteryl ester in the rat. Biochim Biophys Acta Lipids Lipid Metab 1215:93–102, 1994. 165. S Jäckle, F Rinninger, T Lorenzen, H Greten, E Windler. Dissection of compartments in rat hepatocytes involved in the intracellular trafficking of high­density  lipoprotein particles or their selectively internalized cholesteryl esters. Hepatology 17:455–465, 1993. 166. MW Scobey, FL Johnson, LL Rudel. Delivery of high­density lipoprotein free and esterified cholesterol to bile by the perfused monkey liver. Am J Physiol  257:G644–G652, 1989. 167. AK Hatzopoulos, A Rigotti, RD Rosenberg, M Krieger. Temporal and spatial pattern of expression of the HDL receptor SR­BI during murine embryogenesis. J  Lipid Res 39:495–508, 1998. 168. S Acton, A Rigotti, KT Landschulz, S Xu, HH Hobbs, M Krieger. Identification of scavenger receptor SR­BI as a High Density Lipoprotein receptor. Science  271:518–520, 1996. 169. KF Kozarsky, MH Donahee, A Rigotti, SN Iqbal, ER Edelman, M Krieger. Overexpression of the HDL receptor SR­B1 alters plasma HDL and bile  cholesterol levels. Nature 387:414–417, 1997. 170. M Arrese, JM Crawford. Of plaques and stones: the SR­BI scavenger receptor. Hepatology 26:1072–1074, 1997. 171. M Krieger. The ''best" of cholesterols, the "worst" of cholesterols: a tale of two receptors. Proc Natl Acad Sci USA 95:4077–4080, 1998. 172. X Gu, B Trigatti, S Xu, S Acton, J Babitt, M Krieger. The efficient cellular uptake of high density lipoprotein lipids via scavenger receptor class B type I requires  not only receptor­mediated surface binding but also receptor­specific lipid transfer mediated by its extracellular domain. J Biol Chem 273:26338–26348, 1998. 173. K Fluiter, DR Van der Westhuijzen, TJC Van Berkel. In vivo regulation of scavenger receptor BI and the selective uptake of high density lipoprotein cholesteryl  esters in rat liver parenchymal and Kupffer cells. J Biol Chem 273:8434–8438, 1998. 174. P Marques­Vidal, C Azéma, X Collet, H Chap, BP Perret. Hepatic lipase­mediated hydrolysis versus liver uptake of HDL phospholipids and triacylglycerols by  the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta 1082:185–194, 1991. 175. F Burgaya, J Peinado, M Llobera, I Ramirez. Hepatic endothelial lipase activity in neonatal rat liver. Biosci Rep 9:559–564, 1989. 176. B Breedveld, K Schoonderwoerd, AJM Verhoeven, R Willemsen, H Jansen. Hepatic lipase is localized at the parenchymal cell microvilli in rat liver. Biochem J  321:425–430, 1997. 177. DA Sanan, J Fan, A Bensadoun, JM Taylor. Hepatic lipase is abundant on both hepatocyte and endothelial cell surfaces in the liver. J Lipid Res 38:1002–1013,  1997. 178. SJ Robins, JM Fasulo, CR Pritzker, GM Patton. Hepatic transport of unesterified cholesterol in the rat is traced by the plant sterol, sitostanol. Hepatology  22:240A, 1995. 179. CC Schwartz, LG Halloran, ZR Vlahcevic, DH Gregory, L Swell. High and low density lipoprotein metabolism in man: preferential utilization of HDL free  cholesterol by the liver for biliary cholesterol secretion. Science 200:62–64, 1978. 180. CC Schwartz, M Berman, ZR Vlahcevic, LG Halloran, DH Gregory, L Swell. Multi­compartment analysis of cholesterol metabolism in man: characterization of  the hepatic bile acid and biliary cholesterol precursor sites. J Clin Invest 61:408–423, 1978. 181. SJ Robins, JM Fasulo, G Salen, GM Patton. Preferential sterol transport from HDL to bile. Hepatology 22:240A, 1995.

  

Page 95

182. E Bravo, A Cantafora, L Argiolas. Hepatic uptake and metabolism of free cholesterol from different lipoprotein classes: an in vivo study in the rat. Biochim  Biophys Acta 1003:315–320, 1989. 183. E Brava, A Cantafora. Hepatic uptake and processing of free cholesterol from different lipoproteins with and without sodium taurocholate administration: an in  vivo study in the rat. Biochim Biophys Acta 1045:74–80, 1990. 184. SJ Robins, JM Fasulo. High density lipoproteins, but not other lipoproteins, provide a vehicle for sterol transport to bile. J Clin Invest 99:380–384, 1997. 185. TL Steck, FJ Kezdy, Y Lange. An activation­collision mechanism for cholesterol transfer between membranes. J Biol Chem 263:13023–13031, 1988. 186. ZR Vlahcevic, EC Gurley, DM Heuman, PB Hylemon. Bile salts in submicellar concentrations promote bidirectional cholesterol transfer (exchange) as a function  of their hydrophobicity. J Lipid Res 31:1063–1071, 1990. 187. F Berr, HC Jaeger, T Bitterle, J Mössner. Evidence for secretory coupling of phosphatidylcholine molecular species to cholesterol in rat bile. J Hepatol  26:1069–1078, 1997. 188. SG Barnwell, PJ Lowe, R Coleman. The effects of colchicine on secretion into bile of bile salts, phospholipids, cholesterol and plasma membrane enzymes: bile  salts are secreted unaccompanied by phospholipids and cholesterol. Biochem J 220:723–731, 1984. 189. A Rigotti, L Núñez, L Amigo, L Puglielli, J Garrido, M Santos, S González, G Mingrone, A Greco, F Nervi. Biliary lipid secretion: immunolocalization and  identification of a protein associated with lamellar cholesterol carriers in supersaturated rat and human bile. J Lipid Res 34:1883–1894, 1993. 190. JM Crawford. Cellular and molecular biology of the inflamed liver. Curr Opin Gastroenterol 13:175–185, 1997. 191. M Trauner, M Arrese, H Lee, JL Boyer, SJ Karpen. Endotoxin downregulates rat hepatic ntcp gene expression via decreased activity of critical transcription  factors. J Clin Invest 101:2092–2100, 1998. 192. M Trauner, M Arrese, CJ Soroka, M Ananthanarayanan, TA Koeppel, SF Schlosser, FJ Suchy, D Keppler, JL Boyer. The rat canalicular conjugate export  pump (Mrp2) is down­regulated in intrahepatic and obstructive cholestasis. Gastroenterology 113:255–264, 1997. 193. IM Yousef, SG Barnwell, F Gratton, B Tuchweber, A Weber, CC Roy. Liver cell membrane solubilization may control maximum secretory rate of cholic acid in  the rat. Am J Physiol 252:G84–G91, 1987. 194. WGM Hardison, DE Hatoff, D Miyai, RG Weiner. Nature of the bile acid maximum secretory rate in the rat. Am J Physiol 241:G337–G343, 1981. 195. C Gartung, M Ananthanarayanan, MA Rahman, S Schuele, S Nundy, CJ Soroka, A Stolz, FJ Suchy, JL Boyer. Down­regulation of expression and function of  the rat liver Na+/bile acid cotransporter in extrahepatic cholestasis. Gastroenterology 110:199–209, 1996. 196. C Gartung, S Schuele, SF Schlosser, JL Boyer. Expression of the rat liver Na+/taurocholate cotransporter is regulated in vivo by retention of biliary constituents  but not their depletion. Hepatology 25:284–290, 1997. 197. NV Bergasa, EA Jones. The pruritus of cholestasis: potential pathogenic and therapeutic implications of opioids. Gastroenterology 108:1582–1588, 1995. 198. M Muller, PLM Jansen. The secretory function of the liver: new aspects of hepatobiliary transport. J Hepatol 28:344–354, 1998. 199. AS Knisely, NB Freimer. Insight into bile duct differentiation takes (notched) wings. Hepatology 27:298–299, 1998. 200. CMJ Van Nieuwkerk, RPJO Elferink, AK Groen, R Ottenhoff, GNJ Tytgat, KP Dingemans, MAVB Weerman, GJA Offerhaus. Effects of ursodeoxycholate  and cholate feeding on liver disease in FVB mice with a disrupted mdr2 P­glycoprotein gene. Gastroenterology 111:165–171, 1996.

  

Page 96

201. JML De Vree, E Jacquemin, E Sturm, D Cresteil, PJ Bosma, J Aten, JF Deleuze, M Desrochers, M Burdelski, O Bernard, et al. Mutations in the MDR3 gene  cause progressive familial intrahepatic cholestasis. Proc Natl Acad Sci USA 95:282–287, 1998. 202. JF Deleuze, E Jacquemin, C Dubuisson, D Cresteil, M Dumont, S Erlinger, O Bernard, M Hadchouel. Defect of multidrug­resistance 3 gene expression in a  subtype of progressive familial intrahepatic cholestasis. Hepatology 23:904–908, 1996. 203. R Welti, M Glaser. Lipid domains in model and biological membranes. Chem Phys Lipids 73:121–137, 1994. 204. OG Mouritsen, K Jorgensen. Dynamical order and disorder in lipid bilayers. Chem Phys Lipids 73:3–25, 1994. 205. NM Hooper. Membrane biology: do glycolipid microdomains really exist? Curr Biol 8: R114–R116, 1998. 206. F Schroeder. Lipid domains in plasma membranes from rat liver. Eur J Biochem 132: 509–516, 1983. 207. PFF Almeida, WLC Vaz, TE Thompson. Percolation and diffusion in three­component lipid bilayers: effect of cholesterol on an equimolar mixture of two  phosphatidylcholines. Biophys J 64:399–412, 1993. 208. Y­K Shin, DE Budil, JH Freed. Thermodynamics and dynamics of phosphatidylcholine­cholesterol mixed model membranes in the liquid crystalline state: effects  of water. Biophys J 65:1283–1294, 1993. 209. PL­G Chong, F Liu, MM Wang, K Truong, IP Sugar, RE Brown. Fluorescence evidence for cholesterol regular distribution in phosphatidylcholine and in  sphingomyelin lipid bilayers. J Fluoresc 6:221–230, 1996. 210. F Liu, IP Sugar, PLG Chong. Cholesterol and ergosterol superlattices in three­component liquid crystalline lipid bilayers as revealed by dehydroergosterol  fluorescence. Biophys J 72:2243–2254, 1997. 211. P Mattjus, JP Slotte. Does cholesterol discriminate between sphingomyelin and phosphatidylcholine in mixed monolayers containing both phospholipids. Chem  Phys Lipids 81:69–80, 1996. 212. HM McConnell. Equilibration rates in lipid monolayers. Proc Natl Acad Sci USA 93: 15001–15003, 1996. 213. MB Sankaram, TE Thompson. Cholesterol­induced fluid­phase immiscibility in membranes. Proc Natl Acad Sci USA 88:8686–8690, 1991. 214. C Rahner, B Stieger, L Landmann. Structure­function correlation of tight junctional impairment after intrahepatic and extrahepatic cholestasis in rat liver.  Gastroenterology 110:1564–1578, 1996. 215. R Schubert, K Beyer, H Wolburg, K Schmidt. Structural changes in membranes of large unilamellar vesicles after binding of sodium cholate. Biochemistry  25:5263–5269, 1986. 216. DJ Cabral, DM Small, HS Lilly, JA Hamilton. Transbilayer movement of bile acids in model membranes. Biochemistry 26:1801–1804, 1987. 217. PFF Almeida, WLC Vaz, TE Thompson. Lateral diffusion and percolation in two­phase, two­component lipid bilayers: topology of the solid­phase domains in­ plane and across the lipid bilayer. Biochemistry 31:7198–7210, 1992. 218. JW Nichols. Low concentrations of bile salts increase the rate of spontaneous phospholipid transfer between vesicles. Biochemistry 25:4596–4601, 1986. 219. AR Tall, DM Small. Body cholesterol removal: role of plasma high­density lipoproteins. Adv Lipid Res 17:1–51, 1980. 220. T Handa, H Saito, K Miyajima. Phospholipid monolayers at the triolein­saline interface: production of microemulsion particles and conversion of monolayers to  bilayers. Biochemistry 29:2884–2890, 1990. 221. P Ostapchuk, P Hearing, D Ganem. A dramatic shift in the transmembrane topology of a viral envelope glycoprotein accompanies hepatitis B viral  morphogenesis. EMBO J 13:1048–1057, 1994.

  

Page 97

222. DP Siegel, RM Epand. The mechanism of lamellar­to­inverted hexagonal phase transitions in phosphatidylethanolamine: Implications for membrane fusion  mechanisms. Biophys J 73:3089–3111, 1997. 223. DM Small, MC Bourgès, DG Dervichian. The biophysics of lipidic association: I. The ternary systems lecithin­bile salt­water. Biochim Biophys Acta 125:563– 580, 1966. 224. J Lemmich, K Mortensen, JH Ipsen, T Honger, R Bauer, OG Mouritsen. The effect of cholesterol in small amounts on lipid bilayer softness in the region of the  main phase transition. Eur Biophys J Biophys Lett 25:293–304, 1997. 225. KJ Van Erpecum, MC Carey. Influence of bile salts on molecular interactions between sphingomyelin and cholesterol: relevance to bile formation and stability.  Biochim Biophys Acta Lipids Lipid Metab 1345:269–282, 1997. 226. PL Yeagle. Cholesterol and the cell membrane. Biochim Biophys Acta 822:267–287, 1985. 227. JH Ipsen, OG Mouritsen, M Bloom. Relationships between lipid membrane area, hydrophobic thickness, and acyl­chain orientational order: the effects of  cholesterol. Biophys J 57:405–412, 1990. 228. TX Xiang, BD Anderson. Phase structures of binary lipid bilayers as revealed by permeability of small molecules. Biochim Biophys Acta Bio Membr 1370:64– 76, 1998. 229. P Walde, J Sunamoto, CJ O'Connor. The mechanism of liposomal damage by taurocholate. Biochim Biophys Acta 905:30–38, 1987. 230. CJ O'Connor, RG Wallace, K Iwamoto, T Taguchi, J Sunamoto. Bile salt damage of egg phosphatidylcholine liposomes. Biochim Biophys Acta 817:95–102,  1985. 231. A Carruthers, DL Melchior. Studies of the relationship bertween bilayer water permeability and bilayer physical state. Biochemistry 22:5797–5807, 1983. 232. C Oshio, MJ Phillips. Contractility of bile canaliculi: implications for liver function. Science 212:1041, 1981. 233. N Watanabe, N Tsukada, CR Smith, MJ Phillips. Motility of bile canaliculi in the living animal: implications for bile flow. J Cell Biol 113:1069–1080, 1991. 234. D Needham. Measurement of interbilayer adhesion energies. Methods Enzymol 220: 111–129, 1993. 235. A De la Maza, AM Manich, JL Parra. Intermediate aggregates resulting in the interaction of bile salt with liposomes studied by transmission electron microscopy  and light scattering techniques. J Microsc 186:75–83, 1997. 236. A Kaplun, Y Talmon, FM Konikoff, M Rubin, A Eitan, M Tadmor, D Lichtenberg. Direct visualization of lipid aggregates in native human bile by light­ and  cryo­transmission electron­microscopy. FEBS Lett 340:78–82, 1994. 237. M Fuchs, MC Carey, DE Cohen. Evidence for an ATP­independent long­chain phosphatidylcholine translocator in hepatocyte membranes. Am J Physiol  273:G1312–1319, 1997. 238. GA Kullak­Ublick, T Gerloff, B Hagenbuch, F Berr, PJ Meier, B Stieger. Expression of a rat liver phosphatidylcholine translocator in Xenopus laevis oocytes.  Hepatology 23: 1254–1259, 1996. 239. L Cornacchia, H Domdey, J Mössner, F Berr. Expression of a non­mdr2­coded liver phosphatidylcholine membrane transport protein in Xenopus laevis  oocytes. Biochem Biophys Res Commun 231:277–282, 1997. 240. DE Cohen, M Fuchs. Transmembrane translocation of phosphatidylcholines and biliary lipid secretion: evidence for "flippases" in the canalicular plasma  membrane. Hepatology 24:1546–1548, 1996. 241. D Seidel, P Alaupovic, RH Furman. A lipoprotein characterizing obstructive jaundice: I. Method for quantitative separation and identification of lipoproteins in  jaundiced subjects. J Clin Invest 48:1211–1223, 1969. 242. P Laggner, O Glatter, K Muller, O Kratky, G Kostner, A Holasek. The lipid bilayer structure of the abnormal human plasma lipoprotein X: an x­ray small­ angle­scattering study. Eur J Biochem 77:165–171, 1977.

  

Page 98

243. RPJ Oude Elferink, R Ottenhoff, J Van Marle, CMG Frijters, AJ Smith, AK Groen. Class III P­glycoproteins mediate the formation of lipoprotein X in the  mouse. J Clin Invest 102:1749–1757, 1998. 244. ECR Quintao. Is reverse cholesterol transport a misnomer for suggesting its role in the prevention of atheroma formation. Atherosclerosis 116:1–14, 1995. 245. B Khanuja, Y­C Cheah, M Hunt, PM Nishina, DQ­H Wang, HW Chen, JT Billheimer, MC Carey, B Paigen. Lith1, a major gene affecting cholesterol  gallstone formation among inbred strains of mice. Proc Natl Acad Sci USA 92:7729–7733, 1995. 246. D Machleder, B Ivandic, C Welch, L Castellani, K Reue, AJ Lusis. Complex genetic control of HDL levels in mice in response to an atherogenic diet— coordinate regulation of HDL levels and bile acid metabolism. J Clin Invest 99:1406–1419, 1997. 247. A Rigotti, BL Trigatti, M Penman, H Rayburn, J Herz, M Krieger. A targeted mutation in the murine gene encoding the high density lipoprotein (HDL) scavenger  receptor class B type I reveals its key role in HDL metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 94: 12620–12615, 1997. 248. DM Heuman. The source of the bile: The legacy of Mathias Möckel. Hepatology 24: 274–276, 1996.

  

Page 99

5—  Bile Ductal Secretion and Its Regulation Won Kyoo Cho Indiana University School of Medicine and The Richard L. Roudebush VA Medical Center, Indianapolis, Indiana I—  Introduction As ancient Babylonian and Greeks thought, bile secretion serves a very important role in our well­being. Bile secretion assists fat digestion by forming micelles with bile  acids, neutralizes gastric acid with bicarbonate secretion, and facilitates removal of toxins or waste materials. The role of bile duct epithelium in bile formation has been  recognized since 1920s (1). Early physiological studies suggested the importance of the bile duct epithelium in the modification of bile via secretion and absorption of  ions, water, bile acids, carbohydrates, and proteins. In fact, cholangiocytes contribute about 10% of daily bile output in the rat and about 40% in the human, although  they represent only 2 to 5% of total liver cells (2,3). In spite of rigorous attempts to isolate and study the cholangiocytes in the past, the relatively small numbers of  cholangiocytes in the liver and their tight associations with hepatic parenchymal cells had made their isolation a difficult task. However, recent advances in isolation  methods have rejuvenated the research efforts to understand the physiology and biology of bile ducts. This chapter focuses on these recent developments in this  exciting research area. II—  Anatomy Greater than 2 km of bile ducts and ductules in the human liver deliver bile from hepatocyte to the second portion of the duodenum at the papilla of Vater (4). Bile  ducts are lined with cholangiocytes resting on a basement membrane and sealed with tight junctions. Bile ducts receive their blood supply from the peribiliary vascular  plexus arising from the hepatic artery as well as from portal blood and lymph vessels for gas and nutrients (5). The biliary system is categorized into extrahepatic and intrahepatic bile ducts. The extrahepatic bile ducts consist of the right and left hepatic ducts, which join to form  the common hepatic duct. The intrahepatic bile ducts are divided into 12 generations of bile duct branches with decreasing diameter from the hilum. of the liver toward  canals of Hering in the periphery. Commonly, these bile duct branches are named according to the size of their diameters (Table 1). About six definable segments with  12 branches are recognized based on the diameters of the segments. Recent studies indicate that larger bile ducts are lined by larger, columnar cholangiocytes with  basally displaced nuclei and a lower nucleus­to­cytoplasm ratio, while smaller ducts are lined by less tall columnar or cuboidal cells with a higher nucleus­to­cytoplasm  ratio (6,7). The cholangioles or ductules are the smallest intrahepatic ducts, measuring less than 15  m in diameter, and are lined by 3 to 4 cuboidal cholangiocytes (6).  The canals of Hering,

  

Page 100 Table 1 Terminology of Intrahepatic Bile Ducts Type of ducts

Generation of branching Approximate diameter ( m)

Left and right hepatic duct

First generation

Segmental duct

Second generation

Area duct

>800 400–800

Third generation

300–400

Septal duct

 

Interlobular duct

 

15–100

Medium­sized

 

40–100

Small­sized

 

15–40

Ductules (cholangioles)

>100

Twelfth generation

<15

the smallest extensions of the intrahepatic biliary tree, are lined by both hepatic parenchymal cells and cholangiocytes with an intact basement membrane. They  establish the connections between the hepatic parenchyma and the biliary tree. III—  Functions of the Biliary System Until recently, bile ducts were considered merely passive conduits delivering bile produced by hepatocytes to the duodenum. However, it has become more apparent  that bile ducts play many other active roles in hepatic biology and pathophysiology. In addition to their active involvement in bile secretion and absorption of various  ions and biochemicals, as further discussed in this chapter, they also participate actively in immune functions as well as proliferation/differentiation during growth and  liver regeneration (8,9). They secrete peptides and mediators such as IgA immunoglobulins (2), interleukins (10), transforming growth factor beta (TGF­ b ) (11),  monocyte chemotactic protein­1 (MCP­1) (12), and endothelin­1 (13), which may play important roles in intercellular communication, proliferation, inflammation, and  immunomodulation. Furthermore, bile ducts are increasingly being recognized as major sites of diverse pathological processes in inflammatory, immunological,  infectious, toxic, ischemic, and neoplastic liver diseases as well as in congenital and acquired "vanishing bile duct" disorders (9). Covering such diverse areas of rapidly  expanding research in biliary physiology is beyond the scope of this chapter. Thus, this chapter focuses on the functions of the biliary system in bile secretion and  modification. IV—  Experimental Models of Biliary Secretion Physiological in vivo animal models using dog, pig, and rat have been widely available to study bile secretion. Although these study models have contributed greatly to  our understanding of bile secretion and hepatic physiology, the complexities of bile secretion involving both hepatocytes and bile ducts and possible influences from  other organs or neurohumoral effects have limited their usefulness. Important ex vivo models to study bile ductal secretion are isolated perfused rat liver (IPRL) with  and without bile duct ligation. By using these experimental models, studies in the 1960s showed that secretin stimulated bicarbonate­rich choleresis from the bile ducts,  and that the increase in   was associated with a reciprocal decrease in Cl­ in bile. More recently, the development of in vitro models—such as isolated bile duct  cells, isolated bile duct units, and bile duct cell monolayers as well as long­term cultures—have provided better tools to study biliary secretion.

  

Page 101

A—  Isolated Perfused Rat Liver Although many in vivo and ex vivo animal models have been used to study bile secretion, IPRL models have been the best characterized and most widely utilized since  their use was first reported by Claude Bernard over 100 years ago (14). Other animals—such as cat, dog, guinea pig, pig, and monkey—have also been used for  isolated perfused liver studies, but the rat is most commonly used, not only because of well established techniques but also because of its easy availability, convenient  size, and low cost (14). Moreover, IPRL permits repeated sampling of the perfusate and bile, easy administration of drugs or hormones, and alteration of temperature  or perfusate. It also allows experiments to be conducted independent of neurohumoral effects or influence from other organ systems. Therefore, this model has been  used extensively to study hepatic metabolism, synthesis, and extraction as well as bile secretion, drug toxicity, and lobular heterogeneity (14). In bile secretion studies, IPRL has been an invaluable tool to examine various aspects of the bile secretory process and its regulation, but IPRL has some limitations for  studying bile duct secretion. The bile collected from the IPRL represents the final products after hepatic secretions and bile ductular modifications; thus it is not  possible to examine each component of bile secretion selectively. In rat livers, since cholangiocytes contribute only ~10% of bile output, alterations in secretion from  bile duct level are not readily detectable. To overcome this limitation, bile duct ligation or  ­naphthylisothiocyanate feeding has been employed to induce selective bile  duct proliferations to augment the bile duct secretory component of bile secretion. This bile duct­proliferated rat liver model has been used successfully to demonstrate  that secretin, bombesin, and VIP stimulate bile duct secretion (15–17). B—  Isolated Bile Duct Cells Isolation of cholangiocytes has been a difficult task, since they represent only 2 to 5% of total liver cells and their size and density are similar to those of other  nonparenchymal and inflammatory cells in the liver (2,3). Detailed discussions of the recent advances in cholangiocyte isolation are presented elsewhere (18). Initially, a large number of relatively pure cholangiocytes were isolated from animals with bile duct proliferation resulting from bile duct ligation or  ­ naphthylisothiocyanate treatment. These isolation techniques involved differential gradient centrifugation and counterflow elutriation techniques (3,19). Although these  cholangiocytes were isolated from rat livers with bile duct proliferation, subsequent studies showed that they had cellular and functional characteristics similar to those  from normal livers (3,19). Further improvements in isolation techniques—such as isopycnic and Percoll gradients, immunoabsorption (20), and immunomagnetic  isolation using bile duct—specific antibodies (21)—allowed the isolation of pure cholangiocytes from normal rat livers with purity as high as >95% and cell yields up to  1 million cholangiocytes per normal rat liver (21). These cell preparations were extensively characterized as cholangiocytes by morphology, using light and electron  microscopy,  GT histochemistry, or immunocytochemical detection of intermediate filament proteins such as cytokeratins 7 and 19 or other specific antigenic  determinants such as HEA 125 for human cholangiocytes (3,20,22). Currently, primary cholangiocytes have been isolated from rat, mouse, pig, and human livers.  Furthermore, these isolation techniques have also been used to isolate cholangiocytes not only from normal human livers (22) but also from diseased livers of patients  with primary biliary cirrhosis (23). Although most of these isolation and characterization methods can be applied to other animal species, some important species  differences need to be considered. For example, mouse cholangiocytes do not constitutively express  GT (24), while in guinea pig liver,  GT is expressed in  cholangiocytes as well as in sinusoidal endothelial cells (25). The isolation of pure cholangiocytes has contributed greatly to the study of biliary physiology and secretion. Intracellular pH (pHi) studies using fluorescent dyes such  as BCECF, radioisotope efflux studies, and electrophysiological studies using patch­clamping techniques

  

Page 102

have been used to characterize ion transport mechanisms and their regulation (19,26–28). Measurements of secondary messenger levels have permitted the  examination of signal transduction pathways involved in the regulation of bile duct secretion by various neuroendocrine peptides such as secretin or somatostatin  (29,30). The expression and regulation of various proteins such as transporters and receptors have been studied using molecular and cellular techniques (7,23,31). In  addition, the development of methods to isolate apical and basolateral plasma membrane fractions from isolated cholangiocytes using sucrose gradients has helped to  study the subcellular distribution of proteins such as ion transporters (32). Although these primary cholangiocyte preparations were invaluable to study biliary physiology, they have certain inherent limitations. Their relatively low cell yield and  diminishing viability after isolation as well as their high demand for labor and cost in isolation procedures have restricted their use. Furthermore, these isolated cell  preparations lose cell polarity and local cellular contacts, which are important for various aspects of epithelial cell physiology such as ion transport and the expression  of cellular proteins. In addition, although the size of the cell and the nucleus/cytoplasm ratio may help to determine the approximate origins of the isolated cells with  respect to the anatomical location (6,7), the lack of specific markers makes it impossible to ascertain from which biliary segment they are derived. The localization of  the origins of these isolated cholangiocytes may be important, since recent studies indicate functional heterogeneities among cholangiocytes from different segments of  bile ducts (6,7). C—  Bile Duct Cell Culture/Monolayer To overcome some of the problems associated with primary cell cultures, long­term biliary cell cultures and cell lines have been developed to study biliary physiology.  These include the cholangiocarcinoma cell lines Mz­ChA­1 and Sk­ChA­1, which were isolated from human adenocarcinomas derived from the gallbladder and  extrahepatic biliary tree, respectively (33). They have been used to study ion channels (27,28), intracellular pH (34), and signal transduction pathways (27). More  recently, by using retroviral transduction of SV40 large T antigen, immortalized bile duct cell lines from mouse (35) and human (36) livers were developed.  Furthermore, by using the same technique, immortalized cholangiocytes were also isolated from patients with cystic fibrosis (37). The development of these techniques  to prepare immortalized cholangiocytes from diseased livers should help to study various liver diseases affecting bile ducts. However, these transformed or tumor cell  lines have intrinsic limitations related to their origin and the nature of transformed cells, so that they may not exhibit normal cholangiocyte phenotypes. In addition, long­term cholangiocyte cultures also have been established from both rat and human livers (38–40). Rat cholangiocytes can form confluent polarized  monolayers with tight junctions, providing an invaluable tool to study ion transport and secretion (39,41). Although these cell cultures are thought to be derived from  "normal" cholangiocytes, they also have certain problems, such as clonal selection and dedifferentiation, which can modify their phenotypes and gene expression with  multiple passages. Therefore, they may not represent normal cholangiocytes, raising questions on the validity of applying the results to normal biliary physiology.  Furthermore, as with the isolated cholangiocyte model, functional heterogeneities among cholangiocytes cannot be studied with these cell lines, since they represent  only the phenotypes of certain cholangiocyte populations from which these cell lines derived. D—  Isolated Bile Duct Unit To overcome some of the problems associated with the isolated cholangiocytes, recent efforts have focused on the isolation of intact, polarized bile duct units. Initially,  microdissection techniques were used to isolate intrahepatic bile ducts from pig livers (42). This cell preparation could be used within 6 h of isolation to study the  regulation of intracellular pHi during secretin stimulation. Subsequently, similar bile duct units were microdissected from rat livers following

  

Page 103

collagenase perfusion and injection of a liquid trypan blue­agar solution into the portal vein and hepatic artery to better distinguish bile ducts from blood vessels (43).  These isolated bile ducts were cultured for 36 to 48 h to allow the open ends to seal and form bile duct units. These IBDUs were then microinjected with fluorescent  pH and Cl­ markers to measure luminal pH and [Cl­] with secretin stimulation (43). This preparation method is very labor­intensive and time­consuming, yielding only a  small number of IBDUS. It also cannot be used to isolate smaller interlobular IBDUS, ranging from 15 to 100  m in diameter, which make up the major portion of the  Bile Duct Epithelium (BDE) and are thought to represent the main "active" secretory site. More recently, we have developed a novel intact polarized isolated bile duct unit (IBDU) from rat liver, consisting of an enclosed lumen lined by polarized  cholangiocytes (44) (Fig. 1). In contrast to the earlier isolation methods from pig (42) and rat livers (43), our newer isolation method eliminates the tedious and time­ consuming microdissection step and can produce many functional and polarized IBDUs from small to medium­sized (30­ to 100­ m) bile ducts from rat (44). The  isolation method involves collagenase perfusion, teasing out parenchymal cells, mincing, and serial enzymatic digestion of the remaining stroma with pronase,  collagenase, DNase, and hyaluronidase (44). After selecting digested bile duct fragments using sized meshes, segments of bile ducts averaging 25  m in diameter can  be identified by  ­glutamyl transferase and cytokeratin (7,19) immunostaining (44). When placed on matrigel and cultured for 24 to 48 h, these segments seal off their  luminal ends and develop spheroids with an enclosed lumen lined by cholangiocytes, as demonstrated by Nomarski, confocal, and electron microscopy (Fig. 1) (44). Functionally, we have demonstrated these IBDUs to be a powerful functional secretory model to study the effects of agonists and inhibitors on biliary secretion  (16,44). The IBDUs respond to neuroendocrine peptides such as secretin, bombesin, and VIP by increasing secretion into their enclosed luminal spaces, and these  changes in volume can be measured by quantitative videomicroscopy (16,44). Using BCECF microfluorometric pH and micropuncture techniques, we have shown  that these peptides stimulate fluid and bicarbonate secretion at the level

Figure 1 Videomicroscopy of isolated bile duct unit (IBDU) from the rat. Nomarski images of the IBDU show that IBDU is consisted of a central lumen enclosed by cholangiocytes. Videomicroscopic images before (left panel) and after (right panel) stimulation with VIP (100 nM) for 30 min demonstrate that the enclosed lumen expands with an increased secretion into the lumen.

  

Page 104

Figure 2 Ion transport mechanisms in the cholangiocyte. Many ion transport mechanisms have been characterized recently, but the precise localizations for some of these transporters are not determined; thus they are tentatively shown in the figure. At the apical membrane, a   exchanger (AE2), which is presumably coupled to Cl­ channels, mainly mediates   secretion into the bile following  administration of choleretic agents such as secretin. A number of different Cl­ channels have been  characterized, including cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), Ca2+­activated  Cl­channel (CDCC), as well as high­conductance anion channel (HCAC). The CDCC is thought to be  activated by increased intra­cellular Ca2+ levels from luminal purinergic nucleotides or UDCA. Apical  Na+/H+ exchanger (NHE2) is thought to mediate Na+ reabsorption. At the basolateral membrane, in  addition to Na+/H+ exchanger (NHE1), acid extrusion is mainly mediated by   symport  in the rat, Na+­dependent   exchanger in the human, and H+­ATPase in pig cholangiocytes  to counteract intracellular acidification from apical   secretion. Basolateral Na+/K+­ATP­ ase  in conjunction with K+ channels establish and regulate Na+ gradient and membrane potentials, which  are vital for various ion transport activities. High intracellular Cl­ level is maintained by a basolateral  Na+/K+/2Cl­ cotransport. Water transport across bile duct epithelium is facilitated by water channels  present in both basolateral and apical membranes. In addition, a carbonic anhydrase present in cholangiocytes helps intracellular pH regulation.

  

Page 105

of the bile duct by increasing   exchange (16,17,45). Furthermore, studies using various specific inhibitors have enabled us to further characterize the  underlying ion transport mechanisms involved in these neuroendocrine peptide­stimulated biliary secretory responses (46,47). These novel IBDUs represent the only intact functional polarized in vitro bile duct model that permits direct measurements of net fluid secretion to study the biliary  secretion in small to medium­sized interlobular segments of the biliary tree where CFTR resides (7,44). Moreover, the lumen is large enough to be microinjected with  cell­impermeable pH­sensitive BCECF­ dextran to study changes in luminal pH (16,44). In addition, this isolation method can be of help in the study of various  populations of IBDUs from different segments of biliary tree with apparent functional and structural heterogeneities (6,7) by selecting different sizes of bile duct  fragments during enzymatic digestion steps. Although each experimental cell model has its shortcomings, they have provided invaluable clues to the complex puzzles in biliary physiology required to elucidate the  mechanism and regulation of biliary secretion and modification at the cellular and molecular levels, as discussed below. V—  Fluid and Solute Transport Biliary fluid and electrolyte transport have been extensively reviewed elsewhere (48–50). In this review, current information on the mechanism and regulation of biliary  secretion and modification of bile by cholangiocytes is summarized. A—  Electrolyte Transport Since secretin was shown to stimulate bicarbonate­rich choleresis from bile ducts in the 1960s, ion transport mechanisms in cholangiocytes have been extensively  studied and characterized (Fig. 2). These ion transporters can be broadly classified as carriers, such as exchangers and cotransporters, or ion channels. 1—  Ion Transporters A number of ion transporters have been characterized in cholangiocytes using ion transport and pH studies (Table 2). Some of these transporters are active  transporters such as Na+/K+­ ATPase and H+­ATPase, which require energy generated from ATP hydrolysis, while others are facilitated transporters, such as  Na+/H+ exchanger and Na+/K+/2Cl­ cotransporter, which are driven by ion electrochemical gradients. These transporters play important roles in cellular homeostasis,  ion transport, and pH regulation.

  

Page 106 Table 2 Ion Transporters Present in Bile Duct Epithelium Ion transporter

Animals

+

Localization

Stoichiometry

Activator

Inhibitor

Rat, human

Apical

1:1

Secretin, forskolin

DIDS

Human

Basolateral

1:1

 

DIDS

H ­ATPase

Pig

Basolateral

ATP, ?secretin

Bafiolmycin A1

Na+/H+ exchanger: NHE­1

Rat, human

Basolateral

1:1

 

Amiloride

NHE­2

Rat, human

Apical

1:1

 

Amiloride

Rat

?Basolateral

1:3

Depolarization

DIDS

All

Basolateral

3:2

ATP

Ouabain

Rat

?Basolateral

 

Bumetanide

Na ­independent 

 exchanger

Na+­dependent 

 exchanger

+

 cotransporter Na+/K+ ATPase +

+

­

Na /K /2Cl  cotransporter

Key: DIDS, 4,4'­diisothiocyano­2,2'­stilbene disulfonic acid.

  

 

 

Page 107 +

­

a. Na ­Independent  in response to their changes in chemical gradient (19,26,45,51). This transporter is thought to be closely coupled to Cl  channel  for its function and activation during secretin­stimulated biliary secretion (26). This exchanger has been localized to small and medium­sized bile ducts in  humans (51) but to medium­ and large­sized bile ducts in rats (7). The physiological significance of the heterogeneous distribution of this transporter is  unknown. b. Na+­Dependent  c. 

 symporter of rat cholangiocytes, into the cell (52).

 in response to transmembrane electrical potential changes (19,26,45).

d. Na+/H+ Exchanger. Driven by the Na+ electrochemical gradient, this transporter exchanges a Na+ with H+ and is inhibited by amiloride (19,26). Functional pH  studies in rat and human cholangiocytes indicate that they may function as an acid extruder following an acid load to maintain phi (19,26,36,52). However, its activity  is inversely proportional to pHi due to its known allosteric inhibition by H+ and has a ''set point" of pH 7.15 in rat cholangiocytes (19,26). Thus, Na+/H+ exchanger  (NHE) is thought to be relatively inactive under basal conditions in media containing   and may play a minor role in recovery from acid load under physiological  conditions. Recent molecular study has confirmed the presence of NHE isoforms 1 and 2 in cholangiocytes, while hepatocytes appears to express only isoform 1 (55).  The NHE­1 isoform is thought to be localized in the basolateral domain, while NHE­2 isoform may be present in the apical domain as in other Na+ absorbing epithelia  such as gallbladder (8) and is thought to be involved in the Na+ reabsorption. e. H+­ATPase. Like Na+/K+ ATPase, H+­ATPase is an active transporter requiring ATP as an energy source to transport H+ against its electrochemical gradient.  Some functional pH studies suggest the presence of bafilomycin­inhibitable, vacuolar­type H+­ATPase in the basolateral domain of pig cholangiocytes, which may  mediate a counterregulatory pH adjustment during secretin­stimulated bicarbonate secretion (53). However, pH studies in rat and human cholangiocytes (45,52,54)  and immunocytochemical studies of rat bile ducts (45,54) failed to show the presence of H+­ATPase in these epithelia. f. Na+/K+­ATPase. In many epithelial cells, this active electrogenic transporter provides electrochemical gradients necessary for diverse physiological processes by  pumping out three Na+ ions in exchange for two K+ ions by using the energy from ATP hydrolysis. Immunocytochemical study of the human biliary tree showed that  this transporter is localized in the basolateral domain (57). This active transporter maintains the Na+ gradient required for the functioning of various Na+­dependent  transporters discussed in this section. g. Na+/K+/2Cl­ Cotransporter. Radioisotope uptake and efflux data suggest the presence of Na+/K+/2C­ cotransporter inhibitable by bumetanide in transformed bile  duct cell

  

Page 108 ­

­

­

lines (27). This ion transporter may play an important role in basolateral Cl  uptake to maintain the high Cl  gradient in cholangiocytes necessary to secrete Cl  into the  bile when Cl­ channels are activated (27). 2—  Ion Channels Ion channels are selective transmembranous proteins that provide an aqueous pore for the movement of ions driven by their electrochemical gradients. In bile duct  epithelia, a number of different ion channels have been identified and characterized, as shown Table 3. a. Chloride Channels. Recent electrophysiological and radioisotope efflux studies have demonstrated various Cl­ channels in cholangiocytes. Separate Ca2+ and  cAMP­dependent Cl­ currents have been identified and are thought to participate actively in the regulation of fluid and electrolyte secretion in bile duct epithelial cells. 1. cAMP­Dependent Chloride Channels or CFTR. The cAMP­dependent Cl­ channel is the best studied ion channel in bile duct epithelium. Both structurally and  functionally it appears to be the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), which mediates secretin­stimulated biliary secretion (26,28,58). It is  expressed only on the luminal membranes of cholangiocytes but not on hepatocytes (58). This Cl­ channel has a linear current­voltage relationship with no time  dependence and is stimulated by forskolin or CAMP analogues, but it is not inhibited by DIDS (28,58). This Cl­ channel is also thought to be closely coupled to the   secretion during secretin­stimulated choleresis (26,28). However, studies in other cells suggest that CFTR has multiple other functions, which include regulation  of other Cl­ channels (59) or Na+ channels (60), ATP transport across membranes (59), regulation of endocytotic recycling (61), and protein glycosylation and  sulfation (62). Therefore, CFTR is a complex multifunctional protein that is responsible for the myriad heterogeneous pathologies in cystic fibrosis (CF) patients and  the defects in biliary secretion in these patients may contribute to the pathogenesis of cholestatic liver disease in CF. 2. Calcium­Dependent Chloride Channels. In bile duct epithelium, intracellular Ca2+ levels increase with extracellular nucleotide triphosphates such as ATP or UTP,  muscarinic agonists such as acetylcholine and carbacol, as well as the bile acid ursodeoxycholic acid (UDCA) (34,63–65). Increase in intracellular Ca2+ level  stimulates the Ca2+­dependent Cl­ channels (CDCCS) via activation of Ca2+/calmodulin­dependent protein kinase II (50,64). These channels are outwardly rectified,  show time­dependent activation at depolarizing potentials, and reverse near the equilibrium potential for Cl­ (64). They can be stimulated by ionomycin and inhibited by  the Cl­ channel blocker DIDS. Although it is plausible that increased intracellular Ca2+ levels may induce biliary secretion, there is no direct evidence that CDCCs have  any significant role in biliary secretion in cholangiocytes. In fact, one secretion study in rat bile duct units has shown that increases in intracellular Ca2+ have minimal  direct effects on bile duct secretion (65). Therefore it remains to be determined whether CDCCs can selectively modulate biliary secretion and to determine their  physiological role in cholangiocytes. 3. High­Conductance Anion Channels. Electrophysiological studies have identified high­conductance anion channels (HCACS) in cholangiocytes (66,67), which are  generally closed in basal conditions and have significant permeability to both Cl­ and   (2:1). They are shown to be insensitive to CAMP or Ca2+ but are regulated  cooperatively by membrane potential and pertussis toxin (PTX)­sensitive G proteins in a membrane­delimited manner (66,67). They can be activated by GDP and  inhibited by GTP and PTX (67). Although HCACs are thought to be involved in the regulation of pH, cell volume, and secretion of fluid and electrolytes, their role in  biliary secretion and physiology remains to be further elucidated. b. Potassium Channels. Potassium channels are involved in the regulation of electrogenic solute transport in various epithelia including bile duct epithelia (27,68,69).  The biliary secretion induced by various secretagogues such as secretin, bombesin, and VIP is dependent on K+ channels, presumably related to the role of the cell  membrane potential as described for

  

Page 109 Table 3 Ion Channels Present in Bile Duct Epithelium Channels

Localization

Ion selectivity

I/V relation

 

Time dependence

 

Activator

 

 

Apical

Cl­  > I­

Linear

No

Secretin,  forskolin

NPPB

Calcium­dependent (CDCC)

?Apical

I­  > Cl­

Outward

Yes

ATP, UDCA,  ionoycin

DIDS

High­conductance anion  channel

?

Cl­  > gluconate

Potassium channels

?Basolateral

 

Water channels (aquaporin)

Both

 

  Linear

 

 

Inhibitor

cAMP­dependent (CFTR)

Chloride channels

 

 

PTX

 

 

ATP

BaCl2

 

Secretin

HgCl2

Key: NPPB, 5­nitro­2'­(3­phenylpropylamino)­benzoate; DIDS, 4,4'­diisothiocyano­2,2'­stilbene disulfonic acid; PTX, pertussis toxin.

  

Page 110 +

secretin (26,46,47). These secretagogues may facilitate secretion by activating K  channels and hyperpolarizing cholangiocytes, which provides an electrogenic driving  force for Cl­ conductance via Cl­ channels or balances the membrane depolarization resulting from  exit at the luminal surface. Among many types of K+ channels known in different cell types, maxi­K+ channels, which are inhibited both by BaCl2 and TEA, appear to be involved in the secretin­  and bombesin­stimulated fluid secretion (47). While the main effects of various secretogogues such as secretin and DBcAMP are thought to be induced by an increase  in apical Cl­ conductance that results in membrane depolarization, it does not exclude the possibility that a primary increase in basolateral K+ conductance may also  occur. Whether this K+ channel involvement represents a primary increase in basolateral K+ conductance, as occurs in some Cl­ secreting epithelia (68), or a  secondary increase driven by membrane depolarization resulting from Cl­ efflux remains to be determined. In fact, patch­clamp experiments in pancreatic duct cells  have shown that following exposure of these cells to secretin, the activity of maxi­K+ channels increases more than 2000 times above control values mainly by a  substantial reduction in the time that the channel is in the closed state (69). Electrophysiological studies will be needed to further clarify this question in regard to  cholangiocytes. 3—  Carbonic Anhydrase A histochemical study has demonstrated that carbonic anhydrase activity is preferentially localized to bile ductules, with weaker reactions in peripheral zones of the  liver lobules (70). Previous in vivo studies in bile fistula rats (71,72) showed that acetazolamide significantly decreased UDCA­induced bile flow and bicarbonate  secretion. In pigs (70), acetazolamide also inhibited UDCA­dependent as well as secretin­stimulated biliary   secretion but had no effect on basal   secretion  in sodium taurocholate­infused pigs. These studies indicate the involvement of carbonic anhydrase in bicarbonate secretion into bile. Recent studies using isolated rat  bile duct units confirmed that carbonic anhydrase has a minimal function during basal secretion but may be necessary to generate additional   when    secretion is stimulated by various secretagogues such as secretin, bombesin, and VIP (46,47). Thus, these findings suggest that carbonic anhydrase in cholangiocytes  may provide another mechanism, in addition to   symport or H+­ATPase, to increase the   supply when the demand for   increases during  NHCO.GIF secretagogue­stimulated   secretion. B—  Water Transport Water movement through transcellular and paracellular pathways passively follows osmotic driving forces produced by active solute transport in epithelial cells. Tight  junctions play important roles in establishing cell polarity and barrier. In bile duct epithelium, in vitro data indicate that transepithelial water transport occurs primarily  through a transcellular pathway and is mainly mediated by water channel or aquaporin (73). Recent molecular and immunohistochemical studies have shown that  aquaporin 1 (AQP 1) is present in apical as well as basolateral domains of cholangiocytes but not in hepatocytes (73,74). Furthermore, this water channel is thought to  be regulated by membrane recycling and involved in the secretin­induced biliary secretion (75). C—  Bile Acid Transport/Cholehepatic Circulation In vivo studies of the effect of administration of bile acids on bile secretion in anesthetized biliary fistula hamsters, rats, and guinea pigs as well as the isolated perfused  hamster liver showed that UDCA induced a marked bicarbonate­rich hypercholeresis, which was far greater than that induced by any other bile acid administered  (76). As an explanation for this UDCA­

  

Page 111

induced bicarbonate­rich hypercholeresis, the cholehepatic shunt hypothesis was proposed (76). This hypothesis postulates that a fraction of UDCA taken up by  hepatocytes is secreted into canalicular bile in the unconjugated form and is protonated by a H+ ion derived from carbonic acid that was generated by the hydration of  luminal CO2 by carbonic anhydrase present in biliary ductular cells. The protonated UDCA is reabsorbed, thus leaving a bicarbonate anion in the lumen. The bile acid  passes through the cholangiocyte and is transported across the basolateral membrane; it returns to the sinusoids via the peribilliary capillary plexus and is taken up by  the hepatocytes to then be resecreted into bile. Thus, this recycling of the UDCA by cholehepatic shunt pathway can provide a plausible explanation for the observed  UDCA­induced bicarbonate­rich hypercholeresis. Although bile acid transport was thought to occur in cholangiocytes, the details of this process were not known until recently. Molecular and radioisotope uptake  studies in confluent polarized monolayers of normal rat cholangiocytes have demonstrated a Na+­dependent, unidirectional, apical to basolateral transport of [3H] taurocholate, indicating the presence of a bile acid transporter in bile duct epithelium (31,41). Kinetic studies in purified apical membrane vesicles and molecular  characterizations in rat cholangiocytes have shown that a bile acid transporter is present in the cholangiocytes and is identical to the rat ileal apical Na+­dependent bile  acid transporter (31,41). Immunoblots and immunohistochemistry have demonstrated that this 48­kDa protein is present only in apical membranes of large but not  small cholangiocytes (31,41). In addition, the 14­kDa ileal cytosolic binding protein is also shown to be present in large but not small cholangiocytes (31) and may  help to transport absorbed bile acids across the cholangiocyte. Therefore, these studies indicate that conjugated bile acids can be taken up by this apical bile acid  transporter and may modify canalicular bile secretion and modulate ductal bile secretion. However, the real physiological significance of this bile acid uptake system in  cholangiocytes and the transport mechanism across the basolateral membrane is poorly understood. Moreover, the UDCA­induced hypercholeresis may not use this  transport mechanism, since the protonated UDCA is thought to be reabsorbed mainly by permeation across the apical membrane (76). D—  Glucose Transport For a long time, physiological studies have shown that biliary epithelia absorb simple sugars such as glucose and xylose from the bile system by Na+­dependent and  independent transport systems (77,78). This ductular absorption of monosaccharides also causes decreased bile flow and increased taurocholate concentration in bile,  suggesting that this process also induces water reabsorption (78). Although the physiological roles of this ductular absorption of sugar are not clear, it may prevent  bacterial growth in gallbladder by decreasing the nutrients in bile and may serve as a mechanism for water absorption from bile duct epithelium (78). Recent studies have demonstrated the presence of two glucose transporters in bile duct epithelium. Radiolabeled nonmetabolizable monosaccharide uptake studies  using polarized rat cholangiocyte monolayer revealed a vectorial, saturable, apical glucose uptake which was Na+­dependent and inhibitable by phlorizin, a competitive  inhibitor of the Na+/glucose cotransporter (41). Further molecular studies using RT­PCR also confirmed the expression of the Na+/glucose transporter SGLT­1 in  cholangiocytes (41). In addition, the facilitated glucose transporter GLUT­1 has also been shown to be present in cholangiocytes (41,79). However, in contrast to the  previous immunofluorescent study in rat liver sections showing its apical and lateral plasma membrane localization (79), a more recent molecular study using polarized  rat cholangiocyte monolayers showed that GLUT­1 was detected in vesicles enriched in basolateral plasma membrane fractions (41). The reason for this discrepancy  is not clear. These studies suggest that cholangiocytes take up glucose from bile via SGLT­1 (and GLUT­1) present on the apical domain and transport glucose across  the basolateral membrane via GLUT­1, thus accounting for glucose absorption from bile.

  

Page 112

E—  Amino Acid Transport Measurements of biliary amino acids in the rat, guinea pig, rabbit, and dog reveal that glutamate (0.06 to 0.5 mM), cystine (0.2 to 1.1 mM), and glycine (1.7 to 2.8  mM) account for most of the total amino acids in bile (80,81). In these animals, glutathione contributes to the major portion of bile acid­independent bile flow. It is  secreted into bile but is broken down by  GT present on the apical membranes of bile duct epithelium (80,81). Subsequently, the glutamate and cysteine moieties  derived from the hydrolysis of glutathione are partially reabsorbed either as peptides, free amino acids, or conjugates (81). These data indicate that cholangiocytes  have transport systems for amino acids involved in the intrahepatic reabsorption of amino acids from bile. One recent study in primary cultures of rat cholangiocytes  demonstrated that cholangiocytes have high­capacity Na+­dependent as well as a Na+­independent uptake systems for glutamate (82) that are different from those in  hepatocytes. These transport systems may play an important role in reclaiming the glutathione from the bile (80,81). VI—  Regulation of Biliary Secretion Physiological in vivo studies in dogs in 1960s demonstrated that the feeding of food stimulated bicarbonate­rich bile secretion (83). Secretin, identified by Bayliss and  Starling in 1902, has been considered as the main regulator of biliary bicarbonate secretion (84). However, as with the Pavlovian response in gastric secretion,  bicarbonate­rich bile secretion increased also with sham feeding (85), indicating the importance of neural regulation in postprandial choleresis. Although there are many  unanswered questions in the regulation of bile secretion, the unavailability of adequate experimental models and complexities of bile secretion involving hepatocytes and  bile ducts has limited our understanding of this process. In this section, recent understandings of this fascinating topic are reviewed with special focus on endocrine,  neural, and paracrine regulation of biliary secretion. A—  Endocrine The first experiment showing that hepatic bile secretion is under hormonal control was performed in 1825 by Leuret and Lassaigne (86). They found that bile flow  increased when vinegar was applied to duodenal mucosa. Subsequently Bayliss and Starling in 1902 described secretin as the responsible secretagogue (84). As shown in Table 4, many hormones have been shown to influence bile secretion in in vivo models but only recently, with the developments of various in vitro and ex  vivo models of bile secretion, have these processes been examined systematically. Interestingly, endocrine control has a quite limited role in bile acid­dependent bile  secretion, but it has variable influences in canalicular bile acid­independent and bile ductular secretions. Some hormones—such as secretin, CCK, and glucagon— have stimulatory effects on bile secretion, while somatostatin and substance P are known to be inhibitory. Furthermore, these hormones also interact among themselves  to modulate bile secretion. 1—  Secretin Discovered in 1902 as the first hormone, secretin has been shown to stimulate bicarbonate­rich bile secretion (84), but it was not until the 1960s that its choleretic  effect was thought to occur by acting at the bile ducts (87). This secretin­stimulated biliary   exchange mechanism (87). Studies in the bile duct­ligated rat  model with bile duct

  

Page 113 Table 4 Effects of Neuroendocrine Peptides on Bile Secretion Neuroendocrine peptide

Bile acid dependent

Bile acid independent

Bombesin

0

0

Bile ductal

CCK

0

+

Gastrin

0

0

Glucagon

0

+

Secretin

0

0

+

Somatostatin

­

­

­/0

+

  +/­

 

Substance P

0

­

0

VIP

+

0

+

proliferation have also demonstrated that secretin acts on the bile duct epithelium to stimulate biliary bicarbonate secretion (3). Autoradiographic studies using 125I­ labeled secretin confirmed the presence of secretin binding sites on bile ducts but not on hepatocytes (88). Our recent pH studies in isolated rat cholangiocytes indicate that secretin stimulates biliary bicarbonate secretion by stimulating  pH (19,26). In contrast, in human cholangiocytes, stimulation of Na+­independent 

 entry to maintain the intracellular 

 secretion in human cholangiocytes.

In addition, secretin is also thought to stimulate secretion by membrane recycling of vesicles containing ion transporters (53,90) and water channels (75). In pig bile  duct epithelium, secretin induces a colchicine­inhibitable decrease in the number of cytoplasmic vesicles, which is associated with an increase in the basolateral  membrane surface area (91,92). Moreover, functional pH data suggest that these vesicles may contain vacuolar­type H+­ATPase (53). These findings indicate that in  pig cholangiocytes, secretin appear to recruit more H+­ATPase to the basolateral membrane by vesicular exocytosis to counteract the increased intracellular acid load  during the secretin­stimulated   secretion (53). In contrast, rat and human cholangiocytes lack H+­ATPase (45,52). In rat cholangiocytes, some evidence exists  for secretin­induced microtubule­dependent vesicular translocation of vesicles and AQP1 water channels to the plasma membrane (75,90), which may serve as a  mechanism for secretin­stimulated biliary fluid secretion.

  

Page 114

2—  Gastrin Gastrin is a hormone produced by G cells in the antrum of the stomach. Gastrin actually comprises a family of closely related hormones that vary in peptide length.  Although best known as a major regulator of gastric acid secretion, gastrin can stimulate pancreatic secretion and inhibit the reabsorption of water and electrolytes in  the intestine, but it has no effect on gallbladder secretion (93–95). As for bile secretion, gastrin has been shown to induce choleresis in in vivo and ex vivo studies in  dogs (93,96), but nonsulfated gastrin I had no effect on bile flow (96). One recent study in the rat demonstrates that gastrin receptors are expressed in cholangiocytes  (97). However, that particular study instead shows that gastrin I has no effect on basal biliary secretion from the bile ducts but has inhibitory effects on secretin­ induced increases in cAMP levels in cholangiocytes as well as secretin­stimulated choleresis in anesthetized rats (97). The reasons for the observed discrepancy in  biliary secretory responses to gastrin in these studies are not clear but may be partly related to the use of different experimental models and the types and  concentrations of gastrin used. 3—  Somatostatin Since its initial isolation from sheep hypothalamus in 1973, somatostatin, a cyclic peptide with 14 or 28 amino acid residues, has been found throughout the body  (98,99). It is produced by specialized endocrine cells such as D cells in the gastrointestinal tract and neurons and can act as a hormone and neuropeptide (98). Five  subtypes (SSTRs 1 to 5) of somatostatin receptors have been identified in various tissues and are coupled to G proteins to inhibit adenyl cyclase or K+ channels (99).  Somatostatin has been shown to inhibit exocrine secretion, release of neuroendocrine peptides and substances, gastrointestinal motility, splanchnic blood flow, and  certain types of tissue growth and proliferation (98). In various animal models, somatostatin also has been shown to inhibit bile secretion both directly as well as indirectly by inhibiting the release of other secretagogues  such as secretin (95). Rat cholangiocytes express SSTR2 mRNA exclusively, whose level increases with bile duct ligation (30). While many in vivo studies on dogs  and in vitro studies in rat IBDU (16,17,100) suggested that somatostatin had no effect on secretin­induced choleresis or biliary secretion, one study in bile duct­ligated  rats showed that it inhibited both the secretin­stimulated choleresis in IPRL and increase in cAMP levels in cholangiocytes (30). The reason for this discrepancy is not  clear but may be related to the known upregulation of somatostatin receptors with bile duct ligation. In addition, somatostatin inhibits the bombesin­stimulated biliary  secretion (16) but not the choleretic effect of VIP (17,101). B. Neural Since the late nineteenth century, it has been recognized that the liver, gallbladder, and bile ducts are richly innervated by sympathetic and parasympathetic systems as  well as the right phrenic nerve via anterior and posterior plexuses (102–104). Sympathetic innervation comes mainly from the T7­10 and reaches celiac ganglia via  greater splanchnic nerves, while parasympathetic fibers are derived mainly from vagus nerves (105). Afferent nerves are poorly understood and thought to be localized  in the hepatic branch of the vagus as well as in the anterior plexus of the hepatic nerve (103). In addition, some neuropeptidergic nerves are also present in portal  triads and along the sinusoids (106,107). Although there are considerable variations in the hepatic nerve supply among different species, the intrinsic innervation by  nerve fibers mainly follows the vascular and biliary structures. Some fibers may enter the hepatic lobule, where they form a network around hepatocytes and extend  into the sinusoids (106,107). The terminal plexus in the liver parenchyma may be homologous to the Auerbach and Meissner plexuses in the gastrointestinal tract or the  cardiac and pulmonary plexuses (106,107). These hepatic nerves have been shown to be important for both efferent and sensory

  

Page 115

functions in carbohydrate and lipid metabolism, regulation of the hepatic microcirculation, and osmo­ and chemoreception. Although nerve fibers are abundant within the portal tract, blood vessels, and bile ducts, their roles in bile secretion are poorly understood, partly due to the inherent  complexities of bile secretion involving both hepatocytes and bile duct cells, inadequate study models, and interspecies variations in bile secretion. It is also difficult to  determine whether these effects occur directly from neurotransmitters or indirectly from neurally mediated alterations in perfusion, released hormones, and/or metabolic  changes. 1—  Autonomic Nerve System A direct effect of vagal tone on bile flow has been suggested, since truncal vagotomy decreases spontaneous bicarbonate secretion and reduces insulin­induced  choleresis (108). However, vagal stimulation in dogs increases bile flow but has no effect in rabbits and cats (109,110). Recently, acetylcholine receptor subtype M3  but not M1 or M2 was identified in rat bile ducts (111). Interestingly, acetylcholine alone does not have any stimulatory effect on secretion from bile duct cells but  augments the secretin­stimulated activity of the   exchanger by secretin (cAMP) and acetylcholine (Ca2+) may have an important role in the regulation of  biliary bicarbonate secretion to neutralize the gastric acid delivered to the small intestines. However, given the pharmacological doses used for acetylcholine (10  M)  in the study, the real physiological significance of this finding is unknown and needs further study. Adrenergic control mechanisms are even less understood. Splanchnic nerve section or dopamine administration increases bile secretion (110,112), while electrical  stimulation of sympathetic nerves or norepinephrine administration inhibits bile secretion (113). Therefore the role of sympathetic nerves in the regulation of bile  secretion appears to be inhibitory but remains unclear. 2—  Neuropeptidergic Nerve System There are abundant neuropeptidergic nerves present in portal triads and along the sinusoids (106,107). Immunoreactivity to various neuropeptides within ganglion cells  and nerves in the hepatic plexus and in the intrahepatic periarterial spaces suggests that these peptides are intrinsic to these structures (106). Thus, these neuropeptides  likely regulate the function of the bile duct epithelium and/or the hepatic vasculature (107). Nevertheless, the functional significance of these hepatic peptidergic nerves  in biliary physiology and bile secretion has not been clearly established until recently, partly because of the lack of adequate in vitro models and partly due to complex  interactions with other secretagogues. a. Bombesin. Bombesin is a neuropeptide of 14 amino acid residues initially isolated from the skin of the European frogs Bombina bombina and Bombina variegata  variegata (114). Subsequently, its mammalian homologue, gastrin­releasing peptide (GRP), was isolated from mammalian gut extracts and found to have identical  biological actions and similar potency as bombesin (115,116). Bombesin/GRP is almost exclusively confined to nerve fibers (117) and GRP­like immunoreactivity was  identified within ganglion cells and nerves in the hepatic plexus and in the intrahepatic periarterial spaces, suggesting an intrinsic origin for this peptide (106). Moreover,  nerve cell bodies with bombesin­like immunoreactivity are also localized in hypothalamic and medullary nuclei in the central nervous system involved in the regulation of  autonomic functions (118). Immunoreactivity to these peptides and their receptors also has been detected in the gastrointestinal tracts of various mammals (106). They  have been shown to increase gastric secretion (119) and gut motility (120), stimulate gallbladder contraction (120), and release numerous peptides such as  neurotensin, motilin, insulin, CCK, secretin, and glucagon (121–124).

  

Page 116

In the dog and pig, bombesin/GRP increase bicarbonate­rich bile secretion (123–125). Our recent studies in the rat demonstrate that like secretin, bombesin can  directly stimulate biliary bicarbonate and fluid secretion from bile ducts (16). The ion transport mechanisms (Fig. 3) involved in this bombesin­stimulated biliary  secretion appear to be similar to those of secretin (45). Bombesin stimulates the   symporter by altering the Cl­ concentration gradient and membrane  potential (45,47) (Fig. 3). However, unlike secretin, the response of the bombesin is not dependent on microtubules nor is it associated with increased cAMP levels in isolated cholangiocytes  (127). These findings indicate that bombesin has a distinctly different underlying mechanism from that of secretin to induce   secretion from cholangiocytes.  Currently, the signal transduction pathway mediating the bombesin­stimulated secretion in cholangiocytes is unknown but does not appear to involve cAMP, cGMP,  or Ca2+­dependent pathways (127). Study of modulating roles of other neuroendocrine peptides on the bombesin response has revealed that somatostatin but not substance P had a direct inhibitory effect  on bombesin­stimulated biliary secretion from bile ducts (16). However, in the in vivo setting, these inhibitory neuropeptides may also have additional indirect  modulatory effects by affecting the release or metabolism of bombesin from nerve terminals. These studies suggest that central and/or hepatic nerves may regulate secretion by releasing neuropeptides that can activate specific receptors on cholangiocytes,  thereby modulating biliary transport and secretion. Therefore, autonomic and/or intrinsic hepatic neural pathways might regulate biliary secretion through neuropeptides  such as bombesin by producing a bicarbonate­rich choleresis to counteract the increase in acid loads during food digestion or a Pavlovian response. b. Vasoactive Intestinal Peptide. A major regulatory enteric neuropeptide of 28 amino acid residues was initially identified by Said and Mutt in 1970 from porcine  intestine (128) and named as vasoactive intestinal peptide (VIP) due to its potent vasodilatory properties. In addition to its vasoactive effects, VIP plays important  roles in the regulation of blood flow (129); gastrointestinal motility (130); and salivary, gastric, pancreatic, intestinal, and gallbladder secretions (131,132). VIP is  found exclusively in nervous tissue in enteric, peripheral, and central neurons in various mammals (106,133) and is considered a principal nonadrenergic,  noncholinergic neurotransmitter (133,134). Although most VIP nerve fibers in the gastrointestinal tract are considered to be of intrinsic origin, some are supplied by  extrinsic nerves, such as vagal nerve branches for human subdiaphragmatic enteric nerves (135) and the pelvic nerve in the cat (136). These findings suggest that VIP  nerves may interact with other peripheral and central neurons to produce complex neuroregulation of gastrointestinal function and physiology. VIP has been known to increase bicarbonate­rich biliary secretion in the human (137), dog (138), and rat (139). In addition, it increases bile acid secretion in rats with  bile acid supplementation (139) but not in humans with partial bile acid depletion for 6 to 8 days after cholecystectomy and choledocholithotomy with common bile  duct cannulation (137). Our recent studies in the rat have demonstrated that VIP stimulates biliary fluid and   from bile duct cells by stimulating the    exchanger, but more potently than secretin or bombesin (17,46) (Fig. 3). In addition, VIP also has a stimulatory effect on bile acid secretion, presumably from  hepatocytes (17). Although the ion transport mechanisms responsible for the VIP­stimulated choleresis from rat bile duct appear to be similar to that of secretin (46),  the underlying signal transduction system is not known but appears to be independent of cAMP, cGMP, or Ca2+ signal transduction pathways, as with bombesin  (140). However, unlike bombesin, VIP­stimulated biliary secretion is inhibited by colchicine and is not inhibited by somatostatin or substance P (17). These studies  indicate that, as with bombesin, VIP may also serve an important regulatory role in biliary secretion by stimulating a bicarbonate­rich choleresis during food digestion  or Pavlovian response to counteract acid loads from the stomach.

  

Page 117

Figure 3 Regulation of bile ductal secretion. A number of neuroendocrine peptides and mediators regulate bile ductal secretion via specific receptors and signal transduction pathways. Secretin stimulates and somatostatin (and possibly gastrin) inhibits biliary secretion by their effects on cAMP/PKA­dependent  pathways which appear to regulate the Cl­ channel activity by phosphorylation, but the signal  transduction pathways of bombesin and VIP are not known. Increases in intracellular Ca2+ by ATP,  UDCA, or others have no direct effect on biliary secretion, but acetylcholine augments the secretin response, presumably via Ca2+­dependent pathways. Although all the specific details of processes  involved are not understood, the end result appears to be stimulatory or inhibitory effects on the activity of   exchanger as well as on the membrane recycling of vesicles containing various transporter(s), resulting increased or decreased fluid and   secretions into bile.

  

Page 118

c. Substance P. In 1931 von Euler and Gaddum discovered substance P, the first gut neuropeptide to be found. Substance P has 11­amino acid residues. It is found  in nerve fibers in the myenteric and submucosal plexus of the gastrointestinal tract and has been shown to play a role in the regulation of intestinal secretion (141). In  bile secretion, substance P has anticholeretic effects in in vivo studies in the dog, but it failed to produce a significant inhibitory effect on secretin­, bombesin­, or VIP­ stimulated fluid secretion in the dog or IBDU from rat (16,17,100). These findings indicate that substance P may inhibit hepatocyte canalicular bile secretion.  Furthermore, the inhibitory neuroendocrine peptides like substance P or somatostatin may also act in vivo by inhibiting the release of bombesin from local nerve  terminals. C—  Paracrine Paracrine regulation of bile secretion is poorly understood. Recent studies in rat bile duct cells and human biliary cell lines indicate that biliary secretion may be  modulated by extracellular ATP (64). In bile from the human, rat, and pig, adenosine nucleotides are present in micromolar concentrations sufficient to activate  purinergic receptors (142). Extacellular ATP stimulates P2u receptors on apical membrane of bile duct cell and increases intracellular Ca2+ levels, thus resulting in  activation of Cl­ conductances (65,143) (Fig. 3). Therefore, this purinergic receptor activation by the nucleotides released presumably from hepatocytes might  constitute a paracririe mechanism for modulation and coordination of biliary secretion from hepatocytes and cholangiocytes. In addition, various bile acids may also have some modulatory effect on bile secretion. Bile acids are taken up by cholangiocytes by the Na+­dependent bile acid  transporter in the apical membrane as discussed previously (31,41). Furthermore, UDCA increases the intracellular Ca2+ levels in cholangiocytes (63), but UDCA has  no significant effect on ion transporters (144). Although it is speculated that bile acids may have some modulatory effects on biliary secretion, the physiological effects  or significance remain unknown. VII—  Conclusion The advances in our understanding in biliary physiology and secretion in recent years have been spectacular, but this area of research is still young. Although many  human liver diseases—such as CF liver disease, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and vanishing bile duct syndrome—are thought to arise mainly  from the defects or injury in the bile ducts, with impaired biliary secretion, our knowledge in the pathophysiology and pathogenesis of these liver diseases is still very  limited. However, as we begin to learn more of the physiology and biology of bile ducts, we will be better able to understand the underlying disease process and to  develop treatments for these liver diseases. For example, initially, the CF liver disease was thought to be due to defects in hepatocytes. However, recent  demonstration that CFTR is only expressed in cholangiocytes but not hepatocytes drastically changed the research focus to bile ducts. In fact, the CF liver diseases  are currently thought to arise from the impaired bile duct secretion from defects in the cAMP­dependent Cl­ channel, resulting obstruction of bile ductules from this  thick biliary secretion. As discussed in this review, Cl­ channels other than CFTR are expressed in bile duct epithelium (Fig. 2); thus one possible therapeutic approach  is to develop methods to activate non­cAMP­dependent biliary secretory pathways to compensate for the CFTR defect. Therefore, further understanding in biliary  physiology and biology will eventually allow us to develop methods to treat and prevent such cholangiopathy. References 1. P Rous, PD McMaster. Physiologic causes of stasis bile. J Exp Med 34(21):75–95, 1921.

  

Page 119

2. N Tavoloni. The intrahepatic biliary epithelium: an area of growing interest in hepatology. Semin Liver Dis 7(4):280–292, 1987. 3. G Alpini, R Lenzi, L Sarkozi, N Tavoloni. Biliary physiology in rats with bile ductular cell hyperplasia—Evidence for a secretory function of proliferated bile  ductules. J Clin Invest 81:569–578, 1988. 4. WHH Andrews. Excretory function of the liver: a re­assessment. Lancet 2:166–169, 1955. 5. WE Burkel. The fine structure of the terminal branches of the hepatic arterial system in the rat. Anat Res 167:329–349, 1970. 6. A Benedetti, C Bassotti, K Rapino, L Marucci, AM Jezequel. A morphometric study of the epithelium lining the rat intrahepatic biliary tree. J Hepatol 24(3):335– 342, 1996. 7. G Alpini, S Roberts, SM Knutz, Y Ueno, S Gubba, PV Podila, G Lesage, NF LaRusso. Morphological, molecular, and functional heterogeneity of cholangiocytes  from normal rat liver. Gastroenterology 110:1636–1643, 1996. 8. M Strazzabosco. New insights into cholangiocyte physiology. J Hepatol 27(5):945–952, 1997. 9. DH Adams. Biliary epithelial cells: innocent victims or active participants in immune­mediated liver disease? J Lab Clin Med 128:528–530, 1996. 10. K Matsumoto, H Fujii, G Michalopoulos, JJ Fung, AJ Demetris. Human biliary epithelial cells secrete and respond to cytokines and hepatocyte growth factors in  vitro: interleukin­6, hepatocyte growth factor and epidermal growth factor promote DNA synthesis in vitro. Hepatology 20(2):376–382, 1994. 11. S Milani, H Herbst, D Schuppan, H Stein, C Surrenti. Transforming growth factors 1 and 2 are differentially expressed in fibrotic liver disease. Am J Pathol  139:1221–1229, 1991. 12. F Marra, R De Franco, C Grappone, M Pinzani, S Milani, S Pastacaldi, et al. Expression of monocyte chemotactic protein­a during active hepatic fibrogenesis in  humans. Ital J Gastroenterol 28:300, 1996. 13. C Housset, A Carayon, B Housset, C Legendre, L Hannoun, R Poupon. Endothelin­1 secretion by human gallbladder epithelial cells in primary culture. Lab  Invest 69(6): 750–755, 1993. 14. GJ Gores, LJ Kost, NF LaRusso. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology 6(3):511–517, 1986. 15. G Alpini, R Lenzi, W Zhai, PA Slott, MH Liu, L Sarkozi, N Tavolini. Bile secretory function of intrahepatic biliary epithelium in the rat. Am J Physiol 20:G124– 133, 1989. 16. WK Cho, A Mennone, SA Rydberg, JL Boyer. Bombesin stimulates bicarbonate secretion from rat cholangiocytes: implications for neural regulation of bile  secretion. Gastroenterology 13:311–321, 1997. 17. WK Cho, JL Boyer. Vasoactive intestinal polypeptide is a potent regulator of bile secretion from rat cholangiocytes. Gastroenterology 117(2):420–428, 1999. 18. G Alpini, JO Phillips, B Vroman, NF LaRusso. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology 20(2):494–514, 1994. 19. M Strazzabosco, A Mennone, J Boyer. Intracellular pH regulation in isolated rat bile duct epithelial cells. J Clin Invest 87:1503–1512, 1991. 20. DC Hixon, JP Allison. Monoclonal antibodies recognizing oval cells induced in liver of rats by N­2­fluorenylacetamide or ethionine and a choline deficient diet.  Cancer Res 45: 3750–3760, 1985. 21. M Ishii, B Vroman, NF LaRusso. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology 97(5):1236–1247,  1989. 22. R Joplin, AJ Strain, JM Neuberger. Immuno­isolation and culture of biliary epithelial cells from normal human liver. In Vitro Cell Dev Biol 25(12):1189–1192,  1989. 23. R Joplin, AJ Strain, JM Neuberger. Biliary epithelial cells from the liver of patients with primary biliary cirrhosis: isolation, characterization, and short­term culture.  J Pathol 162(3):255–260, 1990.

  

Page 120

24. K Paradis, HL Sharp. In vitro duct­like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J Lab Clin Med 113(6):689–694, 1989. 25. AJ Lanca, Y Israel. Histochemical demonstration of sinusoidal g­glutamyltransferase activity by substrate protection fixation: comparative studies in rat and guinea  pig liver. Hepatology 14(1):857–863, 1991. 26. D Alvaro, WK Cho, A Mennone, JL Boyer. Effect of secretin on intracellular pH regulation in isolated rat bile duct epithelial cells. J Clin Invest 92:1314–1325,  1993. 27. S Basavappa, J Middleton, AW Mangel, JM McGill, JA Cohn, JG Fitz. Cl­ and K+ transport in human biliary cell lines. Gastroenterology 104:1796–1805, 1993. 28. JM McGill, TW Gettys, S Basavappa, JG Fitz. Secretin activates Cl­channels in bile duct epithelial cells through a cAMP­dependent mechanism. Am J Physiol  266:G731–G736, 1994. 29. R Lenzen, G Alpini, N Tavoloni. Secretin stimulates bile ductular secretory activity through the cAMP system. Am J Physiol 263(4 pt 1):G527–G532, 1992. 30. PS Tietz, G Alpini, LD Pham, NF Larusso. Somatostatin inhibits secretin­induced ductal hypercholeresis and exocytosis by cholangiocytes. Am J Physiol 269(1  pt 1):G110–G118, 1995. 31. G Alpini, SS Glaser, R Rodgers, JL Phinizy, WE Robertson, J Lasater, A Caligiuri, Z Tretjak, GD LeSage. Functional expression of the apical Na+­dependent  bile acid transporter in large but not small rat cholangiocytes. Gastroenterology 113(5):1734–1740, 1997. 32. P Tietz, S Levine, R Holman, C Fretham, NF LaRusso. Characterization of apical and basolateral plasma membrane domains derived from cultured rat  cholangiocytes. Analytical Biochemistry 254(2): 192–199, 1997. 33. A Knuth, H Gabbert, W Dippold, et al. Biliary adenocarcinoma: characterization of three new human tumor cell lines. J Hepatol 1:579–596, 1985. 34. M Strazzabosco, C Poci, C Spirli, L Sartori, A Knuth, G Crepaldi. Effect of ursodeoxycholic acid on intracellular pH in a bile duct epithelium­like cell line.  Hepatology 19(1): 145–154, 1994. 35. K Paradis, ON Le, P Russo, M St­Cyr, H Fournier, D Bu. Characterization and response to interleukin 1 and rumor necrosis factor of immortalized murine  biliary epithelial cells. Gastroenterology 109(4): 1308–1315, 1995. 36. SA Grubman, RD Perrone, DW Lee, SL Murray, LC Rogers, Ll Wolkoff, AE Mulberg, V Cherington, DM Jefferson. Regulation of intracellular pH by  immortalized human intrahepatic biliary epithelial cell lines. Am J Physiol 266(6 pt 1):G1060–G1070, 1994. 37. SA Grubman, SL Fang, AE Mulberg, RD Perrone, LC Rogers, DW Lee, D Armentano, SL Murray, HL Dorkin, SH Cheng, et al. Correction of the cystic  fibrosis defect by gene complementation in human intrahepatic biliary epithelial cell lines. Gastroenterology 108(2):584–592, 1995. 38. Y Yang, SE Raper, JA Cohn, JF Engelhardt, JM Wilson. An approach for treating the hepatobiliary disease of cystic fibrosis by somatic gene transfer. Proc Natl  Acad Sci USA 90:4601–4605, 1993. 39. B Vroman, NF LaRusso. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab Invest 74:303–313,  1996. 40. R Joplin, T Hishida, H Tsubouchi, Y Daikuhara, R Ayres, JM Neuberger, AJ Strain. Human intrahepatic biliary epithelial cells proliferate in vitro in response to  human hepatocyte growth factor. J Clin Invest 90(4):1284–1289, 1992. 41. KN Lazaridis, L Pham, B Vroman, PC de Groen, NF LaRusso. Kinetic and molecular identification of sodium­dependent glucose transporter in normal rat  cholangiocytes. Am J Physiol 272(5 pt 1):G1168–G1174, 1997. 42. O Villanger, T Veel, MR Holthe, EJ Cragoe Jr, MG Raeder. Secretin stimulates bile ductules to secrete both H+ and  376, 1992. 43. S Roberts, S Kuntz, G Gores, NF LaRusso. Regulation of bicarbonate­dependent duc­

  

 ions. Acta Physiol Scand 146:369–

Page 121

tular bile secretion assessed by luminal micropuncture of isolated rodent intrahepatic bile ducts. Proc Natl Acad Sci USA 90:9080–9084, 1993. 44. A Mennone, D Alvaro, WK Cho, JL Boyer. Isolation of small polarized bile duct units. Proc Natl Acad Sci USA 92:6527–6531, 1995. 45. WK Cho, A Mennone, JL Boyer. Intracellular pH regulation in bombesin­stimulated secretion in isolated bile duct units from rat liver. Am J Physiol 275:G1028– G1036, 1998. 46. WK Cho, SA Rydberg, JL Boyer. Characterization of VIP­stimulated bile secretion in isolated perfused rat liver (IPRL) and cholangiocytes (abstr). Hepatology  4:147A, 1996. 47. WK Cho, JL Boyer. Characterization of ion transport mechanisms involved in bombesin­stimulated biliary secretion in rat cholangiocytes. J Hepatology 30(6):  1045–1051, 1999. 48. JL Boyer. Bile duct epithelium: frontiers in transport physiology. Am J Physiol 33:G1–G5, 1996. 49. RA Marinelli, NF Larusso. Solute and water transport pathways in cholangiocytes. Semin Liver Dis 16(2):221–229, 1996. 50. AP Kwiatkowski, JM McGill. Electrolyte transport in biliary epithelia. J Lab Clin Med 130(1):8–13, 1997. 51. E Martinez­Anso, JE Castillo, J Diez, JF Medina, J Prieto. Immunohistochemical detection of chloride/bicarbonate anion exchangers in human liver. Hepatology  19(6): 1400–1406, 1994. 52. M Strazzabosco, R Joplin, A Zsembery, L Wallace, C Spirli, L Fabris, A Granato, A Rossanese, C Poci, JM Neuberger, L Okolicsanyi, G Crepaldi. Na(+)­ dependent and ­independent Cl­/HCO­3 exchange mediate cellular HCO­3 transport in cultured human intrahepatic bile duct cells. Hepatology 25(4):976–985,  1997. 53. O Villanger, T Veel, MG Raeder. Secretin causes H+ secretion from intrahepatic bile ductules by vacuolar­type H+­ATPase. Am J Physiol 265:G719–G724,  1993. 54. WK Cho, A Mennone, JL Boyer. Forskolin stimulates secretion in isolated polarized bile ductular units by mechanisms lacking a H+­ATPase response—evidence  for heterogeneity of the biliary epithelium (abstr). Hepatology 8:296A, 1993. 55. U Marti, C Elsing, EL Renner, S Liechti­Gallati, J Reichen. Differential expression of Na+,H(+)­antiporter mRNA in biliary epithelial cells and in hepatocytes. J  Hepatol 24(4):498–502, 1996. 56. K Yoshitomi, BC Burckhardt, E Froemter. Rheogenic sodium­bicarbonate cotransport in the peritubular cell membrane of rat renal proximal tubule. Pflugers Arch  405:360–366, 1985. 57. JY Scoazec, AF Bringuier, JF Medina, E Martinez­Anso, D Veissiere, G Feldmann, C Housset. The plasma membrane polarity of human biliary epithelial cells: in  situ immunohistochemical analysis and functional implications. J Hepatol 26(3):543–553, 1997. 58. JA Cohn, TV Strong, MR Picciotto, AC Nairn, FS Collins, JG Fitz. Localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in human bile duct  epithelial cells. Gastroenterology 105:1857–1864, 1993. 59. EM Schwiebert, ME Egan, TH Hwang, SB Fulmer, SS Allen, GR Cutting, WB Guggino. CFTR regulates outwardly rectifying chloride channels through an  autocrine mechanism involving ATP. Cell 81(7):1063–1073, 1995. 60. MJ Stutts, CM Canessa, JC Olsen, M Hamrick, JA Cohn, BC Rossier, RC Boucher. CFTR as a cAMP­dependent regulator of sodium channels (see  comments). Science 269(5225):847–850, 1995. 61. NA Bradbury, T Jilling, G Berta, EJ Sorscher, RJ Bridges, KL Kirk. Regulation of plasma membrane recycling by CFTR. Science 91:319–328, 1992. 62. A Dosanjh, W Lencer, D Brown, DA Ausiello, JL Stow. Heterologous expression of delta F508 CFTR results in decreased sialylation of membrane  glycoconjugates. Am J Physiol 266(2 pt 1):C360–C366, 1994.

  

Page 122

63. GH Shimokura, JM McGill, T Schlenker, JG Fitz. Ursodeoxycholate increases cytosolic calcium concentration and activates Cl­ currents in a biliary cell line.  Gastroenterology 109(3):965–972, 1995. 64. JM McGill, S Basavappa, AW Mangel, GH Shimokura, JP Middleton, JG Fitz. Adenosine triphosphate activates ion permeabilities in biliary epithelial cells.  Gastroenterology 107:236–243, 1994. 65. MH Nathanson, AD Burgstahler, A Mennone, JL Boyer. Characterization of cytosolic Ca2+ signaling in rat bile duct epithelia. Am J Physiol 271(1 pt 1):G86– G96, 1996. 66. JM McGill, S Basavappa, JG Fitz. Characterization of high­conductance anion channels in rat bile duct epithelial cells. Am J Physiol 262(4 pt 1):G703–G710,  1992. 67. JM McGill, TW Gettys, S Basavappa, JG Fitz. GTP­binding proteins regulate high conductance anion channels in rat bile duct epithelial cells. J Membr Biol 133 (3):253–261, 1993. 68. OH Petersen. Calcium­activated potassium channels and fluid secretion by exocrine glands. Am J Physiol 251:G1–G13, 1986. 69. MA Gray, JR Greenwell, AJ Garton, BE Argent. Regulation of maxi­K+ channels on pancreatic duct cells by cyclic AMP­dependent phosphorylation. J Membr  Biol 115: 203–215, 1990. 70. T Buanes, T Grotmol, T Veel, T Landsverk, Y Ridderstrale, MG Raeder. Importance of carbonic anhydrase for canalicular and ductular choleresis in the pig.  Acta Physiol Scand 133:535–544, 1988. 71. M Corbic, C Munoz, M Dumont, G de Couet, S Erlinger. Effect of systemic pH, PCO2 and bicarbonate concentration on biliary bicarbonate secretion in the rat.  Hepatology 5: 594–599, 1985. 72. JJ Garcia­Marin, M Dumont, M Corbic, G de Couet, S Erlinger. Effect of acid­base balance and acetazolamide on ursodeoxycholate­induced biliary bicarbonate  secretion. Am J Physiol 248:G20–G27, 1985. 73. SK Roberts, M Yano, Y Ueno, L Pham, G Alpini, P Agre, NF LaRusso. Cholangiocytes express the aquaporin CHIP and transport water via a channel­ mediated mechanism. Proc Natl Acad Sci USA 91(26):13009–13013, 1994. 74. S Nielsen, BL Smith, El Christensen, P Agre. Distribution of aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia. Proc Natl Acad Sci  USA 90:7275–7279, 1993. 75. RA Marinelli, L Pham, P Agre, NF LaRusso. Secretin promotes osmotic water transport in rat cholangiocytes by increasing aquaporin­1 water channels in plasma  membrane: evidence for a secretin­induced vesicular translocation of aquaporin­1. J Biol Chem 272(20): 12984–12988, 1997. 76. YB Yoon, LR Hagey, AF Hofmann, D Gurantz, EL Michelotti, JH Steinbach. Effect of side­chain shortening on the physiologic properties of bile acids: hepatic  transport and effect on biliary secretion of 23­nor­ursodeoxycholate in rodents. Gastroenterology 90(4):837–852, 1986. 77. P Guzelian, JL Boyer. Glucose reabsorption from bile: evidence for a biliohepatic circulation. J Clin Invest 53:526–535, 1974. 78. M Lira, CD Schteingart, JH Steinbach, K Lambert, JA McRoberts, AF Hofmann. Sugar absorption by the biliary ductular epithelium of the rat: evidence for two  transport systems (see comments). Gastroenterology 102(2):563–571, 1992. 79. HJ Hacker, B Thorens, R Grobholz. Expression of facilitative glucose transporter in rat liver and choroid plexus: a histochemical study in native cryostat sections.  Histochemistry 96(5):435–439, 1991. 80. N Ballatori, R Jacob, JL Boyer. Intrabiliary glutathione hydrolysis: a source of glutamate in bile. J Biol Chem 261(17):7860–7865, 1986. 81. N Ballatori, R Jacob, C Barrett, JL Boyer. Biliary catabolism of glutathione and differential reabsorption of its amino acid constituents. Am J Physiol 254(1 pt  1):G1–G7, 1988.

  

Page 123

82. I Eisenmann­Tappe, S Wizigmann, R Gebhardt. Glutamate uptake in primary cultures of biliary epithelial cells from normal rat liver. Cell Biol Toxicol 7(4):315– 325, 1991. 83. DL Nahrwold, MI Grossman. Secretion of bile in response to food with and without bile in the intestine. Gastroenterology 53:11–17, 1967. 84. WM Bayliss, EH Starling. The mechanism of pancreatic secretion. J Physiol 28:325–353, 1902. 85. K Powell, L Miller, F Brooks. Effect of sham feeding on bile flow in cholecystectomized dogs. Proc Soc Exp Biol Med 118:481–483, 1965. 86. DL Kaminski, DL Nahrwold. Neurohormonal control of biliary secretion and gallbladder function. World J Surg 3(4):449–456, 1979. 87. WGM Hardison, JC Norman. Electrolyte composition of the secretin fraction of bile from the perfused pig liver. Am J Physiol 214:758–763, 1968. 88. M Farouk, SR Vigna, DC McVey, WC Meyers. Localization and characterization of secretin binding sites expressed by rat bile duct epithelium.  Gastroenterology 102:963–968, 1992. 89. D Alvaro, A Mennone, JL Boyer. Role of kinases and phosphatases in the regulation of fluid secretion and  273:G303–G313, 1997.

 exchange in cholangiocytes. Am J Physiol 

90. A Kato, GJ Gores, NF LaRusso. Secretin stimulates exocytosis in isolated bile duct epithelial cells by a cyclic AMP­mediated mechanism. J Biol Chem  267:15523–15529, 1992. 91. T Buanes, T Grotomol, T Landsverk, M Raeder. Secretin empties bile duct cell cytoplasm of vesicles when it initiates ductular  Gastroenterology 95:417–424, 1988.

 secretion in the pig. 

92. T Veel, T Buanes, T Grotmol, E Engeland, MG Raeder. Colchicine blocks the effects of secretin on bile duct cell tubulovesicles and plasma membrane geometry  and impairs ductular   secretion in the pig. Acta Physiol Scand 139:603–607, 1990. 93. S Konturek. The influence of gastrin analogues on gastric, pancreatic and bile secretion. Acta Med Polona 8(2):201–212, 1967. 94. DL Nahrwold, AN Shariatzedeh. Role of the common bile duct in formation of bile and in gastrin­induced choleresis. Surgery 70(1): 147–153, 1971. 95. L Thulin, C Johansson. Gastrointestinal hormones. Acta Chir Scand Suppl 482:69–72, 1978. 96. DL Kaminski, YG Deshpande. Effect of gastrin I and gastrin II on canine bile flow. Am J Physiol 236(5):E584–E588, 1979. 97. SS Glaser, RE Rodgers, JL Phinizy, WE Robertson, J Lasater, A Caligiuri, Z Tretjak, GD LeSage, G Alpini. Gastrin inhibits secretin­induced ductal secretion by  interaction with specific receptors on rat cholangiocytes. Am J Physiol 273(5 pt 1):G1061–G1070, 1997. 98. S Reichlin. Somatostatin. N Engl J Med 309(24):1495–1501, 1983. 99. F Raulf, J Perez, D Hoyer, C Bruns. Differential expression of five somatostatin receptor subtypes, SSTR1­5, in the CNS and peripheral tissue. Digestion 55 (suppl 3):46–53, 1994. 100. I Magnusson, L Thulin, K Einarsson, K Bergstrom. Effects of substance P and somatostatin on taurocholate­stabilized and CCK­ or secretin­induced choleresis  in the anesthetized dog. Scand J Gastroenterol 19:1007–1014, 1984. 101. B Nyberg, B Angelin, K Einarsson. Somatostatin does not block the effect of vasoactive intestinal peptide on bile secretion in man. Eur J Clin Invest 22:60–66,  1992. 102. WF Alexander. The innervation of the biliary system. J Comp Neurol 73:357–370, 1940. 103. F Magni, C Carobi. The afferent and preganglionic parasympathetic innervation of the rat liver, demonstrated by the retrograde transport of horseradish  peroxidase. J Auton Nerv Syst 8(3):237–260, 1983. 104. T Terada, Y Nakanuma. Innervation of intrahepatic bile ducts and peribiliary glands in

  

Page 124

normal human livers, extrahepatic biliary obstruction and hepatolithiasis: an immuno­histochemical study. J Hepatol 9(2):141–148, 1989. 105. D Sasse, UM Spornitz, IP Maly. Liver architecture. Enzyme 46(1–3):8–32, 1992. 106. F Carlei, NJ Lygidakis, V Speranza, WH Brummelkamp, JF McGurrin, R Pietroletti, E Lezoche, DG Bostwick. Neuroendocrine innervation of the hepatic  vessels in the rat and in man. J Surg Res 45:417–426, 1988. 107. M el­Salhy, R Stenling, L Grimelius. Peptinergic innervation and endocrine cells in the human liver. Scand J Gastroenterol 28(9):809–815, 1993. 108. RE Geist, RS Jones. Effect of selective and truncal vagotomy on insulin­stimulated bile secretion in dogs. Gastroenterology 60(4):566–571, 1971. 109. DL Kaminski, J Dorighi, M Jellinek. Effect of electrical vagal stimulation on canine hepatic bile flow. Am J Physiol 227:487–493, 1974. 110. CA Tanturi, AC Ivy. On the existence of secretory nerves in the vagi for and the reflex excitation and inhibition of bile secretion. Am J Physiol 121:270–283,  1938. 111. D Alvaro, G Alpini, AM Jezequel, C Bassotti, C Francia, F Fraioli, R Romeo, L Marucci, G Le Sage, SS Glaser, A Benedetti. Role and mechanisms of action  of acetylcholine in the regulation of rat cholangiocyte Secretory functions [published erratum appears in J Clin Invest 1997 Oct 15;100(8):following 2139]. J Clin  Invest 100(6):1349–1362, 1997. 112. RF Harty, RC Rose, DL Nahrwold. Stimulation of hepatic bile secretion by dopamine. J Surg Res 17(5):359–363, 1974. 113. K Beckh, R Arnold, Regulation of bile secretion by sympathetic nerves in perfused rat liver. Am J Physiol 261(5 pt 1):G775–G780, 1991. 114. V Erspamer, G Falconieri Erspamer, M Inselvini. Some pharmacological actions of alytesin and bombesin (letter). J Pharm Pharmacol 22:875, 1970. 115. TJ McDonald, G Nilsson, M Vagne, M Ghatei, SR Bloom, V Mutt. A gastrin releasing peptide from the porcine non­antral gastric tissue. Gut 1978(19):767– 774, 1978. 116. JR Reeve Jr, JH Walsh, P Chew, B Clark, D Hawke, JE Shively, Amino acid sequences of three bombesin­like peptides from canine intestine extracts. J Biol  Chem 258:5582–5588, 1983. 117. GJ Dockray, C Vaillant, JH Walsh. The neuronal origin of bombesin­like immunoreactivity in the rat gastrointestinal tract. Neuroscience 4:1561–1568, 1979. 118. M Panula, HYT Yang, E Costa. Neuronal localization of the bombesin­like immunoreactivity in the central nervous system of the rat. Reg Pept 4:275–283,  1982. 119. G Bertaccini, V Erspamer, M Impicciatore. The actions of bombesin on gastric secretion of the dog and the rat. Br J Pharmacol 49:437–444, 1973. 120. AGE Pearse, JM Polak, SR Bloom. The new gut hormones. Gastroenterology 80:746–761, 1977. 121. HR Fender, PJ Curtis, PL Rayford, JC Thompson. Effect of bombesin on serum gastrin and cholecystokinin in dogs. Surg Forum 27:414–416, 1976. 122. V Schusdziara, D Rouiller, V Harris, EF Pfeiffer, RH Unger. Effect of bombesin upon plasma somatostatin­like immunoreactivity, insulin, and glucagon in normal  and chemically sympathectomized dogs. Regul Pept 1:89–96, 1980. 123. DL Kaminski, YG Deshpande. Effect of somatostatin and bombesin on secretin­stimulated ductular bile flow in dogs. Gastroenterology 85(6):1239–1247,  1983. 124. H Glad, P Svendsen, MA Ainsworth, O Olsen, JF Rehfeld, OB Schaffalitzky De Muckadell. The effect of gastrin­releasing peptide on porcine  pancreaticobiliary bicarbonate secretion is mediated by secretin. Scand J Gastroenterol 29:195–202, 1994. 125. WJ Kortz, JRB Nashold, E Delong, WC Meyers, Effects of bombesin on fasting bile formation. Ann Surg 203(1):1–7, 1986. 126. WK Cho, A Mennone, JL Boyer. Intracellular pH regulation in bombesin­stimulated secretion in isolated bile duct units from rat liver. Am J Physiol 275 (5):G1028–G1036, 1998. 127. WK Cho, A Mennone, JL Boyer. Bombesin stimulates bile secretion in calcium­ and PKC­independent pathways. Gastroenterology 114(4):L0112, 1998.

  

Page 125

128. SI Said, V Mutt. Potent peripheral and splanchnic vasodilator peptide from normal gut. Nature 225(235):863–864, 1970. 129. S Eklund, J Fahrenkrug, M Jodal, O Lundgren, OB Schaffalitzky de Muckadell, A Sjoqvist. Vasoactive intestinal polypeptide, 5­hydroxytryptamine and reflex  hyperaemia in the small intestine of the cat. J Physiol 302:549–557, 1980. 130. KN Bitar, GM Makhlouf. Relaxation of isolated gastric smooth muscle cells by vasoactive intestinal peptide. Science 216:531–533, 1982. 131. N Ashton, BE Argent, R Green. Effect of vasoactive intestinal peptide, bombesin and substance P on fluid secretion by isolated rat pancreatic ducts. J Physiol  427:471–482, 1990. 132. IK Morton, SJ Phillips, SH Saverymuttu, JR Wood. Secretin and vasoactive intestinal peptide inhibit fluid absorption and induce secretion in the isolated gall­ bladder of the guinea­pig (proceedings). J Physiol 266(1):65P–66P, 1977. 133. MG Bryant, MM Polak, I Modlin, SR Bloom, RH Albuquerque, AG Pearse. Possible dual role for vasoactive intestinal peptide as gastrointestinal hormone and  neurotransmitter substance. Lancet 1 (7967):991–993, 1976. 134. RK Goyal, S Rattan, SI Said. VIP as a possible neurotransmitter of non­cholinergic non­adrenergic inhibitory neurones. Nature 288(5789):378–380, 1980. 135. JM Lundberg, T Hokfelt, J Kewenter, G Pettersson, H Ahlman, R Edin, A Dahlstrom, G Nilsson, L Terenius, K Uvnas­Wallensten, S Said. Substance P­, VIP­ , and enkephalinlike immunoreactivity in the human vagus nerve. Gastroenterology 77(3):468–471, 1979. 136. M Kawatani, IP Lowe, I Nadelhaft, C Morgan, WC De Groat. Vasoactive intestinal polypeptide in visceral afferent pathways to the sacral spinal cord of the  cat. Neurosci Lett 42(3):311–316, 1983. 137. B Nyberg, K Einarsson, T Sonnenfeld. Evidence that vasoactive intestinal peptide induces ductular secretion of bile in humans. Gastroenterology 96:920–924,  1989. 138. L Thulin, M Hellgren. Choleretic effect of vasoactive intestinal peptide. Acta Chir Scand 142:235–237, 1976. 139. G Ricci, J Fevery. The action of VIP on bile secretion and bile acid output in the non­anesthetized rat. Biochem Pharmacol 34(20):3765–3767, 1985. 140. WK Cho, JL Boyer. VIP stimulates bile secretion in cholangiocytes by cAMP­, PKA­independent mechanisms (abstr). Hepatology 26(4):397A, 1997. 141. KA Hubel. Intestinal nerves and ion transport: stimuli, reflexes, and responses. Am J Physiol 248(3 pt 1):G261–G271, 1985. 142. RS Chari, SM Schutz, JE Haebig, GH Shimokura, PB Cotton, JG Fitz, WC Meyers. Adenosine nucleotides in bile. Am J Physiol 270(2 pt 1):G246–G252,  1996. 143. LI Wolkoff, RD Perrone, SA Grubman, DW Lee, SP Soltoff, LC Rogers, M Beinborn, SL Fang, SH Cheng, DM Jefferson. Purinoceptor P2U identification  and function in human intrahepatic biliary epithelial cell lines. Cell Calcium 17(5):375–383, 1995. 144. D Alvaro, A Mennone, JL Boyer. Effect of ursodeoxycholic acid on intracellular pH regulation in isolated rat bile duct epithelial cells. Am J Physiol 265:G783– G791, 1993.

  

Page 127

6—  Epidemiology, Risk Factors, and Pathogenesis of Gallstones Nezam H. Afdhal Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts Gallstone disease is the most common and costly of all digestive diseases resulting in 700,000 cholecystectomies annually and as many as 1 million hospitalizations.  The cost of treating gallstone­related disease in the United States has been estimated at approximately $5 billion dollars each year. In recent years, the development of  laparoscopic cholecystectomy has significantly reduced hospital inpatient costs and recovery time, but this cost saving has been offset by a 28% increase in the number  of cholecystectomies (1). Over the past two decades, a great deal has been learned about the epidemiology of and risk factors for gallstones (see Table 1). Ultrasonography has played a major  role in this process, providing a rapid, risk­free method of screening large populations. Prior to the availability of ultrasound, most studies relied on highly selective  autopsy data and limited oral cholecystography. I—  Epidemiology Epidemiological data are now available from a number of large European and American populations (see Table 2). These studies have revealed a marked variation in  overall gallstone prevalence between different ethnic populations. In general, there appear to be higher rates of cholelithiasis in western Caucasians, Hispanic, and  Native American populations and lower rates in eastern European and African populations (2–6). In North America, the most detailed prevalence data are available for Hispanics and Native Americans. One report evaluated three distinct Hispanic­American  populations using ultrasonography: Puerto Ricans, Mexican Americans, and Cuban Americans (7,8). Even among Hispanic patients, there is a marked difference in  gallstone prevalence dependent on ethnicity. Hispanic women between the ages of 20 and 40 years were found to have an overall prevalence rate of gallstones of  11.2%. The prevalence rose to 22.2% between the ages 40 and 60 years. The highest incidence was in those of Mexican­American origin, where a 1.5 to 1.8 times  greater overall prevalence rate was seen compared to Cuban Americans and Puerto Rican females. The higher rate in Mexican Americans may represent genetic  admixture with Native Americans where the prevalence rate is the highest in the world (see below). The prevalence rate was much lower in Hispanic men: 1.5 and 6%  in the same respective age groups. Native Americans have the highest prevalence of cholelithiasis in North America. As an example, 73% of female Pima Indians over the age of 25 years have gallstones  (9). Similar

  

Page 128 Table 1 Risk Factors for Cholelithiasis Age Female sex Parity Obesity Rapid weight loss Hypertriglyceridemia Genetic: Pima Indians, Chileans Medications: estrogen, clofibrate, ceftriaxone, sandostatin Terminal ileal resection Gallbladder hypomotility: pregnancy, diabetes, postvagotomy Somatostatinoma Total parenteral nutrition Spinal cord injury

high rates have been found in other Native American populations, such as Chippewa and Micmac Indians (10,11). In Caucasian­American populations in North America, the prevalence of cholelithiasis is less well established because there have not been any large ultrasound­based  studies. In a Michigan study using oral cholecystography, men between the ages 35 to 55 years were found to have an overall prevalence of 11%, while a small  ultrasound survey of Canadian women between the ages of 15 and 50 years found an overall prevalence of 16.7% (12). Large ultrasound­based studies from Europe have characterized both gallstone prevalence and incidence. As an example, the Multicenter Italian Study of Cholelithiasis  (MICOL) examined nearly 33,000 subjects aged 30 to 69 years in 18 cohorts in 10 Italian regions (13,14). The overall prevalence of gallstone disease was 18.8% in  women and 9.5% in men (14). Similar results were noted in the Sirmione study which found an overall prevalence rate of 11% in 1930 Italian subjects between the ages of 18 and 65 years (15).  Ultrasounds were repeated on the same patients at 5­year intervals. The 10­year cumulative incidence of new gallstones was 4.6%. A similar study from Denmark  examining the incidence of gallstones showed a cumulative incidence of 2.3%, with the incidence initially appearing higher in women with a female male ratio of 4.7 at  age 35, which was reduced to 1.2 at age 65 years (16). Compared to the above ethnic groups, African Americans appear to have the lowest prevalence of cholelithiasis. Autopsy­based studies performed in the 1950s  found that African Americans had one­half to one­quarter the risk of cholelithiasis compared to Caucasian Americans; later reports have shown a 40% lower risk of  hospitalization for gallstone­related disease (17). II—  Risk Factors In addition to the variability of gallstones in different ethnic populations, a number of other risk factors for this condition have been identified. A—  Age Age is a major risk factor for the gallstones. Gallstones are exceedingly rare in children except in the presence of hemolytic states; in addition, less than 5% of all  cholecystectomies are performed in children. In a study from Bari, where 1400 children and adolescents underwent

  

Page 129 Table 2 The Prevalence of Gallstone Disease in Selected Populations Population Mexican American 1982–84

Test

Female N

Percent  GSD

Male  N

Percent  GSD

416

13.8

360

2.6

259

26.4

202

9.7

79

44.4

72

15.5

52

10.8

Age

US

20–39 40–59 60–74

Cuban Americans 1982–84

US

94

19.2

 

 

60–74

43

21.7

22

14.3

Puerto Ricans 1982–84

US

20–39

184

9

95

2.0

Rome, Italy 1981–82

Bristol, England 1987–89

Copenhagen,  Denmark 1982–84

Okinawa, Japan 1984

Pima Indians 1967–68

20–39

 

US

US

US

US

OCG

40–49

157

60–74

41

20–29

39

0

73

5.1

21.2

81

3.3

12.1

24

11.1

158

2.5

44

2.3

30–39

404

5.9

312

2.0

40–49

311

10.9

430

6.7

17.8

203

14.7

250

14.4

50–59

168

>65

40

20–29

25 —

—

305

3.9

30–39

328

6.4

40–49

199

6.5

430

7.5 11.5

—

—

50–59

141

14.2

226

60–69

85

22.4

182

30

454

4.7

457

4.8

40

460

6.1

473

1.5

50

450

14.5

465

6.6

451

12.9

60

398

22.3

0–19

381

0

20–29

126

30–39

163

40–49

122

396

1.7

1.0

3

132

1.0

3.5

145

2.5

3

135

2.0 1.5

50–59

191

4

272

60–69

167

9

202

4.5

188

15.0

>70

107

9.5

15–25

45

12.7

25–34

47

73.2

45

4.4

35–44

53

70.8

51

11.1

45–54

47

75.8

51

31.9

47

66.3

57

67.8

55–64

50

>65

58

62 89.5

45

0

Key: US, ultrasound; OCG, oral cholecystogram. Source: Adapted from Ref. 128.

ultrasound, gallstones were only found in 2. However in the United States, with obesity becoming more of a problem in young adolescents and adults, we are seeing  more clinical gallstone disease (18). Age 40 appears to represent the cutoff between relatively low and high rates of cholecystectomies. This observation was validated in the Sirmione study, in which the  incidence between the ages of 40 and 69 years was four times higher than that in younger subjects (15). Among the 135 patients with gallstones, only 1 was between  the ages of 18 and 21 years.

  

Page 130

B—  Gender As noted above, a higher prevalence of gallstones has been observed in women in all age groups. The difference between women and men is particularly striking in  young adults and this gap narrows with age. The GREPCO study found that a female­to­male ratio of 2.9 between the ages of 30 to 39 years; the ratio narrowed to  1.6 between the ages of 40 to 49 years and 1.2 between the ages of 50 to 59 years (19,20). Interestingly, women with gallstone disease are more likely to have had a  cholecystectomy than males, and this was confirmed in the HHANES study, where 49% of women but only 28% of men with gallstones had a cholecystectomy. The  higher rates in young women is probably hormonal, since estrogens have been shown to increase biliary cholesterol secretion and progesterone reduces gallbladder  contractility. In countries such as Italy where the pregnancy rate is falling dramatically, sex differences in gallstone disease are less apparent even for the younger age  groups. C—  Pregnancy Pregnancy is a major risk factor for the development of cholesterol gallstones. The risk is related to both the frequency and number of pregnancies. In one report, for  example, the prevalence of gallstones increased from 1.3% in nulliparous females to 12.2% in multiparous females (21). Another study recruited 272 women in the  first trimester of pregnancy (22,23). The incidence of new biliary sludge and gallstones was 31 and 2%, respectively. Sex hormones induce a variety of physiological changes in the biliary system, which ultimately cause bile to become supersaturated with cholesterol, thereby promoting  gallstone formation. These changes include the following: 1. Cholesterol supersaturation occurs as a result of an estrogen­induced increase in cholesterol secretion and a progesterone­induced reduction in bile acid secretion  (24). 2. Pregnancy induces a qualitative change in bile acid synthesis characterized by relative overproduction of hydrophobic bile acids such as chenodeoxycholate, thereby  reducing the ability of bile to solubilize cholesterol (25). 3. Progesterone­induced slowing of gallbladder emptying further promotes the formation of stones by causing bile stasis. These changes normalize 1 to 2 months following delivery. In the postpartum period, gallbladder sludge resolves in 61% of cases (23), and approximately 30% of  stones smaller than 10 mm disappear due at least in part to desaturation of bile. Thus although there is a higher risk of gallstone and sludge development in the third  trimester and early puerperium, there is also spontaneous resolution of gallbladder disease during these time periods as the physiology of bile secretion and gallbladder  motility return to the normal state. D—  Oral Contraceptives and Estrogen Replacement Therapy Studies evaluating the risk associated with estrogen use have been conflicting, although the majority of studies have shown that estrogen therapy is associated with  higher rates of gallstones. Postmenopausal women given estrogen replacement had 3.7 times the relative risk of developing symptomatic gallstones compared to  nonusers (8,26–28), and those women undergoing cholecystectomy were 2.5 times more likely to have used estrogen in the past than those not requiring  cholecystectomy. In the Nurses' Health Study of almost 55,000 postmenopausal women, those currently using postmenopausal hormones were at an increased risk of cholecystectomy  (relative risk 2.1) compared to never­users (29). For current users, the risk of cholecystectomy increased with increasing duration of hormone use and higher doses of  estrogen. The risk for past hormone users decreased substantially in women who had discontinued use within the preceding

  

Page 131

1 to 3 years (relative risk 1.6, a small but significant risk persisted for women who had stopped taking estrogen replacement therapy 5 or more years previously  (relative risk 1.3). There is also an increased risk in men receiving estrogen therapy. In one study of men who had had a myocardial infarction, treatment with estrogen or clofibrate was  associated with more than a twofold increase in risk of gallbladder disease compared to those receiving placebo (30). In another report of men with prostate cancer,  new gallstones detected by ultrasonography developed at 1 year in 5 of 28 men treated with estrogen compared to none of 26 who underwent orchiectomy (31).  Estrogen­treated men had a 40% increase in biliary cholesterol excretion compared to age­matched controls. Oral contraceptive use also appears to cause a slight  increase risk of gallstone formation. Women under the age of 40 and those taking high­dose estrogen (>50  g) preparations have the greatest added risk (28). It has  been suggested that oral contraceptives have only a transient effect on gallstone formation. In support of this hypothesis, a case­control study found a slightly higher  incidence of gallstones shortly after starting oral contraceptives, an effect that disappeared after 10 years (32). A similar relationship was noted in a metanalysis of  controlled epidemiological studies (33). E—  Family History and Genetics Family history studies suggest that genetics has a significant role in the development of gallstones. One report performed oral cholecystography in 171 first­degree  relatives of patients with gallstones and 200 age­matched controls (34). Gallstones occurred more than twice as often in the family group: 20.5 versus 9%. A more  recent study evaluated 330 first­degree relatives of 105 patients with gallstones using ultrasonography; cholelithiasis was found in 15.5% of first­degree relatives  compared to only 3.6% of matched controls (35). The risk was greater in female relatives in both of these studies. The great variation in gallstone rates amongst different ethnic groups described above could be due to genetic as well as dietary and cultural habits. A dramatic  example occurs in Pima Indians, who have exceptionally high rates of cholesterol gallstones: 73% in women over the age of 25 years (9). Although no gallstone genes  have been described for humans, there are gallstone­susceptible mice that have a complex polygenic basis for developing gallstones (36). F—  Obesity Obesity (defined as weight greater than 120% of ideal body weight) is a well­established risk factor for the development of cholesterol gallstones, presumably due to  enhanced cholesterol absorption, synthesis, and secretion (37–41). The risk is particularly high in women and in those with morbid obesity as well as in younger age  groups, among whom a threefold increase in risk has been reported (15). It has also been suggested that the incidence of gallbladder disease in morbidly obese subjects may be higher than expected from ultrasonography or oral  cholecystography. In one report, 62 morbidly obese patients underwent prophylactic cholecystectomy at the time of a gastric exclusion procedure (42). Among the 47  who had normal imaging studies, 40 had abnormal histological findings in the gallbladder. G—  Rapid Weight Loss Rapid weight loss is also a risk factor for gallstone formation, occurring in approximately 35% of patients after proximal gastric bypass (40,43,44). High rates of  gallstone formation have also been associated with very low calorie diets (45). Gallstones that form in association with rapid weight loss appear to more common in  Caucasians and women. The mechanism by which this occurs is incompletely understood. One report evaluated changes in gallbladder bile during periods of weight loss (44,46–48). Bile  mucin content

  

Page 132

increased 18­fold and bile calcium concentration rose 40%. These factors may promote cholesterol nucleation and stone formation. Motility is also affected by dieting  and a reduction in effective gallbladder emptying in patients on very low calorie diet who receive less than 10 g fat daily has been described (49,50). In contrast to the general population, in which the great majority of gallstones are asymptomatic, persons with weight loss­related cholelithiasis are more likely to be  symptomatic. In one series, for example, 28% of patients required urgent cholecystectomy within 3 months after a gastric exclusion procedure (42). Prophylaxis with  ursodeoxycholic acid (UDCA) has been shown to be effective at reducing the risk of stone formation during rapid weight loss. In one trial of 1004 patients treated  with a very low calorie diet, ultrasonography was performed at baseline and at 8 and 16 weeks (45). The incidence of gallstones was 28% in the placebo group,  compared to 8, 3, and 2% of those treated with 300, 600, and 1200 mg/day of UDCA, respectively. In another controlled trial, 68 obese subjects were randomized to UDCA (1200 mg/day), aspirin, or placebo at the time of entry into a 520 kcal/day diet program  (50a). The patients were treated for up to 16 weeks and were reevaluated at 4 weeks and at 3 weeks after treatment. None of the patients treated with UDCA  developed gallstones or cholesterol crystals in the bile compared to five and six patients, respectively, in the placebo group (p < 0.001). The bile saturation index fell  by about 18% with UDCA compared to a 20% elevation in the patients receiving placebo. These findings have led to the recommendation that obese patients should  be started on UDCA 600 mg at night during very low caloric diets or after weight reduction surgery. H—  Diabetes Mellitus Diabetes mellitus appears to be associated with an increased risk of gallstones (51). A case­control study compared 336 patients who had gallstones or had  undergone cholecystectomy to 336 controls (44,52). Diabetes was more prevalent in the patients with gallbladder disease (11.6 versus 4.8%). In another case­control  study, an increased prevalence of gallstones in diabetes could only be demonstrated in women (42 versus 26% in nondiabetic women) (53). Why diabetes predisposes to gallstones is not well understood. Gallbladder hypomotility is common in diabetics and is seen as a response of smooth muscle to  hyperglycemia; it can also be caused by autonomic neuropathy (54). I—  Serum Lipids The precise role of serum lipids on gallstone formation is not known. Gallstones appear to be positively associated with apolipoprotein E4 phenotype and elevated  serum triglycerides (55,56). In contrast, a negative association exists between gallstones and HDL. There is no conclusive evidence linking elevated serum cholesterol  and gallstones. J—  Gallbladder Stasis Conditions that result in bile stasis are associated with a higher prevalence of gallstones. In the normal state, the gallbladder avidly absorbs water from bile. If bile  remains within the gallbladder for a prolonged period of time, it can become overly concentrated with cholesterol, which in turn promotes stone formation. Common  examples of this mechanism include spinal cord injuries, prolonged fasting, and the use of total parenteral nutrition (57–59). A much rarer cause of stasis­induced  gallstones are somatostatinomas. A somatostatinoma is a neuroendocrine tumor that secretes somatostatin, a potent inhibitor of gallbladder emptying. By the same  mechanism, the use of octreotide, a somatostatin analog, has also been associated with gallstone formation (60).

  

Page 133

K—  Other Drugs A number of widely used drugs can promote gallstone and biliary sludge formation. Clofibrate, a cholesterol­lowering agent, is strongly associated with gallstones.  Clofibrate reduces bile acid secretion by inhibiting the rate­limiting enzyme in bile acid synthesis, cholesterol 7 ­hydroxylase. This results in cholesterol supersaturated  bile and stone precipitation (61). Ceftriaxone, a the third­generation cephalosporin, is a major cause of biliary sludge formation in hospitalized patients. Bile excretion  accounts for up to 40% of ceftriaxone elimination and in bile; drug concentrations can reach 200 times that of the serum (62). When supersaturated, ceftriaxone  complexes with calcium and precipitates out of bile. This process is probably potentiated in intensive care unit patients who are not fed enterally and have bile stasis. III—  Cholesterol Gallstone Pathogenesis—An Overview There are three predominant types of gallstones: cholesterol, brown pigment, and black pigment stones. Pigment stones are addressed later in the chapter by  Solloway; in this chapter the focus is on cholesterol gallstones. Cholesterol gallstones can contain from 50 to 99% cholesterol and are the commonest type of stones in  countries where a western­style diet, rich in fat, is ingested. In the United States, they account for 80% of gallstones, and the risk factors for their development are  given in the first section of this chapter. In the last few decades, critical advances have occurred in our understanding of how gallstones form; we will examine an  overview of gallstone formation in this chapter. Many of the following chapters focus on the specific defects associated with gallstone formation, and this chapter will  serve more as an overview of the problem, with more specific details found in the following chapters. Cholesterol gallstone formation can most simply be described as a failure of the constituents of bile to maintain cholesterol in the solubilized form, leading to a  precipitation of cholesterol crystals and then growth to form gallstones. However, multiple pathophysiological mechanisms are involved in gallstone formation, including  supersaturation of bile with cholesterol, as well as alteration of mucosal and motor function. The prolithogenic state is best characterized by excess cholesterol in bile, a  more rapid nucleation of bile, an alteration of biliary mucin and proteins, and finally a loss of normal gallbladder contractility (63–67). These events lead to the  formation initially of cholesterol crystals and then cholesterol gallstones, a process depicted in Fig. 1. Each of these events appears critical for gallstone formation; in  animal models and humans, manipulation of one of these components can lead to the prevention of gallstones (50,68–71). Thus gallstone formation is the culmination  of a number of distinct but closely related pathophysiological pathways, which are described in this and subsequent chapters. A—  Cholesterol Metabolism Cholesterol homeostasis is closely regulated by the liver in humans and biliary cholesterol secretion remains as one of the critical pathways by which one is able to  excrete excess cholesterol. The three major sources of hepatic cholesterol are dietary intake, plasma­derived cholesterol transported from the tissues as low­density  lipoprotein (LDL), high­density lipoprotein (HDL), and very low density lipoprotein (VLDL) as well as newly synthesized cholesterol within the hepatocyte (Fig. 2).  The hepatocyte must process approximately 1800 mg of cholesterol daily, and it does this through three pathways: (1) esterification of cholesterol into lipoproteins and  secretion back into plasma; (2) synthesis of bile salts; and (3) excretion of free cholesterol into bile. Biliary excretion of cholesterol accounts for more than 50% of the  metabolism of free cholesterol in the hepatocyte. In situations where there is excess hepatocyte cholesterol, this excretory pathway becomes even more important but  results in the formation of a cholesterol supersaturated bile. Robins has shown that most biliary cholesterol

  

Page 134

Figure 1 Venn diagram showing triple defect necessary for gallstone formation. Gallstones form in the mucin gel layer in the gallbladder.

Figure 2 Schematic of cholesterol metabolism in the hepatocyte. (BSEP, bile salt export pump; MDR2, phospholipid flipase.)

  

Page 135

is derived from HDL uptake (72), which is mediated by scavenger receptors such as SR­BI (73). Cholesterol synthesis accounts for little of that excreted into bile,  and cholesterol derived from LDL is predominantly metabolized into bile salts (Fig. 2). Since cholesterol is insoluble in water, the cosecretion of the other lipid  components of bile, such as bile salts and phospholipids, are critical for maintaining cholesterol in a soluble state. B—  Biliary Lipids and the Physical Chemistry of Bile Bile is formed at the hepatocyte­canalicular membrane in the liver, modified as it passes through the larger bile ducts, and stored in the gallbladder, where it is further  modified by the gallbladder mucosa. Bile contains water, electrolytes, hepatocyte and biliary canalicular proteins, and lipids (Table 3). The three major lipid moieties in  bile are the primary and secondary bile acids, phosphatidylcholine (lecithin), and cholesterol. These molecules are depicted graphically in Fig. 3 according to their  hydrophobic and hydrophilic characteristics. The relative concentration of the three lipid components of bile can be plotted as a ternary­phase diagram and predicts  the physicochemical characteristics of the lipid carriers in bile (Fig. 4) (74,75). In unsaturated bile, the cholesterol saturation index (CSI) < 1.0. Cholesterol is carried  as mixed micelles; it is solubilized by lecithin and bile salts in the gallbladder. As the CSI rises above 1.0 and bile is supersaturated by cholesterol, the threshold for the solubilization of cholesterol as mixed micelles is reached and cholesterol is  now present in vesicles (76–79). Vesicles are bilayer structures composed of cholesterol and phospholipids, with small concentrations of bile salts; they are  thermodynamically unstable (80). Fusion of vesicles can result in giant multilamellar vesicles or liquid crystals, which appear as Maltese crosses on polarized light  microscopy and from which cholesterol monohydrate crystals can nucleate (81). In humans, bile is frequently supersaturated with cholesterol; but not all persons Table 3 Constituents of Human Canalicular Bile Bile salts, 12 g/L

Cholates, 35%

Glycine conjugates, 75%

Chenodeoxycholates, 35%

Taurine conjugates, 24.8%

Deoxycholates, 25%

Free bile acids, 0.2%

Lithocholates, 1% Miscellaneous, 4%

Phospholipids, 5 g/L

Phosphatidylcholine, 96% Phosphatidyl ethanolamine, 3%

Cholesterol, 1 g/L

Free, unesterified, 99%

Bilirubin, 0.2 g/L

Diglucuronide, 80% Monoglucuronide, 18% Unconjugated, 2%

Proteins, 2 g/L

Albumin, 50% Immunoglobulins, 23% CBP/APF Serum proteins, 9% Canalicular proteins, 1%

Electrolytes

Sodium, 150 meq/L Magnesium, 2 meq/L Calcium, 3 meq/L Potassium, 5 meq/L Chloride, 110 meq/L Bicarbonate, 30 meq/L

Key: CBP, calcium binding  protein; APF, anionic polypeptide  fraction.

  

Page 136

Figure 3 Cartoon depicting the hydrophobic and hydrophilic structure of the lipid constituents of bile.

Figure 4 Phase diagram for a physiological mixture of mixed bile salts, lecithin, and cholesterol. The zones representing cholesterol in 1, 2 and 3 phases are demarcated by solid lines. Distinct pathways of nucleation from liquid crystals through intermediate transition forms are shown by the zones marked A to E. (Adapted from Refs. 74, 75, and 129.)

  

Page 137

with supersaturated bile develop gallstones. The degree of cholesterol supersaturation of bile has been shown by several investigators to be the most important  determinant of gallstone formation (82). Thus, cholesterol supersaturation is a sine qua non for gallstone formation, but other pathophysiological defects in nucleation  and motility are also required. C—  Biliary Lipid Secretion and Cholesterol Supersaturation Cholesterol metabolism is closely regulated by the liver, and excess dietary cholesterol is predominantly excreted as free cholesterol in bile. Therefore, western diets  high in cholesterol lead to biliary supersaturation. In certain populations, such as Pima Indians and in Chileans, an unexplained genetic defect results in very high  cholesterol supersaturation and a predilection for gallstone development. However, since the saturation of cholesterol is also dependent on the relative concentrations  of bile salts and lecithin, secretion of these lipids into bile is critical. The major pathways for both lecithin and bile acid secretion have been elucidated. Bile salts are synthesized in the hepatocyte and undergo an enterohepatic circulation, with reabsorbtion through ileal bile acid receptors in the terminal ileum.  Approximately 300 mg of cholesterol is utilized for bile acid synthesis daily via two pathways involving the enzymes 7­ ­hydroxylase and sterol­27­hydroxylase (83).  Bile salt secretion across the canalicular membrane into the canalicular space is an active process involving the newly recognized ATP­dependent bile salt export pump  (BSEP) (84). BSEP is a canalicular protein and was previously known as the sister of p­glycoprotein. Lecithin is transported to the inner leaflet of the canalicular membrane by a specific phosphatidylcholine (PC) transport protein that is highly selective for PC species of  lecithin (85). Once at the inner leaflet, PC is transferred into bile by a protein flippase, multidrug resistance 2 protein (MDR2) (86). In knockout mice, the absence of  this protein leads to complete loss of both cholesterol and phospholipids in bile (87). The secretion of both bile salt and PC appears to be closely linked to cholesterol  secretion into bile. Elegant experiments using rapid cryofixation electron microscopy have demonstrated vesicular budding of cholesterol from the outer leaflet of the  canalicular membrane into bile in association with bile acid secretion (88). Rapid solubilization of these cholesterol vesicles by the high bile salt concentration in the  canalicular space results in the formation of mixed micelles. To date no specific cholesterol transporter has been described; cholesterol secretion may be predominantly  due to bile salt­induced rapid fluxes across the canalicular membrane. Thus, the physical chemistry of biliary lipids and their secretion into bile act as the background upon which gallstone formation occurs. Gallstones will not occur without  cholesterol supersaturation, and this is probably the most important criterion for stone development. However, in the rest of this chapter, we explain why other  processes are so important for stone formation. D—  Role of the Gallbladder in Gallstone Formation The gallbladder is critical for cholesterol gallstone formation, since nearly all stones are formed in this organ. The gallbladder mucosa has certain critical functions that  are necessary to protect the mucosa from injury due to the high bile salt concentrations (up to 300 mM) seen in humans. The gallbladder mucosa is a simple epithelial  cell lining and is able to secrete mucins and hydrogen ions and to absorb water (89). The secretion of mucin is critical for the prevention of autodigestion of the  gallbladder, since these mucins are highly negatively charged and exert important Gibbs­Donnan forces to protect the mucosa from bile salts. Acidification of bile is  through an active Na+/H+ transporter and the acidification is necessary to prevent calcium salt precipitation in bile (90,91). In gallstone formation, both of these  processes are impaired, resulting in excess mucin secretion, which is prolithogenic and increased free calcium with calcium salt precipitation onto gallstones. These  issues are dealt with in detail in the sections on gallbladder mucin and biomineralization.

  

Page 138

Water absorption by the gallbladder is important for the concentration of bile and effective storage of bile salts in the gallbladder in the interprandial state.  Concentration of bile salts can rise to as high as 300 mM in bile and there is an associated concentration of total lipids from 3 g/dL in hepatic bile to as high as 10 g/dL  in gallbladder bile. The high lipid concentration is critical for the nucleation of cholesterol monohydrate crystals and explains why crystallization occurs in the  gallbladder rather than in hepatic bile. Lipid absorption by the gallbladder mucosa results in preferential absorption of PC versus cholesterol, especially from vesicles.  This leads to a very high ratio of cholesterol to PC in vesicles (2:1) and results in vesicles becoming thermodynamically more unstable. Unilamellar vesicles fuse to  become multilamellar vesicles enriched in cholesterol, and these vesicles contain domains from which nucleation of solid cholesterol monohydrate crystals can occur.  Thus the gallbladder is critical for modification of biliary lipids, leading to a cholesterol­supersaturated unstable bile that is susceptible to nucleation. E—  Nucleation of Cholesterol Monohydrate Crystals We have reviewed the events that lead up to the development of a bile that is able to nucleate cholesterol crystals. However, many normal persons who never develop  crystals or gallstones have a similar lipid profile in the gallbladder with strongly cholesterol­supersaturated bile. Holzbach demonstrated, in a critical study examining  biles of similar cholesterol saturation from patients with and without gallstones, that biles from gallstone­forming patients had a more rapid nucleation (usually <3 days)  of cholesterol crystals in vitro (92–95). This time to the appearance of crystals is known as the nucleation time or crystal appearance time and is an important  cofactor in gallstone formation. Cholesterol nucleates from bile by a process of heterogeneous nucleation, where some nidus promotes initial crystallization. Our current understanding of nucleation is that bile contains a balance of both pro­ and antinucleating factors and that an imbalance in these factors results in the more  rapid nucleation seen in gallstone biles. Despite intensive investigation, there has been little consensus on the exact nature of pronucleating agents (96,97). Certainly  both lipid and protein nucleating agents have been described; in every case their exact role is unclear. This issue is discussed further in Chapter 11. Several proteins  have been well characterized as nucleating agents; these are listed in Table 4 (98–109). The mechanism by which proteins act as nucleating agents is unclear. Some  authors have suggested that the total protein content and the hydrophilic­hydrophobic content of proteins (110) are the critical determinants of nucleation, whereas  others have shown differences in proteins from patients with multiple gallstones versus those with solitary stones (111,112). Gallbladder mucin is a potent nucleating  agent and appears to work via the promotion of vesicular aggregation and fusion to form multilamellae and specific domains of mucin have been shown to be critical  for its pronucleating properties (81,103). Further studies on other proteins to examine how they interact with lipids in bile should add to our knowledge of the  mechanism of nucleation. In addition, antinucleating factors have been described; these act to stabilize cholesterol­containing vesicles and to retard vesicle fusion and nucleation (93,113,114).  The best­described include apolipoprotein AI and AII, and these have been shown to be effective in vivo and in vitro (115–117). A potent and effective orally  delivered anti­nucleating agent would have an important role in prevention of gallstones. Alteration of the lipid content of bile can also affect the nucleation of cholesterol. Nucleation is more rapid in the presence of higher concentrations of deoxycholate,  which affect vesicle membrane stability. The more hydrophobic bile acids destabilize membranes when compared to hydrophilic bile salts such as taurodeoxycholate  or ursodeoxycholate. In the case of deoxycholate, these findings are important, since levels of deoxycholate in gallbladder bile are increased during cholelithiasis (118).  Deoxycholate is formed by bacterial degradation of bile acids and reuptake from the bowel (119). In situations of cholesterol excess, there may also be abnormal  motility of the intestine, with a prolongation of transit time. This may lead

  

Page 139 Table 4 Nucleating Factors Present in Bile That May Inhibit or Promote Nucleation  of Cholesterol Monohydrate Crystals Pronucleators

Antinucleators Proteins

Gallbladder mucin

Apolipoproteins AI and AII

Immunoglobulins M and G

128­kDa Helix pomatia binding dimer

Aminopeptidase N

28­kDa IgA fragment

Alpha1­acid glycoprotein

 

Phospholipase c

 

Haptoglobin

   

Fibronectin

Nonprotein Factors Total lipid conc. >5 g/dL

Total lipid conc. <3 g/dL

High vesicular cholesterol: phospholipid  Low vesicular cholesterol: phospholipid  ratio ratio High calcium

Low calcium

Increased secondary hydrophobic bile  acids

Increased hydrophilic bile acids

Polyunsaturated PL species

Saturated PL species

High CSI

Low CSI

Key: PL, phospholipid; CSI, cholesterol saturation index. Source: Adapted from Ref. 129.

to increased levels of deoxycholate in bile and these findings have been demonstrated by Dowling (see Chap. 4) in patients with sandostatin­induced gallstones and  those with constipation (60). Alterations to the length (increasing chain length to C16–C20) and hydrophobicity of the fatty acids in the Sn­1 and Sn­2 position of lecithin can also effect nucleation in  vitro but have little relevance in vivo, where PC is overwhelmingly the dominant form of phospholipid. However, if one were able to derive a bile acid conjugated to  long­chain fatty acid, as has been shown by Gilat and Konikoff (personal communication), nucleation could be retarded and the lipids could enter bile through the  enterohepatic circulation. F—  Gallbladder Motility Several chapters in this book are devoted to the normal and abnormal motility of the gallbladder, particularly with reference to gallstone formation. In the preceding  sections, we have shown that cholesterol crystals can be formed in the gallbladder, but these are of a size that would easily be ejected through the cystic duct by  normal gallbladder ejection. However, simultaneously with the defects in lipid secretion and gallbladder mucosal function, there is also a defect in motility. Current  theories suggest that the smooth muscle is also saturated with cholesterol, leading to an uncoupling of the contractile mechanism and decreased muscle contraction  (120–124). There may also be a defect in the intrinsic nervous control of gallbladder motility. The resulting effect is the retention by the gallbladder of a gel phase— consisting of mucus, cholesterol crystals and microliths, calcium bilirubinate granules—which is described as biliary sludge (125–127) (see Chap. 21). Biliary sludge is  not only a precursor of gallstones but is

  

Page 140

also able to provoke clinical symptoms such as pancreatitis, as this particulate matter can escape into the common bile duct and lead to inflammation of the pancreas. G—  Gallstone Prevention As our understanding of gallstone formation has progressed, the ability to start considering prevention of gallstones is now a very real consideration. Primary  prevention with exercise, avoidance of high­cholesterol foods, and constipation are simple lifestyle measures that can be undertaken. Therapies to increase BSEP  delivery of bile acids or to stimulate bile acid synthesis are becoming a reality. Alteration of nucleation with bile salt therapy or mucolytic agents may be possible in the  future. Finally, drugs to stimulate contraction of the gallbladder such as CCK analogs or motilin agonists, can be used to prevent sludge formation. These exciting  opportunities in basic and clinical research may make gallstone disease a medically treatable disorder and obviate the need for so many cholecystectomies. IV—  Summary In this chapter we have discussed the epidemiology and multifactorial pathogenesis of gallstone formation and laid the groundwork for the following chapters, which  discuss the specific mechanisms in much greater detail. The future for gallstone research looks exciting and the prevention of gallstone disease may soon become a  reality in clinical medicine. References 1. Steiner CA, Bass EB, Talamini MA, Pitt HA, Steinberg EP. Surgical rates and operative mortality for open and laparoscopic cholecystectomy in Maryland (see  comments). N Engl J Med 1994;330(6):403–408. 2. Zahor A, Sternby NH, Kagan A, Uemura K, Vanecek R, Vichert AM. Frequency of cholelithiasis in Prague and Malmo: an autopsy study. Scand J Gastroenterol  1974;9(1):3–7. 3. Lindstrom CG. Frequency of gallstone disease in a well­defined Swedish population: a prospective necropsy study in Malmo. Scand J Gastroenterol 1977;12 (3):341–346. 4. Brett M, Barker DJ. The world distribution of gallstones. Int J Epidemiol 1976;5(4):335–341. 5. Diehl AK, Schwesinger WH, Holleman DR, Jr, Chapman JB, Kurtin WE. Gallstone characteristics in Mexican Americans and non­Hispanic whites (see  comments). Dig Dis Sci 1994;39(10):2223–2228. 6. Heaton KW, Braddon FE, Mountford RA, Hughes AO, Emmett PM. Symptomatic and silent gall stones in the community. Gut 1991;32(3):316–320. 7. Maurer KR, Everhart JE, Ezzati TM, et al. Prevalence of gallstone disease in Hispanic populations in the United States [published erratum appears in  Gastroenterology 1989 Jun;96(6):1630]. Gastroenterology 1989;96(2 Pt 1):487–492. 8. Maurer KR, Everhart JE, Knowler WC, Shawker TH, Roth HP. Risk factors for gallstone disease in the Hispanic populations of the United States. Am J  Epidemiol 1990;131(5):836–844. 9. Sampliner RE, Bennett PH, Comess LJ, Rose FA, Burch TA. Gallbladder disease in Pima Indians: demonstration of high prevalence and early onset by  cholecystography. N Engl J Med 1970;283(25):1358–1364. 10. Williams CN, Johnston JL, Weldon KL. Prevalence of gallstones and gallbladder disease in Canadian Micmac Indian women. Can Med Assoc J 1977;117 (7):758–760.

  

Page 141

11. Thistle JL, Schoenfield LJ. Lithogenic bile among young Indian women. N Engl J Med 1971;284(4):177–181. 12. Williams CN, Johnston JL. Prevalence of gallstones and risk factors in Caucasian women in a rural Canadian community. Can Med Assoc J 1980;122(6):664– 668. 13. Attili AF, Pazzi P, Galeazzi R. Prevalence of previously undiagnosed gallstones in a population with multiple risk factors. Dig Dis Sci 1995;40(8):1770–1774. 14. Attili AF CN, Roda N et al. Epidemiology of gallstone disease in Italy; prevalence data of the multicenter Italian study on cholelithiasis (MICOL). Am J Epidemiol  1995;141: 158. 15. Barbara L SC, Morselli­Labate AM, et al. A ten year incidence of gallstone disease: the Sirmione study. J Hepatol. 1993;18:43. 16. Jensen KH, Jorgensen T. Incidence of gallstones in a Danish population. Gastroenterology 1991;100(3):790–794. 17. Sichieri R, Everhart JE, Roth H. A prospective study of hospitalization with gallstone disease among women: role of dietary factors, fasting period, and dieting.  Am J Public Health 1991;81(7):880–884. 18. Waldhausen JH, Benjamin DR. Cholecystectomy is becoming an increasingly common operation in children. Am J Surg 1999;177(5):364–367. 19. Angelico F, Del Ben M, Barbato A, Conti R, Urbinati G. Ten­year incidence and natural history of gallstone disease in a rural population of women in central  Italy: The Rome Group for the Epidemiology and Prevention of Cholelithiasis (GREPCO). Ital J Gastroenterol Hepatol 1997;29(3):249–254. 20. Attili AF, De Santis A, Capri R, Repice AM, Maselli S. The natural history of gallstones: the GREPCO experience. The GREPCO Group. Hepatology 1995;21 (3):655–660. 21. Valdiviseo V CC, Siegel F, et al. Pregnancy and cholelithiasis: pathogenesis and natural course of gallstones diagnosed in early puerperium. Hepatology  1993;17:1. 22. Maringhini A, Marceno MP, Lanzarone F, et al. Sludge and stones in gallbladder after pregnancy: prevalence and risk factors. J Hepatol 1987;5(2):218–223. 23. Maringhini A, Ciambra M, Baccelliere P, et al. Biliary sludge and gallstones in pregnancy: incidence, risk factors, and natural history. Ann Intern Med 1993;119 (2):116–120. 24. Everson GT, McKinley C, Kern F Jr. Mechanisms of gallstone formation in women: effects of exogenous estrogen (Premarin) and dietary cholesterol on hepatic  lipid metabolism. J Clin Invest 1991;87(1):237–246. 25. Kern F Jr., Everson GT, DeMark B, et al. Biliary lipids, bile acids, and gallbladder function in the human female: effects of pregnancy and the ovulatory cycle. J  Clin Invest 1981;68(5):1229–1242. 26. Grodstein F, Colditz GA, Hunter DJ, Manson JE, Willett WC, Stampfer MJ. A prospective study of symptomatic gallstones in women: relation with oral  contraceptives and other risk factors. Obstet Gynecol 1994;84(2):207–214. 27. Misciagna G, Leoci C, Guerra V, et al. Epidemiology of cholelithiasis in southern Italy: Part II: Risk factors. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996;8(6):585–593. 28. Scragg RK, McMichael AJ, Seamark RF. Oral contraceptives, pregnancy, and endogenous oestrogen in gall stone disease—a case­control study. Br Med J  (Clin Res Ed) 1984;288(6433):1795–1799. 29. Everhart JE, Khare M, Hill M, Maurer KR. Prevalence and ethnic differences in gallbladder disease in the United States. Gastroenterology 1999;117(3):632– 639. 30. Group CDPR. Gallbladder disease as a side effect of drugs influencing lipid metabolism: experience in the coronary drug project. N Engl J Med 1977;296:1185. 31. Hendricksson P EK, Eriksson A, et al. strogen induced gallstone formation in males. relation to changes in serum and biliary lipids during hormonal treatment of  prostatic carcinoma. J Clin Invest 1989;84:811. 32. Thijs C, Leffers P, Knipschild P. Oral contraceptive use and the occurrence of gallstone disease—a case­control study. Prev Med 1993;22(1):122–131.

  

Page 142

33. Thijs C KP. Oral contraceptives and the risk of gallbladder disease: a meta­analysis. Am J Public Health 1993;22:122. 34. Gilat T, Feldman C, Halpern Z, Dan M, Bar­Meir S. An increased familial frequency of gallstones. Gastroenterology 1983;84(2):242–246. 35. Sarin SK, Negi VS, Dewan R, Sasan S, Saraya A. High familial prevalence of gallstones in the first­degree relatives of gallstone patients (see comments).  Hepatology 1995;22(1): 138–141. 36. Khanuja B, Cheah YC, Hunt M, et al. Lithl, a major gene affecting cholesterol gallstone formation among inbred strains of mice. Proc Natl Acad Sci USA  1995;92(17):7729–7733. 37. Acalovschi MV, Blendea D, Pascu M, Georoceanu A, Badea RI, Prelipceanu M. Risk of asymptomatic and symptomatic gallstones in moderately obese women:  a longitudinal follow­up study. Am J Gastroenterol 1997;92(1):127–131. 38. Everhart JE. Contributions of obesity and weight loss to gallstone disease. Ann Intern Med 1993;119(10):1029–1035. 39. Friedman GD, Kannel WB, Dawber TR. The epidemiology of gallbladder disease: observations in the Framingham Study. J Chronic Dis 1966;19(3):273–292. 40. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JH, Brewer WH, Moore EW. Gallstones in patients with morbid obesity: relationship to body weight, weight loss and  gallbladder bile cholesterol solubility. Int J Obesity Rel Metab Disord 1993;17(3):153–158. 41. Stampfer MJ, Maclure KM, Colditz GA, Manson JE, Willett WC. Risk of symptomatic gallstones in women with severe obesity. Am J Clin Nutr 1992;55 (3):652–658. 42. Amaral JF TW. Gallbladder disease in the morbidly obese. Am J Surg 1985;149:551. 43. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Brewer WH, Moore EW. Gallstone formation after rapid weight loss: a prospective study in patients undergoing gastric  bypass surgery for treatment of morbid obesity. Am J Gastroenterol 1991;86(8):1000–1005. 44. Shiffman ML, Shamburek RD, Schwartz CC, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Gallbladder mucin, arachidonic acid, and bile lipids in patients who develop  gallstones during weight reduction. Gastroenterology 1993;105(4):1200–1208. 45. Shiffman ML, Kaplan GD, Brinkman­Kaplan V, Vickers FF. Prophylaxis against gallstone formation with ursodeoxycholic acid in patients participating in a very­ low­calorie diet program [see comments]. Ann Intern Med 1995;122(12):899–905. 46. Andersen T. Liver and gallbladder disease before and after very­low­calorie diets. Am J Clin Nutr 1992;56(1 Suppl):235S–239S. 47. Marks JW, Bonorris GG, Albers G, Schoenfield LJ. The sequence of biliary events preceding the formation of gallstones in humans. Gastroenterology 1992;103 (2):566–570. 48. Yang H, Petersen GM, Roth MP, Schoenfield LJ, Marks JW. Risk factors for gallstone formation during rapid loss of weight. Dig Dis Sci 1992;37(6):912–918. 49. Gebhard RL, Prigge WF, Ansel HJ, et al. The role of gallbladder emptying in gallstone formation during diet­induced rapid weight loss. Hepatology 1996;24 (3):544–548. 50. Marks JW, Bonorris GG, Schoenfield LJ. Effects of ursodiol or ibuprofen on contraction of gallbladder and bile among obese patients during weight loss. Dig Dis  Sci 1996; 41(2):242–249. 50a. Broomfield PH, Chopra R, Sheinbaum RC, Bonorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodexycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. N Engl J Med 1988;319(24):1567–1572. 51. Sasazuki S, Kono S, Todoroki I, et al. Impaired glucose tolerance, diabetes mellitus, and gallstone disease: an extended study of male self­defense officials in  Japan. Eur J Epidemiol 1999;15(3):245–251. 52. De Santis A, Attili AF, Ginanni Corradini S, et al. Gallstones and diabetes: a case­control study in a free­living population sample. Hepatology 1997;25(4):787– 790. 53. Chapman BA, Wilson IR, Frampton CM, et al. Prevalence of gallbladder disease in diabetes mellitus. Dig Dis Sci 1996;41(11):2222–2228.

  

Page 143

54. Hahm JS, Park JY, Park KG, Ahn YH, Lee MH, Park KN. Gallbladder motility in diabetes mellitus using real time ultrasonography. Am J Gastroenterol 1996;91 (11): 2391–2394. 55. Scragg RK, Calvert GD, Oliver JR. Plasma lipids and insulin in gallstone disease: a case­control study. Br Med J (Clin Res Ed) 1984;289(6444):521–525. 56. Kern F, Jr. Effects of dietary cholesterol on cholesterol and bile acid homeostasis in patients with cholesterol gallstones. J Clin Invest 1994;93(3):1186–1194. 57. Apstein MD, Dalecki­Chipperfield K. Spinal cord injury is a risk factor for gallstone disease. Gastroenterology 1987;92(4):966–968. 58. Moonka R, Stiens SA, Eubank WB, Stelzner M. The presentation of gallstones and results of biliary surgery in a spinal cord injured population. Am J Surg  1999;178(3): 246–250. 59. Moonka R, Stiens SA, Resnick WJ, et al. The prevalence and natural history of gallstones in spinal cord injured patients. J Am Coll Surg 1999;189(3):274–281. 60. Hussaini SH, Pereira SP, Veysey MJ, et al. Roles of gall bladder emptying and intestinal transit in the pathogenesis of octreotide induced gall bladder stones. Gut  1996;38(5): 775–783. 61. Stahlberg D RE, Rudling M et al. Influence of benzfibrate on hepatic cholesterol metabolism in gallstone patients: reduced activity of cholesterol 7  ­hydroxylase.  Hepatology 1995;21:1025. 62. Shiffman ML, Keith FB, Moore EW. Pathogenesis of ceftriaxone­associated biliary sludge. In vitro studies of calcium­ceftriaxone binding and solubility.  Gastroenterology 1990;99(6):1772–1778. 63. Afdhal N, Smith B. Current concepts on the pathogenesis of cholesterol gallstones. Views Dig Dis 1990;22:13–18. 64. Apstein MD, Carey MC. Pathogenesis of cholesterol gallstones: a parsimonious hypothesis. Eur J Clin Invest 1996;26(5):343–352. 65. Carey MC, Lamont JT. Cholesterol gallstone formation. 1. Physical­chemistry of bile and biliary lipid secretion. Progr Liver Dis 1992;10:139–163. 66. Donovan JM. Physical and metabolic factors in gallstone pathogenesis. Gastroenterol Clin North Am 1999;28(1):75–97. 67. Lamont JT, Carey MC. Cholesterol gallstone formation: 2. Pathobiology and pathomechanics. Progr Liver Dis 1992;10:165–191. 68. Lee SP, Carey MC, LaMont JT. Aspirin prevention of cholesterol gallstone formation in prairie dogs. Science 1981;211(4489):1429–1431. 69. Lee SP. Lessons from experimental cholelithiasis: gallbladder and mucosa, nonsteroidal antiinflammatory drugs, and gallstones (editorial; comment).  Gastroenterology 1991; 101(3):857–860. 70. Levenson DE, Fromm H. 10 g of fat per day may keep gallstones away. Gastroenterology 1993;104(6):1880–1881. 71. Xu QW, Shaffer EA. Cisapride improves gallbladder contractility and bile lipid composition in an animal model of gallstone disease. Gastroenterology 1993;105 (4):1184–1191. 72. Robins SJ FJ. High density lipoproteins, but not other lipoproteins, provide a vehicle for sterol transport to bile. J Clin Invest 1997;99:380–384. 73. Acton S RA, Landschulz KT, Xu S, Hobbs HH, Krieger M. Identification of a scavenger receptor SR­B1 as a high density lipoprotein receptor. Science  1996;271:518–520. 74. Wang DQ, Carey MC. Characterization of crystallization pathways during cholesterol precipitation from human gallbladder biles: identical pathways to  corresponding model biles with three predominating sequences. J Lipid Res 1996;37(12):2539–2549. 75. Wang DQ, Carey MC. Complete mapping of crystallization pathways during cholesterol precipitation from model bile: influence of physical­chemical variables of  pathophysiologic relevance and identification of a stable liquid crystalline state in cold, dilute and hydrophilic bile salt­containing systems. J Lipid Res 1996;37(3):606– 630.

  

Page 144

76. Cohen DE, Angelico M, Carey MC. Quasielastic light scattering evidence for vesicular secretion of biliary lipids. Am J Physiol 1989;257(1 Pt 1):G1–G8. 77. Donovan JM, Carey MC. Separation and quantitation of cholesterol ''carriers" in bile. Hepatology 1990;12(3 Pt 2):94S–104S; discussion 104S–105S. 78. Eckhardt ER, van de Heijning BJ, van Erpecum KJ, Renooij W, VanBerge­Henegouwen GP. Quantitation of cholesterol­carrying particles in human gallbladder  bile. J Lipid Res 1998;39(3):594–603. 79. Gantz DL, Wang DQ, Carey MC, Small DM. Cryoelectron microscopy of a nucleating model bile in vitreous ice: formation of primordial vesicles. Biophys J  1999;76(3):1436–1451. 80. Somjen GJ, Marikovsky Y, Lelkes P, Gilat T. Cholesterol­phospholipid vesicles in human bile: an ultrastructural study. Biochim Biophys Acta 1986;879(1):14– 21. 81. Afdhal NH, Niu N, Nunes DP, et al. Mucin­vesicle interactions in model bile: evidence for vesicle aggregation and fusion before cholesterol crystal formation.  Hepatology 1995;22(3):856–865. 82. Miquel JF, Nunez L, Amigo L, et al. Cholesterol saturation, not proteins or cholecystitis, is critical for crystal formation in human gallbladder bile.  Gastroenterology 1998;114(5): 1016–1023. 83. Javitt NB. Bile acid synthesis from cholesterol: regulation and auxiliary pathways. FASEB J 1994;8:1308–1311. 84. Gerloff T, Steiger B, Hagenbuch B, et al. The sister of p­glycoprotein represents the canalicular bile salt export pump of mammalian liver. J Biol Chem  1998;173:10046–10050. 85. Cohen DE, Leonard MR, Carey MC. In vitro evidence that phospholipid secretion into bile may be coordinated intracellularly by the combined actions of bile  salts and the specific phosphatidylcholine transfer protein of liver. Biochemistry 1994;33(33):9975–9980. 86. Smit JJ, Schinkel AH, Oude Elferink RP, et al. Homozygous disruption of the murine mdr2 P­glycoprotein gene leads to a complete absence of phospholipid from  bile and to liver disease. Cell 1993;75(3):451–462. 87. Elferink R, Ottenhof R, Vanwijland M, Smit JJM, Schinkel AH, Groen AK. Regulation of biliary lipid secretion by the mdr2p­glycoprotein in the mouse. J Clin  Invest 1995; 95:31–38. 88. Crawford JM, Mockel GM, Crawford AR, et al. Imaging biliary lipid secretion in the rat: ultrastructural evidence for vesiculation of the hepatocyte canalicular  membrane. J Lipid Res 1995;36(10):2147–2163. 89. Conter RL, Washington JL, Liao CC, Kauffman GL Jr. Gallbladder mucosal blood flow increases during early cholesterol gallstone formation (see comments).  Gastroenterology 1992;102(5):1764–1770. 90. Rege RV, Moore EW. Evidence for H+ secretion by the in vivo canine gallbladder. Gastroenterology 1987;92(2):281–289. 91. Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore EW. Human gallbladder mucosal function: effect of concentration and acidification of bile on cholesterol and calcium  solubility. Gastroenterology 1990;99(5):1452–1459. 92. Holzbach RT. Factors influencing cholesterol nucleation in bile. Hepatology 1984;4(5 Suppl):173S–176S. 93. Holzbach RT. Metastability behavior of supersaturated bile. Hepatology 1984;4(5 Suppl):155S–158S. 94. Holzbach RT. Recent progress in understanding cholesterol crystal nucleation as a precursor to human gallstone formation. Hepatology 1986;6(6):1403–1406. 95. Holzbach RT, Kibe A, Thiel E, Howell JH, Marsh M, Hermann RE. Biliary proteins: unique inhibitors of cholesterol crystal nucleation in human gallbladder bile. J  Clin Invest 1984;73(1):35–45.

  

Page 145

96. Afdhal NH, Smith BF. Cholesterol crystal nucleation: a decade­long search for the missing link in gallstone pathogenesis. Hepatology 1990;11(4):699–702. 97. Harvey PR, Strasberg SM. Will the real cholesterol­nucleating and ­antinucleating proteins please stand up? (editorial; comment). Gastroenterology 1993;104 (2):646–650. 98. Abei M, Kawczak P, Nuutinen H, Langnas A, Svanvik J, Holzbach RT. Isolation and characterization of a cholesterol crystallization promoter from human bile  (see comments). Gastroenterology 1993;104(2):539–548. 99. Harvey PR, Upadhya GA, Strasberg SM. Immunoglobulins as nucleating proteins in the gallbladder bile of patients with cholesterol gallstones. J Biol Chem  1991;266(21):3996–4003. 100. Lee TJ, Smith BF. Bovine gallbladder mucin promotes cholesterol crystal nucleation from cholesterol­transporting vesicles in supersaturated model bile. J Lipid  Res 1989;30(4):491–498. 101. Luk AS, Kaler EW, Lee SP. Protein lipid interaction in bile: effects of biliary proteins on the stability of cholesterol­lecithin vesicles. Biochim Biophys Acta  1998;1390(3):282–292. 102. Miquel JF, Von Ritter C, Del Pozo R, Lange V, Jungst D, Paumgartner G. Fibronectin in human gallbladder bile: cholesterol pronucleating and/or mucin "link"  protein? Am J Physiol 1994;267(3 Pt 1):G393–G400. 103. Nunes DP, Afdhal NH, Offner GD. A recombinant bovine gallbladder mucin polypeptide binds biliary lipids and accelerates cholesterol crystal appearance time.  Gastroenterology 1999;116(4):936–942. 104. Nuutinen H, Corradini SG, Jungst D, et al. Correlation between biliary alpha 1­acid glycoprotein concentration and cholesterol crystal nucleation time in gallstone  disease. Dig Dis Sci 1995;40(6):1174–1178. 105. Nuutinen H, Abei M, Schwarzendrube J, et al. Biliary alpha 1­acid glycoprotein concentrations in gallstone­free controls and in patients with multiple or solitary  cholesterol gallstones. Dig Dis Sci 1995;40(8):1786–1791. 106. Offner GD, Gong D, Afdhal NH. Identification of a 130­kilodalton human biliary concanavalin A binding protein as aminopeptidase N. Gastroenterology  1994;106(3):755–762. 107. Small DM. Cholesterol nucleation and growth in gallstone formation. N Engl J Med 1980;302:1305–1307. 108. Smith BF. Human gallbladder mucin binds biliary lipids and promotes cholesterol crystal nucleation in model bile. J Lipid Res 1987;28(9):1088–1097. 109. Smith BF. Gallbladder mucin as a pronucleating agent for cholesterol monohydrate crystals in bile. Hepatology 1990;12(3 Pt 2):183S–186S; discussion 186S– 188S. 110. Ahmed HA, Petroni ML, Abu­Hamdiyyah M, Jazrawi RP, Northfield TC. Hydrophobic/hydrophilic balance of proteins: a major determinant of cholesterol  crystal formation in model bile. J Lipid Res 1994;35(2):211–219. 111. Van Erpecum KJ, Van Berge­Henegouwen GP, Eckhardt ER, et al. Cholesterol crystallization in human gallbladder bile: relation to gallstone number, bile  composition, and apolipoprotein E4 isoform. Hepatology 1998;27(6):1508–1516. 112. Jungst D, Lang T, von Ritter C, Pratschke E, Paumgartner G. Cholesterol nucleationtime in gallbladder bile of patients with solitary or multiple cholesterol  gallstones. Hepatology 1992;15(5):804–808. 113. Busch N, Holzbach RT. Crystal growth­inhibiting proteins in bile. Hepatology 1990;12(3 Pt 2):195S–198S; discussion 199S. 114. Busch N, Matiuck N, Sahlin S, Pillay SP, Holzbach RT. Inhibition and promotion of cholesterol crystallization by protein fractions from normal human  gallbladder bile. J Lipid Res 1991;32(4):695–702. 115. Kibe A, Holzbach RT, LaRusso NF, Mao SJ. Inhibition of cholesterol crystal formationby apolipoproteins in supersaturated model bile. Science 1984;225 (4661):514–516.

  

Page 146

116. Secknus R, Yamashita G, Ginanni Corradini S, et al. Purification and characterization of a novel human 15 kd cholesterol crystallization inhibitor protein in bile. J  Lab Clin Med 1996;127(2):169–178. 117. Tao S, Tazuma S, Kajiyama G. Apolipoprotein A­I stabilizes phospholipid lamellae and thus prolongs nucleation time in model bile systems: an ultrastructural  study. Biochim Biophys Acta 1993;1166(1):25–30. 118. Hay DW, Carey MC. Chemical species of lipids in bile. Hepatology 1990;12(3 Pt 2):6S–14S; discussion 14S–16S. 119. Marcus SN, Heaton KW. Deoxycholic acid and the pathogenesis of gallstones. Gut 1988;29(4):522–533. 120. Chen Q, Amaral J, Oh S, Biancani P, Behar J. Gallbladder relaxation in patients with pigment and cholesterol stones. Gastroenterology 1997;113(3):930–937. 121. Chen Q, Amaral J, Biancani P, Behar J. Excess membrane cholesterol alters human gallbladder muscle contractility and membrane fluidity. Gastroenterology  1999;116(3):678–685. 122. van de Heijning BJ, van de Meeberg PC, Portincasa P, et al. Effects of ursodeoxycholic acid therapy on in vitro gallbladder contractility in patients with  cholesterol gallstones. Dig Dis Sci 1999;44(1):190–196. 123. Yu P, Harnett KM, Biancani P, De Petris G, Behar J. Interaction between signal transduction pathways contributing to gallbladder tonic contraction. Am J  Physiol 1993;265(6 Pt 1):G1082–G1089. 124. Yu P, De Petris G, Biancani P, Amaral J, Behar J. Cholecystokinin­coupled intracellular signaling in human gallbladder muscle. Gastroenterology 1994;106 (3):763–770. 125. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1988;95(2):508–523. 126. Ko CW, Sekijima JH, Lee SP. Biliary sludge. Ann Intern Med 1999;130(4 Pt 1):301–311. 127. Lee SP, Maher K, Nicholls JF. Origin and fate of biliary sludge. Gastroenterology 1988;94(1):170–176. 128. Everhart JE. Gallstones. In: Digestive Diseases in the United States: Epidemiology and Impact, 1994. NIH Publication No. 94­1447. Bethesda, MD:  National Institutes of Health, 1994. 129. Afdhal NH, Carey MC. New Perspectives on gallstone pathogenesis and prevention. J Ir Coll Phys Surg 1995;24:267–278.

  

Page 147

7—  Pigment Gallstones Roger D. Soloway and Nyingi M. Kemmer University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas Jinguang Wu Peking University, Beijing, People's Republic of China I—  Introduction Although the pathogenesis of cholesterol gallstones is increasingly well known, the pathogenesis of noncholesterol components in stones is varied and much less  completely understood. Noncholesterol components in stones occur in three compositional and clinical settings: (a) as periodic, ring­shaped crystallization of calcium  salts on a protein scaffolding situated between the cholesterol crystal matrix of cholesterol gallstones; (b) as the crystallization of a variety of calcium salts in a protein  matrix, forming black pigment stones in the gallbladder; and (c) as the precipitate of a supersaturated solution of the calcium salts of bilirubin and fatty acids forming  brown pigment stones anywhere within the biliary tract (1–3). The epidemiology and pathogenesis of these three types of stones are mutually exclusive, meaning that  only one type of stone will form at a given point in time. This exclusivity is reflected in their differing structures and compositions and is the subject of this chapter.  Sludge, or microlithiasis, may be a stage in gallstone formation or may be a separate condition and is treated independently. II—  Epidemiology A—  General An examination of the geography of gallstone composition demonstrates striking differences in the operative frequency of gallstone types around the world. Although  genetics plays an important role, infection, motility, and diet are also independent and important factors governing regional differences. Cholesterol stones account for  70 to 90% of gallstones in various areas in the United States (4) and usually contain a series of rings of calcium salts laid down on a protein scaffolding when examined  in cross section (5). Black pigment stones make up the remainder of gallbladder stones in western countries and are composed of calcium salts and proteins with  almost no cholesterol content. In the West, brown pigment stones occur predominantly as common duct stones developing more than 2 years after cholecystectomy  (6), while in Asia, stones occur within the gallbladder but predominantly as pyogenic cholangitis and hepatolithiasis due to the formation of brown stones in the  extrahepatic or intrahepatic bile ducts (7–13). The relationship of gallbladder sludge or microlithiasis to these stones is

  

Page 148

unclear, since less than 20% of patients with sludge later develop traditionally sized gallstones (14–17). B—  Noncholesterol Content in Cholesterol Gallstones Studies of stone composition have revealed that the pigmented centers and rings of "mixed" cholesterol stones, the most common type of gallstone, contain primarily  cholesterol (18). Cholesterol stones contain 70 to 100% cholesterol, and the cross­sectional distribution of noncholesterol content on examination of individual stone  sets appears to be unique for each patient (unpublished results). Studies comparing cholesterol content between cholesterol stones in different countries did not  demonstrate striking average differences between series, although the range of proportions of cholesterol in stones in different operative series was quite wide  (unpublished results). The mechanisms governing the formation and composition of the various components of cholesterol stones seem to be similar throughout the  world. Although we did not recognize different crops of gallstones in a series of gallstones from Philadelphia, we did not consider the presence of sludge or microlithiasis in  that series (4). In a more recent series from Germany, where this phenomenon was specifically examined, 29% of 310 sets of stones contained two distinct  generations of stones (19). In Philadelphia (4), only 2 of more than 100 stone sets contained both a cholesterol and a distinct black pigment stone layer, while in  Germany, 47% of gallstones contained a black or brown outer layer (19). It is unclear if this marked difference was due to the lack of differentiation by investigators  between secondary deposition of noncholesterol components in a field of loosely packed cholesterol crystals or to the primary deposition of a noncholesterol layer of  calcium salts and proteins (characteristic of black pigment stones) on the surface of a cholesterol stone. We and others have recently identified patients with several  crops of stones in the same gallbladder (19–21) and others have identified patients with gallstones and sludge (19). Solitary and multiple gallstones demonstrate differences in response to bile acid dissolution treatment and in recurrence after dissolution (19,22). Pure cholesterol  stones (so­called solitaires) represent about 20% of cholesterol stones in the United States (unpublished results) and 22.5% in Germany (70 of 310) (19). These  stones contain no visible noncholesterol components (the most sensitive way to detect calcium bilirubinate). Mixed stones are typical of most patients with crops of  stones (1). The various calcium carbonate polymorphs in cholesterol stones (23,24) differ in frequency between the United States, Bolivia, Mexico, and Italy (unpublished  results), confirming the clinical impression from gallstone dissolution trials that gallstones from Europe more frequently become calcified or become calcified in the  course of treatment monitoring. Calcite, aragonite, and vaterite were each identified in stones, but in different layers (23). Two studies found that carbonate was more  prevalent in the periphery than in the center of cholesterol stones, suggesting that its deposition was more related to intermittent obstruction (23–25) than to stone  nidation (26,27). Biliary obstruction is most frequently painful but may be tolerated to different extents in different cultures. Calcium hydroxyapatite, the usual form of calcium phosphate in stones, occurs less frequently than calcium carbonate. There may be regional environmental factors  that influence stone composition. This could be due to differences in mineral content of the drinking water or in the predisposition of changes in the diet to increase the  biliary secretion of calcium or carbonate and hydroxyapatite. Alternatively, if these salts are precipitated as a result of the activity of commensal biliary tract bacteria,  as occurs for urinary stones or dental calculus (28), the average indigenous bacterial population may differ significantly between regions, and some bacteria in Europe  may be more predisposed to calcium salt formation. New prospective and extensive regional studies are needed to provide additional information about the causation  of differing regional patterns of cholesterol gallstone composition. Although there are virtually no black pigment stones formed in La Paz, Bolivia, or Mexico City,  Mexico (29–30), the non­

  

Page 149

cholesterol content of these stones was not significantly different from that of the stones studied in Philadelphia (4). C—  Black Pigment Gallstones These stones are heterogeneous in composition but grouped as black because of the appearance of the metal salts of bilirubinate anionic copolymers after exposure to  singlet oxygen (31,32). Calcium bilirubinate may vary from 10 to 90% of stone weight (4,33), and a variety of other calcium and metal salts of carbonate and  hydroxyapatite are also present. These stones are associated primarily with old age (34,35) and to a much smaller extent with hemolysis (36,37), hyperalimentation  (38), Crohn's disease (39,40) and cirrhosis (41–45). The incidence of these stones varies less strikingly by country of origin than for cholesterol stones when  compared in operative series (4,34,46). In Galveston Texas, with a large Hispanic population, and in Rochester, Minnesota, with a large proportion of Scandinavian  peoples, as well as in Scandinavia, the incidence of black pigment stones is 5% (3). In Japan, the incidence is 9%, with a significant incidence of brown pigment stones  (35), a phenomenon not noted in western series. In the eastern United States the incidence is 30% (34); in India, the incidence is 40% (47); among Amerinds, the  incidence is very low or nonexistent (29,30). Although the average age of these various populations differs, this is not enough to explain the differences. In the  presence of hemolysis, as in sickle cell disease, all patients, in whom stones have been examined have had black pigment stones (32). This is also true for the majority  of the small number of stones formed in patients receiving total parenteral nutrition (TPN) (38,48). However, since the large majority of stones and sludge forming in  late pregnancy dissolve following delivery, with the return of the gallbladder and other muscles to normal levels of motility, the hypomotility of pregnancy probably  predisposes to cholesterol rather than pigment gallstones. Those who have examined stone formation during hyperalimentation have demonstrated that hypomotility is  crucial, since administration of a meal or of cholecystokinin octipeptide several times a week, resulting in gallbladder contraction, prevented stone formation even  though TPN was continued (48). The mechanism by which advancing age causes an increase in the operative incidence of black pigment stones and a decrease in the  incidence of cholesterol stones is unknown, but this has been observed repeatedly throughout the world when it was looked for (34,35). The most striking study to  date, has been the study by Hikasa and associates, in which they fed 5­week­old (adolescent) hamsters a cholesterol stone­producing diet and 80% developed  cholesterol stones. However, when they fed the same diet to 5­month­old (middle­aged) hamsters, only 60% developed cholesterol stones, while 20% formed black  pigment stones (49). A number of questions have been left unanswered by this provocative study: (a) What is the effect of aging on causing the formation of black  pigment stones? (b) What is special about the 20% of a homogenous strain that produce black pigment rather than cholesterol gallstones? (c) Why do 20% of this  same strain not form stones at all at either age point selected? D—  Brown Pigment Gallstones The frequency of primary brown pigment gallbladder stones varies from 0% in Bolivia (29,30), to 30% in Japan (35), to greater than 90% of operative series in rural  regions in China (3) and it is thought to be related to the classic low­animal­protein, low­calorie, high­vegetable diet of Asian peoples. In Asia, stones occurred  primarily in the biliary tract and liver (50), associated with recurrent pyogenic cholangitis (51) or cholangiohepatitis (52). The operative frequency varies throughout  Asia (53). Asian surgeons have become skillful in hepatic resection and duct reconstruction to reduce stone recurrence in areas of the liver damaged by infection. The  strongest support for this hypothesis comes from Japan, where studies of gallstone incidence have been performed repeatedly over decades (7,8,43). With the advent  of endoscopy, large clinics have been established to handle frequent removal of recurrent stones from patients with advanced disease. Prior to 1945, brown pigment  stones accounted for more than 70% of stones

  

Page 150

removed at operation in Japan (7,8). Many of these stones were associated with stones concomitantly formed in the common bile duct or within the intrahepatic biliary  system, sometimes in the absence of gallbladder stones. This pattern was typical throughout Asia and remains the pattern in rural China. By 1978, in a large Japanese  study (35), brown pigment stones accounted for only 30% of operative series and were replaced by cholesterol stones as the predominant stone type found in Japan.  This was thought to be due to the change in diet to a higher­calorie, high­protein, high­carbohydrate, and more westernized diet. Additional support for this hypothesis  came from the finding that during the 3 years of this large multicenter Japanese study (35), there was a trend toward a decreasing frequency of brown pigment stones.  Patients in this study (35) being treated in rural hospitals were more likely to have brown pigment stones, reflecting their more traditional diet. The reason that brown  pigment stones rarely form in the gallbladder in the West but are common or even predominant in Asia is unknown. However, eating a diet that does not stimulate bile  flow as actively as a high­protein, high­calorie western diet may be a contributing factor. This dietary difference may cause alterations in the population of biliary  bacteria, changes in biliary or duodenal motility, or differences in mucosal injury, which have variously been proposed as etiological factors. When Japanese or Chinese or other East Asian peoples emigrated to Australia, Hawaii, or the continental United States, the brown pigment stone disease they  brought with them was instructive for surgeons in these regions. However, the first generation of their descendants born in the new country did not demonstrate this  type of stone disease but instead reflected the disease of their locality. Our experience in communication with surgeons in these regions is that they were unable to  identify U.S.­ or Australian­born patients of East Asian origin who had primary brown pigment stone disease. This type of primary disease is very uncommon in the  west. In more than 30 years of searching for this type of patient and during collection of more than 2000 sets of stones from various western countries, we have  identified only two Caucasian patients with primary brown pigment stone disease. The reasons that brown pigment stone rarely form in the gallbladder in the West but  are common or even predominant in the East is unknown. Again, diet, differences in biliary bacterial populations, changes in motility, or differences in mucosal injury  have been proposed. The primary incidence of brown pigment stones in the West (54) is secondary to choledocholithiasis; they are formed more than 2 years after cholecystectomy (6),  most frequently for cholesterol cholelithiasis. In contrast to Asia, most of these patients do not have clinical episodes of bacterial cholangitis but bacteria can be  cultured from the stones and they closely resemble, chemically and visually, primary stones found in Asian countries. Abnormalities of the biliary tract resulting in  altered motility—including choledochal cysts, Caroli's disease, and paravaterian duodenal diverticula—have been associated with the formation of primary common  bile duct stones (55–58). Similar material causes occlusion of biliary stents; its composition depends on the character of the stent material, which appears to act as a  template, influencing the character of the precipitate (59–60). Studies have demonstrated that the components of this type of stone are characteristic of deposits in the various endoprostheses and are responsible for stent  occlusion (59). The stent surface provides a template for precipitation, since the rate of precipitation varies with the composition of the stent (60). E—  Sludge Sludge is more common than found by detection methods, since only 50% of cases are identified by ultrasound. It is usually thought to consist of either calcium  bilirubinate or cholesterol microliths (14,15), although some believe that it is essentially calcium bilirubinate (61). Although it is known to develop during conditions  inducing stasis—such as fasting (48), surgery (62), pregnancy, and weight loss—and its natural history in these conditions is now described, there is no information  available about the frequency of sludge formation in response to these

  

Page 151

stimuli in various countries. Only in the minority of cases does sludge evolve into gallstones (63,64). III—  Pathogenesis A—  General The initiating factor(s) in the pathogenesis of pigment stones remains unknown (2,3,66). Some investigators have considered this to be a problem of supersaturation of  components in the bulk phase of bile (65). Others, among whom we are included, favor the development of areas of supersaturation within localized  microenvironments in glands, in mucous gel layers, or within developing stones (1,3,66). The question of whether proteins within stones provide the scaffolding on  which crystallization occurs, whether they provide the limits within their gel meshwork for a myriad of microenvironments, or whether they precipitate within a  crystalline field, providing the cement to hold the crystals together, or whether all of these mechanisms play a role remains unanswered. B—  Noncholesterol Components in Cholesterol Stones Recent studies have suggested, that instead of being the nidus upon which cholesterol stones form, noncholesterol components [protein (67), bilirubin (68)] frequently  precipitate following migration within an already nidated and growing cholesterol stone. This facilitates the formation of the rings of concentric pigmented precipitates  present in many cholesterol stones when stones are cut in cross section (69). These are "mixed" or "combination" cholesterol stones. These pigmented Liesegang rings  of precipitation (69) occur due to the diffusion of the noncholesterol components along concentration gradients (69) toward the center of the stone. The ratios of the  components and the gradients are such that, at periodic intervals, precipitation begins (70). This attracts ions composing the precipitated salt from the surrounding  gradient, adding to the precipitate in the initial ring and reducing the concentrations of these ions above or below the ring in the gradient. This phenomenon recurs  repeatedly, forming a ring­like pattern. Cholesterol stones make up from 80 to 95% of most operative series in western countries and mixed stones constitute 67 to  80% of most cholesterol stone series. These stones usually occur in crops of stones with an identical cross­sectional pattern, indicating that the gradients governing ring  formation occurred within each stone but were widely distributed throughout the gallbladder. While the features characteristic of these stone crops are very similar  within each stone group, each group was unique when compared with any other cholesterol stone crop with regard to the number of rings, intensity of pigment  deposition, band width, distance between bands, and number of bands in a Liesegang system. In crops of larger stones, in cross section, there may be two or more  Liesegang systems that have developed during stone growth with the coprecipitation of a variety of carbonate and phosphate calcium salts. Each system of rings may  differ from the next. In addition, areas of chaotic precipitation may occur as well between ring systems of periodic precipitation. Such ring systems may prevent further  exchange with the environment, since the pores present in the loosely packed cholesterol layers may be absent due to filling with protein and calcium salts. The clinical  correlate of this phenomenon is the partial dissolution of cholesterol stones by chenodeoxycholic acid with the arrest of precipitation at the surface of one of these rings  (71,72). These rings can be breached by lithotripsy, a focused ultrasound technique by which stones may be pulverized (73). This leads to a greater proportion of  stones undergoing dissolution and a more rapid rate of stone dissolution (73,74). The remaining stones are so­called solitary cholesterol stones, or pure cholesterol  stones, containing virtually no noncholesterol components. In contrast to mixed cholesterol stones, such stones do not recur after dissolution (19), implying a separate  mechanism of nidation and/or growth.

  

Page 152

C—  Black Pigment Stones These stones may present with bands containing many different shades of black, brown, or gray, dependent on highly individual composition from patient to patient.  However, this succinct color classification makes certain that clinicians and researchers do not confuse these stones with brown pigment stones, simply because  calcium bilirubinate is the predominant calcium salt (75). Calcium bilirubinate in these stones occurs as microcrystals or linear polymers (75) in a sea of protein  macromolecules. By analogy from synthetic polymers, some areas may be flexible threads, while other areas may, through local compositional differences, be partially  or completely crystalline (3). Their small crystal size may help to explain why x­ray diffraction of these stones has not yielded a molecular crystalline structure but  rather an x­ray powder pattern (24,76,77). Calcium hydroxyapatite also occurs as a rope­like polymeric thread (31,78), but calcium carbonate has not been identified  in this form. Crystalline material has been identified in separate rings in black stones, indicating changing conditions for precipitation during stone growth (79). In a  series of studies using a variety of techniques, we have produced a spectrum of bilirubinates containing from 2 to 12% calcium (80,81). It is clear that bilirubin was not  coordinating with calcium in a fixed stoichiometric fashion. Our infrared spectroscopic studies (80,81) demonstrated a series of differing relative intensity for the  bilirubin propionic acid carbonyl group at 1700 cm­1 and for the B and C ring pyrrole groups at 3400 cm­1. The infrared spectral peak intensities of these two groups  varied in a tight linear fashion, indicating the coordination of halves of the bilirubin molecule with calcium; there observations support the heterogeneity of calcium  bilirubinate, perhaps due to a random ordering of hemiportions of neighboring molecules through metal coordination. We have constructed a number of models of  calcium bilirubinate (3) but have not been able to confirm the molecular identity of any model due to the heterogeneous metal binding from molecule to molecule and  the presence of multiple cations with similar binding capability but forming differing coordination complexes. Contrary to past theory (82,83), our infrared studies of  calcium bilirubinate indicate that bilirubin, a linear tetrapyrrole, can coordinate with calcium by donating up to four hydrogens per molecule, from either of the pyrrole  groups on the central B or C rings of the tetrapyrrole molecule or from either of the B and C ring propionic acid side chains (3). The A and B rings and the C and D  rings appear to act independently in metal binding, so that one half of the molecule may retain its three hydrogen bonds in the configuration of protonated bilirubin while  the other half may donate both a carboxyl and pyrrole hydrogen, forming a heterogenous compound termed an acid salt (84). Each bilirubin molecule forms one­half  of the calcium coordination structure for one calcium ion, with a neighboring bilirubin molecule providing the other half. Thus, calcium bilirubinate may form long metal­ ion polymeric chains that may also branch and form a network. When such stones were dissolved within seconds using DMSO (85) and the samples were examined  by electrophoresis, the only pigment found to be present in human stones was unconjugated bilirubin (1). When stones from mice with hemolytic anemia were  examined, it was found that they were made up of 37% bilirubin monoglucuronide, 6% diglucuronide, and 56% unconjugated bilirubinate (86). Monoglucuronide  conjugates of bilirubin and conjugates with other sugars have been proposed to predispose to the formation of pigment precipitates (87,88). Others have suggested  that bilirubin was present as a polybilirubinate (82,83) but there has been no evidence to support this in dissolution studies. Similarly, the suggestion that bilirubin was  complexed via vinyl groups (88,89) has not been supported, since black stones can be completely dissolved using several methods (1), none of which identify  products other than bilirubin. Vinyl bridging would not be expected to be reconstituted following stone dissolution. The equilibrium swelling attributed to bilirubin  polymers (89,90) may instead be due to the associated glycoprotein network (91). Black stones have been noted to develop within the lumina of gallbladder glands in mice (92) and in humans (93,94) with chronic hemolytic anemia (92–94), where  they likely nidate in a secreted protein matrix and in the surface mucous layer. Most human black pigment stones are found in the elderly (34,35), but they also occur  in patients with chronic hemolysis and

  

Page 153

cirrhosis (36). Cirrhosis and hemolysis can be linked by intermittent or chronic hemolysis, respectively, resulting in hyperbilirubinbilia. This concentration of bilirubin  exceeds the ion product for calcium bilirubinate and myriad microcrystals of bilirubin form on protein templates and, at times, in layers. Black stones have been noted  to occur in crops and occasionally with similar cross­sectional structure, as with cholesterol stones, suggesting that conditions for stone formation occurred throughout  the gallbladder at a discrete point in time. However, these small stones are less uniform in size and shape and do not reach the size of many crops of cholesterol  stones, suggesting that conditions for their formation are intermittent and less frequent or that they have not been present for as long a time. It is clear that gallbladder  mucosal secretion, protein, and its associated calcium are necessary for black pigment stone formation, since cholecystectomy prevents recurrent stone formation in  patients with hemolytic anemia, where the hyperbilirubinbilia continues unabated. The reason that stones may take years to develop in humans with hemolytic anemia  and take a proportionally equivalent length of time to develop in mice with hemolytic anemia (92) remains unclear. If bilirubin supersaturation were solely responsible,  precipitation should occur in utero or shortly after birth, but this is not the case in either mice or men. One hypothesis is that chronic hyperbilirubinbilia may take time to  alter mucosal function and stimulate the production of altered proteins that serve as templates for calcium bilirubinate crystallization. A second hypothesis might invoke  the development of gallbladder glands of increasing complexity and depth, creating a different precipitation microenvironment. Alternatively, conditions may favor the  growth of commensal or other bacteria, which, in turn, secrete a biofilm that predisposes to calcium salt precipitation, including calcium bilirubinate. Oral calcium  administration increases pigment stone formation in animals (95) through effects on mucin and/or bilirubin secretion. Intestinal resection also increases bilirubinbilia  (39). The mean bilirubin content of stones from these patients with hemolysis exceeds that found in patients without hemolysis but the range of concentrations largely  overlaps (36,38), suggesting that the processes by which these stones formed were similar. However, the increased concentration of bilirubin in the bile of patients  with hemolysis appears to have influenced the increased proportion of calcium bilirubinate in stones. Black pigment stones also form behind biliary strictures, with or  without clinical bacterial infection (36). A prime example is in patients with primary sclerosing cholangitis. Although calcium is the predominant metal in stones, small amounts of other divalent metals, primarily copper, occur in stones (96). We have undertaken in vitro  studies of calcium and copper bilirubinate formation and have found that copper bilirubinate complexes have a different infrared spectrum from calcium bilirubinate,  implying a different salt structure. Further studies indicate that it was present as a Cu2+ N chelate (80,81). Calculations (97) indicate that protonated bilirubin is flexible  at the "ridge­tile" angle between the two halves of the tetapyrrole, varying from 60 to 133°. Lightner et al. first postulated this lepidopterous effect on the basis of their  studies of tetrapyrroles (98). Such flexibility is critical for two molecules of bilirubin to coordinate with Cu2+ (97). Copper salts are more soluble than calcium salts and  in mixture may help keep calcium salts in solution (99) and therefore in a form that can be excreted. 1—  Bilirubinate In our experience, the black pigment stone set containing the highest proportion of calcium bilirubinate contained 91% calcium bilirubinate (31), no other calcium salts  and presumably 9% protein. Other sets of black stones contain less than 10% calcium bilirubinate and, despite the presence of predominantly calcium hydroxyapatite  or calcium carbonate, appear black. The black color of these stones is from the outer layer and is due to the incorporation of singlet oxygen from the atmosphere or  surrounding bile after the precipitate is left standing for a period of time (99–102). When such stones are fractured, inner layers are red­brown to brown in color,  indicating that this interaction has not occurred.

  

Page 154

2—  Carbonate This salt may form as part of the pigmented bands in cholesterol stones described above and as the predominant salt in some black pigment stones. It is stimulated by  obstruction of the gallbladder and is responsible for the formation of ''milk of calcium" bile and the "porcelain" gallbladder. Three types of carbonate can be formed— vaterite, aragonite, and calcite (24)—indicating that changes in the conditions governing precipitation occurred during stone growth (79), perhaps due to changes in  ionic concentrations and/or pH. We have identified, by infrared spectroscopy, differences in these polymorphs and have identified these in different layers of the same  stone, as close as 10 to 50  m from each other, using infrared microspectroscopy of particles from neighboring stone layers (23). Alternatively, diffusion gradients  within the stone may have provided the conditions for the formation of different polymorphs at the same time. Vaterite is very unstable in air or in a fluid environment  and should have changed to calcite in our stored stones. However it is detected, even after long periods of storage (23). This suggests that it is coated with protein or  other protection that prevents change. We unsuccessfully searched for altered infrared carbonate spectra suggesting stabilization, as in crustaceans (103), by  intercalation of proteins within the calcite or vaterite crystal. Vaterite is intrinsically unstable and rapidly converts to calcite despite storage at 100°C (23). Despite this  in vitro observation, this carbonate polymorph is identified in stones (23,24) after years of storage, suggesting that vaterite was somehow protected. Possibilities  include a thin but effective protein coating that we have observed, using the scanning electron microscope (SEM), to be covering some crystal surfaces or due to  intercalated protein in the vaterite crystal, as occurs in crustaceans (103). This intercalation should cause a marked change in the infrared spectrum of vaterite and  should be easily identified. However, we have not identified such changes in areas of vaterite (unpublished results) despite a systematic search. Thus, protein crystal  coating seems the most likely explanation. 3—  Hydroxyapatite Glycine conjugated bile salts, through submicellar binding (104) to amorphous calcium phosphate nidi, can poison these microaggregates and prevent transformation to  microcrystalline calcium hydroxyapatite and thus prevent growth to a sufficient size to cause precipitation (105). Phospholipid modifies this inhibitory effect (106).  Human gallbladder mucin (107) and polyamines (108) also modify bile salt inhibition. Thus, like cholesterol, bile contains a series of accelerators and inhibitors, the  balance of which determines whether calcium hydroxyapatite will precipitate in a given gallbladder. Bile salts have been proposed to regulate calcium and carbonate  ion concentrations in bile (109). Calcium hydroxyapatite is also present in urinary stones and dental calculus (28). In these situations, bacteria, which produce biofilm, are capable of forming the  scaffolding for this type of calcification and have been identified. It seems probable that a similar process is operative in the gallbladder. Studies by Swidzinski and  colleagues (110), using bacterial DNA identification techniques, indicated that bacteria had been present in the gallbladder (110), which had previously been thought  to be sterile (111). The benchmark of 105 colonies per milliliter used as the index of clinical infection of bile, urine and other fluids may not be appropriate in  considering the role of bacteria in gallstone formation, since bacteria may exist in much smaller concentrations in the mucous layer along the gallbladder and biliary tract  mucosa and may interact with the underlying mucosa to stimulate the production of calcium­binding proteins. 4—  Metals The proportion of calcium salts in stones greatly exceeds its concentration in bile, although it is the most common cation (96). The activity of Ca2+ in bile is much less  than its total concentration due to complexing with bile salts (112–114) phospholipids (114–116) and pro­

  

Page 155

teins (117), either in precipitates or in soluble complexes. Calcium is highly concentrated within intracellular mucous globules, serving to hold mucous in a tightly  packed form (117). After secretion, the stores of calcium are released into the mucous layer at concentrations greatly exceeding the concentrations of calcium in the  bulk phase. Thus, a calcium gradient is likely to be established across the mucous layer, from mucosa to bile, facilitating the formation of Liesegang rings in precipitates  developing in this layer. Since bile is also a major excretory pathway for calcium, the forces determining biliary calcium secretion and concentration are multiple and  complex (118–120). Calcium salts are less soluble than magnesium salts and, even though magnesium is the second most common cation in bile (96), copper is the  second most common cation in stones (96). As stated above, copper salts are more soluble than calcium salts and serve to keep calcium salts in solution when  copper­calcium bilirubinates are formed (121). A provocative study in the prairie dog indicated that feeding calcium significantly increased biliary bilirubin, bilirubin  monoglucuronide, and glycoprotein but not ionized calcium (95). These animals all demonstrated pigment stones and calcium bilirubinate sludge. These findings  deserve examination in humans, since calcium supplementation is recommended for elderly females to prevent osteoporosis. This is just the group at risk for the  development of pigment gallstones. A variety of other metals are present in stones, probably reflecting the wide range of divalent cations secreted in bile, the major  excretion route for all divalent cations except calcium, where most is secreted in the urine. 5—  Bile Acids In a series of studies, we have demonstrated that bile acids and calcium as well as other cations form periodic and fractal precipitates in agar gel systems, a model  designed to resemble the mucin layer in the gallbladder. In the gallbladder, bile acids could diffuse across the mucous layer in a gradient opposite to that of calcium  (see above), creating an opportunity for periodic precipitation at the optimal concentration of these two components. Because the concentration of calcium at the  mucosal surface, following mucous granule release, is much greater than in bile, calcium bile salts are more likely to precipitate in the mucous layer than in the bulk  phase of bile. In vitro, we have found that bilirubinate, carbonate, and hydroxyapatite precipitate in areas where bile salts have initially precipitated (122). Although  only small amounts of bile acids have been identified in stones (122), with larger amounts in pigment than in cholesterol stones (122), calcium salts of bile acids may  serve the critical role of acting as a nidation focus for other calcium salts. It is also reasonable to hypothesize that bile salts may redissolve to some extent and release  calcium locally to then form bilirubinates, carbonates, or hydroxyapatites. However, experiments in agar gels over several months indicate that the calcium bile salt  precipitates do not change in shape, as rings of calcium bilirubinate form superimposed on the original sites of precipitation (123). 6—  Protein A mucin network was identified in stones by histochemical staining (124,125), and it was noted that protein and bilirubin were codistributed (33,126–128). On  extraction and protein purification of black pigment gallstones, we found that as much as 12% could be identified as mucin glycoprotein, but even more was present as  protein using other techniques (129). A series of calcium­binding proteins have facilitated the formation of both cholesterol and pigment gallstones (130–135).  Precipitation may occur through sequestration of these smaller proteins (132–135) within the meshwork in the mucin layer formed by mucin glycoproteins. Studies of a  variety of minerals to examine protein crystallization indicated that there were specific mineral components that could induce protein crystallization at lower critical  levels of supersaturation than required for spontaneous growth (136). It might be postulated that the reverse is also true: proteins might act to facilitate protein­specific  patterns of precipitation at component concentrations below that found in the bulk phase of bile. Clearly, this concept needs testing.

  

Page 156

D—  Brown Pigment Gallstones These stones, the product of stasis and infection (2,36,137–140), are formed through the action of bacterial enzymes to deconjugate bilirubin from glucuronic acid  (137) and to hydrolyze phospholipids (141), providing large amounts of bilirubin and free fatty acids to precipitate with calcium. Cross­sectioning these stones  demonstrates that they are formed in layers. Unlike the regular spacing of Liesegang rings, these layers are of random thickness and composition. They vary from  predominantly calcium bilirubinate to predominantly calcium salts of fatty acids, with layers containing all combinations of these components. Since calcium bilirubinate  is reddish­brown and calcium salts of fatty acids are white, the periodicity of precipitation is clearly visible. The reason for this alternation between deconjugation of  bilirubin and lecithin hydrolysis is unknown but may involve periodic changes in the species of bacteria present in bile. Alternatively, layers of bacteria in biofilm have  been identified in these stones (138) and may provide stop and start signals for different types of precipitation. Bacteria have been associated with the calcium  bilirubinate layers but less so with the calcium fatty acid layers (138). Characteristics of bacteria in stones and in bile were compared (139). Bacteria from stones  contain the P1­specific fimbriae, a minority of strains had the Forssman antigen­specific fimbriae, and none demonstrated mannose­specific fimbriae. All strains bound  anti­Gal, a ubiquitous naturally occurring IgG specific for  ­galactosyl residues. All of these characteristics distinguish these bacteria from gut flora. The authors  postulate that these properties may enhance the ability of these bacteria to colonize the biliary tract and/or to initiate pigment gallstone formation (139). In contrast to black pigment stones, these stones contain calcium carbonate or hydroxyapatite very rarely. Protein is present, but it is not known if it has a central role,  as in the case of cholesterol and black pigment stones, or whether it is coprecipitant, trapped in stone by the speed of precipitation or because mucin and other  proteins bind to all precipitates. Possibly much of the protein found in these stones might be present as biofilm secreted by bacteria for their protection (138). When  these films completely encase and protect all of the local bacteria, they may also act to prevent bacterial action in the surround medium. Based on SEM and spectroscopic techniques, we have concluded that black pigment stones form much more slowly, through microcrystallization in local  microenvironments within a protein gel, while brown pigment stones precipitate much more rapidly through supersaturation of the bulk phase of bile. Teleologically, it  seems important for brown pigment stones to form through rapid precipitation within the more actively flowing bile in the bile ducts compared to the relative stasis in  the gallbladder. 1—  Bilirubinate In brown pigment stones, calcium bilirubinate is present as a loosely packed amorphous precipitate (33). When examined by SEM before and after exposure to an  oxygen plasma environment which dissolved away the protein network, no rod­like microcrystals or polymers of calcium bilirubinate were demonstrated, as in black  stones (33). When dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), only unconjugated bilirubin was identified (85). 2—  Fatty Acid Salts When freshly obtained stones were examined using high­performance liquid chromatography (HPLC) separation, a variety of fatty acids salts were identified, mirroring  the fatty acid composition of the biliary lecithin isolated from the same patient (141), strongly supporting their hydrolysis from biliary lecithin by bacterial  phospholipases. These stones contained about 15% cholesterol, which is believed to be coprecipitated through reduction in the concentrations of lecithin and bile acids, occurring  through hydrolysis and deconjugation, respectively. Alternatively, cholesterol might have coprecipitated passively

  

Page 157

due to the rapidity of the deconjugation and precipitation of stone components, lecithin, and bile acids, which hold cholesterol in solution. E—  Sludge Although sludge has been shown to cause a number of clinical syndromes—such as recurrent pancreatitis, cholangitis, and biliary colic—questions concerning its  pathogenesis remain. Does it form by mechanisms separate from those of the three major types of gallstones? Do the microliths, which rest between the bulk phase of  bile and the mucous layer, grow to larger stones or must stones remain within the mucous layer to grow to larger size? Clearly, sludge can shift—as monitored by  ultrasound, with changes in gallbladder position—as do larger stones. Why is it that stones large enough to cause ultrasound shadowing (142) (greater than 4 mm)  infrequently follow the development of sludge? Whether the sludge represents microliths of cholesterol or calcium bilirubinate forming during total parenteral nutrition or  weight loss, when the gallbladder is hypomotile, periodic gallbladder contraction and bile acid administration (143,144) have been shown to remove and/or dissolve  sludge and prevent its consequences. IV—  Conclusion This review has concentrated on organizing the observations of many investigators on the components of black and brown gallstones and has attempted to weave them  together with a number of hypotheses. The conclusions drawn are open to investigation and are stated to provoke interest in this area by future investigators using  different techniques. Acknowledgments Supported by Institutional Funds, Sealy and Smith Foundation, Marie B. Gale Professorship, past NIH support (RDS). Grants from the National Science Foundation  of China, Institutional Funds (J­G W). References 1. Soloway RD, Wu J­G. Analysis of gallstones, In: Muraca M, ed. Methods in Biliary Research. Boca Raton, FL: CRC Press, 1995, pp. 167–190. 2. Trotman BW, Soloway RD. Pigment gallstone disease: summary of the National Institutes of Health­International workshop. Hepatology 1982; 2:879–884. 3. Soloway RD, Wu J­G, Xu D­F. Pigment gallstones and secondary calcification of gallstones. In: Swobodnik W, Ditschuneit H, Soloway RD, eds. Gallstone  Disease. Patho­physiology and Therapeutic Approaches. Munich: Springer­Verlag, 1990, pp. 35–46. 4. Trotman BW, Ostrow JD, Soloway RD. Pigment vs. cholesterol cholelithiasis: comparison of stone and bile composition. Am J Dig Dis 1974; 19:585–590. 5. Malet PF, Weston NE, Trotman BW, Soloway RD. Cyclic deposition of calcium salts during growth of cholesterol gallstones. Scanning Electron Microsc 1985;  2:775–779. 6. Malet PF, Dabezies MA, Huang G, Long WB, Gadacz TR, Soloway RD. Quantitative infrared spectroscopy of common bile duct gallstones. Gastroenterology  1988; 94:1217–1221. 7. Miyake Jr H. Statistische, klinische und chemische Studien zur Aetiology der Gallensteine mit besonderer Beruchsichtigung der japanischen und deutschen  Verhaltnisse. Arch Klin Chir 1913; 101:54–117.

  

Page 158

8. Miyake H, Kuwatsuka T, Tamesue N, Uzumi K. Comparative studies on the chemical composition of gallstones in Japan, China and the United States. Fukuoka  Acta Med 1963; 54:781–826. 9. Diehl AK, Schweisinger WH, Holleman DR Jr, Chapman JB, Kurtin WE, et al. Gallstone characteristics in Mexican Americans and non­Hispanic whites. Dig Dis  Sci 1994; 60: 2223–2228. 10. Nakayama F. Quantitative microanalysis of gallstones. J Lab Clin Med 1969; 72:602–611. 11. Agarwal DK et al. Utility of biliary microcrystal analysis in predicting composition of common bile duct stones. Scand J Gastroenterol 1994; 29:352–354. 12. Mukaihara S. Classification and composition of human gallstones. Arch Jpn Chir 1981; 50:476–500. 13. Cetta F. The classification of biliary calculi and the clinico­therapeutic implications. Ann Ital Chir 1998; 69:701–708. 14. Lee SP, Nichols JF. Nature and composition of biliary sludge. Gastroenterology 1986; 90:677–686. 15. Lee, SP, Maher K, Nichols JF. Origin and fate of biliary sludge. Gastroenterology 1988; 88:170–176. 16. Chen CY, Shiesh SC, Lin XZ. Biliary sludge and pigment stone formation in bile ductligated guinea pigs. Dig Dis Sci 1999; 44:203–209. 17. Duchmann JC, Joly JP, Decrombecque C, Delcenserie R, Levy S, Capron D, Capron JP. Cirrhosis: a new but expected cause of biliary sludge. Alcohol Clin Exp  Res 1997; 21:119–121. 18. Malet PF, Williamson CE, Trotman BW, Soloway RD. Composition of the pigmented center of cholesterol gallstones. Hepatology 1986; 6:477–481. 19. Wolpers C, Hofmann AF. Solitary versus multiple cholesterol gallbladder stones. Clin Invest 1993; 71:423–434. 20. Strasberg SM, Harvey PRC, Taylor DR, Soloway RD. Multiple crops of cholesterol gallstones in the same gallbladder indicate that cholesterol precipitates first  and pigmented centers and layers develop during remodeling (abstr). Gastroenterology 1996; 110:A477. 21. Donovan JM. Physical and metabolic factors in gallstone pathogenesis. Gastroenterol Clin North Am 1999; 28:75–97. 22. Jungst D, Lang T, von Ritter C, Pratschke E, Paumgartner G. Cholesterol nucleation time in gallbladder bile of patients with solitary or multiple cholesterol  gallstones. Hepatology 1992; 15:804–808. 23. Taylor DR, Crowther RS, Cozart JC, Sharrock P, Wu J­G, Soloway RD. Calcium carbonate in cholesterol gallstones. Polymorphism, distribution and  hypotheses about pathogenesis. Hepatology 1995; 22:488–496. 24. Bogren HG. The polymorphs of calcium carbonate in human gallstones. Scand J Clin Lab Invest 1983; 43:371–375. 25. Ruiz de Aguiar A, Medina Nunez JA, Lopez Domingo MI, Villacorta Patino J, Leguey Jimenez S. Calcium carbonate in cholesterol gallstones. J Hepatol 1988;  6:71–79. 26. Kaufman HS, Magnuson TH, Pitt HA, Frasca P, Lillemoe KD. The distribution of calcium salt precipitates in the core, periphery and shell of cholesterol, black  pigment and brown pigment gallstones. Hepatology 1994; 19:1124–1132. 27. Agarwal DK, Choudhuri G, Kumar J. Chemical nature and distribution of calcium compounds in radiolucent gallstones. Scand J Gastroenterol 1993; 28:613– 616. 28. Hou R­Z, Wu J­G, Soloway RD, Zhang Y­F, Du Y­C, Liu F, Xu G­X. Fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy of dental calculus. Mikrochim  Acta 1988; 2:133–136. 29. Rios­Dalenz J, Takabayashi A, Henson DE, Strom BL, Soloway RD. Cancer of the gallbladder in Bolivia: suggestions concerning etiology. Am J Gastroenterol  1985; 80:371–375.

  

Page 159

30. Strom BL, Soloway RD, Rios­Dalenz J, Rodriguez­Martinez HA, West SL, Kinman JL, Crowther RS, Taylor D, Polansky M, Berlin JA. Biochemical  epidemiology of gallbladder cancer. Hepatology 1996; 23:1402–1411. 31. Li W­H, Tong X­B, Soloway RD, Zhou W­J, Weng S­F, Shen G­R, Xu D­F, Taylor D, Hong N­K, Hirakawa N, Crowther RD, Wu J­G. Copper forms black  bilirubinate related to the formation of free radicals and causes alteration of the pyrrole rings and tetrapyrrole structure. 2nd Bilirubin Workshop, Trieste Italy, 1992. 32. Yang Z­L, Weng S­F, Soloway RD, Taylor D, Wu J­G, Xu G­X. Free radicals are required for solid­state formation of calcium and barium bilirubinates (abstr).  Gastroenterology 1991; 100:A814. 33. Soloway RD, Fayusal EB, Trotman BW, Weston NE, Ficca Jr JF. Water content of gallstones: location and contribution to a hypothesis concerning stone  structure. Hepatology 1982; 2:223–229. 34. Trotman BW, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: clinical and epidemiologic aspects. Am J Dig Dis 1986; 20:735–740. 35. Hikasa Y, Nagase M, Soloway RD, Tanimura H, Setoyama M, Kato H. Gallstones in western Japan: 1. Epidemiologic factor affecting the type and location of  gallstones. Arch J Surg 1981; 50:272–288. 36. Soloway RD, Trotman BW, Maddrey WC, Nakayama F. The influence of hemolysis, infection and stasis on the calcium salts in pigment gallstones. Dig Dis Sci  1986; 31: 454–460. 37. Fevery J, Verwilghen R, Tan TG, DeGroote J. Glucuronidation of bilirubin and the occurrence of pigment gallstones in patient with chronic hemolytic disease. Eur  J Clin Invest 1980; 10:219–226. 38. O'Brien CB, Berman JM, Fleming CR, Malet PF, Soloway RD. Total parenteral nutrition gallstones contain more calcium bilirubinate than sickle cell gallstones  (abstr). Gastroenterology 1986; 90:1752. 39. Brink MA, Slors JFM, Keulemans YCA, Mok KS, de Waart DR, Carey MC, Groen AK, Tytgat GNJ. Enterohepatic cycling of bilirubin: a putative mechanism  for pigment gallstone formation in ileal Crohn's disease. Gastroenterology 1999; 116:1420–1427. 40. Lapidus A, Baugstad M, Astron M, Muhrbeck O. The prevalence of gallstone disease in a defined cohort of patients with Crohn's disease. Am J Gastroenterol  1999; 94:1261–1266. 41. Trotman BW, Morris III TA, Cheney HM, Ostrow JD, Sanchez HM, Soloway RD, and Conn HO. Pigment gallstone composition in cirrhotic and non–cirrhotic  subjects. Am J Dig Dis 1978; 23:872–876. 42. Nicholas P, Rinaudo PA, Conn HO. Increased incidence of cholelithiasis in Laennec's cirrhosis. Gastroenterology 1972; 63:112–121. 43. Schwesinger WH, Kurtin WE, Levine BA, Page CP. Cirrhosis and alcoholism as pathogenetic factors in pigment gallstone formation. Ann Surg 1985; 201:319– 322. 44. Maggi A, Solenghi D, Pauzeri A, Borroni G, Cazzaniga M, Sangiovanni A, de Fazio C, Salerno F. Prevalence and incidence of cholelithiasis in patients with liver  cirrhosis. Ital J Gastroenterol Hepatol 1997; 29:330–335. 45. Sakata R et al. formation of black pigment gallstone in a hamster model of experimental cirrhosis. Eur J Clin Invest 1997; 27:840–845. 46. Diehl AK, Schwesinger WH, Holleman DR Jr, Chapman JB, Kurtin WE. Clinical correlates of gallstone composition: distinguishing pigment from cholesterol  stones. Am J Gastroenterol 1995; 90:967–972. 47. Soloway RD, Takabayashi A, Rios­Dalenz J, Nakayama R, Tandon RK, Trotman BW, Henson DE. Geographic differences in the operative incidence and type  of pigment gallstone and in the noncholesterol components of cholesterol gallstones. Hepatol Rapid Lit Rev 1981; 11:1637–1638. 48. Messing B, Bories C, Kunstlinger F, Bernier JJ. Does total parental nutrition induce gallbladder sludge formation and lithiasis? Gastroenterology 1983; 84:1012– 1019.

  

Page 160

49. Hikasa Y, Nagase M, Tanimura H, Shioda R, Setoyama M, Kobashi N, Mukaihara S, Kamata T, Maruyama K, Kato H, Mori K, Soloway RD. Epidemiology  and etiology of gallstones. Arch Jpn Chir 1980; 49:555–575. 50. Nagase M, Hikasa Y, Soloway RD, Tanimura H, Setoyama M, Kato H. Gallstones in western Japan: factors affecting the prevalence of intrahepatic stones.  Gastroenterology 1980; 78:684–690. 51. Lam SK, Chan CW. Pyogenic cholangitis: recent etiology and management. Surg Dig Dis 1985; 3:12–24. 52. Leung JWC, Sung JY, Costerton JW. Bacteriological and electron microscopy examination of brown pigment stones. J Clin Microbiol 1989; 27:915–921. 53. Nakayama F, Soloway RD, Nakama T, Miyazaki K, Ichimiya H, Sheen PC, Ker CG, Ong GB, Choi TK, Boey J, Foong WC, Tan EC, Tung KH, Lee CN.  Hepatolithiasis in East Asia: retrospective study. Dig Dis Sci 1986; 31:21–26. 54. Cetta F. The role of bacteria in pigment gallstone disease. Ann Surg 1991; 213:315–326. 55. Loveit T, Osnes M. Duodenal diverticula. Scand J Gastroenterol 1984; 19:579–581. 56. Kennedy RH, Thompson MH. Are duodenal diverticula associated with choledocholithiasis? Gut 1988; 29:1003–1006. 57. Lobo DN, Balfour TW, Iftikhar SY, Rowlands BJ. Periampullary diverticula and pancreaticobiliary disease. Br J Surg 1999; 86:588–597. 58. Kim MH, Myung SJ, Seo DW, Lee SK, Kim YS, Lee MH, Yoo BM, Min MI. Association of periampullary diverticula with primary choledocholithiasis but not  with secondary choledocholithiasis. Endoscopy 1998; 30:601–604. 59. Moesch C, Sautereau D, Cessot F, Berry P, Mounier M, Gainant A, Pillegand. Physicochemical and bacteriological analysis of the contents of occluded biliary  endoprostheses. Hepatology 1991; 14:1142–1146. 60. Hirakawa N, Burke D, Soloway RD, Schnall M, Wen G, Crowther RS, Wu J­G. Stent composition determines the components precipitated in biliary sludge on  the stent surface: an infrared study (abstr). Hepatology 1990; 11:1310. 61. Allen B, Bernhoft R, Blanchaert N, Svanvik J, Filly R; Gooding G, Way L. Sludge is calcium bilirubinate associated with bile stasis. Am J Surg 1981; 141:51. 62. Bolondi L, Gaiani S, Testa S, Labo G. Gall bladder sludge formation during prolonged fasting after gastrointestinal tract surgery. Gut 1985; 26:734–738. 63. Jungst D, Del Pozo R, Christon S, Miguel JF, Eder MI, Lange V, Frimberger E, Von Ritter C, Paumgarmer G. Sedimentation of biliary sludge: effect on  composition of gallbladder bile from patients with cholesterol, mixed or pigment stones. Scand J Gastroenterol 1996; 31(930):273–278. 64. Janowitz P, Kratzer W, Zemmler T, Tudyka J. Wechsler JG. Gallbladder sludge: spontaneous course and incidence of complications in patients without stones.  Hepatology 1994; 20:291–294. 65. Cahalane MJ, Neubrand MW, Carey MC. Physical­chemical pathogenesis of pigment gallstones. Semin Liver Dis 1988; 8:317–328. 66. Crowther RS, Soloway RD. Pigment gallstone pathogenesis: from man to molecules. Semin Liver Dis 1990; 10:171–180. 67. Sanabria JR, Upadhya AR, Harvey PRC, Strasberg SM. Diffusion of substances into human cholesterol gallstones. Gastroenterology 1994; 106:749–754. 68. Sanabria JR, Gordon ER, Harvey PRC, Goresky CA, Strasberg SM. Accumulation of unconjugated bilirubin in cholesterol pellets implanted in swine  gallbladders. Gastroenterology 1996; 110:607–613. 69. Peng Q, Wu J­G, Soloway RD, Hu T­D, Huang W­D, Xu Y­Z, Wang L­B, Li X­F, Li W­H, Xu D­F, Xu G­X. Periodic and chaotic precipitation phenomena in  a bile salt system related to gallstone formation. Biospectroscopy 1997; 3:195–206. 70. Xie D­T, Qi O­Y, Soloway RD, Xu Y­Z, Wu J­G, Xu G­X. The kinetic process of

  

Page 161

Liesegang ring formation is described using computer analysis of videotaped recordings of a metal ion­cholate diffusion system (abstr). Gastroenterology 1999;  116:G0139. 71. Whiting MJ, Jarvinen V, Watts JM. Chemical composition of gallstones resistant to dissolution therapy with chenodeoxycholic acid. Gut 1980; 21:1077–1081. 72. Freilich HS, Malet PF, Schwartz JS, Soloway RD and the National Cooperative Gallstone Study Group. Chemical and morphologic characteristics of cholesterol  gallstones that failed to dissolve on chenodiol: the National Cooperative Gallstone Study. Gastroenterology 1986; 91:713–718. 73. Sackmann M, Pauletzki J, Sauerbruch T, Paumgartner G. The Munich Gallbladder Lithotripsy Study: results of the first 5 years with 711 patients. Ann Intern Med  1991; 114:290–296. 74. Schoenfield LJ, Berci G, Carnovale RL, et al. The effect of ursodiol on the efficacy and safety of extracorporeal shock­wave lithotripsy of gallstones: the Dornier  National Biliary Lithotripsy Study. N Engl J Med 1990; 323:1239–1245. 75. Malet PF, Takabayashi A, Trotman BW, Soloway RD, Weston NE. Black and brown pigment gallstones differ in microstructure and microcomposition.  Hepatology 1984; 4:227–234. 76. Bogren H, Larsson K. Crystalline components of biliary calculi. Scand J Clin Lab Invest 1963; 15:457–462. 77. Bogren H, Larsson K. An x­ray­diffraction study of crystalline cholesterol in some pathological deposits in man. Biochem Biophys Acta 1963; 75­65­69. 78. Qiu S­M, Wen G, Wen J, Soloway RD, Crowther RS. Interaction of human gallbladder mucin with calcium hydroxyapatite: binding studies and the effect on  hydroxyapatite formation. Hepatology 1995; 21:1618–1624. 79. Sutor DJ, Wooley SE. The sequential deposition of crystalline material in gallstones: evidence for changing gallbladder bile composition during the growth of some  stones. Gut 1974; 15:130–131. 80. Shen G­R, Li W­H, Soloway RD, Wen J, Wu J­G. Cu++ increases solubility of black Ca­bilirubinate complexes in vitro: possible protection against gallstones  (abstr). Clin Res 1993; 41:A159. 81. Li W­H, Tong X­B, Soloway RD, Zhou W­J, Weng S­F, Shen G­R, Xu D­F, Taylor D, Hong N­K, Hirakawa N, Crowther RS and Wu J­G. Copper facilitates  formation of black bilirubinate salts when co­precipitated in in vitro formation of nonstoichiometric salts (abstr). Gastroenterology 1991; 100:A813. 82. Wosiewitz U, Schroebler S. On the chemistry of "black" pigment stones from the gallbladder. Clin Chim Acta 1981; 89:1–12. 83. Burnett W, Dwyer KR, Kennard CHL. Black pigment or polybilirubinate gallstones: composition and formation. Ann Surg 1981; 193:331–333. 84. Berman JM, Dabezies MA, Malet PF, Soloway RD. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) can identify and quantitate the acid and neutral salts of  calcium bilirubinate (abstr). Gastroenterology 1985; 88:1711. 85. Trotman BW, Roy­Chowdhury J, Wirt GD, Bernstein SE. Ethyl anthranilate diazotization of unconjugated and conjugated bilirubin using dimethyl sulfoxide:  application to bile and serum. Anal Biochem 1982; 121:175–181. 86. Trotman BW, Nair CR, Bernstein SE. Monoconjugated bilirubin is a major component of hemolysis­induced gallstones in mice. Hepatology 1988; 8:919–924. 87. Keida Y, Nakano T, Tabata M, Shimuzu S, Nakayama. Significance of different conjugate forms of bilirubin in the formation of pigment gallstones. J  Gastroenterol Hepatol 1991; 6:595–598. 88. Vitetta L, Sali A, Little P, Nayman J, Elzarka A. Primary "brown pigment" bile duct stones. HPB Surg 1991; 4:209–20. 89. Black, BE, Carr SH, Ohkubo H, Ostrow JD. Equilibrium swelling of pigment gallstones: evidence for network polymer structure. Biopolymers 1982; 21:601– 610.

  

Page 162

90. Ohkubo H, Ostrow JD, Carr SH, Rege RV. Polymer networks in pigment and cholesterol gallstones assessed by equilibrium swelling and infrared spectroscopy.  Gastroenterology 1984; 87:805–814. 91. Guo H, Soloway RD, Xu D­F, Crowther RS, Wu J­G. Dependence of equilibrium swelling on an interaction between calcium bilirubinate and proteins (abstr).  Gastroenterology 1990; 98:A254. 92. Trotman BW, Bernstein SE, Bove KE, Wirt GD. Studies on the pathogenesis of pigment gallstones in hemolytic anemia: description and characteristics of a  mouse model. J Clin Invest 1980; 65:1301–1308. 93. Haider MZ, Ashebu S, Aduh P, Adekile AD. Influence of alpha­thalassemia on cholelithiasis in SS patients with elevated Hb F. Acta Haematol 1998; 100:147– 150. 94. Kalayaci AG, Albayrak D, Gunes M, Incesu L, Agac R. The incidence of gallbladder stones and gallbladder function in beta­thalassemic children. Acta Radiol  1999; 40:440–443. 95. Magnuson TH, Lillemoe KD, Peoples GE, Pitt HA. Oral calcium promotes pigment gallstone formation. J Surg Res 1989; 46:286–291. 96. Trotman BW, Petrella EJ, Soloway RD, Sanchez HM, Morris III TA, Miller WT. Evaluation of radiographic lucency or opaqueness of gallstones as a means of  identifying cholesterol or pigment stones: correlation of lucency or opaqueness with calcium and minerals. Gastroenterology 1975; 68:1563–1566. 97. Ferraro JR, Wu J­G, Soloway RD, Li W­H, Xu Y­Z, Xu D­F, Shen G­R. Copper binding to bilirubin as determined by FT­IR and EPR spectroscopy. Appl  Spectrosc 1996; 50:922–927. 98. Lightner DA, Nogales DF, Holmes DL, Anstine DT. Bilirubin structure—an overview. International Bilirubin Workshop, Trieste, Italy, 1995. 99. Li W­H, Shen G­R, Soloway RD, Xu Z­H, Yang Z­L, Guo H, Wu J­G. Characterization of black calcium bilirubinate by Fourier transform infrared spectroscopy  (abstr). Gastroenterology 1991; 100:A766. 100. Yang Z­L, Weng S­F, Soloway RD, Taylor D, Wu J­G, Xu G­X. Free radicals are required for the solid­state formation of calcium and barium bilirubinates  (abstr). Gastroenterology 1991; 100:A814. 101. Li W­H, Shen G­R, Soloway RD, Xu Z­H, Yang Z­L, Guo H, Wu J­G. Characterization of black calcium bilirubinate by Fourier transform infrared  spectroscopy (abstr). Gastroenterology 1991; 100:A766. 102. Li W­H, Tong X­B, Soloway RD, Zhou W­J, Weng S­F, Shen G­R, Xu D­F, Taylor D, Hong N­K, Hirakawa N, Crowther RS, Wu J­G. Copper facilitates  formation of black bilirubinate salt when co­precipitated with calcium: implications for black pigment gallstone formation (abstr). Gastroenterology 1992; 102:A842. 103. Berman A, Addadi L, Kvick A, Leiserowitz L, Nelson M, Weiner S. Intercalation of sea urchin proteins in calcite: study of a crystalline composite material.  Science 1990; 250:664–666. 104. Qiu S­M, Soloway RD, Crowther RS. Interaction of bile salts with calcium hydroxyapatite: inhibitors of apatite formation exhibit high affinity premicellar binding.  Hepatology 1992; 16:1280–1289. 105. Qiu S­M, Wen G, Hirakawa N, Soloway RD, Hong N­K, Crowther RS. Glycochenodeoxycholic acid inhibits calcium phosphate precipitation in vitro by  preventing the transformation of amorphous calcium phosphate to calcium hydroxyapatite. J Clin Invest 1991; 88:1265–1271. 106. Okido M, Soloway RD, Crowther RS. Influence of phospholipid on bile salt binding to calcium hydroxyapatite and on the poisoning of nascent hydroxyapatite  crystals. Liver 1996; 16:321–325. 107. Qiu S­M, Wen G, Wen J, Soloway RD, Crowther RS. Interaction of human gallbladder mucin with calcium hydroxyapatite: binding studies and the effect on  hydroxyapatite formation. Hepatology 1995; 21:1618–1624.

  

Page 163

108. Crowther RC, Pritchard CM, Qiu S­M, Soloway RD. Inhibition of calcium hydroxyapatite formation by polyamines. Liver 1993; 13:141–145. 109. Gleeson D, Qureshi Y, Murphy GM, Dowling RH. The role of bile acids in regulating biliary calcium and carbonate ions concentrations in man. In: Paumgartner  G, Stiehl A, Gerok W, eds, Bile Acids and the Liver. Lancaster PA: MTP Press, 1987; pp 199–212. 110. Swidzinski A, Ludwig W, Pahlig H, Priem E Molecular genetic evidence of bacterial colonization of cholesterol gallstones. 1995; 108:860–864. 111. Goodhart GL, Levison ME, Trotman BW, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: bacteriology of gallbladder stone, bile, and tissue correlated with  biliary lipid analysis. Am J Dig Dis 1978; 23:877–882. 112. Moore EW, Celic L, Ostrow JD. Interactions between ionized calcium and sodium taurocholate: bile salts are important buffers for prevention of calcium­ containing gallstones. Gastroenterology 1982; 83:1079–1089. 113. Sutor DJ, Wilkie LI, Jackson MJ. Ionized calcium in pathological human bile. J Clin Pathol 1980; 33:86–88. 114. Percy­Robb IW. Contribution of biliary lipids to calcium binding in bile. Gastroenterology 1980; 78:696–702. 115. Rajogopalan N, Lindenbaum S. The binding of Ca2+ to taurine­ and glycine­conjugated bile salt micelles. Biochim Biophys Acta 1982; 711:66–74. 116. Altenbach C, Sellig J. Ca2+ binding to phosphatidylcholine bilayers as studied by deuterium magnetic resonance: evidence for the formation of a Ca2+ complex  with two phospholipid molecules. Biochemistry 1984; 23:3913–3920. 117. Verdugo P, Deyrup­Olsen I, Aitken M, et al. Molecular mechanism of mucin secretion: the role of intragranular charge shielding. J Dent Res 1987; 66:506–508. 118. Cummings SA, Hofmann AF. Physiologic determinants of biliary calcium secretion in the dog. Gastroenterology 1984; 87:664–673. 119. Moore EW. Biliary calcium and gallstone formation. Hepatology 1990; 12:206S–214S. 120. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of binding of ionize calcium on the in vitro nucleation of cholesterol and calcium bilirubinate in  human gallbladder bile. Gut 1986; 27:1382–1386. 121. Shen G­R, Li W­H, Soloway RD, Wen J, Wu J­G. Cu2+ increases solubility of black Ca­bilirubinate complexes in vitro: possible protection against gallstones  (abstr). Clin Res 1993; 41:A159. 122. Schoenfield LJ, Sjovall J, Sjovall K. Bile acid composition of gallstones from man. J Lab Clin Med 1966; 68:186–194. 123. Yang Z, Soloway RD, Weng S, Zhang X, Taylor DR, Wu J­G. The growth of periodic calcium bilirubinate rings following and superimposed upon the fractal  (chaotic) precipitations of calcium deoxycholate in an agar gel system. Gastroenterology 1998; 114:A550. 124. Womack NA, Zeppa R, Irvin GL III. The anatomy of gallstones. Ann Surg 1963; 133: 937–945. 125. Sheen PC, Lee KT, Liu YE. Mucin content in gallbladders with brown pigment stones or combination stones with a brown periphery. Digestion 1998; 599:660– 664. 126. Been JM, Bills PM, Lewis D. Electron probe microanalysis in the study of gallstones. Gut 1977; 18:836–842. 127. Been JM, Bills PM, Lewis D. Microstructure of gallstones. Gastroenterology 1979; 76:548–555. 128. Maki T, Matsushiro T, Suzuki N, Nakamura N. Role of sulfated glycoprotein in gallstone formation. Surg Gyn Obstet 1974; 132:846–853. 129. Lamont JT, Ventola AS, Trotman BW, Soloway RD. Mucin glycoprotein content of human pigment gallstones. Hepatology 1983; 3:377–382. 130. Sutor DJ, Wooley SE. The organic matrix of gallstones. Gut 1974; 15:487–489. 131. Hay DW, Carey MC. Pathophysiology and pathogenesis of cholesterol gallstone formation. Semin Liver Dis 1990; 10:159–170.

  

Page 164

132. Nalbone G, Lafont HJ, Vigne JL, Domingo N, Hauton JC. Purification of the human anion polypeptide fraction of the apo­bile lipoprotein complex by zonal  ultracentrifugation. Lipids 1985; 20:884–889. 133. Shimuzu S, Sabsay B, Veis A, Ostrow JD, Rege RV, Dawes LG. Isolation of an acid protein from cholesterol stones which inhibits the precipitation of calcium  carbonate in vitro. J Clin Invest 1989; 84:1990–1996. 134. Okido M, Shimuzu S, Ostrow JD, Nakayama F. Isolation of a calcium­regulatory protein from black pigment gallstones: similarity with a protein from cholesterol  gallstones. Hepatology 1992; 15:1079–1085. 135. Kestell MF, Sekijima J, Lee SP, Park HZ, Long M, Kaler EW. A calcium binding protein in bile and gallstones. Hepatology 1992; 16:1315–1321. 136. McPherson A, Shlichta P. Heterogeneous and epitaxial nucleation of protein crystals on mineral surfaces. Science 1988; 239:385–387. 137. Maki T. Pathogenesis of calcium bilirubinate gallstone: role of E. coli b ­glucuronidase and coagulation by inorganic ions, polyelectrolytes and agitation. Ann Surg  1966; 164: 90–100. 138. Costerton JW, Irvin RT. The bacterial glycocalyx in nature and disease. Annu Rev Microbiol 1981; 35:299–324. 139. Tabata M, Nakayama F. Bacteria and gallstones: etiological significance. Dig Dis Sci 1981; 26:218–224. 140. Stewart L, Smith AL, Pellegrini CA, et al. Pigment gallstones form as a composite of bacterial microcolonies and pigment solids. Ann Surg 1987; 206:242–250. 141. Robins SJ, Fasulo JM, Patton GM. Lipids of pigment gallstones. Biochim Biophys Acta 1982; 712:21–25. 142. Good LI, Edell SL, Soloway RD, Trotman BW, Mulhern C, Arger PA. Ultrasonic properties of gallstones. Effect of stone size and composition.  Gastroenterology 1979; 77: 258–263. 143. Broomfield PH, Chopra R, Sheinbaum RC, Bonorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodeoxycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. New Engl J Med 1988; 319:1567–1572. 144. Ros E, Navarro S, Bru C, Garcia­Puges A, Valderrama R. Occult microlithiasis in idiopathic acute pancreatitis: prevention of relapses by cholecystectomy or  ursodeoxycholic acid therapy. Gastroenterology 1991; 101:1701–1709.

  

Page 165

8—  Hepatic Metabolism of Cholesterol, Bile Salts, and Phospholipids Douglas M. Heuman and Z. Reno Vlahcevic Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia I—  Introduction The major lipids of bile are cholesterol, bile salts, and phosphatidylcholine. The liver plays a key role in synthesis and metabolism of each. In this chapter we  summarize briefly the metabolic pathways and regulatory mechanisms involved in synthesis of these lipids as well as general aspects of their uptake and elimination. We  also discuss the factors responsible for maintenance of hepatic homeostasis of cholesterol and bile salts, perturbations of which may contribute to pathogenesis of  cholesterol gallstone disease, cholestasis, and hypercholesterolemia. II—  Cholesterol A—  Biology of Cholesterol Cholesterol is of critical importance in mammalian cell function. In humans all nucleated cells have the capacity to synthesize cholesterol. Because of the liver's size and  its need for cholesterol for lipoprotein synthesis, bile salt synthesis, and bile secretion, the liver is quantitatively the most important site of cholesterol synthesis in most  species (1). The majority of free cholesterol in cells is contained in membranes, especially the plasma membrane. Although cholesterol is very poorly water­soluble, its single  hydroxy group constitutes a polar moiety. Cholesterol partitions into phospholipid bilayers, where it intercalates between phospholipid acyl chains, its hydroxy group  interacting with phosphate and water at the lipid­water interface. Cholesterol stabilizes membranes, causing phospholipids to pack together more tightly (condensation)  and limiting mobility of the phospholipid acyl chains (reduced fluidity). At the same time, the presence of cholesterol prevents phospholipids from forming immobile  crystalline aggregates at cool temperatures (inhibition of liquid­gel transition) and thereby permits cells to function over a broad range of temperatures. Cholesterol also  dramatically reduces the susceptibility of phospholipid bilayers to disruption by surfactants, such as bile salts, and reduces bilayer permeability to small polar  molecules. An appropriate membrane cholesterol concentration is necessary for the normal function of many membrane­spanning proteins, including receptors and  transporters (2).

  

Page 166

B—  Biosynthesis Cholesterol synthesis is a three­part process (Fig. 1). Initially, three acetate molecules derived from oxidation of fatty acids or carbohydrate are combined to form  mevalonate, which then is decarboxylated to yield a branched five­carbon isoprene, the building block from which sterols are constructed (Fig. IA). Next, six isoprene  units are joined together in a series of reactions to produce squalene, a long­chain unsaturated hydrocarbon (Fig. 1B). Squalene condenses internally at four points in a  chain reaction that forms the 30­carbon parent sterol, lanosterol, and lanosterol then undergoes a series of decarboxylations, isomerizations, and reductions to yield  cholesterol (Fig. 1C). The principal rate­limiting step in the cholesterol biosynthetic pathway is synthesis of 3­hydroxy­3­methylglutaryl coenzyme A (HMG­CoA) from acetyl coenzyme A  and its subsequent reduction to form mevalonate. The two enzymes involved in this process, cytosolic HMG­CoA synthase (HMG­CoA­S) and microsomal HMG­ CoA reductase (HMG­CoA­R), constitute major sites of regulation of cholesterol synthesis. These enzymes are subject to complex regulation by a variety of effectors  at many levels, including gene transcription, translational efficiency, mRNA turnover, protein turnover, and posttranslational modification such as  phosphorylation/dephosphorylation (3–5). Distal enzymes in the cholesterol biosynthetic pathway that may also contribute to regulation of cholesterol biosynthesis  include farnesyl diphosphate synthase and squalene synthase. All four of these enzymes are downregulated at the level of gene transcription in a negative feedback manner by cholesterol and various cholesterol oxidation products  (oxysterols). This regulation is mediated via a short sequence in the 5'­flanking region of the gene termed the sterol regulatory element (SRE) (6). An identical SRE in  the 5'­flanking region of the low­density­lipoprotein (LDL) receptor gene permits uptake of preformed lipoprotein cholesterol and de novo cholesterol synthesis to be  regulated coordinately. The SRE is activated by binding of a basic helix­loop­helix leucine­zipper transcription factor. This factor is a fragment derived from cleavage  of a larger peptide called the SRE­binding protein (SREBP), a constitutive component of the smooth endoplasmic reticulum. Initial proteolytic cleavage of SREBP,  which is rate­determining for release of the transcription regulatory fragment, is catalyzed by a sterol­sensitive enzyme, SREBP cleavage activation protein (SCAP).  Depletion of cholesterol in the smooth endoplasmic reticulum produces a physical alteration in this membrane that causes SCAP to become activated and to cleave  SREBP. Following a second, non­regulated cleavage, the N­terminal fragment of SRE is released. This regulatory fragment travels to the nucleus, binds to the SRE,  and increases transcription of the associated genes, as illustrated in Fig. 2 (6). C—  Esterification, Storage, and Lipoprotein Secretion Cholesterol esters are synthesized by attaching a fatty acid to the 3­beta­hydroxy moiety of cholesterol. This modification eliminates the slight polarity of cholesterol  and changes its physical chemical behavior. Cholesterol esters, unlike free cholesterol, have little affinity for phospholipid bilayers and instead tend to form oil drops  along with other neutral lipids such as triglycerides. In lipoproteins, free cholesterol resides in the surface amphiphilic monolayer of phospholipid and proteins, while  cholesterol esters are present along with triglycerides almost entirely in the hydrophobic core (7). Cholesterol esterification is a means whereby excess hepatic cholesterol can be diverted either to storage in cytosolic oil droplets or to export in very low density  lipoproteins (VLDL). Cholesterol esterification is catalyzed by acyl­coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT), a microsomal enzyme. At least two forms of  ACAT exist with different expression in different tissues. ACAT1, the first form identified, is important in adrenals and macrophages but was found to be expressed  poorly in liver (8); knockout of this gene in mice had no effect on hepatic cholesterol esterification (9). Recently a second form of ACAT, termed ACAT2, has

  

Page 167

Figure 1 Pathway and major intermediates of cholesterol biosynthesis. See text for details. A. Synthesis of isopentenyl pyrophosphate, the basic building block of sterols. Synthesis of mevalonate by HMG­CoA reductase is the major rate­limiting step in the  cholesterol biosynthetic pathway. B. Condensation of six isopentenyl pyrophospates results in the long­chain hydrocarbon  squalene. C. Internal condensation of squalene yields lanosterol and ultimately cholesterol.

  

Page 168

Figure 2 Transcriptional regulation of major genes regulating cholesterol uptake and biosynthesis. SRE, sterol  regulatory element (gene promoter); SREBP, sterol regulatory element binding protein; SCAP, SREBP cleavage activating protein; HMG­CoA, 3­hydroxy­3­methyl­glutaryl­coenzyme A. See text for details.

been identified, cloned and sequenced by several groups (10–12). ACAT2 is strongly expressed in liver and intestine and is a likely candidate for the major hepatic  cholesterol esterifying enzyme. With this discovery, understanding of the regulation of ACAT on a molecular level is expected to progress rapidly. When demand for cholesterol increases within the hepatocyte, cholesterol can be retrieved from oil droplets via hydrolysis of cholesterol esters. The enzyme  responsible for mobilization of this stored cholesterol, neutral cytosolic cholesterol ester hydrolase (CEH), has recently been cloned and characterized (13). CEH has  been shown to be downregulated in response to feeding of cholesterol or increased cholesterol synthesis and is upregulated by maneuvers that inhibit cholesterol  synthesis or enhance cholesterol degradation (14). The liver exports cholesterol to the tissues via synthesis and secretion of VLDL. These large particles have a low surface­to­volume ratio and contain a high proportion  of cholesterol esters and triglycerides. The regulation of VLDL production is not well understood, but cholesterol ester availability appears to be an essential element,  since manipulations that inhibit cholesterol synthesis or esterification clearly reduce VLDL secretion (15). D—  Lipoprotein Cholesterol Uptake The liver takes up circulating lipoprotein cholesterol (predominantly cholesterol esters) via two major pathways employing receptor­mediated endocytosis. LDLs are  recognized by a receptor specific for apoproteins B and E, more commonly termed the LDL receptor. Chylomicron

  

Page 169

remnants are taken up via a selective apo­E receptor. The ingested particles are imported via clathrin­coated pits to endocytotic vesicles (16). Ultimately the  cholesterol esters are transferred to liposomes, where they are acted on by a cholesterol ester hydrolase whose activity is optimal at an acidic pH. This acidic CEH  differs from the neutral cytosolic cholesterol ester hydrolase and is not thought to play a regulatory role in cholesterol homeostasis. Subsequent trafficking of lipoprotein  cholesterol to various sites, including the cell plasma membrane, appears to involve both vesicular transport and cytosolic carrier proteins (17). The liver also takes up cholesterol esters from high density lipoproteins (HDL). Much of HDL cholesterol originates in peripheral tissues, and the delivery of this  cholesterol to the liver for catabolism to bile acids or excretion into bile constitutes a pathway of ''reverse cholesterol transport" that plays an essential role in  prevention of atherosclerosis. A recently identified receptor, termed the scavenger receptor B1 (SR­B1), binds circulating HDL at the hepatocyte sinusoidal  membrane and mediates transfer of cholesterol esters between HDL particles and hepatocytes (18). The HDL particles do not appear to be ingested. Rather, the  transfer of cholesterol esters to the cell occurs selectively, without uptake of the apoproteins, by a mechanism that is currently unknown (19). Both expression of SR­ B1mRNA and rate of uptake of HDL cholesterol esters in hepatocytes are downregulated following treatment with ethinyl estradiol or cholesterol feeding;  interestingly, an opposite pattern of regulation is noted in Kupffer cells (20). E—  Elimination The liver is the only organ that plays a significant role in elimination of cholesterol from the body. Two principal pathways are responsible. First, cholesterol can be  oxidized to form bile salts. Second, free cholesterol can be secreted directly into bile along with phosphatidylcholine in the form of large unilamellar vesicles. Bile salt  synthesis and its regulation are discussed in some detail below. The processes by which cholesterol is transported to the canalicular membrane, packaged into vesicles,  and secreted into bile are of critical importance in pathogenesis of gallstones and are discussed in a later chapter. III—  Bile Salts A—  Biology of Bile Salts Bile salts (also termed bile acids) are anionic detergents synthesized from cholesterol. They are produced only in the liver. Synthesis of bile acids represents a major  pathway for elimination of cholesterol from the body. About half of daily cholesterol turnover in humans is attributable to synthesis of bile acids. Bile salts serve a  number of biological functions. Secretion of bile salts drives bile secretion, creating an excretory route for elimination of many metabolic wastes. Bile salts also  stimulate canalicular secretion of cholesterol and lecithin into bile. In the digestive tract, bile salts contribute to emulsification of lipids, activation of digestive lipases, and  solubilization of products of lipid digestion such as monoglycerides. Bile salts are actively and efficiently reabsorbed from the distal small intestine, taken up by the liver,  and resecreted into bile. The flux of bile salts in this enterohepatic circulation regulates key rate­limiting enzymes of bile salt synthesis and thereby controls the rate of  cholesterol degradation. Thus perturbations of the enterohepatic circulation of bile salts can have profound effects on cholesterol homeostasis. B—  Bile Salt Synthesis Structures of the primary bile salts of humans, cholic acid and chenodeoxycholic acid, are illustrated in Fig. 3. Studies of Bjorkhem (21) in the 1970s indicated that the  first steps in bile

  

Page 170

Figure 3 Pathways of bile acid synthesis, showing key rate­limiting enzymes. Cyp7A, cholesterol 7 ­hydroxylase; Cyp27, sterol  27­hydroxylase; Cyp12, sterol 12 ­hydroxylase; Cyp7B, oxysterol 7 ­hydroxylase.

  

Page 171

acid synthesis involve ring modifications. The initial step in this classical pathway of bile acid biosynthesis is hydroxylation in the 7  position. Following conversion to  the 3 keto­delta 4 derivative, an additional hydroxylation may occur in the 12  position. Next, modification of the side chain begins with 27­hydroxylation, followed  by 24 hydroxylation and oxidative cleavage at C24. Finally, reduction of the keto group and double bond yields a saturated ring with a 3  hydroxy group and a 5   hydrogen. The rate­determining enzyme of this classic "neutral" pathway of bile acid synthesis, cholesterol 7  hydroxylase, has been extensively characterized during the past 10  years. Cholesterol 7 ­hydroxylase is a unique microsomal cytochrome P450 isoenzyme (Cyp7A) (22). It is highly regulated. Expression of Cyp7A is downregulated  by bile acids in the enterohepatic circulation at the level of gene transcription in a negative feedback inhibitory manner (23). The feedback inhibitory potency of  different bile acids varies with their relative hydrophobicity (24). Recent studies in isolated cultured hepatocytes indicate that bile acids may exert their effects indirectly  through activation of protein kinase C isoenzymes (25), leading in turn to a cascade of activation of a series of regulatory kinases. The precise molecular basis for bile  acid regulation of cholesterol 7  hydroxylase remains unclear at this time. In some species such as rat, Cyp7A expression also is upregulated at the level of gene transcription by cholesterol (26). In other species such as hamster and rabbit,  transcriptional regulation of Cyp7A by cholesterol is not observed, and under normal circumstances this does not appear to be of major importance in most humans.  However upregulation of C7 H by cholesterol may account in part for the ability of some individuals to tolerate diets containing very high levels of cholesterol (27). Other regulatory factors in animal studies include insulin, glucocorticoids, and thyroid hormone (28). In rats, infusion of taurocholate intraduodenally produced marked  downregulation of Cyp7A, whereas an equimolar infusion delivered intravenously was ineffective (29). These studies suggested that an additional intestinal factor may  be involved in mediating or modulating bile acid biofeedback. Recent evidence indicates that an alternate pathway may, under some circumstances, account for a substantial fraction of bile acid biosynthesis. In this alternate  pathway, side­chain oxidation precedes nuclear modifications. The initial step in this pathway is hydroxylation of the side chain at position 27 (30). The 7   hydroxylase activity in this pathway is not attributable to Cyp7A; rather, a second hydroxylase, termed oxysterol 7 ­hydroxylase or Cyp7B, is responsible (31).  Cyp7B is also a microsomal cytochrome P450; unpublished preliminary data from our laboratories suggest that Cyp7B, like Cyp7A, may be regulated by bile salts in  a negative feedback inhibitory manner. Sterol 27 hydroxylase, the initial enzyme in the alternate pathway of bile acid biosynthesis, is a mitochondrial cytochrome P450 (Cyp27). Like cholesterol 7   hydroxylase, it is inducible at the level of gene transcription following bile salt depletion and is suppressed by bile salt supplementation in the diet, though quantitatively  the changes in activity are less pronounced for Cyp27 than for Cyp7A (32). Unlike Cyp7A, which is expressed only in liver, Cyp27 is expressed in many extrahepatic  tissues as well. It has been suggested that oxidation of cholesterol by Cyp27 in these extraheptic sites may be a key step in the pathway of "reverse cholesterol  transport" by which cholesterol is mobilized in the periphery, delivered to the liver, and eliminated. Cyp27 also is responsible for initiating side­chain oxidation in the  classic pathway of bile acid synthesis and thus is required for both major pathways of bile acid synthesis. Genetic deficiency of Cyp27 results in cerebrotendinous  xanthomatosis, and accelerated atherosclerosis (33). Patients with this disorder lack bile acids; instead, large amounts of polyhydroxylated C­27 sterols (bile alcohols)  are formed. The strongest evidence supporting the existence of an alternate pathway of bile acid synthesis comes from transgenic "knockout" mice in which the Cyp7A gene has  been deleted. Although they require bile acid supplements in early life, these mice at maturity synthesize primary bile salts in sufficient quantities to survive and digest  normally (34). Similarly in bile fistula rats, administration of the squalene synthase inhibitor squalestatin was found to suppress

  

Page 172

Cyp7A gene expression by more than 95% while preserving Cyp27; squalestatin reduced bile acid synthesis by less than 50% (35). Curiously, in the latter studies,  bile acid synthesis was observed to gradually return to normal despite persistent suppression of Cyp7A and stable activity of Cyp27, suggesting the possibility of a  third potentially rate­limiting step in bile acid biosynthesis. C—  Bile Salt Pool Composition The proportions of cholic and chenodeoxycholic acids in the bile salt pool vary widely. The introduction of a 12  hydroxy moiety is catalyzed by a microsomal  cytochrome P450, sterol 12 ­hydroxylase (Cyp12), whose activity appears to be a major determinant of the cholic/chenodeoxycholic ratio. The cDNA for this  enzyme in rats recently has been cloned and sequenced (36). Preliminary studies of its regulation in rats (37) indicate that, like cholesterol 7  hydroxylase, its  expression was downregulated by hydrophobic bile salts at the level of gene transcription. However, in contrast to cholesterol 7  hydroxylase, sterol 12  hydroxylase  activity was induced by inhibitors of cholesterol synthesis and suppressed by cholesterol feeding. Most bile salts are efficiently amidated in human liver with glycine or taurine. This amidation (commonly termed conjugation) lowers the pKa from about 5 for the  unconjugated bile salt to 3.9 for glycine conjugates or less than 1 for taurine conjugates (38). Amidated bile salts are secreted into bile and, after a period of storage  and concentration in the gallbladder, are expelled into the proximal intestine. Between 95 and 99% of secreted bile salt normally is reabsorbed from the intestine,  predominantly via sodium­dependent active transport in the distal ileum. A small fraction of bile salt escapes ileal absorption and reaches the colon, where bile salts are deconjugated by anaerobic bacteria. Several species of gram­positive  anaerobes, including some species of Clostridium and Eubacterium, further metabolize bile acids to remove the 7­hydroxy group, as shown in Fig. 4. This  apparently simple metabolic step requires a series of enzyme­catalyzed reactions. The responsible bacterial operon has been extensively characterized (39). The  resulting secondary bile acids, deoxycholic acid (from 7 ­dehydroxylation of cholate) and lithocholic acid (from 7 ­dehydroxylation of chenodeoxycholate) are  absorbed by passive diffusion, return to the liver, and are reamidated. Deoxycholate conjugates become part of the circulating bile salt pool. Lithocholic acid is further  modified by sulfation and glucuronidation; although secreted into bile, these metabolites are poorly reabsorbed from the intestine and are largely lost in the feces. The metabolic effects of bile salts are determined to a large extent by their relative hydrophobicity. Secondary bile salts are more hydrophobic than the corresponding  primary bile salts. Enrichment of the bile salt pool with deoxycholate leads to increased biliary cholesterol secretion (40) and more potent suppression of cholesterol  7 ­hydroxylase (24). In some individuals, enrichment of the intestinal flora with bacteria capable of bile salt 7­dehydroxylation is associated with a high proportion of  biliary deoxycholate and increased secretion of supersaturated bile; suppression of these bacteria with antibiotics was found to reduce deoxycholate and normalize  biliary cholesterol saturation (41). IV—  Inborn Errors of Cholesterol and Bile Acid Synthesis A—  Inborn Errors of Cholesterol Synthesis The Smith­Lemli­Opitz syndrome is an autosomal recessive disorder that was described as a clinical entity in 1964 but was only recently fully characterized as a  disorder of hepatic cho­

  

Page 173

Figure 4 Origins of major primary and secondary bile acids of humans. Primary bile acids, cholic and chenodeoxycholic, are synthesized de novo from cholesterol. Secondary bile acids, deoxycholic and lithocholic, are produced in the colon by bacterial 7 ­dehydroxylation.

lesterol synthesis (42). Clinically the disease is characterized by microcephaly, poor growth, dysmorphic facial features, syndactyly, polydactyly, genital and endocrine  disorders, and mental retardation (43). After cystic fibrosis, it is the most common autosomal recessive disorder in the United States. Biochemically, the syndrome is  characterized by increased tissue concentration of 7­dihydrocholesterol due to a defect in 3 ­hydroxycholesterol  ­7­reductase, the last enzymatic step in cholesterol  synthesis (44,45). The deficiency of this enzyme leads to a decrease in serum cholesterol and its replacement with dihydrocholesterol. This combination of biochemical  abnormalities leads to the clinical manifestations. A diet high in cholesterol and bile salts can partially correct cholesterol deficiency while suppressing cholesterol  synthesis

  

Page 174

and consequently may improve the biochemical abnormalities associated with the disease (46,47). B—  Inborn Errors of Bile Acid Synthesis Several inborn errors of bile acid biosynthesis have been identified. These disorders are very rare and can be divided into a group in which there is a deficiency of  enzymes participating in the modification of steroid nucleus and another group in which there is a deficiency in the enzyme participating in the side chain cleavage of  cholesterol or bile acid intermediates (Table 1). Clinical disorders have been reported in association with three bile acid biosynthetic enzymes that act on the steroid nucleus: 3 ­hydroxy­C27­steroid oxidoreductase  (48),  4­3­oxo­steroid­5 ­reductase (classic pathway) (49), and oxysterol 7 ­hydroxylase (alternative pathway) (50). Clinically all three of these defects are  associated with cholestasis and tend to progress to cirrhosis and early death in infancy. Cholestatic features associated with these diseases are presumably due to  accumulation of hepatotoxic intermediates and metabolites in the liver. Therapy with primary bile acids (chenodeoxycholic or cholic), with the intent of restoring the  bile salt pool and suppressing endogenous bile acid synthesis, has been successful in ameliorating the course of disease and leading to histological improvement (51). Deficiency in sterol 27­hydroxylase, an enzyme that initiates side­chain oxidation, results in a disease called cerebrotendinous xanthomatosis (CTX). This is an  autosomal recessive disorder characterized by xanthomas, progressive neurological dysfunction, premature atherosclerosis, and eventual death (52). These patients  have severely reduced bile acid synthesis, a marked increase in biliary secretion of bile alcohols (multiply hydroxylated cholesterol derivatives lacking a carboxylic acid  in the side chain), and increased cholesterol synthesis. In patients with CTX, there is also a marked accumulation of cholestanol in the tissues and plasma (52).  Recently, the molecular basis of CTX has been established, following cloning and sequencing of sterol 27­hydroxylase (33). Patients with CTX have been shown to  have a variety of point mutations or deletions of sterol 27­hydroxylase, which lead to loss of enzyme activity and are responsible for the observed biochemical  abnormalities. CTX can be treated by administration of cholic or chenodeoxycholic acid to repress bile acid synthesis, thereby reducing accumulation of cholesterol  and bile alcohols (53). Also, some improvement in the manifestations of disease was reported with the use of lovastatin, an inhibitor of the synthesis of HMG­CoA  reductase and cholesterol (54). If the disease is recognized and treated early, the accu­ Table 1 Inborn Errors of Bile Acid Synthesis Disease

Deficient enzyme

3 ­ 5­C27, hydroxy  oxidoreductase deficiency

Same

Cholestatic liver disease

Primary bile acids, liver  transplantation

Same

Cholestatic liver disease

Primary bile acids, liver  transplantation

Same

Cholestatic liver disease

Liver transplantation

Neurological disorder;  premature atherosclerosis

Primary bile acids

­4­3­oxosteroid­5 ­reductase Oxysterol 7 ­hydroxylase

Cerebrotendinous xanthomatosis  Sterol 27­ (CTX) hydroxylase

  

Clinical manifestation

Therapy

Page 175

mulation of sterols in the central nervous system as well as neurological damage can be prevented. V—  Cholesterol and Bile Salt Homeostasis in Health and Disease Figure 5 summarizes the pathways of cholesterol metabolism in the hepatocyte. Net cholesterol input to the hepatocyte comes from de novo synthesis or uptake of  lipoproteins; elimination proceeds via either lipoprotein secretion (VLDL), bile salt synthesis, or biliary secretion of free cholesterol. Within the hepatocyte, cholesterol  may be compartmented in various membranes, predominantly the plasma membrane, or may be reversibly stored in lipid droplets in the form of cholesterol esters. Changes in one pathway of cholesterol metabolism frequently lead to compensatory changes in other pathways. Thus, for example, moderate inhibition of cholesterol  synthesis with inhibitors of HMG­COA reductase leads to upregulation of this enzyme at the level of gene transcription (55) as well as upregulation of LDL receptors  (56). More profound inhibition of cholesterol synthesis in some species may lead to downregulation of cholesterol 7 alpha hydroxylase with suppression of bile acid  synthesis (57,58). Another example is the response to feeding of bile acid­binding resins such as cholestyramine. These agents cause increased fecal elimination of bile  salts, leading to upregulation of bile acid synthesis. The resultant increase in cholesterol degradation is, in turn, accompanied by upregulation of both HMG­CoA  reductase and LDL receptor (59). The magnitude of a particular response often varies both between and within species. Genetic variations in regulation of individual pathways of cholesterol homeostasis  may explain why some individuals placed on low­cholesterol diets exhibit a decline in circulating LDL

Figure 5 Overview of pathways of hepatic cholesterol metabolism.

  

Page 176

cholesterol, whereas others show no hypolipidemic response to wide variations in dietary cholesterol (27,60). Genetic variations may also help to explain individual  heterogeneity in response to hypolipidemic drugs. Changes in pathways of cholesterol homeostasis that increase the availability of free cholesterol within the hepatocyte frequently lead to increased biliary cholesterol  secretion. The mechanisms by which biliary vesicles are assembled and secreted are poorly understood, as are the factors that dictate the absolute rate of biliary  cholesterol secretion and the cholesterol: phosphatidylcholine ratio of biliary vesicles. These two parameters are critical in determining the degree to which bile is  saturated with cholesterol. It has been proposed that a "metabolically active" pool of free cholesterol in the hepatocyte may be the principal determinant of biliary  cholesterol secretion (61,62). Attempts to define this regulatory cholesterol pool by kinetic techniques have yielded inconclusive results. Nevertheless, this hypothesis  provides a useful conceptual framework for explaining many of the factors that predispose to cholesterol gallstone disease. A clearer understanding of the regulation of  biliary cholesterol in health and disease must await elucidation of the cellular and biochemical mechanisms by which cholesterol is delivered to the canalicular  membrane and packaged into vesicles for secretion into bile. VI—  Phosphatidylcholine A—  Biology of Phosphatidylcholine Phospholipids are the fundamental components of all biological membranes. These compounds are very poorly water­soluble lipids possessing a strongly hydrophilic  head group and two strongly hydrophobic hydrocarbon tails. In aqueous systems, phospholipids self­aggregate to form fluid planar bilayers. In these bilayers, the  individual phospholipids are oriented perpendicularly with their polar head groups exposed at the bilayer surface and nonpolar tails sequestered (63). Phospholipid  bilayers are relatively impermeable to polar molecules, and this property is crucial to their role of demarcating cellular and subcellular compartments with distinct  composition and function. Although a wide variety of phospholipids are present in cells, nearly all of the phospholipid in bile is of a single class, phosphatidylcholine (also termed lecithin). The  basic structure of phosphatidylcholine (PC) is illustrated in Fig. 6. Glycerol forms a backbone, to which two fatty acids are esterified at adjacent carbons. In general, in  mammals the fatty acid on the first carbon (sn­1) is saturated, whereas the second (sn­2) is unsaturated. The third carbon is esterified to phosphate, which, in turn, is  esterified to the quaternary amine choline. Phosphatidylcholine is a zwitterion; at physiological pH, the phosphate group carries a negative charge that balances the  positive charge of the choline moiety, and the net charge is thus neutral. B—  De Novo Synthesis The great majority of phosphatidylcholine secreted into bile is synthesized de novo in the liver. PC synthesis in hepatocytes begins with the assembly of diacylglycerol.  This is followed by addition of choline phosphate, which can occur via two pathways (64), as shown in Fig. 7. In the predominant pathway, choline phosphate is  transferred directly to diacylglycerol; in the alternate methylation pathway, phosphatidylethanolamine is synthesized and then converted to PC by addition of 3 N­ methyl groups. Biosynthesis of diacylglycerol starts with transesterification of an sn­1 fatty acid from coenzyme A to glycerol­3­phosphate. Two distinct glycerol­3­phosphate  acyltransferases are involved, one located in mitochondria and the other in the endoplasmic reticulum. This is followed by addition of a second fatty acid at the sn­2  position, catalyzed by a third enzyme to produce phosphatidic acid. The regulation of this process and the mechanisms by which specific fatty acids are selected for  incorporation at each step are not well understood. Finally,

  

Page 177

Figure 6 Structure of phosphatidylcholine. Fatty acyl substituents in this instance include palmitic acid (saturated) in the sn­1 position  and linoleic acid (unsaturated) in the sn­2 position.

phosphatidic acid phosphohydrolase cleaves the sn­3 phosphate to release diacylglycerol. Phosphatidic acid phosphohydrolase normally resides in the cytoplasm in its  inactive form; in the presence of phosphatidic acid, it translocates to the endoplasmic reticulum and becomes active. Most of the choline employed for phosphatidylcholine biosynthesis derives from dietary sources. Choline is an essential nutrient in the human diet; it is actively taken up  from the gut and is transported into the hepatocyte actively by both sodium­dependent and sodium­independent carriers. In the liver, a fraction of choline is oxidized to  betaine and employed as a methyl donor for methionine synthesis; the majority, however, is employed in synthesis of phospholipid. The activation of choline for phospholipid synthesis begins with phosphorylation by choline kinase. This is followed by transesterification with cytidine triphosphate to  form CDP choline, catalyzed by the key enzyme CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CCT). In the final step of this pathway, CDP­choline condenses with 1,2­ diacylglycerol to yield phosphatidylcholine (64). This reaction is catalyzed by CDP­choline: 1,2­diacylglycerol phosphotransferase, a predominantly microsomal  enzyme that to date has not been well characterized in mammals. CCT is the major rate­limiting step in PC biosynthesis (65). It is upregulated by CDP­choline (feed­forward regulation) and downregulated by PC (feedback  inhibition). The major site of regulation is posttranslational. CCT normally resides in the cytoplasm in its inactive form; when phosphorylated, it translocates to the  endoplasmic reticulum and becomes active. Phosphorylation is largely mediated via protein kinase C, which, in turn, is activated by diacylglycerol. However, under  extreme conditions of phosphatidylcholine depletion, such as partial hepatectomy, upregulation of CCT gene expression has been demonstrated. Recently the  existence of two distinct human CCT genes, termed CCT­  and CCT­ , has been demonstrated

  

Page 178

Figure 7 Pathways of synthesis of phosphatidylcholine (PC) in the liver. G­3­P,  glycerol­3­phosphate; PA, phosphatidic acid; DAG, 1,2­diacylglycerol; FA,  fatty acyl group; PE, phosphatidylethanolamine; CK, choline kinase; CCT, CTP:phosphocholine cytidyltransferase; CP, CDP­choline:1,2­diacylglycerol  phosphotransferase; G3PA, glycerol­3­phosphate acyltransferase; PAPH,  phosphatidic acid phosphohydrolase; PEMT, phosphatidylethanolamine methyltransferase.

(66). The latter is present predominantly in placenta and testis; its role, if any, in the liver is not known. The pathway described above exists in virtually all nucleated human cells; the ability to synthesize phosphatidylcholine is critical for cell growth and proliferation. A  second pathway to production of phosphatidylcholine is found almost exclusively in the liver. In this alternate pathway, the cell first synthesizes  phosphatidylethanolamine, which then is converted to phosphatidylcholine via a series of three methylations. Two phosphatidylethanolamine­N­methyltransferases  (PEMT) catalyze these steps (67,68). The first, PEMT1, is found on the endoplasmic reticulum; the second, PEMT2, is confined to an ER­like membrane fraction  associated with mitochondria. The role and regulation of this alternate pathway are not fully understood. In cell culture, overexpression of PEMT suppresses CCT gene expression (69). PEMT2  overexpression also inhibits cell proliferation by a mechanism that appears to be independent of phosphatidylcholine production (70). However knockout of the  PEMT2 gene in mice had no discernible effect on overall phenotype, liver morphology, or plasma or biliary lipid composition (71). C—  Uptake, Hydrolysis, and Reacylation Although a large amount of phospholipid is delivered to the liver in lipoproteins, kinetic studies suggest that very little is taken up intact. PC ingested during receptor­ mediated uptake of LDL and chylomicron remnants is degraded in lysosomes. PC of HDL is hydrolysed by hepatic lipase on sinusoidal endothelial cells, yielding  lysolecithin and fatty acid, which are then taken up by the hepatocyte via pathways that are not yet known. Reacylation of lysolecithin in many tissues utilizes a 1­acyl­ glycerophosphocholine:acyl­CoA acyltransferase that is present in mi­

  

Page 179

crosomes and is specific for polyunsaturated acyl groups (72). Deacylation­reacylation permits modification of the fatty acid composition of the PC molecule and may  be important in determining the relative proportions of different molecular species of PC within the hepatocyte. Acknowledgments This work was supported in part by grants from the U.S. Department of Veterans Affairs and National Institutes of Health, PO1­DK38030. The authors wish to  thank Mary Cousins and Cecile Rock for their expert secretarial assistance. References 1. J.M. Dietschy, S.D. Turley, and D.K. Spady. Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species,  including humans. J. Lipid Res. 34:1637–1659, 1993. 2. P.L. Yeagle. Cholesterol and the cell membrane. In: P.L. Yeagle, ed. Biology of Cholesterol. Boca Raton, FL: CRC Press, 1988, pp. 121–146. 3. L. Liscum, K.L. Luskey, D.J. Chin, Y.K. Ho, J.L. Goldstein, and M.S. Brown. Regulation of 3­hydroxy­3­methylglutaryl coenzyme a reductase and its mRNA in  rat liver as studied with a monoclonal antibody and a cDNA probe. J. Biol. Chem. 258:8450–8455, 1983. 4. M.S. Brown and J.L. Goldstein. Multivalent feedback regulation of HMG CoA reductase, a control mechanism coordinating isoprenoid synthesis and cell growth.  J. Lipid Res. 21:505–517, 1980. 5. M.S. Brown, J.L. Goldstein, and J.M. Dietschy. Active and inactive forms of 3­hydroxy­3­methylglutaryl coenzyme A reductase in the liver of the rat: comparison  with the rate of cholesterol synthesis in different physiological states. J. Biol. Chem. 254:5144–5149, 1979. 6. M.S. Brown and J.L. Goldstein. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane­bound transcription factor. Cell 89:331– 340, 1997. 7. D.M. Small. Lipid classification based on interactions with water. In: D.M. Small, ed. Handbook of Lipid Research: IV. The Physical Chemistry of Lipids. New  York: Plenum Press, 1986, pp. 89–96. 8. T.J. Rea, R.B. DeMattos, R. Homan, R.S. Newton, and M.E. Pape. Lack of correlation between ACAT mRNA expression and cholesterol esterification in  primary liver cells. Biochim. Biophys. Acta Lipids Lipid Metab. 1299:67–74, 1996. 9. V.L. Meiner, S. Cases, H.M. Myers, E.R. Sande, S. Bellosta, M. Schambelan, R.E. Pitas, J. McGuire, J. Herz, and R.V.J. Farese. Disruption of the acyl­ CoA:cholesterol acyltransferase gen in mice: evidence suggestion multiple cholesterol esterification enzymes in mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14041– 14046, 1996. 10. P. Oelkers, A. Behari, D. Cromley, J.T. Billheimer, and S.L. Sturley. Characterization of two human genes encoding acyl coenzyme A:Cholesterol  acyltransferase­related enzymes. J. Biol. Chem. 273:26765–26771, 1998. 11. R.A. Anderson, C. Joyce, M. Davis, J.W. Reagan, M. Clark, G.S. Shelness, and L.L. Rudel. Identification of a form of acyl­CoA:cholesterol acyltransferase  specific to liver and intestine in nonhuman primates. J. Biol. Chem. 273:26747–26754, 1998. 12. S. Cases, S. Novak, Y.W. Zheng, H.M. Myers, S.R. Lear, E. Sande, C.B. Welch, A.J. Lusis, T.A. Spencer, B.R. Krause, S.K. Erickson, and R.V.J. Farese.  ACAT­2, a second mammalian acyl­CoA:cholesterol acyltransferase: its cloning, expression and characterization. J. Biol. Chem. 273:26755–26764, 1998.

  

Page 180

13. S. Ghosh, D.H. Mallonee, P.B. Hylemon, and W.M. Grogan. Molecular cloning and expression of rat hepatic neutral cholesteryl ester hydrolase. Biochim.  Biophys. Acta 1259:305–312, 1995. 14. S. Ghosh, R. Natarajan, W.M. Pandak, P.B. Hylemon, and W.M. Grogan. Regulation of hepatic neutral cholesteryl ester hydrolase by hormones and changes in  cholesterol flux. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 274:G662–G668, 1998. 15. G.R. Thompson, R.P. Naoumova, and G.F. Watts. Role of cholesterol in regulating apolipoprotein B secretion by the liver. J. Lipid Res. 37:439–447, 1996. 16. D.K. Spady. Hepatic clearance of plasma low density lipoproteins. Semin. Liver Dis. 12:373–385, 1992. 17. L. Liscum and N.K. Dahl. Intracellular cholesterol transport. J. Lipid Res. 33:1239–1254, 1992. 18. S. Acton, A. Rigotti, K.T. Landschulz, S. Xu, H.H. Hobbs, and M. Krieger. Identification of scavenger receptor SR­B1 as a high density lipoprotein receptor  (see comments). Science 271:518–520, 1996. 19. S. Xu, M. Laccotripe, X. Huang, A. Rigotti, V.I. Zannis, and M. Krieger. Apolipoproteins of HDL can directly mediate binding to the scavenger receptor SR­ B1, and HDL receptor that mediates selective lipid uptake. J. Lipid Res. 38:1289–1298, 1997. 20. K. Fluiter, D.R. van der Westhuijzen, and T.J. van Berkel. In vivo regulation of scavenger receptor B1 and the selective uptake of high density lipoprotein  cholesteryl esters in rat liver parenchymal and Kupffer cells. J. Biol. Chem. 273:8434–8438, 1998. 21. I. Bjorkhem and H. Danielsson. 1976. Biosynthesis and metabolism of bile acids in man. Prog. Liver Dis. 5:215–231, 1976. 22. M. Nishimoto, M. Noshiro, and K. Okuda. Structure of the gene encoding human liver cholesterol 7a­hydroxylase. Biochim. Biophys. Acta Gene Struct.  Express. 1172:147–150, 1993. 23. W.M. Pandak, Y.C. Li, J.Y.L. Chiang, E.J. Studer, E.C. Gurley, D.M. Heuman, Z.R. Vlahcevic, and P.B. Hylemon. Regulation of cholesterol 7a­hydroxylase  mRNA and transcriptional activity by taurocholate and cholesterol in the chronic biliary diverted rat. J. Biol. Chem. 266:3416–3421, 1991. 24. D.M. Heuman, P.B. Hylemon, and Z.R. Vlahcevic. Regulation of bile acid synthesis: III. Correlation between biliary bile salt hydrophobicity index and activities of  enzymes regulating cholesterol and bile acid synthesis in the rat. J. Lipid Res. 30:1161–1171, 1989. 25. R.T. Stravitz, Y.P. Rao, Z.R. Vlahcevic, E.C. Gurley, W.D. Jarvis, and P.B. Hylemon. Hepatocellular protein kinase C activation by bile acids: Implications for  regulation of cholesterol 7a­hydroxylase. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 271:G293–G303, 1996. 26. M.P. Jones, W.M. Pandak, D.M. Heuman, J.Y.L. Chiang, P.B. Hylemon, and Z.R. Vlahcevic. Cholesterol 7a­hydroxylase: evidence for transcriptional regulation  by cholesterol or metabolic products of cholesterol in the rat. J. Lipid Res. 34:885–892, 1993. 27. F. Kern Jr. Normal plasma cholesterol in an 88­year­old man who eats 25 eggs a day—mechanisms of adaptation. N. Engl. J. Med. 324:896–899, 1991. 28. H.M.G. Princen, P. Meijer, and B. Hofstee. Dexamethasone regulates bile acid synthesis in monolayer cultures of rat hepatocytes by induction of cholesterol 7a­ hydroxylase. Biochem. J. 262:341–348, 1989. 29. W.M. Pandak, D.M. Heuman, P.B. Hylemon, J.Y.L. Chiang, and Z.R. Vlahcevic. Failure of intravenous infusion of taurocholate to downregulate cholesterol 7a­ hydroxylase in rats with biliary fistulas. Gastroenterology 108:533–544, 1995. 30. I. Björkhem. Mechanism of degradation of the steroid side chain in the formation of bile acids. J. Lipid Res. 33:455–472, 1992. 31. M. Schwarz, E.G. Lund, R. Lathe, I. Björkhem, and D.W. Russell. Identification and characterization of a mouse oxysterol 7a­hydroxylase cDNA. J. Biol.  Chem. 272:23995–24001, 1997.

  

Page 181

32. Z.R. Vlahcevic, S.K. Jairath, D.M. Heuman, R.T. Stravitz, P.B. Hylemon, N.G. Avadhani, and W.M. Pandak. Transcriptional regulation of hepatic sterol 27­ hydroxylase by bile acids. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 270:G646–G652, 1996. 33. J.J. Cali, C.­L. Hsieh, U. Francke, and D.W. Russell. Mutations in the bile acid biosynthetic enzyme sterol 27­hydroxylase underlie cerebrotendinous  xanthomatosis. J. Biol. Chem. 266:7779–7783, 1991. 34. S. Ishibashi, M. Schwarz, P.K. Frykman, J. Herz, and D.W. Russell. Disruption of cholesterol 7 ­hydroxylase gene in mice: 1. Postnatal lethality reversed by bile  acid and vitamin supplementation. J. Biol. Chem. 271:18017–18023, 1996. 35. Z.R. Vlahcevic, R.T. Stravitz, D.M. Heuman, P.B. Hylemon, and W.M. Pandak. Quantitative estimations of the contribution of different bile acid pathways to  total bile acid synthesis in the rat (see comments). Gastroenterology 113:1949–1957, 1997. 36. U. Andersson, G. Eggertsen, and I. Björkhem. Rabbit liver contains one major sterol 12alpha­hydroxylase with broad substrate specificity. Biochim. Biophys.  Acta 1389:150–154, 1998. 37. Z.R. Vlahcevic, P.B. Hylemon, K. Redford, G. Eggertsen, R.T. Stravitz, D.M. Heuman, and W.M. Pandak. Regulation of sterol 12a hydroxylase (CYP12) and  cholic acid synthesis (abstr). Hepatology 28:379A, 1998. 38. A. Fini and A. Roda. Chemical properties of bile acids: IV. Acidity constants of glycineconjugated bile acids. J. Lipid Res. 28:755–759, 1987. 39. D.H. Mallonee, W.B. White, and P.B. Hylemon. Cloning and sequencing of a bile acid­inducible operon from Eubacterium sp. strain VP1 12708. J. Bacteriol.  172:7011–7019, 1990. 40. N. Carulli, P. Loria, M. Bertolotti, L.M. Ponz de, D. Menozzi, G. Medici, and I. Piccagili. Effects of acute changes of bile acid pool composition on biliary lipid  secretion. J. Clin. Invest. 74:614–624, 1984. 41. F. Berr, G.A. Kullak­Ublick, G. Paumgartner, W. Münzing, and P.B. Hylemon. 7a­dehydroxylating bacteria enhance deoxycholic acid input and cholesterol  saturation of bile in patients with gallstones. Gastroenterology 111:1611–1620, 1996. 42. G.S. Tint, M. Irons, E.R. Elias, A.K. Batta, R. Frieden, T.S. Chen, and G. Salen. Defective cholesterol biosynthesis associated with the Smith­Lemli­Opitz  syndrome. N. Engl. J. Med. 330:107–113, 1994. 43. C. Cunniff, L.E. Kratz, A. Moser, M.R. Natowicz, and R.I. Kelley. Clinical and biochemical spectrum of patients with RSH/Smith­Lemli­Opitz syndrome and  abnormal cholesterol metabolism. Am. J. Med. Genet. 68:263–269, 1997. 44. G.S. Tint, M. Seller, R. Hughes­Benzie, A.K. Batta, S. Shefer, D. Genest, M. Irons, E. Elias, and G. Salen. Markedly increased tissue concentrations of 7­ dehydrocholesterol combined with low levels of cholesterol are characteristic of the Smith­Lemli­Opitz syndrome. J. Lipid Res. 36:89–95, 1995. 45. G. Xu. Reproducing abnormal cholesterol biosynthesis as seen in the Smith­Lemli­Opitz syndrome by inhibiting the conversion of 7­dehydrocholesterol to  cholesterol in rats. J. Clin. Invest. 95:76–81, 1995. 46. M. Irons, E.R. Elias, G.S. Tint, G. Salen, R. Frieden, T.M. Buie, and M. Ampola. Abnormal cholesterol metabolism in the Smith­Lemli­Opitz syndrome: report of  clinical and biochemical findings in four patients and treatment in one patient. Am. J. Med. Genet. 50:347–352, 1994. 47. N.A. Nwokoro and J.J. Mulvihill. Cholesterol and bile acid replacement therapy in children and adults with Smith­Lemli­Opitz (SLO/RSH) syndrome. Am. J.  Med. Genet. 68: 315–321, 1997. 48. E. Jacquemin, K.D.R. Setchell, N.C. O'Connell, A. Estrada, G. Maggiore, J. Schmitz, M. Hadchouel, and O. Bernard. A new cause of progressive intrahepatic  cholestasis: 3b­hydroxy­C27­steroid dehydrogenase/isomerase deficiency. J. Pediatr. 125:379–384, 1994. 49. B.L. Shneider, K.D. Setchell, P.F. Whitington, K.A. Neilson, and F.J. Suchy. Delta 4­3­

  

Page 182

oxosteroid 5 beta­reductase deficiency causing neonatal liver failure and hemochromatosis. J. Pediatr. 124:234–238, 1994. 50. E.R. Elias and M. Irons. Abnormal cholesterol metabolism in Smith­Lemli­Opitz syndrome. Curr. Opin. Pediatr. 7:710–714, 1995. 51. D.W. Russell and K.D. Setchell. Bile acid biosynthesis. Biochemistry 31:4737–4749, 1992. 52. G. Salen, S. Shefer, F.W. Cheng, B. Dayal, A.K. Batta, and G.S. Tint. Cholic acid biosynthesis: the enzymatic defect in cerebrotendinous xanthomatosis. J. Clin.  Invest. 63:38–44, 1979. 53. G. Salen, T.W. Meriwether, and G. Nicolau. Chenodeoxycholic acid inhibits increased cholesterol and cholestanol synthesis in patients with cerrebrotendinous  xanthomatosis. Biochem. Med. 14:57–74, 1975. 54. T. Nakamura, Y. Matsuzawa, K. Takemura, M. Kubo, H. Miki, and S. Tarui. Combined treatment with chenodeoxycholic acid and pravastatin improves plasma  cholestanol levels associated with marked regression of tendon xanthomas in cerebrotendinous xanthomatosis. Metabolism 40:741–746, 1991. 55. T. Kita, M.S. Brown, and J.L. Goldstein. Feedback regulation of 3­hydroxy­3­methylglutaryl coenzyme A reductase in livers of mice treated with mevinolin, a  competitive inhibitor of the reductase. J. Clin. Invest. 66:1094–1100, 1980. 56. P.T. Ma, G. Gil, T.C. Sudhof, D.W. Bilheimer, J.L. Goldstein, and M.S. Brown. Mevinolin, an inhibitor of cholesterol synthesis, induces MRNA for low density  lipoprotein receptor in livers of hamsters and rabbits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:8370–8374, 1986. 57. W.M. Pandak, D.M. Heuman, P.B. Hylemon, and Z.R. Vlahcevic. Regulation of bile acid synthesis: IV. Interrelationship between cholesterol and bile acid  biosynthesis pathways. J. Lipid Res. 31:79–90, 1990. 58. W.M. Pandak, Z.R. Vlahcevic, J.Y.L. Chiang, D.M. Heuman, and P.B. Hylemon. Bile acid synthesis: VI. Regulation of cholesterol 7 ­hydroxylase by  taurocholate and mevalonate. J. Lipid Res. 33:659–668, 1992. 59. D.K. Spady, E.F. Stange, L.E. Bilhartz, and J.M. Dietschy. Bile acids regulate hepatic low density lipoprotein receptor activity in the hamster by altering  cholesterol flux across the liver. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1916–1920, 1986. 60. S.D. Turley, D.K. Spady, and J.M. Dietschy. Identification of a metabolic difference accounting for the hyper­ and hyporesponder phenotypes of cynomolgus  monkey. J. Lipid Res. 38:1598–1611, 1997. 61. S.D. Turley, D.K. Spady, and J.M. Dietschy. Alteration of the degree of biliary cholesterol saturation in the hamster and rat by manipulation of the pools of  preformed and newly synthesized cholesterol. Gastroenterology 84:253–264, 1983. 62. B.G. Stone, S.K. Erickson, W.Y. Craig, and A.D. Cooper. Regulation of rat biliary cholesterol secretion by agents that alter intrahepatic cholesterol metabolism.  Evidence for a distinct biliary precursor pool. J. Clin. Invest. 76:1773–1781, 1985. 63. D.M. Small. Phospholipids. In: D.M. Small, ed. Handbook of Lipid Research: IV. The Physical Chemistry of Lipids. New York: Plenum Press, 1986, pp. 475– 522. 64. D.E. Vance. Glycerolipid biosynthesis in eukaryotes. In: D.E. Vance and J.E. Vance, eds. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. Amsterdam:  Elsevier Science, 1986, pp. 153–181. 65. S.L. Pelech, P.H. Pritchard, D.N. Brindley, and D.E. Vance. Fatty acids promote translocation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase to the endoplasmic  reticulum and stimulate rat hepatic phosphatidylcholine synthesis. J. Biol. Chem. 258:6782–6788, 1983. 66. A. Lykidis, K.G. Murti, and S. Jackowski. Cloning and characterization of a second human CTP:phosphocholine cytidyltransferase. J. Biol. Chem. 273:14022– 14029, 1998. 67. D.E. Vance, C.J. Walkey, and Z. Cui. Phosphatidylethanolamine N­methyltransferase from liver. Biochim. Biophys. Acta 1348:142–150, 1997.

  

Page 183

68. Z. Cui, J.E. Vance, M.H. Chen, D.R. Voelker, and D.E. Vance. Cloning and expression of a novel phosphatidylethanolamine N­methyltransferase: a specific  biochemical and cytological marker for a unique membrane fraction in rat liver. J. Biol. Chem. 268:16655–16663, 1993. 69. Z. Cui, M. Houweling, and D.E. Vance. Expression of phosphatidylethanolamine N­methyltransferase­2 in McArdle­RH7777 hepatoma cells inhibits the CDP­ choline pathway for phosphatidylcholine biosynthesis via decreased gene expression of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. Biochem. J. 312:939–945, 1995. 70. Z. Cui, M. Houweling, and D.E. Vance. Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N­methyltransferase­2. J. Biol.  Chem. 269:24531–24533, 1994. 71. C.J. Walkey, L.R. Donohue, R. Bronson, L.B. Agellon, and D.E. Vance. Disruption of the murine gene encoding phosphatidylethanolamine N­methyltransferase.  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12880–12885, 1997. 72. P.C. Choy, M. Skrzypczak, D. Lee, and F.T. Jay. Acyl­GPC and alkenyl/alkyl­GPC:acyl­CoA acyltransferases. Biochim. Biophys. Acta 1348:124–133, 1998.

  

Page 185

9—  Cholesterol Crystallization in Bile Fred M. Konikoff Tel Aviv Sourasky Medical Center, Tel Aviv, Israel Joanne M. Donovan Harvard Medical School and Boston VA Medical Center, Boston, Massachusetts I—  Introduction In supersaturated bile, cholesterol tends to precipitate and form crystals. A variety of crystal morphologies can be detected by polarizing light microscopy in fresh  human gallbladder bile obtained at cholecystectomy. Moreover, typical rhomboid cholesterol monohydrate crystals can form rapidly (within a few days) during ex  vivo incubation of lithogenic human bile that has first been cleared from native crystals by filtration or ultracentrifugation (1). This chapter reviews the crystal forms  found in cholesterol gallstones and their mechanisms of formation, approaches to assessing crystallization in bile, factors that modulate crystal formation, and, last,  touches upon the process of crystal agglomeration that must occur to produce a mature gallstone. In 1674, van Leeuwenhoek, using light microscopy, first observed cholesterol crystals (2). Almost 300 years later, Lyon devised a way of stimulating gallbladder  contraction and collecting bile specimens from the duodenum (3). The method was used by Juniper and Burson to demonstrate the significance and usefulness of  detecting biliary crystals in the diagnosis of hepatobiliary and pancreatic diseases (4); thus they initiated the modern era of investigating cholesterol crystallization and its  relevance for gallstone formation. The central role of cholesterol crystallization in gallstone formation was defined by two sets of observations: first, the ability to define the physical properties of bile that  allow crystals to form, and, second, the clinical correlation of cholesterol crystals with gallstone disease. Physicochemical studies revealed that cholesterol supersaturation was essential for biliary cholesterol to nucleate and crystallize (5,6). Despite this basic understanding  of the physicochemical forces that govern biliary cholesterol solubilization on one hand and its precipitation on the other hand, it was soon realized that supersaturation  is a necessary but not sufficient prerequisite for crystal and stone formation (7). Subsequently, Holzbach and colleagues showed that the propensity of bile to form de  novo cholesterol crystals during ex vivo incubation is the most definitive characteristic differentiating the biles of gallstone formers and nonformers (1). In a landmark study, Sedaghat and Grundy showed that cholesterol crystals appeared in gallbladder biles of all patients with cholesterol stones, as opposed to none in  the biles of pigment stone patients (8). Cholesterol crystals could also be detected in duodenal bile, although intermittently (9). Thus, gradually accumulating evidence  supported the notion that cholesterol crystallization is the key to the cascade leading to gallstone formation.

  

Page 186

Evidence reviewed elsewhere in this volume describes the panoply of biliary proteins that have been demonstrated to accelerate or inhibit cholesterol crystallization in  vitro or in vivo. This chapter focuses on the physicochemical mechanisms by which cholesterol crystallization occurs in bile. II—  Crystal Composition of Gallstones Cholesterol gallstones, as the name implies, are composed mainly of cholesterol and can be defined by a weight fraction of cholesterol that is greater than 75 to 80%  cholesterol (10), but which, in some cases, approaches 100% (11,12). The composition of gallstones bears archeological witness to the composition of bile during the  lengthy period of lithogenesis. In the western world, over three­quarters of patients have predominantly cholesterol stones (13,14). Mixed stones, with cholesterol  compositions intermediate between those of pigment and cholesterol stones, are thought to occur in biles that have become secondarily infected (15). The remainder of a cholesterol gallstone is a mixture of biliary glycoproteins, calcium salts, and bile pigments (16). Stones with from 25 to 75% cholesterol by weight  (16), are likely to derive from secondary bacterial contamination and precipitation of calcium bilirubinate. At the center of most cholesterol gallstones is a nidus of  visible pigment (17), which has been determined by infrared spectroscopy to be the calcium salt of the unconjugated bilirubin (UCB) monoanion, Ca(HUCB)2 (18).  Small amounts of calcium phosphate and traces of calcium carbonate are also present at the core of most human cholesterol stones (19) and in laminated rings  associated with calcium bilirubinate (20). While this central pigment has been hypothesized to be involved in the earliest stages of nucleation, its presence may  represent coprecipitation (18) or subsequent diffusion of pigments into existing stones (21). From a materials sciences perspective, the term cholesterol gallstone is, strictly speaking, a misnomer, since these stones are not real ceramic stones but organic  concretions (22). As revealed by inspection with the unaided eye and low­power microscopy, these concretions are agglomerates of a multitude of individual crystals  of cholesterol monohydrate, usually oriented with the long axes radiating outward like spokes of a wheel from the center of the stone and held together by an organic  matrix of glycoproteins (23). Formation of these concretions requires the presence of a matrix composed of mucin glycoproteins (24,25), and has yet to be duplicated  in vitro. Cholesterol crystallization is a pivotal step in cholesterol gallstone formation, irrespective whether the crystallization occurs as a primary event within the bile or  secondarily on the surface of a stone. Therefore, the study of cholesterol crystallization has become a central issue in the study of cholesterol gallstone pathogenesis  (26,27). III—  Crystal Forms of Cholesterol In nature, cholesterol can exist in two different crystalline forms, anhydrous and monohydrate (Fig. 1), both of which are thermodynamically stable under different  conditions. In an aqueous environment such as bile at 37°C, the most stable form is cholesterol monohydrate (28). Although cholesterol may also crystallize as esters  or other mixed compounds, these are generally not found in bile (29–31). A—  Cholesterol Monohydrate Cholesterol monohydrate crystals are triclinic, with eight molecules of cholesterol and eight water molecules in the unit cell, as disclosed by the elegant x­ray diffraction  studies of Craven (32). As shown in Fig. 1, cholesterol molecules are packed such that they form a double­layer

  

Page 187

Figure 1 Crystalline structures of cholesterol monohydrate and anhydrous cholesterol. Dark circles represent oxygen atoms  from the cholesterol hydroxyl group or from water for the monohydrate form. For cholesterol monohydrate, the eight molecule crystal structure is formed by superimposing the right four molecules (D, E, F, H) over the left four molecules (A, B, C, G). Two eight­member unit cells of low­temperature anhydrous cholesterol are shown, and are superimposed  over each other for the complete crystal structure. For cholesterol monohydrate, note the internal bilayer structure formed by mirror reflections of the steroid nuclei, with the hydrogen­bonded oxygen atoms forming an approximate  plane. Also, the steroid nuclei are approximately perpendicular to the plane formed by the oxygen atoms. In anhydrous cholesterol, the oxygen atoms are hydrogen bonded, but the planar structure is less distinct. (From Ref. 31.)

  

Page 188

structure with a thickness of 33.9 Å. The water molecules are located between the double layers, so that the C­3 hydroxyl groups of cholesterol and the water  molecules produce a hydrogen bonding network between the layers (32). Cholesterol monohydrate crystals have a typical appearance of rhomboid, plate­like structures, with characteristic angles (79.2 and 100.8 degrees) (28). These  crystals frequently have a tiny corner notch, which has been suggested to derive from a sequence of cholesterol crystallization via a variety of intermediate structures  such as arcs, spirals, helices, and tubes (33), as discussed further below. Polarizing light microscopy allows identification of these crystal forms by their characteristic  morphology and birefringence properties. Physical identification of cholesterol monohydrate crystals can be made by x­ray diffraction, calorimetry, or specific gravity measurements. Powder diffraction of  cholesterol monohydrate crystals reveals three major reflection peaks at 34.1, 17.6, and 5.9 Å (28). The mass density of cholesterol monohydrate crystals is 1.045  g/dL. With differential scanning calorimetry (DSC), cholesterol monohydrate crystals display two secondary transitions and a primary phase transition (28). During  heating from room temperature to 160°C (beyond the melting point of cholesterol), three distinct endotherms, at 86.4, 123.4, and 156.8°C are observed,  corresponding to the loss of hydration, transition from crystal to liquid crystal, and melting point, respectively. B—  Anhydrous Cholesterol Anhydrous cholesterol also has a triclinic crystal configuration, but with distinct features (34). One striking difference from the monohydrate is that anhydrous  cholesterol exists in two different polymorphic forms, as detected by differential scanning calorimetry (35) and x­ray diffraction (28). At a temperature below 31.6°C,  the unit cell consists of eight cholesterol molecules; whereas at higher temperatures (including body temperature), it has 16 molecules. The mass density of anhydrous  cholesterol crystals is 1.03 g/dL (34), and the crystal habit is needle­like. The aqueous solubility of anhydrous cholesterol in micellar bile salt solutions exceeds that of  cholesterol monohydrate (36) due to the less thermodynamically favorable crystal structure. In the presence of excess water, cholesterol monohydrate is the  thermodynamically stable form. Of note, the crystal habit observed visually is not specific for the presence of monohydrate or anhydrous crystals and is determined by additional factors, including  hydration and the speed of crystallization. Thus, anhydrous cholesterol crystals may sometimes have a plate­like habit, just as the monohydrate may have a needle­like  habit (35,37). Unless cholesterol monohydrate crystals are maintained under conditions of high humidity, the water molecules are lost and calorimetry will fail to  demonstrate the transition from monohydrate to anhydrous forms at 86°C. Evaporation of the water of hydration may account for some observations of anhydrous  crystals in cholesterol gallstones not continuously maintained in an aqueous environment (38,39). C—  Additional Crystal Forms in Bile Biliary cholesterol crystallization can yield a variety of crystal forms, or habits, in addition to classic rhomboid plates (33,40,41). These intermediate structures appear  transiently between metastable supersaturated systems and thermodynamic equilibrium. Therefore all are thermodynamically unstable with respect to cholesterol  monohydrate (i.e., their crystal structures are metastable or less favorable thermodynamically) (42). Figure 2 displays the wide variety of morphologies that can be observed. In a dilute, bile salt­rich model bile, the earliest cholesterol crystals are flexible filamentous  structures, with a mass density as well as x­ray diffraction pattern suggestive of initial anhydrous crystallization (33,43). Thin needle structures or arc­like crystals form  under similar conditions and are be­

  

Page 189

Figure 2 Intermediate crystal structures found in model and native biles. Helical and tubular structures can be seen in a–d,  along with a filament in a. Helical markings can be seen on the tubule in c. Panels e and f show fracture of a tubule with subsequent growth of a plate­like crystal. (From Ref. 42.)

lieved also to reflect anhydrous crystallization. These structures subsequently undergo a series of morphological transformations while growing in size. Cholesterol can  form helical structures of at least two different pitch angles (44). Further crystal growth produces tubule structures, sometimes with characteristic markings attesting to  their helical origin. Fracture of tubules can be observed, unfurling a flat crystal with characteristic angles and often notches typical of plate­like crystals of cholesterol  monohydrate. As discussed below, the composition of bile influences formation of these structures. Although initially observed in a bile salt­rich dilute, nonphysiological system (33),  these structures have also been observed in concentrated, physiologically relevant model biles as well as native biles. The quantitative contribution of these structures  to cholesterol crystallization in human bile in vivo remains unclear. IV—  Solubilization of Cholesterol in Bile Bile salts, phosphatidylcholine, and cholesterol aggregate to form different biliary lipid aggregates, depending on their relative concentrations. The amphiphilic nature of  these lipids drives formation of these aggregate structures that minimize exposure of hydrophobic portions of the molecules to aqueous solution. Alone, aqueous bile  salts form simple micelles, aggregates about 20 to 30 Å in size, above the critical micellar concentration of up to several millimol depending on the bile salt species  (45,46). Together with phosphatidylcholine, thermodynamically stable

  

Page 190

mixed micelles are formed (47). At high relative bile salt contents and total lipid concentrations, mixed micelles are small and globular (40 to 80 Å in diameter) (47);  but at low relative bile salt contents and total lipid concentration, rod­shaped structures up to several hundred angstroms in length form (48). Cholesterol can be  solubilized by simple or mixed micelles, although the capacity of the mixed micelle greatly exceeds that of simple micelles (49). When the micellar solubility of either phosphatidylcholine or cholesterol is exceeded, additional phases can form: a cholesterol crystalline phase and a lamellar phase  (50). At equilibrium, the crystal structure is that of cholesterol monohydrate. Bilayer structures containing phosphatidylcholine, cholesterol, and small amounts of bile  salts range in size from unilamellar vesicles (250–2000 Å in diameter) composed of a single phosphatidylcholine/cholesterol bilayer to multilamellar structures of a size  visible by light microscopy (>2000 Å). A—  Equilibrium Phase Diagram Fundamental insights into cholesterol crystallization in bile derive from the equilibrium­phase diagram of biliary lipids, which define the conditions under which  cholesterol crystal formation can occur in bile (5,51). Because the total lipid concentration of bile varies severalfold, relative rather than absolute concentrations of the  three major biliary lipids—bile salts, phosphatidylcholine, and cholesterol—were found to define the limits of cholesterol solubility most precisely (6). As shown in Fig.  3, the equilibrium­phase diagram displays relative compositions

Figure 3 Equilibrium­phase diagram of model bile at a total lipid concentration of 10 g/dl.  See text for details. (From Ref. 52.)

  

Page 191

of the principal lipids of bile at a physiological concentration, 10 g/dL total lipid concentration. Each triangular apex represents systems made up of a single component:  either bile salt, phosphatidylcholine, or cholesterol. Interior points represent biles with differing relative compositions of all three components. Only within the micellar  zone at relatively high bile salt concentrations do simple and mixed micelles completely solubilize cholesterol. The cholesterol saturation index is defined as the ratio between the molar percentage of cholesterol of a system and the maximum micellar solubility of cholesterol; it is  unity at the micellar­phase boundary. Systems with cholesterol contents that exceed the micellar­phase boundary (CSI > 1) must contain at least one additional phase  at equilibrium, either cholesterol monohydrate crystals or cholesterol/phosphatidylcholine bilayer structures. On the left side of the phase diagram at relatively high bile  salt contents, a two­phase region contains cholesterol­saturated micelles and cholesterol monohydrate crystals. On the right side of the phase diagram at relatively high  phosphatidylcholine contents, another two­phase region contains cholesterol/phosphatidylcholine bilayer structures and cholesterol­unsaturated micelles. Between  these two regions is a three­phase region, that contains cholesterol monohydrate crystals, cholesterol­saturated micelles, and cholesterol/phosphatidylcholine vesicles,  presumably in a 1:1 ratio (53). Both the micellar phase limit and the boundaries between the multiphase regions depend on total lipid concentration and bile salt hydrophobicity (5,40,54). In dilute  biles, the micellar zone is smaller, and the boundaries of the multiphase regions shift to the left. Thus, the two­phase zone containing micelles and a lamellar phase is  expanded at the expense of the regions containing cholesterol monohydrate crystals at equilibrium. With increasing bile salt hydrophobicity, the micellar zone expands,  and the boundaries of the multiphase regions shift to the right. Consequently, the regions containing cholesterol monohydrate crystals at equilibrium are expanded. The relative lipid concentrations, as plotted on the triangular equilibrium phase diagram, have been shown to be important also in determining the crystallization  pathways of cholesterol, including the intermediate crystal forms, as is discussed below. B—  Metastable Equilibrium Cholesterol­supersaturated biles can exist in metastable states in which cholesterol crystals are not present but will form if sufficient time is allowed for the system to  reach equilibrium. Under these conditions, the vesicular cholesterol/phosphatidylcholine ratio exceeds unity, and the coexisting micelles are also cholesterol­ supersaturated (55–58). The composition of biliary lipid aggregates under these conditions is not fixed and must be determined by an analytical method that does not  perturb the composition of the micelles and vesicles (53,59). Biliary mixed micelles and vesicles are in rapid equilibrium with bile salt monomers and simple micelles at a concentration known as the intermixed  micellar/intervesicular bile salt concentration (IMC). Utilizing this concentration, biliary vesicles can be isolated by gel filtration chromatography, resulting in their  dilution without alterations in their composition (60). As higher concentrations of bile salts more effectively solubilize vesicular phosphatidylcholine than cholesterol  (61), higher IMC values are associated with increased vesicular cholesterol/phosphatidylcholine ratios (58). Thus, in supersaturated biles, changes in relative and  absolute biliary lipid composition such as increased total lipid concentration and increased bile salt/phosphatidylcholine are associated with higher IMC values, and are  consequently associated with increases in vesicular cholesterol/phosphatidylcholine ratio. Cholesterol can equilibrate between lipid bilayers over a period of hours (62), but the presence of bile salts accelerates this process (63). The implication is that in  supersaturated biles, both micelles and vesicles are supersaturated, as has been confirmed experimentally (58). Rapid equilibration of cholesterol between  noncrystalline phases can therefore allow both micelles and vesicles to serve as sources for cholesterol crystallization.

  

Page 192

V—  Measurement of Cholesterol Crystallization in Bile Measurements of the kinetics of cholesterol crystallization have been an indispensable tool in gallstone research, enabling investigation of factors that promote or retard  cholesterol crystallization (1,64,65). In clinical practice, observations of cholesterol crystals in duodenal bile, obtained after gallbladder contraction induced by  cholecystokinin, can provide key diagnostic information. The presence of cholesterol crystals as determined by biliary microscopy can diagnose biliary sludge and  allow for further therapeutic interventions to prevent complications such as pancreatitis (66,67). Measurement of the kinetics of crystallization in bile obtained from the  duodenum has been proposed (68), but the accuracy is limited by the presence of pancreatic phospholipase (69,70), producing free fatty acid in a process known to  accelerate nucleation (71). Determination of the nucleation time has been used to predict the likelihood of gallstone dissolution by oral bile salts (72) and recurrence of  gallstones after cholecystotomy (73). Despite the limitations of individual assay techniques, these methods provide much of our current understanding of biliary  cholesterol crystallization and the factors that modulate crystallization. A—  Concept of Critical Nucleus Biliary cholesterol crystallization includes a sequence of distinct steps. Initially, there is rearrangement of cholesterol­containing lipid aggregates (supersaturated vesicles  and micelles) and possible redistribution of cholesterol within and between the aggregates (74). This is believed to result in the formation of a critical nucleus, the  earliest form of crystalline cholesterol (75). Detection of this critical nucleus has been so far unsuccessful. The earliest crystals are small and thin, below the resolution  limits (about 200 nm) of conventional light microscopy. Further increase in crystal mass and size, which may also involve changes in crystal shape and habit (42),  eventually leads to the formation of thermodynamically stable, classic plate­like cholesterol monohydrate crystals. While mature birefringent cholesterol crystals are easily recognized by polarizing light microscopy, the precise time point at which cholesterol crystallization occurs has  been elusive. Moreover, crystallization may occur in bile from multiple nuclei, as a continuing asynchronous process (75). Hence, attempts to assess biliary cholesterol  crystallization quantitatively have intrinsic limitations. Nucleation is classified as homogeneous, which occurs from an isotropic solution, or heterogeneous, which occurs on a separate nidus. Heterogeneous nucleation is  believed to predominate in bile (75) and occurs far more readily than homogeneous nucleation. For example, extremely pure filtered water can be supercooled well  below the freezing point, but it freezes rapidly once ice crystals or even dust is added. Thus, the presence of microcrystals of cholesterol that are not completely  removed can accelerate the observed rate of crystallization (76). B—  Direct Light Microscopy Despite methodological limitations, measurement of cholesterol crystallization has become an essential part of gallstone research and the clinical assessment of bile  lithogenicity. For measurements of nucleation time, crystals are removed by ultracentrifugation (1) and the isotropic supernatant is incubated at 37°C, while aliquots are  removed periodically for examination by polarized light microscopy. Nucleation time is a misnomer and has more recently and more properly been renamed crystal  observation time. A variation on this technique is mixing model biles with serial dilutions of native biles, with determination of the maximum dilution affecting crystal  observation time (77). The number of crystals provides a semiquantitative measure of the mass of crystalline cholesterol. This procedure is laborious, but can be performed by polarized light  microscopy

  

Page 193

(79). The crystal growth curve provides additional information about crystallization kinetics, but with the disadvantage of not taking into consideration variations in  crystal size. Moreover, once the number of crystals becomes large and agglomeration occurs, the technique loses accuracy. Attempts to automate this process with a  Coulter counter have not gained wide acceptance because of concerns about its accuracy (80,81). C—  Turbidity­Based Assays Assays based on the turbidity of suspended cholesterol crystals offer advantages in reproducibility and speed (81). Busch et al. (81) introduced a spectrophotometric  method to provide a means of measuring cholesterol crystal growth. A minute amount of seed crystals is added to a model bile to act as a catalyst for crystal growth.  At intervals, aliquots of model bile are diluted with excess bile salts to rapidly solubilize bilayer structures, and the turbidity of the resulting solution is measured.  Because bile salts dissolve cholesterol crystals relatively slowly (36), the light scattered by the crystals alone can be measured. The development of turbidity with time  yields a sigmoidal crystal growth curve that is characterized by an onset time, a rate of increase in turbidity corresponding to crystal growth, and a plateau reflecting  maximal crystal concentration at equilibrium. The process of nucleation can thus be characterized by a lag period in which no crystals can be observed, followed by  crystal growth. The technique has the theoretical limitation that scattered light is not always directly correlated with the number of crystals due to variability in crystal  sizes and shapes. The method is less sensitive than microscopy because several hundreds of crystals are required before detection, but it is less dependent on  investigator expertise and easier to perform on a large number of samples. Recently, the assay was modified using microtiter plates and a plate reader, providing a  rapid high­capacity method for detecting cholesterol crystal precipitation and growth in model biles (82,83). Unfortunately, biliary pigments limit the use of optical methods for crystallization assays in native biles. However, studies have been extended to develop methods that  allow early detection and quantitative measurement of cholesterol monohydrate crystal growth in human native gallbladder bile, based on the combination of  spectrophotometry with preparative ultracentrifugation (84) or dilution of the samples (85). D—  Assessment of Intermediate Crystal Forms None of the above crystallization assays provide information about the actual mechanism(s) by which cholesterol nucleates and crystals grow, nor do they distinguish  between various crystallization pathways (40,86). To overcome this limitation, the crystallization process has been depicted by a semiquantitative graphic method that  shows separate crystallization curves for distinct crystal forms (40,86,87). Because of differences in crystal morphology, this format does not necessarily reflect the  relative mass of each type of crystal present. A density gradient ultracentrifugation assay has been developed to overcome this limitation (88). E—  Measurement of Crystal Mass Crystal mass can be quantified radiochemically using tracer amounts of [3H]­cholesterol (80), although this method has not been widely applied or validated.  Ultracentrifugation with a density gradient can also be used to separate cholesterol crystals and quantify crystal growth (84). Separation of cholesterol precipitates by sequential ultracentrifugation (88) can provide quantitative as well as qualitative monitoring of the crystallization process. This  technique takes advantage of differences in the density (d) of bilayer structures (d < 1.02 g/mL), anhydrous

  

Page 194

cholesterol (d = 1.03), and cholesterol monohydrate (d = 1.04). Early intermediate forms composed of anhydrous cholesterol can be separated from rhomboidal  cholesterol monohydrate plates. However, intermediate forms—such as helices and tubules—approach the density of cholesterol monohydrate and cannot be  determined independently. This technique also allows the concomitant monitoring of precipitable cholesterol­containing multilamellar vesicles during the crystallization  process. VI—  Mechanisms of Crystallization A—  Origins of Biliary Cholesterol Cholesterol is secreted into bile in unilamellar phosphatidylcholine vesicles (56,89,90), as described in detail elsewhere in this volume. Formation of these vesicles  depends upon activity of mdr2 (91,92), a canalicular membrane protein of the ATP cassette family that transfers phosphatidylcholine to the exoleaflet of the  canaliculus. These nascent vesicles are believed to have a cholesterol/phosphatidylcholine ratio of approximately 0.3, the ratio of these lipids in hepatic bile (Fig. 4).  Bilayer structures with this composition are thermodynamically stable and incapable of forming cholesterol crystals (94). Independent active transport of bile salts into  the canaliculus by the bile salt export protein (95) mediates transformation of these nascent vesicles. Because the capacity of bile salts to solubilize phosphatidylcholine  exceeds their capacity to solubilize cholesterol, mixed micelles are formed, but residual vesicles contain a much higher relative cholesterol concentration (61,89,96). Within the gallbladder, further rearrangement of cholesterol­containing lipid aggregates occurs before nucleation and crystallization. Due to concentration of bile,  micellar cholesterol­

Figure 4 Biliary lipid aggregates in bile. Cholesterol is secreted into bile as cholesterol/phosphatidylcholine vesicles with a molar ratio of approximately 0.3. As the bile ducts concentrate bile, bile salts as monomers and micelles selectively solubilize phosphatidylcholine to produce supersaturated cholesterol/phosphatidylcholine vesicles with molar ratios above unity. In the gallbladder, vesicles aggregate and fuse, forming cholesterol­rich microdomains that provide a template  for formation of crystalline cholesterol. (From Ref. 93.)

  

Page 195

carrying capacity increases. Concomitantly, vesicles aggregate and fuse, initiating the process of cholesterol nucleation and precipitation in supersaturated bile (97–99).  Rhomboidal plates can be seen emerging from aggregated vesicles by phase­contrast microscopy (99). Quantitation of biliary aggregates suggests that the  preponderance of precipitated cholesterol derives from vesicles rather than from micelles (100). Further support for this sequence comes from the observation that  nucleation­promoting proteins also disrupt vesicles (101) and accelerate vesicle fusion and aggregation (97). On the other hand, apolipoprotein A­I, which prolongs  crystal observation time (102), prevents fusion of vesicles in model systems (103). The striking similarity in molecular orientation between putative cholesterol­rich  microdomains in these multilayer structures and the crystal structure of cholesterol monohydrate suggests that multilamellar structures form a template that accelerates  cholesterol crystallization (104). Recently, video­enhanced light microscopy has been used in combination with cryogenic transmission electron microscopy (cTEM) to provide direct imaging of  microstructural details and evolution during biliary cholesterol nucleation and crystallization (105–108) (Fig. 5). These studies have substantiated the role of micelles  and vesicular (uni­ and multilamellar) aggregates in the nucleation process, and revealed additional early vesicular structures, believed to represent intermediates in a  micelle to vesicle transition (105,108). They have, however, failed to support the importance of vesicle fusion in the nucleation process (105,108). Although the critical  nucleus has so far evaded even these new powerful observation methods, the growth of early cholesterol crystals by possible feeding from micelles and bilayer  structures has been visualized (108). Despite the weight of evidence that vesicle aggregation precedes cholesterol crystal formation, mixed micelles also play a role. First, mixed micelles coexisting with  cholesterol­rich vesicles are also supersaturated (58). In bile salt­cholesterol model systems, cholesterol crystals are formed in the absence of phosphatidylcholine, and  cholesterol crystals have been observed to derive from the micellar phase in vivo (109). Because of the difficulty of separating micelles and vesicles and the rapid  equilibration of cholesterol between membranes and micelles, the true origin of crystalline cholesterol is ambiguous. B—  Pathways of Cholesterol Crystallization Since the initial description of non­plate­like (filamentous, helical, and tubular) cholesterol crystals (33), it has become evident that there are several pathways by which  biliary cholesterol can nucleate and grow into ''mature" crystals. As shown in Fig. 6, there appear to be at least five distinct pathways in model bile, as denoted by  Wang and Carey from A to E, according to the relative lipid composition as it plots on a triangular phase diagram (40). These pathways differ in terms of cholesterol  precipitates involved and their sequence of appearance, as shown schematically in Fig. 7. In pathway A, the first cholesterol precipitates are arc­like crystals, followed  by helical and tubular crystals. Plates appear only after helices and become predominant only as other crystals disappear. In pathway B, plates are the first precipitates  to appear, soon after supersaturation is initiated, followed by transient appearances of arcs, helices, and tubular cholesterol crystals. In pathways C and D, crystal  precipitation is slower and is preceded by the appearance of liquid crystals. In both these pathways the first crystal precipitates are plate­like. However, in pathway C,  the crystallization sequence is similar to that in pathway B (plates arcs helices tubes plates); whereas in pathway D, only plates form. In pathway E, only liquid  crystals form, without precipitation of solid cholesterol crystals. Thus all pathways except E lead eventually to the formation of classical plate­like cholesterol  monohydrate crystals at equilibrium. As shown in Fig. 7, these can be grouped into pathways in which intermediate crystal habits and cholesterol monohydrate crystals  appear (A, B, and C), and those in which only cholesterol monohydrate crystals appear. The distinction may be whether the degree of cholesterol supersaturation is  sufficient thermodynamically to allow anhydrous cholesterol to precipitate (110).

  

Page 196

Figure 5 Cryo­TEM of lipid microstructures appearing in nucleating  bile. After dilution totrigger supersaturation, spheroidal micelles are seen immediately along with discoid structures and forming vesicles. Panels B and C show evolution of multilamellar structures with incomplete bilayer patches. (From Ref. 108.)

A major underlying factor that determines the crystallization behavior of biliary cholesterol is the relative phosphatidylcholine concentration of the bile (40). At low­ phosphatidylcholine molar fractions, cholesterol crystallization occurs in the absence of liquid crystal formation, revealing filamentous and arc­like crystals as the  earliest crystal forms (pathways A and B). With increasing phosphatidylcholine concentrations, cholesterol crystallization is preceded by liquid crystal (multilamellar  vesicle) formation, and plate­like crystals precipitate before or even without precipitation of other crystal forms (pathways C, D, and E). Dilution,

  

Page 197

Figure 6 Ternary phase diagram showing relative concentrations for which various crystallization pathways occur. The shaded areas depict the two­phase zones that at equilibrium contain micelles and  cholesterol monohydrate crystals, and a lamellar phase and cholesterol monohydrate crystals, respectively. Above the micellar zone is the unshaded three­phase zone containing micelles,  cholesterol monohydrate crystals, and a lamellar phase at equilibrium. Four distinct sequences of cholesterol crystallization occur, defined by the temporal sequence in which different structures appear. For pathway A, arc­like crystals appear, followed by helices, tubules, and plates. For  pathway B, plates appear initially, followed by transient appearances of helices, tubules, and plates. In pathway C, formation of microscopically observable vesicles precede the same sequence as in B. In pathway D, liquid crystals precede the development of plate. Pathway E denotes regions of the phase diagram where only liquid crystals are present. Increases in bile salt hydrophobicity or total lipid concentration result in an expansion of all zones to the left. (From Ref. 40.)

cooling, and decreasing bile salt hydrophobicity have an opposite effect to the increasing phosphatidylcholine content (40,41,111). Phospholipid molecular species  also influence the crystallization pathways of biliary cholesterol (87,112). The shifts in pathways of crystallization occur in parallel with shifts in the multiphase regions of  equilibrium that are observed with changes in total lipid concentration, temperature, and bile salt hydrophobicity (40). Recently, Carey has proposed a tentative molecular explanation for cholesterol crystallization pathways (113). At high phosphatidylcholine molar fractions, an  abundance of phosphatidylcholine/cholesterol vesicles aggregate and fuse to form multilamellar vesicles. Within these multilayered structures, cholesterol molecules  align themselves in bimolecular layers, resembling the molecular packing in cholesterol monohydrate crystals. When supersaturated,

  

Page 198

Figure 7 Sequence of structures appearing during various cholesterol crystallization path­ways. In  pathways A, B, and C, intermediate structures including arcs, helices, and tubules disappear to leave cholesterol monohydrate plates at equilibrium. The relative position of these structures on the horizontal axis depicts the relative time at which they appear during the various pathways. The column on the right displays the final crystal structures. Increases in relative bile salt content, bile salt hydrophobicity, or total lipid concentration result in shifts  toward pathway A.

these cholesterol­rich layers grow and tend to precipitate as plate­like cholesterol monohydrate crystals. At low phosphatidylcholine molar fractions, however, only  unilamellar vesicles form. Within these, in the absence of multilayers, cholesterol packs at supersaturation as a condensed core structure, far from water molecules.  From these cholesterol­rich cores, cholesterol precipitates as anhydrous crystals, with a filamentous or needle­like habit. In bile, anhydrous crystals hydrate slowly  (28), while going through a series of morphological transitions to become classic plate­like monohydrate crystals. This explanation is, however, at present highly  speculative, and needs to be validated by confirmatory experiments. In general, human bile has a composition that falls into the two­ and three­phase regions of the phase diagram, which involve crystallization pathways B, C, or D  (40,86). Therefore, in native bile, the earliest cholesterol crystal forms tend to be plate­like. However, in most human biles, intermediate crystal forms (arcs, helices,  and tubes) should appear during the crystallization process. These predictions have been substantiated by observations in fresh human bile samples as well as in ex  vivo incubated biles (41). In interpreting these data, one special point of caution must be remembered. The depiction of cholesterol crystallization pathways is based on information accumulated  from model biles and native biles obtained from cholesterol gallstone patients. Both these situations may not adequately represent what happens in vivo, particularly at  the beginning of gallstone formation. This, of course, is a general caveat in the study of gallstone formation and must be kept in mind in discussing gallstone  pathogenesis. Nevertheless, since similar pathways have also been observed in sequentially studied animal models, these processes likely play a role in cholesterol  crystallization in vivo.

  

Page 199

VII—  Factors Modulating Crystallization Both the rate and extent of cholesterol crystal formation can be affected by numerous physiologically relevant factors, including cholesterol content,  phosphatidylcholine content and acyl chain composition, bile salt content and hydrophobicity, total lipid concentration, a panoply of biliary proteins, and ionic  constituents of bile, as well as in vitro by temperature and ionic strength. The effects of biliary proteins and the local environment in the gallbladder are reviewed in  detail elsewhere in this volume. A—  Cholesterol Content Initial studies examining crystal observation time in bile focused on cholesterol saturation index as a key parameter controlling crystallization rate (1). Although there  was a general trend of decreasing crystal observation time with increasing cholesterol saturation index, a wide variability was observed for any given value. The  limitations of cholesterol saturation index as a single parameter were highlighted by observations that cholesterol crystals did not precipitate from highly supersaturated  hepatic bile (65). However, at least in concentrated biles, the cholesterol/phosphatidylcholine of the vesicular phase in supersaturated bile was found to correlate  inversely with crystal observation time (114,115). Despite the identification of a variety of pro­ and antinucleating proteins in bile, multivariate analysis has shown that  cholesterol saturation was the only variable independently correlated with crystal observation time (116). The equilibrium­phase diagram (Fig. 3) shows why cholesterol saturation index is inadequate as a measurement of propensity for cholesterol crystallization. At the  micellar phase limit, the cholesterol saturation index is, by definition, unity. However, at low bile salt/phosphatidylcholine ratios, cholesterol crystals cannot exist at  cholesterol contents slightly above the micellar phase limit. The concept of cholesterol monomer activity has been proposed to measure the thermodynamic propensity  for cholesterol crystallization (109). The concentration of cholesterol monomers in aqueous solution is extremely low and must be below the limit of cholesterol  solubility in unsaturated solutions (approximately 3 × 10­8) (118). By definition thermodynamically, supersaturated solutions that can form cholesterol monohydrate  crystals must contain monomeric cholesterol concentrations above this limit. This monomeric cholesterol activity can be measured experimentally by quantitating  partitioning of cholesterol into a polymeric phase (110,117,119). Although crystal observation time has been found to correlate inversely with cholesterol monomer  activity (117,120), this approach has not been used widely. B—  Bile Salt Species Patients with cholesterol gallstones consistently have an increased fraction of the hydrophobic bile salt deoxycholate in their bile acid pool (121–124). Intestinal  bacterial transformation of the trihydroxy bile acid cholic acid produces the more hydrophobic dihydroxy bile acid deoxycholic acid. Deoxycholate is a more powerful  detergent and can more efficiently extract cholesterol from the canalicular membrane (125,126). When the reservoir function of the gallbladder is impaired in  cholesterol gallstone disease (127,128), newly synthesized hepatic bile tends to be secreted into the intestinal lumen via the common bile duct rather than stored in the  gallbladder. Since the relative amount of residence time in the intestine increases, a larger fraction is transformed to deoxycholate. In addition to its role in increasing biliary cholesterol content, deoxycholate independently accelerates cholesterol crystal formation in model (54,129) and native (123)  biles. This effect appears to be mediated through an increased cholesterol/phosphatidylcholine ratio in vesicles (123).

  

Page 200

C—  Phosphatidylcholine As discussed above, altering the relative phosphatidylcholine/bile salt ratio can affect the pathway of crystallization in model and native biles. Either an increase in the  relative phosphatidylcholine content or addition of exogenous phosphatidylcholine prolongs the crystal observation time (129,130). The type of phosphatidylcholine  also influences cholesterol crystallization, with more unsaturated acyl chains tending to accelerate nucleation (131,132), especially in the sn­2 position (133). In part,  this is due to alterations in the size of the micellar zone (134). Individual phosphatidylcholine species are differentially distributed between micelles and vesicles (135),  and vesicular lipids are preferentially adsorbed to early cholesterol crystals (87). D—  Calcium The precise role of calcium in cholesterol gallstone formation is unclear. Calcium has minimal effect on the equilibrium solubility of cholesterol in bile  salt/phosphatidylcholine solutions (40). The presence of calcium at the core of cholesterol gallstones suggests a role of calcium salts in initial stages of gallstone  formation, possibly serving as templates for heterogeneous nucleation. Experimental evidence is conflicting: addition of calcium to model biles accelerated cholesterol  crystal formation, but only at supraphysiological concentrations (136,137), while calcium chelation did not reduce crystal observation time in native bile (138). On the  contrary, calcium appears to accelerate crystal growth disproportionate to any effect on crystal observation time (139,140). Since calcium binds to monomeric bile  salts (141), mixed micelles, and vesicles (142), its effect could be mediated through induction of lateral­phase separations of membrane lipids, as is known to occur for  other phospholipids (143). Calcium accelerates fusion, particularly of negatively charged phospholipid vesicles (143). Calcium interactions with negatively charged bile  salts bound to cholesterol/phosphatidylcholine vesicles could have similar effects in bile (142). E—  Total Lipid Concentration Both in model and native biliary lipid systems, increases in total lipid concentration accelerate cholesterol crystallization (144,145), despite the enhanced micellar  solubility of cholesterol at high total lipid concentrations (5). Increases in total lipid concentration are associated with increased vesicular  cholesterol/phosphatidylcholine ratios. F—  Biliary Sterols Other Than Cholesterol Cholesterol is the predominant biliary sterol, constituting over 97% of total sterols (146). In gallstones, polar sterols are enriched relative to bile, and have been  suggested to be important in biliary cholesterol crystallization (147). However, the similarity of patterns in cholesterol and pigment stones argues against a pathogenic  role (148). VIII—  Crystal Growth and Stone Formation After initial nucleation and crystal formation, cholesterol crystals continue to grow and aggregate, forming clusters and finally small stones. Despite the importance of  these steps in gallstone pathogenesis, surprisingly little has been published in this regard in gallstone research. This may in part be related to the fact that the process of  stone formation is a slow and prolonged one, and it has not been successfully reproduced ex vivo. Structural analysis of gallstones obtained at cholecystectomy (and  autopsy) have provided indirect data regarding stone formation and growth.

  

Page 201

Two separate and distinct forms of stone growth appear to occur in humans (12,149). In one form, a single stone grows, often to quite large dimensions. In the second  form, many (occasionally thousands) small stones develop simultaneously, without agglomeration into a single stone. Interestingly, after treatment (by lithotripsy,  dissolution, or surgery), when the gallbladder is left in place, the initial growth pattern is usually preserved when stones recur. Why these two different growth patterns,  presumably representing two distinct disease patterns, occur is at present obscure. Looking at the "anatomy of gallstones," Womack et al. realized over 35 years ago that gallbladder mucin plays a central role in stone formation and growth (17). They  noted that even pure cholesterol stones are built within a meshwork of mucous glycoproteins, while the nucleus of the stone also generally contained a focal collection  of mucin. Other types of cholesterol stones were suggested to be agglomerates of smaller stones, held together by mucin. Womack et al. suggested that mucin  aggregation was the primary event, upon which cholesterol precipitated and grew to form a stone. Although the universality of a mucin­based nidus has been  challenged thereafter (18), more recent studies—employing scanning and freeze­fracture electron microscopy as well as immunostaining—support the general  presence of mucin in the matrix of cholesterol gallstones (23,150,151). Which is the primary event—mucin or cholesterol precipitation—cannot be determined by  certainty from these studies. In addition to mucin, cholesterol gallstones also contain other matrix substances. Calcium bilirubinate and other calcium salts (e.g.,  carbonate and palmitate) have been shown to be deposited cyclically during the growth process of cholesterol stones (19,152). Other metal cations, sulfur, and  phosphorus are also present (151). An outer shell of pigment and calcium salts may encase some stones (153,154). Several biliary proteins have been shown to be  incorporated into gallstones. Using immunostaining and EDAX microanalysis, specific proteins have been localized to different areas within cholesterol gallstones  (151). Mucin was identified in a three­dimensional network intercalated between deposits of pigment and cholesterol, whereas the biliary calcium­binding protein  APF/CBP and the pronucleating protein aminopeptidase­N coated only the calcium­rich pigment deposits. No specific topographical localization was found for  albumin or IgA. These findings have been interpreted as evidence for an active role for mucin, APF/CBP, and aminopeptidase­N in the formation of cholesterol  gallstones. The authors propose that during stone formation, cholesterol crystals and aminopeptidase­N bind directly to mucin, while calcium salts and pigment deposit  on APF/GBP bind hydrophobically to mucin (151). The crystalline form of cholesterol within gallstones is generally held to be the monohydrate. However, anhydrous cholesterol crystals have been observed repeatedly  in stones (38,39,155,156). The interpretation has generally been technical, in terms of postharvesting dehydration of the stones held or stored in room air. In view of  the more recent observations of possible early anhydrous crystallization of cholesterol in bile, these findings have gained renewed interest. It has been implied that  anhydrous crystals, which are needle­like and stickier than the monohydrate plates, may precipitate periodically and induce agglomeration of mixtures of cholesterol  microliths (113). Gallstones grow quite slowly. It has been estimated by 14C­radiocarbon measurements that the growth rate is about 2.6 mm per year (157). Calculations from a large  cohort of cholecystectomies or periodic follow­up of individual stone growth by ultrasonography have revealed even slower growth rates, between 0.4 and 2 mm per  year (158,159). IX—  Conclusion Available data regarding how cholesterol crystals are transformed or incorporated into gallstones, as well as how stones grow, are clearly patchy and incomplete. This  somewhat neglected field will hopefully be tackled more intensively in the future, applying some of the newer approaches of modern chemical and biocrystallization  techniques to gallstone research.

  

Page 202

Acknowledgments Supported in part by research funding from the Veterans Administration and the Minerva Center for Cholesterol Gallstones and Lipid Metabolism in the Liver. References 1. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 2. van Leeuwenhoek A. Letter No. 16, February 11th 1675. In: Geleerden CvN, ed. The Collected Letters of Antoni van Leeuwenhoek. Amsterdam: NV. Swets  & Zeitlinger; 1939:265–267. 3. Lyon BBV. Non­surgical Drainage of the Gall Tract. Philadelphia and New York: Lea & Febiger; 1923. 4. Juniper K Jr, Burson EN Jr. Biliary tract studies: II. The significance of biliary crystals. Gastroenterology. 1957; 32:175–208. 5. Carey MC, Small DM. The physical chemistry of cholesterol solubility in bile: relationship to gallstone formation and dissolution in man. J Clin Invest 1978;  61:998–1026. 6. Admirand WH, Small DM. The physico­chemical basis of cholesterol gallstone formation in man. J Clin Invest 1968; 47:1045–1052. 7. Holzbach RT, Marsh M, Olszewski M, Holan K. Cholesterol solubility in bile: evidence that supersaturated bile is frequent in healthy man. J Clin Invest 1973;  52:1467–1479. 8. Sedaghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980; 302:1274–1277. 9. Marks JW, Bonorris G. Intermittency of cholesterol crystals in duodenal bile from gallstone patients. Gastroenterology 1984; 87:622–627. 10. Bills PM, Lewis D. A structural study of gallstones. Gut 1975; 16:630–637. 11. Juvonen T, Kervinen K, Kairaluoma MI, Lajunen LH, Kesaniemi YA. Gallstone cholesterol content is related to apolipoprotein E polymorphism.  Gastroenterology 1993; 104:1806–1813. 12. Wolpers C, Hofmann AF. Solitary versus multiple cholesterol gallbladder stones. Mechanisms of formation and growth. Clin Invest 1993; 71:423–434. 13. Sauerbruch T, Stellaard F, Soehendra N, Paumgartner G. Cholesteringehalt von Gallengangssteinen. Dtsch Med Wochenschr 1983; 108:1099–1102. 14. Trotman BW, Ostrow JD, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: comparison of stone and bile composition. Am J Dig Dis 1974; 199:585–590. 15. Wosiewitz U, Schenk J, Sabinski F, Schmack B. Investigations on common bile duct stones. Digestion 1983; 26:43–52. 16. Nakayama F. Quantitative microanalysis of gallstones. J Lab Clin Med 1968; 72:602–611. 17. Womack NA, Zeppa R, Irvin GL III. The anatomy of gallstones. Ann Surg 1963; 157: 670–686. 18. Malet PF, Williamson CE, Trotman BW, Soloway RD. Composition of pigmented centers of cholesterol gallstones. Hepatology 1986; 6:477–481. 19. Been JM, Bills PM, Lewis D. Microstructure of gallstones. Gastroenterology 1979; 76: 548–555. 20. Ruiz de Aguiar A, Medina Nuñez JA, Lopez Domingo MI, Villacorta Patió J, Leguey Jimenez S. Calcium carbonate in cholesterol gallstones. J Hepatol 1988;  6:71–79. 21. Sanabria JR, Gordon ER, Harvey PR, Goresky CA, Strasberg SM. Accumulation of unconjugated bilirubin in cholesterol pellets implanted in swine gallbladders.  Gastroenterology 1996; 110:607–613.

  

Page 203

22. Kumar S, Burns SJ. The crystallization behavior of gallstones grown from cholesterol. J Mater Sci 1993; 4:460–465. 23. Abe A, Tsuchiya Y, Sugiura N, Saisho H, Nishimura K, Takeo K. Ultrastructure of cholesterol gallstones as observed by electron microscopy after freeze­ fracturing. Tissue Cell 1997; 29:191–7. 24. LaMont JT, Smith BF, Moore JRL. Role of gallbladder mucin in the pathophysiology of gallstones. Hepatology 1984; 4:51S–56S. 25. Sutor DJ, Wooley SE. The organic matrix of gallstones. Gut 1974; 15:487–491. 26. Holzbach RT. Nucleation of cholesterol crystals in native bile. Hepatology 1990:155S–159S. 27. Carey MC, LaMont JT. Cholesterol gallstone formation: 1. Physical­chemistry of bile and biliary lipid secretion. Prog Liver Dis 1992; 10:139–163. 28. Loomis CR, Shipley GG, Small DM. The phase behavior of hydrated cholesterol. J Lipid Res 1979; 20:525–535. 29. Klinkner AM, Waites CR, Kerns WD, Bugelski PJ. Evidence of foam cell and cholesterol crystal formation in macrophages incubated with oxidized LDL by  fluorescence and electron microscopy. J Histochem Cytochem 1995; 43:1071–1078. 30. Katz SS, Small DM. Isolation and and partial characterization of the lipid phases of human atherosclerotic plaques. J Biol Chem 1980; 255:9753–9759. 31. Craven BM. Cholesterol crystal structures: adducts and esters. In: Small DM, ed. The Physical Chemistry of Lipids: From Alkanes to Phospholipids. New  York: Plenum Press; 1986:149–182. 32. Craven BM. Crystal structure of cholesterol monohydrate. Nature 1976; 260:727–729. 33. Konikoff FM, Chung DS, Donovan JM, Small DM, Carey MC. Filamentous, helical, and tubular microstructures during cholesterol crystallization from bile:  evidence that cholesterol does not nucleate classic monohydrate plates. J Clin Invest 1992; 90:1155–1160. 34. Shieh HS, Hoard LG, Nordman CE. Crystal structure of anhydrous cholesterol. Nature 1977; 267:287–289. 35. Hsu LY, Nordman CE. Phase transition and crystal structure of the 37 degrees C form of cholesterol. Science 1983; 220:604–606. 36. Igimi H, Carey MC. Cholesterol gallstone dissolution in bile: dissolution kinetics of crystalling (anhydrate and monohydrate) cholesterol with chenodeoxycholate,  ursodeoxycholate, and their glycine and taurine conjugates. J Lipid Res 1981; 22:254–270. 37. Garti N, Karpuj L, Sarig S. Correlation between crystal habit and the composition of solvated and nonsolvated cholesterol crystals. J Lipid Res 1981; 22:785– 791. 38. Sutor DJ, Gaston PJ. Anhydrous cholesterol: a new crystalline form in gallstones. Gut 1972; 13:64–65. 39. Aho AJ, Vilhonen E, Peltola S, Lehtonen A. An x­ray diffraction study of the crystalline composition of gallstones. Scand J Gastroenterol 1985; 20:901–906. 40. Wang DQH, Carey MC. Complete mapping of crystallization pathways during cholesterol precipitation from model bile: influence of physical­chemical variables  of pathophysiologic relevance and identification of a stable liquid crystalline state in cold, dilute and hydrophilic bile salt­containing systems. J Lipid Res 1996;  37:606–630. 41. Portincasa P, van EK, Jansen A, Renooij W, Gadellaa M, vanBerge HG. Behavior of various cholesterol crystals in bile from patients with gallstones.  Hepatology 1996; 23: 738–748. 42. Chung DS, Benedek GB, Konikoff FM, Donovan JM. Elastic free energy of anisotropic helical ribbons as metastable intermediates in the crystallization of  cholesterol. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:11341–11345. 43. Konikoff FM, Carey MC. Cholesterol crystallization from a dilute bile salt­rich model bile. J Crystal Growth 1994; 144:79–86.

  

Page 204

44. Zastavker YV, Asherie N, Lomakin A, et al. Self­assembly of helical ribbons. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:7883–7887. 45. Small DM. The physical chemistry of cholanic acids. In: Nair PP, Kritchevsky D, eds. The Bile Acids, Vol. I. New York: Plenum Press; 1971:249–356. 46. Carey MC. Physical­chemical properties of bile acids and their salts. In: Danielsson H, Sjsvall * J, Van Deenen LLM, eds. Sterols and Bile Acids. Amsterdam:  Elsevier; 1985: 345–403. 47. Mazer NA, Benedek GB, Carey MC. Quasielastic light­scattering studies of aqueous biliary lipid systems: mixed micelle formation in bile salt­lecithin solutions.  Biochemistry 1980; 19:601–615. 48. Cohen DE, Chamberlain RA, Thurston GM, Benedek GB, Carey MC. Cylindrical "worm­like" micelles in bile salt­lecithin solutions: implications for the earlies  events in bile formation. In: Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Bile Acids as Therapeutic Agents. Lancaster UK: Kluwer Academic; 1991:147–150. 49. Armstrong MJ, Carey MC. Thermodynamic and molecular determinants of sterol solubilities in bile salt micelles. J Lipid Res 1987; 28:1144–1155. 50. Small DM, Bourg SM, Dervichian DG. Ternary and quaternary aqueous systems containing bile salt, lecithin, and cholesterol. Nature 1966; 211:816–818. 51. Cabral DJ, Small DM. Physical chemistry of bile. In: Schultz SG, Forte JG, Rauner BB, eds. Handbook of Physiology—The Gastrointestinal System III,  Section 6. Baltimore, MD: American Physiology Society, Waverly Press; 1989:621–662. 52. Donovan JM. Pathogenesis of Gallstones. In: LaRusso NF, ed. Images in Gastroenterology—Gallstones. Philadelphia: Current Medicine; 1996: 8.1–8.16. 53. Donovan JM, Carey MC. Separation and quantitation of cholesterol "carriers" in bile. Hepatology 1990; 12:94S–105S. 54. Donovan JM, Timofeyeva N, Carey MC. Cholesterol monohydrate and liquid crystal formation in model biles: effects of bile salt hydrophobicity and  phosphatidylcholine contents, Hepatology 1989; 10:598. 55. Somjen G, Gilat T. Contribution of vesicular and micellar carriers to cholesterol transport in human bile. J Lipid Res 1985; 26:699–704. 56. Ulloa N, Garrido J, Nervi F. Ultracentrifugal isolation of vesicular carriers of biliary cholesterol in native human and rat bile. Hepatology 1987; 7:235–244. 57. Pattinson N, Chapman B. Distribution of biliary cholesterol between mixed micelles and nonmicelles in relation to fasting and feeding in humans.  Gastroenterology 1986; 91: 697–702. 58. Donovan JM, Jackson AA. Accurate separation of biliary lipid aggregates requires the correct inter­mixed micellar/intervesicular bile salt concentration.  Hepatology 1998; 27: 641–648. 59. Harvey PRC, Somjen G, Gilat T, Gallinger S, Strasberg SM. Vesicular cholesterol in bile: Relationship to protein concentration and nucleation time. Biochim  Biophys Acta 1988; 958:10–18. 60. Donovan JM, Timofeyeva N, Carey MC. Influence of total lipid concentration, bile salt/lecithin ratio and cholesterol content on inter mixed micellar/vesicular (non­ lecithin associated) bile salt concentrations in model bile. J Lipid Res 1991; 32:1501–1512. 61. Cohen DE, Angelico M, Carey MC. Structural alterations in lecithin­cholesterol vesicles following interactions with monomeric and micellar bile salts: physical­ chemical basis for subselection of biliary lecithin species and aggregative states of biliary lipids during bile formation. J Lipid Res 1990; 31:55–70. 62. McLean LR, Phillips MC. Mechanism of cholesterol and phosphatidylcholine exchange or transfer between unilamellar vesicles. Biochemistry 1981; 20:2893– 2900. 63. Vlahcevic ZR, Gurley EC, Heuman DM, Hylemon PB. Bile salts in submicellar concentrations promote bidirectional cholesterol transfer (exchange) as a function  of their hydrophobicity. J Lipid Res 1990; 31:1063–1071.

  

Page 205

64. Holzbach RT, Kibe A, Thiel E, Howell JH, Marsh M, Hermann RE. Biliary proteins: unique inhibitors of cholesterol crystal nucleation in human gallbladder bile. J  Clin Invest 1984; 73:35–45. 65. Groen AK, Stout JPJ, Drapers JAG, Hoek FJ, Grijm R, Tytgat GNJ. Cholesterol nucleation­influencing activity in T­tube bile. Hepatology 1988; 8:347–352. 66. Lee SP, Nicholls JF, Park HZ. Biliary sludge as a cause of acute pancreatitis. N Engl J Med 1992; 326:589–593. 67. Ros E, Navarro S, Bru C, Garciapuges A, Valderrama R. Occult microlithiasis in idiopathic acute pancreatitis—prevention of relapses by cholecystectomy or  ursodeoxycholic acid therapy. Gastroenterology 1991; 101:1701–1709. 68. Janowitz P, Swobodnik W, Wechsler JG, Zoller A, Kuhn K, Ditschuneit H. Comparison of gall bladder bile and endoscopically obtained duodenal bile. Gut  1990; 31:1407–1410. 69. Marks JW, Broomfield P, Bonorris GG, Schoenfield LJ. Factors affecting the measurement of cholesterol nucleation in human gallbladder and duodenal bile.  Gastroenterology 1991; 101:214–219. 70. Petroni ML, Jazrawi RP, Ahmed HA, Finch PJ, Dormandy J, Northfield TC. Cholesterol nucleation time measurement in nasobiliary or nasoduodenal bile— comparison with surgical bile. Scand J Gastroenterol 1993; 28:803–808. 71. Luk AS, Kaler EW, Lee SP. Phospholipase­C­induced aggregation and fusion of cholesterol­lecithin small unilamellar vesicles. Biochemistry 1993; 32:6965– 6973. 72. Janowitz P, Wechsler JG, Janowitz A, Kuhn K, Swobodnik W, Ditschuneit H. Nucleation time, cholesterol saturation index, and biliary bile acid pattern: a  comparison in responders and nonresponders to systemic litholysis with bile acids. Scand J Gastroenterol 1991; 26:367–373. 73. Jungst D, del PR, Dolu MH, Schneeweiss SG, Frimberger E. Rapid formation of cholesterol crystals in gallbladder bile is associated with stone recurrence after  laparoscopic cholecystotomy. Hepatology 1997; 25:509–513. 74. Fudim­Levin E, Bor A, Kaplun A, Talmon Y, Lichtenberg D. Cholesterol precipitation from cholesterol­supersaturated bile models. Biochim Biophys Acta  1995; 1259: 23–28. 75. Small DM. Cholesterol nucleation and growth in gallstone formation. N Engl J Med 1980; 302:1305–1307. 76. Harvey PR, Upadhya GA, Strasberg SM. Cholesterol microcrystals associated with concanavalin A­binding glycoproteins contribute artifactually to nucleating  activity assays. J Lipid Res 1995; 36:2661–2669. 77. Drapers JAG, Groen AK, Stout JPJ, et al. Quantification of cholesterol nucleation promoting activity in human gallbladder bile. Clin Chim Acta 1987; 165:295– 302. 78. Lee TJ, Smith BF. Bovine gallbladder mucin promotes cholesterol crystal nucleation from cholesterol­transporting vesicles in supersaturated model bile. J Lipid  Res 1989; 30:491–498. 79. Levy PF, Smith BF, LaMont JT. Human gallbladder mucin accelerates nucleation of cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87:270–275. 80. Whiting M J, Watts JM. Cholesterol crystal formation and growth in model bile solutions. J Lipid Res 1983; 24:861–868. 81. Busch N, Tokumo H, Holzbach RT. A sensitive method for determination of cholesterol growth using model solutions of supersaturated bile. J Lipid Res 1990;  31:1903–1909. 82. Harvey PR, Upadhya GA. A rapid, simple high capacity cholesterol crystal growth assay. J Lipid Res 1995; 36:2054–2058. 83. Somjen GJ, Ringel Y, Konikoff FM, Rosenberg R, Gilat T. A new method for the rapid measurement of cholesterol crystallization in model biles using a  spectrophotometric microplate reader. J Lipid Res 1997; 38:1048–1052. 84. Corradini SG, Cantafora A, Capocaccia L, Dellaguardia P, Giacomelli L, Angelico M.

  

Page 206

Development and validation of a quantitative assay for cholesterol crystal growth in human gallbladder bile. Bba­Lipid Lipid Metab 1994; 1214:63–72. 85. Ohya T, Tazuma S, Hatsushika S, et al. An estimation of human bile metastability: clinical application of a sensitive cholesterol crystal growth assay. J  Gastroenterol Hepatol 1994; 9:223–227. 86. Wang DQ, Carey MC. Characterization of crystallization pathways during cholesterol precipitation from human gallbladder biles: identical pathways to  corresponding model biles with three predominating sequences. J Lipid Res 1996; 37:2539–2549. 87. Konikoff FM, Cohen DE, Carey MC. Phospholipid molecular species influence crystal habits and transition sequences of metastable intermediates during  cholesterol crystallization from bile Salt­Rich model bile. J Lipid Res 1994; 35:60–70. 88. Konikoff FM, Laufer H, Messer G, Gilat T. Monitoring cholesterol crystallization from lithogenic model bile by time­lapse density gradient ultracentrifugation. J  Hepatol 1997; 26:703–710. 89. Cohen DE, Carey MC. Physical chemistry of biliary lipids during bile formation. Hepatology 1990:143S–147S. 90. Cohen DE, Angelico M, Carey MC. Quasielastic light scattering evidence for vesicular secretion of biliary lipids. Am J Physiol 1989; 257:G1–G8. 91. Elferink RPJO, Ottenhoff R, Vanwijland M, Smit JJM, Schinkel AH, Groen AK. Regulation of biliary lipid secretion by mdr2 p­glycoprotein in the mouse. J Clin  Invest 1995; 95:31–38. 92. Crawford JM, Mockel GM, Crawford AR, et al. Imaging biliary lipid secretion in the rat: ultrastructural evidence for vesiculation of the hepatocyte canalicular  membrane. J Lipid Res 1995; 36:2147–2163. 93. Donovan JM. Physical and metabolic factors in gallstone pathogenesis. Gastroenterol Clin North Am 1999; 28:75–98. 94. Collins JJ, Phillips MC. The stability and structure of cholesterol­rich codispersions of cholesterol and phosphatidylcholine. J Lipid Res 1982; 23:291–298. 95. Gerloff T, Steiger B, Hagenbuch B, et al. The sister of P­glycoprotein represents the canalicular bile salt export pump of mammalian liver. J Biol Chem 1998;  173:10046–10050. 96. Carey MC, Cohen DE. Update on physical state of bile. Ital J Gastroenterol 1995; 27:92–100. 97. Afdhal NH, Niu N, Nunes DP, et al. Mucin­vesicle interactions in model bile: evidence for vesicle aggregation and fusion before cholesterol crystal formation.  Hepatology 1995; 22:856–865. 98. Halpern Z, Dudley MA, Lynn MP, Nader JM, Breuer AC, Holzbach RT. Vesicle aggregation in model systems of supersaturated bile: relation to crystal  nucleation and lipid composition of the vesicular phase. J Lipid Res 1986; 27:295–306. 99. Halpern Z, Dudley MA, Kibe A, Lynn MP, Breuer AC, Holzbach RT. Rapid vesicle formation, and aggregation in abnormal human biles: a time­lapse video­ enhanced contrast microscopy study. Gastroenterol 1986; 90:875–885. 100. Peled Y, Halpern Z, Eitan B, Goldman G, Konikoff F, Gilat T. Biliary micellar cholesterol nucleates via the vesicular pathway. Biochim Biophys Acta 1989;  1989:246–249. 101. de Bruijn MAC, Goldhoorn BG, Zijlstra AIM, Tytgat GNJ, Groen AK. Interaction of cholesterol­crystallization­promoting proteins with vesicles. Biochem J  1995; 305:93–96. 102. Kibe A, Holzbach RT. Inhibition of cholesterol crystal formation by apolipoproteins in supersaturated model bile. Science 1984; 225:514–516. 103. Tao S, Tazuma S, Kajiyama G. Apolipoprotein A­I stabilizes phospholipid lamellae and thus prolongs nucleation time in model bile systems: an ultrastructural  study. Biochim Biophys Acta 1993; 1166:25–30. 104. Phillips MC. Cholesterol packing, crystallization and exchange properties in phosphatidylcholine vesicle systems. Hepatology 1990; 12:75S–80S; discussion  80S–82S.

  

Page 207

105. Gantz DL, Wang DQ, Carey MC, Small DM. Cryoelectron microscopy of a nucleating model bile in vitreous ice: formation of primordial vesicles. Biophys J  1999; 76:1436–1451. 106. Kaplun A, Talmon Y, Konikoff FM, et al. Direct visualization of lipid aggregates in native human bile by light­ and cryo­transmission electron microscopy. FEBS  Lett 1994; 340:78–82. 107. Kaplun A, Konikoff FM, Eitan A, et al. Imaging supramolecular aggregates in bile models and human bile. Microsc Res Tech 1997; 39:85–96. 108. Konikoff FM, Danino D, Weihs D, Rubin M, Talmon Y. Microstructural evolution of lipid aggregates in nucleating model and human biles visualized by cryo­ transmission electron microscopy. Hepatology 2000; 31:261–268. 109. Ahrendt SA, Foxtalbot K, Kaufman HS, Lillemoe KD, Pitt HA. Cholesterol nucleates rapidly from mixed micelles in the prairie dog. Bba­Lipid Lipid Metab  1994; 1211:7–13. 110. Donovan JM, Jackson AA, Yuet PK, Blankschtein D. Cholesterol thermodynamic activity determines cholesterol crystal habit in model bile. Gastroenterology  1996; 110:A454. 111. Juste C, Catala I, Henry R, et al. Influence of bile salt molecular species on cholesterol crystallization from supersaturated model biles. Bba­Lipid Lipid Metab  1995; 1254:89–97. 112. Konikoff FM, Cohen DE, Carey MC. Filamentous crystallization of cholesterol and its dependence on lecithin species in bile. Mol Cryst Liq Cryst 1994;  248:291–296. 113. Carey MC. Formation and growth of cholesterol gallstones: the new synthesis. In: Fromm H, Leuschner U, eds. Bile Acids­Cholestasis­Gallstones. Dordrecht:  Kluwer Academic; 1996:147–175. 114. Harvey PRC, Rupar CA, Gallinger S, Petrunka CN, Strasberg SM. Quantitative and qualitative comparison of gallbladder mucous glycoprotein from patients  with and without gallstones. Gut 1986; 27:374–381. 115. Somjen GJ, Rosenberg R, Gilat T. Gel filtration and quasielastic light scattering studies of human bile. Hepatology 1990:123S–128S. 116. Miquel JF, Nunez L, Amigo L, et al. Cholesterol saturation, not proteins or cholecystitis, is critical for crystal formation in human gallbladder bile.  Gastroenterology 1998; 114:1016–1023. 117. Chijiiwa K, Kiyosawa R, Nakayama F. Cholesterol monomer activity correlates with nucleation time in model bile. Clin Chim Acta 1988; 178:181–192. 118. Renshaw PE, Janoff AS, Miller KW. On the nature of dilute aqueous cholesterol suspensions. J Lipid Res 1983; 24:47–51. 119. Jain UK, Higuchi WI, Liu CL, Lee PH, Mazer NA. Cholesterol (thermodynamic) activity determinations in bile salt­lecithin­cholesterol systems and cholesterol­ rich liquid crystalline mesophase formation. Pharm Res 1992; 9:792–799. 120. Noshiro H, Chijiiwa K, Hirota I. Activity of cholesterol in human gallbladder bile in relation to nucleation of cholesterol monohydrate crystals. Clin Chim Acta  1992; 205:167–179. 121. Marcus SN, Heaton KW. Intestinal transit, deoxycholic acid and the cholesterol saturation of bile—three inter­related factors. Gut 1986; 27:550–558. 122. Marks JW, Bonorris GG, Schoenfield LJ. Roles of deoxycholate and arachidonate in pathogenesis of cholesterol gallstones in obese patients during rapid loss of  weight. Digest Dis Sci 1991; 36:957–960. 123. Hussaini SH, Pereira SP, Murphy GM, Dowling RH. Deoxycholic acid influences cholesterol solubilization and microcrystal nucleation time in gallbladder bile.  Hepatology 1995; 22:1735–1744. 124. VanBerge Henegouwen GP, van der Werf SDJ, Ruben AT. Fatty acid composition of phospholipids in bile in man: Promoting effect of deoxycholate on  arachidonate. Clin Chim Acta 1987; 165:27–37.

  

Page 208

125. Carulli N, Loria P, Bertolotti M, et al. Effects of acute changes of bile acid pool composition on biliary lipid secretion. J Clin Invest 1984; 74:614–624. 126. Gurantz D, Hofmann AF. Influence of bile acid structure on bile flow and biliary lipid secretion in the hamster. Am J Physiol 1984; 247:G736–G748. 127. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 128. van der Werf SDJ, van Berge Henegouwen GP, Palsma DMH, Ruben AT. Motor function of the gallbladder and cholesterol saturation of duodenal bile. Neth J  Med 1987; 30:160–171. 129. Jungst D, Lang T, Huber P, Lange V, Paumgartner G. Effect of phospholipids and bile acids on cholesterol nucleation time and vesicular/micellar cholesterol in  gallbladder bile of patients with cholesterol stones. J Lipid Res 1993; 34:1457–1464. 130. Holzbach RT, Marsh M. Transient liquid crystals in human bile analogues. Mol Cryst Liq Cryst 1974; 28:217. 131. Tao S, Tazuma S, Kajiyama G. Fatty acid composition of lecithin is a key factor in bile metastability in supersaturated model bile systems. Biochim Biophys  Acta 1993; 1167:142–146. 132. Tazuma S, Ochi H, Teramen K, et al. Degree of fatty acyl chain unsaturation in biliary lecithin dictates cholesterol nucleation and crystal growth. Bba­Lipid Lipid  Metab 1994; 1215:74–78. 133. Ringel Y, Somjen GJ, Konikoff FM, Rosenberg R, Gilat T. Increased saturation of the fatty acids in the sn­2 position of phospholipids reduces cholesterol  crystallization in model biles. Biochim Biophys Acta 1998; 1390:293–300. 134. Halpern Z, Moshkowitz M, Laufer H, Peled Y, Gilat T. Effect of phospholipids and their molecular species on cholesterol solubility and nucleation in human and  model biles. Gut 1993; 34:110–115. 135. Cohen DE, Carey MC. Acyl chain unsaturation modulates distribution of lecithin molecular species between mixed micelles and vesicles in model bile— implications for particle structure and metastable cholesterol solubilities. J Lipid Res 1991; 32:1291–1302. 136. Kibe A, Dudley MA, Halpern Z, Lynn MP, Breuer AC, Holzbach RT. Factors affecting cholesterol monohydrate crystal nucleation time in model systems of  supersaturated bile. J Lipid Res 1985; 26:1102–1111. 137. Toor EW, Evans DF, Cussler EL. Cholesterol monohydrate growth in model bile solutions. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75:6230–6234. 138. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of binding of ionised calcium on the in vitro nucleation of cholesterol and calcium bilirubinate in  human gall bladder bile. Gut 1986; 27:1382–1386. 139. Berenson MM, Cardinal JR. Calcium accelerates cholesterol phase transitions in analog bile. Experientia 1985; 41:1328–1330. 140. Konikoff FM, Lechene de la Porte P, Laufer H, Domingo N, Lafont H, Gilat T. Calcium and the anionic polypeptide fraction (APF) have opposing effects on  cholesterol crystallization in model bile. J Hepatol 1997; 27:707–715. 141. Moore EW. The role of calcium in the pathogenesis of gallstones: Ca++ electrode studies of model bile salt solutions and other biologic systems: with a hypothesis  on structural requirements for Ca++ binding to proteins and bile acids. Hepatology 1984; 4:228S–243S. 142. Donovan JM, Leonard MR, Batta AK, Carey MC. Calcium affinity for biliary lipid aggregates in model biles: complementary importance of bile salts and  lecithin. Gastroenterology 1994; 107:831–846. 143. Leckband DE, Helm CA, Israelachvili J. Role of calcium in the adhesion and fusion of bilayers. Biochemistry 1993; 32:1127–1140. 144. van Erpecum KJ, vanBerge Henegouwen GP, Stoelwinder B, Schmidt YMG, Willekens FLH. Bile concentration is a key factor for nucleation of cholesterol  crystals and cho­

  

Page 209

lesterol saturation index in gallbladder bile of gallstone patients. Hepatology 1990; 11:1–6. 145. van Erpecum KJ, Stolk MFJ, van den Broek AMWC, Renooij W, van de Heijning BJM, van Berge Henegouwen GP. Bile concentration promotes nucleation  of cholesterol monohydrate crystals by increasing the cholesterol concentration in the vesicles. Eur J Clin Invest 1993; 23:283–288. 146. Miettinen TA, Kesaniemi YA, Jarvinen H, Hastbacka J. Cholesterol precursor sterols, plant sterols, and cholestanol in human bile and gallstones.  Gastroenterology 1986; 90:858–864. 147. Boldrini P. C­C­2W is the physical cause of cholesterol gallstones. Physiol Chem Phys 1979; 11:303–316. 148. Miettinen TE, Kesaniemi YA, Gylling H, Jarvinen H, Silvennoinen E, Miettinen TA. Noncholesterol sterols in bile and stones of patients with cholesterol and  pigment stones. Hepatology 1996; 23:274–280. 149. Jungst D, Lang T, Vonritter C, Pratschke E, Paumgartner G. Cholesterol nucleation time in gallbladder bile of patients with solitary or multiple cholesterol  gallstones. Hepatology 1992; 15:804–808. 150. Bogren HG, Mutvei H, Renberg G. Scanning electron microscope studies of human gallstones after plasma etching. Ultrastruct Pathol 1995; 19:447–453. 151. de la Porte PL, Domingo N, Vanwijland M, Groen AK, Ostrow JD, Lafont H. Distinct immuno­localization of mucin and other biliary proteins in human  cholesterol gallstones. J Hepatol 1996; 25:339–348. 152. Malet PF, Weston NE, Trotman BW, Soloway RD. Cyclic deposition of calcium salts during growth of cholesterol gallstones. Scan Electron Microsc 1985; 11 (Pt 2):775–779. 153. Kaufman HS, Magnuson TH, Pitt HA, Frasca P, Lillemoe KD. The distribution of calcium salt precipitates in the core, periphery and shell of cholesterol, black  pigment and brown pigment gallstones. Hepatology 1994; 19(5):1124–1132. 154. Ostrow JD. Unconjugated bilirubin and cholesterol gallstone formation. Hepatology 1990; 12:219S–224S. 155. Sutor DJ, Wooley SE. X­ray diffraction studies of the composition of gallstones from English and Australian patients. Gut 1969; 10:681–683. 156. Bogren H, Larsson K. An x­ray diffraction study of crystalline cholesterol in some pathological deposits in man. Biochim Biophys Acta 1963; 75:65–69. 157. Mok HYI, Druffel ERM, Rampone WM. Chronology of cholelithiasis: dating gallstones from atmospheric radiocarbon produced by nuclear bomb explosions. N  Engl J Med 1986; 314:1075–1077. 158. Lowenfels AB, Walker AM, Althaus DP, Townsend G, Domello L. Gallstone growth, size, and risk of gallbladder cancer: an interracial study. Int J Epidemiol  1989; 18:50–54. 159. Nudelman I. On the growth rate of gallstones in the human gallbladder. J Crystal Growth 1993; 130:1–5.

  

Page 211

10—  Gallbladder Mucin Gwynneth D. Offner Boston University Medical Center, Boston, Massachusetts I—  Introduction Epithelial surfaces lining the gastrointestinal, respiratory, and genitourinary tracts are covered with a layer of mucus comprised of water, electrolytes, proteins, and  DNA. This layer forms a viscous barrier that protects the underlying epithelium from desiccation, mechanical injury, and chemical and microbial assault while allowing  active absorption and secretion by mucosal cells. The principal protein components of the mucous layer are called mucins. These proteins are made up of  approximately 15 to 20% protein and 80% carbohydrate, present largely in the form of O­linked glycans (1–4). They are well suited for their protective functions in  that mucin monomers can form multimers, with apparent molecular weights greater than 20 to 40 million Da. The hydrophilic mucin multimers expand rapidly in the  presence of water molecules shortly after secretion to form the cytoprotective gel layer. Because of the unique physiological environment within the gallbladder, mucins secreted by this epithelium have been the subject of much active research over the past  three decades. Gallbladder mucins must protect the gallbladder epithelium from a variety of potentially harmful and cytotoxic substances present in bile, such as bile  acids, lysophospholipids, and oxygen metabolites. Perhaps more importantly, however, ample evidence has accumulated that, in addition to their protective functions,  gallbladder mucins also have a major role in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease. This chapter reviews the structural features of gallbladder mucins, the nature of their interactions with biliary lipids, and factors that regulate synthesis and secretion.  This information is correlated with the multiple functions of mucins in the healthy and pathological gallbladder. II—  General Properties of Mucins The very properties that enable mucins to function effectively as barrier molecules have made study of these proteins by classic biochemical techniques a formidable  challenge. Their large size and extensive glycosylation have made it nearly impossible to obtain primary amino acid sequence information. In addition, mucins display  considerable heterogeneity in both the protein and carbohydrate moieties (1–3). Early studies that focused on the overall structural and rheological properties of  mucins demonstrated that these macromolecules were made up of monomeric subunits that polymerized into rod­like structures, presumably by end­to end linkage  (5,6). The ability to polymerize is crucial for the viscoelastic properties of mucins and the

  

Page 212

formation of mucin gels. That disulfide bonding between mucin monomers could account for their ability to polymerize was shown by treatment with reducing agents,  which led to depolymerization (7,8). A—  Mucin Glycans While the mucin polypeptide backbone has been difficult to study, characterization of mucin glycans by classic techniques has revealed that most are O­linked,  although several early reports have suggested the presence of N­linked glycans as well (1). Molecular cloning studies have now shown that virtually all mucins contain  the consensus N­glycosylation sites Asn­X­Ser and Asn­X­Thr. In general, mucin O­glycans range in length from 8 to 20 sugar residues and contain N­acetyl  galactosamine (GalNAc), N­acetyl glucosamine (GlcNAc), galactose (Gal), fucose (Fuc), and sialic acid (NeuNAc) (9). The glycan structure can be divided into a  core region containing GalNAc attached to serine or threonine residues in the mucin polypeptide, a backbone region, and a peripheral region. Six types of simple core  structures have been identified that can either be directly terminated with sialic acid residues or can serve as the attachment sites for the backbone sugar residues. Two  common types of backbone structures have been identified: type 1, Gal (1–3)GlcNAc, and type 2, Gal (1–4)GlcNAc. The backbone structures can be branched  and sometimes sulfated or terminated with peripheral sugars Fuc, GalNAc, Gal, and NeuNAc. The peripheral regions of many mucin glycans are rich in sialic acid and  sulfate esters, which confer an overall negative charge to the sugar moieties and to the molecule as a whole. The complexity of these glycan structures is amplified by  the fact that many different side chains can be found on a single mucin molecule. Furthermore, side chains can be terminated prematurely during synthesis, owing in  part to the availability of specific glycosyltransferases or substrate sugars in different Golgi compartments. B—  Mucin Primary Structure It was only after molecular cloning techniques were applied to the study of human mucins that the first information about the primary structure of the polypeptide  backbone became available. These studies are discussed in greater detail in Sec. IV.A below, but they showed that, in general, all human mucins share several  common structural features. The mucin protein backbone can be divided into two distinct regions. The first—enriched with respect to serine, threonine, and sometimes  proline—contains tandemly repeated sequences ranging from 8 to 169 amino acids in length. In some cases, these sequences may be repeated hundreds of times with  little variation. In many mucins, this domain occupies the central region of the molecule and serves as the attachment site for O­linked glycans. The sequences flanking  the central tandem repeat domain are frequently enriched with respect to cysteine and are only sparsely glycosylated with both O­ and N­linked sugars. The  polymerization of mucin monomers into multimers occurs through intermolecular disulfide linkages between these cysteine­rich domains. III—  Gallbladder Mucin and the Pathogenesis of Gallstone Disease It is now well recognized that the development of gallstones is multifactorial (10,11), involving three primary defects: (a) hepatic secretion of cholesterol supersaturated  bile; (b) accelerated nucleation of cholesterol monohydrate crystals within the gallbladder; and (c) impaired gallbladder motility with stasis, allowing growth and  agglomeration of cholesterol crystals into gallstones. Studies performed in our laboratory and elsewhere have shown that gallbladder mucin is intimately involved in the  latter two abnormalities; it accelerates the nucleation of

  

Page 213

cholesterol crystals and, as a consequence of hypersecretion, forms a mucin gel layer that provides an ideal environment for the growth of cholesterol crystals into  mature stones. A—  Gallbladder Mucin Is Found in Cholesterol Gallstones Some of the earliest evidence for the involvement of gallbladder mucin in gallstone disease came from the observation that a glycosylated substance could be detected  in the core of cholesterol gallstones as well as in the stone matrix (12,13). This led to the speculation that this glycoprotein might serve as a scaffold upon which  cholesterol, calcium, and other organic molecules could be deposited. Subsequent studies identified this glycoprotein as mucin by demonstrating that the glycoprotein  isolated from gallstones had a composition similar to that of the high­molecular­weight mucin isolated from gallbladder bile (14,15). More recent work using specific  antibodies has localized mucin to the core of cholesterol gallstones as well as to a three­dimensional fibrillar network intercalated with cholesterol crystals (16). B—  Mucin Hypersecretion Precedes the Formation of Stones Numerous studies have now shown that mucin hypersecretion occurs prior to the formation of cholesterol crystals and gallstones in a variety of animal models. One of  the most widely used models is the prairie dog, which, in response to cholesterol feeding, rapidly develops cholesterol­saturated bile and stones. In a seminal study,  Lee and colleagues examined the rate of mucin secretion in explants from gallbladders removed 3 to 14 days after initiating the cholesterol­enriched diet (17).  Increased mucin secretion was first noted on day 3, although no crystals could be detected until day 5, at which time mucin synthesis reached a maximum. As  discussed below, the cholesterol crystals were embedded in the thick layer of mucin covering the gallbladder epithelium. Hypersecretion of mucin before the  appearance of cholesterol crystals and stones has also been observed in mice (18,19), hamsters (20), and ground squirrels (21,22) fed a lithogenic diet. Numerous studies in humans have also shown that mucin levels are increased in the gallbladders of patients with cholesterol gallstone disease (14,23–26). While no  temporal relationship between mucin secretion and stone formation could be established by these observations, a series of recent studies on morbidly obese subjects  has provided a unique opportunity to investigate changes in the bile composition of patients who developed gallstones during rapid weight reduction. Patients in these  studies had a sample of gallbladder bile removed at the time of gastric bypass surgery and again at the time of cholecystectomy for symptomatic gallstones. Mucin  levels increased 18­ to 50­fold over the levels found prior to stone formation (27,28). C—  Mucin Forms a Gel Layer in Which Cholesterol Crystals Nucleate While concentrations of mucin in the bulk phase of bile range from 1 to 4 mg/mL, hypersecretion can result in concentrations as high as 10 to 20 mg/mL in the gel layer  adherent to the gallbladder epithelium. Examination of gallbladders removed at cholecystectomy from patients with cholesterol stones revealed that crystals were found  predominantly within the mucous gel layer, indicating that high local concentrations of gallbladder mucin provided an ideal environment for stone formation (29,30).  These findings have been extended by the demonstration of cholesterol crystals in biliary sludge—a complex mixture of calcium bilirubinate, mucin, and other  proteins—which is recognized as a precursor to the development of gallstones in high­risk individuals such as patients on long­term parenteral nutrition or those on  rapid­weight­reducing diets (31,32). As discussed above, Lee and colleagues demonstrated that in prairie dogs fed a high­cholesterol diet, hypersecretion of gallbladder mucin preceded the appearance of  cholesterol

  

Page 214

crystals (17). It was also noted that in this animal model, crystals were first found within the mucous gel layer of the gallbladder. Similar findings were obtained in mice  (18,19), Syrian hamsters (20), and ground squirrels (21,22) fed a lithogenic diet. In a more recent study, Syrian hamsters treated with estradiol and  medroxyprogesterone showed marked hypersecretion of mucin, which was associated with crystal­like deposits viewed by transmission and scanning electron  microscopy (33). Taken together, these findings in both humans and animal models have shown that interactions between mucin and biliary lipids are promoted in the  thick mucin gel lining the gallbladder, much in the same way that gels have been shown to promote crystallization and crystal growth in industrial applications (34). D—  Role of Mucin in Nucleation and Growth of Cholesterol Crystals In order to dissect the mechanisms by which gallbladder mucin promotes gallstone formation, in vitro models were developed to examine different stages in the  pathway of cholesterol crystallization. In early work, purified human gallbladder mucin was added to model bile containing lithogenic concentrations of bile salts  (usually sodium taurocholate), phospholipid (egg­yolk phosphatidylcholine) and cholesterol with cholesterol saturation index (CSI) 1.3–1.4. In a typical ''nucleation"  assay, aliquots of the solution were examined daily by polarizing light microscopy for the appearance of cholesterol crystals. These studies showed that mucin at  concentrations of 1 to 4 mg/mL were capable of accelerating the appearance of crystals in a time­ and dose­dependent manner (35,36). Similar results were obtained  when purified mucin was added back to bile from cholesterol gallstone patients from which the mucin had been removed by ultracentrifugation and ultrafiltration (37). These early studies led to several important observations. First, they showed that mucin purified from control gallbladders nucleated as effectively as mucin purified  from the gallbladders of patients with gallstone disease (35). This suggested that there are no qualitative differences in the gallbladder mucins isolated from these two  groups of individuals and that such differences could not be used to explain the propensity of some individuals, families, and ethnic groups to develop gallstone disease.  It was concluded that in cholesterol gallstone patients, the increased quantity of gallbladder mucin but not the properties of mucin itself was important for accelerating  cholesterol crystallization both in vivo and in vitro. However, in view of what is now known about the complex expression pattern of mucin genes in the gallbladder, it  is tempting to speculate that alterations in the levels of one or more of these genes could contribute to the development of gallstone disease (See Sec. VI). The second key observation provided by these studies was that gallbladder mucin contained two distinct domains, one heavily glycosylated and the other minimally or  nonglycosylated. Both bovine and human gallbladder mucin were shown to bind a variety of hydrophobic ligands including bilirubin (38), hydrophobic dyes (36,39),  cholesterol (36), and phospholipids (36). Binding of these ligands could be abolished by prior treatment of the mucin with pronase, which could remove only the  nonglycosylated portions of the molecule, leaving the heavily glycosylated portion intact (36,39). In addition, Smith showed that pronase­treated mucin lost its ability to  promote cholesterol crystallization in vitro (36). These experiments demonstrated that the protease­sensitive, nonglycosylated domains of mucin were critical for its  interactions with biliary lipids. In addition to its role in promoting cholesterol crystal nucleation, gallbladder mucin has also been shown to promote crystal growth. Bovine gallbladder mucin was  added to supersaturated model bile pre­seeded with cholesterol crystals of a defined size. Daily analysis of the incubation mixture by polarizing light microscopy  showed a time­ and concentration­dependent increase in crystal area beginning at day 3. This increase in crystal mass was accompanied by a concomitant decrease in  the CSI of the model bile with no detectable increase in the number of crystals present (40). Since few crystal aggregates were detected, the results of this study  suggest that mucin promotes the growth of crystals by accelerating the transfer of cholesterol from either smaller microcrystals or from cholesterol­rich vesicles.

  

Page 215

IV—  Identification of Gallbladder Mucins It is now clear that, in humans, a number of different mucin genes are expressed in the gallbladder. Each of these genes is expressed in other tissues in the  gastrointestinal and respiratory tracts and, as yet, a unique gallbladder mucin gene has not been identified. The identification of the major gallbladder mucins has come  only recently following a decade of research in which molecular cloning techniques were applied to the study of human and other mammalian mucin genes. A—  Human Mucin Genes To date, the partial or complete sequences of nine human mucins have been determined (2,3,41,42). Mucin genes have been given the name MUC and have been  numbered MUC1 to MUC4, MUC5AC, MUC5B, and MUC6 to MUC8, in the order of their discovery. Each of these genes is expressed in a unique but  overlapping tissue­specific pattern. Human mucins can be subdivided into membrane­associated and secreted forms and into high­ and low­molecular­weight forms.  In addition, mucins have also been classified as either epithelium­associated or endothelium­leukocyte associated glycoproteins. The latter group includes adhesion  molecules, some of which function as ligands for selectins and integrins (42). Because these molecules lack many of the characteristic structural features of epithelial  mucins, they are not discussed further here. Many of the mucins described below were identified using a common technique. Mucin was isolated from the appropriate tissue and purified using a combination of  size­exclusion chromatography and cesium chloride density­gradient ultracentrifugation. The purified protein was deglycosylated using hydrogen fluoride and  antibodies were raised against the deglycosylated protein. These antibodies were used to screen a cDNA expression library prepared with mRNA isolated from the  corresponding tissue. In most cases, this method resulted in the identification of cDNA clones encoding mucin tandem repeats, since the deglycosylated repeat  sequences are highly immunogenic. Clones containing the sequences flanking the tandem repeats were more difficult to obtain; frequently, genomic cloning or 5' and 3'  rapid amplification of cDNA ends (RACE) were used to obtain complete mucin sequences. The properties of each of the human mucins identified to date are listed in  Table 1 and are discussed briefly below. 1—  MUC1 MUC1 is expressed almost ubiquitously in normal epithelia, including the gallbladder, and in neoplastic tissues (43,44). It was first isolated nearly simultaneously from  mammary gland and pancreas (45–47) and was the first mucin identified that contains a membrane­spanning domain, through which it is anchored to the cell surface.  This mucin, also referred to as episialin, contains well­conserved 20­amino acid tandem repeats and encodes a 300­kDa mucin gene product. MUC1 contains a 69­ amino acid cytoplasmic domain that is thought to interact with intracellular actin, a transmembrane domain, and an extracellular domain (43,48). MUC1 is not a gel­forming mucin, but it has been shown to exist in both soluble and membrane­associated forms. These forms can result from alternative splicing of  MUC1 mRNAs (49,50), or from a novel recycling pathway in which the membrane­associated form can be internalized and reprocessed in the Golgi apparatus with  further glycosylation and removal of the cytoplasmic tail (51). The recycled protein can then be secreted from the cell as a different species (52). The function of  MUC1 in normal epithelia is not well established, but it has recently been shown to have an important role in the enhancement of tumor progression and metastasis.  Increased levels of MUC1 expression in carcinoma cells inhibit cell­cell adhesion and interactions with cytotoxic T lymphocytes (53,54) as well as reducing integrin­ mediated contacts with the extracellular matrix (55).

  

Page 216 Table 1 Human Mucin Genes Gene

Source of cDNA

Expression in GB ++

 

Tandem repeat

MUC1

Pancreatic/Mammary

MUC2

Intestine

­

20 aa GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP

MUC3

Intestine

+++

17 aa HSTPSFTSSITTTETTS

MUC4

Trachea

­

16 aa TSSASTGHATPLPVTD

MUC5AC

Trachea, stomach

+

MUC5B

Trachea, gallbladder

MUC6

23 aa PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQT

8 aa TSTTSAP

+++

29 aa SSTPGTAHTLTVLTTTATTPTATGSTATP

Stomach

+

169 aa SPFSSTGPMTATSFQTTTTYPTPSHPQTT LPTHVPPFSTSLVTPSTGTVITPTHAQMA TSASIHSTPTGTIPPPTTLKATGSTHTAPP MTPTTSGTSQAHSSFSTAKTSTSLHSHTS STHHPEVTPTSTTTITPNPTSTGTSTPVAH TTSATSSRLPTPFTTHSPPTGS

MUC7

Salivary Gland

­

MUC8

Trachea

­

a

Degenerate tandem repeats.

  

23 aa TTAAPPTPSATTPAPPSSSAPPE 13/41 aa TSCPRPLQEGTRVa

Page 217

2—  MUC2, MUC5AC, MUC5B, and MUC6 MUC2, MUC5AC, MUC5B, and MUC6 are all secreted high­molecular­weight mucins. The genes for these mucins are clustered at 11p15 (56,57) and all have  been shown to have a similar structural organization. However, each of these mucins displays a unique pattern of tissue­specific expression. MUC2 was first cloned from a human small intestinal cDNA library screened with antibodies to deglycosylated colonic mucin (58). It is expressed primarily in small  intestine, colon, and respiratory epithelium (44,59,60) and was the first high­molecular­weight mucin to be sequenced completely (61,62). This mucin is >5100 amino  acids in length and contains a central domain made up of 23 amino acid repeats that is flanked by cysteine­rich regions at the N­and C­termini (61,62). The amino­ terminal domain contains D1, D2, and D3 domains analogous to those found in human pre­pro von Willebrand factor (63,64), while the carboxylterminal domain  contains a D4 domain followed by a C1 domain and an extreme C­terminal cystine knot motif. The cystine knot is a higher­ordered structure which is found in  transforming growth factor beta (TBF­ ) and related growth factors (65). This structure contains three pairs of disulfide­bonded cysteine residues with an internal free  cysteine which has been implicated in the formation of homo­ and heterodimers (66). This domain is necessary for the dimerization and efficient secretion and  packaging of von Willebrand factor monomers (63,67) and well as porcine submaxillary mucin monomers (68). In von Willebrand factor, the amino­terminal D  domains are involved in the higher­ordered polymerization of protein dimers in a process thought to be self­catalyzed. MUC5AC (originally called MUC5) was first isolated from a tracheal cDNA library screened with antibodies to deglycosylated tracheobronchial mucin (69).  MUC5AC is expressed primarily in the bronchial mucosa (59) as well as the stomach (70) and conjuctiva (71). The overall structure of MUC5AC is similar to that  described for MUC2 except that its central tandem repeat region is interrupted by domains containing cytsteine­rich sequences (72,73). The amino­ and carboxyl­ terminal regions of MUC5AC contain cysteine­rich sequences similar to those in MUC2 and von Willebrand factor (72,74–77). MUC5B was also first isolated from a tracheobronchial cDNA library (78) and is expressed primarily in the respiratory epithelium (59,79), gallbladder (80), female  reproductive tract (81,82), colon (78,83), and salivary glands (84–86). The central region of this mucin contains domains of 29­amino acid tandem repeats, which,  like those of MUC5AC, are interrupted by short cysteine­rich sequences (87) and it, like MUC2 and MUC5AC, has amino­and carboxyl­terminal cysteine­rich von  Willebrand factor­like sequences (80,88–90). MUC5B is one of the major mucin gene products expressed in the gallbladder (80); more detail about its structural  properties is given in Sec. IV.C. MUC6 was first identified in a gastric cDNA library, and this mucin is expressed primarily in this tissue with lesser amounts in the gallbladder, colon, and terminal ileum  (91). MUC6 contains the longest tandem repeats described in any mucin, each containing 169 amino acids. MUC6 and MUC5AC expression have been localized to  the mucous neck cells and the surface mucous cells of the stomach, respectively, suggesting that these mucins have distinct functional roles in the stomach (70).  Interestingly, the carboxyl­terminal sequence of MUC6 lacks a von Willebrand factor­like D4 domain but contains a cystine knot motif at the extreme C­terminal end  (92). The amino­terminal region of MUC6 has not been described. 3—  MUC3 MUC3 was first cloned from a human small intestinal cDNA library using antibodies against deglycosylated small intestinal mucin (93). The gene for MUC3 is located  at 7q22 (94), and this mucin is expressed primarily in the small intestine (93) as well as in the gallbladder (44). MUC3 contains 17­amino acid tandem repeats, which  are flanked by a non­repetitive region and a cysteine­rich sequence at the C­terminal end (95). Unlike the cysteine­rich D domain like sequences, the cysteine­rich  sequence in MUC3 resembles an epidermal growth factor

  

Page 218

(EGF) motif, similar to those found in a number of proteins with ligand­binding properties. Whether this region in MUC3 has a ligand­binding function and the nature  of the potential ligands remains unclear. While there are as yet no sequence data for the amino­terminal region of MUC3, this mucin appears to have one of the most  complicated structural organizations of any known mucin. Restriction fragment analysis indicates that there are at least two regions in the molecule containing the 17­ amino acid tandem repeats (95) and recent work from another laboratory has identified yet another tandem repeat region containing 59­amino acid repeats (96).  There has been speculation that MUC3 may be another membrane­associated mucin like MUC1. While no transmembrane domain has as yet been identified, two  animal homologues, mouse and rat MUC3, both contain putative membrane­spanning regions (97,98). 4—  MUC4 MUC4 was first isolated from a tracheobronchial cDNA library (99). It is expressed primarily in respiratory epithelium (99) and female reproductive tract (81,82),  with lesser expression in the colon (99) and salivary glands (100). The gene for MUC4 is located at 3q29 (99,101), and this mucin appears to have yet another unique  structural organization. It contains a central tandem repeat region comprised of 16­amino acid repeats (99) flanked by an N­terminal region that is nearly devoid of  cysteine (102). The C­terminal region is cysteine­rich and contains two EGF repeats similar to the one in MUC3 (103). MUC4 displays a high degree of homology to  the heterodimeric rat sialomucin complex, which consists of a membrane­associated mucin subunit (ASGP­1) and a transmembrane subunit (ASGP­2) (104,105). It  has been suggested that MUC4 may bind the receptor tyrosine kinase ErbB2, thereby functioning as both an epithelial mucin and a cell­signaling molecule. 5—  MUC7 MUC7 is the only known low­molecular­weight secreted mucin and is expressed primarily in the submandibular and sublingual glands, with lesser expression in the  trachea (79,106,107). The gene for MUC7 is located at 4q13­21 and encodes a protein containing five (or six) 23­amino acid tandem repeats flanked by a N­ terminal region containing only two cysteines and a C­terminal region devoid of cysteine (108). MUC7 appears to be a small secretory protein that does not form  intermolecular disulfide linkages and probably exists as monomers in salivary secretions. 6—  MUC8 MUC8 was identified in a tracheal cDNA library screened with an antibody to deglycosylated tracheobronchial mucin. The sequences of several clones revealed that  this mucin contained a tandem repeat domain comprising 41 base repeats. The fact that this number is not divisible by three, coupled with several nucleotide deletions,  produces alternating tandem repeats with either 41 or 13 amino acids. MUC8 has been localized to 12q24 and its expression has only been detected in the respiratory  epithelium and stomach (109,110). B—  Identification of Gallbladder Mucin Genes Until the complexity of the mucin gene family was discovered by molecular cloning studies, it was widely thought that gallbladder mucin was a single biochemical entity,  which, like other mucins isolated from gastrointestinal tissues, displayed heterogeneity primarily in its carbohydrate moieties. This was supported by histochemical  studies using classic techniques that could distinguish between neutral mucins and both sulfated and sialic acid­containing acid mucins. Epithelial cells in the body of the  gallbladder were found to contain primarily sulfomucins, with staining observed on both the luminal surface and within cytoplasmic secretory

  

Page 219

granules. Mucous glands in the neck of the gallbladder stained for both sulfo­ and sialomucins (111–114). Similar heterogeneous staining was observed when  gallbladder tissue sections were probed with a panel of lectins (111). In addition, Groen and colleagues have shown that mucins isolated from gallbladder bile vary  widely in their reactivity toward both lectins and carbohydrate­reactive anti­mucin antibodies (115). Taken together, these studies suggested either that there was great  diversity in the carbohydrate side chains of a single gallbladder mucin polypeptide or that distinct mucin polypeptides with different glycan structures were expressed in  the gallbladder. As cDNA probes for the human mucin genes became available, it was clear that the latter possibility was true. A complex and sometimes contradictory expression  pattern of gallbladder mucin genes emerged, owing in part to the fact that different studies employed different techniques and used normal and diseased gallbladder  tissue interchangeably. Some of the first studies used Northern blot analysis to demonstrate that MUC2 (116), MUC3 (44), and MUC6 (91) mRNAs were  expressed in the gallbladder. Subsequently, the expression of MUC1, MUC2, MUC5AC, and MUC5B apomucins were examined in gallbladder epithelium using a  panel of specific monoclonal and polyclonal antibodies (117). All antisera reacted to sections of gallbladder epithelium, with the strongest reactivity seen with MUC1  and MUC5B. Subsequently, Campion and colleagues examined RNA isolated from freshly isolated gallbladder epithelial cells by Northern analysis and found that the  cells expressed high levels of MUC3, MUC5AC, and MUC5B mRNAs with lower levels of MUC1 and MUC4 mRNA expression and barely detectable levels of  MUC2 mRNA (118). Several years later, members of the same group used in situ hybridization and Northern analysis to demonstrate high levels of MUC5B, MUC3,  and MUC6 mRNA and weaker expression of MUC1, MUC5AC, and MUC2 mRNA in the gallbladder (119). The discrepancies in these findings led us to try to identify the major human gallbladder mucins by expression cloning. A human gallbladder cDNA expression library  was prepared and screened with an antibody directed against deglycosylated human gallbladder mucin (80). Analysis of positive clones showed that greater than 95%  encoded MUC5B tandem repeats. Since the antibody used was raised against all mucins present in gallbladder mucosal scrapings, these results suggested that  MUC5B was the major mucin polypeptide expressed in the gallbladder. This was somewhat surprising in view of the fact that when Northern blots of human  gallbladder mRNA were hybridized with a series of mucin­specific probes, high levels of both MUC5B and MUC3 transcripts were observed with lower levels of  MUC5AC and MUC6 transcripts and almost undetectable levels of MUC2 and MUC4 (Fig. 1). The failure to detect MUC3 clones in the library suggests either that  MUC3 mRNA is not translated into protein at high levels in the gallbladder or, more likely, that the MUC3 polypeptide was not present in the high­molecular­weight  mucin fraction used to prepare the antiserum. Taken together, these studies show that at least four mucin genes are expressed in the gallbladder and that human  gallbladder mucin is likely to contain a mixture of the corresponding mucin gene products. C—  Structural Organization of the Major Gallbladder Mucin, MUC5B At the time MUC5B was identified as a major gallbladder mucin, nothing was known about the primary structure of this mucin except for the sequence of the tandem  repeats (78). It was therefore of interest to determine the sequences of the amino­ and carboxyl­terminal regions flanking the tandem repeat domain, since these were  likely to contain the protease­sensitive functional domains of human gallbladder mucin identified earlier. The complete sequence of the carboxyl­terminal region of MUC5B was deduced from the sequences of cDNA and genomic clones and was found to contain  approximately 800 amino acids (80). This sequence was enriched with respect to cysteine residues, nearly all of which occurred in identical positions in the carboxyl­ terminal sequences of MUC2 (61), MUC5AC (72,76), and the D4, C1, and extreme C­terminal domain of human von Willebrand factor (120,121). Remarkably, the  positions of exon/intron boundaries in the carboxyl­terminal

  

Page 220

Figure 1 Northern blot analysis of human gallbladder mRNA hybridized with a panel of mucin cDNA probes (A) or with a series of control cDNA probes (B). All of the mucin probes were specific for tandem repeat sequences and all blots were hybridized and washed under identical conditions and exposed to X­ray film  for 18 h. The positions of the 28S and 18S ribosomal RNAs are indicated. These data show that MUC5B and MUC3 transcripts are abundant in gallbladder RNA, with significantly lower levels of MUC5AC and MUC6 RNA and almost undetectable levels of MUC2 and MUC4 RNA. The polydisperse signals observed on these Northern blots are typical of the hybridization patterns usually seen with mucin mRNAs. The reason for this pattern is incompletely understood, but could result from rapid turnover of mucin mRNAs, partial degradation of large mRNAs, alternative splicing or heterogeneity of mRNA species synthesized. (B). Stripping and rehybridization of blots with control probes for 28 S ribosomal RNA (28S), actin or glyceraldehyde 3­phosphate dehydrogenase  (GAPDH) showed a discrete signal in each case, demonstrating the integrity of the RNA preparations used in this study.

regions of MUC5B were nearly identical to those in von Willebrand factor, as were the type of splice junctions (types 0, 1, 2), suggesting that these proteins were  derived from a common ancestral gene. It is widely held that introns were inserted into existing genes late in evolution and that the presence of introns has played a major role in the evolution of mammalian  protein families

  

Page 221

by promoting exon shuffling between genes (122). The shuffling of exons encoding different protein modules has been especially important in the evolution of cell­ surface and ligand­binding proteins (123). Exons encoding these shuffled modules are commonly bordered by type 1 introns at their 5  and 3  ends (124). As in other  mucin genes, the tandem repeat domain of MUC5B is encoded in a single exon, which is separated from the first exon encoding the carboxyl­terminal domain with a  type 1 intron (80,87). This suggests that MUC5B may have been assembled by shuffling of the tandem­repeat exon into a von Willebrand factor­like precursor  molecule. In a broader sense, the mechanism for evolution of mucin genes with distinct tandem­repeat arrays may have involved the insertion and subsequent  duplication of exons encoding tandem repeats into the primordial gene for a mucin­like cell­surface protein. The MUC5B tandem­repeat domain contains 19 separate subdomains of three distinct types (Fig. 2). Subdomains containing the MUC5B 29 amino acid repeats (RI­ RV) and other conserved subdomains (R01,R02) are interrupted by cysteine­rich subdomains containing approximately 100 amino acids (Cys1 to Cys7). The  organization of these sequences results in a pattern that has been referred to as a superrepeat (87) in that the subdomains are organized in manner in which they too  are repeated four times. The amino­terminal region of MUC5B contains 1321 amino acids, and like the carboxyl­terminal region is enriched with respect to cysteine (88). This cysteine­rich  sequence is organized into D1, D2, and D3 domains, similar to those in von Willebrand factor. Interestingly, the degree of sequence identity between the amino­ terminal regions of MUC5B, MUC5AC, and MUC2 is much higher than that between the corresponding carboxyl­terminal regions, suggesting that structural features  required for mucin assembly or function have been conserved. Each of the D domains contains the consensus sequence CGLCG, which resembles the sequence at the  active site of protein disulfide isomerase (125) and is thought to be involved in the self­catalyzed polymerization of von Willebrand factor monomers (126). In addition,  analysis of the D domains showed the presence of a number of structural motifs found on extracellular and ligand­binding proteins and not previously identified in  mammalian mucins. For example, the D3 domain contains consensus motifs for C­type lectin domains, which have been shown to bind calcium, protein ligands, and  carbohydrates (127,128) as well as selectin complement­binding repeats, which mediate the interactions between P­selectin and leukocytes (129). In addition,  sequences similar to low­density­lipoprotein (LDL)receptor class A repeats were identified. These repeats are present on the LDL receptor family proteins megalin  and the  2 macroglobulin and have been shown to bind a variety of ligands including apolipoprotein J, lipoprotein lipase, lactoferrin, calcium, and polycationic drugs  (161).

Figure 2 Schematic of the structural organization of MUC5B. MUC5B is organized into an N­terminal, a  tandem repeat (TR) and a C­terminal region. The N­terminal region contains von Willebrand  factor­like D1, D2 and D3 domains (gray boxes). The TR domain contains alternating cysteine­rich  subdomains (Cys1­Cys7; white boxes) and TR domains (RI­RV; black boxes). Other semi­unique  sequences present in the TR domain are not shown here. The C­terminal region contains a von  Willebrand factor­like D4 domain (gray box) and a cystine knot at the extreme C­terminal end  (hatched box).

  

Page 222

V—  Relationship between Gallbladder Mucin Structure and Function As discussed above, early studies performed with bovine and human gallbladder mucins clearly showed that these molecules are comprised of two distinct domains, a  heavily glycosylated, protease­insensitive domain and a poorly glycosylated protease­sensitive domain, the latter necessary for the binding of biliary lipids and for  promoting cholesterol crystallization. Recent studies on the cloning of both bovine (130) and human gallbladder mucin (80) have identified the structural basis for these  findings. As noted above, both of these mucins contains cysteine­rich sequences that bear some resemblance to the ligand­binding domains on a variety of extracellular  proteins. We have attempted to further define the sequences of the lipid­binding domains on gallbladder mucin with the goal of developing therapeutic modalities that could  prevent the interactions between gallbladder mucin and biliary lipids. In these studies, bovine gallbladder mucin was used as a model system since, despite the  heterogeneity observed in human gallbladder mucin, only one mucin gene product has been identified in the bovine gallbladder. This mucin has an overall structural  organization similar to that of the major human gallbladder mucin, MUC5B, in that it contains alternating glycosylated tandem repeat and cysteine­rich sequences  (130). These cysteine­rich sequences display little similarity to the cysteine­rich sequences in MUC5B, but bear a striking resemblance to the scavenger receptor  cysteine­rich (SRCR) domains found on a number of extracellular ligand binding proteins, including the macrophage scavenger receptor (131), CD5 (132), and CD6  (133). Constructs containing cysteine­rich repeats were expressed in Escherichia coli and the recombinant bovine gallbladder mucin (rGBM) purified. rGBM was shown to  bind cholesterol and hydrophobic dyes in a manner similar to that of native mucin (134). It also accelerated the appearance of cholesterol crystals in a "nucleation" time  assay. These studies show directly that the nonglycosylated regions of gallbladder mucin are responsible for its interactions with biliary lipids. Furthermore, they show  that the formation of a gel is not required for the ability of mucin to bind cholesterol or promote cholesterol crystallization. These studies also demonstrate the feasibility  of using recombinant proteins to investigate the function of individual mucin domains. As noted above, it has been suggested that unlike the secreted, gel­forming mucins MUC5B, MUC5AC, and MUC2, MUC3 may be anchored to the cell membrane  like MUC1 and MUC4 (95). This observation is supported by the identification of immunoreactive MUC3 in intrahepatic bile ducts (119) and suggests that in the  gallbladder, MUC5B and MUC3 in intrahepatic bile ducts (119) and suggests that in the gallbladder, MUC5B and MUC3 may have distinct functions. It is not as yet  possible to separate individual high­molecular­weight mucins from one another due to the overall similarity in their physical properties. Therefore, in order to determine  whether MUC5B, MUC3, and other mucins have unique functions in the gallbladder, recombinant polypeptides containing cysteine­rich domains from these mucins  are currently being examined in lipid­binding and nucleation experiments such as those described above. These studies may show that different mucin gene products  perform different functions in the gallbladder and may provide important insights into the role of these proteins in the pathogenesis of gallstone disease. VI—  Expression of Mucin Genes in Gallstone Disease Histological and histochemical examination of gallbladder tissue from patients with cholesterol gallstones consistently shows changes in both the morphological  appearance of the gallbladder epithelium and in the staining pattern of gallbladder mucins (111,112). Intestinal­type metaplasia with increased numbers of goblet cells  has been correlated with increased staining for nonsulfated acid mucin and neutral mucin. Gastric metaplasia has also been noted in some specimens with the  appearance of antral­type glands and gastric­type epithelium and alterations

  

Page 223

in the mucin staining pattern. In animal models of gallstone disease, similar changes in the histochemical properties of hypersecreted mucin have been identified.  Gallbladders removed from cholesterol­fed ground squirrels demonstrated a reduction in the percentage of sialic acid­containing mucins when compared with control  gallbladders (22). While it is not possible to correlate the histochemical staining pattern with the presence of a particular mucin gene product, studies in both humans  and animals suggest that alterations in mucin gene expression, perhaps associated with inflammatory or metaplastic changes, occur in cholesterol gallstone disease. We have recently attempted to investigate this question by comparing the pattern of mucin gene expression in control gallbladders and in gallbladder specimens  obtained at cholecystectomy from patients with cholesterol gallstone disease. RNA transcripts for MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, and MUC6 were  measured in slot­blot experiments and by reverse transcriplase polymerase chain reaction (RT­PCR). When normalized to actin mRNA expression, levels of MUC3  and MUC5B were significantly increased in gallstone patients, whereas levels of the other mucin mRNAs were unchanged (135). Similar increases in the level of  MUC5B and MUC3 transcripts in gallstone patients were also noted by Kano and collaborators who showed in addition, that MUC2 and MUC6 mRNA levels were  also increased (136). These studies suggest that changes in the relative expression of mucin genes does occur in patients with cholesterol gallstones, although it is not  possible to identify any one gene product as the "lithogenic" mucin. VII—  Regulation of Mucin Secretion As noted above, mucin hypersecretion precedes gallstone formation in a number of animal models and increased mucin levels have been found in gallbladder tissue  and bile from patients with cholesterol gallstone disease. The mediators and intracellular signaling pathways leading to increased mucin secretion remain unclear, but  several potential mechanisms are discussed below. In the prairie dog, the profound increase in mucin secretion resulting from cholesterol feeding can be prevented by ligation of the cystic duct (17), suggesting that the  stimulus for mucin hypersecretion is carried to the gallbladder in hepatic bile. Whether cholesterol supersaturation of bile is the stimulus or whether other substances  are released into the bile by the liver in response to cholesterol feeding is not known, but similar studies in the ground squirrel suggest that this response is rapid and  occurs within hours of cholesterol feeding (21,22). A—  Prostaglandins It is possible that cholesterol­supersaturated bile induces a local inflammatory response in the gallbladder epithelium. Proinflammatory substances such as  prostaglandins have been shown to mediate mucin secretion in both the gallbladder and other mucin­secreting tissues such as the stomach and trachea (137,138).  Administration of aspirin to cholesterol­fed prairie dogs (139) and ground squirrels (22) prevented mucin hypersecretion and stone formation, suggesting that  increased prostaglandin synthesis by the gallbladder might mediate mucin secretion. In the prairie dog, increases in gallbladder prostaglandin levels in response to  cholesterol feeding were found to precede the hypersecretion of gallbladder mucin (140), and exogenous arachidonic acid has been shown to increase mucin secretion  in prairie dog gallbladder explants (141). In another study, intraperitoneal treatment of guinea pigs with prostaglandin E2 (PGE2) also led to a significant increase in  mucin secretion despite the fact that these animals were fed a control diet and did not develop cholesterol­supersaturated bile (142). Finally, using cultured dog  gallbladder epithelial cells, Kuver and colleagues demonstrated that prostaglandins and other substances that increased the level of intracellular cAMP resulted in  increased secretion of mucin (143). Despite this considerable body of evidence, the effect of prostaglandins

  

Page 224

on mucin secretion remains controversial, since additional studies have shown that prostaglandins had no effect on mucin secretion in both prairie dogs and hamsters  (144,145). Less is known about the effect of prostaglandins on human gallbladder mucin secretion. We have demonstrated increased levels of mucin secretion in a human  gallbladder epithelial cell line treated with PGE2 (146). In addition, treatment of human gallbladder explants with aspirin was shown to result in an inhibition of mucin  synthesis (147). The latter result led to a series of clinical studies in which nonsteroidal anti­inflammatory drugs (NSAIDs) were administered to patients prior to  cholecystectomy (148), to high­risk patients on rapid­weight­reducing diets (149), and to patients after gallstone dissolution therapy (150). Again, the results of these  studies have not established a conclusive link between NSAID use and inhibition of mucin secretion or gallstone formation (151,152), although there is some evidence  for a reduction in gallbladder mucin secretion in patients with a history of chronic NSAID use (25). B—  Other Mediators Other biliary constituents that have been suggested to contribute to the mucin secretory response are lysophosphatidylcholine (LPC), the proinflammatory cytokine  tumor necrosis factor­alpha (TNF­ ), and increased concentrations of free bile acids. In the cholesterol­fed prairie dog, LPC levels in the gallbladder increased prior  to the hypersecretion of mucin and stone formation and LPC was shown to stimulate mucin release in guinea pig gallbladder explants (140). We and others have  shown that treatment of gallbladder epithelial cells with TNF­  leads to an increase in mucin secretion (153,154). This cytokine has been identified in both gallbladder  and hepatic bile (155) although its origin and mechanism of secretion remain unknown. Similar effects of TNF­  on mucin secretion have been observed in tracheal  epithelial cells (156,157). A series of studies performed with cultured dog gallbladder epithelial cells has shown that bile salts stimulate mucin secretion (158,159) in a manner independent of the  detergent effects of the bile salts on the cell membrane. A more recent study with primary cultures of human gallbladder epithelial cells has also shown a bile­salt  stimulated increase in mucin secretion, which appears to act by increasing the level of intracellular calcium through activation of calcium/calmodulin kinase II (160). The  latter study also demonstrated the involvement of the protein kinase C (PKC) pathway in mediating mucin secretion in response to substances such as phorbol esters.  Interestingly, these authors found no significant stimulation in mucin secretion in response to activation of protein kinase A (PKA) by increased intracellular levels of  cAMP which would be generated by mediators such as prostaglandins, vasoactive intestinal peptide (VIP), and secretin. It has also been suggested that increased concentrations of cholesterol itself may alter the fluidity of gallbladder epithelial cell membranes leading to a secretory  response, perhaps through the generation of NO, a known mucin secretogogue in other tissues (157,162). This effect would be analogous to the generation of NO in  vascular endothelial cells in patients with hypercholesterolemia. It is of interest in this regard that iNOS has recently been identified in human gallbladder epithelial cells  (163). VIII—  Regulation of Mucin Gene Expression in the Gallbladder There are several levels at which mediators such as those described above could lead to increased secretion of gallbladder mucin. At one level, these mediators could  act as a stimulus for the release of stored mucin secretory granules. They could also initiate a signal­transduction cascade leading to increased transcription of mucin  genes or could act at the posttranscriptional level by influencing factors such as mRNA stability. At present, nothing is known about the

  

Page 225

effects of mucin secretagogues on rates of transcription and steady­state levels of individual gallbladder mucin mRNAs. The availability of the MUC5B gene promoter  (88) will allow us to begin to elucidate the pathways by which different mediators activate specific transcription factors and to identify the sequence elements to which  these factors bind. It is clear that a detailed understanding of how each of the gallbladder mucin genes is regulated is critical to an understanding of the role of these  important proteins in the healthy and diseased gallbladder. In future, this information could lead to the development of pharmaceuticals that could selectively modulate  transcription of mucin genes and prevent the formation of cholesterol gallstones in susceptible individuals. Acknowledgment Supported in part by grant DK44619 from the National Institutes of Health. References 1. Strous G, Dekker J. Mucin­type glycoproteins. Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27:57–92. 2. Gum JR. Mucin genes and the proteins they encode. Am J Respir Cell Mol Biol 1992; 7:557–564. 3. Gendler SJ, Spicer AP. Epithelial mucin genes. Annu Rev Physiol 1995; 57:607–634. 4. Amerongen AN, Bolscher JGM, Bloemena E, Veerman ECI. Sulfomucins in the human body. Biol Chem 1998; 379:1–18. 5. Sheehan JKK, Oates K, Carlstedt I. Electron microscopy of cervical, gastric and bronchial mucus glycoproteins. Biochem J 1986; 239:147–153. 6. Allen A. Mucus glycoproteins of the normal gastrointestinal tract. Eur J Gastroenterol Hepatol 1993; 5:193–199. 7. Snary D, Allen A, Pain RH. Structural studies on gastric mucus glycoproteins; lowering of molecular weights after eduction with 2­mercaptoethanol. Biochem  Biophys Res Comm 1970; 40:844–850. 8. Sellers LA, Allen A, Morris ER, Ross­Murphy SB. Mucus glycoprotein gels: role of glycoprotein polymeric structure and carbohydrate side chains in gel formation.  Carbo Res 1988; 178:93–110. 9. Devine PL, McKenzie IFC. Mucins: Structure, function, and associations with malignancy. Bioessays 1992; 14:619–625. 10. Carey MC. Pathogenesis of gallstones. Am J Surg 1993; 165:410–419. 11. Carey MC, Lamont JT. Cholesterol gallstone formation: 1. Physical chemistry of bile and biliary lipid secretion. Prog Liver Dis 1992; 10:139–163. 12. Womack NA, Zeppa R, Irvin GL. The anatomy of gallstones. Ann Surg 1963; 157:670–686. 13. Maki T, Matsushiro T, Suzuki N, Nakamura N. Role of sulfated glycoprotein in gallstone formation. Surg Gynecol Obstet 1971; 132:846–854. 14. Lee SP, Lim TH, Scott AJ. Carbohydrate moities of glycoproteins in human ehpatic and gallbladder bile, gallbladder mucosa and gallstones. Clin Sci 1979;  56:533–538. 15. Smith BF, LaMont JT. Identification of gallbladder mucin­bilirubin complex in human cholesterol gallstone matrix: effects of reducing agents on in vitro dissolution  of matrix and intact gallstones. J Clin Invest 1985; 76:439–445. 16. Lechene de la Porte P, Domingo N, vanWijland M, Groen AK, Ostrow JD, Lafont H. Distinct immuno­localization of mucin and other biliary proteins in human  cholesterol gallstones. J Hepatol 1996; 25:339–348.

  

Page 226

17. Lee SP, LaMont JT, Carey MC. Role of gallbladder mucus hypersecretion in the evolution of cholesterol gallstones. J Clin Invest 1981; 67:1712–1723. 18. Lee SP. Hypersecretion of mucus glycoprotein by the gallbladder epithelium in experimental cholelithiasis. J Pathol 1981; 134:199–207. 19. Lee SP, Scott AJ. The evolution of morphologic changes in the gallbladder before stone formation in mice fed a cholesterol­cholic acid diet. Am J Pathol 1982;  108:1–8. 20. Malet PF, Deng SQ, Soloway RD. Gallbladder mucin and cholesterol and pigment gallstone formation in hamsters. Scand J Gastroenterol 1989; 24:1055–1060. 21. Pemsingh RS, MacPherson BR, Scott GW. Mucus hypersecretion in the gallbladder epithelium of ground squirrels fed a lithogenic diet. Hepatology 1987;  7:1267–1271. 22. MacPherson BR, Pemsingh RS. Ground squirrel model for cholelithiasis: role of epithelial glycoproteins. Microsc Res Tech 1997; 39:39–55. 23. Bouchier IAD, Cooperband SR, Kodsi BM. Mucous substances and viscosity of normal and pathological human bile. Gastroenterology 1965; 49:343–353. 24. Mingrone G, Greco AV, Finotti E, Passi S. Free fatty acids: a stimulus for mucin hypersecretion in cholesterol gallstone biles. Biochim Biophys Acta 1988;  958:52–59. 25. Sterling RK, Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore EW. Effect of NSAIDs on gallbladder bile composition. Dig Dis Sci 1995; 40:2220–2226. 26. Swobodnik W, Wenk H, Janowitz P, Hagert N, Kratzer W, Berghold J, Zhang Y, Bittner R, Schusdziarra V, Ott R, Kuhn K, Classen M. Total biliary protein,  mucus glycoproteins, cyclic AMP, and apolipoproteins in the gallbladder bile of patients with cholesterol stones and stone­free controls. Scand J Gastroenterol 1991;  26:771–778. 27. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Changes in gallbladder bile composition following gallstone formation and weight reduction.  Gastroenterology 1992; 103:214–221. 28. Shiffman ML, Shamburek RD, Schwartz CC, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Gallbladder mucin, arachidonic acid, and bile lipids in patients who develop  gallstones during weight reduction. Gastroenterology 1993; 105:1200–1208. 29. Hulten O. Formation of gallstones. II. Acta Chir Scand 1968; 134:557–561. 30. Hulten O. Formation of gallstones I. Acta Chir Scand 1968; 134:125–130. 31. Lee SP. Pathogenesis of biliary sludge. Hepatology 1990; 12:200S–203S; discussion, 203S–205S. 32. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1988; 95:508–523. 33. Gilloteaux J, Karkare S, Don AQ, Sexton RC. Cholelithiasis induced in the Syrian hamster: evidence for an intramucinous nucleating process and down regulation  of cholesterol 7 alpha­hydroxylase (CYP7) gene by medroxyprogesterone. Microsc Res Tech 1997; 39:56–70. 34. Henisch HK. Crystal Growth in Gels. University Park, PA: Pennsylvania State University, 1970. 35. Levy PF, Smith BF, LaMont JT. Human gallbladder mucin accelerates nucleation of cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87:270–275. 36. Smith BF. Human gallbladder mucin binds biliary lipids and promotes cholesterol crystal nucleation in model bile. J Lipid Res 1987; 28:1088–1097. 37. Gallinger SA, Taylor RD, Harvey PR, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of mucous glycoprotein on nucleation time of human bile. Gastroenterology 1985;  89:648–658. 38. Smith BF, LaMont JT. Bovine gallbladder mucin binds bilirubin in vitro. Gastroenterology 1983; 85:707–712. 39. Smith BF, LaMont JT. Hydrophobic binding properties of bovine gallbladder mucin. J Biol Chem 1984; 259:12170–12177. 40. Afdhal NH, Niu N, Gantz D, Small DM, Smith BF. Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrate crystal growth in model bile. Gastroenterology  1993; 104:1515–1523. 41. Seregni E, Botti C, Massaron S, Lombardo C, Capobianco A, Bogni A, Bombardieri E. Structure, function and gene expression of epithelial mucins. Tumori  1997; 83:625–632.

  

Page 227

42. Van Klinken BJW, Dekker J, Buller HA, Einerhand AWC. Mucin gene­structure and expression: protection: protection vs. adhesion. Am J Physiol 1995;  269:G613–G627. 43. Gendler SJ, Spicer AP, Lalani EN, Duhig T, Peat N, Burchell J, Pemberton L, Boshell M, Taylor­Papadimitriou J. Structure and biology of a carcinoma­ associated mucin, MUC1. Am Rev Respir Dis 1991; 144:S42–S47. 44. Ho SB, Niehans GA, Lyftogt C, Yan PS, Cherwitz DL, Gum ET, Dahiya R, Kim YS. Heterogeneity of mucin gene expression in normal and neoplastic tissues.  Cancer Res 1993; 53:641–651. 45. Gendler SJ, Burchell JM, Duhig T, Lamport D, White R, Parker M, Taylor­Papadimitriou J. Cloning of partial cDNA encoding differentiation and tumor­ associated mucin glycoproteins expressed by human mammary epithelium. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:6060–6064. 46. Lan MS, Bhatra SK, Qi W, Metzgar RS, Hollingsworth MA. Cloning and sequencing of a human pancreatic tumor mucin cDNA. J Biol Chem 1990;  265:15294–15299. 47. Gendler SJ, Lancaster CA, Taylor­Papadimitriou J, Duhig T, Peat N, Burchell J, Pemberton L, Lalani E, Wilson D. Molecular cloning and expression of the  human tumor­associated polymorphic epithelial mucin, PEM. J Biol Chem 1990; 265:15286–15293. 48. Pemberton L, Taylor­Papadimitriou J, Gendler SJ. Antibodies to the cytoplasmic domain of the MUC1 mucin show conservation throughout mammals. Biochem  Biophys Res Commun 1992; 185:167–175. 49. Ligtenberg MJL, Vos HL, Gennissen AMC, Hilkens J. Episialin, a carcinoma­associated mucin, is generated by a polymorphic gene encoding splice variants with  alternative amino­termini. J Biol Chem 1990; 5573–5578. 50. Ligtenberg MJ, Gennissen AM, Vos HL, Hilkens J. A single nucleotide polymorphism in an exon dictates allele dependent differential splicing of episialin mRNA.  Nucleic Acids Res 1991; 19:297–301. 51. Boshell M, Lalani EN, Pemberton L, Burchell J, Gendler S, Taylor­Papadimitriou J. The product of the human MUC1 gene when secreted by mouse cells  transfected with the full­length cDNA lacks the cytoplasmic tail. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185:1–8. 52. Litvinov SV, Hilkens J. The epithelial sialomucin, episialin, is sialylated during recycling. J Biol Chem 1993; 268:21364–21371. 53. Ligtenberg MJL, Buijs F, Vos HL, Hilkens J. Suppression of cellular aggregation by high levels of episialin. Cancer Res 1992; 52:2318–2324. 54. van de Wiel­van Kemenade E, Ligtenberg MJ, de Boer AJ, Buijs F, Vos HL, Melief CJ, Hilkens J, Figdor CG. Episialin (MUC1) inhibits cytotoxic lymphocyte­ target cell interaction. J Immunol 1993; 151:767–776. 55. Wesseling J, Van der Valk SW, Vos HL, Sonnenberg A, Hilkens J. Episialin (MUC1) overexpression inhibits integrin­mediated cell adhesion to extracellular  matrix components. J Cell Biol 1995; 129:255–265. 56. Pigny P, Guyonnet­Duperat V, Hill AS, Pratt WS, Galliegue­Zoutitina S, h'Hooge MC, Laine A, Van­Seuningen I, Degand P, Gum JR, Kim YS, Swallow DM,  Aubert JP, Porchet N. Human mucin genes assigned to 11p15.5: identification and organization of a cluster of genes. Genomics 1996; 38:340–352. 57. Desseyn JL, Buisine MP, Porchet N, Aubert JP, Degand P, Laine A. Evolutionary history of the 11p15 human mucin gene family. J Mol Evol 1998; 46:102–106. 58. Gum JR, Byrd JC, Hicks JW, Toribara NW, Lamport DTA, Kim YS. Molecular cloning of human intestinal mucin cDNAs. J Biol Chem 1989; 264:6480–6487. 59. Audie JP, Janin A, Porchet N, Copin C, Gosselin B, Aubert JP. Expression of human mucin genes in the respiratory, digestive and reproductive tracts ascertained  by in situ hybridization. J Histochem Cytochem 1993; 41:1479–1485. 60. Chang SK, Dohrman AF, Basbaum CB, et al. Localization of mucin (MUC2 and MUC3) messenger RNA and peptide expression in human normal intestine and  colon cancer. Gastroenterology 1994; 107:28–36.

  

Page 228

61. Gum JR Jr, Hicks JW, Toribara NW, Rothe EM, Lagace RE, Kim YS. The human MUC2 intestinal mucin has cysteine­rich subdomains located both upstream  and downstream of its central repetitive region. J Biol Chem 1992; 267:21375–21383. 62. Gum JR Jr, Hicks JW, Toribara NW, Siddiki B, Kim YS. Molecular cloning of human intestinal mucin (MUC2) cDNA: identification of the amino terminus and  overall sequence similarity to prepro­von Willebrand factor. J Biol Chem 1994; 269:2440–2446. 63. Sadler JE. Biochemistry and genetics of von Willebrand factor. Annu Rev Biochem 1998; 67:395–424. 64. Sadler JE, Shelton­Inloes BB, Sorace JM, Titani K. Cloning of cDNA and genomic DNA for human von Willebrand factor. Cold Spring Harb Symp Quant Biol  1986; 51:515–523. 65. Sun PD, Davis DR. The cystine­knot growth factor superfamily. Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995; 24:269–291. 66. Meitinger T, Meindl A, Bork P, Rost B, Sander C, Haasemann M, Murken J. Molecular modeling of the Norrie disease protein predicts a cystine knot growth  factor tertiary structure. Nature Genet 1993; 5:376–380. 67. Voorberg J, Fontijn R, Calafat J, Janssen H, van Mourik JA, Panekoek H. Assembly and routing of von Willebrand factor variants: the requirements for disulfide­ linked dimerization reside within the carboxy­terminal 151 amino acids. J Cell Biol 1991; 113:195–205. 68. Perez­Vilar J, Hill RL. The carboxyl­terminal 90 residues of porcine submaxillary mucin are sufficient for forming disulfide­bonded dimers. J Biol Chem 1998;  273:6982–6988. 69. Aubert JP, Porchet N, Crepin M, Duterque­Coquilland M, Vergnes G, Mazzuca M, Debuire B, Petiprez D, Degand D. Evidence for different human  tracheobronchial mucin peptides deduced from nucleotide cDNA sequences. Am J Respir Cell Mol Biol 1991; 5:178–185. 70. Ho SB, Roberton AM, Shekels LL, Lyftogt CT, Niehans GA, Toribara NW. Expression cloning of gastric mucin complementary DNA and localization of mucin  gene expression. Gastroenterology 1995; 109:735–747. 71. Inatomi T, Spurr­Michaud S, Tisdale AS, Zhan Q, Feldman ST, Gipson IK. Expression of secretory mucin genes by human conjunctival epithelia. Invest  Ophthalmol Vis Sci 1996; 37:1684–1692. 72. Meerzaman D, Charles P, Daskal E, Polymeropoulos MH, Martin BM, Rose MC. Cloning and analysis of cDNA encoding a major airway glycoprotein, human  tracheobronchial mucin (MUC5). J Biol Chem 1994; 269:12932–12939. 73. Guyonnet Duperat V, Audie JP, Debailleul V, Laine A, Buisine MP, Galiegue­Zouitina S, Pigny P, Degand P, Aubert JP, Porchet N. Characterization of the  human mucin gene MUC5AC: a consensus cysteine­rich domain for 11p15 mucin genes? Biochem J 1995; 305:211–219. 74. van de Bovenkamp JH, Hau CM, Strous GJ, Buller HA, Dekker J, Einerhand AW. Molecular cloning of human gastric mucin MUC5AC reveals conserved  cysteine­rich D­domains and a putative leucine zipper motif. Biochem Biophys Res Commun 1998; 245:853–859. 75. Li D, Gallup M, Fan N, Szymkowski DE, Basbaum CB. Cloning of the amino­terminal and 5 ­flanking region of the human MUC5AC mucin gene and  transcriptional upregulation by bacterial exoproducts. J Biol Chem 1998; 273:6812–6820. 76. Lesuffleur T, Roche F, Hill AS, Lacasa M, Fox M, Swallow DM, Zweibaum A, Real FX. Characterization of a mucin cDNA clone isolated from HT­29 mucus­ secreting cells: the 3  end of MUC5AC? J Biol Chem 1995; 270:13665–33673. 77. Buisine MP, Desseyn JL, Porchet N, Degand P, Laine A, Aubert JP. Genomic organization of the 3 ­region of the human MUC5AC mucin gene: additional  evidence for a common ancestral gene for the 11p15.5 mucin gene family. Biochem J 1998; 332:729–738.

  

Page 229

78. Dufosse J, Porchet N, Audie JP, Guyonnet­Duperat V, Laine A, Van Seuningen I, Marrakchi S, Degand P, Aubert JP. Degenetate 87 base pair tandem repeats  create hydrophilic/hydrophobic alternating domains in human mucin peptides mapped to 11p15. Biochem J 1993; 293:329–337. 79. Sharma P, Dudus L, Nielsen PA, Clausen H, Yankasas JR, Hollingsworth MA, Englehardt JF. MUC5B and MUC7 are differentially expressed in mucous and  serous cells of submucosal glands in human bronchial airways. Am J Respir Cell Mol Biol 1998; 19: 30–37. 80. Keates AC, Nunes DP, Afdhal NH, Troxler RF, Offner GD. Molecular cloning of a major human gall bladder mucin: complete C­terminal sequence and genomic  organization of MUC5B. Biochem J 1997; 324:295–303. 81. Gipson IK, Spurr­Michaud S, Moccia R, Zhan Q, Toribara N, Ho SB, Gargiulo AR, Hill JA. MUC4 and MUC5B transcripts are the prevalent mucin messenger  ribonucleic acids of the human endocervix. Biol Reprod 1999; 60:58–64. 82. Gipson IK, Ho SB, Spurr­Michaud SJ, Tisdale AS, Zhan Q, Torlakovic E, Pudney J, Anderson DJ, Toribara NW, Hill JA. Mucin genes expressed by human  female reproductive tract epithelia. Biol Reprod 1997; 56:999–1011. 83. van Klinken BJ, Dekker J, van Gool SA, van Marle J, Buller HA, Einerhand AW. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a  subset of colonic goblet cells. Am J Physiol 1998; 274:G871–G878. 84. Troxler RF, Iontcheva I, Oppenheim FG, Nunes DP, Offner GD. Molecular characterization of a major high molecular weight mucin from human sublingual gland.  Glycobiology 1997; 7:965–973. 85. Troxler RF, Offner GD, Zhang F, Iontcheva I, Oppenheim FG. Molecular cloning of a novel high molecular weight mucin (MG1) from human sublingual gland.  Biochem Biophys Res Commun 1995; 217:1112–1119. 86. Nielsen PA, Bennett EP, Wandall HH, Therkildsen MH, Hannibal J, Clausen H. Identification of a major human high molecular weight salivary mucin (MG1) as  tracheobronchial mucin MUC5B. Glycobiology 1997; 7:413–419. 87. Desseyn JL, Guyonnet­Duperat V, Porchet N, Aubert JP, Laine A. Human mucin gene MUC5B, the 10.7­kb large central exon encodes various alternate  subdomains resulting in a super­repeat: structural evidence for a 11p15.5 gene family. J Biol Chem 1997; 272:3168–3178. 88. Offner GD, Nunes DP, Keates AC, Afdhal NH, Troxler RF. The amino­terminal sequence of MUC5B contains conserved multifunctional D domains:  implications for tissue­specific mucin functions Biochem Biophys Res Commun 1998; 251:350–355. 89. Desseyn JL, Aubert JP, Van Seuningen I, Porchet N, Laine A. Genomic organization of the 3  region of the human mucin gene MUC5B. J Biol Chem 1997;  272:16873–16883. 90. Desseyn JL, Buisine MP, Porchet N, Aubert JP, Laine A. Genomic organization of the human mucin gene MUC5B. cDNA and genomic sequences upstream of  the large central exon. J Biol Chem 1998; 273:30157–30164. 91. Toribara NW, Roberton AM, Ho SB, Kuo WL, Gum E, Hicks JW, Gum JR, Byrd JC, Siddiki B, Kim YS. Human gastric mucin: identification of a unique  species by expression cloning. J Biol Chem 1993; 268:5879–5885. 92. Toribara NW, Ho SB, Gum E, Gum JR Jr, Lau P, Kim YS. The carboxyl­terminal sequence of the human secretory mucin, MUC6: analysis of the primary amino  acid sequence. J Biol Chem 1997; 272:16398–16403. 93. Gum JR, Hicks JW, Swallow DM, Lagace RL, Byrd JC, Lamport DTA, Siddiki B, Kim YS. Molecular cloning of cDNAs derived from a novel human intestinal  mucin gene. Biochem Biophys Res Commun 1990; 171:407–415. 94. Fox MF, Lahbib F, Pratt W, Attwood J, Gum J, Kim Y, Swallow DM. Regional localization of the intestinal mucin gene MUC3 to chromosome 7q22. Ann Hum  Genet 1992; 56:281–287.

  

Page 230

95. Gum JR Jr, Ho JJL, Pratt WS, Hicks JW, Hill AS, Vinall LE, Roberton AM, Swallow DM, Kim YS. MUC3 human intestinal mucin: analysis of gene structure,  the carboxyl terminus, and a novel upstream repetitive region. J Biol Chem 1997; 272:26678–26686. 96. Van Klinken BJ, Van Dijken TC, Oussoren E, Buller HA, Dekker J, Einerhand AW. Molecular cloning of human MUC3 cDNA reveals a novel 59 amino acid  tandem repeat region. Biochem Biophys Res Commun 1997; 238:143–148. 97. Shekels LL, Hunninghake DA, Tisdale AS, Gipson IK, Kieliszewski M, Kozak CA, Ho SB. Cloning and characterization of mouse intestinal MUC3 mucin: 3   sequence contains epidermal­growth­factor­like domains. Biochem J 1998; 330:1301–1308. 98. Khatri IA, Forstner GG, Forstner JF. The carboxyl­terminal sequence of rat intestinal mucin RMuc3 contains a putative transmembrane region and two EGF­like  motifs. Biochim Biophys Acta 1997; 1326:7–11. 99. Porchet N, Nguyen VC, Dufosse J, Audie JP, Guyonnet­Duperat V, Gross MS, Denis C, Degand P, Bernheim A, Aubert JP. Molecular cloning and  chromosomal localization of a novel human tracheobronchial mucin cDNA containing tandemly repeated sequences of 48 base pairs. Biochem Biophys Res Commun  1991; 175:414–422. 100. Liu B, Offner GD, Nunes DP, Oppenheim FG, Troxler RF. MUC4 is a major component of salivary mucin MG1 secreted by the human submandibular gland.  Biochem Biophys Res Commun 1998; 250:757–761. 101. Gross MS, Guyonnet­Duperat V, Porchet N, Bernheim A, Aubert JP, Nguyen VC. Mucin 4 (MUC4) gene: regional assignment (3q29) and RFLP analysis.  Ann Genet 1992; 35:21–26. 102. Nollet S, Moniaux N, Maury J, Petiprez D, Degand P, Laine A, Porchet N, Aubert JP. Human mucin gene MUC4: organization of its 5'­region and  polymorphism of its central tandem repeat array. Biochem J 1998; 322:739–748. 103. Moniaux N, Nollet S, Porchet N, Degand P, Laine A, Aubert JP. Complete sequence of the human mucin MUC4: a putative cell membrane­associated mucin.  Biochem J 1999; 338:325–333. 104. Wu K, Fregien N, Carraway KL. Molecular cloning and sequencing of the mucin subunit of a heterodimeric, bifunctional cell surface glycoprotein complex of  ascites rat mammary adenocarcinoma cells. J Biol Chem 1994; 269:11950–11955. 105. Sherblom AP, Carraway KL. A complex of two cell surface glycoproteins from ascites mammary adenocarcinoma cells. J Biol Chem 1980; 255:12051–12059. 106. Bobek LA, Tsai H, Biesbrock AR, Levine MJ. Molecular cloning, sequence, and specificity of expression of the gene encoding the low molecular weight human  salivary mucin (MUC7). J Biol Chem 1993; 268:20563–20569. 107. Bobek LA, Liu J, Sait SN, Shows TB, Bobek YA, Levine MJ. Structure and chromosomal localization of the human salivary mucin gene, MUC7. Genomics  1996; 31:277–282. 108. Biesbrock AR, Bobek LA, Levine MJ. MUC7 gene expression and genetic polymorphism. Glycoconj J 1997; 14:415–422. 109. Shankar V, Pichan P, Eddy RL Jr, Tonk V, Nowak N, Sait SN, Shows TB, Schultz RE, Gotway G, Elkins RC, Gilmore MS, Sachdev GP. Chromosomal  localizatioin of a human mucin gene (MUC8) and cloning of the cDNA corresponding to the carboxy terminus. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16:232–241. 110. Shankar V, Gilmore MS, Elkins RC, Sachdev GP. A novel human airway mucin cDNA encodes a protein with unique tandem repeat organization. Biochem J  1994; 300:295–298. 111. Madrid JF, Hernandez F, Ballesta J. Characterization of glycoproteins in the epithelial cells of human and other mammalian gallbladder: a review. Microsc Res  Tech 1997; 38: 616–630. 112. Laitio M. Morphology and histochemistry of non­tumorous gallbladder epithelium. Pathol Res Pract 1980; 167:335–345.

  

Page 231

113. Frierson HF. The gross anatomy and histology of the gallbladder, extrahepatic bile ducts, valerian system and minor papilla. Am J Surg Pathol 1989; 13:146– 162. 114. Esterly JR, Spicer SS. Mucin histochemistry of human gallbladder: changes in adenocarcinoma, cystic fibrosis and cholecystitis. J Natl Cancer Inst 1968; 40:1– 11. 115. Klinkspoor JH, van Wijland MJ, Koeleman CA, van Dijk W, Tytgat GN, Groen AK. Heterogeneity of human biliary mucin: functional implications. Clin Sci  1994; 86:75–82. 116. Jany BH, Gallup MW, Yan PS, Gum JR, Kim YS, Basbaum CR. Human bronchus and intestine express the same mucin gene. J Clin Invest 1991; 87:77–82. 117. Carrato C, Balague C, de Bolos C, Gonzalez E, Gambus G, Planas J, Perini JM, Andreu D, Real FX. Differential apomucin expression in normal and neoplastic  human gastrointestinal tissues. Gastroenterology 1994; 107:160–172. 118. Campion JP, Porchet N, Aubert JP, L'Helgoualc'h A, Clement B. UW­preservation of cultured human gallbladder epithelial cells: phenotypic alterations and  differential mucin gene expression in the presence of bile. Hepatology 1995; 21:223–231. 119. Vandenhaute B, Buisine MP, Debailleul V, Clement B, Moniaux N, Dieu MC, Degand P, Porchet N, Aubert JP. Mucin gene expression in biliary epithelial cells.  J Hepatol 1997; 27:1057–1066. 120. Shelton­Inloes BB, Titani K, Sadler JE. cDNA sequences for human von Willebrand factor reveal five types of repeated domains and five possible protein  sequence polymorphisms. Biochemistry 1986; 25:3164–3171. 121. Titani K, Kumar S, Takio K, Ericsson LH, Wade RD, Ashida K, Walsh KA, Chopek MW, Sadler JE, Fukikawa K. Amino acid sequence of human von  Willebrand factor. Biochemistry 1986; 25:3171–3184. 122. Rogers JH. The role of introns in evolution. FEBS Lett 1990; 268:339–343. 123. Baron M, Norman DG, Campbell ID. Protein modules. Trends Biochem Sci 1991; 16:13–17. 124. Patthy L. Intron­dependent evolution: preferred types of exons and introns. FEBS Lett 1987; 214:1–7. 125. Mayadas TN, Wagner DD. Vicinal cysteines in the prosequence play a role in von Willebrand factor multimer assembly. Proc Natl Acad Sci USA 1992;  89:3531–3535. 126. Dong Z, Thoma RS, Crimmins DL, McCourt DW, Tuley EA, Sadler JE. Disulfide bonds required to assemble functional von Willebrand factor multimers. J Biol  Chem 1994; 269:6753–6758. 127. Aspberg A, Miura R, Bourdoulous S, Shimonaka M, Heinegard D, Schachner M, Ruoslahti E, Yamaguchi Y. The C­type lectin domains of lecticans, a family of  aggregating chondroitin sulfate proteoglycans, bind tenascin­R by protein­protein interactions independent of carbohydrate moiety. Proc Natl Acad Sci USA 1997;  94:10116–10121. 128. Hosoi T, Imai Y, Irimura T. Coordinated binding of sugar, calcium, and antibody to macrophage C­type lectin. Glycobiology 1998; 8:791–798. 129. Ruchaud­Sparagano MH, Malaud E, Gayet O, Chignier E, Buckland R, McGregor JL. Mapping the epitope of a functional P­selectin monoclonal anibody  (LYP20) to a short complement­like repeat (SCR 4) domain: use of human­mouse chimaera and homologue­replacement mutagenesis. Biochem J 1998; 332:309– 314. 130. Nunes DP, Keates AC, Afdhal NH, Offner GD. Bovine gall­bladder mucin contains two distinct tandem repeating sequences: evidence for scavenger receptor  cysteine­rich repeats. Biochem J 1995; 310:41–48. 131. Kodama T, Freeman M, Rohrer L, Zabrecky J, Matsudaira P, Krieger M. Type I macrophage scavenger receptor contains  ­helical and collagen­like coiled  coils. Nature 1990; 343:531–535. 132. Jones NH, Clabby ML, Dialynas DP, Huang HS, Herzenberg LA, Strominger JL. Isolation of complementary DNA clones encoding the human lymphocyte  glycoprotein T1/Leu­1. Nature 1986; 323:346–349.

  

Page 232

133. Aruffo A, Melnick MB, Linsley PS, Seed B. The lymphocyte glycoprotein CD6 contains a repeated domain structure characteristic of a new family of cell  surface and secreted proteins. J Exp Med 1991; 174:949–952. 134. Nunes DP, Afdhal NH, Offner GD. A recombinant bovine gallbladder mucin polypeptide binds biliary lipids and accelerates cholesterol crystal appearance time.  Gastroenterology 1999; 116:936–942. 135. Ofner GD, Nunes DP, Zhang F, McAneny DB, Afdhal NH. Alterations in gallbladder mucin gene expression in patients with cholesterol gallstones.  Gastroenterology 1996; 110:A1282. 136. Kano M, Shoda J, Irimura T, Ueda T, Iwasaki R, Urasaki T, Kawauchi Y, Asano T, Matsuzaki Y, Tanaka N. Effects of long­term ursodeoxycholate  administration on expression levels of secretory low­molecular­weight phospholipases A2 and mucin genes in gallbladders and biliary composition in patients with  multiple cholesterol stones. Hepatology 1998; 28:302–313. 137. McCool DJ, Marcon MA, Forstner JF, Forsmer GG. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to  various secretagogues. Biochem J 1990; 267:491–500. 138. Forstner G, Zhang Y, McCool D, Forstner J. Mucin secretion by T84 cells: stimulation by PKC, Ca2+, and a protein kinase activated by Ca2+ ionophore. Am J  Physiol 1993, 264:G1096–G1102. 139. Lee SP, Carey MC, LaMont JT. Aspirin prevention of cholesterol gallstone formation in prairie dogs. Science 1981; 211:1429–1431. 140. LaMorte WW, LaMont JT, Hale W, Booker ML, Scott TE, Turner B. Gallbladder prostaglandins and lysophospholipids as mediators of mucin secretion during  cholelithiasis. Am J Physiol 1986; 251:G701–G709. 141. LaMont JT, Turner BS, DiBenedetto D, Handin R, Schafer AI. Arachidonic acid stimulates mucin secretion in prairie dog gallbladder. Am J Physiol 1983;  245:G92–G98. 142. Sasaki H, Tazuma S, Kajiyama G. Effects of 16,16­dimethyl prostaglandin E2 on biliary mucous glycoprotein and gallstone formation in guinea pigs. Scand J  Gastroenterol 1993; 28:495–499. 143. Kuver R, Savard C, Oda D, Lee SP. PGE generates intracellular cAMP and accelerates mucin secretion by cultured dog gallbladder epithelial cells. Am J  Physiol 1994; 267:G998–G1003. 144. Cohen BI, Mosbach EH, Ayyad N, Yoshi M, McSherry CK. Aspirin does not prevent cholesterol cholelithiasis in two established animal models.  Gastroenterology 1991; 101:1106–1109. 145. O'Leary DP, LaMorte WW, Scott TE, Booker ML, Stevenson J. Inhibition of prostaglandin synthesis fails to prevent gallbladder mucin hypersecretion in the  cholesterol­fed prairie dog. Gastroenterology 1991; 101:812–820. 146. Offner GD, Nunes DP, Moore EW, Afdhal NH. Prostaglandin E1 stimulates mucin secretion and increases MUC3 mRNA levels in cultured human gallbladder  epithelial cells. Hepatology 1995; 22:110A. 147. Rhodes M, Allen A, Lennard TWJ. Mucus glycoprotein biosynthesis in the human gallbladder: inhibition by aspirin. Gut 1992; 33. 148. Rhodes M, Allen A, Dowling RH, Murphy G, Lennard TW. Inhibition of human gallbladder mucus synthesis in patients undergoing cholecystectomy. Gut 1992;  33:1113–1117. 149. Broomfield PH, Chopra R, Sheinbaum RC, Bonorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodeoxycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. N Engl J Med 1988; 319:1567–1572. 150. Hood K, Gleeson D, Ruppin DC, Dowling RH. Prevention of gallstone recurrence by non­steroidal anti­inflammatory drugs. Lancet 1988; 2:1223–1225. 151. Pazzi P, Scagliarini R, Sighinolfi D, Govoni M, La Corte R, Gullini S. Nonsteroidal

  

Page 233

antiinflammatory drug use and gallstone disease prevalence: a case­control study (see comments). Am J Gastroenterol 1998; 93:1420–1424. 152. Kurata JH, Marks J, Abbey D. One gram of aspirin per day does not reduce risk of hospitalization for gallstone disease. Dig Dis Sci 1991; 36:1110–1115. 153. Eder MI, Nunes DP, Afdhal NH, Offner GD, TNF  stimulates mucin secretion, but not mucin synthesis, in human gallbladder epithelial cells. Gastroenterology  1998; 114:A1238. 154. Cheung CH, Moore EW, Prystowsky JB, Rege RV. TNF  stimulates mucus secretion in gallbladder epithelial cells. Gastroenterology 1998; 114:A1224. 155. Jackson GDF, Dai Y, Fung C, Hansen PGC. Tumour necrosis factor alpha—A constitutive protein of bile. Adv Exp Med Biol 1995; 371B:1083–1086. 156. Levine SJ, Larivee P, Logun C, Angus CW, Ognibene FP, Shelhamer JH. Tumor necrosis factor­alpha induces mucin hypersecretion and MUC­2 gene  expression by human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 12:196–204. 157. Fischer BM, Rochelle LG, Voynow JA, Akley NJ, Adler KB. Tumor necrosis factor­alpha stimulates mucin secretion and cyclic GMP production by guinea pig  tracheal epithelial cells in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 1999; 20:413–422. 158. Klinkspoor JH, Kuver R, Savard CE, Oda D, Azzouz H, Tytgat GN, Groen AK, Lee SP. Model bile and bile salts accelerate mucin secretion by cultured dog  gallbladder epithelial cells. Gastroenterology 1995; 109:264–274. 159. Klinkspoor JH, Yoshida T, Lee SP. Bile salts stimulate mucin secretion by cultured dog gallbladder epithelial cells independent of their detergent effect. Biochem  J 1998; 332:257–262. 160. Dray­Charier N, Paul A, Combettes L, Bouin M, Mergey M, Malladur P, Capeau J, Housset C. Regulation of mucin secretion in human gallbladder epithelial  cells: predominant role of calcium and protein kinase C. Gastroenterology 1997; 112:978–990. 161. Orlando RA, Exner M, Czekay RP, Yamazaki H, Saito A, Ullrich R, Kerjaschki D, Farquhar MG. Identification of the second cluster of ligand­binding repeats  in megalin as a site for receptor­ligand interactions. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:2368–2373. 162. Adler KB, Fischer BM, Li H, Choe NH, Wright DT. Hypersecretion of mucin in response to inflammatory mediators by guinea pig tracheal epithelial cells in  vitro is blocked by inhibition of nitric oxide synthase. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13:526–530. 163. Keaveny AP, Offner GD, Afdhal NH. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is the principal isoform expressed in human gallbladder. Gastroenterology 1998;  114:A526.

  

Page 235

11—  Role of Proteins in Cholesterol Crystallization in Bile A. Andre van den Berg and Albert K. Groen Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands I—  Introduction Until the mid­seventies, cholesterol supersaturation of bile was considered to be the primary and perhaps only factor responsible for cholesterol gallstone formation. In  the early eighties, several reports appeared (1–4) that demonstrated cholesterol supersaturation in bile from persons without cholesterol stones and sometimes  undersaturated bile in patients with stones (4), with much overlap. Rather, those with gallstones were distinguished by the much more rapid crystallization of cholesterol  when the filtered bile was studied in vitro. These phenomena were considered to be incompatible with an exclusive role of cholesterol supersaturation, and proteins  were considered to be responsible for the anomalous behavior. In 1984, a landmark study of Holzbach et al. (5) appeared, for the first time showing inhibition of  cholesterol crystallization by a fraction of bile that contained primarily proteins. Somewhat later, Strasberg's group suggested that bile also contained proteins  promoting cholesterol crystallization (6). Since these pioneering studies, a multitude of biliary proteins have been isolated and claimed to be important factors in the  pathogenesis of cholesterol gallstones. In this chapter we review the characteristics, mechanism, and significance of the different proteins. II—  Origin of Protein To a great extent, the protein composition of the bile reflects that of serum (7). It has therefore been assumed that most biliary protein originates from the serum  compartment and passes into bile via the tight junctions between both the hepatocytes and the biliary epithelial cells. Exceptions to the rule suggest, however, that  many proteins synthesized in the liver are transported directly into bile either via selective active transport mechanisms or in a selective mode through cotransport. A  case in point is albumin; Saucan and Palade (8) demonstrated that, at least in rats, this most abundant biliary protein is secreted in bipolar fashion both at the sinusoidal  and canalicular side of the membrane. Mucin is the second most abundant biliary protein, followed by IgA and APF/CBP (see Chap. 10) (9) (Table 1). Apart from mucin, no important differences have  been observed so far between the relative composition of proteins in gallbladder bile and hepatic bile. Interestingly, in control patients (without gallstones), no  difference has been observed in the concentrations of protein between gallbladder bile and hepatic bile despite the concentrative function

  

Page 236 Table 1 Important Proteins in Gallbladder Bile

 

Concentration (mg/mL)

Reference

Albumin

0.4–2.5

17,74

Mucin

0.2–10

17,18,32,75,76

APF/CBP

0.6–1

77,78

Immunoglobulin A

0.13

17,18,27

Immunoglobulin G

0.05–0.62

17,18,27

Immunoglobulin M

0.05–0.14

17,18,27

0.05–0.07

17,18,48

0.04–0.05

17,18,47

­1­acid glycoprotein Haptoglobin Aminopeptidase N

0.13

17

of the gallbladder, which should have increased the protein content to a similar extent as the biliary lipids—i.e., about fivefold (10). Since protease activity in  gallbladder bile is minor, one has to conclude that there is substantial uptake of protein by the gallbladder epithelium (11). In patients with gallstones, the situation is  different. An increased protein content compared to controls, which has been reported in most but not all studies (12–16), would suggest a defect in the absorption of  protein by the gallbladder. Recent studies have shed more light on this issue. Miquel et al. confirmed the increased protein content of gallbladder bile from cholesterol  stone patients compared with samples from controls (17). Interestingly, this increase was due to only a few proteins: albumin, mucin, and IgG. In line with these  observations, Keulemans et al., studying cholesterol gallstone patients, found that only albumin, mucin and IgG were relatively enriched in gallbladder bile as compared  with hepatic bile (18). These observations suggest that, under normal conditions, uptake of all biliary proteins takes place in the gallbladder. This process is largely  intact in gallstone patients, but there appears to be selective impairment of absorption and/or secretion of certain proteins, perhaps due to local inflammatory processes  in the gallbladder mucosa. III—  Definition of Nucleation Many studies use the term nucleation time to describe the first measurable appearance of crystals in human or model bile during incubation in vitro. The unit cell of a  cholesterol crystal comprises eight cholesterol molecules (9). The size of such a crystal nucleus is a few angstroms—too tiny to be visualized by the methodology  available today. Thus, it is crystal detection time (CDT) and crystal growth that is actually measured, so that it is inappropriate to use the terms nucleation time or  nucleation factors. We will therefore employ a more general terminology and describe the effects exerted by proteins as crystallization­promoting or inhibiting. In almost all studies described in this chapter, model biles have been used to characterize the influence of proteins. These model biles are composed of physiological  total concentrations of bile salts, phospholipid, and cholesterol. In general, taurocholate is employed as the bile salt and egg­yolk lecithin as the phospholipid. These  differ from the bile salts and phospholipids in human bile, which not only influences crystallization behavior but also may affect the way proteins influence the system.  To circumvent these problems, the group of Strasberg (19) has used heat­inactivated bile derived from gallstone patients. The advantage of this system is that the lipid  and ion content of such bile fully reflects the in situ situation. The disadvantages are the lack of fixed concentrations of nonprotein components and the presence of  heat­denatured proteins.

  

Page 237

IV—  Inhibitors of Crystallization Table 2 shows a list of biliary proteins that have been demonstrated to exert crystallization­inhibiting activity. Since the bile of patients without gallstones was frequently  found to be supersaturated with cholesterol, the activity of this class of proteins was expected to be present in such control biles. In 1984, Holzbach et al. (5)  fractionated bile by gel permeation chromatography and found indeed a fraction that inhibited cholesterol crystallization and contained a multitude of proteins.  Subsequently apolipoproteins AI and AII from this fraction were shown to be good candidates to account for the inhibiting activity (20). Busch et al. (21) confirmed  that Apo AI both increases the time of onset of visible cholesterol crystallization and also inhibits crystal growth. The concentration in gallbladder bile, however, does  not differ between patients with or without gallstones (22). To our knowledge, the protein has not been isolated from bile, rendering it uncertain whether biliary Apo  AI is intact and exerts activity or might differ qualitatively in bile from patients with gallstones versus those without. Subsequently Holzbach's group has isolated a  potent inhibiting fraction by its affinity for Helix pomatia lectin (23). The main protein in this fraction was a 128­kDa protein composed of 58­ and 63­kDa subunits,  each of which yielded an identical polypeptide of 35 kDa after deglycosylation (23). A preliminary report of partial amino acid sequence showed homology to a  cytokeratin, but this work has not yet appeared in definitive form, nor has the concentration of the protein been compared between stone and nonstone patients. More  recently the same group reported the presence of yet another crystallization inhibitor in human gallbladder bile. This 15­kDa protein, which forms dimers and  tetramers, was isolated by affinity chromatography using bound antibodies against Apo AI. The protein was also present in serum and appeared to be unique on N­ terminal amino acid sequencing. When this protein was added to model biles to a final concentration of 10 µg/mL (24), it only mildly affected crystal detection time and  the crystal mass formed. Busch et al. (25) isolated another inhibitory protein fraction that coprecipitated with the cholesterol crystals formed upon incubation in supersaturated model biles of  the protein fraction, which bound to the H. pomatia lectin. The four coprecipitated proteins, purified via SDS­polyacrylamide gel electrophoresis (SDS­PAGE), each  inhibited crystallization of cholesterol from model bile systems. Amino­terminal sequencing revealed the 74­, 63­, and 28­kDa proteins to be parts of IgA (26). The  identity of the 16­kDa protein was not established, but the molecular weight suggested this protein to be the J chain of IgA (26). The 74­, 63­, and 28­kDa subunits  each increased onset time and decreased the final extent of crystallization; the 28­kDa light chain exhibited the highest inhibitory activity. Since the subunits probably  denatured during isolation from SDS­PAGE gels, it is not clear whether the activity observed has relevance for the in vivo situation. No reconstitution experiments  were performed comparing the activity of the combined subunits to the intact (native) IgA fraction. Busch et al. did test the activity of native (polymeric) IgA, isolated  by immunoaffinity purification from an H. pomatia­bound fraction. A complex pattern of inhibition was observed. At very low concentrations (1 and 10 µg/mL), the  protein did have an inhibiting effect, but this was attenuated Table 2 List of Crystallization Inhibitors Inhibitor

Reference

Apolipoprotein AI

20

Apolipoprotein AII

20

128­kDa Helix pomatia binding protein IgA 15­kDa Protein

  

23 25,26 24

Page 238

as concentrations of IgA were increased; at 300 µg/mL, no effect was observed (26). By contrast, Upadhya et al. (27) found a modest dose­dependent increase of  crystallization when 62.5 to 625 µg/mL of purified biliary IgA was added to heat inactivated bile samples from gallstone patients; very low concentrations were not  tested, however. Ahmed et al. (28), on addition of IgA derived from human colostrum, reported a dose dependent increase in crystallization of cholesterol from model  bile. In their hands, 5 µg/mL decreased crystal detection time by 50%. What can be the explanation for these varying results? First, the three groups used different detection systems; particularly the system of heated abnormal bile used by  Upadhya et al. (27) could behave differently, since this system already contains endogenous IgA. Second, different fractions of IgA were used in the three studies; of  note, the immunopurified protein obtained by Busch et al. (26) from the H. pomatia­binding fraction contains only a minor subfraction of biliary IgA. It is not yet clear  whether the activity of IgA varies with subclass. If all components of the protein indeed are inhibitory, probably the (variable) antigen binding site is not involved.  Clearly more work is required to clarify these issues. V—  Crystallization­Promoting Proteins Table 3 lists the proteins that have been reported to promote cholesterol crystallization. The first evidence for the presence of promoters was reported by Burnstein et  al. (6), who showed that the addition of small portions of gallbladder bile from patients with cholesterol gallstones dramatically shortened the crystal detection time of  bile from patients without stones. Although the presence of microcrystals in the pathological biles could not be excluded, passage of the activity through a filter with a  300­kDa cutoff was highly suggestive for a role of proteins smaller than mucins. We later demonstrated potent crystallization­promoting activity of a concanavalin A­ bound biliary glycoprotein fraction that was devoid of mucins (29). Levy et al. (30) did report promoting activity for mucin at physiological concentrations. By  contrast, Gallinger et al. (19) demonstrated that removal of mucin from native bile by filtration and ultracentrifugation did not change crystal detection time, suggesting a  minor role for mucin. In this study, however, potential effects on crystal growth were not determined, nor could it be excluded that microcrystals were still present in  the ultracentrifuged samples. The investigators did confirm the procrystallizing activity of mucin; when added to heat­inactivated bile, the protein did accelerate  crystallization. Gallinger et al. also found no difference in activity between mucin from patients with stones compared to that from controls (19). This result was  confirmed by Klinkspoor et al. (31). Harvey et al. found a twofold higher mucin content in Table 3 Pronase Resistancy of Crystallization Promoters Crystallization promoter

Pronase­resistant

Reference

Mucin

No

79

Aminopeptidase N

No

37,38

Immunoglobulin G

No

27,43

Immunoglobulin M

No

27,43

No

72

No

47

­I­Acid glycoprotein Haptoglobin ­1­Antichymotrypsin

38

Yes

80

Fibronectin

No

41

Low­density pronucleator

Yes

52

  

Yes

Phospholipase C

Page 239

cholesterol stone patients compared to controls and pigment stone patients, but the difference was not significant (32). Nonetheless, as during the isolation of the  mucins, their quaternary structures are distorted; the equality of the activities might be imposed by the isolation procedure. Differences in the qualities of the  hydrophobic domains of native mucin between gallstone patients and controls might still exist and influence the crystal detection time. A simple and reliable isolation  procedure has recently been described by Miquel et al. (33) and applied to measure the mucin content of gallbladder bile in a large group of Chilean patients.  Qualitatively, the results compared well with those of Harvey et al. (32), but the twofold difference in mucin content between cholesterol stone patients and controls  was highly significant. The values in the Chilean patients were threefold higher, which might reflect technology but also ethnic differences (33). Similar results were  found by other groups, indicating that the lack of significance in the study of Harvey et al. was probably due to a type 2 error. Using lectin affinity chromatography with concanavalin A (Con A) sepharose, a nonmucin biliary glycoprotein fraction was isolated that contained potent  crystallization­promoting activity (29). Later, Harvey et al. (34) demonstrated that lentil lectin and wheat germ agglutinin likewise could bind glycoproteins with  crystallization­promoting activity. Like Con A, lentil lectin is selective for glycoproteins containing saccharide side chains with mannose or glucose, whereas wheat  germ aggulutinin is selective for N­acetylglucosamine. Since the Con A­binding fraction (CABF) seemed to contain the most potent activity in most studies, this  fraction was used for further purification. In 1988, we reported that the activity in CABF was resistant to prolonged treatment with pronase, a potent protease (29).  This was important, because Pattinson and Willis demonstrated no effect of prolonged pronase treatment on the crystal detection time (CDT) of gallbladder bile from  patients with cholesterol gallstones (35); we have confirmed this result (unpublished data). After pronase treatment, a 130­kDa protein was isolated from CABF by  native polyacrylamide gel electrophoresis (36); this protein was identified later as aminopeptidase­N (37). Offner et al. (37) could not confirm the resistance of this  protein to pronase, and subsequent studies by us confirmed the pronase sensitivity of isolated aminopeptidase­N (38). Probably, in native bile, the protein is partly  protected because it incorporates into phospholipid/cholesterol vesicles (39,40). A number of other proteins in CABF were reported to be crystallization promoters. Chijiiwa et al. (41) suggested a role for fibronectin. However, their results could  not be confirmed (42). The group of Strasberg suggested immunoglobulin G and M to be the most active candidates in the Con A­binding fraction (27,43). When  isolated from bile, these proteins indeed shortened CDT in heat­inactivated bile, and others have confirmed these results in model biles (28,44). IgG concentrations  were found to be increased in gallbladder bile of cholesterol stone patients (27,43) and up to fivefold in (45) in bile derived from Chilean patients. It remains unclear,  however, whether the immunoglobulins indeed account for the rapid crystallization in gallstone patients. Extraction of immunoglobulins from bile did not influence  crystallization activity (45), and the immunoglobulins are not resistant to pronase even under the conditions prevailing in the Con A­binding fraction. The group of Holzbach reported crystallization­promoting activity by other proteins in the Con A­binding fraction—the acute­phase proteins  ­1­acid glycoprotein  and haptoglobin (46,47). The concentration of  ­1­acid glycoprotein was reported to be increased somewhat in the bile of cholesterol stone patients (48). Extraction  of  ­1­acid glycoprotein by immunoaffinity chromatography reduced the crystallization­promoting activity of CABF by about 30% (44). We have not been able to  confirm this result. Pattinson and Willis found phospholipase C­like activity in bile, which was resistant to pronase treatment, and the enzyme is a potent crystallization  promoter when added to model bile (40–51). Abei et al. (44), however, were unable to immunoprecipitate the phospholipase C­like activity by immunoaffinity  chromatography and suggested that the activity was caused by something else. It could well be, however, that the phospholipase C isolated by Pattinson and Willis  (49) is an as yet uncharacterized isoform that does not cross­react with available antibodies. To identify the protease­resistant crystallization­promoting proteins,  Zijlstra et al. carried out a prolonged and repeated incubation

  

Page 240

with pronase and subsequently fractionated the digested CABF on a superose gel­permeation column. Two peaks with activity emerged; one in the void volume the  other at about 60­kDa (38). Pronase treatment did not alter the elution profile of the activity, indicating that promoters remained intact and were truly protease­ insensitive. The void volume peak contained a biliary lipoprotein consisting of small amounts of free fatty acid, cholesterol, phospholipid, and an 85­kDa protein (52).  The 60­kDa peak contained a number of proteins, as determined by N­terminal amino acid sequencing, which revealed the more prominent components to be derived  from the protease inhibitors  ­1­antitrypsin and  ­1­antichymotrypsin (28). Immunoextraction of these proteins from bile showed that  ­1­antichymotrypsin  accounted for most of the activity;  ­1­antitrypsin was not active. De Bruijn (53) attempted to quantify the contribution of the biliary lipoprotein particle, which  contains the 85­kDa protein, to the  ­1­antichymotrypsin­containing fraction. She separated the two activities by density­gradient ultracentrifugation, which generates  a baseline separation. Unfortunately, it proved to be impossible to produce a reliable quantification, since the isolation procedure altered the activity of the promoters,  producing a recovery of higher than 100%. Harvey et al. (54) suggested that CABF contained cholesterol microcrystals that account for part of the activity and in  principle could explain the excess of activity found by De Bruijn (53). Two observations argue against the importance of contaminating cholesterol crystals. First, after  biotinylation of the proteins in CABF, almost all activity bound to agarose bead coated with streptavidin. Second, filtration of mixtures of CABF with model bile over  a 0.2­µm filter did not remove activity, which excludes a role for the type of crystal reported by Harvey et al. (54). Patients carrying the E4 isoform of apolipoprotein E (apo E) have been implicated to be at risk for gallstone disease. A higher cholesterol content of their gallstones  has been reported in Finnish patients (55) and an increased cholesterol saturation index (CSI) in Spanish patients (56). In Chileans the association was, however,  absent (57), and also in Dutch patients no association between apo E4 subtype and CSI or CDT was found (58). Whether the isolated apo E4 shows crystallization­ promoting activity has not been reported. VI—  Relevance of Proteins to Crystallization in Native Bile Differences in CDTs between biles from patients with versus those without gallstones are quite dramatic. Therefore, for a given bile component, clear­cut qualitative or  quantitative differences can be expected if such a factor truly contributes significantly to the more rapid crystal formation in bile of gallstone patients. However, the fact  that isolated biliary factors often display significant effects on the crystallization of cholesterol when applied as a single agents in model biles and show significant  changes in concentration during formation of gallstones in laboratory animals provides no proof of their relevance in complete human biles. The role of an individual protein in native human bile is best assessed by investigating the effect of specific extraction or addition on the crystallization of cholesterol.  Gallinger et al. (19) were the first to perform such a study. In their hands, extraction of mucin did not affect crystallization. In principle, this is convincing evidence for a  lack of importance of mucins in the bile samples tested. The effect of addition of mucins isolated from the same biles was not tested. In our lab the effect of adding isolated CABF to native bile was tested. In 5 of the 7 samples, CABF increased crystallization in native bile (29). Keulemans et al. (59)  determined the effect of direct extraction of CABF from native bile sample. To this purpose, native bile was incubated with Con A­sepharose beads, and bile  incubated with sepharose beads served as control. After 2 h of incubation, the beads were centrifuged and crystallization was determined in the supernatant.  Surprisingly, extraction of CABP, inhibited crystallization only in fast­crystallizing biles (<4 days), and the effect was more pronounced on crystal growth than on  crystal detection time. Extraction never induced increased crystallization, indicating that inhibitors that bind to Con­A do not play a role in the regulation of  crystallization in bile from

  

Page 241

patients with gallstones. Interestingly, the content of proposed promoters or inhibitors ( ­1­acidglycoprotein, IgA, IgM, IgG, haptoglobin) was not different between  slow­ and fast­crystallizing samples. In addition, removal of all these factors from slow­crystallizing samples did not influence crystallization, indicating that these  factors, at least in combination, do not control crystallization. Van Erpecum et al. investigated whether the content of known crystallization promoters could account  for the differences in CDT between patients with single stones and those with multiple stones. No difference in the content of  ­1­acidglycoprotein, IgA, IgM, IgG,  haptoglobin, and mucin was observed. Since biles from single­stone patients in general belong to the slow­crystallizing group of gallstone patients with CDT >4 days,  this observation is in line with the data of Keulemans et al. (59), who also did not find a difference in the content of the above mentioned promoters between slow­ and  fast­crystallizing biles. The question remains which factor then accounts for the activity in the fast crystallizing samples. A good candidate is the LDL particle, but no direct quantifying method  for this factor is yet available. In a subsequent study, Keulemans et al. (56) investigated whether the CABF played a role in the rapid crystallization of cholesterol from  gallbladder biles from patients with Crohn's disease. Indeed, extraction of CABF shortened CDT in all but one of the crystallizing samples. In contrast, in biles from  patients with ulcerative colitis, extraction of CABF increased crystallization in 7 of the 9 crystallizing samples, indicating activity of crystallization inhibitors. Subjecting  supersaturated samples from patients with and without stones to the same procedure will have to reveal differences. As yet, no firm evidence has been provided that any individual biliary protein contributes significantly to the difference between the fast crystallization of supersaturated  biles from patients with cholesterol gallstones and the slower crystallization of similarly supersaturated biles from patients without cholesterol gallstones. VII—  Possible Mechanism by Which Proteins Affect Crystallization The molecular mechanisms involved in the crystallization of cholesterol are discussed in greater detail in Chap. 5 of this book. Here a limited interpretation is given to  provide a basis for understanding how biliary proteins can influence the formation of cholesterol crystals. Supersaturated biles carry small amounts of monomeric cholesterol in the aqueous phase but primarily in mixed micelles and vesicles. Theoretically, these three  separate but interequilibrating forms might serve as precursors for the formation of cholesterol crystals. In bile supersaturated with cholesterol, the bulk of excess  cholesterol is probably carried in vesicles, and most studies indicate an important role for the vesicles in the onset of crystallization (60–63). A clear negative  correlation between the time of detectable onset of crystallization (recorded crystal detection time) and the presence of large multilamellar vesicles has been suggested  by several studies. Studies on pure vesicle suspensions demonstrated that vesicles with high cholesterol­to­phospholipid ratios participate more actively in cholesterol  crystallization (see Chap. 5). Some studies haved clearly demonstrated a relationship between the CDT and the vesicular fraction of bile (64,65). This has been taken  to indicate that crystal nuclei that form in model and native biles probably originate from cholesterol in vesicles. Aggregation and fusion of small unilamellar vesicles into  large multilamellar vesicles seems to enhance formation of the crystal nucleus as well as its subsequent growth into larger crystals that can be detected by light  microscopy. Nevertheless, it has not been excluded that the nuclei originate from supersaturated micelles or from monomeric free cholesterol in the aqueous phase.  The distribution of cholesterol between the different phases is determined by the bile salts and phospholipids. In native bile, an additional phenomenon plays a role— e.g., direct nucleation of cholesterol on small foreign bodies or precipitates of calcium salts, a process called epitaxy. Epitaxis for cholesterol in bile has been  demonstrated to occur (9).

  

Page 242

Pronucleating agents in bile enhance the crystallization of cholesterol, either by stimulating the formation of crystal nuclei and/or the subsequent growth of these nuclei  to the size of visible crystals. The former can be accomplished either by increasing the cholesterol to the phospholipid ratio of vesicles and/or by promoting the  aggregation and/or fusion of vesicles into larger multilamellar vesicles. Because the basal unit of the cholesterol crystal is an octameric flat box with two layers of four  molecules in square orientation, one could envision that the probability of layering of cholesterol in such an orientation increases when cholesterol­rich domains are  present in several stacked membranes. This probably explains why aggregation and fusion of vesicles into multilamellar vesicles promotes cholesterol crystallization.  The vesicles could be the target of both promoters and inhibitors of crystallization—the former by destabilizing vesicles or promoting fusion and the latter by  stabilization or prevention of fusion of vesicles. Ahmed et al. (28) suggested the effect of proteins to be aspecific and just a function of their hydrophobicity. In their  hands, hydrophilic proteins were promoters and hydrophobic proteins inhibitors. Although this is an attractive concept, data from many others do not support this  contention. For instance, Ahmed et al. (28) found that a strong promoting effect was exerted by albumin in bile, which has not been seen in other studies. In addition,  albumin is pronase­sensitive, and this concept would not explain the resistance of the CDT to pronase. VIII—  Crystallization Inhibitors A—  APo A1 and A2 Yamashita and coworkers (66) studied the crystallization­inhibiting activity of Apo A1. When commercially available Apo A1 was eluted from a sepharose CL­6B  column, the retention time was altered if it was first incubated in model bile, suggesting that an interaction with biliary lipids occurred. After addition to model bile to a  concentration of 30  g/mL, Apo A1 (within the physiological range of human gallbladder biles), Yamashita et al. observed only a slight inhibition of crystal formation in  a photometric crystal growth assay. More direct evidence for a stabilizing role of apolipoproteins toward bile has come from a sequential transmission electron  microscopy study by Tao et al. (67). In this study, lipid particles in model bile displayed much slower fusion of phospholipid vesicles into multilamellar structures and  subsequent nucleation of cholesterol crystals in the presence of Apo A1. After elution from a gel­permeation column, the Apo A1 was consistently recovered from the  fractions that contained small phospholipid vesicles, again supporting the hypothesis that apolipoproteins bind to small vesicles and inhibit their fusion. Another study  from Japan likewise reported that both Apo A1 and Apo A2 retarded the development of maximal turbidity of supersaturated model biles. Since the maximal turbidity  is likely related to multilamellar vesicles and coincides with the onset of crystallization, these results also suggest that apolipoproteins inhibit crystallization by slowing  the fusion of unilamellar vesicles (68). In summary, the data favor a mechanism in which apolipoproteins bind to or are incorporated into the smaller vesicular structures of bile, preventing their aggregation  and/or fusion into the larger multilamellar vesicles from which crystals nucleate. The recently described nonperturbing techniques of cryotransmission electron  microscopy or video­enhanced light microscopy should now be applied to directly estimate the effects of various biliary apolipoproreins on the average size of vesicles  in bile and the time of onset of crystal formation (69). B—  Lectin­Binding Inhibitory Glycoproteins The supposed mechanism whereby the bile glycoproteins inhibit crystallization and bind to H. pomatia lectin is completely different from that of the apolipoproteins.  The former are hypothesized to function like the glycoproteins in the serum of polar fish, preventing formation of ice in the blood (23,25). These glycoproteins inhibit  crystal growth by binding to and

  

Page 243

poisoning the crystal surface—i.e., they are antitaxis factors. The proteins apparently bind preferentially to the sites where crystal growth is fastest, very effectively  arresting growth. The study by Busch and colleagues (26) is strong support for a similar mechanism involved in the inhibition of cholesterol crystal growth by the four  secretory IgA glycoproteins. These IgA subunits were shown to bind to cholesterol crystals, change the morphology of the crystals, and retard the growth rate,  resulting in a decreased crystal mass. This mechanism has also been proposed for the inhibition of crystal formation by the 120­kDa glycoprotein and its subunits (23).  This seems less likely, as these glycoproteins did not change growth kinetics. IX—  Crystallization Promoters A—  Mucin Biliary mucins (described in detail in Chap. 6) are among the most potent in vitro pronucleating agents. Afdhal and coworkers (70) showed that mucins from various  sources all accelerate both vesicle aggregation and vesicle fusion and stimulate the formation of cholesterol crystals in model biles. Using fluorescently labeled bovine  gallbladder mucins in model biles with fluorescently labeled vesicles, they demonstrated further that mucin has a biphasic effect. The glycan domains reversibly promote  vesicle aggregation. The hydrophobic stretches of the mucin polypeptide backbone facilitated an irreversible fusion of vesicles. These authors hypothesized further that  a large multilamellar vesicular structure, with mucin bound to it, is the true crystal precursor in systems with mucin present, but no evidence has been provided that this  complex generates crystals more readily than normal multilamellar vesicles in the absence of mucin. B—  Concanavalin A­Binding Fraction CABF has multiple effects on crystallization. It strongly decreases crystal appearance time, increases the rate of crystal growth, and increases the magnitude of the final  plateau of crystallization. In true equilibrium, the quantity of crystals at the plateau is determined exclusively by the degree of supersaturation of the system. Since it is  difficult to imagine how relatively small amounts of proteins could control the thermodynamics of cholesterol solubilization, it is likely that only metastable intermediary  plateaus of crystallization are influenced by CABF. De Bruijn et al. loaded small vesicles with high (self­quenching) concentrations of the fluorescent dye  carboxyfluorescein (71). Addition of CABF lead to immediate fluorescence, indicating release of the carboxyfluorescein in the surrounding medium. The CABF thus  disrupted the vesicles directly without their prior aggregation and fusion into large multilamellar vesicles. This mechanism has also been shown to be part of the  pronucleating activity of mucins. Which of the individual proteins in CABF is responsible for these phenomena is not yet clear, but De Bruijn (53) showed differential  effects of the low­ and high­density fractions in the crystal growth assay. The low­density­particle fraction mainly shortened CDT and had very little effect on crystal  growth, whereas the mixture of proteins in the high­density fraction mainly increased crystal growth. Data from the group of Holzbach (72) suggest that the glycan  moieties of the proteins determine activity, since only  ­1­acid glycoprotein, with a high Con A­binding affinity, significantly promoted activity. X—  Role of Proteins in Gallstone Growth So far we have limited our discussion to the effect of biliary proteins on cholesterol crystallization on a time scale of days, but growth of a gallstone appears to occur  over many years. The role of pro­ and antinucleating proteins in stone growth has been little studied, since it has always been assumed that factors promoting the  crystallization of cholesterol likewise

  

Page 244

Figure 1 Growth of small human cholesterol gallstones, 15 to 25 mg each, in 2 mL of model biles supersaturated with cholesterol. The model biles were composed of tauro­ and  deoxytaurocholic acids, egg­yolk lecithin,  and cholesterol (molar ratios 8:2:1) with total lipids 12 g/dL, CSI 1.6. A. The increase in mass was set to 100% in each experiment. B to D. Relative mass increases in model biles where crystallization was stimulated with 330  g/mL CABF added  (B); 660  g/mL CABF added (C); 1 mg/mL  of human hepatic mucin and calcium phosphate precipitates added (D). E. Mass increases in model biles where crystallization of cholesterol was completed before gallstones were added.

enhance the formation and growth of cholesterol gallstones. This contention has never been proven; no one has yet been able to grow cholesterol gallstones de novo in  vitro. We have approached this problem by studying the growth of human small gallstones in model systems and native bile. A summary of our recent data is given in  Fig. 1. Small cholesterol gallstones incubated in 2 mL of fresh model biles supersaturated with cholesterol increased their mass from 3 to 18% within 2 weeks. This  growth rate was positively correlated with the saturation index but was negatively correlated with the rate of crystallization. Thus, when the formation of cholesterol  crystals in model biles was increased either by the addition of hepatic human mucins, calcium salt precipitates or the addition of Con A­binding glycoprotein fractions  of biles from gallstone patients, the growth of the stones was very much reduced. Stones incubated in model biles containing massive amounts of cholesterol crystals  but with far lower excess cholesterol in the fluid phase never increased more than 2% in mass, suggesting that the stones did not grow by aggregation of performed  crystals. It thus seems that cholesterol carried in excess in bile can either accrete to the surface of a stone or self­aggregate and nucleate as a crystal, and these  processes appeared to be competitive in vitro. Whether such cholesterol that accretes to stone surface is of monomeric, micellar, or vesicular origin requires further  investigation. We hypothesize that soluble protein factors that induce crystallization of cholesterol reduce stone growth in vivo as well. One could reason that during  inflammation of the gallbladder, when contraction is reduced and bile becomes more supersaturated, a mechanism is activated to prevent stone formation. The  physicological function of these pronucleators, many of which are acute­phase proteins and immunoglobulins, would then be to limit growth of cholesterol gallstones  through rapid growth of cholesterol crystals. It suggests a rationale for why the human body would produce pro­ and antinucleating proteins. XI—  Concluding Remarks The major conclusion from this chapter is that biliary proteins do play a role in cholesterol crystallization and particularly account for the rapid crystal formation often  seen in bile of

  

Page 245

patients with gallstones. Which specific factors are responsible for this phenomenon still remains elusive. None of all the putative promoters that have been isolated as  yet fulfill the criteria formulated by Harvey and Strasberg (73): (a) the substance should be present in fast­crystallizing bile with either a quantitative or qualitative  difference from normal bile; (b) upon extraction of the substance from fast­crystallizing bile, the crystallization should be delayed; and (c) when the substance is added  to slowly crystallizing bile, the crystallization should be accelerated. We add a fourth criterion: such a protein should be resistant to protease treatment. Of the promoters listed in Table 3, only three candidates fulfill the latter criterion;  phospholipase C,  ­1­antichymotrypsin, and the low­density particle from CABF. Regarding the role of inhibitors, the situation is even more uncertain. An inhibiting  influence of proteins has not yet been demonstrated except in bile of patients with ulcerative colitis. It has been postulated by many authors that an imbalance between  procrystallizing and anticrystallizing factors is decisive whether or not stones are formed. Our recent data on the effect of proteins on gallstone growth makes one  wonder whether this hypothesis is correct. The true relevance of pro­ and antinucleating protein factors to the overall cholelithiasis in native bile, especially to the  growth of gallstones, remains to be explored. References 1. Holzbach RT, Marsh M, Oleszewski M, Holan K. Cholesterol solubility in bile: evidence that supersaturated bile is frequent in healthy man. J Clin Invest 1973;  53:1467–1479. 2. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease (abstr).  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 3. Sedaghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980; 302:1274–1277. 4. Gollish SH, Burnstein MD; Ilson RG, Petrunka CN, Strasberg SM. Nucleation of cholesterol monohydrate crystals from hepatic and gallbladder bile of patients  with cholesterol gallstones. Gut 1983; 24:836–844. 5. Holzbach RT, Kibe A, Thiel E, Howell JH, Marsh M, Hermann RE. Biliary proteins: unique inhibitors of cholesterol crystal nucleation in human gallbladder bile. J  Clin Invest 1984; 73:35–45. 6. Burnstein MJ, Ilson RG, Petrunka CN, Taylor RD, Strasberg SM. Evidence for a potent nucleating factor in the gallbladder bile of patients with cholesterol  gallstones. Gastroenterology 1983; 85:801–807. 7. He C, Fischer S, Meyer G, Muller I, Jungst D. Two­dimensional electrophoretic analysis of vesicular and micellar proteins of gallbladder bile. J Chromatogr 1997;  776:109–115. 8. Saucan L, Palade GE. Differential colchicine effects on the transport of membrane and secretory proteins in rat hepatocytes in vivo—bipolar secretion of albumin.  Hepatology 1992; 15:714–721. 9. Craven BM. Crystal structure of cholesterol monohydrate. Nature 1976; 260:727–729. 10. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Ilson RG, Strasberg SM. Biliary proteins and the nucleation defect in cholesterol cholelithiasis. Gastroenterology 1987;  92:867–875. 11. Harvey PRC, Aravinda Upadhya G, Toth JL, Strasberg SM. Fluorometric assay of protein in native human bile. Clin Chim Acta 1989; 183:147–154. 12. Sahlin S. Total protein content of human gallbladder bile: relation to cholesterol gallstone disease and effects of treatment with bile acids and aspirin. Eur J Surg  1996; 162:463–469. 13. Jungst D, Lang T, von Ritter C, Paumgartner G. Role of high total protein in gallbladderbile in the formation of cholesterol gallstones. Gastroenterology 1991;  100:1724–1729.

  

Page 246

14. Chijiiwa K, Hirota I, Noshiro H. High vesicular cholesterol and protein in bile are associated with formation of cholesterol but not pigment gallstones. Dig Dis Sci  1993; 38:161–166. 15. Strasberg SM, Toth JL, Gallinger S, Harvey PRC. High protein and total lipid concentration are associated with reduced metastability of bile in an early stage of  cholesterol gallstone formation. Gastroenterology 1990; 98:739–746. 16. Yamazaki K, Powers SP, LaRusso NF. Biliary proteins: assessment of quantitative techniques and comparison in gallstone and nongallstone subjects. J Lipid Res  1988; 29:1055–1063. 17. Miquel JF, Nunez L, Amigo L, Gonzalez S, Raddatz A, Rigotti A, Nervi F. Cholesterol saturation, not proteins or cholecystitis, is critical for crystal formation in  human gallbladder bile. Gastroenterology 1998; 114:1016–1023. 18. Keulemans YCA, Mok KS, Dewit LT, Gouma DJ, Groen AK. Hepatic bile versus gallbladder bile—a comparison of protein and lipid concentration and  composition in cholesterol gallstone patients. Hepatology 1998; 28:11–16. 19. Gallinger S, Taylor RD, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of mucous glycoprotein on the nucleation of time of human bile: Gastroenterology  1985; 89:648–658. 20. Kibe A, Holzbach RT, LaRusso NF, Mao ST. Inhibition of cholesterol crystal formation by apolipoproteins A­I and A­II in model systems of supersaturated bile:  implications for gallstone pathogenesis in man. Science 1984; 225:514–516. 21. Busch N, Matiuck N. Sahlin S, Pillay SP, Holzbach RT. Inhibition and promotion of cholesterol crystallization by protein fractions from normal human gallbladder  bile. J Lipid Res 1991; 32:695–702. 22. Sewell RB, Mao SJT, Kawamoto T, LaRusso NF. Apolipoproteins of high, low, and very low density lipoproteins in human bile. J Lipid Res 1983: 24:391–401. 23. Ohya T, Schwarzendrube J, Busch N, Gresky S, Chandler K, Takabayashi A, Igimi H, Egami K, Holzbach RT. Isolation of a human biliary glycoprotein inhibitor  of cholesterol crystallization. Gastroenterology 1993; 104:527–538. 24. Secknus R, Yamashita G, Corradini SG, Chernosky A, Williams C, Hays L, Secknus MA, Holzbach RT. Purification and characterization of a novel human 15  kd cholesterol crystallization inhibitor protein in bile. J Lab Clin Med 1996; 127:169–178. 25. Busch N, Lammert F, Marschall HU, Matern S. A new subgroup of lectin­bound biliary proteins binds to cholesterol crystals, modifies crystal morphology, and  inhibits cholesterol crystallization. J Clin Invest 1995; 96:3009–3015. 26. Busch N, Lammert F, Matern S. Biliary secretory immunoglobulin a is a major constituent of the new group of cholesterol crystal­binding proteins.  Gastroenterology 1998; 115:129–138. 27. Upadhya CA, Harvey PRC, Strasberg SM. Effect of human biliary immunoglobulins in the nucleation of cholesterol. J Biol Chem 1993; 268:5193–5200. 28. Ahmed HA, Petroni ML, Abu­Hamdiyyah M, Jazrawi RP, Northfield TC. Hydrophobic/hydrophilic balance of proteins: a major determinant of cholesterol  crystal formation in model bile. J Lipid Res 1994; 35:211–219. 29. Groen AK, Stout JPJ, Drapers JAG, Hoek FJ, Grijm R, Tytgat GNJ. Cholesterol nucleation­influencing activity in T­tube bile. Hepatology 1988; 8:347–352. 30. Levy PF, Smith BF, Lamont JT. Human gallbladder mucin accelerates nucleation of cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87:270–275. 31. Kinkspoor JH, Van Wijland MJA, Koeleman CAM, Van Dijk W, Tytgat GNJ, Groen AK. Heterogeneity of human biliary mucin: functional implications. Clin Sci  1994; 86:75–82. 32. Harvey PRC, Rupar CA, Gallinger S, Petrunka CN, Strasberg SM. Quantitative and qualitative comparison of gallbladder mucus glycoprotein from patients with  and without gallstones. Gut 1986; 27:374–381.

  

Page 247

33. Miquel JF, Groen AK, Vanwijland MJA, Delpozo R, Eder MI, Vonritter C. Quantification of mucin in human gallbladder bile: a fast, specific, and reproducible  method. J Lipid Res 1995; 36:2450–2458. 34. Harvey PRC, Toth JL Sr. Lectin binding characteristics of a cholesterol nucleation promoting protein. Clin Chim Acta 1989; 185:185–189. 35. Pattinson NR, Willis KE. Nucleation of cholesterol crystals from native bile and the effect of protein hydrolysis. J Lipid Res 1991; 32:215–221. 36. Groen AK, Noordam C, Drapers JA, Egbers P, Jansen PLM, Tytgat GN. Isolation of a potent cholesterol nucleation­promoting activity from human gallbladder  bile: role in the pathogenesis of gallstone disease. Hepatology 1990; 11:525–533. 37. Offner GD, Gong DH, Afdhal NH. Identification of a 130­kilodalton human biliary concanavalin A binding protein as aminopeptidase N. Gastroenterology 1994;  106:755–762. 38. Zijlstra AIM, Offner GD, Afdhal NH, Vanoverveld M, Tytgat GNJ, Groen AK. The pronase resistance of cholesterol­nucleating glycoproteins in human bile.  Gastroenterology 1996; 110:1926–1935. 39. Rigotti A, Nunez L, Amigo L, Puglielli L, Garrido J, Santos M, Gonzalez S, Mingrone G, Greco A, Nervi F. Biliary lipid secretion: immunolocalization and  identification of a protein associated with lamellar cholesterol carriers in supersaturated rat and human bile. J Lipid Res 1993; 34:1883–1894. 40. Nunez L, Amigo L, Mingrone G, Rigotti A, Puglielli L, Raddatz A, Pimentel F, Greco AV, Gonzalez S, Garrido J, Miquel JF, Nervi F. Biliary aminopeptidase­N  and the cholesterol crystallization defect in cholelithiasis. Gut 1995; 37:422–426. 41. Chijiiwa K, Koga A, Yamasaki T, Shimada K, Noshiro H, Nakayama F. Fibronectin: a possible factor promoting cholesterol monohydrate crystallization in bile.  Biochim Biophys Acta 1991; 1086:44–48. 42. Miquel JF, Vonritter C, Delpozo R, Lange V, Jungst D, Paumgartner G. Fibronectin in human gallbladder bile: cholesterol pronucleating and/or mucin ''link"  protein? Am J Physiol 1994; 267:G393–G400. 43. Harvey PRC, Upadhya GA, Strasberg SM. Immunoglobulins as nucleating proteins in the gallbladder bile of patients with cholesterol gallstones. J Biol Chem  1991; 266:13996–14003. 44. Abei M, Schwarzendrube J, Nuutinen H, Broughan TA, Kawczak P, Williams C, Holzbach RT. Cholesterol crystallization­promoters in human bile: comparative  protencies of immunoglobulins, alpha 1­acid glycoprotein, phospholipase C, and aminopeptidase N1. J Lipid Res 1993; 34:1141–1148. 45. Hajri T, Elliottbryant R, Sipe JD, Liang JS, Hayes KC, Cathcart ES. The acute phase response in apolipoprotein a­1 knockout mice—apolipoprotein serum  amyloid a and lipid distribution in plasma high density lipoproteins. Biochim Biophys Acta Lipids Lipid Metab 1998; 1394:209–218. 46. Thompson RP, Hofmann AF. Separation of bilirubin and its conjugates by thin layer chromatography. Clin Chim Acta 1971; 35:517–519. 47. Abei M, Nuutinen H, Kawczak P, Schwarzendrube J, Pillay SP, Holzbach RT. Identification of human biliary alpha(1)­acid glycoprotein as a cholesterol  crystallization promoter. Gastroenterology 1994; 106:231–238. 48. Nuutinen H, Abei M, Schwarzendrube J, Corradini SG, Walsh M, Kawczak P, Holzbach RT. Biliary alpha(1)­acid glycoprotein concentrations in gallstone­free  controls and in patients with multiple or solitary cholesterol gallstones. Dig Dis Sci 1995; 40:1786–1791. 49. Pattinson NR, Willis KE. Effect of phospholipase C on cholesterol solubilization in model bile: a concanavalin A­binding nucleation­promoting factor from human  gallbladder bile. Gastroenterology 1991; 101:1339–1344. 50. Pattinson NR, Willis KE. Phospholipase C and diacylglycerol lipase in human gallbladder and hepatic bile. Gastroenterology 1990; 99:1798–1806. 51. Pattinson NR. Identification of a phosphatidylcholine active phospholipase C in human

  

Page 248

gallbladder bile [published erratum appears in Biochem Biophys Res Commun 1988 Mar 15;151(2):955]. Biochem Biophys Res Commun 1988; 150:890–896. 52. De Bruijn MAC, Mok KS, Nibbering CP, Out T, Vanmarle J, Stellaard F, Tytgat GNJ, Groen AK. Characterization of the cholesterol crystallization­promoting  low­density particle isolated from human bile. Gastroenterology 1996; 110:1936–1944. 53. De Bruijn MAC. Crystallization Promoting Factors in Cholesterol Gallstone Formation. Utrecht, Holland: Elinkwijk, 1994. 54. Harvey PRC, Upadhya GA, Strasberg SM. Cholesterol microcrystals associated with concanavalin a­binding glycoproteins contribute artifactually to nucleating  activity assays. J Lipid Res 1995; 36:2661–2669. 55. Juvonen T, Kervinen K, Kairaluoma MI, Lajunen LH, Kesaniemi YA. Gallstone cholesterol content is related to apolipoprotein e polymorphism.  Gastroenterology 1993; 104:1806–1813. 56. Keulemans YCA, Mok KS, Slors JFM, Gouma DJ, Tytgat GNJ, Groen AK. The biliary concanavalin A­binding fraction explains increased cholesterol  crystallization in bile from patients with Crohn's disease compared to patients with ulcerative colitis (abstr). Gastroenterology 1995; 110:A461. 57. Mella JG, Miquel JF, Rollan A, Covarrubias C, Nervi F. Apolipoprotein­E polymorphism in patients with cholesterol gallstones in a high risk population (abstr).  Gastroenterology 1996; 112:A1332. 58. Vanerpecum KJ, VanBergeHenegouwen GP, Eckhardt ERM, Portincasa P, Vandeihjning BJM, Dallingathie GM, Groen AK, Cholesterol crystallization in human  gallbladder bile—relation to gallstone number, bile composition, and apolipoprotein e4 isoform. Hepatology 1998; 27:1508–1516. 59. Keulemans YCA, Mok KS, Gouma DJ, Groen AK. The role of the concanavalin Abinding fraction in cholesterol crystallization in native human bile. J Hepatol  1997; 27:1041–1050. 60. Halpern Z, Dudley, MA, Lynn MP, Nader JM, Breuer AC, Holzbach RT. Vesicle aggregation in model systems of supersaturated bile: relation to crystal  nucleation and lipid composition of the vesicular phase. J Lipid Res 1986: 27:295–306. 61. Lee SP, Park HZ, Madani H, Kaler EW. Partial characterization of a nonmicellar system of cholesterol solubilization in bile. Am J Physiol 1987; 252:G374– G384. 62. Harvey PRC, Somjen G, Lichtenberg MS, Petrunka C, Gilat T, Strasberg SM. Nucleation of cholesterol from vesicles isolated from bile of patients with and  without cholesterol gallstones. Biochim Biophys Acta 1987; 921:198–204. 63. Peled Y, Halpern Z, Baruch R, Goldman G, Gilat T. Cholesterol nucleation from its carriers in human bile. Hepatology 1988; 8:914–918. 64. Ahrendt SA, Fox­Talbot MK, Kaufman HS, Lillemoe KD, Lipsett PA, Pitt HA. Characterization of a small vesicular cholesterol carrier in human gallbladder bile.  Ann Surg 1994; 220:635–643. 65. Harvey PRC, Somjen G, Gilat T, Gallinger S, Strasberg SM. Vesicular cholesterol in bile: relationship to protein concentration and nucleation time. Biochim  Biophys Acta 1988; 958:10–18. 66. Yamashita Y, Tazuma S, Kajiyama G. Method for quantitative assessment of transformation of non­micellar cholesterol carriers in model bile systems. J  Gastroenterol Hepatol 1996; 11:864–869. 67. Tao S, Tazuma S, Kajiyama G. Fatty acid composition of lecithin is a key factor in bile metastability in supersaturated model bile systems. Biochim Biophys Acta  1993; 1167:142–146. 68. Yamashita G, Secknus R, Chernosky A, Krivacic KA, Holzbach RT. Comparison of haptoglobin and apolipoprotein AI on biliary lipid particles involved in  cholesterol crystallization. J Gastroenterol Hepatol 1996; 11:738–745. 69. Kaplun A, Talmon Y, Konikoff RM, Rubin M, Eitan A, Tadmor M, Lichtenberg D. Direct

  

Page 249

visualization of lipid aggregates in native human bile by light­ and cryo­transmission electron­microscopy. FEBS Lett 1994; 340:78–82. 70. Afdhal NH, Niu N, Nunes DP, Bansil R, Cao XX, Gantz D, Small DM, Offner GD. Mucin­vesicle interactions in model bile: evidence for vesicle aggregation and  fusion before cholesterol crystal formation. Hepatology 1995; 22:856–865. 71. De Bruijn MAC, Goldhoorn BG, Zijlstra AIM, Tytgat GNJ, Groen AK. Interaction of cholesterol­crystallization­promoting proteins with vesicles. Biochem J  1995; 305:93–96. 72. Yamashita G, Corradini SG, Secknus R, Takabayashi A, Williams C, Hays L, Chernosky AL, Holzbach RT. Biliary haptoglobin, a potent promoter of cholesterol  crystallization at physiological concentrations. J Lipid Res 1995; 36:1325–1333. 73. Harvey PR, Strasberg SM. Will the real cholesterol­nucleating and ­antinucleating proteins please stand up? (editorial; comment). Gastroenterology 1993;  104:646–650. 74. Cohen S, Kapplan M, Gottlieb L, Patterson J. Liver disease and gallstones in regional enteritis. Gastroenterology 1971; 60:237–245. 75. Lee SP, Nicholls JF. Nature and composition of biliary sludge. Gastroenterology 1986; 90:677–686. 76. Broomfield PH, Chopra R, Sheinbaum RV, Bonorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodeoxycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. N Engl J Med 1988; 319:1567–1572. 77. Ostrow JD. APF/CBP, an anionic polypeptide in bile and gallstones that may regulate calcium salt and cholesterol precipitation from bile (editorial). Hepatology  1992; 16:1493–1496. 78. Domingo N, Lafont H, Halpern Z, Pele Y, Grosclaude J, Gilat T. Anionic polypeptide fraction in bile of patients with and without gallstones. Hepatology 1993;  17:778–780. 79. Afdhal NH, Niu N, Gantz D, Small DM, Smith BE Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrate crystal growth in model bile. Gastroenterology  1993; 104:1516–1523. 80. Pattinson NR. The possible role of phospholipase in gallstone pathogenesis; reply. Gastroenterology 1991; 101:593.

  

Page 251

12—  Normal Gallbladder Motor Functions R.P. Jazrawi St. George's Hospital Medical School, London, England I—  Introduction Gallbladder (GB) motor functions play a vital role in the maintenance of an intact enterohepatic circulation in health, and it is evident that abnormalities of GB motor  functions have serious clinical implications. Despite the significant improvement in the techniques used for measuring GB motor functions, the old concept that the GB  empties gradually after meals and fills between meals is still held by many. The goals of this chapter are to give a brief overview of the physiology of GB motor  functions, to describe the techniques used in measurement and discuss the information provided by these techniques, to highlight controversies in the available data,  and to present a new concept of GB motor functions in health and its role in disease. II—  The Role of the Gallbladder in Health: A Historical Review The representative eighteenth­century view of GB function may be summarized as follows: "it receives the bile when the stomach, being empty, has no call for it, that  afterwards it may be able to return it in greater plenty, when we principally want it for the digestion of aliments now flowing in great quantity into the duodenum" (1).  This view, which is strikingly similar to our current understanding of GB function, was further elaborated in the nineteenth century by physiologists like Foster, who said  that "The act of secretion of bile from the liver must not be confounded with the discharge of bile from the bile duct into the duodenum. When the acid contents of the  stomach are poured over the orifice of the biliary duct, a gush of bile takes place. . . . The discharge is due to a contraction of the muscular walls of the GB and the  ducts, accompanied by a relaxation of the sphincter of the orifice; both acts are probably of a reflex nature . . ."(2). Boyden, in a series of studies on animals and humans (3–8), established that GB emptying has both hormonal [cholecystokinin­(CCK)mediated] and neural (vagus  mediated) components and that during GB emptying, the GB contracts and the sphincter of Oddi relaxes. He also established sex and age differences in the emptying  of the human GB. III—  Control of Gallbladder Motility GB motility parameters are controlled by both neural and endocrine mechanisms. A list of the hormones and neurotransmitters that affect GB motility is presented in  Table 1. As the evolution

  

Page 252 Table 1 Hormones and Neurotransmitters That Affect  Gallbladder Motility Compound

GB motility

 

Hormones Cholecystokinin

Up

Motilin

Up

Gastrin

Up Up

Cerulin Secretin

 

Glucagon

Down

Somatostatin

Down

a

Neurotransmitters

 

Vasoactive intestinal peptide Down Pancreatic polypeptide

Down

Peptide YY

Down

Neuropeptide Y

Up

Substance P

Up

Gastrin­releasing peptide

Up

Calcitonin

Down

Neurotensin

Down

Histamine

Up (H1), down (H2)b

Opiates

Down

a

Potentiates effect of CCK but has no effect by itself on  GB motility. b H1 and H2 are histamine receptors 1 and 2.

of our understanding of these control mechanisms progresses, the distinction between them becomes less defined, as it is now established that several peptides function  as hormones or neurotransmitters under different circumstances. Even CCK, the main hormone promoting GB contraction, has been identified in nerve fibers within  the GB wall and has been proposed as a parasympathetic neurotransmitter. A—  Neural Control The GB is innervated extrinsically by parasympathetic and sympathetic nerves and intrinsically by an intramural plexus involving different cholinergic, catecholinergic,  serotonergic, and peptinergic neurones. The central nervous system may have a modulating effect on the enteric neural circuits that influence the digestive state. Thus  GB motility in humans is under the influence of cephalic regulation, as demonstrated by GB contraction in response to sham feeding (9,10) and by the fact that this  emptying is not accompanied by a concomitant increase in circulating cholecystokinin (9). It has been suggested that direct vagal stimulation is involved in the GB  response to sham feeding. There is also evidence that vagal activity contributes to the normal GB tone. The physiological significance of sympathetic innervation of the GB remains unclear, although in balance the effect of sympathetic stimulation is to inhibit GB motility  (11). There is evidence that adrenergic agents produce GB relaxation (12) via a beta adrenoreceptor­mediated effect (13).

  

Page 253

B—  Hormonal Control The endocrine factors include both intrinsic and extrinsic hormones and/or peptides that act as hormones (neurotransmitters or neuromodulators). A summary of the  effects of these compounds on GB motility is shown in Table 1. The intrinsic neurotransmitters include acetylcholine, vasoactive intestinal peptide, nitric oxide, gastrin­ releasing peptide, and substance P. These are present in the autonomic plexuses within the GB wall. Of the extrinsic hormones, the most important is CCK; however,  others like somatostatin, motilin, and pancreatic polypeptide also play an important role in regulating GB motility. CCK is a peptide hormone (33 amino acids), that was first extracted from the small intestinal mucosa and given its name by Ivy and Oldberg (14). Its C­terminal  sequence of eight amino acids (CCK octapeptide) was later identified as the active segment (15). Its release from the intestinal mucosa is stimulated by luminal H+, fat,  and amino acids (16) and inhibited by pancreatic secretion (especially trypsin) and, in a negative­feedback fashion, by bile salts (17). CCK produces a dose­ dependent GB contraction in vitro (18,19) and in vivo (20). Its action is mediated by binding to a specific receptor on the smooth muscle cells of the GB (21).  Blockade of this receptor by a specific CCK antagonist loxiglumide completely abolishes CCK­induced GB contraction (22). CCK acts directly on the GB smooth  muscle and its effect is not significantly altered by cholinergic or adrenergic blockade (13,23). It has also been identified within vagal neurons in the GB intramural  plexus and may act as a parasympathetic neurotransmitter (12). Gastrin has some structural similarity to CCK (24) and some cholecystokinetic activity, but at pharmacological rather than physiological doses (19,25). Gastrin­ releasing peptide immunoreactive nerve fibers and functional receptors have also been demonstrated in the GB wall of the pig, and their stimulation has been shown to  cause GB contraction. However, its role in the regulation of GB motility remains unclear. Motilin is a polypeptide produced in the upper gastrointestinal mucosa; it has  been shown to cause GB contraction both in vivo (26) and in vitro on isolated smooth muscle cells from the GB (27). Spontaneous fasting GB contractions have been  shown to be associated with increased endogenous serum motilin levels (28,29). Secretion is also produced in the upper gastrointestinal mucosa in response to luminal  acidic contents. On its own, it has no effect on the GB; but it can protentiate the effects of CCK (30–34). Somatostatin, a 28­amino acid peptide released by the  intestine in response to a fatty meal, is a potent inhibitor of GB contraction, whether meal­stimulated, vagally induced, or CCK­induced (35). Female sex hormones  (estrogen and progesterone receptors) have been identified GB (36), but no direct effect of these compounds on the GB has been demonstrated. During pregnancy,  increased resting GB volume (37,38) as well as impaired GB emptying in response to food (38,39) have been demonstrated. C—  Other Peptides and Neurotransmitters With regard to intrinsic neurotransmitters, acetylcholine plays an important role in controlling interdigestive GB motility (40,41), specifically via muscarinic receptors  (42). Vasoactive intestinal peptide (VIP)­immunoreactive nerve fibers have been demonstrated in the GB wall of different species (43), and its stimulation causes GB  relaxation (44–46). However in none of these studies have the plasma levels of VIP been measured to distinguish between the physiological and pharmacological  actions of this peptide. The GB is supplied by three types of nerve fibers: cholinergic, CCK­ergic and VIP­ergic. The vagal regulation of GB tone and contraction is,  therefore, the net result of the interplay between the stimulatory actions of acetylcholine and CCK and the inhibitory actions of VIP. Nitric oxide acts as a neurotransmitter in nonadrenergic, noncholinergic pathways of the gastrointestinal tract including the GB (47). This compound has been found to  inhibit GB tone and contraction in both animal and human studies (48–51). Pancreatic polypeptide, peptide

  

Page 254

YY, and neuropeptide Y are all 36­amino acid peptides with considerable sequence homology. Pancreatic polypeptide and peptide YY both cause relaxation of the  GB and may be important in facilitating postprandial Gb refilling (52,53). Neuropeptide Y, unlike the other two, has been shown to promote GB contraction (54). A number of other peptides have known effects on GB motility, but their physiological significance is unclear. Substance P causes GB contraction (55). Calcitonin  gene­related peptide, pancreastatin, and neurotensin all inhibit CCK­stimulated GB contraction or cause GB relaxation in vivo (56–58). Histamine can cause both GB  contraction by binding to H1 receptors and GB relaxation mediated by H2 receptors (59). Prostaglandins have also been shown to have potent effects on enhancing GB motility in animals and humans (60–62). These effects are inhibited by opiates and  tetradotoxin but not by hexamethonium or atropine (61), suggesting that prostaglandins act on intrinsic noncholinergic, nonadrenergic nerves. Opiates are produced  endogenously by neuroendocrine cells of the gut mucosa and myenteric plexus. They have been found to inhibit CCK­induced GB emptying and to increase fasting  GB volume (63). Control of GB motility is therefore a complex process involving both the enteric and autonomic nervous systems as well as an interplay between several hormones.  The specific role of each system is difficult to investigate because of mutual regulatory mechanisms involving different nervous circuits, neurotransmitters, and  hormones. IV—  Role of the Gallbladder in the Enterohepatic Circulation of Bile Acids The integrity of the enterohepatic circulation depends on the intact function of two physical pumps (GB and intestinal motility) and two chemical pumps (active bile acid  uptake by the terminal ileum and by the liver). During fasting, a large proportion of the bile acid pool collects in the GB and is concentrated there by removal of water  and electrolytes; consequently the organic constituents become concentrated by a factor of 5 to 10 (64). The proportion of hepatic bile handled in the GB prior to  delivery into the duodenum has been estimated to be 35 to 50% in the baboon (65) and about 75 to 100% in humans (20,66). Besides receiving, storing, and concentrating bile, the function of the GB is to react to the stimulus of eating by contracting and discharging its content into the  duodenum. In contracting, the GB acts as as motor driving the enterohepatic circulation (67). When the GB is inert, as is the case in patients with celiac disease, the  enterohepatic circulation is said to be sluggish. The distribution of the bile acid pool changes during the day. This phenomenon is illustrated by the diurnal pattern in bile acid concentration in blood and in bile.  Increased postprandial bile acid concentration, by comparison with the fasting state, has been reported in humans in portal (68–69) and peripheral blood (68, 70–73).  These observations imply a role for the mechanical pumps (GB and intestinal motility) in the diurnal variation of the bile acid pool distribution. Indeed the role of GB  emptying in regulating the size of the bile acid pool in humans was elegantly demonstrated by Duane and Hanson (74), who found a significant inverse correlation  between GB emptying and the pool sizes of both cholic and chenodeoxycholic acids. They attributed that to variations in fractional turnover rates but not synthesis  rates for the two primary bile acids, as only the former but not the latter correlated with GB emptying. Prolonged increase in GB emptying induced by CCK  octapeptide injections has also been shown to cause a reduction in the size of the bile acid pool and an increase in fractional turnover rate but no change in the  synthesis rate of the two primary bile acids (75). Everson et al. (76) demonstrated that more complete GB emptying and faster intestinal transit increased hepatic  secretion and enterohepatic cycling of all biliary lipids and reduced the molar percent of cholesterol in bile. The above studies have provided the rationale that GB  motor functions are important for maintaining the integrity of the enterohepatic circulation and that abnormal­

  

Page 255

ities of GB motor functions are instrumental in the pathogenesis of gallstone disease. This is best illustrated by the fact that 50% of patients with acromegaly who are on  octreotide therapy develop gallstones (77). V—  Measurement of Gallbladder Motor Functions Four techniques have been used for measuring GB motor functions. These are oral cholecystography, ultrasonography, cholescintigraphy, and duodenal perfusion  techniques. The advantages and disadvantages of each of these techniques are discussed separately. A—  Oral Cholecystography This technique was first applied by Boyden (4,5) to the systematic study of GB motor function; the method he devised for the measurement of GB volume (5) was  later improved by DePaula and Silva (78). It was still the principal technique used for measuring GB volume and emptying in the 1960s (79–81). GB volume is usually  estimated by direct measurement from oral cholecystogram images. It is no longer used as a research method due to the radiation hazards and pitfalls in the method  itself (the volume measurements being based on planimetric geometry and on several theoretical assumptions). The distance of the subject and the x­ray film from the  x­ray tube can lead to large magnification errors and thus variable errors in volume estimation. This can probably account for the many conflicting results from early  studies on GB emptying using oral cholecystography (82). Keeping the distance between x­ray film and x­ray tube constant although still produces a constant  magnification error, but it can get rid of some of the variability in repeated volume measurements (83). B—  Ultrasonography In 1978, the use of ultrasonography in measuring GB emptying was first reported by Ornstein et al. (84). It quickly became the method of choice for measuring GB  volume because, unlike cholecystography, it involves no radiation hazards and can therefore be used to carry out repeated measurements (85,86). Conventionally, by  using an ultrasound probe situated over the abdomen, the GB is visualized on a screen. A caliper is used to determine the largest longitudinal and transverse diameters.  The probe is then positioned at a right angle to its first position and a third diameter is calculated. The three diameters are used to calculate GB volume. GB images can  be either filmed using an attached camera or stored on a linked computer for later analysis. Quantitatively, the information provided by both techniques above is similar, as they both measure fluctuations in GB volume—as shown by Everson et al. (87)—but  measurements by ultrasonography are more accurate than by cholecystography due to lack of magnification errors. The specific disadvantge of ultrasonography,  however, is its dependence on personal operator skills, resulting in high intra­ and interobserver error (87). Disadvantages inherent to both techniques are as follows: 1. GB volume calculations are geometry­dependent, requiring assumptions to be made regarding GB shape. Thus standardizing the position of the subject with regard  to the x­ray tube during cholecystography, as well as the angle of the probe and the timing of the measurement with regard to inspiration or expiration during ultraso­  nography, are important in minimizing errors due varying GB geometry. 2. Changes in volume without any change in bile flow in and out of the GB may occur because of net secretion or absorption of fluid across the GB wall. 3. If GB emptying and refilling both occur between one observation period and the next, cholescintigraphy and ultrasonography can detect only the net result of both

  

Page 256

events. For example, if an emptying of 10 mL and refilling of 4 mL both occurred between two observations, cholescintigraphy and ultrasonography will detect an  emptying (reduction in GB volume) of 6 mL. 4. The information obtained may differ according to the length of the observation period and to the frequency of observations. For example, measurements made at  20­ or 30­min intervals may provide a different value for maximum GB emptying from those carried out at 5­ to 10­min intervals. Similarly, studies lasting 30 min may  provide a different picture of GB emptying from those lasting 120 min or longer. 5. Obesity, intraabdominal gas, blocked cystic duct, and thickened GB wall are among many factors that can cause poor GB visualization by either or both techniques  and hence may introduce errors in volume calculations. Furthermore, cholecystography is indirect, requiring hepatic metabolism and excretion of contrast material and  concentration by the GB. It is necessary, therefore, for one to be prudent in interpreting or comparing results of studies using these techniques. C—  Cholescintigraphy In 1966, Englert and Chiu (88) were the first to report that the use of a gamma­labeled radio­isotope (113mI­iopanoic acid), secreted specifically into bile, in  combination with external scanning using a scintillation counter, could overcome many of the problems inherent in other methods. In 1975, Harvey et al. (89)  described the use of 99mTcHIDA, one in a family of improved hepatobiliary agents, which—due to their high specificity for hepatic uptake and excretion, short half life,  and low radiation exposure—rapidly became the most suitable substances for hepatobiliary scintigraphy. The transport of 99mTcHIDA across the hepatocyte follows a  carrier­mediated organic anion pathway, similar to the hepatic handling of bilirubin (90). Furthermore, the use of a gamma camera linked to a computer system has  enabled studies to be recorded on tape or disk and then played back to delineate precise regions of interest and exclude adjacent structures (91–93). More recently, a synthetic gamma­labeled bile acid analogue, 75SeHCAT, has become available for hepatobiliary scintigraphy. This substance behaves like a natural  bile acid with regard to its overall enterohepatic circulation, ileal absorption, and hepatic uptake (94–97). With regard to measuring GB motor functions, the main  difference between 99mTcHIDA and 75SeHCAT is that the former is not reabsorbed in the intestine whereas the latter is reabsorbed in the terminal ileum and  undergoes enterohepatic recycling (98). Thus, following a bolus injection of both isotopes, the postprandial GB activity measurement of 99mTcHIDA provides an index  of GB emptying only, whereas that of 75ScHCAT provides an index of GB emptying plus refilling. The conventional procedure for 99mTcHIDA GB scintigraphy is to inject 99mTcHIDA as an intravenous bolus, then allowing sufficient time for it to be excreted by the  liver and for a proportion to get partitioned into the GB. 99mTcHIDA activity over a period of time is then monitored over the GB region of interest, following  administration of a stimulus to contract the GB. Immediately prior to GB contraction, the proportion of 99mTcHIDA in the GB out of the total abdominal activity is used  to determine fasting GB filling. Following GB contraction, the percentage reduction in fasting GB activity is used to determine absolute GB emptying. It is called  absolute because no 99mTcHIDA activity is present in the hepatic bile entering the GB postprandially. 99mTcHIDA can also be administered as a continuous infusion at  a constant rate (99). Using this procedure, one can measure a postprandial GB change in activity, which is a net result between that leaving and that entering the GB.  This in a way is similar to the information obtained with ultrasonography. The main advantages of cholescintigraphy is that the technique is noninvasive, quantitative, and reproducible and has a low interobserver error (100). Furthermore,  99mTcHIDA is a

  

Page 257

high­energy, short­half­life compound, allowing a small dose with negligible radiation hazard to enable accurate observations to be carried out at a high sampling  frequency. The main disadvantages of cholescintigraphy are as follows: 1. When it is carried out in the conventional way, the fasting GB volume is not known; thus all measurements are a fractional percentage of an unknown starting volume  and are usually expressed as a percent of the starting 99mTcHIDA GB activity. 2. The main assumption in this technique is that when 99mTcHIDA enters the GB with hepatic bile, it mixes homogeneously and immediately with GB contents.  Although there is some evidence suggesting no stratification of GB contents in health (101), the same cannot be said in gallstone disease; there is no information on  other disease categories. 3. The concentration of 99mTcHIDA activity differs between hepatic bile and GB bile even when a constant hepatic infusion of 99mTcHIDA is used. Indeed, hepatic bile  should theoretically contain very little or no 99mTcHIDA activity if a bolus injection is used and sufficient time is allowed for it to clear the liver. Thus, in the context of  expulsion of GB contents, a reduction in GB 99mTcHIDA activity of, for example, "20%" at the beginning of the emptying phase (a large amount of emptying  accompanied by a small amount of filling), has a different meaning from a "20%" reduction at the end of the emptying phase (a small amount of emptying accompanied  by a large amount of filling). 4. Varying the distance between the region of interest and the gamma camera crystal, whether situated anteriorly or posteriorly, can introduce errors in radioactivity  counting. Thus, in a large GB, if an anterior gamma camera crystal were used, the same amount of radioactivity would give a higher count if it were situated at the  topmost part of the GB than if it were placed at the bottom of the GB (101,102). Ideally, a combination of anterior and posterior recording of activity and calculation  of the geometric mean should be carried out (101,103). For continuous imaging, this would require a double gamma camera, which is not always available. D—  Duodenal PerfusionTechniques These techniques provide an alternative method of measuring GB motor functions; they are not influenced by GB absorption or secretion and therefore specifically  indicate GB storage or emptying. Whether it provides net or absolute of GB storage of emptying depends on the experimental conditions and particularly whether a  hepatic bile marker, a GB bile marker, or both are used in addition to a duodenal recovery marker. Conventionally, this technique enables recovery of an endogenous  (bilirubin) or exogenous (indocyanine green) hepatic bile marker to be measured by comparison with nonabsorbable recovery markers infused intraduodenally  (104,105). Since these hepatic markers are excreted by the liver at a known and constant rate, net GB emptying is measured when the duodenal recovery of the  hepatic marker exceeds its hepatic secretion rate; net GB storage is being measured when the duodenal recovery is lower than the hepatic secretion rate (66). The  main disadvantages of these techniques are as follows: 1. They are quite invasive, requiring continuous intravenous infusions over long periods of time (12 to 24 h), intraabdominal catheters using x­ray screening situated at  specific parts of the stomach and duodenum and checked radiologically to ensure that they have not changed position. 2. Sampling frequency is low because a representative sample must be collected to ensure that correction for incomplete recovery does not introduce large errors.  Errors can also occur due to incomplete aspiration or inadequate mixing of GB contents with gastric and duodenal secretions.

  

Page 258

3. Aspiration techniques assume a steady state and are unable to differentiate in the duodenal aspirate between duodenal and GB bile unless a dual­marker technique  is employed (66). 4. The hepatic marker indocyanine green can itself alter GB motor functions by its choleretic effect (106). Similarly, depletion of the duodenal bile acids during  aspiration and reinfusion of part of the aspirate as boluses may affect GB motility through its marked effect on intestinal motility (107,108). VI—  Parameters of Gallbladder Motor Functions A—  Gallbladder Volume Measurement of GB volume forms the basis for the assessment of GB motor functions by cholecystography and ultrasonography. B—  Gallbladder Filling and Storage GB filling is determined by the rate of bile secretion from the liver and the resistance to flow through the lower end of the bile duct produced by the sphincter of Oddi.  This latter factor is the main regulator of bile flow into the GB or duodenum, although there is some evidence that the cystic duct displays sphincter­like properties (18)  and responds to pharmacological and hormonal stimuli (109). Bile that enter the GB is concentrated by transport of solute and water across the GB mucosa. The amount (or mass) of compound stored in the GB is the product of  the volume of bile within the GB and the concentration of the compound. Thus, GB storage of a compound is influenced by the GB motor functions that regulate GB  volume and its concentration capacity. In this chapter, the term GB filling refers to the short­term partitioning of bile or its constituents in into the GB, whereas GB  storage refers to the long­term (overnight) storage capacity of a compound that has been affected by the concentration process in the GB. In vivo, GB filling is measured by selecting a test compound and determining the amount of the compound that partitions into the GB. Filling can be quantitatively  expressed as percent filling or filling rate. These have been conventionally measured by short­term (60­ to 90­min) cholescintigraphic techniques. Using these  techniques, filling rate (i.e., the rate of 99mTcHIDA accumulation in the GB expressed as a percent of the maximum activity of the isotope in the GB on completion of  the filling phase) has been reported to average 2 to 2.5%/min (20). Percent filling (usually taken as the GB activity expressed as a percent of the total abdominal  activity of 99mTcHIDA) has been reported to average 40 to 70% (20,101,110). The variations can in part be accounted for by methodological differences. Shaffer et  al. (20) and van der Werf et al. (110) used one (anterior) gamma camera scanning head only for assessing 99mTcHIDA activity, whereas Jazrawi et al. (101) used two  scanning heads (anterior and posterior) and found, with this latter technique, that the error in radioactivity counting due to variable distance of the GB from the  scanning head is about 8%, compared with an error of up to 300% when one scanning head is used. GB refilling following administration of a solid meal has been  reported by Lawson et al. (111) to start at about 250 min after the meal and to be 70% complete at about 340 min when ultrasonography is used to assess changes in  GB volume. The long­term storage function of the GB has been measured by using duodenal perfusion techniques (104,105) and reported to be 50 to 58% of the bile  acid pool. Another technique to assess long­term GB storage is to measure the mass of bile acids within the GB and express that as a proportion of the total size of the bile acid  pool (102,112). Such studies have yielded similar values to those obtained by perfusion studies. It therefore appears that short­term GB filling studies, although hardly  representative of GB storage function during a physiological period of fasting, agree with long­term studies in indicating that

  

Page 259

the GB on average stores about 50% of hepatic bile during the interdigestive period. Animal studies carried out in animals (65,113) also agree with this quantitative  estimate of GB storage function. C—  Gallbladder Emptying All the different techniques described above have been used to assess GB emptying. With cholescintigraphy and ultrasonography, GB volumes are determined in the  fasting state and at different intervals following stimulation of GB contraction. The reduction in poststimulus GB volumes, by comparison with fasting GB volume, has  been used to describe different GB emptying parameters as follows: 1. Lag time, which is the time between application of stimuli and the start of GB emptying. 2. Maximum emptying, which is the difference between the smallest poststimulus and fasting GB volumes. Results have been expressed in terms of milliliters or in  percentage terms, whereby fasting GB volume is considered as 100%. 3. Ejection fraction, which is calculated at different time periods from the fractional reduction in fasting GB volume at the time of observation. It is expressed either in  percentage terms considering fasting GB volume as 100%, or in milliliters (ejection volume). This calculation has been the most popular, because several  measurements can be made at different observation times and plotted against time to demonstrate an emptying pattern. 4. Emptying rate, which is calculated by dividing the ejection fractions or volumes by the time period between start of stimulus and observation. Results can again be  expressed in terms of percent per unit time or milliliters per unit time. Using cholescintigraphy, the GB volume cannot be measured. However, all the above kinetic parameters can be calculated exactly as described above, but using GB  counts (of the radioisotope) in the fasting and poststimulus states instead of the GB volumes and expressing the results in percentage terms, considering the fasting GB  count to be 100%. Continuous scintigraphic imaging has the advantage over ultrasonography that observations can be made at very frequent time intervals (<1 min)  and that radioisotope counting by a gamma camera is more sensitive than volume calculation on ultrasound. Duodenal perfusion techniques, when used in the  conventional way, can measure emptying rates but not emptying volumes or ejection fractions. With the use of continuous gamma camera imaging, there is now a consensus that the pattern of GB emptying approximates a double exponential function: a rapid fast  exponential where about 50% emptying occurs in around 30 min (114,115) followed by a slower exponential. A similar biphasic pattern for GB emptying has been  observed using ultrasonography (111). D—  Mixing Function of the Gallbladder Mixing of freshly secreted hepatic bile with GB content is supported by the observation that both lipid­soluble contrast media and water­soluble cholescintigraphic  agents are evenly distributed within the GB. Although it is conceivable that the turbulence caused by GB emptying may favor mixing of GB contents postprandially,  little is known of the mechanism involved in this effect in the fasting state. Shaffer et al. (1978), cited by Howard (116), studied the mechanism of GB uptake of  intravenously injected contrast media radiologically. They reported early collection of the contrast media in the infundibulum 15 min after its intravenous injection,  followed by its spreading within the GB from the wall toward the fundus, with complete mixing after 2 h. Van der Linden and Kempi (117) studied the kinetics of the  mixing process using

  

Page 260

computer­assisted cholescintigraphy. They reported a pattern characterized first by the appearance of activity along the long axis of the GB, with subsequent lateral  spreading. They constructed time­activity curves for 99mTcHIDA activity in the ''proximal" and "distal" parts of the GB. Using this technique, they almost always  observed simultaneous increase of activity in both distal and proximal. Jazrawi et al. (101) measured the ratio of 99mTcHIDA activity to bile acid concentration in  successive GB bile­rich duodenal samples aspirated following GB stimulation. The 99mTcHIDA had been injected as an intravenous bolus 2 h earlier. They found a  constant ratio despite large differences in the bile acid concentrations in the successive samples. They argued that the successive samples represented bile from  different areas in the GB, and that the constant ratio suggested homogenous mixing of 99mTcHIDA or by implication hepatic bile with the GB contents in healthy  subjects. The driving forces involved in the exchange mechanism between different parts of the GB are unknown, but one possibility is that the turbulence created by rapid  alternations in filling and emptying in the interdigestive and postprandial. period may play a role (66). Impairment in the filling and emptying functions of the GB could  therefore lead to stratification of GB contents, which might contribute to the pathogenesis of gallstone disease. VII—  Variability of Gallbladder Motor Functions in Health and Disease In health, there is no established physiological range for any of the kinetic parameters of GB motor functions described above. Furthermore, studies on gallbladder  motor function in patients with gallstones have yielded conflicting results. Increased (118–120), normal (121), and impaired gallbladder emptying have all been  described (122–129). Several factors are implicated in the wide variability in results obtained in the different studies. These factors fall into three categories: (a)  subject­related differences, (b) methodological differences, and (c) conceptual differences. Each of these categories is discussed separately. A—  Subject­Related Differences 1—  Intraindividual Variation In cholescintigraphic studies in particular, intraindividual variability makes it difficult to discriminate between normal and abnormal GB emptying. In order to overcome  this problem, Mackie et al. (130) attempted to, construct a database for GB emptying in asymptomatic subjects to be used as a reference in clinical cholescintigraphy.  They. found percent 99mTcHIDA remaining in the GB, 50 min after administration of 300 mL milk had a value of 21 ± 58% (mean ± 2 SD), and the authors stated that  the range of responses was too broad for normal value purposes. Similar wide variations in fasting and residual GB volumes and in GB contraction have been  observed using ultrasonography in healthy subjects (131). In an attempt to explain the variability between individual subjects, Baxter et al. (114) suggested the possibility of subpopulations of healthy subjects for GB emptying.  These authors, by measuring simultaneously gastric emptying and GB emptying using two different gamma­labeled isotopes, were able to divide their healthy controls  into two groups: a group with GB emptying in relation to eating and a second group with GB emptying unrelated to eating. The former group was also separated into  two subgroups with a high and low efficiency in GB emptying in terms of both t1/2 and ejection fraction, respectively. The differences between the groups could not be  accounted for by age, sex, or body weight. Similar observations have been reported in gallstone subjects with radiologically functioning GBs (124,132,133). In these  latter studies two populations of gallstone patients have been reported: "contractors" and "noncontractors." Although the proposal of a nonnormal distribution of GB  emptying in the general population may be attractive, it must be born in mind that results in the studies reported above

  

Page 261

have been based upon arbitrary separation of the subgroups and a small number of subjects. A true bimodal distribution of GB emptying parameters will need  epidemiological studies for confirmation. 2—  Effect of Age, Sex, and Obesity Results on comparisons between young and old subjects are conflicting, with reduced, similar, and increased GB motor functions reported (28,91,130,134–136).  Similarly, with regard to the effect of sex, some authors have reported reduced GB emptying in males as compared with females, whereas others have found no  difference (91,111,130). In a large population studied by ultrasonography (136), the authors found that males had larger GB volumes than females at all ages, but  those authors did not compare GB emptying in the two sexes. In females, the ovulatory cycle is thought to influence GB motor functions to only a minor degree  (38,39,137). Progesterone, however, can cause impairment in GB motor functions, as has been shown from both in vivo and in vitro studies (137,138). There is some evidence that obesity may influence GB motor functions (139–141) and that obese subjects have larger GB volumes than nonobese subjects (136). The  balance of evidence, however, suggests that obesity per se has no effect on GB motor functions (142,143). The increase in gallstone prevalence in obese populations  (144–146) is thought to be due to increased hepatic cholesterol synthesis and secretion rather than impaired GB motor functions. B—  Methodological Differences 1—  Type of Stimulus A wide variety of stimuli have been used in different studies on GB motor functions. These have included hormones (CCK, CCK­octapeptide, motilin, cerulin);  prokinetic agents (cisapride, erythromycin, nitric oxide synthase inhibitors); relaxing agents (octreotide, loxiglumide, nitric oxide synthase stimulators) or meals of  different caloric values; constituency (solid, liquid, or mixed) or composition (amino acid or fat content). This has to be taken into consideration when comparisons  between different studies are made, as it has been demonstrated, for example, that meal composition can affect GB emptying (76,147–149). Liquids empty quickly  from the stomach and stimulate immediate CCK release from the upper intestine to induce rapid GB contraction, whereas solids empty more slowly, maintain  prolonged CCK release, and induce tonic GB contraction. Gastric emptying, which influences GB contraction, is itself dependent on the physical state of the meal  (liquid or solid) as well as on its fat content (148). 2—  Dose and Route of Administration A dose­response effect has been reported for cholecystokinin (91,92) and also for synthetic cholecystokinin analogues (150). It is therefore important to take into  consideration whether a physiological or pharmacological dose of a stimulus or whether a low­ or high­caloric­value meal is administered. A different pattern of GB  emptying has been reported for intravenous infusion by comparison with either intravenous or intramuscular bolus injection of hormones (150). Because meals are  given orally, they may cause GB contraction via a cephalic phase (114). 3—  Techniques Used for Assessing Gallbladder Motor Functions Difficulties may arise from the differences in methods used for the assessment of GB emptying and for expression of results. Thus time lag measured by continuous 1­ min­frame cholescintigraphy (20,114) is not comparable with that measured by duodenal recovery of bile marker (74) because of the delay in the recovery of  duodenal contents and the longer time intervals between consecutive samples in using the latter method. Results of emptying rates as measured

  

Page 262

by cholescintigraphy (114,123) are usually expressed in terms of t 1/2 (time for the gamma­labeled GB bile marker to half its activity over the GB region of interest) or  as time for maximum emptying. These results are not comparable to those obtained by ultrasonography or by cholecystography (5,76). The main reason is that  cholescintigraphic techniques are not affected by GB filling and can only detect "absolute" GB emptying, whereas both ultrasonographic and radiological techniques  measure changes in GB volume and thus are affected by GB filling; therefore they measure "net" GB emptying (66). The duration of procedures can vary widely, especially with ultrasound studies. Some studies have lasted as little as 30 min, whereas others run to 3 to 4 h. Similarly,  the observation frequency has varied between 1/min and 1 to 2/h. 4—  Expression of Results Results form previous studies especially on GB emptying have been expressed in a number of ways. Terms such as ejection fraction, ejection rate, ejection  volume, % emptying, rate of emptying, emptying volume, time to maximum emptying, time to 50% emptying, slope of emptying, area under the curve for  emptying, and so on are among ones used in both ultrasound­

Figure 1 The old concept of the behavior of the GB in response to a stimulus, which is in the form continuous emptying over a period of time followed by continuous filling. The new concept of rapidly alternating short periods of emptying and refilling occurring during the whole postprandial period.

  

Page 263

or cholescintigraphy­based studies. This wide variation in the expression of results adds to the difficulties encountered in trying to compare previous studies. C—  Conceptual Problems Qualitatively, the response of the GB to food or hormones has been conventionally described as a continuous smooth emptying curve (Fig. 1A). This pattern has been  reported by all the different techniques, including cholecystography (151,152), ultrasonography (87,133, 134,153,154), and cholescintigraphy (10,35,93,114,130) as  well as intestinal perfusion techniques (74,104,105). All the above techniques had two unifying methodological aspects: First, for the cholecystographic and  ultrasonographic studies, time intervals between observations were relatively long (15 min or more), thus they were unable to detect what happens during the 15­min  intervals. Second, for the cholescintigraphic and perfusion studies, only one marker of GB or hepatic bile was used. Thus only one pattern of GB motor function  (emptying or filling) could be observed. In a few studies, when certain modifications to conventional methodology were applied (mainly more frequent measurements),  there were clues to a different pattern of postprandial GB response: that of a rapid alternation between emptying and filling (5,155,156). Further evidence of this new  pattern of GB motor function has been provided by several animal studies (26,157,158). VIII—  Gallbladder Motor Functions: Concepts and Methods The assumption that in humans the GB empties progressively after meals and refills progressively between meals was originally challenged by studies using dual isotope  scintigraphy (98), which demonstrated that both emptying and refilling occurred simultaneously during the postprandial period (Fig. 2). This observation was later  confirmed by measuring simultaneous postprandial emptying and refilling using a combination of duodenal perfusion and scintigraphy (66). The observation of  intermittent postprandial emptying and refilling has also been reported in humans using minute­by­minute ultrasonography (120). On the basis of these observations, a new concept of GB response to a stimulus was proposed (Fig. 1B), in which the continuous emptying and refilling phases shown  in Fig. 1A are composed of several small, rapidly alternating phases of emptying and refilling. None of the previous studies of gallbladder motor function in health and gallstone disease, however, have been designed to enable assessment of both emptying and  refilling, since neither ultrasonography nor scintigraphy used alone is capable of assessing both events simultaneously. In fact, ultrasonography measures changes in  gallbladder volume, which are dependent on refilling, whereas scintigraphy measures the reduction in total GB isotope counts, which is independent of refilling (Fig. 3). Jazrawi et al. in 1995 (115) employed both ultrasonography and scintigraphy simultaneously to measure GB emptying in healthy subjects and gallstone patients. This  enabled them to quantify for the first time postprandial GB refilling, and to calculate turnover of bile within the GB (being the sum of postprandial GB emptying and  refilling). They observed that GB refilling started immediately after a meal, increased slowly during the first 40 min of the postprandial period and faster afterwards.  This pattern is not surprising as both emptying and refilling takes place in a rapid alternating fashion through a single channel (cystic duct). It is therefore logical to  assume that there is a limit to the overall traffic of bile (input plus output; see Fig. 3) through this channel. Hence, a large output (emptying) during the fast emptying  phase would lead to a small input (refilling) and vice versa. The finding in the healthy subjects of GB refilling of 41 mL at 90 min (115) confirms the observation (66)  that the majority of hepatic bile enters the GB before reaching the duodenum even in the postprandial period. The large discrepancy between cumulative refilling and  residual GB volume suggests that the he­

  

Page 264

Figure 2 Time­activity curves generated over the GB area for 99mTcHIDAe and  75 SeHCAT using simultaneous dual­isotope recording. Following an initial  rapid emptying phase, where the activities of both isotopes decrease in parallel, the activity of the absorbable isotope 75SeHCAT starts to increase,  whereas that of the nonabsorbable 99mTcHIDA continues to decrease. This  suggests that at the latter part of the emptying phase, both emptying and filling of the GB were occurring in the same time.

patic bile that enters the gallbladder in the postprandial period leaves quickly, thus confirming the "washout effect" (120) postulated in a previous study. Jazrawi et al. (115) also reported that the cumulative turnover of bile in the GB (the volume of bile handled by the GB in the postprandial period) was more than five  times the fasting GB volume in health, suggesting that the GB is a dynamic organ With complex motor functions and not a mere storage sac for bile that empties  postprandially. Lanzini et al. (66), have demonstrated that rapid alternations in GB filling and emptying occur not only postprandially but also during fasting. They  suggested that these rapid alternations contribute to mixing of GB contents. The results of Jazrawi et al. (115) confirmed that these rapid alternations are indeed  associated with high turnover of bile within the GB (i.e.; a "washout effect") postprandially. They are therefore likely to have a similar effect in the fasting state. The  same authors also demonstrated that in gallstone patients both GB refilling and turnover were markedly impaired in gallstone patients (115) and that they are useful  measures to distinguish between those with and those without gallstone recurrence (159). IX—  Prospective Studies A—  Techniques Although there has been a vast improvement in the techniques for measuring GB motor functions in the past decades, there is still scope for further improvement. Three  dimensional (3D) ultrasonography is not influenced by differences in GB position due to the respiratory cycle,

  

Page 265

Figure 3 This diagram postulates a bidirectional traffic of bile in the cystic duct during fasting (large filling,  small emptying) and the postprandial period (initial large emptying accompanied by small filling, followed by reduced emptying and increased filling). It also shows the different pattern of results obtained by ultrasound and scintigraphy, suggesting that these techniques do not measure the same parameters of GB motor functions.

thus it has the advantage over conventional ultrasonography of more accurately measuring GB volume. Furthermore, it should, in theory, allow more frequent  measurements to be carried out because it is not restricted by the respiratory cycle. If the 3D probe can be secured to the abdominal wall, 24­h monitoring of  fluctuations in GB volume should become possible. With regard to scintigraphy, long­half­life gamma­labeled isotopes should enable the retention of GB contents to  be measured. In the context of gallstone formation, it is of less importance to know how much the GB empties than how long what remains in the GB stays there. B—  Methods It is now recognized that postprandial GB filling and turnover play an important role in the pathogenesis of primary and recurrent gallstones. Future studies should  enable the assessment of these parameters in high­risk patients (Table 2) like the obese; those on weight­reducing diets, parenteral nutrition, or female sex hormones;  diabetics; and patients with Crohn's disease. It should be possible to resolve some of the controversies in the results obtained with regard to the effect of certain  prokinetic agents like motilin agonists (160,161), antikinetic agents like nitric oxide (47–49,51), or octreotide (162,163). Ursodeoxycholic acid (UDCA) has long been established in the nonsurgical treatment of gallstones, but there is still a lot of controversy regarding its effect on GB  emptying (164–167). Indeed, most studies have shown that UDCA impairs emptying (166,167). Most of these studies are based on ultrasound, which measures net  differences in gallbladder volume and thus an increase in refilling, which is expected with a choleretic agent like UDCA, might be detected as reduced emptying by  ultrasound.

  

Page 266 Table 2 Conditions Associated with Abnormalities  in Gallbladder Motor Functions Condition

GB motility

Gallstone disease

Down

 

Gastrointestinal diseases Crohn's diseasea

Down

b

IBS

Down

Celiac disease

Down

Idiopathic slow transit  constipationa

Down

 

Surgical procedures Biliopancreatic bypass

a

Down

Gastrectomya

Down

Vagotomya

Down

Sphincterotomy

Up

a

Colectomy

Down

Proctocolectomy plus ileal pouch

Up

 

Other conditions a

Down

Diabetes mellitus a

Down

Cirrhosis

Enteral nutrition

Up a

Parenteral nutrition

Down

Sickle hemoglobinopathy

Down

Pregnancy

Down

a

Down

Obesity

a

Rapid weight loss a

Down

Associated with increased risk of gallstones. Irritable bowel syndrome.

 

b

X—  Summary The GB plays an integral part in the enterohepatic circulation of bile acids, and normal GB motor functions are of vital importance to health. Control of GB motor  functions involves a constant interplay between a large number of stimulatory and inhibitory hormone and neurotransmitters. The concept of GB emptying during meals  and refilling between meals is not correct. GB response to a stimulus is more complex, involving rapid alternation of emptying and refilling during the postprandial  period. Present methodology (ultrasonography or scintigraphy alone) is not capable of evaluating both emptying and refilling in a quantitative manner, and previous  studies employing these techniques have yielded large variations in results in healthy persons and conflicting results in gallstone patients. Hence there is a need for  improved methodology. Postprandial refilling and turnover of bile are important parameters that need to be assessed in addressing gallbladder motor function and its  role in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease. References 1. Anatomy and Physiology Lectures, 2nd ed. Edinburgh, Scotland: University of Edinburgh, 1787, p 404 (quoted by Boyden, 1926). 2. Textbook of Physiology, 6th ed. Part II. Book II. 1895 p 495 (quoted by Boyden, 1926).

  

Page 267

3. Boyden EA. The effect of natural foods on the distention of the gallbladder with a note of the change in pattern of the mucosa as it passes from distension to  collapse. Anat Rec 1925; 30:333–363. 4. Boyden EA. A study of the behaviour of the human gallbladder in response to the ingestion of food, together with some observations on the mechanism of expulsion  of bile in experimental animals. Anat Rec 1926; 40:201–256. 5. Boyden EA. An analysis of the reaction of the human gallbladder to food. Anat Rec 1928; 40:147–189. 6. Boyden EA, Birch CL. Reaction of gall bladder to stimulation of gastrointestinal tract: 1. Response to substances injected into the duodenum. Am J Physiol 1930;  92:287–300. 7. Boyden EA, Fuller AH. Anatomy and physiology of the gall bladder in children. Am J Dis Child 1934; 48:565–576. 8. Boyden EA, Grantham SA Jr. Evacuation of Gall Bladder in Old Age. Surg Gynecol Obstet 1936; 62:34–42. 9. Hopman WPM, Jansen JBMJ, Rosenbusch G, Lamers CBHW. Cephalic stimulation of gallbladder contraction in humans: role of cholecystokinin and the  cholinergic system. Digestion 1987; 38:197–203. 10. Fisher RS, Rock E, Malmud LS. Gallbladder emptying response to sham feeding in humans. Gastroenterology 1986; 90:1854–1857. 11. Tierney S, Pitt HA, Lillemoe KD. Physiology and pathophysiology of gallbladder motility. Surg Clin North Am 1993; 73:1267–1290. 12. Strah KM, Melendez RL, Pappas TN, et al. Interactions of vasoactive intestinal polypeptide and cholecystokinin octapeptide on the control of gallbladder  contraction. Surgery 1986; 99:469–473. 13. Amer MS. Studies with cholecystokinin in vitro: III. Mechanism of the effect on the isolated rabbit gallbladder strips. J Pharmacol Exp Ther 1972; 183:527–534. 14. Ivy AC, and Oldberg E. A hormone mechanism for gallbladder contraction and evacuation. Am J Physiol 1928; 86:599–613. 15. Jorpes JE, Mutt V, Toczko K. Further purification of cholecystokinin and pancreozymin. Acta Chem Scand 1964; 18:2408–2410. 16. Thompson JC, Fender HR, Ramus NI, et al. Cholecystokinin metabolism in man and dogs. Ann Surg 1975; 182:496–504. 17. Gomez G, Liuis F, Guo Y­S, et al. Bile inhibits release of cholecystokinin and neurotensin. Surgery 1986; 100:363–368. 18. Doyle JS, Farrar JT. A sphincteric mechanism in the cystic duct of dogs. Irish J Med Sci 1969; 2:109–113. 19. Yau WM, Maklouf GM, Edward LE, et al. Mode of cholecystokinin and related peptides on gallbladder muscle. Gastroenterology 1973; 65:451–456. 20. Shaffer EA, McOrmond P, Duggan H. Quantitative cholescintigraphy: assessment of gallbladder filling and emptying and duodenogastric reflux. Gastroenterology  1980; 79:899–906. 21. Schjoldager B, Molero X, Miller LJ. Functional and biochemical characterization of the human gallbladder muscularis cholecystokinin receptor. Gastroenterology  1987; 96:1119–1125. 22. Schmidt WE, Creutzfeldt W, Schleser A, et al. Role of CCK in regulation of pancreaticobiliary functions and GI motility in humans: effects of loxiglumide. Am J  Physiol 1991; 260:G197–G206. 23. Hedner P. Effect of the C­terminal octapeptide of cholecystokinin on guinea pig ileum and gallbladder in vitro. Acta Physiol Scand 1970; 78:232–235. 24. Dockray GJ. Molecular evolution of gut hormones: application of comparative studies on the regulation of digestion. Gastroenterology 1978; 72:344–358. 25. Nakano M, McCloy RE, Gin AC, et al. Effect of prostaglandins E1, E2, F2 alpha, and pentagastrin on the gallbladder pressure in dogs. Eur J Pharmacol 1975;  30:107–112.

  

Page 268

26. Takahashi I, Suzuki T, Aizawa I, et al. Comparison of gallbladder contractions induced by motilin and cholecystokinin in dogs. Gastroenterology 1982; 82:419– 424. 27. Yamasaki T, Chijiiwa K, Chijiiwa Y. Direct contractile effect of motilin on isolated smooth muscle cells human gallbladder. J Surg Res 1994; 56:89–93. 28. Peeters TL, Vantrappen G, Janssens J. Bile acid output and the interdigestive migrating complex in normals and in cholecystectomized patients. Gastroenterology  1980; 79:678–681. 29. Vantrappen G, Janssens J, Hellemans J, et al. Motilin and the interdigestive migrating motor complex in man. Dig Dis Sci 1979; 24:497–500. 30. Cameron AJ, Phillips SF, Summerskill WH. Effect of cholecystokinin, gastrin secretin, and glucagon on human gallbladder in vitro. Proc Soc Exp Biol Med 1969;  131:149–153. 31. Jansson R, Svanvik J. Effects of intravenous secretin and cholecystokinin on net water absorption and motility in the cat. Gastroenterology 1977; 72:639–643. 32. Grace PA, Poston GJ, Williamson RCN. Biliary motility. Gut 1990; 31:571–582. 33. Ryan J, Cohen S. Interaction of gastrin I, cholecystokinin on gallbladder smooth muscle. Am J Physiol 1976; 230:553–556. 34. Ryan J, Cohen S. Pressure­volume response to gastrointestinal hormones. Am J Physiol 1976; 230:1461–1465. 35. Fisher RS, Rock E, Levin G, et al. Effects of somatostatin on gallbladder emptying. Gastroenterology 1987; 92:885–890. 36. Messa C, Maselli MA, Cavallini A, Caruso ML, Pezzolla F, Di Leo A. Sex steroid hormone receptors and human gallbladder motility in vitro. Digestion 1990;  46:214–219. 37. Redberg G, Asztely M, Cantor P, Rehfield JR, Jarnfeldt­Samsioe, Svanvik J. Gastric and gallbladder emptying in relation to the secretion of cholecystokinin after  a meal in late pregnancy. Digestion 1989; 42:174–180. 38. Braverman DZ, Johnson ML, Kern F. Effect of pregnancy and contraceptive steroids on gallbladder function. N Engl J Med 1980; 302:362–364. 39. Everson GE, McKinley C, Lawson M, Johnson M, Kern F. Gallbladder function in the human female: effect of the ovulatory cycle, pregnancy, and contraceptive  steroids. Gastroenterology 1982; 82:711–719. 40. Ura K, Sarna SK, Condon RE. Antral control of gallbladder cyclic motor activity in the fasting state. Gastroenterology 1992; 102:295–302. 41. Magee DF, Naruse S, Pap A. Vagal control of gallbladder contraction. J Physiol 1984; 355:65–70. 42. Yegen B, Biren T, Onat F, Tankurt E, Gurmen N, Oktay S, Chey WY, Ulusoy NB. Modulation of gallbladder contraction by pirenzepine in humans. Am J  Gastroenterol 1995; 90:1489–1494. 43. Sundler F, Alumets J, Hakanson R, Ingemansson S, Fahrenkrug J, Schaffalitzky de Muckadell O. VIP innervation of the gallbladder. Gastroenterology 1977;  72:1375–1377. 44. Jansson R, Steen G, Svanvik J. Effects of intravenous vasoactive intestinal peptide (VIP) on gallbladder function in the cat. Gastroenterology 1978; 75:47–50. 45. Vagne M, Troitskoja V. Effects of secretin, glucagon, and VIP on gallbladder contraction. Digestion 1976; 14:62–67. 46. Ryan JP, Cohen S. Effect of vasoactive intestinal polypeptide on basal and cholecystokinin induced gallbladder pressure. Gastroenterology 1977; 73:870–872. 47. Sanger P, Schneider H, Hanisch E. Nonadrenergic noncholinergic regulation of gallstone containing and gallstone free human gallbladders. Zentralbl Chir 1997;  122:418–424. 48. Mourelle M, Guarner F, Molero X, Moncada S, Malagelada JR. Regulation of gallbladder motility by the arginine­nitric oxide pathway in guinea pigs. Gut 1993;  34:911–915.

  

Page 269

49. Salomons H, Keaveny AP, Henihan R, et al. Nitric oxide and gallbladder motility in prairie dogs. Am J Physiol 1997; 272:G770–G778. 50. Pauletzki JG, Xu QW, Shaffer EA. Inhibition of gallbladder emptying decreases Cholesterol saturation in bile in the Richardson ground squirrel. Hepatology 1995;  22:325–331. 51. Konturek JW, Konturek SJ, Pawlik T, Domschke W. Physiological role of nitric oxide in gallbladder emptying in men. Digestion 1997; 58:373–378. 52. Conter R, Roslyn JJ, Muller EL, et al. Effect of pancreatic polypeptide on gallbladder filling. J Surg Res 1985; 38:461–467. 53. Conter RL, Roslyn JJ, Taylor IL. Effect of peptide YY on gallbladder motility. Am J Physiol 1987; 252:736–741. 54. Lillemoe KD, Webb TH, Pitt HA. Neuropeptide Y: a candidate neurotransmitter for biliary motility. J Surg Res 1988; 45:254. 55. Lonovics J, Varro V, Thompson JC. The effect of cholecystokinin and substance P antagonist on cholecystokinin­substance P­stimulated gallbladder contraction  (abstr). Gastroenterology 1985; 88:1480. 56. Hashimoto T, Poston GJ, Gomez G, et al. The effect of pancreastatin on cholecystokinin stimulated gallbladder contraction in vivo and in vitro (abstr).  Gastroenterology 1988; 94:A176. 57. Hashimoto T, Poston GJ, Greeley GH Jr, et al. CGRP inhibits gallbladder contractility. Surgery 1988; 104:419–423. 58. Walker JP, Khalil T, Wiener J, et al. The role of neurotensin in human gallbladder motility. Ann Surg 1985; 201:678–683. 59. LaMorte WW, Shoetz DJ, Birkett DH, Williams LF. The role of the gallbladder in the pathogenesis of cholesterol gallstones. Gastroenterology 1979; 77:580– 592. 60. Thornell E, Svanvik J, Wood JR. Effects of intra­arterial PGE2 on gallbladder fluid transport, motility and hepatic bile flow in the cat. Scand J Gastroenterol 1981;  16:1083–1088. 61. Jivegard L, Svanvik J. The influence of morphine, loperamide and naloxone on gallbladder response to protaglandin E2 in anaesthetized cat. Acta Physiol Scand  1986; 127:275–279. 62. Kotwall CA, Clanachan AS, Baer HP. Effect of prostaglandins on motility of gallbladder removed from patients with gallstones. Arch Surg 1984; 119:709–712. 63. Worobetz LJ, Baker RJ, McCallum JA, et al. The effect of naloxone, morphine, and an enkephalin analogue on cholecystokinin, octapeptide­stimulated  gallbladder emptying. Am J Gastroenterol 1982; 77:7:506–511. 64. Davenport HW. Physiology of the Digestive Tract, 2nd ed. Chicago: Year Book, 1966. 65. O'Brien JJ, Shaffer EA, Williams LF, Small DM, Lynn J, Wittenberg J. A physiological model to study gallbladder function in primates. Gastroenterology 1974;  67:119–125. 66. Lanzini A, Jazrawi RP, Northfield TC. Simultaneous, quantitative measurements of absolute gallbladder storage and emptying during fasting and eating in humans.  Gastroenterology 1987; 92:852–861. 67. Low­Beer TS, Heaton KW, Heaton ST, Read AE. Gallbladder inertia and sluggish enterohepatic circulation of bile salts in coeliac disease. Lancet 1971; 1:991– 994. 68. Lindblad L, Lundholm K, Schersten T. Bile acid concentration in systemic and portal serum in presumably normal man and in cholestatic and cirrhotic conditions.  Scand J Gastroenterol 1977; 12:395–400. 69. Angelin B, Bjorkhem I, Einarsson K, Ewerth S. Hepatic uptake of the bile acids in man: fasting and postprandial concentrations of individual bile acids in portal  venous and systemic blood serum. Clin Invest 1982; 70:724–731. 70. Hepner GW, Deemers LM. Dynamics of the enterohepatic circulation of the glycine conjugates of cholic, chenodeoxycholic, deoxycholic and sulfolithocholic acid  in man. Gastroenterology 1977; 72:499–501.

  

Page 270

71. Roda E, Aldini A, Mazzella G, Roda A, Sama C, Festi D, Barbara L. Enterohepatic circulation of bile acids after cholecystectomy. Gut 1978; 19:640–649. 72. Pennington CR, Ross PE, Bouchier IAD. Influence of the gallbladder on serum bile acids. J Clin Pathol 1982; 35:754–756. 73. Setchell KDR, Lawson AM, Blackstock RJ, Murphy GM. Diurnal changes in serum unconjugated bile acids in normal man. Gut 1982; 23:637–642. 74. Duane WC, Hanson KC. Role of gallbladder emptying and small bowel transit in regulation of bile acid pool size in man. J Lab Clin Med 1978; 92:858–872. 75. Jazrawi RP, Northfield TC. Effects of a pharmacological dose of cholecystokinin on bile acid kinetics and biliary cholesterol saturation in man. Gut 1986; 27:355– 362. 76. Everson TG, Lawson MJ, McKinley C, Showalter R, Kern F Jr. Gallbladder and small intestinal regulation of biliary lipid secretion during intraduodenal infusion  of standard stimuli. J Clin Invest 1983; 71:596–603. 77. Hussaini SH, Pereira SP, Veysey MJ, et al. Roles of gallbladder emptying and intestinal transit in the pathogenesis of octreotide induced gallbladder stones. Gut  1996; 38:775–783. 78. DePaula E, Silva GS. A simple method for computing the volume of human gallbladder. Radiology 1949; 52:94–102. 79. Glanville JN, Duthie HL. Contraction of the gallbladder before and after total abdominal vagotomy. Clin Radiol 1964; 15:350–354. 80. Rudrick J, Hutchinson JSF. Effects of vagal nerve section on the biliary system. Lancet 1964; 1:579–581. 81. Ingberg MV, Vuorio M. Human gallbladder function after selective gastric and total abdominal vagotomy. Acta Chir Scand 1969; 135:625–633. 82. Baxter JN. Gallbladder emptying. Gastroenterol Hepatol 1989; 4:353–372. 83. Jazrawi RP, Pigozzi G, Lanzini A, Galatola G, Kupfer RM, Northfield TC. Optimum bile acid therapy for rapid gallstone dissolution. Gut 1992; 33:381–386. 84. Ornstein MH, Palframan A, Meire H. Real time ultrasound—a new method for investigating gallbladder dynamics (abstr). Gut 1978; 19:971. 85. Lanzini A, Northfield TC. Gallbladder motor function in man. In: Northfield T, Jazrawi R, Zentler­Munro P, eds. Bile Acids in Health and Disease. Dordrecht:  Kluwer, 1988, pp 83–86. 86. Dodds W, Groh W, Darweesh R, Lawson T, Kishk S, Kern M. Sonographic measurement of gallbladder volume. Am J Roentgenol 1985; 145:1009–1011. 87. Everson GT, Braverman DZ, Johnson L, Kern F Jr. A critical evaluation of real­time ultrasonography for the study of gallbladder volume and contraction.  Gastroenterology 1980; 79:40–46. 88. Englert E, Chiu VSW. Quantitative analysis of human biliary evacuation with a radio­isotope technique. Gastroenterology 1966; 50:506–518. 89. Harvey E, Loberg M, Cooper M. Tc­99mHIDA: A new radiopharmaceutical for hepatobiliary imaging. J Nucl Med 1975; 16:533–538. 90. Harvey E, Loberg M, Ryan J, Sikorski S, Faith W, Cooper M. Hepatic clearance mechanism of Tc­99m­HIDA and its effect on quantitation of hepatobiliary  function. J Nucl Med 1979; 20:310–313. 91. Spellman SJ, Shaffer EA, Rosenthal L. Gallbladder emptying in response to cholecystokinin: a cholescintigraphic study. Gastroenterology 1979; 77:115–120. 92. Krishnamurthy GT, Bobba VR, Kingston E, Turner F. Measurement of gallbladder emptying sequentially using a single dose of 99mTc labelled hepatobiliary agent.  Gastroenterology 1982; 83:773–776. 93. Fisher RS, Rock E, Malmud LS. Cholinergic effects of gallbladder emptying in humans. Gastroenterology 1985; 98:716–722. 94. Jazrawi RP, Ferraris R, Bridges C, Northfield TC. Kinetics of the synthetic bile acid 75SeHCAT in man: Comparison with 14C taurocholate. Gastroenterology  1988; 95:164–169.

  

Page 271 75

95. Jazrawi RP, Ferraris R, Northfield TC.  SeHCAT: an overview of its physiological properties and clinical value. In: Northfield TC, Jazrawi RP, Zentler­Munro  PL, eds. Bile Acids in Health and Disease. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988, pp 277–289. 96. Galatola G, Jazrawi RP, Bridges C, Joseph AEA, Northfield TC. Direct measurement of first­pass ileal clearance of a bile acid in humans. Gastroenterology  1991: 100:1100–1105. 97. Galatola G, Jazrawi RP, Bridges C, Joseph AEA, Northfield TC. Hepatic handling of the synthetic g­labeled bile acid (75SeHCAT). Gastroenterology 1988;  94:771–778. 98. Jazrawi RP, Lanzini A, Britten A, Meller ST, Northfield TC. Dynamic of gallbladder function and of the enterohepatic circulation of bile acids studied by a gamma  labelled bile acid. Clin Sci 1984; 66:10P. 99. Qvist N. Motor activity of the gallbladder and gastrointestinal tract as determinants of the enterohepatic circulation: A scintigraphic and manometric study. Danish  Med Bull 1995; 42:426–440. 100. Krishnamurthy GT, Bobba VR, Kingston E. Radionuclide ejection fraction: a technique for quantitative analysis of motor function of the human gallbladder.  Gastroenterology 1981; 80:482–490. 101. Jazrawi RP, Kupfer RM, Bridges C, Northfield TC. Isotopic assessment of gallbladder storage functions in man. Clin Sci 1983; 65:185–191. 102. Jazrawi RP, Bridges C, Joseph AEA, et al. Effects of artificial depletion of the bile acid pool in man. Gut 1986; 27:771–777. 103. Oster­Jorgensen E, Gerner T, Pedersen SA. The determination of gastric emptying rate. Eur J Surg 1991; 564 (suppl):32–43. 104. Mok HYI, Von Bergman K, Grundy SM. Kinetics of the enterohepatic circulation during fasting: biliary lipid secretion and gallbladder storage. Gastroenterology  1980; 78:1023–1033. 105. Van Berge Henegouwen G, Hofmann AF. Nocturnal gallbladder storage and emptying in gallstone patients and healthy controls. Gastroenterology 1978;  75:879–885. 106. Loeb PM, Berk RN, Lobo­Frenkel A, Barnhart JL. The biliary and urinary excretion and the choleretic effect of ioglycamide in dogs. Invest Radiol 1976;  11:449–458. 107. Penagini R, Misiewicz JJ, Frost PG. Effect of jejunal infusion of bile acids on small bowel transit and fasting jejunal motility in man. Gut 1988; 29:789–794. 108. Nilsson BI, Svenberg T, Tollstrom T, Hellstrom PM, Samuelson K, Schnell PO. Relationship between interdigestiVe gallbladder emptying, plasma motilin and  migrating motor complex in man. Acta Physiol Scand 1990; 139:55–61. 109. Doty JE, Pitt HA, Porter­Fink V, et al. The effect of intravenous fat and total parenteral nutrition on biliary physiology. J Parenteral Enteral Nutr 1984; 8:263. 110. Van der Weft SDJ, van Berge Henegouwen GP, Palsma DMH, Ruben AT. Motor function of the gallbladder and cholesterol saturation of duodenal bile. Neth J  Med 1987; 30:160–171. 111. Lawson M, Everson GT, Klingensmith W, Kern F. Co­ordination of gastric and gallbladder emptying after ingestion of a regular meal. Gastroenterology 1983;  85:866–870. 112. Jazrawi RP, Galatola G, Lanzini A, Northfield TC. Biliary lipid mass in the gallbladder in health and in cholesterol gallstone disease. Eur J Gastroenterol Hepatol  1993; 5:373–381. 113. Pellegrini CA, Ryan T, Broderick W, Way LW. Gallbladder filling and emptying during cholesterol gallstone formation in the prairie dog: a cholescintigraphic  study. Gastroenterology 1986; 90:143–149. 114. Baxter JN, Grime JS, Critchley M, Shields R. Relationship between gastric emptying of solids and gallbladder emptying in normal subjects. Gut 1985; 26:342– 351. 115. Jazrawi RP, Pazzi P, Petroni ML, Prandini N, Paul C, Adam JA, Gullini S, Northfield TC. Postprandial gallbladder motor function: refilling and turnover of bile in  health and cholestasis. Gastroenterology 1995; 109:582–591.

  

Page 272

116. Howard PJ. Motor aspects of the enterohepatic circulation and the role of biliary tract and intestinal motor activity in the enterohepatic circulation of bile acids.  M.D. thesis, University of London, 1988. 117. Van der Linden W, Kempi W. Filling of the gallbladder as studied by computer assisted Tc­99m HIDA scintigraphy: concise communication. J Nucl Med 1984;  25:292–298. 118. Maudgal DP, Kupfer RM, Zentler­Munro PL, Northfield TC. Postprandial gallbladder emptying in patients with gallstones. BMJ 1980; 280:141–143. 119. Pauletzki J, Cicala M, Holl J, Sauerbruch T, Schafmayer A, Paumgartner G. Correlation between gallbladder fasting volume and postprandial emptying in  patients with gallstones and healthy controls. Gut 1993; 34:1443–1447. 120. Howard PJ, Murphy GM, Dowling RH. Gallbladder emptying patterns in response to a normal meal in healthy subjects and patients with gallstones: ultrasound  study. Gut 1991; 32:1406–1411. 121. Van Erpecum KJ, Van Berge Henegouwen GP, Stolk MFJ, Hopman WPM, Jansen JBMJ, Lamers CBHW. Effect of ursodeoxycholic acid on gallbladder  contraction and cholecystokinin releases in gallstone patients and normal subjects. Gastroenterology 1990; 3:836–842. 122. Krishnamurthy GT, Bobba VR, McConnell D, Mesgarzadeh M, Kingston E. Quantitative biliary dynamics: introduction of a new noninvasive scintigraphic  technique. J Nucl Med 1983; 24:217–223. 123. Forgacs IC, Maisey MN, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and ursodeoxycholic acid therapy on gallbladder emptying. Gastroenterology 1984;  37:299–307. 124. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 125. Sylvestrowics TA, Shaffer EA. Gallbladder function during gallstone dissolution: effect of bile acid therapy in patients with gallstones. Gastroenterology 1988;  95:740–748. 126. Masclee AAM, Jansen JBMJ, Driessen WMM, Geuskens LM, Lamers CBHW. Plasma cholecystokinin and gallbladder responses to intraduodenal fat in  gallstone patients. Dig Dis Sci 1989; 34:353–359. 127. Festi D, Frabboni R, Bazzoli F, et al. Gallbladder motility in cholesterol gallstone disease: effect of ursodeoxycholic acid administration and gallstone dissolution.  Gastroenterology 1990; 99:1779–1785. 128. Spengler U, Sackmann M, Sauerbruch T, Holl J, Paumgartner G. Gallbladder motility before and after extracorporeal shock­wave lithotripsy. Gastroenterology  1989; 96:860–863. 129. Kishk SMA, Darweesh RMA, Dodds WJ, Lawson TL, Stewart ET, Kern MK, et al. Sonographic evaluation of resting gallbladder volume and postprandial  emptying in patients with gallstones. Am J Roentgenol 1987; 148:875–880. 130. Mackie CR, Baxter JN, Grime JS, Hulks G, Cushieri A. Gallbladder emptying in normal subjects a data base for clinical cholescintigraphy. Gut 1987; 28:137– 141. 131. Donald JJ, Fache JS, Buckley AR, Burhenne HJ. Gallbladder contractility: variation in normal subjects 1991; 157:753–756. 132. Thompson JC, Gried GM, Ogden WD, Fagan CJ, Inoue K, Wiener I, Watson LC. Correlation between release of cholecystokinin and contraction of the  gallbladder in patients with gallstones. Ann Surg 1982; 195:670–675. 133. Upp JR, Nealon WH, Singh P, Fagan AS, Greely GH, Thompson JC. Correlation of cholecystokinin receptors with gallbladder contractility in patients with  gallstones. Ann Surg 1987; 205:641–648. 134. Khalil T, Walker JP, Weiner I, Fagan CJ, Townsend CM, Greeley GH, Thompson JC. Effect of ageing on gallbladder contraction and release of  cholecystokinin­33 in humans. Surgery 1985; 98:423–429. 135. Portis SA, King JC. The gastrointestinal of the gallbladder tract in the aged. JAMA 1952; 148:73–79.

  

Page 273

136. Palasciano G, Serio G, Portincassa P, et al. Gallbladder volume in adults, and relationship to age, sex, body mass index, and gallstones: a sonographic population  study. Am J Gastroenterol 1992; 87:493–497. 137. Shaffer EA, Taylor PJ, Logan K, Gadomski S, Corenblum B. The effect of progestin on gallbladder function in young women. Am J Obstet Gynecol 1984;  148:504–507. 138. Keane P, Colwell D, Baer HP, et al. Effects of age, gender and female sex hormones upon contractility of the human gallbladder in vitro. Surg Gynecol 1986;  163:555–560. 139. Marzio L, Capone F, Neri M, Mezzetti M, De Angelis C, Cuccurullo F. Gallbladder kinetics in obese patients: effect of regular meal and low­calorie meal. Dig  Dis Sci 1988; 33:4–9. 140. Bonfissuto G, Soresi M, Amato S, et al. Ultrasonographic assessment of gallbladder motility in obese subjects. Recent Prog Med 1996; 87:338–341. 141. Gourtsoyiannis NC, Damilakis JE, Charoulakis NZ, et al. Relationship of gallbladder contour, fasting volume and emptying to body size indices in normal  subjects and patients with gallstones. Digestion 1995; 56:395–399. 142. Vezina WC, Paradis RL, Grace DM, et al. Increased volume and decreased emptying of the gallbladder in large (morbidly obese, tall muscular normal) people.  Gastroenterology 1990; 98:1000–1007. 143. Stone BG, Gaveler JS, Belle SH, et al. Impairment of gallbladder emptying in diabetes mellitus. Gastroenterology 1988; 95:170–176. 144. Barbara L, Sama C, Leabate AMM, et al. A population study on the prevalence of gallstone disease: the Sirmione study. Hepatology 1987; 7:913–917. 145. Bennion LJ, Grundy SM. Risk factors for the development of cholelithiasis in man. N Engl J Med 1978; 299:1161–1167, 1221–1227. 146. Kern F Jr, Everson GT, DeMark B, et al. Biliary lipids, bile acids, and gallbladder function in the human female. J Clin Invest 1981; 68:1229–1242. 147. Go VLW, Hofmann AF, Summerskill WHJ. Pancreozymin bioassay in man based on pancreatic enzyme scretion: potency of specific amino acids and other  digestive products. J Clin Invest 1970; 49:1558–1564. 148. Fisher RS, Rock E, Malmud LS. Effects of meal composition on gallbladder and gastric emptying in man. Dig Dis Sci 1987; 32:1337–1344. 149. Fried M, Jansen JB, Harpole T, et al. Pancreatobiliary response to an intragastric amino acid meal: comparison to albumin, dextrose, a maximal cholecystokinin  stimulus. Gastroenterology 1989; 97:1544–1549. 150. Sarva RP, Shreiner DP, Van­Thiel D, Vingvorapant N. Gallbladder function: methods of measuring filling and emptying. J Nucl Med 1985; 26:140–144. 151. Sacchetti G, Mandelli V, Roncoroni R, Motanari C. Influence of age and sex on gallbladder emptying induced by a fatty meal in normal subjects. Am J  Roentgenol Radium Ther Nucl Med 1973; 119:40–45. 152. Morewood DJW, Whitehouse GH. Ceruletide cholecystography dose­response and gallbladder function. Br J Radiol 1984; 57:439. 153. Hansen WE, Maurer H, Vollmar J, Brauning C. Guar gum and bile: effects on postprandial gallbladder contraction and on serum bile acids in man.  Hepatogastroenterol 1983; 30:131–133. 154. Hopman WPM, Rosenbusch G, de Long AJL, Lamers CBHW. Gallbladder contraction: effects of fatty meals and cholecystokinin. Radiology 1985; 157:37– 39. 155. Boyden EA, Bergh GS, Layne JA. An analysis of the reaction of the human gallbladder and sphincter of Oddi to magnesium sulphate. Surgery 1943;723–733. 156. Torsoli A, Ramorino ML, Colagrande C, Demaio G. Experiments with cholecystokinin. Acta Radiol 1960; 55:193–205. 157. Traynor OJ, Dozois RR, DiMagno EP. Canine interdigestive and postprandial gallbladder motility and emptying. Am J Physiol 1984; 246:G426–G431. 158. Takahashi I, Kern MK, Dodds WJ, Hogan WJ, Sarna SK, Soergel KH, Itoh Z. Con­

  

Page 274

traction pattern of opossum gallbladder during fasting and after feeding. Am J Physiol 1986; 250:G227–G235. 159. Pazzi P, Petroni ML, Prandini N, Adam JA, Gullini S, Northfield TC, Jazrawi RP. Postprandial refilling and turnover: Specific gallbladder motor function defects  in patients with gallstone recurrence. Eur J Gastroenterol Hepatol, 1999. In press. 160. Pilot MA. Macrolides in roles beyond antibiotic therapy. Br J Surg 1994; 81:1423–1429. 161. Wehrmann R, Pfeltzer C, Caspary WF. Effect of erythromycin on human biliary motility. Aliment Pharmacol Ther 1996; 10:421–426. 162. Redfern JS, Fortuner WJ II. Octreotide­associated biliary tract dysfunction and gallstone formation: pathophysiology and management. Am J Gastroenterol  1995; 90:1042–1052. 163. Stolk MF, van Erpecum KJ, Koppeschaar HP, et al. Effect of octreotide on fasting gallbladder emptying, antroduodenal motility, and motilin release in  acromegaly. Gut 1995; 36:755–760. 164. Portincassa P, DiCiaula A, Palmieri V, et al. Tauroursodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid and gallbladder motility in gallstone patients and healthy subjects.  Ital J Gastroenterol 1996; 28:111–113. 165. Van de Heijning BJM, van de Meeberg PC, Portincassa P, et al. Effects of ursodeoxycholic acid therapy on in vitro gallbladder contractility in patients with  cholesterol gallstones. Dig Dis Sci 1999; 44:190–196. 166. Sailer C, Pauletzki J, Klueppelberg UG, et al. Acute effect of ursodeoxycholic acid on gallbladder volume in healthy subjects. Scand J Gastroenterol 1996;  31:512–516. 167. Xu QW, Freedman SM, Shaffer EA. Inhibitory effect of bile salts on gallbladder smooth muscle contractility in the guinea pig in vitro. Gastroenterology 1997;  112:1699–1706.

  

Page 275

13—  Gallbladder Motility and Gallstones Ralph R.S.H. Greaves St. Bartholomew's and the Royal London School of Medicine and Dentistry, London, England Luke J.D. O'Donnell Mayo General Hospital, Castlebar, Ireland I—  Physiology of Gallbladder Motility A—  Gallbladder Function The function of the gallbladder is to deliver concentrated bile to the duodenum after a meal. This requires a complex coordination of the motor, secretory, and  absorptive functions of the gallbladder and gastrointestinal tract, which is orchestrated by a variety of neural, endocrine, paracrine, and autocrine factors. This section  describes the physiology of gallbladder motility, with special reference to the human gallbladder. B—  Embryology and Structure The gallbladder develops as an evagination of the duodenal mucosa (1–3) and shares similarities in structure and innervation with the small intestine. Gallbladder  smooth muscle consists of a interwoven arrangement of longitudinal, transverse, and circular muscle layers (4,5). C—  Nerve Innervation—Extrinsic The gallbladder is extrinsically innervated by both parasympathetic and sympathetic pathways. Parasympathetic fibers reach the gallbladder through the hepatic branch  of the left vagus nerve (6) and terminate in the ganglia of the lamina propria and the smooth muscle (7). Sympathetic fibers originate from the seventh to tenth thoracic  segments, reaching the gallbladder via the celiac ganglia (8) and the right phrenic nerve (2). These fibers innervate smooth muscle and interconnect with nonadrenergic  nerve cells. D—  Nerve Innervation—Intrinsic Nerve ganglia are present in all three main layers in the gallbladder, comprising the subserosal, the myenteric, and mucosal plexuses (9,10). The network of these  intramural plexuses receives input from the parasympathetic and sympathetic nervous systems. Several neurotransmitter groups have been identified within the  gallbladder wall, including cholinergic (7), adrenergic (7,8), peptidergic (11), serotonergic (12), enkephalinergic (13) and nitrergic neurotransmitters

  

Page 276

(14,15). Peptides identified in the plexuses include cholecystokinin (16), vasoactive intenstinal polypeptide (17), and neuropeptide Y (18). Although pharmacological  studies demonstrate that these neurotransmitters may affect gallbladder function, their physiological role remains for the most part unclear. E—  Normal Pattern of Gallbladder Motility 1—  Fasting Gallbladder Motility In the fasting state, the human gallbladder is not at rest. Small contractions and relaxations occur constantly, emptying up to 20% of its contents every hour. Isotope  emptying studies suggest frequent alterations in absolute gallbladder storage and emptying, analogous to the action of a bellows (19). 2—  Postprandial Gallbladder Motility Under physiological conditions, food is the main stimulus to gallbladder emptying. However, it is clear that gallbladder emptying is more complex than a simple mass  expulsion after a luminal trigger (20–22). Approximately 15% of gallbladder emptying occurs before the onset of gastric emptying, and refilling occurs after the  expulsion of 85% of the gastric contents (21,23). Recent simultaneous scintigraphic and ultrasonographic studies on healthy subjects show that postprandial  gallbladder emptying is a dynamic response, combining simultaneous emptying and refilling. Gallbladder refilling begins immediately postprandially, then accelerates  after 40 min (24). In addition, there are superimposed small alternating contractions and relaxations of the gallbladder, likened to bellows movements, seen during  fasting (19,24). After a liquid meal containing fat, minimum gallbladder volume is reached in 30 to 45 min, after which refilling starts (20). After a solid meal, it may  take up to 4 h for the gallbladder to reach its minimum volume (25). The time taken for the gallbladder to refill after a meal depends on the composition of the meal. Following a liquid meal, the gallbladder may start to refill within 30 min.  After a solid meal, however, refilling may not occur for several hours, and only after most of the meal has been emptied from the stomach (21). Two patterns of  gallbladder refilling have been described: (1) a steady rate and (2) filling in a stepwise manner (24). F—  Regulation of Fasting Gallbladder Motility Gallbladder motility in the fasting state depends on a functioning cholinergic pathway and the hormone cholecystokinin (CCK). Cholinergic blockade with an infusion  of atropine distends the fasting gallbladder, implying that cholinergic mechanisms have a role in maintaining fasting tone (26,27). Similarly, CCK antagonists increase  fasting gallbladder volume, implying a ''tick­over" tonic CCK effect on the resting gallbladder (28–30). The regular, small, bellows­like emptying and refilling  movements in the fasting state are related to phase II of the duodenal migrating motor complex (31–34). Retrograde neural tracer studies in the Australian brush­tailed  possum demonstrate long projections between the duodenum and gallbladder, and it seems likely that these are responsible for the coordination of duodenal and  gallbladder motility (35). During fasting, the gut peptide motilin is likely to be responsible for the coordination of gallbladder emptying and the migrating motor complex  in the dog (36–38), although in humans this appears not to be the case (39). Motilin has no direct effect on in vitro human gallbladder muscle strips (40). G—  Neural Regulation of Postprandial Gallbladder Motility Postprandial gallbladder emptying may be divided into cephalic, gastric, and intestinal phases. Sham feeding may produce emptying of up to 65% of gallbladder  contents (41,42). This

  

Page 277

cephalic phase is predominantly a muscarinic M1­mediated response, as it is blocked by pirenzipine, an M1­receptor antagonist (43). The gastric phase is dependent  on antral distention, triggering a cholinergic vagovagal pylorocholecystic reflex (44). Meals high in polyunsaturated fat are the most powerful stimuli to emptying,  although meals containing protein and carbohydrate also stimulate some emptying (8,45,46). The cephalic and gastric phases are predominantly cholinergic­mediated  and independent of a rise in CCK (47). Cholinergic blockade with atropine reduces the rate of gallbladder emptying after a liquid or solid meal, supporting a  cholinergic role in gallbladder emptying (42). In contrast, the intestinal phase of gallbladder emptying is largely CCK­dependent (43). The physiological role of the adrenergic nerve system in human gallbladder motility is unclear. Beta agonists relax rabbit and human gallbladder muscle strips (48,49).  Splanchnic nerve stimulation or noradrenaline infusion produces gallbladder relaxation in the dog and cat (49,50,52); however, other studies have failed to confirm  these findings (53,54). There are no published data on the effect of the adrenergic system in the control of human gallbladder motility in vivo. H—  Endocrine Regulation of Postprandial Gallbladder Motility The main hormonal regulator of gallbladder contraction is CCK. CCK is a peptide hormone, synthesized and stored in the duodenal I cells as a large preprohormone,  CCK­58 (55). It is cleaved to CCK­8, CCK­33, and an intermediate form (56). The terminal eight amino acid residues, containing a sulfated tyrosyl residue at  position 7, are mainly responsible for its biological activity (57). CCK is released into the circulation upon ingestion of a meal. Unsaturated fats, proteins, and amino acids are the most potent nutrients producing CCK release  (56,58–60). Specific luminal peptides have a modulating role in controlling the release of CCK. Monitor peptide, a 61­amino acid protein homologous to the  pancreatic trypsin inhibitor family of proteins (61), is produced by the pancreas and released into the intestinal lumen, where it stimulates CCK release (62). This acts  in conjunction with a trypsin­sensitive CCK­releasting peptide that is intestinal in origin (63,64). In addition to stimulatory factors, there is also evidence for luminal CCK­inhibitory factors in the gut such as trypsin, chymotrypsin, elastase and bile salts (65–70). The receptors for CCK in peripheral tissues can be classified into two subtypes CCK­A and CCK­B, the latter being identical to the gastrin receptor (71,72). The  human gallbladder expresses only CCK­A receptors (73,74). The receptor status is unrelated to age, gender, body weight, or pathological state of the gallbladder  (73,75). CCK can act directly on gallbladder CCK receptors to cause a dose­dependent contraction (76). The mechanism of action of CCK at the cellular level has been  extensively studied in the isolated pancreatic acinar preparation (77–79) and more recently the isolated gallbladder smooth muscle cell (80,81). CCK­receptors belong to the G protein­coupled family of receptors and act by generation of intracellular messengers, primarily calcium and diacylglycerol (DAG)  (82). Production of these messengers is increased by activation of a phospho­inositide­specific phospholipase C enzyme that cleaves phosphotidylinositol 4,5­ biphosphate (PIP2) to produce inositol 1,4,5­triphosphate (IP2)and DAG IP2 acts to release calcium from intracellular stores and promote calcium influx, thus  increasing intracellutar calcium. Calcium and DAG act by regulating a number of kinases and phosphatases. There are two major concentration­dependent intracellular  pathways. CCK activates the protein kinase C pathway at low concentrations, whereas it activates the calmodulin pathway at high concentrations, which, in turn,  inhibits the activation of protein kinase C (80). Infusion of CCK into the systemic circulation produces dose­dependent gallbladder contraction in humans (83,84). Systemic circulating concentrations of CCK are  highly correlated with the rate of human gallbladder emptying (56,85).

  

Page 278

Specific CCK­A receptor antagonists have been shown to inhibit CCK­ and meal­stimulated gallbladder contraction, suggesting that CCK is the major mediator of  postprandial gallbladder emptying (28–30,86,87). CCK and vagal cholinergic neurotransmission are intimately related. In animals, CCK acts via cholinergic­mediated intrinsic neurons, and it is likely that this is the  predominant physiological pathway (16,88–92). In humans, cholinergic blockade with atropine reduces gallbladder emptying in response to exogenous CCK (93– 95). Similarly, vagotomy reduces the release of CCK in response to intraduodenal fat (96). I—  Autocrine and Paracrine Factors in the Gallbladder As well as the classic endocrine­ and neurally mediated pathways of gallbladder motility regulation, there is increasing evidence that several bioactive agents, produced  and acting locally, also have dramatic effects on motility. These extracellular signals can be classified as paracrine or autocrine and are described in the following  sections. The term paracrine was proposed by Feyter to describe a network of cells distributed throughout the gut and other organs close to nerve endings and blood vessels  (97). He postulated that these cells were "peripheral endocrine glands" and speculated that, in addition to their distant endocrine actions, these cells might also have  local "paracrine" effects in cell regulation. Thus, in paracrine signaling, the target cell is close to the signaling cell, and release of the mediator produces a local response.  Many paracrine systems have been described to date—for instance, the local effect of prostaglandins on the uterus at parturition (98), the action of nitric oxide in a  number of physiological systems and pathophysiological states (99), the role of endothelins on the peripheral vasculature (100), and the release of vasoactive intestinal  peptide by the feline gallbladder in response to vagal stimulation (101). In 1980 Sporn and Todaro added the concept of autocrine secretion to explain the endogenous production of autostimulatory growth factors by transformed cells.  Although it was initially postulated that autocrine action was limited to malignant cells, it became clear that autocrine action is central to normal cell biology (102). In  autocrine signaling, therefore, cells respond to substances that they themselves release. The autocrine/paracrine systems described here in relation to the regulation of  gallbladder motility, and the pathogenesis of gallstones are the prostanoids, nitric oxide, vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase­activating polypeptide  (VIP/PACAP), and endothelin. 1—  Prostaglandins Prostaglandins are potent biological mediators found in several tissues of many species, with diverse physiological and pathophysiological roles. All major  prostaglandin subgroups are synthesized in the gallbladders of guinea­pig (103–105), prairie dog (105–110), and rabbit (111–113). Gallbladder muscle strips from  various animal species contract in response to exogenous prostaglandins in vitro. With the guinea pig gallbladder, the rank order of potency is U46619 > PGE2 >  PGF2;a (104,114,115). The cat gallbladder will contract upon addition of PGE1, PGE2, and PGF2a (114). The isolated dog gallbladder will contract on the addition of  PGD2, PGE1, PGE2, and PGF2a (116). Several in vivo models demonstrate gallbladder contraction with the addition of exogenous prostaglandins. Intraarterial PGE2,  produces contraction of the feline gallbladder (114,117). Intravenous administration of PGE2 and PGF2a produces contraction of the canine gallbladder (118). Inhibition of PG synthesis with nonsteroidal anti­inflammatory drugs (NSAIDs) also affects in vivo animal gallbladder motility. Administration of indomethacin to guinea  a pigs inhibits gallbladder hypostasis during a high­cholesterol lithogenic diet (119). PGE2, PGF2 , and U46619 are potent contractile agents in normal human  gallbladder muscle strips, with a rank order of potency of PGE2 > U46619 > PGF2a (120).

  

Page 279

The synthetic prostaglandin E1 derivative misoprostol has been studied in healthy subjects, in whom it had no effect on fasting gallbladder volume or meal­induced  gallbladder emptying (121,122). Both aspirin and indomethacin—potent inhibitors of prostaglandin synthesis—have been investigated in normal subjects (122–124).  In these studies, aspirin (124) and indomethacin (122,123) had no significant effect on basal gallbladder volume or gallbladder emptying. Prostaglandins are produced in all species of mammalian gallbladders studied thus far. Exogenous application of prostaglandins can affect gallbladder smooth muscle  motility. However, the exact physiological role of prostaglandins in normal gallbladders remains undefined. 2—  Nitric Oxide NOS­containing neurons have been demonstrated in both the gallbladder (14,15,125), and sphincter of Oddi (125,126) of several animals. NO­producing neurons  have been characterized in the human gallbladder (14,15), both in the fibromuscular layer and in the mucosal layer (127). There is colocalization with the  neurotransmitters VIP and PACAP, among others (127). Inhibition of NOS in in vitro gallbladder strips from guinea pigs shows a significant enhancement of the contractile response to CCK (128). In addition, inhibition of  NOS in guinea­pig gallbladder in vivo increases basal gallbladder pressure, indicating that there is a continuous tick­over production of NO in the gallbladder which  contributes to the maintenance of gallbladder volume in the fasting state (128). Pharmacological blockade of NOS in the cat in vivo has no effect on gallbladder  motility (125). In healthy humans, glyceryl trinitrate, acting as an NO donor, produces gallbladder dilatation in the fasting state and reduces postprandial gallbladder  emptying, suggesting that nitric oxide mechanisms may be operative in the human gallbladder in vivo (129). Inhibition of NOS in animal sphinctor of Oddi both in vitro  and in vivo increases sphincter tone, implying a role for NO in regulating sphincter function (125,126,130,131). The effects of NO on human sphincter of Oddi have  not been reported. 3—  Vasoactive Intestinal Peptide VIP belongs to a family of structurally related peptides that includes secretin and glucagon (132). VIP is localized to the gallbladder of several species, including  humans where it is often colocalized with NO­producing neurons (15,127,133,134). VIP is also highly represented in the sphincter of Oddi of several species (134– 136). Evidence for a paracrine neurotransmitter role for VIP in the gallbladder comes from studies demonstrating that the cat gallbladder in vivo releases VIP at a basal rate,  and the release is increased in response to activation of noncholinergic fibers in the vagus nerve (101). VIP produces dose­related decreases in resting tension, spontaneous activity, and contractile response to CCK both with isolated guinea pig gallbladder and  gallbladder strips (137–139). VIP intravenous infusion in the guinea­pig, opossum, cat, and dog in vivo reduces basal tone and CCK­stimulated gallbladder  contraction (17,135,140–142). The effects of VIP on the human gallbladder both in vitro and in vivo have not been documented. 4—  Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide PACAP was isolated first from ovine hypothalamus (143). The primary structure indicates that PACAP is a member of the VIP/glucagon/secretion family of peptides,  most homologous to VIP. There are two molecular forms, PACAP­27 and PACAP­38 (144). The N­terminal 28 residues of PACAP show a 68% homology with  VIP (144). Recent immunohistochemical work has demonstrated the existence of PACAP­containing neurons in the fibromuscular and mucosal layers of the human  gallbladder, with colocalization with VIP and NOS (127). PACAP­27 and PACAP­38 have no effect on the resting tension and CCK­stimulated contraction of canine gallbladder muscle strips (142). The effect of PACAP  on guinea pig gallbladder smooth muscle strips has not been described.

  

Page 280

PACAP­27 and PACAP­38 produce transient and tonic gallbladder contractions in the dog in vivo, both in the digestive and interdigestive states, approximately one­ tenth as potent as contractions induced by CCK on a molar basis (142). There are no data on the effect of PACAP on human gallbladder either in vitro or in vivo.  The effects of VIP and PACAP on the gallbladder are likely to be closely related. Both would appear to be synthesized locally, with paracrine and neuroendocrine  effects on gallbladder motility. 5—  Endothelins Endothelins are potent vasoconstrictor peptides produced in a variety of tissues, where they act at modulators of vasomotor tone, cell proliferation, and hormone  production (100,145). There are no recorded data on the release of endothelins from animal gallbladder; however, human gallbladder epithelial cells in primary culture secrete endothelins,  and high­performance liquid chromatography of cultured supernatant shows a single peak of endothelin­1 (ET­1). Synthesis in cultured human gallbladder epithelial  cells is stimulated by physiological concentrations of CCK, and this has an inhibitory effect on gallbladder secretion by an autocrine/paracrine mechanism (146,147).  ET­1 and 2 can be detected in the normal human gall­bladder by radioimmunoassay, and ET­2 is likely to be the physiologically significant endothelin isopeptide  expressed (148). Both ETA and ETB receptors have been characterized in the guinea pig gallbladder by pharmacological techniques, although additional receptors not conforming to the  ETA­ETB classification may be present (149,150). ETA receptors appear to predominate in the human gallbladder (148). Receptor status in the human gallbladder has  not been systematically described. ET­1, ET­2, and ET­3 all produce dose­dependent contraction in guinea pig gallbladder muscle strips (149,151). The effect of  endothelins on human gallbladder motility has not been described. II—  Impaired Gallbladder Motility and Gallstones A—  Introduction The most common disorder affecting the gallbladder is gallstone formation. Gallstones occur in about one­third of postmenopausal women (152). Although most are  asymptomatic, the natural history suggests that approximately one­half of subjects with asymptomatic gallstones will eventually require a cholecystectomy (153).  Consequently, cholecystectomy is the most common elective surgical procedure in the western world. The three major determinants of human cholesterol gallstone formation are cholesterol supersaturation of bile (154), impaired gallbladder emptying (155), and pro­ aggregatory nucleating factors in the bile (156). Although Meckel von Hemsbach in 1856 suggested that impaired gallbladder emptying was the primary factor (157),  much of the work this century has concentrated on bile composition. However, it has only been possible to accurately measure gallbladder motility in humans since the  advent of ultrasonographic screening and isotope scintigraphy in the late 1970s and the 1980s. In animal models of gallstone pathogenesis, a reduction in gallbladder emptying precedes gallstone formation, implying that this is a primary pathogenic factor (158– 161). Moreover, enhanced periodic emptying of the gallbladder by administration of a duodenal lavage with a protein­lipid mixture or exogenous CCK prevents  gallstone formation (162,163). Animal in vitro work has shown a reduction in maximal muscle strip contraction in response to spasmogens of greater than 50%, compared to controls, in strips  obtained from gallbladders containing gallstones (161,164). The specific defect in muscle contraction is elusive, as membrane excitation and excitation­contraction  coupling are not impaired and total contractile protein is unchanged (165). However, some workers have failed to demonstrate the decrease in muscle contraction in  this model (166).

  

Page 281

B—  Human Studies of Gallbladder Dysmotility and Gallstone Pathogenesis The majority of studies using reliable methodologies demonstrate that at least a subset of patients with gallstones have impaired gallbladder motility. Impaired  gallbladder emptying after a fatty meal has been demonstrated in patients with gallstones by both isotope and ultrasound scanning techniques (20,24,167–172).  Gallbladder emptying is also reduced after intravenous CCK in gallstone subjects compared to controls (20,167,173). In studies of large numbers of gallstone  patients, contraction is impaired in approximately half of the subjects (20,167,170,174). In patients with gallstones who have undergone successful extracorporeal  lithotripsy, the motility defect persists (173), and reduced ejection fraction predicts which subjects will develop recurrent gallstones (155). All these studies indicate  that impaired gallbladder emptying is an important factor in the development of gallstones. C—  Miscellaneous Conditions Associated with Impaired Gallbladder Motility and Gallstone Formation In a number of patient groups with either temporary or permanent impairment of gallbladder motility, there is an increased predisposition to stone formation, which also  indicates that the motility defect plays an important role in the pathogenesis of gallstones. Patients who have had major abdominal surgery with associated fasting for  more than 48 h have an increased incidence of gallstones (175). This is probably as a result of bile stasis and sludge formation that accompanies pre­ and  postoperative fasting (176,177). Patients receiving total parenteral nutrition do not empty their gallbladders regularly (25) and have a high incidence of both biliary  sludge and gallstones (178,179). The regular administration of parenteral CCK in this setting reduces the incidence of biliary sludge and may be a useful prophylactic  therapy (180). Women who have had several pregnancies have an increased prevalence of gallstones (181,182). In the last trimester of pregnancy, as the serum progesterone rises,  the fasting gallbladder volume is increased and emptying is impaired (183,184). Although bile becomes more supersaturated with cholesterol in the last trimester (185),  gallbladder stasis is also likely to be an important factor in the development of pregnancy­associated gallstones. Patients treated with somatostatin (186,187) or octreotide, a somatostatin analogue (188), have impaired gallbladder emptying and have an increased prevalence of  gallstones. This is due to the somatostatin­like action on the gallbladder, which produces dilatation and inhibition of CCK­induced emptying (186,187). Patients with spinal cord injuries and after truncal vagotomy, both conditions causing impaired gallbladder emptying, also have an increased prevalence of gallstones  (6,189,190,191). D—  The Role of CCK in Gallbladder Dysmotility Associated with Gallstones The exact role of CCK in the gallbladder dysmotility associated with gallstones has not been determined. Subjects with gallstones have increased levels of CCK in the  duodenal mucosa compared to healthy controls (192); however, studies of the release of CCK into the plasma in subjects with gallstones and healthy controls have  produced conflicting results. Studies demonstrate a similar (172,193), reduced (96), and increased release (194) of CCK in subjects with gallstones compared to  healthy controls. Human gallbladder muscle strips show a reduction in isometric tension in response to CCK in cholesterol gallstone­containing gallbladder compared to pigment stone­ containing gallbladder (195). This finding has been replicated using isolated smooth muscle cells as well as muscle strips (81).

  

Page 282

The human gallbladder in vivo shows a variable response to exogenous CCK. Most studies demonstrate that exogenously administered CCK produces less  contraction in gallstone­containing gallbladders than in normal gallbladders (167,173), although a single study demonstrated an equivalent response (168). Whether these differing responses are due to an alteration in CCK receptor status in subjects with gallstones is unclear. Although early studies suggested a reduction in  CCK receptors (75,196), these studies were uncontrolled. More recent work with appropriate controls has shown that gallstone­containing human gallbladder is able  to bind circulating CCK with equal affinity to gallstone­free gallbladder. Moreover, the size of the CCK binding subunit is similar between the two groups, implying  normal function of the CCK receptors (73). In conclusion, the relationship between CCK release and gallbladder smooth muscle response in the dysmotility found in subjects with gallstones is complex and  incompletely understood. Nevertheless, the balance of evidence indicates that there is likely to be an end­organ reduction in response to circulating CCK. E—  Prostaglandins and Animal Models of Gallstone Production A high­cholesterol diet is lithogenic in several animal models. This diet stimulates the production of PGE2, PGF2a, PGI2, and thromboxane A2 in the prairie dog (105– 108,197), and PGE2 and PGI2 in rabbit gallbladders (111,113). This is unlike the response in the guinea pig gallbladder, where enhanced PGI2 production alone is  seen (105). In the prairie dog fed on a high­cholesterol lithogenic diet, a reduction in gallbladder emptying correlates with the increased synthesis of PGE2 and PGF2a in the  gallbladder (106). In this model, there was no increase in PGI2 synthesis. Administration of salicylate in the same model inhibits gallbladder stasis and the formation of  gallstones (198). However, others have found that although aspirin in the cholesterol­fed prairie dog inhibits endogenous microsomal prostaglandin synthesis, there is  no subsequent reduction in gallstone formation (107). This, however, was a 2­week study, which may have been too brief to identify gallstone formation. In addition,  the same group showed that in the prairie dog, aspirin has no effect on the reduction in CCK­stimulated muscle strip contractility observed with the cholesterol diet  (110). However, aspirin inhibited PGE2 synthesis solely, with no inhibition of PGF2a, PGI2, and TXA2 synthesis; this is therefore at variance with the rest of the  published work in this field. It is likely that local prostaglandin production is stimulated by cholesterol supersaturation in bile. Cholesterol is absorbed into the gallbladder mucosa in both the guinea  pig and human gallbladder (199–203). Recent work has demonstrated that the degree of absorption is proportional to biliary cholesterol saturation (204). F—  Prostaglandins and Gallstone Pathogenesis in Humans Human gallbladder in vitro produces increased levels of PGE2 and PGI2, which correlate with the degree of histological inflammation (205–207). PGE2, PGF2a, PGI2,  and U46619 (a stable analogue of thromboxane­A2) produce contractions in human gallbladder obtained from patients with gallstones (115). Kotwall, again using  gallstone­containing gallbladders, showed a dose­dependent contraction to PGD2, PGE1, PGE2, and PGF2a. The spontaneous rhythmic contractions were inhibited by  indomethacin, suggesting a continuous release of endogenous prostaglandin (208). In an epidemiological study, NSAID usage appeared to confer some protection against the development of gallstones, but the protective mechanism is poorly  understood (209). Both aspirin and indomethacin have been investigated in subjects with gallstones (123,124). In patients with gallstones, administration of aspirin  (124) improved the percentage of postprandial gallbladder emptying from 62 to 74%. Similarly, patients who had received successful extra­corporeal lithotripsy for  gallstone disease also showed improved postprandial gallbladder emptying after administration of indomethacin (123). This differential effect of NSAIDs on the

  

Page 283

postprandial emptying of normal and diseased gallbladders is intriguing and may reflect a localised role for PGI2, since PGI2, relaxes only gallstone­containing  gallbladders (120). Since gallbladders containing cholesterol­supersaturated bile produce increased PGI2 (206,207), this PGI2­induced relaxation may be a  determinant of the impaired gallbladder motility of gallstone disease. Whether cholesterol absorption in the human gallbladder has an effect on local prostaglandin production has not been conclusively demonstrated. However obese  patients on a weight­reducing diet produce increased amounts of biliary PGE2 as biliary cholesterol saturation increases (210), and there is an association between  biliary cholesterol saturation and biliary PGE2 production in postmenopausal women (211). G—  Other Autocrine/Paracrine Factors and Gallstone Pathogenesis NO is a potent relaxant of nonvascular smooth muscle. Electrical activation of NANC neurons produces relaxation of diseased human gallbladder in vitro that is  mediated by NO (212). Since glyceryl trinitrate—acting as an NO donor—has a potent inhibitory effect on human gallbladder motility in vivo (129), it is possible that  local alterations in NO production will modify gallbladder motility and gallstone pathogenesis. Similarly, VIP, PACAP, and endothelins each have potent effects on gallbladder motility and may play a role in gallstone pathogenesis. These possibilities, however,  have not been investigated to date. H—  Molecular Mechanisms Underlying Gallbladder Dysmotility and Cholesterol Gallstone Pathogenesis Isolated muscle cells from gallbladders with cholesterol gallstones contract less well to CCK, acetylcholine, and potassium chloride than muscle cells from gallbladders  containing pigment gallstones, which were used as controls (81), confirming previous work in the human (195) and prairie dog gallbladder (161). This suggests that the  contractility defect in human gallbladder muscle contraction is in part intrinsic to the muscle cell, as confounding factors such as mucosal edema or fibrosis have been  excluded. Impaired muscle contraction cannot be fully explained by damage to CCK or acetylcholine receptors, because the impaired contraction is observed not only  in response to CCK and acetylcholine but also in response to potassium chloride, which contracts cells by receptor­independent mechanisms. When cholesterol gallstone muscle cells are permeabilized with the detergent saponin and the second messenger substrate inositol triphosphate is added, the difference  in contractility is eliminated (81). This indicates that the postmembrane pathways and the actin­myosin complex are functionally intact, confirming earlier work on the  cholesterol­fed prairie dog model of cholesterol gallstone (165). Further work has shown a reduced production of the second messengers inositol triphosphate and  diacylglycerol (213). In this study, the difference in contraction in the cholesterol gallstone group and bile pigment stone group normalized with the addition of G­ protein activators. These results indicate that CCK cannot fully activate the intracellular pathways in smooth muscle derived from gallstone­containing gallbladders;  however, the pathways can be fully activated by circumventing membrane receptors with either second messengers or G­protein activators. The defect may be located  in the receptor itself or in the interaction between receptors and G proteins. Behar and colleagues speculate that cholesterol supersaturation alters membrane fluidity  and "stiffens" the cell membrane, thus impairing the interaction between receptors and G proteins and reducing contractility (213). Behar and colleagues have also  recently demonstrated that isolated gallbladder muscle cells from both prairie dogs and patients with cholesterol gallstones have an increased membrane  cholesterol/phospholipid ratio and decreased membrane fluidity, resulting in impaired muscle contractility (214,215).

  

Page 284

Decreased contractility of the smooth muscle cell due to an abnormal membrane­CCK receptor relationship, as demonstrated by Behar and colleagues using isolated  gallbladder cells, is clearly important. However, other nonreceptor factors may also be important in this gallbladder dysmotility, as cholesterol­rich gallbladders have  impaired contraction to potassium chloride, which is receptor­independent. Altered local production of autocrine/paracrine factors in the gallbladder wall—such as  prostaglandins, NO, and VIP—due to cholesterol infiltration is highly likely and also might alter the contractility of the gallbladder in response to CCK and other  stimulants. I—  Gallstone Prevention by Improving Gallbladder Motility The prevention of gallstone formation in animals (163) and sludge formation in humans (180) by promoting gallbladder emptying raises the possibility that oral  prokinetic agents may prevent stone formation in humans. Several pharmacological agents modulate gallbladder motility. Indomethacin enhances gallbladder emptying in patients after extracorporeal lithotripsy (123). Similarly, aspirin has a prokinetic effect on gallbladder emptying, which  is restricted to patients with gallstones (124). Prevention of gallstone formation by NSAIDs (209) may therefore be the result of their prokinetic effect. A number of other agents have a prokinetic effect on the gallbladder, including erythromycin (216), cholestyramine (217), and intravenous amino acids (59,218). The  effect of cisapride is controversial, with early studies demonstrating a prokinetic effect (219,220) and subsequent studies failing to show this (221,222). The sole agent that has been demonstrated to prevent gallbladder sludge formation in humans is daily administration of intravenous CCK in patients receiving total  parenteral nutrition (180). Several of the above agents may well find a role in preventing stone formation in high­risk groups such as dieting obese subjects, patients on long­term parenteral  nutrition, and those who have had their gallstones removed by nonsurgical techniques (bile acid dissolution, extra­corporeal lithotripsy); however, the evidence is  unavailable at present. III—  Summary and Conclusion Impaired gallbladder motility is an important factor in gallstone formation. The cause of the impaired motility is not fully defined, but cholesterol infiltration of the  gallbladder smooth muscle layer with consequent alterations in prostaglandin production and action, as well as cholesterol stiffening of the smooth muscle membrane,  may be important. Improving motility in animals prevents gallstones, and in humans prevents the formation of gallbladder sludge and may prevent gallstones.  Gallbladder prokinetic agents such as NSAIDs and erythromycin may find a future role in the prevention of gallstone formation in high­risk subjects. References 1. Moore KL. The Developing Human: Clinically Oriented Embryology. Philadelphia: Saunders, 1973. 2. Williams PL, Wendell­Smith CP, Treadgold S. Basic Human Embryology, 2nd ed. Philadelphia: Lippincott, 1969. 3. Cai W, Gu J, Huang W. Peptide immunoreactive nerves and cells of the guinea pig gallbladder and biliary pathways. Gut 1983; 24:1186–1193. 4. McPherson BR, Pemsingh RS, Scott GW. Experimental cholelithiasis in the ground squirrel. Lab Invest 1987; 56:138–144.

  

Page 285

5. Wegstapel H, Chess­Williams R, Stephenson TJ, Majeed AW, Bird NC, Johnson AG. Is there a dominant axis of contraction in the human gallbladder? Gut 1992;  33:S58. 6. Clave RA, Gaspar MR. Incidence of gallbladder disease after vagotomy. Am J Surg 1969; 118:169–176. 7. Kyosola K, Pentilla O. Adrenergic innervation of the human gallbladder. Histochemistry 1977; 54:209–218. 8. Ryan JP. Motility of the gallbladder and biliary tree. In: Johnson L, ed. Physiology of the Gastrointestinal Tract. New York: Raven Press, 1981, pp 473–476. 9. Burnett W, Gairns FW, Bacsich P. Some observations on the innervation of the extrahepatic biliary system in man. Ann Surg 1964; 159:8–26. 10. Sutherland SD. The neurons of the gallbladder and gut. J Anat 1967; 101:701. 11. Bauer AJ, Hanani M, Muir TC, Szurszewski JH. Intracellular recordings from the gallbladder ganglia of opossums. Am J Physiol 1991; 260:G299. 12. Mawe GM. The role of cholecystokinin in ganglionic transmission in the guinea pig gallbladder. J Physiol 1991; 439:89–102. 13. Polak JM, Bloom SR, Sullivan SN, Facer P, Pearse AGE. Enkephalin­like immunoreactivity in the human gastrointestinal tract. Lancet 1977; 1:972–974. 14. De Giorgio R, Parodi JE, Brecha NC, Brunicardi FC, Becker JM, Go VLS. Nitric oxide producing neurons in the monkey and human digestive system. J Comp  Neurol 1994; 342:619–627. 15. Talmage EK, Mawe GM. NADPH­diaphorase and VIP are co­localized in neurons of gallbladder ganglia. J Auton Nerv Syst 1993; 43:83–89. 16. Strah KM, Pappas TN, Melendez RL, Debas HT. Contrasting cholinergic dependence of pancreatic and gallbladder responses to cholecystokinin. Am J Physiol  1986; 250: G665–G669. 17. Strah KM, Melendez RL, Pappas TN, Debes HT. Interactions of vasoactive intestinal polypeptide and cholecystokinin octapeptide on the control of gallbladder  contraction. Surgery 1986; 99:469–473. 18. Allen M, Gu J, Adrian TE, Bloom SR. Neuropeptide Y in the guinea pig biliary tract. Experientia 1984; 40:765. 19. Lanzini A, Jazrawi P, Northfield TC. Simultaneous quantitative measurements of absolute gallbladder storage and emptying during fasting and eating in humans.  Gastroenterology 1987; 92:852–861. 20. Forgacs IC, Maisy MN, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and ursodeoxycholic acid therapy on gallbladder emptying. Gastroenterology 1984;  87:299–307. 21. Lawson M, Everson GT, Klingensmith W, Kern F. Co­ordination of gastric and gallbladder emptying after ingestion of a regular meal. Gastroenterology 1983;  85:866–870. 22. Howard PJ, Murphy GM, Dowling RH. Gallbladder emptying patterns in response to a normal meal in healthy subjects and patients with gallstones. Gut 1991;  32:1409–1411. 23. Baxter JN, Grime JS, Critchley M, Shields R. Relationship between gastric emptying of solids and gallbladder emptying in normal subjects. Gut 1985; 26:342– 351. 24. Jazrawi RP, Pazzi P, Petroni ML, Prandini N, Paul C, Adam JA, Gullini S, Northfield TC. Postprandial gallbladder motor function: refilling and turnover of bile in  health and in cholelithiasis. Gastroenterology 1995; 109:582–591. 25. Cano C, Cicero F, Ranieri F, Martin J, Di Contanzo J. Ultrasonographic study of gallbladder motility during parenteral nutrition. Gastroenterology 1986; 91: 313– 317. 26. Marzio L, Capone F, Neri M, Di Felice F, Celiberti V, Mezzetti AGD, Cuccurullo F. Effect of cholinergic agonists and antagonists on gallbladder volume in  fasting man. Eur J Clin Pharmacol 1987; 33:151–153. 27. Svenberg T, Christofides ND, Fitzpatrick ML, Areola­Ortiz F, Boom SR, Welbourn RB. Interdigestive biliary output in man: relationship to fluctuations in plasma  motilin and effect of atropine. Gut 1982; 23:1024–1028. 28. Niederau C, Heintges T, Rovati L, Strohmeyer G. Effects of loxiglumide on gallbladder emptying in healthy volunteers. Gastroenterology 1989; 97:1331–1336.

  

Page 286

29. Corazziari E, Ricci R, Biliotti D, Bontempo I, De Medici A, Pallota N, Torsoli A. Oral administration of loxiglumide inhibits post prandial gallbladder contraction  without affecting gastric emptying. Dig Dis Sci 1990; 35:50–54. 30. Meyer BM, Werth BA, Beglinger C, Hildebrand P, Jansen JB, Zach D, Rovati LC, Stalder GA. Role of cholecystokinin in regulation of gastrointestinal motor  functions. Lancet 1989; 2:12–15. 31. Tooli J, Bushell M, Stephenson G, Dent J, Wycherley A, Iannos J. Gallbladder emptying in man related to fasting duodenal migrating motor contractions. Aust NZ  J Surg 1986; 56:147–151. 32. Kraglund K, Hjermind J, Jensen FT, Stodkilde­Jorgensen H, Oster­Jorgensen E, Pedersen SA. Gallbladder emptying and gastrointestinal cyclic activity in  humans. Scand J Gastroenterol 1984; 19:990–994. 33. Quist N, Oster­Jorljensen E, Rasmussen L, Kraglund K, Pedersen SA. The relationship between gallbladder mechanics and the migrating motor complex in  fasting healthy subjects. Scand J Gastroenterol 1988; 23:562–566. 34. Marzio L, Neri M, Capone F, Di Felice F, De Angelis C, Mezzetti ACF. Gallbladder contraction and its relationship to interdigestive duodenal motor activity in  normal human subjects. Dig Dis Sci 1988; 33:540–544. 35. Furness JB, Kuramoto H, Baker RA, Toouli J. Direct neural projections from the duodenum to the gallbladder and sphincter of Oddi. Gastroenterology 1990;  98:A379. 36. Itoh Z, Aizawa I, Takeuchi S, Couch EF. Proceedings of the Fifth International Symposium on Gastrointestinal Motility. Herentals, Belgium: Typoff, 1975, pp 48– 55. 37. Wingate DL, Ruppin H, Thompson HH. 13­Norleucine motilin versus pentagastrin: contrasting and competitive effects on gastrointestinal myoelectrical activity in  the conscious dog. Acta Hepatogastroenterol 1975; 22:409–410. 38. Takahasi I, Suzuki T, Aizawa I, Itoh Z. Comparison of gallbladder contractions induced by motilin and choalecystokinin in dogs. Gastroenterology 1982; 82:419– 424. 39. Svenberg T, Nilsson I, Samuelson K, Welbourn RD. Studies on the causal relationship between gallbladder emptying and motilin release in man. Acta Chir Scand  1984; 520(suppl):59–61. 40. Pomeranz IS, Davison JS, Shaffer EA. In vitro effects of pancreatic polypeptide and motilin on contractility of human gallbladder. Dig Dis Sci 1983; 28:539–544. 41. Ellenbogen S, Grime JS, Mackie CR, Calam J, Springer C, Jenkins SA. Mechanisms responsible for the cephalic phase of gallbladder emptying. Gut 1986;  27:A621. 42. Fisher RS, Rock E, Malmud LS. Gallbladder emptying response to sham feeding in humans. Gastroenterology 1986; 90:1854–1857. 43. Tankurt E, Yegen BC, Biren T, Gurmen N, Ulosoy NB. Influence of pirenzipine on gallbladder contraction in man induced by sham feeding or an intraduodenal  meal. Digestion 1992; 51:103–109. 44. Debas HT, Yagamashi T. Evidence for a pylorocholecystic reflex for gallbladder contraction. Ann Surg 1979; 190:170–176. 45. Everson GT, Lawson MJ, McKinley C, Showalter R, Kern F. Gallbladder and small intestine regulation of biliary lipid secretion during intraduodenal infusion of  standard stimuli. J Clin Invest 1983; 71:596–603. 46. Fried M, Jansen JB, Harpole T, Taylor IL, Lamers CB, Reedy T, Elsahoff J, Meyer JH. Pancreatobiliary response to an intragastric amino acid meal; comparison  to albumin, dextrose and a maximal cholecystokinin stimulus. Gastroenterology 1989; 97:1544–1549. 47. Ellenbogen S, Jenkins SA, Grime JS, Critchley M, Mackie CR, Baxter JN. Preduodenal mechanisms in initiating gallbladder emptying in man. Br J Surg 1988;  75:940–945. 48. Amer MS. Studies with cholecystokinin in vitro: mechanism of the effect on the isolated rabbit gallbladder strips. J Pharmacol Exp Ther 1972; 183:527–534. 49. Persson CGA. Adrenoceptors in the gallbladder. Acta Pharmacol Toxicol 1972; 31:177–185.

  

Page 287

50. Bainbridge FA, Dale HH. The contractile mechanism of the gallbladder and its extrinsic nervous control. J Physiol Lond 1905; 33:138–155. 51. Persson CGA. Dual effects on the sphincter of Oddi and gallbladder induced by stimulation of the right great splanchnic nerve. Acta Physiol Scand 1973; 87:334– 343. 52. Bjork S, Jansson R, Svanvik J. Adrenergic influence on concentrating function in the feline gallbladder. Gut 1982; 23:1019–1023. 53. Winkelstein A, Achsner PW. The pressure factors in the biliary­duct system of the dog. Am J Med Sci 1924; 168:812. 54. Shoetz DJ, Birkett DH, Williams LF. Gallbladder motor function in the intact primate: autonomic pharmacology. J Surg Res 1978; 24:514. 55. Eysselein VE, Eberlein GA, Schaeffer M, Grandt D, Goebell H, Niedal W, Rosenquist GL, Meyer HE, Reeve JR. Characterisation of the major form of  cholecystokinin in human intestine. Am J Physiol 1990: 258:G253–G260. 56. Liddle RA, Goldfine ID, Rosen MS, Taplitz RA, Williams JA. Cholecystokinin bioactivity in human plasma: molecular forms, responses to feeding and relationship  to gallbladder contraction. J Clin Invest 1985; 75:1144–1152. 57. Turkelson CM, Solomon TE. Molecular forms of cholecystokinin in rat intestine. Am J Physiol 1990; 259:G364–G371. 58. Beardshall K, Morarji Y, Bloom SR, Frost G, Domin J, Calam J. Saturation of fat and cholecystokinin release: implications for possible pancreatic carcinogenesis.  Lancet 1989; 2:1008–1010. 59. Nealon WH, Upp JR, Alexander RW, Gomez G, Townsend CM, Thompson JC. Intravenous amino acids stimulate human gallbladder emptying and hormone  release. Am J Physiol 1990; 259:G173–G178. 60. Hopman WPM, DeJong AJL, Rosenbusch G, Jansen JBMJ, Lamers CBHW. Elemental diet stimulated gallbladder contraction and secretion of cholecystokinin  and pancreatic polypeptide in man. Dig Dis Sci 1987; 32:45–49. 61. Lin Y­Z, Isaac DD, Tam JP. Synthesis and properties of cholecystokinin­releasing peptide (monitor peptide), a 61­residue trypsin inhibitor. Int J Peptide Protein  Res 1990; 36:433–439. 62. Iwai K, Fukuoka T, Fushiki T, Kodaira T, Ikei N. Elevation of plasma cholecystokinin concentration after intestinal administration of a pancreatic enzyme  secretion­stimulating peptide purified from rat bile­pancreatic juice: analysis with N­terminal region specific radioimmunoassay. Biochem Biophys Res Commun 1986;  136:701–706. 63. Lu L, Louie D, Owyang C. A cholecystokinin releasing peptide mediates feedback regulation of pancreatic secretion. Am J Physiol 1989; 256:G430–G435. 64. Miyasaka K, Guan R, Liddle RA, Green GM. Feedback regulation by trypsin: evidence for intraluminal cholecystokinin­releasing peptide. Am J Physiol 1989;  257:G175–G181. 65. Liddle RA, Goldfine ID, Williams JA. Bioassay of plasma cholecystokinin in rats: effects of food, trypsin inhibitor and alcohol. Gastroenterology 1984; 87:542– 549. 66. Louie DS, May P, Miller P, Owyang C. Cholecystokinin mediates feedback regulation of pancreatic enzyme secretion in rats. Am J Physiol 1986; 250:G252– G259. 67. Owyang CD, Louie DS, Tatum D. Feedback regulation of pancreatic enzyme secretion­suppression of cholecystokinin release by trypsin. J Clin Invest 1986;  77:2042–2047. 68. Folsch URP, Cantor HM, Wilms A, Schafmayer A, Becker HD, Creutzfeldt W. Role of cholecystokinin in the negative feedback control of pancreatic enzyme  secretion in conscious rats. Gastroenterology 1987; 92:449–458. 69. Liener IE, Goodale RL, Deshmukh A, Satterberg TL, Ward G, DiPietro CM, Bankey PE, Borner JW. Effect of a trypsin inhibitor from soybeans on the  secretory activity of the human pancreas. Gastroenterology 1988; 94:419–427. 70. Gomez G, Lluis F, Guo YS, Greelay GH, Townsend CM, Thompson JC. Bile inhibits release cholecystokinin and neurotensin. Surgery 1986; 100:363–368.

  

Page 288

71. Muller LJ. Heterogeneity of CCK receptors: classification and characterization. In: Adler G, ed. CCK Antagonists in Gastroenterology. Berlin: Springer­Verlag,  1991, pp 27–34. 72. Wank SA, Harkins R, Jensen RT, Shapira H, DeWerth A, Slattery T. Purification, molecular cloning, and functional expression of the cholecystokinin receptor  from rat pancreas. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:3125–3129. 73. Schjoldager B, Molero X, Miller LJ. Functional and biochemical characterization of the human gallbladder muscularis cholecystokinin receptor. Gastroenterology  1989; 96: 1119–1125. 74. Tang C, Biemond I, Lamers CBHW. Cholecystokinin receptors in human pancreas and gallbladder muscle: a comparative study. Gastroenterology 1996;  111:1621–1626. 75. Upp JP, Nealon WH, Singh P, Fagan C J, Jonas AS, Greeley GH, Thompson JL. Correlation of cholecystokinin receptors with gallbladder contractility in  patients with gallstones. Ann Surg 1987; 205:641–647. 76. Yau WM, Makhlouf GM, Edwards LE, Farrar JT. Mode of action of cholecystokinin and related peptides on gallbladder muscle. Gastroenterology 1973;  65:451–456. 77. Peikin SRA, Rottman S, Batzri S, Gardner JD. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. Am J Physiol 1978; 235:E743– E749. 78. Schultz GS, Sarras MP, Gunther GR, Hull BE, Alicea HA, Gorelick FS, Jamieson JD. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp Cell  Res 1980; 130:49–62. 79. Williams JA, Korc M, Dormer RL. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am J Physiol 1978; 235:E517– E524. 80. Yu P, De Petris G, Biancani P, Amaral J, Behar J. Cholecystokinin­coupled intracellular signalling in human gallbladder muscle. Gastroenterology 1994; 106:763– 770. 81. Behar J, Rhim BY, Thompson W, Biancani P. Inositol trisphosphate restores impaired human gallbladder motility associated with cholesterol stones.  Gastroenterology 1993; 104:563–568. 82. Williams JA, Yule DI. Stimulum­secretion coupling in pancreatic acinar cells. In: The Exocrine Pancreas: Biology, Pathobiology and Disease. 2nd ed. New York:  Raven Press 1993. 83. Spellman SJ, Shaffer EA, Rosenthall L. Gallbladder emptying in response to cholecystokinin: a cholescintographic study. Gastroenterology 1979; 77:115–120. 84. Hopman WP, Kerstens PJ, Jansen JB, Rosenbusch G, Lamers CB. Effect of graded physiologic doses of cholecystokinin on gallbladder contraction measured by  ultrasonography: determination of threshold, dose­response relationships and comparison with intraduodenal bilirubin output. Gastroenterology 1985; 89:1242–1247. 85. Wiener I, Inoue K, Fagan CJ, Lilja P, Watson LC, Thompson JC. Release of cholecystokinin in man: correlation of blood levels with gallbladder contraction. Ann  Surg 1981; 194:321–327. 86. Liddle RA, Gertz BJ, Kanayama S, Beccaria L, Coker LD, Turnbull TA, Morita ET. Effects of a novel cholecystokinin receptor antagonist, MK­329, on  gallbladder contraction and gastric emptying in humans: implications for the physiology of CCK. J Clin Invest 1989; 84:1220–1225. 87. Malesci A, Defazio C, Festorazzi S, Bonato C, Valenti A, Tacconi M, Rovati L, Setnikar I. Effect of loxiglumide on gallbladder contractile response to caerulein  and food in humans. Gastroenterology 1990; 98:1307–1310. 88. Behar J, Biancini P. Pharmacology of the biliary tract. In: Scultz SG, Wood JD, Rauner BB, eds. Handbook of Physiology: Section 6. The Gastrointestinal  System. New York: Oxford University Press, 1989, pp 1103–1130. 89. Hanyu N, Dodds WJ, Layman RD, Hogan WJ, Chey WY, Takahashi I. Mechanism of cholecystokinin­induced contraction of the opossum gallbladder.  Gastroenterology 1990; 98:1299–1306. 90. Brotschi EA, Pattavino J, Williams LF. Intrinsic nerves affect gallbladder contraction in the guinea pig. Gastroenterology 1990; 99:826–830.

  

Page 289

91. Pozo MJ, Salido MD, Madrid JA, Salido GM. In vitro effect of pirenzipine on motility of canine gallbladder. J Pharm Pharmacol 1990; 42:89–93. 92. Takahashi T, May D, Owyang C. Cholinergic dependence of gallbladder response to cholecystokinin in the guinea pig in vivo. Am J Physiol 1991; 261:G565– G569. 93. Gullo L, Bolondi L, Scarpignato C, Priori P, Casnova P, Labo G. Effect of somatostatin and thyrotropin­releasing hormone on cholecystokinin­induced  gallbladder emptying. Dig Dis Sci 1986; 31:1345–1350. 94. Fisher RS, Rock E, Malmud LS. Cholinergic effects on gallbladder emptying in humans. Gastroenterology 1985; 89:716–722. 95. Hopman WP, Jansen JB, Rosenbusch G, Lamers CB. Role of Cholecystokinin and the cholinergic system in intestinal stimulation of gallbladder contraction in  man. Hepatology 1990; 11:261–265. 96. Masclee AA, Jansen JMBJ, Driessen WM, Geuskens LM, Lamers CBHW. Effect of truncal vagotomy on cholecystokinin release, gallbladder contraction, and  gallbladder sensitivity to cholecystokinin in humans. Gastroenterology 1990; 98:1338–1344. 97. Feyter F. Uber die These von den peripheren endokrinen Druesen. Wien Z Inn Med 1946; 27:9–38. 98. Olofsson J, Leung CK. Auto/paracrine role of prostaglandins in corpus luteum function. Mol Cell Endocrinol 1994; 100:87–91. 99. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43:109–142. 100. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M, Masaki Y. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells.  Nature 1988; 32:411–415. 101. Bjork S, Fahrenkrug J, Jivegard L, Svanvik J. Release of immunoreactive vasoactive intestinal peptide from the gallbladder in response to vagal stimulation. Acta  Physiol Scand 1986; 128:639–642. 102. Sporn MB, Todaro GJ. Autocrine secretion and malignant transformation of cells. N Eng J Med 1980; 303:878–880. 103. Booker ML, LaMorte WW. Prostaglandin release from in vitro guinea­pig gallbladder. Prostaglandins 1983; 25:143–153. 104. Nakata K, Osumi Y, Fujiwara M. Prostaglandins and the contractility of the guinea pig biliary system. Pharmacology 1981; 22:24–30. 105. LaMorte WW, Booker ML, Scott TE, Williams LF. Increases in gallbladder prostaglandin synthesis before the formation of cholesterol gallstones. Surgery  1985; 98:445–451. 106. Chapman WC, Peterkin GA, LaMorte WW, Williams LF. Alterations in biliary motility correlate with increased gallbladder prostaglandin synthesis in early  cholelithiasis in prairie dog. Dig Dis Sci 1989; 34:1420–1424. 107. Myers SI, Li YF, Weisbrodt NW, Russell DH, Moody F. Endogenous gallbladder prostaglandin biosynthesis is not related to gallstone formation in the prairie  dog fed a high­cholesterol diet. Surg Forum 1989; 40:157–158. 108. LaMorte WW, LaMont JT, Hale W, Booker ML, Scott TE, Turner B. Gallbladder prostaglandins and lysophospholipids as mediators of mucin secretion during  cholelithiasis. Am J Physiol 1986; 251:G701–G709. 109. LaMont JT, Turner BS, DiBenedetto D, Handin R, Schafer AI. Arachidonic acid stimulates mucin secretion in prairie dog gallbladder. Am J Physiol 1983;  245:G92–G98. 110. Li YF, Russell DH, Myers SI, Weisbrodt NW, Moody FG. Gallbladder contractility in aspirin­ and cholesterol­fed prairie dogs. Gastroenterology 1994;  106:1662–1667. 111. Myers S, Bartula L, Kalley­Taylor B. The role of prostaglandin I2 and biliary lipids during evolving cholecystitis in the rabbit. Gastroenterology 1993; 104:248– 255. 112. Myers SI, Haley­Russell D, Bartula L Nabzdyk. Long­term cholesterol feeding stimulates increased bile phospholipids and gallbladder prostanoid synthesis.  Surgery 1991; 109:656–662.

  

Page 290

113. England DW, Jaffe BM, Webb H, Hoover E. The prostaglandin response to cholesterol feeding by the rabbit gallbladder in vitro. Surgery 1988; 103:69–73. 114. Andersson KE, Andersson R, Hedner P, Persson CGA. Parallelism between mechanical and metabolic responses to cholecystokinin and prostaglandin E2 in  extrahepatic biliary tract. Acta Physiol Scand 1973; 89:571–579. 115. Wood JR, Saverymuttu SH, Ashbrooke AB, Stamford IF. Effects of various prostanoids on gallbladder muscle. Adv Prostaglandin Thromboxane Leuko Res  1980; 8:1569–1571. 116. Mroczka J, Baer HP, Scott GW. Effects of prostaglandins on isolated dog gallbladder and cystic duct. In: Wienbeck M. ed. Motility of the Digestive Tract.  New York: Raven Press, 1982, pp 421–426. 117. Svanvik J, Thornell E, Wood JR. Effects of prostaglandin E2 on gallbladder function in the cat. J Physiol 1980; 305:104P. 118. Nakano J, McCloy RE, Gin AC, Nakano SK. Effect of prostaglandins E1, E2 and F2a and pentagastrin on the gallbladder pressure in dogs. Eur J Pharm 1975;  30:107–112. 119. Brotschi EA, LaMorte WW, Williams LF. Effect of dietary cholesterol and indomethacin on cholelithiasis and gallbladder motility in guinea pig. Dig Dis Sci  1984; 29:1050–1056. 120. Greaves RRSH, O'Donnell LJD, Farthing MJG. Differential effect of prostacyclin on motility of normal and diseased human gallbladder in vitro.  Gastroenterology 1996; 110: A456. 121. Jonderko G, Jonderko K, Konca A, Polko M. Effect of synthetic prostaglandin E1 derivative, misoprostol, on fasted gallbladder volume and on meal­induced  gallbladder emptying in man. Am J Gastroenterol 1989; 84:1375–1377. 122. Murray FE, Stinchcombe SJ, Hawkey CJ. Effect of indomethacin and misoprostol on fasted gallbladder volume and meal­induced gallbladder contractility. Dig  Dis Sci 1992; 37:128–131. 123. O'Donnell LJD, Wilson P, Guest P, Catnach SM, McLean A, Wickham JEA, Fairclough PD. Indomethacin and postprandial gallbladder emptying. Lancet  1992; 339:269–271. 124. Das A, Baijal SS, Sarawat VA. Effect of aspirin on gallbladder motility in patients with gallstone disease. Dig Dis Sci 1995; 40:1782–1785. 125. Thune A, Delbros DS, Nisson B, Friman S, Svanvik J. Role of nitric oxide in motility and secretion of the feline hepatobiliary tract. Scand J Gastroenterol 1995;  30:715–720. 126. Kaufmann HS, Shermak MA, May CA, Pitt HA, Lillemoe JD. Nitric oxide inhibits resting sphincter of Oddi activity. Am J Surg 1993; 165:74–80. 127. Uemura S, Pompolo S, Furness JB, Hardy KJ. Nitric oxide synthase in neurons of the human gallbladder and its colocalization with neuropeptides. J  Gastroenterol Hepatol 1997; 12:257–265. 128. Mourelle M, Guarner F, Molero X, Moncada S, Malagelada JR. Regulation of gall bladder motility by the arginine­nitric oxide pathway in guinea pigs. Gut  1993; 34:911–915. 129. Greaves RRSH, Miller J, O'Donnell LJD, McLean A, Farthing MJG. Effect of the nitric oxide donor, glyceryl trinitrate, on human gallbladder motility. Gut 1998;  42:410–413. 130. Mourelle M, Guarner F, Moncada S, Malagelada JR. The arginine/nitric oxide pathway modulates sphincter of Oddi motor activity in guinea pigs and rabbits.  Gastroenterology 1993; 105:1299–1305. 131. Pauletzki JG, Sharkey KA, Davison JS, Bomzon A, Shaffer EA. Involvement of Larginine­nitric oxide pathways in neural relaxation of the sphincter of Oddi. Eur  J Pharmacol 1993; 232:263–270. 132. Bondanszky M, Klausner YS, Said S. Biological activities of synthetic peptides corresponding to fragments of and to the entire sequence of the vasoactive  intestinal peptide. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70:382–384. 133. Sundler F, Alumets J, Hakanson R, Ingemanson S, Fahrekrug J, Shaffalitzky de Muckadell O. VIP innervation of the gallbladder. Gastroenterology 1977;  72:1375–1377.

  

Page 291

134. Sand J, Tainio H, Nordback I. Neuropeptides in pig sphincter of Oddi, bile duct, gallbladder, and duodenum. Dig Dis Sci 1993; 38:694–700. 135. Dahlstrand C, Edin R, Dahlstrom A, Ahlman H. Adrenergic and VIP­ergic relaxatory mechanisms of the feline extrahepatic biliary tree. J Auton Nerv Syst 1989;  26:97–106. 136. Alumets J, Fahrekrug J, Hakanson R, Shaffalitzky de Muckadell O, Sundler F, Uddman R. A rich VIP nerve supply is characteristic of sphincters. Nature 1979;  280:155–156. 137. Ryan JP, Ryave S. Effect of vasoactive intestinal peptide on gallbladder smooth muscle in vitro. Am J Physiol 1978; 234:E44–E46. 138. Wood JR, Brennan LJ, Hormbrey JM. Comparisons of the effects of VIP, secretin, GIP and glucagon on gallbladder function. Regul Pept 1982; 3:87. 139. Piper P, Said S, Vane JR. Effects on smooth muscle preparations of unidentified vasoactive peptides from muscle and lung. Nature 1970; 225:1144–1146. 140. Vagne M, Troitskaja V. Effect of secretin, glucagon and VIP on gallbladder contraction. Digestion 1976; 14:62–67. 141. Ryan JP, Cohen S. Effect of vasoactive intestinal peptide on basal and cholecystokinin­induced gallbladder pressure. Gastroenterology 1977; 77:870–872. 142. Mizumoto A, Fujimura M, Ohtawa M, Ueki S, Hayashi N, Itoh Z, Fujino M, Arimura A. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide stimulates gallbladder  motility in conscious dogs. Regul Pep 1992; 42:39–50. 143. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler M, Coy DH. Isolation of a novel 38­residue hypothalamic polypeptide which stimulates  adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164:567–574. 144. Miyata A, Jiang L, Dahl RR, Kitada C, Kubo K, Fujino M, Minamino N, Arimura A. Isolation of a neuropeptide corresponding to the N­terminal 27 residues  of the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide with 38 residues. Biochem Biophys Res Commun 1990; 170:643–648. 145. Hickey KA, Rubayani GM, Paul RJ, Highsmith RF. Characterization of a coronary vasoconstrictor produced by cultured endothelial cells. Am J Physiol 1985;  248:C550–C556. 146. Housset C, Carayon A, Housset B, Legendre C, Hannoun L, Poupon R. Endothelin­1 secretion by human gallbladder epithelial cells in primary culture. Lab  Invest 1993; 69:750–755. 147. Fouassier L, Chinet T, Robert B, Carayon A, Balladur P, Mergey M, Paul A, Poupon R, Capeau J, Barbu V, Housset C. Endothelin­1 is synthesised and  inhibits cyclic adenosine monophosphate­dependent anion secretion by an autocrine/paracrine mechanism in gallbladder epithelial cells. J Clin Invest 1998; 101:2881– 2888. 148. McCartney SA, Greaves RRSH, Warner TD, Domizio P, Farthing MJG. Endothelin content but not expression is reduced in inflamed gallbladders.  Gastroenterology 1997; 112:A517. 149. Battistini B, O'Donnel JD, Warner TD, Fournier A, Farthing MJG, Vane JR. Characterization of endothelin (ET) receptors in the isolated gallbladder of the  guinea pig: evidence for an additional ET receptor subtype. Br J Pharmacol 1994; 112:1244–1250. 150. Cardozo AM, D'Orleans­Juste P, Yano M, Frank PA, Rae GR. Influence of endothelin A and endothelin B receptor antagonists on endothelin­induced  contractions of the isolated guinea pig gallbladder. Regul Pept 1997; 69:15–23. 151. Moummi C, Gullikson GW, Gaginella TS. Effect of endothelin­1 on guinea pig gallbladder smooth muscle in vitro. J Pharmacol Exp Ther 1992; 260:549–553. 152. Heaton KW, Braddon FEM, Mountford RA, Hughes AO, Emmett PM. Symptomatic and silent gallstones in the community. Gut 1991; 32:316–320. 153. Attili AF, De Santis A, Capri R, Repice AM, Maselli S. The natural history of gallstones: the GREPCO experience: the GREPCO Group. Hepatology 1995;  21:655–660. 154. Admirand WH, Small DM. The physicochemical basis of cholesterol gallstone formation in man. J Clin Invest 1968; 47:1043–1052.

  

Page 292

155. Pauletzki J, Althaus R, Holl J, Sackmann M, Paumgartner G: Gallbladder emptying and gallstone formation: a prospective study on gallstone recurrence.  Gastroenterology 1996; 111:765–771. 156. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 157. Von Hemsbach JH. Mikrogeologie—Ueber die Concemente in Theirischen Organismus: Nach des Vertassers Tode Herausgegeben und Bevortet von Dr.  Theodor Billroth. Berlin: Reimer, 1856, pp 1–275. 158. Doty JE, Pitt HA, Kuchenbecker SL, DenBesten L. Impaired gallbladder emptying before gallstone formation in the prairie dog. Gastroenterology 1983;  85:168–174. 159. Pellegrini CA, Ryan T, Broderick W, Way L. Gallbladder filling and emptying during cholesterol gallstone formation in the prairie dog: a cholescintigraphic study.  Gastroenterology 1986; 90:143–149. 160. Meyer PD, DenBesten L, Gurll NJ. Effects of cholesterol gallstone induction on gallbladder function and bile salt pool size in the prairie dog model: Surgery  1978; 83:599–604. 161. Fridhandler TM, Davison JS, Shaffer EA. Defective gallbladder contractility in the ground squirrel and prairie dog during the early stages of cholesterol gallstone  formation. Gastroenterology 1983; 85:168–174. 162. Roslyn JJ, DenBesten L, Thompson JE. The effect of periodic gallbladder emptying on gallbladder function and cholesterol gallstone formation. Surg Forum  1979; 30:403–406. 163. Roslyn JJ, DenBesten L, Pitt HA, Kuckenbecker S, Polarek JW. Effects of cholecystokinin on gallbladder stasis and cholesterol gallstone formation. Surg Res  1981; 30:200–204. 164. Li YF, Moody FG, Weisbrodt NW, Zalewsky CA, Coelho JC, Senninger N. Decrease of contractility of prairie dog gallbladder muscle strips following  cholesterol feeding. Surg Forum 1984; 35:224–226. 165. Li YF, Weisbrodt NE, Moody FG, Coelho JC, Gouma DJ. Calcium­induced contraction and contractile protein content of gallbladder smooth muscle after  high­cholesterol feeding of prairie dogs. Gastroenterology 1987; 92:746–750. 166. Ono K, Nakayoshi A, Suzuki K, Scott GW, Clanachan AS. Gallbladder contractility and gallstone formation in the Richardson ground squirrel. Gastroenterol  Jpn 1990; 25:95–103. 167. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 168. Fisher RS, Stelzer F, Rock E, Malmud LS. Abnormal gallbladder emptying in patients with gallstones. Dig Dis Sci 1982; 27:1019–1024. 169. Shaffer EA, McOrmond P, Duggan H. Quantitative cholescintigraphy: assessment of gallbladder filling and emptying and duodeno­gastric reflux.  Gastroenterology 1980; 79:899–906. 170. Portincasa P, Di Ciaula A, Baldassarre G, Palmieri V, Gentile A, Cimmino A, Palasciano G. Gallbladder motor function in gallstone patients: sonographic and in  vitro studies on the role of gallstones, smooth muscle function and gallbladder wall inflammation. J Hepatol 1994: 21:430–440. 171. Stolk MFJ, Van Erpecum KJ, Renooij W, Portincasa P, Van de Heijning BJM, VanBerge­Henegouwen GE Gallbladder emptying in vivo, bile composition, and  nucleation of cholesterol crystals in patients with cholesterol gallstones. Gastroenterology 1995; 108:1882–1888. 172. Van Erpecum KJ, van Berge Henegouwen GP, Stolk MFJ, Hopman WPM, Jansen JBMJ, Lamers C. Fasting gallbladder volume, postprandial emptying and  cholescystokinin release in gallstone patients and normal subjects. J Hepatol 1992; 14:194–202.

  

Page 293

173. Spengler U, Sackmann M, Sauerbruch T, Holl J, Paumgartner G. Gallbladder motility before and after extracorporeal shock­wave lithotripsy. Gastroenterology  1989; 96:860–863. 174. Festi D, Frabboni R, Bazzoli F, Sangermano A, Ronchi M, Rossi L, Parini P, Orsini M, Primerano AMM, Mazzella G, Aldini R, Roda E. Gallbladder motility in  cholesterol gallstone disease. Gastroenterology 1990; 99:1779–1785. 175. Little JM, Avramovic J. Gallstone formation after major abdominal surgery. Lancet 1991; 337:1135–1137. 176. Lee SP, Maher K, Nicholas JF, Origin and fate of biliary sludge. Gastroenterology 1988; 94:170–176. 177. Bolondi L, Gaiani S, Testa S, Labo G. Gallbladder sludge formation during prolonged fasting after gastrointestinal surgery. Gut 1985; 26:734–738. 178. Roslyn JJ, Pitt HA, Mann LL, Ament ME, Den Besten L. Gallbladder disease in patients on long­term parenteral nutrition. Gastroenterology 1983; 84:148–154. 179. Messing B, Bories C, Kuntslinger F, Bernier JJ. Does total parenteral nutrition induce gallbladder sludge formation and lithiasis? Gastroenterology 1983;  84:1012–1019. 180. Sitzmann JV, Pitt HA, Steinborn PA, Pasha ZR, Sanders RC. Cholecystokinin prevents parenteral nutrition induced biliary sludge in humans. Surg Gynecol  Obstet 1990; 170:25–31. 181. Scragg RKR, McMichael AJ, Seamark RF. Oral contraceptives, pregnancy, and endogenous oestrogen in gallstone disease—a case­control study. BMJ 1984;  288:1795–1799. 182. Barbara L, Sama C, Labate AMM. A population study on the prevalence of gallstone disease: the Sirmione study. Hepatology 1987; 7:913–917. 183. Everson GT, McKinley C, Lawson M, Johnson M, Kern F. Gallbladder function in the human female: effect of the ovulatory cycle, pregnancy and contraceptive  steroids. Gastroenterology 1982; 82:711–719. 184. Braverman DZ, Johnson ML, Kern F. Effects of pregnancy and contraceptive steroids on gallbladder function. N Engl J Med 1980; 302:362–364. 185. Kern F, Everson GT, DeMark B, McKinley C, Showalter R, Erfling W, Braverman DZ, Szczepanik­Van Leeuwen P, Klein PD. Biliary lipids, bile acids and  gallbladder function in the human female: effects of the ovulatory cycle. J Clin Invest 1981; 68:1229–1242. 186. Fisher RS, Rock E, Levin G, Malmud LS. Effects of somatostatin on gallbladder emptying. Gastroenterology 1987; 92:885–889 187. Neri M, Cuccurullo F, Marzio L. Effect of somatostatin on gallbladder Volume and small intestinal motor activity in humans. Gastroenterology 1990; 98:316– 320. 188. Catnach SM, Anderson JV, Fairclough PD, Trembath RC, Wilson PAJ, Parker E, Besser GM, Wass JAH. Effect of octrotide on gallstone prevalence and  gallbladder motility in acromegaly. Gut 1993; 34:270–273. 189. Apstein MD, Dalecki­Chipperfield K. Spinal cord injury is a risk factor for cholesterol gallstone disease. Gastroenterology 1987: 92:966–968. 190. Sapala MA, Sapala JA, RestoSoto AD, Bouwman DL. Cholelithiasis following subtotal gastric resection with truncal vagotomy. Surg Gynecol Obstet 1979;  148:36–38. 191. Nino Murcia M, Burton D, Chang P, Stone L, Perkash I. Gallbladder contractility in patients with spinal cord injuries: a sonographic investigation. AJR 1990;  154:521–524. 192. Katoka S, Syoji K. Elevated cholecystokinin­like activity in the duodenal mucosa in patients with cholelithiasis. Tohoku J Exp Med 1985; 145:395–402. 193. Pauletzki J, Cicala M, Holl J, Sauerbruch T, Schafmayer A, Paumgartner G. Correlation between gall bladder fasting volume and postprandial emptying in  patients with gallstones and healthy controls. Gut 1993; 34:1443–1447. 194. Bailey IS, Walsh TN, Hill ADK, Jazrawi S, Hennessy TPS. Effect of cholecystectomy on plasma CCK. Br J Surg 1992; 79:456–460. 195. Behar J, Lee KY, Thompson WR, Biancani P. Gallbladder contraction in patients with pigment and cholesterol gallstones. Gastroenterology 1989; 97:1479– 1484.

  

Page 294

196. Thompson JC, Fried GM, Ogden MD, Fagan CJ, Inoue K, Wiener J, Watson LC. Correlation between release of CCK and contraction of the gallbladder in  patients with gallstones. Ann Surg 1982; 195:670–676. 197. O'Leary DP, LaMorte WW, Scott TE, Booker ML, Stevenson J. Inhibition of prostaglandin synthesis fails to prevent gallbladder mucin hypersecretion in the  cholesterol­fed prairie dog. Gastroenterology 1991; 101:812–820. 198. Kuckenbecker SL, Doty JE, Pitt HA, DenBesten L. Salicylate prevents gallbladder stasis and cholesterol gallstones in the prairie dog. Surg Forum 1981;  32:154–155. 199. Neiderheiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lip Res 1976; 17:117–124. 200. Braghetto I, Antezana C, Hurtado C, Csendes A. Triglyceride and cholesterol content in bile, blood, and gallbladder wall. Am J Surg 1988; 156:26–28. 201. English M, Hopwood D. Lipid in the human gallbladder mucosa: a histochemical study by light and electron microscopy. J Pathol 1985; 146:333–336. 202. Jacyna MR, Ross PE, Bakar MA, Hopwood D, Bouchier IAD. Characteristics of cholesterol absorption by human gallbladder: relevance to cholesterolosis. J  Clin Pathol 1987; 40:524–529. 203. Ross PE, Butt AN, Gallagher C. Cholesterol absorption by the gallbladder. J Clin Pathol 1990; 43:572–575. 204. Sahlin S, Stahlberg D, Einarsson K. Cholesterol metabolism in liver and gallbladder mucosa of patients with cholesterolosis. Hepatology 1995; 21:1269–1275. 205. Kaminski DL, Deshpande Y, Thomas L, Blank W. Evaluation of the role of prostaglandins E and F in human cholecystitis. Prostaglandins Leukot Med 1984;  16:109–120. 206. Kaminski DL, Deshpande YG, Westfall S, Herbold D. Evaluation of prostacyclin production by human gallbladder. Arch Surg 1989; 124:277–280. 207. Myers SI, Bartula L. Human cholecystitis is associated with increased gallbladder prostaglandin I2 and prostaglandin E2 synthesis. Hepatology 1992; 16:1176– 1179. 208. Kotwall CA, Clanachan AS, Baer HP, Scott GW. Effects of prostaglandins on motility of gallbladders removed from patients with gallstones. Arch Surg 1984;  119:709–712. 209. Hood KA, Gleeson D, Ruppin DC, Dowling RH. Gall stone recurrence and its prevention: the British/Belgian Gall Stone Study Group's post­dissolution trial.  Gut 1993; 34:1277–1288. 210. Marks JW, Bonorris GG, Albers G, Schoenfield LJ. The sequence of biliary events preceding the formation of gallstones in humans. Gastroenterology 1992;  103:566–570. 211. Marks JW, Uhler ML, Bonorris GG, Judd HL. Nucleation of biliary cholesterol, arachidonate, prostaglandin E2, and glycoproteins in postmenopausal women.  Gastroenterology 1997; 112:1271–1276. 212. McKirdy ML, McKirdy HC, Johnson CD. Non­adrenergic non­cholinergic inhibitory innervation shown by electrical field stimulation of isolated strips of human  gallbladder muscle. Gut 1994; 35:412–416. 213. Yu P, Chen Q, Harnett KM, Amaral J, Biancani P, Behar J. Direct G protein activation reverses impaired CCK signalling in human gallbladders with cholesterol  stones. Am J Physiol 1995; 269:G659–G665. 214. Yu P, Chen Q, Biancani P, Behar J. Membrane cholesterol alters gallbladder muscle contractility in prairie dogs. Am J Physiol 1996; 271:G56–G61. 215. Chert Q, Amaral J, Biancani P, Behar J. Excess membrane cholesterol alters human gallbladder muscle contractility and membrane fluidity. Gastroenterology  1999; 116:678–685. 216. Catnach SM, Fairclough PD, Trembath RC, O'Donnel LJ, McLean AM, Law PA, Wickham JE. Effect of oral erythromycin on gallbladder motility in normal  subjects and subjects with gallstones. Gastroenterology 1992; 102:2071–2075. 217. Portincasa P, Di Ciaula A, Palmieri V, Baldassarre G, Palasciano G. Enhancement of gallbladder emptying in gallstone patients after oral cholestyramine. Am J  Gastroenterol 1994; 89:909–914.

  

Page 295

218. Zoli G, Ballinger AB, Healy J, O'Donnell LJD, Clark ML, Farthing MJG. Promotion of gallbladder emptying by intravenous amino acids. Lancet 1993;  341:1240–1241. 219. Marzio L, Neri M, De Angelis C, Di Felice F, Celiberti V, Cuccurullo F. Effect of cisapride on gallbladder kinetics in normals and patients with decreased  gallbladder response to a liquid meal. Curr Ther Res 1987; 42:895–900. 220. Marzio L, Di Felice F, Laico MG, Imbibo B, Lapenna D, Cuccurullo F. Gallbladder hypokinesia and normal gastric emptying of liquids in patients with  dyspeptic symptoms: a double blind, placebo controlled trial with cisapride. Dig Dis Sci 1992; 37:262–267. 221. Zieganhagen DJ, Glimm E, Kruis W, Zehtner E. Oral cisapride increases gallbladder volume in volunteers. J Gastrointest Motil 1992; 4:119–123. 222. Ziegenhagen DJ, Heitz W, Kruis W, Pohl C, Zehtner E. Cisapride increases gallbladder volume in gallstone patients before and after extracorporeal shock wave  lithotripsy. Aliment Pharmacol Ther 1993; 7:617–622.

  

Page 297

14—  The Role of Intestinal Transit R. Hermon Dowling The Guy's, King's College and St. Thomas's Medical and Dental School, London, England I—  Introduction The concept that slow intestinal transit, a deficiency of dietary fiber, and excess of refined carbohydrate intake might contribute to cholesterol gallstone formation is  neither new (1–6) nor widely accepted. In part this is because over the past 30 years, thoughts about gallstone pathogenesis have been dominated by three different  factors. First, there was an obsession about biliary cholesterol saturation (7,8). Second, it became clear that although supersaturation of bile with cholesterol was an  essential prerequisite for cholesterol stone formation, supersaturation alone was not adequate (9); in addition, there had to be a nucleation defect due to an excess of  promoters and/or a deficiency of inhibitors of cholesterol microcrystal precipitation (10–12). A third major factor—that of stasis of bile within the gallbladder (13–17)  (secondary to impaired gallbladder motility and, in animals at least, to crystal trapping by excess mucus glycoprotein gel on the surface of the gallbladder mucosa)— also diverted attention away from the role of intestinal transit and other potentially important mechanisms, in cholesterol gallstone pathogenesis. The individual contributions to this so­called triple defect (18,19)—supersaturation, nucleation defects, and gallbladder stasis—are discussed fully elsewhere in this  book. Their importance is not in question and this is recognized by the editor with multiple relevant chapters in this book. However, the brief for this chapter was to  extend the limited evidence (4,20) incriminating intestinal transit in the development of cholesterol­rich gallbladder stones. In fact, the different pathogenetic  mechanisms discussed above are not mutually exclusive and may well be interrelated. It is just conceivable that all the various mechanisms are secondary to changes in  intestinal transit. However, the argument is not about the relative importance of the ''lithogenic liver" versus the "guilty gallbladder" versus (now) the "indolent intestine,"  but rather about the attempt to develop a unifying hypothesis that might even harmonize the apparently divergent theories about gallstone formation. This hypothesis is  based on the assumption that prolonged intestinal transit increases the formation and solubilization of deoxycholic acid (DCA) in the colon and absorption from it (21).  It also depends on the validity of the evidence that increased proportions of DCA in bile promote biliary cholesterol hypersecretion (22,23), supersaturation, and stone  formation. This too is controversial; therefore the evidence for and against this assumption is also reviewed. The story begins with the observation in the late 1980s (24,25) that some acromegalic patients treated long term with the somatostatin analogue octreotide developed  gallbladder stones (26).

  

Page 298

II—  Effect of Octreotide Treatment on the Prevalence/Incidence of Gallbladder Stones Patients with somatostatin­secreting tumors (somatostatinomas) are known to have a high prevalence of gallstones (27). Partly for this reason, clinicians treating  patients with octreotide (OT; a relatively long­acting analogue of native human somatostatin) were alert to the possibility that chronic OT treatment might induce  gallstone formation. That it does so is now beyond dispute. Figure 1 summarizes the reported incidence of new gallstone formation in acromegalic patients treated long term with OT. As results in this figure indicate, in the  different reports the dose and duration of OT treatment varied widely—as did the de novo development of gallstones. (In these 18 studies, all patients were gallstone­ free by ultrasound before the OT treatment was introduced.) Thus the incidence of stone development ranged from 10% in one study (28) to 60% in another (29).  Despite this, most patients received 100 to 200  g of OT three times daily and, after 1 to 2 years of treatment, just under 30% of patients developed iatrogenic  gallbladder stones (Fig. 1).

Figure 1 Reported incidence of gallbladder stones (GBS) in acromegalic patients treated with octreotide (OT) in doses ranging from 100 to 1500  g/day for periods ranging from 3 to  70 months. (Most patients received 100 to 200  g thrice daily by subcutaneous injection  for approximately 1 to 2 years.) Since at the start of OT treatment these patients were free of GBS by ultrasound, the results of these 18 studies represent the frequency of OT­induced  (rather than OT­associated) GBS. The vertical bars represent the percentage of patients  developing cholelithiasis: the numbers at the top of the columns refer to the numbers of patients developing stones over the numbers of patients treated. The broken horizontal line represents the mean incidence of OT­induced stones (29%) in these 18 studies.  (From Ref. 119.)

  

Page 299

A—  Composition of Octreotide­Induced Gallbladder Stones Based on rather scant evidence, it was initially assumed that all of these OT­associated stones were cholesterol­rich. However, in common with "conventional"  gallstones (developing spontaneously in the absence of acromegaly or octreotide treatment), most patients with OT­induced gallbladder stones (GBS) were symptom­ free and therefore did not warrant cholecystectomy (30). As a result, only a few patients with OT­associated gallstones came to surgery, when their stones could be  retrieved and analyzed for their chemical composition. In these patients, the stones were indeed cholesterol­rich (>70% cholesterol by weight) (31). But in those who  did not undergo cholecystectomy, a number of indirect methods of estimating stone composition was used. These included (a) bile microscopy and studies of bile lipid  composition, (b) the use of computed tomography (CT) scanning in vivo (gallstone attenuation scores, measured in Hounsfield units, predict stone composition)  (32,33), and (c) the dissolution response of the gallstones to oral ursodeoxycholic acid therapy (34,35). Taking the results of these direct and indirect studies together,  the consensus is that OT­induced stones are indeed cholesterol­rich (31). But like most gallstones in industrialized societies, they were not pure cholesterol stones:  rather, they were mixed in composition, containing, in addition to cholesterol, small amounts of bile pigments, calcium salts, and amorphous material. III—  Mechanism for Octreotide­Induced Gallbladder Stone Formation A—  The Role of Gallbladder Emptying Acromegaly is characterized by high circulating levels of both growth hormone (GH) and insulin­like growth factor­I (IGF­I). OT is an effective treatment for  acromegaly: it acts by suppressing GH and IGF­I levels (36–38). However, this suppressive effect of OT is not specific: the somatostatin analogue also inhibits the  meal­stimulated release of many peptide hormones from the gastrointestinal tract, including cholecystokinin (CCK). In turn, suppression of CCK release is the  principal but not the sole mechanism whereby both native somatostatin (39,40) and OT (41–45) inhibit postprandial gallbladder emptying. Thus, a single 50­ g  subcutaneous injection of OT virtually "paralyzes" the GB by abolishing meal­stimulated gallbladder emptying for at least 4 h (44). Since long­term OT treatment is  usually given thrice daily by subcutaneous injection, it was initially assumed that somatostatin analogue­induced gallstones were caused by gallbladder stasis alone. The  author's team certainly confirmed that OT dramatically impairs GB emptying in response to a fat­rich liquid test meal (45). However, given the fact that the  pathogenesis of cholesterol­rich gallstones is multifactorial, it seemed important to study not only gallbladder emptying but also bile composition and physical chemistry  in acromegalic patients with OT­associated GBS. B—  Bile Lipid Composition and Physical Chemistry Most but not all (46) investigators believe that to study the distribution of biliary cholesterol between vesicles and micelles and to measure the cholesterol microcrystal  nucleation time (or, more correctly, the crystal detection or appearance time), one needs to study fresh gallbladder bile—rather than bile­rich duodenal fluid or the  mixture of hepatic and gallbladder bile that is obtained during endoscopic retrograde cholangio­pancreatography (ERCP). Therefore the controversial approach of  ultrasound­guided, percutaneous, transhepatic, fine­needle puncture of the gallbladder (47–49) was used to aspirate samples of fresh gallbladder bile from (a) stone­ free acromegalic patients untreated with OT (the closest approximation available to a control group), (b) acromegalics with OT­associated gallbladder stones, and (c)  patients with conventional, cholesterol­rich GBS unrelated to acromegaly or OT treatment. In these fresh samples, bile acid and bile lipid composition were measured  and bile physical chemistry (the

  

Page 300

distribution of cholesterol between vesicles and micelles and the microcrystal nucleation/observation time) was studied (50). The results of these studies showed that all the acromegalic patients with OT­associated GBS had bile that was supersaturated with cholesterol. The excess biliary  cholesterol was found mainly in the vesicular fraction, and the molar ratio of cholesterol:phospholipids (CH:PL) in these vesicles was high. High CH:PL molar ratios in  biliary vesicles predict rapid nucleation of cholesterol microcrystals (51)—a prediction that was confirmed by direct measurement in the patients with OT­GBS (50).  In fact, the pattern of results in the patients with OT­associated gallstones was virtually identical to that in the "disease controls" with conventional gallstone disease.  However, the changes in the bile lipid composition and physical chemistry were apparently due to the OT treatment rather than secondary to the presence of  gallstones. Thus, when paired, before and during OT treatment studies were carried out in a small number of patients, the bile lipid changes were found to have  developed within weeks of starting the OT, independent of stone formation (50). C—  Biliary Bile Acid Composition The next chapter in the saga relates to induced changes in the bile acid composition and the concept that the bile lipid findings might be secondary to increases in the  percentage of the hydrophobic DCA in bile. When biliary bile acid composition was measured by high­performance liquid chromatography (HPLC), the mean  proportion of DCA (percentage of total bile acids) was approximately twice as high in the gallstone carriers as in the stone­free individuals (50). Furthermore, in the  paired studies, the mean proportion of DCA increased significantly from approximately 12% before OT to around 24% during long­term treatment with the  somatostatin analogue. At the same time, the biliary cholesterol saturation increased significantly and the bile became supersaturated in cholesterol, again independent  of the presence or absence of iatrogenic stone formation. IV—  Mechanism for the Increased Percentage of DCA in Bile during OT Treatment A—  Small Bowel Transit Why OT should induce an increase in the percent DCA in bile was not immediately obvious. However, a possible explanation came from studies of small bowel  transit, measured by the breath hydrogen technique, in nonacromegalic individuals (control subjects and patients with the irritable bowel syndrome) given a single  subcutaneous injection (50  g) of OT 30 min before a liquid test meal "spiked" with lactulose (a substrate for breath hydrogen production). The results of four  separate studies (41,52–54), in all of which a similar protocol was used, showed that OT markedly prolongs small bowel transit time—as measured by the breath  hydrogen technique (55). However, when the Guy's studies began, there was little or no information about the effects of chronic (as opposed to the acute effect of a  single injection) OT treatment in either control subjects or acromegalic patients, and no information about the effects of OT on large bowel transit—of importance,  since the colon is the major intestinal site for DCA production (56,57). B—  Large Bowel Transit The results of studies by the author's group (45) confirmed that a single 50­ g injection of OT significantly prolonged small bowel transit both in control subjects and in  acromegalic patients. More important (at least in the context of iatrogenic gallstone formation), chronic OT

  

Page 301

treatment also prolonged large bowel transit time (LBTT) as measured by the progress of ingested radiopaque marker shapes through the intestine (58). This method  is simple and non­invasive, but it is a relatively crude technique that yields a considerable scatter of results (K.W. Heaton, personal communication). This may explain  why, initially, no significant difference was found in the results for LBTT between acromegalic patients untreated and treated with OT (45). However, when LB. was  measured before and during OT treatment, with each individual acting as his or her own control, it became clear that the somatostatin analogue did indeed significantly  prolong LBTT by an average of approximately 15 h (59,60). C—  Relationship between Large Bowel Transit Time and the Percentage of DCA in Serum/Bile For ethical reasons, we did not feel justified in extending our studies of bile composition in samples obtained by percutaneous fine­needle puncture of the gallbladder.  Instead, as part of a study in which the size of the bile acid pool and the bile acid "synthesis" rates were measured (61) using serum sampling and stable isotopes (13C­  and 2H­labeled bile acids) (62), we analyzed fasting serum bile acid composition by gas chromatography­mass spectrometry (GCMS). In paired before and during  treatment studies, we found that not only LBTT but also the percentage of DCA in fasting serum increased during the OT therapy (59,60). This raised an obvious  question: Is there a relationship between colonic transit and the percent DCA in fasting serum (and, by implication, in gallbladder bile)? To answer this question, the study was extended, initially, to 64 individuals [control subjects and acromegalic patients ± long­term OT treatment (60)] in whom a  highly significant (p < 0.001) linear relationship between the percentage of DCA in fasting serum and LBTT was found. This relationship has now been confirmed in  over 200 individuals (Fig. 2) from five different studies (Veysey et al., unpublished observations): in other words, the longer the colonic transit time, the higher the  proportion of DCA in serum and, again by inference, in bile.

Figure 2 Relationship between the proportion of deoxycholic acid (DCA) expressed as a percentage of total bile acids in fasting serum, measured by gas chromatography­mass spectrometry, and large  bowel transit time (LBTT), assessed by recording the progress of radio­opaque marker shapes through  the intestine. The data in these 207 individuals come from five separate studies (21,60,61,118,120) in which a similar pattern of results was found.

  

Page 302

D—  Relationship between LBTT and DCA Pool Size/Formation Rate In some ways, the attempt to correlate LBTT and the percentage of DCA in fasting serum was a "chalk and cheese" comparison. The proportion of the individual bile  acids in serum was measured in a "snapshot" by an exquisitely sensitive technique (63). In contrast, LBTT was measured over a 4­day period using a relatively crude  technique. The next step, therefore, was to measure the DCA pool size and the DCA formation or "synthesis" rate (input into the enterohepatic circulation) rate using  stable isotope dilution and serum sampling (62). When this was done, the results of paired studies again showed that during OT treatment, there was a significant  increase in both the DCA pool size and its formation rate with a corresponding decrease in the pool size of the parent bile acid, cholic acid (CA) (61,64). Indeed, by  using dual isotopes, it was possible to measure the conversion rate of 13C­labeled CA into 13C­labeled DCA in serum (64). Both before and during OT treatment, there were highly significant linear relationships between (a) LBTT and the DCA pool size (61,64) and (b) LBTT and DCA  formation (61,64), both variables now being measured over the same 4­ to 5­day period. Moreover, during OT treatment, there were significant increases in the  conversion rate of 13C­CA to 13C­DCA on days 2, 3, and 4 of the study (64). V—  Is the Percentage of DCA in Serum a Valid Marker for the Percentage of DCA in Bile? How valid is it to use the percent DCA in fasting serum as an indicator of the percent DCA in bile? To date, the evidence that it is limited: further studies are needed to  confirm (or refute) that such a relationship exists. For two reasons, however, it seems that the bile acid composition of serum does, in fact, provide a valid surrogate  marker for that in bile. First, although the total bile acid concentration in the peripheral circulation (approx 5 to 15 µM) is only one­thousandth of that in the intestinal lumen (around 5 to 15  mM), which, in turn, is between one­tenth and one­twentieth of that in concentrated gallbladder bile (100 to 200 mM); ultimately, the bile acid pools in these different  "compartments" must be in equilibrium. Indeed, this is the justification for sampling serum, rather than bile­rich duodenal fluid, when measuring pool sizes and turnover  rates by isotope dilution (61,62). This does not imply that from minute to minute, or even from hour to hour, the bile acid composition in the different compartments  will necessarily be the same. Indeed, the ability of the liver to take up bile acids from the portal blood (first­pass extraction efficiency) varies considerably from one bile  acid to the next. This is explained, at least in part, by the avidity of the bile acid binding to albumin (and other proteins in the blood) (65,66). Thus, the first­pass  extraction efficiency of the liver for the conjugates of cholic acid is high, while that for unconjugated secondary bile acids, such as DCA, is low (65–67). This results in  a selective "spillover" of bile acids into the peripheral circulation, which inevitably leads to a temporary mismatch between the pattern of bile acids in serum and that in  bile—particularly after a meal. Indeed, the turnover of bile acids in serum/plasma is very rapid, the t 1/2 being <10 min (68). However, over the course of a day (and  certainly over the course of the 4 to 5 days required to measure bile acid kinetics by isotope dilution), these temporary inconsistencies are ironed out. These  considerations were fully addressed by Stellaard and colleagues (62) in their validation of the serum sampling method when using stable isotopes to measure bile acid  pool size and turnover. Second, the question has been addressed directly by Nagengast et al. (69), who compared the percentage of DCA in serum and the percentage of DCA in bile from  74 individuals. They showed that within an 8% variation, the molar percentage of DCA in bile could be predicted from the percentage of DCA in serum using a simple  formula. It must be admitted, however, that for other bile acids, such as ursodeoxycholic acid (UDCA), the concordance between serum and biliary bile acids is  variable. In some studies it is high (70,71), while in others it is

  

Page 303

indifferent (72,73). The reason for the variable concordance is unclear but may relate to the fact that in some of these studies, the serum bile acids were measured  using suboptimal methods (gas chromatography) in disease states, such as primary biliary cirrhosis (73). VI—  Evidence That DCA Influences Biliary Cholesterol Secretion, Saturation, and the Risk of Gallstone Formation A detailed discussion of this topic is beyond the scope of this chapter. However, since much of the argument advanced to date is based on the assumption that  prolonged intestinal transit influences CH gallstone formation through its effect on DCA metabolism, the question about the central role of DCA in gallstone formation  is not a trivial one. It demands at least a brief response. A—  Percentage of DCA in Bile: Gallstone Carriers versus Stone­Free Controls In 1988, Marcus and Heaton (4) reviewed the evidence incriminating DCA in the pathogenesis of CH gallstones. At that time, they cited 20 studies from the literature  in which biliary bile acid composition had been compared in stone­free controls and patients with presumed CH­rich gallstones. In 19 of the 20 comparisons, there  was more DCA (percentage of total bile acids) in the bile of the gallstone carriers than in that of the controls. However, these differences were statistically significant in  only 7 of the 19 comparisons—although in some of the non­significant comparisons, the numbers of control subjects and gallstone carriers were relatively small, with  the attendant risk of a type II error. Marcus and Heaton (4) also noted that the percentage of DCA in bile was greater than normal in individuals with risk factors for  developing GBS—namely increased age, female sex (gender), hypertriglyceridemia, and "not being a vegetarian." Since the 1988 review, there have been many subsequent publications in which similar comparisons of biliary bile acid composition have been made between stone­ carrying and stone­free groups. Most (21,50,74–77) but not all (78–82) confirmed that the proportion of DCA in bile is indeed significantly higher in gallstone patients  than in matched controls. B—  Effect of Increasing the Percentage of DCA in Bile on Biliary Cholesterol Secretion Two groups have shown that DCA enrichment of bile induces biliary cholesterol hypersecretion. Thus, Carulli et al. (22) studied postcholecystectomy T­tube patients  in whom they had depleted the bile acid pool by external biliary drainage or "washout." They then replaced the endogenous bile acids with exogenous bile acids by  intraduodenal infusion. This enriched the T­tube bile with the infused bile acid, and when DCA became the dominant bile acid (>90 to 95%), there was hypersecretion  of biliary CH. Leiss and von Bergmann (23) used a different technique—that of steady­state secretion­perfusion to measure the hour­by­hour output of biliary lipids  under the influence of different bile acids. Once again, in the presence of DCA, there was relative hypersecretion of biliary CH. The mechanism whereby DCA­rich bile induces biliary CH hypersecretion may involve the "leaching" of CH from selected domains of the outer hemileaflet of the  canicular membrane as a function of bile acid hydrophobicity. Certainly the linear relationships between biliary CH and biliary bile acid secretion were much steeper  when the bile was enriched with hydrophobic bile acids, such as DCA, as opposed to hydrophilic bile acids, such as chenodeoxycholic and ursodeoxycholic acids  (22).

  

Page 304

C—  The Relationship between the Percentage of DCA and the Moles Percent Cholesterol, the CH Saturation Index, and the Percentage of Arachidonic  Acid­Rich Phospholipids in Bile A number of investigators have shown that there are significant linear relationships between the percentage of DCA in bile and (a) the moles percent cholesterol in GB  bile (74,75,77,84–88), (b) the CH saturation index (CSI) (74,75,77,84–88), and (c) the CH mass in the gallbladder (89). Thus, in the American National  Cooperative Gallstone Study, Hofmann et al. (85) showed that before treatment, men but not women with gallstones had a significant linear relationship between the  percentage of DCA in bile, and both the moles percent CH, and the CSI. Similarly, Hussaini et al. (88) examined the relationship between these parameters in several  groups of patients in whom the proportion of DCA in bile varied spontaneously rather than as a result of bile acid feeding (3,90), antibiotic therapy (90,91), or  manipulation of the rates of intestinal transit (see below). Hussaini and colleagues also showed significant linear relationships between the percentage of DCA in bile  and both the moles percent cholesterol and the CSI. This observation may explain why they also found that the percentage of DCA was significantly greater in  individuals with abnormally rapid CH crystal nucleation times (<5 days) than in those with normal nucleation times (>10 days) (88). However, these findings have been  challenged by others, who found no such relationship (82). Despite this, in model (artificial) biles, hydrophobic bile acids—such as DCA and its conjugates—induce  faster and more extensive precipitation of various types of CH microcrystals, than hydrophilic bile acids, such as cholic acid and its conjugates (92). In humans, virtually all the biliary phospholipids are present as phosphatidylcholines. And when the percentage of DCA in bile is plotted against the percentage of  phosphatidylcholines rich in arachidonic acid, both van Berge Henegouwen et al. (93) and Pereira et al. (94) showed, independently, that there are significant linear  relationships between the two variables. In turn, high levels of arachidonic acid­rich phosphatidylcholines (AAPCs) are risk factors for CH GBS formation (95,96).  This may be due to the fact that after the AAPCs have been hydrolyzed (by phospholipases) and absorbed from the bile into the GB wall, the archidonic acid may  serve as a precursor for prostaglandins. The prostaglandins so formed may influence the synthesis of mucus glycoprotein (MGP) and secretion by the gallbladder.  (MGP is a potent promotor of CH crystal nucleation/precipitation and crystal trapping.) Prostaglandins may also affect GB motility (97). However appealing the logic,  this theory contains many unproven assumptions. Thus, it is far from clear that the GB wall derives significant amounts of arachidonic acid from phospholipids in the  GB lumen rather than from the circulation or as a result of synthesis in situ. D—  Effect of Pharmacological Manipulation of Intestinal Transit on the Percentage of DCA and the Cholesterol Saturation Index in Bile A number of groups have shown that when intestinal transit is prolonged pharmacologically, the percentage of DCA and the CH saturation of bile both increase. This  happens, for example, with loperamide (98) or octreotide (50). Conversely, when intestinal transit is accelerated with senna (98), lactulose (99), bran (100–102), or  cisapride (103), the proportion of DCA and/or the cholesterol saturation of bile decrease. E—  Effect of DCA Feeding on Biliary Cholesterol Saturation The fifth and weakest link in the chain of evidence incriminating DCA in the pathogenesis of gallstones comes from studies of bile acid feeding. Here the results are  widely contradictory. Thus, when Low­Beer and Pomare (3) fed normal people 100 to 150 mg of DCA per day for 2 weeks, there was a significant increase in the  lithogenic (biliary CH saturation) index. Sim­

  

Page 305

ilarly, when Carulli et al. (92) fed similar doses of DCA to gallstone patients, the mean CSI rose from 1.07 to 1.42. Conversely, when Ahlberg et al. (104), La Russo  et al. (105), Carulli et al. (106) and Hillebrant et al. (78) fed DCA, they could not confirm the original observations. However, as is so often the case, the protocols  used by different investigators varied considerably, and in these latter three studies the oral dose of DCA varied from 750 to 1000 mg/day. In an attempt to explain these discrepant results, the Bristol group suggested that the relationship between biliary CH saturation and the dose of DCA might conform to  a "Starling curve." In other words, they suggested that the absence of effect of DCA feeding on the biliary CH saturation indices might be due to the fact that, in many  of the subsequent studies, "pharmacological" (rather than physiological) doses of DCA were used. However, this explanation is not totally satisfactory. Ponz de Leon  et al. (90) also fed large doses of DCA (800 to 1000 mg/day) and did find a significant rise in the lithogenic index, as did Di Donnato et al. (107), despite the fact that  they fed small daily doses of DCA (180 to 250 mg/day), comparable to those used by Low­Beer and Pomare in their original study (3). VII—  Evidence That Prolonged Intestinal Transit and Altered DCA Metabolism Are Important in Conventional Cholesterol Gallstone Formation As indicated above, the author's interest in the role of intestinal transit in the pathogenesis of cholesterol gallstones began with studies of the unique human model of  iatrogenic gallstone disease—that induced by OT. However interesting, the results of these studies would be of limited value if they applied only to this small group of  patients. The question therefore arises: What is the evidence that prolonged colonic transit also plays a role in the genesis of "conventional" cholesterol gallstones? And  if it does, how precisely does prolonged large bowel transit affect DCA metabolism? For example, does it influence DCA formation in the intestine? Does it favor the  solubilization, and therefore the bioavailability, of the newly formed DCA? Or does the prolonged residence time in the colon simply allow more time for DCA  absorption? A—  Review of Published Literature To date, the number of published reports providing evidence in favor of a role for prolonged intestinal transit in conventional gallstone disease is limited (n = 5).  However, the results of these studies all point in the same direction. For example, Heaton and colleagues from Bristol (108) compared whole­gut transit time  (measured directly in some and estimated indirectly in others) and fecal wet weight, in nonobese women with gallstones who had no known risk factors for  cholelithiasis, and in matched stone­free controls. They showed that, on average, the whole­gut transit time was almost 20 h longer in the gallstone patients than in the  controls, while their mean fecal wet weight was approximately half that of the controls. To paraphrase their findings, the gallstone carriers seemed to suffer from slow­ transit constipation. Subsequently, the Bristol group traveled halfway round the world to carry out similar, although less detailed, studies in Ladakhi women from  Northern India (109). The Ladakhis have a particularly high prevalence of gallstones and they also seem to suffer from constipation—allegedly because they suppress  the urge to defecate outdoors in a primitive, low­temperature mountainside environment. Then, in a study from Japan and Sweden, Shoda et al. (74) measured a large number of variables, again comparing gallstone patients with matched controls. These  variables included measurements of intestinal transit, gallbladder emptying, and, in gallbladder bile, bile lipid and bile acid composition. It may well be unwise to "cherry  pick" from the large number of results in this publication, but in support of the author's hypothesis, Shoda and colleagues (74) found that, when compared to controls,  the gallstone patients had significantly prolonged small bowel

  

Page 306

transit times, approximately twice as much DCA (percentage of total bile acids), and supersaturated rather than unsaturated duodenal "bile." Azzaroli et al. from Bologna, Italy (76), also compared results in control subjects and gallstone patients. Despite the fact that DCA is thought to be formed in the colon  (56,57) rather than in the small intestine, these authors also measured small rather than large bowel transit time by three different methods. Like the Japanese, they too  found that oro­ileal, oro­cecal and duodeno­colonic transit times were all significantly prolonged in the gallstone patients, with corresponding increases in the  percentage of DCA and the CH saturation indices. Indeed, as noted above, these authors found significant linear relationships between small bowel transit and the  percentage of DCA in bile. B—  Roles of Cecal Anaerobes, Bile Acid­Metabolizing Enzymes, and Intracolonic pH in the Formation and Solubilization of DCA in, and the Absorption  of DCA from, the Colon At about the same time, Thomas et al. (21) conducted similar but independent studies in London. They, too, speculated that patients with conventional CH­rich  gallstones might have prolonged large bowel transit times. In their working hypothesis (21), they suggested that prolongation of LBTT might lead to increased numbers  of total and Gram­positive anaerobic bacteria in the proximal colon capable of bile acid deconjugation (removal of glycine or taurine by the intestinal bacterial enzyme  cholyglycine hydrolase: CGH) and/or dehydroxylation (removal of the 7­  hydroxyl group from unconjugated cholic acid, to form unconjugated deoxycholic acid by  the enzyme 7­  dehydroxylase: 7­  DH). In other words, prolongation of large bowel transit could either increase the number of colonic anaerobes or the activity of  the bile acid­metabolizing enzymes, either of which would favor increased DCA formation. Alternatively, the prolonged LBTT, if present, might increase the specific  activities of the bile acid­metabolizing enzymes—that is, the amounts of enzyme per unit bacterial protein. The authors also hypothesized that transit­induced increases  in fecal and/or colonic luminal pH (102,110) would favor the solubilization, and therefore the bioavailability, of newly formed unconjugated DCA for passive  absorption from the colon. Finally, they suggested that any prolongation of colonic transit would allow more time for DCA absorption as the luminal contents traversed  the colon. To test these working hypotheses, Thomas and colleagues (21) studied 20 individuals who were stone­free by cholecystosonography and 20 patients with GBS that  were CH­rich, as judged by maximum stone­attenuation scores of <100 Hounsfield units on in vivo CT scanning. All 40 individuals underwent clinically indicated  colonoscopy, for which the contents of the left colon were washed out by instant enema, leaving those in the right side (cecum plus ascending colon) undisturbed and  available for study. As before, LBTT was measured by the marker­shape technique (58). The pH profile throughout the gastrointestinal tract was measured by  radiotelemetry (111–113) while the percentage of DCA in fasting serum was again quantitated by gas chromatography­mass spectrometry (GC­MS) (114). Then, in  fresh homogenized cecal aspirates obtained at colonoscopy, the authors used serial dilution techniques to measure the number of total and Gram­positive anaerobes  and the activities of the two bile acid­metabolizing enzymes (CGH and 7­  DH). The results of these studies confirmed that, compared to stone­free "controls," the gallstone carriers had significantly prolonged large bowel transit times. This was  associated with two­ to three­fold increases in the numbers of total and Gram­positive anaerobes in the cecal aspirates. Assuming that the complement of bile acid­ metabolizing enzymes per bacterium did not change, it follows that the increase in anaerobic bacterial numbers leads to a corresponding increase in the mass (total  amount) of enzymes present in the colon. In addition, however, the specific activity (units of enzyme per milligram of protein) of both CGH and 7­  DH increased  (significantly so only for 7­  DH), allegedly because of substrate­enzyme induction (115). The

  

Page 307

authors suggested that the combination of more time (prolonged LBTT) and more enzymes (as a result of more anaerobic bacteria and an increase in 7­  DH specific  activity), favored increased DCA formation. At the same time, the prolonged large bowel transit was associated with small but consistent and significant increases in colonic luminal pH—apparently because the  slow transit allowed more time for short­chain fatty acid absorption (110,116,117). Parallel ex vivo studies showed that these subtle changes in pH markedly  increased the solubilization, and therefore the bioavailability, of the newly formed DCA. The net result of these transit­related increases in DCA formation and  solubilization was enhanced DCA absorption (presumably by passive nonionic diffusion from the colon), as evidenced by significant increases in fasting serum DCA  (percentage of total serum bile acids).

Figure 3 Flow diagram summarizing the results of several studies from the author's department (18,45,59,120–124) showing how prolongation of large bowel transit time (LBTT) might  increase the proportion of deoxycholic acid (DCA) in the bile acid pool and in serum and bile. Thus, an increase in LBTT favors an increase in the numbers of Gram­positive (gram + ve) anaerobes in the proximal colon. This increase in the numbers of anaerobes leads to increases in the total amounts (biomasses) of the intestinal bacterial bile acid metabolizing enzymes responsible for deconjugation [cholylglycine hydrolase (CGH)] and 7 ­dehydroxylation  [7 ­dehydroxylase (7 ­DH)] of the conjugated bile acids in the cecum and colon. The  resultant increase in deconjugation means that more cholic acid (CA) is formed in the proximal colon, and this, in turn, may increase the specific activity (spec act) of 7 ­DH. The  combination of increased total amounts of 7 ­DH and increased 7 ­DH­specific activity  favors enhanced DCA formation. At the same time, the prolongation in LBTT increases colonic luminal pH, which ensures that the newly formed unconjugated DCA is solubilized in the colon and is therefore made bioavailable for passive nonionic (n.i.) diffusion from the colon. This expands the proportion of DCA in the bile acid pool, which is in dynamic equilibrium with the percentage of DCA in serum and bile. The consequences of increased proportions of DCA in bile are summarized in Fig. 4. (From Ref. 119.)

  

Page 308

Figure 4 Schematic flow diagram explaining how an increase in the percentage of deoxycholic acid (%DCA) in bile might lead to an increased formation (Formn) of cholesterol gallbladder stones (CH­GBS). Thus, enrichment of bile with DCA leads to a relative increase in biliary cholesterol secretion (secrn) (22). This may explain way we (88) and others (85,125) find that there is a significant linear relationship between the %DCA in bile and the molar percentage (moles %) cholesterol, and the cholesterol saturation index (SI) in gallbladder bile. It may also explain, at least in part, why we find that the mean %DCA in bile is approximately twice as high in patients with abnormally rapid (<5 days) nucleation or precipitation of cholesterol microcrystals, as in individuals with normal (>10 days) nucleation times (88). We (94) and others (83,93,126,127) also showed that the percentage of DCA in bile was linearly related to the percentage of arachidonic acid­rich phospholipids (AAPL) in bile. In turn, this may explain (98) why mucus glycoprotein (MGP) synthesis by, and secretion into, the gallbladder are increased in gallstone patients (128–130). An  increase in the proportion of AAPLs in GB bile could also contribute to the reduced meal­stimulated gallbladder emptying (13–15,131) that characterizes cholesterol  gallstone disease. (From Ref. 119.)

C—  Unifying Hypothesis: Overall Summary A schematic flow diagram summarizing the results of these, and related, studies is shown in Fig. 3. This suggests in detail how prolongation of colonic transit might  increase DCA formation, solubilization, and absorption, leading to increases in the DCA pool size and the percentage of DCA in serum and bile. In turn, the multiple  pathways whereby increases in the percentage of DCA might favor cholesterol gallstone formation is illustrated in Fig. 4. VIII—  Reversal of Transit­Induced Abnormalities in DCA Metabolism with Intestinal Prokinetics If these hypotheses are correct, in theory it should be possible to reverse the multiple steps depicted in Figs. 3 and 4 by accelerating transit through the intestine. The  results of several studies in the literature had already shown that the use of regimens that shorten intestinal transit time resulted in declines in the percentage of DCA  and in the CH saturation index of gallbladder bile (98–102).

  

Page 309

In the authors' unit, this problem was addressed in acromegalic patients treated long term with OT. From a long list of possible therapeutic agents, the intestinal  prokinetic drug cisapride was chosen for a prospective double­blind controlled trial (118). The acromegalic patients were all taking long­term OT to which either  cisapride or placebo was added, after which mouth­to­cecum and large bowel transit times were measured and the results related to the percent DCA in fasting  serum. These findings were then compared with those in a historic disease control group of acromegalic patients untreated with octreotide. The study confirmed that long­term OT prolonged both small and large bowel transit times and increased the percent DCA in fasting serum. However, the use of the  intestinal prokinetic cisapride, in a dose of 10 mg four times daily, completely reversed the prolongation in both small and large bowel transit and the increase in the  percent in DCA serum induced by OT treatment. The implication of these results is that treatment of individuals who are at high risk of forming gallstones should  prevent (a) the high percent DCA in bile, (b) supersaturated bile, and (c) cholesterol gallstone formation. This hypothesis has yet to be tested by prospective  controlled trials but, for the first time, we now have soundly based scientific strategies on which to base such studies. Acknowledgments The author wishes to thank the following colleagues and collaborators whose work forms the basis of this review: Michael Besser, Gary French, Hyder Hussaini, Paul  Jenkins, Tony Mallet, Gerry Murphy, Steve Pereira, Linzi Thomas, Martin Veysey, and John Wass. Thanks are also due to Ken Heaton, Phil Hylemon, and Gustav Paumgartner for their help in establishing laboratory methods, training junior colleagues, and stimulating  original ideas and discussion. Financial support of the Special Trustees of Guy's Hospital, the John Ellerman Foundation, and the Sandoz/Novartis Companies (UK and Switzerland), is gratefully  acknowledged. Last, but not least, the author wishes to thank Mrs. Ann Hollington for her invaluable help in preparing this manuscript. References 1. Cleave TL, Campbell GD, Painter NS. Diabetes, Coronary Thrombosis and the Saccharine Disease. Bristol, UK: John Wright, 1969. 2. Heaton KW. Effects of increased dietary fibre on intestinal transit. Clin Gastroenterol 1973; 2:67–83. 3. Low­Beer TS, Pomare EW. Can colonic bacterial metabolites pre­dispose to cholesterol gallstones? BMJ 1975; 1:438–440. 4. Marcus SN, Heaton KW. Deoxycholic acid and the pathogenesis of gall stones. Gut 1988; 29:522–533. 5. Misciagna G, Leoci C, Guerra V, et al. Epidemiology of cholelithiasis in southern Italy: Part II. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996; 8:585–593. 6. Low­Beer TS. How the colon begets gallstones. Lancet 1998; 351:612–613. 7. Isaksson B. On the dissolving power of lecithin and bile salts for cholesterol in human bladder bile. Acta Soc Med Upsalien 1954; 59:296–306. 8. Admirand WH, Small DM. The physico­chemical basis of cholesterol gallstone formation in man. J Clin Invest 1968; 47:1043–1052. 9. Holzbach RT, Marsh M, Olszewski M, Holan K. Cholesterol solubility in bile: evidence that supersaturated bile is frequent in healthy man. J Clin Invest 1973;  52:1467–1479. 10. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, et al. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology 1979; 77:611– 617.

  

Page 310

11. Sedeghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980; 302:1274–1277. 12. Burnstein MJ, Ilson RG, Petrunka CN, Taylor RD, Strasberg SM. Evidence for a potent nucleating factor in the gallbladder bile of patients with cholesterol  gallstones. Gastroenterology 1983; 85:801–807. 13. Fisher RS, Stelzer, F, Rock E, Melmud LS. Abnormal gallbladder emptying in patients with gallstones. Dig Dis Sci 1982; 27:1019–1024. 14. Forgacs IC, Maisey MN, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and ursodeoxycholic acid therapy on gallbladder motor function. Gastroenterology  1984; 87:299–307. 15. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985, 88; 787–791. 16. Patankar R, Ozmen MM, Bailey IS, Johnson CD. Gallbladder motility, gallstones, and the surgeon. Dig Dis Sci 1995; 40:2323–2335. 17. O'Donnell LJD, Fairclough PD. Gall stones and gall bladder motility. Gut 1993; 34:440–443. 18. Dowling RH, Gleeson D, Ruppin DC, Murphy GM and the British/Belgian Gallstone Study Group. Gallstone recurrence and post­dissolution management. In:  Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Enterohepatic Circulation of Bile Acids and Sterol Metabolism. Lancaster, UK: MTP Press, 1985, pp 361–369. 19. Carey MC. Formation of cholesterol gallstones: the new paradigms. In: Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Trends in Bile Acid Research.  Dordrecht/Boston/London: Kluwer, 1989, pp 259–281. 20. Dowling RH, Veysey MJ, Pereira SP, Hussaini SH, Thomas LA, Wass JAH, Murphy GM. Role of intestinal transit in the pathogenesis of gallbladder stones. Can  J Gastroenterol 1997; 11:57–64. 21. Thomas LA, Bathgate T, Veysey MJ, King A, French GL, Murphy GM, Dowling RH. Is cholelithiasis an intestinal disease? (abstr). Gut 1997; 41(suppl 3):A2. 22. Carulli N, Loria P, Bertolotti C, Ponz de Leon M, Menozzi D, Medici G, Piccagli I. Effects of acute changes in bile acid pool composition on biliary lipid  secretion. J Clin Invest 1985; 74:616–624. 23. Leiss O, von Bergmann K. Comparison of biliary lipid secretion in non­obese cholesterol gallstone patients with normal, young, male volunteers. Klin Wochenschr  1985; 63:1163–1169. 24. McKnight JA, McCance DR, Crothers JG, Atkinson AB. Changes in glucose tolerance and development of gall stones during high dose treatment with octreotide  for acromegaly. BMJ 1989; 299:604–605. 25. Wass JAH, Anderson JV, Besser GM, Dowling RH. Gall stones and treatment with octreotide for acromegaly (letter). BMJ 1989; 299:1162–1163. 26. Dowling RH, Hussaini SH, Murphy GM, Besser GM, Wass JAH. Gallstones during octreotide therapy—Metabolism: clinical and experimental. 1992; 41(suppl  2):22–33. 27. Krejs G, Orci L, Conlon JM, et al. Somatostatinoma syndrome. N Engl J Med 1979; 301:285–292. 28. Catnach SM, Anderson JV, Fairclough PD, et al. The effect of octreotide on gallstone prevalence and gallbladder motility in acromegaly. Gut 1993; 34:270–273. 29. McKnight JA, McCance DR, Sheridan B, et al. Four years' treatment of resistant acromegaly with octreotide. Eur J Endocrinol 1995; 132:429–432. 30. Attili A, Carulli N, Roda E, et al. Epidemiology of gallstone disease in Italy: prevalence data of the Multicenter Italian Study on Cholelithiasis (MICOL). Am J  Epidemiol 1995; 141:158–165. 31. Hussaini SH, Pereira SP, Murphy GM, Kennedy C, Wass JAH, Besser GM, Dowling RH. Composition of gallbladder stones associated with octreotide:  response to oral ursodeoxycholic acid. Gut 1995; 36:126–132.

  

Page 311

32. Rajagopal SU, Keightley A, Bills P, Walters JRF, Murphy GM, Dowling RH. Predictive value of pre­treatment CT scanning vs conventional radiology in  determining composition, dissolvability and fragmentability of gallbladder stones (GBS) (abstr). J Hepatol 1989; 9:S211. 33. Brakel K, Lameris JS, Nijs HGT, et al. Predicting gallstone composition with CT: in vivo and in vitro analysis. Radiology 1990; 174:337–341. 34. Petroni ML, Jazrawi RP, Grundy A, et al. Prospective, multicenter study on value of computerized tomography (CT) in gallstone disease in predicting response to  bile acid therapy. Dig Dis Sci 1995; 40:1956–1962. 35. Pereira SP, Veysey MJ, Kennedy C, Hussaini SH, Dowling RH. Gallstone dissolution with oral bile acid therapy: importance of pre­treatment CT scanning and  reasons for non­response. Dig Dis Sci 1997; 42:1775–1782. 36. Plewe G, Beyer J, Krause U, Neufeld M, Del Pozo E. Long­acting and selective suppression of growth hormone secretion by somatostatin analogue SMS 201­ 995 in acromegaly. Lancet 1984; 2:782–784. 37. Lamberts SWJ, Uiterlinden P, Verschoor L, Dongegen van KJ, Del Pozo E. Long acting treatment of acromegaly with the somatostatin analogue SMS 201­995.  N Engl J Med 1985; 313:1576–1580. 38. Melmed S. Acromegaly. N Engl J Med 1990; 322:966–977. 39. Reichlin S. Somatostatin. N Eng J Med 1983; 309:1495–1501, 1556–1563. 40. Fisher RS, Rock E. Levin G, et al. Effects of somatostatin on gallbladder emptying. Gastroentology 1987; 92:885–890. 41. Lembcke B, Creutzfeldt W, Schleser S, et al. Effect of somatostatin analogue Sandostatin (SMS 201­995) on gastrointestinal, pancreatic and biliary function, and  hormone release in normal men. Digestion 1987; 36:108–124. 42. van Liessum PA, Hopman WP, Pieters GF. Postprandial gallbladder motility during long term treatment with the long­acting somatostatin analog SMS 201­995 in  acromegaly. J Clin Endocrinol Metab 1989; 69:557–562. 43. Mitsukawa T, Takemura J, Nishizono F, et al. Effects of atropine, proglumide and somatostatin analogue (SMS 201­995) on bombesin­induced gallbladder  contraction and CCK secretion in humans. Am J Gastroenterol 1989; 84:1371–1374. 44. Stolk MFJ, van Erpecum KJ, Koppeschaar HPF, et al. Postprandial gallbladder motility and hormone release during intermittent and continuous subcutaneous  octreotide therapy in acromegaly. Gut 1993; 34:808–813. 45. Hussaini SH, Pereira SP, Veysey MJ, Kennedy C, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. The roles of gallbladder emptying and intestinal transit in  the pathogenesis of octreotide induced gallbladder stones. Gut 1996; 38:775–783. 46. Marks J, Broomfield P, Bonorris GG, Schoenfield LJ. Factors affecting the measurement of cholesterol nucleation in human gallbladder and duodenal bile.  Gasteroenterology 1991; 101:214–219. 47. Swobodnik W, Hagert N, Janowitz P, Wenk H. Diagnostic fine­needle puncture of the gallbladder with US guidance. Radiology 1991; 178:755–758. 48. Herbetko J, Fache JS. Diagnostic fine­needle puncture of the gallbladder (letter). Radiology 1991; 180:586. 49. Hussaini SH, Kennedy C, Pereira SP, Wass JAH, Dowling RH. Ultrasound­guided percutaneous fine needle puncture of the gallbladder for studies of bile  composition. Br J Radiol 1995; 68:271–276. 50. Hussaini SH, Murphy GM, Kennedy C, Besser GM, Wass JAH, Dowling RH. The role of bile composition and physical chemistry in the pathogenesis of  octreotide­associated gallbladder stones. Gastroenterology 1994; 107:1503–1513. 51. Collins JJ, Phillips MC. The stability and structure of cholesterol­rich codispersions of cholesterol and phosphatidylcholine. J Lipid Res 1982; 23:291–298. 52. Fuessl HS, Carolan G, Williams G, Bloom SR. Effect of a long­acting somatostatin

  

Page 312

analogue (SMS 201­995) on postprandial gastric emptying of 99mTc­tin colloid and mouth­to­caecum transit time in man. Digestion 1987; 36:101–107. 53. Moller N, Petrany G, Cassidy D, et al. Effects of the somatostatin analogue SMS 201­955 (sandostatin) on mouth­to­caecum transit time and absorption of fat  and carbohydrates in normal man. Clin Sci 1988; 75:345–350. 54. O'Donnell LJD, Watson AJM, Cameron D, Farthing MJG. Effect of octreotide on mouth­to­caecum transit time in healthy subjects and in the irritable bowel  syndrome. Aliment Pharmacol Ther 1990; 4:177–182. 55. Bond JH, Levitt MD. Investigation of small bowl transit time in man utilizing pulmonary hydrogen measurements. J Lab Clin Med 1974; 85:546–556. 56. Hill MJ, Drasar BS. The normal colonic bacterial flora. Gut 1974; 6:318–323. 57. Midtvedt T. Microbial bile acid transformation. Am J Clin Nutr 1974; 27:1341–1347. 58. Metcalf AM, Phillips SF, Zinsmeister AR, et al, Simplified assessment of segmental colonic transit. Gastroenterology 1987; 92:40–47. 59. Veysey MJ, Arraton SRD, Mallet A, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. Long­term octreotide treatment increases large bowel transit time  (LBTT), the proportion of deoxycholic acid (%DCA) in serum and the risk of gallstone formation (abstr). Gut 1996; 39(suppl 3):A134. 60. Veysey MJ, Thomas LA, Mallet AI, Jenkins PJ, Besser GM, Wass JAH, Murphy GM, Dowling RH. Prolonged large bowel transit increases serum deoxycholic  acid: a risk factor for octeotide induced gallstones. Gut 1999; 44:675–681. 61. Veysey MJ, Gathercole DJ, Mallet A, Jenkins P, Besser GM, Wass JAH, Murphy GM, Dowling RH. Large bowel transit time influences deoxycholic acid input  rate and pool size—risk factors for octeotide­induced gallstones (abstr). Gastroenterology 1997; 112:A525. 62. Stellaard F, Paumgartner G, van Berge Henegouwen GP, et al. Determination of deoxycholic acid pool size and input rate using [24­ 13C] deoxycholic acid and  serum sampling. J Lipid Res 1986; 27:1222–1225. 63. Setchell KDR, Matsui A. Serum bile acid analysis. Clin Chim Acta 1983; 127:1–17. 64. Veysey MJ, Mallett A, Jenkins P, Besser GM, Murphy GM, Dowling RH. Deoxycholic (DCA) and cholic acid (CA) kinetics in acromegalic patients treated with  octreotide (OT) (abstr.). Gut 1998; 42(suppl 1):All. 65. Rudman D, Kendall FE. Bile acid content of human serum: II. The binding of cholanic acids by human plasma proteins. J Clin Invest 1957; 36:538–542. 66. Burke CW, Lewis B, Panveliwalla D, Tabaqchali S. The binding of cholic acid and its taurine conjugate to serum proteins. Clin Chim Acta 1971; 32:207–214. 67. Forker EL, Luxon B. Albumin helps mediate removal of taurocholate by rat liver. J Clin Invest 1981; 67:1517–1522. 68. LaRusso NF, Hoffman NE, Korman MG, Hofmann AF, Cowen AE. Determinants of fasting and postprandial serum bile acid levels in healthy man. Am J Dig Dis  1978; 23: 385–391. 69. Nagengast FM, van Munster IP, Salemans JMJI. Deoxycholic acid metabolism in patients with adenomas. Gastroenterology 1993; 105:955–956. 70. Bazzoli F, Roda A, Fromm H, Sarva RP, Roda E, Barbara L. Relationship between serum and biliary bile acids as an indicator of chenodeoxycholic and  ursodeoxycholic acid­induced hepatotoxicity in the rhesus monkey. Dig Dis Sci 1982; 27:417–424. 71. Bazzoli F, Fromm H, Roda A, et al. Value of serum determinations for prediction of increased ursodeoxycholic and chenodeoxycholic levels in bile. Dig Dis Sci  1985; 30:650–654. 72. van de Meeberg PC, Wolfhagen FHJ, van Berge Henegouwen GP, et al. Single or multiple dose ursodeoxycholic acid for cholestatic liver disease: biliary  enrichment and biochemical response. J Hepatol 1996; 25:887–894. 73. Lindor KD, Lacerda MA, Jorgensen RA, et al. Relationship between biliary and serum

  

Page 313

bile acids and response to ursodeoxycholic acid in patients with primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 1998; 93:1498–1504. 74. Shoda J, He B­F, Tanaka N, et al. Increase of deoxycholate in supersaturated bile of patients with cholesterol gallstone disease and its correlation with de novo  syntheses of cholesterol and bile acids in liver, gallbladder emptying, and small intestinal transit. Hepatology 1995; 21:1291–1302. 75. Galatola G, Jazrawi RP, Corrao G, Fracchia M. Biliary lipid determinants of bile lithogenicity and cholesterol gallstone formation (abstr). Gut 1996; 39:A104. 76. Azzaroli F, Mazzella G, De Vegori E, Festi D, Colcchia A, Villanova N, Simoni P, Mazzo C, et al. Sluggish gallbladder and small bowel motility are associated  with cholesterol gallstones. Gastroenterology 1997; 112:A499. 77. Jazrawi RP, Northfield TC. Effects of a pharmacological dose of cholecystokinin on bile acid kinetics and biliary cholesterol saturation in man. Gut 1986; 27:355– 362. 78. Hillebrant C­G. On the regulation of hepatic cholesterol and bile acid metabolism in gallstone patients. Thesis. Karolinska Institute at Huddinge University  Hospital, Stockholm, Sweden, 1998. 79. Sahlin S, Stahlberg D, Einarsson K. Cholesterol metabolism in liver and gallbladder mucosa of patients with cholesterolosis. Hepatology 1995; 21:1269–1275. 80. Berr F, Pratschke E, Fischer S, Paumgartner G. Disorders of bile acid metabolism in cholesterol gallstone disease. J Clin Invest 1992; 90:859–868. 81. Berr F, Kullak­Ublick GA, Paumgartner G, et al. 7­alpha dehydroxylating bacteria enhance deoxycholic acid input and cholesterol saturation of bile in patients  with gallstones. Gastroenterology 1996; 111:1611–1620. 82. Noshiro H, Chijiiwa K, Makino I, Nakano K, Hirota I. Deoxycholic acid in gall bladder bile does not account for the shortened nucleation time in patients with  cholesterol gall stones. Gut 1995; 36:121–125. 83. Cantafora A, Di Biase A, Alvaro D, Angelico M, Marin M, Attili AF. High performance liquid chromatographic analysis of molecular species of  phosphatidylcholine—development of quantitative assay and its application to human bile. Clin Chim Acta 1983; 134:281–295. 84. van der Linden W, Bergmann F. An analysis of data on human hepatic bile. Relationship between main bile components, serum cholesterol and serum  triglycerides. Scand J Clin Lab Invest 1977; 37:741–747. 85. Hofmann AF, Grundy SM, Lachin JM, et al. Pre­treatment lipid composition in white patients with gallstones in the National Cooperative Gallstone Study.  Gastroenterology 1982; 83:738–752. 86. Alvaro D, Angelico F, Atilli AF, et al. Plasma lipid lipoproteins and biliary lipid composition in female gallstone patients. Biochim Biophys Acta 1986; 45:761– 768. 87. Rutgeerts P, Ghoos Y, Vantrappen J, Fevery J. Biliary lipid composition in patients with non­operated Crohn's disease. Dig Dis Sci 1986; 31:27–32. 88. Hussaini SH, Pereira SP, Murphy GM, Dowling RH. Deoxycholic acid influences cholesterol solubilisation and microcrystal nucleation time in gallbladder bile.  Hepatology 1995; 22:1735–1742. 89. Fracchia M, Jazrawi RP, Galatola G. Determination of gallbladder bile lithogenicity in patients with primary biliary cirrhosis. Ital J Gastroenterol 1996; 28:255– 260. 90. Ponz de Leon M, Carulli N, Iori R, Loria P, Romani M. Regulation of cholesterol absorption by bile acids: role of deoxycholic acid and cholic acid pool  expansion on dietary cholesterol absorption. Ital J Gastroenterol 1993; 15:86–93. 91. Low­Beer TS, Nutter S. Colonic bacterial activity, biliary cholesterol saturation, and pathogenesis of gallstones. Lancet 1978; 11:1063–1065. 92. Carulli N, Ponz de Leon M, Loria P, et al. Effect of selective expansion of the cholic acid pool on bile lipid composition: possible mechanism of bile acid induced  biliary cholestrol desaturation. Gastroenterology 1981; 81:539–546.

  

Page 314

93. van Berge Henegouwen GP, van der Weft SDJ, Ruben AT. Fatty acid composition of phospholipids in bile in man: promoting effect of deoxycholate on  arachidonate. Clin Chim Acta 1987; 165:27–37. 94. Pereira SP, Hussaini SH, Cassell TB, Murphy, GM, Wass JAH, Dowling RH. Biliary phospholipids and mucin glycoprotein are altered in octreofide induced  gallstones (abstr). Gut 1995; 36(S1):A47. 95. Ahlberg J, Curstedt T, Einarsson K, et al. Molecular species of biliary phosphatidylcholine in gallstone patients. J Lipid Res 1981; 22:404–409. 96. Cantafora A, Angelico M, Di Blase A, et al. Structure of biliary phosphatidyl choline in cholesterol gallstone patients. Lipids 1981; 16:589–592. 97. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1993; 95:508–523. 98. Marcus SN, Heaton KW. Intestinal transit, deoxycholic acid and the cholesterol saturation of bile—three interrelated factors. Gut 1986; 27:550–558. 99. Thornton JR, Heaton KW. Do colonic bacteria contribute to cholesterol gallstone formation? Effects of lactulose on bile. BMJ 1981; 282:1018–1020. 100. Pomare EW, Heaton KW, Low­Beer TS, Espiner HJ. The effect of wheat bran upon bile salt metabolism and upon the lipid composition of bile in gallstone  patients. Am J Dig Dis 1976; 21:521–526. 101. Marcus SN, Heaton KW. Effects of a new, concentrated, wheat fibre preparation on intestinal transit, deoxycholic acid metabolism and the composition of bile.  Gut 1986; 27:893–900. 102. Lewis SJ, Heaton KW. Increasing butyrate concentration in the distal colon by accelerating intestinal transit. Gut 1997; 41:245–251. 103. Veysey MJ, Jenkins P, Besser GM, Wass JAH, Dowling RH. The effect of cisapride on large bowel transit time: a randomised double­blind placebo­controlled  study in four groups of individuals. Gut 1997; 41(suppl 3):A123. 104. Ahlberg J, Angelin B, Einarsson K, Hellstrom L, Leijd B. Influence of deoxycholic acid on biliary lipids in man. Clin Sci Mol Med 1977; 53:249–256. 105. LaRusso NF, Szcepanik PA, Hofmann AF, Coffin SB. The effect of deoxycholic acid ingestion on bile acid metabolism and biliary lipid secretion in normal  subjects. Gastroenterology 1977; 72:132–140. 106. Carulli N, Ponz de Leon M, Zironi F, Iori R, Loria P. Bile acid feeding and hepatic sterol metabolism: effect of deoxycholic acid. Gastroenterology 1980;  79:637–641. 107. DiDonato P, Carubbi F, Ponz de Leon M, Carulli N. Effect of small doses of deoxycholic acid on bile cholesterol saturation in patients with liver cirrhosis. Gut  1986; 27:23–26. 108. Heaton KW, Emmett PM, Symes CL, Braddon FEM. An explanation for gallstones in normal­weight women: slow intestinal transit. Lancet 1993; 341:8–10. 109. Spathis A, Heaton KW, Emmett PM, Norboo T, Hunt L. Gallstones in a community free of obesity but prone to slow intestinal transit. Eur J Gastroenterol  Hepatol 1997; 9:201–206. 110. El Oufir L, Flourie B, Bruley des Varannes S, et al. Relations between transit time, fermentation products, and hydrogen consuming flora in healthy humans. Gut  1996; 38:870–877. 111. Bown RL, Gibson JA, Sladen GE, Hicks B, Dawson AM. Effects of lactulose and other laxatives on ileal and colonic pH as measured by a radiotelemetry  device. Gut 1974; 15:999–1004. 112. Evans DF, Pye G, Bramley R, et al. Measurement of gastrointestinal pH profiles in normal ambulant human subjects. Gut 1988; 29:1035–1041. 113. Fallingborg J, Christensen LA, Ingeman­Nielson M, et al. pH profile and regional transit times of the normal gut measured by a radiotelemetry device. Aliment  Pharmacol Ther 1989; 3:605–613. 114. Goto J, Watanabe K, Miura H, et al. Trace analysis of bile acids by gas chromatography­mass spectrometry with negative ion and chemical ionization detection.  J Chromatogr 1987; 388:379–387.

  

Page 315

115. White BA, Lipsky RH, Fricke RJ, Hylemon PB. Bile acid induction specificity of 7­alpha­dehydroxylase activity in an intestinal Eubacterium sp. Steriods 1980;  35:103–109. 116. Newmark HL, Lupton JR. Determinants and consequences of colonic luminal pH: implications for colon cancer. Nutr Cancer 1990; 14:161–173. 117. Hond ED, Heile M, Evenepoel P, Peeters M, Ghoos Y, Rutgeerts P. In vivo butyrate metabolism and colonic permeability in extensive ulcerative colitis.  Gastroenterology 1998; 115:584–590. 118. Veysey MJ, Arraton SRD, Mallet A, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. Does cisapride overcome the effects of octreotide on intestinal transit,  thereby reducing the proportion of deoxycholic acid in bile and serum? In: Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Bile Acids in Hepatobiliary Disease. Dordrecht:  Kluwer, 1997, pp 82–91. 119. Dowling RH. The gallstone story. Ulster Med J 1998; 67:20–24. 120. Veysey MJ, Arraton SRD, Gilani SS, et al. The relationship between large bowel transit time (LBTT) and the proportion of deoxycholic acid (%DCA) in serum  (abstr). Gut 1996; 38(suppl 1):A53. 121. Veysey MJ, Mallet A, Murphy GM, Dowling RH. Deoxycholic acid pool size and input rate, measured by stable isotope dilution, are increased in patients with  slow transit constipation (abstr). Clin Sci 1997; 92:3P. 122. Thomas LA, Veysey MJ, Murphy GM, Dowling RH, King A, French GL. Bile acid metabolising intestinal bacterial enzyme activity: a novel factor in cholesterol  gallstone pathogenesis. Gut 1997: 40(suppl 1):A67. 123. Thomas LA, Bathgate T, Veysey MJ, King A, French GL, Murphy GM, Dowling RH. Do changes in colonic luminal pH explain the increased proportions of  serum and biliary deoxycholic acid seen in patients with cholesterol gallbladder stones (GBS)? (abstr). Gut 1997; 41(suppl 3):A32. 124. Veysey MJ, Arraton SRD, Mallet A, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. Cisapride reverses the effects of octreotide (OT) on intestinal transit  and the proportion of deoxycholic acid (%DCA) in bile and serum (abstr). Gut 1996; 39(suppl 3):A103. 125. Berr F, Schrieber E, Frick U. Interrelationships of bile acid and phospholipid fatty acid species with cholesterol saturation of duodenal bile in health and gallstone  disease. Hepatology 1992; 16:71–81. 126. Angelico M, Corradini GS, Masella R, Alvaro D, Cantafora A, Capocaccia L. Molecular composition of biliary phosphatidylcholines, as related to cholesterol  saturation, transport and nucleation in human gallbladder bile. J Hepatol 1992; 15:59–66. 127. Hatsushika S, Tazuma S, Kajiyama G. Nucleation time and fatty acid composition of lecithin in human gallbladder bile. Scand J Gastroenterol 1993; 28:131– 136. 128. Lee SP. Lessons from experimental cholelithiasis: gallbladder and mucosa, nonsteroidal antiinflammatory drugs, and gallstones. Gastroenterology 1991;  101:857–860. 129. Marks JW, Bonorris GG, Albers G, Schoenfield LJ. The sequence of biliary events preceding the formation of gallstones in humans. Gastroenterology 1992;  103:566–570. 130. Shiffman ML, Sugarman HJ, Kellum JM, Moore EW. Changes in gallbladder bile composition following gallstone formation and weight reduction.  Gastroenterology, 1992; 103:214–221. 131. Thompson JC, Fried GM, Ogden DW, et al. Correlation between release of cholecystokinin and contraction of the gallbladder in patients with gallstones. Ann  Surg 1982; 145:670–675.

  

Page 317

15—  Calcium Salt Precipitation in Bile and Biomineralization of Gallstones Huguette Lafont INSERM U­476, Marseilles, France J. Donald Ostrow University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands I—  Introduction: The Structure of Gallstones Gallstones are organized structures in which crystals of cholesterol and calcium salts are arrayed on a matrix composed of mucin polymer and small regulatory proteins  (1–3). Virtually all the mineral components of human gallstones (4–10) and their localization within the various types of gallstones (11–16) have been characterized.  Gallstones are usually classified into four types (Tables 1 and 2) according to the proportion of cholesterol and calcium salts (especially bilirubinates) and the gross  arrangement of these components (4,6,17–22). In addition to the cholesterol, mixed, brown pigment, and black pigment stone types, a rarer fifth type has been  described, called a salt and pepper stone (Table 1) (17). There is considerable overlap among these groups, however, and gallstones actually exhibit a wide spectrum  of compositions, ranging from over 98% to less than 5% cholesterol; the remainder is composed mainly of calcium salts (especially bilirubinates) and the proteins and  glycoproteins of the matrix (Table 2). All gallstones, including the core of ''pure" cholesterol gallstones, contain calcium salts (2,8,12,15,16,23–29) of one or more of the five "calcium­sensitive" anions  (which form poorly soluble calcium salts: bilirubinates, phosphates, carbonates, fatty acylates, and bile salts (9,30,31). Thus, gallstone formation is not simply a  process of cholesterol precipitation. It has been proposed that calcium salt precipitation may initiate the formation of all types of gallstones (9). Each compound found in gallstones is derived by precipitation from bile. This may occur only if the bile is thermodynamically supersaturated with that component.  Supersaturation in itself is not sufficient to cause precipitation; rather, precipitation of cholesterol from biliary vesicles and of calcium salts from the bulk fluid phase of  bile, seems to be governed by regulatory proteins (kinetic factors) in bile (9,32,33). In gallstones, the cholesterol crystals and calcium salt precipitates are not simply clumped together, but are arrayed on a network of organic matrix (2,33–35), which  consists mainly of polymerized mucin gel (1,34,36–38), to which are bound smaller proteins, including amphipathic anionic polypeptide/calcium­binding protein  (APF/CBP) (3,39–42) and probably aminopeptidase­N (APN) (3,43) and others (43). Examining the cut surface of some stones, the cholesterol and calcium salts  sometimes seem to be distributed diffusely and randomly, but there is evidence for sequential waves of deposition of crystals of different composition as

  

Page 318 Table 1 Characteristics of Major Types of Gallstonesa Stone type

Cholesterol

Mixed

Brown pigment

Black pigment

Main components

Cholesterol

Cholesterol pigments

Ca bilirubinates, Ca  fatty acylates,  cholesterol

Gross appearance

Round, shiny yellow­ white, pigmented center

Round or faceted,  brown pigment in  rings or specks

Ovoid or irregular,  Faceted or spiky,  brown to orange, soft,  black, shiny or dull laminated

Number in GB

Usually single

Usually multiple

Single or multiple

Many

Usual site

Gallbladder

Gallbladder ± ducts

Bile ducts

Gallbladder ± ducts

Bile bacteria

Culture (­), DNA (+)

Culture (­), DNA (+)

Infected (E. coli)

Culture (­), DNA (+)

Geography

Mainly in West

Mainly in West

Mainly in Orient

West and Orient

Disease/drug  associations

Multiparity, obesity,  diabetes, octreotide

Multiparity, obesity,  diabetes, octreotide

Postcholecystectomy,  Hemolysis, cirrhosis strictures, sutures,  low­protein diet

a

Pigment polymer, Ca  phosphates and/or  carbonates

 A fifth type of gallstone, called a salt­and­pepper stone, has been described (17). It is rare in western countries and is  composed of white crystals of calcium carbonate or yellowish­white crystals of cholesterol compacted with black to  brown spherules of pigment, which is predominantly polymerized.

  

Page 319 Table 2 Composition of Major Types of Gallstonesa,b Stone type

Cholesterol

Cholesterolc

60–99% d 

Total pigment

Mixed

Brown pigment

Black pigment

0–47%

0g

46–86%

<2%

3–20%

12–61%

12–59%

N.D.

50–77%

>80%

  Pigment polymere

N.D.

Ca phosphate

0

0–8%

0

0–56%

Ca carbonate

0

0–9%

0

0–37%

0

0

Ca fatty acylates Ca bile salts

<3%

<3%

5–20%

0

<7%

<7%

  Residuef

1–35%

0–49%

a

27–76%

0–76%

 

Percentage of dry weight, based on infrared spectroscopic analysis Stone classification and data from Refs. 6 and 17.  c In "pure" cholesterol stones, pigment is visible only in the center, and cholesterol  constitutes >98% of mineral components. In mixed stones, laminae of cholesterol and  pigment alternate, but cholesterol is >50% of total mineral. d Includes calcium bilirubinate plus black pigment polymer.  e Percent of pigment that is polymer, based on loss of vinyl grups of bilirubin assessed  by infrared spectroscopy (17,158). N.D., not determined, due to very low pigment  content. f 100% (minus sum of measured components).  g 0, below the limit of detection. b

gallstones grow (13,16,44). Often (e.g., the mixed gallstone in Fig. 1), the components are clearly arranged in alternating rings of cholesterol and pigment deposits (3).  As in Fig. 1, virtually all cholesterol and mixed gallstones also show a pigmented core (8,24,25,45,46) with at least one central cavity, and any type of stone may be  encased in an outer shell of calcium salts with or without pigment. The organized structure of gallstones, with crystals arrayed on an organic matrix, is typical of formation of mineralized structures (e.g., bone, teeth, shells, concretions)  throughout the phylogenetic tree and in geological formations (47–50). Thus, gallstone formation may be viewed as a biomineralization process, in which  precipitation from a supersaturated solution is regulated by soluble proteins and organized on a matrix composed of these proteins bound to the mucin gel  (2,3,33,40,41). In vitro studies suggest that both the mucin (51–53) and the small proteins present in the matrices of gallstones (54–56), when unbound in bile, play  important roles in controlling the onset and rates of precipitation of calcium salts (41,57), bile pigments (2,58), and cholesterol (54–56,59–61). This section summarizes the evidence for these concepts and reviews the roles of calcium, mucin, APF, CBP, other proteins and bile salts in the regulation of calcium  and cholesterol precipitation and in the formation of the matrix and organization of the precipitates in gallstones. It is first necessary to describe the thermodynamic  states and regulation of the concentrations of calcium salts and "calcium­sensitive" anions in bile. The state of cholesterol in bile, and the regulation of cholesterol  precipitation by biliary glycoproteins, are detailed elsewhere in this volume. II—  Calcium and Calcium Salts in Bile A—  Free and Bound Calcium Total calcium [CaT] in bile consists of two major fractions—the unbound (free) calcium ions [Ca2+], and the bound calcium (9,30,62) (Fig. 2). The bound calcium is, in  turn, divided into

  

Page 320

Figure 1 Cross­section of a mixed gallstone. Note the  pigmented core with a central cavity (arrow) and alternating rings of pigment (dark) and cholesterol (light) zones. Bar = 1 mm. (From Ref. 3.)

two fractions: (a) complexes with electrolyte anions, bile pigments (including unconjugated and conjugated bilirubins), and anionic bile salt amidates (monomers and  oligomers) of molecular weight <3 kDa; and (b) larger bile salt aggregates (simple and mixed micelles) and anionic proteins (mainly albumin, soluble mucins, and  CBP). The group of smaller complexes, together with the unbound Ca2+ cations, constitute ultrafilterable calcium, which can traverse the "pores" in the  hepatobilary epithelium. In the complexes, the calcium is apparently bound bifunctionally, either chelated between two anionic groups, or between an anionic group  and an —OH group (9,30,63). B—  Determinants of Ionized and Total Calcium Concentrations in Bile In both hepatic and gallbladder bile, the concentrations of both unbound calcium, [Ca2+], and total calcium, [CaT] (and, therefore, also bound calcium) increase linearly  with total bile salt concentrations, [BST], but the slope of the regression for [CaT] versus [BST] is much steeper than that for [Ca2+] versus [BST] (Fig. 3) (64–66). In  normal human bile, [Ca2+] may range from as low as 0.8 mM, when [BST] is 10 mM, to 3.0 mM in concentrated gallbladder bile with [BST] of 300 mM or more;  corresponding values for [CaT] are 1.5 and 18 mM respectively

  

Page 321

Figure 2 Fractions of calcium in bile. Those that may contribute to ultrafilterable calcium are shown in italics. The relative contributions of each fraction are only crudely represented since they vary markedly according to bile composition, and differ greatly between hepatic versus gallbladder bile and normal versus pathological bile. (Based on Ref. 9.)

(66–68). Patients with gallstones of any type, compared with subjects without gallstones, often have gallbladder bile containing significantly higher [Ca2+] and [CAT] in  relation to [BST] (66,69), and black pigment stones are often associated with higher [BST] (up to 300 mM) (66). The fraction of [Ca2+]/[CaT], however, is similar for  subjects with and without stones and is about 0.4 at the lowest [BST] and decreases curvilinearly to a plateau of about 0.2 at [BST] above 100 mM (66,70). The findings in normal subjects are the result of two processes: (a) Ca2+ ions freely and rapidly cross the tight junctions between the hepatocytes bounding the bile  canalicular space, as well as the tight junctions between the biliary epithelium lining the biliary tree and gallbladder, by both passive diffusion and convection with fluid  flow (65,71,72). Except at very

  

Page 322

Figure 3 Plot of concentrations of ionized and total calcium versus bile salts in canine bile. Note linear relationships, with higher values and steeper slope for total calcium. (From Ref. 64.)

high bile flows, bile [Ca2+] equilibrates with, and is determined by plasma [Ca2+] (73). (b) The equilibrium between [Ca2+] in plasma and bile is determined by the  Gibbs­Donnan relationship (Fig. 4) (9,74). This law dictates that the presence of large, impermeant anions on one side of a semipermeable membrane will result in an  increase in the concentration of unbound cations on that side of the membrane (9,75). The summed concentrations of the impermeant large bile salt micelles and  anionic proteins (especially mucin and albumin) in bile usually exceed the concentrations of plasma albumin, the major impermeant anion in plasma. Thus, at bile salt  concentrations in bile above 18 mM, the Gibbs­Donnan relationship dictates that the [Ca2+] in bile must be above the normal plasma [Ca2+] (mean 1.1 mM) (i.e., ratio  of bile/plasma [Ca2+] > 1.0) (9). Two corollaries of these concepts are (9) (a) infusion of cholephiles that bind Ca2+ (i.e., bile salts) will not decrease the [Ca2+] in bile but increase both the ionized and  bound calcium concentrations in bile and (b) the bile/plasma ratio of calcium concentrations must increase as the biliary concentrations of bile salts and proteins  increase (74,76). In the gallbladder, where the bile is concentrated by absorption of NaCl and water (77), concentrations of [BST] and proteins increase by four­ to  ninefold (78). This, along with secretion of mucin by the gallbladder epithelium, engenders greater Gibbs­Donnan forces and increased binding of calcium (9). As a  consequence, in concentrated gallbladder bile, the Gibbs­Donnan ratio for [Ca2+] may be as high as 3.0, and the fraction of bound calcium increases (74). This  increase in [Ca2+] and, consequently in [CaT], in the gallbladder is, however, mitigated somewhat by passive absorption of Ca2+ through diffusion down a  concentration gradient and convection with the absorbed water (65,71,72), as well as by possible nonequilibrium conditions (76). C—  Measurement of Calcium in Bile The activity of free Ca2+ ions can be determined with either calcium­selective electrodes (30,62,76) or with indicator dyes whose color or fluorescence changes as  they bind calcium

  

Page 323

Figure 4 Schematic for Gibbs­Donnan equilibrium.

(79). Both methods are subject to errors due to bile salts in bile. Calcium­selective electrodes are poisoned by bile salts, leading to severe underestimation of [Ca2+];  this can be prevented by covering the active end of the electrode with a plastic membrane that has pores small enough to prevent access of bile salts to the sensor  (9,80,81). The best way to show that an electrode is not poisoned by bile salts is to demonstrate that simultaneous measurements of bile and plasma [Ca2+] fulfill the  Gibbs­Donnan relationship (30,80). The absorbance and fluorescence of most calcium­indicator dyes may be altered by their interaction with bile salts (79), and bile  pigments may interfere spectrally (82). Since the great variation in concentration and composition of bile salts among bile samples renders it difficult to correct for these  effects with appropriate standards, use of calcium­indicator dyes in native bile is problematic. It should be realized that both methods measure the activity of unbound, ionized calcium in bile (millimoles per kilogram), not the concentration of unbound calcium  ion, [Ca2+] (millimoles per liter) (30,62). Most commercial electrodes are designed to convert the measured calcium ion activity to report [Ca2+] = Ca2+  activity/activity coefficient, using the mean activity coefficient for normal plasma of 0.304 at pH 7.4 and an ionic strength of 0.16 (62,81). The mean activity coefficient  for bile is also 0.3 (30,83) and, as in serum (62), may vary with changes in pH and ionic strength. Some electrodes convert the [Ca2+] value to pH 7.4, adjusting for  the decreasing activity of calcium ions, due to increasing concentrations of calcium­complexing anions (especially carbonate) as pH increases (9,67,68,76). The reader  is cautioned that many published papers on ionized calcium in bile do not make clear whether calcium ion activity or [Ca2+] is being reported or whether the reported  values are at the actual pH of the bile or are adjusted to pH 7.4.

  

Page 324 2+

Other pitfalls in the use of Ca ­electrodes are (a) variable water contents of the "anhydrous" CaCl2, or CaCl2∙2H2O, used to prepare the standards; (b) the use of  standards of differing pH, ionic strength or buffer composition than the samples under study; and (c) poor selectivity for sensing Ca2+ as compared with the other  major cations in bile, Na+, K+, and Mg2+ (81). Comparison of four commercial electrodes available in 1983 revealed differences in reproducibility and in values  reported with standards and plasma samples (84); similar rigorous comparisons have not been reported for bile, or for electrodes available today. Total calcium concentrations [CaT], may be measured with either the "Calcette," based on a dye­binding method (30), or by atomic absorption spectroscopy (85).  The indicator dyes used are powerful chelators, which preferentially strip bound calcium from other complexes in bile. Bile salts and pigments (vide supra) seem to  interfere less with these indicator dyes than those used to assay [Ca2+], since there is good agreement with the [CaT] obtained by atomic absorption spectroscopy  (30). III—  Thermodynamics of Calcium Salts in Bile A—  The Solubility Product (K¢ sp) of Poorly Soluble Calcium Salts Ca2+ may form insoluble salts with the five "calcium­sensitive" anions of bile, bilirubinates, carbonates, phosphates, fatty acylates and bile salts (9,30,31). For a calcium  salt to precipitate, its net charge must be zero. The equilibrium solubility of each salt is determined by its solubility product ( ) (9):

Note that only the unbound ionized fractions of the calcium and the anion contribute to the ion product (the right­hand side of each equation) and strictly should be  based on the products of the ion activities, but the above approximations are satisfactory. If the ion product exceeds the empirically determined  supersaturated for that salt. Calcium cannot form a salt with the fully protonated, neutral form of a weak acid (HAo).

, the system is 

B—  The Formation Constant (K'f) of Soluble Calcium Complexes When the ion product of a calcium salt is below the  , the salt exists only as free ions and as soluble complexes; the latter, which are usually positively charged,  contribute to the bound calcium in bile (9,30,62,75). Ca2+ ions also form soluble complexes with anions in bile that do not form poorly soluble calcium salts; the most  important are   and three polyanionic proteins in bile: mucin, albumin, and calcium­binding protein (CBP). The affinity of the calcium for the anion(s) in the  complex is defined, at equilibrium, by the formation (association) constant, K f:

The terms in the denominator refer only to the unbound species. If the stoichiometry of the complex (i.e., m and n) and the pKa of HA are known, K f can be  determined from measured values of [Ca2+] and the total concentrations of [AT] and [CaT]. Thus:

 is derived from [AT] and pKa, using the Henderson­Hasselbalch equation, and values of [Cam An] and [A­] from Eqs. (4 and 5) are substituted in Eq. (3).

  

Page 325

C—  Factors Affecting Calcium Salt Saturation  increases with increasing temperature and decreases with increasing ionic strength; these variables are homeostatically maintained relatively constant in vivo. Of  far greater importance, as pH increases in relationship to the pKa values of a given acid (H2A or HA), the proportions of A= and A­ increase and the proportion of  H2Ao or HAo decreases (9). Consequently, as pH increases, the ion product increases, and the system becomes more saturated with the given Ca2+ salt (2,9,76,86); a  decrease in bile pH has the opposite effects (87). This is important, since (a) ductal bile is alkalinized by secretin­stimulated bicarbonate secretion by biliary epithelial  cells (88) and (b) in the gallbladder during fasting, as solutes from hepatic bile are concentrated by water and NaCl absorption, the increases in concentrations of A=  and A­ are countered by the acidification of the bile (78,87,89), mediated by an amiloride­sensitive Na+/H+ exchanger in the gallbladder epithelium (90­93). In the  postprandial state, however, this process is reversed, due to effects of secretin released from the duodenum, resulting in dilution and alkalinization of bile (88,94–97).  Increased intracellular [Ca2+] and activation of protein kinase C may mediate these effects of secretin (98,99), whereas octreotide causes net absorption (100). Net  secretion and alkalinization of bile by the gallbladder has also been demonstrated after crystallization but before stones appear in animal models of cholesterol gallstone  formation (101–103), and in diseased human gallbladders (104). The protective effect of acidification in gallbladder bile is reinforced by two other factors: (a) enhanced binding of bilirubinates and fatty acylates by the increasing  concentrations of bile salts (105–108) and (b) passive absorption of calcium by convection (71,72) and of the protonated (acid) forms of the organic anions  (unconjugated bile acids, unconjugated bilirubin and fatty acids) by non­ionic diffusion (109–112). Impaired acidification of bile should favor precipitation of calcium salts and gallstone formation, and acidification of gallbladder bile is reportedly defective in many  patients with any type of gallstone (76,87), though some find this only in biles harboring gallstones which are radiopaque (i.e., calcium­containing) (67,68). One must  consider the duration of overnight fasting in the subjects studied, since the pH of gallbladder bile declines progressively with fasting and may attain levels as low as pH  6.5 (76,113). The pH of normal gallbladder bile is seldom above 7.2 (68,76). Whether or not there is defective acidification, the elevated [Ca2+] in gallbladder bile of  many patients with gallstones contributes to increased saturation with all calcium salts (66,69). The increase in [Ca2+] in plasma in patients with hyperparathyroidism  should engender an increase in [Ca2+] in bile (73), which might explain the possibly increased incidence of gallstones in this condition (114,115). D—  Status of Calcium Salts of Calcium­Sensitive Anions in Bile The pKa, 

, and K'f values of calcium salts are summarized in Table 3.

1—  Bile Salts and Simple and Mixed Micelles Ca2+ ions in bile are bound mainly by bile salt anions, (BS­). This involves high­affinity binding by premicellar (mainly monomeric) bile salts in the form of CaBS+  complexes and lower­affinity binding to bile salt micelles as  C0325­01.GIF  complexes (9). Compared with dihydroxy BS­, anions of trihydroxy BS (cholates) have lower  affinity for Ca2+ ions (9), and their Ca2+ salts have much higher 

 values (116,117), which renders them unlikely to precipitate in vivo. In human bile, taurine­

conjugated BS constitute only about 25 to 40% of total BS (118,119), and their Ca2+ salts have high   values (117), so they are unlikely to precipitate. By  comparison, glycine­conjugated bile salt anions have much higher affinities for Ca2+ (9), but their Ca2+ salts have only moderately lower solubilities (116,117). Thus,  though bile may become supersaturated with Ca2+ salts of glycine­conjugated BS, they seldom precipitate because of marked and prolonged metastability (116,117).  Due to their higher pKa values (5.0 to 5.5) and their very low total concentrations in bile (except in patients with intestinal bacterial

  

Page 326 Table 3 pKa , Solubility Products (

), and Formation Constants (K f) of Calcium Salts of Calcium­

Sensitive Anions of Bile (Mean ± S.D.)a pKa b 

Calcium complex

Mon.

 

(Bile Salts)

  <1.5

TC

   

  3 c

 (M )

Micelle

 

  1.85

TDC

<1.5

 

1.95

TCDC

<1.5

 

1.95

K'f, monomer

K'f, micellar

(M­1)d

(M­1)d

  >1.0 × 10­5

  1.3 ± 0.5

3.9

­7

47.7 ± 2.0

10.0

­7

71.2 ± 3.5

13.6

­7

1.2 × 10 3.5 × 10

GC

3.88

 

4.09

10.1 ± 0.6

6.1

GDC

3.88

 

4.50

1.0 × 10

­8

53.6 ± 1.8

25.8

GCDC

3.87

 

4.54

2.0 × 10­9

96.0 ± 2.9

34.8

­8

GUDC

3.86

 

5.12

C

5.00

 

5.50

6.0 × 10

N.D.

e

N.D.

­7

N.D.

N.D.

­9

4.0 × 10

6.4 ± 0.3 × 10

DC

5.02

 

6.30

N.D.

N.D.

CDC

4.98

 

6.53

­8

1.0 ± 0.2 × 10

N.D.

N.D.

 

6.25

9.1 ± 3.0 × 10­8

N.D.

N.D.

1870

N.A.e

UDC

5.02

Carbonate

6.01

 

N.A.

Bicarbonate

9.80

 

N.A.

Phosphates =

Bilirubins B

HB­ Fatty acylates

e

7.21

 

N.A.

8.44

 

N.A.

8.12

 

N.A.

4.5–7.0

 

5.1–7.5k

1.5 ± 0.6 × 10

­8f

3.76 ± 0.1 × 10

12.5 or 5.4 ± 0.5g

Soluble

i

46 ± 17

N.A.

­13j

N.D.

N.A.

1.65 × 10 ca. 2 × 10

­21j

ca. 2 × 10 N.D.

N.A.

­6h

 

  N.D.

N.A.

  S.D. given if available in original article. b a pK  values in H2O, 25°C, except bilirubinates at ionic strength 0.15. Mon., monomer. (Data for bile salts  based on Refs. 280 and 281.) a

 of for bile salts are the apparent solubility products, at 25°C based on an electroneutral Ca(BS)2  salt with an ion product = [Ca2+] x [BS­]2∙[Ca2+] = free calcium ion activity, measured with the (Ca2+)  ion­selective electrode. Since residual dissolved [BST] was below the CMC, so that bile salts were  mostly monomeric with a fugacity close to 1.0, and the pH was high enough for full ionization of the  bile salts, free (BS­) was assumed to be equal to [BST], ignoring the small proportion bound to Ca2+.  The value given thus probably represents a maximum value for  . (Based on Refs. 116 and 117.) d K'f for both premicellar and micellar bile salts is expressed as if the complex was CaBS+ (1:1  stoichiometry). where [Ca2+] = free Ca2+ ion activity, determined with the (Ca2+) ion­selective electrode at 25°C and  total sodium concentration of 0.15 M. Above the CMC, the total concentration of micellar bile salts  ([BST] ­ CMC) is used in place of [BST] in the equation. (Based on unpublished data from Moore EW,  Mukerjee P, and Ostrow JD.) e N.D., not determined; N.A., not applicable.  f

For calcium carbonate as calcite at 37°C; value at 24°C is 1.33 ± 0.04 M2. Data from Ref. 121.    values for vaterite and aragonite have not been determined. g For calcium carbonate and bicarbonate at 37°C, ionic strength 0.15. First value obtained with calcium  electrode, is from Ref. 122. Second value obtained by calcium electrode (282) and by gel filtration on  Biogel P­2 (283). h For CaHPO4 at 25°C, ionic strength 0.15 (123,284).  i

For calcium phosphate at 37°C and ionic strength 0.15, at pH 7.4, determined by gel filtration on Biogel  P­2. K f thus reflects affinity mainly for  anions are present also (283).  j Approximate value for Ca(HB)2, obtained by 24­h partition of UCB from chloroform into aqueous CaCl2  solutions at ionic strength = 0.15 and 25°C, over the pH range from 6.0 to 7.8. Though a stable value  was attained for (Ca2+) × (HB­)2, it was not proven that true equilibrium was attained. The value given  thus probably represents a maximum value for   (137). k pKa  values for fatty acylates increase with increasing chain length, and average about 0.6 pH unit  higher when dissolved in bile salt micelles (161,162).

  

Page 327

overgrowth syndromes) (119), the activity of unconjugated bile salt anions is relatively low at the normal pH of gallbladder bile (6.5 to 7.0). Calcium salts of  unconjugated bile acids, therefore, rarely precipitate, even though they have very low   values and do not display metastability. Collectively, these concepts explain  why calcium complexes of glycine­conjugated dihydroxy bile salts are major binders of calcium in bile and why calcium salts of bile acids constitute only a small  proportion of the minerals in gallstones. In bile, bile salts are carried mainly in mixed micelles with lecithin and cholesterol (32,120). Several studies utilizing calcium­selective electrodes have reported that  addition of egg­yolk lecithin to simple micelles decreased the activity of Ca2+ ions in a dose­related fashion, implying increased calcium binding to mixed micelles as  compared with simple micelles (82,116). This binding was not affected by addition of cholesterol, even to the point of saturating the mixed micelles (82). Though  reservations have been raised concerning the interpretation of these findings (80), the concordant results with two different calcium­sensitive electrodes and two  different bile salts support their validity. In contrast to this apparent binding of Ca2+ to mixed micelles, little calcium is bound to lecithin­cholesterol vesicles (9,82). 2—  Carbonate/Bicarbonate At the normally acid pH of gallbladder bile (67), ion products of CaCO3, (as calcite) are usually below the solubility product (  = 3.8 × 10­8 M)  (67,68,76,89,121). By contrast, both canine and human hepatic biles are always markedly supersaturated with CaCO3 because the pH is usually  7.1 (67,89).  Calcium bicarbonate, by contrast, is a very soluble salt that is present as soluble complexes (122). 3—  Phosphates In simple solutions containing only calcium and phosphate at pH > 6.0, CaHPO4 is the only phosphate salt that is found in the precipitates, with a   of 1.65 × 10­6  M (123) but marked metastability (124). Initial precipitates are amorphous, but they metamorphose gradually through a variety of crystal forms, including CaHPO4,  ultimately yielding the most stable form, hydroxyapatite, which has the lowest   (125,126) and is the principal form in gallstones (6,24). Biles from patients with and  without gallstones seldom exhibit supersaturation with CaHPO4 (127), since the concentrations of inorganic phosphate are low (mean 0.35 mM in hepatic bile and 0.6  mM in gallbladder bile) (128,129). This suggests that the precipitation of calcium phosphates, found in the centers of most cholesterol gallstones (2,8,15,27), might be  triggered by a temporary increase in phosphate concentration due to hydrolysis of biliary lecithins. 4—  Bilirubinates Bilirubin conjugates (mainly glucuronides), which constitute over 99% of the total bilirubin in normal bile (130,131), do not form insoluble calcium salts, but they bind  calcium in soluble complexes (K f about 200 L/mol) (132,133). Though bilirubin conjugates are fully ionized throughout the pH range of bile, they bind avidly to simple  and mixed bile salt micelles (134,135), so that their unbound concentration is relatively low at total concentrations that are rarely above 10 mM. Nonetheless, bilirubin  conjugates are found in some gallstones (136), presumably by mechanisms other than precipitation as calcium salts—for example, by covalent binding to CBP (see  below) (41). By contrast, calcium salts of unconjugated bilirubin (UCB) have extremely low aqueous solubility (137). The small proportion of UCB in bile is derived  primarily from hydrolysis of secreted conjugates, mediated by endogenous b ­glucuronidases (138) secreted into bile by the hepatocytes and biliary epithelium (18). At  any given fractional rate of hydrolysis, an increase in the concentration of total bilirubin in bile will result in a proportional increase in the concentration of UCB (139).

  

Page 328

Upon solvent partition of UCB from chloroform into buffered, aqueous CaCl2 solutions, the Ca(HB)2 (acidic) salt precipitates only above pH 6.2 and the CaB  (neutral) salt only above pH 8.0 (137). The very low apparent   for Ca(HB)2 of approximately 1 × 10­21 M3 (137) guarantees that even normal bile is always  supersaturated with Ca(HB)2, even when fully acidified in the gallbladder. This is because HB­ is the major unbound UCB anion over the entire pH range of bile  (105,140). The small fraction of UCB dianion (B=) present below pH 8.0 also has a very high affinity for bile salts (105–108,141,142), so that the concentration of  unbound B= should be extremely small. Therefore, except when pH and total [UCB] are considerably elevated, CaB is usually the minor calcium bilirubinate salt in  gallstones (11,13,25,143–145). The K f of the soluble Ca2+ complexes of unconjugated HB­ and B= have not been determined. The above considerations indicate that factors which increase the concentration of unbound HB­ and B= will favor precipitation of calcium bilirubinates (2). These  include the following: 1. An increase in bile pH (86) 2. A decrease in bile salt and/or increase in lecithin concentration, decreasing the binding of bilirubin anions (105) 3. An increase in the concentration of total UCB in the bile, due to either a. Increased hepatic secretion of conjugated bilirubins, as in hemolysis (131) b. Increased secretion of UCB photoisomers during phototherapy (146) c. Increased hydrolysis of secreted bilirubin conjugates to UCB (138,147,149). Enhanced formation of UCB by hydrolysis can result from (a) increased activity of  ­glucuronidase in bile (138) due to a decrease in pH (150) or decreased  concentrations of the endogenous inhibitors of this enzyme [bile salts (150,151), b ­glucuronolactone and glucaric acid (152,153)]; (b) increased release of  endogenous b ­glucuronidases into bile (138), as with hepatocellular necrosis or biliary tract inflammation (18,147); (c) introduction of bacterial  ­glucuronidases  (147,148,154); or (d) an increased proportion of bilirubin monoglucuronides as compared with diglucuronides, as occurs with hemolysis or in Gilbert's syndrome  (131). Gross infection of bile is almost universal in the formation of brown pigment gallstones, whereas black pigment gallstones are commonly associated with hemolysis  (18,21). Recent studies indicate, however, that DNA of bacteria and/or bacterial b ­glucuronidase is detectable in most gallstones, even when the surrounding bile  yields no growth on aerobic and anaerobic cultures (154–157). The pigment polymer network, which accounts for the dark color and resistance to chemical dissolution of the black pigment gallstones, is believed to form by solid­ state polymerization of precipitated calcium bilirubinates, mediated by oxidative mechanisms (17,158). Though an increased proportion of this polymer is associated  with loss of the 990 cm­1 peak of the vinyl groups of bilirubin in infrared spectroscopy (158), it is disputed whether polymer formation involves these vinyl groups (17)  or the —CONH— groups in the two outer pyrrolenone rings of bilirubin (159,160). 5—  Fatty Acylates Like bilirubinate anions but unlike carbonate or phosphate, amphiphilic free fatty acid anions (FA­) bind to mixed micelles and proteins in bile (161). Thus, knowledge  of the solubilities and pKa values for FA­ in simple, buffered aqueous solutions (161,162) is insufficient to describe the solubilities of FA­ or their calcium salts in bile. In  simple aqueous systems, since the FA­ anion is more soluble than the protonated FA, the overall solubility of FFA decreases and the pKa increases with increasing  hydrocarbon chain length. Thus, the pKa is 4.5 to 5.0 for myristic acid (C12:0), but 6.5 to 7.0 for palmitic acid (C16:0), the most abundant fatty acid found in  gallstones (7,163). Free fatty acids in gallstones probably derive mainly from hydrolysis of lecithins by phospholipase­A2, so that the composition of the FFAs mimics  the fatty

  

Page 329

acid composition of the phospholipids (7,164) and are present mainly as calcium palmitate and oleate (4,7,163,165). IV—  Kinetics of Calcium Salt and Cholesterol Precipitation and Biomineralization Theory Calcium salt and cholesterol precipitation from supersaturated solutions is both regulated and organized. The persistent supersaturation of even normal human bile with  cholesterol (166) and (in hepatic bile) carbonates (167), and probably with calcium bilirubinates (2), indicates that supersaturation is a necessary but not sufficient  condition for precipitation of these components of bile. Calcium salts (125,168,169) and cholesterol (170–172) precipitate initially as unstable polymorphs (crystal  forms) and then undergo transition to more stable forms, which may differ in composition and degree of hydration, as well as crystal structure. As with cholesterol, proteins and other factors in bile regulate calcium salt precipitation, but the mechanisms differ somewhat. Factors promoting cholesterol  nucleation act mainly by influencing the aggregation, fusion and/or stability of the unilamellar vesicles which are the major carriers of cholesterol in bile, forming  multilamellar vesicles from which cholesterol seems to crystallize (32,173–177). By contrast, the proteins and bile salts that inhibit calcium crystallization do so  primarily by adhering to the growth centers on the surface of nascent crystals, ''poisoning" their ability to grow to a size sufficient for precipitation (178–180) or to  undergo transition from less stable to more stable polymorphs (169,181). Recently, similar mechanisms have been demonstrated for four biliary glycoproteins that bind  to the growing faces of cholesterol crystals and alter the morphology of the crystals (182). In gallstones, the calcium salts and cholesterol appear to be arrayed on a three­dimensional network of polymerized mucin gel (1,34,35,45,183); thus, the pattern of  crystallization is organized (Fig. 5) (3). A key difference, however, is that immunoreactive APF/CBP, which

Figure 5 Schematic of biomineralized structure of a mixed gallstone. (Ref. 10.)

  

Page 330

binds to mucin (51), appears to be interposed between the calcium salts and the mucin (3), whereas cholesterol may be bound directly to the hydrophobic,  nonglycosylated domains of the mucin (184,185) without the intervention of APF/CBP (3). A—  Biomineralization The apparent regulation and organization of calcium and cholesterol crystallization in gallstones, mediated by proteins that may be involved in both aspects, is  characteristic of biomineralization processes throughout nature (Fig. 6) (33,41,47–50,168,186). This applies both to physiological biomineralization [e.g., formation of  bones and teeth (47,49), and the shells of eggs and bivalves (178)] and pathological biomineralization [e.g., calculus formation in the saliva (187,188), urine  (189,190), and pancreatic juice (191,192)]. In all cases, the mineralized structure consists of three classes of components (41): 1. The crystals themselves, equivalent to the bricks in a building. 2. A large structural protein with hydrophobic domains, which can polymerize to form the three­dimensional structure, equivalent to the girders in a building. 3. Small (usually <20­kda), amphiphilic, acidic regulatory proteins/polypeptides, which anchor the calcium salt to the structural protein (equivalent to the mortar). The equivalent components in bile and gallstones are (a) calcium salts and cholesterol, (b) mucin (2 × 106 kDa) and (c) calcium­binding APF/CBP (7 kDa) and the  cholesterol­binding immunoglobulin fragments (28 to 74 kDa).

Figure 6 Schematic of steps in biomineralization of a mixed gallstone. (Modified from Ref. 2.)

  

Page 331

B—  Biomineralizaton of Calcium Salts The key players are acidic regulatory proteins/polypeptides (33,41,49,178,179), which have both hydrophobic and polyanionic domains, either on opposite faces of a  b ­pleated sheet (resembling a bile salt) or as the tail and head of a linear molecule (resembling a fatty acid anion). In their inactive form, the anionic groups are shielded  (e.g., by amidation of —COOH groups on glutamate or aspartate), and the hydrophobic domains are inaccessible or not in proper conformation to bind to the  structural protein. When activated by deamidation of —CONH2 groups, phosphorylation of —OH groups, and/or  ­carboxylation of glutamate residues, the  regulatory protein alters its conformation, so that its hydrophobic domain can bind to the structural protein, forming a matrix, to which Ca2+ is bound by the now  exposed anionic groups (Fig. 6) (2). The anionic groups on the regulatory protein are set at intervals of about 6.9 Å, the typical distance between Ca2+ ions in the  crystal lattice of the calcium salts (49). Thus, the matrix forms a template on which the Ca2+ ions are arrayed, and on which the crystal grows by accretion of the  relevant anions and more Ca2+ ions (Fig. 6). Studies with components of molluscan shells (50,178,180) or bile/gallstones (51,182,193) have shown that the regulatory  proteins not only regulate the rate of crystal formation; they also direct the stoichiometry and morphology of the growing crystal. Ultimately, growth of the crystal may be arrested by binding of the anionic groups of free regulatory protein molecules to the calcium cations at the growth face of the  crystal (Fig. 6). The exposed hydrophobic domains of the bound regulatory protein act as a barrier to accretion of more ions but can bind more mucin, allowing the  process to be repeated and generating multiple layers or cells of calcium salt crystals (33). In bile, alternatively, cholesterol can bind to the mucin, forming a layer of  cholesterol crystals, which can, in turn, bind more mucin (Fig. 6). This is considered a likely mechanism for the presence of a core of calcium phosphates and  bilirubinates in the center of all cholesterol gallstones (2,8,15,27); the nucleus of calcium salts and matrix forms first and then serves as a nidus for accretion of  cholesterol monomers to form crystals. Formation and growth of a biomineralized structure usually involves accretion of monomers from the supersaturated solution rather than aggregation of preformed  crystals (47,49,194). When not combined in a matrix to trigger and organize calcium salt crystallization, unbound CBP and mucin can bind ionically to the growing  face of microcrystals or stones and arrest their further growth by blocking further accretion of calcium salts (51). It is not known how APF/CBP is activated, whether  APF binds to mucin, or whether factors other than the molar ratios of APF/CBP to mucin determine whether crystal growth is promoted or arrested in the presence of  both proteins. C—  Biomineralization of Cholesterol As with calcium salts (125), cholesterol crystals may undergo transitions from early, spiral, and filamentous forms (believed to be anhydrous cholesterol) to mature,  plate­like crystals of cholesterol monohydrate (170–172). Four candidate regulatory glycoproteins have been isolated from bile by their properties of binding to  cholesterol crystals and affinity for Helix pomatia lectin (182); the latter suggests the presence of N­acetyl­ a ­ D­galactosamine residues. Three of the four are  apparently subunits of polymeric human IgA, with apparent molecular weights on SDS­PAGE of 28 kDa (light chain) 63 kDa (heavy chain), and 74 kDa (secretory  component). In model bile at pH within ± 1.0 U of their pI values (6.3 to 8.3) (182), each glycoprotein binds to cholesterol crystals, slowing the maximum growth  rates, diminishing the quantity of precipitated cholesterol at equilibrium, and altering crystal morphology (182). Similar effects were obtained with other inhibitory biliary  glycoproteins that bound to concanavalin A (Con A) or lentil lectins, but the H. pomatia proteins were up to fivefold more potent, in the order 63 > 16 > 74 > 28  kDa (182). Though immunoglobulins are present in human gallstones (3,54), IgA is distributed randomly throughout mixed gallstones, without specific

  

Page 332

localization (3), suggesting that this immunoglobulin does not act as a "mortar" to anchor cholesterol crystals to the mucin scaffolding; it is currently believed that the  cholesterol crystals are bound directly to the mucin (3). To be determined are the effects on cholesterol crystallization in human bile samples of the specific removal  from, or addition of, immunoglobulins. D—  The Roles of Mucins 1—  Structure Mucin­type glycoproteins are heavily glycosylated macromolecules; they are the most abundant proteins in bile (53,195). The soluble mucin monomers have a very  high molecular mass (2 × 106 kDa), over 80% of which consists of the O­linked oligosaccharide chains (53,196). Mucins from human bile are known to be quite  heterogeneous in regard to the proportions of different glycan chains and sulfation (197–201). The core polypeptide chain contains at least two distinct regions (202– 205). One consists of 20­amino acid tandem repeat sequences that are rich in serine, threonine, and proline; the glycan (carbohydrate ± sulfate) chains are covalently  bound to the first two residues. The second nonglycosylated, hydrophobic region, possibly internally located, consists of 123­amino acid tandem repeat units rich in  serine, glutamine/glutamic acid, and glycine, and 127­amino acid tandem repeats rich in cysteine and glycine. The uniquely high proportion of anionic sialic acid (16%  of sugar residues) in gallbladder mucin is correlated with its ability to bind calcium (206,207), while the hydrophobic domains bind ligands such as bilirubin (37,58),  lipids (185), and some proteins, including APF/CBP (51); both domains are believed to contribute to the pathogenesis of cholesterol lithiasis (53,185,208,209). 2—  Function Mucins polymerize at concentrations above about 4 g/dL, mediated by concentration­dependent self­aggregation and possibly by formation of disulfide bridges,  generating a highly hydrated and viscous polyanionic gel (196,210). A network polymer of this gel constitutes the supporting matrix of both sludge (210,211) and  cholesterol and pigment gallstones (1,34,35,45,183), and is believed to serve as a nidus for gallstone formation (53,210). The viscous mucous gel layer overlying the  gallbladder epithelium is believed to prolong the residence time of lithogenic bile and microcrystals in the gallbladder, granting time for the accretion of cholesterol  crystals on to gallstones (210). Addition of soluble mucins to supersaturated model biles has been reported variously to promote (a) fusion and/or aggregation of vesicles; (b) instability/leakiness of  vesicles and crystallization of cholesterol therefrom; and (c) growth rate and size of cholesterol crystals (52,174,185,208,212–217). Mucin also stimulates  crystallization of calcium phosphates and bilirubinates (33,51,147) and diminishes the size of hydroxyapatite crystals (218). The presence of mucins in the core of  cholesterol and mixed gallstones also supports their important role in the crystallization process (1,3,36–38). In animal models of gallstone formation, hypersecretion of mucins has seemed to occur before crystals and stones were formed (219–222), but inhibition of mucin  secretion with nonsteroidal anti­inflammatory agents or aspirin has not consistently prevented crystal and stone formation (223–226). Aspirin, however, has been  shown to have a slight protective effect against the high frequency of cholesterol gallstone formation during rapid weight loss in morbidly obese humans (227). In  human bile samples, contradictory results have been obtained regarding the relationships between the concentrations of mucins and the presence of gallstones  (210,228,229). This suggests that differences in the structure of mucin, rather than its concentration, might be more important in the pathogenesis of gallstones  (200,201,210,228), but no qualitative differences have been detected between mucins from gallbladder bile of humans with versus without gallstones, regarding either  structure or in vitro effects on crystallization (201,228).

  

Page 333

Though it has been proposed that both calcium salts and cholesterol precipitate within the mucin gel layer covering the gallbladder epithelium (32,210,230), this has  not been demonstrated directly, and virtually all studies of the effects of mucin on cholesterol and calcium crystallization have been performed with soluble mucins.  Though phospholipids (231), cholesterol (232), and protonated organic acids [such as unconjugated bilirubin (110) and long­chain free fatty acids (111,112)] are  absorbed readily from the alkaline bile across the thin mucus gel layer in the guinea pig gallbladder, this is not true of organic anions with lower pKa values (109),  including conjugated bile salts. This might be expected, despite the favorable 10­mV lumen­to­plasma gradient across the gallbladder mucosa (233), since the large,  negatively charged anions would undergo electrostatic repulsion by the polyanionic mucin gel [pI about 4.0 (233)]. Moreover, the increasing acidity in the deeper  layers of the gel (86), generated by the Na+/H+­exchanger in the gallbladder epithelium (91–93), would largely protonate those anions that did penetrate, converting  them to acids that are incapable of forming calcium salts and are more readily absorbed across the gallbladder epithelium (234,235). For these reasons and since most  gallstones in humans are not embedded in the mucin gel layer, it may well be that the precipitates form and are organized on mucin monomers in the bulk bile [as has  been shown in model biles (51)]; these could then polymerize to form the gallstone and adhere it to the mucin gel layer covering the gallbladder epithelium. Clearly, the  activities of unbound Ca2+ and HB­ need to be determined in the mucin gel. E—  Roles of APF and CBP—The Small Regulatory Proteins of Bile APF (anionic peptide fraction) and CBP (calcium­binding protein) are two closely related, immunologically cross­reacting, small (about 7 kDa), amphipathic  polypeptides (236), which together constitute the third most abundant protein(s) in human bile (39,237). APF/CBP is abundant in both hepatic and gallbladder bile,  from controls as well as patients with gallstones, in concentrations ranging between 0.6 and 1.2 mg/mL (237). It is also uniformly present in all types of gallstones (51).  Immunostaining of the cut surface of gallstones reveals that immunoreactive APF/CBP can be demonstrated only in the zones that contain calcium salts and bile  pigments (3,238). 1—  Preparations of APF and CBP from Bile and Gallstones Early preparations of APF, isolated from bile by zonal ultracentrifugation (239,240), and of CBP, isolated from gallstones by delipidation and demineralization  (40,42,51,241) or from bile by coprecipitation on calcium carbonate (42,236), were contaminated with bile salts, lipids, bile pigments, or sodium dodecyl sulfate  (SDS) and contained both APF and CBP in various proportions (236). SDS contamination was later minimized by excluding it from electroelution solutions and by  extraction with 50 mM KCl (242). Removal of pigments was facilitated by performing the SDS­polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) on 15% Laemmli rather  than Schägger von Jagow gels (236). It was also realized that preparations from gallstones would include denatured proteins formed during the long sojourn of the  stones in the gallbladder (236). Recently, virtually pure preparations of APF and CBP, with minimal denaturation, have been obtained by using fresh human hepatic bile collected into tubes containing  protease inhibitors and eliminating the use of lipid solvents and SDS­PAGE (236). As before, CBP was recovered by calcium precipitation and then demineralization  with EDTA, whereas bile was simply centrifuged for the APF preparation. Larger proteins and aggregates were removed by serial ultrafiltration through 100­, 30­,  and 10­kDa membranes, and a final hydrophobic 3.5­kDa membrane removed residual salts, lipids, and bile salts (236). Preparative hydrophobic high­performance  liquid chromatography (HPLC) (Fig. 7) then cleanly separated APF and CBP from small polypeptide fragments and most of the residual pigment (236). Analytical  HPLC revealed that the APF preparations isolated by serial ultracentrifugation or serial ultrafiltration

  

Page 334

Figure 7 Hydrophobic HPLC patterns in the Marseille system, with detection at 280 nm. (top) APF from bile. (middle) CBP from a cholesterol gallstone. (bottom) CBP from calcium precipitation of bile. "O.D. ELISA" refers to reactivity to polyclonal antibody against peak 4 from (A) by enzyme­linked immunosorbent assay, as  O.D./area under the curve of HPLC peak. (Modified from Ref. 236.)

  

Page 335 Table 4 Characteristics of Amphipathic Anionic Polypeptide (APF) and Calcium­ Binding Protein (CBP) Characteristic

APF

CBP

Present in

Bile (and stones)

Bile and gallstones

Molecular weights (SDS­PAGE)

7 and 12 kDa

7 and 12 kDa

Amphipathic

Yes

Yes

Anionic (acidic)

Yes (pI < 5.0)

Yes (pI < 5.0)

Hydrophobic binding

Strong

Strong

Glycosylation

Not determined

None detected

Stain with Coomassie blue

No

No

Stain with silver

Orange­brown

Orange­brown

Bound pigments

+

+ + +

Amino acids

Closely similar compositions (see Table 5)

Binding to membranes

Bind poorly to artificial blotting  membranes

Antibody binding

Complete immunological cross­reactivity.

Binds calcium

Little

Strongly

If unbound, inhibits calcium salt  precipitation

No

Yes

When added to mucin, promotes  calcium salt precipitation

No

Yes

Stabilizes biliary vesicles

Yes

No

Inhibits cholesterol crystallization

Yes

No

contained small amounts of CBP, but that CBP preps, obtained by initial extraction of gallstones or calcium precipitation of bile, contained no APF (236). This is  important to consider in evaluating results obtained with these preparations. 2—  Characteristics of APF and CBP APF and CBP share many common characteristics (Table 4). Both (a) are highly amphipathic, leading to avid self­aggregation, strong binding of phospholipids  (39,243) and pigments (33,41,51) as well as bile salts, and a tendency to adhere to hydrophobic surfaces, such as concanavalin A and C­18 reverse­phase columns  (41,51); (b) are highly acidic, revealing up to three bands on isoelectric focusing, with pI values of approximately 4.5, 4.7, and 4.9 (39,41,243); (c) show two bands  on SDS­PAGE in Schägger von Jagow gels with apparent molecular weights of about 6.5 to 7.0 and 12 kDa (51,236); (d) do not stain with Coomassie blue but stain  orange­brown with silver (39); (e) are yellow, brown, or green in color due to tightly (? covalently) bound bile pigments (more for CBP than APF) (40,51); (f) have  closely similar amino acid compositions (Table 5) [with about 24% diacidic and 10% dibasic amino acids, about 14% serine + threonine, about 38% neutral amino  acids, low proportions of proline

  

Page 336 Table 5 Amino Acid Compositions of Amphipathic Anionic Polypeptide/Calcium­Binding  Protein Preparationsa,b,c Source Preparation

Hepatic bile APF­mar

CBP­newd

Mixed stone

Xol stone

CBP­mixd

CBP­xol

Amino acid Taue

ND

ND

0.0

ND

Pro

3.3

4.7

5.4

5.2

Asp

10.0

9.7

13.2

12.5

Glu

12.3

13.8

13.8

14.8

Thr

6.1

5.1

5.1

6.6

Ser

7.9

8.9

7.2

7.6

Gly

19.8

11.4

13.6

14.0

Ala

7.1

7.2

8.4

6.0

Val

6.9

7.5

6.1

4.6

Ile

4.0

3.8

2.9

3.3

Leu

8.0

8.6

7.8

8.7

Cys/2

0.6

0.0

0.0

0.3

Met

0.0

1.9

0.0

0.0

Tyr

1.7

3.8

2.0

1.4

Phe

3.6

4.7

4.0

4.3

His

1.4

1.6

1.8

1.2

Lys

3.8

4.5

4.7

5.2

Arg

3.4

2.9

4.1

4.3

Mol % diacid

22.2

23.5

27.0

27.2

Mol % dibasic

10.7

8.7

9.0

10.6

Mol % Ser + Thr

14.0

14.0

12.3

14.2

Diacid­dibasic

13.5

14.5

16.4

16.6

a

Percent of residues. Data from Ref. 236, where the nature of the above APF and CBP  preparations is defined. b With CBP­new as reference, values in bold are significantly higher and values in italics are  significantly lower. c Absence of tryptophane confirmed by independent nondestructive analysis.  d Average of closely similar values for 7­ and 12­kDa bands.  e

N.D., not determined.

and aromatic amino acids, and little or no cysteine or methionine (236)]; (g) adhere poorly to most artificial membranes used for immunoblotting and amino acid  sequencing (236), with the possible exception of the positively charged Immobilon membrane (Millipore­Waters) (39). Most importantly, APF and CBP show complete immunological cross­reactivity with all poly­ and monoclonal antibodies thus far developed against either polypeptide  (39,236). This renders it impossible to distinguish APF from CBP in immunoassays of body fluids or immunostaining of tissues or gallstones; the polypeptide thus  assayed or identified is referred to as APF/CBP. Some monoclonal antibodies prepared against earlier preparations of APF or CBP also showed cross­ immunoreactivity with apolipoprotein A­1 and HDL­3 (39,236), but a certain number of monoclonal and all polyclonal antibodies against APF, used for enzyme­ linked immunosorbent assay (ELISA) of body fluids, did not. Nonetheless, the reported amounts of APF/CBP in biological fluids [e.g., 0.6 to 1.2 mg/mL in human  gallbladder biles (237)], based on ELISA, may represent different estimates due to changed exposure of APF/CBP epitopes

  

Page 337

in the presence of lipids and detergent bile salts than with the APF/CBP standards (244). Using the latest procedures, up to 42 mg of pure CBP has been isolated  from 1 L of human hepatic bile, and as much as 5.2 mg CBP has been isolated per gram of dried black pigment gallstones and 1 to 2 mg/g from cholesterol and mixed  gallstones (van den Berg AA, Ostrow JD; unpublished data). The same values, 1 mg/g, were estimated for APF in mixed gallstones (238). The 7­ and 12­kDa bands, seen on SDS­PAGE of all preparations of APF/CBP, share many common properties: (a) closely similar amino acid patterns (236); (b) a  blocked N­terminal residue; (c) closely similar patterns on hydrophobic HPLC (236); and (d) inhibit the precipitation of calcium phosphate and bind to gallbladder  mucin with similar affinity, forming complexes which alter the kinetics and structure of the formation of calcium phosphate (51). Though these findings suggest that the  12­kDa band is a dimer of the 7­kDa band, each band eluted from a preparative gel ran true on second gel, with no evident dissociation of the 12­kDa band to yield  the 7­kDa band, or association of the 7­kDa band to yield the 12­kDa band (236). This suggests that, if the 12­kDa band is a dimer, the two 7­kDa bands must be  covalently linked. Both bands, however, were detected in the presence of mercaptoethanol, excluding cross­linkage by S­S bond(s), but other linkers—for example  covalently bound pigment—have not been excluded (236). The relationship between these two bands of APF/CBP remains unsolved. The most important differences between APF and CBP are their affinities for calcium and their effects on cholesterol crystallization (236). CBP, but not APF, avidly  binds 45Ca2+ (236), adsorbs to calcium carbonate precipitates (42,236), inhibits the nucleation of crystals of calcium carbonate (40) or phosphate (51), and—when  prebound to bovine gallbladder mucin—promotes the precipitation of calcium phosphate and alters its crystal structure (51). By contrast, APF but not CBP  reportedly regulates the rates and amounts of cholesterol precipitation from model bile solutions, whether or not they contain calcium (59,216,245). These differences  are discussed further in Secs. F. 2 and F. 3 below. Since repeated efforts by four labs have failed to sequence the APF/CBP polypeptide(s), the true structural relationships between APF and CBP are not known. It  has been shown that CBP, isolated from gallstones, is not glycosylated and does not bind specifically to Con A, H. pomatia, or lentil lectins (41), but this has not been  assessed for preparations of CBP from fresh bile or for APF. Our current hypotheses, influenced by biomineralization theory, are that APF and CBP have the same  polypeptide structure and that CBP is a posttranslational modification of the APF synthesized in the rough endoplasmic reticulum of the hepatocyte (236). The binding  of calcium by CBP but not APF suggests that CBP, like the activated form of most calcium­regulatory proteins, is formed by deamidation and/or phosphorylation  (2,47,49). 3—  Sources of APF/CBP in Bile Immunomicroscopy reveals APF/CBP in the rough endoplasmic reticulum of rat and human hepatocytes (246) but not in nonparenchymal liver cells (Lechène de la  Porte P, Lafont H; unpublished data). Radiolabeled leucine is incorporated into immunoreactive APF/CBP by isolated rat hepatocytes (246), and APF/CBP appears  in the bile secreted by the isolated perfused rat liver (247). The synthesis of APF/CBP by isolated rat hepatocytes (247), and the biliary secretion of APF/CBP by the  bile fistula rat (248,249) and the isolated perfused rat liver (247) increase in parallel with secretion of bile salts. Surprisingly, the output of APF/CBP is greater the less  the hydrophobicity and micelle­forming properties of the bile salts (GDC < TC << TDHC) and does not correlate with biliary phospholipid or cholesterol secretion  (247–249), despite an apparent close association of APF/CBP with the bile pigment­lipoprotein complex in bile (243). It thus appears that APF/CBP is synthesized by hepatocytes and secreted into the bile. It has not been determined whether, like other proteins in bile (250,251), it is  absorbed across the gallbladder mucosa.

  

Page 338

F—  Functions of Calcium, APF, CBP, and Calcium Salt Precipitates 1—  Functions of Calcium Binding of calcium, by addition of EDTA to human bile, blocked precipitation of calcium bilirubinates but did not affect the time of the appearance of cholesterol  crystals (252). Note, however, that this study failed to first remove cholesterol microcrystals from the bile or to measure the growth rate or amount of crystals formed;  in addition, EDTA binds bilirubin and other bile components besides calcium. In contrast, addition of calcium to biles from patients with gallstones increases the  number of cholesterol crystals formed (253). In model biles, addition of physiological concentrations of calcium has been shown to enhance both the hydrophobic  binding of bilirubin (254) and cholesterol (255) to mucin and the promotion of cholesterol precipitation and crystal growth engendered by Con A­binding  glycoproteins (256). Each of our groups have recently demonstrated, using phase­contrast light microscopy, that addition of calcium to model biles at concentrations  10 mM promotes  cholesterol precipitation under conditions in which insoluble calcium salts are not formed (no phosphate in buffer, CO2 excluded from the system) (59,216). In the  French­Israeli study (59), the model biles were prepared without buffer (pH was <7.0), taurocholate was the only bile salt used, supersaturation was initiated by 10­ fold dilution with 0.15 M NaCl, and crystals and vesicular phases were quantitated also by sucrose density gradient ultracentrifugation. In the Amsterdam study (216),  model biles were buffered with PIPES to pH 7.0, equimolar concentrations of taurocholate and taurodeoxycholate were added, the solutions were supersaturated  from the time of dissolution, and nephelometry was used also to quantitate crystallization of cholesterol. Despite comparable total calcium and bile salt concentrations,  the addition of taurodeoxycholate in the Amsterdam study results in much lower [Ca2+] compared with the use of taurocholate alone in the French­Israeli study (9),  probably accounting for effects at lower total calcium concentrations in the latter study (1 mM versus 5 mM). In both studies, addition of calcium led to an accelerated rate of cholesterol crystal growth, but only the Israeli­French study detected an increase in the cholesterol  crystal mass at equilibrium (Fig. 8) (59). By contrast, only the Amsterdam study detected a hastening of the time to the first appearance of crystals and more rapid  attainment of equilibrium in the presence of calcium (216). The Israeli­French study was able to show also that the effect of added calcium was mediated by promoting  the aggregation of vesicles and destablizing the multilamellar vesicles from which cholesterol crystallizes (59). In the Amsterdam study, addition of 1 mg/mL human  hepatic bile mucin even more potently accelerated crystallization than did 10 mM calcium, and also doubled the crystal mass, and the effects of mucin plus calcium  were additive (216). That study also showed that rapid crystallization of calcium phosphates more potently accelerated and increased cholesterol precipitation than did  the same concentrations of soluble calcium ions, and the influence of mucin was still additive (216). This demonstrated potentiation of cholesterol crystallization by physiological concentrations of calcium in model biles must be interpreted cautiously until similar results  are obtained with human bile. The observation, in one study (216) of an even greater effect of precipitated calcium phosphate is compatible with the demonstrated  presence of calcium phosphates in the centers of cholesterol gallstones (2,8,15,27) and favors the hypothesis that calcium precipitation might initiate cholesterol  gallstone formation (9). The Israeli­French study also documented that the effect of soluble calcium anions was to increase vesicle size (fusion), aggregation and  instability (59), confirming Moore's earlier proposals (9). 2—  Functions of APF APF is found in higher concentrations in the vesicular than in the nonvesicular fractions of bile (59,245). By its phospholipid­binding properties, APF appears to  stabilize aggregated unilamellar vesicles and the fused, large multilamellar vesicles (59,174–176), highly supersatu­

  

Page 339

Figure 8 Effects of calcium (lower two pairs of panels) and APF (right panels) on distribution of cholesterol among  multilamellar vesicles (gray bars), early crystals (white bars) and mature cholesterol monohydrate crystals (black bars) at various intervals after acute dilution of concentrated model bile. (From Ref. 59.)

  

Page 340

rated with cholesterol (59), hindering cholesterol crystallization from cholesterol­rich domains within these structures (257). Thus, APF had effects on cholesterol  precipitation exactly opposite to calcium, and could markedly suppress the enhancement of cholesterol precipitation by added calcium (Fig. 8) (59). With fluorescein­ labeled APF, it was shown that the APF was bound primarily to the large vesicles, presumably accounting its effect (59), but binding of bile salts by APF might have  contributed also. The small proportions of CBP in the APF preparation used (236) were too small to attribute the observations to binding of calcium ions, and APF  has little affinity for calcium (236). It thus appears that APF stabilizes cholesterol within supersaturated multilamellar and aggregated vesicles, markedly decreases the rate of crystal formation, and  largely suppresses the effect of calcium (59). Several observations to this concept should be noted, however: (a) addition of APF preparations to human bile samples  has not altered the distribution of cholesterol among various carriers or the time to first appearance of cholesterol crystals (245); (b) ELISA assay has revealed no  differences in APF/CBP concentrations in gallbladder biles between patients with cholesterol gallstones and control subjects without gallstones (237); and (c)  nucleation times of biles from patients with gallstones are unrelated to APF concentrations (237). APF was increased in biles from pigment­stones subjects (237). Though, as noted earlier, APF does not seem to determine phospholipid or cholesterol secretion into bile, it may play a role in regulation of the uptake of lipoproteins  and metabolism of lipids by the liver (258,259). Addition of APF to liposomes containing 14C­cholesterol, administered intravenously to rats, enhances the uptake and  storage of the cholesterol by the liver while decreasing its conversion to bile salts (259). 3—  Functions of CBP In mixed gallstones, immunoreactive APF/CBP is clearly associated with the calcium­containing pigmented zones (Figs. 4 and 6 in Ref. 3), where it is in contact with  the mucin bands at the interface between the pigment deposits and cholesterol layers (3,238). No APF/CBP is detected in the cholesterol layers, where the  cholesterol crystals are associated with mucin (3,238). In view of the known calcium­binding properties of CBP as opposed to APF (236), the immunostained  APF/CBP associated with the calcium­pigment zones is most probably CBP. In model systems in vitro, mucin and CBP alone each inhibit formation of calcium  phosphate (51) and calcium carbonate (41) crystals, while the complex of the two proteins promotes calcium phosphate precipitation and alters the stoichiometry and  form of the crystals (51). By contrast, addition of CBP (0.25 mg/mL) had no effects on cholesterol crystallization from model biles, whether or not calcium, calcium  phosphate precipitates, or mucin was present (216). It should be noted, however, that the marked degree of supersaturation with CaHPO4 in that study may have  precluded inhibition of precipitation of that salt despite the high concentration of CBP used. The properties of CBP on calcium salt crystallization in model systems thus fulfill the criteria for a protein that regulates biomineralization of calcium salts (33,178), but  these effects must be demonstrated also in supersaturated human biles before the role of CBP can be confirmed. Interestingly, the content of immunoreactive  APF/CBP in gallbladder bile is one­third higher in patients with black pigment gallstones than in controls, and the ratio of APF/CBP to phospholipid concentrations is  significantly higher in patients with pigment gallstones compared to cholesterol gallstones or to controls (237). By contrast, biomineralization theory would predict that  lower CBP levels would favor calcium salt precipitation, since the excess of unbound CBP, which inhibits crystallization, would diminish in relation to the mucin­bound  CBP, which promotes crystallization. The apparent conflict may relate to the failure of ELISA assays to distinguish between APF and CBP (236).

  

Page 341

G—  Biomineralization Functions of Other Proteins and Biliary Lipids Aminopeptidase­N has been identified as the 130­kDa protein which promotes crystallization of cholesterol from model biles (260). Curiously, immunostaining of  gallstones reveals that this protein is not detected in the cholesterol­rich zones but is distributed alongside APF/CBP in the calcium­pigment zones, interposed between  mucin and the calcium­pigment precipitates (3). Effects of aminopeptidase­N on calcium binding and calcium salt precipitation need to be determined with the  techniques used for APF/CBP (51). Other bile proteins which inhibit cholesterol precipitation from model biles (261) are discussed in Sec. 2, Chaps. 3, 5, and 7. Their distribution in relation to mucins,  calcium, pigments and cholesterol need to be studied by immunostaining the cut surface of gallstones, akin to published studies for mucin, APF/CBP, aminopeptidase­ N and albumin (3). Bile salts. During the precipitation of calcium phosphates, the initial amorphous calcium phosphate (ACP) precipitate metamorphoses through a series of intermediate  forms, including CaHPO4, to the least soluble and most stable form, hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) (125). Anionic bile salts can bind avidly to precipitates of ACP  (Fig. 9) (262,263), with moderate affinity to Ca3(PO4)2 and with low avidity to other intermediate crystalline forms and hydroxyapatite (Fig. 10) (263), as well as  CaCO3 (263). The bound bile salts inhibit both the transition of ACP to hydroxyapatite and the growth of hydroxyapatite crystals (169,264) as well as crystallization  of CaCO3 (181). Both types of binding are greatest with glycine­amidated and then unconjugated bile salts but very low with taurine­amidated bile salts (Figs. 9A and 10) (262–264).  Within each category, there is essentially no binding of trihydroxy­ or triketo­bile salts; among the avidly­binding dihydroxy bile salts, adsorption of ursodeoxycholates  (3a ,7b ­hydroxy) is somewhat less than chenodeoxycholates (3a ,7 a ­hydroxy) or deoxycholates (3a , 12a ­hydroxy) (Fig. 9A and B and Fig. 10) (262–264). These  relative affinities of various bile salts for precipitated calcium salts are reminiscent of, but not identical to, their relative affinities for dissolved Ca2+ ions (Table 3). The  reasons for these differences in binding among bile salts are unknown. The adsorption is mainly of premicellar bile salts (Figs. 9B and 10) and is not evident below a certain threshold concentration of bile salts, which is less than half the  critical micellar concentration (CMC) (262–264). It probably involves binding of the —COO­ and —OH groups of the bile salt monomers to exposed calcium ions  on the surface of the crystal lattice, akin to their binding to soluble Ca2+ ions (9), followed by hydrophobic binding of a second bile salt monomer, covering the  exposed hydrophobic b ­face of the bound bile salt (264). Above the critical micellar concentration, additional bile salts may complex with the bound monomer, but  with less avidity than premicellar binding (Fig. 10) (264). Thus, since [BST] in bile are far above the CMC, it is unlikely that changes in [BST] in bile would greatly  influence the inhibition of crystallization by bile salts. By contrast, increases in the ratio of glycine­ to taurine­amidated bile salts in bile, due to interruption of the  enterohepatic circulation or taurine­deficient diets (119), might augment the inhibitory effects of bile salts on crystal growth. The major mechanism by which bile salt anions inhibit the growth of hydroxyapatite crystals appears to be competition with dissolved   anions for attachment to  Ca2+ ions in the crystal lattice (264). The mechanisms for the steep increase in binding of BS­ as pH increases from 5.5 to 6.2 (Fig. 9C) (262), and the decline in  binding as pH increases above that range (262,264), are not well­understood. Phospholipids are found in pigment gallstones, are almost entirely phosphatidylcholine, and have a fatty acid composition similar to that of biliary lecithins (7). It has  been shown that added phospholipid affects both the time of onset of cholesterol crystallization from lithogenic human bile (265) and the nature and transitions of the  crystals that are formed in supersaturated model biles (266) or in films on the surface of water (267). Different phospholipids may have different effects. The  mechanisms of these phenomena are unclear.

  

Page 342

Figure 9 Adsorption of bile salts to amorphous calcium phosphate precipitates. A. Dependence on bile salt amidation and ring hydroxylation. (From Ref. 263.) B. Dependence on concentrations of glycine­amidated bile salt. (From Ref.  263.) C. Dependence on pH. (From Ref. 262.) CBC denotes the critical binding concentration of the bile salt below which no bile salts were bound.

  

Page 343

Figure 9 Continued.

V—  Overview and Future Directions A—  Summary of Current Concepts The pathogenesis of gallstone disease is multifactorial: gallstone formation in the gallbladder results from supersaturation of bile with calcium salts and cholesterol,  impaired balance among kinetic factors which either promote or inhibit precipitation, and an enhanced residence time in the gallbladder (9,32). Supersaturation with  cholesterol is determined by its interactions with bile salts and phospholipids, particularly its relative concentrations in mixed vesicles with lecithin (32). Supersaturation  with calcium salts is determined by the activities of Ca2+ ions and the ''calcium­sensitive" anions in bile; the former is mainly governed by the activity of Ca2+ ions in  plasma and Gibbs­Donnan forces across the biliary tract epithelium, generated by the large, impermeant polyanions in bile [mucins, and the simple and mixed micelles  of bile salts (9)]. Once thermodynamic supersaturation is attained, the nucleation of microcrystals is apparently determined by kinetic factors (proteins, glycoproteins,  and bile salts) (9,32), and the

  

Page 344

Figure 10 Adsorption of bile salts to calcium hydroxyapatite crystals. Effects of bile salt structure, concentration and self­association in the presence of 8 mM calcium chloride in the supernatant. Left ordinates, bile  salt bound, micromoles per milligram of hydroxyapatite ( ); right ordinates, bile salt self­association,  assessed by fluorescence of bile salt­associated 1,6­dephenyl­1,3,5­hexatriene (DPH).  (Modified from Ref. 264.)

subsequent growth and organization of gallstones is governed by biomineralization processes (2,3,33,41,51,268). In the structure of gallstones, by analogy with that of a building, mucins are the girders, the regulatory proteins are the mortar, and the calcium­pigment granules and  cholesterol crystals are the bricks (41). Mucins and the bound regulatory proteins not only form the matrix on which the deposition of the mineral components is  organized, but also act as a template which directs the stoichiometry and form of the crystal structures. When free in solution, moreover, mucins and regulatory  proteins, along with bile salts and calcium ions, may control the rates of crystallization by altering the stability of cholesterol in biliary vesicles and/or by "poisoning"  growth centers on nascent crystals. Lectin­binding glycoproteins and APF appear to be the key regulatory proteins for cholesterol crystallization, while CBP is  currently the only candidate regulatory protein for calcium precipitation. Mucins seem to have regulatory functions in both systems. B—  Limitations of Current Concepts The concepts outlined above are based mainly on in vitro studies of the effects of addition of individual components to supersaturated model biles. Conflicting results in  such studies may be related to differences in the species of bile salts or mucin utilized. Due to financial considerations, most studies in model biles have used  taurocholate, rather than a natural mixture of the bile salts present in human bile, which are much more hydrophobic (269) and bind calcium

  

Page 345

much more avidly (9). Most studies using purified mucins have been performed with soluble mucins rather than polymerized mucin gels and with bovine gallbladder  mucins, which, though similar, are not identical to human or hepatic bile mucins (202–205). While studies with model biles may demonstrate specific effects of a given component, conflicting results are frequently obtained when the same component is added  individually to natural bile samples and/or when several components are added together (270,271). There may, moreover, be discrepancies between interactions  shown in vitro and the localization or the association of a component with calcium salts or cholesterol in the stones [e.g., aminopeptidase­N promotes cholesterol  crystallization (260), but is associated only with the calcium salts in gallstones (3)]. It has been proposed (261,270) that a specific role for a given bile component in  gallstone formation is best demonstrated by showing that (a) its selective removal from, and addition to, normal and lithic samples of human bile produce consistent  and concordant alterations in the precipitation of calcium salts and/or cholesterol and/or the organization and growth of crystals and stones and (b) its structure and/or  its concentration in bile are significantly altered in patients with a given type of gallstone, by comparison with patients with other types of gallstones or no gallstones.  Further support could be obtained from the demonstration, in animal models of pigment or cholesterol gallstone formation, that changes in these bile components  precede the appearance of crystals and gallstones. Note, however, that some effects of some regulatory proteins are manifest only in cooperation with other specific  proteins. C—  Initiation of Mineral Nucleation and Precipitation Possibly the most interesting and least understood phenomenon in gallstone pathogenesis is the process that triggers the initial nucleation of calcium salts and  cholesterol and their organization into gallstones. In animal models, a large increase in mucin secretion and gel formation seems to precede gallstone formation  (221,222), but it is unclear if this applies also to human gallstone disease (34,53). Another possible trigger is a rapid increase in the relative proportion of pronucleating  versus antinucleating factors and/or of activated and bound CBP, but there is as yet no evidence for these proposals. Black pigment gallstones contain calcium bilirubinates and, phosphates, and often carbonates also (11,272), suggesting that an increase in the Ca2+ activity and/or pH  of bile is the trigger for forming these stones. By contrast, the presence of calcium bilirubinates and phosphates but little or no carbonates in the cores of cholesterol  and mixed gallstones (2,8,15,26,27) as well as in some black pigment stones (15,272) militates against an increase in Ca2+ activity or pH as the trigger for formation of  these types of stones, since those should lead also to precipitation of CaCO3. Calcium palmitate and bilirubinate are enriched in the cores of brown pigment gallstones  (11,21,273), suggesting that the trigger in this case is bacterial hydrolases (147). Recent evidence for the presence of bacteria and bacterial b ­glucuronidase in the  cores of mixed gallstones (154–157,274) indicates that bacterially mediated hydrolysis of bilirubin conjugates and phospholipids may initiate formation of these stones  as well. Note that addition of b ­glucuronidase to lithogenic human bile enhances precipitation of other components as well as bilirubin (147,275). The single or multiple cavities, found almost uniformly in the core of mature gallstones (Fig. 1), appear to involve dissolution of matrix as well as mineral. Bacterial  hydrolases are logical candidates for this process also and the salts and digested fragments of matrix proteins might well diffuse out through the porous interstices of the  gallstones (276). In model biles, APF inhibits cholesterol crystallization (59) and unbound CBP inhibits calcium salt crystallization (51), while CBP bound to mucin promotes accretion  of calcium salts in gallstones (51). The possibility that CBP is an activated form of APF suggests the hypothesis that the balance between APF and CBP levels in bile  might determine whether cholesterol or calcium/pigment salts will precipitate. A low APF/CBP ratio would favor cholesterol precipitation, whereas a high ratio,  mediated by activation of APF to CBP, would promote calcium/pigment precipitation. The testing of this hypothesis must await development

  

Page 346

of a means to individually measure APF and CBP concentrations in bile and distinguish their presence in various regions of gallstones. All these hypotheses need to be evaluated by analysis of bile components, including regulatory proteins and hydrolytic enzymes, in the period immediately preceding  crystallization in animal models (221,222) or in humans at high risk for gallstone formation [e.g., morbidly obese patients undergoing rapid weight reduction (277)]. D—  Conclusion In a rich and diversified fluid like bile, it is difficult to assess which components are directly or indirectly implicated in the precipitation processes and how they function  (270). Major efforts are needed in the next few years to perform the types of studies proposed in the preceding paragraphs, to sequence and clone all the putative  regulatory proteins (most importantly, APF and CBP), and to study the genetic regulation of gallstone disease in humans and in knockout mice, a process already  begun for cholesterol gallstone formation (278,279). Acknowledgments We thank Paulette Lechène de la Porte, Nicole Domingo, Bert Groen, and Andre van den Berg for their critical reviews of the manuscript. Dr. Ostrow especially  remembers Edward W. Moore, whose creative insights, during three decades of collaboration, led to the development of most of the concepts relating to calcium in  bile, and to Arthur Veis, who opened the door for application of biomineralization theory to gallstone formation. Dr. Lafont sends posthumous thanks to Jacques  Hauton, her former mentor, who guided her to the discovery of APF and the understanding of its multiple key roles in lipid metabolism and gallstone formation. References 1. Womack NA, Zeppa R, Irvin G. The anatomy of gallstones. Ann Surg 1963; 157:670–686. 2. Ostrow JD. Unconjugated bilirubin and cholesterol gallstone formation. Hepatology 1990; 12:219S–226S. 3. Lechène de la Porte P, Domingo N, van Wijland M, Groen AK, Ostrow JD, Lafont H. Distinct immuno­localization of mucin and other biliary proteins in human  cholesterol gallstones. J Hepatol 1996; 25:339–348. 4. Nakayama F. Quantitative microanalysis of gallstones. J Lab Clin Med 1969; 72:602–611. 5. Ananthakrishnan N, Rao BNB, Kapur BML. Studies on gall­stone composition: IV. Analysis of gall­stones by microchemical methods. Indian J Med Res 1975;  63:810–817. 6. Trotman BW, Morris TA III, Sanchez HM, Soloway RD, Ostrow JD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis. Identification and quantification by infrared  spectroscopy. Gastroenterology 1977; 72:495–498. 7. Robins SJ, Fasulo JM, Patton GM. Lipids of pigment gallstones. Biochim Biophys Acta 1982; 712:21–25. 8. Malet PF, Williamson CE, Trotman BW, Soloway RD. Composition of pigmented centers of cholesterol gallstones. Hepatology 1986; 6:477–481. 9. Moore EW. Biliary calcium and gallstone formation. Hepatology 1990; 12:206S–218S. 10. Grigorescu M, Suciu A, Acalovski M, Parian I, Duca S. The chemical composition of gallstones. Rom J Gastroenterol 1993; 2:195–197.

  

Page 347

11. Malet PF, Takabayashi A, Trotman BW, Soloway RD, Weston NE. Black and brown pigment gallstones differ in microstructure and microcomposition.  Hepatology 1984; 2: 227–234. 12. Kienzle H­F, Radtke J. Lokalisation und Verteilung von Calciumsalzen in Gallensteinen. Langenbecks Arch Chir 1980; 353:171–182. 13. Malet PF, Weston NE, Trotman BW, Soloway RD. Cyclic deposition of calcium salts during growth of cholesterol gallstones. In: Johari OM, ed. Scanning  Electron Microscopy. Vol 2. Chicago: SEM, 1985, pp 775–779. 14. Kaufman HS, Lillemoe KD, Magnusson TH, Frasca P, Pitt HA. Backscattered electron imaging and windowless energy dispersive x­ray microanalysis: a new  technique for gallstone analysis. Scanning Microsc 1990; 4:853–860. 15. Kaufman HS, Magnusson TH, Pitt HA, Frasca P, Lillemoe KD. The distribution of calcium salt precipitates in the core, peripery and shell of cholesterol, black  pigment and brown pigment gallstones. Hepatology 1994; 19:1124–1132. 16. Taylor DR, Crowther RS, Cozart JC, Sharrock P, Wu J, Soloway RD. Calcium carbonate in cholesterol gallstones: polymorphism, distribution and hypothesis  about pathogenesis. Hepatology 1995; 22:488–496. 17. Ohkubo H, Ostrow JD, Carr SH, Rege RV. Polymer networks in pigment and cholesterol gallstones assessed by equilibrium swelling and infrared spectroscopy.  Gastroenterology 1984; 87:805–814. 18. Soloway RD, Trotman BW, Ostrow JD. Pigment gallstones. Gastroenterology 1977; 72: 167–182. 19. Trotman BW, Ostrow JD, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: comparison of stone and bile composition. Am J Dig Dis 1974; 19:585–590. 20. Cetta F, DeNisi A, Malet PF, Soloway RD. Black and brown pigment gallstones differ in microstructure and microcomposition (letter). Hepatology 1986; 6:153– 154. 21. Soloway RD, Trotman BW, Maddrey WC, Nakayama F. Pigment gallstone composition in patients with hemolysis or infection/stasis. Dig Dis Sci 1986; 31:454– 460. 22. Trotman BW, Soloway RD. Pigment gallstone disease: summary of the National Institutes of Health­International Workshop. Hepatology 1982; 2:879–884. 23. Wosiewitz U. Limy bile and radiopaque, calcified gallstones: a combined analytical, radiographic and micromorphologic examination. Pathol Res 1980; 167:273– 286. 24. Been JM, Bills PM, Lewis D. Microstructure of gallstones. Gastroenterology 1979; 76: 548–555. 25. Bogren H, Larsson K. On the pigment in biliary calculi. Scand J Clin Lab Invest 1963; 15:569–572. 26. Ruiz de Aguiar A, Medina Nunez JA, Lopez Domingo MI, Villacorta Patino J, Leguey Jimenez S. Calcium carbonate in cholesterol gallstones. J Hepatol 1988;  6:71–79. 27. Srivastava AK, Lal K, Tandon RK. A layerwise quantitation of human cholesterol gallstone constituents. Ind J Med Res 1983; 77:733–738. 28. Bogren HG, Mutvei H, Renberg G. Scanning electron microscope studies of human gallstones after plasma etching. Ultrastruct Pathol 1995; 19:447–452. 29. Kodaka T, Mori R, Debari K, Takiguchi R, Higashi S. Backscattered electron imaging and energy­dispersive x­ray microanalysis studies of evidence for calcium  salt heterogeneity in fifteen gallstones from an elderly human. Scanning Microsc 1995; 9:907–920. 30. Moore EW. The role of calcium in the pathogenesis of gallstones: Ca2+ electrode studies of model bile salt solutions and other biologic systems. Hepatology 1984;  4:228S–243S. 31. Sutor DJ, Wilkie LI. Calcium in bile and calcium salts in gallstones. Clin Chim Acta 1977; 79:119–127. 32. Carey MC. Formation and growth of cholesterol gallstones: the new synthesis. In: Fromm H, Leuschner U, eds. Bile Acids—Cholestasis—Gallstones: Advances  in Basic and Clinical Bile Acid Research. Dordrecht: Kluwer, 1996, pp 147–175.

  

Page 348

33. Ostrow JD. The roles of calcium salts and matrix in gallstone formation. In: Meyer zum Büschenfelde KH, Paumgartner G, Schölmerich J, eds. Perspectives in  Gastroenterology. Munich: Urban & Schwarzenberg, 1995:143–152. 34. Lamont JT, Smith BF, Moore JRL. Role of gallbladder mucin in pathophysiology of gallstones. Hepatology 1984; 4:51S–56S. 35. Sutor DJ, Wooley SE. The organic matrix of gallstones. Gut 1974; 15:487–491. 36. Lamont JT, Ventola AS, Trotman BW, Soloway RD. Mucin glycoprotein content of human pigment gallstones. Hepatology 1983; 3:377–382. 37. Smith BF, Lamont JT. Identification of gallbladder mucin­bilirubin complex in human cholesterol gallstone matrix: effects of reducing agents on in vitro dissolution  of matrix and intact gallstones. J Clin Invest 1985; 76:439–445. 38. Pearson JP, Foster SNE. Mucus glycoprotein content of human cholesterol gallstones. Digestion 1987; 36:132–140. 39. Domingo N, Grosclaude J, Bekaert ED, Chapman MJ, Shimizu S, Ayrault­Jarrier M, Ostrow JD, Lafont H. Epitope mapping of the human biliary amphipathic  anionic polypeptide (APF): similarity with a calcium­binding protein (CBP) isolated from gallstones and bile and immunologic cross­reactivity with apolipoprotein A­I.  J Lipid Res 1992; 33:1419–1430. 40. Shimizu S, Sabsay B, Veis A, Ostrow JD, Rege RV, Dawes LG. Isolation of an acidic protein from cholesterol gallstones, which inhibits the precipitation of  calcium carbonate in vitro. J Clin Invest 1989; 84:1990–1996. 41. Ostrow JD. APF/CBP, an anionic polypeptide in bile and gallstones that may regulate calcium salt and cholesterol precipitation from bile. Hepatology 1992;  16:1493–1496. 42. Kestell MF, Sekijima J, Lee SP, Park HZ, Long M, Kaler EW. A calcium­binding protein in bile and gallstones. Hepatology 1992; 16:1315–1321. 43. Murray FE, Smith BF. Non­mucin glycoproteins in the matrix of human cholesterol gallstones. Scand J Gastroenterol 1991; 26:717–723. 44. Sutor DJ, Wooley SE. The sequential deposition of crystalline material in gallstones: evidence for changing gallbladder bile composition during the growth of some  stones. Gut 1974; 15:130–131. 45. Womack NA. The development of gallstones. Surg Gynecol Obstet 1971; 133:937–945. 46. Bills PM, Lewis D. A structural study of gallstones. Gut 1975; 16:630–637. 47. Westbroek P, DeJong EW. Biomineralization and Biological Metal Accumulation: Biological and Geological. Dordrecht: Riedel, 1982, pp 1–533. 48. Lowenstam HA, Weiner S. Mineralization by organisms and the evolution of biomineralization. In: Westbroek P, DeJong EW, eds. Biomineralization and  Biological Metal Accumulation. Dordrecht: Reidel, 1983, pp 191–203. 49. Veis A, Sabsay B. Bone and tooth formation: insights into biomineralization strategies. In: Westbroek P, DeJong EW, eds. Biomineralization and Biological Metal  Accumulation: Biological and Geological. Dordrecht: Riedel, 1982, pp 273–284. 50. Berman A, Hanson J, Leiserowitz L, Koetzle TF, Weiner S, Addadi L. Biological control of crystal texture: a widespread strategy for adapting crystal properties  to function. Science 1993; 259:776–779. 51. Afdhal NH, Ostrow JD, Koehler RK, Niu N, Groen AK, Veis A, Nunes DP, Offner GD. Interaction of bovine gallbladder mucin and calcium­binding protein:  effects on calcium phosphate precipitation. Gastroenterology 1995; 109:1661–1672. 52. Levy PF, Smith BF, Lamont JT. Human gallbladder mucin accelerates in vitro nucleation of cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87:270–275. 53. Smith BF, Lamont JT. Gallbladder mucin and gallstone formation. In: Cohen S, Soloway RD, eds. Gallstones. New York: Churchill Livingstone, 1985:101–111. 54. Lipsett PA, Hildreth J, Kaufman HS, Lillemoe KD, Pitt HA. Human gallstones contain pronucleating nonmucin glycoproteins that are immunoglobulins. Ann Surg  1994; 219: 25–33.

  

Page 349

55. Kibe A, Holzbach RT, LaRusso NF, Mao SJ. Inhibition of cholesterol crystal formation by apolipoproteins in supersaturated model bile. Science 1984; 225:514– 516. 56. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Ilson RG, Strasberg SM. Biliary proteins and the nucleation defect in cholesterol cholelithiasis. Gastroenterology 1987;  92: 867–875. 57. Dawes LG, Moore EW, Rege RV, Shimizu S, Ostrow JD. Canine bile contains anti­crystallization factors which inhibit precipitation of CaCO3. Hepatology 1991;  14:701–706. 58. Smith BF, Lamont JT. Bovine gallbladder mucin binds bilirubin in vitro. Gastroenterology 1983; 85:707–712. 59. Konikoff FM, Lechène de la Porte P, Laufer H, Domingo N, Lafont H, Gilat T. Calcium and the anionic polypeptide fracton (APF)have opposing effects on  cholesterol crystallization in model bile. J Hepatol 1997; 27:707–715. 60. Groen AK, Ottenhoff R, Jansen PLM, van Marle J, Tytgat GNJ. Effect of cholesterol nucleation­promoting activity on cholesterol solubilization in model bile. J  Lipid Res 1989; 30:51–58. 61. Groen AK, Noordam C, Drapers JAG, Egbers P, Jansen PLM, Tytgat GNJ. Isolation of a potent cholesterol nucleation­promoting activity from human  gallbladder bile: role in the pathogenesis of gallstone disease. Hepatology 1990; 11:525–533. 62. Siggaard­Andersen O, Thode J, Fogh­Andersen N. What is ionized calcium? Scand J Clin Lab Invest 1983; 43(suppl 165):11–16. 63. Moore EW. Role of calcium in the pathogenesis of gallstones with an hypothesis of structural requirements for Ca++­binding to proteins and bile acids. In: Barbara  L, Dowling RH, eds. Recent Advances in Bile Acid Research. New York: Raven Press, 1985, pp 109–143. 64. Rege RV, Moore EW, Nahrwold DL. Pathogenesis of calcium­containing gallstones: relationship of total calcium and free ionized Ca++ in canine gallbladder and  duct bile. Surg Forum 1985; 36:132–134. 65. Rege RV, Dawes LG, Moore EW. Biliary calcium secretion in the dog occurs primarily by passive convection and diffusion and is linked to bile flow. J Lab Clin  Med 1990; 115:593–602. 66. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Calcium in human gallbladder bile. J Lab Clin Med 1992; 120:875–884. 67. Gleeson D, Hood KA, Murphy GM, Dowling RH. Calcium and carbonate ion concentrations in gallbladder and hepatic bile. Gastroenterology 1992; 102:1707– 1716. 68. Knyrim K, Vakil N. Bile composition, microspheroliths, antinucleating activity, and gallstone calcification. Gastroenterology 1992; 103:552–559. 69. Rudnicki M, Jorgensen T, Thode J. Increased activity of ionized calcium in gall bladder bile in gallstone disease. Gut 1992; 33:1404–1407. 70. Sutor DJ, Wilkie LI, Jackson MJ. Ionised calcium in pathological human bile. J Clin Pathol 1980; 33:86–88. 71. Rege RV, Nahrwold DL, Moore EW. Absorption of biliary calcium from the canine gallbladder: protection against the formation of calcium­containing gallstones.  J Lab Clin Med 1987; 110:381–386. 72. Rege RV, Moore EW. Convective movement of Ca2+ ions across guinea pig gallbladder epithelium. Am J Physiol 1992; 262:G990–G995. 73. Ahrendt SA, Ahrendt GM, Pitt HA, Moore EW, Lillimoe KD. Hypercalcemia decreases bile flow and increases biliary calcium in the prairie dog. Surgery 1995;  117:435–442. 74. Rege RV, Lee MJ, Moore EW. The Gibbs­Donnan equilibrium: its effect on the distribution of calcium (Ca2+) across rabbit gallbladder epithelium (abstr).  Gastroenterology 1986; 90:1761. 75. Fogh­Andersen N, Thode J, Siggaard­Andersen O. Ionized calcium during dialysis and ultrafiltration. Scand J Clin Lab Invest 1983; 43(suppl 165):39–41. 76. Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore EW. Human gallbladder mucosal function: effect

  

Page 350

of concentration and acidification of bile on cholesterol and calcium solubility. Gastroenterology 1990; 99:1452–1459. 77. O'Grady SM, Wolters PJ. Sodium and chloride transport across the isolated porcine gallbladder. Am J Physiol 1989; 257:C45–C51. 78. Svanvik J. Role of gallbladder in modifying hepatic bile composition. In: Tavoloni N, Berk PD, eds. Hepatic Transport and Bile Secretion: Physiology and  Pathophysiology. New York: Raven Press, 1993:607–618. 79. Scarpa A. Measurements of cation transport with metallochromic indicators. Methods Enzymol 1979; 56:301–308. 80. Moore EW, Ostrow JD. Some Ca2+ electrodes misrepresent Ca2+ binding by bile salts (letter). Gastroenterology 1995; 109:662. 81. Thode J, Wandrup J, Aas F, Siggaard­Andersen O. Evaluation of a new semiautomatic electrode system for simultaneous measurement of ionized calcium and  pH. Scand J Clin Lab Invest 1982; 42:407–415. 82. Donovan JM, Leonard MR, Batta AK, Carey MC. Calcium affinity for biliary lipid aggregates in model biles: complementary importance of bile salts and lecithin.  Gastroenterology 1994; 107:831–846. 83. Moore EW, Ross JW. NaCl and CaCl2, activity coefficients in mixed aqueous solutions. J Appl Physiol 1965; 20:1332–1336. 84. Boink ABTJ, Gimpel JA, Maas AHJ. A comparison of four Ca2+ analyzers. Scand J Clin Lab Invest 1983; 43(suppl 165):17–19. 85. Bowers GN Jr, Rains TC. Measurement of total calcium in biological fluids: flame atomic absorption spectrometry. Methods Enzymol 1988; 158:302–319. 86. O'Brien CB, Malet PF, Saul SH, Shiau Y­F, Soloway RD. Mucosal and bulk phase gallbladder pH influences the calcium bilirubin composition of the surface  layer of cholesterol stones in man (abstr). Gastroenterology 1986; 90:1752. 87. Marteau C, Sastre B, Iconomidis N, Portugal H, Pauli A­M, Gérolami A. pH regulation in human gallbladder bile: study in patients with and without gallstones.  Hepatology 1990; 11:997–1002. 88. Buanes T, Grotmol T, Landsverk T, Raeder MG. Secretin empties bile duct cell cytoplasm of vesicles when it initiates ductular  Gastroenterology 1988; 95:417–424.

 secretion in the pig. 

89. Rege RV, Moore EW. Pathogenesis of calcium­containing gallstones: canine ductular bile, but not gallbladder bile, is supersaturated with calcium carbonate. J Clin  Invest 1986; 77:21–26. 90. Petersen KU, Wehner F, Winterhager JM. Na/H exchange at the apical membrane of guinea­pig gallbladder epithelium: properties and inhibition by cyclic AMP.  Pflugers Arch Eur J Physiol 1985; 405(suppl 1):S115–S120. 91. Heintze K, Petersen KU, Wood JR. Effects of bicarbonate on fluid and electrolyte transport by guinea pig and rabbit gallbladder: stimulation of absorption. J  Membr Biol 1981; 62:175–181. 92. Silviani V, Colombiani V, Heyries L, Gerolami A, Cartouzou G, Marteau C. Role of NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger in sodium absorption by the rabbit  gallbladder. Pflugers Arch Eur J Physiol 1996; 432:791–796. 93. Colombiani V, Silviani V, Marteau C, Lerique B, Cartouzou G, Gerolami A. Presence of the NHE3 isoform of the Na+/H+ exchanger in human gallbladder. Clin  Sci 1996; 91:209–212. 94. Jacyna MR, Ross PE, Hopwood D, Bouchier IAD. The effect of secretin on sodium ion absorption by the isolated human gallbladder. Aliment Pharmacol Therap  1989; 3:293–297. 95. Jacyna MR. Interactions between gall bladder bile and mucosa: relevance to gall stone formation. Gut 1990; 31:568–570. 96. Svanvik J, Allen B, Pellegrini C, Bernhoft R, Way L. Variations in concentrating function of the gallbladder in the conscious monkey. Gastroenterology 1984;  86:919–925.

  

Page 351

97. Igimi H, Yamamoto F, Lee SP. Gallbladder mucosal function: Studies in absorption and secretion in humans and cultured dog gallbladder epithelium. Am J Physiol  1992; 263:G69–G74. 98. Moser AJ, Abedin MZ, Cates JA, Giurgiu DI, Karam JA, Roslyn JJ. Converting gallbladder absorption to secretion: the role of intracellular calcium. Surgery  1996; 119:410–416. 99. Cates JA, Abedin MZ, Saunders­Kirkwood KD, Moser AJ, Giurgiu DI, Roslyn JJ. Protein kinase C regulates prairie dog gallbladder ion transport. Surgery  1995; 117:206–212. 100. Moser AJ, Abedin MZ, Giurgiu DI, Roslyn JJ. Octreotide promotes gallbladder absorption in prairie dogs: a potential cause of gallstones. Gastroenterology  1995; 108:1547–1555. 101. Conter RL, Roslyn JJ, Porter­Fink V, DenBesten L. Gallbladder absorption increases during early cholesterol gallstone formation. Am J Surg 1986; 151:184– 191. 102. Roslyn JJ, Doty JE, Pitt HA, Conter RL, DenBesten L. Enhanced gallbladder absorption during gallstone formation: the roles of cholesterol saturated bile and  gallbladder stasis. Am J Med Sci 1986; 292:75–80. 103. Giurgiu DI, Saunders­Kirkwood KD, Roslyn JJ, Abedin MZ. Sequential changes in biliary lipids and gallbladder ion transport during gallstone formation. Ann  Surg 1997; 225:382–390. 104. Jacyna MR, Ross PE, Hopwood D, Bouchier IAD. Sodium transport in the diseased human gallbladder and the effects of indomethacin. Clin Sci 1988; 75:147– 149. 105. Ostrow JD, Mukerjee P, Tiribelli C. Structure and binding of unconjugated bilirubin: relevance for physiological and pathophysiological function. J Lipid Res  1994; 35:1715–1737. 106. Ostrow JD, Celic L, Mukerjee P. Solvent partition of unconjugated bilirubin (B) from CHCl3 into bile salt solutions: evidence that affinity of B for bile salts  increases with ionization of B (abstr). Gastroenterology 1993; 104:A968. 107. Ostrow JD, Celic L, Webster CC, Mukerjee P. Binding of unconjugated bilirubin (UCB) to various bile salts at pH 9.0, assessed by solvent partition from  CHCl3 (abstr). Gastroenterology 1994; 106:A957. 108. D'Alagni M, Galantini L, Giglio E, Gavuzzo E, Scaramuzza L. Micellar aggregates of sodium glycocholate and sodium taurocholate and their interaction  complexes with bilirubin IX . J Chem Soc Faraday Trans 1994; 90:1523–1532. 109. Ostrow JD. Absorption by the gallbladder of bile salts, sulfobromophthalein, and iodipamide. J Lab Clin Med 1969; 74:482–494. 110. Ostrow JD. Absorption of bile pigments by the gallbladder. J Clin Invest 1967; 46:2035–2052. 111. Neiderhiser DH, Pineda FM, Hejduk LJ, Roth HP. Absorption of oleic acid by the guinea pig gallbladder. J Lab Clin Med 1971; 77:985–992. 112. Rege RV, Wallner EI, Neri KM, Moore EW. Absorption of free fatty acids (FFA) from guinea pig gallbladder: effects of the unstirred water layer (UWL).  Gastroenterology 1991; 100:A336. 113. Sutor DJ, Wilkie LI. Diurnal variations in pH of pathological gallbladder bile. Gut 1976; 17:971–974. 114. Selle JG, Altemeier WA, Fullen WD, Goldsmith RE. Cholelithiasis in hyperparathyroidism. Arch Surg 1972; 105:369–374. 115. Werner S, Hjern B, Sjoberg HE. Primary hyperparathyroidism. Acta Chir Scand 1974; 140:618–625. 116. Jones CA, Hofmann AF, Mysels KJ, Roda A. The effect of calcium and sodium ion concentration on the properties of dilute aqueous solutions of glycine  conjugated bile salts: phase behavior and solubility products of the calcium salts of the common glycine conjugated bile acids. J Colloid Interface Sci 1986; 114:452– 470.

  

Page 352

117. Gu J­J, Hofmann AF, Ton­Nu H­T, Schteingart CD, Mysels KJ. Solubility of calcium salts of unconjugated and conjugated natural bile acids. J Lipid Res 1992;  33:635–646. 118. Rossi SS, Converse JL, Hofmann AF. High pressure liquid chromatographic analysis of conjugated bile acids in human bile: simultaneous resolution of sulfated  and unsulfated lithocholyl amidates and the common conjugated bile acids. J Lipid Res 1987; 28:589–595. 119. Ostrow JD. Metabolism of bile salts in cholestasis in humans. In: Tavaloni N, Berk PD, eds. Hepatic Transport and Bile Secretion; Physiology and  Pathophysiology. New York: Raven Press, 1993, pp 673–712. 120. Carey MC, Lamont JT. Cholesterol gallstone formation: 1. Physical chemistry of bile and biliary lipid secretion. In: Boyer JL, Ockner RK, eds. Progress in Liver  Diseases. Philadelphia: Saunders, 1992, pp 139–163. 121. Moore EW, Verine HJ. Pathogenesis of pancreatic and biliary CaCO3, lithiasis: the solubility product (K sp) of calcite determined with the Ca+ + electrode. J  Lab Clin Med 1985; 106:611–618. 122. Moore EW, Verine HJ. Pancreatic calcification: Formation constants of CaHCO3 and  241:G182–G190.

 complexes determined with Ca2+ electrode. Am J Physiol 1981; 

123. Moore EW, Kelley EH, Keith FB, Krell H. Pathogenesis of phosphate­containing gallstones: II. CaHPO4, precipitation and solubility product constant (K'sp)  (abstr). Gastroenterology 1989; 96:A632. 124. Moore EW, Kelley EH, Keith FB, Krell H. Pathogenesis of phosphate­containing gallstones: IV. Kinetics of CaHPO4 precipitation: the metastable phase— crystallization times (abstr). Gastroenterology 1989; 96:A633. 125. Nancollas GH. Crystallization in bile. Hepatology 1984; 4:169S–172S. 126. Moore EW, Keith FB, Krell H, Kelley EH. Pathogenesis of phosphate­containing gallstones: III. Kinetics of CaHPO4 precipitation—nucleation and  crystallization (abstr). Gastroenterology 1989; 96:A632. 127. Moore EW, Keith FB, Krell H, Kelley EH. Pathogenesis of phosphate­containing gallstones: VI. Gallbladder bile is unsaturated with CaHPO4 in patients with  gallstones or morbid obesity (abstr). Gastroenterology 1989; 96:A633. 128. Krell H, Ritzmann A, Feger R, Moore EW. Inorganic phosphate in bile: concentrations in bile of rat, hamster, and man (abstr). Hepatology 1989; 10:738. 129. Sutor DJ, Wilkie LI. Inorganic phosphorus in human bile. Clin Chim Acta 1977; 77:31–36. 130. Boonyapisit ST, Trotman BW, Ostrow JD. Unconjugated bilirubin and the hydrolysis of conjugated bilirubin in gallbladder bile of patients with cholelithiasis.  Gastroenterology 1978; 74:70–74. 131. Fevery J, Blanckaert N, Leroy P, Michiels R, Heirwegh KPM. Analysis of bilirubins in biological fluids by extraction and thin­layer chromatography of the intact  tetrapyrroles: application to bile of patients with Gilbert's syndrome, hemolysis, or cholelithiasis. Hepatology 1983; 3:177–183. 132. Shimizu S, Rege RV, Webster CC, Ostrow JD, Celic L, Moore EW. High­affinity binding of ionized calcium (Ca2+) by conjugated bilirubin (abstr). Hepatology  1987; 7:1110. 133. Ostrow JD, Murphy NH. Isolation and properties of conjugated bilirubin from bile. Biochem J 1970; 120:311–327. 134. Reuben A, Howell KE, Boyer JL. Effects of taurocholate on the size of mixed lipid micelles and their associations with pigment and proteins in bile. J Lipid Res  1982; 23:1039–1052. 135. Verkade HJ, Havinga R, Gerding A, Vonk RJ, Kuipers F. Mechanism of bile acid­induced biliary lipid secretion in the rat: effect of conjugated bilirubin. Am J  Physiol 1993; 264:G462–G469. 136. Trotman BW, Nair CR, Bernstein SE. Monoconjugated bilirubin is a major component of hemolysis­induced gallstones in mice. Hepatology 1988; 8:919–924.

  

Page 353

137. Vadali M, Ostrow JD, Mukerjee P, Celic L. Aqueous solubility products of calcium bilirubinate salts determined by solvent partition from chloroform into buffer  solutions of CaCl2, (abstr). Proceedings of the 12th International Bile Acid Meeting, 1992. 138. Ho K­J, Hsu SC, Chen JS, Ho LHC. Human biliary b ­glucuronidase: correlation of its activity with deconjugation of bilirubin in the bile. Eur J Clin Invest 1986;  16:361–367. 139. Shull SD, Wagner CI, Trotman BW, Soloway RD. Factors affecting bilirubin excretion in patients with cholesterol or pigment gallstones. Gastroenterology 1977;  72:625–629. 140. Hahm JS, Ostrow JD, Mukerjee P, Celic L. Ionization and self­association of unconjugated bilirubin, determined by rapid solvent partition from chloroform, with  further studies of bilirubin solubility. J Lip Res 1992; 33:1123–1137. 141. Carey MC, Koretsky AP. Self association of unconjugated bilirubin IXa  in aqueous solution at pH 10 and physico­chemical interactions with bile salt monomers  and micelles. Biochem J 1979; 179:675–689. 142. Ostrow JD, Celic L, Mukerjee P. Unconjugated bilirubin (B) dianions ''co­micellize" with taurocholate (TC): evidence from partition of B from CHCl3 into  aqueous TC solutions (abstr). Hepatology 1991; 14:150A. 143. Sutor DJ, Wilkie LI. The crystalline salts of calcium bilirubinate in human gallstones. Clin Sci Mol Med 1977; 53:101–103. 144. Malet PF, Dabezies MA, Huang G, Long WB, Gadacz TR, Soloway RD. Quantitative infrared spectroscopy of common bile duct gallstones. Gastroenterology  1988; 94:1217–1221. 145. Crowther RS, Soloway RD. Pigment gallstone pathogenesis from man to molecules. Semin Liver Dis 1990; 10:171–180. 146. McDonagh AF, Lightner DA. Phototherapy and photobiology of bilirubin. Semin Liver Dis 1988; 8:272–281. 147. Maki T. Pathogenesis of calcium bilirubinate gallstones: Role of E. coli, b ­glucuronidase and coagulation by inorganic ions, polyelectrolytes and agitation. Ann  Surg 1966; 164:90–100. 148. Maki T, Sato T, Saitoh T. A study on the activity of b ­glucuronidase in bile in connection with precipitation of calcium bilirubinate. Tohoku J Exp Med 1962;  77:179–186. 149. Wosiewitz U, Althoff J, Langhans P. Beta­glucuronidase activity in human cholesterol and pigment stone bile. Z Gastroenterol 1982; 12:237–239. 150. Ho K­J. Human b ­glucuronidase: Studies on the effects of pH and bile acids in regard to its role in the pathogenesis of cholelithiasis. Biochim Biophys Acta  1985; 827:197–206. 151. Ho K­J, Ho LHC. Inhibitory effect of bile acids on human b ­glucuronidase activity at its optimal pH. Proc Soc Exp Biol Med 1981; 167:304–309. 152. Ho Y­D, Ho K­J. Biliary D­glucaric acid: Its quantitation and preventive role in gallstone formation. Scand J Gastroenterol 1990; 25:631–640. 153. Matsushiro T, Suzuki N, Sato T, Maki T. Effects of diet on glucaric acid concentraton in bile and the formation of calcium bilirubinate gallstones.  Gastroenterology 1977; 72:630–633. 154. Liu Y­L, Lam K, Tang YJ, Gumerlock PH, Lee SP, Silva J Jr, Leung JW. Detection of bacterial b ­glucuronidase gene in human intrahepatic stone by the  polymerase chain reaction (abstr). Gastroenterology 1997; 112:A515. 155. Swidsinski A, Khilkin M, Pahlig H, Swidsinski S, Priem F. Time dependent changes in the concentration and type of bacterial sequences found in cholesterol  gallstones. Hepatology 1998; 27:662–665. 156. Liu Y­L, Lam K, Shi X­B, Gumerlock PH, Tang YJ, Lee SP, Leung JW. Analysis of Clostridium sp. in human intrahepatic stones by SSCP method (abstr).  Gastroenterology 1997; 112:A1322. 157. Lee DK, Tarr PI, Haigh WG, Lee SP. Bacterial DNA in mixed cholesterol gallstones. Am J Gastroenterol 1999; 94:3502–3506.

  

Page 354

158. Rege RV, Webster CC, Ostrow JD, Carr SH, Ohkubo H. Validation of infrared spectroscopy for assessment of vinyl polymers of bile­pigment gallstones.  Biochem J 1984; 224:871–876. 159. Zilm KW, Grant DM, Englert E Jr, Straight RC. The use of 13C nuclear magnetic resonance for the characterization of cholesterol and bilirubin pigment  composition of human gallstones. Biochem Biophys Res Commun 1980; 93:857–866. 160. Woolfenden WR, Grant DM, Straight RC, Englert E Jr. Chemical characterization of pigment gallstones, using 13C­nuclear magnetic resonance analysis.  Biochem Biophys Res Commun 1982; 107:684–694. 161. Shankland W. The ionic behavior of fatty acids solubilized by bile salts. J Colloid Interface Sci 1970; 34:9–25. 162. Sallee VL. Apparent monomer activity of saturated fatty acids in micellar bile salt solutions measured by a polyethylene partitioning system. J Lipid Res 1974;  15:56–64. 163. Sutor DJ. Calcium palmitate and  ­palmitic acid in gallstones. Gut 1970; 11:618–619. 164. Ahlberg J, Curstedt T, Einarsson K, Sjövall J. Molecular species of biliary phosphatidylcholine in gallstone patients: the influence of treatment with cholic acid  and chenodeoxycholic acid. J Lipid Res 1981; 22:404–409. 165. Wosiewitz U, Schenk J, Sabinski F, Schmack B. Investigations on common bile duct stones. Digestion 1983; 26:43–52. 166. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman WJ, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 167. Shiffman ML, Carithers RCJ, Mendez­Picon G, Moore EW. Duct bile is supersaturated with CaCO3 in man: implications for the pathogenesis of gallstone  formation (abstr). Hepatology 1987; 7:110. 168. Nancollas GH, Sawada K, Schuttringer E. Mineralization reactions involving calcium carbonates and phosphates. In: Westbroek P, DeJong EW, eds.  Biomineralization and Biological Metal Accumulation. Dordrecht: Reidel, 1983, pp 155–169. 169. Qiu SM, Wen G, Hirakawa N, Soloway RD, Hong NK, Crowther RS. Glycochenodeoxycholic acid inhibits calcium phosphate precipitation in vitro by  preventing the transformation of amorphous calcium phosphate to calcium hydroxyapatite. J Clin Invest 1991; 88:1265–1271. 170. Kaplun A, Talmon Y, Konikoff FM. Rubin M, Eitan A, Tadmor M, Lichtenberg D. Direct visualization of lipid aggregates in native human bile by light and cryo­ transmission electron­microscopy. FEBS Lett 1994; 340:78–82. 171. Wang DQH, Carey MC. Complete mapping of crystallization pathways during cholesterol precipitation from model bile: influence of physical­chemical variables  of pathophysiologic relevance and identification of a stable liquid crystalline state in cold, dilute and hydrophobic bile­salt containing systems. J Lipid Res 1996;  37:606–630. 172. Wang DQH, Carey MC. Characterization of crystallization pathways during cholesterol precipitation from human gallbladder biles: identical pathways to  corresponding model biles with three predominating sequences. J Lipid Res 1996; 37:2539–2549. 173. Holzbach RT. Recent progress in understanding cholesterol crystal nucleation as a precursor to human gallstone formation. Hepatology 1986; 6:1403–1406. 174. Afdhal NH, Niu N, Nunes DP, Bansil R, Cao X, Gantz D, Small DM, Offner GD. Mucin­vesicle interactions in model bile: evidence for vesicle aggregation and  fusion before cholesterol crystal formation. Hepatology 1995; 22:856–865. 175. Halpern Z, Dudley MA, Lynn MP, Nader JM, Breuer AC, Holzbach RT. Vesicle aggregation in model systems of supersaturated bile: relation to crystal  nucleation and lipid composition of the vesicular phase. J Lipid Res 1986; 27:295–306. 176. Halpern Z, Dudley MA, Kibe A, Lynn MP, Breuer AC, Holzbach RT. Rapid vesicle formation and aggregation in abnormal human bile: a time­lapse video­ enhanced contrast microscopy study. Gastroenterology 1986; 90:875–885.

  

Page 355

177. Konikoff FM, Laufer H, Messer G, Gilat T. Monitoring cholesterol crystallization from lithogenic model bile by time­lapse density gradient ultracentrifugation. J  Hepatol 1997; 26:703–710. 178. Weiner S, Addadi L. Acidic macromolecules of mineralized tissues: the controllers of crystal formation. Trends Biochem Sci 1991; 16:252–256 179. Moradian­Oldak J, Frolow F, Addadi L, Weiner S. Interactions between acidic matrix macromolecules and calcium phosphate ester crystals: relevance to  carbonate apatite formation in biomineralization. Proc R Soc Lond B 1992; 247:47–55. 180. Addadi L, Weiner S. Interactions between acidic proteins and crystals: stereochemical requirements for biomineralization. Proc Natl Acad Sci USA 1985;  82:4110–4114. 181. Marteau C, Portugal H, Pauli A­M, Gerolami A. Effect of glycoursodeoxycholate on precipitation of calcium carbonate. Hepatology 1985; 5:1209–1212. 182. Busch N, Lammert F, Marschall H­U, Matern S. A new subgroup of lectin­bound biliary proteins binds to cholesterol crystals, modifies crystal morphology, and  inhibits cholesterol crystallization. J Clin Invest 1995; 96:3009–3015. 183. Maki T, Matsushiro T, Suzuki N, Nakamura N. Role of sulfated glycoprotein in gallstone formation. Surg Gynecol Obstet 1971; 132:846–851. 184. Smith BF, Lamont JT. Hydrophobic binding properties of bovine gallbladder mucin. J Biol Chem 1984; 259:12170–12177. 185. Smith BF. Human gallbladder mucin binds biliary lipids and promotes cholesterol crystal nucleation in model bile. J Lipid Res 1987; 28:1088–1097. 186. Nancollas GH, Tomson MB. The precipitation of biological materials. Faraday Discuss 1976; 61:175–183. 187. Moreno EC, Varughese K, Hay DI. Effect of human salivary proteins on the precipitation kinetics of calcium phosphate. Calcif Tissue Int 1979; 28:7–16. 188. Schlesinger DH, Hay DI. Complete covalent structure of statherin, a tyrosine­rich acidic peptide which inhibits calcium phosphate precipitation from human  parotid saliva. J Biol Chem 1977; 252:1689–1695. 189. Nakagawa Y, Abram V, Kezdy FJ, Kaiser ET. Purification and characterization of the principal inhibitor of calcium oxalate monhydrate crystal growth in human  urine. J Biol Chem 1983; 258:12594–12600. 190. Nakagawa Y, Ahmed M, Hall SL, DeGanello S, Coe FL. Isolation from human calcium oxalate renal stones of a glycoprotein inhibitor of calcium oxalate crystal  growth: evidence that nephrocalcin from patients with calcium oxalate nephrolithiasis is deficient in  ­carboxyglutamic acid. J Clin Invest 1987; 79:1782–1787. 191. DeCaro A, Multigner L, Lafont H, Lombardo D, Sarles H. The molecular characteristics of a human pancreatic acidic phosphoprotein that inhibits calcium  carbonate crystal growth. Biochem J 1984; 222:669–677. 192. Bernard JP, Adrich Z, Montalto G, DeCaro A, De Reggi M, Sarles H, Dagorn JC. Inhibition of nucleation and crystal growth of calcium carbonate by human  lithostatine. Gastroenterology 1992; 103:1277–1284. 193. Okido M, Soloway RD, Crowther RS. Inhibition of vaterite (CaCO3) formation by a calcium­binding protein from black pigment gallstones (abstr).  Gastroenterology 1993; 104:A968. 194. van den Berg AA, van Buul JD, Tytgat GNJ, Ostrow JD, Groen AK. Cholesterol gallstone growth in model biles is inversely related to cholesterol crystal  formation. Gastroenterology 1998; 114:G2237. 195. Strous GJ, Dekker J. Mucin­type glycoproteins. In: Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. Boca Raton, FL: CRC Press, 1992, pp 57–92. 196. Smith BF, Peetermans JA, Tanaka T, Lamont JT. Subunit interactions and physical properties of bovine gallbladder mucin. Gastroenterology 1989; 97:179– 187. 197. Matsushiro T, Nemoto T, Endo M, Yosizawa Z. Glycoproteins and sulfated glycoproteins isolated from human bile. Clin Chim Acta 1970; 30:645–655.

  

Page 356

198. Lee SP, Lim TH, Scott AJ. Carbohydrate moieties of glycoproteins in human hepatic and gallbladder bile, gallbladder mucosa and gallstones. Clin Sci Mol Med  1979; 56:533–538. 199. Stanley RA, Lee SP, Roberton AM. Heterogeneity in gastrointestinal mucins. Biochim Biophys Acta 1983; 760:262–269. 200. van Wijland MJA, Klinkspoor JH, de Wit LT, Oude Elferink RPJ, Tytgat GNJ, Groen AK. Heterogeneity of human gallbladder mucin in bile. Clin Sci 1994;  86:67–74. 201. Klinkspoor JH, van Wijland MJA, Koeleman CAM, van Dijk W, Tytgat GNJ, Groen AK. Heterogeneity of human biliary mucin: functional implications. Clin  Sci 1994; 86:75–82. 202. Afdhal NH, Offner GD, Smith BF. Characterization of bovine gallbladder mucin: amino acid sequences of tryptic peptides from the glycosylated domain of the  protein core. Gastroenterology 1990; 99:1493–1501. 203. Afdhal NH, Offner GD, Murray FE, Troxler RF, Smith BF. Isolation and characterization of peptides from the protein core of bovine gallbladder mucin.  Gastroenterology 1990; 98:1633–1641. 204. Nunes DP, Keates AC, Afdhal NH, Offner GD. Bovine gall­bladder mucin contains two distinct tandem repeating sequences: evidence for scavenger receptor  cysteine­rich repeats. Biochem J 1995; 310(pt 1):41–48. 205. Keates AC, Nunes DP, Afdhal NH, Troxler RF, Offner GD. Molecular cloning of a major human gallbladder mucin: complete C­terminal sequence and  genomic organization of MUC5B. Biochem J 1997; 324(pt 1):295–303. 206. Shiffman ML, Smith BF, Hirsch JI, Moore EW. Ca++­binding to bovine gallbladder mucin: high affinity but low capacity (abstr). Hepatology 1989; 10:601. 207. Sterling RK, Shiffman ML, Smith BF, Moore EW. Ca2+­binding by gallbladder mucin (GBM) is related to sialic acid content (abstr). Hepatology 1992;  16:155A. 208. Smith BF, Lamont JT. The central issue of cholesterol gallstones. Hepatology 1986; 6:529–531. 209. Malet PF, Deng S­Q, Soloway RD. Gallbladder mucin and cholesterol and pigment gallstone formation in hamsters. Scand J Gastroenterol 1989; 24:1055– 1060. 210. Lee SP, Nicholls JF. Nature and composition of biliary sludge. Gastroenterology 1986; 90:677–686. 211. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1988; 95:508–523. 212. Gallinger S, Taylor RD, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. The effect of mucous glycoprotein on nucleation time of human bile. Gastroenterology  1985; 89:648–658. 213. Lee TJ, Smith BF. Bovine gallbladder mucin promotes cholesterol crystal nucleation from cholesterol­transporting vesicles in supersaturated model bile. J Lipid  Res 1989; 30:491–498. 214. Afdhal NH, Niu N, Nunes DP, Bansil R, Caoxx, Gantz D, Small DM, Offner GD. Mucin­vesicle interaction in model bile: evidence for vesicle aggregation and  fusion before cholesterol crystal formation. Hepatology 1995; 22:856–865. 215. Afdhal NH, Niu N, Gantz D, Small DM, Smith BF. Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrate crystal growth in model bile.  Gastroenterology 1993; 104:1515–1523. 216. van den Berg AA, van Buul JD, Tytgat GNJ, Groen AK, Ostrow JD. Mucins and calcium phosphate precipitates additively stimulate cholesterol crystallization. J  Lipid Res 1998; 39:1744–1751. 217. de Bruijn MAC, Goldhoorn BG, Zijlstra AIM, Tytgat GNJ, Groen AK. Interaction of cholesterol­crystallization promoting proteins with vesicles. Biochem J  1995; 305:93–96. 218. Qiu SM, Wen G, Wen J, Soloway RD, Crowther RS. Interaction of human gallbladder mucin with calcium hydroxyapatite: binding studies and the effect on  hydroxyapatite formation. Hepatology 1995; 21:1618–1624.

  

Page 357

219. Lee SP. Hypersecretion of mucus glycoprotein by the gallbladder epithelium in experimental cholelithiasis. J Pathol 1981; 134:199–207. 220. Rege RV, Nahrwold DL. Animal models of pigment gallstone disease. J Surg Res 1987; 43:196–203. 221. Rege RV, Dawes LG, Ostrow JD. Animal models of pigment gallstones. In: Cornelius CE, ed. Animal Models in Liver Research. Orlando, FL: Academic Press,  1993, pp 257–287. 222. Rege RV, Ostrow JD. Animal models of pigment and cholesterol gallstone disease. In: Muraca M, ed. Methods in Hepatobiliary Research. Boca Raton, FL:  CRC Press, 1995, pp 203–243. 223. Lee SP, Lamont JT, Carey MC. Role of gallbladder mucus hypersecretion in the evolution of cholesterol gallstones: studies in the prairie dog. J Clin Invest 1981;  67:1712–1723. 224. Lee SP, Carey MC, Lamont JT. Aspirin prevention of cholesterol gallstone formation in prairie dogs. Science 1981; 211:1429–1431. 225. O'Leary DP, LaMorte WW, Scott TE, Booker ML, Stevenson J. Inhibition of prostaglandin synthesis fails to prevent gallbladder mucin hypersecretion in the  cholesterol­fed prairie dog. Gastroenterology 1991; 101:812–820. 226. Cohen BI, Mosbach EH, Ayyad N, Yashii M, McSherry CK. Aspirin does not inhibit cholesterol cholelithiasis in two established animal models.  Gastroenterology 1991; 101:1109–1116. 227. Broomfield PH, Chopra R, Sheinbaum RC, Bonorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodeoxycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. N Engl J Med 1988; 319:1567–1572. 228. Harvey PRC, Rupar CA, Gallinger S, Petrunka CN, Strasberg SM. Quantitative and qualitative comparison of gallbladder mucus glycoprotein from patients  with and without gall stones. Gut 1986; 27:374–381. 229. Shiffman ML, Shamburek RD, Schwartz CC, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Gallbladder mucin, arachidonic acid, and bile lipids in patients who  develop gallstones during weight reduction. Gastroenterology 1993; 105:1200–1208. 230. Trotman BW, Bongiovanni MB, Kahn MJ, Bernstein SE. A morphologic study of the liver and gallbladder in hemolysis­induced gallstone disease in mice.  Hepatology 1982; 2:863–869. 231. Neiderhiser DH, Morningstar WA, Roth HP. Absorption of lecithin and lysolecithin by the gallbladder. J Lab Clin Med 1973; 82:891–897. 232. Neiderhiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res 1976; 17:117–124. 233. Gerlarden RT, Rose RC. Electrical properties and diffusion potentials in the gallbladder of man, monkey, dog, goose and rabbit. J Membrane Biol 1974; 19:37– 54. 234. Shiau Y­F, Kelemen RJ, Reed MA. Acidic mucin layer facilitates micelle dissociation and fatty acid diffusion. Am J Physiol 1990; 259:G671–G675. 235. Wallner EI, Moore EW, Rege RV. Amiloride decreases butyrate permeability across guinea pig gallbladder (abstr). Hepatology 1991; 14:268A. 236. Lafont H, Domingo N, Groen AK, Kaler EW, Lee SP, Koehler RK, Ostrow JD, Veis A. APF/CBP, the small, amphipathic, anionic protein(s) in bile and  gallstones, consists of lipid­binding and calcium­binding forms. Hepatology 1997; 25:1054–1063. 237. Domingo N, Lafont H, Halpern Z, Peled Y, Grosclaude J, Gilat T. Anionic polypeptide fraction (APF) in bile of patients with and without gallstones. Hepatology  1993; 17:778–780. 238. Martigne M, Domingo N, Lechène de la Porte PL, Lafont H, Hauton JC. Identification and localization of the apoprotein fraction of the bile lipoprotein complex  in human gallstones. Scand J Gastroenterol 1988; 23:731–737. 239. Hauton JC. The apoprotein of the bile lipoprotein complex (apo­BLC). In: Fisher MM,

  

Page 358

Goresky CA, Shaffer EA, Strasberg SM, eds. Gallstones. New York: Plenum Press, 1979, pp 71–87. 240. Martigne M, Domingo N, Lafont H, Nalbone G, Hauton JC. Purification of the human anionic polypeptide fraction of the bile lipoprotein complex by zonal  ultracentrifugation. Lipids 1985; 20:884–889. 241. Okido M, Shimizu S, Ostrow JD, Nakayama F. Isolation of a calcium regulatory protein from black pigment gallstones: similarity with a protein from cholesterol  gallstones. Hepatology 1992; 15:1079–1085. 242. Suzuki H, Terada T. Removal of dodecyl sulfate from protein solution. Anal Biochem 1988; 172:259–263. 243. Nalbone G, Lafont H, Vigne JL, Domingo N, Lairon D, Chabert C, Lechène de la Porte P, Hauton JC. The apoprotein fraction of the bile lipoprotein complex:  isolation, partial characterization and phospholipid binding properties. Biochimie 1979; 61:1029–1041. 244. Nalbone G, Lafont H, Lairon D, Vigne JL, Domingo N, Leonardi J, Hauton JC. Immunogenicity of the apoprotein of the bile lipoprotein complex. Biochimie  1978; 60:691–694. 245. Halpern Z, Lafont H, Arad J, Domingo N, Peled Y, Konikoff FM, Gilat T. The distribution of the biliary anionic polypeptide fraction between cholesterol  carriers in bile and its effects on nucleation. J Hepatol 1994; 21:979–983. 246. Domingo N, Botta D, Martigne­Cros M, Lechène de la Porte P, Pak­Leung P, Hauton JC, Lafont H. Evidence for the synthesis and secretion of APF—a bile  lipid associated protein—by isolated rat hepatocytes. Biochim Biophys Acta 1990; 1044:243–248. 247. Domingo N, Chanussot F, Botta D, Reynier MO, Crotte C, Hauton JC, Lafont H. Modulating effects of bile salt hydrophobicity on bile secretion of the major  protein of the bile lipoprotein complex. Lipids 1993; 28:883–887. 248. Chanussot F, Domingo N. Tuchweber B, Lafont H, Yousef IB. Influence of dehydrocholic and cholic acid infusions on the biliary secretion of anionic  polypeptide fraction, the major apoprotein of the biliary lipoprotein complex. Scand J Gastroenterol 1992; 27:238–242. 249. Verkade HJ, Kuipers F, Domingo N, Havinga R, Leonardi J, Vonk RJ, Lafont H. Biliary secretion of anionic polypeptide fraction is not coupled to that of  phospholipids and cholesterol in rats. Hepatology 1997; 25:38–47. 250. Toth JL, Harvey PRC, Upadyha GA, Strasberg SM. Albumin absorption and protein secretion by the gallbladder in man and in the pig. Hepatology 1990;  12:729–737. 251. Keulemans YCA, Mok KS, de Wit LT, Gouma DJ, Groen AK. Hepatic bile versus gallbladder bile; a comparison of protein and lipid concentration and  composition in cholesterol gallstone patients. Hepatology 1998; 28:11–16. 252. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of binding of ionized calcium on the in vitro nucleation of cholesterol and calcium bilirubinate in  human gallbladder bile. Gut 1986; 28:1382–1386. 253. Neithercut WD. Effect of calcium, magnesium and sodium ions on in vitro nucleation of human gall bladder bile. Gut 1989; 30:665–670. 254. Gourdin TG, Afdhal NH, Niu N, Smith BF. Calcium augments binding of bilirubin to bovine gallbladder mucin (abstr). Hepatology 1990; 12:899. 255. Niu N, Gourdin TG, Smith BF. Calcium (Ca++) augments hydrophobic binding properties of bovine gallbladder mucin (BGM) (abstr). Gastroenterology 1990;  98:A615. 256. Teramen K. Tazuma S, Ohya T, Kajiyama G. Comparative effects of biliary concanavalin A­bound glycoproteins and calcium ion on cholesterol crystal  nucleation and growth in model bile. J Gastroenterol 1995; 30:500–507. 257. Carey MC, Cohen DE. Biliary transport of cholesterol in vesicles, micelles and liquid crystals. In: Paumgartner G, Stiehl A, Gerok W, eds. Bile Acids and the  Liver. Lancaster, UK: MTP Press, 1986, pp 287–300. 258. Martigne M, Meli B, Mahlberg F, Domingo N, Chanussot F, Lafont H, Hauton JC. Detection and characterization of anionic polypeptidic fraction binding sites  in rat liver

  

Page 359

plasma membranes and cultured hepatocytes. Biochim Biophys Acta 1989; 979:341–346. 259. Martigne M, Domingo N, Chanussot F, Nalbone G, Lafont H, Hauton JC. Effect of bile anionic polypeptidic fraction on the fate of cholesterol carried by  liposomes in the rat. Proc Soc Exp Biol Med 1988; 187:229–234. 260. Offner GD, Gong D, Afdhal NH. Identification of a 130­kilodalton human biliary concanavalin A binding protein as aminopeptidase N. Gastroenterology 1994;  106:755–762. 261. Harvey PRC, Strasberg SM. Will the real cholesterol­nucleating and antinucleating proteins please stand up? (editorial). Gastroenterology 1993; 104:646–650. 262. Van der Meer R, De Vries HT. Differential binding of glycine­ and taurine­conjugated bile acids to insoluble calcium phosphate. Biochem J 1985; 22:265–268. 263. Govers MJAP, Termont DSML, Van Aken GA, Van der Meer R. Characterization of the adsorption of conjugated and unconjugated bile acids to insoluble,  amorphous calcium phosphate. J Lipid Res 1994; 35:741–748. 264. Qiu SM, Soloway RD, Crowther RS. Interaction of bile salts with calcium hydroxyapatite: inhibitors of apatite formation exhibit high­affinity premicellar binding.  Hepatology 1992; 16:1280–1289. 265. Jüngst D, Lang T, Huber P, Lange V, Paumgartner G. Effect of phospholipids and bile acids on cholesterol nucleation time and vesicular/micellar cholesterol in  gallbladder bile of patients with cholesterol stones. J Lipid Res 1993; 34:1457–1464. 266. Konikoff FM, Cohen DE, Carey MC. Phospholipid molecular species influence crystal habits and transition sequences of metastable intermediates during  cholesterol crystallization from bile salt­rich model bile. J Lipid Res 1994; 35:60–70. 267. Lafont S, Rapaport H, Sömjen GJ, Renault A, Howes PB, Kjaer K, Als­Nielsen J, Lieserowitz L, Lahav M. Monitoring the nucleation of crystalline films of  cholesterol on water and in the presence of phospholipids. J Phys Chem B 1998; 102:761–765. 268. Verder JM. Les inhibiteurs macromoleculaires de cristallisation dans la salive et dans le bile. Nephrologie 1993; 14:251–255. 269. Heuman DM. Quantitative estimation of the hydrophobic­hydrophilic balance of mixed bile 2salt solutions. J Lipid Res 1989; 30:719–730. 270. de Bruijn MAC, Mok KS, Out T, Tytgat GNJ, Groen AK. Immunoglobulins and  1­ acid glycoprotein do not contribute to the cholesterol crystallization­ promoting effect of concanavalin A­binding biliary protein. Hepatology 1994; 20:626–632. 271. Keulemans YCA, Mok KS, Gouma DJ, Groen AK. The role of concanavalin A­binding fraction in cholesterol crystallization in native human bile. J Hepatol  1997; 27:1041–1050. 272. Trotman BW, Morris TA III, Cheney HM, Ostrow JD, Sanchez HM, Soloway RD, Conn HO. Pigment gallstone composition in cirrhotic and non­cirrhotic  subjects. Am J Dig Dis 1978; 230:872–876. 273. Liu C­H, Chen G­H, Soloway RD, Wu J­G. Comparing core, rim and peripheral composition of intraductal gallstones with pathogenesis by infrared  spectroscopy (abstr). Gastroenterology 1997; 112:A1322. 274. Stewart L, Oesterle A, Erden I, Way LW. Infectious and sterile gallstones: morphology, chemical composition, and bacterial beta­glucuronidase production  (abstr). Gastroenterology 1997; 112:A1477. 275. Higashijima H, Ichimiya H, Nakano T, Yamashita H, Kuroki S, Satoh H, Chijiiwa K, Tanaka M. Deconjugation of bilirubin accelerates coprecipitation of  cholesterol, fatty acids, and mucin in human bile—in vitro study. J Gastroenterol 1996; 31:828–835. 276. Sanabria JR, Upadhya GA, Harvey PRC, Strasberg SM. Diffusion of substances into human cholesterol gallstones. Gastroenterology 1994; 106:749–754. 277. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Brewer WH, Moore EW. Gallstones in patients with morbid obesity: relationship to body weight, weight loss, and  gallbladder bile cholesterol solubility. Int J Obesity 1993; 17:153–158.

  

Page 360

278. Khanuja B, Cheah YC, Hunt M, Nishina PM, Wang DQH, Chen HW, Billheimer JT, Carey MC, Paigen B. Lithl, a major gene affecting cholesterol gallstone  formation among inbred strains of mice. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:7729–7733. 279. Wang DQH, Paigen B, Carey MC. Phenotypic characterization of Lith genes that determine susceptibility to cholesterol cholelithiasis in inbred mice: physical­ chemistry of gallbladder bile. J Lipid Res 1997; 38:1395–1411. 280. Cabral DJ, Small DM. Physical chemistry of bile. In: Schultz SG, Forte JG, Rauner BB, eds. Handbook of Physiology. The Gastrointestinal System III, Section  6. New York: Waverly Press, 1989:621–662. 281. Fini A, Roda A. Chemical properties of bile acids: IV. Acidity constants of glycine­conjugated bile acids. J Lipid Res 1987; 28:755–759. 282. Hughes WS, Aurbach GD, Sharp ME, Marx SE. The effect of bicarbonate anion on serum ionized calcium concentration in vitro. J Lab Clin Med 1984;  103:93–103. 283. Toffaletti J, Gitelman HJ, Savory J. Separation and quantitation of serum constituents associated with calcium by gel filtration. Clin Chem 1976; 22:1968–1972. 284. Moore EW, Kelley EH, Keith FB, Krell H. Pathogenesis of phosphate­containing gallstones: V. Saturation limits for total inorganic phosphate in bile as functions  of [Ca2+] and pH (abstr). Gastroenterology 1989; 96:A633.

  

Page 361

16—  Prevention of Gallstones Mitchell L. Shiffman Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia I—  Introduction Gallstone disease is a major health problem throughout the western world. Approximately 10 to 15% of adults, or more than 20 million persons in the United States,  have gallstones. These are found nearly twice as frequently in women than in men—18 versus 9% (1,2). Approximately 80% of all patients with gallstones are  asymptomatic. However, several large prospective studies have demonstrated that 1 to 3% of patients with silent gallstones become symptomatic each year (3–5). It  is the appearance of symptoms that leads to a new diagnosis of gallstones in approximately 1 million patients annually. Severe complications of gallstones include acute  cholelithiasis, cholangitis with sepsis, acute pancreatitis, and gallbladder carcinoma. Of these, acute cholecystitis is the most common complication, occurring in nearly  10% of symptomatic patients (6,7). Cholecystectomy is a very safe and effective therapy for symptomatic gallstone disease. Biliary pain is relieved in 99% of cases (8,9). Mortality in very large series  remains under 1% (10–12). The most common cause of death following cholecystectomy results from unsuspected cardiac disease (10). Morbidity following  cholecystectomy, both long and short term, appears to develop in 5% of patients or less (10–12). A variable percentage of patients develop postcholecystectomy  sequellae, which include bilious gastroesphageal reflux and post­prandial diarrhea or dumping (13,14). Cholecystectomy reduces the bile salt pool, increases bile salt  recycling, and increases the content of hydrophobic bile acids, which may be toxic and/or precarcinogenic to colonic mucosa (15). More than a dozen epidemiological  studies from seven different countries have suggested that cholecystectomy may increase the long­term risk of developing colonic carcinoma (16–27), although the  methodology utilized in many of these studies remains controversial. Cholecystectomy remains one of the most common operative procedures performed in the United States. In 1991, shortly after the introduction of laparoscopic  cholecystectomy to this country, approximately 600,000 patients underwent cholecystectomy (28). Today, cholecystectomy is performed via laparoscopy in over  90% of cases. This technique has significantly reduced morbidity, inpatient hospital days, and recovery following cholecystectomy compared with the open surgical  approach (29). However, laparoscopic cholecystectomy has not reduced I would like to dedicate this chapter to my mentor, colleague, and friend Edward W. Moore, MD, who taught me how to think scientifically and critically and shared with me his  love for medicine, science, and life.

  

Page 362

the overall cost of caring for patients with gallstone disease, as originally predicted (29,30). Rather, the widespread acceptance of this technique by patients and  surgeons alike has led to a dramatic increase in the number of cholecystectomies performed to over 800,000 annually (28). As a result, treatment of gallstone disease  has become the most costly of all digestive disorders. In 1994 this cost exceeded $2 billion (31). Preventing gallstones from forming may therefore be the only manner by which to reduce the morbidity, mortality, and the cost of caring for patients with gallstone  disease. This chapter focuses on ways to prevent the development of gallstones and/or to prevent gallstones from becoming symptomatic and requiring surgical  treatment. The pathogenesis and risk factors associated with the development of cholesterol and pigment gallstones were discussed in previous chapters. In this chapter, those  pathogenic factors thought to be important for development of gallstones in select high­risk populations are reviewed. Special emphasis is placed on those factors that  could be modified by diet, exercise, or pharmacological therapy to reduce gallstone formation. Several studies have already demonstrated that ursodeoxycholic acid is  very effective therapy for prevention of cholesterol gallstones in patients undergoing rapid weight reduction (32–35). These data are reviewed and the applicability of  this treatment to other populations at high risk for cholesterol gallstone formation is discussed. Data regarding other pharmacological agents or treatments that have  been hypothesized but not proven to reduce the risk for gallstone formation are also summarized. II—  Cholesterol Gallstones Approximately 80% of gallstones found in patients living in the western world are classified as cholesterol (36). These stones are made up of more than 50%  cholesterol but also contain variable amounts of calcium, bilirubin, and mucin glycoprotein (37–39). The pathogenesis of cholesterol gallstones was discussed in  previous chapters. This is reviewed briefly here, with special emphasis on those factors thought to be important for the prevention of gallstones. Four factors are  considered essential for cholesterol gallstones to form: (a) bile must be supersaturated with cholesterol, (b) precipitation of cholesterol crystals must occur, (c)  gallbladder mucosa must secrete excess mucin, and (d) gallbladder motility must be reduced. Each of these is considered below. A—  Cholesterol Solubility Cholesterol is virtually insoluble in an aqueous environment (40). To solubilize this biliary lipid, the liver secretes bile salts and phospholipids. These amphipathic  molecules form both micelles and vesicles, which incorporate cholesterol and thereby markedly increase cholesterol solubility within bile (36,37,41). The proportion of  bile salts and phospholipids necessary to maintain cholesterol in solution was originally described by Amirand and Small (42). Additional studies on model solutions  composed of bile salts, lecithin, and cholesterol by Carey and Small led to the concept and definition of the cholesterol saturation index (CSI) (43). The CSI has since  been utilized to assess cholesterol solubility in human bile under various conditions. Whenever the amount of cholesterol in bile exceeds the solubilizing capacity of bile  salts and phospholipids, CSI exceeds 1 and bile is referred to as being either lithogenic or supersaturated with cholesterol. In this state, solid crystals of cholesterol  monohydrate may precipitate out of solution and begin the process of gallstone formation. Gallbladder bile is supersaturated with cholesterol in most patients with  cholesterol gallstones (44). In contrast, when gallbladder bile is unsaturated, cholesterol cannot precipitate and gallstone formation is impossible. Any factor that increases biliary cholesterol secretion to a greater extent than the secretion of bile salts and/or phospholipids will render bile supersaturated. Genetic  alterations in the relative proportions of cholesterol, bile salts, and phospholipids secreted into bile are thought

  

Page 363

to account for the increase in CSI and increased incidence of gallstones observed in some American Indians and the Scandinavian population (45,46). Certain drugs  utilized to treat hyperlipidemia, such as clofibrate, also enhance secretion of cholesterol into bile and increase CSI (47). A reduction in the secretion of bile salts  relative to cholesterol also reduces cholesterol solubility within bile. The increased risk for gallstone formation observed in some nonobese women has been attributed  to such an alteration in biliary lipid secretion (48,49). Sex steroids are an important factor affecting biliary cholesterol secretion. Estrogens increase the secretion of cholesterol into bile and CSI (50–52). This effect of  estrogens is observed not only during pregnancy but also in women taking oral contraceptive steroids. In contrast, biliary cholesterol secretion appears to be  unaffected by the normal ovulatory cycle (51). This effect of estrogens on biliary cholesterol secretion accounts in part for the increased incidence of gallstone  formation observed during and following pregnancy and in multiparous women (2,45,53). Of the various factors that enhance cholesterol secretion into bile, alterations in body weight appear to have the most profound effect. Both biliary cholesterol secretion  and CSI increase with increasing body weight (54–57). This may account for the stepwise increase in gallstone risk observed with increasing body weight (2,58–62).  Cholesterol secretion into bile is also increased during rapid weight loss (56,57), such as that which occurs in patients participating in a very low calorie diet program  (32) and following gastric bypass surgery (63,64). Both of these populations are at high risk for gallstone formation (32–35, 65–68). B—  Nucleation and Cholesterol Crystal Growth Crystals of cholesterol do not always form and precipitate out of solution when bile is supersaturated with this lipid (69,70). Rather, it appears that bile contains both  pro­ and antinucleating proteins, which regulate the formation, growth, and precipitation of cholesterol crystals from supersaturated bile (71–73). Candidate proteins  that appear to have strong nucleating effects include immunoglobulins (73,74) and gallbladder mucin (75–78). This later glycoprotein is discussed in detail below. The balance between pro­ and antinucleating proteins may be altered in patients who develop gallstones. For example, cholesterol crystals develop within days from  supersaturated gallbladder bile obtained from patients with gallstones (69). In contrast, crystals may not develop for weeks to months, if at all, when gallbladder bile  with an equal CSI is obtained from patients without gallstones. Cholesterol crystals will also precipitate from supersaturated model bile solutions when gallbladder bile  from patients with gallstones is added, but not after the addition of bile from patients without gallstones (79). Despite extensive work in this area little is known  regarding the mechanism by which many of these proteins function and how they may be affected by body weight, weight loss, and other factors thought to be  associated with gallstone formation. C—  Gallbladder Mucin Several lines of evidence strongly support the role of gallbladder mucin in gallstone pathogenesis. In animal models of cholesterol gallstone disease hypersecretion of  mucin by gallbladder mucosa precedes the development of gallstones (80–82), and inhibition of mucin secretion abolishes gallstone formation (83). Gallbladder mucin  is a potent stimulus for nucleation and growth of cholesterol crystals (75–78). Mucin also binds biliary lipids and is found within the central nidus region of cholesterol  gallstones (78,84,85). Secretion of gallbladder mucin appears to be stimulated by prostaglandins (86–88), which, in turn, are synthesized from arachidonic acid within  gallbladder mucosa (88,89). Inhibitors of prostaglandin synthesis, such as aspirin and other nonsteroidal anti­inflammatory drugs (NSAIDs), reduce the secretion of  gallbladder mucin and prevent gallstone formation in animal models (83,88). It has been hypothesized that patients who develop gallstones secrete bile that is rich in  the arachidonic acid

  

Page 364

precursor phosphatidylcholine (90). Alternatively, synthesis of prostaglandins by gallbladder mucosa may occur in response to inflammation, which is stimulated by  either an increase in the concentration of hydrophobic bile acids within bile (91,92) and/or by the presence of cholesterol crystals (93). Hypersecretion of mucin  creates a thick gel that lines the gallbladder mucosa, traps cholesterol, and provides an environment for crystal fusion and subsequent gallstone growth (36). During this  process, mucin is incorporated within the gallstone matrix (85). The viscous mucus gel prevents cholesterol crystals and small gallstones from being expelled from the  gallbladder during contractions. Studies in persons at high risk for gallstone formation also suggest that mucin may play an important role in gallstone formation. Gallbladder mucin increases in patients  on rapid­weight­loss diets (32,94) and in patients who develop gallstones following gastric bypass surgery (63). One study has also suggested that both arachidonic  acid and prostaglandin E2 increase in bile prior to the increase in mucin concentration (94). However, this observation has not been confirmed by other studies (64).  The effect of other well­known risk factors of gallstone formation on gallbladder mucin secretion remain unexplored. D—  Gallbladder Motility Numerous studies have demonstrated that gallbladder motility is frequently abnormal in patients with gallstones and in persons at increased risk for gallstone formation  (95). Gallbladder contractility is reduced in patients with gallstones following a fatty meal (96,97) and in some patients following direct stimulation with intravenous  cholecystokinin (98,99). Patients with gallstones have an increase in both gallbladder resting and residual volumes (95,100), which leads to stasis of bile within the  gallbladder. These abnormalities in gallbladder volume and contractility appear to be intrinsic defects. Placement of synthetic stones within the gallbladder does not  reduce motility (101), and gallbladder contractility does not appear to improve following complete gallstone dissolution (96,98,102). Animal studies have  demonstrated that a reduction in gallbladder motility precedes the development of cholesterol gallstone formation (103–105). Supersaturation of bile with cholesterol may be the primary event leading to a reduction in gallbladder motility. Cholesterol is absorbed from supersaturated bile across  gallbladder mucosa (106,107). In the submucosa, cholesterol appears to alter the fluidity of smooth muscle cell membranes and to reduce the contractility of these  cells (108). Gallbladder smooth muscle contractility is reduced both in patients with gallstones and in patients with cholesterolosis and no gallstones. The contractility of  gallbladder smooth muscle cells derived from patients without gallstones is also reduced following incubation with supersaturated model bile solutions (109). A decline in gallbladder contractility has also been demonstrated to be present in several populations at high risk to develop gallstones (95). The most common of  these populations includes those on a very low calorie weight­reduction diet and patients following gastric surgery. The increased risk for gallstone formation during the  third trimester of pregnancy may also be secondary to a reduction in gallbladder contractility that has been documented to develop during this time. III—  Pigment Gallstones Pigment gallstones are found in nearly one­third of patients who undergo cholecystectomy (2,110). They are composed of calcium salts of bilirubin, phosphates and  fatty acids, mucin glycoprotein, and small amounts of cholesterol (111). Several studies have demonstrated that the incidence of black pigment gallstones increases  with advancing age. Black pigment gallstones also develop in patients with cirrhosis or chronic hemolytic disorders and those on long­term parenteral alimentation  (110–116).

  

Page 365

No current treatments are available to either dissolve pigment gallstones once they have formed or to prevent these stones from developing. Prevention of pigment  gallstones in these high­risk populations is not considered in this chapter. IV—  Gallbladder Sludge Gallbladder sludge is an echogenic substance that layers within the dependent portion of the gallbladder and does not cast an acoustic shadow (117,118). It is  composed of gallbladder mucin, calcium, bilirubin, and cholesterol crystals (117,119). Gallbladder sludge may appear, dissolve spontaneously, and then reappear; this is primarily a function of gallbladder motility. Factors that promote stasis of gallbladder  bile are all associated with the appearance of biliary sludge. This includes the third trimester of pregnancy, parenteral alimentation, prolonged fasting, a reduction in the  fat content of the diet, and gastric bypass surgery (32,68,114,115,121–123). Although sludge may resolve spontaneously in many cases, many other patients with  sludge will eventually develop gallstones. Indeed, prospective studies have clearly demonstrated that gallbladder sludge is an essential event in the development of  gallstones (114,118,124,125). As such, any treatment that either prevents gallbladder sludge from forming or removes sludge from the gallbladder may prevent the  development of gallstones. V—  High­Risk Populations Major risk factors associated with the development of cholesterol gallstones and gallbladder sludge are listed in Table 1. Each of these factors alters biliary cholesterol  and bile salt secretion in a manner that reduces cholesterol solubility within bile and/or reduces gallbladder motility. Each of these high­risk populations is discussed  below. Emphasis is placed on how these factors might be altered to prevent gallstone formation. Table 1 Populations at High Risk for Gallstone  Formation in Whom Prevention Has Been Proven  Effective or May Be Effective Cholesterol gallstones Obesity Rapid weight lossa Acute spinal cord injury Pregnancy and the immediate postpartum state Long­term somatostatin (octreotide) therapy Increasing age Diabetes mellitus Intestinal disease Biliary sludge Total parenteral nutritionb   UDCA proven to reduce incidence of gallstones. CCK proven to reduce incidence of biliary sludge.

a

b

  

Page 366

A—  Obesity The incidence of gallstones increases stepwise with increased body weight (58,61,62). As illustrated in Fig. 1, patients whose body mass index is as little as 1.5 above  ideal have a three­to fivefold increased risk for developing gallstones. The risk for developing gallstones increases to a maximum of eightfold in patients who are  morbidly obese and weigh in excess of 100 lb over ideal. Since dieting is common among obese patients, some authors have suggested that simply being overweight  may not be as strong a risk factor for gallstones as originally thought. However, this hypothesis was shown to be incorrect. When controlled for the effects of dieting,  obesity was still found to be a strong risk factor for developing gallstones (126). The risk for developing symptomatic gallstones also appears to increase with  increasing body weight (127). Approximately 30% of patients with morbid obesity have either undergone prior cholecystectomy or have been found to have gallstones  at the time of bariatric surgery (2,59,60,68,128–130). Obesity increases the risk for gallstone formation by increasing cholesterol secretion into bile (54–57). Obesity may also enhance nucleation of cholesterol from  supersaturated bile (131). Several studies have evaluated the effects of obesity on gallbladder motility. Gallbladder resting volume appears to increase with body size,  but this appears to be true for large nonobese persons as well (132). Gallbladder contraction either in response to a fatty meal or to cholecystokinin (CCK) appears  to be unaffected by body weight (132,133). It is therefore unlikely that obesity in and of itself alters gallbladder motility in a manner that could increase the risk of  gallstone formation. B—  Rapid Weight Loss Rapid weight loss is one of the most studied risk factors associated with gallstone formation. Several prospective studies have demonstrated that approximately 25 to  30% of persons develop gallstones while participating in a very low calorie weight­loss program (32,35,65,66) or following gastric bypass surgery (33,34,67,68). Two approaches have been taken to obtain gallbladder bile during and following weight reduction and to study the mechanisms by which rapid weight reduction may  contribute to gallstone formation. In one set of studies, bile was obtained by aspirating duodenal contents following CCK administration at periodic intervals while  patients participated in a very low

Figure 1 Relationship between body weight and the risk of developing gallstones. (Redrawn from Ref. 58.)

  

Page 367

calorie weight­reduction diet (94,134). In another set of studies, bile was aspirated directly from the gallbladder at the time of gastric bypass surgery (prior to gallstone  formation) and at cholecystectomy after gallstones had formed (63,64). These studies demonstrated that rapid weight loss was associated with an increase in the  secretion of cholesterol into bile, a rise in CSI, and a marked increase in the concentration of mucin within gallbladder bile (63,94). No alteration in the bile salt pool  (i.e., no increase in the percentage of deoxycholic acid) during weight reduction was observed in either of these studies (64,134). In one of these studies, both  arachidonic acid and prostaglandin E2 were noted to increase with weight reduction (94). In the other set of studies, no alteration in the phospholipid content of  gallbladder bile was observed following gastric bypass surgery (64). Weight loss in and of itself does not appear to alter gallbladder motility. However, the mechanism by which weight is lost does appear to be a factor. Both gastric  bypass surgery and very low calorie diets are associated with a reduction in gallbladder motility. The absence of fat in most very low calorie diets provides no stimulus  for gallbladder contraction and thereby promotes stasis of gallbladder bile (135). Patients who have undergone Billroth II gastrectomy with Roux­en­Y  gastroenterotomy have an increase in gallbladder resting volume and a reduction in gallbladder contractility following a fatty meal (136). The decline in gallbladder  emptying associated with gastric bypass surgery may result from an alteration in the secretion of several gastrointestinal hormones affecting gallbladder motility (137).  However, this decline in gallbladder contractility appears to resolve and gallbladder motility returns back to its presurgical baseline within 6 to 12 months (138). C—  Spinal Cord Injury Patients who have sustained spinal cord injury were found to have a nearly threefold increased risk for gallstones compared to a controlled population (139). In  another study, 30% of patients with spinal cord injury were found either to have gallstones on screening ultrasound examination or to have undergone prior  cholecystectomy (140). It has been proposed that the increased incidence of gallstones in this population results from a reduction in gallbladder contractility following  injury to the spinal cord. However, the only study to assess gallbladder motility following spinal cord injury could not confirm that a motility defect existed in these  patients (140). Most of these patients had conventional risk factors associated with cholelithiasis. D—  Pregnancy and Sex Steroid Hormones Pregnancy has long been thought to be a risk factor for cholesterol gallstone disease. The risk of developing gallstones appears to increase with the number of  pregnancies (2,59,141). The risk of gallstone disease is increased in women who become pregnant before the age of 30 years (142). Alternatively, the risk for  developing gallstones appears to be reduced if the first pregnancy occurs at an older age (53). Women who take contraceptives steroids (53,95,141) and men treated  with estrogens (143) are also at increased risk for gallstone formation. Pregnancy and sex steroid hormones affect both bile lipid composition and gallbladder motility in ways that promote gallstone formation. During the later stages of  pregnancy, biliary cholesterol secretion into bile and the cholesterol saturation index of gallbladder bile are increased (51). This effect appears to result from the effects  of estrogens. Estrogen therapy in males with prostate cancer was associated with a marked increase in biliary cholesterol secretion and cholesterol saturation index  compared to a control group of men who underwent orchidectomy (143). Biliary lipid secretion in women taking oral contraceptives and estrogen replacement  therapy is also increased (50,52). Pregnancy is also associated with a marked reduction in gallbladder motility and an increase in resting gallbladder volume (144,145). These effects lead to stasis of bile  within the gallbladder, are especially pronounced during the third trimester, and resolve within weeks of

  

Page 368

delivery (146). In contrast, studies that have examined the effect of oral contraceptive hormones on gallbladder motility have yielding mixed results. Some of these  studies have demonstrated that gallbladder contractility is reduced in response to a test meal and that gallbladder residual and fasting volumes are increased (145).  Other studies have been unable to confirm these observations (144). The high concentration of progestins appears to be directly responsible for this reduction in gallbladder contractility during the later phase of pregnancy. Progesterone  inhibits the contractility of gastrointestinal smooth muscle strips in vitro (147). Additional studies have demonstrated that progestins but not estrogens inhibit the  contractility of human gallbladder muscle strips obtained from either men or women (148). Progesterone reduces cholecystokinin and meal­stimulated gallbladder  contraction in animal studies (149) and treatment of women with progestins reduces cholecystokinin­mediated gallbladder contraction (150). Despite the overwhelming epidemiological evidence relating pregnancy and gallstone formation, it is actually uncommon for women to develop symptomatic gallstone  disease during the pregnancy (151–153). Rather, most gallstones that either develop or are present during pregnancy become symptomatic during the peripartum  period. This most likely results from the rapid decline in serum progestins and restoration of gallbladder contractility following delivery. E—  Somatostatin The relationship between somatostatin and gallstone formation was first recognized in patients with somatostatin­secreting tumors. It appears that gallstones are  identified in approximately 65 to 80% of these patients (154–156). Similarly, the synthetic somatostatin analogue octreotide is also associated with gallstone formation.  Numerous studies have demonstrated that gallstones develop in approximately 20% of patients treated with long­term administration of octreotide for acromegaly,  carcinoid tumors, secretory diarrhea, and other conditions (154,157–161). The risk for gallstone formation increases with the duration of octreotide therapy but  plateaus after 6 to 12 months of treatment (161). Octreotide leads to the development of gallstones by inhibiting the postprandial release of cholecystokinin and other gastrointestinal hormones that stimulate gallbladder  contraction (154,161–163). This, in turns, leads to an increase in the resting volume of the gallbladder and stasis of gallbladder bile. Administration of octreotide does  not appear to alter the relative proportion of bile salts, phospholipids, or cholesterol in bile or the CSI (164). However, both cholesterol crystals and gallstones have  been shown to develop in patients who had supersaturated bile prior to the initiation of octreotide (164,165). F—  Increasing Age The incidence of gallstones increases with age. The reasons for this have not been clearly defined. In one study, the ratio of biliary cholesterol to bile salt secretion was  noted to increase with age (166). In contrast, both gallbladder contractility and CCK release in response to a fatty meal appear unaffected by advancing age (167). G—  Diabetes Mellitus Many patients with obesity also have type II diabetes. However, most studies have demonstrated that it is obesity, not diabetes, that increases the risk for gallstone  disease in this population (59,60,141,168). Despite this, patients with diabetes have been shown to have a reduction in gallbladder contractility, and this appears to be  pronounced in patients with autonomic neuropathy (169). Diabetes may therefore contribute to the increased incidence of gallstones in some obese patients.

  

Page 369

H—  Small Bowel Disease Bile acids are reabsorbed in the terminal ileum and return to liver via portal blood to complete the enterohepatic circulation. This process is necessary to maintain a  steady­state pool of bile acids. Disruption of the enterohepatic circulation leads to a marked reduction in the size of the bile acid pool. In some patients with Crohn's  disease of the terminal ileum and patients who have had surgical resection of the terminal ileum, the enterohepatic circulation is disrupted (170,171). This increases the  relative proportion of cholesterol to bile acids secreted into bile and leads to supersaturation of bile with cholesterol. These observations explain the increased  incidence of gallstones in these populations. VI—  Prevention of Gallstones Gallstone disease is the most costly of all digestive disorders. Given the staggering health care costs associated with treating gallstones—over $2 billion annually  (31)—preventing gallstones from forming is of paramount importance. At this time, studies to prevent gallstone formation have been performed only in those patients  undergoing rapid weight reduction. However, it is quite possible that lifestyle factors could be altered and/or pharmacological agents could be utilized to reduce the  risk of gallstone formation in many other high­risk populations (Table 2). A—  Participation in a Regular Exercise Program Several epidemiological studies have examined the relationship between symptomatic gallstones disease and exercise. Although some studies did not find a relationship  between exercise and symptomatic gallstones (2,60,62), others have demonstrated that such a relationship may indeed exist (172–174). The most recent and  extensive of these studies evaluated over 45,000 men between the ages of 45 and 75 years (174). In men younger than 65 years of age, 2 to 3 h of moderate physical  activity per week seemed to reduce the risk of gallstone disease by 20 to 40%. This degree of activity was achieved by either running, jogging, brisk walking, or  participation in racquet sports. The protective effective of moderate exercise was still evident even when adjusted for body weight and body mass index. In contrast,  sedentary behavior, defined as watching more than 40 h of television per week and failure to participate in regular exercise, strongly correlated with the development  of symptomatic gallstones. Table 2 Lifestyle Factors or Pharmacological Agents That May Reduce the Risk of  Cholesterol Gallstone Formation Intervention

Proposed mechanism of action

Exercise

Increases gallbladder motility

Slowing of the rate of weight lossa

Reduces biliary cholesterol secretion

Increasing fat within the low calorie diet

Increases gallbladder motility

Increasing dietary vitamin C

Reduces biliary cholesterol secretion

Ursodeoxycholic acid

a

 

Reduces biliary cholesterol secretion Increases cholesterol solubility

b

NSAIDs

Reduce biliary mucin secretion

Inhibitors of hepatic cholesterol synthesis

Reduce cholesterol secretion into bile

Cholecystokinin

Increases gallbladder motility

  Proven to be effective in large clinical trials. b Nonsteroidal anti­inflammatory drugs. a

  

Page 370

The mechanism(s) by which regular exercise may contribute to this decreased risk of gallstone disease remains unexplored. Exercise affects several metabolic  pathways that could reduce the risk associated with gallstone formation. This includes an increase in serum high­density­lipoprotein (HDL) cholesterol (175) and  reduction in serum triglycerides (176). HDL cholesterol is preferentially utilized for bile salt synthesis (177), and patients with elevated serum HDL secrete bile with a  lower CSI (178) and have a reduced risk for gallstone disease (179). Triglycerides have been shown to be a stimulus for mucin secretion (180). Regular exercise is  also associated with an increased secretion of cholecystokinin, which may increase gallbladder motility (181). B—  Lowering of the Rate of Weight Reduction Rate of weight loss appears to be an important factor leading to gallstone formation. In the largest epidemiological study to evaluate this relationship, nearly 90,000  women were evaluated over a 2­year period (104). Compared to women who lost less than 4 kg, those who lost 4 to 10 kg had a 44% increase in the risk for  symptomatic gallstone disease. Women who lost more than 10 kg over the 2­year observation period had a 94% increase in the risk of developing symptomatic  gallstones. Several prospective studies have examined the relationship between weight loss and gallstone formation in the placebo arm of randomized controlled trials designed to  prevent gallstone formation during rapid weight loss. In the study by Yang et al. (66), patients who lost more than 25% of their baseline body weight during a 16­week  very low calorie rapid­weight­loss diet had an incidence of new gallstone formation more than twice that observed for patients with a lower rate of weight loss. In two  other studies (34,35), the rate of new gallstone formation increased stepwise with the rate of weight loss. Gallstones developed in only 8% of patients who lost less  than 10 lb per month. This increased to 31% in patients who lost 10 to 15 lb per month and 49% in patients who lost 15 to 20 lb per month (Fig. 2). The relationship  between rate of weight loss and gallstone formation appeared to be stronger in women than men. These data suggests that the risk of gallstone formation during weight  reduction could be reduced to less than 10% if the rate of weight loss is limited to only 1 to 2 lb per week.

Figure 2 Relationship between the rate of weight loss and the incidence of new gallstone formation. Data was compiled from the placebo arms of two randomized, double­blinded, placebo­controlled clinical trials  designed to prevent gallstone formation during rapid weight reduction. (From Refs. 34 and 35.)

  

Page 371

C—  Changes in the Composition of Low­Calorie Diets Gallstones develop in approximately 25 to 30% of patients who consume very low calorie diets that supply only 420 calories per day and 0 to 2 g of fat (32,35,65). It  is believed that the low fat content of these diets provides an insufficient stimulus for gallbladder contraction (135). This, coupled with the enhanced biliary cholesterol  secretion that occurs during weight loss (56,57) leads to the increased incidence of gallstones observed in these patients. An uncontrolled trial has suggested that diets  that supply a slightly higher caloric content, 800 kcal/day, and 15 to 25 g of fat could reduce the incidence of new gallstone formation during dieting (182). Only 4% (2  of 53) of patients consuming this diet over 10 weeks developed gallstones. Interestingly, the mean rate of weight loss in the two patients who developed gallstones in  this study (2.5 kg/week) was far greater than that observed in the remaining individuals (only 0.9 kg/week) who did not develop gallstones. Thus, rate of weight loss,  as discussed above, may be a more important factor in gallstone formation than the specific diet and/or its fat content. D—  Vitamin C Several small case­controlled studies have suggested that increased dietary consumption of ascorbic acid is associated with a reduction in gallstones (183–185). This  benefit appears to be isolated to women, where a 50 to 65% reduction in gallstone disease and cholecystectomy were observed. In contrast, vitamin C did not appear  to reduce gallstone disease in men. In the second National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES II) the incidence of gallstone disease was also found  to be inversely related to serum ascorbic acid concentration in women but not in men (185). Previous studies have demonstrated that animals fed an ascorbic acid—deficient diet develop gallstones (186). However, the manner in which vitamin C reduces the  incidence of gallstones remains unclear. Animal studies have demonstrated that ascorbic acid enhances hepatic metabolism of cholesterol to bile acids (187). This  process could lead to an increase in bile salt secretion relative to cholesterol secretion and thereby improve the solubility of biliary cholesterol. Why this only occurs in  women is speculative. It is also unknown what effects if any ascorbic acid may have upon cholesterol nucleation from supersaturated bile, secretion of gallbladder  mucin, and gallbladder motility. E—  Ursodeoxycholic Acid Ursodeoxycholic acid (UDCA) is the major bile acid in the polar bear and has long been employed in Asian folk medicine as a treatment for liver disorders. UDCA is  the 7b ­epimer of chenodeoxycholic acid (CDCA). It is relatively hydrophilic and a poor detergent (188). UDCA affects biliary cholesterol synthesis, secretion, solubility, and lithogenicity in a manner that reduces the risk for gallstone formation. UDCA appears to reduce  hepatic cholesterol synthesis by inhibiting b ­hydroxy­ b ­methylglutaryl­coenzyme A (HMG­CoA) reductase (189,190), although this is not a universal finding  (191,192). UDCA has also been shown to directly reduce canalicular cholesterol secretion (193) and intestinal cholesterol absorption (194). These effects lead to a  reduction in hepatic cholesterol secretion into bile (195). In contrast, UDCA has little effect on the synthesis and secretion of bile salts (194,196). As a result,  treatment with UDCA leads to a marked reduction in CSI. UDCA also increases the cholesterol content of both mixed micelles and vesicles (197) and directly inhibits  nucleation of cholesterol from supersaturated bile (198). UDCA may also effect gallbladder motility in a manner that reduces the risk for gallstone formation. Some studies have demonstrated that treatment with UDCA  increases fasting gallbladder volume in patients with gallstones as well as in control patients without gallstones (199). In addition, both meal­ and CCK­stimulated  gallbladder contraction appear to be increased in patients treated with UDCA. Other studies have been unable to confirm these ob­

  

Page 372

servations (200,201). The varying results observed in these studies may reflect differences in the manner in which gallbladder volume and contraction have been  assessed and the specific stimulus utilized to stimulate gallbladder contraction. UDCA was originally developed as a nonsurgical treatment for symptomatic cholesterol gallstones. Approximately, 30% of patients treated with this bile acid achieved  complete gallstone dissolution within 12 months (190,202,203). UDCA treatment has also been reported to reduce symptoms associated with cholelithiasis  (203,204). Unfortunately, gallstones appear to reform in nearly 50% of patients within 5 years following successful stone dissolution and discontinuation of treatment  (205). UDCA is well tolerated. The most common side effect is diarrhea, and this develops in only 2% of treated patients (190,202,203). During treatment, the  percentage of UDCA in bile increases from a baseline value of 2 to 5% to nearly 50 to 60% of the total bile salt pool (188,206). Several studies have now demonstrated that UDCA is very effective for prevention of cholesterol gallstone formation in patients undergoing rapid weight reduction  (32–35). In the largest of these studies, over 1000 patients participating in a 16­week very low calorie rapid­weight­loss program were randomly assigned to receive  one of three doses of UDCA or a placebo. UDCA reduced gallstone formation from nearly 28% in placebo­treated patients to 8% in patients treated with 300  mg/day and to only 3% in patients treated with 600 mg of UDCA daily (34). In another large study, 310 patients who underwent proximal gastric bypass surgery as a  treatment for morbid obesity were also randomized to receive either UDCA or placebo for 16 weeks. As in the dietary weight­loss study, UDCA significantly  reduced the incidence of new gallstone formation following gastric bypass surgery from 32% in placebo treated patients to only 2% in patients treated with 600 mg of  UDCA daily (35). Based upon the results of these two large studies, the Food and Drug Administration approved UDCA for prevention of gallstone formation in  persons undergoing rapid weight reduction via either dietary or surgical means. UDCA remains the only treatment proven to be effective for prevention of gallstone  formation in high­risk populations (Fig. 3). Although no formal safety and efficacy studies of UDCA treatment have been performed during pregnancy, at least one report has demonstrated that this agent may  be utilized during pregnancy without adverse effects to the developing infant (207). While this observation in no way supports the routine use of UDCA for prevention  of gallstone formation during the third trimester of pregnancy, it does suggest that UDCA might be safely utilized in this population.

Figure 3 Prevention of gallstone formation with ursodeoxycholic acid in patients undergoing rapid weight loss either while participating in a very low calorie diet program or following gastric bypass surgery. (Redrawn from Refs. 34 and 35.)

  

Page 373

F—  Aspirin and Other NSAIDs Both aspirin and NSAIDs have been evaluated as potential agents to prevent gallstone formation. As noted above, gallbladder mucin plays an essential role in  gallstone pathogenesis. Animal studies have demonstrated that hypersecretion of gallbladder mucin occurs prior to gallstone formation (80–82), and human studies  have demonstrated that the mucin content of gallbladder bile increases in patients who develop gallstones during rapid weight loss (32,63,64,94). Mucin secretion is  stimulated by prostaglandins, which, in turn, are synthesized from arachidonic acid (86–89). Aspirin and NSAIDs inhibit prostaglandin synthesis (86–88), and these  agents have been shown to both inhibit gallbladder mucin secretion and gallstone formation in animal models of gallstone disease (83,88). NSAIDs have been shown  to improve gallbladder motility in an animal model of gallstone disease (208), although this has not been confirmed by subsequent studies (209,210). The effect of aspirin on bile composition has been evaluated in patients participating in a very low calorie rapid­weight­loss diet (32). In this randomized, double­blind,  placebo­controlled trial, an increase in biliary prostaglandins, mucin, and cholesterol saturation was observed in placebo­treated patients. In contrast, treatment with  600 mg/day of aspirin prevented these changes. In another study, gallbladder bile was sampled from patients with and without gallstones at the time of bariatric surgery  (211). Those patients who utilized NSAIDs on a regular basis had less gallbladder mucin and a lower cholesterol/phospholipid ratio than patients who did not use  NSAIDs. NSAIDs have also been shown to have a positive effect on gallbladder motility. Use of indomethacin in patients with symptomatic gallstones was associated  with an increase in postprandial gallbladder emptying and a reduction in residual volume (212). Each of these observations lends support to the hypothesis that  NSAIDs could be utilized for the prevention of gallstones. Several epidemiological studies have also examined the effect of NSAIDs on gallstone disease. The most promising of these studies evaluated gallstone recurrence  following oral bile salt dissolution therapy (213,214). Gallstones did not develop in those patients who utilized NSAIDs on a regular basis, whereas 32% of non­ NSAID users developed gallstone recurrence within 5 years follow­up. In contrast, two other studies could not demonstrate that regular NSAID use reduced the  incidence of either gallstones or symptomatic gallstone disease. The prevalence of gallstones was found to be nearly identical in patients who were prescribed NSAIDs  for various rheumatological conditions compared to a population matched for age, gender, and body weight who did not take NSAIDs (215). In the Myocardial  Infarction Study, regular aspirin use did not reduce the hospitalization rate for symptomatic gallstone disease (216). Finally, the incidence of new gallstone formation  observed in a randomized, double­blind, placebo­controlled trial was not significantly reduced by treating patients with 600 mg of aspirin daily as compared with  placebo while they were participating in a very low calorie rapid­weight­loss diet (32). In summary, although NSAID use appears to affect bile composition in a manner that could reduce gallstone formation, epidemiological studies have been unable to  provide definitive evidence that aspirin or other NSAIDs could be utilized as an effective prophylactic agent in patients at high risk for gallstone formation (217). G—  Inhibitors of Cholesterol Synthesis Cholesterol biosynthesis occurs within hepatic microsomes and is controlled by the rate­limiting enzyme HMG­CoA reductase (218). This enzyme is blocked by the  family of drugs known as HMG­CoA reductase inhibitors or ''statins." These agents are potent inhibitors of cholesterol biosynthesis and widely utilized for the  treatment of hypercholesterolemia. Several studies have demonstrated that HMG­CoA reductase inhibitors reduce biliary cholesterol secretion and the percentage of cholesterol in bile without affecting  bile salt synthesis (219–222). This reduces the biliary CSI. Combining HMG­CoA reductase inhibitors

  

Page 374

with UDCA leads to an even greater decline in cholesterol saturation than is observed with either of these agents alone (221,222). At least one report has documented  dissolution of cholesterol gallstones in a patient treated with an HMG­CoA reductase inhibitor (223). These observations suggest that these agents may be effective for  the dissolution and/or prevention of gallstones. However, these observations were made in patients taking HMG­CoA reductase inhibitors for the treatment of  hypercholesterolemia. One study has suggested that HMG­CoA reductase inhibitors do not have beneficial effects on biliary cholesterol secretion and solubility in  patients with normal plasma lipids (224). Although not yet proven to be effective, HMG­CoA reductase inhibitors remain a potential therapy for gallstone prophylaxis,  at least in patients with hypercholesterolemia. H—  Cholecystokinin A reduction in gallbladder motility is believed to play an important role in the formation of both biliary sludge and gallstones (95–99). Several studies have documented  that both meal­stimulated and CCK­induced gallbladder contractility is reduced in gallstone patients (96–99). A reduction in gallbladder contractility is also observed  during pregnancy, in response to oral contraceptive steroids, and following gastric bypass surgery (138,144–150). The lack of dietary fat in many very low calorie  diets and in patients on long­term parenteral nutrition does not provide a stimulus for gallbladder contraction (135). The increased risk of gallstones and biliary sludge  observed in these patients may result, at least in part, from a reduction in gallbladder motility. One possible treatment for such patients is to contract the gallbladder via pharmacological stimulation at periodic intervals. Indeed, in a randomized, blinded, placebo­ controlled trial, daily administration of an intravenous CCK bolus to patients receiving long­term parenteral nutrition led to a significant reduction in gallbladder resting  volume (225) and reduced the incidence of gallbladder sludge from 60% to less than 5% (Fig. 4). Although not specifically studied, it is possible that periodic  treatment with CCK to induce gallbladder contraction could reduce the risk of gallstone formation in other populations in whom a reduction in gallbladder motility  appears to be the primary defect. This includes patients with acute spinal cord injury,

Figure 4 Effect of cholecystokinin on the incidence of gallbladder sludge in patients who were unable to eat for a prolonged period and received total parenteral nutrition. (Redrawn from Ref. 225.)

  

Page 375

patients on low­fat weight­loss diets, and those who have undergone gastric bypass surgery or gastrectomy. Pharmacological agents that stimulate gastrointestinal motility might also enhance gallbladder contractility; if so, they could be utilized to reduce the risk of gallstone  formation in certain high­risk populations. Cisapride increases bile salt recycling, probably by reducing intestinal transit time; in some studies, this was associated with a  reduction in CSI (226,227). However, cisapride appears to offer no beneficial effect on gallbladder contractility (227,228). The effect of erythromycin on gallbladder  contractility and CSI has been evaluated only in an animal model of gallstone formation. In this ground squirrel model of cholesterol gallstone disease, treatment with  erythromycin increased bile salt recycling, reduced the bile salt pool, reduced CSI, and improved gallbladder motility (229). It remains to be seen if erythromycin  could provide similar benefits in humans and develop into an effective agent for gallstone prevention. VII—  Summary Gallstone disease is one of the most common and costly of all digestive disorders. Preventing gallstones and biliary sludge from forming has the potential for reducing  morbidity and health care costs associated with gallbladder disease. This chapter has reviewed data clearly demonstrating that prevention of gallstones and biliary  sludge is indeed possible in certain high­risk populations. Daily administration of intravenous CCK is highly effective for prevention of biliary sludge in patients  receiving parenteral nutrition. The applicability of this treatment to other high­risk populations has yet to be explored. The most effective agent for prophylaxis against  cholesterol gallstones appears to be UDCA. This has been demonstrated to be highly effective in patients undergoing rapid weight loss via either dietary means or  following gastric bypass surgery. It is quite possible that UDCA could be utilized to prevent cholesterol gallstone formation in many other high­risk populations as well. References 1. Diehl AK. Epidemiology and natural history of gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:1–19. 2. Friedman GD, Kannel WB, Dawber TR. The epidemiology of gallbladder disease: observations in the Framingham study. J Chronic Dis 1966; 19:273–292. 3. Gracie WA, Ransohoff DF. The natural history of silent gallstones: the innocent gallstone is not a myth. N Eng J Med 1982; 307:798–800. 4. McSherry CK, Ferstenberg H, Calhoun WF, Lahman E, Virshup M. The natural history of diagnosed gallstone disease in symptomatic and asymptomatic patients.  Ann Surg 1987; 202:59–63. 5. Friedman GD, Raviola CA, Fireman B. Prognosis of gallstones with mild or no symptoms: 25 years of follow­up in a health maintenance organization. J Clin  Epidemiol 1989; 42:127–136. 6. Wenckert A, Robertson B. The natural course of gallstone disease: eleven year review of 781 nonoperated cases. Gastroenterology 1966; 50:376–381. 7. Newman HF, Northup JD, Rosenblum M, Abrams H. Complications of cholelithiasis. Am J Gastroenterol 1968; 50:476–496. 8. Wetter LA, Way LW. Surgical therapy for gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:157–169. 9. Lee SP, Kuver R. Gallstones. In: T Yamada, DH Alpers, C Owyang, DW Powell, FE Silverstein, eds. Textbook of Gastroenterology. Philadelphia: Lippincott,  1995, pp 2187–2212.

  

Page 376

10. McSherry CK, Glen F. The incidence and causes of death following surgery for nonmalignant biliary tract disease. Ann Surg 1980; 191:271–275. 11. Kelley JE, Burrus RG, Graham LD, Chandler KE. Safety, efficacy, cost and morbidity of laparoscopic versus open cholecystectomy: a prospective analysis of  228 consecutive patients. Am Surg 1993; 59:23–27. 12. Stoker ME, Vose J, O'Mara P, Maini BS. Laparoscopic cholecystectomy: a clinical and financial analysis of 280 operations. Arch Surg 1992; 127:589–594. 13. Glinatsis MT, Griffith JP, McMahon MJ. Open vs laparoscopic cholecystectomy: a retrospective comparative study. J Laparoendosc Surg 1992; 2:81–86. 14. Gagic N, Frey CF. The results of cholecystectomy for the treatment of acute cholecystitis. Surg Gynecol Obstet 1975; 140:255–257. 15. Almond HR, Vlahcevic ZR, Bell CC Jr, Gregory DH, Swell L. Bile acid pools, kinetics and biliary lipid composition before and after cholecystectomy. N Engl J  Med 1973; 289:1213–1216. 16. Lee SS, Cha S, Lee RL. The relationship between cholecystectomy and colon cancer: an Iowa study. J Surg Oncol 1989; 41:81–85. 17. Werner B, De Heer K, Mitschke H. Cholecystectomy and carcinoma of the colon: An experimental study. Z Krebforsch 1977; 88:223–230. 18. Capron JP, Delamarre J, Canarelli JP, Brousse N, Dupas JL. Does cholecystectomy predispose to the development of colorectal cancer? Gastroenterol Clin Biol  1978; 2:383–389. 19. Turunen MJ, Kivilaakso EO. Increased risk of colorectal cancer after cholecystectomy. Ann Surg 1981; 194:639–641. 20. Linos DA, Beard CM, O'Fallon WH, Dockerty MB, Beart RW Jr, Kurland LT. Cholecystectomy and carcinoma of the colon. Lancet 1981; 2:379–381. 21. Vernick LJ, Kuller LH. Cholecystectomy and right­sided colon cancer: an epidemiological study. Lancet 1981; 2:381–383. 22. Alley PG, Lee SP. The increased risk of proximal colon cancer after cholecystectomy. Dis Colon Rectum 1983; 26:522–524. 23. Turnbull PRG, Smith AH, Isbister WH. Cholecystectomy and cancer after cholecystectomy. Dis Colon Rectum 1983; 26:522–524. 24. Weiss NS, Daling JR, Chow WH. Cholecystectomy and the incidence of large bowel cancer. Cancer 1982; 49:1713–1715. 25. Kwai AH. Cholecystectomy and large bowel cancer. Mt Sinai J Med 1983; 50:359–363. 26. Narisawa T, Sano M, Sato M, Takahashi T, Arakawa H. Relationship between cholecystectomy and colon cancer in low­risk Japanese population. Dis Colon  Rectum 1983; 26:512–515. 27. Lowenfels AB, Domellof L, Lindstrom CG, Bergman F, Monk MA, Sternby NH. Cholelithiasis, cholecystectomy and cancer: a case control study in Sweden.  Gastroenterology 1982; 83:672–676. 28. Digestive disease statistics. NIH publication no. 95–3873. Bethesda, MD: National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, US Dept of Health  and Human Services, 1995. 29. The Southern surgeons club: a prospective analysis of 1518 laproscopic cholecystectomies. N Engl J Med 1991; 324:1073–1078. 30. Legorreta AP, Silber JH, Costantino GN, Kobylinski RW, Zatz SL. Increased cholecystectomy rate after the introduction of laparoscopic cholecystectomy.  JAMA 1993; 270:1429–1432. 31. National Center for Health Statistics. National hospital discharge survey. Advance data from vital and health statistics of the national center for health statistics. No  278. Rockville, MD: US Dept of Health, Education and Welfare, Public Health Service, Health Resources Administration, 1994.

  

Page 377

32. Broomfied PH, Chopra R, Sheinbaum RC, Bonnorris GG, Silverman A, Schoenfield LJ, Marks JW. Effects of ursodeoxycholic acid and aspirin on the formation  of lithogenic bile and gallstones during loss of weight. N Engl J Med 1988; 319:1567–1572. 33. Worobetz LJ, Inglis FG, Shaffer EA. The effect of ursodeoxycholic acid therapy on gallstone formation in the morbidly obese during rapid weight loss. Am J  Gastroenterol 1993; 88:1705–1710. 34. Sugerman HJ, Brewer WH, Shiffman ML, Brolin RE, Fobi MAL, Linner JH, MacDonald KG, MacGregor AM, Martin LF, Oram­Smith JC, Popoola D,  Schirmer BD, Vickers FF. Prophylactic ursodeoxycholic acid prevents gallstone formation following gastric bypass surgery induced rapid weight loss: a multicenter,  placebo controlled, randomized, double­blind prospective trail. Am J Surg 1995; 169:91–97. 35. Shiffman ML, Kaplan GD, Brinkman­Kaplan V, Vickers FF. Prevention of gallstone formation with ursodeoxycholic acid in patients participating in a very low  calorie diet program. Ann Intern Med 1995; 122:899–905. 36. Heuman DM, Shiffman ML. Prevention and medical treatment of gallstones. In: Friedman G et al., eds. Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics.  Philadelphia: Lippincott­Raven, 1997. 37. Donovan JM, Carey MC. Physical­chemical basis of gallstone formation. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:47–66. 38. Heuman DM, Moore EW, Vlahcevic ZR. Pathogenesis and dissolution of gallstones. In: Zakim D, Boyer JD, eds. Hepatology: A Textbook of Liver Disease.  Philadelphia: Saunders, 1996, pp 1833–1876. 39. Carey MC. Pathogenesis of gallstones. Am J Surg 1993; 165:410–419. 40. Renshaw PE, Janoff AS, Miller KW. On the nature of dilute aqueous cholesterol suspensions. J Lipid Res 1987; 28:673–683. 41. Carey MC, LaMont JT. Cholesterol gallstone formation: 1. Physical chemistry of bile and biliary lipid secretion. Prog Liver Dis 1993; 10:139–163. 42. Admirand WH, Small DM. The physical chemical basis of cholesterol solubility in bile: relationship to gallstone formation and dissolution in man. J Clin Invest  1968; 47:1043–1052. 43. Carey MC, Small DM. The physical chemistry of cholesterol solubility in bile: relationship to gallstone formation and dissolution in man. J Clin Invest 1978;  61:998–1026. 44. Mackay C, Crook JN, Smith DC, McAllister RA. The composition of hepatic and gallbladder bile in patients with gallstones. Gut 1972; 13:759–762. 45. Bennion L, Grundy SM. Risk factors for the development of cholelithiasis in man. N Engl J Med 1978; 299:1161–1167. 46. Grundy SM, Metzger AL, Adler RD. Mechanism of lithogenic bile formation in American Indian women with cholesterol gallstones. J Clin Invest 1972; 51:3026– 3042. 47. Grundy SM, Ahrens EHJ, Salen G, Schreibman PH, Nestel PJ. Mechanisms of action of clofibrate on cholesterol metabolism in patients with hyperlipidemia. J  Lipid Res 1972; 13:531–551. 48. Vlahcevic ZR, Bell CCJ, Buhac I, Farrar JT, Swell L. Diminished bile acid pool size in patients with gallstones. Gastroenterology 1970; 59:165–173. 49. Reuben A, Maton PN, Murphy GM, Dowling RH. Bile lipid secretion in obese and non­obese individuals with and without gallstones. Clin Sci 1985; 69:71–79. 50. Kern FJ, Everson GT. Contraceptive steroids increase cholesterol secretion in bile: mechanism of action. J Lipid Res 1987; 28:828–839. 51. Kern FJ, Everson GT, DeMark B, McKinley C, Showalter R, Erfling W, Braverman DZ, Szczepanik­Van Leeuwen P, Klein PD. Biliary lipids, bile acids and  gallbladder function in the human female: effects of pregnancy and the ovulatory cycle. J Clin Invest 1981; 68:1229–1242. 52. Kern FJ, Everson GT, DeMark B, McKinley C, Showalter R, Erfling W, Braverman DZ, Szczepanik­Van Leeuwen P, Klein PD. Biliary lipids, bile acids and  gallbladder function

  

Page 378

in the human female: effects of contraceptive steroids. J Lab Clin Med 1982; 99:798–805. 53. Scragg RKR, McMichael AJ, Seamark RF. Oral contraceptives, pregnancy and endogenous oestrogen in gallstone disease: a case controlled study. BMJ 1984;  2:1795. 54. Mabee TM, Meyer P, DenBesten L, Mason EE. The mechanism of increased gallstone formation in obese human subjects. Surgery 1976; 79:460–468. 55. Madura JA, Loomis RC, Harris RA, Grosfield J, Tompkins RK. Relationship of obesity to bile lithogenicity in man. Ann Surg 1979; 189:106–111. 56. Mok HYI, Von Bergmann K, Crouse JR, Grundy SM. Biliary lipid metabolism in obesity. Effects of bile acid feeding before and during weight reduction.  Gastroenterology 1979; 76:556–567. 57. Bennion LJ, Grundy SM. Effects of obesity and caloric intake on biliary lipid metabolism in man. J Clin Invest 1975; 56:996–1011. 58. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JH, Brewer WH, Moore EW. Gallstones in patients with morbid obesity: relationship to body weight, weight loss and  gallbladder bile cholesterol solubility. Int J Obesity 1993; 17:153–158. 59. Barbara L, Sama C, Labate AMM, Taroni F, Rusticali AG, Festi D, Sapio C, Roda E, Banterle C, Puci A, Formentini F, Colasanti S, Nardin F. A population  study on the prevalence of gallstone disease: the Sirmione study. Hepatology 1987; 7:913–917. 60. Capocaccia L, Giunchi G, Pocchiari F and GREPCO. The epidemiology of gallstone disease in Rome, Italy: Part II. Factors associated with the disease.  Hepatology 1988; 8:907–913. 61. Maclure KM, Hayes KC, Colditz GA, Stampfer MJ, Speizer FE, Willett WC. Weight, diet and the risk of symptomatic gallstones in middle­aged women. N Engl  J Med 1989; 321:563–569. 62. Jorgensen T. Gallstones in a Danish population: relation to weight, physical activity, smoking, coffee consumption and diabetes mellitus. Gut 1989; 30:528–534. 63. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Changes in gallbladder bile composition following gallstone formation and weight reduction.  Gastroenterology 1992; 103:214–221. 64. Shiffman ML, Shamburek RD, Schwartz CC, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Effect of gallstone formation on the phospholipid, bile salt and mucin  content of gallbladder bile in persons undergoing rapid weight reduction. Gastroenterology 1993; 105:1200–1208. 65. Liddle RA, Goldstein RB, Saxton J. Gallstone formation during weight reduction dieting. Arch Intern Med 1989; 149:1750–1753. 66. Yang H, Petersen GM, Roth MP, Schoenfield LJ, Marks JW. Risk factors for gallstone formation during rapid loss of weight. Dig Dis Sci 1992; 37:912–918. 67. Wattchow DA, Hall JC, Whiting MJ, Bradley B, Iannos J, Watts JM. Prevalence and treatment of gall stones after gastric bypass surgery for morbid obesity.  BMJ 1993; 286:763. 68. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Brewer WH, Moore EW. Gallstone formation following rapid weight loss: a prospective study in patients undergoing  gastric bypass surgery for treatment of morbid obesity. Am J Gastroenterol 1991; 86:1000–1005. 69. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 70. Gollish SH, Burnstein MJ, Ilson RG, Petrunka CN, Strasberg SM. Nucleation of cholesterol monohydrate crystals from hepatic and gall­bladder bile of patients  with cholesterol gall stones. Gut 1983; 24:836–844. 71. Groen AK, Drapers JAG, Tytgat GNJ. Cholesterol nucleation and gallstone formation. J Hepatol 1988; 6:383–387. 72. Harvey PRC, Strasberg SM. Will the real cholesterol nucleating and anti­nucleating proteins please stand up. Gastroenterology 1979; 77:611–617.

  

Page 379

73. Abei M, Schwarzendrube J, Nuutinen H, Broughan TA, Kawczak P, Williams C, Holzbach RT. Cholesterol crystalization­promoters in human bile: comparative  potencies of immunoglobulins, a 1­acid glycoprotein, phospholipase C and aminopeptidase N. J Lipid Res 1993; 34:1141–1148. 74. Aravinda Upadhya G, Harvey PRC, Strasberg SM. Effect of human biliary immunoglobulins on the nucleation of cholesterol. J Biol Chem 1993; 268:5193–5200. 75. Afdhal NH, Niu N, Gantz D, Small DM, Smith BF. Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrate crystal growth in model bile. Gastroenterology  1993; 104:1515–1523. 76. Levy PF, Smith BF, LaMont JT. Human gallbladder mucin accelerates in vitro nucleation of cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87:270–275. 77. Gallinger S, Taylor RD, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of mucous glycoprotein on the nucleation time of human gallbladder bile.  Gastroenterology 1985; 89:648–658. 78. Smith BF. Human gallbladder mucin binds biliary lipids and promotes cholesterol crystal nucleation in model biles. J Lipid Res 1987; 28:1088–1097. 79. Sedaghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980; 302:1274–1277. 80. Lee SP, LaMont JT, Carey MC. The role of gallbladder mucus hypersecretion in the evolution of cholesterol gallstones: studies in the prairie dog. J Clin Invest  1981; 67:1712–1723. 81. Pemsingh RS, MacPherson BR, Scott GW. Mucus hypersecretion in the gallbladder epithelium of ground squirrels fed a lithogenic diet for the induction of  cholesterol gallstones. Hepatology 1987; 7:1267–1271. 82. Lee SP, Scott AF. The evolution of morphologic changes in the gallbladder before stone formation in mice fed a cholesterol­cholic acid diet. Am J Pathol 1982;  108:1–8. 83. Lee SP, Carey MC, LaMont JT. Aspirin prevention of cholesterol gallstone formation in prairie dogs. Science 1985; 98:445–451. 84. Smith BF, LaMont JT. Bovine gallbladder mucin binds bilirubin in vitro. Gastroenterology 1983; 85:707–712. 85. Smith BF, LaMont JT. Identification of gallbladder mucin­bilirubin complex in human cholesterol gallstone matrix: effects of reducing agents on in vitro dissolution  of matrix and intact gallstones. J Clin Invest 1985; 76:439–445. 86. LaMorte WW, LaMont JT, Hale W, Booker ML, Scott TE, Turner B. Gallbladder prostaglandins and lysophospholipids as mediators of mucin secretion during  cholelithiasis. Am J Physiol 1986; 14:G701–G709. 87. LaMore WW, Booker ML, Scott TE, Williams LF. Increases in gallbladder prostaglandin synthesis before the formation of cholesterol gallstones. Surgery 1985;  98:445–451. 88. Lee SP. Lessons from experimental cholelithiasis: gallbladder and mucosa, nonsteroidal inflammatory drugs and gallstones. Gastroenterology 1991; 101:857–860. 89. LaMont JT, Turner BS, DiBenedetto D, Handlin R, Schafer Al. Arachidonic acid stimulates mucin secretion in prairie dog gallbladder. Am J Physiol 1983;  8:G92–G98. 90. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge? Gastroenterology 1988; 95:508–523. 91. O'Leary DP, Murray FE, Turner BS, LaMont JT. Bile salts stimulate glycoprotein release by guinea pig gallbladder in vitro. Hepatology 1991; 13:957–961. 92. Van Berge Henegouwen GP, van der Werf SDJ, Ruben AT. Fatty acid composition of phospholipids in bile in man: promoting effect of deoxycholate on  arachidonate. Clin Chim Acta 1987; 165:27–37. 93. Rege RV, Prystowsky JB. Crystalline cholesterol reduces sodium transport in guinea pig gallbladder. Gastroenterology 1993; 104:1515–1523. 94. Marks JW, Bonnorris GG, Albers G, Schoenfield LJ. The sequence of biliary events preceeding the formation of gallstones in humans. Gastroenterology 1992;  103:566–570.

  

Page 380

95. Everson GT. Gallbladder function in gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:85–110. 96. Fisher RS, Stelzer F, Rock E, Malmud LS. Abnormal gallbladder emptying in patients with gallstones. Dig Dis Sci 1982; 27:1019–1024. 97. Forgacs IC, Maisey MN, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and ursodeoxycholic acid therapy on gallbladder emptying. Gastroenterology 1984;  87:299–307. 98. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 99. Sylwestrowicz TA, Shaffer EA. Gallbladder function during gallstone disolution: effect of bile acid therapy in patients with gallstones. Gastroenterology 1988;  95:740–748. 100. Pauletzki J, Cicala M, Holl J, Sauerbruch T, Schafmayer A, Paumgartner G. Correlation between gall bladder fasting volume and postprandial emptying in  patients with gall stones and healthy controls. Gut 1993; 34:1443–1447. 101. Pomeranz IS, Davison JS, Shaffer EA. The effects of prosthetic gallstones on gallbladder function and bile composition. J Surg Res 1986; 41:47–52. 102. Pellegrini C, Ryan T, Broderick W, Way LW. Gallbladder filling and emptying during cholesterol gallstone formation in the prairie dog: a cholescintigraphic  study. Gastroenterology 1986; 90:143–149. 103. Fridhandler TM, Davison JS, Shaffer EA. Defective gallbladder contractility in the ground squirrel and prairie dog during the early stages of cholesterol gallstone  formation. Gastroenterology 1983; 85:830–836. 104. Doty JE, Pitt HA, Kuchenbecker SL, DenBesten L. Impaired gallbladder emptying before gallstone formation in the prairie dog. Gastroenterology 1983;  85:168–174. 105. Li YF, Moody FG, Weisbrodt NW, Zalewsky CA, Coelho JCU, Senninger N. Decrease in contractility of prairie dog gallbladder muscle strips following  cholesterol feeding. Surg Forum 1984; 35:224–226. 106. Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore, EW. Human gallbladder mucosal function: effects of concentration and acidification of bile on biliary cholesterol and  calcium solubility. Gastroenterology 1990; 99:1452–1459. 107. Neiderhiser DH, Harmon CK, Roth HP. Absorption of cholesterol by the gallbladder. J Lipid Res 1976; 17:117–124. 108. Behar J, Lee KY, Thompson WR, Biancani P. Gallbladder contraction in patients with pigment and cholesterol gallstones. Gastroenterology 1989; 97:1479– 1484. 109. Yu P, Chen Q, Biancani P, Behar J. Membrane cholesterol alters gallbladder muscle contractility in prairie dogs. Am J Physiol 1996; 271:G56–G61. 110. Trotman BW, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: clinical and epidemiological aspects. Am J Dig Dis 1975; 20:735–740. 111. Trotman BW. Pigment gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:111–126. 112. Nicholas P, Rinaudo PA, Conn HO. Increased incidence of cholelithiasis in Laennec's cirrhosis: a postmortem evaluation of pathogenesis. Gastroenterology  1972; 63:112–118. 113. Fornari F, Civardi G, Buscarini E, Cavanna L, Imberti D, Rossi S, Sbolli G, Di Stasi M, Buscarini L. Cirrhosis of the liver: a risk factor for development of  cholelithiasis in males. Dig Dis Sci 1990; 35:1403–1408. 114. Messing B, Bories C, Kunstlinger F, Bernier JJ. Does total parenteral nutrition induce gallbladder sludge formation and lithiasis. Gastroenterology 1983;  84:1012–1019. 115. Levinson DE, Fromm H. Medical management of gallbladder disease. In: Zakim D, Boyer JD, eds. Hepatology: A Textbook of Liver Disease. Philadelphia:  Saunders, 1996, pp 1877–1897. 116. Roslyn JL, Pitt HA, Mann LL, Ament ME, DenBesten L. Gallbladder disease in patients on long term parenteral nutrition. Gastroenterology 1983; 84:148–154. 117. Soloway RD, Trotman BW, Maddrey WC, Nakayama F. Pigment gallstone composition in patients with hemolysis of infection/stasis. Dig Dis Sci 1986;  31:454–460.

  

Page 381

118. Lee SP. Pathogenesis of biliary sludge. Hepatology 1990; 12:200S–205S. 119. Lee SP, Maher K, Nicholls JF. Origin and fate of biliary sludge. Gastroenterology 1988; 94:170–178. 120. Lee SP, Nicholls JF. Nature and composition of biliary sludge. Gastroenterology 1986; 90:677–686. 121. Bolondi L, Gaini S, Testa S, Labo G. Gallbladder sludge formation during prolonged fasting after gastrointestinal surgery. Gut 1985; 26:734–738. 122. Cohen S. The sluggish gallbladder of pregnancy. N Engl J Med 1980; 302:397–399. 123. Maringhini A, Ciambra M, Baccelliere P, Raimondo M, Pagliaro L. Sludge, stones and pregnancy. Gastroenterology 1988; 95:1160–1161. 124. Gafa M, Sarli L, Miselli A, Pietra N, Carreras F, Peracchia A. Sludge and microlithiasis of the biliary tract after total gastrectomy and postoperative total  parenteral nutrition. Surg Gynecol Obstet 1987; 165:413–418. 125. Janowitz P, Kratzer W, Zemmler T, Tudyka J, Wechsler JG. Gallbladder sludge: spontaneous course and incidence of complications in patients without stones.  Hepatology 1994; 20:291–294. 126. Thijs C, Knipschild P, Leffers P. Is gallstone disease caused by obesity or by dieting? Am J Epidemiol 1992; 135:274–280. 127. Stampfer MJ, Maclure KM, Colditz GA, Manson JE, Willett WC. Risk of symptomatic gallstones in women with severe obesity. Am J Clin Nutr 1992;  55:652–658. 128. Sugerman HJ, Starkey JV, Birkenhauer R. A randomized prospective trial of gastric bypass versus vertical banded gastroplasty for morbid obesity and their  effects on sweets versus non­sweets eaters. Ann Surg 1987; 205:613–624. 129. Thiet MD, Mittelstaedt CA, Herbst CA, Buckwalter JA. Cholelithiasis in morbid obesity. South Med J 1984; 77:415–417. 130. Amaral JF, Thompson WR. Gallbladder disease in the morbidly obese. Am J Surg 1985; 149:551–557. 131. Ginanni­Corradini S, Yamashita G, Nuutinen H, Chernosky A, Williams C, Hays L, Shiffman ML, Walsh RM, Svanvik J, Della Guardia P, Capocaccia L,  Holzbach RT. Variations in pigment and carbohydrate content of gallbladder bile affect accurate quantitation of total protein when using the fluorescamine method.  Scand J Gastroenterol 1997; 32:340–349. 132. Vezina WC, Paradis RL, Grace DM, Zimmer RA, Lamont DD, Rycroft KM, King ME, Hutton LC, Chey WY. Increased volume and decreased emptying of  the gallbladder in large (morbidly obese, tall normal and muscular normal) people. Gastroenterology 1990; 98:1000–1007. 133. Marzio L, Capone F, Neri M, Mezzetti A, De Angelis C, Cuccurullo F. Gallbladder kinetics in obese patients: effect of a regular meal and a low­calorie meal.  Dig Dis Dis 1988; 33:4–9. 134. Marks JW, Bonorris GG, Schoenfield LJ. Roles of deoxycholate and arachidonate in pathogenesis of cholesterol gallstones in obese patients during rapid loss of  weight. Dig Dis Sci 1991; 36:957–960. 135. Stone BG, Ansel HJ, Peterson FJ, Gebhard RL. Gallbladder emptying stimuli in obese and normal weight subjects. Hepatology 1992; 15:795–798. 136. Vassilakis JS, Pechlivanides G, Fountos A, Zoras OJ, Xynos E. Roux­en­Y gastroenterostomy severely disturbs emptying of the gallbladder. J Am Coll Surg  1994; 179:313–317. 137. Kellum JH, Kuemmerle J, O'Dorisio T, Rayford P, Martin D, Engle K, Wolf N, Sugerman H. Gastrointestinal hormone responses to meals before and after  bypass and vertical banded gastroplasty. Ann Surg 1990; 211:763–771. 138. Inoue K, Fuchigami A, Higashide S, Sumi S, Kogire M, Suzuki T, Tobe T. Gallbladder sludge and stone formation in relation to contractile function after  gastrectomy. Ann Surg 1992; 215:19–26.

  

Page 382

139. Apstein MD, Dalecki­Chipperfield K. Spinal cord injury is a risk factor for gallstone disease. Gastroenterology 1987; 92:966–968. 140. Ketover SR, Ansel HJ, Goldish G, Roche B, Gebhard RL. Gallstones in chronic spinal cord injury: is impaired gallbladder emptying a risk factor. Arch Phys  Med Rehabil 1996; 77:1136–1138. 141. GREPCO­Rome group for the epidemiology and prevention of cholelithiasis: prevention of gallstone disease in an Italian adult female population. Am J  Epidemiol 1984; 119: 796–805. 142. Buiumsohn A, Albu E, Gerst PH, Subbara O. Cholelithiasis and teenage mothers. J Adolesc Health Care 1990; 11:339–342. 143. Henriksson P, Einarsson K, Eriksson A, Kelter U, Angelin B. Estrogen­induced gallstone formation in males. J Clin Invest 1989; 84:811–816. 144. Braverman DZ, Johnson ML, Kern F Jr. Effects of pregnancy and contraceptive steroids on gallbladder function. N Engl J Med 1980; 302:362–364. 145. Everson GT, McKinley C, Lawson M, Johnson M, Kern F Jr. Gallbladder function in the human female: effect of the ovulatory cycle, pregnancy and  contraceptive steroids. Gastroenterology 1982; 82:711–719. 146. Braverman DZ, Herbert D, Goldstein R, Persitz E, Eylath U, Jacobsohn WZ. Postpartum restoration of pregnancy­induced cholecystoparesis and prolonged  intestinal transit time. J Clin Gastroenterol 1988; 10:642–646. 147. Fisher RS, Roberts GS, Grabowski CJ, Cohen S. Inhibition of lower esophageal sphincter circular muscle by female sex hormones. Am J Physiol 1978;  234:E243–E247. 148. Keane P, Colwell D, Baer HP, Clanachan AS. Effects of age, gender and female sex hormones upon contractility of the human gallbladder in vitro. Surg  Gynecol Obstet 1986; 163:555–560. 149. Ryan JP, Pellecchia D. Effect of progesterone pretreatment on guinea pig gallbladder motility in vitro. Gastroenterology 1982; 83:81–83. 150. Shaffer EA, Taylor PJ, Logan K, Gadomski S, Corenblum B. The effect of progestin on gallbladder function in young women. Am J Obstet Gynecol 1984;  148:504–507. 151. Friley MD, Douglas G. Acute cholecystitis in pregnancy and the puerperium. Am Surg 1972; 38:314–317. 152. Glen F, McSherry CK. Gallstones and pregnancy among 300 young women treated by cholecystectomy. Surg Gynecol Obstet 1968; 127:1067–1072. 153. Hill LM, Johnson CE, Lee RA. Cholecystectomy in pregnancy. Obstet Gynecol 1975; 46:291–293. 154. Dowling RH, Hussaini SH, Murphy GM, Besser GM, Was JAH. Gallstones during octreotide therapy. Metabolism 1992; 41(suppl 2):22–33. 155. Boden G, Shimoyama R. Somatostatinoma. Contemp Issues Gastroenterol 1985; 5:95–99. 156. Fisher RS, Rock E, Levin G, Malmud L. Effects of somatostatin on gallbladder emptying. Gastroenterology 1987; 92:885–890. 157. Page MD, Millward ME, Taylor A, Preece M, Hourihan M, Hall R. Long term treatment of acromegally with a long­acting analogue of somatostatin, octreotide.  Q J Med 1990; 74:189–201. 158. Ho KY, Weissberger AJ, Marbach P, Lazarus L. Therapeutic efficacy of the somatostatin analog SMS 201–995 (octreotide) in acromegaly. Ann Intern Med  1990; 112:173–181. 159. Plockinger V, Dienemann D, Quabbe HJ. Gastrointestinal side­effects of octreotide during long term treatment of acromegaly. J Clin Endocrinol Metab 1990;  71:1658–1662. 160. Roti E, Minelli R, Gardini E, Salvi M, Bianconi L, Balducci L, Manfredi A, Braverman LE. Chronic treatment with a long­acting somatostatin analogue in a  patient with intestinal carcinoid tumor: occurrence of cholelithiasis. J Endocrinol Invest 1990; 13:69–72. 161. Redfern JS, Fortuner WJ II. Octreotide associated biliary tract dysfunction and gallstone formation: pathophysiology and management. Am J Gastroenterol  1995; 90:1042–1052.

  

Page 383

162. Hussaini SH, Pereira SP, Veysey MJ, Kennedy C, Jenkins P, Murphy GM, Wass JAH, Dowling RH. Roles of gall bladder emptying and intestinal transit in the  pathogenesis of octreotide induced gall bladder stones. Gut 1996; 38:775–783. 163. Stolk MFJ, van Erpecum KJ, Koppeschaar HPF, Samsom M, Smout AJPM, Akkermans LMA, Peeters TL, vanBerge­Henegouwen GP. Effect of octreotide  on fasting gall bladder emptying, antroduodenal motility and motilin release in acromegally. Gut 1995; 36: 755–760. 164. Erlinger S, Chanson P, Dumont M, Ponsot P, Warnet A, Harris AG. Effects of octreotide on biliary lipid composition and occurrence of cholesterol crystals in  patients with acromegaly: a prospective study. Dig Dis Sci 1994; 39:2384–2388. 165. Buscail L, Tauber JP, Escourrou J, et al. Gallstone formation and occurrence of cholesterol monohydrate crystals in gallbladder bile of patients with long­term  sandostatin treatment. Gastroenterol Clin Biol 1991; 15:800–804. 166. Einarsson K, Nilsell K, Leijd B, Angelin B. Influence of age on secretion of cholesterol and synthesis of bile acids by the liver. N Engl J Med 1985; 313:277– 282. 167. Khalil T, Walker JP, Wiener I, Fagan CJ, Townsend CM Jr, Greeley GH Jr, Thompson JC. Effect of aging on gallbladder contraction and release of  cholecystokinin­33 in humans. Surgery 1985; 98:423–429. 168. Capocaccia L, Giunchi G, Pocchiari F and GREPCO. The epidemiology of gallstone disease in Rome, Italy: Part I. Prevalence data in men. Hepatology 1988;  8:904–906. 169. Stone BG, Gavaler JS, Belle SH, Shreiner DP, Peleman RR, Sarva RP, Yingvorapant N, Van Thiel DH. Impairment of gallbladder emptying in diabetes mellitus.  Gastroenterology 1988; 95:170–176. 170. Marks JW, Conley DR, Capretta TL, Bonorris GG, Chung A, Coyne MJ, Schoenfield LJ. Gallstone prevalence and biliary lipid composition in inflammatory  bowel disease. Am J Dis Sci 1977; 22:1097–1100. 171. Heaton KW, Read AE. Gall stones in patients with disorders of the terminal ileum and disturbed bile acid metabolism. BMJ 1969; 3:494–496. 172. Kato I, Nomura A, Stemmermann GN, Chyou PH. Prospective study of clinical gallbladder disease and its association with obesity, physical activity, and other  factors. Dig Dis Sci 1992; 37:784–790. 173. Williams CN, Johnson JL. Prevalence of gallstones and risk factors in Caucasian women in a rural Canadian community. Can Med Assoc J 1980; 122:664– 668. 174. Leitzmann MF, Giovannucci EL, Rimm, EB, Stampfer MJ, Spiegelman D, Wing AL, Willett WC. The relation of physical activity to risk for symptomatic  gallstone disease in men. Ann Intern Med 1998; 128:417–425. 175. Baker TT, Allen D, Lei KY, Willcox KK. Aterations in lipid and protein profiles of plasma lipoproteins in middle­aged men consequent to an aerobic exercise  program. Metabolism 1986; 35:1037–1043. 176. Tran ZV, Weltman A, Glass GV, Mood DP. The effects of exercise on blood lipids and lipoproteins: a meta­analysis of studies. Med Sci Sports Exerc 1983;  15:393–402. 177. Halloran LG, Schwartz CC, Vlahcevic ZR, Nisman RM, Swell L. Evidence for high­density lipoprotein­free cholesterol as the primary precursor for bile acid  synthesis in man. Surgery 1978; 84:1–7. 178. Thornton JR, Heaton KW, Macfarlane DG. A relation between high­density­lipoprotein cholesterol and bile cholesterol saturation. BMJ 1981; 283:1352–1354. 179. Petitti DB, Friedman GD, Klatsky AL. Association of a history of gallbladder disease with a reduced concentration of high­density­lipoprotein cholesterol. N  Engl J Med 1981; 304:1396–1398. 180. Mingrone G, Greco AV, Finotti E, Passi S. Free fatty acids: a stimulus for mucin hypersecretion in cholesterol gallstone biles. Biochim Biophys Acta 1988;  958:52–59. 181. Philipp E, Wilckens T, Friess E, Platte P, Pirke KM. Cholecystokinin, gastrin and stress hormone responses in marathon runners. Peptides 1992; 13:125–128. 182. Hoy MK, Heshka S, Allison DB, Grassett E, Blank R, Abiri M, Heymsfield SB. Reduced

  

Page 384

risk of liver­function­test abnormalities and new gallstone formation with weight loss on 3350­J (800­kcal) formula diets. Am J Clin Nutr 1994; 60:249–254. 183. Ortega RM, Fernandez­Azuela M, Encinas­Solillos A, Andres P, Lopez­Sobaler AM. Differences in diet and food habits between patients with gallstones and  controls. J Am Coll Nutr 1997; 16:88–95. 184. Simon JA, Grady D, Snabes MC, Fong J, Hunninghake DB. Ascorbic acid supplement use and the prevalence of gallbladder disease. J Clin Epidemiol 1998;  51:257–265. 185. Simon JA, Hudes ES. Serum ascorbic acid and other correlates of gallbladder disease among US adults. Am J Public Health 1998; 88:1208–1212. 186. Jenkins SA. Biliary lipids, bile acids and gallstone formation in hypovitaminotic C guinea­pigs. Br J Nutr 1978; 40:317–322. 187. Ginter E. Cholesterol: vitamin C controls its transformation to bile acids. Science 1973; 179:702–704. 188. Salen G, Tint GS, Shefer S. Treatment of cholesterol gallstones with litholytic bile acids. Gastroenterol Clin North Am 1991; 20:171–182. 189. Maton PN, Ellis HJ, Higgins MJ, Dowling RH. Hepatic HMG CoA reductase in human cholelithiasis: effects of chenodeoxycholic and ursodeoxycholic acids.  Eur J Clin Invest 1980; 10:325–332. 190. Salen G, Colalillo A, Verga D, Bagan E, Tint GS, Shefer S. Effect of high and low doses of ursodeoxycholic acid on gallstone dissolution in humans.  Gastroenterology 1980; 78:1412–1418. 191. Angelin B, Ewerth S, Einarsson K. Ursodeoxycholic acid treatment in cholesterol gallstone disease: effect on hepatic 3­hydroxy­3­methyl­glutaryl coenzyme A  reductase activity, biliary lipid composition and plasma lipid levels. J Lipid Res 1983; 24:461–468. 192. Carulli N, Ponz De Leon M, Zironi F, Pinetti A, Smerieri A, Iori R, Loria P. Hepatic cholesterol and bile acid metabolism in subjects with gallstones:  comparative effects of short term feeding of chenodeoxycholic and ursodeoxycholic acids. J Lipid Res 1980; 21:35–43. 193. Carulli N, Loria P, Bertolotti M, Ponz de Leon M, Menozzi D, Medici G, Piccagli I. Effects of acute changes of bile acid pool composition on biliary lipid  secretion. J Clin Invest 1984; 74:614–624. 194. Hardison WGM, Grundy SM. Effect of ursodeoxycholic acid and its taurine conjugate on bile acid synthesis and cholesterol absorption. Gastroenterology 1984;  87:130–135. 195. Stiehl A, Raedsch R, Rudolph G, Walker S. Effect of ursodeoxycholic acid on biliary bile acid and bile lipid composition in gallstone patients. Hepatology 1984;  4(1):107–111. 196. Von Bergmann K, Epple­Gutsfeld M, Leiss O. Differences in the effects of chenodeoxycholic and ursodeoxycholic acid on biliary lipid secretion and bile acid  synthesis in patients with gallstones. Gastroenterology 1984; 87:136–143. 197. Igimi H, Carey MC. Cholesterol gallstone dissolution in bile: dissolution kinetics of crystalline (anhydrate and monohydrate) cholesterol with chenodeoxycholate,  ursodeoxycholate and their glycine and taurine conjugates. J Lipid Res 1981; 22:254–270. 198. Tazuma S, Sasaki H, Mizuno S, Sagawa H, Hashiba S, Horiuchi I, Kajiyama G. Effect of ursodeoxycholic acid administration on nucleation time in human  gallbladder bile. Gastroenterology 1989; 97:173–178. 199. Van Erpecum KJ, Van Berge Henegouwen GP, Stolk MFJ, Hopman WPM, Jansen JBMJ, Lamers CBHW. Effects of ursodeoxycholic acid on gallbladder  contraction and cholecystokinin release in gallstone patients and normal subjects. Gastroenterology 1990; 99: 836–842. 200. Forgacs IC, Maisey MN, Murphy GM, Dowling RH. Influence of gallstones and ursodeoxycholic acid therapy on gallbladder emptying. Gastroenterology 1984;  87:299–307. 201. Sylwestrowicz T, Shaffer EA. Gallbladder function during gallstone dissolution: effect of bile acid therapy in patients with gallstones. Gastroenterology 1988;  95:740–748.

  

Page 385

202. Kutz C, Schulte A. Effectiveness of ursodeoxycholic acid in gallstone dissolution. Gastroenterology 1977; 73:632–633. 203. Maton PN, Murphy GM, Dowling RH. Ursodeoxycholic acid treatment of gallstones. Lancet 1977; 2:1297–1301. 204. Bachrach WJ, Hofmann AF. Ursodeoxycholic acid in the treatment of cholesterol cholelithiasis: part II. Dig Dis Sci 1982; 27:833–856. 205. O'Donnell LDJ, Heaton KW. Recurrence and re­recurrence of gallstones after medical dissolution: a longterm follow­up. Gut 1988; 29:655–658. 206. Tint GS, Salen G, Shefer S. Effect of ursodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid on cholesterol and bile acid metabolism. Gastroenterology 1986;  91:1007–1018. 207. Scott LD. Gallstone disease and pancreatitis in pregnancy. Gastroenterol Clin North Am 1992; 21:803–815. 208. Brotschi EA, LaMorte WW, Williams LF. Effect of dietary cholesterol and indomethacin in cholelithiasis and gallbladder motility in guinea pig. Dig Dis Sci 1984;  29:1050–1056. 209. Li YF, Russell DH, Myers SI, Weisbrodt NW, Moody FG. Gallbladder contractility in aspirin­ and cholesterol­fed prairie dogs. Gastroenterology 1994;  106:1662–1667. 210. Borch K, Chu M, Carlsson B, Rehfeld JF. Endogenous hypercholecystokininemia but not aspirin reduces the gallstone incidence in the hamster model. Scand J  Gastroenterol 1994; 29:740–743. 211. Sterling RK, Shiffman ML, Sugerman HJ, Moore EW. Effect of NSAIDs on gallbladder bile composition. Dig Dis Sci 1995; 40:2220–226. 212. O'Donnell LJD, Wilson P, Guest P, Catnach SM, McLean A, Wickham JEA, Fairclough PD. Indomethacin and postprandial gallbladder emptying. Lancet  1992; 339:269–271. 213. Hood KA, Ruppin DC, Gleeson D, Dowling RH. Prevention of gallstone recurrence by non­steroidal anti­inflammatory drugs. Lancet 1988; 26:1223–1225. 214. Hood KA, Gleeson D, Ruppin RH, Dowling RH. British­Belgian gall stone study group: gall stone recurrence and its prevention: the British­Belgian gall stone  study group's post­dissolution trial. Gut 1993; 34:1277–1288. 215. Pazzi P, Scagliarini R, Sighinolfi D, Govoni M, La Corte R, Gullini S. Non­steroidal anti­inflammatory drug use and gallstone disease prevalence: a case control  study. Am J Gastroenterol 1998; 93(9):1420–1424. 216. Kurata JH, Marks J, Abbey D. One gram of aspirin per day does not reduce the risk of hospitalization for gallstone disease. Dig Dis Sci 1991; 36:1110–1115. 217. Sterling RK, Shiffman ML. Non­steroidal anti­inflammatory drugs and gallstone disease: will an aspirin a day keep the gallstones away? Am J Gastroenterol  1998; 93(9):1405–1407. 218. Grundy SM. HMG­CoA reductase inhibitors for treatment of hypercholesterolemia. N Engl J Med 1988; 319:24–33. 219. Reihner E, Rudling M, Stahlberg D, Berglund L, Ewerth S, Bjorkhem I, Einarsson K, Angelin B. Influence of pravastatin, a specific inhibitor of HMG­CoA  reductase, on hepatic metabolism of cholesterol. N Engl J Med 1990; 323:224–228. 220. Hillebrant CG, Axelson M, Bjorkhem I, Wang FH, Nyberg B, Einarsson C. Effects of short term treatment with pravastatin on the hepatic synthesis of  cholesterol and bile acids in gallstone patients. Eur J Clin Invest 1998; 28:324–328. 221. Duane WC, Hunninghake DB, Freeman ML, Pooler PA, Schlasner LA, Gebhard RL. Simvistatin, a competitive inhibitor of HMG­CoA reductase, lowers  cholesterol saturation index of gallbladder bile. Hepatology 1988; 8:1147–1150. 222. Hoogerbrugge van der Linden N, de Rooy FWM, van Blankenstein M. The effect of pravastatin on biliary lipid composition and bile acid synthesis in familial  hypercholesterolemia. Gut 1990; 31:348–350. 223. Smit JWA, Van Erpecum KJ, Stolk MFJ, Geerdink RA, Cluysenaer OJJ, Erkelens DW, Van Berge Henegouwen GP. Successful dissolution of cholesterol  gallstone during treatment with pravastatin. Gastroenterology 1992; 103:1068–1070.

  

Page 386

224. Sharma BC, Agarwal DK, Baijal SS, Saraswat VA. Pravastatin has no effect on bile lipid composition, nucleation time and gallbladder motility in persons with  normal levels of cholesterol. J Clin Gastroenterol 1997; 25:433–436. 225. Sitzmann JV, Pitt HA, Steinborn PA, Pasha ZR, Sanders RC. Cholecystokinin prevents parenteral nutrition induced biliary sludge in humans. Surg Gynecol  Obstet 1990; 170: 25–31. 226. Patankar R, Ozen MM, Sanderson A, Johnson CD. Effect of cisapride on gallbladder emptying and plasma CCK in normal and vagotomized human subjects.  Dig Dis Sci 1996; 41:543–548. 227. Takaoka M, Kubota Y, Fujimura K, Ogura M, Kin H, Yamamoto S, Inoue K. Effect of single and multiple administrations of cisapride on postprandial  gallbladder emptying in healthy humans. Intern Med 1994; 33:381–386. 228. Thorens J, Schnegg JF, Brignoli R, Froehlich F, Jansen JB, Dorta G, Blum AL, Gonvers JJ, Fried M. Effect of cisapride on gallbladder motility after  extracorporeal shock­wave lithotripsy. J Hepatol 1995; 22:333–337. 229. Xu QW, Scott RB, Tan DTM, Shaffer EA. Effect of prokinetic agent, erythromycin, in the Richardson round squirrel model of cholesterol gallstone disease.  Hepatology 1998; 28:613–619.

  

Page 387

17—  The Gallbladder and Biliary Tree in Cystic Fibrosis Michael P. Curry and John E. Hegarty St. Vincent's University Hospital, Dublin, Ireland I—  Introduction Cystic fibrosis (CF) is the most common severe autosomal recessive disorder in the Caucasian population, with a frequency of 1 in 2000 births and a calculated  carrier frequency of 5%. The first comprehensive report of cystic fibrosis was published in 1938 and highlighted the variability in clinical presentation, pathological  findings, and outcome of patients with the disease. The term mucoviscidosis was coined in 1944 to reflect the importance of exocrine gland obstruction by inspissated  mucus throughout multiple organ systems. Subsequently, in 1985, the gene for CF was mapped to chromosome 7. The gene and its product are termed the cystic  fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). The basic defect in the CFTR involves the abnormal control of ion and water transport across epithelial  cells, resulting in the production of an abnormally viscous luminal secretion and reduced hydration of ductal mucus in the airways, pancreas, liver, and reproductive  systems, leading to progressive obstructive damage. Until recent years, the incidence of subclinical liver disease has been overshadowed by respiratory and pancreatic  complications. However, with increasingly effective management of such complications, resulting in better survival, management of liver disease and its complications  has become important to a larger number of patients. Some 60% of CF patients now survive to adulthood. Liver disease is the second leading cause of death in CF  and affects approximately 20 to 30% of adolescents and adults. Focal biliary cirrhosis is the pathognomonic hepatic lesion, which can progress to multilobular biliary  cirrhosis, with signs and symptoms of cirrhosis and portal hypertension. Approximately 10% of this group will require liver transplantation for complications of their  liver disease. Liver disease in CF may also occur as a consequence of malnutrition, bacterial or viral infection, drug­induced hepatotoxocity, or right heart failure. II—  Prevalence Since 1938, when Anderson first reported the hepatobiliary manifestations associated with CF, there has been considerable controversy in the literature regarding the  prevalence of liver disease (1). The wide variation in the reported series probably relates to factors such as the different age groups studied and the sensitivity of  methods used to detect liver disease, ranging from physical examination to diagnosis at autopsy. Autopsy studies have shown abnormal

  

Page 388

histological appearances of the liver of 10 to 30% of patients with CF. These studies suggest an age­related increase in the incidence of histologically diagnosed CF  liver disease from 10.8% in infants less than 3 months to 26.8% in those over the age of 1 year. This is further supported by an incidence of 72% in those patients who  died over the age of 24 years (2,3). However, necropsy studies may not reflect the true age­related prevalence, as liver disease itself may contribute to death. A  number of reports have attempted to assess the clinical prevalence of CF­related liver disease. In a review of 2500 patients over a 25­year period, it was noted that  2% of children had portal hypertension, and this incidence increased tenfold in adolescent patients. Furthermore, a study of 1100 patients has shown a prevalence of  clinically overt liver disease of 4.4%, with a progressive rise in prevalence from 0.3% in the 0 to 5 age group to a peak of 8.7% in those aged 16 to 20 years.  Thereafter, instead of the expected rise, there was a fall to 4.1% in those over 20 years of age, which may reflect an increased mortality from respiratory or liver failure  in those with liver disease during teenage years. The mean age at presentation was 9.8 years, with a male preponderance (4). The male preponderance has been  supported in two further studies (5,6). One prospective study has been performed to assess the incidence and outcome of liver disease. Hepatic status was assessed  at yearly intervals using a combination of clinical, biochemical, and ultrasound examinations. A cumulative incidence of 17% was reported with a male predominance.  In contrast to the reported retrospective data, liver disease developed in the first decade of life and no incidence peak was observed in any age group (7). Like liver disease, the reported incidence of gallbladder and biliary tract disease among patients with CF is variable. Nonfunctioning gallbladder is the commonest  abnormality, and microgallbladder has been observed in up to one­third of cases. Cholelithiasis has been a recognized complication of CF since 1973 and has an  incidence of 14 to 24% (2,3,8). Cholangiographic features of sclerosing cholangitis have been reported in CF patients with liver disease (9–11). Strictures of the distal  common bile duct (CBD) have been demonstrated in 90% of patients with CF liver disease and implicated as an etiological factor (11). Two further studies have failed  to confirm this finding; therefore the role of distal CBD stenosis in the pathogenesis of CF­related liver disease is controversial (9,10). III—  Genetics CF is the most significant autosomal recessive disorder in the Caucasian population and has been reported in all racial groups with varying frequencies (12). The  frequency of homozygote carrier status varies from 1:2500 in the United Kingdom to 1:16,000 in the African­American population. This frequency has been  determined by case finding from large population studies rather than widespread neonatal screening and thus may underestimate the true incidence of CF. The genetic defect responsible for CF was localized to the long arm of chromosome 7 in 1985 and the gene was cloned in 1989. Since then the precise location of the  gene has been established and sequenced; it was found to encode for a 1480­amino acid protein termed the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator  (CFTR) (13–17). Definitive evidence that this is the correct gene comes from gene transfer experiments resulting in correction of the defective chloride channels. The  amino acid sequence indicates that the CFTR belongs to the ABC (ATP­binding cassette) family of proteins with transmembrane transport function. The protein has  two groups of six membrane­spanning regions, two intracellular nucleotide­binding folds (NBFs), and a highly charged ''R domain" containing multiple phosphorylation  sites. Activation of the chloride channel requires protein kinase A­mediated phosphorylation of the R domain and continuous presence of ATP in the NBF. The CFTR  functions as a cyclic adenine monophosphate (cAMP)/protein kinase A­activated chloride (Cl­) channel. The cAMP­stimulated secretion of Cl­ generates an osmotic  gradient that drives sodium (Na+) and water into the lumen, leading to dilution of the bile. As in the pancreatic ducts, the change in the apical

  

Page 389 Table 1 Classification of the CFTR Mutations Mutations

Description of mutation

Class I

Defective protein production—This mutation results in premature  termination on the mRNA and complete absence of the CFTR protein.

Class II

Defective protein processing—This mutation prevents the CFTR  protein trafficking to the correct cellular location.

Class III

Defective regulation—This mutation leads to diminished channel  activity in response to ATP.

Class IV

Defective conduction—This mutation results in correct production,  localization, and cAMP­mediated stimulation of the CFTR, with  reduced rate of ion flow and duration of channel opening.

Source: From Ref. 21.

Cl­ gradient facilitates bicarbonate (

) excretion from the biliary epithelium, resulting in biliary alkalinization.

The most common defect of the CFTR is caused by a 3­base pair deletion at position 508 with loss of a phenylalanine residue. This  F508 defect accounts for  approximately 70% of CF mutations, but its frequency varies considerably among ethnic groups (18,19). The  F508 mutation is associated with classic severe CF  with a high risk of lung disease, pancreatic insufficiency, and meconium ileus (20). Over 500 other genetic mutations have been identified. Heterozygotes for the CF  are entirely asymptomatic. The  F508 mutation results in disease because the mutated CFTR fails to reach the apical membrane of the epithelium; this is a result of  incomplete glycosylation and failure to leave the endoplasmic reticulum or Golgi apparatus, where it becomes degraded (class II mutation). Other mutations may allow  the CFTR to reach the apical membrane, but it fails to function (Table 1) (21). IV—  Pathogenesis It has been clearly established by immunohistochemical techniques that the CFTR is expressed on the apical membrane of epithelial cells lining the intra­ and  extrahepatic biliary tree (22). While the pathogenesis of CF­associated liver disease is not completely understood, it is thought that a mutation in the CFTR results in  failure of the apical Cl­ channel function, resulting in reduced hydration and abnormally viscous ductal secretions. The resultant inspissation of bile ductules with  tenacious eosinophilic secretions may lead to the characteristic histological features of duct obstruction, dilatation, hyperplasia, proliferation, and subsequent  periductular inflammation and fibrosis. While focal fibrosis increases with advancing age, mucous obstruction of bile ducts is rarely seen beyond the neonatal period  and in some cases is reversible. Furthermore, cholestasis is not a prominent feature of CF­related liver disease beyond the neonatal period (23). These data would  suggest that intrahepatic bile duct mucus, while important, is not the only determinant of the pathogenesis or progression of liver disease in CF. There is some evidence  to suggest that necrosis of biliary epithelial cells occurs in the absence of bile duct obstruction and dilatation, implicating toxic injury to biliary epithelial cell death by  cytotoxic compounds as a primary event in CF­related liver disease (24). Glycine­conjugated bile acids prevalent in those patients with CF as a result of bile acid  malabsorption may be responsible for cytotoxic damage to cholangiocytes. Retention of hydrophobic bile acids within the hepatic parenchyma has been implicated as  a major cause of liver disease, since it was shown that lithocholic acid induced cirrhosis in animal models (25). The association of certain HLA antigens with the  development of liver disease and the presence of

  

Page 390

antibodies to liver­specific lipoproteins suggests that lymphocyte­mediated immune responses may either contribute to the primary damage or further exacerbate  secondary progressive liver disease (26,27). Gallbladder abnormalities are present in approximately one­third of patients with CF, the majority of which are due to microgallbladder. The role of cholecystokinin  (CCK) (hormonal stimulus promoting gallbladder contraction) in the pathogenesis of microgallbladder and gallbladder disease has been extensively investigated. High  resting and postprandial CCK levels are observed in CF patients, consistent with microgallbladder and the negative feedback loop between reduced luminal bile acids  and CCK release (28). Administration of a CCK antagonist (Loxiglumide) does not produce the expected relaxation of the gallbladder in CF patients. In view of this  and the frequently observed association of cholelithiasis with microgallbladder, it is speculated that gallstone disease results in chronic inflammation and the  development of microgallbladder. While the mechanism of stone formation is not completely understood, fat malabsorption has been incriminated because of its contribution to increased fecal bile acid  loss and subsequent development of lithogenic glycine­conjugated bile. The clinical practice of pancreatic enzyme supplementation and dietary measures has not,  however, been associated with a reduced frequency of gallstones. The proposed hypothesis of cholesterol supersaturation of bile promoting the formation of  radiolucent cholesterol gallstones has been refuted by many studies showing normal or reduced cholesterol saturation in CF (29). Furthermore, there is no difference in  cholesterol saturation between CF patients with and without gallstones (30). These studies would suggest that bile acid depletion alone is not sufficient for the  observed increased incidence of gallstone disease. It has therefore been hypothesized that bile stasis resulting from cystic duct and biliary tract disease may impair  gallbladder emptying, promote nucleation, and allow gallstone formation. V—  Clinical Variability The large clinical variability of hepatobiliary manifestations and the familial clustering of CF patients with liver disease has led some authors to investigate the correlation  between genotype and phenotype. Mutation analysis of large series of patients with CF has shown clear associations between genotype and pancreatic function;  however, there is no association between CF genotype and the development or severity of liver disease (31,32). A familial concordance for liver disease has  suggested that genes outside the CF locus may be involved in the pathogenesis of liver disease. Duthie et al. (26) have demonstrated that the HLA class III antigen  DQw6 was present in 66.7% of a British population of CF patients with liver disease, compared with 32.9% of those without liver disease and 28.8% of controls.  This and weaker association with HLA­DR2 (DR15), B7, B16, B21, and B22 are for male patients only, suggesting that a genetic susceptibility to chronic liver  disease in male CF patients is associated with genes at or close to the DQ locus. The association between chronic liver disease in male patients with CF and the B7­ DR2­DQ6 haplotype is similar to that observed in a subgroup of patients with primary sclerosing cholangitis, which has similar biliary features to CF and also has a  male predominance (33). This may have therapeutic implications for establishing early treatment with ursodeoxycholic acid (UDCA) in male patients with the HLA­ DQw6 genotype. The ability to predict the development of liver disease on the basis of genetic testing is hampered by the lack of association with genotype and the  association of HLA class II molecules only with the male sex. The possibility that a mutation not as yet identified may be responsible for CF­related liver disease is an  attractive but unlikely concept. Autopsy studies have demonstrated that there is a strong association with meconium ileus or meconium ileus equivalent and the  development of liver disease (34). These studies are strongly supported by the findings of Colombo et al., showing that CF patients who have a history of neonatal  meconium ileus are six times more likely to develop liver disease than those who do not (6,7).

  

Page 391 Table 2 Clinical Liver Problems in Cystic Fibrosis Neonatal cholestasis with or without meconium ileus Fatty liver causing transient hepatomegaly associated  with malnutrition Asymptomatic hepato(spleno)megaly Abdominal pain Variceal hemorrhage Hypersplenism Decompensated cirrhosis Asymptomatic abnormalities of liver biochemistry or  ultrasound Sources: From Refs. 1, 4, 7, 34, and 35.

VI—  Clinical Features Hepatic disease in CF may be asymptomatic and usually follows a slowly progressive course characterized by focal bile duct damage, portal hypertension, and  preservation of hepatic architecture and liver cell integrity. As a result of the characteristic pathological process, the major clinical features of CF­associated liver  disease relate to the development of portal hypertension and its complications (Table 2). Some asymptomatic patients will be diagnosed as having liver disease on  routine screening in the CF clinic on the basis of abnormal clinical findings with or without associated biochemical or radiological abnormalities. Rarely, the first clinical manifestations of CF can be liver­related and present to the gastroenterologist/hepatologist. Neonatal cholestasis (35,36) or vitamin K­deficient  hemorrhagic diseases are rare presentations of CF (37). Neonatal jaundice occurs more frequently in association with meconium ileus and is sometimes due to  obstruction of the extrahepatic biliary tree with tenacious bile; laparotomy and biliary lavage may be required to clear the obstruction (38). Hepatomegaly can be  detected in isolation in infancy due to massive hepatic steatosis and malnutrition, but it is more commonly a presenting sign in combination with splenomegaly due to  cirrhosis in childhood or adolescence (4,39). It is therefore worthwhile to determine the sweat electrolyte concentration in the evaluation of obscure liver disease in  children and adolescents (39). Progressive enlargement of liver and spleen may give rise to abdominal distention and pain, which must be differentiated from intestinal  obstruction secondary to meconium ileus equivalent. Abdominal pain may also result from symptomatic gallbladder disease, common bile duct obstruction, and  intrahepatic microlithiasis in a small number of patients (11,40–42). Encephalopathy and ascites are rare and late clinical features and cutaneous stigmata are usually  absent (43). The first clinical presentation of liver disease may be an acute variceal hemorrhage and usually occurs in those with splenomegaly. The percentage of CF  patients with portal hypertensive varices is unknown, but in one cohort of 1100 patients, only 6 patients had a variceal bleed (4). Massive splenomegaly may occur as  a consequence of portal hypertension and result in the hematological features of hypersplenism. This rarely requires intervention, as the response to bleeding and  infection is not significantly impaired. Left­upper­quadrant pain may occur as a direct result of splenic enlargement or as a consequence of infarction; if severe, it may  require splenectomy in selected cases. VII—  Diagnosis The traditional diagnostic criteria for CF of persistently elevated concentration of sweat electrolytes plus characteristic clinical findings or a family history still apply.  When these criteria

  

Page 392

are fulfilled, the diagnosis of CF can be made; however, if the criteria are not met, CF cannot be ruled out. These atypical patients usually present as adolescents or  adults with complications of pancreatitis and/or infertility. Liver disease has long been a recognized feature of CF; however, early detection of liver involvement remains difficult. This is confounded by the fact that  commencement of prophylactic therapy in the form of ursodeoxycholic acid (UCDA) may serve to prevent progression to biliary cirrhosis. Early detection and  diagnosis of liver disease in CF is therefore essential and should be based on a combination of clinical assessment, biochemical analysis, and diagnostic imaging. A—  Clinical Assessment While clinical assessment of the patient offers the best available method for the detection of cirrhosis, it is neither sensitive nor specific enough to confirm the diagnosis  of early CF­related liver disease. The presence of an enlarged liver alone may reflect depression of a normal­sized liver below the costal margin by hyperinflated lungs.  Reliance on cutaneous stigmata as diagnostic aids is problematic as they are usually absent in CF­related liver disease (43). B—  Laboratory Investigations Conventional biochemical tests of liver function are abnormal in a high proportion of patients with a predominantly cholestatic pattern, but the degree of abnormality  does not correspond with the extent of the fibrotic process. The correlation with clinical evidence of liver disease is also poor, as 13% of patients with clinical liver  disease reported in a series by Scott­Jupp et al. had normal liver function tests and 12.9% with elevated liver enzymes had no clinical liver disease (4). Elevation of the  alkaline phosphatase, seen in 38% of patients, is the commonest abnormality and must be differentiated from the skeletal isoenzyme, which may be elevated in  association with growth or metabolic bone disease. Serum glutathione S­transferase B1 may be a more sensitive method of detecting liver impairment, as elevated  levels were observed in 16 of 18 patients with clinically apparent CF­related liver disease and none of 12 patients with abnormal liver function tests in the absence of  clinical liver disease (44). Further, larger follow­up studies will be required to verify the usefulness of this assay, as elevations of liver function tests are sometimes only  transient events secondary to self­limiting coexistent disease or medication. Hepatic synthetic function as reflected by the prothrombin time is usually normal, but it may  be prolonged in cases of vitamin K deficiency and advanced liver disease. Noninvasive markers of liver fibrosis for the diagnosis and follow­up of CF liver disease are urgently required. Circulating collagen VI levels, which are elevated in  adults with liver fibrosis and cirrhosis, have been found to be significantly elevated in children with CF­related liver fibrosis or cirrhosis and normal in all those with no  evidence of liver disease and normal controls. This may provide a sensitive and specific serum marker for the detection of liver fibrosis in children with CF (Fig. 1)  (45). C—  Ultrasound Ultrasound examination is a noninvasive method of assessing liver echotexture and morphology and therefore is useful in determining the presence of absence of  hepatobiliary disease, portal hypertension, and architectural distortion. Abnormal echotexture may be due to either steatosis or fibrosis. The differentiation can be  reliably made only by histological analysis. Duplex Doppler ultrasound has been used to assess the diameter of the portal vein so as to determine the presence of liver  disease; however, these measurements serve only as a more sensitive method for the detection of portal hypertension reflecting already established liver disease  (46,47). The application of a systematic scoring system to assess the echotexture of the hepatic

  

Page 393

Figure 1 Serum collagen VI levels in 224 healthy children and 54 children with liver fibrosis (left panel) and 133 CF children with no overt liver disease and 30 CF children with liver disease (right panel). (From Ref. 44.)

parenchyma, contour of the liver edge, and presence of portal fibrosis has resulted in a reproducible method of assessing CF patients for the presence of liver disease.  This technique may be of value in identifying precirrhotic liver disease and therefore allow for the early detection and subsequent prophylactic treatment of CF­related  liver disease (48). D—  Hepatobiliary Scintigraphy Hepatobiliary scintigraphy is a useful investigation because it provides both functional and structural information about the liver. Scintigraphy can demonstrate a  spectrum of abnormal findings in CF­related liver disease, including delayed clearance of isotope from the liver parenchyma, nonvisualization of the gallbladder, dilated  intrahepatic ducts, and intrahepatic duct strictures (49). Beading and stricturing of the intrahepatic biliary tree, which is found most frequently in those patients with  established liver disease, probably represents the strictures found during cholangiography (50). Delayed uptake and retention of isotope within the parenchyma is  significantly more common in those patients with established liver disease (Fig. 2) (10). Intrahepatic retention is also seen in patients with abnormal liver enzymes and  no clinical evidence of advanced liver disease and may represent focal cholestasis. This is supported by the observation that significant improvement in isotope  clearance is noted following treatment with UDCA (50,51). These studies suggest that hepatobiliary scintigraphy has a role in the diagnosis of CF­related liver disease.  It is sufficiently sensitive to detect liver abnormalities in asymptomatic individuals and provides a mechanism to monitor the response to UDCA. E—  Liver Histology Liver biopsy is not routinely used to establish a diagnosis of CF because of the focal nature of the pathological process and the possibility of sampling error.  Percutaneous needle biopsy

  

Page 394

Figure 2 Maximum time (Tmax) for hepatic uptake of 99Tc DISIDA and percentage clearance  of 99Tc DISIDA from the liver and biliary tree at 45 (E45) and 60 (E60) minutes in  CF patients with and without liver disease. (From Ref. 10.)

can underestimate the pathological changes in CF­related liver disease as compared with perioperative wedge biopsy (52). This contrasts with studies from other liver  diseases. F—  Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography Endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) is an invasive investigation and is therefore not useful as a screening test for liver disease. In clinical studies,  it has identified intrahepatic bile duct strictures similar to those of primary sclerosing cholangitis and extra­hepatic biliary obstruction, which may be important in  determining the progression of the disease (Fig. 3) (10,11). Despite the possible associated morbidity, it is an invaluable tool for the diagnosis and treatment of biliary  obstruction secondary to cholelithiasis (10). G—  Magnetic Resonance Imaging Magnetic resonance cholangiography (MRC) has rapidly become an important noninvasive technique for the evaluating intra­ and extrahepatic ducts. Unlike  conventional cholangiography, MRC does not require the introduction of contrast material into the ductal system and so avoids the associated morbidity. MRC  provides diagnostic cholangiograms in 90 to 100% of patients with a dilated system and can identify the larger intrahepatic ducts in 83 to 100% of patients with a  normal­caliber biliary tree. As a result, MRC may not be sufficiently sensitive to evaluate the second­ and third­order intrahepatic ducts (53). MRC is currently being  evaluated in CF­related liver disease and may provide the necessary noninvasive tool for its early detection (54).

  

Page 395

Figure 3 Endoscopic retrograde cholangiogram in a 15­year­old girl with cystic fibrosis related  liver disease, demonstrating beading and stricturing of the intrahepatic biliary tree. (From Ref. 10.)

VIII—  Pathology The biliary cirrhosis of cystic fibrosis has distinctive histopathology. Large sections of hepatic parenchyma are spared, but the liver architecture may be sufficiently  distorted to produce portal hypertension, hypersplenism, and gastrointestinal hemorrhage. The pathological features of fatty liver, mild portal fibrosis, and biliary  cirrhosis were first described in Andersen's original paper on CF in 1938 (1). Subsequently Farber et al. described small bile ducts blocked by inspissated eosinophilic  material resembling that found in the pancreatic ducts and acini (55). The focal nature of the fibrotic lesion with associated eosinophilic concretions was termed focal  biliary cirrhosis, and the term multilobular biliary cirrhosis was used to describe the large, irregular nodules typical of cirrhosis in those patients with CF. Hepatic  changes may be

  

Page 396

present at any age. Neonatal cholestasis is present in 30% of cases and may be associated with neonatal hepatitis or biliary atresia. Excessive biliary mucus associated  with mild periportal inflammation and early fibrosis is common in infants, while focal biliary fibrosis with associated eosinophilic PAS­positive material in ductules, bile  duct reduplication, and chronic inflammatory infiltrates is present in >20% of adolescents (Fig. 4). In some patients, focal lesions coalesce and progress to multilobular  biliary cirrhosis characterized by irregular nodules, large bands of fibrosis, regenerative microscopic nodules, and bile duct reduplication adjacent to areas of preserved  hepatic lobular architecture (Fig. 5). Bile plugs and cholestasis may be present, but even in advanced disease they are rare beyond the neonatal period (56). Fatty  liver, which occurs in approximately 30% of CF patients, was previously attributed to malnutrition with specific deficiencies of fatty acids or carnitine; however,  increased amounts of fat in hepatocytes has been documented in well­nourished patients with high Scwachman scores (Fig. 6). The relationship between steatosis and  the other hepatic lesions has not been defined, but there is no correlation between fatty infiltration and the amount of collagen deposition (24,57). Electron microscopy  of CF liver tissue has identified disrupted and necrotic cholangiocytes in the absence of biliary dilatation or bile plugs. Bile duct reduplication is a prominent feature.  Inflammatory cells—including lymphocytes, occasional neutrophils, and macrophages—are present in the portal tracts and are more numerous in those with extensive  fibrosis. Activated fat­storing cells, known to produce collagen, are present in fibrotic portal tracts and are possibly engaged in collagen production (24). IX—  Bile Acid Metabolism and Fat Malabsorption Bile acids represent the predominant component of bile and are synthesized de novo in the liver from cholesterol. The primary bile acids, cholic and chenodeoxycholic  acids, are conjugated with glycine and taurine normally in a ratio of 3:1 to increase solubility. Further conjugation may occur with the addition of a sulfate or a  glucuronide to one or more hydroxyl groups of the cholesterol nucleus. These conjugates are more soluble and less readily absorbed from the gut. In the intestine,  bacteria convert primary bile acids into secondary forms (deoxycholic and lithocholic acids) through a process of dehydroxylation. Approximately 95% of the bile  acids are reabsorbed in the terminal ileum, enter the enterohepatic circulation, and are re­excreted in the bile. The absorbed fraction of lithocholic acid is conjugated  with sulfate, thus reducing the amount of this potentially harmful hydrophobic bile acid that is reabsorbed. Bile acids act as detergents, participating in the solubilization  and absorption of lipids. The more hydrophobic bile acids are better detergents and are therefore potentially more destructive to cell membranes. Hydrophobic bile  acids, in contrast to the hydrophilic bile acids, decrease bile flow and may further promote liver injury (58). Fecal bile acid (FBA) excretion is markedly increased in CF patients with and without pancreatic insufficiency, leading to a reduced total bile acid pool. Fecal fat loss  as a consequence of pancreatic insufficiency is also increased in CF, resulting in nutritional deficiencies. This association of fecal fat and bile acid excretion may result  from inhibition of bile acid absorption by intraluminal unhydrolyzed triglycerides. However, although the addition of pancreatic enzymes and H2 receptor antagonists  and substitution of dietary fat for medium­chain triglycerides reduces fecal fat excretion, the same does not always hold true for bile acid excretion (59). The  administration of sodium bicarbonate also reduces fecal fat excretion but has no effect on FBA loss, and patients with near normal fat excretion continue to lose large  amounts of FBA (59). These data would suggest that mechanisms other than inhibition of bile acid absorption by intraluminal unhydrolyzed triglycerides plays a role in  excessive bile acid excretion. Decreased intestinal motility due to viscid intraluminal mucus, or altered intestinal hormones with resulting bacterial overgrowth,  deconjugation, and dehydroxylation of bile acids has been suggested to reduce bile acid absorption and contribute to fat malabsorption (60). It is unlikely that bacterial  overgrowth alone contributes to FBA and fecal fat loss, as the mal­

  

Page 397

Figure 4 Histological section demonstrating proliferating ductules within fibrous bands in a patient with cystic  fibrosis. The ductules are distended by eosinophilic granular material (H&E, ×20).  (Courtesy of Dr. Niamh Nolan.)

Figure 5 Biliary cirrhosis with hepatocyte nodules and broad fibrous bands (H&E, ×20).  (Courtesy of Dr. Niamh Nolan.)

  

Page 398

Figure 6 H&E section demonstrating extensive hepatic steatosis. This is the most common finding in cystic fibrosis, present in one­third of patients.  (Courtesy of Dr. Niamh Nolan.)

absorption of fat and bile acids is similar in patients who have evidence of bacterial overgrowth and those that do not. In vitro studies have suggested that dysfunction  of ileal transport processes may contribute to excessive FBA loss. The presence of a primary defect in ileal mucosal transport selective for cholic acid is further  supported by the observations of reduced postprandial serum cholic acid level and increased fecal loss of cholic acid in CF patients with and without pancreatic  insufficiency. Absorption of chenodeoxycholic acid is reduced in CF patients with pancreatic insufficiency as compared to those with normal pancreatic function,  suggesting that cholic acid absorption is impaired by a defect in mucosal transport and that absorption of both cholic and chenodeoxycholic acid is reduced by  pancreatic insufficiency (61). The malabsorption of these primary bile acids results in the production of hydrophobic secondary bile acids as a consequence of dehydroxylation by colonic flora.  Secondary bile acids are reported to be cytotoxic and their increased absorption, circulation, and accumulation within the liver may contribute to the pathogenesis of  CF­related liver disease (62). Serum levels of several potentially toxic secondary bile acids are increased in CF­related liver disease. Fasting levels of  taurochenodeoxycholic acid are increased 30­fold in patients with liver disease and correlate closely with biochemical cholestasis. Administration of UDCA results in  reduction in the serum and biliary level of taurochenodeoxycholic acid, with associated improvement in liver biochemistry (63). X—  Management of CF­Related Hepatobiliary Disease A—  Nutrition Malnutrition in cystic fibrosis has been described for over a half a century and results from malabsorption and increased energy expenditure as a consequence of  chronic disease. Severe

  

Page 399

liver disease with an associated reduction in the bile acid pool and poor protein synthesis may contribute to the patient's poor nutritional status. Energy intake in CF  patients on a free diet has been calculated to be 80.3 ± 4.6% of the recommended daily allowance (RDA), which falls well below the recommended total energy  intake of 120 to 150% (64). A dietary fat intake of 40% of total daily energy intake along with adequate pancreatic enzyme supplementation is now advocated for all  patients (65). Deficiencies of fat­soluble vitamins D, E, and K occur in CF­related liver disease and require supplementation with adequate nontoxic amounts.  Judicious use of vitamin A supplementation is recommended, as serum levels do not reflect hepatic stores and there are reports of toxicity (66). B—  Ursodeoxycholic Acid The use of UDCA for the treatment of a wide range of cholestatic liver diseases has been increasing rapidly since the first reports of its beneficial effects on serum  bilirubin (67). The mechanism of action of UDCA is not fully understood; however, experimental and clinical evidence currently available suggests that the effects of  UDCA are due to the protection of cell membranes at the level of the biliary tree and stimulation of impaired hepatocellular secretion of toxic hydrophobic bile acids.  UDCA conjugates have a stabilizing effect on biomembrane exposed to hydrophobic bile acids, possibly by the formation structure of mixed micelles. Taurine­ conjugated UDCA also promotes secretion from cholestatic hepatocytes through a complex of signals mediated by Ca2+ and protein kinase C (68). The accumulation  of inspissated bile within the intrahepatic biliary tree and toxic hydrophobic bile acids in the liver parenchyma are two possible mechanisms involved in the pathogenesis  of CF liver disease. The use of UDCA, a hydrophilic bile acid with choleretic properties, is therefore reasonable in the treatment of this condition. A randomized,  double blind, placebo­controlled trial has demonstrated that UDCA improves biochemical cholestasis, nutritional status in compromized individuals, pulmonary  function, and general well­being in patients treated for 1 year (69,70). The optimal dose of 20 mg/kg body weight to achieve biliary enrichment is higher than that for  other cholestatic diseases because of impaired intestinal absorption due to pancreatic insufficiency. UDCA at this dose has been shown to increase in the duodenal bile  to an average of 42% of bile acids (71). That UDCA stimulates biliary excretion and improves hepatic morphology has been confirmed by hepatobiliary scintigraphy  (51). In one uncontrolled study, UDCA administered for 2 years was shown to improve the histological features of CF­related liver disease with a reduction in portal­ based inflammation, fibrosis, bile duct proliferation, and infiltration (72). UDCA is a promising and well­tolerated treatment that confers a beneficial effect on biochemical cholestasis, nutrition, and perhaps liver morphology. Long­term  follow­up studies are required to assess its effectiveness in preventing progression to liver cirrhosis resulting in the need for liver transplantation or death. C—  Biliary Complications Up to 4% of the CF population will develop symptomatic gallbladder disease, and some of these will require surgical management (40). A decision to perform a  cholecystectomy in such patients is difficult due to the possible pulmonary complications and the risk of hepatic decompensation in those with advanced cirrhosis.  Biliary surgery in patients whose respiratory function has been optimized with the pre­ and postoperative use of mucolytic aerosols, intravenous antibiotics, and  intensive physiotherapy is complicated by a morbidity and mortality of 10 and 5% respectively (73). Laparoscopic cholecystectomy under general or continuous  epidural anaesthesia may have advantages in those patients with poor respiratory function (74,75). Choledocholithiasis complicated by cholangitis or distal common  bile duct obstruction or stricture causing abdominal pain can be treated by endoscopic sphincterotomy, stone extraction, and stent insertion with less respiratory  complications than may be involved in abdominal

  

Page 400

surgery. In those patients unsuitable for surgery with mild symptoms that can be controlled with analgesia who have a functioning gallbladder and a small number of  radiolucent stones, medical therapy with oral bile salts and/or extracorporeal shock­wave lithotripsy may succeed in dissolving the gallstones. D—  Complications of Portal Hypertension Acute variceal hemorrhage should be managed by direct admission to hospital. If there is hemodynamic compromise, blood volume should be replaced and  coagulation abnormalities corrected with caution to prevent right heart failure, pulmonary edema, and further respiratory compromise. Once the patient is  hemodynamically stable, an endoscopy by a skilled endoscopist should be performed to establish the site of bleeding and proceed with injection sclerotherapy or  variceal banding to control hemorrhage. A course of sclerotherapy or variceal ligation should be embarked upon until varices have been obliterated, followed by a  surveillance program to maintain obliteration. A metanalysis comparing injection sclerotherapy with variceal banding revealed a reduced rate of rebleeding, esophageal  stricture, and death due to rebleeding with variceal banding in patients with portal hypertension. It was also noted that the number of session of treatment was lower  with the banding technique (76). Vasoactive drugs such as octreotide, somatostatin, vasopressin, or terlipressin—which are potent splanchnic vaso­constrictors— lower portal pressure and can be used as adjuvants to endoscopic therapy (77). Balloon tamponade, first used in 1930, is a highly effective method of arresting  variceal hemorrhage but can cause significant complications (78). Patients are usually sedated and may require ventilation to protect them from aspiration pneumonia.  Therefore balloon tamponade should be reserved for cases of uncontrolled bleeding and used only by experienced personnel adhering to a strict protocol. Portosystemic shunt surgery for the control variceal bleeding has largely been replaced by endoscopic methods and also by the emergence of the transjugular  intrahepatic portosystemic shunt (TIPS). Shunt surgery involves a major operation with significant morbidity and mortality. It is usually complicated by significant  deterioration in pulmonary function and also complicates any subsequent attempt at liver transplantation. The use of TIPS in the management of uncontrolled bleeding  in CF­related disease remains to be evaluated (79). Prophylactic injection sclerotherapy for the obliteration of esophageal varices is not recommended as the risk of rebleeding is increased until the varices are  obliterated. Similarly, the use of beta blockers is not recommended for prophylaxis because of the risk of bronchospasm. The role of prophylactic banding of varices  remains to be evaluated. E—  Liver Transplantation Liver transplantation offers the only potentially curative treatment for portal hypertension and its complications. Until recent years, liver transplantation was not  considered a suitable therapy for patients with CF­related liver disease because of the high incidence of pulmonary complications and because it was thought that the  lifelong immunosuppression required for recipients would predisposse to further pulmonary infection. A number of series have been published that have documented  good survival rates following liver transplantation with no increase in the incidence of respiratory compromise (80–82). The optimal time for liver transplantation in CF  is difficult to judge, as standard liver biochemistry is sometimes normal and so may underestimate the severity of liver disease. Liver transplantation should be reserved  for those patients in whom there is evidence of hepatocellular failure, such as impaired protein synthesis, prolonged prothrombin time unresponsive to vitamin K, raised  bilirubin in the absence of biliary obstruction, and hepatic encephalopathy. A helpful scoring system has been devised to indicate the need for referral for  transplantation based on the severity of portal hypertension, impaired hepatic function, nutritional status, and hypersplenism (83). Prior to transplantation, malnutrition  should be aggressively managed with supplemental feeding, preferably by the enteral route.

  

Page 401

Pulmonary function should be optimized by intense chest physiotherapy, the use of nebulized DNase to loosen sticky secretions, and the treatment of active infection  with intravenous antibiotics. Patients with poor lung function (as evidenced by an FEV1 of 30 to 50%) can now undergo successful liver transplantation with  appropriate pre­ and postoperative pulmonary care. An improvement in postoperative respiratory function may result from the use of corticosteroids, which reduce production of the mucus, and inhibit both leukocyte  activation and the synthesis of inflammatory cytokines. Furthermore, the removal of a large liver, the reduction in portal hypertension, and consequent reduction in  ascites will result in abdominal decompression and improved respiratory function. In the intraoperative period, there is a dramatic improvement in oxygenation and  CO2 exchange when the abdomen is open and diaphragmatic splinting is relieved (83). There is controversy as to whether the biliary anastomosis should be directly from bile duct to bile duct or whether a Roux­en­Y loop should be fashioned (84). The  high incidence of biliary complications reported by Noble­Jamieson et al. (83) in patients who had direct duct to duct biliary anastomosis, would seem to suggest that  a Roux­en­Y loop is preferable. Splenectomy may be necessary in some cases due to the large size of the organ, and therefore prophylactic vaccination against  Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae is recommended in children. Postoperatively, chest physiotherapy, nebulized DNase, and intravenous antibiotics are commenced early to prevent serious respiratory tract infections. Antifungal  agents are used in those patients with positive Aspergillus serology and culture. The use of bronchoalveolar lavage through the endotracheal tube both preoperatively  and at the end of the transplant has been advocated to reduce postoperative respiratory dysfunction (82). Malabsorption may prevent adequate levels of  immunosuppression; therefore larger doses, increased dosing frequency, or intravenous immunosuppression may be required to achieve therapeutic levels. The newer  immunosuppressive agents, neoral and tacrolimus, are better absorbed than conventional cyclosporine. Successful liver transplantation with relief of portal hypertension  results in an improvement in absorption, nutrition, and respiratory function. Combined heart­lung­liver or lung­liver transplantation can be performed successfully in patients with hepatic cirrhosis and severe, irreversible pulmonary disease with  significant functional improvement (85). However, the increasing shortage of organ donors means that patients requiring multiple organ transplantation will wait longer,  and it may be beneficial to transplant these patients early, before they develop severe respiratory compromise. XI—  Gene Therapy Gene therapy remains the ultimate treatment for CF. Although many organ systems are involved in CF, efforts to develop gene therapy have focused almost entirely  upon curing pulmonary disease, as it is the cause of greater than 90% of the mortality from CF. Recombinant adenoviruses have been extensively studied as vectors to  deliver CFTR genes. The adenoviruses used for gene transfer are modified to replace adenoviral genome with the CFTR, resulting in a nonreplicating virus that is  capable of CFTR expression. Clinical trials have indicated that recombinant adenoviruses will infect human airway cells with limited efficiency, and some but not all of  the clinical trials report the generation of CFTR chloride channel activity (86,87). CFTR gene expression is short­lived, usually lasting less than a few weeks. This may  result from virus­induced innate immune responses and tissue injury, as antiviral antibodies prevent epithelial cell infection and T cell­mediated killing of transfected  cells. The use of nonviral vectors has failed to overcome these problems, as inflammation has been reported when high doses of liposomes are delivered and the  duration of expression of CFTR is short. Human biliary epithelial cell lines have been successfully infected by adenovirus vector with expression of functioning CFTR (88). In transgenic animal studies,  adenovirus vectors

  

Page 402

have been infused into the biliary tract, with resultant expression of CFTR in almost all cells for a period of 21 days (89). An efficient method for the delivery of  recombinant CFTR that can be sustained within the transfected epithelial cell is required for a successful outcome to gene therapy. XII—  Conclusions Liver disease is an important complication of CF, with significant morbidity and mortality in the ever­increasing number of CF survivors. CF­associated hepatobiliary  disease is clearly the result of genetic expression of a basic defect in the biliary epithelium. Defective chloride secretion results in reduced hydration and increased  viscosity of the intraluminal bile and plugging of small bile ductules, which may directly or by some other means cause periductular inflammation and fibrosis. The  inflammatory and fibrotic process may be perpetuated by an increase in the ratio of toxic hydrophobic to hydrophilic bile acids, which accumulate within the liver and  cause damage to cholangiocytes. The early detection of CF­related liver disease—using a combination of clinical, biochemical, and imaging techniques—might allow for the introduction of UDCA prior  to the development of irreversible liver damage. The patient with mild to moderate impairment of respiratory function and severe life­threatening liver disease and  portal hypertension should be referred for liver transplant assessment, as survival following a liver graft is good. For those patients with severe respiratory impairment,  multiple organ transplantation remains an option. References 1. Anderson DH. Cystic fibrosis of pancreas and its relation to coeliac disease. Am J Dis Child 56:344–349, 1938. 2. Oppeinheimer EH, Esterly JR. Hepatic changes in young infants with cystic fibrosis: possible relation to focal biliary cirrhosis. J Pediatr 86:683–689, 1975. 3. Vawter GF, Shwachman H. Cystic fibrosis in adults: an autopsy study. Pathol Ann 14:357–382, 1979. 4. Scott­Jupp R, Lama M, Tanner MS. Prevalence of liver disease in cystic fibrosis. Arch Dis Child 66:698–701, 1991. 5. Feigelson J, Anagnostopoulos C, Poquet M, Pecau Y, Munck A, Navarro J. Liver cirrhosis in cystic fibrosis­therapeutic implications and long term follow up. Arch  Dis Child 68:653–657, 1993. 6. Colombo C, Apostolo MG, Ferrari M, Seia M, Genoni S, Giunta A, Sereni LP. Analysis of risk factors for the development of liver disease associated with cystic  fibrosis. J Pediatr 124:393–399, 1994. 7. Colombo C, Battezzati PM, Strazzabosco M, Podda M. Liver and biliary problems in cystic fibrosis. Semin Liver Dis 18:227–235, 1998. 8. Rovsing H, Sloth K. Micro­gallbladder and biliary calculi in mucuviscidosis. Acta Radiol (Diagn) 14:588–592, 1973. 9. Nagel RA, Westaby D, Javaid A, Kavani J, Meire HB, Lombard MG, Wise A, Williams R. Liver disease and bile duct abnormalities in adults with cystic fibrosis.  Lancet 11:1422–1425, 1989. 10. O'Brien S, Keogan M, Casey M, McErlean D, Fitzgerald MX, Hegarty JE. Biliary complications of cystic fibrosis. Gut 33:387–391, 1992. 11. Gaskin KJ, Waters DLM, Howman­Giles R, De Silva M, Earl JW, Martin HCO, Kan AE, Brown JM, Dorney SFA. Liver disease and common bile duct  stenosis in cystic fibrosis. N Engl J Med 318:340–346, 1988.

  

Page 403

12. Marino CR, Gorelick FS. Scientific advances in cystic fibrosis. Gastroenterology 103:681–693, 1992. 13. Tsui LC, Buchwald M, Barker D, Braman JC, Knowlton R, Schumm JW, Eiberg H, Mohr J, Kennedy D, Plavisc N. Cystic fibrosis locus defined by a genetically  linked polymorphic DNA marker. Science 230:1054–1057, 1985. 14. Knowlton RG, Cohen­Haguenaur O, Van Cong NV, Frezal L, Brown VA, Barker D, Braman JC, Schumm JW, Tsui LC, Buchwald M. A polymorphic DNA  marker linked to cystic fibrosis is located on chromosome 7. Nature 318:380–382, 1985. 15. Riordan JR, Rommens JM, Kerem B, Alon N, Rozmahel R, Grelczak Z, Zielenski J, Lok S, Plavsic N, Chou JL, Drumm ML, Iannuzzi MC, Collins F, Tsui LC.  Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterisation of complementary DNA. Science 245:1066–1073, 1989. 16. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, Tsui LC. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.  Science 245:1073–1077, 1989. 17. Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B, Drumm ML, Melmer G, Dean M, Rozmahel R, Cole JL, Kennedy D, Hidaka N, Zsiga M, Buchwald M, Riordan JR,  Tsui LC, Collins FS. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 245:1059–1065, 1989. 18. Kerem E, Corey M, Kerem B, Rommens J, Markiewicz D, Levison H, Tsui LC, Durie P. The relationship between genotype and phenotype in cystic fibrosis­ analysis of the most common mutation ( F508). N Engl J Med 323:1517–1522, 1990. 19. Knight RA. Genetics of cystic fibrosis. Br J Hosp Med 47:502–506, 1992. 20. Santis G, Osborne L, Knight RA, Hodson M. Independent genetic determinants of pancreatic and pulmonary status in cystic fibrosis. Lancet 336:1081–1084,  1990. 21. Davis PB, Drumm M, Konstan MW. Cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 154:1229–1256, 1996. 22. Cohn JA, Strong TV, Picciotto MR, Nairn AC, Collins FS, Fitz JG. Localisation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in human bile duct  epithelial cells. Gastroenterology 105:1857–1864, 1993. 23. Hultcrantz R, Mengarelli S, Strandvik B. Morphological findings in the liver of children with cystic fibrosis: a light and electron microscopical study. Hepatology  6:811–889, 1986. 24. Lindbald A, Hultcrantz R, Strandvik B. Bile­duct destruction and collagen deposition: a prominent ultrastructural feature of the liver in cystic fibrosis. Hepatology  16:372–381, 1992. 25. Hosti P. Cirrhosis of the liver induced in rabbits by gastric instillation of 3–monohydroxycholynic acid. Nature 186:250–252, 1960. 26. Duthie A, Doherty DG, Donaldson PT, Scott­Jupp R, Tanner MS, Eddleston A, Mowat AP. The major histocompatibly complex influences the development of  chronic liver disease in male children and young adults with cystic fibrosis. J Hepatol 23:532–537, 1995. 27. Mieli­Vergani G, Psacharopoulous HT, Nicholson AM, Eddleston ALWF, Mowat AP, Williams R. Immune responses to liver membrane antigens in patients with  cystic fibrosis and liver disease. Arch Dis Child 55:696–701, 1980. 28. Van Haren EH, Hopman WPM, Jansen JBMJ, Rosenbusch G, Lamers CBHW, Van Herwaarden CLA. Increased plasma cholecystokinin levels and small  gallbladders in adult patients with cystic fibrosis. Clin Sci 81:85–89, 1991. 29. Roy CC, Weber AM, Morin CL, Combes JC, Nussle D, Megevand A, Lasalle R. Abnormal biliary lipid composition in cystic fibrosis: effect of pancreatic  enzymes. N Engl J Med 297:1301–1305, 1977. 30. Angelico M, Gandin C, Cannuzzi P, Bertasi S, Cantafora A, De Santis A, Quattrucci S, Antonelli M. Gallstones in cystic fibrosis: a critical appraisal. Hepatology  14:768–775, 1991.

  

Page 404

31. De Arce M, O'Brien S, Hegarty J, O'Mahoney SM, Cashman SM, Delgado M, Fitzgerald MX. Deletion delta F508 and clinical expression of cystic fibrosis— related liver disease. Clin Genet 42:271–272, 1993. 32. Duthie A, Doherty DG, Williams C, Scott­Jupp R, Warner JO, Tanner MS, Williamson R, Mowat AP. Genotype analysis for  F508, G551D and R553X  mutations in children and young adults with cystic fibrosis with and without chronic liver disease. Hepatology 15:660–664, 1992. 33. Donaldson PT, Farrant JM, Wilkinson ML, Hayllar KM, Portmann BC, Williams R. Dual association of HLA DR2 and DR3 with primary sclerosing cholangitis.  Hepatology 13:129–133, 1991. 34. Maurage C, Lenaerts C, Weber A, Brochu P, Yousef I, Roy CC. Meconium ileus and its equivalent as a risk factor for the development of cirrhosis: an autopsy  study in cystic fibrosis. J Pediatr 9:17–20, 1989. 35. Smith FEM, Doughty IM, David TJ, Miller V, Patel L. Severe jaundice in two infants with cystic fibrosis. J R Soc Med 89:289–290, 1996. 36. Valman HB, France NE, Wallis PG. Prolonged neonatal jaundice in cystic fibrosis. Arch Dis Child 46:805–809, 1971. 37. Torstenson OL, Humphrey GB, Edson JR, Warwick WJ. Cystic fibrosis presenting with severe haemorrhage due to vitamin K malabsorption: a report of three  cases. Paediatrics 45:857–861, 1970. 38. Evans JS, George DE, Mollit D. Biliary infusion therapy in the inspissated bile syndrome of cystic fibrosis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12:131–135, 1991. 39. Wilroy RS, Crawford SE, Johnson WW. Cystic fibrosis with extensive fat replacement of the liver. J Pediatr 68:67–73, 1966. 40. Stern RC, Rothstein FC, Doershuk CF. Treatment and prognosis of symptomatic gallbladder disease in patients with cystic fibrosis. J Pediatr Gastroenterol Nutr  5:35–40, 1986. 41. Patrick MK, Howan­Giles R, De Silva M, Van Asperen P, Pitkin J, Gaskin KJ. Common bile duct obstruction causing right upper abdominal pain in cystic  fibrosis. J Pediatr 108:101–102, 1986. 42. Magrude MJ, Munden MM. Intrahepatic microlithiasis: another gastrointestinal complication of cystic fibrosis. J Ultrasound Med 16:763–765, 1997. 43. Tanner MS, Taylor CJ. Liver disease in cystic fibrosis. Arch Dis Child 72:281–284, 1995. 44. Rattenbury JM, Taylor CJ, Haeth PK, Howie AF, Beckett GJ. Serum glutathione S­transferase B1 activity as an index of liver function in cystic fibrosis. J Clin  Pathol 48:771–774, 1995. 45. Gerling B, Becker M, Staab D, Schuppan D. Prediction of liver fibrosis according to serum collagen VI levels in children with cystic fibrosis. N Engl J Med  336:1611–1612, 1997. 46. Vergesslich KA, Gotz M, Mostbeck G, Sommer G, Ponhold W. Portal venous blood flow in cystic fibrosis: assessment by duplex Doppler sonography. Pediatr  Radiol 19:371–374, 1989. 47. Kumari­Subaiya S, Gorvoy J, Phillips G, Ross P, Riddelsberger MM. Portal vein measurement by ultrasonography in patients with long standing cystic fibrosis:  preliminary observations. J Pediatr Gastroenterol Nutr 6:71–78, 1987. 48. Williams SGJ, Evanson JE, Barret N, Hodson ME, Boultbee JE, Westaby D. An ultrasound scoring system for the diagnosis of liver disease in cystic fibrosis. J  Hepatol 22:513–521, 1995. 49. Dogan AS, Conway JJ, Lloyd­Still JD. Hepatobiliary scintigraphy in children with cystic fibrosis and liver disease. J Nucl Med 35:432–435, 1994. 50. O'Connor PJ, Southern KW, Bowler IM, Irving HC, Robinson PJ, Littlewood JM. The role of hepatobiliary scintigraphy in cystic fibrosis. Hepatology 23:281– 287, 1996.

  

Page 405

51. Colombo C, Castellani MR, Balistreri WF, Seregni E, Assaisso ML, Giunta A. Scintigraphic documentation of an improvement in hepatobiliary excretory function  after treatment with ursodeoxycholic acid in patients with cystic fibrosis and associated liver disease. Hepatology 4:677–684, 1992. 52. Picciotto A, Ciravegna G, Lapertosa G, Celle G. Percutaneous of laparoscopic needle biopsy on cystic fibrosis in the evaluation of chronic liver disease? Am J  Gastroenterol 79:567­–68, 1984. 53. Hintze RE, Adler A, Veltzke W, Abou­Rebyeh H, Hammerstring R, Vogl T, Felix R. Clinical significance of magnetic resonance cholangiopancreatography  (MRCP) compared to endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP). Endoscopy 29:182–187, 1997. 54. Durieu I, Pellet O, Gaillard C, Bellon G, Vital Durand D. Magnetic resonance cholangiography in cystic fibrosis (abstr). Paediatr Pulmonol 14(suppl):307, 1997. 55. Farber S. Pancreatic function and disease in early life: pathological changes associated with pancreatic insufficiency in early life. Arch Pathol 37:238–250, 1944. 56. Park RW, Grand RJ. Gastrointestinal manifestations of cystic fibrosis: a review. Gastroenterology 81:1143–1161, 1981. 57. Colombo C, Apostolo M, Assaisso M, Roman B, Bottani P. Liver disease in cystic fibrosis. Neth J Med 41:119–122, 1992. 58. Palmer RH. Bile acids, liver injury and liver disease. Arch Intern Med 130:606–617, 1972. 59. Weber AM, Roy CC, Chartrand L, Lepage G, Dufour OL, Morin CL, Lasalle R. Relationship between bile acid malabsorption and pancreatic insufficiency in  cystic fibrosis. Gut 17:295–299, 1976. 60. Allen JM, Penketh ARL, Adrian TE. Adult cystic fibrosis: postpramdial responses of gut regulatory peptides. Gastroenterology 85:1379–1383, 1983. 61. Colombo C, Aldo R, Roda E, Sereni LP, Brega A, Fugazza R, Giunta A. Bile acid malabsorption in cystic fibrosis with and without pancreatic insufficiency. J  Pediatr Gastroenterol Nutr 3:556–562, 1984. 62. Scholmerich J, Becher MS, Schmidt K. Influence of hydroxylation and conjugation of bile acids on their membrane damaging properties: studies on isolated  hepatocytes and lipid membrane vesicles. Hepatology 2:187–201, 1982. 63. Nakagawa M, Colombo C, Setchell KDR. Comprehensive study of the biliary bile acid composition of patients with cystic fibrosis and associated liver disease  before and after UDCA administration. Hepatology 12:322–334, 1990. 64. Chase HP, Long MA, Lavin MH. Cystic fibrosis and malnutrition. J Pediatr 95:337–347, 1979. 65. Heymans HS. Gastrointestinal dysfunction and its effects on nutrition in cystic fibrosis. Acta Paeditrica Scandinavia; 363(Suppl):74–78, 1989. 66. Eid NS, Shoemaker LR, Saminec TD. Vitamin A in cystic fibrosis: case reports and review of the literature. J Ped Gastroenterol Nutr 10:265–269, 1990. 67. Leuschner U, Fischer H, Kurtz W, Guldutuna S, Hubner K, Hellstern A, Gatzen M. Ursodeoxycholic acid in primary biliary cirrhosis: results of a controlled  double blind trial. Gastroenterology 97:1268–1274, 1989. 68. Beuers U, Boyer JL, Paumgartner G. Ursodeoxycholic acid in cholestasis: potential mechanisms of action and therapeutic applications. Hepatology 28:1449– 1453, 1998. 69. Colombo C, Battezzati PM, Podda M, Bettinardi N, Giunta A. Ursodeoxycholic acid for liver disease associated with cystic fibrosis: a double­blind, multi­centre  trial—the Italian group for the study of ursodeoxycholic acid in cystic fibrosis. Hepatology 23:1484–1490, 1996. 70. O'Brien SM, Campbell GR, Burke AF, Maguire OC, Rowlands BJ, Fitzgerald MX, Hegarty JE. Serum bile acids and ursodeoxycholic acid treatment in cystic  fibrosis­related liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 5:477–483, 1996.

  

Page 406

71. Colombo C, Crosignani A, Assaiaao ML. Ursodeoxycholic acid therapy in cystic fibrosis associated liver disease: a dose response study. Hepatology 16:924– 930, 1992. 72. Lindbald A, Glaumann H, Strandvik B. A two­year prospective study of the effect of ursodeoxycholic acid on urinary bile acid excretion and liver morphology in  cystic fibrosis­associated liver disease. Hepatology 27:166–174, 1998. 73. Snyder CL, Ferrell K, Saltzmann DA, Warwick WJ, Leonard AS. Operative therapy of gallbladder disease in patients with cystic fibrosis. Am J Surg 157:557– 561, 1989. 74. McGrath DS, Short C, Bredin CP, Kirwan WO, Rooney E, Meeke R. Laparoscopic cholecystectomy in adult cystic fibrosis. Irish J Med Sci 166:70–71, 1997. 75. Edelman DS. Laparoscopic cholecystectomy under continuous epidural anaesthesia in patients with cystic fibrosis. Am J Dis Child 145:723–724, 1991. 76. Laine L, Cook D. Endoscopic ligation compared with sclerotherapy for treatment of oesophageal variceal bleed. Ann Intern Med 123:280–287, 1995. 77. Tanner MS. Current clinical management of hepatic problems in cystic fibrosis. J R Soc Med 12(suppl):38–43, 1986. 78. Conn HO. Hazards attending the use of esophageal tamponade. N Engl J Med 259:701–707, 1958. 79. Sergent G, Gottrand F, Delemazure O, Ernst O, Bonvarlet P, Mizrahi D, L'Hermine C. Transjugular intrahepatic portosystemic shunt in an infant. Paediatr­Radiol  27:588–590, 1997. 80. Mieles LA, Orenstein D, Teperman L, Podesta L, Koneru B, Starzl TE. Liver transplant in cystic fibrosis. Lancet 1:1073, 1989. 81. Mack DR, Traystman MD, Colombo JL. Clinical denouement and mutation analysis of patients with cystic fibrosis undergoing liver transplantation for biliary  cirrhosis. J Pediatr 127:881–887, 1995. 82. Rocca GD, Pompei L, Pugliese F, Coccia C, Ruberto F, Montecchi C, Antonini M, Rossi M, Alfani D, Cortesini R, Gasparetto A. Anaesthesia for liver  transplantation in cystic fibrosis patients. Eur J Surg 8:278–281, 1998. 83. Noble­Jamieson G, Barnes N, Jamieson N, Friend P, Calne R. Liver transplantation for hepatic cirrhosis in cystic fibrosis. J R Soc Med 89(suppl):31–37, 1996. 84. Sharp HL. Cystic fibrosis liver disease and transplantation. J Pediatr 127:944–946, 1995. 85. Couetil JP, Houssin DP, Sourbane O, Chevalier PG, Dousset BE, Loulmet D, Achkar A, Tolan MJ, Amrein CI, Guinvarch A. Combined lung and liver  transplantation in patients with cystic fibrosis: a 4­1/2 year experience. J Thorac Cardiovasc Surg 110:1415–1422, 1995. 86. Zabner J, Couture LA, Gregory RJ, Graham SM, Smith AE, Welsh MJ. Adenovirus­mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in  nasal epithelia of patients with cystic fibrosis. Cell 75:207–216, 1993. 87. Grubb BR, Pickles RJ, He H, Yankaskas JR, Vick RN, Engelhardt JF, Wilson JM, Johnson LG, Boucher RC. Inefficient gene transfer by adenovirus vector to  cystic fibrosis airway epithelia of mice and humans. Nature 371:802–806, 1994. 88. Grubman SA, Fang SL, Mulberg AE, Perrone RD, Rogers LC, Lee DW, Armentano D, Murray SL, Dorkin HL, Cheng SH. Correction of the cystic fibrosis  defect by gene complementation in human intrahepatobiliary cell lines. Gastroenterology 108:584–592, 1995. 89. Yang Y, Raper SE, Cohn JA, Engelhardt JR, Wilson LM. An approach for treating the hepatobiliary disease of cystic fibrosis by somatic gene transfer. Proc Natl  Acad Sci USA 90:4601–4605, 1993.

  

Page 407

18—  Selected Advances in Imaging of the Gallbladder and Bile Ducts Matthew Barish and Joseph T. Ferrucci Boston Medical Center, Boston, Massachusetts Michael Blake Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, Massachusetts I—  Introduction Imaging of the gallbladder and biliary tree has undergone major changes in the last 5 to 10 years predominantly due to advances in ultrasound (US), computed  tomography (CT), and magnetic resonance imaging (MRI). These techniques are now capable of imaging the entire biliary tract noninvasively with accuracy rates  approaching or equaling those of invasive techniques such as endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) and percutaneous transhepatic  cholangiography (PTC), dramatically changing the approach to the diagnosis of diseases of the biliary system. This chapter reviews the recent advances in imaging of  the gallbladder and biliary tract, focusing on the techniques of US, helical CT, and MRI. The role of these various techniques in specific disease entities is discussed. II—  Imaging Advances A—  Ultrasonography Ultrasound (US) remains one of the primary modalities for imaging the biliary system and is particularly successful in examining the gallbladder. Recent advances in US  equipment have improved both spatial and contrast resolution, which have, in turn, increased the radiologist's sensitivity and specificity in the detection and  characterization of diseases of the biliary tract. The major innovation in US over the past 10 years has been the introduction of color and power Doppler vascular  imaging techniques. Their application has expanded the role of US to permit evaluation of vessel patency—flow direction as well as tissue perfusion—without the need  for contrast administration. The use of Doppler imaging in the evaluation of the biliary tree and cholecystitis is discussed in subsequent sections. B—  Helical Computed Tomography The introduction of helical CT has improved our ability to image the biliary tract by allowing the rapid acquisition of a volume of data capable of imaging all portions of  the ductal system. Previously, nonhelical CT scanners acquired data in separate slices during repetitive breath­hold acquisitions, which led to the risk of portions of the  biliary tract being excluded from the images. The use of helical CT permits the acquisition of a larger volume of tissue in which

  

Page 408

the entire biliary tract can be included in a single breath­hold period. In addition, the use of a helical technique allows retrospective reconstruction of images with  variable slice overlap. This postprocessing of data has led to an increase in the diagnostic accuracy of CT in the evaluation of diseases of the biliary tract. Current  techniques for imaging of the biliary tract require the use of spiral acquisition with thin collimation (3 to 5 mm), 20 to 40% reconstruction overlap, pitch of 10 to 1.5,  and use of both conventional and narrow image­display window widths. The use of oral and intravenous contrast material depends on the suspected disease entity  under study. However, dedicated biliary CT is improved with the use of negative (low­attenuation) contrast agents such as a water or lipid­containing fluids such as  milk. The use of high­density oral contrast material can create undesired artifacts as well as obscure stones of the distal common bile duct. In addition, scans should be  obtained both prior to and following the injection of intravenous contrast. Noncontrast scans are useful to detect both cholelithiasis and choledocholithiasis, which can  be obscured by enhancement of the walls of the gallbladder or bile ducts. C—  Magnetic Resonance Imaging MRI of the biliary system has undergone a major change due to the recent introduction of noninvasive methods, which provide projectional images of the biliary tree  simulating those obtained at ERCP. This technique has been termed magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP), and because of its recent  introduction, a review of the technique is warranted. MRCP uses the inherent tissue contrast between fluid­filled structures and the surrounding solid organs to  generate images of only the fluid­containing structures (gallbladder, bile duct, and pancreatic ducts). No exogenous contrast (either by intravenous or direct injection)  is necessary and the technique is completely noninvasive (1). The images rendered by MRCP resemble those provided by direct cholangiography obtained through  ERCP or PTC. They are projectional images and display ducts as bright against a dark background, which makes them easily understandable (Fig. 1). This has  allowed MRCP to become the primary diagnostic imaging modality in several clinical situations. It competes successfully with invasive tests, such as ERCP and PTC,  and with more traditional and widely accepted noninvasive imaging techniques, such as CT and US. Besides the well­known advantages of MRI—such as  noninvasiveness and multiplanar capabilities—other elements that have led to the widespread use of MRCP in biliary tract disease include faster sequences with  shorter total exam duration, use of high­resolution parameters without compromising signal­to­noise ratio (SNR), and improved three­dimensional rendering  techniques. The reasons for the great interest that MRCP has generated among radiologists, gastroenterologists, and surgeons are many. First, high­quality images can  be obtained with nearly all clinical scanners. Second, images are easy to interpret and agreement between different observers interpreting the same images is moderate  to substantial in most cases. Third, the available data demonstrate that MRCP has replaced diagnostic ERCP for many indications, with major implications for patient  management (1). Various pulse sequences and different approaches for MRCP have been described. Regardless of the specific sequence used, the principle underlying the technique is  the same: on heavily T2­weighted images, structures with long T2 relaxation times, such as those containing stationary fluids, exhibit very high signal intensity, while the  surrounding organs and tissues show marked decreases in signal intensity. The signal arising from fat can be further decreased with the use of chemically selective fat  suppression. The optimal sequence for routine clinical practice varies with different scanners and depends upon the availability of software applications. Most or all  techniques for MRCP described acquire images in a coronal or oblique coronal plane (following the usual anatomic arrangement of the extrahepatic bile ducts).  Imaging times depend on the sequences used with high­resolution imaging, which allow for three­dimensional, rotational viewing requiring approximately 6 to 15 min.  Alternatively, one can obtain two­dimensional projectional images or low­resolution imaging in 2 to 30 s. These rapid

  

Page 409

Figure 1 Normal MR cholangiogram demonstrating the projectional overview of the entire biliary system provided by the technique. gb, gallbladder; curved arrow, common hepatic duct; arrowhead and arrow, pancreatic duct.

imaging techniques have shown relatively high accuracy in the detection of cholecystolithiasis, choledocholithiasis, and biliary obstruction. III—  Disease Entities A—  Cholelithiasis 1—  Ultrasound The normal appearance of the gallbladder on US is that of an anechoic structure with a hyperechoic, well­defined wall measuring 3 mm or less in thickness. Minor  angulation of the transducer or decentering can cause pseudothickening of the gallbladder wall. The shape of the gallbladder can vary because of infolding of its wall. A  ''Phrygian cap" deformity is caused by folding of the fundus over its body; occasionally, prominent folds may cause acoustic shadowing mimicking a polyp or a stone.  The prone view is useful for demonstrating the mobility of stones, especially those hidden in the neck, and for avoiding shadowing from bowel gas and reverberation  artifacts. Occasionally, stones or sludge in the gallbladder can be demonstrated exclusively on prone views (2). Classically, a gallstone appears as an echogenic structure within the gallbladder lumen that causes distal acoustic shadowing and moves with gravity (Fig. 2). Accuracy  of up to 96% of sonography in the diagnosis of gallstones has been reported, results improving with advances in technology. (3) Gallstone size and number, however,  cannot be estimated accurately by US (4). When calculi completely fill the gallbladder, the demonstration of a wall echo shadow (WES) or double­arc shadow sign,  which consists of two parallel hyperechoic lines separated by a thin hypoechoic space and distal acoustic shadowing, is the key to the diagnosis (5). The proximal arc  represents the gallbladder wall, the distal arc represents the gallstones' reflections, and the hypoechoic space in between represents either a hypoechoic portion of the  wall or a small sliver of bile. Shadowing from the gallbladder fossa may also be caused by porcelain

  

Page 410

Figure 2 Gallstone demonstrated by sonography. Transverse image of the gallbladder demonstrates echogenic focus (arrow) with distal acoustic shadowing (arrowheads).

gallbladder or by acute emphysematous cholecystitis due to gas in the gallbladder. Focal intramural gas in acute emphysematous cholecystitis is usually associated with  reverberations or a comet­tail artifact. Gas­containing stones are rarely recognized on sonographic examination, even though gas has been noted by computed tomography in 4% of patients with visible  stones. The fissures in these calculi are usually arranged in a triradiate pattern. Gas­containing stones may also appear as two parallel linear echoes (double­echo sign)  or have a large, rounded gas bubble surrounded by a rim of solid material (6). Gallstones may be mimicked by intraluminal gas bubbles that cause shadowing. Gas  bubbles are usually associated with reverberation or comettail artifacts but may appear simply as echogenic foci. Cholesterol polyps causing subtle shadowing and  small gallstones not producing any acoustic shadow can also sometimes cause confusion. Sonographic findings of milk of calcium bile include layering echogenic  material with a flat fluid­fluid level or a convex meniscus usually associated with acoustic shadowing. Milk of calcium bile may also produce a weak reverberation  artifact (7). 2—  Computed Tomography CT detects approximately 75% of gallstones due to the differential attenuation between the bile and the stone. Approximately 25% of gallstones are not detected,  since they are either

  

Page 411

isodense to bile or too small to visualize adequately (8,9). Screening for gallstones with CT is not a routine technique because of its high cost, radiation exposure, and  low sensitivity. Although not a screening method, the widespread use of CT scanning of the upper abdomen for a variety of indications frequently reveals the incidental  presence of gallstones. Recognition and appreciation of the varied appearances of gallstones on CT images (Fig. 3) is therefore necessary and can avoid further  imaging. Gallstones can appear as homogeneously hyperdense to bile and are then readily detected (Figure 3c and d). Soft tissue—density stones are of only slightly  greater density than bile and can be difficult to visualize without narrow window­width settings (Fig. 4). In addition, the variable density of bile in the gallbladder can  change the relative densities between calculi and concentrated bile, rendering them isodense. Less frequently, a stone may appear homogeneously hypodense to bile;  these stones are felt to represent cholesterol calculi. Stones can have a more complex pattern, with hyperdense rims, varying layers of hypodensity and hyperdensity  (laminated) (Fig. 3c and d), central punctate hyperdensity, and even a central lucency containing gas. A proportion of routine intravenously administered iodinated  contrast is excreted in bile and can render bile within the gallbladder variably hyperdense. Specific biliary contrast agents that are preferentially excreted in bile exist in  both oral and intravenous formulations. After administration of these agents, bile in the gallbladder will become homogeneously hyperdense. This will improve detection  of lower density stones (Fig. 5) but may rarely obscure homogeneously hyperdense calculi. These CT biliary contrast agents are discussed in greater detail further on  in this chapter. 3—  Magnetic Resonance Imaging Gallbladder calculi generally show low signal on T1­ and T2­weighted MR images due to the lack of mobile protons (Fig. 6). However, most stones show at least  small areas of signal on T1­ or T2­weighted images typically in a central location. The size, distribution, and configuration of these areas of signal result in gallstones  with a variety of patterns (Fig. 7) (10). The ability to detect gallstones on MRI depends on the difference in signal between the bile and the stone. On T1­weighted  sequences, the bile within the gallbladder can vary in signal intensity from uniformly low (water­signal intensity) to uniformly bright (fat­signal intensity) due to variations  in lipid and bile salt concentrations in the concentrated bile of the gallbladder. This results in a variable detection rate of gallstones on T1­weighted sequences. On T2­ weighted sequences, bile will be of high signal intensity, similar to fluid elsewhere in the body. Rarely, sufficiently concentrated bile may appear to be of low signal even  on heavily T2­weighted sequences. MRCP or similar bright bile sequences are particularly effective in detecting calculi due to the high contrast between bile and  stones. MR exceeds CT and US in stone visualization because of this high contrast. B—  Cholecystitis 1—  Ultrasound of Cholecystitis Findings on gray­scale US supportive of a diagnosis of acute cholecystitis but lacking specificity include gallstones, sludge, gallbladder distention, a thickened wall with  hypoechoic zones, pericholecystic fluid, and intraluminal membranes (Fig. 8) (11). Gallbladder wall thickening may be seen in other disorders such as anasarca,  cirrhosis, pancreatitis, hepatitis, AIDS cholangiopathy, gallbladder carcinoma, and hyperplastic cholecystopathy (Fig. 9). A positive sonographic Murphy's sign,  defined as the presence of maximal tenderness elicited by direct pressure of the ultrasound transducer over the visualized gallbladder, has been reported to have a  positive predictive value for acute cholecystitis up to 73% (12). The positive predictive value of sonographic Murphy's sign combined with the presence of gallstones is  higher and reported to be 77 to 92% (12,13). Sonographic Murphy's sign may be negative in up to 70% of patients with gangrenous cholecystitis or on ventilator  support.

  

Page 412

Figure 3 Various appearances of gallstones on CT. (a) Noncontrast CT showing several calculi with faint central and peripheral calcifications (arrows). (b) Noncontrast CT shows innumerable small calculi of mixed attenuation with punctate central calcification (arrows). Oral dilute barium contrast is seen in the stomach and duodenal bulb. St, stomach; d, duodenum. (c) and (d) Noncontrast CT demonstrating large, laminated gallstone (arrows) on normal windows (c) and wide bone windows (d).

  

Page 413

Figure 4 Demonstration of calculi at different window settings on CT. (a) Stone with calcified rim in gallbladder (arrow) is barely visible at window level 40 and width 370. d, duodenum. (b) Stone becomes more conspicuous (arrow) at window level 50 and narrower width of 129. d, duodenum.

In recent years the main area of research in the diagnosis of cholecystitis has been related to vascular imaging innovations such as power Doppler imaging. Schiller et  al. showed the hyperemic changes in a thickened gallbladder wall to be more sensitive than a sonographic Murphy's sign and abnormal laboratory values (14). A  subsequent study showed the sensitivity of power Doppler sonography to be 95%, compared with 33% for color Doppler sonography, in revealing a  hypervascularized gallbladder wall. Power Doppler sonography revealed hyperemia within a nonthickened gallbladder wall in some patients with surgically proven  acute cholecystitis. Although the sensitivity of power Doppler sonography in diagnosing acute cholecystitis was similar to that of gray­scale sonography, the specificity  of power Doppler sonography was significantly higher, which substantially improved diagnostic confidence (15). Color Doppler sonography (CDS) of the cystic artery flow in the anterior wall of the gallbladder has also been used to diagnose acute cholecystitis by demonstrating  increased color flow in patients with acute cholecystitis (16,17). With normal CDS, the color flow is visible only in the proximal body and neck of the gallbladder and  can be seen in up to 40% of healthy persons (16,17). Jeffrey et al. reported increased color flow with visualization of cystic artery length greater than half of the  anterior gallbladder wall length in 26% of patients with acute cholecystitis, compared with only 2% of normal gallbladders (18). Even though increased color flow is  suggestive of acute cholecystitis, the usefulness of CDS in the diagnosis of acute cholecystitis is limited by its low sensitivity (40%) and low positive predictive value  (24%) (16). It is important to be aware that power Doppler sonography is significantly more sensitive than CDS for revealing cystic artery flow in patients with normal gallbladders  (19). In this study, power Doppler sonography revealed flow in 73% of patients with normal gallbladders, compared with 53% revealed by CDS. The flow patterns in  patients with normal gallbladders

  

Page 414

Figure 5 Gallbladder calculi seen on CT following intravenously administered cholangiographic contrast. (Courtesy of Jorge Soto.) Stones are seen as multiple filling defects (arrows) within the opacified gallbladder. Note opacification of several intrahepatic bile ducts (arrowheads).

obtained with power Doppler sonography overlapped the flow patterns previously reported as fairly specific criteria for diagnosing acute cholecystitis using CDS (i.e.,  flow within the distal fundal quartile and flow spanning greater than 50% of the anterior wall). Therefore, different power Doppler sonography criteria are necessary, as  CDS criteria are not applicable to the diagnosis of acute cholecystitis with power Doppler sonography (19). Researchers from Paris have reported on color velocity imaging, a color sonographic technique that uses data contained in gray­scale B­mode image scan lines, to  determine blood flow velocity. Sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive value, and negative predictive value of color velocity imaging and power Doppler  sonography for revealing acute cholecystitis were 95, 100, 99, 100, and 99%, respectively. The accuracy of color velocity imaging and power Doppler sonography in  revealing acute cholecystitis was significantly greater than the accuracy of gray­scale sonography (20). If these results are confirmed on further studies, color velocity  imaging would be a major breakthrough. Although advances in vascular imaging using Doppler have been reported to improve the accuracy of ultrasound in the  diagnosis of cholecystitis, further study is needed before these techniques are fully accepted. The many complications of acute cholecystitis can have varied appearances on US. Empyema with pus in a distended gallbladder may simply resemble echogenic  sludge. Several sonographic features can suggest gangrenous cholecystitis, including striated thickening of the wall, intraluminal membranes, marked wall asymmetry,  and pericholecystic debris­filled collections (Fig. 9) (21,22). Sonographic findings in hemorrhagic cholecystitis are similar to those in gangrenous cholecystitis, with  which it is often associated. Following gallbladder perforation, pericholecystic fluid collections may appear anechoic or complex. The gallbladder frequently has an  irregular indistinct outline; sometimes a focal interruption of the gallbladder wall signifies the site of perforation (23). If acute emphysematous cholecystitis develops, gas  in the

  

Page 415

Figure 6 Cholelithiasis on MRI. (a) Axial image from T1­weighted sequence shows foci of reduced  signal within the gallbladder representing gallstones (arrow). (b) Axial image from heavily T2­weighted sequence show foci of reduced  signal within the gallbladder representing gallstones (arrow). d, duodenum; open arrow, common bile duct.

gallbladder lumen typically produces a hyperechoic reflection with reverberations or comet­tail artifacts within its acoustic shadow. Similarly gas within the wall of the  gallbladder is usually seen as a hyperechoic ring around the fluid­filled gallbladder, often with associated reverberations (24). Acute acalculous cholecystitis (AAC) accounts for 5 to 15% of all cases of acute cholecystitis, but clinical diagnosis is difficult. Sludge within a distended gallbladder is  nonspecific, but abnormalities more indicative of AAC include diffuse intraluminal echogenicity secondary to pus or hemorrhage, hypoechoic regions within a thickened  wall, and a positive sonographic Murphy's sign (25). Chronic cholecystitis is most commonly (90%) associated with gallstones. The long­standing chronic inflammation may cause muscular hypertrophy of the gallbladder  wall and a fibrotic reaction leading to dilatation of the Rokitansky­Aschoff sinuses and hyperplastic cholecystopathy. In appropriate clinical circumstances, sonographic  findings of gallbladder wall thickening and gallstones are suggestive even though nonspecific. Chronic acalculous cholecystitis is a poorly understood entity and no  single test provides a specific diagnostic sign. Diffuse gallbladder wall thickening and intraluminal nonshadowing echoes may be seen. Biliary scintigraphy may be the  most sensitive technique for the diagnosis (26). Sonographic findings of xanthogranulomatous cholecystitis may mimic carcinoma and include marked thickening of the  gallbladder wall, which may be irregular and lobulated with hypoechoic nodules, and an indistinct interface between the gallbladder and liver.

  

Page 416

Figure 7 Variable appearance of gallstones on MRCP. (a) Four consecutive source coronal images from MRCP demonstrate a large filling defect in the gallbladder representing a stone (arrow). (b) Oblique coronal maximum­intensity  projection (MIP) MRCP demonstrates several rounded filling defects representing gallstones in the dependent portion of the gallbladder (open arrow). (c) Oblique coronal MIP MRCP demonstrates several filling defects in the gallbladder representing gallstones (black arrow). The central stellate high signal represents the MR equivalent of a "Mercedes Benz" sign (white arrow).

  

Page 417

Figure 8 Acute cholecystitis on US. Longitudinal (a) and transverse (b) sonograms show marked circumferential thickening of the gallbladder wall (arrows) and a pericholecystic complex collection (curved arrows) in a patient with acute cholecystitis and a positive sonographic Murphy's sign.

  

Page 418

Figure 9 Gallbladder wall thickening in the absence of acute cholecystitis in a 35­year­old HIV­positive male. Longitudinal (a) and transverse (b)  sonograms of the gallbladder show asymmetrical circumferential thickening of the gallbladder wall (arrows) secondary to HIV infection and a low­albumin state.

  

Page 419

2—  Computed Tomography of Cholecystitis As in the evaluation of cholecystolithiasis, CT is not the primary method of evaluation of acute cholecystitis. CT is used, however, in the evaluation of patients with  unexplained abdominal pain where cholecystitis may be the etiology. Since complicated cholecystitis may present confusing signs, symptoms, and clinical presentations,  CT scanning may be the initial imaging modality chosen in these patients with unsuspected gallbladder disease. In one series of complicated cholecystitis by Terrier et  al., gallbladder disease was suspected in only 7 of 23 patients (27). It is important, therefore, to recognize and appreciate the appearances of acute cholecystitis on  CT images. The CT appearance of acute cholecystitis mimics the ultrasound findings and consists of gallbladder wall thickening (>3 mm) and cholelithiasis (Fig. 10) (28). These  findings are nonspecific and gallbladder wall thickening may be seen in multiple other disorders. The lack of an equivalent CT diagnostic criterion to the sonographic  Murphy's sign may decrease specificity. CT can visualize the infiltration and inflammation of the pericholecystic fat, however, which is not visible on ultrasound (Fig.  11). Additional CT findings suggestive of cholecystitis include increased density of bile, loss of definition of the gallbladder wall, and dilatation of the gallbladder lumen. As in US, complicated cholecystitis can present an array of findings which, on CT, include hypodense regions in the thickened gallbladder wall, pericholecystic fluid  collections, intrahepatic parencymal low attenuation from edema, direct spread of the inflammatory process, or intrahepatic abscesses. Emphysematous cholecystitis is  demonstrated on CT as air within the gallbladder wall or lumen (Fig. 12). Air within the gallbladder lumen can also be a sign

Figure 10 Acute cholecystitis demonstrated on CT. (a) Gallstones (arrows) are of almost the same attenuation as the bile in the gallbladder, which has a thickened wall. (b) Low attenuation within the liver superior to gallbladder fundus represents adjacent hepatic inflammation (arrowheads).

  

Page 420

Figure 11 Acute cholecystitis demonstrated on contrast­enhanced CT. There is  circumferential thickening of the wall with muscosal enhancement (arrows) and extensive stranding of the pericholecystic fat (curved arrow).

Figure 12 Emphysematous cholecystitis on CT. Consecutive axial CT images show multiple calcified gallstones within the gallbladder (black arrows; a and b), air in the gallbladder lumen (curved arrows; a and b), and air in the gallbladder wall (white arrow; b).

  

Page 421

of emphysematous cholecystitis; however, intraluminal gas can also be due to prior ERCP, sphincterotomy, biliary­enteric anastomoses, or biliary­enteric fistulae. 3—  Magnetic Resonance Imaging of Cholecystitis As in the CT diagnosis of acute cholecystitis, the MR hallmark of the disease is gallbladder wall thickening in the presence of gallstones. In addition, the added tissue  and fluid characterization of MR has been used in an attempt to increase the diagnostic accuracy of MR by evaluating the functional capability of the gallbladder to  concentrate bile. This technique of evaluating the signal intensity of bile on MR was used to diagnose cholecystitis as early as 1986 (29). The diseased gallbladder is  unable to concentrate bile and therefore, on T1­weighted images, the gallbladder bile in patients with cholecystitis is isointense or hypointense to hepatic parenchyma,  while in normal gallbladders the bile is hyperintense (29,30). Other authors, however, reported no significant difference in T1 and T2 relaxation times between  extracted bile (in vitro) from normal gallbladders and those with acute cholecystitis (31). The morphological changes of acute cholecystitis are also well demonstrated by MR imaging. Gallbladder wall thickening is well demonstrated on both T1­ and T2­ weighted images, while intramural fluid, pericholecystic fluid, and edema are better seen on T2­weighted imaged (Fig. 13) (32). Recent advances in MRI have led to  more rapid imaging techniques capable of imaging the upper abdomen with T2­weighted images in a single breath­hold. These

Figure 13 Acute cholecystitis on MRI. T2­weighted axial MR image  depicting several low­signal foci representing gallstones (black  arrows) and pericholecystic high signal representing surrounding inflammation within the pericholecystic fat of Morrison's pouch (white arrows) and edema within the liver parenchyma (curved arrows).

  

Page 422

techniques have been applied to the evaluation of cholecystitis by Regan and coworkers, who have reported a sensitivity of 91% and a specificity of 79%. The  diagnosis of cholecystitis was based on the presence of pericholecystic high signal and gallbladder calculi (33). In this study, HASTE MRI detected seven patients with  choledocholithiasis, while ultrasound visualized the calculi in only five. Since this examination can be performed in less than 10 min, it is possible that MR may compete  with US in the evaluation of patients with atypical right­upper­quadrant pain in whom either acute cholecystitis or choledocholithiasis with acute cholangitis is  suspected. 4—  Nuclear Medicine Imaging of Cholecystitis Radionuclide cholescintigraphy was one of the major radiological advances of the 1970s and is of proven value in the diagnosis of acute cholecystitis (34). The  radiopharmaceutical is injected intravenously, metabolized by hepatocytes, excreted in bile, and concentrated by the gallbladder. With gamma camera, images of the  biliary tree can be obtained by recording the photons emitted from the radionuclide within the bile. Multiple images are obtained over a prolonged period of time (up to  6 h), which demonstrate the distribution of the ''tagged" bile. The principle underlying interpretation of radionuclide cholescintigraphy is that the lack of gallbladder  visualization indicates occlusion of the cystic duct, while lack of visualization of the duodenum suggests obstruction of the bile duct. Recent progress has centered on  technical and pharmacological developments. The evolution of biliary imaging compounds such as 99mTc disofenin and mebrofenin now allow the depiction of the biliary tree even in patients with a high level of  bilirubin (35). Administration of morphine reduces the examination duration and gives functional gallbladder information. Nonvisualization of the gallbladder by 90 min  with morphine in an appropriate clinical setting is diagnostic of acute cholecystitis. When the gallbladder is not observed by 60 min but then appears within 60 min  following morphine administration, a positive diagnosis of abnormal gallbladder function can be made (36). Morphine­enhanced radionuclide cholescintigraphy has  also been shown to be useful in the evaluation of critically ill patients for suspected acute cholecystitis, particularly in patients with known risk factors or documented  gallstones (37). Administration of morphine thus has many advantages, including a shortened examination time and a reduction in the incidence of false­positive results.  False positives still occur, however, due to chronic cholecystitis, hyperalimentation, or excessive fasting (38). When the gallbladder is observed in a clinical setting of  biliary pain, cholecystokinin­8 (CCK­8) may be infused intravenously for the measurement of the ejection fraction. An ejection fraction value of less than 35% is  indicative of calculous or acalculous chronic cholecystitis (36). The excellent direct sonographic visualization of the gallbladder along with the generally greater availability of US has seen scintigraphy supplanted in many centers, but  it remains a good technique for the diagnosis of acute cholecystitis. Cystic duct calculi are sometimes difficult to visualize ultrasonographically, so hepatobiliary  scintigraphy may be particularly useful to evaluate the functional patency of the cystic duct in patients whose clinical presentation strongly supports stone disease (39). C—  Choledocholithiasis 1—  Ultrasound of Choledocholithiasis Choledocholithiasis occurs in approximately 15% of patients with gallstones, with the majority of common duct stones originating from the gallbladder (40). In Asia,  parasitic infection can be a major cause of intraductal formation of calculi (primary CBD stones). Sonography is usually considered to be the screening method of  choice due to its low cost, noninvasiveness, availability, and lack of ionizing radiation. Sensitivity for sonographic detection of CBD stones has improved with the  newer higher­resolution US machines and has approached 75% in certain studies (41). This high sensitivity depends on high operator skill, meticulous technique, and  cooperative patients and is therefore difficult to achieve routinely in clinical practice (Fig. 14a).

  

Page 423

Figure 14 Choledocholithiasis on US. (a) Sonogram. reveals dilated common bile duct (arrow) measuring 11.2 mm. (cursors), but the obstructing stone was not visualized. (b) Sagittal oblique sonography shows a dilated common bile duct (CBD) with an intraluminal focus of increased echogenicity representing a CBD stone (arrow) (no associated demonstrable shadowing). Portal vein (V) lies posterior to CBD.

  

Page 424

Calculi are often impacted in the distal CBD and detection may be optimized by using a gastric window after the patient ingests water or scanning transversely with the  patient in an erect position. CBD stones appear as hyperechoic structures with distal acoustic shadowing, similar to stones within the gallbladder. Occasionally, distal  acoustic shadowing may be difficult to demonstrate (Fig. 14b). It is easier to demonstrate stones in a dilated duct, but in about one­third of cases of CBD calculi, no  duct dilatation is seen due to the intermittent nature of stone impaction and obstruction. Several possible interpretative pitfalls exist in the diagnosis of CBD stones. Pancreatic calcification, pneumobilia, surgical clips, and folds in tortuous ducts may all be  associated with distal shadowing and can mimic stones. The distal cystic duct insertion or right hepatic artery indentation may also produce an echo within the CBD.  The true cause of these mimics of stone disease can usually be recognized by a careful scanning technique and by assessing the patient in different positions. Sludge in  the CBD appears as echogenic material without shadowing and occasionally demonstrates layering or a plug­like appearance. Biliary sludge is seen in 10 to 29% of  patients following liver transplantation and may lead to biliary obstruction and ascending cholangitis (42). There is considerable interest in new applications of US in assessing the biliary tree. In a study of 65 patients intraoperative US compared favorably with intraoperative  cholangiography in terms of untility in exploring bile ducts for stones and with respect to its safety, shorter examination period, and ease of administration. The authors  found intraoperative US to be an effective procedure for biliary exploration during laparoscopic cholecystectomy (43). In a larger study of 216 patients with  symptomatic cholelithiasis, the main intra­ and extrahepatic ducts were well documented by laparoscopic US in all patients, but in eight cases the distal tract of the  CBD was not well visualized. The authors concluded that laparoscopic ultrasonographic examination may be a real alternative to cholangiography during laparoscopic  cholecystectomy, but considerable ultrasonographic experience is required for the examination to be performed successfully (44). 2—  Computed Tomography of Choledocholithiasis A—  Noncontrast Computed Tomography In patients in whom the diagnosis of choledocholithiasis is the main concern, ultrasonography is the usual screening technique. Direct referral to ERCP may be  indicated where there is a high clinical suspicion of ductal stones owing to the high accuracy of ERCP and the ability to extract the stone during the same procedure.  However, patients often present with biliary obstructive signs and symptoms without a clear etiology. In these patients, US, CT, and recently MRI have become  acceptable screening modalities for the evaluation of the site and etiology of the biliary obstruction. The reported sensitivity of noncontrast CT for the detection of  biliary stones varies from 45 to 90% (45–49). More recent reports with thin­section helical CT have shown improved performance. Neitlich et al. demonstrated a  sensitivity of 88% with an overall accuracy of 94% for the detection of choledocholithiasis using thin­section breath­hold helical CT. Neither hyperdense oral contrast  nor intravenous contrast was used, as both of these agents can obscure biliary calculi. In addition, detection of calculi was improved by the use of narrow "bile  windows" in which the display­window width was set to 150 HU and the level was set to the mean attenuation of bile (50). The appearance of a duct stone is variable and may resemble (a) a calcific density surrounded by a crescent of hypointense biles, (b) a hyperattenuating ring  surrounded by hypoattenuating bile, or (c) a soft tissue attenuation focus either surrounded by hypoattenuating bile or with hypoattenuating bile above and below (50).  Stones within the biliary tract show the same variable appearance as stones within the gallbladder. Ductal calculi may appear hyperintense or hypointense to bile.  Calcific stones are easily seen as hyperintense foci along the course of the bile duct (Fig. 15). When stones have a peripheral rim of calcium, the rim can be difficult to  differentiate from the duct wall. This differentiation is even more difficult after

  

Page 425

Figure 15 Choledocholithiasis evaluated with CT and MRI. a to c. Axial CT (a), T1­weighted MRI (b), and  T2­weighted MRI at the same level. (a) Axial CT  showing calcified calculus (arrow) within the gallbladder. Small stone in the common bile duct (CBD) is difficult to visualize (curved arrow). (b) T1 weighted axial MR image shows a high signal gallbladder calculus (arrow) and a stone in the common bile duct (curved arrow). (c) T2­weighted axial MR images shows a low­signal  filling defect in the dependent portion of the gallbladder representing the calculus (arrow) and the CBD calculus (curved arrow). (d) T2­weighted axial MR image shows a CBD  calculus (arrow). (e) Source coronal image from MR cholangiopancreatogram (MRCP) demonstrates a filling defect in the CBD representing the stone (curved arrow). (f) Oblique coronal maximum­intensity projection  (MIP) MRCP clearly demonstrates the CBD calculus (curved arrow). (g) CT demonstrates a calcified calculus (arrow) in the CBD. (h) T1­weighted axial MR image shows the stone  in the distal CBD (curved arrow). (i) Source coronal image from MRCP demonstrates the calculus impacted in the distal CBD (curved arrow).

the administration of intravenous contrast, which produces enhancement of the bile duct wall simulating a hyperdense calcified rim of an intraductal stone. Cholesterol  stones can appear isointense to bile and therefore may be difficult or impossible to detect with noncontrast helical CT (50). The bile in the ducts is not as concentrated  as the bile in the gallbladder; and therefore. hypointense CBD stones are less common. B—  Computed Tomography Following Cholangiographic Contrast Agents In an effort to improve the accuracy of helical CT in the detection of common duct stones, multiple investigators have proposed the use of exogenously administered  contrast agents that are preferentially excreted in bile (51,52). Several intravenous agents exist that include meglumine salts, such as iodoxamate, iotroxamate,  ioglycamate, and iododipamide. These agents are slowly infused over 45 min, conjugated by the liver, and excreted in bile, resulting in the opacification of the biliary  tract approximately 30 min after the end of infusion. This technique, known as CT cholangiography, attempts to improve the visualization of calculi by increasing the  attenuation of bile to a level greater than that of biliary stones. The resultant images would have

  

Page 426

Figure 15 Continued.

  

Page 427

Figure 15 Continued.

the greatest contrast differential for hypoattenuating stones such as cholesterol stones (Fig. 16). The resultant axial images can be reviewed as in conventional CT  interpretation or the helical CT data set can be subjected to a variety of postprocessing tools such as maximum­intensity pixel projection (MIP) or shaded surface  displays (SSDs). These techniques yield projectional images similar to ERCP or three­dimensional images capable of fully demonstrating the complex biliary anatomy.  In a study by Stockberger et al., bile duct stones were detected with a

  

Page 428

Figure 16 Calculi on CT following an orally administered cholangiographic contrast agent. (Courtesy of Jorge Soto.) Stones are seen as multiple filling defects within the opacified gallbladder (arrows) and CBD (curved arrow).

sensitivity of 86%, a specificity of 100%, and an accuracy of 94% (51). There was one stone that was isodense to the enhanced bile and was not detected by the  technique. The intravenous agent produced poor opacification of the biliary tree in 75% of patients, in whom the serum bilirubin levels were elevated above 2 mg/dL  (34 mmol/L). Intravenous CT cholangiography is not likely to obtain widespread use for many reasons, which include the poor biliary excretion of the contrast agent in  patients with elevated bilirubin levels, lack of FDA approval of these agents in the United States, and the reported incidence of severe reactions, including death (53). Orally administered cholangiographic contrast agents are also being used to opacify the biliary tract for CT cholangiography. Soto used 6 g of orally administered  iopanoate ingested 12 h prior to helical CT scanning (54). This agent is generally considered safe and is well tolerated by most patients. Adequate opacification of the  biliary tract was achieved in 27 of 29 patients. Sensitivity, specificity, and accuracy for choledocholithiasis were 93, 100, and 97% respectively. Common duct  opacification was further improved by administering a fatty meal to evacuate the gallbladder (54). The use of orally administered cholangiographic contrast agents as  part of the routine preparation for abdominal CT in patients with suspected biliary disease still awaits further evaluation. Because of the ease of administration, lack of  significant adverse reactions, and wide availability of these agents, their routine use may become standard practice in the future. The major limitations of the technique  are the lack of sufficient biliary excretion of the agent with elevated bilirubin levels and the theoretical risk of masking hyperdense calculi by increasing the attenuation of  bile to equal that of the stone. 3—  Magnetic Resonance Imaging/Magnetic Resonance Cholangiopancreatography of Choledocholithiasis The high contrast resolution of MRI allows the detection of CBD stones without the need for injection of contrast material or invasive techniques such as ERCP or  PTC. MRI techniques

  

Page 429

for the detection of biliary stone disease capitalize on the inherent contrast between high­signal bile and the low signal of nearly all types of stones. Routine axial T2­ weighted images are capable of demonstrating intraductal stones as low­signal filling defects usually seen on the dependent wall (Figs. 17 to 20). The major limitation  of routine axial imaging is the large number of slices necessary to cover the entire biliary tree. This results in prolonged scan times, possible gaps between slices,  degradation of image quality by motion artifact, and loss of spatial resolution. Recent use of coronal acquisitions and the addition of fast imaging techniques have  allowed MRI to produce high­contrast images capable of demonstrating the entire pancreaticobiliary tree. The resultant coronal images can be reviewed as individual  source images, or the volumetric data can be subjected to a variety of postprocessing tools such as maximum­intensity pixel projection (MIP) or shaded surface  displays (SSD). These techniques yield projectional images similar to ERCP or three­dimensional images that better demonstrate the complex biliary anatomy. These  dedicated MR sequences and the postprocessing techniques are termed MR cholangiopancreatography. MRCP has allowed the detection of bile duct stones with high accuracy, nearing or equaling ERCP. Recent experience (55–58) has demonstrated sensitivities for the  diagnosis of choledocholithiasis approaching 98%, when stones 4 mm or greater in size are considered. The higher SNR afforded by phased­array coils allows  imaging with high­resolution parameters, thereby improving detection of small stones (59). Sensitivity for the diagnosis of choledocholithiasis by MRCP is certainly  superior to that of US (20 to 75%) (41) and CT (45 to 85%) (60,61). The interpretation of MRCP studies for detecting intraductal stones demands a meticulous  review of the source images, since in the MIP reconstructions the foci of low signal (the typical appearance of stones on MRCP) can be obscured by the very high  signal intensity of surrounding bile. The importance of careful review of these source images in confirming the presence of stones cannot be overemphasized. Another  potential error is misdiagnosing a stone for another type of intraluminal filling defect, such as an intraductal tumor. The recent acceptance of laparoscopic cholecystectomy as the procedure of choice for the management of patients with cholelithiasis has resulted in a decrease in  postoperative

Figure 17 Choledocholithiasis on MRI. Signal voids throughout the CBD representing multiple stones (arrow) on oblique coronal maximum­intensity projection  (MIP) MR cholangiopancreatogram. GB, gallbladder; Du, duodenum.

  

Page 430

Figure 18 Choledocholithiasis on MRI. a and b. Signal void in distal common bile duct (CBD) representing a CBD stone (arrow) on oblique coronal maximum­intensity projection MR cholangiopancreatogram (MRCP) and coronal source image from MRCP.

recovery time and hospital stay (62). The role of MRCP in the preoperative diagnosis of choledocholithiasis is complicated, especially since minimally invasive  laparoscopic methods to remove bile duct calculi have also emerged. Approximately 10 to 15% of patients who undergo cholecystectomy have CBD calculi (63), and  currently the preoperative evaluation of patients almost always includes US and measurement of serum liver function tests. These studies however lack sufficient  sensitivity and the incidence of CBD stones unsuspected on preoperative investigations but discovered at time of intra­operative cholangiography (IOC) ranges from 3  to 5% (64). Liver function tests also lack specificity, since only 33% of patients with abnormal results have choledocholithiasis (65). This lack of specificity results in a  40 to 70% incidence of negative ERCP examinations for CBD stones (66). Since MRCP has been shown to have high sensitivity and specificity for  choledocholithiasis, MRCP could limit preoperative ERCP to therapy for those patients with stones. ERCP is a technically challenging procedure. Reported rates of failure of ductal cannulation vary between 3 and 10% (67–69), the frequency clearly being determined  by the experience and expertise of the endoscopist. Although many failures are due to inexperience, several anatomical factors such as periampullary diverticula and  duodenal stenosis (68,69) may be responsible for difficulties in duct cannulation. When the ducts are not cannulated with conventional ERCP, a precut papillotomy  with a needle­knife is often required. The incidence and severity of complications following precut papillotomy are much higher than those after conventional diagnostic  ERCP. The reported rate of postprocedure pancreatitis and other complications for this needle­knife procedure (6 to 15%) (67,70) is substantially higher than the 1 to  5% for conventional diagnostic ERCP (67,71,72). Other available options, such as PTC and surgery, are also associated with significant morbidity. In a study that  specifically addressed

  

Page 431

Figure 19 Choledocholithiasis on MRI. (a) Two consecutive source coronal images from MRCP demonstrate multiple filling defects in the common bile duct (CBD) representing calculi (arrows and curved arrow). (b) Corresponding oblique coronal maximum­intensity projection MR  cholangiopancreatogram again demonstrates filling defects in the CBD representing calculi (arrow and curved arrow).

Figure 20 T2­weighted axial MR images shows a low­signal filling defect in the  dependent portion of the gallbladder (GB), representing the gallbladder calculus (arrow), and a further common bile duct (CBD) low­signal focus  representing the CBD calculus (curved arrow).

  

Page 432

this issue, MRCP was shown to be useful for evaluating patients who have had a failed ERCP attempt, regardless of the reason for failure, and that it can be helpful in  guiding patient management (73). The failure rate of ERCP in patients who have had a previous biliary­enteric anastomosis or gastroenteric drainage procedure such as Bilroth II has been shown to be  considerably higher than in intact patients, with reported figures varying between 10 and 48% (74–76). In patients with Bilroth II anatomy, the length of the afferent  limb is the most important factor determining the ability to reach the periampullary region (76). In this group of patients, MRCP will demonstrate the site of the biliary­ enteric anastomosis as well as the status of the intrahepatic ducts and can therefore help determine which patients may benefit from antegrade duct cannulation with a  drainage procedure or a possible balloon dilatation of a stenotic anastomosis (73,77). Even though the high sensitivity and specificity for MRCP in the diagnosis of CBD stones is established, the precise role of MRCP in the workup of patients with  suspected choledocholithiasis has not yet been defined. Many patients are referred for ERCP because of high suspicion for stones on the basis of clinical history,  symptoms, results of liver function tests, or finding on US or CT. Routine use of MRCP for confirmation of the presence of stones prior to ERCP is difficult to justify in  this era of cost awareness (78,79), since most of these patients will need to be treated endoscopically with stone extraction immediately following cholangiographic  diagnosis. MRCP is clearly indicated when the diagnosis is being entertained and the CBD cannot be cannulated on ERCP, since definitive therapy usually requires  more invasive intervention, such as precut papillotomy, antegrade cholangiography with stone extraction, or surgical exploration. In these cases, MRCP will increase  diagnostic certainty, thereby limiting these therapeutic procedures to those patients who will truly benefit from them (73). MRCP may also be indicated when clinical  suspicion is only moderate and a primary diagnostic ERCP is difficult to justify. IV—  Conclusion Recent advances in ultrasound, CT, and MRI have changed and will continue to change the diagnostic evaluation of patients with biliary stone disease. As these  noninvasive methods are refined and improved, they will compete with more invasive diagnostic examinations such as PTC and ERCP. Currently, MRCP has  demonstrated accuracy rates equivalent to ERCP for the detection of common duct stones and accuracy rates surpassing ultrasound for the detection of gallstones. It  seems prudent to surmise that in the future, invasive diagnostic techniques with their higher rates of complications, higher costs, and lower availability will be replaced  by noninvasive imaging techniques. Therapy will remain, for now at least, the domain of invasive techniques. References 1. Barish MA, Soto JA. MR Cholangiopancreatography: techniques and clinical applications. AJR 1997; 5:1295–1303. 2. Parulekar SG. Evaluation of the prone view for cholecystosonography. J Ultrasound Med 1986; 5:617. 3. Zeman R. Cholelithiasis and cholecystitis. In: Gore RM, Levine MS, Laufer I, eds. Gastrointestinal Radiology. Philadelphia: Saunders, 1994, p 1657. 4. Brakel K, Lameris JS, Nijs HG, et al. Accuracy of ultrasound and oral cholecystography in assessing the number and size of gallstones: implications for non­ surgical therapy. Br J Radiol 1992; 65:779. 5. MacDonald FR, Cooperberg, PL, Cohen MM. The WES triad: a specific sonographic sign of gallstones in the contracted gallbladder. Gastrointest Radiol 1981;  6:39.

  

Page 433

6. Mitchell DG, Needleman L, Frauenhoffer S, et al. Gas containing gallstones: the sonographic ''double echo sign." J Ultrasound Med 1988; 7:39. 7. Parulekar SG. Ultrasonic detection of calcification in gallstones: "the reverberation shadow." J Ultrasound Med 1984; 3:123. 8. Baron RL, Rohrmann CA Jr, Le SP, Shuman WP, Teefey SA. CT evaluation of gallstones in vitro: correlation with chemical analysis. AJR 1988; 151:1123–1128. 9. Barakos JA, Ralis PW, Lapin SA, et al. Cholelithiasis: evaluation with CT. Radiology 1987; 162:415–418. 10. Baron RL, Shuman WP, Lee SP, Rohrman CA, Golden RN, Richards TL, Richardson L, Nelson JA. MR appearance of gallstones in vitro at 1.5 T: correlation  with chemical composition. AJR 1989; 153:497–502. 11. Laing FC, Federle MP, Jeffrey RB, et al. Ultrasonic evaluation of patients with acute right upper quadrant pain. Radiology 1981; 140:449. 12. Bree RL. Further observations on the usefulness of the sonographic Murphy sign in the evaluation of suspected acute cholecystitis. JCU J Clin Ultrasound 1995;  23:169. 13. Ralls PW, Colletti PM, Lapin SA, et al. Real­time sonography in suspected acute cholecystitis. Radiology 1985; 155:767. 14. Schiller VL, Turner RR, Sarti DA. Color Doppler imaging of the gallbladder wall in acute cholecystitis. Abdom Imaging 1996 May–Jun; (3):233–237. 15. Uggowitzer M, Kugler C, Schramayer G, et al. Sonography of acute cholecystitis: comparison of color and power Doppler sonography in detecting a  hypervascularized gallbladder wall. AJR 1997; 168(3):707–712. 16. Parulekar SG, Hillier SA, Adell JA, et al. Color Doppler sonography of the gallbladder wall. J Ultrasound Med 1995; 14(suppl):S21. 17. Paulson EK, Kliewer MA, Hertzberg BS, et al. Diagnosis of acute cholecystitis with color Doppler sonography: significance of arterial flow in thickened  gallbladder wall. AJR 1994; 162:1105. 18. Jeffrey RB Jr, Nino­Murcia M, Ralls PW, et al. Color Doppler sonography of the cystic artery: comparison of normal controls and patients with acute  cholecystitis. J Ultrasound Med 1995; 14:33. 19. Olcott EW, Brooke Jeffrey R, Jain KA. Power versus color Doppler sonography of the normal cystic artery: implications for patients with acute cholecystitis. AJR  1997; 168:703–705. 20. Soyer P, Brouland JP, Boudiaf M, et al. Color velocity imaging and power Doppler sonography of the gallbladder wall: a new look at sonographic diagnosis of  acute cholecystitis. AJR 1998; 171:183–188. 21. Teefey SA, Baron RL, Radke HM, et al. Gangrenous cholecystitis: new observations on sonography. J Ultrasound Med 1991; 10:603. 22. Teefey SA, Baron RL, Bigler SA. Sonography of the gallbladder: the significance of striated (layered) thickening of the gallbladder wall. AJR 1991; 156:945. 23. Chau WK, Wong KB, Chan SC, et al. Ultrasonic hole sign: a reliable sign of perforation of the gallbladder. J Clin Ultrasound 1992; 20:294. 24. Bloom RA, Libson E, Lebensart PD, et al. The ultrasound spectrum of emphysematous cholecystitis. J Clin Ultrasound 1989; 17:251. 25. Cornwell EE III, Rodriquez A, Mirvis SE, et al. Acute acalculous cholecystitis in critically injured patients: preoperative diagnostic imaging. Ann Surg 1989;  210:52. 26. Raptopoulos V, Compton CC, Doherty P, et al. Chronic acalculous gallbladder disease: multi­imaging evaluation with clinical­pathologic correlation. AJR 1986;  147:721. 27. Terrier F, Becker CD, Stoller C, Triller JK. Computed tomography in complicated cholecystitis. J Comput Assist Tomogr 1984; 8:58–62. 28. Kane RA, Costello P, Duszlak E. Computed tomography in acute cholecystitis: new observations. AJR 1983; 141:697–701. 29. McCarthy S, Hricak H, Cohen M, Fisher MR, Winkler ML, Filly RA, Margulis AR. Cholecystitis: detection with MR imaging. Radiology 1986; 158:333–336.

  

Page 434

30. Pu Y, Yamamoto F, Igimi H, et al. A comparative study of usefulness of magnetic resonance imaging in the diagnosis of acute cholecystitis. J Gastroenterol 1994;  14:192–198. 31. Loflin TG, Simeone JF, Mueller PR, et al. Gallbladder bile in cholecystitis: in vitro MR evaluation. Radiology 1985; 157:457–459. 32. Weissleder R, Stark D, Compton CC, Simeone JF, Ferrucci JT. Cholecystitis: diagnosis by MR imaging. Magn Reson Imaging 1988; 6:345–348. 33. Regan F, Schaefer DC, Smith DP, Petronis JD, Bohlman ME, Magnuson TH. The diagnostic utility of HASTE MRI in the evaluation of acute cholecystitis; half  Fourier acquisition single shot turbo SE. J Comput Assist Tomogr 1998; 22(4):638–642. 34. Ralls PW, Colletti PM, Halls JM, Siemsen JK. Prospective evaluation of 99mTc­IDA cholescintigraphy and gray scale US in the diagnosis of acute cholecystitis.  Radiology 1982; 144:369–371. 35. Krishnamurthy S, Krishnamurthy K. Quantitative assessment of hepatobiliary diseases with 99mTc­IDA scintigraphy. In: Nuclear Medicine Annual. New York:  Raven Press, 1988, pp 309–313. 36. Krishnamurthy S, Krishnamurthy K. Cholecystokinin and morphine pharmacological intervention during 99mTc­HIDA cholescintigraphy: a rational approach.  Semin Nucl Med 1996; 26(1):16–24. 37. Flancbaum L, Choban PS. Use of morphine cholescintigraphy in the diagnosis of acute cholecystitis in critically ill patients. Intens Care Med 1995; 21(2):120– 124. 38. Kim EE, Moon T­Y, Delpassand ES, Podoloff DA, Haynie TP. Nuclear hepatobiliary imaging. Radiol Clin North Am 1993; 31:923–33. 39. Zemen RK, Garra BS. Gallbladder imaging, the state of the art. Gastroenterol Clin North Am 1991; 2:127–156. 40. Laing FC. Ultrasound diagnosis of choledocholithiasis. Semin Ultrasound CT MR 1987; 8:103. 41. Dong B, Chen M. Improved sonographic visualization of choledocholithiasis. J Clin Ultrasound 1987; 15:185. 42. Barton P, Maier A, Steininger R, et al. Biliary sludge after liver transplantation: 1. Imaging findings and efficacy of various imaging procedures. AJR 1995;  164:859. 43. Ohtani T, Kawai C, Shirai Y, Kawakami, Yoshida K, Hatakeyama K. Intraoperative ultrasonography versus cholangiography during laparoscopic  cholecystectomy: a prospective comparative study. J Am Coll Surg 1997; 185(3):274–282. 44. Santambrogio R, Montorosi M, Bianchi P, et al. Common bile duct exploration and laparoscopic cholecystectomy: role of intraoperative ultrasonography. J Am  Coll Surg 1997; 185(1):40–48. 45. Baron RL, Stanley RJ, Lee JKT, Koehler RE, Melson GL, Balfe DM, Weyman PJ. A prospective comparison of the evaluation of biliary obstruction using  computed tomography and ultrasonography. Radiology 1982; 145:91–98. 46. Baron RL, Stanley RJ, Lee JKT, Koehler RE, Leavitt RG. Computed tomographic features of biliary obstruction. AJR 1983; 140:1173–1178. 47. Baron RL. Common bile duct stones: reassessment of criteria for CT diagnosis. Radiology 1987; 162:419–424. 48. Jeffrey RB Jr, Federle MP, Laing FC, Wall S, Rego J, et al. Computed tomography of choledocholithiasis. AJR 1983; 140:1179–183. 49. Mitchell SE, Clark RA. Comparison of computed tomography and sonography in choledocholithiasis. AJR 1984; 142:729–732. 50. Neitlich JD, Topazian M, Smith R, Gupta A, Burrell MI, Rosenfield AT. Detection of choledocholithiasis: comparison of unenhanced helical CT and endoscopic  retrograde cholangiopancreatography. Radiology 1997; 203:753–757. 51. Stockberger SM, Waas JL, Sherman S, Lehman GA, Kopecky KK. Intravenous cholan giography with helical CT: comparison with endoscopic retrograde  cholangiopancreatography. Radiology 1994; 192:675–680.

  

Page 435

52. Van Beers BE, Lacrosse M, Trigaux J­P, de Cannière L, De Ronde T, Pringot J. Noninvasive imaging of the biliary tree before or after laparoscopic  cholecystectomy: use of three­dimensional spiral CT cholangiography. AJR 1994; 162:1331–1335. 53. Goldberg HJ. Helical cholangiography: complementary or substitute study for endoscopic retrograde cholangiography? Radiology 1994; 192:615–616. 54. Soto JA, Velez SM, Guzman J. Choledocholithiasis: diagnosis with oral­contrast­enhanced CT cholangiography. AJR 1999; 172:943–948. 55. Macaulay SE, Schulte SJ, Sekijima JH, et al. Evaluation of a non­breath hold MR cholangiography technique. Radiology 1995; 196:227–232. 56. Guibaud L, Bret PM, Reinhold C, Atri M, Barkun AN. Diagnosis of choledocholithiasis: value of MR cholangiography. AJR 1994; 163:847–850. 57. Guibaud L, Bret PM, Reinhold C, Atri M, Barkun AN. Bile duct obstruction and choledocholithiasis: diagnosis with MR cholangiography. Radiology 1995;  197:109–115. 58. Soto JA, Barish MA, Yucel EK, Siegenberg D, Ferrucci JT, Chuttani R. Magnetic resonance cholangiography: comparison to endoscopic retrograde  cholangiopancreatography. Gastroenterology 1996; 110:589–597. 59. Reinhold C, Taourel P, Bret PM, Barkun AN, Atri M. MR cholangiography of choledocholithiasis by using a multicoil array and high­resolution imaging  parameters (abstr). Radiology 1995; 197(P):342. 60. Jeffrey RB, Federle MP, Laing FC, et al. Computed tomography of choledocholithiasis. AJR 1983; 140:1179–1183. 61. Baron RL, Stanley RJ, Lee JKT, et al. Computed tomographic features of biliary obstruction. AJR 1983; 140:1173–178. 62. Gallstones and laparoscopic cholecystectomy. NIH Consensus Statement 1992; 10(3):1–26. 63. Fink AS. Commentary: controversies in the management of common duct calculi. Surg Clin North Am 1994; 74(4):949–950. 64. Tompkins RK, Pitt HA. Surgical management of benign lesions of the common bile ducts. Curr Probl Surg 1982; 19:327­–98. 65. Cranley B, Logan H. Exploration of the common bile duct: the relevance of the clinical picture and the importance of preoperative cholangiography. Br J Surg  1980; 67:869–872. 66. Philips EH. Controversies in the management of common duct calculi. Surg Clin North Am 1994; 74(4):931–948. 67. Bilbao MK, Dotter CT, Lee TG, Katon RM. Complications of endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP). A study of 10,000 cases.  Gastroenterology 1976; 70:314–320. 68. Silvis ES, Ansel HJ. Endoscopic retrograde cholangiography: application in biliary tract disease. In: Berk JE, ed. Bockus' Gastroenterology. Philadelphia:  Saunders, 1985, pp 3569–3579. 69. Rieger R, Wayand W. Yield of prospective, noninvasive evaluation of the common bile duct combined with selective ERCP/sphincterotomy in 1930 consecutive  laparoscopic cholecystectomy patients. Gastrointest Endosc 1995; 2(1):6–12. 70. Dowsett JF, Polydorou AA, Vaira D, et al. Needle knife papillotomy: how safe and how effective? Gut 1990; 31:905­–08. 71. Hamilton I, Lintott DJ, Rothwell J, Axon ATR. Acute pancreatitis following endoscopic retrograde cholangiopancreatography. Clin Radiol 1983; 34:543–546. 72. Thoeni RF, Fel SC, Goldberg HI. CI detection of asymptomatic pancreatitis following ERCP. Gastrointest Radiol 1990; 15:291–295. 73. Soto JA, Yucel EK, Barish MA, Chuttani R, Ferrucci JT. MR Cholangiopancreatography after unsuccessful or incomplete ERCP. Radiology 1996; 199:91–98. 74. Forbes A, Cotton PB. ERCP and sphincterotomy after Billroth II gastrectomy. Gut 1984; 25:971–974.

  

Page 436

75. Osnes M, Rosseland AR, Aabakken L. Endoscopic retrograde cholangiography and endoscopic papillotomy in patients with a previous Billroth­II resection. Gut  1986; 27:1193–1198. 76. Cunningham JT. Endoscopic papillotomy and stent insertion: B­II technique and limitations. In: Barkin JS, O'Phelan CA, eds. Advanced Therapeutic Endoscopy.  New York: Raven Press, 1990, pp 193–200. 77. Pavone P, Laghi A, Catalano C, Broglia L, Messina A, Passariello R. Three­dimensional MR cholangiography: a unique diagnostic procedure for evaluation of  bile ducts in patients with biliary­enteric anastomosis. Radiology 1995; 197(P):312. 78. Outwater EK, Gordon SJ. Imaging the pancreatic and biliary ducts with MR. Radiology 1994; 192:19–21. 79. McDermott VG, Nelson RC. Re: MR cholangiopancreatography: efficacy of three­dimensional turbo spin­echo technique. AJR 1995; 165:301–302.

  

Page 437

19—  Endoscopic Ultrasound of the Gallbladder and Bile Ducts Brian R. Stotland Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts I—  Introduction Endoscopic ultrasound (EUS) is a relatively new imaging modality that provides detailed images of structures both within the wall of the luminal gastrointestinal tract  and in adjacent areas. By incorporating an ultrasonic transducer into the tip of an endoscope or through the use of probes passed through the working channel of an  endoscope, ultrasound can be performed from within the body cavity. The advantage of this approach over conventional, transcutaneous ultrasound is that a higher  frequency of ultrasound may be employed. Higher­frequency ultrasound provides greater image resolution, but with less depth of penetration. In EUS, this limitation is  circumvented by placing the transducer in close proximity to the structure of interest. Thus, by using an ultrasound frequency of between 7.5 to 20.0 MHz, structures  as small as 2 mm can be distinguished. EUS can also be performed by passing an ultrasound probe through the working channel of a standard endoscope. While there has been a virtual explosion of publications on the use of EUS in the past decade, comparatively few publications have evaluated its role in biliary tract  disease. This chapter reviews the use of this exciting modality and suggests its practical role in clinical practice. II—  Technique Most echoendoscopes have oblique viewing optics; the esophagus is intubated and the scope is advanced in a fashion similar to the passage of a duodenoscope for  endoscopic retrograde pancreatography (ERCP). Standard EUS imaging of the gallbladder and bile ducts is performed by placing the transducer into the duodenum  or gastric antrum. From within the descending duodenum, the intrapancreatic common bile duct (CBD) is identified adjacent and parallel to the pancreatic duct. At this  level, particularly if the lumen is filled with water, the ampulla itself can be identified. As the scope is withdrawn into the duodenal bulb, the bile duct can be traced to  the CBD, but in general the hilum is less well visualized and the right and left biliary ducts are difficult to identify. The cystic can be identified coming and into and then  out of view alongside the CBD and can sometimes be traced back into the gallbladder. The gallbladder can be readily identified from within the duodenal bulb or  gastric antrum (Fig. 1). The wall normally appears three­layered with a hypoechoic center corresponding to the muscularis pro­

  

Page 438

Figure 1 Endoscopic ultrasound view of the normal gallbladder, as imaged from within the duodenal bulb.

pria, bordered by hypoechoic layers on either side. The procedure is contraindicated in patients who cannot tolerate conscious sedation or who are at risk for  perforation from an endoscopy. The presence of a duodenal diverticulum may obstruct some fields of EUS imaging. In patients who have a biliary or pancreatic stent  in place, attention must be given on echoendoscope withdrawal to avoid inadvertently dislodging the stent. III—  Evaluation for Gallstones It is well established that transabdominal ultrasound (TUS) should be the first imaging modality chosen when evaluating for the presence of stones within the  gallbladder. However, TUS accuracy is less than 100% even in the best of hands (1). There is evidence that EUS may be able to detect cholelithiasis when TUS is  normal, particularly in obese patients (2). In addition, EUS may be valuable in evaluating for the presence of microlithiasis. Biliary microlithiasis has been shown to be a  cause of pancreatitis and perhaps biliary pain due to cholecystitis and is not detectable by TUS. In a study by Dill et al. (3), 66 patients with biliary­type pain and  negative TUS underwent EUS. At operation, 61 of the patients had cholecystitis documented histologically, and 58 of these had preoperative EUS evidence of stones  or sludge. When combined with stimulated biliary drainage for bile analysis, EUS had a 92% sensitivity and 100% predictive value; 90.5% of patients with  preoperative EUS findings had resolution of biliary pain. In choledocholithiasis, common bile duct (CBD) stones can be visualized with TUS in 70 to 90% of cases, depending upon where in the CBD the stone is lodged  (Fig. 2) (4–6). Overlying bowel gas or obesity may impair visualization of the distal CBD. EUS appears to be a more sensitive means of detecting choledocholithiasis  and may be comparable to endoscopic retrograde cholangiography (ERC) without the associated risk of pancreatitis (7). A

  

Page 439

Figure 2 EUS view of the distal common bile duct containing two small stones (arrowheads). (From Ref. 8.)

prospective series of 155 patients found EUS sensitivity for CBD stones to be 96%, significantly better than TUS (63%) or computed tomography (CT) (71%) (8). In  a study by Prat et al. (9) comparing EUS to ERC in the evaluation of choledocholithiasis in 119 patients, the results were EUS sensitivity 93%, specificity 97%,  positive predictive value 98%, and negative predictive value 88%. Corresponding values for ERC were 89, 100, 100, and 83%. Canto et al. (10) prospectively  compared EUS and ERC for the diagnosis of choledocholithiasis in 64 patients. EUS had a 94% accuracy, compared with 97% for ERC. In this study, TUS and CT  had only a 77% accuracy. Overall, complications were significantly less frequently related to EUS (1.6%) compared with ERC (12.5%). In this study, a strategy of  performing ERC only if the EUS exam detected stones would cost $754 per patient, compared with $1109 per patient if ERC were performed as the initial  evaluation. In a large retrospective study by Palazzo et al. (11), EUS had a sensitivity of 94.9%, a specificity of 97.8%, and an accuracy of 95.9%. All stones  detected by ERC had been detected by EUS. These studies suggest that in experienced centers, EUS may be the only precholecystectomy procedure necessary in  patients with a low to medium risk of choledocholithiasis, thus avoiding the risk of ERC. However, in patients with CBD stones detected by TUS or CT, EUS is  unnecessary. Such patients are usually best managed with ERC. Magnetic resonance cholangiography (MRC) is emerging in parallel to EUS as a noninvasive means  for detecting CBD stones. Its accuracy ranges from 89 to 94% (12,13). A prospective study comparing EUS to MRC in 32 patients reported accuracies of 96.9%  for EUS and 81.2% for MRC (not statistically different) (14). Larger prospective studies are needed. An alternative approach to EUS evaluation for choledocholithiasis was reported by Wiersema et al. (15). They reported successful EUS­guided needle puncture of  the distal CBD and contrast ductography in 8 of 11 patients. While EUS­guided pancreatography has also been

  

Page 440

reported, these techniques are considered purely experimental. However, because the procedure would not be expected to induce pancreatitis as a complication, it  offers a theoretical advantage over ERC. IV—  Neoplastic Lesions of the Biliary Tree Gallbladder carcinoma and cholangiocarcinoma are rare lesions and are generally associated with a poor prognosis—though, as with other gastrointestinal  malignancies, survival depends upon stage (Tables 1 to 3). They are frequently difficult to image with TUS or CT. On EUS, gallbladder carcinoma appears as a  hypoechoic mass that obliterates the normal wall­layer pattern. However, gallbladder stones may prevent proper tumor staging in many cases. In addition, in may be  difficult to distinguish adenomyomatosis from carcinoma. Mitake et al. (16) reported an accuracy of 77% for T stage and 90% for N stage, but only when gallstones  did not obstruct visualization of the lesion. Mizuguchi et al. (17) reported—in a study evaluating 25 patients with various gallbladder lesions (seven cancers)—that  EUS was superior to magnetic resonance imaging (MRI), CT, and TUS for preoperative cancer diagnosis. Carcinoma of the bile duct appears as a hypoechoic mass that may extend along the duct, obstruct the lumen, or invade surrounding structures. These lesions are  sometimes surrounded by fibrotic tissue, which appears hyperechoic on EUS. Tio et al. (18), in a study of 76 patients, reported an 83% T­stage accuracy for CBD  tumors and an 85% accuracy for Klatskin and common hepatic duct tumors. However, most other authors report difficulty in visualizing the proximal biliary tree with  EUS. The development of endosonographic probes capable of cannulating the CBD may improve staging ability. These transducers operate at high frequencies (20– 30 MHz), allowing for an axial resolution of 0.03 mm, but with a limited depth of penetration. Theoretically, these probes will improve staging accuracy of proximal  biliary lesions by introducing the probe into the malignant stricture. Using an intraductal probe, Yasuda et al. (19) reported a T­staging accuracy of 83%, compared  with 75% for EUS in 18 lesions. Percutaneous intraductal biliary ultrasound staging of cholangiocarcinoma has also been described (20). However, experience with  intraductal sonography is limited, and the clinical utility is not yet proven. In addition, it is not anticipated that it will allow the differentiation of an early­ Table 1 Gallbladder TNM Staging Tx

Primary tumor cannot be assessed

T0

No evidence of primary tumor

Tis

Carcinoma in situ

T1

Tumor invades lamina propria

T2

Tumor invades perimuscular connective tissue

T3

Tumor perforates the serosa or directly invades an adjacent organ

T4

Tumor extends more than 2 cm into liver or into 2 or more adjacent  organs

NX

Regional lymph nodes cannot be assessed

N0

No regional lymph node metastasis

N1

Metastasis in cystic duct, pericholedochal or hilar nodes

N2

Metastasis in peripancreatic, periduodenal, periportal, celiac or superior  mesenteric lymph nodes

Mx

Distant metastasis cannot be assessed

M0

No distant metastasis

M1

Distant metastasis

Source: Adapted from Ref. 32.

  

Page 441 Table 2 Extrahepatic Duct TNM Staging Tx

Primary tumor cannot be assessed

T0

No evidence of primary tumor

Tis

Carcinoma in situ

T1

Tumor invades subepithelial connective tissue or fibromuscular layer

T2

Tumor invades perifibromuscular connective tissue

T3

Tumor invades adjacent structures: liver, pancreas, duodenum, gallbladder,  colon, stomach

NX

Regional lymph nodes cannot be assessed

N0

No regional lymph node metastasis

N1

Metastasis in cystic duct, pericholedochal or hilar nodes

N2

Metastasis in peripancreatic, periduodenal, periportal, celiac, superior mesenteric  or posterior pancreaticoduodenal lymph nodes

Mx

Distant metastasis cannot be assessed

M0

No distant metastasis

M1

Distant metastasis

Source: Adapted from Ref. 32.

stage cholangiocarcinoma from a benign stricture. Publication of large series demonstrating efficacy on these uncommon conditions will require multicenter studies. Due to the development of obstructive jaundice, ampullary carcinoma often presents early in its course, resulting in a relatively good prognosis. With EUS, the mass  appears as hyperechoic; it may invade into the duodenal wall, pancreatic parenchyma, or adjacent structures. T1 lesions cannot be differentiated from an ampullary  adenoma (Fig. 3). EUS T­stage accuracy ranges from 80 to 90% (21,22). Staging accuracy is in general lower for T1 and T4 lesions. N­staging accuracy tends to be  lower (55 to 70%). However, it is anticipated that when clinically relevant, EUS­guided fine­needle­aspiration techniques will improve N staging. In a retrospective  series, Quirk et al. (23) reported both a sensitivity and specificity of 83% for distinguishing local disease (T2N0, or less) from advanced disease. Because patients with  local disease could be treated with a local surgical resection rather than a Whipple resection, there Table 3 Ampulla of Vater TNM Staging Tx

Primary tumor cannot be assessed

T0

No evidence of primary tumor

Tis

Carcinoma in situ

T1

Tumor limited to the ampulla of Vater or sphincter of Oddi

T2

Tumor invades duodenal wall

T3

Tumor invades 2 cm or less into the pancreas

T4

Tumor invades more than 2 cm into pancreas and/or adjacent organs

NX

Regional lymph nodes cannot be assessed

N0

No regional lymph node metastasis

N1

Regional lymph node metastasis

Mx

Distant metastasis cannot be assessed

M0

No distant metastasis

M1

Distant metastasis

Source: Adapted from Ref. 32.

  

Page 442

Figure 3 A 3­cm ampullary adenoma imaged by EUS. The lesion does not  appear to invade the muscularis propria (MP); this was confirmed by surgical resection.

was a significant cost savings. However, not all studies have demonstrated EUS reliability. Cahen et al. (24) reported only a 44% accuracy for depth of invasion in 23  patients. Menzel et al. (25) found that the accuracy (88.9%) of intraductal ultrasound staging was superior to conventional EUS for ampullary tumors and also  reported a low EUS accuracy (56.3%). A recent study demonstrated that EUS was more accurate than either CT or MRI, and also indicated that the presence of a  transpapillary endobiliary stent reduced EUS T­stage accuracy (from 84 to 72%) (26). Since many patients with ampullary tumors are treated initially with biliary  stents if they are jaundiced, the results suggest that EUS staging should be performed first. Discrepancies reported between studies on the accuracy of ampullary  staging might be due to differences in technique, operator experience, or sample size. It is worth noting that endoscopic pinch biopsies from ampullary lesions are  known to be subject to significant sampling error, such that pathological evidence of adenoma does not rule out the presence of invasive carcinoma. Therefore, EUS is  suggested prior to endoscopic or local surgical excision to rule out the presence of invasive disease that would require a more aggressive approach. In the past several years, multiple studies have demonstrated that the technique of EUS­guided real­time fine­needle aspiration (FNA) is a reliable, accurate, and safe  procedure. It allows tissue sampling of small lesions that are often undetectable or unreachable by other radiographic means. The sensitivity of this technique ranges  from 89 to 100% in experienced hands (27). It is particularly useful for obtaining tissue from the retroperitoneum. N­staging accuracy is generally lower using EUS, in  part due to the relative inability to distinguish benign inflammatory nodes from malignant adenopathy. Although there is limited experience specifically pertaining to the  biliary tract, experience in other organs suggests that EUS­guided FNA should improve N staging, resulting in greater overall staging accuracy.

  

Page 443

V—  Other Benign Conditions EUS may be helpful to evaluate other abnormalities of the biliary tree. Cholecystitis appears as nonspecific gallbladder wall thickening. Mitake et al. (28) demonstrated  that EUS visualization of the CBD and pancreatic ducts can detect anomalous connections between the biliary and pancreatic ducts, which may predispose patients to  cholangitis and cholangiocarcinoma. Tanno et al. (29) reported that a thickened inner hypoechoic layer of the gallbladder indicated the presence of an anomalous  pancreaticobiliary ductal communication. However, this finding is not specific. Anecdotal reports have indicated that EUS may be able to diagnose gallbladder  adhesions (30) and choledochal cysts (31). VI—  Conclusion EUS is emerging as a useful imaging modality in the management of biliary tract disease. Given its reliability in diagnosing choledocholithiasis, EUS may the best test  when there is an intermediate probability of CBD stones. Larger studies prospectively comparing MRC to EUS are needed to define the roles of these modalities in  this setting. Patients with clinically obvious CBD stones are best managed by ERC. Given the ability of EUS to also diagnose neoplasms of the bile duct, ampulla,  gallbladder, and pancreas, it is ideally suited to diagnose and stage obstructive jaundice. Refinement of intraductal ultrasound techniques and use of EUS­guided FNA  for suspicious adenopathy should enhance staging accuracy. References 1. Peikin S, Feld R, Kastenberg D, et al. Role of endosonography in the diagnosis of gallstone disease in obese patients (abstr). Gastroenterology 1992; 104:A328. 2. Dill J, Callis J, Hill S, Evans P. Combined endoscopic ultrasound and endoscopic Meltzer­Lyon testing in the diagnosis of cholelithiasis. Am J Gastroenterol 1994;  89(6):956–957. 3. Dill JE, Hill S, Callis J, Berkhouse L, Evans P, Martin D, Palmer ST. Combined endoscopic ultrasound and stimulated biliary drainage in cholecystitis and  microlithiasis—diagnosis and outcomes. Endoscopy 1995; 27:424–427. 4. Laing FC, Jeffrey RB, Wing VW. Improved visualization of choledocholithiasis by sonography. Am J Radiol 1982; 143:949–952. 5. Laing FC. Ultrasound diagnosis of choledocholithiasis. Semin Ultrasound CT MR. 1987; 8:103–113. 6. Cronan JJ. US diagnosis of choledocholithiasis: a reappraisal. Radiology 1986; 161:133–134. 7. Amouyal PG, Amouyal P, Levy P, et al. Diagnosis of choledocholithiasis by ultrasonography. Gastroenterology 1994; 106:1062–1067. 8. Sugiyama M, Atomi Y. Endoscopic ultrasonography for diagnosing choledocholithiasis: a prospective comparative study with ultrasonography and computed  tomography. Gastrointest Endosc 1997; 45:143–146. 9. Prat F, Amoural PG, Amouyal P, et al. Prospective controlled study of endoscopic ultrasonography and endoscopic retrograde cholangiography in patients with  suspected common­bile duct lithiasis. Lancet 1996; 347:75–79. 10. Canto MI, Chak A, Stellato T, Sivak MV. Endoscopic ultrasonography versus cholangiography for the diagnosis of choledocholithiasis. Gastrointest Endosc  1998; 47:439–448. 11. Palazzo L, Girollet P­P, Salmeron M, Silvain C, Roseau G, Canard J­M, Chaussade S, Coutieer D, Paolaggi J­A. Value of endoscopic ultrasonography in the  diagnosis of com­

  

Page 444

mon bile duct stones: comparison with surgical exploration and ERCP. Gastrointest Endosc 1995; 42:225–231. 12. Soto JA, Barish MA, Yucel EK, Siegenberg D, Ferrucci JT, Chuttani R. Magnetic resonance cholangiography: comparison with endoscopic retrograde  cholangiography. Gastroenterology 1996; 110:589–597. 13. Chan YL, Chan ACW, Lam WWM, Lee DWH, Chung SSC, Sung JJY, et al. Choledocholithiasis: comparison or MR cholangiography and endoscopic  retrograde cholangiography. Radiology 1996; 200:85–89. 14. de Ledinghen V, Lecesne R, Raymond J­M, Gense V, Amouretti M, Drouillard J, Couzigou P, Silvain C. Diagnosis of choledocholithiasis: EUS or magnetic  resonance cholangiography? A prospective controlled study. Gastrointest Endosc 1999; 49:26–31. 15. Wiersema MJ, Sandusky D, Carr R, Wiersema LM, Erdel WC, Frederick PK. Endosonography­guided cholangiopancreatography. Gastrointest Endosc 1996;  43:102–106. 16. Mitake M, Nakazawa Y, Naitoh et al. Endoscopic ultrasonography in diagnosis of the extent of gallbladder carcinoma. Gastrointest Endosc 1990; 36:562–566. 17. Mizuguchi M, Kudo S, Fukahori T, Matsuo Y, Miyazaki K, Tokunaga O, Koyama T, Fujimoto K. Endoscopic ultrasonography for demonstrating loss of  multiple­layer pattern of the thickened gallbladder wall in the preoperative diagnosis of gallbladder cancer. Eur Radiol 1997; 7:1323–1327. 18. Tio TLJ, Cheng OB, Wijers et al. Endosonographic TNM staging of extrahepatic bile duct cancer: comparison with pathological staging. Gastroenterology 1991;  100:1351–1361. 19. Yasuda K, Mukai H, Nakajima M, Kawai K. Clinical application of ultrasonic probes in the biliary and pancreatic duct. Endoscopy 1992; 24(suppl 1):370–375. 20. Duda SH, Huppert PE, Schott U, Brambs HJ, Claussen CD. Percutaneous transhepatic intraductal biliary sonography for lymph node staging at 12.5 MHz in  malignant bile duct obstruction: work in progress. Cardiovasc Intervent Radiol 1997; 20:133–138. 21. Dancygier H, Lightdale CJ, Stevens PD. Endoscopic ultrasonography of the upper gastrointestinal tract and colon. In: Dancygier H, Lightdale CJ.  Endosonography in Gastroenterology. Stuttgart, Germany: Thieme, 199:13–174. 22. Tio TL, Sie LH, Kallimanis G, Luiken GJHM, Kimmings AN, Huibregtse K, Tytgat GNJ. Staging of ampullary and pancreatic carcinoma: comparison between  endosonography and surgery. Gastrointest Endosc 1996; 44:706–713. 23. Quirk DM, Rattner DW, Fernandez­del Castillo C, Warshaw AL, Brugge WR. The use of endoscopic ultrasonography to reduce the cost of treating ampullary  tumors. Gastrointest Endosc 1997; 46:334–337. 24. Cahen DL, Fockens P, DeWit LTH, Offerhaus GJA, Obertop H, Gouma DJ. Local resection or pancreaticoduodenectomy for villous adenoma of the ampulla of  Vater diagnosed before operation. Br J Surg 1997; 84:948–951. 25. Menzel J, Hoepffner N, Sulkowski U, Reimer P, Heinecke A, Poremba C, Domschke W. Polypoid tumors of the major duodenal papilla: preoperative staging  with intraductal US, EUS, and CT—a prospective, histopathologically controlled study. Gastrointest Endosc 1999; 49:349–357. 26. Cannon ME, Carpenter SL, Elta GH, Nostrant TT, Kochman ML, Ginsberg GG, Stotland BR, Rosato EF, Morris JB, Eckhauser F, Scheiman JM. EUS  compared with CT, magnetic resonance imaging, and angiography and, the influence of biliary stenting on staging accuracy of ampullary neoplasms. Gastrointest  Endosc 1999; 50:27–33. 27. Stotland BR, Kochman ML. Diagnostic and therapeutic endoscopic ultrasonography: endoscopic ultrasound­guided fine­needle aspiration in clinical practice.  Gastrointest Endosc 1997; 45:329–331. 28. Mitake M, Nakazawa S, Naitoh Y et al. Endoscopic ultrasonography in the detection of anomalous connections of the pancreatobiliary duct. Endoscopy 1991;  23:117–120. 29. Tanno S, Obara T, Maguchi H, Mizukami Y, Shudo R, Fujii T, Takahashi K, Nishino N, Arisato S, Saitoh Y, Ura H, Kohgo Y. Thickened inner hypoechoic  layer of the gallbladder

  

Page 445

wall in the diagnosis of anomalous pancreaticobiliary ductal union with endosonography. Gastrointest Endosc 1997; 46:520–526. 30. Dill JE, Henretta TR, Berkhouse L. Endoscopic ultrasound in the diagnosis of gallbladder adhesions. Am J Gastroenterol 1995; 90:855–856. 31. Avunduk C, Weiss R, Hampf F, Navab F. Obstructing choledochocele: diagnosis by endoscopic ultrasound. Abdom Imaging 1995; 20:72–74. 32. AJCC. AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia: Lippincott Raven, 1997.

  

Page 447

20—  The Silent Gallstone William R. Brugge Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts I—  Introduction The vast majority of patients with gallstones have no symptoms. In the past, the management of these patients has been controversial because little was known about  the natural history, risk factors for development of symptoms, and how disease states modify the risks. Recently, a large number of studies have focused on these  questions. Only with a complete understanding of the natural history of gallstones can we determine whether a therapy can modify the development of symptoms and  complications. These questions are increasingly important as a large number of low­risk treatments become available. II—  Diagnosis The diagnosis of gallstones is usually made with abdominal ultrasonography, and this approach is ideal for identifying patients with asymptomatic gallstones. Large  populations can be screened with ultrasonography and the prevalence of stones in a population can be determined. In addition, the ultrasound exams can be repeated  over time and the true incidence of stones, including asymptomatic stones, can also be determined (Table 1). Although it may be difficult to correlate the presence of  symptoms and the finding of stones in a large population, these type of studies are critical for investigating the factors responsible for the development of gallstone  symptoms. III—  Prevalence The prevalence of asymptomatic gallstones can be examined with necropsies or with screening ultrasonography. Necropsy studies for asymptomatic gallstones are  subject to bias and have largely been replaced with ultrasonography studies. Although the presence of gallstones is relatively easy to establish, determining the  presence or absence of biliary symptoms in a large population is difficult. In large Italian studies of gallstone patients, biliary colic has been defined as pain located in  the epigastrium or right upper quadrant lasting more than 30 min (1). Using this definition, approximately 85% of screened volunteers in Italy have no biliary symptoms  and the prevalence of silent stones in a combined cohort of 29,739 people from several villages was 6.5% (men) and 10.5% (women) (2).

  

Page 448 Table 1 Prevalence and Incidence of Gallstones in Large Populations

Population studied

Number of  subjects

Author/Ref.

British

1,896 Heaton (17)

2/11.5

Hispanics in the  United States

2,299 Maurer (6)

7.2/23.2 (Mexican Americans)

Italians

1,962 Misciagria (8)

Obese Romanians Italian villages Italians Cirrhotics Indigent Mexicans Chronic renal failure

157

Acalovschi (9)

29,739 Attili (2) 4,751 Attili (7)

Annual  incidence (%)

Prevalence (%) male/females

 

 

9.7

 

 

17

31

 

23/28

 

23.3 14.1

 

12.9

 

93

—

2.6 6.5/10.5

3,505 Gonzalez (3) Korzets (5)

  —

Del Olmo (4)

313

Symptoms (%)

  3.4

    8

The prevalence of asymptomatic stones in other populations have been examined, but without the attention to the symptomatic state of the subjects with gallstones. In  3505 low­income subjects screened in Mexico City, 5.8% of men and 19.7% of women had gallstones (3). The prevalence of stones in select high­risk groups has  also been studied using ultrasound. In Spain, the prevalence of asymptomatic stones in patients with cirrhosis was found to be 23.3%, compared to a prevalence in the  general population of 16.8% (4). Chronic renal failure patients have also been examined and were found to have a lower prevalence—12.9%—not significantly  greater than that in the general population (5). In the United States, specific ethnic groups have a higher prevalence. The Pima Indians are the best studied and have an impressive prevalence of 70% by the age of  25. More recently, Hispanics have been studied with screening ultrasonography (6). Mexican Americans were found to have the highest prevalence, ranging from  7.2% in men to 23.2% in women to 44% in older women. The prevalence in Mexican Americans was 1.7 and 1.8 times greater than in Cuban Americans and Puerto  Ricans. The risk factors for the development of silent stones are probably similar to the risk factors for stones in general. In men, the significant risk factors are age and  diabetes. In women, age, obesity, and parity are significant risk factors. However, the use of these risk factors and others (family history, use of oral contraceptives)  underestimates the risk of gallstones by two­to threefold (7). IV—  Incidence The ability to repeat ultrasound studies over time in a cohort population made it possible to determine the yearly incidence of gallstone development. In a small town in  southern Italy, nearly 2000 people have been followed annually by ultrasonography (8). The annual incidence of stone formation was found to be 9.7 per 1000, and  several risk factors were identified, including age, body mass index, weight change, diabetes, use of laxatives, smoking, consumption of oil and fat, and parity.  Recently, this type of study has been performed in obese subjects followed annually with ultrasonography (9). The annual incidence was found to be 26 per 1000 and  very few of the subjects had symptoms (9). Disease states can also be studied; in cirrhotics, the annual incidence was found to be 34 per 1000 (4). No long­term  incidence study has been performed to examine the change in incidence over time, but preliminary studies from Europe suggest that there may be a recent decline (10).  Similar trends may be appearing in the United

  

Page 449

States. Although cholecystectomy rates in the United States are increasing for the elderly, the rates are decreasing for the young (11). V—  Symptoms The symptoms that arise in association with gallstones are often nonspecific. Nausea, bloating, and irregular bowl movements are the least specific. Colic or transient  upper abdominal pain after eating is the most predictive of gallstones. The presence of gallstones may be associated with no symptoms, unrelated symptoms, or biliary colic. Jorgensen has reported on the correlation between symptoms  and the presence of stones (12). He found that subjects with incidental stones had symptoms that were indistinguishable from those of the population as a whole.  Furthermore, there was no correlation between the size, number, and motility of stones and the presence of symptoms. However, Diehl et al. have noted that  pancreatitis may occur more frequently in the presence of stones with diameters of <5 mm, when there are more than 20 stones present in gallbladder, and when the  stones have a mulberry shape (13). Biliary colic­type pain is more predictive for the presence of gallstones than nausea, flatulence, fat intolerance, and a large number  of other symptoms (14). Diehl and coworkers have found that specific features of abdominal pain were more suggestive of gallstones, such as pain with radiation into  the back lasting more than 3 h (15). However, the symptom response to cholecystectomy suggests that perhaps more than biliary­type pain improved with  cholecystectomy. Gui et al. found that bloating, dyspepsia, heartburn, fat intolerance, nausea, and vomiting improved after cholecystectomy (16). Others, using a large  metanalysis, have disputed that gallstones may be associated with vague symptoms (14). The factors that determine whether gallstones cause symptoms have not been well described. However, several epidemiological observations have been made,  including the possibility that there are two discrete subpopulations, one with symptoms and one comprising those who will never develop symptoms (17). Biliary­type  pain as a symptom of gallstones occurs more frequently in women than in men, whether the pain is mild or severe (7). This has been confirmed by Heaton and may  explain the higher cholecystectomy rates in women (17). There is also evidence that obesity and lack of exercise are independent risk factors for the development of  symptoms related to gallstones (9,18). It has been speculated that in 34% of cases, the development of symptoms related to gallstones could be prevented by a daily  30­min period of endurance­type training. The mechanism of this effect is unknown, but exercise may decrease the lithogenicity of bile or alter the motility of the  gallbladder. VI—  Natural History An understanding of the natural history of asymptomatic gallstones is critical when treatment for gallstones is recommended. The prophylactic treatment of gallstones  can be advocated only if the treatment can reduce the risk of symptoms, complications (cholecystitis or obstruction), and additional costs. Unfortunately, it is very  difficult to perform the necessary natural history studies, since they involve large numbers of healthy subjects who must be observed over many years. Previous observational studies of gallstone patients were retrospective and subject to bias. Ralston and Smith reported an annual incidence rate of 29% for the  development of biliary pain and complications in gallstone patients followed for 15 to 30 years (19). McSherry and coworkers also performed a retrospective chart  review in HMO patients with gallstones and found that the complication rate was considerably lower—7% over 5 years (20). Gracie and Ransohoff performed the first prospective observation study of asymptomatic gallstones by studying faculty members at the University of Michigan (21)  (Table 2). The rate

  

Page 450 Table 2 Rate of Symptom Development in Subjects with Gallstones

Author/Ref. Gracie (21)

123

McSherry (20)

135

 

Percent with  symptoms at 2  years

Number of  subjects

 

  —

 

Percent with  symptoms at 5  years

Percent with  symptoms at  10 years

Percent with  complications at 5  years

10

15

<2

10

—

 

 

7

 

1,911

Thistle (24)

193

31

—

—

17 at 2 years

Attili (23)

151

11.9

16.5 @ 4 years

25.8

3 at 10 years

32

25 @ 3.5 years

—

—

1/8

123

—

18

30

5

Friedman (25)

16

 

Barbara (22)

Zubler (27)

17

(cholecystectomy)

of symptom development was markedly lower than that in previous studies, only 1 to 2% each year, and the complication rate was less than 2%. Overall, only 20% of  the patients developed symptoms over approximately 20 years. However, the population studied was unique and comprised Caucasian professional men with ready  access to medical care. Larger studies of gallstone subjects in a diverse population have been performed in Italy. The Sirmione study was the first of many investigations in Italy that  determined the prevalence rate of gallstones and, with follow­up, the rate of symptom development (22). In the village of Sirmione, 22% of 132 subjects found to  have gallstones during a screening exam had biliary symptoms. When the remaining asymptomatic subjects were followed for 10 years, 16% developed biliary  symptoms. The development of symptoms leveled off after 5 years, so that the percentage of the population with symptoms remained approximately the same over 10  years. Similar studies have also been performed by GREPCO (Rome Group for Epidemiology and Prevalence of Cholelithiasis) (23). They followed 118  asymptomatic subjects with gallstones and determined the rate of biliary colic, complications, cholecystectomy, and death at 2­year intervals. They found the rate of  development of biliary symptoms to be greater than previous studies. There was a nearly constant annual incidence rate of 2 to 3%, and this resulted in 30% of the  population having symptoms at 30 years, with a 3% complication rate at 10 years. Although it is difficult to investigate and follow asymptomatic gallstone subjects in the United States, three studies have attempted to determine the rate of symptom  development. The original study was based on an observation by Thistle in the National Cooperative Gallstone Study (NCGS) (24). By following gallstone patients  (divided into two groups: asymptomatic and symptomatic patients) for 24 months, the frequency of biliary symptoms could be compared. The symptomatic patients  had a high rate of symptoms—68% at 2 years—and the asymptomatic patients had a markedly lower rate—31% at 2 years. The rate of symptom development in the  NCGS was higher than in most other investigations, probably because it was more than an observational study. Unfortunately, there was no long­term follow­up.  However, Friedman et al., using a retrospective study of HMO gallstone patients in the United States found that the rate of symptom development was similar: 18% at  5 years and 30% at 10 years, with an annual complication rate of 1% (25). Women were more likely to become symptomatic than men and obese subjects were  more likely to have a complication. Diabetics did not seem to have a significantly different natural history in terms of symptoms or complications (26). Last, Zubler and  colleagues, using a retrospective study, examined the symptom and complication rate of gallstone patients in the rural United States (27). Thirty­two patients were  followed at 5­year intervals and 25% developed symptoms at an average interval of 3.5 years. The progression of symptom development from asymptomatic to nonspecific symptoms to biliary colic usually occurs in a stepwise progression prior to a complication  such as acute

  

Page 451

cholecystitis. It is rare for acute cholecystitis to develop without antecedent symptoms. The stepwise progression of symptoms allows physicians to prevent  complications of gallstones by performing cholecystectomy in symptomatic patients. VII—  Treatment The treatment approach to patients with asymptomatic gallstones has not been well studied. Clearly, there is little role for routine prophylactic cholecystectomy in all  patients, since this would be prohibitively expensive and would not improve survival. However, there might be high­risk groups that could potentially benefit. The  classic example is the sickle cell anemia patient with recurrent abdominal pain and gallstones. Since it is difficult to differentiate between sickle cell crisis and acute  cholecystitis, some advocate prophylactic cholecystectomy for patients with sickle cell anemia (28). Another high­risk group are American Indians, who have not only  a high incidence of gallstones but also an increased risk of death from gallstones and gastrointestinal malignancies (29). A prophylactic cholecystectomy at an early age  might prevent the complications of gallstone disease and gallbladder cancer, but this has not been documented. Last, Graham has suggested that transplant patients— who are at greater risk of infections, malignancies, and drug­induced hepatobiliary diseases—should be considered for early cholecystectomy (30). Obviously, the  approach can be individualized for specific conditions. Higher­risk patients—for example, an obese patient with other medical problems who has poor access to  health care facilities—might be considered for prophylactic treatment (Table 3). Since it is difficult to perform large­scale studies of various treatments such as prophylactic cholecystectomy or stone dissolution in asymptomatic patients, the other  approach is to perform decision analysis (31). Ransohoff has examined the life expectancy of gallstone patients with various interventions at various ages. For example,  if a prophylactic cholecystectomy were performed on a 50­year­old woman, her life expectancy would be reduced by an average of 12 days. In no scenario was  there an improvement in the life expectancy when a prophylactic cholecystectomy was used. An incidental cholecystectomy is another approach to the treatment of asymptomatic patients with gallstones. Incidental cholecystectomy is performed during  abdominal surgery for another indication. Although good trials are not available, a morbidly obese patient undergoing a laparotomy for gastric stapling should probably  have a cholecystectomy. Similarly, an incidental cholecystectomy has been advocated in patients with porcelain gallbladders or large stones because of the increased  risk of gallbladder cancer (32). Incidental cholecystectomies can also be considered for patients that are increased risk for the development of gallstones, as in patients  with chronic hemolysis (33). Some have suggested that an incidental cholecystectomy should be performed for patients free of gallstones who undergo laparotomy for  another indication, but the postoperative complication rate may be slightly increased (34). Table 3 Possible Indications for  Prophylactic or Incidental  Cholecystectomy Sickle cell anemia American Indians Transplant patients Morbid obesity

  

Page 452

References 1. Capocaccia L and the GREPCO. Clinical symptoms and gallstone disease: lessons from a population study. In: Capocaccia L, Ricci G, Angelico F, Angelico M,  Attili AF, eds. Epidemiology and Prevention of Gallstone Disease. Lancaster, UK: MTP Press, 1984, pp 153–157. 2. Attili AF, Carulli N, Roda E, Barbara B, Capocaccia L, Menotti A, Okoliksanyi L, Ricci G, Capocaccia R, Festi D, et al. Epidemiology of gallstone disease in  Italy: prevalence data of the Multicenter Italian study on cholelithiasis. Am J Epidemiol 141:158–165, 1995. 3. Gonzalez Villalpando C, Rivera Martinez D, Arredondo Perez B, Martinez Diaz S, Gonzalez Villalpando ME, Haffner SM, Stern MP. High prevalence of  cholelithiasis in a low income Mexican population: an ultrasonographic survey. Arch Med Res 28:543–547, 1997. 4. Del Olmo JA, Garcia F, Serra M, Maldonado L, Rodrigo JM. Prevalence and incidence of gallstones in liver cirrhosis. Scand J Gastroenterol 32:1061–1065,  1997. 5. Korzets Z, Golan E, Ben­Chitrit S, Schneider N, Chagnac A, Carel R, Bernheim J. Prevalence of cholelithiasis in non­diabetic hemodialysis and continuous  ambulatory peritoneal dialysis patients. Nephrology 78:44–47, 1998. 6. Maurer KR, Everhart JE, Ezzati TM, Johannes RS, Knowler WC, Larson DL, Sanders R, Shawker TH, Roth HP. Prevalence of gallstone disease in Hispanic  populations in the United States. Gastroenterology 96:487–492, 1989. 7. Attili AF, Pazzi P, Galeazzi R. Prevalence of previously undiagnosed gallstones in a population with multiple risk factors. Dig Dis Sci 40:1770–1774, 1995. 8. Misciagna G, Leoci C, Guerra V, Chiloiro M, Elba S, Petruzzi J, Mossa A, Noviello MR, Coviello A, Minutolo MC, Mangini V, Messa C, Cavallini A,  DeMichele G, Giorgio I. Epidemiology of cholelithiasis in southern Italy: Part II. risk factors. Eur J Gastroenterol Hepatol 8:585–593, 1996. 9. Acalovschi MV, Blendea D, Pascu M, Georoceanu A, Badea RI, Prelipceanu M. Risk of asymptomatic and symptomatic gallstones in moderately obese women: a  longtidunal follow­up study. Am J Gastroenterol 92:127–131, 1997. 10. Norrby S, Fagerberg G, Sjodahl R. Decreasing incidence of gallstone disease in a defined Swedish population. Scand J Gastroenterol 21:158–162, 1986. 11. Diehl AK. Trends in cholecystectomy rates in the United States. Lancet 2:683, 1987. 12. Jorgensen T. Abdominal symptoms and gallstone disease: an epidemiological investigation. Hepatology 9:856–860, 1989. 13. Diehl AK, Holleman DR Jr, Chapman JB, Schwesinger WH, Kurtin WE. Gallstone Size and risk of pancreatitis. Arch Intern Med 157:1674–1678, 1997. 14. Kraagg N, Thijs C, Knipschild P. Dyspepsia—how noisy are gallstones? A meta­analysis of epidemiologic studies of biliary pain, dyspeptic symptoms, and food  intolerance. Scand J Gastroenterol 30:411–421, 1995. 15. Diehl AK, Sugarek NJ, Todd KH. Clinical evaluation for gallstone disease: usefulness of symptoms and signs in diagnosis. Am J Med 89:29–33, 1990. 16. Gui GP, Cheruvu CV, West N, Sivaniah K, Fiennes AG. Is cholecystectomy effective treatment for symptomatic gallstones? Clinical outcome after long­term  follow­up. Ann R Coll Surg Engl 80:25–32, 1998. 17. Heaton KW, Braddon FE, Mountford RA, Hughes AO, Emmett PM. Symptomatic and silent gallstones in the community. Gut 32:316–320, 1991. 18. Lietzmann MF, Giovannucci EL, Rimm EB, Stampfer MJ, Spiegelman D, Wing AL, Willett WC. The relation of physical activity to risk for symptomatic gallstone  disease in men. Ann Intern Med 128:417–425, 1998. 19. Ralston DE, Smith LA. The natural history of cholelithiasis: a 15 to 30­year follow­up of 116 patients. Minn Med 48:327–332, 1965.

  

Page 453

20. McSherry CK, Ferstenberg H, Calhoun WF, Lahman E, Virshup M. The natural history of diagnosed gallstone disease in symptomatic and asymptomatic  patients. Ann Surg 202: 59–63, 1987. 21. Gracie WA, Ransohoff DF. The natural history of gallstones: the innocent gallstone is not a myth. N Engl J Med 307:798–800, 1982. 22. Barbara L, Sama C, Morselli Labate AM, et al. A population study on the prevalence of gallstone disease: the Sirmione Study. Hepatol 7:913–917, 1987. 23. Attili AF, De Santis A, Repice AM, Maselli S, GREPCO Group. The natural history of gallstones: the GREPCO experience. Hepatology 21:656–660, 1995. 24. Thistle JL, Cleary PA, Lachin JM, Tyor MP, Hersh T, the steering committee of the National Cooperative Gallstone Study Group. The natural history of  cholelithiasis: the national cooperative gallstone study. Ann Intern Med 101:171–175, 1984. 25. Friedman GD, Raviola CA, Fireman B. Prognosis of gallstones with mild or no symptoms: 25 years of follow­up in a health maintenance organization. J Clin  Epidemiol 42: 127–136, 1989. 26. Del Favero G, Caroli A, Meggiato T, Volpi A, Scalone P, Puglisi A, DiMario F. Natural history of gallstones in non­insulin­dependent diabetes mellitus. A  prospective 5­year follow­up. Dig Dis Sci 39:1704–1707, 1994. 27. Zubler J, Markowski G, Yale S, Graham R, Rosenthal TC. Natural history of asymptomatic gallstones in family practice office practices. Arch Fam Med 7:230– 233, 1998. 28. Ware RE, Kinney TR, Casey JR, Pappas TN, Meyers WC. Laparoscopic cholecystectomy in young patients with sickle hemoglobinopathies. J Pediatr 120:58– 61, 1992. 29. Grimaldi CH, Nelson RG, Pettitt PH, Knowler WC. Increased mortality with gallstone disease: results of a 20­year population­based survey in Pima Indians. Ann  Intern Med 118:185–190, 1993. 30. Graham SM, Flower JL, Schweitzer E, Bartlett ST, Imbembo Al. The utility of prophylactic cholecystectomy in transplant candidates. Am J Surg 169:44–48,  1995. 31. Ransohoff DF, Gracie WA, Wolfensen LB, Neuhauser D. Prophylactic cholecystectomy or expectant management for silent gallstones. Ann Intern Med 99:199– 204, 1983. 32. Diehl AK. Gallstone size and the risk of gallbladder cancer. JAMA 250:2323–2326, 1983. 33. Bragg LE, Thompson JS. Concomitant cholecystectomy for asymptomatic cholelithiasis. Arch Surg 124:480–482, 1989. 34. Green JD, Birkhead G, Herbert J, Li M, Vogt RL. Increased motility in surgical patients undergoing secondary (incidental) cholecystectomy. Ann Surg 211:50– 54, 1990.

  

Page 455

21—  Biliary Crystals, Microlithiasis, and Sludge Dieter Jüngst Klinikum Grosshadern, Ludwig­Maximilians­University, Munich, Germany Christoph von Ritter Vinzentimm Ruhpolding Hospital, Ruhpolding, Germany I—  Introduction The term sludge is used for a variety of conditions that involve solid material, dispersed in a liquid medium, that slowly settles to the bottom. A ''sandy" precipitate is  frequently found in the gallbladder upon cholecystectomy in patients with symptomatic gallstone disease, and the stratification of bile is a well­known phenomenon.  However, the importance of biliary sludge was increasingly recognized only after the advent of ultrasonography. There is sufficient evidence to indicate that biliary  sludge is an intermediate step in the formation of gallstones of different origin, at least in some patients. Furthermore, biliary sludge has been shown to play a role in the  pathogenesis of cholecystitis, cholangitis, and pancreatitis. II—  Definition Biliary sludge is defined as a suspension of precipitated particulate matter in bile. As synonyms, biliary sediments, microcrystalline disease, and microlithiasis have  been proposed. Generally, biliary sludge may consist of the whole range, from single crystals, aggregated crystals, to microlithiasis dispersed in a viscous, mucin­rich  liquid phase. The chemical composition of biliary sludge depends on the various causes of sludge formation. The more common precipitates are cholesterol monohydrate crystals  (Fig. 1), and bile containing these crystals is characterized by a high viscosity and an increased mucin and protein content (1–4). Other precipitates in human bile  include calcium bilirubinate granules, calcium phosphate and calcium carbonate crystals, and calcium salts of fatty acids and ceftriaxone. We have found that the ultracentrifugation of bile allows quantification of the main components of biliary sludge (5). Our data showed that assessment of the  differences in the concentrations of cholesterol, protein, mucin, and bilirubin between native and ultracentrifuged gallbladder bile samples—collected during  laparoscopic surgery from patients with cholesterol, mixed, and pigment stones—allows an estimation of the content of these components in biliary sludge (Fig. 2). The  amount of biliary sludge was higher in the gallbladder bile of patients with cholesterol gallstones than in that of patients with mixed or pigment stones. Furthermore, the  chemical composition of the precipitates correlated well to the composition of the associated stones (Fig. 2) (6).

  

Page 456

Figure 1 Phase­contrast microscopy of a cluster of cholesterol monohydrate  crystals (Ø 5 to 10 µm) in gallbladder bile.

III—  Diagnosis The major method for the diagnosis of biliary crystals is the microscopic examination of duodenal bile after cholecystokinin stimulation, allowing single crystals with a  diameter of 5 to 10 µm to be detected. Transabdominal ultrasound examination of the gallbladder permits the visualization of particles in bile only above a diameter of  approximately 2 mm. These represent the comparably larger particles of biliary sludge, consisting of aggregated crystals or

Figure 2 Mean concentration difference between native and ultracentrifuged (100,000 g for 1 h) gallbladder bile of cholesterol, protein, mucin, and bilirubin. Samples were collected during surgery from 35 patients with cholesterol (>50% cholesterol), 18 patients with mixed (10 to 50%  holesterol), and 15 patients with pigment stones (<10% cholesterol). (From Ref. 6.)

  

Page 457

microliths embedded in the mucin­rich liquid phase. Therefore, both methods determine different­sized particles of the spectrum of biliary sludge. A—  Transabdominal Ultrasound and Computed Tomography With the advent of gray­scale ultrasound, it has been recognized that the gallbladder may contain layered bile, with the most dependent layer demonstrating  echogenicity of low amplitude (Fig. 3a). The fluid level in the gallbladder changes when the patient is moved from a supine to a decubitus or erect position. The rate at  which this level is reestablished after a positional change is often very slow, suggesting that the medium is relatively viscous. Whenever layering is observed in bile, the  echogenic layer is dependent; rarely, the gallbladder bile is diffusely echogenic. The precise nature of the origin of echoes within biliary sludge has been reported in  different in vitro studies (7–9). These studies showed that filtration of bile converts echogenic bile into echo­free bile. Examination of the filtered residue by light  microscopy revealed that the source of echoes in biliary sludge was predominantly pigment precipitates mixed with cholesterol crystals. The pigment precipitates  consisted mainly of calcium

Figure 3 a. Transabdominal sonography of the gallbladder of a patient with microlithiasis (Ø < 3 mm). b. Abdominal computed tomography of the gallbladder revealed major calcification of the microliths, excluding bile acid dissolution therapy in this patient.

  

Page 458

bilirubinate (7–9). The presence of calcium salts in biliary sludge may be detected by high­resolution computed tomography (Fig. 3b). B—  Biliary Microscopy Gallbladder bile can be collected noninvasively by duodenal drainage after stimulation with magnesium sulfate, which leads to a dilatation of the sphincter of Oddi  followed by contraction of the gallbladder (Meltzer­Lyon test) (10–12). Nowadays the collection of duodenal bile is usually performed during duodenoscopy after  stimulation of the gallbladder with cholecystokinin (13). The particulate matter visible in the microscope consists mainly of cholesterol monohydrate crystals and  calcium bilirubinate granules and less often microspherolites consisting of calcium carbonate (12,14,15). It has been established that the presence of cholesterol  crystals in gallbladder bile allows prediction of cholesterol gallstone disease with a sensitivity and specificity above 80% (15,16). Pigment stones can be predicted by  the presence of only calcium bilirubinate granules with a sensitivity and specificity above 70% (14–16). When bile is collected in the duodenum after stimulation with  cholecystokinin, gallstones can be predicted with a sensitivity of approximately 60 to 70% by microscopic detection of crystals (17). C—  Endoscopic Ultrasound Ultrasonographically, the presence of sludge in the gallbladders of patients with gallstones is detectable in approximately 2% of patients (6). Compared to microscopy,  the sensitivity of transabdominal ultrasound to detect smaller­sized particles of biliary sludge is rather low. These problems can be overcome by the use of endoscopic  ultrasonography. This technique has been compared with microscopic examination of duodenal bile in the diagnosis of microlithiasis in patients with normal  conventional ultrasonography (18,19). Compared to operative results, both methods were equally sensitive (>70%) and equally specific (>85%) in the diagnosis of  biliary sludge or microlithiasis. In conclusion, conventional ultrasonography and microscopy of gallbladder bile collected by duodenal drainage or endoscopically by aspiration after gallbladder  contraction represent valuable methods for the diagnosis of biliary sludge or microlithiasis. However, owing to the differences in sensitivity between the two methods,  ultrasound may miss many patients with clinically relevant biliary sludge, while biliary microscopy may result in overestimation of such cases. Computed tomography  appears to be a valuable aid for the detection or exclusion of major calcification of biliary sludge. IV—  Prevalence, Epidemiology, and Risk Factors In the largest series—17,021 patients—admitted to a department of medicine with different diseases, including cholecystolithiasis, gallbladder sludge was found by  transabdominal ultrasound in 1.7% (20). Further studies also using transabdominal ultrasound detected biliary sludge in 30 (1%) of 2949 consecutive patients admitted  to a department of medicine for various diseases (6). In 452 patients with gallbladder stones, sludge was detected in 2% (6). Using light microscopy after duodenal  drainage of gallbladder bile following cholecystokinin stimulation, cholesterol monohydrate crystals or pigment granules were found in up to 70% of patients with  gallstones (12). Higher prevalences of sonographically detectable biliary sludge in the gallbladder have been reported during pregnancy (30%), parenteral nutrition  (50%), and weight loss (25%) or after ingestion of ceftriaxone (40%) (21–29). Within a population, biliary sludge and microlithiasis occur sporadically, and specific risk factors have been identified that predict their formation.

  

Page 459

A—  Age and Gender Because biliary sludge may dissolve spontaneously, the cumulative prevalence of sludge does not necessarily increase with age. However, since cholesterol secretion  into bile increases with age, this might affect the formation of biliary sludge and microlithiasis. Female sex is a prominent risk factor for cholesterol gallstone formation. However, of 286 patients in whom biliary sludge was detected by ultrasound, 157 were  women and 129 were men (20). Thus female sex seems not to be a specific risk factor at least for the formation of ultrasonographically detectable biliary sludge. B—  Obesity, Weight Loss, and Total Parenteral Nutrition Obesity is a well­known risk factor for the cholesterol gallstones (30). Due to the low prevalence of sonographically detectable biliary sludge, the relation between  obesity and biliary sludge formation is unknown. Rapid weight loss is a recently recognized risk factor for cholesterol gallstone formation. Approximately 25% of  obese patients develop gallstones during dietary weight loss. After gastric bypass surgery, as many as 50% of patients form biliary sludge or gallstones (26,31). The  pathogenesis of biliary sludge and gallstone formation after rapid weight loss and gastric bypass surgery appears to be multifactorial. It has been shown that hepatic  cholesterol secretion increases during caloric restriction (32,33). Additional factors may include increased mucin production (a potent stimulator of cholesterol crystal  nucleation) and decreased gallbladder motility (33,34). Impaired gallbladder motility also appears to be of major importance for the development of biliary sludge  during total parenteral nutrition (TPN). As many as 23% of patients under TPN for a minimum of 3 months were found to develop biliary sludge (22,25,35).  Moreover, in a prospective study, a 50% incidence of biliary sludge was detected by ultrasound within 4 to 6 weeks of TPN. Ten days of fasting following  gastrointestinal surgery caused sludge in 32% of patients (31,34). The high percentage of sludge formation during fasting is believed to be primarily caused by gallbladder hypomotility and bile stasis. In addition failure of the sphincter  of Oddi to relax, causing preferential bile flow into the gallbladder, may play a role. C—  Pregnancy and Parity Pregnancy and parity are well­known risk factors for cholesterol gallstone disease. Pregnancy is a greater risk factor for the development of biliary sludge and  subsequent gallstones (36). During pregnancy, bile becomes more lithogenic as a result of increased serum estrogen levels, which cause increased cholesterol secretion  and supersaturation of bile (37). In addition, due to gallbladder hypomotility, the residual volume of the gallbladder increases and stasis develops, which also promotes  sludge and stone formation (36). The altered gallbladder motility during pregnancy is predominantly due to the smooth muscle inhibitory effect of progesterone and  perhaps to diminished contraction in response to cholecystokinin (38). Sludge formation can develop in the first trimester and increases steadily until delivery (21). D—  Biliary Stasis In addition to impaired motility of the gallbladder, bile stasis is an important cause of sludge formation. Sludge was analyzed in six patients with common duct  obstruction caused by chronic pancreatitis, pancreatic pseudocyst, or carcinoma (27). Microscopy of sludge showed calcium bilirubinate granules but no cholesterol  crystals. During stasis of gallbladder bile, bilirubin glucuronide is hydrolyzed to bilirubin, which then forms the pigment precipitate. When unconjugated bilirubin  precipitates from bile, it forms complexes with inorganic ions, mostly calcium. In an animal model, it has been shown that the ligation of gallbladders resulted in the  formation of pigment sludge and stones (39). Three days after ligation, the gallbladders

  

Page 460

contained copious amounts of viscous black material that was microscopically identified as calcium bilirubinate granules. The major stimulus for this formation of  pigment stones was hypersecretion of gallbladder mucin. E—  Drugs The effect of estrogen on cholesterol gallstone formation has been extensively studied. Exogenous estrogen increases biliary cholesterol secretion by 40%, causing  cholesterol supersaturation in the bile (40). No such relation has been documented between the intake of estrogen and the formation of biliary sludge. Octreotide, the  somatostatin analogue, has been shown to cause a 28% incidence of gallstones in patients receiving this drug for the treatment of acromegaly. Decreased gallbladder  motility is the most probable cause for this octreotide effect (41,42). Ceftriaxone, a third­generation cephalosporin with a long duration of action, is excreted into urine.  However, as much as 40% of the drug is secreted in unmetabolized form into bile, reaching biliary concentrations 100­ to 200­fold higher than the concentration in  serum (43). Once the biliary saturation level is exceeded, ceftriaxone complexes with calcium and forms an insoluble salt (29). Formation of biliary sludge has been  reported in 43% of children receiving high­dose ceftriaxone; 19% of these patients were symptomatic (44). Microscopic examination of surgically collected bile  specimens revealed fine precipitates 20 to 250 µm in diameter. There were a small number of cholesterol monohydrate crystals and calcium bilirubinate granules  among an abundant amount of crystalline material, which predominantly consisted of calcium salts of ceftriaxone (29). F—  Liver Transplantation A well­known complication after liver transplantation is the development of biliary sludge. In the largest series, filling defects of the bile duct were detected by  cholangiography in 94 (5.7%) of 1650 patients (45). On the basis of the cholangiographic appearance, the bile duct filling defects were categorized as sludge or cast in  53 (56%), stones in 32 (34%), and necrotic debris in nine (10%) patients. The formation of biliary sludge is considered to be a serious, life­threatening complication.  The major reasons for sludge formation were biliary strictures and prestenotic dilatations of the bile ducts. As in bile duct necrosis with debris formation due to bile  duct ischemia caused by hepatic artery occlusion, sludge formation may also be caused by ischemia in some cases (45). V—  Pathogenesis The formation of cholesterol monohydrate crystals is believed to be crucial in the pathogenesis of cholesterol gallstones (46,47). A variety of factors that promote or  inhibit cholesterol crystal nucleation in model bile have been reported (48). Although virtually insoluble in water, cholesterol is made soluble in bile through carriers that  include bile salts and phospholipids (49). In unsaturated bile, cholesterol is primarily transported in simple and mixed micelles (17). As cholesterol saturation increases  in bile, more cholesterol is carried in larger phospholipid cholesterol vesicles (Fig. 4). Unilamellar vesicles can coalesce into multilamellar vesicles, which tend to be less  stable and allow the growth of cholesterol crystals from the surface (50,51). These vesicles may interact with soluble mucin, which acts as an annealing agent, favoring  the further nucleation and agglomeration of cholesterol monohydrate crystals (52,53). These crystals are entrapped in the soluble or gel form of mucin. Thus, one form  of biliary sludge represents an early event in cholesterol gallstone formation with cholesterol monohydrate crystals embedded in biliary mucin. Calcium bilirubinate granules represent another major component of biliary sludge. These pigment granules are typically found in the gallbladder bile of patients with  pigment stones

  

Page 461

Figure 4 Transmission electron microscopy of phospholipid cholesterol vesicles (30 to 100 nm) isolated from gallbladder bile by gel­filtration chromatography.

(14–16). In liver cirrhosis, the risk of developing biliary sludge consisting of calcium bilirubinate granules is increased (54). Hypersecretion of bilirubin conjugates  (especially monoglucuronides) into the bile is the most important factor for the formation of biliary sludge consisting of calcium bilirubinate granules. In an animal model,  the presence of hemolysis increased the biliary secretion of bilirubin monoglucuronides more than 10­fold (55). Unconjugated monohydrogenated bilirubin is formed  by the action of endogenous betaglucuronidase, which can coprecipitate with calcium as a result of supersaturation (56). While no defects in gallbladder motility have  been found in patients with pigment stones (57), biliary stasis is an important factor, resulting in increased levels of unconjugated bilirubin. The cytotoxic effect of  unconjugated bilirubin may favor mucin hypersecretion from the biliary epithelial cells (58). VI—  Natural History In a prospective study, 96 patients with sonographically detected biliary sludge were followed for a mean of 3 years by serial ultrasound scans (59). In 17 patients  (18%) biliary sludge disappeared and did not recur for at least 2 years. In 58 patients (60.4%), biliary sludge disappeared, but it recurred during the observation  period, while 8 patients (8.3%) developed asymptomatic gallstones (59). Only 6 patients (6.3%) developed symptomatic gallstones that required treatment by  cholecystectomy. Another 6 patients (6.3%) suffered from attacks of biliary pain in part associated with recurrent pancreatitis; they also had to be treated by elective  cholecystectomy. In a further study, 56 patients with gallbladder sludge were followed by ultrasound (20). Within a mean of 2 months, 40 patients (71.4%) were free of sludge and  showed normal sonographic gallbladder findings. Gallbladder stones without sludge developed in 5 patients (8.9%) within a mean of 2.5 months, and gallstones with  persistence of sludge were observed in 2 further patients (3.6%) after 6.1 and 30.7 months, respectively. None of these patients became symptomatic in the course of  the follow­up period. Acute cholecystitis developed in 4 further patients (7.1%). No cases of acute pancreatitis were observed in this study (20). The incidence of  sludge and stone formation during pregnancy is approximately 30 and 2%, re­

  

Page 462

spectively (60). Both sludge and stones are usually "silent," but when biliary pain develops, it is generally associated with the presence of stones and not with sludge.  After delivery, gallbladder motility returns to normal and sludge disappears in 60 to 70% of cases (60). The incidence of gallbladder sludge amounts to 50% in patients  with total parenteral nutrition of more than 6 weeks' duration (31). Normal nutrition causes disappearance of sludge in most cases within a few weeks; however,  because of the development of acalculous cholecystitis or symptomatic gallstones, cholecystectomy is required in 15% of cases (31). Although biliary sludge in patients receiving ceftriaxone may cause symptoms in about 19%, in most patients sludge spontaneously disappears after the antibiotic  treatment is withdrawn (44). Taken together, these studies show that biliary sludge is a reversible condition. Upon withdrawal of the noxious agent or condition, sludge dissolves or is discharged in  the majority of cases. However, a minority of patients develop gallstones, which may become symptomatic. By far the most serious complication of biliary sludge is the  development of biliary pancreatitis. VII—  Clinical Manifestations of Biliary Sludge The hepatobiliary tract is a low­pressure/low­flow hydraulic excretory pathway for hydrophobic, water­insoluble substances. Because of the low­flow nature of the  system and the tenuous solubility of the bile constituents, bile is prone to precipitation and formation of solid material such as sludge (61). The clinical manifestations of microcrystalline disease (a proposed synonym for biliary sludge and microlithiasis) are only poorly understood. Biliary sludge or  microlithiasis can cause symptoms mainly via two mechanisms: obstruction of either the cystic duct or the common bile duct. The presence of cholesterol monohydrate  crystals is a constant feature of cholesterol gallstone disease (14–16,46). There is evidence to suggest that gallbladder bile rich in cholesterol and cholesterol crystals  may cause epithelial hyperplasia of the gallbladder and result in hypersecretion of mucins (1,2,62–64). In long­standing cholesterol gallstone disease, the consequence  of the persistent secretion of lithogenic bile leads to severe disturbance of gallbladder function, with impaired motility and loss of concentrative function (57,65,66),  both believed to be caused by cholesterol crystals. Moreover, cholesterol crystals in bile may also lead to chronic inflammation of the cystic duct or the sphincter of  Oddi, with subsequent fibrosis and sclerosis (H.U. Kloer, personal communication, 1998). A—  Acalculous Biliary Pain Acalculous biliary pain, an intense episode of right­upper abdominal pain that begins suddenly, rises in intensity over a 15­min period and continues at a steady plateau  for several hours before slowly subsiding. The attacks of pain are frequently but not always precipitated by meals and may be accompanied by vomiting. The  symptoms mimic those of a typical biliary colic. Between attacks, the physical examination is usually normal, with the possible exception of residual upper abdominal  tenderness. The striking preponderance of patients with acalculous biliary pain who are usually young, parous females closely parallels the epidemiology of cholesterol  gallstones. This suggests that there may be similar risk factors for the two conditions. Indeed, some studies of resected gallbladder specimens have shown that as many  as one­half of the patients with acalculous biliary pain actually have microscopic cholecystolithiasis, indicating that the original sonogram yielded a false­negative result  (67). Typically, the Meltzer­Lyon test reveals the presence of cholesterol monohydrate crystals in duodenal bile after the stimulation of gallbladder contraction. The resected gallbladders of a subset of patients with acalculous biliary pain show histological evidence of cholesterolosis. Although usually thought to be an incidental  pathological

  

Page 463

finding, cholesterolosis of the gallbladder may in some patients impair normal gallbladder contraction and result in clinical features identical to those of acalculous biliary  pain (68). B—  Acute Acalculous Cholecystitis Acute acalculous cholecystitis may be caused by biliary sludge or microlithiasis. In most cases acute acalculous cholecystitis is associated with a triad of prolonged  fasting, immobility, and hemodynamic instability. In this setting, the gallbladder epithelium is exposed to one of the most noxious environments endogenous to the body,  which comprises a concentrated solution of detergent bile acids known to solubilize lipids. Normally, the gallbladder empties concentrated bile several times per day  and is replenished with dilute hepatic bile. With prolonged fasting, the gallbladder never receives the adequate cholecystokinin (CCK)­mediated stimulus required to  void its contents; thus concentrated bile lingers in its lumen. Together with splanchnic vasoconstriction resulting from, for instance, septic shock, the stage is set for an  ischemic/chemical injury to the gallbladder epithelium (69). The clinical features of acute acalculous cholecystitis differ from those of cholecystitis resulting from stone disease. Although right­upper­quadrant pain, fever, localized  tenderness over the gallbladder, and leukocytosis may be evident in classic presentations, some or all of these features are frequently lacking in elderly postoperative  patients. Compared to ordinary calculous cholecystitis, the clinical course of acute acalculous cholecystitis is more fulminant. By the time the diagnosis is made, at least  half of the patients have already experienced complications such as gangrene or localized perforation of the gallbladder (70). C—  Cholesterolosis Cholesterolosis of the gallbladder is an acquired histological abnormality of the gallbladder mucosa involving excessive accumulation of cholesterol ester within  epithelial macrophages (71). Although the cause of the accumulation of cholesterol esters and cholesterol in the gallbladder mucosa is unclear, it has been  unequivocally shown that the gallbladder epithelium is capable of absorbing cholesterol from bile (72–74). However, it is unknown why, in some patients, resorbed  biliary cholesterol is esterified and then stored in foamy macrophages, resulting in cholesterolosis (72). The lesion is frequently but not always found in gallbladders  exposed to bile that is supersaturated with cholesterol, and the disorder probably shares a common pathogenetic mechanism with cholesterol gallstone disease (75). D—  Cholangitis and Pancreatitis The most relevant clinical manifestation of microlithiasis or biliary sludge is obstruction of the common biliary duct with acute cholangitis or pancreatitis. Gallstone  pancreatitis is often related to small stones, which may not be detected by conventional cholecystographic techniques (76–79). In a recent study, it was hypothesized  that, in patients with acute pancreatitis of unknown cause, their condition could be caused by microlithiasis or cholesterolosis of the gallbladder (80). In a prospective  study, evidence for this hypothesis was sought by microscopic examination of centrifuged duodenal bile in 51 patients with acute pancreatitis. Clusters of cholesterol  monohydrate crystals, calcium bilirubinate granules, and calcium carbonate microspherolites were found in 67% of the patients. In contrast, biliary drainage showed no  abnormal findings in 12 patients suffering from a bout of known alcoholic pancreatitis. Examination of gallbladder bile at cholecystectomy, or abdominal  ultrasonography of the gallbladder for up to 12 months, showed that 73% of the patients with unexplained pancreatitis had biliary sludge or microlithiasis. Biliary  crystals/solid markers both predicted biliary pancreatitis with a sensitivity and specificity of 86% and a predictive value of 95% (78). In a second prospective study,  Lee et al. determined the frequency of biliary sludge in patients with

  

Page 464

acute idiopathic pancreatitis (77). The study comprised 86 patients with no known cause of pancreatitis and no ultrasonographic evidence of gallstones or dilatation of  the biliary duct. The pancreatitis was considered idiopathic in 31 of the 86 patients (36%), of whom 23 had microscopic evidence of biliary sludge. Biliary sludge was  detected by ultrasonography in only 11 of the 23 patients (48%). The sludge detected by ultrasonography was composed of calcium bilirubinate granules in 10  patients and cholesterol monohydrate crystals in 1. Calcium bilirubinate granules were found more frequently in men (9 men versus 4 women). The presence of biliary  sludge was clearly associated with recurrent attacks of pancreatitis. Therefore, occult microlithiasis should be strongly suspected in cases of acute pancreatitis of  unknown origin, especially when there are frequent relapses. E—  Dysfunction of the Sphincter of Oddi Chronic exposure of the sphincter of Oddi to bile containing cholesterol crystals may lead to dysfunction of this sphincter, a well­known clinical entity in patients with  long­standing gallstone disease (H.U. Kloer, personal communication, 1998). VIII—  Treatment of Biliary Sludge or Microlithiasis As with gallstone disease, treatment is necessary only in patients whose biliary sludge causes symptoms or complications. In the case of accidentally detected biliary  sludge with no biliary symptoms, expectant management is warranted. In accordance with the natural history of the majority of such patients, biliary sludge will dissolve  or be discharged spontaneously. However, in patients whose biliary sludge is causing biliary pain or complications such as acalculous cholecystitis, cholangitis, or  recurrent pancreatitis, immediate treatment is warranted. A—  Ursodeoxycholic Acid Patency of the cystic duct as documented by sonographically normal gallbladder contraction following a test meal or by opacification of the gallbladder after oral  cholecystography is the precondition for oral bile acid dissolution therapy. Furthermore, the exclusion of calcified biliary sludge by a computed tomography scan of the  gallbladder is valuable for the selection of appropriate patients. Treatment should be initiated with ursodeoxycholic acid (UDCA) at a dose of approximately 10  mg/kg/day. After successful dissolution of biliary sludge, a maintenance therapy with 500 mg/day is recommended (78). B—  Laparoscopic Cholecystectomy In patients with persistent biliary sludge despite dissolution treatment with UDCA—and, in particular, in patients with symptomatic microlithiasis and impaired  contractile function of the gallbladder or other complications—laparoscopic cholecystectomy is indicated. C—  Endoscopic Papillotomy An alternative approach for patients with biliary sludge and recurrent biliary outflow obstruction associated with either recurrent cholangitis or pancreatitis is  endoscopic papillotomy (81–83). This treatment may be combined with maintenance treatment including UDCA or laparoscopic cholecystectomy (84). In the more specific situation of symptomatic sludge formation during pregnancy or after

  

Page 465

ceftriaxone application, laparoscopic cholecystectomy may be indicated. After delivery a 3­ to 6­month course of full­dose UDCA may be a treatment option. Biliary  sludge after treatment with ceftriaxone will, in most cases, dissolve rapidly. In patients with persistent sludge and biliary symptoms despite dissolution therapy,  laparoscopic cholecystectomy is the treatment of choice. Biliary sludge after liver transplantation is a serious complication and should be treated primarily by oral chemolysis with UDCA. Unfortunately, medical treatment  often fails and more aggressive approaches—such as percutaneous transhepatic biliary drainage followed by irrigation with heparinized saline solutions, intraluminal  chemolysis with glyceryl­monooctanoate and bile salt ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), or basket extraction—become necessary. Endoscopic intervention and  surgery are alternative approaches (45,85). In patients with symptomatic sludge after weight loss or those receiving TPN, strategies such as bile acid dissolution therapy or laparoscopic cholecystectomy may be  applied. However, since the development of sludge in patients undergoing weight loss and TPN is highly predictable, and in view of the potentially serious  complications, prophylactic therapy is indicated (22,23). In patients on low calorie diets, 500 mg of UDCA daily will minimize the risk of sludge development (86). In  patients receiving TPN, a daily stimulation of gallbladder contraction with intravenous cholecystokinin is highly effective in the prevention of biliary sludge (87). In patients with biliary strictures, the formation of sludge is secondary to the stricture and may itself further impair bile flow. A combined approach using endoscopic  dilatation of the stricture, biliary drainage, and oral administration of UDCA to improve bile flow is a possible approach to this sometimes serious problem. There is evidence that biliary crystals, microlithiasis, and sludge represent intermediate events in gallstone development. Biliary cholesterol monohydrate crystals or  calcium bilirubinate granules in gallbladder bile are associated with overt gallstone disease in approximately 80% of patients (12,14–16). Clinically, it is often  impossible to distinguish whether symptoms in patients with gallstones are derived from visible stones or from sonographically occult microlithiasis. Epidemiological  studies suggest that the most severe complications of gallstone disease, such as acute cholecystitis or acute biliary obstruction with either cholangitis or pancreatitis, are  caused by small stones (79). In patients with cholesterol gallstone disease that may be diagnosed by appropriate clinical correlates (88), small stones or microliths are  amenable to treatment with UDCA. As mentioned above, computed tomography scanning of the gallbladder may be helpful to identify suitable patients. Maintenance  treatment with UDCA in patients with gallstones may improve the natural course of the disease by avoiding the complications caused by microlithiasis. Recently, the  long­term effects of maintenance therapy with UDCA on the natural course of cholesterol gallstone disease was examined using a Cox proportional hazard model  analysis (89). A total of 434 patients with cholesterol gallstones were prospectively followed for up to 12 years with either UDCA (600 mg/day, 168 patients) or no  treatment (266 patients). The long­term cumulative occurrence rates of biliary colic was low in the primarily asymptomatic patients (8 and 16% at 5 and 10 years,  respectively) but high in initially symptomatic patients (62 and 80% at 5 and 10 years, respectively). These rates were markedly reduced in patients taking UDCA,  amounting to 0 and 5% at 5 and 10 years, respectively in the asymptomatic group of patients, and to 16 and 46% at 5 and 10 years, respectively in the symptomatic  patients. Complete gallstone dissolution rates in patients treated with UDCA remained comparably low (22 and 24% at 5 and 10 years, respectively). These data  show that maintenance therapy with UDCA could improve the natural course of gallstone disease in symptomatic patients and to a lesser degree also in asymptomatic  patients. Since in the above study the effect of UDCA is presumably based predominantly on the dissolution of sludge, the results indirectly support an important role  of biliary crystals, microlithiasis, and sludge in the pathogenesis of the symptoms and complications of cholesterol gallstone disease. Very recently, it was confirmed  that bile abnormalities can be successfully corrected with UDCA therapy in patients with microlithiasis (90).

  

Page 466

Acknowledgments The authors thank Alan F. Hofmann, Nair Sreejayan, and Gerd­Achim Kullak­Ublick for critically reviewing the manuscript and Robert Lugmaier for expert technical  assistance. References 1. Gallinger S, Taylor RD, Harvey PTC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of mucous glycoprotein on nucleation time of human bile. Gastroenterology 1985;  89:648–658. 2. Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Ilson RG, Strasberg SM. Biliary proteins and the nucleation defect in cholesterol cholelithiasis. Gastroenterology 1987;  92:867–875. 3. Harvey PRC, Rupar CA, Gallinger S, Petrunka CN, Strasberg SM. Quantitative and qualitative comparison of gallbladder mucus glycoprotein from patients with  and without gallstones. Gut 1986; 27:374–381. 4. Jüngst D, Lang T, von Ritter C, Paumgartner G. Role of high total protein in gallbladder bile in the formation of cholesterol gallstones. Gastroenterology 1991;  100:1724–1729. 5. Jüngst D, del Pozo R, Christoph S, Miquel JF, Eder MI, Lange V, Frimberger E, von Ritter C, Paumgartner G. Sedimentation of biliary ''sludge": effect on  composition of gallbladder bile from patients with cholesterol, mixed or pigment stones. Scand J Gastroenterol 1996; 31:273–278. 6. Christoph S. Gallenblasensludge—Pathophysiologie und klinische Bedeutung. M.D. thesis, Ludwig­Maximilians­University, Munich, Germany, 1994. 7. Conrad MR, Jones RO, Dietchy J. Significance of low level echoes within the gallbladder. Am J Roentgenol 1979; 132:967–972. 8. Filly RA, Allen B, Minton MJ, Bernhoft R, Lawrence WW. In vitro investigation of the origin of echoes within biliary sludge. J Clin Ultrasound 1980; 8:193–200. 9. Jennings WC, Drabek GA, Miller KA. Significance of sludge and thickened wall in ultrasound evaluation of the gallbladder. Surg Gynecol Obst 1992; 174:394– 398. 10. Meltzer SJ. The disturbance of the law of contrary innervation as a pathogenetic factor in the diseases of the bile ducts and the gall­bladder. Am J Med Sci 1917;  153:469. 11. Lyon BBV. Diagnosis and treatment of diseases of the gallbladder and biliary ducts. JAMA 1919; 73:980–982. 12. Juniper K, Burson EN Jr. Biliary tract studies: II. The significance of biliary crystals. Gastroenterology 1957; 32:175–211. 13. Susann PW, Sheppard F, Baloga AJ. Detection of occult gallbladder disease by duodenal drainage collected endoscopically: a clinical and pathologic correlation.  Am Surg 1985; 51:162–165. 14. Poupon R, Chrétien Y, Darnis F. Cristaux de cholestérol, saturation de bile en cholestérol et lithiasise biliaire. Gastroenterol Clin Biol 1984; 8:260–263. 15. Ros E. Navarro S, Fernández I, Reixach M, Ribó JM, Rodés J. Utility of biliary microscopy for the prediction of the chemical composition of gallstones and the  outcome of dissolution therapy with ursodeoxycholic acid. Gastroenterology 1986; 91:703–712. 16. Ramond MJ, Dumont M, Belghiti J, Erlinger S. Sensitivity and specificity of microscopic examination of gallbladder bile for gallstones recognition and  identification. Gastroenterology 1988; 95:1339–1343. 17. Carey MC, Small DM. The physical chemistry of cholesterol solubility in bile: relationship to gallstone formation and dissolution in man. J Clin Invest 1978;  61:998–1026. 18. Dill JE, Hill S, Callis J, Berkhouse L, Evans P, Martin D, Palmer ST. Combined endoscopic ultrasound and stimulated biliary drainage in cholecystitis and  microlithiasis—diagnosis and outcomes. Endoscopy 1995; 27:424–427. 19. Dahan P, Andant C, Lévy P, Amouyal P, Amouyal G, Dumont M, Erlinger S, Sauvanet A, Belghiti J, Zins M, Vilgrain V, Bernades P. Prospective evaluation of  endoscopic

  

Page 467

ultrasonography and microscopic examination of duodenal bile in the diagnosis of cholecystolithiasis in 45 patients with normal conventional ultrasonography. Gut  1996; 38: 277–281. 20. Janowitz P, Kratzer W, Zemmler T, Tudyka J, Wechsler JG. Gallbladder sludge: spontaneous course and incidence of complications in patients with stones.  Hepatology 1994; 20:291–294. 21. Maringhini A, Ciambra M, Bacceliere P, Raimondo M, Pagliario I. Sludge, stones and pregnancy. Gastroenterology 1988; 95:1160–1161. 22. Messing B, Bories C, Kunstlinger F, Bernier J. Does total parenteral nutrition induce gallbladder sludge formation and lithiasis? Gastroenterology 1983; 84:1012– 1019. 23. Bolondi L, Gaiani S, Testa S, Labò G. Gallbladder sludge formation during prolonged fasting after gastrointestinal tract surgery. Gut 1985; 26:734–738. 24. Cano N, Cicero F, Ranieri F, Martin J, di Costanzo J. Ultrasonographic study of gallbladder motility during total parenteral nutrition. Gastroenterology 1986;  91:313–317. 25. Gafá M, Sarli L, Miselli A, Pietra N, Carreras F, Peracchia A. Sludge and microlithiasis of the biliary tract after total gastrectomy and postoperative total  parenteral nutrition. Surg Gynecol Obstet 1987; 165:413–418. 26. Liddle RA, Goldstein RB, Saxton J. Gallstone formation during weight­reduction dieting. Arch Intern Med 1989; 149:1750–1753. 27. Allen B, Bernhoft R, Blanckaert N, Svanvik J, Filly R, Gooding G, Way L. Sludge is calcium bilirubinate associated with bile stasis. Am J Surg 1981; 141:51–56. 28. Pitt HA, Doty JE, den Besten LW, Kuchenbecker SL. Stasis before gallstone formation: altered gallbladder compliance or cystic duct resistance. Am J Surg  1982; 143:144–149. 29. Park HZ, Lee SP, Schy AL. Ceftriaxone­associated gallbladder sludge. Identification of calcium­ceftriaxone salt as a major component of gallbladder precipitate.  Gastroenterology 1991; 100:1665–1670. 30. Stampfer MJ, Maclure KM, Colditz GA, Manson JE, Willett WC. Risk of symptomatic gallstones in women with severe obesity. Am J Clin 1992; 55:652–658. 31. Shiffman ML, Sugerman HJ, Kellum JM, Brewer WH, Moore EW. Gallstone formation after rapid weight loss: a prospective study in patients undergoing gastric  bypass surgery for treatment of morbid obesity. Am J Gastroenterol 1991; 86:1000–1005. 32. Marks JW, Bonorris GG, Albers G, Schoenfield LJ. The sequence of biliary events preceding the formation of gallstones in humans. Gastroenterology 1992;  103:566–570. 33. Shiffman ML, Shambruck RD, Schwartz CC, Sugerman HJ, Kellum JM, Moore EW. Gallbladder mucin, arachidonic acid and bile lipids in patients who develop  gallstones during weight reduction. Gastroenterology 1993; 105:1200–1208. 34. Inoue K, Fuchigami A, Higashide S, Sumi S, Kogire M, Suzuki T, Tobe T. Gallbladder sludge and stone formation in relation to contractile function after  gastrectomy. Ann Surg 1992; 215:19–26. 35. Pitt HA, King W 3d, Mann LL, Roslyn JJ, Berquist WE, Ament ME, Den Besten L. Increased risk of cholelithiasis with prolonged total parenteral nutrition. Am J  Surg 1983; 145:106–112. 36. Tsimoyiannis EC, Antoniou NC, Tsaboulas C, Papanikolaou N. Cholelithiasis during pregnancy and lactation: prospective study. Eur J Surg 1994; 160:627–631. 37. Lynn J, Williams L, O'Brien J, Wittenberg J, Egdahl RH. Effects of estrogen upon bile: implications with respect to gallstone formation. Ann Surg 1973; 178:514– 524. 38. Hould FS, Fried GM, Fazekas AG, Tremblay S, Mersereau WA. Progesterone receptors regulate gallbladder motility. J Surg Res 1988; 45:505–512. 39. Bernhoft RA, Pellegrini CA, Broderick WC, Way LW. Pigment sludge and stone formation in the acutely ligated dog gallbladder. Gastroenterology 1983;  85:1166–1171. 40. Henriksson P, Einarsson K, Eriksson A, Kelter U, Angelin B. Estrogen­induced gallstone formation in males: relation to changes in serum and biliary lipids during  hormonal treatment of prostatic carcinoma. J Clin Invest 1989; 84:811–816.

  

Page 468

41. Van Liessum PA, Hopman WPM, Pieters GFFM, Jansen JBMJ, Smals AGH, Rosenbusch G, Kloppenborg PWC, Lamers CBHW. Postprandial gallbladder  motility during long term treatment with the long­acting somatostatin analog SMS 201–995 in acromegaly. J Clin Endocrinol Metab 1989; 69:557–562. 42. Montini M, Gianola D, Pagani MD, Pedroncelli A, Caldara R, Gherardi F, Bonelli M, Lancranjan I, Pagani G. Cholelithiasis and acromegaly: therapeutic  strategies. Clin Endocrinol 1994; 40:401–406. 43. Arvidsson A, Alvan G, Angelin B, Borga O, Nord CE. Ceftriaxone: renal and biliary excretion and effect on the colon microflora. J Antimicrob Chemother 1982;  10:207–215. 44. Schaad UB, Wedgwood­Krucko J, Tschaeppeler H. Reversible ceftriaxone­associated biliary pseudolithiasis in children. Lancet 1988; 2:1411–1413. 45. Sheng R, Ramirez CB, Zajko AB, Campbell WL. Biliary stones and sludge in liver transplant patients: a 13­year experience. Radiology 1996; 198:243–247. 46. Sedaghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980; 302:1274–1277. 47. Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WY. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.  Gastroenterology 1979; 77:611–617. 48. Holzbach RT. Recent progress in understanding cholesterol crystal nucleation as a precursor to human gallstone formation. Hepatology 1986; 6:1403–1406. 49. Admirand WH, Small DM. The physico­chemical basis of cholesterol gallstone formation in man. J Clin Invest 1968; 47:1043–1052. 50. Sömjen GJ, Gilat T. Changing concepts of cholesterol solubility in bile. Gastroenterology 1986; 91:772–775. 51. Schriever CE, Jüngst D. Association between cholesterol­phospholipid vesicles and cholesterol crystals in human gallbladder bile. Hepatology 1989; 9:541–546. 52. Smith BF. Human gallbladder mucin binds biliary lipids and promotes cholesterol crystal nucleation, in model bile. J Lipid Res 1987; 28:1088–1097. 53. Afdahl NH, Niu N, Gantz D, Small DM, Smith BF. Bovine gallbladder mucin accelerates cholesterol monohydrat crystal growth in model bile. Gastroenterology  1993; 104:1515–1523. 54. Acalovschi M, Badea R, Pascu M. Incidence of gallstones in liver cirrhosis. Am J Gastroenterol, 1991; 86:1179–1181. 55. Trotman BW, Bernstein SE, Bove KE, Wirt GD. Studies on the pathogenesis of pigment gallstones in hemolytic anemia: description and characteristics of a  mouse model. J Clin Invest 1980; 65:1301–1308. 56. Cahalane MJ, Neubrand MW, Carey MC. Physical­chemical pathogenesis of pigment gallstones. Semin Liver Dis 1988; 8:317–328. 57. Behar J, Lee KY, Thompson WR, Biancani P. Gallbladder contraction in patients with pigment and cholesterol stones. Gastroenterology 1989; 97:1479–1484. 58. Trotman BW, Bernstein SE, Balistreri WF, Wirt GD, Martin RA. Hemolysis­induced gallstones in mice: increased unconjugated bilirubin in hepatic bile  predisposes to gallstone formation. Gastroenterology 1981; 81:232–236. 59. Lee SP, Maher K, Nicholls JF. Origin and fate of biliary sludge. Gastroenterology 1988; 94:170–176. 60. Maringhini A, Ciambra M, Baccelliere P, Raimondo M, Orlando A, Tine F, Grasso R, Randazzo MA, Barresi L, Gullo D, Musico M, Pagliaro L. Biliary sludge  and gallstones in pregnancy: incidence, risk factors, and natural history. Ann Intern Med 1993; 119:116–120. 61. Carey MC. Pathogenesis of gallstones. Am J Surg 1993; 165:410–419. 62. Doty JE, Pitt HA, Kuchenbecker SL, Porter­Fink V, Den Besten LW. Role of gallbladder mucus in the pathogenesis of cholesterol gallstones. Am J Surg 1983;  145:54–61.

  

Page 469

63. Lee SP, Nicholls JF. Nature and composition of biliary sludge. Gastroenterology 1986; 90:677–686. 64. Carey MC, Cahalane MJ. Whither biliary sludge. Gastroenterology 1988; 95:508–523. 65. Pomeranz IS, Shaffer EA. Abnormal gallbladder emptying in a subgroup of patients with gallstones. Gastroenterology 1985; 88:787–791. 66. Li YF, Moody FG, Weisbrodt NW, Zalewsky CA, Coelho JC, Senninger N, Gouma D. Gallbladder contractility and mucus secretion after cholesterol feeding in  the prairie dog. Surgery 1986; 100:900–904. 67. Herrera­Ballester A, Canelles­Gamir P, Medina­Chulia E, Soler­Ros JJ, Orti­Ortin E, Ortega­Gonzalez F, Quiles­Teodoro F. Cholecystectomy: a choice  technique in biliary microlithiasis. Ann Med Int 1995; 12:111–114. 68. Kmiot WA, Perry EP, Donovan IA, Lee MJ, Wolverson RF, Harding LK, Neoptolemos JP. Cholesterolosis in patients with chronic acalculous biliary pain. Br J  Surg 1994; 81:112–115. 69. Warren BL. Small vessel occlusion in acute acalculous cholecystitis. Surgery 1992; 111: 163–168. 70. Johnson LB. The importance of early diagnosis of acute acalculous cholecystitis. Surg Gynecol Obstet 1987; 164:197–203. 71. Weedon D. Cholesterolosis: Pathology of the Gallbladder. New York: Masson, 1984: 161. 72. Sahlin S, Stahlberg D, Einarsson K. Cholesterol metabolism in liver and gallbladder mucosa of patients with cholesterolosis. Hepatology 1995; 21:1269–1275. 73. Jacyna MR, Ross PE, Bakar MA, Hopwood D, Bouchier IA. Characteristics of cholesterol absorption by human gallbladder: relevance to cholesterolosis. J Clin  Pathol 1987; 40: 524–529. 74. Tilvis RS, Aro J, Strandberg TE, Lempinen M, Miettinen TA. Lipid composition of bile and gallbladder mucosa in patients with acalculous cholesterolosis.  Gastroenterology 1982; 82:607–615. 75. Braghetto I, Antezana C, Hurtado C, Csendes A. Triglyceride and cholesterol content in bile, blood, and gallbladder wall. Am J Surg 1988; 156:26–28. 76. Negro P, Flati G, Flati D, Porowska B, Tuscano D, Carboni M. Occult gallbladder microlithiasis causing acute recurrent pancreatitis. Acta Chir Scand 1984;  150:503–506. 77. Lee SP, Nicholls JF, Park HZ. Biliary sludge as a cause of acute pancreatitis. N Engl J Med 1992; 326:589–593. 78. Ros E, Navarro S, Bru C, Garcia­Pugés A, Valderrama R. Occult microlithiasis in "idiopathic" acute pancreatitis: prevention of relapses by cholecystectomy or  ursodeoxycholic acid therapy. Gastroenterology 1991; 101:1701–1709. 79. Diehl AK, Holleman DR, Chapman JB, Schwesinger WH, Kurtin WE. Gallstone size and risk of pancreatitis. Arch Intern Med 1997; 157:1674–1678. 80. Paricio PP, Olmo DG, Franco EP, González AP, González LC, López JB. Gallbladder cholesterolosis: an aetiological factor in acute pancreatitis of uncertain  origin. Br J Surg 1990; 77:735–736. 81. Davidson BR, Neoptolemos JP, Carr­Locke DL. Endoscopic sphincterotomy for common bile duct calculi in patients with gallbladder in situ considered unfit for  surgery. Gut 1988; 29:114–120. 82. Carr­Locke DL. Role of endoscopy in gallstone pancreatitis. Am J Surg 1992; 165:519–521. 83. Welbourn CRB, Beckly DE, Eyre­Brook IA. Endoscopic sphincterotomy without cholecystectomy for gallstone pancreatitis. Gut 1995; 37:119–120. 84. Ricci F, Castaldini G, de Manzoni G, Borzellino G, Rodella L, Kind R. Minimally invasive treatment of acute biliary pancreatitis. Surg Endosc 1997; 11:1179– 1182. 85. Barton P, Steininger R, Maier A, Mühlbacher F, Lechner G. Biliary sludge after liver transplantation: 2. Treatment with interventional techniques versus surgery  and/or oral chemolysis. Am J Roentgenol 1995; 164:865–869.

  

Page 470

86. Shiffman ML, Kaplan GD, Brinkman­Kaplan V, Vickers FF. Prophylaxis against gallstone formation with ursodeoxycholic acid in patients participating in a very­ low­calorie diet program. Ann Intern Med 1995; 122:899–905. 87. Sitzmann JV, Pitt HA, Steinborn PA, Pasha ZR, Sanders RC. Cholecystokinin prevents parenteral nutrition induced biliary sludge in humans. Surg Gynecol  Obstet 1990; 170: 25–31. 88. Diehl AK, Schwesinger WH, Holleman DR Jr, Chapman JB, Kurtin WE. Clinical correlates of gallstone composition: distinguishing pigment from cholesterol  stones. Am J Gastroenterol 1995; 90:967–972. 89. Tomida S, Abei M, Yamaguchi T, Shoda J, Matsuzaki Y, Tanaka N, Osuga T. Long­term effects of ursodeoxycholic acid in patients with cholecystolithiasis in  comparison with the natural course: a Cox proportional hazard model analysis. Gastroenterology 1997; 112(4 suppl)A524. 90. Sharma BC, Agarwal DK, Dhiman RK, Baijal SS, Choudhuri G, Saraswat VA. Bile lithogenicity and gallbladder emptying in patients with microlithiasis: effect of  bile acid therapy. Gastroenterology 1998; 115:124–128.

  

Page 471

22—  Biliary Colic and Acute Cholecystitis Robert V. Rege University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, Texas I—  Introduction In the United States, 10% of the population have gallstones. Each year, more than 1 million people develop symptoms attributable to their gallstones, and 500 to 600  thousand patients per year require cholecystectomy to treat their disease. About 10 to 20% of these procedures are performed for acute cholecystitis. Gallstones and  gallstone­related diseases are therefore a significant medical and economic problem in our society. Similarly, gallstones are among the most common disorders  affecting humanity throughout the world. Although dissolution therapy and extracorporeal shock­wave lithotripsy can successfully treat selected patients with  gallstones, cholecystectomy is the mainstay of gallstone treatment. It is without doubt the treatment of choice in individuals who develop acute cholecystitis.  Laparoscopic cholecystectomy, introduced within the last 10 years, decreases postoperative pain and hastens postoperative recovery but does not decrease the  morbidity and mortality of cholecystectomy. Its role in treating patients with complicated gallstone disease has not been fully established and its evolving. This chapter  describes biliary colic, the most common symptom of gallstone disease, and compares it with the signs and symptoms of acute cholecystitis, the most common  complication of gallstones. The diagnosis and treatment of acute cholecystitis are also discussed. Most patients with gallstones do not have symptoms. The majority of gallstones remain silent and undetected for many years, although some are incidentally detected  by ultrasound, computed tomography (CT) of the abdomen, abdominal x­rays ordered for another reason, or during another abdominal operation when the surgeon  palpates them. In the past, it was believed that all gallstones eventually caused symptoms and that patients with untreated gallstones were at great risk for  complications of gallstone disease. Cholecystectomy was, therefore, uniformly recommended for patients with known but asymptomatic gallstones. Several studies (1– 4) over the past two decades have addressed the natural history of asymptomatic gallstones and have found that "silent" gallstones remain asymptomatic for long  periods of time. Only about 1 to 2% of patients per year with asymptomatic gallstones develop symptoms or complications requiring operative intervention, and the  risk of developing symptoms appears to plateau after about 15 to 20 years. Careful risk analysis using data from such studies and outcomes from operative therapy  indicate that, in general, the risk of simply observing patients with asymptomatic gallstones is equal to or less than that associated with prophylactic cholecystectomy,  and currently cholecystectomy is not recommended for most patients with silent gallstones. On the other hand, surgery is recommended for patients who have  symptoms caused by their gallstones.

  

Page 472

II—  Biliary Colic: The Most Common Sign of Gallbladder Disease A—  The Clinical Presentation of Biliary Colic Some patients present initially with a complication of their gallstones, such as acute cholecystitis, gallstone pancreatitis, or obstructive jaundice. However, three­ quarters of patients with gallstones present with attacks of pain, usually in the right upper quadrant or epigastrium, before a complication of gallstone disease occurs.  Patients with intermittent attacks of right­upper­quadrant abdominal pain and gallstones have symptoms due to gallstones and are said to have chronic cholecystitis.  Patients with symptomatic cholelithiasis are clear candidates for cholecystectomy, since the majority of symptomatic patients develop recurrent symptoms, and  symptoms will be severe enough in more than 5 to 10% of these patients per year to necessitate cholecystectomy. Moreover, patients with symptomatic gallstones are  at higher risk for development of complications of gallstones, such as acute cholecystitis, obstructive jaundice, gallstone­related pancreatitis, and cholangitis. Gallstones may also be responsible for mild, nonspecific gastrointestinal symptoms such as transient abdominal pain or discomfort, nausea, dyspepsia, and/or  flatulence. The latter symptoms are not specific for gallstones, since they may be caused by other gastrointestinal disorders, including gastroesophageal reflux disease,  peptic ulcer disease, and spastic colitis. Patients with mild, nonspecific symptoms are similar to patients with asymptomatic gallstones. They are unlikely to develop  more significant symptoms or complications and usually do not require operative therapy (1,3). Operative therapy for "mildly" symptomatic patients with gallstones  should be reserved for patients with frequent episodes without evidence of another cause after complete evaluation. Even with thorough evaluation, there is a high (10  to 50%) chance that cholecystectomy will not completely relieve the symptoms. Gallstones typically cause intermittent episodes of moderate to severe right­upper­quadrant and/or epigastric abdominal pain beginning 15 to 60 min after a meal.  These episodes of pain are commonly referred to as biliary colic, although the pain does not come in paroxysms, like those associated with renal calculi. Rather, the  pain is constant and unremitting. The attack of pain is often associated with a meal and sometimes with specific foods, including fatty, fried, and spicy foods or dairy  products. However, many patients are unable to identify a precipitating event. The pain is often quite severe and may bring the patient to an emergency room. It is  often associated with nausea and vomiting, and patients may feel relief after vomiting. Vomiting of bilious (bitter­tasting) material is commonly described. Vomiting  does not persist, as it does with intestinal obstruction; it usually subsides as the abdominal pain improves. In some patients, pain will not be localized to a specific  quadrant of the abdomen and may be felt as generalized abdominal pain in the upper or even the lower abdomen. Pain can sometimes radiate to the back or right  shoulder. Atypical symptoms from gallstones can mimic pain from acute hepatic disorders, peptic ulcers, reflux esophagitis, perforated viscus, bowel obstruction, and  even myocardial ischemia. Likewise, these disorders can cause symptoms that mimic gallstone disease. An episode of biliary colic typically lasts for 15 min to 1 h and rarely lasts longer than 3 to 4 h. If the episode lasts for more than 6 h, one should suspect a  complication of gallstone disease, such as acute cholecystitis, choledocholithiasis, or gallstone pancreatitis; otherwise another nonbiliary cause for the patient's  abdominal pain should be considered. Unremitting epigastric pain radiating to the center back is highly suggestive of choledocholithiasis or gallstone pancreatitis. True  colicky pain suggests renal calculi or early intestinal obstruction. Pain from a perforated peptic ulcer, perforated appendicitis, or diverticulitis usually becomes  generalized rapidly as peritonitis spreads throughout the abdominal cavity, and these disorders are associated with significant abdominal tenderness. Pancreatitis may  also cause diffuse abdominal pain and tenderness. Attacks of biliary colic occur randomly and are unpredictable. They may be separated by just a few days or by intervals of months or years. The frequency of attacks  is often quite

  

Page 473

stable in a given patient for long periods of time. However, patients who experience frequent attacks or an increase in the frequency or severity of their attacks are  likely to continue to experience symptoms, to develop more severe attacks, or to develop complications of gallstone disease. These patients are clear candidates for  prompt though elective operative intervention. B—  The Diagnosis of Chronic Cholecystitis in Patients with Biliary Colic Typical episodes of biliary colic are characteristic of and very specific for gallstone disease. The diagnosis can frequently be made on the basis of clinical history and  physical examination alone, although the presence of gallstones or signs of gallstone disease must be confirmed by ultrasound, cholescintigraphy, or x­ray studies  before treatment is undertaken. Episodes of biliary colic are rarely associated with fever or an elevated white blood cell count since the gallbladder is not acutely  inflamed during an attack of biliary colic. Physical examination shows mild to moderate tenderness in the right upper quadrant of the abdomen or epigastrium during an  attack, but the tenderness resolves as the pain subsides. Tenderness is never severe and peritoneal signs, such as percussion and rebound tenderness, are absent. If  fever, an elevated white blood cell count, significant tenderness, or peritoneal signs are present, a complication of gallstone disease or another diagnosis should be  considered (Table 1). Pathological changes in the gallbladder wall do not necessarily correlate with the type or degree of symptoms exhibited. Patients with symptoms of recent onset often  have marked chronic inflammation and fibrosis on microscopic examination when their gallbladders are removed, while patients with a long history of symptoms or  with severe symptoms may exhibit minimal pathological changes. Likewise, patients with increased white blood cell counts, fever, and edematous gallbladders at  operation clearly have acute cholecystitis but may have chronic, not acute changes on pathological examination. Preoperative clinical findings reliably predict  intraoperative and pathological findings, but the reverse is not necessarily true. The diagnoses of acute and chronic cholecystitis should be based on clinical  presentation and intraoperative findings rather than pathological diagnosis (5). C—  Causes of Biliary Colic The cause of biliary colic is not known, but it is hypothesized that the pain occurs when a gallstone becomes lodged in the cystic duct. Gallbladder distention and  contractions of the gallbladder in an attempt to eliminate the stone are thought to result in pain. The attack subsides when the stone becomes dislodged. In some  patients, small gallstones may actually pass through Table 1 Distinguishing Biliary Colic from Acute Cholecystitis

 

Biliary colic

Acute cholecystitis

Present

Present

Abdominal tenderness

Absent or mild

Moderate to severe (+) Murphy's sign

Fever

Absent or low­grade

Usually present

 White blood cell count (>11,000)

Absent

Usually present

Duration of symptoms

<4 h

>6 h

Ultrasound

Gallstones

Gallstones Wall thickening Ultrasound Murphy's sign

Radionucleotide cholescintigraphy

Gallbladder visualized  within 4 h

No visualization of the  gallbladder

  

R