Креатинфосфокиназный путь транспорта энергии в мышечных клетках

БИОЛОГИЯ КРЕАТИНФОСФОКИНАЗНЫЙ ПУТЬ ТРАНСПОРТА ЭНЕРГИИ В МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ В. И. КАПЕЛЬКО Московский государственный институт радиоэлектроники и автоматики (технический университет)

ВВЕДЕНИЕ

CREATINEPHOSPHATE KINASE ENERGY TRANSPORT IN MUSCLE CELLS V. I. KAPEL’KO

Main stages of the development of the “creatine phosphate shuttle” concept as an alternative way of transport in phosphate bonds in cells are discussed. Taking cardiomyocytes as an example, the crucial role of this route toward ensuring the fulfillment of the cardiac pump function is shown. Рассмотрены основные стадии формирования концепции “креатинфосфатного челнока” как альтернативного пути транспорта фосфатных связей в клетках. На примере сердечных клеток показана ведущая роль данного пути в обеспечении насосной функции сердца.

Функция всех клеток в организме зависит от адекватного энергообеспечения. Эта потребность особенно высока в таких интенсивно работающих органах, как головной мозг, сердце, почки, скелетные мышцы. Именно в тканях этих органов наряду с молекулами АТФ, являющимися субстратом для различных АТФаз, обнаружено высокое содержание креатинфосфата (Кф) – другого фосфорного соединения с макроэргической фосфорной связью. Молекулы Кф были идентифицированы даже несколько раньше, чем АТФ, и их роль казалась вполне понятной после обнаружения реакции Ломана (1934 год): АТФ + креатин

Кф + АДФ

(1)

или

H

CH3

ATФ +H N C N CH2 C O− NH2

O

Креатин

O− H

CH3

−

O P N C N CH2 C O− + AДФ O

NH2

O

© Капелько В.И., 2000

Креатинфосфат

8

www.issep.rssi.ru

Избыток АТФ, синтезируемого в клетке, используется ферментом креатинфосфокиназой (КФК) для запасания энергии в форме Кф, рассматриваемого таким образом как резервная форма запаса энергии в клетках. Такая точка зрения была доминирующей в течение десятилетий и до сих пор представлена в некоторых учебниках. Однако достижения биохимиков в 70-х годах потребовали пересмотра этой традиционной концепции, и после длительной дискуссии доминирующим стало представление о том, что Кф служит удобной формой не только запасания, но и транспорта энергии в клетках.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 1 , 2 0 0 0

БИОЛОГИЯ ТРАНСПОРТ ЭНЕРГИИ В КЛЕТКАХ Согласно традиционной концепции, реакция (1) должна находиться в состоянии кинетического равновесия и не должно существовать серьезных ограничений диффузии молекул внутри клеток. В таком случае ускоренное использование молекул АТФ, например в сократительном процессе, будет сопровождаться снижением концентрации АТФ, что создаст условия для протекания обратной реакции, то есть ресинтеза АТФ. При этом допускается, что высокие концентрации АТФ и Кф сохраняются именно вблизи сократительного аппарата. Однако в большинстве скелетных мышц, а также в сердечной мышце и нейронах головного мозга источником АТФ являются митохондрии. Хотя они расположены вблизи миофибрилл, но все же молекулы АТФ должны преодолевать определенный путь не только к миофибриллам, но и проникать внутрь них (рис. 1), а молекулы АДФ, в свою очередь, двигаться в обратном направлении. Скорость диффузии макромолекул в миоплазме зависит прямо от разницы концентраций и обратно от размеров молекул. Расчетная величина потока АТФ для сердечной мышцы определена как 35 мМ/мин/г, и эта величина примерно в 250 раз превышает измеренную скорость использования АТФ. Расчетная величина потока АДФ составляет 0,1 мМ/мин/г, что на 20% меньше измеренной скорости использования АДФ. Столь значительная разница скорости потока двух близких по размеру молекул обусловлена крайне низкой концентрацией свободного АДФ (порядка 0,04 мМ), обусловленной тем, что подавляющее большинство молекул АДФ находится в связанном состоянии. Поэтому по-

АТФ АДФ

АДФ АТФ Мх

Мф

Рис. 1. Схема части мышечной клетки, представляющая традиционную концепцию транспорта энергии – аденилатный путь. Молекулы АТФ (синие), синтезированные в митохондриях (Мх), диффундируют в глубь миофибрилл (Мф). После гидролиза АТФ миозиновой АТФазой образующиеся молекулы АДФ (голубые) диффундируют в обратном направлении (пунктирные линии)

ток АДФ от миофибрилл к митохондриям вряд ли может обеспечить высокую скорость использования энергии в сократительном аппарате. В отличие от этого коэффициент диффузии Кф и креатина примерно вдвое выше, чем АТФ, и скорость потока в связи с более высокими концентрациями этих соединений еще выше – 122 и 103 мМ/мин/г. Эти величины примерно на три порядка выше, чем для АДФ, что заведомо превышает максимальную скорость использования АТФ. Кроме того, АТФ и АДФ на пути диффузии могут легко связываться с различными белками – миозином и другими АТФазами, в то время как Кф и креатин являются субстратом только одного фермента – КФК. В биохимических исследованиях было обнаружено существование различных изоферментов КФК не только в разных органах, но и в одной и той же клетке. В частности, в мышечных клетках идентифицированы четыре изофермента – в митохондриях, миофибриллах, мембранах саркоплазматического ретикулума, а также в комплексе с мембранными транспортными белками. Наличие разных кинетических характеристик изоферментов в зависимости от их локализации позволило предположить, что в митохондриях преимущественно происходит прямая реакция, то есть превращение АТФ в Кф, а в местах использования энергии — обратная реакция. Такое предположение основано на допущении, что концентрации АТФ и креатина высоки вблизи митохондрий и низки вблизи миофибрилл. Этого не допускала традиционная концепция, постулировавшая равномерное распределение соединений по миоплазме. Данный постулат был подвергнут сомнению еще в 1966 году Бессманом и Фонио, допустившими существование отсеков, компартментов в клетке, в каждом из которых происходит либо прямая, либо обратная реакции. А вскоре традиционной концепции был нанесен серьезный удар, когда С. Гудбьярнассон и соавторы (1970 год) установили, что при ишемии (прекращении кровотока) сокращения сердца останавливаются через 1–2 мин, когда запасы АТФ снижаются всего лишь на 20%, а содержание Кф гораздо более значительно. Эти результаты заставляли допустить, что лишь небольшой запас АТФ в клетке может быть использован для сокращения, в то время как основной запас АТФ остается невостребованным. На основании этих данных стала утверждаться иная точка зрения на Кф, а именно ему стали приписывать транспортную функцию переноса фосфатных групп из митохондрий к миофибриллам. Молекула Кф выполняет таким образом роль челнока, позволяющего быстро и плавно пополнять расходуемые запасы АТФ без существенного повышения ее концентрации. Эту ситуацию С. Бессман образно назвал «беседой» между двумя изоэнзимами КФК. Общая схема данного представления дана на рис. 2.

К А П Е Л Ь К О В . И . К Р Е А Т И Н Ф О С Ф О К И Н А З Н Ы Й П У Т Ь Т РА Н С П О Р ТА Э Н Е Р Г И И В М Ы Ш Е Ч Н Ы Х К Л Е Т К А Х

9

БИОЛОГИЯ

АТФаза

Образованная в процессе окислительного фосфорилирования молекула АТФ переносится через внутреннюю мембрану митохондрий посредством специализированной молекулы – АТФ/АДФ-транслоказы, одновременно вносящей АДФ в матрикс митохондрий

ААТ

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ФУНКЦИИ МЫШЦ

Кф

АТФ

КФК КФК К Митохондрия

Миофибрилла

Рис. 2. Схема креатинфосфатного челнока между митохондрией и миофибриллой. Молекулы АТФ, образованные в реакциях окислительного фосфорилирования, выносятся из матрикса митохондрии молекулой АТФ/АДФ-транслоказы (ААТ) в межмембранное пространство, где одна фосфатная связь (синий кружок) улавливается молекулой креатинфосфокиназы (КФК) и переносится на креатин (К). Новообразованная молекула креатинфосфата (Кф) диффундирует к миофибрилле или другим участкам клетки, где расположены молекулы КФК. Миофибриллярный изофермент КФК переносит фосфатную связь на молекулу миозиновой АТФазы, где уже находится АДФ (два синих кружка), и молекула АТФ подвергается гидролизу, а освободившаяся молекула креатина возвращается к митохондрии

для рефосфорилирования. Попадая в межмембранное пространство, молекула АТФ улавливается близко расположенной молекулой КФК, и одна фосфатная связь переносится на креатин. Молекула образованного Кф свободно диффундирует в миоплазме, достигая мест локализации других изоферментов КФК, где фосфатная связь вновь переносится на имеющиеся вокруг молекулы АДФ. Чем интенсивнее происходит гидролиз АТФ, например в миофибриллах, тем большее количество молекул АДФ может служить акцепторами фосфатной связи, тем сильнее ускоряется распад Кф и освобождающийся креатин возвращается назад к митохондриям, стимулируя новообразование Кф. Концепция Кф-челнока позволяет успешно объяснить, почему Кф находится в столь высокой концентрации (в 2–4 раза выше, чем АТФ) в сердечной и красных скелетных мышцах, работающих или способных работать с высокой интенсивностью в течение длительного времени, почему при высокой интенсивности

10

функции содержание АТФ не меняется, а также почему при внезапной гипоксии или ишемии снижается сначала содержание Кф, а затем АТФ. Можно полагать, что сам креатинфосфатный путь транспорта энергии формируется в онтогенезе под влиянием значительного повышения уровня функции. Так, известно, что в сердце плода имеется только аденилатный путь транспорта, то есть транспорт АТФ, а Кф-путь возникает только после рождения, когда резко возрастает нагрузка на сердце. У многих беспозвоночных функцию Кф выполняет другой фосфаген – аргининфосфат.

По мере утверждения данной концепции в среде биохимиков к ней стали проявлять интерес и физиологи, старавшиеся внести свою лепту в дискуссию. Первые обнадеживающие данные были получены на препаратах изолированных миофибрилл, когда оказалось, что их расслабление в присутствии Кф происходит быстрее и полнее, чем при наличии высокой концентрации АТФ. Это хорошо согласовалось с наличием диффузионных ограничений для АТФ и существованием в миофибриллах изофермента КФК. Известно, что при недостаточном рефосфорилировании АДФ в миофибриллах возникает контрактура – состояние повышенной упругости, обусловленное неразмыканием части актомиозиновых связей. Функциональные исследования концепции транспорта энергии на изолированных мышцах или сердцах затруднены в связи с необходимостью поиска адекватных подходов для воздействия на тот или иной вид транспорта. Были отработаны два приема, снижающие креатинкиназный поток, – ингибирование активности КФК в условиях острого опыта, а также снижение содержания креатина в клетках в хроническом опыте. Для снижения активности КФК применяли неспецифический ингибитор иодацетамид (0,5 мМ), который помимо почти полного подавления активности КФК (до 1%) ингибировал также активность ферментов гликолиза, хотя в значительно меньшей степени, но не влиял на окислительное фосфорилирование. Действие иодацетамида сопровождалось умеренным снижением как АТФ, так и Кф на 31 и 44% соответственно [1]. Сократительную функцию изолированного сердца крыс оценивали в двух режимах: изоволюмическом, когда левый желудочек при сокращении создавал давление в баллончике постоянного объема, введенном в его полость, и в естественном режиме, когда желудочек наполнялся перфузатом из левого предсердия и изгонял его в аорту. Первый режим позволял оценить способность миокарда к развитию силы, а второй – к выполнению насосной функции, зависевшей от всех основных свойств сердца: растяжимости, сократимости и расслабимости.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 1 , 2 0 0 0

БИОЛОГИЯ После добавления к перфузату иодацетамида способность сердец развивать давление в изоволюмических условиях сохранялась, но они оказались неспособными к выполнению насосной функции (рис. 3). Эти результаты позволяли предполагать нарушение процессов расслабления и растяжения сердца. Действительно, диастолическое давление в левом желудочке сердец, обработанных иодацетамидом, возрастало значительно круче даже при меньшей степени наполнения сердца (рис. 4). Следствием недостаточного наполнения левого желудочка является и недостаточное растяжение мышечных волокон, что ограничивает как развитие давления, так и выброс жидкости из желудочка. Этот результат согласуется с упомянутыми выше опытами на изолированных миофибриллах. В тех же условиях опыта была проведена оценка деятельности сердца после ингибирования не креатинфосфатного, а аденилатного пути транспорта. Это достигалось применением 2-деоксиглюкозы (ДОГ), останавливающей гликолиз на уровне глюкозо-6-фосфата и создающей так называемую фосфатную ловушку. Вследствие прогрессирующего дефицита фосфата содержание АТФ снижалось примерно в три раза, в то время как содержание Кф снижалось всего на треть. Соответственно на 30% уменьшалась интенсивность потока через креатинфосфокиназу. После обработки ДОГ сердца были способны осуществлять насосную функцию, максимальный уровень Сердечный выброс, мл/мин 50

40

Контроль

30 ДОГ 20

10 ИАА 0

5 10 15 20 25 ДН, см водного столба

Рис. 3. Насосная функция изолированного сердца крыс при действии иодацетамида (ИАА) или 2-деоксиглюкозы (ДОГ). Результаты получены в группах из 7–10 опытов и представляют собой средние величины и их средние ошибки. Увеличение давления наполнения (ДН, см водного столба) усиливает приток к левому желудочку, и в результате возрастает сердечный выброс (СВ) в группах контроля и ДОГ, а в группе ИАА выброс практически отсутствует

КДД, мм рт. ст. 16 12

8

4 0 0,08

0,16 0,24 0,32 Объем наполнения ЛЖ, мл

Рис. 4. Влияние иодацетамида на растяжимость изолированного сердца крыс. Характеристика растяжимости получена во время объемной нагрузки на сердце (см. рис. 3) и представляет собой соотношение между степенью наполнения сердца и конечнодиастолическим давлением (КДД) в левом желудочке, отражающим упругость миокарда. Данные представляют собой средние величины из 8–10 опытов и их средние ошибки. Сдвиг кривой вверх и влево под влиянием иодацетамида (квадраты) характеризует снижение растяжимости

которой был снижен всего на 30% (см. рис. 3), а максимальная работа – на 20%. В изоволюмических условиях различий с контрольной группой не было отмечено. Сравнение этих результатов показывает, что ингибирование креатинфосфатного пути транспорта энергии посредством иодацетамида сопровождается значительно более глубокой депрессией насосной функции сердца, чем ингибирование аденилатного пути транспорта посредством ДОГ. В первом случае, при доминировании аденилатного пути, сократительная функция сердца остается неизменной только в изоволюмических условиях (при постоянной степени растяжения) и невысоком уровне функции. В этих условиях энергетический запрос миофибрилл, по-видимому, может вполне быть удовлетворен прямой диффузией АТФ, поскольку сниженная скорость потока через КФК все же выше, чем скорость гидролиза АТФ. Однако даже в этих условиях насосная функция сердца резко нарушена из-за неполного расслабления и ухудшенного наполнения сердца. Во втором случае, при доминировании креатинфосфатного пути, умеренно сниженная скорость потока через КФК заведомо превышает скорость гидролиза АТФ, и энергоснабжение миофибрилл оказывается достаточным для поддержания нормальной расслабимости и растяжимости сердца. Это позволяет полагать, что креатинфосфокиназная система является жизненно необходимой для осуществления полного расслабления миофи-

К А П Е Л Ь К О В . И . К Р Е А Т И Н Ф О С Ф О К И Н А З Н Ы Й П У Т Ь Т РА Н С П О Р ТА Э Н Е Р Г И И В М Ы Ш Е Ч Н Ы Х К Л Е Т К А Х

11

БИОЛОГИЯ брилл и их адекватного растяжения в диастоле, а также для поддержания высокой работоспособности сердца. Другой подход к оценке функционального значения Кф-пути был основан на применении β-гуанидинпропионата (ГП) – конкурентного ингибитора транспорта креатина в клетки. Добавление его к пищевому рациону крыс в течение нескольких недель сопровождалось значительным снижением содержания креатина в мышцах и сердце до 5–10%. Поскольку ГП лишь в ограниченной степени мог заменить креатин в качестве акцептора фосфата, указанная ситуация значительно ослабляла функцию Кф-челнока. Первые исследования в 1984–1985 годах на изолированных сердцах или выделенных из них папиллярных мышцах показали, что максимальный уровень функции сохранялся таким же, как и в контрольной группе, что позволило авторам поддержать тех биохимиков, которые отвергали концепцию Кф-челнока. Однако более поздние исследования показали неправомерность такого заключения. Действительно, было обнаружено, что, несмотря на девятикратное снижение содержания Кф после шестинедельного добавления к пище ГП, работа сердца в изоволюмических условиях не изменялась [2]. Скорость потока через КФК составляла около 50% контрольной величины, то есть даже при низком уровне Кф скорость ресинтеза АТФ была достаточной для восполнения энергорасхода при данной нагрузке. Однако при максимальной нагрузке на сердце его работа и поглощение кислорода оказались на 30% ниже контрольного уровня. Как и при действии иодацетамида, снижение насосной функции было связано с недостаточным наполнением ЛЖ и растяжением мышечных волокон. Подобное снижение максимальной работоспособности было отмечено при исследовании функции медленных скелетных мышц животных с дефицитом креатина. Таким образом, как в острых, так и в хронических опытах было установлено, что искусственно вызванное снижение потока через КФК неизбежно сопровождается снижением максимальной работоспособности сердца и медленных скелетных мышц. Степень этого снижения примерно соответствовала степени уменьшения креатинкиназного потока. Значительное его снижение при ингибировании функции КФК в острых опытах сопровождалось развитием острой сердечной недостаточности. В хроническом опыте, при меньшей степени снижения потока и мобилизации некоторых компенсаторных факторов, нарушалась лишь максимальная работоспособность. Дальнейшие исследования позволили выявить некоторые компенсаторные возможности кардиомиоцитов, которые могли быть мобилизованы при умеренном и длительном ограничении поступления креатина в миокард молодых животных. Замедление скорости обра-

12

зования и распада актомиозиновых связей в миофибриллах сочеталось со снижением АТФазной активности миозина, что означает снижение потребления энергии. Одновременно развивалась гипертрофия миокарда, необходимая для поддержания прежнего уровня сократительной функции сердца. Близкие к этим данные были получены при клинических обследованиях людей с сердечной патологией: оказалось, что гипертрофия сердца у людей сочетается со сниженной КФК-активностью. Креатинфосфокиназный путь транспорта имеет важное значение не только для сократительной активности сердца, но и для обеспечения энергией работы мембранных насосов и синтеза белка. В опытах с использованием ядерно-магнитного резонанса было показано, что поток через КФК усиливается при растяжении даже несокращающегося изолированного сердца. В целом функциональные исследования подтвердили концепцию КФ-челнока, сформулированную биохимиками, и позволили полагать, что функциональное значение креатинфосфокиназного пути транспорта состоит в эффективной трансляции высокого отношения АТФ/АДФ, существующего в межмембранном отсеке митохондрий, к миофибриллам, мембранным ионным насосам и другим местам использования энергии в клетках. Ограничение роста АДФ при функциональных нагрузках предохраняет запас АТФ от распада с образованием АМФ и аденозина, что имеет место при гипоксии. Одновременно происходит закономерное накопление АДФ в миофибриллах, повышается их ригидность, затрудняющая наполнение сердца, падает его насосная функция. Сопоставление данных о сравнительном ингибировании двух путей транспорта энергии позволяет заключить, что креатинфосфокиназный путь является основным для энергоснабжения миофибрилл миокарда и поддержания нормальной насосной функции сердца. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Капелько В.И., Куприянов В.В., Новикова Н.А. и др. Функциональное значение двух путей транспорта энергии в кардиомиоцитах // Кардиология. 1992. № 32 (4). С. 71–74. 2. Капелько В.И., Куприянов В.В., Новикова Н.А. и др. Механизмы приспособления сократительной функции и энергетического метаболизма сердца к условиям хронического дефицита фосфокреатина // Физиол. журн. 1988. № 34 (1). С. 3–11.

Рецензент статьи А.Н. Тихонов *** Валерий Игнатьевич Капелько, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории экспериментальной патологии сердца Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ. Область научных интересов – сократительная функция сердца и ее энергообеспечение в норме и при заболеваниях сердца. Автор 240 статей и одной монографии.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 1 , 2 0 0 0