Введение в прикладную биотехнологию

Камчатский государственный технический университет

Кафедра технологии рыбных продуктов

М.В. Ефимова

ВВЕДЕНИЕ В ПРИКЛАДНУЮ БИОТЕХНОЛОГИЮ Рекомендовано Дальневосточным региональным учебно-методическим центром в качестве учебного пособия для студентов направления 655900 «Технология сырья и продуктов животного происхождения» специальности 271000 «Технология рыбы и рыбных продуктов» вузов региона

Петропавловск-Камчатский 2004

УДК 573.6.086.83 ББК 30.16 Е91 Рецензенты: Н.Г. Клочкова, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией альгологии Камчатского отделения Тихоокеанского института географии (КО ТИГ ДВО РАН) Т.И. Кузякина, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник Научно-исследовательского геотехнологического центра (НИГТЦ ДВО РАН)

Ефимова М.В. Е91

Введение в прикладную биотехнологию: Учебное пособие для студентов направления 655900 «Технология сырья и продуктов животного происхождения» специальности 271000 «Технология рыбы и рыбных продуктов». – Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2004. – 95 с. ISBN 5–328–00060–9 Учебное пособие «Введение в прикладную биотехнологию» разработано в соответствии с рабочей программой по дисциплине «Основы биотехнологии» для студентов специальности 271000 «Технология рыбы и рыбных продуктов». УДК 573.6.086.83 ББК 30.16

ISBN 5–328–00060–9

© КамчатГТУ, 2004 © Ефимова М.В., 2004

2

ВВЕДЕНИЕ Цель изучения дисциплины «Основы биотехнологии» – приобрести знания в области использования культур клеток бактерий, дрожжей, животных и растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. Основная задача изучения дисциплины – подготовка на современном уровне инженеров-технологов, знакомых с новейшими нетрадиционными, ресурсосберегающими технологиями получения биологически активных веществ, кормовых продуктов, продуктов питания. Для изучения дисциплины «Основы биотехнологии» студентам необходимы знания по таким дисциплинам, как «Неорганическая химия», «Физическая и коллоидная химия», «Органическая химия», «Биохимия», «Биология и микробиология». Изучение дисциплины включает изучение следующих разделов: 1. История возникновения и развития биотехнологии как науки. 2. Культивирование микроорганизмов. 3. Методы биотехнологии. 4. Производство ферментов, этилового спирта, биогаза. 5. Производство пластмасс, текстильных изделий, электроники. 6. Производство пищевых продуктов. 7. Производство белка одноклеточных организмов. 8. Производство токсинов сине-зеленых водорослей. 9. Биотехнология и экология. В процессе изучения дисциплины применяются такие формы контроля знаний студентов, как контрольная работа, экспресс-контроль, аттестация текущей успеваемости, зачет.

3

1. ИСТОРИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И РАЗВИТИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ КАК НАУКИ Биотехнология – использование культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ, т. е. применение биологических процессов и систем в производстве. Исторически биотехнология возникла на основе традиционных микробиологических (в основном бродильных) производств. Многие подобные «технологии» осознанно применялись еще в древности при получении вина, пива, хлеба. Дальнейшее развитие этих традиционных биопроизводств было связано с успехами в области биохимии и других наук биологического цикла. Более чем 6000 лет назад в Двуречье уже владели искусством пивоварения. После увлажнения ячмень проращивали. Из проросших зерен выпекали «пивные хлебцы», измельчали их и заливали водой. Жидкость отделяли от твердого осадка и разливали в глиняные сосуды, которые хранили затем в закупоренном состоянии. Вскоре из жидкости в сосудах поднимались пузырьки газа, т. е. жидкость начинала бродить. Преемникам культуры Двуречья, вавилонянам, было известно уже более 20 различных сортов пива. Умели варить пиво и древние египтяне. Осирис, бог земли и плодородия, одновременно почитался ими как бог пива. Египтяне уже знали, что брожение наступит скорее, если добавить отстой удачно сваренного пива. Естественно, они и не подозревали, что брожение обусловлено живыми организмами – дрожжами. Желтые шарики дрожжевых клеток сумел отыскать под микроскопом Энтони Ван Левенгук (1632–1723 гг.). К этому времени дрожжи уже употребляли в концентрированном и очищенном виде как для хлебопечения, так и для пивоварения и для получения вина. В современном пивоварении основные процессы остались те же, что и много тысяч лет назад, только прежде люди использовали работу микроорганизмов неосознанно. Пивоварение, виноделие, хлебопечение, сыроварение, производство уксуса, квашение капусты – это процессы, которыми человек более или менее хорошо владел в течение тысячелетий. Да и сушка мяса, рыбы и овощей, копчение и засолка также относятся к способам предохранения пищевых продуктов от порчи, только здесь упор делается на то, чтобы не допустить развития вредных микроорганизмов, тогда как, к примеру, при приготовлении вина необходимо, чтобы происходило размножение полезных микроорганизмов – дрожжей. Считается, что хлебопечение было «изобретено» позднее пивоварения. Вначале людям был известен только плотный пресный хлеб. Лишь примерно около 6000 лет назад древнеегипетские пекари стали 4

выпекать пористый хлеб из заквашенной мучной кашицы. Это кислое тесто содержало многочисленные пузырьки газа, возникшие в результате брожения. Тесто выпучивалось и становилось рыхлым. При выпекании брожение прекращалось, так как высокая температура в печи убивала клетки дрожжей. Образующийся при брожении спирт улетучивался, и в выпеченном тесте оставались только порообразные пустоты. Когда человек начал приручать овец, коз и крупный рогатый скот и получать от своих домашних животных молоко, то он познакомился и с кислым молоком, которое возникало «само по себе», когда свежее молоко стояло в течение некоторого времени. Правда, кипяченое молоко «портилось» не столь быстро, это было уже известно из накопленного опыта. Из кислого молока путем отделения более плотных компонентов получали творог, из творога готовили сыр. Очень скоро люди подметили, что сыр был значительно лучшего качества, если к молоку добавляли субстанцию из желудков молочных телят – сычуг. Сычуг обладает способностью свертывать молочный белок, при этом плотные компоненты молока очень быстро склеиваются в комки и становятся намного плотнее, чем при обычном скисании. После отделения сыворотки полученный таким способом творог перемешивали с солью и разрезали на куски. При получении мягких сыров предусматривали, чтобы на поверхности сырной массы росли плесневые грибы. С давнего времени в сыроварнях маленьких французских селений Камамбер и Рокфор культивируются и используются особые плесени, благодаря которым там получают сорта сыров, названия которых связаны с местом их изготовления. Сыры уплотняются с помощью сырных прессов; твердые сорта более легкие, чем мягкие. При изготовлении твердых сыров плесени добавляют прямо в сырную массу, и тогда плесень растет не только на поверхности, но и в объеме головки сыра. Для «вентилирования» в сырной массе прокалывают острой палочкой тонкие каналы. Еще одно древнейшее биотехнологическое «производство» – квашение капусты с целью сделать ее пригодной для длительного хранения. Точно также в сельскохозяйственном производстве заквашивают зеленый корм на зиму, при этом образуется лежкоспособный силос. Все перечисленные процессы связаны с брожением, эти способы применялись человеком на протяжении тысячелетий. Накопленный опыт передавался из поколения в поколение, хотя человеку было еще совершенно ничего неизвестно о причинах брожения и о том, как оно осуществляется. И только в XIX в. французский ученый Луи Пастер разогнал мрак неизвестности. Тем самым он заложил основы сознательного управления технологическими процессами, в которых микроорганизмы являются «главными работниками». Луи Пастер считается одним из отцов современной биотехнологии. 5

Современная биотехнология далеко ушла от той науки о живой материи, которая рождалась в середине прошлого века. Успехи молекулярной биологии, генетики, цитологии, химии, биохимии, биофизики электроники позволии получить новые сведения о процессах жизнедеятельности микроорганизмов. В 1984 г. на Третьем съезде Европейской ассоциации биотехнологов в Мюнхене голландский ученый Е. Хаувинк разделил историю биотехнологии на пять периодов. Их характеристика приведена в табл. 1. Таблица 1 Период 1 Допастеровский период (до 1865 г.) Послепастеровский период (1866–1940 гг.) Период антибиотиков (1941 – 1960 г.г.)

Период управляемого биосинтеза (1961–1975 гг.)

Период новой биотехнологии (после 1975 г.)

Характеристика периода 2 Использование спиртового и молочнокислого брожения при получении пива, вина, хлебопекарных и пивных дрожжей, сыра, получение ферментированных продуктов и уксуса Производство этанола, бутанола, ацетона, глицерола, органических кислот и вакцин. Аэробная очистка канализационных вод. Производство кормовых дрожжей из углеводов Производство пенициллина и других антибиотиков путем глубинной ферментации. Культивирование растительных клеток и получение вирусных вакцин. Микробиологическая трансформация стероидов Производство аминокислот с помощью микробных мутантов. Получение чистых ферментов. Промышленное использование иммобилизованных ферментов и клеток. Анаэробная очистка канализационных вод и получение биогаза. Производство бактериальных полисахаридов Использование генной и клеточной инженерии в целях получения агентов биосинтеза. Получение гибридов, моноклональных антител, трансплантация эмбрионов

Современная биотехнология оказывает огромное влияние на все аспекты практической деятельности человека. С ее помощью в настоящее время получают десятки дорогостоящих биологически активных веществ (гормоны, ферменты, витамины, антибиотики, некоторые лекарства). Огромна роль биотехнологии в медицине. Здесь благодаря применению генной инженерии, позволяющей «встраивать» чужие гены в клетки-продуценты, удается производить такие ценнейшие вещества, как человеческий инсулин, интерфероны и др. 6

Важное значение имеет биотехнология в экологизации промышленных производств на основе создания безотходных процессов; биотехнологические методы применяются для очистки воды; биологические методы подавления вредителей сельскохозяйственных культур уверенно вытесняют химические инсектициды. Благодаря биотехнологии разработаны и внедрены энерго- и ресурсосберегающие производства. Биотехнологические процессы являются базой для получения кормового и пищевого белка. Биотехнологическим способом получают возобновляемые источники энергии. Дальнейший прогресс человечества связывают с широким применением во всех сферах жизни электроники и биотехнологии. Продукты биотехнологической промышленности можно условно разделить на крупнотоннажные (этиловый спирт, дрожжи, органические кислоты, фруктозные сиропы) и медикаменты, аминокислоты, гормоны и другие продукты тонкого микробного синтеза.

2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ 2.1. СТРОЕНИЕ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ Микроорганизмы, применяемые в биотехнологии, принадлежат к разным таксонометрическим группам (бактерии, сумчатые грибы, фикомицеты, актиномицеты и др.) и существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, по способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т.д. Наиболее широко используемыми микроорганизмами являются дрожжи, бактерии и микромицеты. Из более чем 100 тысяч известных видов микроорганизмов в промышленности используют около 100 видов, к которым принадлежат несколько тысяч штаммов. Из всех микроорганизмов, пожалуй, лучше всего изучена кишечная палочка Escherichia coli (рис. 1). Она открыта венским врачом Теодором Эшерихом. Кишечные палочки в ограниченных количествах населяют органы пищеварения животных и человека и даже снабжают своих «хозяев» витаминами, которые они могут синтезировать из сахаров.

7

Рис. 1. Схематическое строение клетки Escherichia сoli: 1 – клеточная стенка; 2 – жгутики; 3 – рибосомы; 4 – запасные питательные вещества; 5 – плазмиды; 6 – нуклеотид

Ширина клетки E. сoli составляет около 1 мкм, длина – около 2 мкм. Стенки колибактерии образованы оболочкой, состоящей из деревянистых и жироподобных веществ. В стенках расположены маленькие запирающие поры, окруженные кольцами из белковых тел, и большое количество канальцев. Через эти отверстия пищевые вещества из питательной среды поступают во внутренний объем клетки. Снаружи клетка покрыта слизистой массой, из которой выступают длинные жгутики, которые непрерывно вращаются и продвигают бактерию. Клетка заполнена цитоплазмой. В цитоплазме находится около 200 млн. молекул сахаров. В накопительных отсеках клетки сахара отлагаются в форме крахмала. Кроме того, в цитоплазме около 30 млн. молекул аминокислот и 25 млн. молекул липидов. Из трех главных «строительных блоков» – сахара, аминокислоты и жира – построены почти все вещества клетки. Всего в одной клетке содержится около 1 млн. молекул белков, причем около 5000 из них – это белковые молекулы различных типов: фибриллярные, транспортные, ферменты. Бактерии принадлежат к группе прокариот (доядерных), у которых, в отличие от эукариот (ядерных), ядра как такового нет. Оно может быть представлено в виде аналога – нуклеотида, или ядерное вещество просто диффузно распределено в протоплазме. Главные функции ядерного вещества – хранение информации и передача информации дочерним клеткам при репликации. В бактериальных клетках и в клетках низших эукариот присутствуют плазмиды – кольцевые двухспиральные молекулы ДНК длиной от 8

нескольких тысяч до ста тысяч пар оснований. Носителем генетической информации у большинства живых существ является дезоксирибонуклеиновая кислота, только у некоторых бактериальных вирусов и вирусов животных генетическая информация закодирована в рибонуклеиновой кислоте. Плазмиды играют важную роль в обмене генетической информацией между клетками микроорганизмов. 2.2. МЕТАБОЛИЗМ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ Метаболизм – это вся сумма целенаправленных реакций, протекающих под действием ферментных систем клетки, которые регулируются различными внешними и внутренними факторами. Метаболизм обеспечивает все жизненные процессы в клетке в зависимости от среды обитания. В результате метаболизма происходит увеличение размеров клетки, ее деление. Обмен веществ клетки происходит тремя центральными метаболическими путями: – из внешней среды в клетку поступает энергия либо в виде химической энергии органических веществ, либо в виде энергии солнечного света; – из веществ питательной среды, перенесенных в клетку собираются «строительные блоки», которые формируют биополимеры клетки и синтезируют макромолекулы белков, нуклеиновых кислот, углеводов, жиров и других клеточных компонентов; – в клетке происходят постоянные синтез и разрушение биополимеров, выполняющих различные специфические функции. Сверхсинтез, т. е. способность микроорганизма синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Обмен веществ у микроорганизмов можно рассматривать как сумму катаболизма и анаболизма. Катаболизм – это ферментативное расщепление крупных органических молекул с выделением свободной энергии. Анаболизм – это построение новых биополимеров клетки из простых соединений с поглощением энергии (рис. 2). В результате этих двух параллельно протекающих процессов строится «тело» клетки, накапливаются необходимые клеткам запасные вещества, ферменты и промежуточные продукты обмена веществ. Таким образом, обмен веществ слагается в клетке из конструктивного и энергетического обменов. 9

Катаболизм и анаболизм – это два самостоятельных пути в обмене веществ, но отдельные их участки могут быть общими. Такие участки называют амфиболическими. В катаболических и анаболических процессах биохимические реакции следуют друг за другом в строжайшей последовательности, так как продукты реакции предыдущей стадии процесса, как правило, являются субстратом для протекания последующей стадии. Такая четкая преемственность возможна благодаря высокой специфичности ферментов, участвующих в обмене веществ. Скорость протекания метаболических процессов зависит от состава питательной среды, от условий культивирования. Интенсивный обмен веществ между клеткой и средой обеспечивается большой поверхностью тела микроорганизма, через которую происходит поступление питательных веществ и выделение в окружающую среду продуктов обмена. На метаболизм клетки оказывают влияния изменения рН среды, концентрация субстрата, содержание продуктов метаболизма в среде и другие факторы культивирования. Регулирование метаболизма в клетке является очень сложным процессом.

Рис. 2. Схема метаболизма микробной клетки

10

2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для микробиологической биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ, включая первичные и вторичные продукты фотосинтеза. Но каждый конкретный вид микроорганизмов, используемый в биотехнологии, весьма избирателен к питательным веществам, и органическое сырье (кроме лактозы, сахарозы и крахмала) без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Потребность в тех или иных веществах определяется физиологическими особенностями данного вида микроорганизмов, но во всех случаях среда должна представлять собой водный раствор этих веществ и обеспечивать приток их в клетку в определенном количестве. Ориентировочный состав питательной среды можно определить на основе состава клеточного вещества микроорганизмов. В табл. 2 приведен усредненный элементарный состав биомассы некоторых микроорганизмов: Таблица 2 Химический состав микробной клетки С N2 O2 H2 Р2O5 K2O SO3 Na2O MgO CaO Fe2O3 SiO3

Состав биомассы, % сухого вещества Бактерии

Дрожжи

Грибы

50,4 12,3 30,5 6,8 4,95 2,41 0,29 0,07 0,82 0,89 0,08 0,03

49,8 12,4 31,1 6,7 3,54 2,34 0,04 – 0,42 0,38 0,03 0,09

47,9 5,2 40,2 6,7 4,85 2,81 0,11 1,12 0,38 0,19 0,16 0,04

Кроме приведенных в табл. 2 элементов и соединений в состав клеток всегда входят микроэлементы: В, Мо, Mn, Zn, Cu, Br, J, Co, необходимые микроорганизмам для образования ферментов и витаминов. Обычно микроэлементы вносят в среду вместе с водопроводной водой. Микроорганизмы используют питательные вещества среды не только на построение клеточного вещества, но и на обеспечение энергией всех биохимических превращений в клетке. 11

В процессе роста культуры состав среды меняется, это оказывает влияние на развитие культуры и ее биосинтетическую способность. Часто сырьем для выращивания микроорганизмов служит материал, который они не в состоянии использовать без предварительной подготовки (целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, пектин и т. д.). В этих случаях для приготовления питательной среды биополимеры предварительно гидролизуют ферментативным или химическим способом до получения усвояемой формы. Наибольшее значение среди веществ питательной среды имеет углерод. Он входит в состав почти всех органических соединений клетки: аминокислот, белков, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов. Большинство микроорганизмов, применяемых как продуценты белков и аминокислот, в качестве источника углерода используют органические вещества. Клетки сине-зеленых водорослей используют диоксид углерода. Непосредственным источником углерода могут быть углеводы несложного строения: гексозы, пентозы, низкомолекулярные олигосахариды, органические кислоты, спирты, жирные кислоты, легкие и тяжелые углеводороды и др. Азот микроорганизмы усваивают только в виде неорганических солей, кислот, органических соединений. Незначительный недостаток азота в питательной среде приводит к «ожирению» клеток, т. е. к повышению содержания в них липидов за счет уменьшения белковой и аминокислотной фракции. Поэтому в производственных условиях при получении обогащенных белком кормовых дрожжей следят за тем, чтобы в среде не было недостатка азота. Источниками фосфора являются соли фосфорной кислоты. Их вносят в среду с различными естественными субстратами (отварами растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом), реже – с синтезированными соединениями (фитин). В клетке фосфор входит в состав АТФ, АДФ, АМФ, обеспечивая энергетический и конструктивный обмен. Состав питательной среды для каждого продуцента устанавливают экспериментально. Это трудоемко и требует глубоких знаний физиологии микроорганизма. Для обеззараживания питательных сред применяют дезинфекциию, воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовое облучение, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.). Состав среды и оптимальные режимы определяют двумя способами: длинным многостадийным эмпирическим подбором и использованием математических методов планирования эксперимента. Первый способ является самым распространенным в настоящее время. 12

2.4. МЕТОДИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Высокопродуктивные штаммы микроорганизмов по большей части так чувствительны и так «избалованы» биотехнологами, что они просто не в состоянии выжить в нормальных условиях. Например, плесневому грибу-суперпроизводителю его необыкновенная способность производить в 1000 раз больше пенициллина по сравнению с его диким предком не приносит никакой пользы, это не его решение в борьбе за жизнь. Он принуждается к «сверхпроизводительности» человеком, который изменяет его наследственную природу и условия существования. Поэтому только в искусственно созданных условиях, при «комфортных» температурах, с избытком предпочитаемого питания, оберегаемые от природных конкурентов и врагов, такие микроорганизмы способны существовать и служить производителями. Путем тщательной селекционной работы получают высокопродуктивные штаммы микроорганизмов для производства определенного вещества, например пенициллина, подбирают также оптимальную питательную среду. Селекционируя любой живой организм, опираются на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы как объект селекции имеют ряд особенностей: – выращивание микробной культуры из одной клетки приводит к образованию клона, имеющего генетическую однообразность, но клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счет естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами; – большинство микроорганизмов имеют один экземпляр хромосом, поэтому у них нет изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов; – селекцию клеток можно вести только вегетативным путем, так как они не способны к половому размножению; – возможностей для отбора положительных экземпляров при селекционировании микроорганизмов больше, так как микроорганизмы отличаются исключительно быстрой сменой поколений. По определению Л.И. Воробьевой (1987 г.), промышленный штамм должен соответствовать следующим требованиям: – расти на дешевых и доступных субстратах; – обладать высокой скоростью роста биомассы и давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата; – проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов; 13

– быть устойчивым к фагам и другой посторонней микрофлоре; – быть безвредным для людей и для окружающей среды; – целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата. Процесс выращивания микроорганизмов проводят в две стадии: – получение чистой культуры посевного материала; – выращивание микробных масс в промышленных биореакторах. Посевной материал – чистая культура микроорганизмов, которая получается путем ее последовательного асептического пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема. Приготовление посевного материала производится по следующим ступеням выращивания: – в условиях лаборатории; – в малом посевном аппарате; – в большом посевном аппарате; – в малом ферментаторе (биореакторе); – в промышленном ферментаторе (биореакторе). 2.4.1. Подготовка посевного материала в лабораторных условиях В условиях лаборатории главной задачей является необходимость сохранить исходный штамм в неизменном состоянии. Споры микроорганизмов – наилучшая форма сохранения их исходного штамма. Однако при длительном хранении культуры могут возникнуть спонтанные нерегулируемые мутации. Наиболее распространенный способ поддержания жизнедеятельности культур – периодические пересевы продуцента на свежие питательные среды. Необходимо не только периодически проводить рассев культуры, но и осуществлять проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам. При рассеве из колонии, давшей наилучшие показатели на диагностирующей среде, делают новый рассев в 30–40 пробирок. Затем из каждых 5–6 пробирок отбирают одну и проверяют находящиеся в ней микроорганизмы на способность образовывать то вещество, продуцентом которого они являются. Проведение такой непрерывной селекции позволяет сохранить в активной форме исходящую культуру продуцента. Однородный штамм микроорганизмов высевают в пробирки, выращивают до определенного возраста в оптимальных условиях, а затем перемещают в холодильник при температуре 3–4ºС. Пересевы культур производят через определенные промежутки времени. Длительные паузы между пересевами недопустимы, так как при этом истощается и сохнет среда, сказывается отрицательное влияние метаболитов, возможны мутации. 14

Однако при многократных пересевах увеличивается возможность потери активности продуцента, поэтому любой продуцент лучше хранить в консервированном виде. Для длительного хранения ряда штаммов часто используют крахмальные среды. Более длительное время можно хранить культуру под слоем стерильного, химически чистого вазелинового масла. Хранят культуры при температуре –14 … –11ºС с пересевами через 10–16 месяцев. Грибные и дрожжеподобные культуры хранят в 10%-ном растворе глицерина в запаянных ампулах в атмосфере жидкого азота при температурах –196 … –165ºС. Эти культуры даже через 5 лет сохраняют свои физиолого-биохимические свойства. В настоящее время самый распространенный способ сохранения микробных культур – лиофилизация. Она заключается в том, что вода при пониженном атмосферном давлении испаряется из замороженного материала, превращаясь в пар, минуя жидкое состояние. В целях увеличения выживаемости вегетативных клеток микробов перед лиофилизацией их, как правило, помещают в защитные среды (стерильную бычью сыворотку, лошадиную сыворотку, смесь 10%-ного раствора сахарозы и 1%-ного раствора желатина). Защитные среды, очевидно, регулируют осмотическое давление клетки при высушивании. Микроорганизмы помещают в стерильные ампулы, закрывают стерильными ватными тампонами и быстро замораживают при температуре –78 … –35ºС, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате при температуре 20 – 22ºС и остаточном давлении 10 Па в течение 25–30 ч, после чего ампулы запаивают и хранят до 5–6 лет. Штаммы можно хранить в стерильной почве. Часто хранят штаммы на распаренном зерне (пшене). В этом случае 100 г пшена кипятят в течение 30 мин с 80 см3 воды, высыпают на чистый стол и разбивают комки. Остывшие зерна по 15–16 г засыпают в стерильные флаконы вместимостью 250 см3, закрывают ватной пробкой и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 40 мин. На стерильное распаренное пшено наносят 2 см3 густой взвеси спор или 3 см3 вегетативной биомассы продуцента. Микроорганизмы выращивают при периодическом встряхивании при температуре 25–30ºС. Готовую культуру высушивают в вакууме при температуре 25ºС в течение 60–70 ч. Заготовленные чистые культуры микроорганизмов по мере необходимости подают в промышленное производство. Методика реактивации существенно отражается на выживаемости клеток и должна разрабатываться для каждой культуры отдельно. Часто при переходе от лабораторных условий к культивированию в промышленных масштабах происходит утрата свойств продуцентов. Получение чистой культуры можно осуществлять в лабораторном ферментаторе периодического или непрерывного действия (рис. 3). 15

Рис. 3. Схема лабораторного аппарата для непрерывного процесса культивирования: 1 – регулятор подачи воздуха; 2 – ротаметр; 3 – фильтр для воздуха; 4 – биореактор; 5 – вентиль; 6 – анализатор выходящего воздуха; 7 – фильтр для питательной среды; 8, 10 – сборники питательной среды и готового продукта; 9 – насос; 11 – закрытые пробоотборники

2.4.2. Культивирование микроорганизмов в промышленных условиях На биотехнологических предприятиях для получения микробной биомассы, а также для производства веществ, продуцируемых микроорганизмами, используют стальные резервуары, служащие «жилищем», «яслями» и «местом работы» микроорганизмов – биореакторы, или ферментаторы (рис. 4). Процесс культивирования микроорганизмов называют ферментацией. Современные биореакторы появились в результате многолетней исследовательской работы. Решающим толчком для их проектирования послужила «охота за пенициллином». Когда ученые Флори и Чейн искали подходящую емкость для выращивания плесени, то они начали с чашек Петри, где грибы плавали на поверхности питательного раствора. При культивировании в плоских емкостях необходимы большие площади. Для получения пенициллина в достаточных для медицины количествах был изобретен биореактор. В настоящее время в биореакторах выращивают плесени, дрожжи, бактерии, водоросли. В каждом отдельном случае конструкция биореактора рассчитана именно на получение 16

данного продукта. Например, если надо получить большие количества дрожжей, используемых как кормовая добавка, то строят гигантские биореакторы размерами с многоэтажный дом и вместимостью до 1500 м3; цилиндрические резервуары для производства дрожжей из нефти достигают примерно 40 м в высоту и 20 м в ширину. В пенициллиновом производстве биореакторы имеют меньшие размеры, их вместимость не более 100 м3. Для научно-исследовательской работы в лабораториях испытывают мини-реакторы вместимостью несколько литров. Для хорошего «самочувствия» микроорганизмов важное значение имеет температура питательного раствора. Для большинства микроорганизмов оптимальная температура составляет 20–50ºС. Таким образом, наиболее высокая продуктивность попадает в диапазон от нормальной до «тропических» температур. В химической промышленности, наоборот, при производстве различных веществ требуются очень высокие температуры, в сотни градусов Цельсия. Для достижения таких температур приходится сжигать гигантские количества топлива (угля, нефти, газа). Это дорого. Чаще всего для биотехнологических процессов требуется даже охлаждение, так как плесени и многие микроорганизмы при потреблении питательных веществ выделяют тепло. Поэтому во избежание смертельного для микроорганизмов перегрева стенки биореакторов охлаждают водой. Для ускорения превращения веществ в химических производствах нередко требуются высокие давления. Микроорганизмы действуют при нормальном давлении. Рост культуры можно охарактеризовать временем удвоения количества клеток или биомассы. Однако эти величины могут различаться, так как биомасса может увеличиваться и без деления клеток. Рост числа клеток, биомассы сопровождается изменением содержания биополимеров в биомассе, в частности ДНК, РНК. Если в данных условиях культивирования время удвоения биомассы и числа клеток не различается, значит, рост культуры происходит согласно экспоненциальной зависимости: dx / dt = µx, или dN / dt = µN, где N – количество клеток в 1 дм3 среды; x – концентрация биомассы, г/дм3; µ – удельная скорость роста, 1/ч. Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, начинает размножаться не сразу. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к окружающей среде. 17

Рис. 4. Принципиальная схема биореактора: 1 – мотор; 2 – подача питательной среды; 3 – деаэратор; 4 – система контроля параметров питательной среды; 5 – охлаждающая или обогревающая рубашка; 6 – мешалка; 7 – аэратор; 8 – патрубок для выведения биомассы; 9, 10 – подача и выход холодной или теплой воды соответственно

В биореакторе создаются оптимальные температурные условия, оптимальная концентрация кислорода и оптимальная кислотность среды. Условия контролируют и с помощью чувствительных датчиков. Профильтрованный стерильный воздух продувается через стерильный питательный раствор, который непрерывно перемешивается. Все отверстия биореактора, через которые возможно проникновение чужеродных микроорганизмов, стерилизуются водяным паром. По окончании процесса весь питательный раствор с микроорганизмами и образовавшимися продуктами сливают, затем продукты отделяют и очищают. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Каковы задачи биотехнологии как науки? 2. Охарактеризуйте метаболические процессы в микробной клетке. 3. Охарактеризуйте особенности строения микробной клетки на примере кишечной палочки. 4. Охарактеризуйте методы получения чистой культуры микроорганизмов. 5. Охарактеризуйте способы сохранения чистой культуры до промышленного использования. 6. Опишите устройство и принцип работы промышленного ферментатора. 7. Охарактеризуйте питательные среды для культивирования микроорганизмов. 18

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева и др. – М.: Высшая школа, 1989. – 380 с. 2. Баснаньян Н.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. – М.: Наука, 1989. – 267 с. 3. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Ч. 2. – Мир, 1989. – 592 с. 4. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 5. Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 6. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991, – 112 с. 7. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с.

3. МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Отличительные особенности любого биологического объекта обусловлены генетической информацией. В природных условиях случайные процессы мутации осуществляются тремя путями: – при трансформации организм получает из окружающей среды обрывки ДНК и гены с собственным наследственным материалом; – при трансдукции новый наследственный материал поступает через вектор в собственный наследственный материал микроорганизма; – при конъюгации объединяются донор и рецептор. Эти природные процессы определяют смешивание и поступление чужой наследственной информации в организм. В результате новые информационные единицы не возникают. Происходит лишь проявление имеющегося в наличии наследственного материала. В экспериментальной генетике используются те же методы и достигаются принципиально те же цели, что и в природе. Новые мутации, возникающие естественным путем, наносят вред существующим штаммам. Гораздо больше изменений можно получить, если геномы двух различных штаммов микроорганизма одного вида пересортировать так, чтобы возникли новые комбинации существующих генов. Молекулы ДНК хромосом разрываются в различных местах и меняются попарно с соответствующими секциями партнерских клеток. Такой процесс может осуществляться в клетках разного вида или в одной клетке. 19

Основной задачей генной технологии является создание новых комбинаций наследственного материала в целых клетках микроорганизмов с последующей передачей введенной информации дочерней клетке. 3.1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Генетическая инженерия – это конструирование функционально активных генетических структур и наследственно измененных организмов. При этом возможно три направления: – введение генов в клетки бактерий и дрожжей; – введение генов в клетки растений, животных, человека; – введение генов в зародышевые клетки. Появление генно-инженерной методологии стало возможным благодаря предшествующим работам многих исследователей в различных областях биохимии и молекулярной генетики. Эксперименты генетической инженерии состоят из нескольких последовательных этапов. Первый этап – получение генов, содержащих информацию для синтеза определенной молекулы полипептида. Молекула ДНК состоит из двух обвивающих друг друга одиночных цепей, в которых закодирован «приказ» по построению белков из аминокислотных остатков. Длина ДНК составляет около 1,4 мм. Для передачи приказа рибосомам клетка производит множество «отпечатков» приказа ДНК, копий. Например, когда клетка должна срочно построить фермент амилазу для превращения крахмала в сахар, в клубке ДНК «отыскивается» участок с записанным в нем приказом синтезировать амилазу. Длина участка ДНК, содержащего этот приказ, составляет около 0,0001 мм. Участок ДНК, несущий информацию о синтезе определенного белка, и называется геном. Для снятия копии с гена специальные ферменты постоянно «прокатываются» вдоль цепи ДНК и копируют ее приказы, составляя новую цепь, идентичную «материнской цепи». Затем эта ДНК-копия отъединяется от «материнской» ДНК. Новая цепь имеет длину, равную длине гена, и содержит такой же приказ, что и ген на «материнской» ДНК. В отличие от «материнской», ДНК-копия представляет собой всего лишь одиночную цепь. Эта копия называется информационной РНК. К копии сразу же присоединяется несколько рибосом, они «нанизываются» по всей длине и «считывают» приказ о сборе молекул аминокислот для построения амилазы. Из рибосом как бы выскальзывают связанные друг с другом аминокислоты. После расшифровки копий рибосомы отторгают выходящие из них длинные аминокислотные цепи, которые сворачиваются в клубки и образуют белки в форме шариков 20

с выемкой на поверхности. Тем временем вдоль ДНК-копии наслаиваются новые рибосомы, и таким образом образуется все больше молекул амилазы. На самом деле все эти процессы значительно сложнее. В июле 1980 г. в одной из лондонских больниц 17 добровольцам были сделаны инъекции инсулина. Инсулин обычно получают из поджелудочных желез убойных свиней и крупного рогатого скота. В инсулине свиньи лишь в одном участке цепи содержится аминокислота, иная, чем у человека; а инсулин крупного рогатого скота отличается по трем аминокислотам. Поэтому у некоторых больных диабетом вырабатываются антитела. В подобных случаях помочь может только инсулин человека, который стали получать с помощью кишечной палочки. Идея заключалась в том, чтобы в ДНК бактерий внести ген человеческого инсулина (подложить «куриное яйцо»). Быть может, рибосомы бактерий обманутся и начнут продуцировать человеческий белок как свой собственный? Необходимо было средство для транспортирования гена человеческого инсулина в бактериальную клетку. Таким «транспортным средством» послужили плазмиды. Плазмиды – это кольцевые молекулы нехромосомной ДНК с малой молекулярной массой, кодированные для вторичных признаков. Они являются векторной группой в методике генной инженерии. Оказывается, именно с плазмидами связана приспособительная способность микроорганизмов к антибиотикам. Плазмиды содержат, например, гены пенициллиназ – ферментов, расщепляющих пенициллин. При воздействии пенициллина на клетки их плазмиды передают своим рибосомам приказ о выработке пенициллиназ, которые инактивируют пенициллин. Микробная клетка остается жизнеспособной. Кроме того, при соприкосновении двух бактерий плазмида может перейти из одной бактерии в другую и передать ей приказ к защите против пенициллина. С. Коэн (1928 г.) предложил использовать «страсть плазмид к путешествиям» для транспортировки генов (рис. 5). Для этого нужно извлечь плазмидное кольцо бактерий, разрезать его, вставить участок чужой ДНК с приказом о выработке белка и ввести обратно в бактерию новое плазмидное кольцо с чужим геном. В 1960-х гг. швейцарский биохимик Вернер Арбер открыл ферменты, «разрезающие» ДНК на участки. Эти ферменты называются рестриктазы. В 1970-х гг. Герберт Бойер в Сан-Франциско установил, что рестриктазы разрезают плазмиды только в определенных местах. Другие исследователи открыли лигазы, которые снова «склеивают» разрезанные участки. В 1973 г. Коэн и Бойер выделили из микробной клетки плазмиды и «разрезали» их. Затем они выделили ДНК из клеток лягушек, «вырезали» из них с помощью рестриктаз гены. В пробирку со смесью после 21

этого добавили лигазы. Затем снова ввели плазмиды в клетки микроорганизмов – теперь их рибосомы наряду с собственными белками синтезировали и белок лягушки. Таким же методом был получен и человеческий инсулин.

Рис. 5. Схема методики генной инженерии: 1 – участок ДНК клетки-донора; 2 – вырезанный ген; 3 – бактериальная плазмида с встроенной ДНК донора; 4 – введение плазмиды в бактериальную клетку; 5 – реконструированная клетка; 6 – извлеченная из бактериальной клетки плазмида, «разрезанная» рестриктазой

Наибольшие успехи в области генетической инженерии достигнуты в работах с Escherichia coli, которая стала центральным объектом исследований благодаря генетической изученности. Успешно используют и другие микроорганизмы, такие как Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae и др. Генно-инженерными методами получают некоторые пищевые продукты. Генная инженерия, прежде всего, является нетрадиционным средством решения ряда проблем. Например, в начале 90-х гг. прошлого века в Австралии возникли колоссальные экологические проблемы в связи с эрозией почвы. К этому привело немыслимое увеличение поголовья овец для производства знаменитой австралийской шерсти. Бесчисленные стада разбивали пастбища, ситуация грозила обернуться экологической катастрофой. Был найден выход: в клевер, основной корм овец, ввели ген подсолнечника. В результате повысилось содержание серы в клевере, а овечья шерсть стала намного гуще. Поголовье овец сократили, а на производстве шерсти это никак не отразилось. В ст. 26 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» указано, что условия работы с биологическими веществами, биологическими и микробиологическими организмами и их токсинами, в т. ч. условия работы в области генной инженерии, не должны оказывать вредного воздействия на человека. 22

3.2. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ 3.2.1. Клонирование культур тканей и клеток высших растений Создание культур растительных клеток стало возможным после того, как были разработаны соответствующие среды и режимы культивирования. В культуре тканей определенного вида растений в результате деления дифференцированных клеток образуются недифференцированные вакуолизированные клетки, которые растут хаотично и образуют клеточную массу – каллус. Каллус образуется на питательных средах, содержащих минеральные и органические питательные вещества, витамины, сахароспирты, ауксины, а иногда и цитокинины (гормоны роста). После нескольких пересадок каллус может приспосабливаться к росту без фитогормонов, которые начинают синтезировать клетки. Клетки растений можно культивировать и в жидких питательных средах. Такие культуры называют суспензионными. Соматические клетки растений являются тотипотентными, т. е. от клеток, изолированных из разных тканей растений, можно регенирировать целое растение. Если к питательной среде добавить гормоны в определенных соотношениях, можно индуцировать рост побегов и корневой системы. Ауксины стимулируют рост корней, цитокинины – образование конуса роста и побегов. Чтобы образовались и корни, и побеги, ауксины и цитокинины должны быть взяты в определенных соотношениях. Метод применяют тогда, когда имеются трудности в половом размножении сорта или когда получен удачный гибрид, но его свойства нельзя сохранить, размножая половым путем. Для размножения деревьев используют клетки молодых листьев с верхушки дерева без повреждения верхушечной почки. Протопласты (содержимое растительной клетки) растений впервые были получены в 1971 г. в лаборатории И. Токебе. Для разрушения клеточной стенки обычно используют ферментные препараты трех видов – целлюлазу, гемицеллюлазу и пектиназу. Чтобы выделить жизнеспособные протопласты, необходим осмотический стабилизатор. В качестве таких стабилизаторов используют сахара (глюкоза, сахароза, сорбит, манит) либо растворы некоторых солей. Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны соответсвующие факторы: рН, освещенность, температура и др. После прекращения действия ферментов у протопластов начинает образовываться клеточная стенка. 23

Целое растение можно получить от протопластов далеко не всех растений. Р.Г. Бутенко выделяет факторы, которые определяют способность клеток, возникших из изолированных протопластов, образовывать целые растения: – видовая специфичность и состояние ткани растений; – способ и условия выделения протопластов; – плотность высева протопластов; – состав питательной среды. Схему регенерации растения из протопластов можно представить в общем виде: МАТЕРИНСКОЕ РАСТЕНИЕ ↓ ИЗОЛИРОВАНИЕ ЛИСТА ↓ СТЕРИЛИЗАЦИЯ И РАЗРУШЕНИЕ ЛИСТА ↓ ОБРАБОТКА ПЕКТИНАЗОЙ ↓ УДАЛЕНИЕ ОБОЛОЧЕК ЦЕЛЛЮЛАЗАМИ ↓ ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ ↓ ТРАНСФОРМИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТА ↓ РЕГЕНЕРАЦИЯ ОБОЛОЧКИ ↓ ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК ↓ ОБРАЗОВАНИЕ КАЛЛУСА ↓ ИНДУЦИРОВАНИЕ ПОБЕГОВ И КОРНЕЙ ПРИ ПОМОЩИ ГОРМОНОВ ↓ ЦЕЛОЕ ДОЧЕРНЕЕ РАСТЕНИЕ (КЛОН) Клонирование – наиболее эффективный метод для получения вегетативного потомства растений, обладающего всеми признаками исходной формы. Он позволяет в 3–4 раза ускорить сроки размножения многолетних растений. Микроклональное размножение применяется также для оздоровления посадочного материала. Такая технология дает возможность усовершенствовать и резко ускорить селекционный процесс. 24

Таким образом, из 1 г растительных клеток в пробирке можно вырастить тысячи растений. Подобным образом были размножены земляника, спаржа, ананас, люцерна, картофель, соя. Получаемое потомство называют клоном (от греческого – ветвь). Все они, как однояйцевые близнецы, имеют одинаковый наследственный материал. Если клетки обработать мутагеном и поместить их в какие-то неблагоприятные условия, выживут только мутанты, устойчивые к этим условиям. Такими неблагоприятными условиями могут быть токсичные вещества (пестициды, гербициды), возбудители болезней или факторы роста, которых не хватает в почве, засоление почвы и т. д. В результате клеточной селекции получены растения, устойчивые к возбудителям картофельной гнили, фитофторы, к гербицидам и т. д. Путем клонирования удалось произвести 1000 молодых масличных пальм, которые были высажены в Юго-Восточной Малайзии. Эти пальмы – прямые потомки одной пальмы, оказавшейся необычайно устойчивой против болезней, а также дававшей на 20–30% больше пальмового масла, чем обычно. При клонировании генетическая информация передается от одного «материнского» организма всем потомкам. 3.2.2 .Соматическая гибридизация клеток растений Соматическая гибридизация – это слияние лишенных оболочки соматических клеток или их частей. Таким способом можно преодолеть физиологическую несовместимость и скрещивать неродственные виды, получать ассиметричные гибриды. Слияние протопластов может происходить спонтанно, но более успешно оно осуществляется при использовании индуцирующих факторов. Ими могут быть химические факторы (например полиэтиленгликоль) или физические (переменное электрическое поле). Соматическую гибридизацию перспективно применять для создания межвидовых гибридов культурных растений с их дикими сородичами. Например, в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН совместно с Институтом картофельного хозяйства Украины получен соматический гибрид дикого и культурного картофеля, устойчивого к Y-вирусу. Работы по соматической гибридизации были успешно проведены также с перцем, томатами и другими пасленовыми, затем с зонтичными и бобовыми. Соматическая гибридизация имеет некоторые преимущества по сравнению с переносом генов, т.к. для этого метода нет необходимости знать молекулярные основы действия генов.

25

3.2.3. Особенности культивирования клеток растений В природных условиях клетки растений находятся в тканях и защищены от механических воздействий внешней среды. Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста. Для растительных клеток важное значение имеют соли азота, калия, магния, фосфора и ряд микроэлементов. Из органических веществ, помимо углеводов, важны отдельные аминокислоты, витамины и фитогормоны. В настоящее время растительные клетки культивируют, как правило, в виде каллуса. Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду в пробирках, колбах, чашках Петри. В природных условиях каллусная ткань возникает в травмированных местах для анатомической регенерации пострадавшего органа. От инфекции каллусную ткань в природных условиях защищают иммунные механизмы организма. В искусственных условиях необходимо строго соблюдать стерильность. Через 4–6 недель культивирования в питательной среде возникает первичный каллус, который необходимо перенести на свежую питательную среду. При культивировании на агаризованной среде кусочек каллуса, переносимый на свежую среду, должен иметь массу около 60–100 мг. Такие кусочки ткани переносят на 30–40 см3 свежей среды. Каллусная ткань, выросшая на поверхности твердой питательной среды, имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонкостенных клеток. При длительной пересадке каллусные ткани, имеющие первоначальную белую, желтоватую, зеленую или красную пигментацию, могут терять окраску, а структура ткани становится более рыхлой. Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т. е. начинается их дифференцировка. Этот процесс регулируется гормонами. Клетки растений можно культивировать и глубинным методом в жидкой среде. Для этого необходимо получить линии клеток, образующих небольшие агрегаты по 5–10 клеток. Для глубинного культивирования более пригодны рыхлые каллусные ткани. Трансплантант желательно обрабатывать пектиназой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2-, 4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы кальция. В таких средах агрегаты клеток не образуются. Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через нейлоновые либо металлические сита, чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантанта. На образование клеточных агрегатов оказывает также влияние интенсивность перемешивания среды. Глубинное культивирование можно осуществить в кол26

бах на качалке при частоте вращения 100–120 об/мин. На 60–100 см3 среды берут 2–3 г свежей каллусной ткани. Растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганизмов. Время их удвоения составляет 1–3 суток. Процесс культивирования растительных клеток занимает 2–3 недели. В настоящее время методом культивирования растительных клеток получают вещества вторичного метаболизма (алкалоиды, гликозиды, полисахариды, терпеноиды, полифенолы, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены). 3.2.4. Инженерия культур клеток животных и человека Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства, датируется первым десятилетием 20 в. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда: – стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию; – подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми. Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются, и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области. Культуры клеток и тканей животных и человека в наши дни широко используют как в научно-исследовательской работе, так и в крупнотоннажных производствах для получения вирусных препаратов, создания материала клеток для трансплантации, синтеза физиологически активных веществ. В последние годы широкое применение получают клонирование, трансплантация эмбрионов и создание гибридом. Метод клонирования – это метод выведения популяции, все клетки которой получены из одной первичной клетки. Метод позволяет отселекционировать наиболее эффективную субпопуляцию и стабилизировать популяцию клеток с требуемой клеточной функцией. При получении клонов из популяции клеток используют индивидуальные клетки, с тем чтобы образованные ими колонии были дискретными и доступными 27

для физического изолирования их от всех других клеток. Для этого проводят серийные разведения клеточной суспензии до тех пор, пока (теоретически) в единице объема не останется одна клетка. Затем этот объем переносится на чашку для микротитрования. Чашки просматривают под микроскопом, и те из них, в которых обнаруживается только одна клетка, маркируются. Если в этих чашках разовьются колонии, то будет известно, что они произошли из одиночной клетки. Метод трансплантации эмбрионов представляет большие возможности для увеличения потомства от выдающихся по продуктивности животных, для получения химерных животных и идентичных близнецов. Схему методики трансплантации эмбрионов можно представить в следующем виде: ГОРМОНАЛЬНОЕ ИНДУЦИРОВАНИЕ СУПЕРОВУЛЯЦИИ ↓ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТКИ ↓ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТКИ ИЛИ ЗИГОТ ИЗ ОРГАНИЗМА ДОНОРА ↓ МАНИПУЛИРОВАНИЕ С ЯЙЦЕКЛЕТКАМИ ИЛИ ЗИГОТАМИ ↓ ИМПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ В ОРГАНИЗМ РЕЦИПИЕНТА ИЛИ ХРАНЕНИЕ ИХ В ГЛУБОКОЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ ДО ИМПЛАНТАЦИИ С помощью инъекции гормонов можно получить от одного животного десятки яйцеклеток, искусственно их оплодотворить и имплантировать в матку других животных. В животноводстве применяется манипуляция на клетках раннего эмбриона для получения монозиготных близнецов, основанная на том, что индивидуальная клетка раннего эмбриона может развиться в нормальный плод. Клетки эмбриона разделяют на несколько равных частей и трансплантируют реципиентам. Это позволяет осуществить ускоренное размножение продуктивных сельскохозяйственных животных. Путем трансплантации эмбрионов от одной выдающейся по продуктивности коровы можно получить в год до шести телят, пересаживая эмбрионы в менее продуктивных коров. Трансплантация эмбрионов позволяет сохранить редких диких животных. Так, кобылам были пересажены эмбрионы зебр, и родились зебрята. Интерес представляет также получение химерных животных. Сущность метода заключается в том, что смешивают клетки эмбрионов ранних стадий двух животных и получают животное, содержащее часть 28

клеток одного животного, часть второго. Гибридизация клеток эмбрионов различных животных позволяет преодолеть межвидовой барьер. Так, в результате смешения клетки зародыша овцы в стадии четырех клеток с восемью клетками зародыша козы и трансплантации их овце были получены овце-козы. Получен также химерный теленок в результате смешивания эмбриональных клеток представителей европейского домашнего и зебувидного скота. Создание гибридом. Уже в 60-е гг. прошлого века были разработаны методы слияния соматических клеток животных и человека. В этом процессе были использованы вирус Сендай и полиэтиленгликоль, которые существенно увеличивают вероятность образования гибридов. Переворот в гибридизации клеток совершили работы Г. Келлера и Ц. Мильштейна, которые создали метод получения однородных антител путем слияния опухолевой клетки с клетками селезенки иммунизированного животного. Такие гибриды называют гибридомами. В широком смысле гибридомой являются «бессмертные» гибридные клетки, полученные путем слияния раковых клеток с клетками, продуцирующими ценные вещества. Такую же технику можно применять и для клеток растений. Слияние клеток растений, растущих обычно в культуре медленно, с клетками растительных опухолей позволяет получить клоны быстрорастущих клеток – продуцентов нужных соединений. Наибольшие успехи достигнуты при создании гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, т. е. антитела, способные реагировать лишь с одним антигеном. Антитела в организме производят В-лимфоциты – недолго живущие клетки, каждая из которых способна синтезировать антитела лишь одной специфичности. Лимфоциты – один из типов белых кровяных клеток – лейкоцитов. В организме одновременно действует множество клонов В-лимфоцитов, поэтому в сыворотке находится смесь антител. Гибридома, в которой объединены опухолевая клетка и В-лимфоцит, синтезирует только антитела одного типа, т. е. моноклональные. Процесс получения гибридом на основе опухолевых клеток и иммунизированных лимфоцитов состоит из этапов: – получение опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток; – получение лимфоцитов – продуцентов антител к заданным антигенам. Для этого животное иммунизируют введением определенного антигена, потом выделяют клетки селезенки и от них отделяют лимфоциты; – слияние опухолевых клеток с лимфоцитами. Слияющим агентом служат полиэтиленгликоль, вирус Сендай и лизолецитин, а также электрический импульс; – селекция гибридомных клеток; 29

– проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену; – клонирование гибридных клеток, прошедших проверку на образование моноклональных антител, с контролем на стабильность их иммунных свойств; – получение массовых культур гибридомных клеток. Гибридомные клетки из культуры можно выращивать и в организме животного – мыши или крысы. Для этого гибридомные клетки вводят животному, опухоли из введенных клеток вырастают через 10–14 суток. Начиная с этого времени у животных берут сыворотку, содержащую высокие концентрации моноклональных антител. Моноклональные антитела применяют в настоящее время для диагностики инфекционных и онкологических заболеваний и отрабатывают методы их использования для усовершенствования вакцин, изучения патогенеза и иммунологии заболеваний, генетического анализа человека, лечения инфекционных и онкологических заболеваний. 3.2.5. Особенности культивирования клеток животных Культивирование тканей животных широко применяется в вирусологических исследованиях и при производстве вирусных вакцин. В качестве примера можно рассмотреть получение вакцины Солка из тканевой культуры почек обезьяны. Ткань коркового слоя свежих почек измельчают и суспендируют в питательной среде, затем многократно обрабатывают по 20 мин 0,5%-ным раствором трипсина при рН среды 7,6, чтобы ферментативно гидролизовать ткани и разделить клетки. Суспензию центрифугируют и клетки суспендируют в той же среде с добавлением плазмы телячьей крови или гидролизата лактальбумина. Суспензию клеток инкубируют 5 суток в сосудах, где за это время на стенках сосудов образуется однослойная пленка клеток. Когда клетки вырастут, жидкую фракцию сливают, клетки промывают изотоническим раствором поваренной соли, добавляют свежую среду и засеивают ее соответствующим вирулентным вирусом полиомиелита. После трехсуточного инкубирования вируса клетки полностью разрушаются, и вирусы переходят в раствор. Остатки клеток удаляют центрифугированием, и оставшийся раствор используют для вакцинации. Для сохранения вакцину замораживают. При помощи натуральных животных клеток получают также β-интерферон и урокиназу. В последнее время культуры клеток животных стали использовать также для получения биологически активных белков. 30

С помощью трансформированных методом генетической инженерии клеток животных сегодня получают человеческий γ-интерферон, поверхностный антиген гепатита В, иммуноглобулин и другие вещества. При этом нетрансформированные клетки животных продуцируют необходимый белок значительно медленнее, чем трансформированные клетки, к тому же концентрация вещества у трансформированных в 50 раз выше. Животные клетки уступают бактериальным по продуктивности и достигаемой концентрации продукта в среде. Вместе с тем, несмотря на явные преимущества бактериальной культуры на стадии ферментации, выделение целевого белка из ее биомассы намного сложнее, чем из среды с животными клетками. Потери биологической активности в случае выделения нужного белка из биомассы бактерий в 1000 раз превышает потери при выделении этого белка из среды с животными клетками. Для культивирования животных клеток используют те же технические средства, которые применяют для культивирования микроорганизмов. Однако в этих случаях необходимо добиваться того, чтобы в биореакторах не происходили механические повреждения животных клеток, которые менее прочны, чем клетки микроорганизмов. Внутренняя поверхность биореакторов должна быть гладкой, а механические мешалки не должны создавать сильную турбулентность среды. Большинство клеток требует поверхности для своего роста. Чтобы повысить концентрацию клеток в биореакторе, практикуют отделение клеток от среды при помощи мембран. Необходимо учитывать, что размеры животных клеток составляют примерно 5–10 мкм. Практикуется также адсорбция клеток к поверхности полых волокон или флокуляция при помощи специальных флокулянтов в матриксы. Наиболее широко применяются для культивирования животных клеток шарообразные матриксы из стекла, синтетических полимеров. При этом основная задача состоит в том, чтобы стабилизировать клетки и создать для них оптимальные условия. В матриксах клетки могут быть иммобилизованы не только адсорбцией, но и ковалентным и перекрестным связыванием. Для этого можно использовать такие материалы, как желатин, полилизин, альгинат и агарозу. Выбор конкретного материала зависит также от предназначения иммобилизованных клеток. Такая техника нашла применение для защиты клеток при перевозке или пересылке клеток из одной лаборатории в другую, обеспечении длительного хранения их при температуре 4ºС, исключении иммунного отторжения трансплантированных клеток и защиты хрупких клеток (гибридом) от механических воздействий в биореакторах. Матриксы обеспечивают свободный диффузионный обмен между замкнутым микроокружением клетки и средой, питательными веществами и образующимися продуктами. Чтобы защитить клетки от травм и 31

колебаний температур при перевозках, достаточно добавить клетки в питательную смесь с желатином при температуре 37ºС. При переносе такой смеси в окружающую среду температурой 4ºС происходит быстрое загустение. Клетки можно освободить от загустевшего матрикса путем нагревания материала до 37ºС и разбавления его свежей средой. Такая техника дает, например, возможность рассылать диплоидные клетки человека и первичные клетки обезьян из лаборатории Р.Е. Спиера (Англия) по всему миру. При культивировании иммобилизованных клеток значительно легче производить смену среды в биореакторе, регулировать соотношение объемов клеток и питательной среды, выделять продукты, свободные от клеток.

3.2.6. Получение медицинских препаратов и лекарственных веществ с помощью микроорганизмов и культур тканей Гормоны. Свойствами гормонов могут обладать небольшие молекулы пептидов и молекулы белков. В зависимости от величины и структуры молекул гормоны делят на три группы. Первая группа – пептидные гормоны. К этой группе относятся факторы гипоталамуса, гормоны гипофиза, щитовидной железы, пищеварительного тракта и поджелудочной железы. В железах внутренней секреции гормоны образуются из длинных молекул предшественников под воздействием расщепляющих ферментов. Вторая группа – гормоны роста и пролактины. Гены гормонов роста синтезируются в клетках по информации мРНК либо искусственно. Третья группа – гликозилированные гормоны. Для получения таких гормонов их гены вводят в клетки дрожжей или в клетки культур тканей. Инсулин – первый препарат, производимый бактериями, в которые был введен ген инсулина человека. Первые сообщения о получении инсулина из бактериальных клеток поступили в 1982 г. из нескольких лабораторий. Для лечения сахарного диабета до сих пор используют инсулин, полученный из поджелудочной железы коров и свиней. Эти виды инсулина несколько отличаются по аминокислотному составу от человеческого инсулина, они устраняют главные проявления диабета, но не устраняют побочные осложнения – повреждение почек и глазной сетчатки. Кроме того, инсулин вызывает иммунную реакцию при инъекции. В настоящее время инсулин получают из культур Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae с помощью методов генетической инженерии. Ферменты. В медицине ферменты используют для замены нефункционирующего фермента или увеличения количества фермента, которо32

го недостаточно в организме. В медицине применяют несколько ферментов, полученных методами генетической инженерии. Например, в клиниках США прошла проверку человеческая супероксиддисмутаза, продуцированная микроорганизмами. С помощью этого фермента лечат ишемическую болезнь сердца, интоксикацию кислородом, артриты, его также используют при пересадке почек. Для разрушения тромбов в медицине используют урокиназу и стрептокиназу. Урокиназу синтезируют клетки стенок мочевода, ее можно выделить из мочи. Стрептокиназу синтезируют бактерии. Медицинскую урокиназу можно получить методами генетической инженерии. В Японии с 1984 г. урокиназу производят из культур тканей. Интерфероны – белки, которые синтезируются в разных клетках организма. Их главная функция – защита организма от вирусных инфекций. Кроме того, интерфероны тормозят деление клеток, в т. ч. опухолевых, влияют на иммунные реакции организма, защищают клетки от радиационного повреждения. По своему действию интерфероны напоминают гормоны. Это вещества с очень высокой активностью. Впервые интерферон был описан в 1956 г. английскими учеными А. Исааком и Е. Линдеманом. Интерфероны имеют видовую специфичность. В связи с этим интенсивно разрабатывались методы получения человеческого интерферона из клеток культур отдельных тканей человека, а также из микроорганизмов методами генетической инженерии. В клетке интерферон начинает синтезироваться в ответ на определенные возбудители. Основным возбудителем синтеза интерферона являются вирусы. Исторически первым методом получения интерферона можно считать метод П. Кантеллы, основанный на культивировании лейкоцитов и очистке интерферона. Лейкоциты помещают в поддерживающую среду. Синтез интерферона проводят 16–20 ч при помощи вируса Сендай. Проведение синтеза интерферона надо начинать не позднее 24 ч после взятия крови. Возможности метода Кантеллы ограничены, так как для получения интерферона требуется много донорской крови. Интерферон также получают от культур диплоидных клеток. Синтез интерферона проводят при помощи синтетической РНК. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Охарактеризуйте метод генной инженерии. 2. Что такое плазмиды? Какова их роль в генной инженерии? 3. Для каких целей в генной инженерии применяются ферменты рестриктазы? Лигазы? 33

4. В чем заключается сущность метода клонирования растений? 5. Для каких целей применяются методы клонирования? 6. В чем заключается метод соматической гибридизации клеток? 7. В чем сущность метода трансплантации эмбрионов? 8. Охарактеризуйте гибридомную технику. 9. Для каких целей применяют методы трансплантации эмбрионов и гибридомную технику? 10. Охарактеризуйте методы получения гормонов, ферментов, интерферонов. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Ч. 2. – Мир, 1989. – 592 с. 2. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 3. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: СанПиН 2.3.2.1078-01. – М.: Минздрав России, 2002. – С. 9, 122–123, 147. 4. Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 5. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991, – 112 с. 6. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 7. Спиер Р.Е., Гриффитс Дж.Б. Биотехнология клеток животных. Т. 1. – М.: Агропромиздат, 1989. – 366 с. 8. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та, 1994. – 304 с.

4. ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ, ЭТИЛОВОГО СПИРТА, БИОГАЗА 4.1. ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ Так как ферменты представляют собой макромолекулы, активность которых зависит от их первичной структуры, т. е. от последовательности аминокислот, крупномасштабный химический синтез не всегда возможен и желателен. Поэтому ферменты получают экстрагированием 34

из животных и растительных клеток или производят при помощи микроорганизмов. Современные методы генетики и генетической инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимого фермента. В наибольших количествах биотехнологическими способами производят четыре типа ферментов: протеазы, глюкоамилазу, α-амилазу, глюкозоизомеразу. Для гидролиза крахмала, пивоварения, производства фруктовых соков, хлеба, молока, вина, моющих средств нужны очень большие количества ферментов, производимых микроорганизмами. Микроорганизмы – очень удобные источники ферментов, так как концентрация ферментов в клетке может быть значительно повышена за счет воздействия на условия роста или за счет генетических манипуляций. Среди других преимуществ микроорганизмов – их быстрый рост, способность расти на недорогих питательных средах, существование различных ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию в разных штаммах. Микробные ферменты все активнее заменяют растительные и животные. Технологически очень важно то, что микроорганизмы выделяют ряд ферментов из клеток в окружающую среду, что существенно облегчает выделение и очистку. Для производства ферментов в качестве продуцентов в основном используют плесневые грибы. Большой интерес представляет использование в качестве продуцентов ферментов термофильных организмов. Ферменты, образуемые термофилами, часто являются термостабильными и проявляют активность в широком интервале температур. У некоторых мезофильных микроорганизмов также обнаружены ферменты, устойчивые к действию высоких температур. Например, нуклеазы выдерживают нагревание до температуры 80–100ºС без заметной потери активности. Биотехнологи постоянно ведут интенсивный поиск таких микроорганизмов, которые продуцируют очень активные и стабильные ферменты. Для этого наиболее перспективны микроорганизмы, выживающие в экстремальных условиях – в горячих вулканических источниках, в оттоках из рудных или серных источников, в бассейнах для добывания соли методом осаждения или на морском дне под высоким давлением. Амилазы из Bacillus и Aspergillus заменили ферменты из пшеничного солода и ячменя в пивоварении, хлебопечении, производстве сухого печенья, в текстильной промышленности. Протеазы из Aspergillus заменили животные и растительные протеазы, используемые для размягчения мяса; реннины из Mucor – сычужный фермент из желудка телят в сыроварении. Ряд ферментов играет все возрастающую роль в медицинской диагностике. Так, холестериноксидаза позволяет определить уровень холестерина в сыворотке крови, уреаза – уровень мочевой кислоты. 35

Сегодня около 80% всех выпускаемых моющих средств содержат протеазы. При этом ферменты содержатся в моющих средствах в очень малых количествах – всего 0,01%. И даже при таких малых количествах биодобавок сильно загрязненное белье становится чистым. Ферменты моющих средств наиболее активны при температурах порядка 40–60ºС. Таким образом, они еще помогают сэкономить энергию для нагрева воды при кипячении белья. При полоскании ферменты вновь удаляются из белья (рис. 6).

Рис. 6. Схема действия биомоющих средств: 1 – грязь; 2 – загрязненное волокно; 3 – белок (клеящее вещество); 4 – фермент, расщепляющий белок (протеаза); 5 – растворенная грязь

В настоящее время производится ряд косметических средств для ухода за кожей, содержащих протеазы. При пользовании ими кожа становится свежей и розовой, хотя эти мыла и кремы содержат совершенно ничтожные количества фермента. В кожевенной промышленности протеазы микробиологического происхождения применяют для удаления со шкур волос и щетины и для дубления кож. Ранее для дубления кож применяли фекалии животных; это была очень неприятная работа. Секрет этого процесса заключается в том, что содержащиеся в экскрементах микроорганизмы выделяют протеазы в процессе своей жизнедеятельности. В сельском хозяйстве протеазы примешивают к животному корму, чтобы повысить его усвояемость. Воздействуя протеазами на отходы переработки рыбы, можно отделить белок и превратить его в смесь аминокислот. При этом получается отличная добавка к корму для скота. Большое значение имеет внедрение методов генетической инженерии при производстве ферментов. В Институте молекулярной генетики АН получен суперпродуцент глюкозоизомеразы в результате внедрения в клетку Е. coli гибридной плазмиды, кодирующей глюкозоизомеразу. Этот фермент принимает участие в реакциях преобразования глюкозы во фруктозу. Фруктозу применяют как заменитель сахара, который, 36

не отличаясь от него по вкусу, в то же время не служит пищей кариозным бактериям, а также является менее калорийным и не способствует увеличению массы тела «сластены». На эффективность синтеза и соотношение образуемых клетками ферментов очень большое влияние оказывают внешние параметры выращивания клеток. Образование клетками некоторых ферментов также происходит в ответ на присутствие в питательной среде некоторых метаболитов – индукторов. Индуктор – это экзогенное вещество, которое проникает в клетку и участвует в регулировании процесса синтеза фермента. Для получения протеаз и амилаз штаммы Bacillus или леечной плесени Aspergillus выращивают в белковых или крахмальных питательных средах. Затем побуждают микроорганизмы к усиленному выделению в окружающую жидкость протеаз, расщепляющих белки, или амиаз, расщепляющих крахмал. После отделения микробных клеток получают смесь непотребленных питательных веществ и выделенных ферментов. Центрифугированием тяжелые молекулы ферментов осаждаются в виде концентрированного донного осадка. Потребителям они отпускаются либо в жидком виде, либо в форме высушенного порошка. Большинство процессов производства ферментов проводится в аэробных условиях. При производстве ферментов важной проблемой является обеспечение безопасности процессов для здоровья обслуживающего персонала. Так как ферменты обладают высокой физиологической активностью, то большие их концентрации на промышленных предприятиях могут вызвать ряд заболеваний. Во избежание контакта работников с продуктом применяется герметизированное оборудование и эффективная принудительная вентиляция, а также дистанционное управление технологическими процессами. При испытании ферментов в процессах имеется одна «загвоздка» – ферменты могут быть использованы только единожды. Поэтому был разработан способ повторного использования ферментов. Для этого их прикрепили к довольно большим, видимым невооруженным глазом шарикам так, чтобы они могли по-прежнему выполнять свои функции. Такие ферменты уже не мобильны, т. е. они не могут свободно перемещаться в растворе. Такие закрепленные молекулы называют иммобилизованными (неподвижными). Ферменты могут быть иммобилизованы различными способами: – механическими (путем включения ферментов в полимерные гели, полупроницаемые полимерные микрокапсулы, мембраны, полые волокна); – физическими (путем адсорбции на керамике, полисахаридах, органических смолах); 37

– химическими (путем образования ковалентных связей при соединении фермента с носителем). Иммобилизация осуществляется в мягких условиях, чтобы не произошло инактивации ферментов. Шарики или пористые частицы имеют такие размеры, что могут быть без труда с помощью фильтров грубой очистки вновь выделены из биореакторов. После недолгого отмывания их можно применять повторно. Иммобилизованные ферменты или клетки могут быть использованы при очистке сточных вод от загрязнений, при извлечении из них металлов, ассимиляции солнечной энергии, изготовлении водородных топливных элементов, электродов и т. д. В промышленности и сельском хозяйстве применяется около 50 ферментов. Перспективным является внедрение непрерывных процессов с применением иммобилизованных ферментов и клеток. 4.2. ПРОИЗВОДСТВО ЭТИЛОВОГО СПИРТА Химический синтез этилового спирта осуществляется из этилена, получаемого из нефти и природного газа, при высокой температуре, в присутствии воды и катализаторов. В связи с ростом цен на нефть для получения спирта предпочтительным становится применение способа спиртового брожения. В качестве сырья для получения питательной среды используют сахарный тростник, ананас, сахарную свеклу. Основным углеводом этих растений является сахароза. Усовершенствованию ферментационного производства способствовали методы иммобилизованных ферментов или клеток, методы генной инженерии. На предприятиях по переработке сахарного тростника сначала давят тростник и отделяют жом от сладкого сока. Жом сжигают, чтобы обеспечить производство необходимой энергией. Сладкий сок концентрируют в вакуум-выпарных аппаратах и стерилизуют, а затем подвергают брожению. По окончании процесса брожения раствор отделяют от твердых компонентов. Этиловый спирт получают из 8–10%-ного спиртового раствора путем перегонки. Оставшуюся жидкость очень трудно очистить, но после соответствующей переработки она может служить компонентом удобрений с выходом 2–3%. Усовершенствование производства этилового спирта было сосредоточено на разработке технологии непрерывного брожения, обеспечивающей более высокую концентрацию спирта, на утилизации сельскохозяйственных отходов или побочных продуктов в качестве топлива. В настоящее время действуют установки для получения спирта с помощью иммобилизованных дрожжей. При этом дрожжи включены 38

в пористые шарики. Раствор глюкозы легко проникает через поры к клеткам дрожжей. Образовавшиеся спирт и углекислый газ также легко покидают шарики. Шариками заполняют колонны биореакторов вместимостью 2000 дм3 (рис. 7).

Рис. 7. Схема биореактора для производства этилового спирта: 1 – патрубок для подачи раствора сахара; 2 – шарики с иммобилизованными клетками дрожжей; 3 – патрубок для выведения этилового спирта

Иммобилизованные дрожжи непрерывно «работают» в течение четырех месяцев. В этот период ими продуцируется около 2400 дм3 спирта в сутки. В случае обычного получения спирта при помощи свободно плавающих в растворе дрожжевых клеток необходимо через каждые несколько дней регулярно заменять старые дрожжи новыми. Биореактор с иммобилизованными дрожжевыми клетками функционирует в течение длительного времени, он в 10 раз более продуктивен, а следовательно, полученный этиловый спирт намного дешевле. 4.3. ПРОИЗВОДСТВО БИОГАЗА Метановое «брожение», или биометаногенез, – давно известный способ превращения биомассы в энергию. При этом получается биогаз, представляющий собой смесь 65% метана, 30% углекислого газа, 1% сероводорода, минимального количества азота, кислорода, водорода, закиси углерода. Энергия, заключенная в 28 м3 биогаза, эквивалентна энергии 20,8 3 дм нефти, 18,4 дм3 дизельного топлива. Биометаногенез осуществляется в три этапа: – растворение и гидролиз органических соединений; 39

– ацидогенез; – метаногенез. В процессе биометаногенеза участвуют три группы бактерий. Первые превращают сложные органические субстраты в масляную, пропионовую и молочную кислоты. Вторые превращают эти кислоты в уксусную кислоту, водород и углекислый газ. Затем метанообразующие бактерии восстанавливают углекислый газ в метан с поглощением водорода, который в противном случае может ингибировать уксуснокислые бактерии. Уксуснокислые и метанообразующие бактерии образуют симбиоз. С биохимической точки зрения метановое «брожение» – это анаэробное дыхание, в ходе которого электроны с органических веществ переносятся на углекислый газ, который затем восстанавливаются до метана CH4. Помимо различных органических субстратов (CH3COOH) донором электронов для метанобактерий служит водород, который в почве продуцируется несколькими типами анаэробных бактерий. В условиях строгого анаэробиоза метан можно получить из ароматических соединений. Этот процесс широко распространен в природе, особенно в отходах и сточных водах. В 1894–1899 гг. образование метана изучал академик В.Л. Омелянский. Он показал, что метан, который выделяется при разложении сточных вод, в илах болот, образуется микроорганизмами. Уже в конце 19 в. в Индии испытывали установки, на которых производили метан. В это же время его использовали в Англии для уличного освещения. В процессе участвуют несколько видов микроорганизмов, ответственных за различные стадии деградации ароматических колец до ацетата, который является одним из субстратов для метанобактерий: 4C6H5COOH + 24H2O → 12CH3COOH + 4HCOOH + 8H2 бензоат 12CH3COOH → 12CH4 + 12CO2 ацетат 4HCOOH → 4CO2 + 4H2 формиат 3CO2 + 12H2 → 3CH4 + 6H2O 4C6H5COOH + 18H2O → 15CH4 + 13CO2 Среди бактериальных видов превалируют Methanobacterium formicicum и Methanospirillum hungati. 40

Для всех метанобактерий характерна способность к росту в присутствии водорода и углекислоты, а также высокая чувствительность к кислороду и ингибиторам производства метана. Метановое «брожение» происходит в водонепроницаемых цилиндрических цистернах (дайджестерах) с боковым отверстием, через которое вводится ферментируемый материал. Над дайджестером находится стальной цилиндрический контейнер, который используется для сбора газа. Нависая над бродящей смесью в виде купола, контейнер препятствует проникновению внутрь воздуха, так как весь процесс должен происходить в строго анаэробных условиях. В газовом куполе имеется трубка для отвода биогаза. В качестве субстрата перспективно использовать отходы животноводства, птицеводства, растениеводства, пищевой, деревообрабатывающей, целлюлозно-бумажной промышленности, твердые органические отходы, морские водоросли, траву, быстрорастущие растения, торф. В случае использования отходов домашнего хозяйства или жидкого навоза соотношение между твердыми компонентами и водой должно быть 1‫׃‬1. Смесь сбраживаемых материалов обычно засевают ацетогенными и метаногенными бактериями или отстоем из другого дайджестера. Оптимальные условия для протекания процесса: pH среды 6,0 ÷ 8,0, температура 30 ÷ 40ºС для мезофильных и 50–60ºС для термофильных бактерий. Резкие изменения температуры нежелательны. Биогазовые реакторы служат и охране здоровья: в герметически замкнутых резервуарах возбудители болезней, содержащиеся в экскрементах, убиваются высокой температурой брожения. Из 45 дм3 навозной жижи можно получить 2 м3 биогаза. Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов – одно из возможных решений энергетической проблемы в большинстве сельских районов развивающихся стран. Особенно много установок по получению топливного биогаза создано в КНР, где таким методом производится около 80 млн. т условного топлива. Аналогичные установки есть в Западной Европе, Индии, России. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Охарактеризуйте способы получения ферментов с помощью микроорганизмов. 2. Охарактеризуйте принцип действия биологических моющих средств. 3. Что такое иммобилизованные клетки? В чем преимущество их использования в промышленной биотехнологии? 4. Сравните химический и биотехнологический способы получения этилового спирта. 41

5. Охарактеризуйте процесс биометаногенеза при производстве биогаза. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 2. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991. – 112 с. 3. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с.

5. ПРОИЗВОДСТВО ПЛАСТМАСС, ТЕКСТИЛЬНЫХ ИЗДЕЛИЙ, МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОНИКИ Все больше новых продуктов, ранее вовсе неизвестных, появляются благодаря развитию биопромышленности. Например, определенные микроорганизмы могут продуцировать из сахара полимерные вещества, т. е. без использования нефти и сложных энергоемких установок. Так, бактерия Alkaligenes eutrophus образует полигидроксибутират. Ее клетки накапливают этот полимер в количестве до 80% собственной массы. В таком случае бактерия состоит почти вся из пластмассы. Продуцируемый полимер служит клеткам в качестве запасного материала и поэтому обладает ценным преимуществом перед всеми химически получаемыми полимерами: он разлагается также биологически. Например, нити из «биопласта» могут использоваться для наложения швов на послеоперационные раны. Другие микроорганизмы образуют из крахмала полимер пуллулан. Из пуллулана изготавливают тонкие пленки, в которые можно герметично упаковывать пищевые продукты, сохраняя их свежими. А потом продукты вместе с упаковкой можно класть в кастрюлю и варить, так как пуллулан съедобен и растворяется в горячей воде. При производстве таких пластмасс экономится энергия и сырье, и к тому же они не загрязняют окружающую среду: они быстро разрушаются микроорганизмами. У некоторых микроскопических грибов гифы образуют густое плетение. Эти «нити» значительно тоньше, чем хлопчатобумажные волокна, но очень прочны. Подобные текстильные изделия применяются в медицине при оказании неотложной помощи в качестве искусственной «кожи» для закрытия обширных ран. 42

Наряду с полимерами микроорганизмы могут производить и новые материалы для электроники. Всем знакомы жидкие кристаллы цифровых индикаторов электронных часов или микрокалькуляторов. Бактерии рода нокардия образуют в своих клетках вещества, которые можно применять для жидких кристаллов нового типа. Эти кристаллы реагируют на сигналы значительно быстрее, чем прежние системы. Следовательно, их можно применять, например, для особоплоских телевизионных экранов. Растущая область биотехнологии – биоэлектроника. Использование биосенсоров революционизирует методы измерений и контроля в различных отраслях промышленности, медицине, научных исследованиях. Каждый знаком с темно-фиолетовыми раковинами съедобных мидий, которые во всех морях прикрепляются к сваям, камням, буям, днищам шлюпок при помощи тонких прочных биссусовых нитей (биссус – секрет биссусовой железы, имеющейся в ноге у двустворчатых моллюсков, затвердевающий при выделении в прочные нити). Эти нити состоят из белка, который действует как клей. В отличие от химических клеев, биоклей и в морской воде долгие годы сохраняет крепость камня. С помощью современных методов генной инженерии удалось передать кишечной палочке и дрожжевым клеткам способность вырабатывать белок ракушек. Биоклей ценен в стоматологической практике. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Охарактеризуйте свойства и область применения полигидроксибутирата. 2. Охарактеризуйте свойства и область применения пуллулана. 3. Каким способом получают и где применяют биссусовый клей? 4. Какие материалы для электроники производят биотехнологическими методами? РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 2. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991, – 112 с. 3. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с.

43

6. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Сегодня на Земле полмиллиарда человек не имеют в достатке пищи. В первую очередь ощущается нехватка продуктов – поставщиков белков, таких как мясо, рыба, яйца, молоко, бобовые. Проблема усугубляется тем, что население Земли увеличивается в среднем на 70 млн. человек ежегодно. Для того чтобы покрыть только дополнительную потребность в 2 млн. т белка, обусловленную приростом населения, следовало бы выращивать богатую белком сою на площади 40 млн. га. Как раз в регионах, где налицо нехватка белковых пищевых продуктов, отмечаются и наиболее высокие темпы прироста населения при слабом развитии сельского хозяйства и промышленности. Чтобы производить достаточное количество растительного белка, из которого сельскохозяйственные животные синтезируют полноценный животный белок, требуются большие количества азотных удобрений. Для получения 1 кг животного белка требуется 5–10 кг растительного белка. Микроорганизмы могут помочь решению этих проблем. Они ведь не только продуцируют лечебные средства, вино и сыр – они еще и съедобны. В них содержатся полноценные белки, жиры, сахара и витамины. Уже в 1521 г. после завоевания Мексики испанец Бернал Диас дель Кастилльо сообщал, что ацтеки употребляли в пищу диковинные «пирожки», похожие на сыр. Сейчас известно, что эти «пирожки» изготовлены из одноклеточных водорослей, живущих в мексиканских озерах. В Африке на берегу озера Чад туземцы употребляют в пищу одноклеточную сине-зеленую водоросль рода Spirulina. Она в огромных количествах растет в озере Чад, ее вылавливают, сушат и употребляют в пищу. Водоросли – хорошие продуценты белка. Они удваивают свою массу всего лишь за 6 ч. Злакам для этого требуется 2, цыплятам – 4, поросятам – 6 недель, телятам – 2 месяца. Поэтому во многих странах наука прилагает немалые усилия, чтобы создать «водорослевые фермы». Для этого требуются довольно обширные водные плоскости, в которых водоросли могут в достаточной степени облучаться солнечным светом, с помощью которого они образуют из углекислоты, воды и питательных минеральных веществ белок. Потребление света и воздуха не требует никаких финансовых затрат, необходимы лишь дешевые минеральные вещества. На равновеликих площадях Spirulina образует в 10 раз больше белковой массы, чем пшеница, и к тому же с более высоким содержанием белка. При сборе урожая водоросли попросту «отцеживают» с помощью сетки, затем их сушат на воздухе и добавляют к ним вещества, улучшающие вкус: продукт готов. Еще быстрее, чем водоросли, растут бактерии, дрожжи и другие низшие грибы. Бактерии удваивают свою массу за время от 20 мин до 2 ч, причем бактериальная масса может на 70% состоять из белка. 44

Дрожжевой белок превосходит все кормовые растения по содержанию в нем питательных веществ. Опыты показали, что 1 т дрожжей способна заменить 7–8 т кормовых злаков. Начиная с 1985 г. микробный белок используется также в пищевой промышленности для изготовления различных блюд и полуфабрикатов. В Англии продают слоеные паштеты с начинкой, похожей по виду и вкусу на говяжью. Новый продукт микопротеин изготавливают из гриба фузариум. Он содержит 45% белка и 13% растительного жира, т. е. не уступает по питательности многим сортам мяса. Мицелий так сплетается, что появляется внешняя аналогия с мясными волокнами. Фузариум растет на всех сахаристых веществах (отходы картофеля, фрукты, сахарный тростник). В Финляндии при помощи низших грибов, растущих на ядовитых сточных водах целлюлозно-бумажных предприятий, ежегодно производят 10 000 т ценного кормового белка. Без проведения «микробной обработки» эти сточные воды вызывают массовую гибель рыб. В этом случае биотехнология разрешает одновременно две проблемы – получение белка на беззатратных питательных растворах и защиту окружающей среды. 6.1. ПРИМЕНЕНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ При производстве продуктов питания широко применяют процесс ферментации. Этот процесс в большинстве случаев представляет собой переработку сельскохозяйственных продуктов и продуктов питания при помощи плесеней. Получение сыра из молочных белков – пример типичной ферментации в твердой среде, которая служит способом сохранения молока. Если не принять особых мер предосторожности, в молоко быстро попадают бактерии и другие микроорганизмы, которые заквашивают его, сбраживая лактозу в молочную кислоту. В наши дни по уровню сбыта производство молочнокислых продуктов стоит на втором месте в мире среди видов промышленности, в которых используются микробиологические процессы (после производства алкогольных напитков). Процесс приготовления сыра начинается с добавки к молоку культуры бактерий (одного или нескольких видов). Чтобы молоко свернулось, к смеси добавляют протеолитический фермент. Традиционно для этого использовали сычужный фермент, получаемый из желудка грудного теленка, но в последнее время он все чаще заменяется микробиологическими ферментами. Затем свернувшееся молоко отделяют от сыворотки, прессуют, чтобы отжать часть воды, и заворачивают в ткань 45

для высушивания. В процессе затвердевания продукта микроорганизмы растут на внешней поверхности сыра, обеспечивая тем самым его вкус и запах. Большое разнообразие сортов сыра объясняется природой и свойствами микробных культур, служащих исходными культурами при свертывании молока, температурой изготовления и наличием или отсутствием вторичной микробной флоры, растущей на сыре. Мягкие сыры содержат 50–80% воды и включают такие конечные продукты, как вещества, появляющиеся в процессе созревания сыра при росте на его поверхности плесеней (Penicillium) и дрожжей. К таким сырам относятся бри и камамбер. Полумягкие сыры варят недолго, чтобы уменьшить содержание воды до 45%. Некоторые из них пропитывают рассолом, который индуцирует размножение на поверхности дрожжей и бактерий. В твердых сырах не более 40% воды. Они могут содержать только бактериальную флору (чеддер) или быть заражены спорами Penicillium roquefortii. Рост плесени в мякоти сыра придает ему характерный вкус и аромат (датский голубой, горгонзола, рокфор). При изготовлении сыра грюйер к молоку добавляют пропионовокислые бактерии: они вырабатывают двуокись углерода, в силу чего образуются дырки, характерные для сыров такого типа. Йогурт получают при сбраживании цельного молока смесью двух симбиотических молочнокислых бактерий: Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus termophilus. Температура при брожении поддерживается около 40ºС. Индикатором для определения окончания брожения является значение рН 4,7–4,6. Своим характерным вкусом йогурт обязан молочной кислоте, получаемой из лактозы молока, и ацетальдегиду. Оба этих вещества вырабатываются L. bulgaricus. Сметана образуется при закислении пастеризованных сливок молочнокислыми бактериями. Пахту получают при брожении снятого или полуснятого молока под действием смеси молочнокислых и родственных им бактерий. Среди других ферментируемых молочных продуктов – кефир и кумыс, которые потребляют жители центрально-европейских стран, а также вилия, которую пьют в Финляндии. Для консервирования овощей их помещают в рассол, в котором они подвергаются брожению. На первой стадии происходит рост в рассоле аэробной микрофлоры на поверхности овощей. Затем в процесс включаются молочнокислые бактерии и дрожжи, относящиеся к родам Saccharomyces и Torulopsis. В результате брожения образуются молочная и уксусная кислоты. В дальнейшем дрожжи вытесняют молочнокислые бактерии; брожение завершается, когда использованы все сбраживаемые углеводы овощей. Однако некоторые виды дрожжей, относящиеся к родам Candida, Debaryomyces и Pichia, продолжают расти на поверхности рассола. В современной технике консервирования овощей используются микробные штаммы, в частности штаммы молоч46

нокислых бактерий, подвергшиеся селекции. Пастеризация на последней стадии консервирования уничтожает микробы и гарантирует качество продукта. Во Франции исследователи кафедры технологических процессов Технологического университета в Компьене и сотрудники компании «Крист» в департаменте Сарте разработали новый производственный процесс получения кислой капусты. В ферментационные баки закладывают 6,6 т капусты вместо 20–110 т при традиционном производственном процессе. Баки пластмассовые, их внутреннее покрытие устойчивое к кислоте, выделяемой кислой капустой, к тому же их можно транспортировать. Правда, при новом способе требовалось около месяца, чтобы получить годный к употреблению продукт. По мере усовершенствования производственного процесса этот срок удалось сократить до восьми дней. Капустный сок собирают на дне бака при температуре 15ºС и снова переносят в верхнюю часть бака, в результате листья капусты постоянно омываются жидкостью; бактериальное брожение ускоряется за счет повышения температуры. Новый ускоренный производственный процесс, запатентованный в 1978 г., был внедрен в промышленность уже через год. Он способствовал не только улучшению самого производства кислой капусты, но и усовершенствованию переработки отходов. Последний процесс осуществляется с применением дрожжей Candida utilis, выделенных из сока кислой капусты исследователями Компьенского университета. При этом 25% молочной кислоты превращается в дрожжевую белковую биомассу, стоки теряют кислотность (pH возрастает до 7) и могут быть переработаны на очистных станциях. Новая технология, дополняющая технику ускоренного получения кислой капусты, весьма выгодна, так как позволяет уменьшить загрязнение окружающей среды соками кислой капусты. Во Франции она применяется с 1977 г. При использованиии молока и овощей (а также некоторых плодов, например маслин) брожение в первую очередь служит сохранению питательных компонентов, которые в противном случае быстро деградируют и становятся несъедобными. Другие виды пищевого брожения используются для улучшения вкуса и запаха продуктов питания с одновременным повышением белкового содержания в пище. Исходными продуктами для этих видов пищевого брожения служат рыба или соевые бобы. Их приготовление и употребление в пищу особенно распространено в странах ЮгоВосточной Азии, где они вносят существенный вклад в белковый компонент питания. Например, индонезийский темпех, содержащий 55% белков, представляет собой плотную лепешку (шрот), изготовленную из соевых бобов, арахиса или кокосовых орехов. С 1960 г. в США изучались различ47

ные стадии производства темпеха. Исследования были направлены на повышение активности плесеней при этом брожении и на улучшение питательных качеств самого темпеха. Стейнкраус из агрономического факультета Корнеллского университета и Хэсселтайн из Сельскохозяйственного исследовательского центра в Пеории (шт. Иллинойс) первыми начали исследования в этой области. Затем последовали другие эксперименты, связанные с производством дешевых и богатых белком пищевых продуктов, основанных на местном сырье. Производство темпеха занимает два-три дня. Сначала соевые бобы на 12 ч погружают в воду и лущат (в Индонезии традиционно принято давить соевые бобы в бамбуковых корзинах, после чего их промывают для удаления шелухи). Соевые бобы кипятят в течение получаса, чтобы разрушить ингибиторы трипсина желудочного сока и гормона роста (эти два ингибитора делают сырые соевые бобы несъедобными для человека). Бобы несколько раз промывают и высушивают. Затем производится засев спорами плесени Rhizopus oligosporus, которые вводятся в массу, находящуюся на подносах или в банановых или тиковых листьях (когда темпех изготовляют в сельской местности). Засев обычно производят остатками от предыдущей порции темпеха. Брожение длится 36–38 ч при температуре 31ºС. В итоге получается компактный светлокоричневый шрот, состоящий из бобового пюре и филаментов гриба Rhizopus. Темпех обычно употребляют в пищу сразу после изготовления или хорошенько обжаривают в кокосовом масле. В процессе гидролизуются α-галактозиды и 30% триглицеридов; при этом высвобождается ценная линолевая кислота в количестве 2,5 г/100 г, хотя суммарное содержание жиров в темпехе не отличается от такового в соевых бобах, т. е. составляет около 20–26% сухой массы. Содержание белка возрастает, достигая 50–55% сухой массы по сравнению с 40–43% в соевых бобах (содержание растворимого азота возрастает с 0,5 до 2%, так как значительная часть белков под действием протеолитических ферментов плесени распадается на аминокислоты), рН возрастает с 5 до 7,6. Брожение – высококачественный процесс: из 100 г сырых соевых бобов получается лишь чуть меньше темпеха, который по праву считается высокопитательной и легкоусвояемой пищей. В его состав входит рибофлавин, никотиновая кислота, причем их концентрация в два и пять раз соответственно превышает концентрацию этих витаминов в соевых бобах. Темпех, приготовленный традиционным путем, содержит также цианокобаламин, который синтезируется бактерией, а не плесенью. Эта бактерия отсутствует в ходе контролируемого в лаборатории производственного процесса, в результате там получают темпех, лишенный цианокобаламина. Промышленное или полупромышленное производство темпеха проходит те же стадии, что и традиционный процесс; это гарантирует не 48

только максимальное содержание ценных пищевых компонентов, но и удаление вредных или ингибирующих веществ из соевых бобов. В центральных районах Явы из копровых шротов при помощи той же плесени, что используется при получении темпеха (R. Oligosporus), приготовляют бонгкрек. В западной части Явы для приготовления двух видов продукта онтьем используются шроты из земляного ореха. Один из этих продуктов темно-коричневый или черный и содержит Rhizopus, другой – красного цвета и содержит Neurospora sitophila. Загрязнение бонгкрека или онтьема бактериями (Pseudomonas) или плесенями (Aspergillus flavus) вызывает накопление чрезвычайно опасных токсинов (токсофлавина и афлатоксина). Исследования, проводимые в Сельскохозяйственном университете и Исследовательском институте питания города Богор, направлены на усовершенствование производственных процессов, связанных с получением этих пищевых продуктов, и на контроль микробного загрязнения. Американские ученые приспособили производственный процесс получения индонезийского темпеха для хлебных злаков и маниока. Они обратили внимание на то, что пшеница, ферментируемая с той же плесенью R. oligosporus в течение 20 ч при температуре 31ºС, превращается в продукт, содержащий в 6–7 раз больше белка, в 5 раз больше рибофлавина и в 2 раза больше никотиновой кислоты, чем обычная пшеница. R. oligosporus производит мало амилаз, поэтому пшеничный крахмал не гидролизуется и не происходит спиртового брожения. Индонезийский темпех и его разновидности, приготовляемые из арахиса и кокосовых орехов, – это высокопитательные продукты, получаемые традиционными способами. Они заслуживают более широкого распространения за пределами своих регионов, поскольку в них содержатся белки, витамины и необходимые жирные кислоты в высокой концентрации, зато почти нет насыщенных жиров; кроме того, они просты в приготовлении и дешевы. Среди других восточных блюд, получаемых ферментацией, можно выделить японское мисо, приготавливаемое из целых соевых бобов, ферментируемых с Asрergillus oryzae; китайское суфу – продукт, напоминающий сыр и получаемый при выращивании на закваске из соевых бобов нескольких видов плесеней, преимущественно Mucor; китайский ангкак, при приготовлении которого рис заражается плесенью Monascus purpureus, придающей рису красный цвет. Соевый соус приготавливали много веков назад в Китае и позднее ввезли в другие страны Дальнего Востока, в частности в Японию, которая в настоящее время является его основным производителем. Соевый соус получают сбраживанием осоложенной смеси соевых бобов и пшеницы Aspergillus oryzae. Промежуточный продукт, называемый койя, помещают в сосуд с равным объемом раствора соли, чтобы получить 49

массу – мороми. Мороми бродит в больших цистернах на протяжении 8–12 месяцев при низкой температуре; время от времени ее перемешивают. В брожении принимают участие бактерии Pediococcus soyae и дрожжи Saccharomyces rouxii. Их специально добавляют к мороми в виде исходных культур, или они размножаются в мороми из уже имеющихся там клеток. В результате брожения мороми обогащается молочной и другими кислотами и этанолом. По окончании процесса мороми отжимают и экстрагированный соевый соус расфасовывают. Остающийся при этом шрот часто скармливают домашним животным. Исследователи из французского Бюро по изучению науки и техники Заморских стран (OSTROM) и Национального исследовательского института прикладной химии (IRCHA) разработали метод обогащения белком содержащих крахмал пищевых продуктов, используемых в качестве корма животным. В сваренный крахмалсодержащий пищевой продукт (маниок), который фрагментирован и содержит около 50% воды и минеральные соли, необходимые для роста штамма Aspergillus niger, производится гомогенный засев этого микроорганизма. Гранулярная и пористая структура крахмалистого материала обеспечивает хорошую диффузию кислорода в субстрате, который постепенно зарастает плесенью. Крахмал разрушается и ассимилируется, а субстрат остается твердым, пористым и хорошо пропускающим воздух. Наилучшие результаты достигаются при содержании в маниоковой муке 55% воды и температуре ферментации 35–40ºС. По мере развития гриба происходит быстрое окисление, которое замедляют добавлением смеси соли аммония и мочевины, служащей также источником азота. Оптимальная плотность засева 2 · 107 спор на 1 г муки. Примерно 20% углеводов превращаются в белки. В 40-литровом экспериментальном ферментере усваивается 8 кг сухого субстрата. После 30 ч ферментации, вызванной штаммом Aspergillus niger при температуре 38ºС, содержание белка в крахмалсодержащих отходах картофеля возрастает с 5 до 18%, а содержание углеводов падает с 65 до 28%. Простота и такие преимущества рассматриваемой технологии, как отсутствие необходимости стерилизовать субстрат, полнота выхода конечного продукта, низкий расход энергии и очень небольшие капиталовложения, позволяют создавать мелкомасштабные установки, приспособленные к условиям деревни или мелких хозяйств. Технология может представлять особый интерес для экваториальных стран – производителей маниока и других крахмалсодержащих клубневых растений, питательная ценность которых в результате применения такой технологии может значительно возрасти. На экспериментальной ферментационной установке емкостью 1200 дм3 были проведены исследования с целью изучения надежности процесса, усовершенствования режимов брожения и анализа питатель50

ной ценности конечных продуктов при скармливании свиньям и домашней птице. В Гэлфском университете (провинция Онтарио, Канада) был разработан сходный процесс переработки для 3000-литрового ферментера, содержащего маниоковую муку и штамм Aspergillus niger. Брожение происходило при температуре 40ºС в очень кислых условиях. Эта опытная установка проверялась в Международном центре тропического сельского хозяйства (CIAT) в Колумбии на предмет получения обогащенных белками пищевых продуктов для кормления крупного рогатого скота. Исследовательская программа была начата в 1972 г. Международным исследовательским центром по развитию (IDRC) в Канаде совместно с CIAT и Гэлфским университетом. Сначала микробиологи использовали штаммы Aspergillus fumigatus и мутанты этого вида плесени, однако оказалось, что этот микроорганизм вызывает аллергические реакции у рабочих, занятых в производственном процессе. Затем стали использовать Rhizopus chinensis и, наконец, Сephalosporium eichorniae. Конечный продукт, полученный из маниока под действием этого штамма, содержал 49% белка и охотно употреблялся в пищу экспериментальными животными. Разработанный процесс прост, недорог, надежен и хорошо приспособлен для применения в сельской местности. Проводились также исследования по генетической модификации гриба, чтобы добиться деградации целлюлозного материала для получения белков, в частности отходов и остатков соплодий бананов. При современной технологии хлебопечения необходима повышенная скорость получения теста; по этой причине брожение осуществляется при более высокой температуре (35ºС) и в тесто кладут больше дрожжей. Можно также использовать штаммы Saccharomyces cerevisiae с большей ферментативной активностью. Наряду с этим тесто подвергают интенсивному механическому перемешиванию, которое влияет на его структуру. Дрожжи являются одними из самых распространенных микроорганизмов. Они встречаются в верхних слоях почвы, в пыли, ягодах и цветах, во многих растениях. Они почти всегда встречаются на яблоках, грушах, винограде, смородине, клубнике и других плодах. Иногда дрожжей так много, что они образуют налет сероватого цвета, видимый невооруженным глазом. Дрожжей много в почве садов и виноградников. Дрожжи распространяют пчелы, осы и другие насекомые, а также ветер. Попадая в благоприятную среду, дрожжи размножаются с удивительной быстротой. В течение всей истории цивилизации дрожжи постоянно находились в сфере деятельности человека и часто напоминали о себе, вызывая процессы брожения различных продуктов. Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae известны человеку уже 4 тыс. лет. Самые давние сведения об использовании дрожжей для 51

приготовления хлеба найдены в Египте. В России хлебопекарные дрожжи выращивали в монастырях, начиная с 14–15 в. Прессованные хлебопекарные дрожжи начали производить в 1792 г. в Германии. Дрожжи выращивают в биореакторах на мелассной среде аэробным глубинным способом при рН 4,4–4,5 по так называемому приточному методу. В чистый аппарат вводят 70–80% теплой воды от необходимого для конечного разведения мелассы количества ( 1 : 1 7 – 1 : 30), добавляют 10% мелассы и растворы солей, устанавливают оптимальные рН среды и температуру и начинают умеренную аэрацию при перемешивании. В такую среду вводят посевной материал. В течение первого часа среду не добавляют, а в последующие 10 ч ее вводят непрерывным потоком в количествах 5; 6; 7,2; 8,2; 9,2; 10,2; 11,4; 12,8; 11,0 и 9% в час от общего количества среды. Аэрация в течение всего времени ферментации также меняется. В первый и последний час культивирования она меньше (1:1), а в период интенсивного размножения дрожжей достигает 1,5–2,0 об/мин. В таких условиях дрожжи проходят все фазы развития. В стационарной фазе роста культуру надо выдержать до полного созревания, т. е. до прекращения интенсивного почкования. Во время ферментации незначительно возрастают концентрации среды (от 0,9 до 2,2 по сахариметру) и титруемая кислота (от 0,3 до 0,8 см 3 1 моль/дм 3 раствора кислоты на 100 см 3 раствора). В таких условиях выход прессованных дрожжей составляет 150% от количества использованного сахара (или 37,5% сухой биомассы). После ферментации дрожжи отделяют от среды путем центрифугирования или фильтрации на фильтр-прессе, затем биомассу тщательно промывают водой. Прессованные дрожжи хранят при пониженной температуре (4–6ºС), так как при комнатной температуре бактерии и микромицеты быстро повреждают дрожжевые клетки. Хорошими считаются хлебопекарные дрожжи, которые насыщают тесто большим количеством диоксида углерода. Дозировка прессованных дрожжей в тесто составляет обычно 1–1,5% к массе муки. Мука содержит ферменты (амилазу и протеазу), которые обеспечивают частичный гидролиз крахмала и белков муки, создавая благоприятный субстрат для роста дрожжей. В целях интенсификации процесса брожения в тесто можно добавить сахарозу или солодовый экстракт. В дрожжах, выращенных на мелассе, много инвертазы. Мука содержит также много молочнокислых бактерий, создающих в тесте кислую среду, которая способствует росту дрожжей и предохраняет тесто от размножения посторонних микроорганизмов. В биомассе дрожжей около 50% белков, свободные аминокислоты и витамины. Дрожжи обогащают хлеб ценными веществами. Человек ежедневно принимает с пищей около 2 г дрожжевой биомассы. Для 52

длительного сохранения хлебопекарные дрожжи высушивают до содержания влаги 8–9%. При производстве пива обычно используют специально селекционированные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae,а также дрожжи S. carlsbergensis и др. Выбор штамма является наиболее важным условием, определяющим свойства пива: его окраску, аромат, крепость. Пивное сусло после гидролиза крахмала ферментами ячменного солода содержит следующие углеводы (в % от общего количества углеводов): мальтозу – 53, глюкозу – 12, мальтотриозу – 13, декстрин – 22, небольшое количество мальтотетраозы. Пивные дрожжи ассимилируют мальтозу, глюкозу и мальтотриозу, но не используют декстрины и мальтотетраозу. Поскольку сейчас популярны светлые сорта пива (с низким содержанием углеводов), генетики пытаются создать пивные дрожжи, способные ассимилировать декстрины. Для упрощения технологии пивоварения поставлена задача получить рекомбинантные пивные дрожжи, способные перерабатывать крахмал непосредственно в этанол. Получен штамм S. cerevisiae с трансплантированным геном бактерии Bacillus subtilis, детерминизирующим р-глюканазу. Новый штамм не требует предварительного солодования ячменя. Пиво высокого качества можно получить только при отсутствии в сбраживаемом растворе посторонних микроорганизмов, что требует соблюдения строгих мер предосторожности на всех стадиях пивоварения. В последние годы установлена способность дрожжей к самозащите обитаемого субстрата. Среди них обнаружены особые, агрессивные штаммы, уничтожающие другие виды микроорганизмов. Эти штаммы названы убийцами, или киллерами. Способность дрожжей убивать чужеродные микроорганизмы определяется особыми генами, локализованными в цитоплазме клетки. Их деятельностью управляют хромосомные гены. Путем скрещивания дрожжей, имеющих агрессивные свойства, с промышленными пивными дрожжами получен штамм пивных дрожжей, убивающий дикие дрожжи. Селекционеры надеются получить штаммы пивных дрожжей, уничтожающие также бактериальную микрофлору. Усовершенствовать пивные дрожжи можно также, индуцируя им способность к флокуляции (слипанию клеток) в конце ферментации, что позволяет удалить дрожжи из готового пива. Флокуляция зависит от состава среды, условий культивирования, но одновременно является также генетически детерминированным свойством, контролируемым генами. Пивоварение можно отнести к весьма консервативным отраслям народного хозяйства. Это частично объясняется тем, что изготовление 53

каждого сорта фирменного высококачественного пива традиционно связано с рядом взаимосвязанных технологических тонкостей. Тем не менее в пивоварении постоянно внедряются новые технологические приемы, позволяющие интенсифицировать производственные процессы. Среди них наибольший интерес представляют непрерывные процессы, например непрерывное солодование, а также непрерывное брожение пивного сусла в специальных бродильных колоннах с рециркуляцией дрожжей при использовании флокулирующихся штаммов. Трудоемкий и продолжительный процесс солодования зерна заменяют обработкой его комплексом осахаривающих ферментов микробного происхождения. Для изготовления сусла можно заменить часть солода ферментолизатом муки. Такое сусло содержит как гидролизованный крахмал, так и гидролизованные белки зерна и по химическому составу близко к натуральному суслу, которое добавляют к ферментируемому суслу в небольших количествах в качестве источника вкусовых и ароматизирующих веществ. Современное производство соков немыслимо без применения ферментов, среди которых ведущее место принадлежит пектина-зам — комплексу ферментов, состоящему из полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и др. Пектиназы продуцируют микромицеты Aspergillus niger, бактерии Erwinia carotovora, Clostridium sp. и др. Применение пектиназ в производстве соков обусловлено тем, что они катализируют гидролиз пектиновых веществ растительных клеток, тем самым освобождая сок из клеточных структур. В 1 дм3 виноградного сока содержится 0,2–4,0 г пектина, еще больше его в яблочном и томатном соках. При хранении сока пектин оседает. Освобождение сока от пектина обязательно при изготовлении сиропов путем упаривания, так как присутствие пектина может вызвать желеобразование. Обработка соков пектолитическими ферментами снижает содержание пектина до 50 мг/дм3. Классическим биотехнологическим процессом является виноделие. Виноделие, как известно, основано на сбраживании ягодных или фруктовых соков особыми штаммами дрожжей, в основном рода Saccharomyces. На фоне традиционных приемов виноделия, передаваемых виноделами из поколения в поколение, происходит постепенное вторжение современной биотехнологии. Совершенствуется техника приготовления и хранения соков, с помощью генной и клеточной инженерии создаются новые высокопродуктивные штаммы дрожжей, разрабатываются непрерывные процессы сбраживания сока с использованием иммобилизованных клеток.

54

6.2. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДИКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ Немалый ассортимент пищевых продуктов в настоящее время получают, применяя методику генной инженерии. В Приложении 9 к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» приведено трактование термина «генетически модифицированные источники пищи». Так называют используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде пищевые продукты (компоненты), полученные из генетически модифицированных организмов. А генетически модифицированные организмы, согласно Приложению 9, – это организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в т. ч. гены, их фрагменты или комбинацию генов. Общественное мнение к генным манипуляциям с продуктами питания относится неоднозначно. В США был проведен социологический опрос. Людям предлагалось ответить на два вопроса: как вы относитесь к трансгенным продуктам? Станете ли их покупать, если они будут улучшенного качества, но дороже? 48% опрошенных дали отрицательный ответ, 30 – положительный, остальные – неопределенный. Когда же вопрос сформулировали по-другому, а именно: если качество новых продуктов останется неизменным, а цена упадет, американские потребители ответили с точностью до наоборот. 48% опрошенных выразили готовность покупать трансгенную еду, 30 – отказались. В Швейцарии, например, запрещено использовать в виде продуктов генетически трансформированные овощи и фрукты и выпускать их в окружающую среду, но лабораторные исследования ведутся в закрытых системах, под жестким контролем. В ФРГ в 1996 г. активисты антигенного движения разорили 14 опытных полей Института им. Макса Планка. В то же время бельгийцы и канадцы сеют устойчивый к гербицидам рапс, из которого делают масло. Французы возделывают невосприимчивый к ядохимикатам табак. В США разрешено продавать 16 наименований генетически модифицированных растений, 6 из них созрели в лабораториях Монсанто, в т. ч. помидоры. Такие помидоры собирают бурыми и хранят при температуре 12ºС. При комнатной температуре овощи за считанные часы становятся кроваво-красными и очень долго сохраняют свой товарный вид. Шесть культур выведены из-под государственного регулирования. 55

В Зеленограде вывели необыкновенно устойчивый трансгенный картофель. Директор Информационного центра по биотехнологии при Международном совете научных союзов и Российской Академии наук А.Голиков на вопрос об опасности трансгенных продуктов ответил: «Никто еще не показал, что это опасно. Но потенциальный риск исключить нельзя, так как мы не знаем отдаленных результатов, т. е. возможны непредвиденные эффекты. Как бы ни была мала их вероятность, но если она не равна нулю, то рано или поздно это событие произойдет. Поэтому разработана Конвенция о биологическом разнообразии, в которой речь идет о необходимости «безопасной передачи, использования и применения любых живых измененных организмов, являющихся результатом биотехнологии и способных оказать неблагоприятное воздействие на сохранение и устойчивое использование биологического разнообразия». В СанПин 2.3.2.1078-01 указано: «Для пищевых продуктов из генетически модифицированных источников обязательна информация: «генетически модифицированная продукция», или «продукция, полученная из генетически модифицированных источников», или «продукция содержит компоненты из генетически модифицированных источников» (для продуктов, содержащих более 5% компонентов ГМИ). Пищевые продукты, полученные из ГМИ и не содержащие дезоксирибонуклеиновую кислоту и белок, в дополнительном этикетировании не нуждаются в случае полной эквивалентности пищевой ценности продукта традиционному аналогу». В табл. 3 перечислены пищевые продукты, полученные из генетически модифицированных источников (использованы данные Приложения 4 СанПиН 2.3.2.1078-01). Таблица 3 № пп 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Наименование пищевого продукта 2 Пищевые продукты, подлежащие этикетированию Соевые бобы Концентрат соевого белка и его текстураты Изолят соевого белка Гидролизат соевого белка Соевая мука и ее текстураты Соевое молоко, в т. ч. сухое Ферментированные соевые продукты Соевый соус Тофу Кукуруза для непосредственного употребления в пищу (мука, крупа)

56

Окончание таблицы 3 1 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

2 Кукуруза замороженная и консервированная Попкорн Картофель для прямого потребления Пюре картофельное сухое Картофельные чипсы Томаты для непосредственного употребления в пищу Томатная паста Томатный сок Томатные соусы, кетчупы Кабачки и продукты из/или с использованием кабачков Дыня и продукты из/или с использованием дыни Продукты, содержащие цикорий Пищевые добавки, произведенные из ГМИ Биологически активные добавки к пище, содержащие ГМИ-компоненты Пищевые продукты, не требующие этикетирования Соевое и кукурузное масло рафинированное Соевый лецитин Фруктоза, полученная из сои, кукурузы, сахарной свеклы Кукурузный крахмал Глюкоза, полученная из кукурузы, сахарной свеклы, картофеля Патока, полученная из кукурузы, картофеля Рапсовое, льняное, хлопковое масла

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Какие культуры микроорганизмов применяют при производстве сыров, йогурта, сметаны, кефира? 2. Охарактеризуйте процесс квашения овощей. 3. Охарактеризуйте технологию получения темпеха. 4. Какие микробиологические процессы применяются в хлебопечении? 5. Какие источники пищи называют генетически модифицированными? 6. Какая информация должна быть указана на этикетках генетически модифицированных продуктов? 7. Какие генетически модифицированные продукты производят в настоящее время? 8. Представляют ли опасность для человека генетически модифицированные продукты? 57

9. Для какой группы продуктов обязательно указание их происхождения как генетически модифицированных? Почему? РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 2. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: СанПиН 2.3.2.1078-01. – М.: Минздрав России, 2002. – С. 9, 122–123, 147. 3. Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 4. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991. – 112 с. 5. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с.

7. ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКА ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ Дефицит белка в питании является глобальной проблемой человечества. Недостаток и неполноценность белка приводит к появлению различных заболеваний, увеличению смертности, снижению работоспособности, неблагоприятно влияет на воспроизводство населения и здоровье будущего поколения. В пище населения промышленно развитых стран содержание общего белка составляет 90, в т. ч. животного 44 г в сутки на человека, что соответствует норме, а в развивающихся странах – 58 и 9 г в сутки соответственно. Потребности в белке не могут быть решены на базе традиционных ресурсов растениеводства и животноводства из-за ограниченности посевных площадей, климатических особенностей. Альтернативным источником белка является промышленный биосинтез белка одноклеточных микроорганизмов (БОО). Возможны два вида пищевой цепочки потребления белка одноклеточных организмов. Энергетически более выгодной является двухчленная пищевая цепочка (пищевой белок – человек), т. е. непосредственное потребление белка в пищу, так как сельскохозяйственные животные превращают в животный белок не более 10–30% растительного белка. Но при этом возникают сложные проблемы: возможны аллергические реакции, желудочные заболевания, в ряде случаев необходимо решить проблему плотной клеточной стенки, органолептические свойства белка 58

одноклеточных организмов значительно отличаются от привычных продуктов питания. И, наконец, главной, трудноразрешимой проблемой является невозможность изменить привычки человека, которые, как известно, являются самыми консервативными. Наглядным примером может служить отношение людей к новым формам пищи из белка соевых бобов. Эти продукты появились на прилавках магазинов около 10 лет назад; их ассортимент постепенно расширяется. Среди студентов технологического факультета КамчатГТУ был проведен социологический опрос об их отношении к продуктам из сои. При этом 85–90% студентов выражают негативное мнение, которое объясняют в основном непривычными органолептическими показателями продуктов из сои. Органолептические показатели микробиологического белка являются для человека еще более непривычными. Поэтому основным направлением использования белка одноклеточных организмов является производство кормового белка. В 80-е гг. прошлого века СССР был единственной в мире страной, производящей белок одноклеточных организмов промышленным методом в больших количествах. Объем производства превышал 1 млн. т в год, в т. ч. 40% белка одноклеточных организмов выпускалось на основе гидролизатов древесины и сельскохозяйственных отходов и 60% – на очищенных парафинах нефти. В промышленно развитых странах крупномасштабное производство белка одноклеточных организмов практически отсутствовало, так как для обогащения кормов использовались соевые бобы, содержащие большое количество белка и стоимость которых была в 1,5–2 раза ниже стоимости белка микроорганизмов. Для России этот вариант неприемлем, так как в нашей стране практически нет природно-климатических зон, пригодных для выращивания сои, а крупномасштабный экспорт из США – основного производителя и экспортера – поставил бы Россию в полную производственную зависимость. В то же время значительные природные ресурсы углеводородного сырья благоприятствуют дальнейшему развитию производства кормового белка одноклеточных организмов в России. Решающим фактором для высокой продуктивности мясного животноводства служит наличие сбалансированных по качеству белка и аминокислотному составу кормов. В 80-е гг. прошлого века животноводство СССР потребляло 150 млн. т зерна и давало 14 млн. т мяса. В США эти показатели составили 160 и 26 млн. т соответственно, что явилось результатом сбалансированности кормового рациона. Производя белок одноклеточных организмов, можно решить проблему сбалансированности кормов. Биомасса микроорганизмов содержит 40–85% белка, имеет сбалансированный аминокислотный состав. Эту биомассу можно производить 59

круглогодично, вне зависимости от климата и погоды, на дешевом сырье, с высокой интенсивностью. Благодаря этим достоинствам производство белка одноклеточных организмов является перспективным направлением для решения проблемы дефицита белка. Принципиальная технологическая схема получения микробных белковых препаратов имеет вид: СЫРЬЕ ↓ ПОДГОТОВКА СЫРЬЯ (измельчение, гидролиз, освобождение от токсических веществ и т. д.) ↓ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ↓ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ↓ ОТДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ПРОДУЦЕНТА ОТ ЖИДКОЙ ЧАСТИ И ЕЕ ПРОМЫВАНИЕ ↓ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ БИОМАССЫ И ПЛАЗМОЛИЗ КЛЕТОК ↓ ВЫСУШИВАНИЕ МИКРОБНОЙ МАССЫ ДО СОДЕРЖАНИЯ ВЛАГИ 8–10% ↓ ФАСОВАНИЕ И УПАКОВЫВАНИЕ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА ↓ ХРАНЕНИЕ МИКРОБНОГО БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА

7.1. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ 7.1.1. Особенности метаболизма микроводорослей Как бы ни различались современные методы культивирования микроводорослей, все они основаны на обеспечении клеток достаточным количеством света, углекислоты и других питательных веществ. При отсутствии ограничивающих факторов рост числа клеток идет в геометрической прогрессии в соответствии с уравнением: 60

kN =

dN , dt

где k – удельный коэффициент размножения, N – исходное число клеток, dN – прирост числа клеток за время dt. В отличие от популяций гетеротрофных организмов, где каждому из факторов, определяющих продуктивность культуры, обеспечен одинаковый доступ ко всем индивидам в любой рассматриваемый момент времени, в популяции автотрофных клеток исключение составляет световой фактор, который в силу оптических свойств культуры как сильно поглощающей свет среды достаточно быстро становится ограничивающим. Кратковременность экспоненциальной фазы роста в интенсивно растущих культурах объясняется быстрым формированием полностью поглощающего свет слоя, численность клеток в котором при заданной интенсивности света остается величиной постоянной, несмотря на увеличение плотности по мере роста всей популяции. В культурах высоких плотностей для обеспечения интенсивного роста применяют высокие освещенности, высокие температуры и высокие концентрации солей, т. е. создается напряженность всех факторов среды; «отставание» какого-либо одного фактора, нарушая сбалансированное взаимодействие всех факторов, может повлечь не только снижение продуктивности, но во многих случаях и гибель культуры. Развитие исследований по массовой культуре водорослей дало толчок к совершенствованию методов лабораторного их выращивания. В промышленных масштабах культивируют сине-зеленые и зеленые микроводоросли, которые способны синтезировать вещества своей клетки за счет световой энергии. Наиболее интересным объектом исследований являются синезеленые водоросли, или цианобактерии. Они резко отличаются от других водорослей простотой внутренней организации клеток. Клетки их лишены оформленного ядра, что сближает их с бактериями. Вместе с бактериями сине-зеленые водоросли составляют раздел организмов, обозначаемый как прокариоты (Prokariota), т. е. доядерные, в отличие от всех остальных растений и животных, обладающих оформленным клеточным ядром и обозначаемых как эукариоты (Eukariota), т. е. истинно ядерные. Сине-зеленые водоросли – старейшая группа среди автотрофных организмов и среди организмов вообще. Остатки подобных им организмов найдены среди строматолитов, возраст которых составлял около трех миллиардов лет. В архейских доломитах Трансвааля были найдены скопления графита. Оказалось, что это не что иное, как остатки колоний водорослей, 61

живших 2 млрд. 600 млн. лет назад; по своим особенностям они наиболее близки к сине-зеленым. В Подмосковье от Тулы до Новомосковска открыты залежи гумусово-сапропелевых углей (богхедов). Они образовались за счет органического вещества сине-зеленых водорослей, в массе развивавшихся в континентальных водоемах в карбоновое время. Такие же угли известны на Южном Урале, в Шотландии, Пенсильвании. Химический анализ обнаружил в этих остатках продукты разложения хлорофилла. Клетки сине-зеленых водорослей живут отдельно, а иногда соединяются в колонии или образуют нити. Нити также могут жить отдельно или образовывать колонии. У сине-зеленых водорослей найдено около 30 различных внутриклеточных пигментов, относящихся к четырем группам – хлорофиллам, каротинам, ксантофиллам, билипротеинам. Большинство сине-зеленых водорослей растут только в присутствии света интенсивностью не более 500–1000 лк, реже 8000 лк. Очень высокая интенсивность света может ингибировать рост клеток сине-зеленых водорослей. Все сине-зеленые водоросли растут в присутствии молекулярного кислорода уже потому, что сами его выделяют. Но высокая концентрация кислорода может ингибировать рост этих организмов, и нередко, особенно в присутствии света, они предпочитают микроаэробные условия. Большинство сине-зеленых водорослей растут при значениях рН среды 7,0–9,0, а отдельные виды и при рН 10,0. Оптимальное значение рН чаще всего равно 7,5–8,5. Большинство видов сине-зеленых водорослей, выделенных в виде чистых культур, растут на чисто минеральных средах, содержащих набор солей микро- и макроэлементов. Для культивирования штаммов, выделенных из соленых водоемов, в среды добавляют хлорид натрия. Потребность сине-зеленых водорослей в сере для биосинтетических процессов могут обеспечивать сульфаты. В качестве источников азота они обычно используют нитраты и соли аммония, часто также мочевину. Отдельные виды растут за счет использования нитритов. Значительное число сине-зеленых водорослей могут фиксировать молекулярный азот. Источником углерода для них служит углекислый газ. Углекислота может вводиться в автотрофно выращиваемые культуры водорослей различными методами. Наиболее распространенный способ – подача углекислоты в виде газовоздушной смеси, осуществляющей, помимо снабжения водорослей источником углерода, функцию перемешивания культуры. Некоторые сине-зеленые водоросли могут расти при освещении в результате использования и углекислоты, и органических веществ, т. е. в фотомиксотрофных или фотогетеротрофных условиях. Это 62

представители родов Dermocarpa, Pleurocapsa, Oscillatoria, Nostoc, Nodularia и др. Сине-зеленые водоросли могут потреблять из среды довольно много органических веществ, включая некоторые сахара, органические кислоты (муравьиную, уксусную, гликолевую, пировиноградную, молочную, янтарную, яблочную, лимонную и др.), аминокислоты, пурины и пиримидины. Обнаружена также способность отдельных видов воздействовать на нафталин и другие соединения ароматического ряда. Но далеко не всегда органические вещества стимулируют рост сине-зеленых водорослей. Некоторые из них (пропионат, отдельные аминокислоты) даже в низкой концентрации ингибируют рост сине-зеленых водорослей. Органических соединений, поддерживающих рост культуры, известно немного. Чаще всего это D-глюкоза, реже D-фруктоза, D-рибоза, мальтоза и глицерол. Однако фотоавтотрофный тип питания является для сине-зеленых водорослей основным, но не единственным. Кроме настоящего фотосинтеза культуры способны к фоторедукции, фотогетеротрофии, автогетеротрофии, гетероавтотрофии, полной гетеротрофии. При наличии в среде органических веществ они используют их в качестве дополнительных источников энергии. Благодаря способности к смешанному ( миксотрофному ) питанию, они могут быть активными и в крайних для фотоавтотрофной жизни условиях. В подобных местообитаниях почти полностью отсутствует конкуренция, и сине-зеленые водоросли занимают доминирующее место. Характерной особенностью этих водорослей является синтез азотсодержащего запасного продукта цианофицина. Он представляет собой полипептид, образованный из равных количеств аргинина и аспарагиновой кислоты. Молекулярная масса 25000–100000. Такой полимер не найден ни у каких других организмов. В клетках он образует гранулы. Полагают, что цианофицин может служить источником азота при его недостатке в среде, а также использоваться культурами в качестве источника энергии для синтеза АТФ, когда их клетки находятся в темноте в анаэробных условиях. В целом химический состав сине-зеленых водорослей отличается высоким содержанием азотистых веществ. Общее содержание азота в биомассе Anabaena cylindrica достигает 6,51% сухого вещества. У Anabaena variabilis и A. oscillarioides содержание белков колеблется от 23,7 до 40,0% сухого вещества. Содержание белка у Spirulina platensis достигает 70% органической части. В водоемах, цветущих сине-зелеными водорослями, наблюдается рост количества органического азота, главным образом в виде аминокислот, а также в виде амидов и пептидов. Биомасса сине-зеленых водорослей может служить сырьем для получения белка. 63

7.1.2. Выделение чистой культуры микроводорослей При выделении чистой культуры сине-зеленых водорослей возникает ряд затруднений, связанных с очисткой от сопутствующих водорослей и бактерий. Процесс еще более усложняется, если культура сине-зеленых водорослей длительно развивалась в лабораторных условиях и создалась стойкая ассоциация с другими спутниками. Поэтому при выделении чистой культуры прибегают к предварительной процедуре отмывания от сопутствующих организмов либо на крупнопористых мембранных или ядерных фильтрах, либо на сеточках, используемых для электронной микроскопии. Далее чистую культуру изолируют на твердых средах стандартным клонированием отдельных колоний. Другой способ очистки сине-зеленых водорослей от спутников основан на их способности к скользящему движению. Сущность способа заключается в том, что свежеотобранный материал, содержащий синезеленые водоросли, после предварительного отмывания на фильтре или на сеточках помещается на поверхность подсушенной агаризованной среды в чашку Петри. Затем под бинокулярной лупой через каждые 2 ч ведут наблюдения за нитями водорослей: отползшие нити поддевают тонко оттянутым носиком пастеровской пипетки, переносят в жидкую среду, разлитую в пробирки по 1–2 см3, и экспонируют на свету. Концентрация агара в среде не должна превышать 0,8–1,2%. Такую среду разливают в чашки Петри и подсушивают либо при комнатной температуре двое суток, либо в сушильном шкафу при температуре 65ºС в течение 4–6 ч. Для дальнейшего культивирования используют питательную среду BG-11. Эта среда поддерживает прекрасный или умеренный рост пресноводных сине-зеленых водорослей. Для выращивания культур, выделенных из мест обитания со щелочной реакцией среды, используют среду М. В табл. 4 приведен химический состав питательных сред. Таблица 4 Наименование химического компонента 1 NaNO3 K2HPO4 · H2O MgSO4 · 7H2O CaCl2 · 2H2O Лимонная кислота

Содержание компонента в среде BG-11, г 2 1,5 0,04 0,075 0,036 0,006

64

Содержание компонента в среде М, г 3 0,75 0,02 0,038 0,018 0,003

Окончание таблицы 4 1 Железо аммонийное лимоннокислое Na2CO3 Раствор микроэлементов (B, Mn, Zn, Mo, Cu, Co) Вода деионизированная

2 0,006

3 0,003

0,02 1 см3

0,02 1 см3

1000 см3

250 см3

При изоляции и очистке культуры предпочтительно использовать интенсивность света не более 500 лк. Температура культивирования должна быть около 20ºС, однако при выделении культур из низкотемпературных источников культивирование лучше вести при 10ºС. Реакция питательной среды должна быть нейтральной или щелочной. Насыщение среды углекислотой в процессе культивирования не требуется. В некоторых случаях, особенно при выделении культур из экстремальных условий (горячие источники, содовые озера, кислые ручьи), рекомендуется добавлять к среде природную воду. Развиваясь в огромном количестве в естественных водоемах, синезеленые водоросли в чистых культурах растут крайне медленно и обычно не образуют такой высокой биомассы, как в природе. При этом они значительно изменяются как морфологически, так и физиологически, что значительно затрудняет определение их систематического положения. В частности, резко изменяется форма и темп роста, образование колоний, размеры клеток, степень ослизнения, интенсивность фотосинтеза, количественное соотношение пигментов, потребность в отдельных элементах питания, биохимический состав и др. Например, Microcystis aeruginosa в культуре растет в виде гомогенных клеточных суспензий, образуя бесформенные конгломераты клеток только при слипании в период старения культуры. Aphanizomenon flosaquae в культуре не дает серповидных колоний и растет в виде отдельных нитей. Наблюдения показали, что определенную помощь при введении в культуру отдельных видов сине-зеленых водорослей могут оказать физиологически активные вещества и витамины. 7.1.3. Культивирование микроводорослей В оптимальных условиях культивирования прирост биомассы синезеленых водорослей рода Spirulina составляет 20 г сухого вещества в 65

сутки на 1 м2 поверхности. Ежегодные урожаи спирулины в 10 раз превышают урожаи пшеницы, а выход белка в 10 раз выше, чем у бобов сои. Данные по урожайности некоторых белковых культур приведены в табл. 5. Таблица 5 Культура

Сухой вес, т/га/год

Пшеница Кукуруза Соя Спирулина

4 7 6 50

Неочищенный белок, т/га/год 0,5 1,0 2,4 35,0

Животноводство Камчатской области испытывает недостаток кормов с высоким содержанием белка. Комбикорма завозные. Это отражается на их ценах. Белок животного происхождения (рыбную муку) допускается вводить в состав кормов в ограниченном количестве (5%) и использовать в основном для откорма свиней и птиц. Возможности получения на Камчатке высокобелкового сырья растительного происхождения ограничены. Производство белковых компонентов комбикормов из биомассы сине-зеленых водорослей Камчатки имеет значительный потенциал. В горячих источниках Камчатки обнаружено 52 вида водорослей, из которых 28 относятся к сине-зеленым. В альгобактериальных сообществах гидротерм Камчатки преобладают термофильные виды синезеленых водорослей родов Mastigocladus и Phormidium. По данным Т.И. Кузякиной и Л.В. Захарихиной, проводивших исследования на Верхне-Паратунских и Зеленовских горячих источниках, прирост биомассы сине-зеленых водорослей рода Phormidium может достигать 50,0 мг сухого вещества в час на площади 1 м2. Учитывая высокую скорость прироста биомассы и высокое содержание белка в ней, можно говорить о перспективности использования биомассы сине-зеленых водорослей гидротерм Камчатки в качестве источника белка. Промышленное культивирование микроводорослей осуществляется в настоящее время в нескольких странах. Первая опытная фабрика мощностью 150 т водорослевой муки в год вступила в строй в Мексике на озере Текскоко, в месте традиционного сбора биомассы сине-зеленой водоросли Spirulina platensis, в 1973 г. В 1982 г. производство достигло 1000 т муки в год. В Японии в зависимости от сезона в открытых бассейнах культивируют различные штаммы зеленой микроводоросли Chlorella. Успешная работа этих установок дала основание для строительства в Японии за66

вода производственной мощностью 200 тыс. т в год кормового белкового концентрата для замены рыбной и соевой муки в животноводстве. В Узбекистане в открытых установках культивируют хлореллу, урожай которой составляет 30–60 т сухого вещества с гектара в год. Развитие способов культивирования микроводорослей ведется в двух направлениях: экстенсивное культивирование в открытых водоемах и интенсивное культивирование в закрытых установках в полностью контролируемых условиях. При массовом культивировании используют или обычные минеральные среды, или специально сбалансированные, учитывающие расходование основных компонентов в процессе роста биомассы. Выделив альгологически чистую культуру сине-зеленых водорослей рода Phormidium из альгобактериальных сообществ НижнеПаратунских горячих источников, ее можно использовать для производства водорослевой биомассы как источника кормового белка. Целесообразно культивировать сине-зеленые водоросли на Камчатке в реакторах закрытого типа, используя в качестве субстрата искусственную среду и применяя энергию термальных источников для поддержания оптимальных условий культивирования. При решении этой задачи станет возможным решение проблемы дефицита кормового белка для камчатского животноводства. При производстве белка из биомассы одноклеточных водорослей первостепенное значение имеет процесс их культивирования.

7.1.3.1. Культивирование микроводорослей в открытых системах Экстенсивное культивирование микроводорослей в открытых водоемах ведется в основном для получения биомассы, а также для очистки сточных вод. Для получения биомассы используют простые и недорогие устройства. Чаще всего это круглые, овальные или прямоугольные бассейны небольшой глубины, реже – цементированные или выстланные пленкой траншеи, различной формы лотки, цистерны. Поскольку регулирование температурных условий в открытых водоемах мало осуществимо, такое культивирование микроводорослей обычно проводят в районах, где мало облачных и дождливых дней, невелики суточные перепады температур – в тропиках и субтропиках. В некоторых случаях в холодное время применяют искусственный подогрев. Примером простейшего вида экстенсивного культивирования микроводорослей является выращивание сине-зеленой водоросли спирулины на озере Текскоко в Мексике. Площадь поверхности озера составляет 900 га. Сбор биомассы спирулины производится круглые сутки. Удвоение биомассы микроводоросли 67

в озере происходит каждые 3–4 суток. После фильтрации суспензия высушивается горячим воздухом и измельчается в муку. Готовый продукт используется в качестве источника белка в диетическом питании. Открытые установки в виде круглых бассейнов диаметром до 25 м, глубиной 0,2 м эксплуатируются в Японии (рис. 8).

Рис. 8. Схема открытой установки для культивирования микроводорослей: 1 – резервуар; 2 – водорослевая суспензия; 3 – сегнерово колесо; 4 – насос; 5 – впуск смеси воздуха с углекислым газом; 6 – выгрузка суспензии

Взвесь водорослей циркулирует в бассейне при помощи насоса. Лопатки сегнерова колеса имеют отверстия, и воздух с углекислотой барботируется через эти отверстия. Лопатки приводятся во вращение реактивным движением и перемешивают взвешенные водоросли. Четыре установки обычно соединяют в батарею. После выгрузки взвесь водорослей центрифугируют и сушат в распылительной сушилке при температуре 100ºС. На таких установках в Японии культивируют зеленую микроводоросль хлореллу для производства концентрата, применяемого для замены рыбной и соевой муки в животноводстве. В Узбекистане в установках открытого типа культивируют хлореллу, урожай которой составляет 30–60 т сухого вещества с гектара в год. Лимитирующим фактором культивирования там является сравнительно низкая зимняя температура (2–5ºС). В Тржебоне (Чехия) действует установка каскадного типа (рис. 9) для культивирования зеленой водоросли сценедесмус. Установка состоит из панелей переменной площади, собранных из пластиковых желобов. Сечение желобов влияет на оседание водорослей на дне желоба. Панели защищены прозрачным покрытием, позволяющим сохранять тепло при уменьшении освещенности. Панели можно ориентировать на солнце. Стационарные панели установлены на крышах зданий, сооружений. 68

Рис. 9. Схема открытой установки каскадного типа: 1 – насос; 2, 4 – резервуар со взвесью водорослей; 3 – желоба; 5 – баллон с углекислотой

В Болгарии подобная установка размещена на поверхности грунта. При строительстве были учтены возможности использования местных природных ресурсов, обеспечивающих наряду с хорошей инсоляцией применение природных источников углекислоты и регулирование температуры за счет воды горячих источников. Лабораторные испытания биомассы сине-зеленых водорослей, обитающих в Нижне-Паратунских источниках Камчатки, показали, что содержание белка в ней составляет около 50% органического вещества. Эти водоросли можно культивировать для получения кормового белка. Но продуктивность биомассы зависит от сезонных перепадов температуры. Кроме того, биомасса сине-зеленых водорослей природных источников Камчатки накапливает тяжелые металлы, соли которых содержатся в водах гидротерм. Так, по данным А.А. Ефимова и М.В. Ефимовой, в биомассе сине-зеленой водоросли рода фордимиум, отобранной в горячих источниках Паратунки, содержание меди и цинка составило 0,3 и 1,28 мг/кг сухого вещества соответственно. В биомассе водорослей горячих источников Паужетки содержание меди составило 17,5, цинка – 113,5, кадмия – 1,89, свинца – 156,0 мг/кг сухого вещества. Основным недостатком получения белка при культивировании микроводорослей в открытых установках является зависимость от погодных условий, из-за чего невозможно длительное, стабильное снятие урожая. Другими серьезными недостатками являются подверженность инфекциям (бактерии, личинки комаров, различные виды водорослей), влияние химического состава среды на химический состав биомассы, как в случае с сине-зелеными водорослями камчатских гидротермальных источников.

69

7.1.3.2. Культивирование микроводорослей в закрытых системах Условия культивирования микроводорослей можно улучшить путем использования закрытых установок с естественным освещением. В этом случае микроводоросли выращивают в прозрачных трубах или специально сконструированных культиваторах, в которых предусмотрено поддержание оптимальных условий культивирования. Установки закрытого типа позволяют в 1,5–2 раза увеличить урожай водоросли с единицы объема среды и снизить себестоимость биомассы. Для повышения скорости роста биомассы в закрытых установках через среду продувают воздух, обогащенный диоксидом углерода. Газовую смесь вводят в культуру с помощью компрессора через перфорированные трубки или с током суспензии клеток через центробежный насос. При массовом культивировании в закрытых системах используются или обычные минеральные питательные среды, или специально сбалансированные, учитывающие расходование основных компонентов в процессе роста биомассы. Иногда в целях снижения стоимости получаемой биомассы для приготовления питательных сред применяют минеральные удобрения или естественную минеральную воду. Возможно ведение процесса в миксотрофных условиях при добавлении к минеральной среде органических веществ. Это позволяет получить большую биомассу при относительно низкой интенсивности света. Экономически выгодным оказалось использование сточных вод некоторых производств, в частности сахарных и гидролизных заводов. В Южной Италии построена фабрика, где выращивается спирулина на площади 2 га в закрытой системе – трубчатом реакторе (рис. 10). Трубы одновременно служат солнечным коллектором и тем самым позволяют продлить продуктивный сезон. Эксперименты во Флоренции показали, что если размножение спирулины в прудах, озерах продолжается с июля по сентябрь, в трубах реактора оно начинается в апреле и заканчивается в середине октября. При этом урожай биомассы спирулины в 10 раз превышал урожай пшеницы, а выход белка был в 10 раз выше, чем у соевых бобов. Реактор состоит из 50-метровой прозрачной стеклянной трубки диаметром 1 см. Культура микроводоросли подвергается рециклированию под действием насоса. Сообщество представлено одной водорослью и тремя бактериями; оно является устойчивым к заражению. В состав среды входит аммиак, минеральные соли, углекислота. В процессе культивирования выделяется чистый кислород. В полученной биомассе содержится до 50% белка, липиды, крахмал, глицерин. Такой реактор называют фотореактором, так как он позволяет решить задачу контроля роста биомассы за счет использования солнечной 70

энергии и углекислоты, т. е. прирост биомассы микроводоросли происходит за счет фотосинтеза.

Рис. 10. Схема трубчатой закрытой установки для культивирования спирулины

В настоящее время разработаны установки и аппараты интенсивного управляемого культивирования фотосинтезирующих микроводорослей в полностью контролируемых условиях с автоматической стабилизацией оптимальных условий и непрерывной автоматической регистрацией физиологических функций культуры: скорости роста, интенсивности фотосинтеза и др. В зависимости от конструкции установок ведут периодическое, проточное или комбинированное выращивание биомассы; процесс может быть одно- или многоступенчатым. Наиболее совершенным считается проточное выращивание микроводорослей, при котором по сигналам, поступающим от самой культуры, осуществляется автоматический отбор прирастающих клеток, подача свежей питательной среды и стабилизация оптической плотности культуры. Для культивирования используют высокопродуктивные штаммы микроводорослей, полученные в результате селекции или под действием мутагенов. Чаще всего в качестве продуцентов используют термофилы – светолюбивые формы, сохраняющие высокую скорость роста в плотных популяциях. При интенсивном культивировании микроводорослей продуктивность достигает 80–100 г сухой биомассы с 1 м2 освещаемой поверхности в сутки. Максимальная продуктивность культуры является главным 71

преимуществом этого метода. Однако в связи с большими затратами электроэнергии стоимость продукции высока. По этой причине интенсивное культивирование не используется для производства белка одноклеточных организмов в промышленных масштабах. Для производства белка микроорганизмов разработаны технологии, различающиеся видом и назначением готового продукта, видом продуцента, исходным материалом, типом процесса. Выбор технологии производства белка одноклеточных организмов во многом определяется экономикой процессов. Произведенный готовый продукт должен успешно конкурировать с другими источниками белка. Например, продажная цена кормового белка одноклеточных организмов в 1979 г. составляла 0,39–0,50 долл. США за 1 кг; продажная цена 1 кг соевой муки составляла 0,2–0,22 долл.; 1 кг мясо-костной муки – 0,24–0,25 долл. США. Сравнение кормового белка одноклеточных организмов с основными белковыми кормовыми продуктами показывает, что кормовой микробный белок неконкурентоспособен по цене. Основные затраты при производстве белка одноклеточных организмов связаны со стоимостью субстрата (этанола, метанола, н-алканов, гидролизатов и т. д.). Они составляют 43,6–77,0% всех затрат; 12,0–36,6% составляют затраты на тепло- и энергоснабжение. В связи с этим производство кормового белка из биомассы микроводорослей представляет особый интерес. Для этих организмов не требуется специфический субстрат. Источником углерода для фототрофных микроорганизмов является углекислый газ атмосферы. Некоторым из них не требуются питательные азотсодержащие добавки, так как они являются азотфиксирующими организмами. При этом значительно снижается основная статья расходов. Итак, культивирование микроводорослей для производства белка одноклеточных организмов является особенно перспективным в тех случаях, когда: – возникают значительные транспортные расходы при доставке кормов к местам потребления; – нет сырья (парафины, гидролизаты древесины) для производства белка одноклеточных организмов другими способами; – климатические условия не позволяют выращивать традиционные кормовые культуры; – имеются природные условия, подходящие для культивирования микроводорослей. При культивировании сине-зеленых водорослей гидротерм Камчатки отпадет необходимость в закупке и доставке субстрата. Вода гидротерм может являться источником необходимых минеральных веществ, микроэлементов. Предельно уменьшается потребность в топливе, так как для обеспечения производства теплом, энергией можно 72

использовать энергию термальных источников. Возможна организация круглогодичного производства. Высокие температуры (60–75,7ºС) и использование термофильных сине-зеленых водорослей позволит вести процесс в нестерильных условиях. Учитывая все недостатки культивирования микроводорослей в открытых водоемах, можно организовать массовое культивирование в закрытой системе. Это не потребует высоких капитальных затрат при использовании для обогрева закрытых реакторов энергии горячих источников.

7.2. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВО-УГЛЕВОДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ХЛОРЕЛЛЫ Потребление природной биомассы хлореллы без химической обработки исключено из-за наличия в ней токсичных и аллергенных веществ в липидной фракции. Одним из перспективных методов удаления этих веществ является перекисное окисление липидов с последующей экстракцией продуктов окисления органическими растворителями (ацетоном, этиловым спиртом). Хлорелла – зеленая микроводоросль – богатый источник жирорастворимых витаминов, которые извлекаются органическими растворителями, но под действием пероксида водорода теряют свою биологическую активность. Для сохранения этих веществ проводят предварительную экстракцию пастообразной биомассы с содержанием влаги до 80% органическими растворителями. Для получения белково-углеводного комплекса используют биомассу хлореллы в виде пасты после фильтрации и в виде порошка влажностью 6–8% после сушки в муфельной печи. В процессе обработки продукт обогащается белком, выход которого составляет 75% исходного количества белка хлореллы. Липиды удаляются почти полностью, содержание нуклеиновых кислот снижается в 2 раза. Белково-углеводный комплекс содержит все незаменимые аминокислоты. Исключение составляет триптофан, который в процессе обработки разлагается. По аминокислотному составу и содержанию растворимых белков полученный из хлореллы белково-углеводный комплекс занимает промежуточное положение между белками говяжьего мяса и белками пшеницы. При добавлении к 1 кг белково-углеводного комплекса 5 г триптофана можно получить сбалансированный белковый продукт. Жирные кислоты представлены в белково-углеводном комплексе в основном пальмитиновой кислотой. 73

Основной частью экстрактов являются биологически активные вещества. Содержание каротина в экстрактах ниже его содержания в свежей хлорелле. Окисление хлореллы с предварительной экстракцией органическим растворителем обладает рядом преимуществ перед обработкой без предварительной экстракции: сокращается продолжительность окисления и расход пероксида водорода; исключается возможность воздействия пероксида на ценные биологически активные вещества, что создает условия для более полного и эффективного использования биомассы хлореллы. 7.3. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА ДРОЖЖЕЙ 7.3.1. Технология производства белка дрожжей на растительном субстрате В качестве продуцентов белка используются штаммы кормовых дрожжей видов Candida skotti и Candida tropicalis. Основным субстратом являются гидролизаты растительного сырья, сульфитные щелоки. Технологическая схема производства белка дрожжей имеет вид: ПОЛУЧЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

ФЕРМЕНТАЦИЯ ↓ ФЛОТАЦИЯ ↓ СЕПАРИРОВАНИЕ ↓ ПЛАЗМОЛИЗ ↓ УПАРИВАНИЕ ↓ СУШКА ↓ УПАКОВКА ГОТОВОГО ПРОДУКТА Первоначально проводят посев чистой культуры в лаборатории. При достижении содержания дрожжей 15–20 г на 1 дм3 среды проводят отбор засевных дрожжей в производственный аппарат. 74

Для приготовления питательной среды полисахариды растительного сырья гидролизуют; при подготовке сульфитного щелока проводят инверсию олигосахаридов, нейтрализацию. В углеводсодержащие субстраты добавляют источники азота, фосфора, калия. Для проведения ферментации с целью получения наибольшего выхода дрожжей применяют одночленный ферментатор, двухчленную батарею с последовательным потоком, двухчленную батарею с параллельно-последовательным потоком. В ферментаторах обеспечивается непрерывная подача питательной среды, отбор суспензии, интенсивная аэрация, оптимальная температура и pH среды. Расход воздуха довольно высокий – 20–50 м3 на 1 кг сухих дрожжей. Это связано с плохой растворимостью кислорода в воде. Температура питательной среды поддерживается в пределах 32–38ºС; pH среды – 3,5–5,5. В процессе размножения дрожжей pH среды снижается, и для поддержания оптимальных условий среду подщелачивают. В 1 дм3 дрожжевой суспензии содержится от 20 до 40 г дрожжей влажностью 75%. Влажность готового продукта должна быть не более 10%. Для уменьшения содержания влаги применяют процесс концентрирования. На большинстве предприятий получила распространение следующая схема концентрирования суспензии: флотация, сепарирование, упаривание и сушка. Схема может быть изменена в зависимости от технических возможностей каждого метода и экономической целесообразности. Флотацию проводят на одно- или двухступенчатом флотаторе до достижения концентрации дрожжей 90–120 г/дм3. Сепарирование проводят в сепараторах с частотой вращения 4500–6000 об /мин до достижения концентрации дрожжей в суспензии 600–650 г/дм3 . Затем суспензию подвергают плазмолизу глухим паром температурой 75–80ºС в теплообменнике в течение 30–40 мин. Такой концентрат направляют для сгущения в вакуум-выпарной аппарат. При выпаривании температура пара поддерживается 103–105ºС, температура дрожжей – 90–100ºС. Сушку проводят в вальцовых или распылительных сушилках до достижения содержания влаги в продукте 8–10%. Более высокое качество продукта обеспечивает использование распылительных сушилок, но они громоздкие, неэкономичные, сложные и небезопасные в эксплуатации. Сухие дрожжи выпускают в порошкообразном виде или в гранулированном, более удобном для хранения, транспортировки и дозирования. Фасование осуществляют в бумажные мешки.

75

7.3.2. Технология производства белка дрожжей на углеводородном сырье Основной культурой для промышленного получения белка дрожжей на углеводородном субстрате являются дрожжи вида Candida guilliermondii. В качестве основного субстрата используют жидкие нпарафины с числом углеродных атомов в цепи от 10 до 27. Технологическая схема состоит из таких же операций, что и схема производства микробного белка на растительном сырье, но исключается стадия подготовки сырья, так как предприятия, выпускающие белковый концентрат, получают с нефтеперерабатывающих заводов жидкие н-парафины, не требующие дополнительной подготовки перед подачей на биосинтез. Отсутствует процесс флотации: дрожжевая суспензия сгущается сепарированием и упариванием. Для осуществления процесса ферментации требуется в 2–3 раза больше кислорода, чем при выращивании дрожжей на растительном субстрате, так как молекулы парафинов не содержат кислород. Жидкие н-парафины не растворимы в воде, поэтому их тонко диспергируют в культуральной жидкости путем интенсивной аэрации и перемешивания. Для выращивания дрожжей применяют ферментаторы непрерывного действия большого объема с турбоэжекторными перемешивающими устройствами. При ферментации поддерживается температура 33–38ºС, pH среды 4,0–4,5. В результате жизнедеятельности дрожжей pH среды снижается, поэтому в ферментатор подается аммиачная вода, которая одновременно служит источником азота. По окончании ферментации дрожжевая суспензия с содержанием сухого вещества 1,4–1,7% откачивается на сепарирование. Сепарирование проводится в две стадии. В сепараторах первой группы суспензия сгущается до достижения содержания сухих веществ 4,0–6,0%. В сепараторах второй группы суспензию сгущают до достижения содержания сухих веществ 8,0–12,0%. После сепарирования суспензию нагревают до температуры 90–95ºС и выдерживают в плазмолизаторах в течение 1 ч. Затем суспензию упаривают в вакуум-выпарном аппарате до достижения содержания сухих веществ 18–22%. Сушку проводят в распылительных сушилках до достижения влажности готового продукта 8%. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Почему возникла необходимость изыскивать нетрадиционные источники пищевого и кормового белка? 76

2. Какие микроорганизмы используют для производства белка? 3. Каковы особенности метаболизма микроводорослей? 4. Как интенсивность освещения влияет на развитие микроводорослей? 5. Какие белковые вещества накапливают в своих клетках синезеленые водоросли? Зеленые водоросли? 6. Охарактеризуйте способы выделения чистой культуры синезеленых водорослей. 7. Охарактеризуйте процесс культивирования микроводорослей в открытых установках. 8. Охарактеризуйте процесс культивирования микроводорослей в установках закрытого типа. 9. Приведите сравнительную характеристику процессов культивирования микроводорослей в установках открытого и закрытого типа. 10. Каковы возможности использования водорослевых ресурсов гидротерм Камчатки для получения кормового белка? 11. Охарактеризуйте процесс получения белка дрожжей на гидролизатах растительного сырья. 12. Охарактеризуйте процесс получения белка дрожжей на углеводородном сырье. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева и др. – М.: Высшая школа, 1989. – 380 с. 2. Баснаньян Н.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. – М.: Наука, 1989. – 267 с. 3. Бекер М.Е, Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 4. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия / И.М. Грачева и др. – М.: Колос, 1992. – 375 с. 5. Жизнь растений / Под ред. Ал. А. Федорова. Т. 3. – М.: Просвещение, 1977. – 488 с. 6. Зайцев В.П., Ажгихин И.С., Гандель В.Г. Комплексное использование морских организмов. – М.: Пищ. пром-сть, 1989. – 280 с. 7. Казьмин В.Д. Морская нива. – Владивосток: Дальневост. книж. изд-во, 1980. – 136 с . 8. Непрерывное культивирование микроорганизмов / Под ред. М. Малека. – М.: Пищ. пром-сть, 1969. – 462 с. 9. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 77

8. ПРОИЗВОДСТВО ТОКСИНОВ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Давно известно, что продукты метаболизма некоторых видов синезеленых водорослей могут оказывать вредное влияние на запах и качество воды и делают ее ядовитой для животных и рыб. В настоящее время доказана токсичность сине-зеленых водорослей таких родов, как Microcystic, Aphanizomenon, Anabaena, Gloeotricha, Rivularia, Nadularia. Вопрос о токсичности сине-зеленых водорослей приобрел особую актуальность в связи с их массовым развитием в пресных водоемах и морях. Сообщения о случаях отравления сельскохозяйственных животных массовыми скоплениями сине-зеленых водорослей появились в печати еще в конце 19 в. Первое описание подобного случая было сделано в 1878 г. и относится к оз. Александрина в Австралии, где при температуре 24–40ºС наблюдалось массовое развитие сине-зеленых водорослей Nodularia spumigena. При водопое наблюдалась быстрая гибель скота. В 1945 г. эти явления в том же озере повторились. Аналогичные случаи происходили в США в штате Миннесота, в Южной Африке. После массовой гибели скота на водохранилище Вальдам профессор фармакологии Университета в Претории Штейн доказал токсичность развившихся в водохранилище сине-зеленых водорослей экспериментами на коровах и овцах. Он показал, что токсичны свежие, растущие водоросли. При гибели водорослей токсин выделяется в воду; при разложении массы водорослей в воде токсичность снижается. Некоторые ученые считают, что с интоксикацией воды синезелеными водорослями могут быть связаны желудочно-кишечные расстройства, вспышка которых в 1930–1931 гг. распространялась вниз по течению рек Огайо и Потомака (США) соответственно продвижению «цветения» воды. По литературным данным, обитающие в горячих водах Камчатки термофильные виды сине-зеленых водорослей родов Mastigocladus и Phormidium не являются токсичными. Однако при токсикологических исследованиях природной биомассы вполне «съедобной» спирулины в ней был обнаружен токсический фактор. В литературе имеются указания на возможность детоксикации сине-зеленых водорослей с помощью тепловой обработки. Так, достаточно обработки биомассы спирулины при температуре 100ºС в течение 10 мин, чтобы она не оказывала токсического воздействия на животных. Н.И. Кирпенко предлагает использование прибора АФ-1 для количественного определения токсинов сине-зеленых водорослей. Сущность предлагаемого им метода заключается в установлении степени угнете78

ния активности фермента холинэстеразы токсином водорослей. В зависимости от степени угнетения фермент с различной силой действует на субстрат – ацетилхолин, в результате гидролиза которого в инкубационную среду поступает различное количество уксусной кислоты. На конечном этапе проводят косвенное определение количества гидролизованного субстрата по выделившейся уксусной кислоте. Это определение проводится при помощи фотоэлектроколориметра по изменению цвета индикатора бромтимолового синего в среде или при помощи рН-метра по изменению рН инкубационной смеси. Для этой цели и применяют анализатор ферментативной активности АФ-1, принцип действия которого основан на измерении электропроводности инкубационной смеси, изменяющейся в процессе разложения субстрата ферментом. Токсины некоторых сине-зеленых водорослей применяют в медицинской практике в качестве анестетиков благодаря их свойству блокировать болевые ощущения. 8.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИНОВ И СПОСОБЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ 8.1.1. Токсин Microcystis aeruginosa Токсичность Microcystis aeruginosa изучалась канадскими исследователями Бишопом и Корхамом. По Бишопу, токсин микроцистин является нелетучей кислотой, имеющей карбоксильные группы; имеет пептидную природу. Токсин содержит 10 аминокислотных остатков таких кислот, как аспарагиновая, глутаминовая, D-серин, валин, орнитин, аланин, лейцин. В процессе дальнейших исследований Марти и Капиндаль показали, что в токсичный комплекс входят еще семь аминокислот, а именно: тирозин, треонин, пролин, глицин, аргинин, изолейцин, фенилаланин. Микроцистин хорошо растворим в воде, этиловом, бутиловом, метиловом спирте. Марти и Капиндалем разработан метод получения микроцистина. Для его получения лиофильно высушенные клетки экстрагируют при температуре 0ºС раствором карбоната натрия и дважды – раствором бикарбоната натрия. Прозрачные, окрашенные супернатанты, полученные после центрифугирования, объединяют и вновь подвергают лиофилизации. Полученный материал многократно экстрагируют холодным н-бутанолом. Экстракты бутанола делят на 10 равных частей и каждую фракцию сгущают под вакуумом до удаления растворителя. Смолистый остаток разбавляют небольшими порциями воды и вновь центрифугируют для удаления нетоксичного коричневого не растворимого в воде остатка. Супернатант подвергают диализу через коллоидные пленки. 79

Затем диализат доводят разбавленной соляной кислотой до рН 3,0 и выпаривают в вакууме. Полученный остаток вновь экстрагируют н-бутанолом. Объединенные экстракты сгущают под вакуумом. Остаток растворяют в растворе бикарбоната аммония. Токсичную фракцию лиофилизируют до получения белого порошка. Микроцистин оказывает сильное токсичное действие на мышей с LD500,47 мг/кг живой массы. 8.1.2. Токсин Coelosphaerium kutzingianum Для выделения токсина целосфериевых вначале получают водный экстракт, выдерживая густую взвесь водорослей около 2 ч в термостате при температуре 50–60ºС. Затем взвесь фильтруют через складчатые фильтры, получая фильтрат густо-синего цвета в результате перехода в раствор белков фикобилинов. Полученная жидкость проявляет токсичность для молоди рыб. 8.1.3. Токсин Anabaena Впервые токсичное действие Anabaena на животных было описано Димом и Торпом в 1939 г., затем подтверждено Олсоном в 1960 г. Альготоксин Anabaena оказался очень быстро действующим. Белые мыши, цыплята, кролики и морские свинки гибнут в течение 2, 5, 8 и 20 мин соответственно. Интоксикация животных сопровождается дрожью, слабыми конвульсиями, параличом, после чего наступает смерть. Токсин, выделенный из Anabaena, имеет общие свойства с токсином, выделенным из Microcystis. Но токсичные начала у этих водорослей неидентичны. Симптомы отравления, вызываемые анабенином, сходны с симптомами отравления ядом ботулизма. Анабенин – алкалоид с молекулярным весом менее 300. Он растворим в воде и этиловом спирте, не растворяется в хлороформе, ацетоне, эфире. 8.1.4. Токсин Aphanizomenon flos-aquae Работы по выявлению токсичности Aphanizomenon flos-aquae были проведены сотрудниками Национальной морской лаборатории в США. Было обнаружено, что токсичность водоросли повышается с увеличением возраста и плотности культуры. Значительное влияние на образование токсина оказывает температура и освещенность. Опыты показа80

ли, что токсин афанизоменин сохраняется внутри здоровых клеток и высвобождается только после их лизиса. Для получения афанизоменина биомассу концентрируют центрифугированием и лиофилизируют. Затем проводят экстракцию при различных значениях рН: 2, 7, 11 при температуре 5ºС. Очистка токсина проводится путем проведения последовательных экстракций лиофилизированных клеток ацетоном, а затем этиловым спиртом. Характерными симптомами отравления мышей афанизоменином являются прерывистое дыхание, спастические судороги, зевота, потеря координации, сильная дрожь и смерть в результате нарушения дыхания. Афанизоменин является очень активным блокирующим агентом для нервной и мышечной ткани. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Что понимают под термином «цветение» воды? 2. Почему нередко в период «цветения» воды наблюдается гибель обитателей «цветущего» водоема? 3. Что такое альготоксины? 4. Какие виды сине-зеленых водорослей являются токсичными? 5. Охарактеризуйте сущность метода количественного определения токсинов сине-зеленых водорослей. 6. Где возможно использование токсинов сине-зеленых водорослей? РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. – М.: Пищ. пром-сть, 1972. – 336с. 2. Горюнова С.В., Демина Н.С. Водоросли – продуценты токсических веществ. – М.: Наука, 1974. – 256 с. 3. Метелев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология. – М.: Колос, 1971. – 247 с.

9. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ Человеческое общество с момента своего возникновения нарушало равновесие в окружающей среде. С развитием цивилизации стали более ощутимы пределы естественной продуктивности биосферы – истощаются природные ресурсы, источники энергии, ощущается недостаток 81

пищи, чистой воды. Загрязнение окружающей среды во многих регионах достигает критического предела. Эти проблемы во многом порождены научно-техническим прогрессом и должны решаться с использованием новейших его достижений. Рост населения Земли требует увеличения ресурсов продовольствия. Стремление увеличить ресурсы питания приводит к быстрому ухудшению экологической ситуации в сфере сельскохозяйственного производства. Происходит истощение почвы, ее уплотнение и засорение минеральными веществами, ядохимикатами, загрязнение водоемов, продуктов питания. В результате недостатка в почве органических удобрений в последнее время наблюдается существенное снижение гумуса. На фоне недостатка гумуса в почвах снижается эффективность применения минеральных удобрений. Создание больших животноводческих комплексов привело к загрязнению атмосферы веществами с неприятным запахом и патогенными микроорганизмами, почвы – сорняками, водоемов – патогенными микроорганизмами и гельминтами. Индустриализация народного хозяйства связана с увеличением потребления энергии, превращением сельскохозяйственных угодий в дороги, строительные площадки, созданием крупных заводов, выбрасывающих в атмосферу и водоемы вредные вещества. Уменьшение лесных массивов в результате вырубки леса отрицательно влияет на водный режим, приводит к изменению ландшафта, уничтожению многих видов фауны и флоры, особенно в субтропических зонах, ухудшает газообмен в атмосфере и очистку воздуха. Загрязнение атмосферы диоксидом серы приводит к «кислотным дождям», атомная энергия опасна радиоактивным заражением среды в случае аварий. Строительство гидроэлектростанций связано с затоплением сельскохозяйственных угодий, уменьшением рыбных ресурсов, ухудшением самоочищения воды и рядом других последствий. В крупных городах большую экологическую проблему представляют твердые и жидкие отходы. Ежедневно каждый городской житель в среднем выбрасывает 2–3 кг различных отходов, половина которых – бумага и упаковочные материалы. В Москве на свалку ежегодно вывозят 6–7 млн. т отходов, в том числе 4,5 млн. т коммунальных. Для размещения этой массы отходов в Подмосковье имеется 145 свалок; их площадь ежегодно увеличивается на 40 га, так как вокруг свалки создают санитарную зону шириной 500 м. На улицах Нью-Йорка ежегодно собирают 8 млн. т отходов, Токио – 4,5 млн. т, Лондона – 3 млн. т. Во многих приморских городах коммунальные отходы загружают в контейнеры и сбрасывают в море. В последнее время в связи с химизацией сельского хозяйства в водоемы попадают в больших количествах пестициды, гербициды, дефо82

лианты, антибиотики, дезинфицирующие средства, азотистые и фосфорные соединения. Энергетика и транспорт загрязняют среду нефтепродуктами. В табл. 6 приведена характеристика сложившейся в мире экологической ситуации. Таблица 6 Сельское хозяйство Водоемы Атмосфера, климат

Биосфера Человек

Последствия Эрозия почвы, ее уплотнение, засорение химикатами, сорняками, уменьшение гумуса Засорение химикатами, уменьшение рыбных запасов, изменение водной фауны и флоры Засорение атмосферы газами, диоксидом серы, оксидом азота, диоксидом углерода, оксидом углерода; запыление; кислотные дожди (рН 4,5–5,7); разрушение слоя озона от действия фреона, оксида азота, повышенная радиация УФ-лучей Исчезновение к 2000 г. 15% видов животных и растений главным образом в результате вырубки тропических лесов и попадания химикатов в водоемы Болезни, генетические сдвиги, трудности в хозяйственной деятельности

Проблему экологии нельзя решить в масштабах одной страны или группы стран. Вредные загрязнители среды, выработанные в индустриальных районах, из-за естественной циркуляции водных и воздушных масс распространяются по всей поверхности Земли, достигают стратосферы и глубин океана. Глобальность этой проблемы еще в 1899 г. отмечал К.А. Тимирязев. Биотехнология может оказать существенное влияние на решение экологических проблем, позволит осуществить систему профилактических мероприятий и ликвидировать последствия загрязнения окружающей среды (рис. 11). Важнейшую роль в экологической проблеме играет биология. Сама экология в традиционном понимании – это биологическая дисциплина, изучающая взаимоотношение организмов между собой и с окружающей средой. Биологизация производства – один из главных путей выхода из надвигающегося экологического кризиса. При этом большое значение имеет биотехнология. Взаимоотношения современной биотехнологии и экологии имеют различные аспекты. Достижения экологии как науки входят в научный базис современной биотехнологии. Биотехнология помогает решать ряд экологических проблем: 83

– биотехнологические методы используют для защиты среды от промышленных и бытовых отходов и отбросов и деградации токсичных соединений, уже попавших в среду; – при внедрении биотехнологических методов происходит более полная утилизация сырья, интенсификация выращивания и использования возобновляемых природных ресурсов, создание малоотходных и безотходных промышленных процессов. БИОТЕХНОЛОГИЯ

ЭКОЛОГИЯ КАК НАУКА

Обработка отходов и создание безотходных производств

Повышение экологичности традиционных технологий и продуктов и создание новых экологичных производств

Возможное негативное воздействие биотехнологии на окружающую среду и человека

Биотехнологическая переработка отходов в кормовые продукты, энергию, удобрения, технический белок, липиды и т. д.

Получение индустриальными методами компонентов пищи и кормов

Отрицательное воздействие отходов биотехнологических производств при недостаточном контроле

Биометаллургия, биоэнергетика Использование генной инженерии для создания организмов, способных к обезвреживанию отходов

Создание высокопродуктивных, устойчивых к заболеваниям сортов растений, пород животных

Выход из-под контроля биотехнологических объектов, полученных методами новейшей биотехнологии

Очистка Мирового океана, морей, рек, озер и почв от нефтяных и других загрязняющих веществ

Получение биорациональных пестицидов бакудобрений, ветеринарных препаратов

Создание биологического оружия

Снижение потерь сельскохозяйственной продукции при обработке и хранении Рис. 11. Взаимодействие биотехнологии и экологии

84

При этом наряду с производством новых продуктов биотехнологическими методами получают также и продукты, традиционные способы получения которых менее экологичны. Биотехнология и экология могут взаимодействовать как через продукцию, так и через технологию. Биотехнология должна создать рациональные и безвредные для человека и среды процессы конверсии продуктов сельского хозяйства в более ценные товарные формы. Биотехнология призвана сыграть значительную роль при создании безотходных технологий. Для повышения плодородия почвы необходимо применять органические удобрения, компосты и обезвреженные путем метанового брожения жидкие отходы животноводческих ферм. В целом внедрение биотехнологии способствует повышению экологичности народного хозяйства, возникновению более гармоничных отношений между обществом и природой. Но нельзя забывать и о таком аспекте проблемы взаимоотношений между биотехнологией и экологией, как возможность негативного воздействия на биосферу биотехнологических процессов и даже исследований в области биотехнологии. Надо также учитывать возможность сознательного использования достижений биотехнологии в антигуманных целях для создания мощного биологического и токсинного оружия. В настоящее время разрабатываются и применяются следующие биотехнологические методы защиты окружающей среды: – создание безотходных технологических процессов; – создание препаратов для борьбы с возбудителями болезней человека и животных; – создание растений, устойчивых к болезням и вредителям; – биологические методы борьбы с болезнями и вредителями растений; – бактериальные удобрения и стимуляторы роста растений; – создание методами генетической инженерии культурных растений, способных фиксировать атмосферный азот без участия микроорганизмов; – аэробная биологическая очистка стоков; – анаэробная биологическая очистка стоков; – селективная утилизация индивидуальных химических соединений стоков; – управляемое компостирование твердых отходов; – детоксикация почвы от пестицидов и других химических загрязнений; – биосорбция металлов; – диагностика степени загрязнения среды. 85

9.1. ПРИМЕНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД Каждый городской житель ежедневно «продуцирует» 150–200 дм3 сточных вод. При производстве 1 т бумаги объем сточных вод примерно такой же, как объем бытовых сточных вод от 1000 человек, и нередко сток одного химического предприятия соответствует по объему стокам города с миллионным населением. Для городов с высоким уровнем экологической опасности характерно наличие десятков различных высоко токсичных элементов в воде, атмосфере и почве. Например, в Санкт-Петербургской области наибольший ущерб когда-то чистой Неве наносят местные отрасли промышленности. Индустриальная база региона состоит в основном из предприятий, потребляющих огромное количество воды, энергии и ресурсов. Сотни промышленных предприятий сливают неочищенные отходы в открытую водную систему или в канализацию. Другие проблемы загрязнения связаны с огромным количеством воды, потребляемой частными домовладельцами. Наблюдения Росгидромета свидетельствуют о тенденции повышения загрязненности водных ресурсов. Такая тенденция связана, прежде всего, с малоэффективной очисткой сточных вод. Практически без очистки сбрасываются в поверхностные водотоки и водоемы шахтные воды. По данным Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, наиболее часто выше регламентируемых величин в питьевой воде обнаруживается железо (до 80%), цветность (47%), мутность (40%), суммарное органическое загрязнение по величине перманганатной окисляемости (49%), фенолы (32%), марганец (29%), нефтепродукты (8–11%), формальдегид, капролактам, циклогексанол. Постоянное применение минеральных удобрений на сельхозугодьях является причиной появления соединений азота и фосфора в водных объектах. Серьезна проблема загрязнения поверхностных вод пестицидами, применяемыми главным образом в сельском хозяйстве. Вынос хлорорганических пестицидов на 80–95% обусловлен весенним стоком. Часто ПДК пестицидов были превышены более чем на 20% в бассейнах рек Печора, Обь, Пясина и Урал. До 19 в. гидрологического цикла было достаточно, чтобы поддерживать запас воды на Земле свежим и безопасным для жизни. Но с приходом индустриальной революции все изменилось. Хотя современная промышленность и технология значительно улучшили качество нашей жизни, мы платим за это серьезную цену. В наших водоемах накапливаются промышленные отходы. Ядовитые отходы приводят к отравлению поверхностных и подземных вод. Природный гидрологический 86

цикл нарушен, и во многих местах он уже не в состоянии очистить воду от загрязняющих частиц. Естественной самоочищающей способности водоемов, обусловленной деятельностью микроорганизмов, теперь также не хватает, поэтому сточные воды приходится разлагать с помощью микроорганизмов в гигантских очистных сооружениях (рис. 12) с тем, чтобы стоки можно было вновь спускать в реки и озера без ущерба для природной среды. При очистке сточных вод прежде всего из них удаляются макрозагрязнения: бумага, куски дерева, обрывки ткани. Механическую очистку осуществляют на решетках, в отстойниках, центрифугах, флотаторах и на фильтрах. Тяжелые частицы песка осаждаются в пескоуловителе. Лишь после этого более легкие взвешенные частицы концентрируются на дне отстойника в илоуловителе. Далее сточные воды поступают в аэротенк (аэрируемый резервуар), где поддерживаются идеальные условия для жизнедеятельности микроорганизмов. В аэротенке бактерии, дрожжи и грибы образуют с веществами сточных вод большие хлопья («активный ил»), которые не распадаются благодаря слизи, выделяемой бактериями. Основная проблема этого биопроцесса связана со снабжением микроорганизмов кислородом. На расщепление 1 г сахара микроорганизмы расходуют более 1 г кислорода, а растворимость кислорода в воде в воде при нормальной температуре составляет всего лишь 9 мг/дм3. Поэтому очень скоро после начала микробиологического процесса весь содержащийся кислород будет полностью израсходован микроорганизмами. Поэтому сточные воды в аэротенке должны постоянно перемешиваться и обогащаться кислородом. Для обеспечения аэрации сточных вод аэротенк снабжен вращающимися щетками, лопастями, а также трубой, через которую в воду нагнетается воздух. Воздух постоянно «завихряет» хлопья активного ила, благодаря чему они не достигают слишком больших размеров, остаются взвешенными и хорошо обеспечиваются кислородом. Микроорганизмы хлопьев поглощают вещества сточных вод, разлагают их в процессе дыхания и при этом размножаются. Часть микробных хлопьев затем осаждается во вторичных отстойниках в виде ила. Меньшую часть возвращают в аэротенк для того, чтобы иметь достаточное количество микроорганизмов для окисления вновь поступающих сточных вод. Весь осадок, собранный из первичного и вторичного отстойников, разлагается в септиках или метантенках (сооружения для сбраживания с помощью микроорганизмов осадка сточных вод) метанбактериями до образования биогаза (метана). Этот газ может быть очень рационально использован путем сжигания для получения тепла. Остаточный «переброженный» ил высушивают и нередко применяют в качестве удобрения. Резервуары очистных сооружений занимают большую площадь – это условие трудно выполнить в промышленных районах. Поэтому для 87

очистки сточных вод были разработаны «малогабаритные» башенные биореакторы высотой около 15–20 м. При очистке сточных вод микроорганизмы проделывают особенно трудную работу. Потребляя кислород в процессе дыхания, они с его помощью разлагают содержащиеся в сточных водах сахара, жиры, белки до углекислого газа и воды и на этой основе растут и строят свои новые клетки. Очистные установки предоставляют микроорганизмам наилучшие условия для развития, размножения и для деструктивной деятельности. Это гигантские «биофабрики», и их «биопродуктом» является чистая вода. Сточные воды промышленных предприятий нередко содержат трудноразлагаемые вещества и яды, например синильную кислоту и соединения ртути. Эти вещества не разлагаются обычными микроорганизмами, они даже губительно воздействуют на многие виды микроорганизмов. Поэтому постоянно идут поиски новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, которые могли бы утилизировать такие вещества.

Рис. 12. Схема сооружения для очистки сточных вод: 1– сточные воды; 2 – насосная станция; 3 – решетка; 4 – отстойник песка; 5 – первичный отстойник; 6 – аэротенк; 7 – бассейн для доочистки; 8 – очищенные сточные воды; 9 – биогазовый реактор; 10 – удобрения; 11 – газометр; 12 – потребитель биогаза

88

Индийский биотехнолог Чакрабарти выделил бактерии, способные расщеплять высокотоксичное средство – трихлорофеноксиуксусную кислоту, которое США применяли во время войны во Вьетнаме, чтобы вызвать «листопад» в больших массивах джунглей. Чакрабарти выделил также бактерии, быстро разлагающие ядовитые нефтяные остатки. Они применяются для быстрого разложения нефти в случае катастроф с танкерами. Впоследствии микроорганизмы, размножившиеся в огромных количествах, поедаются морскими животными и благодаря этому быстро исчезают. В Институте биотехнологии в Лейпциге были выделены штаммы бактерий, поглощающие и откладывающие в своих клетках ртуть. Клетки водорослей также обладают способностью накапливать ртуть, свинец и серебро. 9.2. КОНТРОЛЬ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ СТОЧНЫХ ВОД С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМОВ Исследовать сточные воды на содержание разлагаемых и токсичных веществ можно с помощью микроорганизмов. Для этого отбирают пробы сточных вод. Сначала в каждой пробе определяют концентрацию кислорода, затем в пробы вносят микроорганизмы, живущие в сточных водах. Флаконы с пробами плотно закрывают и спустя 5 суток вновь определяют в каждом сосуде содержание кислорода. В пробах с высокой степенью загрязнения содержится много питательных веществ, следовательно, здесь микроорганизмы потребляют больше кислорода, чем в сосудах с «чистыми сточными водами». Но 5 суток – это слишком продолжительный срок. За это время сильно загрязненные сточные воды успевают поступить в реки в огромных количествах. Значит, необходим более ранний «предупредительный сигнал». Для этого применяются «биосенсоры» – биологические измерительные зонды, которые в течение нескольких минут показывают степень загрязнения сточных вод. Биосенсор – это электрод, соединенный с электронным табло, на котором появляются сведения о содержании кислорода в жидкости. На поверхности этого электрода наносится тонкий слой микроорганизмов, живущих в сточных водах; микроорганизмы удерживаются при помощи плотного фильтра. Погрузив такой биосенсор в жидкость, можно непосредственно «измерить» дыхание микроорганизмов. В чистой воде микроорганизмы почти не дышат, так как в воде очень мало питательных веществ, а биосенсор подает совсем слабый сигнал. С помощью таких же биосенсоров можно определять и концентрацию питательных веществ в биореакторе. Существуют биосенсоры, работающие на основе ферментов, полученных из микроорганизмов. Например, прибор с биосенсором, несущим на поверхности своего электрода фермент 89

глюкооксидазу, за 1 ч может с большой точностью определить более чем в 100 пробах крови или мочи, не содержится ли в них повышенное количество сахара. 9.3. ПРИМЕНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОЗДУХА ОТ НЕПРИЯТНО ПАХНУЩИХ ВЕЩЕСТВ Неприятно пахнущие вещества (НПВ) – специфический вид загрязнения окружающей среды. Образуются они в большинстве технологических процессов переработки животного сырья. При производстве сухих животных кормов (кормовой муки, технического жира) образуются различные вещества: аммиак NH3, сероводород H2S, альдегиды, меркаптаны, вызывающие неприятный запах. Применению установок для очистки вентиляционных выбросов должны предшествовать мероприятия по снижению выхода НПВ в процессе производства технологических продуктов. Сырье, используемое для их выработки, необходимо перерабатывать в наиболее короткие сроки. Биологический метод очистки используют в земляных фильтрах, представляющих собой траншею в природном грунте. На дно ее в слой гравия заложены газоподводящие каналы, засыпанные сверху фильтрующим материалом. Для защиты от атмосферных осадков фильтры имеют легкий навес, под которым смонтирована система орошения для увлажнения фильтрующей массы, в которой содержатся микроорганизмы. Очистка воздуха от НПВ происходит в результате адсорбции, абсорбции и химических реакций окисления под действием микроорганизмов. Продуктами окисления являются углекислый газ, вода, сульфаты, нитраты, азот. Более эффективны фильтры из компоста, так как они содержат большее количество микроорганизмов. Компост для фильтров готовят из травы и листвы, собирая их в кучи, увлажняя и несколько раз в год перекладывая. Высота слоя фильтра может достигать от 60 см до 1 м. Также используются биохимические фильтры – вещество с определенными группами бактерий, которые размножаются, абсорбируют и разрушают НВП. Срок использования такой массы достигает нескольких лет. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Охарактеризуйте влияние развития народного хозяйства на окружающую среду. 2. Охарактеризуйте взаимосвязь биотехнологии и экологии. 3. Охарактеризуйте биотехнологические методы защиты окружающей среды. 90

4. Охарактеризуйте принцип действия водоочистительной установки на основе микроорганизмов. 5. Что такое активный ил? 6. Как с помощью микроорганизмов можно контролировать уровень загрязнения сточных вод? 7. Охарактеризуйте принцип действия фильтров для очистки воздуха от неприятно пахнущих веществ. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 2. Вода, которую мы пьем: Учебное пособие / Под ред. М. Черного. – М.: ЗАО «Компания МедиаСервис», 1998. – 50 с. 3. Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 4. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991. – 112 с. 5. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 6. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та, 1994. – 304 с.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева и др. – М.: Высшая школа , 1989. – 380 с. 2. Баснаньян Н.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. – М.: Наука, 1989. – 267 с. 3. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. – М.: Пищ. пром-сть, 1972. – 336 с. 4. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Ч. 2. – М.: Мир, 1989. – 592 с. 5. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с. 6. Вода, которую мы пьем: Учебное пособие / Под ред. М. Черного. – М.: ЗАО «Компания МедиаСервис», 1998. – 50 с. 91

7. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. – М.: Изд-во МГУ, 1989. – 296 с. 8. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: СанПиН 2.3.2.1078-01. – М.: Минздрав России, 2002. – С. 9, 122–123, 147 9. Горюнова С.В., Демина Н.С. Водоросли – продуценты токсических веществ. – М.: Наука, 1974. – 256 с. 10. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия / И.М. Грачева и др. – М.: Колос, 1992. – 375 с. 11. Ефимова М.В. Возможности использования белка сине-зеленых водорослей // Материалы Международной научно-практической конференции «Рыбохозяйственное образование Камчатки в 21 веке». – Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2002. – С. 133–139 12. Ефимова М.В. Биологически активные вещества сине-зеленых водорослей, их получение и использование // Тезисы научнотехнической конференции профессорско-преподавательского состава. – Петропавловск-Камчатский: ПКВМУ, 1995. 13. Ефимова М.В., Ефимов А.А. Исследование химического состава сине-зеленых водорослей гидротерм Камчатки с целью получения белковых компонентов комбикормов // Труды ПКВМУ «Химические процессы в гетерогенных системах». Вып. 2. – Петропавловск-Камчатский: ПКВМУ, 1997. 14. Жизнь растений / Под ред. Ал.А. Федорова. Т. 3. – М.: Просвещение, 1977. – 488 с. 15. Зайцев В.П., Ажгихин И.С., Гандель В.Г. Комплексное использование морских организмов. – М.: Пищ. пром-сть, 1989. – 280 с. 16. Казьмин В.Д. Морская нива. – Владивосток: Дальневост. книж. изд-во, 1980. – 136 с. 17. Кондратьева Е.Н., Максимова И.В., Самуилов В.Д. Фототрофные организмы. – М.: Изд-во МГУ, 1989. – 376 с. 18. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. – М.: Наука, 1989. – 255 с. 19. Кузякина Т.И., Захарихина Л.В. Термофильные цианобактерии Верхне-Паратунских и Зеленовских горячих источников // Материалы конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов 1999–2000 гг.: Сб. статей. – Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2001. – С. 12–18 20. Метелев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология.– М.: Колос, 1971. – 247 с. 21. Непрерывное культивирование микроорганизмов / Под ред. М. Малека. – М.: Пищ. пром-сть, 1969. – 462 с. 22. Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 92

23. Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.: Мир, 1991. – 112 с. 24. Родина А.Г. Методы водной микробиологии. – М.: Наука, 1969. – 240 с. 25. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с. 26. О качестве и безопасности пищевых продуктов: Федеральный закон от 1 декабря 1999 г. // Библиотечка «Российской газеты». – 2000. – № 23. – С. 42–101. 27. О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения: Федеральный закон от 12 марта 1999 г. // СЗ РФ. – 1999. – № 14. – Ст. 1650. 28. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та, 1994. – 304 с.

93

СОДЕРЖАНИЕ Введение ............................................................................................. 1. История возникновения и развития биотехнологии как науки ........................................................... 2. Культивирование микроорганизмов ....................................... 2.1. Строение микробной клетки .................................................. 2.2. Метаболизм микробной клетки ............................................. 2.3. Питательные среды ................................................................ 2.4. Методика культивирования микроорганизмов .................... 2.4.1. Подготовка посевного материала в лабораторных условиях ................................................... 2.4.2. Культивирование микроорганизмов в промышленных условиях ................................................ 3. Методы биотехнологии ............................................................... 3.1. Генная инженерия ................................................................... 3.2. Клеточная инженерия ............................................................. 3.2.1. Клонирование культур тканей и клеток высших растений .................................................. 3.2.2. Соматическая гибридизация клеток растений .................. 3.2.3. Особенности культивирования клеток растений .............. 3.2.4. Инженерия культур клеток животных и человека ............ 3.2.5. Особенности культивирования клеток животных ............ 3.2.6. Получение медицинских препаратов и лекарственных веществ с помощью микроорганизмов и культур тканей ................................... 4. Производство ферментов, этилового спирта, биогаза ........... 4.1. Производство ферментов ....................................................... 4.2. Производство этилового спирта ............................................ 4.3. Производство биогаза ............................................................ 5. Производство пластмасс, текстильных изделий, материалов для электроники .................................................... 6. Производство пищевых продуктов ........................................... 6.1. Применение процесса ферментации при производстве продуктов питания .................................. 6.2. Применение методики генетической инженерии при производстве продуктов питания .................................. 7. Производство белка одноклеточных организмов .................. 7.1. Получение белка микроводорослей ...................................... 7.1.1. Особенности метаболизма микроводорослей ................... 94

3 4 7 7 9 11 13 14 16 19 20 23 23 25 26 27 30 32 34 34 38 39 42 44 45 55 58 60 60

7.1.2. Выделение чистой культуры микроводорослей ................ 7.1.3. Культивирование микроводорослей ................................... 7.1.3.1. Культивирование микроводорослей в открытых системах ........................................................ 7.1.3.2. Культивирование микроводорослей в закрытых системах ........................................................ 7.2. Получение белково-углеводного комплекса из хлореллы .......................................................... 7.3. Получение белка дрожжей ..................................................... 7.3.1. Технология производства белка дрожжей на растительном субстрате .................................................. 7.3.2. Технология производства белка дрожжей на углеводородном сырье ................................... 8. Производство токсинов сине-зеленых водорослей ................. 8.1. Характеристика токсинов и способы их выделения ............ 8.1.1. Токсин Microcystis aeruginosa ............................................. 8.1.2. Токсин Coelosphaerium kutzingianum ................................. 8.1.3. Токсин Anabaena ................................................................. 8.1.4. Токсин Aphanizomenon flos-aquae ...................................... 9. Биотехнология и экология .......................................................... 9.1. Применение микроорганизмов для очистки сточных вод ....................................................... 9.2. Контроль загрязненности сточных вод с помощью микроорганизмов ............................................... 9.3. Применение микроорганизмов для очистки воздуха от неприятно пахнущих веществ .................................................................. Использованная литература ...............................................................

95

64 65 67 70 73 74 74 76 78 79 79 80 80 80 81 86 89 90 91

Учебное пособие

Ефимова Марина Васильевна ВВЕДЕНИЕ В ПРИКЛАДНУЮ БИОТЕХНОЛОГИЮ Редактор И.В. Скрыпкина Технический редактор Е.Е. Бабух Компьютерный набор М.В. Ефимова Верстка М.В. Ефимова, Е.Е. Бабух Оригинал-макет Е.Е. Бабух Лицензия ИД № 02187 от 30.06.00 г. Подписано в печать 15.06.2004 г. Формат 61*86/16. Печать офсетная. Гарнитура Times New Roman Авт. л. 6,21. Уч.-изд. л. 6,34. Усл. печ. л. 6,06 Тираж 70 экз. Заказ № 260 Отпечатано полиграфическим участком РИО КамчатГТУ 683003, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Ключевская, 35

96