Система аскорбиновой кислоты растений: Монография

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Калининград 1997

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ Монография

Калининград 1997

Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография. - Калинингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 120 с. - ISBN 5-88874-063-2. В монографии дана характеристика системы аскорбиновой кислоты растений, включающей аскорбиновую, дегидроаскорбиновую и дикетогулоновую кислоты, а также ферменты, окисляющие и восстанавливающие аскорбат. Приведены результаты исследования действия полихроматического и монохроматического света на компоненты системы, обсуждается вопрос о фоторецепторе светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты. Рассматриваются пути биосинтеза аскорбата, компартментация данного процесса и субклеточная локализация кислот системы аскорбиновой кислоты. Исследована зависимость биосинтеза указанных кислот от фотосинтеза и дыхания. Впервые исследовалась дикетогулоновая кислота как компонент системы аскорбиновой кислоты. Приводится метод получения альбиносных проростков, их физиологобиохимическая характеристика, рекомендация использования в качестве модели для изучения светозависимых процессов не связанных с фотосинтезом. Для физиологов, биохимиков, преподавателей вузов, аспирантов и студентов. Иллюстр. 30. Библиогр.: 461 назв. Рецензент - зав. отделом химии фотосинтеза Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины, чл.-кор. АН Украины А.А. Ясников. Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского государственного университета.

ISBN 5-88874-063-2

© Калининградский государственный университет, 1997

Галина Николаевна Чупахина СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ Монография Лицензия № 020345 от 27.12.1991 г. Редактор Л.Г. Ванцева. Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным. Подписано в печать 25.12.1996 г. Формат 60×90 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Усл. печ. л. 7,5. Уч.-изд. л. 8,0. Тираж 200 экз. Заказ 92. Калининградский государственный университет, 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.

ВВЕДЕНИЕ Аскорбиновая кислота - уникальное полифункциональное соединение. Обладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, она принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетки - фотосинтезе [341, 378] и дыхании [451, 362]; является признанным антиоксидантом [8]. Несомненно ее участие в процессах роста, цветения, вегетативной и репродуктивной дифференциации [230], в водном обмене [151], регуляции ферментативной активности [46], стимуляции реакций метаболизма, связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка [207, 365], в защитных реакциях растений [200, 2]. Особый интерес для биотехнологии представляет факт накопления аскорбиновой кислоты в культуре растительных тканей и активации их роста аскорбатом [288, 295]. В связи с этим знание условий, формирующих пул аскорбиновой кислоты зеленых растений, необходимо не только для программированного получения высоковитаминных растительных продуктов, что само по себе является важным для решения проблемы качества пищи, но и для понимания механизмов, определяющих продуктивность растений. Возросший интерес к аскорбиновой кислоте как к лекарственному препарату [257] обусловлен противовирусным [395] и противоопухолевым действием аскорбиновой кислоты и ее дериватов [450], а также авторитетной рекламой дважды лауреата Нобелевской премии Л.Полинга [116]. При определении витаминной ценности растительного сырья витамин С определяется как сумма взаимопревращающихся восстановленной и окисленной форм аскорбиновой кислоты [152]. Однако дегидроаскорбиновая кислота не всегда переходит в аскорбиновую, так как разрыв ее лактонового кольца ведет к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты, не обладающей витаминной активностью и практически не исследованной у растений. Поэтому для всесторонней оценки роли аскорбиновой кислоты в метаболизме растений необходимо одновременное исследование всей системы аскорбата, включающей вышеназванные органические кислоты, а также ферментные системы, способствующие окислению и восстановлению аскорбиновой кислоты. Именно такие подходы к исследованию витамина С [258, 430] являются наиболее перспективными. 3

Со времени открытия аскорбиновой кислоты интерес к этому соединению не проходит, хотя в последние годы он значительно снизился. Но это не говорит о том, что решены все проблемы, связанные с аскорбатом. Они есть. В частности, до сих пор не выяснены пути синтеза аскорбиновой кислоты, не до конца ясна ее роль в жизни автотрофных организмов, являющихся продуцентами и поставщиками витамина С для человека. Решение этих вопросов требует нового уровня исследований, чему, несомненно, может служить изучение аскорбиновой кислоты как компонента системы органических кислот: аскорбиновая ↔ дегидроаскорбиновая → дикетогулоновая кислота. В предлагаемой работе обобщены литературные данные и результаты собственных исследований автора, касающиеся путей биосинтеза аскорбиновой кислоты и субклеточной локализации аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот. Рассматривается действие полихроматического и монохроматического света на компоненты системы, зависимость биосинтеза анализируемых кислот от фотосинтеза и дыхания. Для решения этих вопросов использовались данные по биосинтезу кислот в проростках ячменя с измененным пигментным составом, в экспериментально полученных альбиносных проростках, а также при ингибировании и стимуляции дыхания интермедиатами цикла Кребса.

4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК - аскорбиновая кислота АО - аскорбатоксидаза ГН - глютатион восстановленный ГS-SГ - глютатион окисленный ДАК - дегидроаскорбиновая кислота ДКГК - дикетогулоновая кислота ДКС - дальний красный свет 2,4 - ДНФ - 2,4 - динитрофенол ИУК - индолилуксусная кислота КС - красный свет МДАК - монодегидроаскорбиновая кислота НАД - никотинамидадениндинуклеотид НАДФН+Н+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ОПФЦ - окислительный пентозофосфатный цикл ПААГ - полиакриламидный гель СМ - стрептомицин УФ - ультрафиолет ФАР - физиологически активная радиация Фдк - фитохром с максимумом поглощения в области дальнего красного света около 730 нм ФС I - фотосистема I ФС II - фотосистема II Хл - хлорофилл ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

5

Глава 1. КИСЛОТЫ И ФЕРМЕНТЫ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В 1927 году A.Сцент-Гиорги впервые выделил из некоторых растений и коры надпочечников неустойчивое вещество с сильно выраженными восстановительными свойствами, которое сначала назвал гексуроновой кислотой, затем аскорбиновой, учитывая ее антискорбутное (скорбут - цинга) действие. Химическая формула АК была предложена в 1933 году Хирстом и независимо от него Эйлером, а в конце 1933 г. ее правильность окончательно доказана Михеелем. Химический синтез АК осуществлен Рейхштейном в 1932 г., когда структура ее еще не была известна. В 1933 г. Рейхштейн и Хаворс с Хирстом опубликовали методы синтетического получения АК. История открытия и изучения АК подробно описана Б.А. Кудряшовым [69]. В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-l-гулоновой кислоты с эмпирической формулой С6Н8О6. Она обладает сильно выраженными восстанавливающими свойствами благодаря наличию в молекуле диэнольной группы: С ОН С ОН

Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу: O

O

C

C

НО-С

О=С

НО-С О H-C

- 2H

О=С

+ 2H

H-C

HO-C-H СH2-OH L-аскорбиновая кислота (восстановленная форма)

О

HO-C-H СH2-OH Дегидроаскорбиновая кислота (окисленная форма)

Этот процесс обратимый, и ДАК может вновь восстановиться до l-AK. Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и двух электронов. При окислении АК в особых условиях (УФ свет, температура жидкого воздуха) за счет отдачи только одного протона возникает свободный радикал - монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная, реакционноспособная форма АК. 6

O

O

O

C

C НО-С

C

C

HO-С

НО-С

-H+

О

O-С -H+

О-С О

О-С

H-C

H-C

H-C

HO-C-H

HO-C-H

HO-C-H

СH2-OH

СH2-OH

L-аскорбиновая новая кислота

O

O=С О

-2e

О=С О H-C HO-C-H

СH2-OH

Монодегидроаскорбиновая кислота

Анион дегидроаскорбиновой кислоты

СH2-OH Дегидроаскорбиновая кислота

Переход l-АК в ДАК двухэтапный. На первом этапе две молекулы l-AK дают начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они дисмутируют: одна молекула превращается в ДАК, другая - в l-АК [60]. Лактоновое кольцо в молекуле l-AK стабильно, а в ДАК легко гидролизует с образованием кислоты с открытой цепью - 2,3-дикетогулоновой кислоты [84]. Последняя может подвергаться окислительному распаду под действием гипоиодида натрия с образованием щавелевой и треоновой кислот: O

O

C

C - OH

О=С О=С О H-C HO - C - H СH2 - OH

+H2O

COOH

С=O

COOH

С=О

Щавелевая кислота

H - C - OH HO - C - H СH2 - OH

COOH H - C - OH HO - C - H CH2OH

Дегидроаскорбиновая кислота

2,3-дикетоl-гулоновая кислота

L-треоновая кислота

7

Введенная экзогенно дикетогулоновая кислота при освещении хлоропластов фотоокисляется [453]. Под влиянием окисляющих АК ферментов происходит декарбоксилирование ДАК и ДКГК с образованием l-ксилоновой и l-ликсоновой кислот. У растений, аккумулирующих щавелевую кислоту (шпинат, бегония, кислица), окисление введенной 1-14С-АК или 1-14С-ДАК происходит с образованием щавелевой и винной кислот. В проростках ячменя, которые не накапливают щавелевую кислоту, включение метки в последнюю происходит слабо. Отмечено, что метка из 1-14C-ДАК легко включалась в щавелевую кислоту шпината и кислицы, а 1-14С-ДКГК очень медленно метаболизировалась в щавелевую кислоту. Вероятно, для образования щавелевой кислоты существенно наличие лактонового кольца в предшественнике [453]. У герани также два первые атома углерода АК включаются в молекулу щавелевой кислоты, а С4-фрагмент - в винную кислоту [445, 448]. Однако судьба двух первых атомов углерода АК может быть иной. Например, у винограда отрезок цепи с первого по четвертый атом углерода включается в l-винную кислоту, а оставшийся С2-фрагмент повторно вовлекается в цикл гексоз и продуктов их метаболизма. [445, 383]. При этом углерод первого атома АК может высвобождаться в форме CO2 [272]. Изолированные листья Parthenocissus quinquefolia L метаболизируют АК с образованием l-треоновой и винной кислот. Показано, что треоновая кислота не является промежуточным метаболитом обмена аскорбата, превращающегося в винную кислоту [271]. Такими метаболитами могут быть l-идониновая, 2-кето-lидониновая и 5-кето-l-идониновая кислоты. В молодых тканях винограда введенная АК превращается в 5-кето-l-идониновую кислоту через 2-кето-lидониновую и l-идониновую кислоты. Из С4-фрагмента 5-кето-l-идониновой кислоты далее синтезируется l-(+)винная кислота. Считается [318], что именно lАК. является физиологическим интермедиатом на пути биосинтеза винной кислоты в листьях винограда. Радиоактивность от 5-кето-l(6-14С)идониновой кислоты обнаруживалась в сахарах и нерастворимом осадке [381, 382]. Следовательно, обмен АК в растениях связан с органическими кислотами и углеводами, которые в одних условиях являются субстратом в биосинтезе АК, а в других для их образования используются фрагменты молекулы АК, полученные после ее деградации. Таким образом, АК в растительных тканях может присутствовать в восстановленной форме, окисленной и в виде нестабильной монодегидроаскорбиновой кислоты. Восстановленная и окисленная АК находятся в свободном состоянии. Известны три связанные формы АК: аскорбиген - соединение АК с полипептидом; комплекс АК с витамином Р и, вероятно, еще с каким-то неизвестным веществом; третья связанная форма АК - это соединение АК с нуклеиновой кислотой через посредство минерального железа [158]. Обычно в растениях преобладает восстановленная форма АК. Накоплению ДАК препятствует ее нестабильность (особенно при рН выше 5), поэтому при измельчении тканей наблюдается быстрая потеря ДАК. Тем не менее измеримые количества ДАК присутствуют во многих тканях. Содержание окисленной формы АК в разных условиях неодинаково и иногда достигает высоких значений. 8

Так, в яблоках в начале созревания ДАК составляла 55% от общего количества АК и ДАК, а в конце - только 5-6% [35]. Соотношение двух форм АК может служить показателем физиологического состояния растений: высокая интенсивность процессов жизнедеятельности - больше восстановленной АК, низкая интенсивность - растет содержание дегидроформы [68,34]. Для красных водорослей показано сезонное изменение соотношения АК/ДАК. В апикальной части таллома птерокладии оно достигало максимума в декабре, а к лету значительно снижалось. В базальной части соотношение АК/ДАК в течение года было низким и мало менялось [303]. АК в чистых растворах с сильно кислой реакцией среды и в растительных соках с нормальной кислотностью при рН ниже 7 не способна к самоокислению. Однако в других растворах на воздухе АК быстро окисляется. Катализирующее действие на процесс неферментативного окисления АК оказывают гидроксильные ионы, двух- и трехвалентные металлы, особенно медь. Известны четыре ферментные системы, принимающие участие в окислении АК. Это специфическая оксидаза АК - аскорбатоксидаза (1.10.3.3), цитохромная система, полифенолоксидаза (1.14.18.1) в присутствии полифенолов и пероксидаза (1.11.1.7) в присутствии перекиси водорода [35]. Аскорбатоксидаза - медьсодержащий фермент, окисляет АК кислородом воздуха, но имеет ограниченное сродство к кислороду [26]. Механизм окисления АК пероксидазой и полифенолоксидазой - с помощью хинонов. Коферментами пероксидаз являются различные фенольные соединения, они окисляются до хинонов, последние окисляют АК до ДАК: кислород + фенол → хинон; хинон + АК → ДАК + фенол. Окислительно-восстановительные превращения АК ↔ ДАК тесно связаны с системой глютатиона: 2ГSН ↔ ГS - SГ + 2Н+, в которой восстановление окисленного глютатиона катализируется ферментом глютатионредуктазой (1.6.4.2), а окисление идет при участии глютатиондегидрогеназы (аскорбата) (1.8.5.1) [409]. Есть мнение, что превращение ДАК в АК - неферментативный процесс [59]. Окислительно-восстановительная система АК у эвглены, по данным Шигеоки и др. [402, 403], включает следующие компоненты: H2O2

(1)

H2O

l-АК

(3)

Монодегидро-l-АК

(3) Дегидро-l-АК

(2) НАДФ+

НАДФН+Н+ (4) ГS - SГ

Г - SH

где: (1) - l-аскорбатпероксидаза, 9

(2) - монодегидро-l-аскорбатредуктаза, (3) - неферментативная реакция, (4) - дегидро-l-аскорбатредуктаза. Таким образом, система АК растений включает АК, монодегидро-АК, ДАК [239], которые обладают витаминной активностью. ДКГК, образующаяся из ДАК, уже лишена биологической активности. Количественный анализ ДКГК может служить показателем направленности процессов в системе АК ↔ ДАК, которая зависит от активности ферментов, окисляющих AК: аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы, а также ферментов, восстанавливающих кислоты системы АК: монодегидро-l-аскорбатредуктазы и дегидро-l-аскорбатредуктазы. В качестве восстановителя выступает система глютатиона ГS - SГ ↔ Г - SН и НАДФН+Н+. Высокий уровень АК стимулирует биосинтез аскорбатоксидазы [240,3] и подавляет аскорбатредуктазу [3]. ДКГК растений, рассматриваемая нами в системе АК, практически не исследована, исключая единичные работы [85,405,279,334,205] и работы автора [181, 174, 178], хотя следует подчеркнуть, что ее уровень дает информацию для понимания функционирования системы АК ↔ ДАК.

Глава II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЖИЗНИ АВТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ 2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений В хлоропластах содержится значительное количество АК, по весу не уступающее содержанию хлорофилла, а выраженное в молях даже превосходящее его [123]. Этот факт, а также способность АК обратимо окисляться и восстанавливаться могут определять ее участие в важнейшем энергетическом процессе зеленых растений - в фотосинтезе. Действительно, многие экспериментальные исследования подтверждают такую возможность. В частности, показано, что аскорбат способствует биосинтезу хлорофилла [237, 218] и восстановлению его в темноте при участии активной МДАК [38]. В семенах японской редьки при 48часовом освещении возрастало содержание АК и пропорционально - содержание хлорофилла. Между количеством хлорофилла и АК отмечалась линейная зависимость при коэффициенте корреляции 0,96 [437]. Основываясь на опытах по обратимому фотохимическому восстановлению хлорофилла АК в растворах пиридина, А.А.Красновский [62, 66] полагал, что этот процесс может представлять одну из стадий фотосинтеза. Подтверждая наличие реакции А.А. Красновского, в результате которой образовывалась красная восстановленная форма хлорофилла при освещении его растворов в пиридине в присутствии АК, Т.Баннистер [213] уточнил, что донором электрона при фото10

восстановлении хлорофилла может быть анион АК, возникающий при ее диссоциации в среде воды и пиридина. На роль АК как донора электронов в фотосинтетических реакциях или в реакциях, тесно связанных с ними, указывал и Л.Мапсон [325]. Он считал, что АК может участвовать в переносе электрона от пластохиона к цитохрому f. Другие авторы также рассматривали АК как переносчика электронов при фотосинтезе [250, 335, 343]. По мнению Л.Мапсона, действительным переносчиком электронов является нестабильная МДАК, способная участвовать в цепи реакций нециклического фосфорилирования в растениях [324]. При изучении фотоокисления аскорбата изолированными хлоропластами шпината было показано [221], что АК может замещать воду как донор электронов для ФС II и что обе световые реакции и электрон-транспортная система между ними принимают участие в фотоокислении АК. В ныне признанных схемах циклического и нециклического переноса электронов в процессе фотосинтеза среди переносчиков электронов нет АК, но в модельных системах АК часто используется как экзогенный донор электрона для ЭТЦ фотосинтеза [298, 376, 384]. При блокировании переноса электронов между ФС I и ФС II дихлорфенилдиметилмочевиной электроны от АК могут поступать в ФС I [85]. АК необходима для фотофосфорилирования [51]. В ее присутствии лучше сохраняется без инактивации фотосинтетический аппарат клетки, увеличивается фосфорилирование изолированных хлоропластов [227, 203, 204, 249, 333], стабилизируется фотофосфорилирование фрагментов фотосинтетических мембран [341]. Таким образом, участие АК в процессе фотосинтеза может проявляться или в биосинтезе фотосинтетического аппарата растительной клетки, или в его стабилизации, что будет способствовать повышению его фотохимической активности, а в конечном итоге - фотофосфорилированию. Предположение о том, что, обладая окислительно-восстановительными свойствами, АК может участвовать в процессе дыхания, впервые было выдвинуто А.Сцент-Дьерди в 1927 г. Позднее ряд исследователей рассматривал АК как существенный фактор дыхания [77, 328, 323]. К.Е.Овчаров [95] отмечал, что не случайно при прорастании семян имеет место энергичное образование АК, ведь энергия дыхания прорастающих семян очень высока. Усиление дыхания под действием АК наблюдали многие авторы [313, 43, 46]. Так, в присутствии аскорбата увеличивалось поглощение кислорода изолированными проростками ячменя [278], суспензией хлоропластов шпината [199] и хлореллы, находящейся в темноте [59], срезанными стеблями томатов [377]. В процессе воздействия на дыхание важная роль принадлежит соотношению АК/ДАК, так как последняя, функционируя как переносчик водорода в дыхательной цепи растений [323], отвлекает часть водорода окисляемого субстрата, что, вероятно, и приводит к торможению дыхания. Показано, что ДАК тормозит активность дегидрогеназ, интенсивность восстановительных синтезов, образование макроаргических связей. Поэтому повышение отношения АК/ДАК за счет 11

уменьшения ДАК сопровождается усилением дыхания и роста растительных клеток [434]. При окислении субстрата за счет отнятия водорода последний при участии переносчиков передается в зависимости от вида растения, сорта или стадии индивидуального развития на цитохромную систему, флавиновую или аскорбатоксидазу. Этот фермент может отдать водород непосредственно на кислород и выполнить функцию терминальной оксидазы [134]: Глютатион редуктаза SH2

НАДФ

S

НАДФ⋅Н2

Редуктаза ДАК

Аскорбатоксидаза

2 глютатион-SH

ДАК

Н2О

глютатион-S-Sглютатион

АК

1/2 О2

Так как аскорбатоксидаза имеет ограниченное сродство к кислороду, можно полагать, что окисление через систему АК/ДАК имеет подчиненное значение. Однако Мапсон и Мустафа [328] нашли, что у проростков гороха дыхание на 25% осуществляется за счет системы аскорбатоксидазы. При прорастании семян гороха примерно через пять дней в них появлялась аскорбиноксидазная система, для функционирования которой требовалась АК, восстановленный глютатион, НАД+Н+ и в качестве окисляемого субстрата - яблочная кислота. Аскорбиноксидазная система проростков была связана с растворимой частью цитоплазмы и не обнаруживалась в митохондриях. По мнению Б.А.Рубина и М.Е.Ладыгиной [134], аскорбатоксидаза участвует и в дыхании хлоропластов, дыхательная цепь которых схематически изображается следующим образом:

НАДФ+Н2+

Система пероксидазы ДАК ↔ АК — Аскорбинатоксидаза Хинон ↔ фенол — о-Дифенолоксидаза Цитохром в6

О2

В молодых плодах лимона система переноса электронов от дыхательного субстрата - яблочной кислоты на кислород также включает АК, оксидоредуктазу АК и глютатион [410]. Интересно отметить, что, как показано в данной работе, глютатион и АК стимулировали дыхание только в августе - декабре, а в январеиюне угнетали. Наряду с фактами активации дыхания в присутствии АК известны примеры прямо противоположного ее действия. Так, наблюдалось ингибирование аскорбатом дыхания корней проростков пшеницы в условиях торможения окисли12

тельной активности эндоплазматического ретикулума, что, вероятно, связано с усилением аскорбатзависимого перикисного окисления липидов [25]. Возможность стимуляции окисления жирных кислот (особенно стеариновой) в присутствии увеличивающихся доз АК (до 106,56 мМ) была показана ранее [255]. Исследуя взаимосвязь между биосинтезом АК и развитием нечувствительного к цианиду дыхания в срезах клубней картофеля, авторы [206] предположили, что АК необходима для синтеза белков, участвующих в дыхании по нечувствительному к цианиду пути. В связи с чем АК рассматривается как фактор, контролирующий данный тип дыхания. Таким образом, АК может участвовать в дыхательном процессе как непосредственный переносчик водорода и как ко-фактор, стимулирующий процесс, о чем говорят данные только что рассмотренного исследования. Причем доля дыхания через систему АК/ДАК может колебаться и в некоторых случаях становиться доминирующей. Так, у растений табака, пораженных картофельным вирусом У основной вклад в интенсивность дыхания вносила система глютатион аскорбат [315]. 2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность, водный режим, ростовые и другие процессы Рассматривая вопрос о физиологической роли АК в растениях, Чикай и Сингх [230] указывают, что АК активирует реакции метаболизма, связанные с обменом нуклеиновых кислот. Это возможно за счет того, что АК играет роль дерепрессора, снимающего репрессорное действие гистонов на ДНК. Таким путем АК освобождает большее число матриц для синтеза мРНК [230, 398]. Наиболее существенное физиологическое воздействие АК на растения обусловлено тем, что она оказывает влияние на ферментативную активность. В ее присутствии активируется тиоглюкозидаза [276], мирозиназа [361], ферментативный гидролиз бензилглюкозинолата [269], протеазы, амилазы, усиливается синтез РНК [231] и активность РНК-азы [338], хотя другие исследования [231] последнее не подтверждают. Характер действия окисленных форм АК на ферментативную активность может быть иным, чем у восстановленной АК. Так, если восстановленная АК активировала фосфоглюкомутазу семян гороха, то ДАК снижала, а ДКГК - не оказывала влияния [205]. Другой пример: АК и ДКГК в анаэробных условиях не меняли активность ферментных систем, окисляющих сукцинат и глюкоза-6-фосфат, а ДАК при этом оказывала тормозящее действие [334]. Известны случаи ингибирующего влияния на активность ферментов и восстановленной формы АК. Это показано для полифенолоксидазы [4] и протеолитических ферментов, для которых АК является антагонистом [390]. АК вызывала лаг-фазу в активности пероксидазы, которая снималась аскорбатоксидазой [224]. Механизм действия АК на ферментативную активность различных энзимов, вероятно, не одинаков. Активацию претеолитических ферментов аскорбатом 13

объясняют [45, 46] тем, что в присутствии АК восстанавливаются дисульфидные группировки. Стимуляция тиоглюкозидазы может происходить за счет того, что АК вызывает конформационное изменение молекулы фермента, сопровождающееся увеличением сродства к субстрату [276]. Есть мнение [231], что действие АК затрагивает геном растений: она контролирует кодирующий механизм, дифференцированно влияя на синтез РНК и скорость реакций различных ферментов. Полагают, что АК может играть роль гормона, мобилизующего ферменты. Таким образом, действие АК на ферментативную активность может проявляться или в изменении активности уже имеющихся ферментов, или в изменении скорости их синтеза. АК оказывает существенное влияние на водный режим растений. Оно проявляется в торможении поступления воды [44, 431, 433], уменьшении оводнённости [44], в изменении подвижности внутриклеточной воды [153], ускорении транспирации [431, 433, 151]. Хотя в отношении последнего имеются и прямо противоположные данные [44]. Под действием АК изменяется соотношение свободной и связанной воды за счет увеличения свободной. Механизм действия АК на поступление и потерю воды объясняют [44] изменением коллоидно-химических свойств протоплазмы, а также деполяризацией протоплазменных мембран. Важную роль АК играет в процессах роста и развития растений. Она обеспечивает дружное и более быстрое прорастание семян у пшеницы, овса, кукурузы, кунжута и других растений [241, 230, 408]; активирует рост гипокотиля и корней [432, 400, 236], проростков люпина, растений ячменя [176] и помидоров, семядоли которых были удалены после прорастания [300], пазушных побегов [58]. Имеются данные о стимуляции роста стеблей тростника окисленной формой АК [443]. Определяя содержание АК в 5-7-дневных проростках гороха и кукурузы, Г.Ф.Проценко [122] показала, что растения, отличающиеся быстрым ростом, содержали меньше АК, чем медленно растущие. На основании чего автор полагает, что АК принимает участие в биохимических превращениях, лежащих в основе роста. Действительно, АК меньше используется карликовыми сортами сорго [291], хотя ее содержание, как показано в данной работе, почти одинаково у высоко-, средне- и низкорослого сортов. Определенную роль АК играет в процессах цветения, вегетативной и репродуктивной дифференциации. Она стимулирует растяжение и морфогенез клетки [385], цветение некоторых растений [166]. Уровень АК резко повышается в начале дифференциации цветков [424]. Обработка растений АК увеличивает количество мужских и женских цветков, но уменьшает их соотношение по сравнению с контролем [396]. Отмечено стимулирующее действие АК на клубнеобразование картофеля и его прорастание [270, 393]. Введение АК в питательную среду значительно усиливало прорастание пыльцы хлопчатника, а обработка растений АК ускоряла образование и уменьшала опадение завязей [96]. Плоды абрикоса и сливы быстрее созревали в присутствии АК [417]. Общее воздействие АК на растение проявляется в задержке старения листьев, то есть распада хлорофилла, РНК, ДНК [252]. 14

Стимулирующее действие АК на ростовые процессы для каждого вида и сорта растений проявляется в определенных пределах концентраций. Обработка семян яровой пшеницы АК в концентрации 0,01% стимулировала ростовые процессы, а в концентрации 0,1% - подавляла их [43]. Для корней кукурузы стимулирующим рост оказался раствор АК в концентрации 0,05-0,005%, а в концентрации 0,05-2,5% - ингибирующим [88]. В ряде опытов [372] стимуляция роста отрезков колеоптилей овса под действием АК наблюдалась в узких пределах концентраций (0,3·10-3 - 4,5·10-3 М). Наряду со стимуляцией роста при обработке растений АК происходит увеличение содержания последней [245, 184, 168, 264, 248, 253, 407], тем самым увеличивается суммарное воздействие АК на ростовые процессы. Отмеченное в ряде работ отсутствие стимуляции или даже угнетение роста под действием АК [334, 352, 369, 428, 435] можно объяснить тем, что АК при окислении быстро превращается в ДАК, которая замедляет рост [47, 436]. Так, ингибирование роста, наблюдаемое у карликовых мутантов кукурузы, имело место при более высоком отношении ДАК/АК по сравнению с нормально растущими растениями и, как заключает автор, рост связан с более восстановленным состоянием клетки [340]. Хотя поддерживать его за счет восстановленной АК непросто, так как у карликовых и нормально растущих растений кукурузы наибольшая активность свободного и связанного с клеточными стенками фермента, окисляющего АК, - АО - обнаружена в тканях мезокотиля с активным растяжением клеток. Таким образом, для активного роста растений необходимо высокое содержание восстановленной формы АК при активной АО. Ингибирующее действие АК на ростовые процессы находит и другое объяснение с учетом результатов следующего опыта: 30-дневные растения пшеницы опрыскивали в течение 11 дней 0,001 и 0,005 М растворами АК [412]. Это привело к снижению высоты растений, количества побегов, массы надземной части, содержания общего количества свободных аминокислот. В связи с чем угнетающее действие АК на рост автор связывает с влиянием ее на синтез аминокислот. Конкретнее, это может проявляться в ингибировании переаминирования глутаминовой кислоты и аланина [398]. Таким образом, в литературе имеются данные о стимуляции и ингибировании ростовых процессов у растений под действием АК. Естественно, это можно объяснить и видовой специфичностью объектов исследования, и конкретными условиями опытов. Но в любом случае для окончательного решения вопроса необходим одновременный анализ всех кислот системы АК: АК ↔ ДАК → ДКГК, так как свойства АК и ДАК как доноров электронов, источников водорода - прямо противоположные, что, несомненно, сказывается на их воздействии на ростовые процессы. При этом легкость перехода АК в ДАК и наоборот усложняет ситуацию определения действующего начала. Тем не менее большинство авторов разделяет точку зрения о том, что в присутствии АК отмечается стимуляция ростовых процессов. Механизм действия АК на рост может быть двояким. С одной стороны, АК может выполнять функцию дерепрессора, снимающего репрессию синтеза ДНК 15

гистонами, что определяет ее участие в работе кодирующего механизма клетки [230, 398]. С другой стороны, действие АК на рост может быть опосредовано через ауксины. Показано, что АК может тормозить окисление индолилуксусной кислоты, катализируемое пероксидазой, возможно, прямо связываясь с ИУК. В этом случае АК выступает как конкурентный ингибитор пероксидазы, защищая ИУК от разрушения [357]. Стоит отметить, что существовало мнение, согласно которому специфическая активность ауксинов сама является результатом их первичного воздействия на обмен АК [332]. Особый интерес для биотехнологии, и в частности для отработки методов культивирования растительных тканей, представляют данные о накоплении АК этими тканями и о стимуляции их роста АК [288, 295]. АК оказывает влияние на азотистый обмен растений. Обработка пшеницы раствором АК приводила к уменьшению в листьях количества свободных аминокислот и некоторому повышению содержания нерастворимого азота [412]. Присутствие АК в функционирующих клубеньках вигны говорит о возможном ее участии в процессе азотфиксации [253]. Под действием АК активируются некоторые биосинтетические процессы. Показана необходимость АК для биосинтеза оксипролинсодержащих белков в растениях [207, 365] и синтеза алкалоидов в недифференцированной каллюсной ткани мака снотворного [295]. АК вызывала снижение окислительно-восстановительного потенциала березы, что ускоряло переход к вегетации, связанной с синтезом биополимеров [144]. Экзогенный аскорбат оказывает действие на разность поверхностных биопотенциалов, сдвигая ее в область положительных значений у набухающих семян кукурузы и пшеницы [139]. АК снимала индуцируемое феррицианидом увеличение рО2 у элодеи и валлиснерии [93]. Таким образом, даже конспективное перечисление тех процессов, в которых принимает участие АК: фотосинтез, дыхание, рост, развитие, устойчивость, экспрессия генома, ферментативная активность, биосинтетические и биофизические процессы, азотфиксация, восстановление нитритов [214] - говорит о том, что АК затрагивает практически все стороны жизнедеятельности растений и относится к числу важнейших полифункциональных соединений автотрофных организмов. 2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты АК выполняет важную защитную функцию, что прежде всего проявляется в отношении растений к пониженным температурам. В ряде работ показана роль АК в формировании зимостойкости [1, 117, 147, 170, 202]. Это касается интродуцируемых растений [72], плодово-ягодных культур [118, 188] и злаков [122, 126], зимостойкие сорта которых накапливали больше АК, чем менее зимостойкие. Большое количество работ посвящено исследованию действия АК на иммунные свойства растений, так как считается, что одним из проявлений активного иммунитета растений является нормальное или повышенное образование в них АК [27, 112, 119]. Например, содержание АК в плодах манго, превышающее 16

40 мг %, увеличивает их устойчивость к поражению бактериями, вызывающими черную пятнистость плодов [439]. Ответной реакцией на многие поражения растений является усиленный биосинтез АК. Так, в листьях виноградной лозы, восприимчивых к антракнозу, обнаружено повышенное содержание АК при высокой активности АО [44]. Высоким был уровень АК в листьях баклажана, подверженных вертициллезному увяданию [389]. Обработка восприимчивых к нематоде сортов томатов раствором АК (45 мМ) на 96-99% снижала их поражаемость. Полагают, что АК используется для синтеза митохондриальных оксипролин-содержащих белков, которые определяют устойчивость томатов к нематоде [208]. Известно мнение, что защитную функцию выполняет не восстановленная АК, а ее окисленная форма [112], так как у устойчивого к пероноспорозу сорта гороха в клетках, расположенных у очага поражения, часть АК была представлена окисленной формой. Она-то, как считают авторы, и служит барьером на пути возбудителя. У восприимчивых сортов гороха в местах проникновения патогена обнаружена только восстановленная форма АК. Защитное действие АК проявляется и при радиационном поражении растений. Предпосевное облучение сухих семян кукурузы различными дозами рентгеновских лучей (до 22 тыс. рентген) и гамма-лучей (до 33 тыс. рентген) вызывало при больших дозах радиации увеличение у растений содержания АК [145]. В связи с этим предпринимаются попытки выяснить защитное действие пре- и постобработки экзогенной АК на семена, подвергнутые воздействию гамма-излучения [426]. Уже имеются данные о том, что замачивание семян ячменя в 0,5 М растворе АК за час до облучения снижало количество поврежденных облучением проростков и стимулировало их рост [449]. При облучении в летальных дозах количество АК может уменьшаться, возможно, за счет того, что возрастает ее расход на окисление липидов [94, 406]. Столь же актуальным, как исследование защитной роли АК при радиационном облучении, является изучение защитных свойств соединений системы АК в отношении растений, обрабатываемых гербицидами [397]. Для практики сельского хозяйства определенный интерес может представлять тот факт, что коэффициент восстановления - окисления ДАК и АК соответственно был значительно выше у сортов, устойчивых к полеганию [82]. Повышенным уровнем АК отличаются пораженные раком органы картофеля [76]. По данным Р.Маковер [316], АК ослабляет его побурение. Некоторые производные АК - аскорбат калия, аскорбат кальция - способны защищать листья фасоли от повреждений, вызываемых озоном [248]. Каким образом растения могут защищать себя от губительного действия озона, используя АК ? Предполагается, что диффундирующий в листья озон прежде всего реагирует с АК, сконцентрированной в клеточных стенках, и это ограничивает его проникновение в наиболее уязвимые ткани. Другие механизмы инактивации озона в клеточной стенке, такие, как разрушение его в результате образования перекисей и реакций с этиленом, вероятно, не столь эффективны [225]. Экзогенный аскорбат может снимать ингибирование нитратредуктазы в листьях овса в темноте вызванное перекисью [293]. Возможная функция АК и 17

компонентов ее системы в растениях, находящихся в условиях стресса, рассматривается в ряде работ [455, 457-461]. Таким образом, при участии АК формируется устойчивость растений по отношению ко многим неблагоприятным воздействиям: к пониженной температуре, радиации, вирусной и бактериальной инфекции и т.д. Учитывая результаты цитированных выше работ, можно рекомендовать использование обработки АК для борьбы с возбудителями некоторых заболеваний растений. Кроме этого, уровень эндогенной АК может служить тестом, характеризующим устойчивость растений. В перспективе растения, обладающие высоким показателем тестирования по данному признаку, можно использовать при получении растений с заданными свойствами методами соматической гибридизации и генной инженерии.

Глава 3. БИОСИНТЕЗ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ДЕРИВАТОВ 3.1. Субстраты для новообразования аскорбата Способностью синтезировать АК обладают растения различных уровней организации: грибы, водоросли, мхи, лишайники, хвощи, плауны, голосеменные и покрытосеменные растения. Присутствует она и в бактериях [152]. Содержание АК в растениях колеблется в значительных пределах, достигая рекордной величины в плодах австралийского растения терминалии фернандианы и мальпигии около 4000 мг % [162]. Виды растений, листья которых отличаются повышенным содержанием АК, могут иметь самое различное таксономическое положение [198]. Растения легко синтезируют АК, но каким образом они это делают, до сих пор полностью не ясно [28]. Изучение путей синтеза АК началось с установления природы веществ, являющихся исходными при ее новообразовании. Первые убедительные доказательства того, что АК образуется из гексоз, были получены в экспериментах С.Рай [371], которая показала, что у отрезанных зародышей гороха, растущих на стерильной синтетической среде, гексозосахара увеличивали содержание витамина С. Со времени первых экспериментов прошло немало лет, однако до сих пор не ясно, какие именно сахара являются исходными для синтеза АК. К.Л.Поволоцкая [115], испытав различные моно- и дисахара: глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, маннозу и сахарозу - показала, что все они, за исключением лактозы, используются в синтезе АК. Необходимость глюкозы для синтеза АК отмечала и К.З.Тульчинская [159]. Инфильтрируя в проростки овса различные соединения, В.Н.Девятнин [32] установил, что синтез АК усиливается при введении веществ, содержащих 6 углеродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении С5-С6 с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор, 18

в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным материалом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую очередь такие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-гулоновая кислота, левулоза и сорбоза. Большое влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты из экзогенных субстратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга [193] выдерживание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-ных растворах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных растворах глюкозы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение содержания аскорбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших исследованиях [98, 103] также подчеркивается необходимость света в образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы. Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс [209]. Из большого набора исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроновая кислота, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и др.) только γ-лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони, находящихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положительного действия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как ряд исследователей [350, 427] рассматривал это соединение как промежуточное при биосинтезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии радиоактивной глюкозы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу [427]. М.Натх и М.Белкходе [350] также отмечали преимущественное использование глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и ацетоацетатом. В опытах М.Накатани [З48] ферментный препарат, выделенный из зародышей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно синтезировать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В присутствии d-глюкозы и d-галактозы синтез АК не шел. Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает сомнения [368, 402]. Что касается исследования органических кислот как субстрата для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе В.А.Девятнина [32], в которой помимо уже названных соединений изучалось действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и 2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь последняя увеличила содержание АК на 20% по сравнению с исходным. Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК, щавелевая - снижала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные на свету. 19

В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве субстрата использовали α-кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую, яблочную и лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные проростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов, помещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД-40 (17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в процессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили растения, растущие во время опыта в темноте. В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез АК в проростках ячменя. На растворе винной кислоты на свету содержание АК в листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же как и глюкоза, оказывала только на свету. Таблица 1 Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) Вариант опыта

АК

t

мкг/г 49,3

% 100

Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе винной кислоты: свет (г) темн. (д)

67,8 50,9

138 103

126,5 44,4

256 90

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

99,0 49,1

201 100

а = 0,41 в б = 9,27 г г = 12,39 е а = 0,85 д б = 6,09 е а = 0,07 ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и α-кетоглутаровая кислота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе α-кетоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на 20

44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь высока, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что αкетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и глюкоза. Использование α-кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только на свету. Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота (табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся на растворах янтарной кислоты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В данных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных условиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте, независимо от наличия экзогенных субстратов. В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с винной, янтарной и α-кетоглутаровой может использоваться как субстрат в биосинтезе АК. Таблица 2 Влияние α-кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе α-кетоглутаровой кислоты: свет (г) темн. (д)

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

АК мкг/г 104,2

t % 100

142,7 115,0

137 110

152,8 98,3

147 94

150,1 111,0

144 106

а = 5,54 в б = 3,62 г г = 0,48 е а = 1,41 д б = 8,70 е а = 1,33 ж

21

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05 Таблица 3 Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе янтарной кислоты: свет (г) темн. (д)

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

АК

t

мкг/г 126,6

% 100

175,7 140,9

139 111

191,7 137,8

151 109

199,6 135,8

158 107

а = 4,96 в б = 3,76 г г = 1,38 е а = 9,58 д б = 4,60 е а = 1,23 ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05 Таблица 4 Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе щавелевой кислоты: свет (г) темн. (д)

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

22

АК

t

мкг/г 113,8

% 100

150,0 125,6

132 110

176,4 144,4

155 127

178,2 130,5

156 115

а = 2,79 в б = 7,45 г г = 0,54 е а = 3,55 д б = 3,61 е а = 1,93 ж

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05

Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и в темноте. Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению действия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому отмечалось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях, находящихся на воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной кислотой увеличение АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде. Таблица 5 Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе яблочной кислоты: свет (г) темн. (д)

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

АК

t

мкг/г 50,4

% 100

107,5 47,6

213 94

74,4 58,2

148 115

121,2 43,5

240 86

а = 1,39 в б = 6,32 г г = 7,35 е а = 0,91 д б = 3,46 е а = 3,85 ж

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05

В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах прибавка АК составила 19-26%. Следовательно, в присутствии экзогенной лимонной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже уменьшается.

23

Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут использоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная, винная и α-кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на свету, а в случае с винной и α-кетоглутаровой кислотами - только на свету [110]. Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной кислот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их избытке, когда возможно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными продуктами реакции, снижаются ее потери. Таблица 6 Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта Контроль (а) На воде: свет (б) темн. (в) На 0,005 М растворе лимонной кислоты: свет (г) темн. (д)

На 0,005 М растворе глюкозы: свет (е) темн. (ж)

АК

t

мкг/г 73,8

% 100

139,6 92,3

189 125

143,6 87,6

194 119

150,6 92,9

204 126

а = 19,91 в б = 0,71 г г = 1,08 е а = 5,05 д б = 1,56 е а = 2,47 ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как непосредственное использование этих соединений при новообразовании АК. Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами - интермедиатами цикла [15]. Это предположение проверялось в опытах по исследованию действия экзогенного пирувата, декарбоксилирование которого дает уксусную кислоту, используемую в ЦТК. Исследования показали стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался 0,005 М раствор глюкозы (рис.1). Поло24

жительное действие пирувата наблюдалось только у освещенных растений (рис. 2). Следовательно, существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на свету.

Рис. 1. Накопление АК в освещенных (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе глюкозы (1) и 0,005 М растворе пирувата (2) различное время

25

Рис. 2. Действие экзогенного пирувата (0,005 М) на накопление АК в листьях ячменя в темноте (1) и на свету (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) (2)

Более достоверные и информативные данные при исследовании возможности использования в биосинтезе АК тех или иных соединений, несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia α.) трансформируют меченую d-глюкозу (5-3H-1-14С-глюкозу и 3H-, 14С-глюкозу) в АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [271, 272]. Таким образом, метод позволяет не только однозначно решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза. Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в следующем разделе. 3.2. Химизм биосинтеза Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не исследованы [28, 306]. Наиболее значительные работы в этой области выполнены двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и Ф.Ловус, Р.Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве с Я.Хелспером, К.Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а на метаболизм АК. Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК считают d-глюкозу и d-галактозу [150]. Это значит, что при превращении их в l-АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть перемещены из d, положения в l. Это может осуществиться прямой инверсией групп у С5 или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6 углеродной цепи АК. Имеется несколько возможных механизмов для реализации этих изменений. Ф.Ишервуд, Г.Чжень, Л.Мапсон [282, 283] считают, что превращение d-глюкозы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без предварительного расщепления углеродной цепи: CHO Н-С-OH НО-С-H

CHO H-С-OH HО-С-H

СH2OH H-С-OH

CO HO-С

HО-С-H

*

HО-С

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-C

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

HO-C-H

СH2OH

СOOH

СOOH

D-глюкоза

D-глюкуро-

L-гулоно-

26

О

СH2-OH L-АК

новая кислота

вая кислота

* инверсия

Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы путем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления dгалактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления γ-лактона последней в lАК: CHO Н-С-OH

CHO H-С-OH

СH2OH H-С-OH

НО-С-H

HО-С-H

HО-С-H

HO-C-H

HO-C-H

HO-C-H

H-C-OH СH2OH D-галактоза

H-C-OH СOOH D-галактуроновая кислота

CO

H-C-OH СOOH L-галактоновая кислота

HO-С *

HО-С

О

H-C HO-C-H СH2-OH L-АК

Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути синтеза АК. Л.Мапсон и Ф.Ишервуд [327] более подробно анализируют превращение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под влиянием экстракта из проростков гороха происходит превращение производных dгалактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты и дальше в lАК. Этот процесс in vitro осуществляется в две стадии: 1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон под влиянием фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы; процесс идет за счет восстановленного НАД⋅Н; 2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного компонента, заключенного в митохондриях. Эффективность использования l-галактоно-γ-лактона в биосинтезе АК показана и другими авторами [287], наблюдавшими при его введении в листовые пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой через 190 часов достигало 12% от сухого веса. Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим образом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное вещество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том случае, когда образование АК идет из d-глюкозы, непосредственным предшественником l-АК будет l-гулоно-γ-лактон [74, 283, 388]. Возможность использования в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона отрицалась Е.Ассольбергсом [209], который показал, что в отрезанных листьях яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор предполагал, что 27

промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может быть иным, чем γ-лактон. Схема биосинтеза АК, предложенная Ф.Ишервудом с сотрудниками, находит подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков салата, бобов и гороха l-галактоно-γ-лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно-γ-лактон и lгулоно-γ-лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве, чем соответствующие производные галактозы. Ф.Ишервуд с сотрудниками первыми демонстрировали образование l-АК in vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно-γ-лактон как субстрат. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри митохондрий. L-галактоно-γ-лактон быстро превращался в l-АК. Скорость превращения lгулоно-γ-лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости предыдущей реакции [282]. Таким образом, группой Ф.Ишервуда получены экспериментальные данные в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы производные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая кислота, lгалактоно-γ-лактон - являются лучшими субстратами, чем соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по мнению авторов, включает инверсию углеродного скелета исходной молекулы и образование промежуточных фосфорилированных продуктов. Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока [402], предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК: Д-глюкоза

Д-галактоза

UДР-глюкоза (А) UДР-глюкуроновая кислота

UДР-галактоза

Д-глюкуроновая кислота

Д-галактуроновая кислота (В) L-галактоновая кислота

UДР-галактуроновая кислота

Д-глюкуроно-γ-лактон (В) L-гулоно-γ-лактон L-галактоно-γ-лактон (С) (С) L-аскорбиновая кислота

Жирные линии на схеме показывают главный путь синтеза АК, в ней приведены некоторые ключевые ферменты, катализирующие данный процесс: (А) - UДР-глюкозо дегидрогеназа; (В) - NАДР: l-гексонат дегидрогеназа; (С) - l-гулоно-γ-лактон дегидрогеназа. 28

Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является использование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с использованием радиоактивных веществ проведены Ф.Ловусом с сотрудниками. В отделенные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз, меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки, проростки кресс-салата, молодые побеги фасоли, Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [272]. В ягодах земляники и побегах фасоли [217] исследовался биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона. Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных Ф.Ловусом с сотрудниками [308, 309, 310, 311, 312], суммированы в таблице 7. Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому, превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода. Это дало возможность авторам предполагать, что образование l-АК из dглюкозы и d-галактозы идет без разрыва углеродной цепи и без специфического использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как один из путей образования АК в растениях, включающий образование фосфорилированных гексоз. Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d-глюкуронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой экспозиции 97% метки было сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что возможно только при перестройке углеродного скелета [311]. Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды земляники d-галактуроновой кислоты [304]. Данные эксперименты подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения специфического углеродного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В нормальном процессе биосинтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным. Таблица 7 Включение субстратов - 14С в l-АК

Объект Проростки кресссалата

Субстрат d-глюкоза-1-14С d-глюкоза-1-14С

Распределение меченого С в молекуле АК, в % от общей активности С1 С2 С3 С4 С5 С6 64 73 65-70 7-8 2-8 14-19 29

Созревающие плоды земляники

d-глюкоза-2-14С d-глюкоза-6-14С d-глюкуронолактон-114 С d-галактоза-1-14С

69-73 24 <1 45

-

0-6 1 8

22-23 2 -

2-5 73 97

6

41

-

Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из dглюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает образование промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает образование l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с исходной уроновой кислотой или лактоном. Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза l-АК, выдвинутое Ф.Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф.Ишервуда и Л.Мапсона [282]. Так как экспериментальные доказательства в пользу отсутствия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует радиоактивное загрязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим веществом авторы считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть образована следующим образом: d-глюкоза → 6-фосфо-d-глюконовая кислота → 3-окси-6-фосфо-d-глюконовая кислота → 3-окси-d-глюконовая кислота → d-арабоаскорбиновая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую также по первому углеродному атому, так что действительная картина превращения d-глюкозы в l-АК будет завуалирована. В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза, а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие работы, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути синтеза l-АК в растениях, как предполагает Ф.Ловус [305], или один путь, включающий инверсию углеродной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-АК, как считает Ф.Ишервуд и др. 3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее в субклеточных структурах во многом зависит от их функционального состояния [195, 289] и от внешних условий [181, 273]. Обнаружение АК в тех или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными компартментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен метаболитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации биосинтеза АК в листьях ячменя нами не только учитывались данные по количественному распределению аскорбата [178], но и исследовалось накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании хлоропластных, митохондриаль-

30

ных и цитоплазматических рибосом в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях ячменя. Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В.Соколовского, Л.В.Лебедевой, Т.Б.Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного материала [172]. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Цитоплазматические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации 15 мкг/мл [155], митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл) [185], учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов [7]. Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели альбиносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону. Анализ содержания АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной пигментацией (рис.3) показал присутствие анализируемых кислот и в альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма АК. Таким образом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать АК и ее производные, несмотря на значительные нарушения структуры некоторых клеточных органоидов.

Рис. 3. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней (1), средней (2) и нижней альбиносной (3) частях мутантных листьев ячменя

Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой ткани листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и по межклетникам паренхимы даже в корни [169]. Исследования, выполненные на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в срезанных 31

листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой ткани в белую ни на свету, ни в темноте [14], хотя стоит учесть, что характер расположения белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных листьев ячменя различный. С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных проростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев. Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них уровень АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление [181]. Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб светозависимого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного выдерживання их в темноте (рис.4). После 48-часовой темновой экспозиции проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК: максимальное количество аскорбата обнаружено в этиолированных проростках, минимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от уровня ее в этиолянтах.

Рис. 4. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в 7-дневных зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в) проростках ячменя, выдержанных 48 часов в темноте

Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был неодинаков; если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то

32

у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и 19% соответственно. Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по степени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной способностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования, в которых восстановленная форма АК обратимо окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты. Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность процессов в системе АК ↔ ДАК → ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК, тогда как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК используется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный уровень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше определяемого. Следует отметить, что если у этиолированных проростков на свету количество ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно, происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в хлоропластах [286]. Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия зеленых, этиолированных и альбиносных проростков и их способность синтезировать АК на свету, можно было бы связывать биосинтез аскорбата с хлоропластами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так как в этих условиях нарастало количество продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных стрептомицином, который взаимодействует с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Следовательно, светозависимое накопление АК может идти при ингибировании хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур. В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования митохондриальных рибосом на биосинтез АК, так как ранее при исследовании количественной локализации АК в листьях ячменя было показано светозависимое накопление АК во фракции, включающей митохондрии [178]. Ингибирование митохондриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом (100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в темноте. Нижние участки листьев данных проростков, а также этиолированных вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор хлорамфеникола на свет (рис. 5).

33

У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на 134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень светозависимого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным возрастанием содержания окисленной формы. В этиолированных проростках, также как и у зеленых, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК тормозился, и только у альбиносов светозависимое наколение АК не ингибировалось хлорамфениколом. Таким образом, в присутствии хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альбиносных.

34

Рис. 5. Действие хлорамфеникола на содержание АК, ДАК и ДКГК в зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в) листьях ячменя, находящихся на свету (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1). Проростки предварительно 48 часов выдерживались в темноте

Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы митохондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов, преимущественно высокомолекулярных [81]. Поэтому снижение уровня АК у зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может быть результатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков на свету масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не менялся, и это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только хлоропластных рибосом, но и митохондриальных. Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в этиолированных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя синтезировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных рибосом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс, идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются разной скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью субстратом процесса биосинтеза АК. Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом [29], но отношение к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то цитоплазматические - цикдогексимидом [7], угнетающим синтез белка. Действие циклогексимида на светозависимое накопление АК проверялось в следующих опытах (рис. 6).

35

Рис. 6. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в зеленых проростках ячменя после 48 часов темноты (а) и 24 часов освещения (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на воде (б) и растворе циклогексимида (15 мкг/мл) (в)

Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное выдерживание их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно активно накапливают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков после темноты освещалась на воде (контроль), другая - на растворе циклогексимида. В контрольном варианте уровень АК повысился более чем в 3 раза, в присутствии же циклогексимида светозависимое накопление АК было полностью блокировано. Следовательно, в процессе биосинтеза АК в растениях на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-рибосомах цитоплазмы. Как говорилось выше, АК в растениях может синтезироваться из глюкозы и (с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не изучен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза → d-галактуроновая кислота → l-галактоновая кислота → l-галактоно-γ-лактон → l-аскорбиновая кислота. По данным [327], восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон в системе in vitro идет при участии фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и гулонолактоноксидаза [74] соответственно (рис. 7). Для второго фермента показано [402], что в митохондриях эвглены его содержание составляет только 11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в цитозоле. Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза аскорбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез глюкуронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез гулонолактоноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она синтезируется на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в этом случае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона. В работе [178] показано, что при длительном освещении проростков ячменя значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей митохондрии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции [243], а в темноте - наоборот. Эти факты могут говорить об активном использовании АК в митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза, поэтому при отсут36

ствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо сформированным фотосинтетическим аппаратом понижается темновое дыхание [161], количество АК увеличивается в митохондриях. Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом субстратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что экзогенный субстрат - глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК [103]. Если же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые" продукты фотосинтеза [125] или восстановитель - НАДРН+Н+ фотосинтетического проис-

37

Рис. 7. Схема биосинтеза аскорбиновой кислоты (по А.Ленинжеру, 1985 г.) 38

хождения, тогда становится понятным факт более активного накопления АК в зеленых проростках на свету по сравнению с этиолированными и альбиносными. Таким образом, масштаб светозависимого накопления восстановленной формы АК в проростках ячменя определяется степенью сформированности хлоропластов и является максимальным у зеленых проростков по сравнению с этиолированными и альбиносными. Пополнение пула АК на свету тормозится в присутствии хлорамфеникола у всех типов проростков, кроме альбиносных. У зеленых растений светозависимое накопление АК полностью ингибировалось циклогексимидом, что говорит об участии цитоплазматических 80S-рибосом в биосинтезе ферментов, принимающих участие в метаболизации углеводов в lАК.

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО И МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА НА БИОСИНТЕЗ КИСЛОТ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ 4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты в зеленых и этиолированных проростках Биосинтез АК в растениях в основном рассматривается как темновой специфически направленный окислительный процесс, в котором происходит аэробное окисление молекулы сахара. К.Л.Поволоцкая [115], наблюдая образование АК в этиолированных проростках, сделала вывод о том, что свет не является безусловно необходимым для биосинтеза АК, но в случае зерновых обеспечивает большее (в 1,5-2 раза) накопление АК. При изучении природы предшественников АК в этиолированных растениях коровьего горошка М. Рейд [374] отмечала увеличение АК в темноте в проростках, находящихся 4 дня на 0,5%-ном растворе глюкозы. Эти данные подтверждают возможность темнового биосинтеза АК и стимуляцию его экзогенной глюкозой в то время, когда собственные запасы семядолей уже израсходованы. Наблюдаемое рядом авторов [77] увеличение содержания АК в ломтиках лука на воздухе В.А.Девятнин [33] рассматривал как свидетельство наличия в луке ферментативной системы, осуществляющей биосинтез АК. Им была сделана попытка экспериментально показать ферментативный характер образования АК. С этой целью свежеотжатый луковый сок помещался в колбу с раствором глюкозы. Через колбу пропускалась сильная струя воздуха, содержимое колбы охлаждалось до 0°С и освещалось. При соотношении сока к раствору глюкозы 1:20 в присутствии сернокислого марганца синтезировалась АК. Прекращение аэрации останавливало процесс. Если в опыте использовался сок, предварительно нагретый до 100°С, биосинтез АК не шел. Этот факт автор рассматривал как подтверждение того, что биосинтез АК идет при участии фер39

мента, который ингибируется высокой температурой. Освещение и температура, как указывает автор, играют второстепенную роль в данном процессе. Таким образом, биосинтез АК В.А.Девятнин [33] рассматривал как ферментативный процесс, который протекает при достаточном снабжении растительных тканей кислородом и катализируется солями марганца. Природа ферментативной системы осталась не выясненной им, но было показано, что в ней принимают участие органические соединения марганца. Однако сама посылка, из которой исходил В.А.Девятнин,-наличие раневого синтеза АК в кусочках лука вскоре стала подвергаться сомнению. Так, И.П.Митев, Р.Белева-Стайкова [86] показали, что при поранении луковицы возрастает содержание сульфгидрильных групп и невитаминных редуктонов, которые при титрационном способе определения АК с 2,6-дихлорфенолиндофенолом дают завышенные результаты. В.Франке [244] на основании анализа литературных данных сделал вывод о косвенном влиянии света на процесс образования АК. Это мнение разделял К.Е.Овчаров [95], отрицающий прямое участие света в биосинтезе АК. Он говорил, что то обстоятельство, что содержание витаминов в растениях, произрастающих в темноте, как правило, снижается, позволило некоторым авторам прийти к выводу о прямом участии света в биосинтезе витаминов. Однако достоверные факты, говорящие о непосредственном действии света, имеются лишь в отношении витамина Д, а что касается других витаминов, в том числе и витамина С, то такое утверждение ошибочно. В подтверждение этого положения он приводит факт темнового образования витаминов в изолированных корнях гороха, хлопчатника и других культур. К.Е.Овчаров считал, что нельзя говорить о прямом, непосредственном действии света в процессе образования витаминов, а наблюдаемое снижение биосинтеза некоторых витаминов в темноте правильнее объяснить глубокими нарушениями обмена веществ, вызванными длительным пребыванием зеленых растений без освещения. Это может задержать биосинтез не только витаминов, но и многих других жизненно необходимых веществ, играющих важную роль в образовании витаминов. Таким образом, сторонники темнового образования АК указывали на факт накопления АК в этиолированных проростках и в неосвещенных частях растений: в корнях, клубнях. Говоря о накоплении АК в этиолированных проростках, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] полагала, что в этих условиях происходит не новообразование АК, а переход ее из неактивной формы в активную. Это предположение автор сделал на основании того, что накопление витамина С в семенах достигает максимума в момент налива семени, а затем снижается в процессе созревания. При прорастании в темноте накопление витамина С в проростке ограничено тем максимумом, которого оно достигало в стадии налива семени. К тому же наблюдаемое в темноте образование АК, возможно, происходит за счет предшественников, которые синтезируются на свету. Такого мнения придерживалась М.Рэйд [374]. Б.Оберг [192] отмечал бóльшее накопление АК в листьях гороха в темноте, чем на свету, но количество синтезированной АК зависело от интенсивности света предыдущих дней. Несмотря на отрицание рядом исследователей прямого участия света в образовании АК, в литературе накапливались данные, указывающие на увеличение 40

ее содержания под действием света. Еще М.Рэйд [374] отмечала большое влияние света на накопление АК при прорастании и на ранних стадиях роста коровьего горошка. Семидневные растения, растущие на свету, содержали в четыре раза, а одиннадцатидневные - в 8 раз больше АК, чем проростки соответствующего возраста, растущие в темноте. В листьях тюльпана, находящихся на свету, по данным Ф.Ажена [266], количество АК было в 4-5 раз больше, чем в темноте. Со временем появляются наблюдения, указывающие на то, что преимущественное накопление АК происходит у растений, растущих на открытых участках, по сравнению с затененными; в солнечные дни - по сравнению с пасмурными. Такие данные для томатов были получены Н.Восом [444], а также Мао Ляном [322], исследовавшим содержание АК у 48 видов дикорастущих овощных культур, 8 видов древесных и у некоторых других растений. У деревьев и кустарников было найдено повышенное содержание АК в наиболее освещенных частях кроны [446], а у хлопчатника в наиболее освещенных ярусах листьев [140]. Высокое содержание АК в солнечную погоду наблюдалось в листьях люцерны [36], кукурузы [37]. Д.И.Шматок [186] на основе определения АК в 242 видах растений из 31 семейства, растущих в полярно-альпийском ботаническом саду (Мурманская область), также отмечает большее накопление АК в солнечную погоду, чем в пасмурную. Аналогичный вывод сделан для плодово-ягодных культур Алтая [188]. Биосинтез АК из меченой 1-14С-,6-14C-,1-4Н- и 6-3Н-Д-глюкозы идет значительно быстрее на свету, чем в темноте [274]. Стимулирующее действие света на биосинтез АК зависит от его интенсивности. Это показано в опытах с этиолированными проростками ряда растений, выполненных Т.Сугаварой [413]. Пятидневные проростки кукурузы, редиса, китайской капусты освещались 6-42 часов светом различной интенсивности (10-1000 люкс). Установлено, что увеличение содержания АК при освещении шло пропорционально увеличению интенсивности света, по крайней мере в пределах эксперимента автора. В этиолированных проростках, находящихся в ходе эксперимента в темноте, количество АК оставалось почти без изменения. Зависимость биосинтеза АК от интенсивности действующего света показана для целого ряда растений: огурцов, кукурузы, проса, конопли, мака, которые выращивались в парниках при интенсивности света, составляющей 1-1/20 от полного летнего освещения. Оказалось, что уменьшение интенсивности освещения в 10 раз у всех растений привело к уменьшению количества АК в 3-5 раз [67]. С увеличением интенсивности света (0, 3000, 10000, 20000 люкс, 43 часа) возрастало содержание АК в проростках капусты [346] и семядолях японской редьки (О, 500, 2500, 10000 люкс, 24 часа) [284]. При выращивании растений в фитотроне уровень АК также повышался с увеличением мощности ФАР [183]. Работы такого плана продолжаются в связи с решением вопросов выращивания овощей в закрытом грунте и получения витаминной пищи [260, 421]. В литературе имеется лишь несколько указаний на то, что содержание АК в растениях снижается в солнечные дни, но при этом или отмечалась очень жаркая погода, или опытные растения находились на прямом солнечном свету [317]. Для гороха показано увеличение содержания АК в ночное время [70]. 41

Первые данные о накоплении АК на свету в нефотосинтезирующих органах приведены М.Рэйд [375]. При искусственном культивировании на питательной смеси отрезанных верхушечных долей корешков Calonyction aculeatum на свету и в темноте спустя 4-8 недель было обнаружено, что содержание АК в темноте не изменилось, а на свету возросло в 4-10 раз. Аналогичные данные приведены А.М.Смирновым и К.Е.Овчаровым [148]. Однако авторы указывали на замедление роста корней на свету, что могло привести к концентрированию АК на единицу веса корня. Позднее стали появляться работы, указывающие на возможное прямое участие света в образовании АК. Так, А.А.Ничипорович [92] отмечал, что наряду с углеводами прямыми продуктами фотосинтетической деятельности растений могут быть аминокислоты, а также вещества высокой физиологической активности типа витаминов и фитогормонов; что состав и количественное соотношение первичных продуктов фотосинтеза сильно меняются в зависимости от типа и физиологического состояния растений, от минерального питания, от условий водного режима, от интенсивности и спектрального состава света. А.Мицуи, Я.Ои [344], изучая природу восстанавливающего вещества, образующегося при освещении реакционной смеси, состоящей из суспензии хлоропластов и цитоплазматической фракции листьев шпината, нашли, что весь неизвестный фотопродукт или большая его часть является АК. Гомогенаты из зеленых и этиолированных проростков ячменя в анаэробных условиях на свету также накапливали восстанавливающие вещества [343]. Данный факт авторы объяснили тем, что на свету происходит фотовосстановление предшественника АК. Если вытяжки содержали не целые хлоропласты, а их фрагменты, то фотовосстановительного образования АК не происходило. Е.Ассолбергс [209] уточняет, что только некоторые ступени синтеза АК являются светозависимыми. Данное заключение он делает на основании того, что отрезанные листья яблони, выдержанные в атмосфере 14СО2, продолжали включать радиоактивный углерод в молекулу АК, находясь в нормальной атмосфере и в темноте, и на свету. Однако с увеличением интенсивности света включение 14 С в АК возрастало. Увеличение содержания АК при освещении связывается многими исследователями с процессом фотосинтеза. Так, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] показала, что при световом голодании взрослого растения происходит прогрессивная потеря АК. При перенесении растения в нормальные условия содержание АК вновь возрастает, но во время активной ассимиляции сильно снижается. Отсюда автор делает вывод об участии АК в процессе фотосинтеза и новообразовании ее в том же самом процессе. Предположение о существовании прямой связи между содержанием АК и фотосинтезом высказал Т.Сугавара [413]. Соответствие между количеством АК и площадью поверхности изолированных листьев яблони, по мнению Е.Ассолбергса [209], указывает на прямую зависимость содержания АК от интенсивности фотосинтеза. Большинство авторов [77,138, 152] стимулирующее действие света объясняют тем, что в процессе фотосинтеза создаются особые активные сахара, из 42

которых легко может синтезироваться АК. С.Д.Львов, Г.К.Гуцевич, А.Пантелеев [77] писали, что связь процесса образования АК с фотосинтезом не прямая, а косвенная, что в условиях оживленного фотосинтеза действительно наблюдается накопление витамина С, поскольку в процессе фотосинтеза создаются особые активные сахара, из которых легче может синтезироваться молекула АК. При отсутствии фотосинтеза для образования АК из наличных сахаров требуются более сложные условия для переработки их в соответствующую форму, поэтому накопление АК идет здесь, если оно вообще имеет место в таких условиях, гораздо более замедленным темпом и не достигает того высокого уровня, как на свету. Подтверждением положения, высказанного С.Д.Львовым с соавторами, может служить наблюдение того, что суточные кривые накопления АК не совпадают с кривыми фотосинтеза, но всегда максимальное накопление АК в растениях отмечается после наибольшего подъема фотосинтеза. В корнях, где отсутствует фотосинтез и сахара вновь не образуются, влияние света, по мнению К.Е.Овчарова [96], осуществляется через активирование ферментов. Связь АК с фотосинтезом В.Франке [244, 246] также считает косвенной, так как синтез АК может идти в бесхлорофильных органах при наличии ассимилятов. У 4-недельных альбиносных проростков конских бобов он наблюдал значительное содержание АК - не меньшее, чем у одновозрастных зеленых. По мнению Г.Менера и В.Франке [339], АК не относится к числу прямых продуктов фотосинтеза, так как при усиленном фотосинтезе в атмосфере, богатой углекислым газом, образование ее ослабевает. Таким образом, имеющиеся в литературе данные не дают возможности однозначно оценить роль света в биосинтезе АК. С одной стороны, известны факты темнового образования АК в этиолированных проростках, корнях и клубнях, с другой стороны, множество наблюдений говорит об увеличении ее содержания на свету. В связи с этим возникает вопрос: ограничивается ли действие света в процессе образования АК только тем, что на свету увеличивается количество продуктов фотосинтеза - углеводов, необходимых для биосинтеза АК в качестве субстрата, или свет непосредственно участвует в процессе новообразования аскорбата? Важную роль в процессе образования АК играет качественный состав света. К 1939 году накопилось немало данных о действии света различного спектрального состава на фотосинтез. Согласно этим данным, продуктивность фотосинтеза в зеленых растениях в большинстве случаев уменьшалась с уменьшением длины волны действующего света. Т.Сугавара [414], признавая наличие прямой связи между фотосинтезом и содержанием АК, попытался установить влияние качества света на биосинтез АК. Им исследовалось действие красного (670 нм), оранжево-красного (645 нм), зеленого (560-455 нм), синего (505-380 нм) и белого света на образование АК в этиолированных проростках кукурузы, гороха, сои, китайской капусты, редиса, ячменя и др. растений. Фильтры, необходимые для получения света различной длины волны, изготавливали, покрывая стеклянные пластинки окрашенной пленкой желатина. Используемый свет выравнивался не по общей энергии, а по 43

величине максимума пропускания. Учитывая эффективность действия на образование АК, свет различных участков спектра можно было расположить в следующем порядке: белый свет > красный ≥ оранжево-красный > зеленый > синий. В опыте с редисом результаты не совпадали с основными наблюдениями: процент АК был относительно высок в зеленой и синей частях спектра. Данный факт автор объяснил тем, что на синем и зеленом свету проростки редиса росли энергичнее. Б.И.Щербаков [187], исследуя проростки пшеницы, нашел, что среди отдельных лучей солнечного спектра наиболее активная роль в стимуляции образования АК принадлежит красному свету (680-620 нм и на линии 344,061 нм). Действие сине-фиолетовых лучей в комплексе с голубыми и зелеными было слабее. Наиболее активным для синтеза АК автор считает свет тех участков спектра, которые активны в отношении фотосинтеза. Однако в опытах с листьями традесканции И.Руге [379] отметил, что содержание АК в листьях при освещении светом с длиной волны 650 нм и выше было больше, чем в неосвещенных листьях, а свет с длиной волны меньше 480 нм тормозил синтез АК, так что наиболее активные для фотосинтеза области спектра - 440 и 630 нм - не совпадали с точками наибольшей стимуляции синтеза АК. Имеются примеры положительного влияния зеленого света на биосинтез АК в растениях [95, 98, 187], что также нельзя связать с процессом фотосинтеза. Результаты исследования действия синего света на биосинтез АК крайне противоречивы. К.Е.Овчаров [95], выращивая проростки хлопчатника под люминесцентными лампами различного спектрального состава, нашел, это синий свет задерживал образование в них АК. По данным И.А.Чернавиной [167], синий свет, напротив, повышал в листьях яровой и озимой пшеницы содержание восстановленной и окисленной форм АК. Только на синем свету (380-440 нм) отмечено увеличение общего количества АК у эвглены, тогда как зеленый и красный свет не проявили активности [404]. К.Богдански, Н.Богданска [220] исследовали накопление АК в плодах яблонь, завязи которых прикрывали цветными пленками из полиэтилена. Определение содержания АК через 6 недель показало, что количество ее в плодах, затененных синей пленкой, было выше, чем в плодах под желтой и особенно под красной пленкой. Эффективность сине-зеленого света для образования АК в проростках фасоли отмечали Нива и Катаяма [351]. В большинстве работ, анализирующих влияние качества света на биосинтез АК, отмечается бóльшая эффективность белого (полихроматического) света по сравнению с монохроматическим [98,108, 187, 194, 220, 414]. Обзор литературных данных о действии света различного спектрального состава на биосинтез АК показывает, что имеется незначительное число работ, освещающих эту тему. К тому же представленные данные, особенно по действию синего света, неоднозначны. Это может быть следствием того, что в работах использовались различные источники света, различные виды растений. Исследованиями же Т.А.Парибок [111] показано, что реакция растений на освещение светом различного спек44

трального состава имеет видовую специфичность. Так, для томатов и сельдерея наиболее активным в образовании АК был свет розовых люминесцентных ламп, а для гороха - синих ламп. Кроме этого специфичность действия лучей различных областей ФАР на биосинтез АК зависит от мощности лучистого потока. У пшеницы и редиса при низкой интенсивности света (50 Вт/м2) максимальное количество АК накапливалось на красном свету, а с повышением интенсивности света до 100 Вт/м2 и выше - на синем свету [48]. В большинстве работ для освещения растений использовался свет широких участков спектра, данные по действию на биосинтез АК света спектральных линий практически отсутствуют. При изучении действия света на биосинтез АК в растениях нами было показано, что свет является одним из важнейших факторов в этом процессе [173]. Стимуляция светом накопления АК в зеленых проростках ячменя проявлялась уже при интенсивности света, равной около 100 эрг⋅см-2⋅с-1 [98], и во многом зависела от первоначального содержания АК в проростках. Поэтому предварительное выдерживание растений в темноте, снижающее общее количество АК, способствовало большему накоплению ее на свету (табл. 8). На основании этого в наших исследованиях проростки перед опытами около 40 часов выдерживались в темноте для снижения в них уровня АК, что в дальнейшем способствовало повышению отзывчивости проростков на освещение. По имеющимся представлениям, биосинтез АК в растениях усиливается при дополнительном снабжении их гексозами, однако роль света в этом процессе не выяснена. Как показали наши исследования, положительное действие углеводов на биосинтез АК в зеленых листьях ячменя проявлялось только на свету (рис.8). В освещенных проростках, находившихся в течение 10 часов на растворе глюкозы, значительно увеличилось содержание АК. За это же время в листьях ячменя, плавающих на растворе глюкозы в темноте, количество АК не повысилось, хотя следовало бы ожидать увеличения содержания АК от дополнительно поступившей в лист глюкозы, если бы биосинтез АК был только темновым процессом. За 6-7 часов пребывания листьев на растворе глюкозы-1,6-14С в темноте в них входит глюкоза: по нашим данным, активность 0,1 мл сока, выделенного из освещенных листьев, составила 2504 имп/мин, а из темновых листьев - 778 имп/мин. К тому же за это время в листьях, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, происходит увеличение редуцирующих углеводов на 20% [100]. Следовательно, хотя в лист в темноте входит значительное количество глюкозы, увеличения содержания АК не наблюдается. Только при очень длительном выдерживании растений, дополнительно снабженных углеводами, в темноте (от 64 часов до 4 суток) на сильно концентрированных растворах (10-20%-ная сахароза) отмечается некоторое увеличение содержания АК [193, 374], что подтверждается и нашими данными [98]. Однако необходимо иметь в виду, что при столь длительном пребывании зеленых растений в темноте в них могли произойти глубокие изменения в обмене веществ. 45

- темнота; - свет Рис. 8. Влияние света на биосинтез АК в растущих проростках ячменя (а) и проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы (б). Интенсивность света 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, экспозиция 10 часов Таблица 8 Влияние предварительного затемнения на содержание АК в 8-дневных проростках овса, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы в темноте и на белом свету (интенсивность света 25 эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 8 часов)

Условия выращивания проростков до опыта Нормальная смена дня и ночи

40 часов в темноте

69 часов в темноте

Условия опыта Исходное содержание В темноте На свету Исходное содержание В темноте На свету Исходное содержание В темноте На свету

Содержание АК мкг/г % 100 537,6±4,8 101 541,6±8,9 116 621,2±13,1 100 468,4±3,5 101 474,4±1,5 128 600,8±3,0 100 386,8±0,3 112 431,6±2,0 133 516,2±9,6

Приведенные данные позволяют заключить, что свет имеет значение не только для фотосинтетического процесса, дающего исходный материал для био46

синтеза АК, но и играет определенную роль в преобразовании углеводов в молекулу АК. Можно предположить, что в зеленых листьях ячменя в процессе биосинтеза АК наряду с темновыми реакциями имеют место фотохимические. Одним из доказательств наличия фотохимической реакции является постоянство продукта реакции в том случае, если не изменяется произведение интенсивности действующего света на время его действия [156]. Из приведенных данных (табл.9) видно, что количество синтезированной АК всегда оставалось постоянным, если произведение интенсивности света на время действия не менялось и равнялось 90 (10 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 9 часов; 15 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 6 часов; 30 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 3 часа). Следовательно, результаты этого опыта подтверждают выдвинутое нами предположение о возможности существования в биосинтезе АК фотохимических реакций. При биосинтезе АК в растениях фотохимическая реакция или реакции, вероятно, чередуются с биохимическими, так как при понижении температуры до минус 1°С наблюдалось замедление образования АК в проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету. Увеличение содержания АК в растениях на свету многие исследователи связывают с процессом фотосинтеза [42, 70, 209], в результате которого образуются углеводы, необходимые для темнового синтеза АК. В этом случае спектры действия биосинтеза АК и фотосинтеза должны совпадать. Нами исследовалось действие света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя. Монохроматический свет получали с помощью цветных стеклянных светофильтров с известными характеристиками. В качестве источника света использовались лампы накаливания и люминесцентные лампы БС-30. В табл. 10 приведены результаты действия света той максимальной интенсивности, которую удалось получить от указанных источников света. Экспериментальные данные показывают, что содержание АК значительно увеличилось только на свету красного участка спектра 620-740 нм, активного для фотосинтеза. Некоторое накопление АК отмечено на зеленом свету 480-560 нм, тогда как активные для фотосинтеза синий 430-520 нм и фиолетовый 370460 нм участки спектра [11, 128] не оказали положительного действия на биосинтез АК. Таблица 9 Влияние света различной интенсивности и времени освещения (при постоянстве их произведения) на биосинтез АК в 6-дневных зелёных проростках ячменя

Условия опыта

Интенсивность света в тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 В темноте На свету 10 На свету 15 На свету 30

Время освещения в часах 9 6 3

Произведение времени освещения на интенсивность света 90 90 90

Содержание АК мкг/г % 65,9±1,3 126,8±8,6 134,0±1,3 138,0±8,9

100 192 203 209

47

Таблица 10 Влияние света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя (экспозицая 10 ч)

№ Условия опыопыта та 1 В темноте На УФ свету 320-400 нм На белом свету 2 В темноте На фиолетовом свету 370-460 нм 3 В темноте На синем свету 430-520 нм 4 В темноте На зеленом свету 480-560 нм 5 В темноте На красном свету 620-740 нм - // 6 В темноте На красном свету 600-1100 нм 7 В темноте На красном свету 690-1100 нм На красном свету 720-1100 нм 8 В темноте На инфракрасном свету 880-3000 нм

Интенсивность света, тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 1,6 16,0 -

Содержание АК в проростках зеленых этиолированных мкг/г % мкг/г % 71,8±1,1 100 89,8±2,7 100 72,6±1,6 101 114,2±2,6 127 156,2±3,8 218 178,0±1,5 198 155,7±12,7 100 151,6±1,8 100

1,3 -

164,4±0,9 106 188,8±10,2 100

183,2±9,2 236,6±3,9

121 100

6,5 -

193,4±2,4 102 86,0±0,1 100

280,3±4,9 184,8±2,8

118 100

4,4 -

98,8±0,8 115 143,6±3,2 100

230,2±4,2 -

125 -

5,0 50,0 -

187,2±7,8 130 208,4±1,2 145 210,4±17,9 100

334,2±1,4

100

26,0 -

217,2±9,0 103 81,0±1,0 100

362,8±5,5 -

109 -

32,0

100,3±0,1 124

-

-

32,0 -

114,4±5,6 141 210,4±17,9 100

128,4±0,6

100

75,0

195,2±12,0

93

160,0±0,4

125

Красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм, включающий активную для фотосинтеза область спектра, также оказался неэффективным для биосинтеза АК, что, возможно, объясняется добавлением к красному свету инфракрасной радиации. В то же время положительно действовал на биосинтез АК длинноволновый красный свет с ближним инфракрасным 690-1100 и 7201100 нм, который малоактивен для фотосинтеза. Таким образом, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпадают. Это дает основание предположить, что биосинтез АК в зеленых проростках ячменя прямо не связан с фотосинтезом. 48

Этиолированные проростки ячменя, несмотря на не полностью синтезированный за 10 часов опыта пигментный аппарат, отличались большей чувствительностью к освещению, чем зеленые. Так, содержание АК в них увеличилось на синем 430-520 нм, фиолетовом 370-460 нм, ультрафиолетовом 320-400 нм и инфракрасном 880-3000 нм свету, т.е. в тех участках спектра, которые не стимулировали биосинтез АК в зеленых проростках. На зеленом свету 480-560 нм АК накапливалась как в зеленых, так и в этиолированных проростках, однако в последних более интенсивно, что тоже говорит о большой чувствительности к освещению этиолянтов. Для этиолированных проростков ячменя, так же, как и для зеленых, неактивным оказался красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм интенсивностью 26 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Увеличение содержания АК в этиолированных проростках на УФ и инфракрасном свету - неактивных для фотосинтеза участках спектра - подтверждает высказанное ранее предположение о том, что биосинтез АК в растениях прямо не связан о фотосинтезом, а протекает при участии специфических фотобиохимических реакций. Об этом же говорят и данные опытов с использованием экзогенной глюкозы-14С [171]. Вывод об отсутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК находит подтверждение в исследовании роли зеленых пигментов в накоплении АК. При решении этого вопроса мы исходили из следующего положения: если существует прямая зависимость между биосинтезом аскорбиновой кислоты и наличием хлорофилла, то освещение проростков светом с длиной волны, соответствующей пикам поглощения хлорофилла А и В в листе [123] как в красной, так и в сине-фиолетовой области, способствовало бы накоплению аскорбиновой кислоты. Этим самым была сделана попытка выяснить спектр действия биосинтеза аскорбиновой кислоты. В результате исследований [104,109] было выяснено, что свет с длиной волны 370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области, и 440-520 нм, включающей пик поглощения хлорофилла В в синей области, не оказал влияния на биосинтез аскорбиновой кислоты в проростках ячменя при интенсивности 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Красный свет 670-740 нм, соответствующий пику поглощения хлорофилла А, оказывал положительное действие на биосинтез АК лишь при высокой интенсивности, равной 12 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. При добавлении к свету данного участка спектра более коротковолнового красного света, включающего пик поглощения хлорофилла В в красной области, накапливалось значительное количество АК уже при интенсивности света 500 эрг⋅см-2⋅с-1. Одновременное освещение проростков светом, соответствующим пикам поглощения хлорофилла А в фиолетовой и красной областях, практически не изменило содержания АК (табл. 11), хотя, как известно, хлорофилл А является основным пигментом фотосинтеза. Следовательно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в области поглощения хлорофилла А не совпадают. 49

Таблица 11 Влияние света с длиной волны, включающей пики поглощения хлорофилла А и В в красной и сине-фиолетовой областях, на биосинтез аскорбиновой кислоты в проростках ячмени (экспозиция 10 ч)

Условия опыта

В темноте На свету с длиной волны: 370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области; 670-740 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в красной области На свету с длиной волны: 440-520 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла В в синей области; 635-780 нм, соответствующем пикам поглощения хлорофилла А и В в красной области На свету лампы накаливания

Интенсивность Содержание света в тыс. восстановленной АК -2 -1 в мкг/г в% эрг⋅см ⋅с 147,8 100 0,7 5,0

159,6

108

184,4 180,6

125 122

0,7 5,0 5,7

К сожалению, с помощью стеклянных светофильтров точно выделить свет, включающий пик поглощения хлорофилла В в красной области, нам не удалось, поэтому исследовали свет, включающий пики поглощения хлорофилла В в синей в хлорофиллов А и В в красной областях. Этот свет оказался активным для биосинтеза АК и по своему действию был идентичен действию света лампы накаливания равной интенсивности. Физиологическая роль хлорофилла В в растениях еще не достаточно ясна. Возможно, что он, поглощая свет соответствующей части красной области спектра, участвует и в фотобиохимическом синтезе АК. В то же время не исключено, что активность света 635-780 нм объясняется добавлением к неактивному участку спектра 670-740 нм, соответствующему пику поглощения хлорофилла А в красной области, более коротко- и длинноволновой радиации, т.е. расширением спектра действующего света. Во всех наших опытах белый свет (полихроматический) был эффективнее в биосинтезе АК, чем монохроматический. При сочетании света нескольких участков видимой области спектра также синтезировалось больше АК, чем при действии света одного участка спектра; в иных случаях активным оказался свет, полученный при смешении неактивных для биосинтеза АК областей спектра. Так, под действием синего света 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 содержание АК в зеленых проростках не изменилось (рис. 9). Неэффективным оказался и фиолетовый свет 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как сине-фиолетовый свет 370-500 нм уже при интенсивности, равной 3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, положительно влиял на накопление АК. Данный эффект, вероятно, не является точной копией эффекта Эмерсона, наблюдаемого в фотосинтезе и 50

заключающегося в усилении активности действующего света при дополнительном освещении светом другой длины волны. В наших опытах активным для биосинтеза АК оказался свет, полученный при сочетании двух неактивных участков спектра. В связи с этим и активность белого света в биосинтезе АК, повидимому, нельзя рассматривать только как простое складывание активных для биосинтеза АК участков спектра.

Рис. 9. Процент увеличения биосинтеза АК на синем свету 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (1), фиолетовом 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (2) и сине-феолетовом 370-500 нм интенсивностью 3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (3) по отношению к контролю (темнота). Экспозиция 10 часов

Обзор литературных данных по действию света различного качественного состава на биосинтез АК показывает, что изучается в основном действие света широких участков спектра и остается невыясненной роль света чистых спектральных линий. Нами [107] исследовался свет синей спектральной линии 436 нм, выделенной из излучения ртутно-кварцевой лампы ПРК-7, при использовании светофильтров СС5, С3С18, ЖС11, а также свет зеленой линии 546 нм (светофильтры ЖС17, С3С10, ПС7) и желтой - 577 нм (светофильтры С3С10; ОС13; 3С7). Инфракрасная радиация устранялась водным экраном. Действие света спектральных линий сравнивалось с действием света соответствующих участков спектра равной интенсивности (6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, рис. 10). Неэффективным для биосинтеза АК оказался свет синей спектральной линии и синего участка спектра (430-520 нм). Свет зеленой спектральной линии не изменил содержания аскорбиновой кислоты ни при интенсивности света, равной 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, ни при 13 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как свет зеленого участка спектра (480-600 нм), как всегда, проявил большую активность. Из трех исследованных спектральных линий только свет желтой линии оказал положительное действие на образование аскорбиновой кислоты. Однако свет желто-оранжевого участка спектра оказался более благоприятным для биосинтеза АК, чем свет желтой 51

спектральной линии. Следовательно, в биосинтезе АК свет широких участков спектра используется лучше, чем свет соответствующих спектральных линий при равных интенсивностях.

Рис. 10. Биосинтез АК проростками ячменя: А - в темноте; Б - на синем свету 430-520 нм; В - на свету синей спектральной линии 436 нм; Г - на белом свету; Д - на зеленом свету 480-600 нм, с резким уменьшением интенсивности в желтой части спектра; Е - на свету зеленой спектральной линии 436 нм; Ж - на желто-оранжевом свету 550-780 нм со значительным уменьшением интенсивности в красной части спектра; З - на свету желтой линии 577 нм. Экспозиция 6 часов. Интенсивность света 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

Известно, что энергия кванта света коротковолновой области спектра превосходит таковую в более длинноволновой области. Поэтому при сравнении действия света различных участков спектра друг с другом необходимо выравнивать их по квантам. Это было учтено в следующей серии опытов, где исследовалось действие красного 652 и 645 нм, желтого 587 нм и зеленого света 553 нм интенсивностью 1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных проростках озимого ячменя сорта Паллидум 330/2. Монохроматический свет был выделен с помощью интерференционных светофильтров от кинопроекционной лампы, мощностью 400 Вт, являющейся точечным источником света. С помощью специальной установки на интерференционный светофильтр проектировали параллельный пучок света, что давало возможность выделить монохроматический свет с шириной в максимуме пропускания 9-12 нм. Приведенные данные (табл. 12) подтвердили сделанный ранее вывод о высокой активности в биосинтезе АК красного света, соответствующего пику поглощения хлорофилла В в красной области спектра (645 нм), а также зеленого света с длиной волны в максимуме пропускания светофильтра 553 нм. Однако 52

наибольшую активность в биосинтезе АК проявил желтый свет - 587 нм, на котором уровень АК увеличился на 160% по сравнению с темновым контролем. Сказанное дает основание заключить, что акцепторами света в процессе светозависимого накопления АК могут быть соединения, поглощающие свет в коротковолновой красной области спектра и в желто-зеленой области. Таблица 12 Влияние зеленого, желтого и красного света интенсивностью 1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных проростках озимого ячменя (экспозиция 8 ч)

№ опыта 1 2 3 4

Вариант опыта В темноте На зеленом свету 553 нм В темноте На желтом свету 587 нм В темноте На красном свету 645 нм В темноте На красном свету 652 нм

Содержание АК мкг/г % 100 58±1,5 190 110±4,0 100 30±2,0 260 78±2,0 100 36±0,5 211 76±3,5 100 22±0,5 150 33±1,0

Продукты фотосинтеза во многом определяются качеством действующего света: работами Н.П.Воскресенской [18, 19] и других [280, 215] показано слабое образование углеводов на синем свету, поэтому можно предположить, что неэффективность синего света (430-520 нм) в процессе образования АК объясняется недостаточной обеспеченностью данного процесса углеводами. Однако в серии опытов, проведенных с зелеными проростками ячменя, плавающими на 0,5%-ном растворе глюкозы, где не было недостатка в исходном материале, также наблюдалась слабая активность синего света по сравнению с красным (620-740 нм) и зеленым (480-600 нм) светом (рис. 11) [102]. На синем свету в проростках, получивших экзогенную глюкозу, накопление АК отмечалось лишь при высокой интенсивности синего света, равной 20 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как на белом свету в проростках даже без дополнительного снабжения углеводами биосинтез АК шел уже при интенсивности света, равной около 100 эрг⋅см-2⋅с-1, на зеленом свету - при интенсивности света, равной 4,4 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, а на коротковолновом красном - при 2,3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Следовательно, активный для фотосинтеза синий участок спектра (430-520 нм) проявляет некоторую активность в биосинтезе аскорбиновой кислоты лишь при высоких интенсивностях света и при дополнительном снабжении углеводами. Вероятно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза аскорбиновой кислоты в отдельных областях не совпадают, а свет оказывает специфическое действие на биосинтез АК помимо фотосинтетического процесса. Аналогичный вывод делает И.Руге [379]. Однако в литературе имеется ряд указаний о положительном действий синего света на биосинтез АК: Нива, Катаяма [351], И.А. Чернавина 53

[167], К. Богдански, Н. Богданска [220]. Но так как большинство авторов для выделения синего света использовало цветные пленки, то, скорее всего, они имели дело не с чисто выделенным синим участком спектра, а с комплексным светом, который используется в биосинтезе АК лучше, чем свет монохроматический [186].

- ДАК - АК Рис. 11. Биосинтез АК и ДАК листьями ячменя, находящимися на 0,5%-ном растворе глюкозы в темноте (а), на синем 430-520 нм (б), зеленом 480-600 нм (в), красном 620-740 нм (г) и белом свету (д) интенсивностью 20 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 8 часов

Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что свет играет важную роль в биосинтезе АК, причем большое значение в этом процессе имеет качественный состав света. Действие света на биосинтез АК не только осуществляется через фотосинтез, дающий субстрат для аскорбата, но и носит специфический характер, что дает основание рассматривать в целом образование АК как фотохимический процесс; хотя, скорее всего, лишь некоторые реакции (или реакция) на пути от углеводов к АК являются фотохимическими. Таким может быть последний этап в образовании АК из предшественника [343].

54

4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов При прорастании семян даже в темноте в проростках образуется АК. Содержание ее в первые дни увеличивается до определенного предела, затем понижается, что связывается с исчезновением субстратных ресурсов семени [374,379]. Для новообразования же АК необходим свет. При перенесении на свет этиолированных проростков наряду с накоплением АК происходит их зеленение, поэтому естественным было связывать новообразование АК с накоплением пигментов. Работами многих авторов показано, что хлорофиллоносные ткани растений наиболее богаты АК [39, 52, 142]. Подтверждением этого положения могут служить исследования Т.Сугавары [414], в которых 5-дневные этиолированные проростки редиса, кукурузы и китайской капусты при прозеленениии на свету высокой интенсивности внешне были тёмно-зелёными и содержали больше АК, чем желто-зеленые проростки, находящиеся на свету низкой интенсивности. В других опытах освещение 5-дневных проростков кукурузы, содержащих хлорофилл, приводило к накоплению в них АК, в то время как альбиносные проростки при освещении не меняли уровня АК. Увеличивающийся синтез АК на свету, по мнению автора, был, несомненно, прямо или косвенно обусловлен влиянием света на деятельность хлоропластов. Как считает Ф.Я.Механик [83], прямая зависимость между содержанием АК и хлорофилла имеет место лишь в определенных пределах уровней этих показателей. Количество АК растет параллельно с увеличением содержания хлорофилла лишь до 85% от его содержания в нормальных листьях. У зеленых овощей, по данным А.Акао [197], отношение содержания хлорофилла к АК составляет 0,81, а в семядолях японской редьки при 48-часовом освещении между содержанием хлорофилла и АК отмечалась линейная зависимость при коэффициенте корреляции 0,96 [284]. Детальные исследования динамики зеленения этиолированных проростков подсолнечника, кукурузы, репы, конских бобов и овса [415] показали, что через 30-60 минут после начала освещения в проростках появляется хлорофилл А и начинается фотосинтез. Только после этого отмечается новообразование АК. Хлорофилл В появляется через 2-3 часа после хлорофилла А, отсюда следует, что присутствие хлорофилла В не обязательно для начала образования АК. В то же время И.Руге [379] считал, что природа листовых пигментов, обусловливающих синтез АК, еще не ясна и что они не идентичны ни хлорофиллу, ни каротину. М.Мириманов [342] предполагал наличие в клеточном соке связи АК с флавонолами. Однако, хотя большее количество АК обычно находится в хлорофиллоносных тканях, ряд авторов [233 363, 374, 415] указывает на отсутствие параллелизма в образовании АК и хлорофилла. М.Рэйд [374] отмечала, что листья могут иметь очень мало хлорофилла, но содержать много АК или иметь очень много хлорофилла, но сравнительно мало АК. В работе К.Г.Врублевской [22] показано, 55

что в отдельные фазы онтогенеза конских бобов значительное количество АК находится в корнях, куда она может транспортироваться из листьев [169]. Независимость образования АК от содержания хлорофилла А.М.Смирнов и К.Е.Овчаров [148] подтверждают опытами с изолированными корнями ряда растений, в которых на свету отмечалось увеличение содержания АК. Корни более 25 месяцев росли без надземных органов, поэтому, как считают авторы, нет оснований считать, что в синтезе АК принимал участие хлорофилл. Вопрос о взаимоотношении АК и желтых пигментов изучен крайне недостаточно. В.А.Бунаков и др. [10, 363], исследуя плоды томата, моркови, шиповника, отмечают отсутствие определенного соотношения между содержанием АК и каротина. Некоторые авторы считают, что существует антогонизм между процессами образования каротина и АК. В.С.Фёдорова [160], напротив, наблюдала одновременное накопление АК и каротина у лиственницы, кедра и кипрея с поднятием их в горы до верхних границ массового распространения видов. Такие противоречивые сведения дают основание сказать, что функциональные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК остаются пока неясными [247]. То же самое с еще большим правом, можно сказать о взаимосвязи биосинтеза АК и желтых пигментов. В работе М.М.Окунцова и др. [109] было показано, что, создавая различные условия освещения для этиолированных проростков, можно получить растения с определенным соотношением зеленых и желтых пигментов и что особенно большим различием в содержании зеленых пигментов отличаются проростки, выращенные на синем и зеленом свету. В своих исследованиях мы использовали это свойство проростков для получения растений, отличающихся по содержанию пигментов, с тем чтобы на этих объектах выяснить зависимость образования АК от количественного содержания пигментов (хлорофилла А, хлорофилла В, каротина, лютеина, виолаксантина). В результате проведенных опытов не обнаружено количественной зависимости в содержании АК и пигментов, а в некоторых случаях растения, содержащие больше зеленых и желтых пигментов, отличались даже более низким уровнем АК (табл.13). Возможно, здесь имеет место такое же явление, как в случае фотосинтеза и хлорофилла, где также не наблюдается количественной зависимости интенсивности фотосинтеза от содержания зеленых пигментов, хотя роль хлорофилла в фотосинтезе общеизвестна. 4.3. Исследование способности альбиносных проростков накапливать аскорбиновую кислоту на свету Освещенные части растений обычно содержат больше АК, однако при исследовании действия света на ее биосинтез рядом исследователей высказывалось предположение, что этот процесс прямо не связан с фотосинтезом [244, 246, 339]. Подтверждением такого мнения могут служить данные о несовпадении в некоторых областях спектров действия биосинтеза АК и фотосинтеза [101, 103].

56

Неясными пока остаются функциональные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК [24, 109].

57

Таблица 13 Влияние белого света на образование аскорбиновой кислоты и пигментов в проростках ячменя, выращенных на синем (430-520 нм) и красном свету (620-1100 нм) интенсивностью 9 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 Условия выращивания проростков 1, 2 день - в темноте 3, 4, 5 день: в темноте по 8 часов на синем свету ежедневно по 8 часов на красном свету ежедневно

Содержание пигментов в γ на 1 г хлорофилл каро- люте- виолакА В тин ин сантин 0,00 0,00 6,70 23,91 17,84

Содержание АК в мг % в% 13,42

100

192,83

47,85

14,97

31,44

23,11

107,2±1,3

154

6 день: в темноте 8 часов на белом свету интенсивностью 5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 725,58

245,01

36,86

48,26

35,75

846,26

285,41

43,60

50,03

36,40

184,0±2,2 179,2±4,4

137 134

После освещения 15 часов в темноте

58

При исследовании этих вопросов наиболее перспективными могут быть работы с беспигментными мутантами или с растениями, имеющими измененный пигментный состав, которые можно получить при обработке растений некоторыми антибиотиками: хлорамфениколом или СМ. Исследование механизма действия СМ на прокариотные организмы показало его ингибирующее влияние на функцию рибосом. СМ связывается с 70S-рибосомами [31, 261], в результате чего появляются ошибки при считывании информации с природной матрицы [420]. Наличие 70S-рибосом и у высших растений объясняет факт подавления в присутствии СМ синтеза хлорофилла, РНК, развития структуры хлоропластов [222], уменьшение скорости включения аминокислот в белки пластид [228]. Угнетение биосинтеза хлорофилла и развития хлоропластов под действием СМ отмечено у этиолированных проростков томатов, турнепса, капусты, горчицы [319, 320, 321]. Другим исследователям, используя обработку растений СМ, удалось получить альбиносные особи эвглены [366] и альбиносные растения пшеницы [6]. По данным Р.С.Бабаяна и др. [6], СМ в концентрации 150200 мкг/мл вызывает появление альбиносных проростков у пшеницы, однако эффективные для пшеницы дозы СМ не оказывали существенного действия на семена ячменя, поэтому в начале своей работы мы определили концентрации СМ, вызывающие альбинизм у ячменя. Эти концентрации примерно в десять раз превосходили активные для пшеницы дозы и равнялись 1-2,5 мг/мл. Такое большое колебание величины концентрации действия, вероятно, объясняется тем, что 30S-субъединицы рибосом в зависимости от температуры могут присоединять одну или две молекулы СМ [31].

Проростки ячменя, выросшие из семян, обработанных стрептомицином (справа - контроль). Фото Я.Д. Кесельман 59

Для получения альбиносных проростков семена ячменя, помещенные в чашки Петри или плоские кюветы, смачивались раствором СМ [181]. Чаще всего использовалась концентрация 2,5 мг/мл. Через сутки обработка семян раствором повторялась; через двое-трое суток проклюнувшиеся семена высаживались в почву. Первый лист проростков, полученных из обработанных СМ семян, на две трети был альбиносным, верхушка оставалась пигментированной (см. фото на с. 57). Зона раздела имела желто-зеленую окраску. В опытах использовались вырезки из альбиносных участков мутантных листьев. В них определено содержание пигментов по Нибому [75]. Действие света (люминесцентные лампы ЛЦЦ40) на содержание хлорофилла и каротиноидов представлено в таблице 14. Кроме альбиносного материала исследовались зеленые и этиолированные проростки. В зеленых листьях ячменя, плавающих на растворе СМ, при освещении происходит уменьшение количества хлорофиллов и суммы каротиноидов по сравнению с контрольным вариантом - листьями, плавающими на воде. Таблица 14 Биосинтез пигментов (мкг/г) листьями ячменя в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Исходное содержание На воде На воде + СМ Исходное содержание На воде На воде + СМ Исходное содержание На воде На воде + СМ Исходное содержание На воде На воде + СМ

Хлорофилл А Хлорофилл В 3еленые листья 360,2±3,0 295,4±13,0 442,7±20,8 305,9±7,9 314,2±10,9 233,8±7,1 Этиолированные 0 0 147,8±2,9 113,2±7,6 42,0±1,8 41,2±10,4 Световые альбиносы 0 0 0 0 0 0 Темновые альбиносы 0,2±0,3 0,3±0,66 0,9±0,03 1,7±0,1 0 0

Каротиноиды 156,3±9,2 212,4±7,4 158,5±5,1 16,0±0,1 94,3±6,5 37,4±1,0 4,1±0,1 4,8±0,4 3,2±0,1 5,0±0,2 8,4±0,6 5,5±0,5

В этиолированных проростках в присутствии СМ за 24 часа освещения синтезируется некоторое количество хлорофилла А, В и каротиноидов, однако в контроле синтез указанных пигментов был в три раза выше. Можно предположить, что ингибирование биосинтеза зеленых пигментов СМ не затрагивает процесс перехода протохлорофиллида в хлорофилл и синтезированные в этиолированных проростках предшественники хлорофилла на свету переходят в хлорофилл даже в присутствии СМ; новообразование предшественников хлоро60

филла, вероятно, ингибируется антибиотиком, что и ведет к меньшему накоплению зеленых пигментов в варианте с СМ. Вырезки из альбиносных частей листьев ячменя, выращенных на свету (в таблице - световые альбиносы) и в темноте (темновые альбиносы), или не имели зеленых пигментов, или содержали их в небольшом количестве, которое убиралось дальнейшим освещением в присутствии СМ. Таким образом, используя обработку семян СМ, удалось получить растительный материал, практически лишенный зеленых пигментов и содержащий незначительное количество каротиноидов. Распределение АК, ДАК и ДКГК по зонам в зеленых и мутантных листьях демонстрирует рис. 12, из которого видно, что по содержанию восстановленной формы АК опытные и контрольные зеленые растения отличались незначительно, в то время как окисленная форма АК и ДКГК преобладали в верхней зеленой и нижней альбиносной части мутантных растений.

- листья с альбиносным основанием - зеленые листья Рис. 12. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней части (1) и основаниях (2) зеленых и частично альбиносных листьев ячменя 61

В дальнейшем исследовалась способность альбиносных листьев синтезировать АК, ДАК и ДКГК. Поскольку используемый материал не содержал зеленых пигментов и фотосинтез в нем был блокирован, субстрат для биосинтеза АК вводился экзогенно: вырезки из листьев помещались на 1%-ный раствор глюкозы. В связи с этим была проверена способность синтезировать хлорофилл А, В и каротиноиды вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы (табл. 15). Ингибирующий эффект СМ сохранялся и в этих условиях, а вырезки из листьев темновых и световых альбиносов содержали следовые количества зеленых пигментов и через 24 часа освещения, если они находились на растворе глюкозы с СМ. Таблица 15 Биосинтез пигментов (мкг/г) вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта Исходное содержание На глюкозе На глюкозе + СМ Исходное содержание На глюкозе На глюкозе + СМ Исходное содержание На глюкозе На глюкозе + СМ Исходное содержание На глюкозе На глюкозе + СМ

Хлорофилл А

Хлорофилл В

Зеленые листья 429,1 ± 7,6 336,1 ± 24,1 496,0 ± 20,0 364,0 ± 9,5 432,7 ± 10,8 356,5 ± 4,5 Этиолированные 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,1 135,7 ± 13,0 141,6 ± 3,0 25,6 ± 3,6 12,7 ± 2,3 Световые альбиносы 0 0 1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,02 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,01 Темновые альбиносы 2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 3,4 ± 0,2 2,3 ± 0,4 2,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1

Каротиноиды 184,2 ± 17,3 211,7 ± 8,8 191,7 ± 6,1 1,5 ± 0,1 70,3 ± 3,0 24,7 ± 1,4 5,8 ± 0,2 6,2 ± 0,1 3,8 ± 0,5 4,5 ± 0,3 8,6 ± 1,0 5,6 ± 1,0

При исследовании зависимости биосинтеза антоцианов от зеленых пигментов Манцинелли, Янг и др. [320] использовали этиолированные проростки, обрабатывая их СМ. Как видно из представленных данных, такие проростки и в присутствии СМ продолжают синтезировать некоторое количество хлорофиллов, вырезки же из альбиносов в этом плане представляют собой лучший материал. Поэтому нами для исследования биосинтеза АК, ДАК и ДКГК в зависимости от содержания зеленых пигментов были взяты альбиносные участки первых листьев проростков ячменя, выращенных на свету, а в качестве контроля - соответствующие участки зеленых листьев. В вырезках из зеленых и альбиносных листьев ячменя было определено исходное содержание всех исследуемых кислот и, как видно из таблицы 16, альби62

носы по количественному содержанию в них АК, ДАК и ДКГК мало отличались от зеленых проростков. Таблица 16 Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1% растворе глюкозы в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)

Вариант опыта

АК

ДАК

ДКГК

Исходное содержание В темноте На свету

Зеленые участки 178,3 ± 10,6 57,3 ± 13,4 85,7 ± 13,1 40,8 ± 7,7 220,2 ± 15,3 22,7 ± 9,1

39,1 ± 10,9 21,0 ± 4,8 69,7 ± 15,8

Исходное содержание В темноте На свету

Альбиносные участки 166,4 ± 8,5 44,5 ± 2,2 91,4 ± 2,0 35,6 ± 7,8 217,5 ± 19,7 13,9 ± 3,3

37,2 ± 6,1 19,1 ± 5,5 71,1 ± 17,6

Выдерживание в темноте зеленых проростков в течение 24 часов привело к уменьшению содержания всех кислот: в большей степени АК и ДКГК, в меньшей - ДАК. 24-часовое освещение способствовало накоплению АК и особенно ДКГК, но в три раза уменьшило количество ДАК. Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК в зависимости от освещения у альбиносов имело такой же характер, как и у зеленых проростков, т.е. не зависело от наличия зеленых пигментов. Накопление АК и ДКГК в зеленых и альбиносных проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, наблюдалось только на свету. Необходимо отметить, что поступление в лист экзогенной глюкозы зависит от условий освещения: так, в опытах М.М.Окунцова, Р.А.Карначук, Н.М.Фроловой [106] на свету в листья овса входило почти в два раза больше 14С-глюкозы, чем в темноте. Следовательно, в нашем опыте проростки, находящиеся на свету, лучше снабжены субстратом, чем темновые, но это, вероятно, не является единственной причиной, обусловливающей световой биосинтез АК и ДКГК, так как если бы он был темновым, мы наблюдали бы накопление кислот и в темноте, но в меньших масштабах, чем на свету. На самом же деле в темноте количество указанных кислот резко снижается. По-видимому, помимо субстрата решающее значение в процессе накопления АК и ДКГК имеет свет. Исследована реакция на свет зеленых и альбиносных проростков, предварительно выдержанных в темноте в течение 45 часов (табл. 17). Такое длительное пребывание в темноте способствовало снижению в зеленых проростках содержания окисленной формы АК и в два раза уменьшило количество восстановленной АК и ДКГК. Последующее 20-минутное освещение почти полностью восстановило исходное содержание АК и ДКГК и резко снизило (в 2,5 раза) количество окисленной формы АК, тогда как в темноте за это время существенных изменений не произошло. 63

Таблица 17 Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ (экспозиция 20 мин; предварительное выдерживание проростков в темноте 45 ч; интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

Вариант опыта

АК

ДАК

ДКГК

Зеленые участки 299,6 ± 2,3 99,0 ± 5,3 95,2 ± 1,3 200,8 ± 9,1

57,8 ± 2,2 50,8 ± 2,8 47,5 ± 1,8 19,3 ± 1,2

86,5 ± 4,8 42,2 ± 4,3 40,5 ± 1,7 79,3 ± 5,7

Альбиносные участки Исходное содержание 177,2 ± 10,1 42,2 ± 2,7 45 ч темноты 87,6 ± 6,6 31,1 ± 2,5 45 ч темноты + 20 мин темноты 90,0 ± 13,8 31,7 ± 2,0 45 ч темноты + 20 мин света 169,7 ± 6,4 8,0 ± 0,0

67,9 ± 4,5 13,0 ± 0,1 12,8 ± 3,6 25,0 ± 1,0

Исходное содержание 45 ч темноты 45 ч темноты + 20 мин темноты 45 ч темноты + 20 мин света

45-часовое пребывание в темноте альбиносов особенно сильно сказалось на содержании ДКГК, количество которой уменьшилось с 67,9 до 13,0 мкг/г. Последующее 20-минутное освещение увеличило ее содержание почти в 2 раза, но оказалось недостаточным для восстановления исходного уровня. Характер изменений восстановленной и окисленной форм АК у альбиносов был таким же, как и у зеленых проростков. Таким образом, альбиносные участки листьев ячменя на свету при наличии экзогенного субстрата интенсивно синтезируют АК и ДКГК, следовательно, их образование не связано с наличием зеленых пигментов и представляет собой не зависимый от фотосинтеза светозависимый процесс. Следует отметить, что под действием СМ количество желтых пигментов в листьях ячменя уменьшается в десятки раз, но это тоже не оказывает существенного влияния на накопление АК и ДКГК, хотя нужно учитывать, что регуляторные функции пигменты могут выполнять и в небольших концентрациях, когда поглощенная ими световая энергия используется лишь для переключения метаболических путей [20, 64]. Механизм светоактивации образования АК и ДКГК пока неясен. Однако, учитывая то, что некоторые органические кислоты (щавелевая, янтарная, винная, α-кетоглутаровая) способствуют накоплению АК на свету [110], можно предположить, что зависящее от света накопление АК (возможно, и ДКГК) в зеленых, и особенно в альбиносных, проростках связано с функционированием цикла Кребса, деятельность которого, как теперь известно, продолжается и на свету [12, 16, 97]. В связи с чем на свету усиливается поступление радиоактивного углерода из 1,6-14С-глюкозы в ди- и трикарбоновые кислоты [97]. О возможности биосинтеза С4-кислот непигментированными клетками уже сообщалось [18].

64

Светозависимое накопление АК альбиносными проростками говорит об отсутствии прямой связи данного процесса с фотосинтезом. Реальнее выглядит зависимость биосинтеза АК от дыхательного процесса, для которого работами последних лет показана возможность функционирования на свету не только ЦТК, но и гликолиза, а также ОПФЦ [5, 13, 16, 80]; тем более, что на свету в анализируемых альбиносных проростках стимулируется дыхание в целом и отдельные его этапы: гликолиз, ОПФЦ, ЦТК [49]. Исследование действия света различного спектрального состава на биосинтез АК в альбиносных проростках ячменя показало (рис. 13), что наибольшую активность в этом процессе проявил зеленый свет (480-600 нм) и далее по мере уменьшения активности - синий (430-520 нм) и красный (620-740 нм).

Рис. 13. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных проростках ячменя на свету различного спектрального состава в % к количеству кислот в темновом варианте - 100% (интенсивность света - 2,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция - 1 ч)

Таким образом, и в опытах с альбиносными проростками ячменя подтвердился факт стимулирующего действия зеленого света на накопление АК. Зеленый свет длительное время рассматривался как малоактивный для растений, и его обычно использовали для выполнения препаративной работы перед световым экспериментом и во время фотоморфогенетических исследований. Работами, выполненными в 60-70-е годы, нам удалось показать, что на зеленом свету, а также на желто-зеленом активно синтезируется АК в этиолированных и зеленых проростках [98, 103, 104]. Далее было установлено, что зеленый свет оказывает влияние на ростовые процессы [53, 297, 302, 394], на фотосинтетический аппарат [24, 40, 55, 91, 314] и содержание органического углерода у растений [79]. 65

Активация некоторых реакций метаболизма зеленым светом рассматривается рядом авторов как опосредованная фитохромом, возбуждаемым зеленым светом [54, 120, 146]. Следовательно, зеленый свет нельзя рассматривать как физиологически инертный, а уточнение механизма его действия на растения - дело будущих исследований. 4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты и ее окисленных форм в связи с освещением Гистохимическое исследование распределения АК в листьях чистяка весеннего (Ficaria verna Huds.) показало, что она сосредоточена в хлоропластах, около ядер и во внешнем слое цитоплазмы. В стебле этого растения центральный цилиндр и кора богаты АК, которая содержится главным образом в хлоропластах [195]. Более 30 - 40% АК листьев шпината также находится в хлоропластах [243]. В клетках корня конских бобов (Vicia faba L.) и лука репчатого (Allium сера L.) повышенное содержание АК обнаружено в области, близкой к клеточной стенке, а в клетках меристемы она распределена по всей цитоплазме равномерно [289]. Много АК и в самой клеточной стенке [225]. В клетках корня хрена весь аскорбат сосредоточен в больших центральных вакуолях [262]. Субклеточная локализация АК в большой степени определяется физиологическим состоянием клетки и ее структур. В зависимости от функционального состояния хлоропластов содержание АК в протоплазме может быть выше, чем в хлоропластах [195]. Делящиеся клетки культивируемых верхушек корней кукурузы накапливали АК в цитоплазме, но картина распределения АК менялась после начала элонгации клеток. В полностью вытянувшихся клетках основная часть АК была связана с клеточной стенкой [236]. Имеющиеся в литературе фрагментарные данные не дают цельной картины количественной локализации АК в клетке. Исследование же этого вопроса, несомненно, имеет большое значение для всесторонней оценки физиологической роли АК в обмене веществ растений. Для клеточных структур свойственен постоянный обмен метаболитами, поэтому, решая вопрос о субклеточной локализации АК, мы провели одновременный анализ ее содержания в хлоропластах и митохондриях, клеточном соке и структурных элементах - фракции целых листьев, оставшейся после извлечения сока [177, 178]. При этом учитывались условия освещенности, которые оказывают существенное влияние на содержание АК [181, 275]. Наряду с анализом восстановленной АК исследовалась ее окисленная форма - дегидроаскорбиновая кислота и продукт необратимого окисления АК - дикетогулоновая кислота, практически не исследованная в растениях [172]. В опытах использовались 7-9дневные проростки ячменя сорта Надя. Источник света - люминесцентные лампы ЛДЦ-40 интенсивностью 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Хлоропласты выделяли по методике, описанной в работе Г.А. Могилевой и др. [87]. Супернатант, полученный при осаждении фракции хлоропластов, подвергали центрифугированию при 9 тыс. об/мин (ЦЛР-1) в течение 15 минут для отделения митохондрий. Целостность структур в выделенных фракциях контро66

лировали микроскопированием соответствующих образцов. Клеточный сок извлекали центрифугированием (1 мин при 2 тыс. об/мин, ЦЛС-3) обработанных хлороформом листьев в специальных стеклянных контейнерах [105]. Расчет количества исследуемых кислот проводился на сухой и сырой вес хлоропластов, митохондрий и целых листьев. Закономерности изменения содержания кислот в условиях опытов сохранялись при обеих формах расчета, поэтому приводим только данные, полученные при пересчете на сырое вещество с тем, чтобы была возможность сопоставить содержание кислот в структурах и клеточном соке. Одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в клеточном соке и структурных элементах листьев ячменя (рис. 14) показал, что все исследованные кислоты количественно преобладают в клеточном соке, превосходя содержание АК в структурных элементах почти в 4 раза, а ДАК - более чем в 2 раза. Длительное выдерживание проростков в темноте (40 ч) привело к выравниванию содержания кислот в анализируемых фракциях за счет повышения уровня АК в структурных элементах и одновременного снижения окисленной формы АК в обеих фракциях. Последующее 24-часовое освещение, снизив уровень АК в структурных элементах и повысив его в клеточном соке, вновь вернуло к исходному соотношение в них АК (1 : 4). Свет повысил содержание ДАК и ДКГК в структурных элементах и в клеточном соке, в последнем особенно резко. Таким образом, основным местом сосредоточения АК, ДАК и ДКГК в листьях ячменя является клеточный сок. Содержание АК и ДКГК в нем довольно стабильно, не меняется даже при длительном пребывании растений в темноте и увеличивается только при продолжительном освещении [180]. Наиболее существенные изменения содержания кислот в связи с освещением происходят во фракции "структурные элементы": в темноте резко возрастает количество АК, что сопровождается снижением ее окисленной формы - ДАК, на свету характер изменений становится противоположным. Вероятно, повышение содержания АК в структурных элементах в темноте является результатом неиспользования ее в процессе фотосинтеза, где она может идти на поддержание в восстановленном состоянии хлорофилла [63], пластоцианина [425], возможно, и других соединений электрон-транспортной цепи [301]. Длительное освещение изменило содержание АК в клеточном соке, увеличив его на 49% по сравнению с исходным содержанием. Это увеличение коррелировало с нарастанием продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Можно предположить, что в данных условиях увеличивается и светозависимое использование АК, идущее с накоплением ее окисленной формы и ДКГК, образующейся при разрыве лактонового кольца ДАК. Стимулируемое светом накопление АК в клеточном соке может идти или за счет ее новообразования, или за счет усиливающихся на свету притоков АК из клеточных структур. Скорее всего, решающим является второе событие, так как в обеих анализируемых фракциях на свету увеличивается содержание ДАК, которое, обладая повышенной по сравнению с АК способностью растворяться в

67

липидах, довольно легко может проходить через клеточные мембраны и выполнять роль транспортной формы АК [154].

- свет - темнота Рис. 14. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2) 68

и ДКГК (3) в клеточном соке (а) и структурных элементах (б) листьев ячменя

- АК

- ДАК

- ДКГК

Рис. 15. Содержание АК, ДАК и ДКГК в целых листьях ячменя (1), хлоропластах (2) и митохондриях (3) после 40 часов пребывания в темноте (а) и последующего 69

24-часового освещения (б) (интенсивность света - 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)

В следующей серии опытов проводился одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в целых листьях, хлоропластах и митохондриях, выделенных из растений, находящихся в различных условиях освещения (рис. 15), с тем, чтобы исследовать способность к биосинтезу АК данных клеточных структур, входящих в состав анализируемой нами фракции "структурные элементы". Из представленных данных видно, что в одном грамме хлоропластов, выделенных из листьев проростков ячменя, находящихся 40 часов в темноте, содержится больше восстановленной АК, чем в грамме целых листьев, а в митохондриях - меньше. Последующее освещение растений, длительное время находившихся в темноте, увеличило содержание аскорбата в целых листьях и существенным образом повлияло на распределение АК в структурах: в хлоропластах уровень кислоты понизился, а в митохондриях увеличился в 3 раза. Таким образом, показано светозависимое накопление АК в беспигментных структурах - митохондриях. Что касается окисленной формы АК, то в структурах, выделенных из темновых листьев, она практически отсутствовала; ДКГК, напротив, накапливалась в больших количествах. Эти данные дают возможность представить направленность обмена исследуемых кислот: в темноте в хлоропластах и митохондриях идет необратимое окисление ДАК до ДКГК. При освещении в хлоропластах появляется ДАК, а в митохондриях ее количество увеличивается с 5,3 мкг/г до 33,3 мкг/г. Следовательно, на свету начинается использование АК с образованием окисленной формы. Последняя в митохондриях в больших размерах необратимо окисляется до ДКГК, а в хлоропластах этот процесс идет не так активно, вероятно, за счет того, что часть ДАК подвергается фотовосстановлению до АК [286]. Способность хлоропластов синтезировать АК в зависимости от освещения исследовалась и в опытах с изолированными хлоропластами. Последние выделялись из листьев 7-9-дневного ячменя, находившегося 40 часов без освещения. В хлоропластах определялся уровень АК, ДАК и ДКГК, затем часть их освещалась 2 часа в склянках Тищенко при постоянном продувании через среду выделения (0,4 М сахароза, 1/15 М фосфатный буфер, 0,01 N NaCl) воздуха со скоростью 1 л/мин; другая часть находилась в аналогичных условиях в темноте (табл. 18). За два часа освещения в изолированных хлоропластах уровень АК увеличился в 4 раза, и только в этом варианте была обнаружена ДАК. Количество ДКГК, напротив, в освещенных хлоропластах было ниже, чем у неосвещенных. Из анализируемых кислот в среде выделения накапливалась только ДКГК, причем в значительном количестве, не уступающем ее содержанию в изолированных хлоропластах и хлоропластах целого листа. По всей видимости, при инкубации изолированных хлоропластов АК, активно синтезируемая в них, выделяется в среду. В темноте она разрушается до

70

ДКГК, на свету этот процесс тормозится, поэтому в среде выделения обнаруживается ДАК - промежуточный продукт окисления АК до ДКГК. Таблица 18 Влияние света на накопление АК, ДАК и ДКГК изолированными хлоропластами листьев ячменя (интенсивность света 15,7 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 2 ч)

Вариант опыта

АК мкг/г

Хлоропласты листьев ячменя, находящегося 40 часов в темноте - (а) + 2 часа темноты: изолированные хлоропласты (б) среда выделения (в) + 2 часа света: изолированные хлоропласты (г) среда выделения (д)

t

210,2 278,2 0 840,4 0

ДАК мкг/г 0

a = 1,61 б

a = 19,2 г б = 10,3 г

ДКГК мкг/г t 233,9

0 0

266,9 225,4

55,6 0

228,7 221,4

a = 0,82 б a = 104 , в a = 0,11 г б = 3,04 г a = 0,78 д

n =8, tтабл. = 2,37 для Р ≤ 0,05

Таким образом, субклеточная локализация АК, ДАК и ДКГК в листьях ячменя в значительной степени определяется условиями освещения. Светозависимое накопление АК при длительной экспозиции связано с увеличением ее содержания в клеточном соке и митохондриях. В хлоропластах на свету также идет новообразование АК за счет или фотовосстановления предшественника [344], или фотовосстановления окисленной формы [286], однако наряду с этим имеет место активное использование восстановленной формы АК в светозависимых процессах, масштаб которого превышает биосинтез. Поэтому при длительном освещении растений содержание АК в хлоропластах начинает снижаться. Можно допустить и другое: синтезированная на свету в хлоропластах АК быстро поступает в клеточный сок, тем самым определяя высокое содержание в нем аскорбата. Обмен восстановителем может идти не только с клеточным соком, но и с митохондриями, и такая возможность уже обсуждается [56]. Представляется интересным подробнее обсудить возможный механизм выявленного нами стимулируемого светом накопления АК в митохондриях. В литературе известны факты светозависимых изменений некоторых процессов в альбиносных растениях [456], в беспигментных структурах: в клеточных ядрах [71], в митохондриях, где при включении света резко возрастает НАД ⋅ Н2 [267]. Что касается биосинтеза АК, то известно, что ферменты, ответственные за превращение l-галактоно-γ-лактона в АК, содержатся в митохондриях [282]. Можно предположить, что эта заключительная реакция в биосинтезе АК является светозависимой. Возможными акцепторами света в митохондриях могут быть цито71

хромы, в частности, цитохром С, для которого показано небольшое ускорение окислительно-восстановительных превращений при действии “белого” света [63, 65]. К тому же цитохромы имеют поглощение в зеленой области спектра - довольно активной в биосинтезе АК [104]. Последняя ступень биосинтеза АК у эвглены катализируется l-гулоно-лактон дегидрогеназой, сосредоточенной преимущественно в цитозоле (86,7%); 11,6% ее находится в митохондриях [402]. На свету активность данного фермента увеличивается [404], что может обусловливать светозависимое накопление АК не только в цитозоле, но и в митохондриях. Если же стимуляция светом биосинтеза АК осуществляется на уровне образования предшественника, то этот процесс должен идти в цитоплазме, содержащей ферменты, ответственные за восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон [307, 327]. Следовательно, помимо субстрата лимитировать биосинтез АК может и восстановитель -НАДФН+Н+. Источником его в растениях являются фотосинтез и ОПФЦ, функционирующий в цитоплазме и в хлоропластах. Поскольку на свету в хлоропластах ОПФЦ полностью ингибирован, а в цитоплазме ограничен [80], то в светозависимом биосинтезе АК, скорее всего, используется восстановитель фотосинтетического происхождения. Тогда возникает вопрос: почему на свету в хлоропластах, где идет фотосинтез, дающий восстановитель, количество АК уменьшается, а в митохондриях - увеличивается? Этот факт можно объяснить лишь рассматривая масштаб использования АК в данных компартментах. В хлоропластах АК используется в фотосинтезе и в дыхании. На свету первый источник затрат резко возрастает, а использование в дыхании, наоборот, уменьшается, следствием чего является снижение общего уровня АК в хлоропластах и повышение в митохондриях. Кроме того, увеличение содержания АК в митохондриях может быть и результатом того, что здесь идет заключительный этап биосинтеза АК - превращение l-галактоно-γ-лактона в АК. Способность этиолированных и альбиносных проростков синтезировать АК говорит о возможном использовании в этом процессе и НАДФН+Н+ ОПФЦ. Наблюдаемая у них стимуляция биосинтеза АК светом также идет за счет использования восстановителя ОПФЦ, так как для альбиносов, например, показано, что на свету гликолиз и ОПФЦ не ингибируются, а напротив, отмечается стимуляция выделения 14СО2 из равномерно меченой глюкозы [80]. Таким образом, на примере альбиносов видно, что не только субстрат, необходимый для биосинтеза АК, но и восстановитель может лимитировать ее новообразование; так, у альбиносов при отсутствии фотосинтеза, дающего субстрат, биосинтез АК стимулируется светом. При исследовании участия АК в обмене веществ растений, как правило, анализируется система кислот АК↔ДАК. Однако присутствующее количество ДАК не всегда говорит о масштабе использования АК, так как уровень ДАК определяется и одновременно идущим процессом восстановления окисленной формы, и необратимым ее окислением до ДКГК. Поэтому привлечение в подобных исследованиях данных по содержанию ДКГК дает дополнительную инфор72

мацию к решению вопроса о направленности окислительно-восстановительных процессов в системе АК↔ДАК↔ДКГК. 4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты Вопрос об акцепторе света, регулирующего накопление АК, пока решается однозначно. Это может быть фитохром [219, 391, 392] или родственное соединение [329]. Фоторецепторную функцию он может выполнять в растениях с различной пигментацией. Так, фитохром обнаружен в проростках овса, биосинтез хлорофилла которых ингибировался гербицидом норфлуразоном, и уровень фитохрома в них мало отличался от такового этиолированных растений [285]. Г.Мор [89], относя увеличение скорости синтеза АК к фотореакциям проростков горчицы, также в качестве пигмента, поглощающего эффективный свет, рассматривает фитохром. По его данным, ФДК способен быстро индуцировать и терминальную оксидазу АК - аскорбатоксидазу. В проростках горчицы лаг-фаза изменения скорости накопления АК при включении дальнего красного света равняется 1,5 часа у 36-часовых проростков и 3 часам у 72-часовых [219]. В связи с этим повышение содержания АК на свету, по-видимому, нельзя объяснить только системой фитохрома, так как лаг-фаза вызванного фитохромом увеличения содержания АК составляет один час и более [219, 391], а в наших и других [404] опытах светозависимое образование АК отмечено и через более короткое время. Регуляторные возможности фитохрома, вероятно, не так безграничны, как сейчас принято считать. В частности, уже приводятся данные о том, что регуляторное действие фитохрома на биогенез хлоропластов в большей степени проявляется в этиолированных проростках и при их прозеленении до этапа образования мембран тилакоидов, а дальше фитохром уже не влияет на состав и функционирование тилакоидов [232]. В связи с этим, пытаясь объяснить механизм стимулирующего действия света на биосинтез АК, нам хотелось бы привлечь внимание исследователей и к другим фоторецепторам [370], в частности, поглощающим свет в зеленой области спектра. Даже в случае с фитохромом высказывается предположение, что зеленый свет фитохром поглощает не самостоятельно, а через посредство “зеленого фоторецептора”, который может взаимодействовать с фитохромом и регулировать его содержание в мембранах [441]. Зеленый свет могут поглощать цитохромы. Основным местом их локализации являются хлоропласты и митохондрии. Каждый цитохром имеет три полосы поглощения α, β и γ [73] (см. табл. 19). Следовательно, и полосы поглощения цитохромов ЭТЦ фотосинтеза приходятся на зеленую область спектра (490 - 570 нм) [50, 131, 438]. Проявивший большую активность в биосинтезе АК зеленый свет с длиной волны 553 нм (табл. 12) как раз соответствует поглощению восстановленного цитохрома f [447]. Митохондриальные цитохромы b и с также имеют поглощение в зеленой области спектра. Оно может несколько отличаться от вышеприведенного. Так, в листьях шпината α-пик цитохрома с обнаружен при 552 нм, b цитохромов - при 560 нм, а цитохромов - при 604 нм. Несколько отличалось поглощение α-пика 73

цитохромов стеблей шпината: оно приходилось на 549 нм у цитохрома с, 599 нм у цитохрома а и 554, 557, 567 нм - у цитохромов b [251]. Таблица 19 Поглощение света цитохромами (нм)

Цитохромы Митохондриальные

Хлоропластные

b с1 с f b6 b3

α 563 554 550 555 563 559

Полоса поглощения β 532 524 521 526 529

γ 429 418 412 422 422-425

B зеленой области спектра поглощают и микросомальные цитохромы в проростках маша: 559, 560,5, 562,5 нм [277]. Цитохромы обнаружены в нефотосинтезирующих клетках [259, 331], поэтому они могут выступать в качестве акцепторов зеленого света и в этиолированных проростках ячменя, пластиды которых содержат цитохромы f, b (низко потенциальный), цитохром b - 563 нм [349]. Помимо цитохромов в зеленой области спектра поглощают беталаиновые пигменты [149], пластоцианин хлоропластов [416] и этиохлоропластов [130], антоцианы и незаряженные флавиновые радикалы (максимум поглощения 580 нм) [85], возможно, и другие соединения [294]. При исследовании спектра действия фотоэлектрической реакции фасоли было показано, что он сходен с таковым фотосинтеза, но имеет еще дополнительный максимум в зеленой области спектра, наличие которого авторы связывают с фикобилиновыми пигментами [358]. Каким образом энергия зеленого света, поглощенного данными соединениями, может стимулировать биосинтез АК, пока не ясно. Заманчиво предположить, что энергия света, поглощаемого, например, цитохромом в-559, функция которого не ясна [234], непосредственно используется в фотовосстановлении ДАК до АК. Система ДАК/АК имеет более высокий отрицательный окислительновосстановительный потенциал (0,08 В, рН 7,0), чем цитохромы (0,12 - 0,29 В) [133], и энергия зеленого света может быть использована для осуществления переноса электрона от цитохромов в сторону компонентов с более высоким отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом: ДАК/АК. Механизм участия зеленого света в биосинтезе АК может быть связан и с активацией ЭТЦ дыхания или фотосинтеза, так как некоторые из указанных фоторецепторов являются их компонентами. Возможно и другое - при облучении зеленым светом, когда меняется скорость ростовых [53, 302, 394, 297] и ряда обменных процессов [24, 40, 55, 91, 314], уменьшается использование АК, например, на фотовосстановление пигментов [378] или других соединений, что также будет способствовать накоплению аскорбата. 74

Такая возможность проверялась в опытах с альбиносными проростками ячменя, в которых с помощью салицилальдоксима ингибировалась активность пластоцианина [175]. Медьсодержащий белок пластоцианин присутствует в тилакоидных мембранах хлоропластов [216, 132] и функционирует в качестве переносчика электронов от цитохрома f на Р700 в ЭТЦ между фотосистемой II и I [265, 354, 355]. Образование пластоцианина зависит от интенсивности действующего света, и скорость его биосинтеза в темноте составляла лишь 1/10 от светового варианта [386]. В спектре поглощения окисленного пластоцианина имеется три максимума - 460, 597 и 775 нм, то есть один из них приходится на зеленую область спектра (рис. 16). Голубая окраска пластоцианина полностью исчезает при его восстановлении АК [416]. АК используется в процессе восстановления пластоцианина, хотя эта реакция может играть лишь второстепенную роль, так как в хлоропластах пластоцианин в основном восстанавливается цитохромом f [422]. Р700 также восстанавливается АК [41, 263], и этот процесс усиливается в 20-25 раз при добавлении 2,6 моля пластоцианина на моль Р700 [301].

Рис. 16. Спектры поглощения цитохрома с в окисленной (1) и восстановленной (2) формах. Указаны характерные полосы поглощения восстановленной формы - α, β и γ (по А.Ленинджеру, 1985)

Пластоцианин присутствует в пигментированных тканях. Наличие его у альбиносов было показано нами с использованием метода афинной хроматографии [182]. Для ингибирования пластоцианина использовались различные концентрации салицилальдоксима (5⋅10-4 - 5⋅10-9 М), добавленные к 1%-ной глюкозе, и в их присутствии исследовалось светозависимое накопление АК альбиносными проростками ячменя (рис. 17). Характер действия салицилальдоксима зависел от его концентрации: при 5⋅10-4 - 5⋅10-5 М отмечено увеличение содержания АК при 75

снижении ДАК; в присутствии меньших концентраций (5⋅10-6 - 5⋅10-7 М) уровень АК и ДКГК снижался, что сопровождалось накоплением ДАК.

Рис. 17. Изменение содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных листьях ячменя, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету (1 час, 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) в присутствии различных концентраций салицилальдоксима (СА) в % к контролю (100%)

Стимулирующее действие салицилальдоксима на накопление АК можно объяснить тем, что ингибирование пластоцианина влечет за собой уменьшение использования АК на его восстановление и восстановление Р700. Салицилальдоксим в концентрации 5⋅10-6 - 5⋅10-7 М, вероятно, уже не оказывает активного ингибирующего действия на пластоцианин, и уменьшение накопления АК на свету в этом случае может определяться использованием ее на восстановление пластоцианина, и как результат использования восстановленной формы АК возрастает ДАК. Обнаруженный нами эффект стимуляции накопления АК салицилальдоксимом в альбиносных проростках ячменя на свету проявлялся, хотя и в меньшей степени, и в этиолированных проростках. Вероятно, прозеленение этиолянтов отвлекает часть восстановленной АК, что подтверждалось данными опытов с более длительной, двухчасовой экспозицией: процесс прозеленения проростков нарастал, и стимуляция накопления АК салицилальдоксимом уже отсутствовала. Следовательно, пул АК в проростках ячменя на свету может зависеть от функ76

ционального состояния пластоцианина, способного самовосстанавливаться и восстанавливаться АК. Обсуждая приведенный материал по исследованию накопления АК в проростках ячменя в присутствии салицилальдоксима, вероятно, нужно иметь в виду и нижеследующее соображение. Механизм ингибирующего действия салицилальдоксима основан на его влиянии на ионы меди. Если это не специфическая реакция, то салицилальдоксим может ингибировать не только медьсодержащий белок - пластоцианин, но и медьсодержащие ферменты, окисляющие АК, и тогда наблюдаемое увеличение уровня АК в присутствии салицилальдоксима будет опосредовано не функциональным состоянием пластоцианина, а оксидазами АК. Возможность влияния экзогенного цитохрома с (поглощение при 550 и 521 нм) на светозависимое накопление АК проверялось нами в опытах с 11дневными альбиносными проростками ячменя, которые предварительно выдерживались 40 часов в темноте (табл. 20). Освещение (интенсивность света 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) листьев на растворе цитохрома с (0,403 мг/мл) стимулировало накопление восстановленной формы АК и снижало ее дериваты - ДАК и ДКГК. Можно предположить, что энергия зеленого света, поглощенного цитохромом с, идет на восстановление ДАК в АК. Таблица 20 Действие экзогенного цитохрома с на содержание АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) в 11-дневных альбиносных проростках ячменя на свету (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) (экспозиция 24 ч; предварительное выдерживание растений в темноте 40 ч)

Вариант опыта На воде

АК 134,4 ± 5,4

ДАК 92,3 ± 4,7

ДКГК 104,4 ± 7,4

На растворе цитохрома с (0,403 мг/мл)

268,6 ± 12,9

66,8 ± 2,1

86,8 ± 11,0

Таким образом, физиологическая активность зеленого света, в частности, в отношении светозависимого накопления АК, может быть связана не только с функционированием фитохрома, но и с другими фоторецепторами, поглощающими свет в зеленой области спектра.

Глава 5. АЛЬБИНОСНЫЕ ПРОРОСТКИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОЗАВИСИМЫХ ПРОЦЕССОВ, НЕ СВЯЗАННЫХ С ФОТОСИНТЕЗОМ Разработанный нами метод получения альбиносных проростков ячменя из обработанных СМ семян (глава 4.3) позволяет получать неограниченное количество материала, который можно использовать для исследования светозависимых 77

процессов, не связанных с фотосинтезом, а также для изучения биогенеза хлоропласта, его функциональной активности. В настоящее время имеется целый ряд примеров успешного использования подобных объектов для исследования некоторых физиологических проблем, и в частности для выяснения механизмов фотосинтеза, его структурной и функциональной организации [411]. Под действием СМ ингибируется синтез хлорофилла, развитие структуры хлоропластов [222, 228]. Детального исследования влияния СМ на биосинтез белков хлоропласта не проводилось. В связи с этим нами выполнена работа по изучению действия СМ на состав и активность некоторых белков электронтранспортной цепи, ферментов цикла Кальвина, ассимиляцию СО2 и продукты пятиминутного фотосинтеза [182]. В опытах использовались вырезки из зеленых и альбиносных участков мутантных листьев ячменя. Контролем служили зеленые проростки. Наличие или отсутствие белков электрон-транспортной цепи контролировали электрофорезом в ПААГ. Для выделения фракции белков навеску листьев 1,5 г измельчали в жидком азоте, затем экстрагировали 0,05 М трис-НСl+ 0,1% тритон Х-100. Белки осаждали холодным ацетоном (1:1 объем/объем), осадок экстрагировали вышеуказанным буфером. Нерастворимые белки отделяли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 15 минут. Супернатант хроматографировали на сефадексе Г25, белковую фракцию, выходящую из колонки первой, использовали для электрофореза. Изоферменты пероксидазы в ПААГ выявляли по Орнстейну [356], ферредоксин-НАДФ-редуктазу, ферредоксин и пластоцианин по Христину и др. [164, 165]. Перед электрофорезом белковые метчики и экстракты листьев инкубировали 40 минут при 90° С в присутствии додецилсульфата натрия (2%) и дитиотреитола (0,01%). Для получения фракции водорастворимых белков листья растирали в трисНСl буфере 0,05 М, рН 7,8, содержащим дитиотреитол 0,001 М, MgCl2 0,01 М, ЭДТА 0,0005 M. После разрушения гомогенат центрифугировали (20 тыс. об/мин) при 0° С в течение 30 минут. Скорость ферментативной реакции измеряли в свежеприготовленных экстрактах. Активность РДФ-карбоксилазы определяли радиометрическим методом, рибозо-5-фосфатизомеразы и фосфорибулокиназы - колориметрическим [129]. Продукты пятиминутного фотосинтеза выявляли в листьях, предварительно экспонированных в газовой камере с 14СO2 (конц. 0,033%), фиксацию проводили кипящим 96%-ным этанолом. Далее листья растирали и экстрагировали нисходящими концентрациями этанола, сумму спиртоводорастворимых соединений лиофильно высушивали, растворяли в 1 мл дистиллята, определенную аликвоту наносили на бумажную хроматограмму. Для разделения соединений применяли систему растворителей: 1 направление - этанол, насыщенный аммиаком, 2 направление - бутанол - метанол - этанол - муравьинная кислота - вода (30:30:36:5:4 соответственно). Хроматограммы совмещали с рентгеновской 78

пленкой РТ-1, 14С-соединения идентифицировали по метчикам, радиоактивные соединения просчитывали в сцинтилляционном счетчике. Расчет радиоактивных соединений вели на радиоактивность всей водорастворимой фракции. Спектр поглощения ацетонового экстракта из альбиносных участков 11дневных листьев ячменя показал отсутствие в объекте хлорофилла и каротиноидов (рис. 18). На этом же рисунке представлены спектры поглощения белков, полученных из ацетоновых экстрактов альбиносных и зеленых листьев. Видно, что белки альбиносных и контрольных растений поглощают в одной области, однако следует отметить большее поглощение первых в области полосы Соре (от 350 до 425 нм).

Рис. 18. Спектры поглощения: А - ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя; Б - белков ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя; В - белков ацетонового экстракта зеленых листьев ячменя

79

Более подробный анализ белков ацетоновых экстрактов показал, что электрофореграммы, окрашенные красителем, а также зимограммы пероксидаз и диафораз существенно не отличаются у зеленых и альбиносных листьев. Обнаружена лишь незначительная разница в интенсивности окрашивания одной изоформы пероксидаз, ферментативная активность которой оказалась выше у альбиносных листьев (рис. 19).

Рис. 19. Электрофореграммы изоферментов пероксидазы (А) и диафоразы (Б) зеленых (1) и альбиносных (2) листьев ячменя

В обоих вариантах опыта обнаружены ферредоксин, содержащий негеминовое железо, и пластоцианин, содержащий ионы меди, что свидетельствует о биосинтезе в альбиносных листьях функционально активного ферредоксина и пластоцианина. Приведенные данные указывают на то, что биосинтез белков ЭТЦ не ингибируется теми концентрациями СМ, которые использованы в опыте. В гомогенатах, полученных из альбиносных и зеленых участков листьев опытных растений, определены РДФ-карбоксилаза, фосфорибулокиназа и рибозо-5-фосфатизомераза (табл. 21). Из представленных данных видно, что ассимиляция СО2 альбиносными тканями очень низкая, что коррелирует с низким уровнем активности РДФ-карбоксилазы. Активность двух других ферментов фосфорибулокиназы и рибозо-5фосфатизомеразы - у альбиносов также снижена, но остается на достаточно высоком уровне. Таблица 21 Ассимиляция СО2 и активность ферментов цикла Кальвина в зеленых и альбиносных участках листьев ячменя, полученных из обработанных СМ семян

Участки листьев

Процент ингибирования от контроля (зеленые листья - 100%) Скорость ас- Количество Активность водораствоРДФ-карфосфори- рибозо-5-фоссимиляции римого белка боксилазы булокиназы фатизомеразы СО2

Зеленые

49,1 ± 1,3

37,3 ± 2,7

41,7 ± 2,2

17,7 ± 2,1

35,5 ± 5,2

Альбиносные

99,6 ± 0,3

- 41,8 ± 2,8*

89,4 ± 5,2

26,5 ± 0,3

44,5 ± 6,6

80

* В данном варианте ингибирование отсутствовало. Количество водорастворимого белка увеличилось на 41,8% по сравнению с контролем.

Таким образом, в листьях ячменя под действием СМ происходит уменьшение активности ферментов цикла Кальвина, и в основном это относится к РДФкарбоксилазе, большая субъединица которой кодируется ДНК хлоропласта и там же синтезируется, что и объясняет ингибирующее действие СМ, связывающегося с 70S рибосомами, на активность РДФ-карбоксилазы [367]. Данные по распределению 14С в продуктах пятиминутного фотосинтеза показывают, что по основным продуктам контроль и зелёная часть опытных листьев не отличаются (табл. 22). Более 80% радиоактивного углерода в них включается в сахара и фосфорные эфиры сахаров. При хроматографировании экстракта из альбиносной ткани почти вся радиоактивность (93%) была обнаружена в зоне стартового пятна. Можно предположить, что у альбиносов в отсутствии фотосинтеза идет ассимиляция CO2 по типу гетеротрофной фиксации высокомолекулярными соединениями, которые при хроматографировании не отрываются от старта использованными системами растворителей. Возможность ассимиляции СO2 белыми листьями подтверждается и другими исследователями [387]. На основании приведенных данных можно заключить, что СМ избирательно ингибирует биосинтез белков в хлоропласте: мало влияя на образование исследованных белков ЭТЦ, он нарушает биосинтез хлорофилла, каротиноидов, ассимиляцию CО2 и активность РДФ-карбоксилазы. Предлагается использовать экспериментально полученные альбиносные проростки как модель для изучения биогенеза хлоропласта, его функциональной активности и регуляции метаболизма.

Глава 6. ОБРАЗОВАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ, ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ И ДИКЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ ДЫХАНИЯ И ОТДЕЛЬНЫХ ЕГО ЭТАПОВ Биосинтез аскорбиновой кислоты связан с окислительным превращением гексоз [306], в зеленых растениях она накапливается преимущественно на свету [110]. Этот процесс идет независимо от фотосинтеза, так как увеличение содержания аскорбата отмечено и у альбиносных проростков при наличии экзогенного субстрата [246, 181]. Пул АК у освещенных растений определяется скоростью ее новообразования и использования, например, в качестве восстановителя в реакциях, связанных с функционированием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и дыхания, и кроме того, скоростью фотовосстановления образующейся в данных процессах окисленной формы аскорбиновой кислоты - ДАК [286]. При разрыве лактонового кольца дегидроформы образуется ДКГК, накопление которой может служить показателем направленности процессов в системе АК↔ДАК. В связи с этим нами одновременно определялось содержание АК, 81

ДАК и ДКГК в зависимости от процесса дыхания в целом и от отдельных его этапов - гликолиза и цикла трикарбоновых кислот с тем, чтобы оценить вклад указанных процессов в формирование пула АК на свету [174].

82

83

Объектом исследования служили зеленые и этиолированные 6-7-дневные проростки ярового ячменя сорта Майя. Перед опытами в зеленых проростках уровень аскорбиновой кислоты снижали сорокачасовым выдерживанием их в темноте. В работе использовали следующие ингибиторы: 2,4-динитрофенол (2,4ДНФ) в концентрации 1 ⋅ 10-3 М, ингибитор гликолиза - фторид натрия (1,5 ⋅ 10-2 М), ингибитор цикла Кребса - малоновая кислота (5 ⋅ 10-2 М). Навески листьев, помещенные на растворы ингибиторов, освещались в течение 1 часа светом люминесцентных ламп дневного света интенсивностью 15 тыс. эрг.⋅см-2⋅с-1. Контрольные растения освещались на воде. 2,4-ДНФ в концентрации 1 ⋅ 10-3 М ингибировал накопление АК и ДКГК в зеленых и этиолированных проростках ячменя на свету (табл. 23). Содержание ДАК при этом в этиолянтах увеличилось более чем в три раза, тогда как в зеленых проростках данный процесс был выражен слабее. Таблица 23 Влияние 2,4-динитрофенола на накопление АК, ДАК и ДКГК в проростках ячменя на свету

Соединение

АК ДАК ДКГК АК ДАК ДКГК

Содержание кислот, мкг/г исходное на воде на 1 ⋅ 10-3 М (а) (б) 2,4-ДНФ (в) 356 67 88 370 50 52

a б

t б в

a в

6,34 6,07 5,69

4,04 2,73 6,34

1,68 4,92 0,60

Этиолированные проростки** 439 348 5,51 21 74 7,06 91 47 8,48

7,23 16,88 11,56

1,74 9,44 1,54

Зеленые проростки* 403 368 30 44 117 85

* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57.

Используемая в опытах концентрация 2,4-ДНФ на 52% подавляла дыхание (рис. 20). Таким образом, ингибирование дыхания оказывает существенное влияние на содержание исследуемых кислот. Выявлена различная способность накапливать ДАК в присутствии 2,4-ДНФ у зеленых и этиолированных проростков, что связано с особенностями фотовосстановления ДАК [286] или необратимого окислительного превращения AK [272] у этих растений. В следующей серии опытов мы исследовали биосинтез АК, ДАК и ДКГК при ингибировании гликолиза (табл. 24). В присутствии фторида натрия содержание восстановленной формы АК и ДКГК возрастало, что сопровождалось уменьшением количества дегидроформы. 84

Рис. 20. Влияние ингибиторов на дыхание листьев ячменя: 1 - контроль (на воде), 2 - в присутствии 2,4-ДНФ (1 × 10-3 М), 3 - в присутствии малоната (5 × 10-2 М), 4 - в присутствии фторида натрия (1,5 × 10-2 М) (экспозиция 1 ч) Таблица 24 Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК в проростках ячменя на свету

Соединение

АК ДАК ДКГК АК ДАК ДКГК

Содержание кислот, мкг/г исходное на воде на 1,5 ⋅ 10-2 М (а) (б) фториде натрия (в)

a б

t б в

434 68 90

Зеленые проростки* 510 530 35 28 117 226

15,5 3,9 5,8

2,1 2,2 22,9

11,5 5,9 27,9

374 38 61

Этиолированные проростки** 437 575 24 0 89 210

15,0 12,8 13,8

23,1 13,4 31,8

19,3 8,1 4,9

a в

* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57.

АК в составе окислительно-восстановительной системы глутатион-аскорбат участвует в превращении дыхательного субстрата [315]. Аллен, Холл [199], Мазурова [78] отмечали стимуляцию дыхания под действием АК, а величины ингибирования дыхания и синтеза АК под действием ликорина - специфического ин85

гибитора биосинтеза АК - коррелировали между собой [206]. В связи с этим можно предположить, что факт стимуляции накопления АК фторидом натрия является результатом снижения использования ее в дыхательном процессе в присутствии данного ингибитора. Но, принимая во внимание то, что фторид натрия лишь на 11% ингибировал дыхание (рис. 20), можно заключить, что высказанное предположение лишь частично объясняет наблюдаемые изменения в содержании АК под действием ингибитора гликолиза. Процесс биосинтеза АК и ДКГК не связан с гликолизом как с энергетическим процессом, так как с энергетической точки зрения гликолиз малоэффективен [134]. Скорее всего, биосинтез АК и ДКГК идет из гексоз без окончательного расщепления их в процессе гликолиза. Это хорошо подтверждается данными опыта, представленными в табл. 25, из которых видно, что дополнительное снабжение листьев ячменя экзогенной глюкозой - одним из основных субстратов в биосинтезе AK [402] - снимает эффект накопления АК и уменьшает накопление ДКГК под действием фторида натрия. Следовательно, биосинтез АК, ДКГК и гликолиз конкурируют за один и тот же субстрат и ингибирование гликолиза, отвлекающего часть имеющихся углеводов, может способствовать накоплению АК и ДКГК. Таблица 25 Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК в этиолированных проростках ячменя, плавающих на растворе глюкозы на свету

Соединение исходное АК ДАК ДКГК

420 ± 20 32 ± 6 72 ± 2

Содержание кислот, мкг/г на 1%-ном растворе глюкозы без фторида натрия с 1,5 ⋅ 10-2 М фторида натрия 512 ± 3 521 ± 14 0 14 ± 3 106 ± 1 123 ± 6

Данные этих опытов не отрицают наличия субстратной связи между биосинтезом АК, ДКГК и гликолизом, так как фторид натрия ингибирует дыхание на стадии превращения 2-фосфоглицериновой кислоты в фосфоенолпируват и не исключено, что в биосинтезе АК и ДКГК используется не целая молекула глюкозы, а метаболизированная в реакциях гликолиза, не ингибируемых фторидом натрия. Кроме этого гликолиз имеет альтернативу - гексозомонофосфатный шунт, который не блокируется данным ингибитором [163]. Эффект стимулирования биосинтеза АК фторидом натрия в этиолированных проростках выше, чем в зеленых, что можно объяснить тем, что часть вновь синтезированной АК в зеленых растениях отвлекается на процессы фотосинтеза и дыхания хлоропластов [206]. Таким образом, указанный эффект в конечном итоге определяется уменьшением использования АК в процессе дыхания в присутствии фторида натрия и увеличением количества субстрата, необходимого для образования АК и ДКГК. Субстратом может быть целая молекула глюкозы или глюкоза, преобразованная в гексозомонофосфатном цикле или начальных реакциях гликолиза. 86

При ингибировании ЦТК малонатом (дыхание снизилось на 31%) содержание всех исследуемых кислот в зеленых и этиолированных проростках на свету уменьшилось по сравнению с контролем (табл. 26). Следовательно, биосинтез АК и ее производных зависит от функционирования ЦТК. Эта зависимость может быть энергетической, поскольку для образований АК необходимо фосфорилирование ее предшественников, если признать схему биосинтеза аскорбата, предложенную Левусом [304]. С другой стороны, ЦТК может быть донором предшественников, необходимых для образования АК. Известно, что некоторые органические кислоты способны отвлекаться из цикла. Среди них α-кетоглутаровая, янтарная, щавелевая - кислоты, стимулирующие биосинтез АК в проростках ячменя [110]. Таблица 26 Влияние малоната на накопление АК, ДАК и ДКГК в проростках ячменя на свету

Соединение

Содержание кислот, мкг/г Исходное На воде На 5 ⋅ 10-2 М рас(а) (б) твора малоната (в)

АК ДАК ДКГК

399 58 86

АК ДАК ДКГК

432 35 64

Зеленые проростки* 512 303 38 15 110 96 Этиолированные проростки** 444 371 24 15 92 83

a б

t б в

6,5 4,0 34,9

19,5 5,4 5,7

12,4 11,8 3,8

2,2 6,9 14,0

9,2 3,7 20,9

4,1 3,9 12,1

a в

* n = 4, tтабл. = 3,18 для Р ≤ 0,05; ** n = 6, tтабл. = 2,57.

Учитывая полученные данные, можно заключить, что на свету в проростках ячменя функционирует система трех кислот - АК↔ДАК→ДКГК. При окислении ДКГК образуется винная кислота и C2-фрагмент, который может вовлекаться в обмен углеводов [306, 405]. Биосинтез двух кислот из этой системы - АК и ДКГК - носит светозависимый характер, тогда как ДАК на свету уменьшается. Изменения в содержании АК, вызванные присутствием ингибиторов дыхания, всегда коррелировали с изменением уровня ДКГК. Это не относится к ДАК, которая является нестабильной и на свету быстро или фотовосстанавливается, или необратимо окисляется до ДКГК, что объясняет светозависимый характер накопления последней. Таким образом, биосинтез АК и ДКГК в зеленых и этиолированных проростках идет с использованием органических кислот или глюкозы - целой ее молекулы или метаболизованной в начальных реакциях гликолиза и гексозомоно87

фосфатного цикла. Светозависимое накопление АК и ДКГК связано с процессом дыхания, причем в большей степени с ЦТК, чем с гликолизом, которые вносят определенный вклад в формирование пула АК на свету.

Глава 7. ФОТОРЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ, ОКИСЛЯЮЩИХ АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ Регуляция обмена веществ растений идет на двух уровнях: на уровне синтеза ферментов и изменения их активности. Значительные колебания ферментативной активности происходят в ответ на такие факторы, как свет, темнота, субстраты, гормоны, оводненность тканей, аэрация и т.д. Механизм световой регуляции активности ферментов особенно важен для фототрофных организмов. Световая и темновая модуляции активности ферментов [201] регулируют обмен веществ у фотосинтезирующих организмов таким образом, что на свету идет синтез сахаров и запасных веществ, а в темноте их использование. Отсюда тот интерес, который проявляют исследователи к вопросу фоторегуляции ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла [21, 191]. На свету в хлоропластах быстро активизируются четыре фермента этого цикла: НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, седогептулозо-1,7-бисфосфатаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза и фосфорибулокиназа, а ферменты гликолитического пути - фосфофруктокиназа и НАДФ-зависимая глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа окислительного пентозофосфатного пути - на свету инактивируются [61]. Изменение активности ферментов на свету, предполагается [201], происходит за счет посттрансляционной модификации хлоропластных и цитоплазматических ферментов. Некоторые модификации, вероятно, включают восстановление дисульфидных связей. Активация светом ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла путем тиол-дисульфидного превращения происходит за счет перевода неактивных -S-S- форм ферментов в активные SH-формы. Это реализуется за счет того, что на свету осуществляется перенос электронов от хлорофилла на атом железа активного центра ферредоксина. Восстановленный белок ферредоксин, окисляясь, передает водород тиоредоксину при участии фермента ферредоксин-тиоредоксин-редуктазы. Тиоредоксин в восстановленной форме выступает как редуктаза дисульфидных групп белков, он функционирует как донор водорода для ряда ферментов. В темноте восстановленные на свету ферменты вновь окисляются, и этот процесс может катализировать окисленный глутатион, также содержащий дисульфидную группу. Механизм активации ферментов на свету путем тиол-дисульфидного обмена не является единственным. Активность ферментов в этих условиях может уси88

ливаться аллостерическими эффекторами: АТФ и NАДРН - для рибулозо-1, 5бисфосфат-карбоксилазы, ионами кальция - для NАД-киназы [61]. Свет может не только менять активность уже имеющихся ферментов, но и индуцировать их синтез, что показано для глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы [454] и фосфоенолпируват-карбоксилазы [189]. Действие света на ферменты катаболиза, и в частности ферменты гликолиза, пентозофосфатного окислительного пути превращения соединений углерода, ферменты ЦТК, исследовано в меньшей степени [189, 14, 17, 161]. Изменение ферментативной активности под действием света зависит от качества последнего. Кроме того, механизмы контролирования активности различных ферментов светом одной и той же длины волны могут быть различны. Так, синий свет способен оказывать прямое действие на активность фермента, за счет чего может повышаться активность гликолатоксидазы, глюкозооксидазы и др., или же изменять активность опосредованно, через изменение уровня субстратов или эффекторов [380]. Восстановленная форма аскорбиновой кислоты на свету увеличивается [103]. Объяснение этого факта предполагает анализ активности ферментов, ее окисляющих: специфической оксидазы АК - аскорбатоксидазы и ферментных систем, которые опосредованно переводят АК в дегидроформу - полифенолоксидазы, пероксидазы и цитохромоксидазы. Однако действие света на эти ферменты исследовано крайне слабо. Аскорбатоксидаза (КФ. 1.10.3.3) - глобулярный конъюгированный медьсодержащий белок. Медь в молекуле фермента находится в смешанном валентном состоянии: два атома - одновалентные, они не несут ферментативной функции; шесть - двухвалентные, ответственные за оксидазную активность и голубую окраску водного раствора очищенного фермента. В молекуле белка содержится 18 различных аминокислот и гексозамин. Апофермент содержит 10 сульфгидрильных групп. Предполагается, что каталитические функции осуществляются не только при обратимом изменении валентности меди, но и при обратимых структурных изменениях белковой части молекулы фермента. Аскорбатоксидаза катализирует реакцию окисления: C6H8O6 + 1/2 О2 → С6Н6О6 + Н2О. АК ДАК Методом ЭПР-спектрометрии было показано возникновение свободных радикалов АК в этой реакции [452]. Активность фермента угнетается цианидом и диэтилдитиокарбаматом натрия, который, активно захватывая ионы меди, образует прочный ферментингибиторный комплекс [134]. Аскорбатоксидаза обнаружена практически во всех хлорофиллоносных клетках. Она отсутствует в клубнях картофеля [326], в покоящихся семенах гороха, но при прорастании последних быстро появляется в осевой части побега и корня, где увеличивается и изоферментный состав оксидазы [418]. В гипокотиле маша активность аскорбатоксидазы снижается от апекса к нижним зонам [256]. 89

Несколько изоформ аскорбатоксидазы обнаружено в тыкве, однако в семядолях и гипокотиле горчицы, освещенной дальним красным светом и находящейся в темноте, присутствует лишь одна изоформа фермента [345]. На клеточном уровне аскорбатоксидаза ассоциирована с клеточной стенкой и цитоплазмой [229]. В процессе роста и старения растений аскорбатоксидазная активность меняется. При снижении интенсивности света за счет общей освещенности и удалении УФ-излучения в растениях ячменя и девясила корнеглавого в онтогенезе активность аскорбактоксидазы понижается [157], что происходит и при созревании ягод черной смородины [141]. Неодинакова аскорбатоксидазная активность и в течение года: в хвое сосны с максимального уровня в весенние месяцы - в марте-апреле - она снижается до минимума в октябре, повторяя ритмический характер накопления АК [240]. Аналогичная закономерность выявлена у деревьев, теряющих на зиму листья (конский каштан) или хвою (лиственница), и вечнозеленых (ель) [258]. Наличие прямой корреляции между содержанием АК и активностью аскорбатоксидазы показано и для хлопчатника [3]. В работе М.М.Окунцова и А.Н. Плотниковой отмечено, что активность АО в растениях фасоли хорошо коррелирует с суточными ритмическими движениями листьев. В дневные часы, когда листья подняты, фермент находится в активном состоянии; ночью, в темноте, в опущенных листьях окислительные ферменты переходят в неактивное состояние. Авторы полагают, что активность АО не зависит от непосредственного влияния света, а связана только с эндогенным суточным ритмом растения [99]. Как считает Н.Т.Бакарджиева [211], световой режим выращивания растений гороха незначительно влияет и на изоферментный состав АО, который в большей степени определяется наличием в средах выращивания определенного типа ионов. Так, показано, что ионы меди активировали синтез АО в темновых растениях. В литературе имеются данные, указывающие на индукцию светом активности АО [17]. Особое значение в фотоактивации АО придается дальнему красному свету, который значительно повышает активность фермента [364, 238, 196, 360]. Фитохром-зависимая репрессия и индукция ферментативного синтеза изучена на горчице [364, 210]. Фитохром ускорял синтез АО в семядолях и гипокотилях и не менял в корнях проростков. Причем активность АО, появившейся при фитохромной индукции, в гипокотиле была выше, чем в семядолях [26]. Фитохром, активируя скорость образования фермента, тем самым увеличивал суммарную активность АО [196]. В исследованиях по фитохромной регуляции синтеза АО показано, что у проростков горчицы определенное время активность фермента возрастает и в темноте, хотя в меньшей степени, чем на дальнем красном свету. Темновой и индуцированный светом фермент - один и тот же молекулярный тип [345]. Авторы [360] считают, что появление АО в темноте и на свету - независимые явления. И можно только предполагать, что наряду с фотоактивацией синтеза АО в темноте имеет место субстратная стимуляция ферментативного синтеза, так как в прорастающих семенах появляется субстрат АО - аскорбиновая кислота. 90

Что же касается механизма фотоактивации аскорбатоксидазной активности, то, признавая факт стимуляции синтеза фермента дальним красным светом и связывая его с фитохромной регуляцией, стоит отметить, что действие света других спектральных участков на ферментативную активность АО совершенно не исследовано. Поэтому в опытах по изучению действия дальнего красного света на активность фермента [364, 238, 196], где в качестве контроля использовались растения, находящиеся в темноте, вероятно, стоило бы вводить и другой контроль - растения, освещающиеся полихроматическим светом. Таким образом, учитывая немногочисленные и крайне противоречивые данные по действию света на активность АО, стоит отметить, что данный вопрос требует дальнейшего исследования, которое должно объяснить механизм световой регуляции активности АО, что в конечном итоге поможет определить условия, формирующие пул АК на свету. Помимо прямого окисления АК специфической оксидазой - аскорбатоксидазой - возможно непрямое окисление при участии гемпротеида - пероксидазы. Этот фермент способен окислять субстрат за счет кислорода перекиси водорода, а в отсутствии последней - за счет молекулярного кислорода. Предполагается, что обе функции фермента - пероксидазная и оксигеназная - локализованы в пределах одной субъединицы. Биосинтез компонентов молекулы пероксидазы имеет различную локализацию. Апопротеиновая часть синтезируется преимущественно на гранулярной эндоплазматической сети, гем - в митохондриях, гликозидная простетическая группа присоединяется к полипептиду в аппарате Гольджи [281]. В клетках листьев и кончиков корней целого ряда растений активность пероксидазы связана с клеточными оболочками, вакуолями, плазмодесмами, ламеллами [290], возможно, и с особыми секреторными органеллами - пероксидазосомами [127]. Пероксидазы широко распространены среди растений. Наряду с классической пероксидазой (КФ 1.11.1.7) известны НАД- и НАДФ-пероксидазы, пероксидаза жирных кислот, глутатионпероксидаза, цитохром-пероксидаза. Аскорбат пероксидаза окисляет АК до ДАК следующим образом [292]: hν

1) 2 Н2О + 2 НАДФ+ ⎯⎯→ 2 НАДФН + 2 Н+ + О2; 2) 2 НАДФН + 2 Н+ + ГSSГ → 4 ГSН + 2 НАДФ+; 3) 4ГSН + 2 ДАК → 2 ГSSГ + 2 АК; 4) 2 АК + 2 H2O2 → ДАК + 4 Н2О. Пероксидаза АК встречается в хлоропластах и в цитозоле, но в митохондриальной и микросомальной фракциях отсутствует [429]. У хлореллы это основной фермент окисляющей АК, так как АК-аза у нее не обнаружена [403]. Молекула пероксидазы поглощает свет определенной длины волны; так, пероксидаза хрена в растворе имеет поглощение при 645, 583 и 498 нм, а также наиболее выраженное при 410-430 нм (линия Соре). После восстановления остаются линия Соре и поглощение при 594 и 586 нм. Взаимодействие с перекисью водорода ведет к образованию промежуточных компонентов (их четыре типа), которые обладают различными спектральными характеристиками [134]. 91

Обладая собственным поглощением, молекула пероксидазы должна быть чувствительна к действию радиации. При светоимпульсном облучении семян растений меняются физиологические и биохимические параметры растений, они приобретают колебательный характер. Механизм обнаруженных колебательных процессов, как показал Б.Г. Явишев [190], связан с активностью пероксидазы, а кроме этого - с синхронными изменениями SН ↔ S = S перехода. Обнаружено обратимое смещение в спектре ЯМР трех линий S- и N-содержащих групп глутатиона. Реакция на освещение пероксидазы различных видов растений, как показывают литературные данные, неоднозначна. Активность фермента на свету резко уменьшалась в стеблевой части гибридных проростков пшеницы [226] и в молодых проростках гороха, растущих при избытке Zn и Mn [212]. Замедление роста стебля гороха при освещении красным светом также сопровождалось падением активности пероксидазы [124]. В листьях риса, напротив, освещение после темноты вызывало подъем активности фермента, а в темноте она снижалась [373], так же, как и в листьях ячменя [399]. Имеются и другие данные о стимуляции активности пероксидазы белым светом [423]. Показана фитохромная регуляция активности пероксидазы кукурузы. Красный свет увеличивал активность фермента на 50-70% (5мин, 500 мкВт ⋅ см-2 ⋅ с-1), эффект красного света был обратим дальним красным светом. При продолжительном (24 часа) освещении дальним красным светом наблюдалась стимуляция активности пероксидазы за счет синтеза фермента [401]. Механизм действия красного света на пероксидазную активность представляется следующим образом: под действием красного света в растениях синтезируется флавоноид кемпферол, который в качестве монофенольного кофактора стимулирует ферментативную активность [254]. В работе [359] объясняется механизм фотоактивации пероксидазы инфракрасным светом. Установлено, что при прямом освещении верхних листьев шпината в них активировались щелочные пероксидазы. Активность повышалась и в затемненных верхних листьях, если начинали освещать нижние листья; ответ наблюдался через 1,5 минуты. Наблюдаемый эффект инфракрасного света, по мнению исследователей, связан с изменениями мембранного аппарата. Коротковолновое УФ-облучение 254 нм вызывало повышение активности растворимой и связанной ионными силами пероксидазы в листьях фасоли [223]. Таким образом, наряду с изучением действия белого света на пероксидазную активность предпринимается исследование света более узких спектральных участков с попыткой объяснения механизма их действия. Что же касается других ферментов, участвующих в непрямом окислении АК, в частности полифенолоксидазы (КФ 1.10.3.1), то вопрос о действии света на ее активность практически не исследован, хотя изучение субклеточной локализации фермента показало его присутствие в хлоропластах [299, 337]. Полифенолоксидаза локализована в тилакоидных мембранах хлоропластов и других пластид растений, но белок ее кодируется ядерным геномом. Предполагается, что все пластиды содержат полифенолоксидазу, активность которой с возрастом растений имеет тенденцию к увеличению [113], и хотя фермент относится к числу широко распространенных, 92

функция его недостаточно ясна. Возможно, она связана с реакцией Мелера в хлоропластах и с созданием в них "кислородного буфера" [440]. Что касается цитихромоксидазы (КФ 1.9.3.1), которая наряду с полифенолоксидазой участвует в непрямом окислении АК, то показана ее определенная реакция на освещение. В листьях пшеницы на свету (10 минут) значительно повышался стационарный уровень восстановленной цитохромоксидазы, что связывается с уменьшением на свету энергизации митохондрий и значительным уменьшением в них НАД+. В хорошо сопряженных митохондриях в темноте при стационарном уровне дыхания цитохромоксидаза находилась в более окисленном состоянии [347]. Цитохромоксидаза присутствует в хлоропластах [134], в бесхлорофилльных тканях ее активность резко снижена. В связи с этим предполагается, что в альбиносных тканях доля участия в дыхании цитихромоксидазы снижается, а окисление дыхательных субстратов осуществляется при участии иных ферментных систем [136]. По другим данным [419], активность цитохром-с-оксидазы зеленых и неокрашенных листьев была близкой. Таким образом, вопросы, касающиеся действия света на ферменты, окисляющие АК, начинают привлекать внимание исследователей, но они еще далеки от окончательного решения. Изучение их является необходимым не только для выяснения условий и механизмов, формирующих пул АК на свету, но также и для решения более общих проблем взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. В связи с этим в своей работе мы изучали действие полихроматического света на активность АО, пероксидазы, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы, а для пероксидазы - и монохроматического синего, зеленого, красного света в проростках ячменя с различной пигментацией с тем, чтобы обсудить вопрос о возможных фоторецепторах светозависимых процессов, а в конечном итоге попытаться объяснить механизм действия света на указанные ферменты [179]. Действие света на активность АО изучалось в опытах с 7-9-дневными зелеными, этиолированными и альбиносными проростками ячменя, в которых определялась исходная активность фермента, уровень ее после суточного пребывания растений в темноте и последующего двухчасового освещения. Оказалось, что начальный уровень активности АО значительно отличается у проростков с различной пигментацией: минимальным он был у зеленых проростков, максимальным - у альбиносных (табл. 27). Таблица 27 Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в 8-дневных проростках ячменя (интенсивность света 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

Вариант опыта

Исходная активность 24 часа темноты + 2 часа света

Активность аскорбатоксидазы в проростках в единицах падения оптической плотности, ΔД Зеленые Этиолированные Альбиносные 2,58 ± 0,18 3,65 ± 0,18 4,89 ± 0,14 5,54 ± 0,10 3,55 ± 0,10 7,85 ± 0,02 4,84 ± 0,12 4,65 ± 0,17 9,58 ± 0,36 93

Выдерживание в темноте в течение 24 часов повысило активность фермента у зеленых растений более чем в два раза и в несколько меньшей степени (в 1,6 раза) у альбиносов. У этиолянтов, для которых условия освещения в данном варианте опыта не изменились, активность фермента осталась на прежнем уровне. Последующее двухчасовое освещение проростков, предварительно выдержанных в темноте, снизило активность АО у зеленых растений и стимулировало у проростков, лишенных зеленых пигментов.

- темнота - свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 21. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в зеленых проростках ячменя

Характер светозависимых изменений активности АО при более длительной (24 часа) световой экспозиции представлен на рис. 21-23. Опытные зеленые и альбиносные проростки перед освещением помещались в темноту на 24 часа; этиолянты, напротив, затемнялись после освещения. Активность фермента оп94

ределялась через каждые 2 часа в течение первых 12 часов пребывания растений на свету или в темноте, а затем в конце 24-часовой экспозиции. У зеленых растений (рис. 21), помещенных в темноту, резко возросла активность АО. Этот подъем продолжался в течение 4 часов, в последующие 4 часа активность фермента снижалась, значительно не доходя до исходного уровня. Дальнейшее присутствие проростков в темноте (от 10 до 12 часов) стабилизировало активность фермента, и этот уровень сохранялся в следующие 12 часов. После темновой экспозиции опытные растения сутки находились на свету. В течение первых 6 часов освещения активность фермента снизилась почти до исходного уровня и после небольшого подъема через 8 часов поддерживалась на одном уровне до конца опыта.

- темнота - свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 22. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в этиолированных проростках ячменя 95

В этиолированных проростках (рис. 22) в первые 2 часа освещения активность повысилась, но в оставшееся до конца световой экспозиции время была значительно ниже исходной. Последующее затемнение растений стимулировало фермент, и через 7 часов его активность достигала исходного значения. Подъем продолжался в течение 10 часов, однако в дальнейшем ферментативная активность стала снижаться и почти приблизилась к исходному уровню через 24 часа. Следует отметить, что через два часа прозеленения этиолированных проростков их реакция на освещение стала такой же, как у зеленых растений: свет ингибировал активность АО, темнота - стимулировала. Иной была реакция на освещение АО альбиносных проростков (рис. 23), у которых активность фермента повышалась не только в темноте, но еще в большей степени при освещении. Причем при смене условий освещения в первые 6-8 часов опыта отмечался резкий подъем активности фермента, в дальнейшем она стабилизировалась и поддерживалась на одном уровне до конца световой или темновой экспозиции.

- темнота - свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 23. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в альбиносных проростках ячменя 96

Таким образом, реакция на освещение АО проростков ячменя в значительном степени зависит от состояния пигментного аппарата анализируемых растений, а в конечном итоге, вероятно, от функционирования того или иного энергетического процесса - фотосинтеза или дыхания. Действие света на активность цитохромоксидазы исследовалось в опытах с 6-дневными проростками ячменя с различной пигментацией (рис. 24), у которых ферментативная активность определялась до и после 24-часовой темновой экспозиции. В темноте значительно повысилась активность цитохромоксидазы в зеленых проростках и в меньшей степени, но статистически достоверно, снизилась в этиолированных и альбиносных. Реакция на 4-часовое освещение растений, предварительно находившихся сутки в темноте, была неоднозначной: в зеленых проростках на свету активность цитохромоксидазы резко снизилась, тогда как в этиолированных и альбиносных - возросла. Следует отметить, что во всех вариантах опыта уровень активности цитохромоксидазы оставался самым высоким у альбиносов, самым низким - у зеленых растений.

- темнота - свет Рис. 24. Влияние условий освещения на активность цитохромоксидазы в зеленых (1), этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя (в усл. единицах)

Действие света на активность полифенолоксидазы представлено на рис. 25. В зеленых, этиолированных и альбиносных проростках, находившихся сутки в 97

темноте, активность фермента медленно нарастала. Включение света резко изменило скорость процесса, причем если у этиолированных и альбиносных проростков активность полифенолоксидазы продолжала увеличиваться еще с большей скоростью, то у зеленых проростков она быстро снизилась.

- темнота - свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 25. Влияние условий освещения на активность полифенолоксидазы (ΔД, с/г) в зеленых (1), этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя

Более длительное 6-часовое освещение по-прежнему стимулировало полифенолоксидазу у альбиносных и этиолированных проростков и только 24часовая экспозиция несколько снизила скорость нарастания активности фермента. Полифенолоксидаза зеленых проростков, снизившись почти до исходного уровня в первые два часа освещения, в дальнейшем медленно возрастала, но в конце освещения (24 часа) тем не менее была в два раза ниже, чем у альбиносных проростков и почти в три раза меньше, чем у этиолянтов. Таким образом, у зеленых проростков включение света после темноты ингибировало активность полифенолоксидазы, а у проростков, лишенных зеленых пигментов, - стимулировало. 98

Анализ изоферментов пероксидазы в полиакриламидном геле показал, что в альбиносных участках мутантных листьев ячменя активность одной из изоформ фермента была выше, чем в соответствующих участках зеленых листьев [182], в этиопластах выше, чем в хлоропластах [135]. В работе М.В. Гусева и др.[30] указывается, что при нарушении биосинтетических функций листа, в том числе связанных с накоплением хлорофилла, число молекулярных форм пероксидазы и активность некоторых из них увеличиваются. В связи с этим нами проведено подробное исследование активности пероксидазы в различных зонах листьев зеленых, этиолированных и мутантных проростков (табл. 28). Оказалось, что активность фермента практически одинакова по всей длине этиолированных листьев, а у зеленых она максимальна в нижней части листа. Таблица 28 Пероксидазная активность различных зон зеленых, этиолированных и мутантных листьев ячменя (ΔД, с/г)

Зона листа Верхняя Средняя Нижняя

Зеленые листья 14,00 ± 0,84 14,45 ± 0,85 17,07 ± 0,41

Этиолированные 15,61 ± 0,61 16,04 ± 0,60 16,91 ± 0,36

Мутантные 21,60 ± 0,39 24,53 ± 0,85 31,98 ± 1,10

Наибольшая гетерогенность в распределении ферментативной активности обнаружена у мутантных листьев, для которых характерен и самый высокий уровень ее по всем зонам листа по сравнению с зелеными и этиолированными проростками. Прослеживается обратная зависимость в содержании зеленых пигментов и активности пероксидазы: наибольшая активность фермента выявлена в нижней альбиносной зоне мутантного листа, наименьшая - в верхнем пигментированном участке. Влияние света на пероксидазную активность представлено на рис. 26. Зеленые проростки сутки выдерживались в темноте, что приводило к снижению активности фермента. Последующее освещение в течение 6 часов резко активировало пероксидазу. В дальнейшем стимуляция активности фермента прекращалась, и в конце световой экспозиции через 24 часа она имела тенденцию к снижению, хотя все еще оставалась выше, чем в темновом варианте. Исследовано действие света различной интенсивности (4,4 и 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) на активность пероксидазы (рис. 27). Оказалось, что светозависимая стимуляция активности фермента в зеленых проростках нарастает с увеличением интенсивности света. Таким образом, показана положительная реакция пероксидазы зеленых проростков на освещение, которая зависит от продолжительности и интенсивности действующего света. Наряду с зелеными проростками изучалось действие света на активность пероксидазы в этиолированных и альбиносных проростках (рис. 28), для которых также оказалась характерна светостимуляция активности фермента. 99

- темнота - свет (30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 26. Влияние условий освещения на активность пероксидазы в зеленых проростках ячменя

Рис. 27. Влияние различной интенсивности света (1 - 4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1; 2 - 30 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) на активность пероксидазы в зеленых проростках ячменя (в % к исходной активности - 100 %) 100

- темнота - свет (4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1) Рис. 28. Действие двухчасового освещения на активность пероксидазы в зеленых (А), этиолированных (Б) и альбиносных (В) проростках ячменя

Для определения спектра поглощения возможного фоторецептора, ответственного за светозависимую стимуляцию пероксидазной активности в проростках ячменя, исследовалось действие света различного спектрального состава на данный процесс (табл. 29). Реакция на освещение монохроматическим зеленым и синим светом была одинакова у всех типов листьев: зеленый свет повышал, а синий снижал активность фермента. Красный свет активировал пероксидазу только у этиолянтов, у других - снижал. Таким образом, световая стимуляция активности пероксидазы в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях ячменя зависит от качественного состава действующего света. Исследование действия света на активность ферментов, окисляющих АК, показало, что характер фотоответа зависел от состояния пигментного аппарата проростков ячменя: если у зеленых растений активность АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы ингибировалась светом и активировалась в темноте, то у альбиносных проростков свет стимулировал активность ферментов. У этиолированных растений реакция на освещение менялась в ходе прозеленения; так, аскорбатоксидазная активность повышалась при переходе темнота - свет, но при продолжающемся освещении с появлением пигментов понижалась. Вышеназванные ферменты являются медьсодержащими белками, которые в окисленной форме имеют интенсивное поглощение света в видимой области спектра 600 и 800 нм [90]. В связи с этим изменение активности АО, полифено101

локсидазы и цитохромоксидазы при освещении можно было бы рассматривать как результат посттрансляционной модификации молекулы фермента. Однако неоднозначная реакция на освещение активности ферментов у зеленых и бесхлорофилльных растений не подтверждает это предположение. Таблица 29 Действие света различного спектрального состава на активность пероксидазы (ΔД, с/г) в листьях ячменя (экспозиция 2 ч; интенсивность света 4,4 тыс. эрг ⋅ см-2 ⋅ с-1)

№ опыта 1

2

3

Условия опыта

Зеленые

Этиолированные

Альбиносные

В темноте На красном свету (620-740 нм) На белом свету

15,04 ± 0,40

9,42 ± 0,12

27,26 ± 1,13

11,82 ± 0,46 16,45 ± 0,15

11,93 ± 0,13 14,40 ± 0,36

19,41 ± 1,46 33,50 ± 1,21

В темноте На синем свету (440-520 нм)

9,92 ± 0,21

16,31 ± 0,22

28,99 ± 0,45

9,01 - 0,16

13,07 ± 0,32

23,97 ± 0,25

В темноте На зеленом свету (480-600 нм)

15,51 ± 0,23

19,50 ± 0,36

23,26 ± 0,74

17,72 ± 0,19

20,24 ± 0,32

26,94 ± 1,27

На свету в зеленых и альбиносных проростках ячменя увеличивается содержание восстановленной формы АК [181], у альбиносов возрастает скорость образования свободных фенольных соединений [121]. Таким образом, на свету при возрастании количества соответствующих субстратов активность АО и полифенолоксидазы снижается. Следовательно, и механизм субстратной активации ферментов не объясняет изменения их активности в связи с освещением. АО, полифенолоксидаза и цитохромоксидаза - дыхательные ферменты, в частности, они являются компонентами дыхательной цепи хлоропластов. Учитывая гипотезу о взаимозаменяемости энергетических процессов - фотосинтеза и дыхания [143], можно полагать, что на свету, когда в ассимилирующих клетках включается фотосинтез, конкуренция за энергетические кофакторы приводит к снижению дыхания. Следствием этого является понижение активности дыхательных ферментов. В нефотосинтезирующих и слабо пигментированных клетках в отсутствии конкуренции за аденилаты усиливается дыхание [330]. Это показано и для альбиносных листьев ячменя (рис. 29). Поэтому в этиолированных и альбиносных растениях в противоположность зеленым на свету активность АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы не снижается, а даже возрастает. Последнее может быть следствием возрастающих на свету энергетических трат, связанных со светозависимыми синтезами. Как показано для анализируемых мутантных проростков ячменя, на свету в альбиносной ткани стимулируется гликолиз, окислительный пентозофосфатный 102

цикл и цикл Кребса [80]. Следовательно, учитывая полученные нами данные по активации светом АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы альбиносных и этиолированных проростков ячменя, можно говорить о стимуляции светом не только дыхательной цепи переноса водорода, включающей цитохромы, но и альтернативных путей, включающих полифенолоксидазу и АО. Последняя у некоторых растений может обеспечить транспорт всего сжигаемого при дыхании водорода [49].

Рис. 29. Дыхание зеленых (А) и альбиносных (Б) участков листа ячменя в % к контролю (контроль - 100 %)

Таким образом, светозависимое изменение активности АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы в зеленых, этиолированных и альбиносных проростках ячменя происходит не путем непосредственного воздействия света на молекулу фермента, а, скорее всего, опосредованно, через изменение интенсивности дыхательного процесса, в котором задействованы указанные оксидазы. Из исследованных нами ферментов, окисляющих АК, в зеленых проростках только пероксидаза активировалась светом. Этот фермент является гемпротеидом, поглощающим свет в нескольких областях спектра. Так, пероксидаза хрена поглощает свет с длиной волны 410-430, 498, 583, 645 нм. Проведенное нами исследование действия света различного спектрального состава на пероксидазную активность показало, что зеленый свет (480-600 нм) повышал, а синий (440520 нм) снижал активность фермента; красный свет (620-740 нм) активировал пероксидазу только у этиолированных проростков. Учитывая спектр поглощения молекулы пероксидазы, можно предположить, что непосредственным акцептором света в светозависимом изменении ее активности может выступать сама молекула фермента, тонкая регуляция активности которой осуществляется светом определенного спектрального состава. Действие света на активность пероксидазы, вероятно, не связано с изменением скорости синтеза фермента, так как нами показано ингибирование активности пероксидазы синим светом, способствующим преимущественному накоплению 103

белков [215]. Синий свет может оказывать прямое действие на ферменты и непрямое - через изменение уровня субстратов и эффекторов [380]. При длительном освещении растений увеличивается чувствительность некоторых клеточных процессов к Фдк и синий свет может оказывать специфическое действие на опосредованный фитохромом синтез ферментов - через модуляцию фитохромом экспрессии генома [353]. Одновременный анализ ферментов, окисляющих АК, в зеленых, этиолированных и альбиносных проростках ячменя показал, что максимальный их уровень был у депигментированных проростков. Этот факт находит подтверждение в работах по исследованию полифенолоксидазы бесцветной ткани листьев хлорофитума [137], мутантных растений ячменя [235], и только у альбиносных проростков кукурузы цитохромоксидазная активность резко снижалась [136]. Хотя у других С4-растений активность цитохром-с-оксидазы была близкой в зеленых и неокрашенных участках пестрых листьев [419]. Наличие пероксидазной, полифенолоксидазной, цитохромоксидазной и АО активности у альбиносных проростков, полученных нами при ингибировании 30S-субъединиц 70S-рибосом, дает основание связывать синтез исследованных ферментов с 80S-рибосомами цитоплазмы. Таким образом, реакция на освещение ферментов, окисляющих АК, неоднозначна и зависит от функциональной активности фотосинтетического аппарата: у зеленых проростков ячменя активность АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы снижается на свету, активность пероксидазы возрастает. В альбиносных и этиолированных тканях листа свет активирует все исследованные ферменты. Следовательно, можно считать, что одной из причин возрастания пула АК у зеленых проростков на свету является ингибирование светом большинства ферментов, ее окисляющих.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Аскорбиновая кислота выполняет важные функции в жизни растений и человека, при этом участие витамина С в метаболизме гетеротрофных организмов более конкретизировано. Что же касается автотрофов, продуцирующих АК, то у них еще нуждается в уточнении и функция данного соединения, и пути его новообразования. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что одним из важнейших условий, определяющих биосинтез АК у растений, является свет. В сухих семенах АК отсутствует, при их прорастании даже в темноте в проростках синтезируется АК, но, вероятно, за счет предшественников, запасаемых в семени. В зеленых же растениях АК накапливается преимущественно на свету, поэтому оправдано было связывать ее биосинтез с фотосинтезом. Однако исследование действия света различного спектрального состава на биосинтез АК показало, что спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпадают. В частности, показана высокая активность желто-зеленого света в процес104

се образования АК. Отсутствует положительная корреляция в содержании фотосинтетических пигментов и способности растений накапливать АК. Кроме этого, светозависимый синтез АК был обнаружен у экспериментально полученных альбиносных проростков ячменя. Все сказанное дает основание говорить об отсутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК, хотя полностью отрицать наличие контактов между этими процессами нельзя, так как углеводный субстрат для новообразования АК дает фотосинтез. Экспериментально показано наличие связи между светозависимым биосинтезом АК и дыхательным процессом в целом, а также с отдельными его этапами: гликолизом и ЦТК, особенно с последним. При активации ЦТК интермедиатами цикла (янтарной, α-кетоглутаровой кислотой) и при его ингибировании соответственно менялось и накопление АК. Исследование субклеточной локализации АК в связи с освещением выявило активное накопление АК во фракции, включающей митохондрии, что также указывает на связь биосинтеза АК с органоидами дыхания, хотя ингибирование хлоропластных, митохондриальных и цитоплазматических рибосом показало, что биосинтез АК в большей степени зависит от функционирования цитоплазматических 80S-рибосом, чем от митохондриальных и хлоропластных. Наблюдаемое светозависимое накопление АК в растениях, вероятно, нельзя связать с каким-либо одним процессом: фотосинтезом или дыханием, как это делалось раньше. Уже сейчас видно, что существует несколько процессов, которые будут определять накопление АК на свету, и эти процессы могут быть связаны с фотосинтезом или с дыханием, для которого в последние годы показано наличие реакций, активируемых светом. Пул АК в растениях определяется одновременно идущими процессами биосинтеза и использованием АК во многих процессах, в том числе и связанных с обоими энергодающими процессами - фотосинтезом и дыханием. Так, показано, что уровень АК на свету, с одной стороны, зависит от функционального состояния пластоцианина и Р700. С другой стороны, он зависит от активности дыхательных ферментов - ферментов, окисляющих АК: аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы. Три первых фермента у зеленых проростков ингибируются светом, пероксидаза - активируется. У дефицитных по зеленым пигментам и альбиносных проростков свет активирует все вышеуказанные ферменты, поэтому одним из факторов, определяющих светозависимое накопление АК у нормально пигментированных растений, является ингибирование светом большинства ферментов, ее окисляющих. Говоря о действии света на биосинтез АК, нужно иметь в виду не только опосредованное его влияние через фотосинтез, дающий субстрат для образования АК, но и непосредственное его действие в процессе образования молекулы АК из глюкозы или галактозы. Одной из таких реакций может быть фотовосстановление предшественника АК [343] или активирование светом l-гулоно-γлактон дегидрогеназы, катализирующей последнюю ступень биосинтеза АК и являющейся флавинсодержащим ферментом. Фонд АК в растениях на свету может пополняться не только за счет новообразования АК, но и путем фотовосстановления ДАК в АК в хлоропластах. Остается неясным, возможно ли восстановление ДАК за счет восстановителя, обра105

зующегося в процессе окислительного фосфорилирования. Следовательно, уровень АК в растениях будет зависеть от направленности процессов в системе АК↔ДАК. В связи с этим, характеризуя содержание АК в растениях, и особенно метаболизм данного соединения, необходимо одновременно анализировать содержание не только АК и ДАК, но и ДКГК, образующейся при необратимой трансформации ДАК в результате разрыва ее лактонового кольца. ДКГК растений практически не исследована, хотя это соединение начинает привлекать к себе внимание благодаря выявленному противоопухолевому его действию [450]. Таким образом, содержание АК в растениях определяется многими одновременно идущими процессами (рис. 30), и регуляция ее накопления требует согласованной их работы. Это имеет место не только при нормальном функционировании растений, но и в стрессовых условиях, которые обычно сопровождаются усилением биосинтеза и использования АК. Познание регуляторных механизмов обменных процессов вообще, и в частности регуляции биосинтеза физиологически активных соединений, таких, как АК, является актуальным для физиологии растений в связи с перспективой биотехнологического использования растительных объектов с целью получения важных для народного хозяйства метаболитов. Фотосинтез Глюкоза

Пероксидаза

НАДФН · Н+ Цитохромоксидаза

Биосинтез АК

Полифенолоксидаза

α-кетоглуторат

Аскорбатоксидаза НАДФН · Н+ Пул АК Изоцитрат ЦТК

Орг. к-ты

Пируват

ДАК

ДКГК

Фотовосстановление в хлоропластах

Гликолиз

Г-SH ОПФП

НАДФ · Н+

ГS-SГ

Рис. 30. Процессы, формтирующие пул АК в зеленых проростках ячменя, активируемые ( ) и ингибируемые ( ) светом Условные обозначения: Г-SH - глютатион восстановленный; ГS-SГ - глютатион окисленный; Орг. к-ты - органические кислоты: янтарная и α-кетоглутаровая 106

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Аксенова О.Ф. // Уч. зап. Томского ун-та. 1960. № 36. С. 219-228. 2. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. 1973. № 4. С. 71-75. 3. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. Сер. биол. наук. 1975. № 2. С.6265. 4. Андрейчева М., Байлов Д. // Изв. Ин-та растениевъдства Бълг. АН. 1959. Кн. 8. С. 79-87. 5. Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С., Волкова О.В. и др. Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 30-36. 6. Бабаян Р.С., Геворкян А.М., Айрапетян Р.Б. и др. // Физиология растений. 1975. Т. 22. № 3. С. 484-489. 7. Бил. Д., Ноулз Д. Внеядерная наследственность. М.: Мир, 1981. 168 с. 8. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии. М., 1987. 543 с. 9. Букин В.Н. // Биохимия витаминов. М., 1982. С. 107. 10. Бунаков В.А. // Биол. науки. 1960. № 2. С. 144-147. 11. Бухов Н.Г., Воскресенская Н.П. // Физиология растений. 1986. № 4. Т. 33. С.692698. 12. Верхотурова Г.С. // Труды НИИ биологии и биофизики при Томском ун-те. 1977. № 8. С. 134-139. 13. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.Н. // Вопросы биологии. Томск, 1978. С. 77-82. 14. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. // Физиология растений. 1983. Т. 30. № 3. С.580. 15. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Дудина Е.В. // Фотосинтез и продуктивность растений / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1987. С. 39-44. 16. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Кудинова Л.И. // Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 19-29. 17. Верхотурова Г.С., Кудинова Л.И., Астафурова Т.П. // Физиология растений. 1987. Т. 33. № 2. С. 261-265. 18. Воскресенская Н.П. // Тр. Ин-та физиологии растений АН СССР. 1953. Т. 8. № 1. С. 42-55. 19. Воскресенская Н.П. Фотосинтез и спектральный состав света. М.: Наука, 1965. 311 с. 20. Воскресенская Н.П. // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений / Отв. ред. А.Л. Курсанов, Н.П. Воскресенская. М., 1975. С. 16-36. 21. Воскресенская Н.П., Мажуль М.М. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 3. С.483-489. 22. Врублевская К.Г. // Уч. зап. Томского ун-та. 1962. № 44. С. 199-207. 23. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. 392 с. 24. Гапоненко В.И., Николаева Г.Н., Куперман Н.И. // Ботаника. Исследования. 1982. №24. С. 176-183. 25. Гордон Л.Х., Голубев А.И. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 1. С. 107-110. 26. Гофман Э. Динамическая биохимия. М.: Медицина, 1971. 311 с. 27. Гродзинский А.М. // Укр. ботанiчний журн. 1973. Т. 30. № 1. С. 28-35. 28. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2 т. М.: Мир, 1986. Т. 1. 392 с.

107

29. Гуликова О.М., Зайцева Г.Н. // Успехи современной биологии. 1984. Т. 97. № 2. С. 208-224. 30. Гусев М.В., Карташова Е.Р., Руденская Г.Н. и др. // Тезисы Междунар. симпоз. "Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза". Пущино, 1983. С. 65-66. 31. Гэйл Э., Кандлифф Э., Рейнолдс П. и др. Молекулярные основы действия антибиотиков. М.: Мир, 1975. 500 с. 32. Девятнин В.А. // Биохимия. 1950. Т. 15. № 4. С. 323-329. 33. Девятнин В.А. // Тр. Всесоюз. науч.-исслед. витаминного ин-та. 1953. № 4. С.128-131. 34. Девятлин В.А. // Тр. Ботан. ин-та АН СССР. 1959. Сер. 6. Вып. 7. С. 345-360. 35. Джеймс В. Дыхание растений. М. Изд-во ИЛ, 1956. 439 с. 36. Дымарский А.А. // Сб. тр. Харьковского вет. ин-та. 1958. № 23. С. 147-150. 37. Дымарский А.А., Артюх Е.И. // Ветеринария. 1958. № 8. С. 77-78. 38. Евстигнеев В.Б., Гаврилова В.А. // Докл. АН СССР. 1971. Т. 200. № 3. С. 725728. 39. Егоров А.Д. Витамин С и каротин в растительности Якутии. Якутск, 1954. 248 с. 40. Зайцева Т.А., Врублевская К.Г., Шапиро Т.Е. и др. // Физиолого-биохимического механизмы регуляции адаптационных реакций растений и агрофитоценозов: Мат-лы Всесоюз. симп. Кишинев, 1984. С. 133-134. 41. Захарова Н.М., Шубин В.В., Бухов Н.Г. и др. // Биофизика. 1982. Т. 27. № 4. С. 572-577. 42. Землянухин А.А. // Бюл. общ-ва естествоиспыт. при Воронежском ун-те. 1955. № 9. С. 19-22. 43. Землянухин А.А. // Физиология растений. 1956. Т. 3. № 4. С. 313-319. 44. Землянухнн А.А. // Физиология растений. 1964. Т. 11. № 6. С. 1047-1055. 45. Землянухин А.А. Регуляторы роста растений. Воронеж, 1964. С. 104-118. 46. Землянухин А.А. Физиологическая роль аскорбиновой кислоты и кислот трикарбонового цикла в растениях: Дисс... д-ра биолог. наук. Воронеж, 1964. 501 с. 47. Зёдинг Г. Ростовые вещества растений. М., 1955. 388 с. 48. Золотухин И.Г., Лисовский Г.М., Баянова Ю.И. // Физиология и биохимия культурных растений. 1979. Т. 11. № 2. С. 141-146. 49. Зубкова Е.К., Филиппова Л.А., Мамушина Н.С., Чупахина Г.Н. // Физиология растений. 1988. Т. 35. Вып. 2. С. 254-259. 50. Иванов Б.Н., Шмелева В.Л., Пигулевская Т.К. // Физиология растений. 1984. Т. 31. № 2. С. 273-280. 51. Канивец Н.П., Волкова Н.В., Василёнок Л.И. и др. // Докл. АН УССР. 1980. Б. № 8. С. 37-39. 52. Карабанов Ю.В. // Тр. Житомирской науч.-исслед. селекц. ст. хмелеводства. 1959. Вып. 6. С. 211-215. 53. Карначук Р.А. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 4. С. 765-773. 54. Карначук Р.А., Постовалова В.М. // Всесоюз. совещ.: “Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе”. Тез. докл. Пущино, 1981. С. 24-25. 55. Карначук Р.А., Протасова Н.Н., Добровольский М.В. и др. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 1. С. 51-59. 56. Карпилов Ю.С., Керимов С.Х., Новицкая И.Л. и др. // Физиология и биохимия культурных растений. 1978. Т. 10. № 5. С. 499-506. 108

57. Карпилов Ю.С., Опарина Л.А., Кузнецова Л.Г. и др. // Физиология и биохимия культурных растений. 1977. Т. 9. № 1. С. 93-99. 58. Колек Ю., Овчаров К.Е. Физиология растений. 1963. Т. 10. № 1. С. 84-89. 59. Колесников П.А., Эйнор Л.О. // Биохимия. 1964. Т. 29. № 3. С. 402-407. 60. Колотилова А.И., Глушанков Е.П. Витамины. Химия, биохимия и физиологическая роль. Л., 1976. 247 с. 61. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности. М., 1986. 144 с. 62. Красновский А.А. // Докл. АН СССР. 1950. Т. 73. № 6. С.1239-1242. 63. Красновский А.А. // Докл. АН СССР. 1955. Т. 103. № 2. С.283-286. 64. Красновский А.А. // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений / Отв. ред. А.А. Курсанов, Н.П. Воскресенская. М., 1975. С. 5-15. 65. Красновский А.А., Войновская К.К. // Биофизика. 1956. Т. 1. № 2. С. 120-126. 66. Красновский А.А., Умрихина А.В. // Докл. АН СССР. 1958. Т. 122. № 6. С.10611064. 67. Красинский Н.П., Валутина В.А., Пряхина-Конькова Е.А. и др. // Физиология растений. 1955. Т. 2. № 1. С. 62-69. 68. Кротов Е.Г. // Тр. Одесского технолог. ин-та пищевой и холодильной промышленности. 1955. № 6. С. 89-97. 69. Кудряшов Б.А. Биологические основы учения о витаминах. М.: Советская наука, 1948. 543 с. 70. Кузнецова-Зарудная Т.Н. // Проблема витаминов. Л., 1937. № 2. С. 57-80. 71. Лемеза Н.А. // Вестник Белорусского университета. 1981. Т. 2. № 1. С. 48-52. 72. Лемпицкий Л.П., Александрова Н.М. // Флористические исследования и зеленое строительство на Кольском полуострове. Апатиты, 1975. С. 124-129. 73. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974. 957 с. 74. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. 731 с. 75. Лимарь Р.С., Сахарова О.В. // Методы комплексного изучения фотосинтеза / Отв. ред. О.Д. Быков. Л., 1973. Вып. 2. С. 260-267. 76. Липсиц Д.В. // Биохимия. 1958. Т. 23. № 4. С. 592-600. 77. Львов С.Д., Гуцевич Г.К., Пантелеев А.Н. // Уч. зап. Ленинградского ун-та. Сер. биол. наук. 1945. № 75. Вып. 15. С. 48-79. 78. Мазурова Т.А. // Вестн. Ленинградского ун-та. 1973. № 21. С.89-94. 79. Малиновская Г.А. // Фотосинтез и продуктивность растений / Отв. ред. М.М. Окунцов. Калининград, 1987. С. 49-52. 80. Мамушина Н.С., Филиппова Л.А., Зубкова Е.К. // Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 5-18. 81. Мартынова Т.Б., Максютова Н.Н., Тарчесский И.А. и др. // Физиология и биохимия культурных растений. 1985. Т. 17. № 6. С. 539-543. 82. Меркис А.И. // Тр. АН Лит. ССР. 1959. Т. Б 3. № 19. С. 123-142. 83. Механик Ф.Я. // Ботанический журнал. 1952. № 1. С. 71-74. 84. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980. Т. 2. 606 с. 85. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980. Т. 3. 488 с. 86. Митев И.П., Белева-Стайкова Р. // I, II. Съобщ. Сб. тр. Висш. мед. ин-т. Пловдив, 1958-1959. № 12. С. 81-88. 87. Могилева Г.А., Сахарова О.В., Зеленский М.И. // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1978. Т. 61. № 3. С. 111-118. 88. Моисеева М.Н. // Ботанический журн. 1961. Т. 46. № 9. С. 1339-1342. 109

89. Мор Г. // Теоретические основы фотосинтетической продуктивности / Отв. ред. А.А. Ничипорович. М., 1972. С. 323-343. 90. Мутускин А.А. // Известия АН СССР. Сер. биологич. 1970. № 5. С. 698. 91. Нечаева Е.П. // Уч. зап. Пермского пед. ин-та. 1974. № 124. С. 19-25. 92. Ничипорович А.А. // Тр. V Междунар. биохимического конгресса. Симпозиум VI. М., 1962. С. 21-28. 93. Новак В.А., Миклашевич А.И. // Изв. АН СССР. Сер. биологич. 1985. № 6. С.944-948. 94. Норбаев Н. // Радиобиология. 1975. № 3. С. 467-469. 95. Овчаров К.Е. Роль витаминов в жизни растений. М.: Изд-во АН СССР, 1958. 286 с. 96. Овчаров К.Е. Витамины растений. М.: Колос, 1969. 328 с. 97. Окунцов М.М., Верхотурова Г.С. // Биологические науки. 1971. № 10. С. 76-81. 98. Окунцов М.М., Котлярова Г.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1964. Вып. 1. С. 34-68. 99. Окунцов М.М., Плотникова А.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1970. № 2. С. 218-224. 100. Окунцов М.М., Фролова Н.М. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1964. Вып. 1. С. 5-33. 101. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Информ. бюл. СО АН СССР. Иркутск. 1968. Вып. 3. С. 97-98. 102. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск. 1970. № 2. С 96-110. 103. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Биологические науки, 1970. № 7. С. 88-94. 104. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Биологические науки. 1972. № 10. С. 74-77. 105. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. // Специальный практикум по биохимии и физиологии растений. Калининград, 1981. С. 11-14. 106. Окунцов М.М., Карначук Р.А., Фролова Н.М. // Биологические науки. 1971. №4. С. 78-82. 107. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н., Дубовик Е.Е. // Вопросы фотосинтеза. / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1970. Вып. 2. С. 111-123. 108. Окунцов М.М., Роньжина О.А., Симонова Е.И. и др. Физиология питания, роста и устойчивости растений // Труды 1 конф. физиологов и биохимиков растений Сибири и Дальнего Востока. М., 1963. С. 99-103. 109. Окунцов М.М., Роньжина О.А., Симонова Е.И., Чупахина Г.Н. // Вопросы фотосинтеза / Отв. ред. М.М. Окунцов. Томск, 1970. № 2. С. 124-136. 110. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н., Старченко Г.Ф. и др. // Биологические науки. 1974. № 5. С. 81-86. 111. Парибок Т.А. // Сб. трудов по агрономической физике. М., 1962. № 2. С. 137144. 112. Пересыпкин В.Ф., Кирин Н.Н., Кошевский И.И. // Вестник сельскохозяйственной науки. 1977. № 8. С. 25-31. 113. Петроченко Е.И., Колесников П.А. // Биохимия. 1961. Т. 26. № 4. С. 701-707. 114. Петрухин Ю.А., Степанова С.П. // Биологические науки. 1979. Т. 185. № 5. С.89-91. 115. Поволоцкая К.Л. // Проблемы витаминов. 1937. Вып. 2. С. 29-57. 116. Полинг Л. Витамин С и здоровье. М., 1974. 80 с. 117. Полищук Л.К. // Вiсник Київськ. ун-ту. Сер. биол. 1962. Т.5. № 1. С. 33-41. 110

118. Полищук Л.К. // Физиология и биохимия культурных растений. 1970. Т. 2. №5. С.198-203. 119. Пономарева В.С. // Бюл. Гл. ботан. сада АН СССР. 1965. Вып. 59. С. 48-53. 120. Постовалова В.М., Карначук Р.А., Прохорова Е.В. // Физиология растений. 1984. Т. 31. № 4. С. 752-757. 121. Прохорчик Р.А., Чупахина Г.Н. // Тезисы докладов пятого Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Таллин, 1987. С. 120. 122. Проценко Д.Ф. // Рост и устойчивость растений. 1967. № 3. С. 215-222. 123. Рабинович Е. Фотосинтез. Т. 2. М., 1953. 652 с. 124. Ракитина Т.Я. // Доклады АН СССР. 1987, Т. 292. № 4. С. 1020-1024. 125. Рахманкулова 3.Ф. // Тр. 17 научн. конф. молодых ученых биол. фак. МГУ "Проблемы современной биологии". М., 1986. С. 66. 126. Рзаев Н.Д. // Тр. Азерб. науч.-исслед. ин-та земледелия. 1966. Т. 13. С. 279-285. 127. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Акимов Б.С. и др. // Физиология раст. 1987. Т.34. №6. С. 1181-1186. 128. Рожковский А.Д., Бухов Н.Т., Воскресенская Н.П. // Физиология растений. 1985. Т. 32. № 6. С. 1046-1054. 129. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М., 1980. 159 с. 130. Рощина В.В. // Биохимия. 1979. Т. 44. № 3. С. 477-481. 131. Рощина В.В., Акулова Е.А. // Физиология растений. 1975. Т. 22. № 3. С. 471478. 132. Рощина В.В., Мутускин А.А. // Успехи биологической химии. М., 1983. Т. 24. С. 214-232. 133. Рубин Б.А., Гавриленко В.Ф. Биохимия и физиология фотосинтеза. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1977. 326 с. 134. Рубин Б.А., Ладыгина М.Е. Физиология и биохимия дыхания растений. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1974. 512 с. 135. Рубин Б.А., Воронков Л.А., Живописцева И.В. // Докл. АН СССР. 1970. Т.190. № 6. С. 1483-1485. 136. Рубин Б.А., Чернавина И.А., Кренделева Т.Е. // Докл. АН СССР. 1962. Т. 147. № 1. С. 240-243. 137. Рубин Б.А., Чернавина И.А., Кренделева Т.Е. // Физиология растений. 1965. Т.12. Вып. 2. С. 204-209. 138. Рубин Б.А., Арциховская Е.В., Спиридонова Н.С. и др. // Биохимия. 1939. Т. 4. № 3. С. 260-268. 139. Рубцова М.С., Кузнецова Т.Н. // Тр. Горьковского сельскохозяйственного инта. 1976. Т. 91. С. 30-47. 140. Садыков А.С., Гусева Д.М. // Докл. АН УзССР. 1954. № 3. С. 31-34. 141. Самородова-Бианки Г.Б. // Физиология растений. 1965. Т. 12. № 2. С. 210-215. 142. Семененко Т.Н. // Биологические науки. 1962. № 4. С. 124-128. 143. Семихатова О.А., Заленский О.В. Физиология фотосинтеза. М.: Наука, 1982. С. 130-145. 144. Сергеев Л.И., Загидуллина Л.Н. // Витаминные растительные ресурсы и их использование. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1977. С. 348-350. 145. Сидоренко I.Д. // Наук. працi. Кам'янець-Подiльськ. с лiськогоспод. iн-т. 1961. № 4. С. 12-18. 146. Симонова Е.И. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 4. С.758-764. 111

147. Скофенко А.О. // Наук. зап. Киёвськ. ун-та. 1957. Т. 16. № 1. С. 165-174. 148. Смирнов А.М., Овчаров К.Е. // Физиология растений. 1960. Т. 7. № 2. С. 240242. 149. Соболева Г.А., Бокучава М.А. // Успехи биологической химии. 1978. Т. 19. С.209-225. 150. Солдатенков С.В. Биохимия органических кислот растений. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1971. 142 с. 151. Спиридонова Н.С. // Физиология растений. 1965. Т. 12. № 2. С. 340-341. 152. Спиридонова Н.С. Аскорбиновая кислота в растениях. Свердловск: СреднеУральское книжное изд-во, 1968. 80 с. 153. Старцева А.В., Васильева В.Н. // Физиология водообмена и устойчивости раст. Казань, 1972. Вып. 2. С. 74-78. 154. Степанова Ф.П., Самородова-Бианки Г.Б. // Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1981. Т. 70. № 3. С. 94-101. 155. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М., 1975. 423 с. 156. Теренин А.Н. Фотохимия красителей и родственных органических соединений. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1947. 350 с. 157. Толибеков Д.Т. // 4 конф. биохимиков респ. Сред. Азии и Казахстана: Тез. докл. Ашхабад, 1986. С. 307-309. 158. Труфанов А.В. Биохимия в физиология витаминов и антивитаминов. М.: Издво сельхоз. лит-ры, 1959. 654 с. 159. Тульчинская К.С. // Тр. Всесоюз. конф. по витаминам. М., 1940. С. 62-63. 160. Федорова В.С. // Изв. Восточных филиалов АН СССР. 1957. № 7. С. 119-121. 161. Филиппова Л.А., Мамушина Н.С., Зубкова Е.К. и др. // Физиология растений. 1986. Т. 33. № 1. С. 66-73. 162. Франке Г., Хаммер К., Ханельт П. И др. Плоды земли. М.: Мир, 1979. 270 с. 163. Хавкин Э.Е. Формирование метаболических систем в растущих клетках растений. Новосибирск, 1977. 221 с. 164. Христин М.С., Акулова Е.А. // Докл. АН СССР. 1975. Т. 223. № 3. С. 758-761. 165. Христин М.С., Таукелева Ш.Н., Акулова Е.А. и др. // Сельскохозяйственная биология. 1981. Т. 16. № 3. С. 407-411. 166. Чайлахян М.Х. // Докл. АН СССР. 1959. Т. 3. № 4. С.894-897. 167. Чернавина И.А. // Проблемы фотосинтеза: Доклады II Всесоюз. конф. по фотосинтезу. М., 1959. С. 198-203. 168. Чикалова Е.А. // Витамины. Киев, 1959. Вып. 4. С. 206-208. 169. Чиркова Т.В. // Уч. зап. Тартуск. ун-та. 1966. Вып. 185. С. 290-294. 170. Читанова Г.В. // Тр. Сухум. ботан. сада. 1982. № 27. С. 49-56. 171. Чупахина Г.Н. Влияние света различного спектрального состава на биосинтез АК в листьях растений. Дисс... канд. биолог. наук. Томск, 1967. 197 с. 172. Чупахина Г.Н. // Специальный практикум по биохимии и физиологии растений. Калининград, 1981. С. 17-20. 173. Чупахина Г.Н. // Тез. Всесоюз. симпозиума "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе". Пущино, 1985. С. 88-89. 174. Чупахина Г.Н., Немирюк Л.В. // Физиология растений. 1984. Т. 31, № 4. С. 780-783. 175. Чупахина Г.Н., Савкина В.В. // Тез. Всесоюз. конф. "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности". Львов, 1984. С. 70-71.

112

176. Чупахина Г.Н., Свеженцева С.В. // Тез. докл. XXI науч. конф. Калининградского ун-та. Калининград, 1989. С. 105. 177. Чупахина Г.Н., Залящева М.В., Сивцова А.М. // Тез. Всесоюз. конф. "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности". Львов, 1984. С. 69-70. 178. Чупахина Г.Н., Залящева М.В., Сивцова А.М. // Фотосинтез и продуктивность растений. / Отв. ред. М.М. Окунцов. Калининград, 1987. С. 33-39. 179. Чупахина Г.Н., Хлебодарова Т.Л. // Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 117-120. 180. Чупахина Г.Н., Брычева Н.А., Просекова Е.А. // Тр. V Всесоюз. межуниверсит. конф. "Биология клетки". Тбилиси, 1987. Ч. 1. С. 387-388. 181. Чупахина Г.Н., Окунцов М.М., Архипова Н.Д. // Физиология растений. 1978. Т. 25. № 6. С. 1179-1184. 182. Чупахина Г.Н., Христин М.С., Кузнецова Л.Г. // Физиология и биохимия культурных растений. 1985. Т. 17. № 5. С. 444-448. 183. Шатилов И.С., Розов Н.Ф., Клюкова В.А. // Изв. Тимирязевской с.-х. акад. 1973. № 1. С. 9-16. 184. Школьник М.Я., Стеклова М.М. // Тр. Ботан. ин-та АН СССР. 1958. Т. 4. № 12. С. 242-256. 185. Шлык А.А., Аверина Н.Г. // Физиология растений. 1973. Т. 20, № 4. С. 725-732. 186. Шматок Д.И. // Вопросы ботаники и почвоведения в Мурманской области". М.; Л., 1962. С. 82-117. 187. Щербаков Б.И. // Докл. АН СССР. 1949. Т. 66. № 6. С. 1149 - 1152. 188. Юрова Г.Г. Свободная и связанная аскорбиновая кислота в сортах основных плодово-ягодных культур Алтая: Автореф. дис... канд. биолог. наук. Томск, 1964. 23 с. 189. Юзбеков А.К., Магомедов И.М. // Вестн. Ленинград. ун-та. 1981. № 5. Сер. биолог. Вып. 3. С. 91-94. 190. Явигиев Б.Г. Автоматизированный анализ колебательных процессов, возникающих в растениях при колебательном возбуждении их светом. // Биофизика. М., 1987. 31 с. Деп. в ВИНИТИ 12.06.87., № 4292-В87. 191. Ядыкин А.А., Титлянов Э.А. // Биология моря. 1980. № 3. С. 74-79. 192. Aberg B. // Ann. Roy. Agr. Coll. Sweden. 1945. N 13. P. 239-273. 193. Aberg B. // Kgl. lantbrukshogs Kol. ann. 1953. Ann. 20. P. 125-138. 194. Abraham P.G., Dave J.C., Saxena O.P., Pandya R.B. // J. Indian Bot. Soc. 1970. Vol. 49. N 1-4. P. 41-49. 195. Acatrinei G., Acatrinei C. // An. Stiint. Univ. Jasi. 1964. Sec. 2a. Vol. 10. N 1. P. 31-36. 196. Acton G.J., Drumm H., Mohr H. // Planta. 1974. Vol. 121. N 1. P. 39-50. 197. Akao A. // Nihon Univ. Med. J. 1958. Vol. 17. N 9. P. 1689-1699. 198. Aliotta G. // G. bot. ital. 1980. Vol. 114. N 5. P. 217-226. 199. Allen I.F., Hall D. // Biochem. and Biophys. Res. Commus 1973. Vol. 52. N 3. P.856-862. 200. Alscher R.G. // Physiol. plant. 1989. Vol. 77. N 3. P. 457-464. 201. Anderson L.E. // Adv. Bot. Res. 1986. Vol. 12. P. 1-46. 202. Andrews I.E., Roberts D.W.A. // Canad. I. Bot. 1961. Vol. 39. N 3. P 503-512. 203. Arnon D.J., Whatley F.R., Allen M.B. // J. Amer. Chem. Soc. 1954. Vol. 76. N 24. P. 6324-6329. 204. Arnon D.J., Whatley F.R., Allen M.B. // Biochim. Biophys. Acta. 1956. Vol. 20. P.449-461. 113

205. Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis. mat. e natur. 1957. T. 22. N 1. P. 77-84. 206. Arrigoni O., Arrigoni-Liso R., Calabrese G. // Science. 1976. Vol. 194. N 4262. P.332-333. 207. Arrigoni O., Arrigoni-Liso R., Calabrese G. // FEBS Lett. 1977. Vol. 82. N 1. P.135138. 208. Arrigoni O., Zacheo G., Arrigoni-Liso R., B1eve-Zacheo T., Lamberti F. // Phytopathology. 1979. Vol. 69. N 6. P. 579-581. 209. Asselbergs E.A.M. // Plant physiology. 1957. Vol. 32. N 4. P. 326-329. 210. Attridge T.H. // Biochimica et Biophysica Acta. 1974. Vol. 362. N 3. P. 258-265. 211. Bakardjieva N.T. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1977. Vol. 30. N 11 P. 1637-1640. 212. Bakardjieva N.T., Nikolova R. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1988. Vol. 41. N 5. P. 101-104. 213. Bannister T.T. // Plant Physiol. 1959. Vol. 34. N 3. P. 246-254. 214. Bar-Akiva A., Sternbaum J. // Physiol. plantarum. 1966. Vol. 19. N 2. P. 422-428. 215. Barro F., Haba P., Maldonado J.M., Fontes A.G. // J. Plant. Physiol. 1989. Vol. 134. N 5. P. 586-591. 216. Baszynski T. // Zesz. nauk. UJ. Pr. biol. mol. 1982. N 9. P. 47-59. 217. Beig M.M., Kelly S., Loewus F. // Plant Physiol. 1970. Vol. 46. N 2. P. 277-280. 218. Bhatt K.C., Vaishnav P.P., Singh Y.D., Chinoy J.J. // Ann. Bot. 1981. Vol. 47. N 3. P. 321-328. 219. Bienger J., Schopfer P. // Planta. 1970. Bd. 93. N 2. S. 152-159. 220. Bogdanski K.A., Bogdanska H.W. // Bull. Acad. polon. Sci. Ser. Sci. biol. 1962. T.10. N 8. S. 291-296. 221. Bohme H., Trebst A. // Biochim. et biophys. acta. 1969. Vol. 180. N 1. P. 137-148. 222. Bourqe D.P., McMillan P.N., Clingenpeel W.J., Naylor A.W. // Bot. Gaz. 1976. Vol. 137. N 3. P. 279-284. 223. Bufler G., Bangerth F. // Plant Sci. Lett. 1982. Vol. 25. N 2. P. 227-237. 224. Castillo F.J., Celardin F.G.H. // Plant Growth Regul. 1984. Vol. 2. N 2. P. 69-75. 225. Chameldes W.Z. // Enviren. Sci. and Technol. 1989. Vol. 23. N 5. P. 595-600. 226. Chaturvedi N., Laloraya M.M. // Physiol. plant. 1984. Vol. 60. N 3. P. 315-320. 227. Chen Pin-Ching, Arnon D.J. // Physiol. veg. 1983. Vol. 21. N 3. P. 415-427. 228. Chia-Ping H. Yang // Biol. plant. 1982. Vol. 24. N 4. P. 296-302. 229. Chichiricco G., Ceru M.P., D'Alessandro A., Oratore A., Avigliano L. // Plant Sci. 1989. Vol. 64. N 1. P. 61-66. 230. Chinoy J.J., Singh Y.D. // Indian Agr. 1971. Vol. 15. N l-2, P. 33-48. 231. Chinoy J.J., Saxena O.P. // Proc. Jnt. Seed Test. Assoc. 1972. Vol. 37. N 3. P. 903910. 232. Chow W.S., Hachnel W., Anderson J.M. // Physiol. plant. 1987. Vol. 70. N 2. P.196202. 233. Clark W.G. // Bot. Gaz. 1937. Vol. 99. N 1. P. 116-124. 234. Cramer W.A., Whitrmarsh J., Widger W. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980. Abstr. S. 1., s. a. P. 130. 235. Demirovska-Kepova K.N., Bakardjieva N.T., Georgiev G.H., Georgiev H.N., Gechov K.I. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1983. Vol. 36. N 1. P. 125. 236. Dhar A.C., Patel K.R., Shah C.K. // Histochemistry. 1980. Vol. 69. N 1. P. 101-109. 114

237. Dilova S., Popov K. // The Reports of the Bulgarian Academy of Sciences. 1970. Vol. 23. N 6. P. 735-738. 238. Drumm H., Bruning K., Mohr H. // Planta. 1972.. Vol. 106. N 3. P. 259-267. 239. El-Fouly M.M. // Ber. Dtsch. bot. Ges. 1965. Bd. 78. N 11. S. 75-82. 240. Esterbauer H., Grill D., Welt R. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Bd. 98. N 5. S. 393402. 241. Euler H. // Qualitas plant. et mater. veget. 1958. N 3-4. S. 157-160. 242. Filner P., Wray J.L., Vanner J.E. // Science. 1969. Vol. 165. N 3891. P. 358-367. 243. Foyer C., Rowell J., Walker D. // Planta. 1983. Vol. 157. N 3. P. 239-244. 244. Franke W. // Planta. 1955. Bd. 45. N 2. S. 166-197. 245. Franke W. // Ber. Dtsch. bot. Ges. 1957. Bd. 70. N 7. S. 297-304. 246. Franke W. // Planta. 1959. Bd. 53. N 6. S. 551-564. 247. Franke W. // Ber. Dtsch. bot. Ges., Sondernummer. 1964. Bd. 77. S. 143-145. 248. Freebairn H.T. // Physiol. plantarum. 1963. Vol. 16. N 3. P. 517-522. 249. Fuchtbauer W., Simonis W. // Naturwissenschaften. 1958. Vol. 45. N 21. P. 519. 250. Fujimura K., Ikeda S. // Mem. Res. Inst. Food Sci., Kycto Univ. 1957. N 12. P. 3844. 251. Gardestrom P., Bergman A., Ericson I., Sahlstrom S. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980, Abstr. S. L., s. a. P. 199. 252. Garg O.P., Kappor V. // J. Exp. Bot. 1972. Vol. 23. N 76. P. 699-703. 253. Garg O.P., Swaraj K. // Symp. Contr. Mech. Cell. Process., Bombay, 1973. Abstrs. S. L., s. a. P. 67. 254. Gaspar Th. et al. Peroxidases. Geneve, 1982. P. 91-97, 109-112. 255. Geyer R.P., Kydol S., Ryan M. // Arch. Biochem. and Biophys. 1957. Vol. 70. N 1. P. 129-140. 256. Goldberg R., Kevers C., Gaspar T. // Biochem. und Physiol. Pflanz. 1989. Bd. 184. N 1-2. S. 155-161. 257. Gottel W., Hallstein H. // Prax. Naturwiss. Chem. 1980. Bd. 29. N 10. S. 295-304. 258. Grill D., Esterbauer H., Welt R. // Phyton. 1980. Bd. 20. N 3-4. S. 251-259. 259. Grimme L.H., Lorenz E. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980. Abstr. S. L., s. a. P. 228. 260. Grimstad Svein O. // Meld. Norg. landbruns-hogst. 1982. Vol. 61. N 3. P. 1-25. 261. Grise-Miron L., Brakier-Gingras L. // Eur. J. Biochem. 1982. Vol. 123. N 3. P. 643646. 262. Grob. K., Matile P. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Vol. 98. N 3. P. 235-243. 263. Gross E.L. // Arch. Biochem and Biophys. 1979. Vol. 195. N 1. P. 198-204. 264. Gutmanis K. // Tautsaimn. derigi augi. Riga, 1963. N 2. S. 103-112. 265. Haehnel W., Propper A., Krause H. // Biochim. et biophys. acta. 1980. Vol. 593. N 2. P. 384-399. 266. Hagehe Ph. // C. r. Acad. Sci. 1958. Vol. 246. N 13. P. 2020-2023. 267. Hampp R., Goller M., Fullgraf H., Eberble I. // Plant Cell Physiol. 1985. Vol. 26. N 1. P. 99-108. 268. Handell M. A., Mekellar P. // Photochem. and Photobiol. 1968. Vol. 7. N 2. P. 211224. 269. Hasapis X., MacLeod A. J. // Phytochemistry. 1982. Vol. 21. N 2. P. 291-296. 270. Heilinger F., Fischnich O., Breyhan Ò. // Landbauforsch. Volkenrode. 1961. Bd. 11. N 3. S. 63-65. 271. Helsper J. P. F. G., Loewus F. A. // Plant Sci. 1985. Vol. 40. N 2. P. 105-109. 115

272. Helsper J. P. F. G., Saito K., Loewus F. A. // Planta. 1981. Vol. 152. N 2. P. 171176. 273. Helsper J. P., Êàgàn L., Hilby Ñ. L., Maynard Ò. M., Frank A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468. 274. Helsper J. P., Kagan L. H., Coral L., Maynard Ò. M., Loewus F. A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468. 275. Helsper J. P., Kagan L., Hibby Ñ. L., Maynard Ò. M., Frank A. // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. N 2. P. 465-468. 276. Henderson H. M., McEwen Ò. J. // Phytochemistry. 1972. Vol. 11. N 11. P. 31273133. 277. Hendry G. A. F., Houghton J. D., Jones Î. Ò. G. // Biochem. J. 1981. Vol. 196. N 3. P. 825-829. 278. Honda S. I. // Plant Physiol. 1957. Vol. 32. N 1. P. 23-31. 279. Horowitz I., Fabry E. M., Gerson Ñ. D. // Jama. 1976. Vol. 235. N 24. P. 2624-2625. 280. Horvath I., Feher I. V. // Acta bot. Acad. scient. hung. 1965. Vol. 11. N 1-2. P. 159164. 281. Huystee R. Â. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1987. Vol. 38. P. 205-219. 282. Isherwood F. A., Mapson L. W. // Annals of the New York Academy of Sciences. 1961. Vol. 92. N 1. P. 6-20. 283. Isherwood F. A., Chen Y. Ò., Mapson L. W. // Biochem. J. 1954. Vol. 56. N 1. P. 115. 284. lzumi H., Tatsumi Y., Murata T. // J. Jap-2 Soc. Food Sci. and Technol. 1984. Vol. 31. N 11. P. 704-709. 285. Jabben M., Gerald F. D. // Photochem. and Photobiol. 1978. Vol. 27. N 6. P. 799802. 286. Jablonski P. P., Anderson J. W. // Plant Physiol. 1981. Vol. 67. N 6. P. 1239-1244. 287. Jackson G. A. D., Wood R. B., Prosser M. V. // Nature. 1961. Vol. 191. N 4785. P.282-283. 288. Jain S. C., Nag T. N., Mohan S., Pushpa K. // Sci. and Cult. 1975. Vol. 41. N 6. P.292-293. 289. Jensen W. A., Kavaljian L. G. // J. Biophys. and Biochem. Cytology. 1956. Vol. 2. N 1. P. 87-92. 290. Jia Jing-Luan // J. Electron. Microsc. 1987. Vol. 35. N 4. P. 3279-3280. 291. Joshi A. K., Sharma N. S., Rathore K. S., Vaishnav P. P., Singh Y. D. // Biochem. und Physiol. Pflanz. 1980. Bd. 175. N 3. S. 208-215. 292. Kalt-Torres M., Burke J. J., Anderson J. M. // Physiol plant. 1984. Vol. 61. N 2. P.271-278. 293. Kenis J. D., Morlans J. D., Trippi V. S. // Physiol. Plant. 1989. Vol. 76. N 2. P. 216220. 294. Keul M. // Z. Pflanzenphysiol. 1976. Bd. 79. N 1. S. 40-52. 295. Khanna P., Khanna R., Sharma M. // Indian Exp. Riol. 1978. Vol. 16. N 1. P. 110112. 296. Klein R. M. //Plant Physiol. 1979. Vol. 63. N 1. P. 114-116. 297. Krstic B., Saric M. // Acta biol. et med. exp. 1986. Vol. 11. N 1. P. 29-34. 298. Kurihara K., Sukigara M., Toyoshima Y. // Biochim. et biophys. acta. 1979. Vol. 547. N 1. P. 117-126. 299. Lazarovits G., Singh B. // Can. J. Bot. 1986. Vol. 64. N 8. P. 1675-1681. 300. Lee A. // Bull. Torrey Bot. Clud. 1955. Vol. 82. N 1. P. 1-8. 116

301. Lien S., San Pietro A. // Arch. Biochem. and Biophys. 1979. Vol. 194. N 1. P. 128137. 302. Lino M., Carr D.J. // Plant Sci. Lett. 1981. Vol. 23. N 3. P. 263-268. 303. Liso R., Calabrese G., Chieppa M. //Phycologia. 1978. Vol. 17. N 2. P. 143-147. 304. Loewus F.A. // Annals of the New York Academy of Sciences. 1961. Vol. 92. N 1. P. 57-78. 305. Loewus F.A. // Phytochemistry. 1963. Vol. 2. P. 109-128. 306. Loewus F.A. // The biochemistry of Plants: In 8 vol. - N.Y. a. o., 1980. Vol. 3. Ch. 3. P. 77-99. 307. Loewus F.A., Baig M.M. // Methods Ensymol. 1970. Vol. 18. P. 22-29. 308. Loewus F.A., Jang R. // Biochim. et biophys. Acta. 1957. Vol. 23. N 1. P. 205-206. 309. Loewus F.A., Jang R. // J. Biol. Chem. 1958. Vol. 232. N 1. P. 505-519, 521-532. 310. Loweus F.A., Jang R., Seegmiller C.G. // J. Biol. Chem. 1958. Vol. 232. N 1. P. 533-541. 311. Loewus F.A., Finkle B.I., Jang R. // Biochim. et biophys. acta. 1958. Vol. 30. N 3. P.629-635. 312. Loewus F.A., Jang R., Seegmiller C.G. // J. Biol. Chem. 1956. Vol. 222. N 2. P. 649-664. 313. Luger H. // Protoplasma. 1954. Vol. 44. N 2. P. 212-238. 314. Lyman H., Kaufman L. // 5th Int. Congr. Photosynth., Halkidiki, 1980. Abstr. S. L., s. a., P. 355. 315. Makovkova O., Sindelar L. // Biol. plant. Acad. Sci. bohemosl. 1975. T. 17. N 5. S.329-334. 316. Makower R.U. // Plant Physiol. 1964. Vol. 39. N 4. P. 520-522. 317. Malavolta E., Leme I., Gurgel I.T.A., Sobro I.S. // Nature. 1956. Vol. 178. N 4530. P. 424. 318. Malipiero U., Ruffner H.P., Rast D.M. // J. Plant Physiol. 1987. Vol. 129. N 1-2. P.33-40. 319. Mancinelli A.L., Ku (Thi) P.K., Susinno R. // Photochem. Photobiol. 1974. Vol. 20. P. 71-79. 320. Mancinelli A.L., Yang Chia-Ping, Lindquist P., Anderson O.R., Rabino I. // Plant Physiol. 1975. Vol. 55. N 2. P. 251-257. 321. Mancinelli A.L., Yang Chia-Ping H., Rabino I., Kuzmanoff K.M. // Plant Physiol. 1976. Vol. 58. N 2. P. 214-217. 322. Mao Liang // Acta nutr. sinica. 1957. Vol. 2. N 3. P. 206-210. 323. Mapson L.W. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1961. Vol. 92. N 1. P. 21-35. 324. Mapson L.W. // Biochem. J. 1962. Vol. 85. N 2. P. 360-369. 325. Mapson L.W. // Phytochemistry. 1964. Vol. 3. N 3. P. 429-445. 326. Mapson L.W., Burton W.G. // Biochem. J. 1962. Vol. 82. N 1. P. 19-25. 327. Mapson L.W., Isherwood F.A. // Biochem J. 1956. Vol. 64. N 1. P. 13-22. 328. Mapson L.W., Moustafa E.M. // Biochem. J. 1956. Vol. 62. N 2. P. 248-259. 329. Mapson L.W., Swain T. // Phytochemistry. 1966. Vol. 5. N 5. P. 829-853. 330. Di Marco G., D'Ambrosio N., Giardi M.T., Massacci A., Tricoli D. // Photosynth. Res. 1989. Vol. 21. N 2. P. 117-122. 331. Maroc J., Garnier J. // Plant and Cell Physiol. 1979. Vol. 20. N 6. P. 1029-1040. 332. Marre E., Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1955. Vol. 19. N 5. P. 320-324. 333. Marre E., Arrigoni O. // Biochim. et biophys. acta. 1958. Vol. 30. N 3. P. 453-457. 117

334. Marre E., Landi G. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1956. Vol. 20. N 1. P. 77 - 82. 335. Marre E., Arrigoni O., Rossi G. // Biochim. et biophys. acta. 1959. Vol. 36. N 1. P.56-64. 336. Marre E., Laudi G., Arrigoni O. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1955 (1956) . Vol. 19. N 6. P. 460-465. 337. Martinez-Cayuela M., Rodriguez-Vico F., Faus M.J., Gil A. // J. Plant Physiol. 1989. Vol. 133. N 6. P. 660-663. 338. Mathew T., Dave J.C., Gaur B.K. // Z. Pflanzenphysiol. 1978. Vol. 90. N 5. P. 391396. 339. Mehner H., Franke W. // Planta. 1960. Bd. 54. N 6. S. 604-610. 340. Mertz D. // Plant Physiol. 1964. Vol. 39. N 3. P. 398-401. 341. Ming-Ching Yu C., Brand J.J. // Biochim. et biophys. acta. 1980. Vol. 591. N 2. P. 483-487. 342. Mirimanoff M.A. // Compt. Rend. Acad. Sci. 1938. Vol. 206. N 766. P. 1038-1040. 343. Mitsui A., Ohta T. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 1. P. 31-34. 344. Mitsui A., Oi Y. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 2. P. 99-104. 345. Moller J., Poucke M. // Phytochemistry. 1970. Vol. 9. N 9. P. 1803-1805. 346. Morimura Y., Aoki J., Aimi R. // Cэйбуцу конке mecэцу, Environ. Contr. Biol. 1982. Vol. 20. N 2-3. P. 53-56. 347. Naik M.S., Nicholas J.D. // Plant Cell Repts. 1986. Vol. 5. N 4. P. 259-261. 348. Nakatani M. // Bull. Agric. Chem. Soc. Japan. 1958. Vol. 22. N 4. P. 261-267. 349. Nasrulhag-Boyce A., Jones O.T.G. // Phytochemistry. 1981. Vol. 20. N 6. P. 11971199. 350. Nath M.C., Belkhode M.L. // Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med. 1958. Vol. 99. N 2. P. 544-546. 351. Niva, Katajama // Japan J. Nutrition. 1955. Vol. 12. N 5-6. P. 44-46. 352. Noor S.M., Ehrenberg L., Naslund M. // Environ. and Exp. Bot. 1980. Vol. 20. N 4. P. 379-387. 353. Oelmuller R., Mohr H. // Plant, Cell and Environ. 1985. Vol. 8. N 1. P. 27-31. 354. Olsen L.F., Cox R.P. // Eur. J. Biochem. 1979. Vol. 102. N 1. P. 139-145. 355. Olsen L.F., Cox R.P., Barber J. // FEBS Lett. 1980. Vol. 122. N 1. P. 13-16. 356. Ornstein L. // Enzyme Analysis. Canalco. 1963. P. 8. 357. Palmieri S., Giovinazzi F. // Physiol. plant. 1982. Vol. 56. N 1. P. 1-5. 358. Pazurkiewicz-Kocot K. // Pr. nauk. USL. Katowicach: Acta biol. 1984. N 16. S. 96103. 359. Penel C., Greppin H. // Saussurea. 1975. N 6. P. 287-291. 360. Peter K., Mohr H. // Z. Naturforsch. 1974. 29C. N 5-6. P. 222-228. 361. Pihakaski S., Pihakaski K. // J. Exp. Bot. 1978. Vol. 29. N 113. P. 1363-1369. 362. Pirson A., Zimmermann M.H. Encyclopedia of Plant Physiology. Berlin, Heidelberg New York, Tokyo, 1985. Vol. 18. 522 p. 363. Pospisilova I., Toul V. // Vedec. prace Vyzkumn. ustavu zelinar. Olomouci. 1963. N 2. S. 119-136. 364. Poucke M., Barthe F., Mohr H. // Naturwissenschaften. 1969. Vol. 56. P. 417. 365. Prabha C., Bharti S. // Indian. J. Plant Physiol. 1980. Vol. 23. N 3. P. 317-318. 366. Provasoli L., Hutner S.H., Schatz A. // Proc. Soc. Exp. Biol. 1948. Vol. 69. P. 279282. 367. Quetier F., Lejeune B. // C. R. Acad. agr. France. 1982. T. 68. N 11. P. 826-833. 118

368. Rao J.V.S., Rao G.R., Krishna C.M., Rao G.G. // Comp. Physiol. Ecol. 1979. Vol. 4. N 4. P. 243-245. 369. Rathore H.S., Chauhan R.A.S., Shukla R.M. // Indian. J. Exp. Biol. 1981. Vol. 19. N 3. P. 289-290. 370. Rau W., Schrott E.L. // Photochem. and Photobiol. 1979. Vol. 30. N 6. P. 755-765. 371. Ray S.N. // Biochem. J. 1934. Vol. 28. N 3. P. 996-1003. 372. Recalde L., Blesa A.C. // An. edafol. y agrobiol. 1961. Vol. 20. N 3. P. 119-128. 373. Reddy K.P., Subhani S.M., Khan P.A., Kumar K.B. // Plant and Cell Physiol. 1985. Vol. 26. N 6. P. 987-994. 374. Reid M. // Amer. J. Bot. 1938. Vol. 25. N 11. P. 701-711. 375. Reid M. // Science. 1939. Vol. 89. N 2321. P. 587. 376. Renger G. // Biochim. et biophys. acta. 1979. Vol. 547. N l. P. 103-116. 377. Rode H.R. // Planta. 1961. Vol. 57. N 2. P. 138-155. 378. Rudolph E., Bukatsch F. // Planta. 1966. Bd. 69. N 2. S. 124-134 379. Ruge U. // Naturwissenschaften. 1957. Bd. 44. N 1. S. 13-14. 380. Ruyters G. Blue Light Effects in Biological Systems. Berlin e. a., 1984. S. 283-301. 381. Saito K., Kasai Z. // Plant and Cell Physiol. 1982. Vol. 32. N 3. P. 499-507. 382. Saito K., Kasai Z. // Plant Physiol. 1984. Vol. 76. N l. P. 170-174. 383. Saito K., Loewus F.A. // Plant and Cell Physiol. 1979. Vol. 20. N 8. P. 1481-1488. 384. Samuelsson G., Oquist G. // Plant and Cell Physiol. 1980. Vol. 21. N 3. P. 445-454. 385. Sandan T. // Bot. Mag. Tokyo. 1958. Vol. 71. N 838. P. 159-163. 386. Sandmann G., Boger P. // Planta. 1980. Vol. 147. N 4. P. 330-334. 387. Saric M.R., Krstic B., Milivojevic D. // 5th Int. Congr. Photosynth. Halkidiki, 1980. Abstr. S. L., s. a. P. 498. 388. Sastry K., Sivarama P.S. // Biochem. J. 1956. Vol. 62. N 3. P. 451-455. 389. Savaprakasam K., Soumini Rajagopalan C.K., Vidhyasekaran P. // Madras Aqr. J. 1974. Vol. 61. N 3-4. P. 86-87. 390. Schmorl K. // Starke. 1957 (1958) . Bd. 9. N 12. S. 250-252. 391. Schopfer P. // Planta. 1966. Bd. 69. N 2. S. 158-177. 392. Schopfer P. // Planta. 1967. Bd. 74. N 3. S. 210-227. 393. Schreven D.A. // Plant and Soil. 1956. Vol. 8. N 2. P. 87-94. 394. Schwarz H., Schneider H.A.W. // J. Plant Physiol. 1985. Vol. 119. N 3. P. 281-284. 395. Schwerdt P.R. // Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 1975. Vol. 148. N 4. P. 1237-1243. 396. Severi A., Laudi G. // G. bot. ital. 1976. Vol. 110. N 3. P. 231-239. 397. Shaaltiel Y., Gressel J. // Pesticide Science and Biotechnology. Israel, 1987. P. 183186. 398. Shah C.K., Bhatt P.N., Suthar H.K. // Biol. Pflanz. 1974. Vol. 50. N 1. P. 121-135. 399. Sharma R., Riswal U.C. // Z. Pflanzenphysiol. 1976. Vol. 78. N 2. P. 169-172. 400. Sharma V.K., Singh R.P., Dua K.L. // Sci. and Cult. 1975. Vol. 41. N 8. P. 383-385. 401. Sharma R., Sopory S.K., Guha-Mukherjee S. // Plant Sci. Lett. 1976. Vol. 6. N 1. P.69-75. 402. Shigeoka S. // Vitamins. 1981. Vol. 55. N 3. P. 127-140. 403. Shigeoka S., Nakano V., Kitaoka S. // Biochem. J. 1980. Vol. 186. N 1. P. 377-380. 404. Shigeoka S., Yokota A., Nakano Y., Kitaoka S. // Agric. Biol. Chem. 1979. Vol. 43. N 10. P. 2053-2058. 405. Shizunori I. // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 3. P. 291-299. 406. Singh B.B. // Radiat. Bot. 1974. Vol. 14. N 3. P. 195-199. 407. Skrabka H. // Acta. Soc. bot. Polon. 1965. T. 34. N 3. S. 479-490. 408. Skrabka H. // Acta. Soc. bot. Polon. 1965. T. 34. N 4. S. 713-718. 119

409. Smith I.K., Vierheller T.L., Thorne C.A. // Physiol. Plant. 1989. Vol. 77. N 3. P.449456. 410. Soler A., Murcia L., Sabater F. // Rev. esp. fisiol. 1965. Vol. 24. N 4. P. 133-138. 411. Somerville C.R. // Annu. Rev. Plant Physiol. Vol. 37. Palo Alto, Calif., 1986. P. 467-507. 412. Srivastava G.C., Sirohi G.S. // Jndian. J. Exp. Biol. 1973. Vol. 11. N 5. P. 470-471. 413. Sugawara T. // Japanese Journal of botany. 1939. Vol. 10. N 1-2. P. 87-95. 414. Sugawara T. // Jap. J. Bot. 1939. Vol. 10. N 3. P. 171-185. 415. Sugawara T. // Japan. J. Bot. 1955. Vol. 15. N 1. P. 10-14. 416. Sugimura Y., Hoshino T., Karahashi A., Yoshizaki F., Shimokorijama M. // Proc. Jap. Acad. 1983. Vol. B59. N 9. P. 300-303. 417. Suranyi D. // Acta. agron. Acad. Sci. hung. 1974. Vol. 23. N 1-2. P. 101-106. 418. Suzuki Yonezo, Ogiso Kazuko. // Physiol. plant. 1973. Vol. 29. N 2. P. 169-172. 419. Suzuki E., Ohnishi J., Kashiwagi M., Kanai R. // Plant and Cell Physiol. 1986. Vol. 27. N 6. P. 1117-1125. 420. Tai Phang-C., Wallace B., Davis B.D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75. N 1. P. 275-279. 421. Tajiri Takashi // J. Jap. Soc. Food Sci. and Technol. 1981. Vol. 28. N 8. P. 430-436. 422. Takabe T., Niwa S., Ishikawa H., Miyakawa M. // J. Biochem. 1980. Vol. 87. N 1. P.111-115. 423. Takaki M., Sartori P.A.A. // Arg. biol. e technol. 1987. Vol. 30. N 3. P. 431-435. 424. Tayal M.S. // J. Indian Bot. Soc. 1972. Vol. 51. N 3-4. P. 223-226. 425. Teruhiro T., Satsuki N., Hiroshi I., Masako M. // J. Biochem. 1980. Vol. 87. N l. P.111-115. 426. Tewary B.K., Mookerjee A. // Indian J. Plant Physiol. 1982. Vol. 25. N 3. P. 258265. 427. Thangamani A., Sarma P.S. // J. Scient. and Industr. Res. 1956. Vol. 15. N 7. P. 157160. 428. Tognoli L., Marre E. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e. natur. 1959. Vol. 26. N 2. P. 278-283. 429. Tommasi F., De Gara L., Liso R., Arrigoni O. // Boll. Soc. ital. biol. sper. 1987. Vol. 63. N 9. P. 779-786. 430. Tomma F., De Gara L., Liso R., Arrigoni O. // J. Plant Physiol. 1990. Vol. 135. N 6. P. 766-768. 431. Tonzig S., Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1954. T. 16. N 4. P. 434-443. 432. Tonzig S., Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1954 (1955) . T. 17. N 6. P. 324-331. 433. Tonzig S., Trezzi F. // Rapp. et communs. Nuitieme Congr. internat. bot., Paris. 1954. Sec. 11-12. P. 157-158. 434. Trezzi F. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1956. Vol. 21. N 3-4. P. 220-228. 435. Trezzi F. // Nuovo giorn. bot. ital. 1956. T. 63. N 2-3. P. 345-354. 436. Tua C., Marre E. // Atti Accad. naz. Lincei. Rend. Cl. Sci. fis., mat. e natur. 1960. T. 28. N 6. P. 910-916. 437. Uzumi H., Tatsumi V., Murata T. // J. Jap. Soc. Food Sci. and Technol. 1984. Vol. 31. N 11. P. 704-709.

120

438. Vallon O., Hoyer-Hansen G., Simpson D.J. // Carlsberg Res. Commun. 1987. Vol. 52. N 6. P. 405-421. 439. Van'Lelyvela L.J. // Agroplantae. 1975. Vol. 7. N 3. P. 45-50. 440. Vaughn K.C., Lax A.R., Duke S.O. // Physiol. plant. 1988. Vol. 72. N 3. P. 659-665. 441. Vicente C., Garcia I. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 100. N 1. P. 17-22. 442. Vidhyasekaran P., Sivaprakasam K., Padmanabhan D. // Labdev J. Sci. and Technol. 1972. Vol. B 10. N 3-4. P. 120-122. 443. Vittoria A. // Boll. Soc. ital. biol. sperim. 1955. Vol. 31. N 6. P. 601-605. 444. Vos N.I. // Voeding. 1957. Vol. 18. N 2. P. 133-142. 445. Wagner G., Loewus F.A. // Plant Physiol. 1974. Vol. 54. N 5. P. 784-787. 446. Wasichy R. // Scientia pharmac. 1958. Bd. 26. N 2. S. 100-103. 447. Whitmarsh J., Cramer W.A. // Biophys. J. 1979. Vol. 26. N 2. P. 223-234. 448. Williams M., Saito K., Loewus F.A. // Phytochemistry. 1979. Vol. 18. N 6. P. 953956. 449. Wonger B. V. // Radiat. Bot. 1973. Vol. 13. N 6. P. 375-379. 450. Yamafuji K., Nakamura G., Omura A., Soeda T., Yyotoku K. // Z. Krebsforsci. 1971. Vol. 76. N 11. P. 1-7. 451. Yamazaki I. // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237. N 1. P. 242-247. 452. Yamazaki I., Piette L.H. // Biochim. et Biophys. Acta. 1961. Vol. 50. N 1. P. 62-69. 453. Yang J.C., Loewus F.A. // Plant Physiol. 1975. Vol. 56. N 2. P. 283-285. 454. Zucker M. // Annual Review Plant Physiol. 1972. Vol. 23. P. 133-156. 455. Гинс В.К., Гусейнова Т.И., Гамбарова Н.Т. // Тез. докл. III съезда Всерос. общва физиологов растений. СПб., 1993. С. 532. 456. Кефели В.И. Физиологические основы конструирования габитуса растений. М.: Наука, 1994. 269 с. 457. Матвеева Н.М., Срослова А.А. Тез. докл. III Междунар. конф. “Регуляторы роста и развития растений”. М., 1995. С.190. 458. Polle A., Eiblmeier M. // Bot. Acta. 1995. Vol. 108. N 5. P. 403-466. 459. Polle A., Wieser Y., Havranek W.M. // Plant, Cell and Enviroment. 1995. Vol. 18. P. 681-688. 460. Polle A. // Planta. 1996. Vol. 198. P. 253-262. 461. Schwanz P., Picon C., Vivin P. and oth. Plant Physiol. 1996. Vol. 110. P. 393-402.

121

ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ...............................................................................................................

3

Список сокращений ..............................................................................................

5

Глава 1. Кислоты и ферменты системы аскорбиновой кислоты ........................

6

Глава 2. Физиологическая роль аскорбиновой кислоты в жизни автотрофных организмов ...................................................................... 2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений ................................................................................................ 2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность, водный режим, ростовые и другие процессы ................. 2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты ......................................... Глава 3. Биосинтез аскорбиновой кислоты и ее дериватов ............................... 3.1. Субстраты для новообразования аскорбата ......................................... 3.2. Химизм биосинтеза ............................................................................... 3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот .............................. Глава 4. Действие полихроматического и монохроматического света на биосинтез кислот системы аскорбиновой кислоты ......................... 4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты в зеленых и этиолированных проростках ............................................................. 4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов ..................................... 4.3. Исследование способности альбиносных проростков накапливать аскорбиновую кислоту на свету .......................................................... 4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты и ее окисленных форм в связи с освещением ............................................. 4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты ......................................................................... Глава 5. Альбиносные проростки как модель для исследования светозависимых процессов, не связанных с фотосинтезом ................

10 10 13 16 18 18 26 30 38 38 54 55 64 71 75

Глава 6. Образование аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот при ингибировании дыхания и отдельных его этапов .........................................................................

79

Глава 7. Фоторегуляция активности ферментов, окисляющих аскорбиновую кислоту ..........................................................................

85

Заключение ...........................................................................................................

101

Библиографический список .................................................................................

104

122