МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИ...
65 downloads
359 Views
1MB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
А. Г. Курегян, С. В. Печинский
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В АНАЛИЗЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Учебное пособие Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для обучающихся по основным профессиональным образовательным программам высшего образования – программам специалитета по специальности «Фармация»
Издательство ВолгГМУ Волгоград 2017
УДК 615.2/.3.074:543.544.1(075.8) ББК 24.46:52.8 КС № 540/05.05-20 от 30.12.2014 г. К 93
Р е ц е н з е н т ы: заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет» д-р фарм. наук, профессор А. И. Сливкин; заведующий кафедрой фармации Уральского государственного медицинского университета д-р фарм. наук, профессор А. Ю. Петров
Печатается по решению ЦМК Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ФГБОУ ВО Волгоградского государственного медицинского университета МЗ РФ
К 93
Курегян, А. Г. Хроматографические методы в анализе лекарственных средств: учебное пособие / А. Г. Курегян, С. В. Печинский. – Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ. – Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2017. – 80 с. ISBN 978-5-9652-0474-8 Учебное пособие «Хроматографические методы в анализе лекарственных средств» предназначено для студентов, обучающихся по специальности высшего образования «Фармация». В пособии рассматриваются основные теоретические основы хроматографических методов, в частности, ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ. Пособие содержит тестовые задания, примеры решения задач, ситуационные задачи. УДК 615.2/.3.074:543.544.1(075.8) ББК 24.46:52.8
ISBN 978-5-9652-0474-8
© Волгоградский государственный медицинский университет, 2017 © Издательство ВолгГМУ, 2017
2
СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………..
5
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИИ……..…………… СУЩНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА…………………… КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ…………… Примеры классификации по механизму разделения веществ (по различию в характере взаимодействия разделяемых компонентов с неподвижной фазой) ……………………………….. Классификация по агрегатному состоянию фаз…………………… Классификация хроматографических методов по технике эксперимента…………………………………………………….…… Классификация по способу относительного перемещения фаз (по способу получения хроматограмм)………………………..…… ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (хроматография в тонком слое сорбента – ТСХ)………………………………………………… ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ТЕРМИНЫ ТСХ……………………….….. ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА ТСХ……………………………………. ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ (ГЖХ) И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ВЭЖХ)…………………………. Стратегия выбора метода хроматографирования…….……………. ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ В КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ………………………………………………….…. Первичные параметры удерживания………………………….……. Приведенные (исправленные) параметры удерживания………….. Относительные параметры удерживания…………………………... ПАРАМЕТРЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ………..…… Параметры эффективности…………………………………….……. Параметры селективности………………………………….….……. Степень разделения……………………………………………..…… АППАРАТУРНАЯ СХЕМА ДЛЯ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ………... АППАРАТУРНАЯ СХЕМА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ…...
7 9 11
3
12 12 13 13 14 14 16 19 19 23 23 24 25 27 27 28 29 30 32
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДАМИ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.................................................................................. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ В КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ…………………………………………………….. Метод нормирования (метод внутренней нормализации)…..…….. Метод внутреннего стандарта……………………………...……….. Метод внешнего стандарта…………………………….……………. Метод стандартных добавок ………………………………………..
34 35 36 37 38 38
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ …………………………………………… 40 ПРИМЕРЫ РЕШЕНИЯ СИТУАЦИОННЫХ ЗАДАЧ………… СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ …………………………………….
53 57
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА……………………………. ОТВЕТЫ К ТЕСТОВЫМ ЗАДАНИЯМ …………………………
76 77
4
Посвящается светлой памяти Клочкова Сергея Владимировича, Цыбулиной Маргариты Геннадиевны, Клочковой Виктории
ВВЕДЕНИЕ Одной из важных задач современной химии является анализ органических веществ, часто близких по строению, следовательно, и по химическим свойствам. Без решения этой проблемы становится невозможным проведение многих химических, биохимических и медицинских исследований. Фармацевтическая, химическая, медицинская и криминалистическая экспертизы, а также экологические методы анализа окружающей среды и многие отрасли народного хозяйства в значительной степени базируются на предварительном разделении компонентов смеси. На современном этапе развития фармацевтической отрасли хроматография является самым распространенным и совершенным методом разделения, позволяющим одновременно проводить как качественный, так и количественный анализ сложных многокомпонентных смесей. Практически не существует смеси лекарственных средств, вспомогательных веществ, которые невозможно было бы разделить, идентифицировать и определить количественно, используя один или несколько хроматографических методов. Среди задач, которые могут быть решены с помощью хроматографических методов, основными являются: разделение смесей веществ на индивидуальные составляющие; проведение качественного и количественного анализа многокомпонентных объектов; 5
концентрирование веществ из очень разбавленных растворов; очистка технических продуктов, т. е. доведение этих продуктов до заданной степени химической чистоты; подтверждение структуры веществ. В зависимости от цели исследования аналитик может выбрать тот или иной хроматографический метод. Для успешного достижения поставленной цели необходимо разработать стратегию исследования, правильно подобрать условия анализа, подготовить пробу, выполнить эксперимент и интерпретировать полученные результаты, что невозможно без четкого понимания теоретических основ аналитического метода. Кроме того, выполнение фармакопейного анализа – воспроизведение методик анализа лекарственных средств и вынесение заключения – также требует определенной теоретической подготовки в области хроматографии. Пособие содержит практически все методические варианты использования хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), газо-жидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в фармацевтическом анализе. Настоящее пособие позволит закрепить уже полученные знания в области аналитической хроматографии и приобрести новые теоретические знания и практический навык фармакопейного анализа различных групп лекарственных средств с использованием методов ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ.
6
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИИ Возникновение хроматографии как науки относят к 1903 г. 21 марта 1903 г. Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, представил свой доклад «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу». С помощью хроматографического метода ученому удалось разделить хлорофилл на составляющие окрашенные вещества. При пропускании экстракта хлорофилла через колонку, заполненную порошком мела, и промывании петролейным эфиром М. С. Цвет получил несколько окрашенных зон и назвал эти зоны хроматограммой (от греческого «хроматос» – цвет), а метод – хроматографией. Впоследствии оказалось, что в этой работе впервые были изложены основы хроматографического метода. По многим субъективным и объективным причинам хроматография мало использовалась почти три последующих десятилетия. В 1938 г. в Харьковском химико-фармацевтическом институте Н. А. Измайлов и М. С. Шрайбер разработали основы метода хроматографии в тонком слое. В 1940 г. А. Мартин и Д. Синг впервые предложили вариант жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве подвижной фазы. Тогда же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ. В 1952 г. за открытие распределительного варианта хроматографии А. Мартин и Д. Синг были награждены Нобелевской премией. 7
Далее в 1952–1953 гг. А. Мартином и Д. Сингом был предложен вариант газовой распределительной хроматографии. Исключительное значение для дальнейшего развития хроматографии имело создание в 1956 г. М. Голеем варианта капиллярной газовой хроматографии. С середины 70-х годов ХХ века начинается период интенсивного развития высокоэффективной жидкостной хроматографии. К середине 80-х годов ХХ века широко была использована флюидная хроматография и выполнена практически полная компьютеризация хроматографического процесса. Из достижений отечественных ученых в теории и практике хроматографии необходимо отметить разработку теории внешнего массообмена (А. А. Жуховицкий, А. Н. Тихонов, Я. Б. Забежинский, 1945 г.); вывод уравнения Ван-Деемтера с учетом внешнего массообмена (А. А. Жуховицкий); термодинамическую интерпретацию удерживаемого объема в газовой хроматографии (В. А. Даванков); создание теории и практики препаративной хроматографии биологически активных амфотерных соединений (Г. В. Самсонов, 1952 г.), а также хиральной хроматографии (В. А. Даванков, 1968–1970 гг.); исследование катализа методом хроматографии (С. З. Рогинский, М. И. Яновский, 1972 г.); открытие жидкостногазовой хроматографии (Л. Н. Москвин, А. И. Горшков, 1982– 1983 гг.); создание эксклюзионной хроматографии вирусов (В. М. Коликов, Б. В. Мчедлишвилли, 1990 г.). Отечественные исследователи внесли вклад в развитие теории хирального распознавания в энантиоселективной хроматографии (В. А. Даванков), теории нелинейной хроматографии (Ю. Я. Лебедев), в разработку методов анализа микропримесей с помощью газовой хроматографии с использованием масс-спектрометров (И. А. Ревельский, 1976 г.), в расширение возможностей ионной и ион-парной хроматографии (Ю. А. Золотов, О. А. Шпигун, 1982 г.), в измерение и расчет обобщенных (линейно-логарифмических) индексов удерживания в обращенно-фазной ВЭЖХ для лекарственных средств различной природы (И. Г. Зенкевич). Хроматографический анализ является фармакопейным методом анализа. В общей фармакопейной статье «Хроматография» в Государственную фармакопею Х были включены только ионообменная, бумажная и тонкослойная (ТСХ) виды хроматографии. 8
В общей фармакопейной статье «Хроматография» ГФ XI включены разделы с общими положениями по ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ. ГФ XIII РФ содержит ОФС «Хроматография», «Хроматография на бумаге», «Тонкослойная хроматография», «Газовая хроматография», «Высокоэффективная жидкостная хроматография» и «Сверхкритическая флюидная хроматография».
СУЩНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА С необходимостью разделения смеси веществ на составляющие ее компоненты приходится сталкиваться специалистам различных отраслей производства. Разделение смеси не вызывает какихлибо трудностей, если ее компоненты находятся в различных фазах, решение задачи по разделению существенно осложняется, если компоненты смеси образуют одну фазу. В этом случае приходится или изменять агрегатное состояние отдельных компонентов, или применять химические и физико-химические методы разделения. Такие широко известные методы разделения, как дистилляция, кристаллизация, экстракция и адсорбция основаны на изменении фазовых равновесий. В этих процессах молекулы веществ, образующих смесь, переходят через границу раздела, стремясь к такому распределению между фазами, при котором в каждой из них устанавливается постоянная равновесная концентрация. Если разделение смеси производить в системах, в которых одна из фаз (подвижная) перемещается относительно другой (неподвижной), то улавливание и удаление молекул, покидающих поверхность раздела фаз, осуществляются благодаря постоянному перемещению подвижной фазы. Как и при фазовом равновесии, молекулы, выходящие из подвижной фазы, возвращаются в нее, попадая не в прежний элемент ее объема, а в новый. Таким образом, в любом варианте хроматографических методов используют сочетание неподвижной (стационарной) фазы (НФ) и подвижной фазы (ПФ). При введении в колонку веществ происходит непрерывный обмен молекулами между неподвижной и подвижной фазами. При этом каждая молекула часть времени находится в адсорбированном состоянии, а часть времени в подвижной фазе, двигаясь 9
с той же скоростью, что и эта фаза. Подвижная фаза перемещается вдоль неподвижной, в результате этого частицы разделяемых веществ, переносимые вместе с подвижной фазой, могут многократно переходить из подвижной фазы в неподвижную и наоборот. Коэффициент распределения (К) отражает степень распределения хроматографируемого компонента между подвижной и неподвижной фазами: С ( НФ) , (1) К С ( ПФ) где С(НФ) – содержание данного компонента в неподвижной фазе, г/мл; С(ПФ) – содержание данного компонента в подвижной фазе, г/мл. Если в процессе разделения фазовые переходы повторять многократно, то можно получить высокую эффективность разделения. Таким образом, разделение веществ с помощью хроматографирования основано на различном сродстве разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам. Это приводит к различию в скоростях движения частиц разделяемых компонентов в подвижной фазе относительно неподвижной фазы и в конечном итоге – к разделению веществ. Например, если провести разделение компонентов смеси А, Б и С и при этом предположить, что наибольшим сродством к неподвижной фазе обладает вещество А, наименьшим – С, а компонент Б занимает промежуточное положение, то из всех компонентов прочнее всего на неподвижной фазе удерживается компонент А (рис. 1).
Рис. 1. Схема хроматографического разделения компонентов смеси
10
Наименьшее удержание на неподвижной фазе будет характерно для вещества С. Разделение компонентов смеси А, Б, С проявляется в виде последовательного выхода веществ из колонки или образования видимых зон адсорбции (пятен) на различных уровнях на неколоночном носителе. Способность хроматографической системы делить данную пару соединений определяют как селективность. Роль хроматографической системы сводится к тому, чтобы обеспечить различную хроматографическую подвижность компонентов смеси. Чем больше различие в этом показателе, тем больше расстояние между максимумами пиков или пятнами на хроматографической пластине, тем лучше их разделение. Хроматография – это физико-химический метод анализа веществ и их смесей, основанный на дифференциальной миграции, т. е. различной скорости перемещения молекул веществ относительно неподвижной фазы с током подвижной фазы. Для проведения хроматографического разделения компонентов смеси необходимо соблюдение следующих условий: 1) наличие подвижной и неподвижной фаз; 2) растворение компонентов в подвижной фазе и взаимодействие их с неподвижной фазой; 3) многократное повторение сорбции и десорбции разделяемых веществ, перемещающихся в подвижной фазе относительно неподвижной фазы.
КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ Существует несколько подходов к классификации методов хроматографического разделения, в основу которых положены различные критерии, учитывающие особенности процесса разделения. В настоящем пособии приведены только основные типы классификации хроматографических методов.
11
Примеры классификаций по механизму разделения веществ (по различию в характере взаимодействия разделяемых компонентов с неподвижной фазой) Механизм процесса разделения
Название варианта хроматографии
Неодинаковая способность разделяемых компонентов вступать в специфическое взаимодействие с поверхностью адсорбента за счет адсорбции Различия в коэффициентах распределения разделяемых компонентов между подвижной фазой и неподвижной фазой, представляющей собой жидкость Различная способность ионов разделяемых компонентов, находящихся в подвижной фазе, к обмену с ионами неподвижной фазы
адсорбционная
распределительная
ионообменная
Классификация по агрегатному состоянию фаз Подвижная фаза
Газ
Название варианта хроматографии общее частное
Неподвижная фаза
твердое вещество
газовая
жидкость
Жидкость
твердое вещество
жидкостная
жидкость 12
газоадсорбционная газожидкостная жидкостноадсорбционная жидкостножидкостная
Классификация хроматографических методов по технике эксперимента Неподвижная фаза (НФ) НФ – адсорбент помещен на внутреннюю стенку колонки НФ в виде тонкого слоя адсорбента или пленки жидкости размещается на внутренней стенке капилляра НФ – тонкий слой адсорбента, нанесенный на поверхность плоской подложки НФ – специальная бумага, пропитанная слоем воды или другой жидкостью
Характер движения Название варианта подвижной фазы (ПФ) хроматографии ПФ движется под давлением
колоночная
ПФ движется под давлением
капиллярная
ПФ движется за счет капиллярных сил
тонкослойная (ТСХ)
ПФ движется за счет капиллярных сил
бумажная (БХ)
Классификация по способу относительного перемещения фаз (по способу получения хроматограмм) Способ введения растворителя и анализируемой смеси В колонку непрерывно вводят анализируемый раствор, содержащий компоненты смеси и растворитель В колонку вначале вводят смесь веществ в растворителе, а далее эти вещества промывают чистым растворителем В колонку вначале вводят смесь веществ в растворителе, а далее эти вещества промывают чистым растворителем с некоторым веществом, у которого сродство к НФ больше, чем у компонентов смеси 13
Разновидность колоночной хроматографии фронтальная
элюентная (проявительная)
вытеснительная
ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (хроматография в тонком слое сорбента – ТСХ) Тонкослойная хроматография является разновидностью жидкостной хроматографии с точки зрения агрегатного состояния фаз. Это один из видов адсорбционной (по механизму разделения), разновидность плоскостной хроматографии. Основные особенности ТСХ определяются движением ПФ по слою НФ за счет капиллярных сил. Скорость движения веществ определяется соотношением времени движения в токе ПФ и удерживания за счет адсорбции на поверхности НФ.
ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ТЕРМИНЫ ТСХ Линия старта – линия, на которую наносят пробы (рис. 2).
Рис. 2. Общий вид хроматограммы при разделении смеси методом ТСХ
Линия финиша (линия финиша растворителя) – это линия, до которой доходит фронт растворителя при хроматографировании. Фронт подвижной фазы (b) измеряется от линии старта до линии финиша. Путь стандартного образца (СО) (с) измеряется от линии старта до центра пятна вещества, принятого за стандарт. 14
Путь, пройденный веществом (а) измеряется от линии старта до центра пятна, соответствующего этому веществу (рис. 2). Фактор удерживания – Rf (Rf – фактор, или коэффициент подвижности) характеризует подвижность хроматографических зон в ТСХ и определяется экспериментально соотношением расстояния (а или с), пройденного веществом или СО от точки на линии старта до центра зоны (пятна), и расстояния (b) – фронта подвижной фазы:
R
f
a или b
R
f
a . c
(2)
Величина Rf находится между 0 и 1. При Rf = 0 вещество не движется, а остается на линии старта, при Rf = 1 вещество движется с ПФ, не задерживаясь на неподвижной фазе. Таким образом, значение Rf должно быть больше 0 и меньше 1 (0 Rf1). Фактор удерживания зависит от целого ряда факторов: природы и качества сорбента, равномерности его зернения, толщины слоя, активности сорбента (содержания в нем влаги) и т. д. Для нивелирования влияния этих факторов на результаты эксперимента используют относительный фактор удерживания (относительный коэффициент подвижности) – Rs . Относительный фактор удерживания (относительный коэффициент подвижности) (Rs) – представляет отношение фактора удерживания вещества (Rfа) к фактору удерживания вещества, принятого за стандарт (Rf st):
R
s
R . R fa
(3)
fst
Для характеристики разделения двух компонентов А и Б используют степень (критерий) разделения. Ее рассчитывают по формуле: l , (4) R (1 2 ) / 2 где l – расстояние между центрами пятен компонентов А и Б; 1, 2 – диаметры пятен веществ А и Б, соответственно. Для оценки селективности разделения двух веществ А и Б используют коэффициент разделения () (рис. 2): (5) da . Если = 1, то компоненты смеси А и Б не разделяются. 15
ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА ТСХ 1. Подготовка пробы. Данный этап является наиболее ответственной операцией. Как правило, способ выделения биологически активных соединений из объектов исследования, которыми могут быть лекарственные средства, биологические жидкости, объекты окружающей среды, подробно описываются в нормативной документации на ЛС, в научной литературе или разрабатываются самими исследователями. Важно, чтобы все анализируемые вещества растворялись (переходили) в растворителе, который использован для приготовления пробы. Растворитель должен легко удаляться с поверхности пластины перед началом разделения, т. е. должен быть достаточно летучим, улетучиваться при нанесении пробы, или подсушивании. 2. Нанесение пробы. Анализируемую пробу наносят на линию старта микрошприцами или дозаторами. Диаметр пятна пробы на линии старта обычно составляет от 1 до нескольких мм, но не более 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятен происходит изменение их формы и границы разделенных компонентов могут пересекаться. Часть растворителя удаляется при нанесении пробы, остатки устраняют естественной сушкой пластин в течение 5–10 мин или дополнительной сушкой, с учетом свойств компонентов разделяемой смеси. 3. Хроматографирование. Этот этап проводят в специальных хроматографических камерах. Предварительно в камеру помещают подвижную фазу и проводят насыщение камеры парами растворителя. В зависимости от направления движения подвижной фазы ТСХ имеет несколько основных способов развития хроматограмм: восходящая, нисходящая, горизонтальная. Восходящий вариант хроматографирования является наиболее распространенным. Он основан на том, что фронт подвижной фазы за счет капиллярных сил поднимается по хроматографической пластинке снизу вверх. Нисходящий вариант хроматографирования основан на том, что фронт подвижной фазы движется по пластине сверху вниз, в этом случае действие сил тяжести ускоряет процесс хроматографирования. Для этого метода в верхней части камеры крепится кювета, из которой подвижная фаза подается на хроматографическую пластинку. 16
При проведении горизонтального варианта хроматографии пластинка помещается горизонтально и подача подвижной фазы осуществляется с помощью фитиля. Подвижная фаза перемещается вдоль слоя сорбента от центра к периферии. Хроматографирование ведут в закрытой камере, в которой насыщение парами растворителей происходит довольно быстро, что можно отнести к достоинствам этого варианта ТСХ. В методах ТСХ используют одномерную, двумерную, многократную (повторную), ступенчатую хроматографии. Одномерная хроматография наиболее распространена, ее проводят, не изменяя направления движения подвижной фазы (рис. 3,а). ПФ2
Линия фронта растворителя
Линия фронта растворителя
3
3
2
2
1
1 ПФ1
Линия старта с ПФ1
Линия старта с ПФ2 а
б
Рис. 3. Схема проведения двумерной хроматографии
Двумерную хроматографию обычно применяют для анализа сложных смесей (рис. 3). Вначале проводят хроматографирование в первой подвижной фазе (рис. 3,а). На полученной хроматограмме через полученные пятна, которые являются не разделившимися компонентами, проводят новую линию старта и хроматографируют во второй подвижной фазе, повернув пластинку на 90 С (рис. 3,б). 17
Многократная хроматография – это многократное повторение хроматографирования с одной и той же подвижной фазой на одной и той же пластинке, при котором достигают максимального разделения компонентов смеси. После каждого хроматографирования пластинку тщательно высушивают. Ступенчатое хроматографирование проводят на одной и той же пластинке, используя каждый раз новую подвижную фазу, до достижения разделения компонентов меси. Двумерную, многократную (повторную) и ступенчатую хроматографии обычно применяют для анализа объектов сложного состава, как правило, растительного или животного происхождения. 4. Удаление элюента. Этот этап проводится после окончания процесса хроматографирования путем сушки хроматографических пластин. 5. Детектирование (визуализация) хроматографических зон. Вариант детектирования хроматографических пятен (зон адсорбции) зависит от того, являются ли они окрашенными или бесцветными. В случае окрашенных пятен после сушки определяют цвет каждого из веществ, но в большинстве случаев пятна являются бесцветными, и необходимо провести их детектирование одним из методов. К методам детектирования зон адсорбции на хроматографических пластинках относят облучение УФ-светом, термическую и химическую обработки, причем возможно использование либо одного из этих методов визуализации, либо их сочетание. 6. Идентификация компонентов анализируемой смеси. После детектирования хроматограмм проводят идентификацию компонентов разделяемой смеси. Как правило, установление подлинности компонентов проводят по значению фактора удерживания Rf, сравнивая его с данными литературы или нормативных документов для конкретного соединения и условий проведения анализа. Чаще всего в анализе используются вещества-свидетели, и тогда для анализируемого компонента смеси рассчитывают значение относительного фактора удерживания Rs, сравнивая его с данными нормативных документов или с данными научной литературы. 18
В фармацевтическом анализе идентификацию анализируемых веществ проводят при одновременном хроматографировании одинаковых количеств анализируемого вещества и стандартного образца в одних и тех же хроматографических условиях. При этом, если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны находятся на одном уровне, имеют одинаковую форму, интенсивность поглощения или окраски и равные величины Rf. 7. Количественная оценка в ТСХ. При помощи метода ТСХ возможно не только разделение компонентов и их идентификация, но и их количественный анализ. Для этого существует несколько приемов: элюирование компонентов смеси c зоны адсорбции или денситометрический метод. Прием элюирования заключается в том, что нужную зону вырезают с хроматограммы, экстрагируют вещество с поверхности носителя, концентрируют и далее устанавливают содержание одним из методов количественного определения. При использовании денситометрического метода изолирование вещества с поверхности носителя не проводят, для его реализации используются денситометры. Исходя из базового положения денситометрии о том, что размер и интенсивность окраски пятна прямо пропорциональны количеству вещества в пятне, программа производит расчет концентрации вещества в пробе или процентного состава компонентов в смеси.
ГАЗО-ЖИДКОСТНАЯ (ГЖХ) И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ВЭЖХ) Стратегия выбора метода хроматографирования В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы методы колоночной хроматографии подразделяют на газовую, при которой подвижной фазой является газ, и жидкостную, для которой подвижная фаза – это жидкость. Термин газовая хроматография (ГХ) объединяет все методические варианты с газообразной подвижной фазой и включает газо-адсорбционный метод (ГАХ) (неподвижная фаза – адсорбент) и газо-жидкостный вариант (ГЖХ) (неподвижная фаза – слой жидкости, 19
нанесенной на поверхность твердого носителя). Если подвижной фазой является жидкость, то говорят о жидкостной хроматографии, основными разновидностями которой являются варианты жидкостно-адсорбционной (неподвижная фаза – адсорбент) и жидкостно-жидкостной (неподвижная фаза – жидкость, химически привитая к поверхности твердого сорбента) хроматографии. Если на протяжении всего хроматографического процесса состав подвижной фазы и его параметры остаются постоянными, то говорят об изократическом режиме хроматографирования, если состав подвижной фазы и его параметры изменяются в ходе анализа, то такой режим называют градиентным. Для хроматографирования летучих соединений, а также веществ, разлагающихся при высоких температурах до устойчивых летучих производных, можно использовать вариант газожидкостной хроматографии. Компоненты разделяемой смеси перемещаются по колонке с потоком газа-носителя, при этом разделение достигается за счет неодинакового сродства веществ к подвижной фазе (газу-носителю) и неподвижной фазе (жидкости, нанесенной на поверхность сорбента). Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения жидкой подвижной фазы занимает много времени. С целью ускорения этого процесса хроматографирование проводят под давлением. При уменьшении размеров частиц сорбентов, используемых в жидкостной хроматографии, возрастает эффективность хроматографического анализа. На основе этого критерия выделяют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). ВЭЖХ является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой. В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют два варианта хроматографирования: 1) на полярном 20
сорбенте с использованием неполярного элюента – вариант прямо-фазной ВЭЖХ; 2) на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента – обращенно-фазовая ВЭЖХ. Перед непосредственным проведением хроматографического анализа (эксперимента) лекарственного средства или их смеси необходимо выбрать метод. В общем виде алгоритм выбора хроматографического метода представлен на рис. 4. Образец для хроматографического анализа
Вещество или вещества являются летучими соединениями ДА
НЕТ
ГХ
ЖХ
Газовая смесь имеет постоянный состав ДА
НЕТ ГЖХ
ГАХ
Молекулярная масса разделяемых соединений более 3000 НЕТ Вещества способны растворяться в полярных растворителях
Разделяемые компоненты – слабые электролиты НЕТ Ионные методы анализа
ДА
ДА
Гельхроматография
НЕТ Нормальнофазная ЖХ
ДА Обращеннофазовая ВЭЖХ
Рис. 4. Алгоритм выбора метода хроматографирования
21
Стратегия эксперимента или анализа строится, как правило, исходя из природы анализируемых объектов. Если такая априорная информация отсутствует, то необходимо прибегнуть к комбинации хроматографии с другими методами анализа. Графическим результатом хроматографического процесса является хроматограмма. Хроматограмма – кривая зависимости сигнала детектора от объема подвижной фазы или от времени. В зависимости от типа детектора получают дифференциальные или интегральные хроматограммы. Нами рассмотрен пример дифференциальной хроматограммы (рис. 5). Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы. Отдельный пик на хроматограмме соответствует максимуму регистрируемого сигнала детектора или концентрации компонента хроматографируемой смеси в элюенте. Площадь пика прямо пропорциональна концентрации компонента в элюате.
Рис. 5. Общий вид дифференциальной хроматограммы
На хроматограмме различают следующие составляющие: 1 – нулевая линия, которая представляет собой участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала детектора во время выходы из колонки чистого газа-носителя или растворителя; 22
2 – пик несорбирующегося компонента смеси; 3 – пик, полученный при регистрации сигнала детектора во время выхода из колонки одного из определяемых компонентов смеси. Пик ограничивается фронтом, соответствующим возрастанию концентрации компонента до максимальной, и тылом, отвечающим убыванию концентрации компонента в подвижной фазе. Хроматографические условия включают тип и марку используемого хроматографа, размеры хроматографической колонки и марку используемого в ней адсорбента, состав и расход элюента, тип элюирования (изократический или градиентный) и форму градиента, объем пробы, тип детектора и условия детектирования, температуру окружающей среды или термостата колонок.
ОСНОВНЫЕ
ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ В КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Первичные параметры удерживания К основным первичным параметрам удерживания относят время удерживания, объем удерживания, время удерживания несорбируемого компонента, объем удерживания несорбируемого компонента. Время удерживания вещества (total retention time) (tR или t) [мин, с] – время пребывания вещества в хроматографе. На практике время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимальной амплитуды хроматографического пика. Время удерживания несорбируемого вещества (мертвое время) (hold-up time, dead time) (tо или tМ) [мин, с] – время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе, например, растворителя или газа-носителя. Так как не всегда удается подобрать полностью несорбируемый компонент, то на практике используют время удерживания наименее сорбируемого компонента, которое также обозначается tM. Удерживаемый объем, или объем удержания компонента (total retention volume) (VR) [см3], – объем элюента или газа-носителя, который проходит через хроматографическую колонку от момента ввода пробы до момента выхода максимальной концентрации 23
компонента, или объем подвижной фазы, вытекающий за время удерживания. Объем удерживания несорбируемого компонента («мертвый» объем системы, или «мертвый» объем удерживания) (dead volum) (V0 или VM) – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования несорбируемого компонента. «Мертвый» объем позволяет учитывать свободные объемы колонки, дозатора, детектора и соединительных линий. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания. Оно зависит от природы вещества, подвижной и неподвижной фаз, температуры, длины колонки. Чем выше коэффициент распределения (1) хроматографируемого вещества, тем больше его время удерживания. Это положение является основой идентификации компонентов разделяемой смеси по временам удерживания при жестком соблюдении постоянства условий эксперимента. Для сопоставления получаемых параметров хроматографирования с учетом влияния на них различных факторов используют группу относительных параметров удерживания.
Приведенные (исправленные) параметры удерживания Приведенное (исправленное) время удерживания (adjusted retention time) (t'R) – это время, в течение которого данный компонент находится на НФ, оно пропорционально коэффициенту распределения данного компонента разделяемой смеси (1) и определяется по формуле с учетом времени удерживания несорбируемого компонента: t'R = tR – tо . (6) Фактор емкости (коэффициент емкости, коэффициент извлечения) (retention factor) (k') – это отношение приведенного времени удерживания (t') ко времени удерживания несорбируемого компонента (to): k' = t'R /to . (7) коэффициент емкости является более универсальной характеристикой, чем время удерживания, т. к. он не зависит от длины колонки и скорости подачи элюента и др. Чем выше значение k', тем большее время анализируемый компонент находится в НФ. 24
Приведенное (исправленное) расстояние удерживания (adjusted retention distance) (l’) – расстояние от пика несорбируемого компонента (l0) до максимума выхода пика соответствующего компонента (l): l’ = l – l0. (8) Исправленный удерживаемый объем для ГЖХ-процесса (V') определяется по формуле: (9) V' = Vj, где j – поправочный коэффициент, учитывающий перепад давления на входе (Рвх.) и выходе (Рвых.) из колонки и характеризующий сжижаемость подвижной фазы (в ВЭЖХ сжижаемость подвижной фазы ничтожно мала):
Р вх j 2 Р вх 3
Р вых 1 . 2 Р вых 1 2
(10)
Исправленный удерживаемый объем можно сравнить в случае проведения анализа на одной и той же колонке при прочих равных условиях, но при различном перепаде давления на входе и выходе из колонки. Приведенный удерживаемый объем (adjusted retention volume) (V') определяется по формуле, используется как в ГЖХ, так и в ВЭЖХ анализе: V' = V–VM . (11) Этот показатель позволяет учитывать «мертвые» объемы колонки, дозатора, детектора, соединительных линий и др. Приведенный удерживаемый объем можно сравнить в случае проведения анализа как на одной и той же, так и на различных колонках, но при одинаковом перепаде давления на входе и выходе из колонки. В повседневной практике наибольшее распространение получила группа относительных параметров удерживания.
Относительные параметры удерживания Параметр, в меньшей степени зависящий от внешних условий, чем время удерживания, – это относительное время 25
удерживания (relative retention time) (r) – отношение времени удерживания определяемого компонента ко времени удерживания вещества, принятого за стандарт: '
r tR .
t
(12)
st
Относительный объем удерживания (relative retention volume) (V'r) – отношение объема удерживания определяемого компонента к объему удерживания вещества, принятого за стандарт: '
Vr
VR V st .
(13)
Относительные величины удерживания не зависят от количества сорбента в колонке, от ее объема, занятого подвижной фазой, от перепада давления, от скорости подачи подвижной фазы и др. Они зависят от природы анализируемого вещества, от природы вещества-стандарта, от сорбента и температуры колонки, поэтому используются для идентификации и публикуются в виде таблиц в оригинальной и справочной литературе. При установлении относительных параметров удерживания в качестве стандартных (реперных) могут быть использованы различные вещества. Как правило, это соединение, относящееся к тому же классу соединений, что и определяемое вещество с известными значениями параметров удерживания. Более удобным и целесообразным является определение параметров удерживания относительно двух стандартных веществ. При этом первый стандарт должен иметь меньшее значение, второй – большее значение времени удерживания, чем анализируемое вещество. Это дает возможность представлять данные в виде интерполяционных параметров удерживания, наиболее распространенными из которых являются индексы удерживания. В 1958 г. Е. Ковачем в практическую газовую хроматографию был введен индекс удерживания I (индекс удерживания Ковача), далее с начала 90-х годов ХХ века этот параметр стал применяться и для представления данных по относительному удерживанию в ВЭЖХ. 26
ПАРАМЕТРЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ Параметры эффективности Под эффективностью в хроматографии понимают способность системы предотвращать (ограничивать, максимально снижать) размывание зон адсорбции разделяемых веществ. Основным параметром, характеризующим размывание зон веществ при прохождении их через колонку, является эффективность хроматографической колонки. Этот показатель измеряется числом теоретических тарелок. Термин «теоретическая тарелка» появился благодаря концепции, согласно которой хроматографическая колонка разбивается на ряд «тарелок» – зон или слоев – подобно ректификационной колонне, на каждой из которых происходит единичный акт адсорбции-десорбции при условии отсутствия диффузионного переноса анализируемого вещества между зонами. Число теоретических тарелок (N) характеризует число ступеней становления равновесия распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами и определяется экспериментально по результатам хроматографирования: 2
2
t N 5,545 t R или N 16 R , W 0,5 W где N – число теоретических тарелок; tR – время удерживания компонента смеси; W – ширина пика на половине высоты;
(14)
0, 5
W – ширина пика. Согласно формуле (14), эффективность колонки тем больше, чем уже хроматографический пик при тех же временах удерживания. Число теоретических тарелок не является достаточной характеристикой разделения, так как не учитывает длину хроматографической колонки. Эффективность хроматографической системы с использованием набивных хроматографических колонок описывается высотой, эквивалентной теоретической тарелке – ВЭТТ (Н): 27
ВЭТТ (H) = L/N, (15) где L – длина колонки; N – эффективность хроматографических колонок (число теоретических тарелок). Для характеристики капиллярных колонок применяют высоту, эквивалентную эффективной теоретической тарелке, а в расчетах используется число эффективных теоретических тарелок. Зная число теоретических тарелок, приходящихся на длину колонки, а также диаметр зерна сорбента, можно рассчитать значение приведенной высоты, эквивалентной теоретической тарелке: ПВЭТТ (h) = H/dc , (16) где Н – высота, эквивалентная теоретической тарелке; dc – средний диаметр зерна сорбента, мм. Сравнивая число теоретических тарелок двух хроматографических колонок, сравнивают их эффективность. При сравнении ВЭТТ можно оценить эффективность колонок с одинаковым зернением, но разной длины. Величины ПВЭТТ для двух колонок, не зависимо от их длины, природы и зернения сорбент позволяют оценить качество сорбента и качество заполнения колонок.
Параметры селективности Теория тарелок позволяет описать распределение одного компонента, в то время как селективность является мерой взаимного распределения (относительной подвижности) двух и более компонентов смеси в ходе их хроматографического разделения. Удерживание вещества характеризуется временем удерживания и пропорционально коэффициенту распределения (К). Коэффициент распределения зависит от физико-химических свойств вещества, неподвижной и подвижной фаз. Для возможности разделения двух и более веществ достаточно выбрать подвижную и неподвижную фазы, которые обеспечивают разницу в коэффициентах подвижности компонентов смеси, т. е. основным требованием к хроматографической системе является различие в коэффициентах распределения разделяемых веществ: К1 К2 . (17) 28
В практике газовой и жидкостной хроматографии получил распространение фактор разделения (коэффициент распределения). Фактор разделения (separаtion factor) (коэффициент разделения, фактор селективности) () характеризует способность хроматографической системы делить данную пару соединений. Селективность хроматографической системы при разделении двух веществ определяется экспериментально по формуле: α = К2/К1. (18) Так как условием разделения двух веществ является неравенство К2 > К1 , то численное значение α всегда больше 1.
Степень разделения Разрешение (степень разделения пиков) является важным параметром при разделении компонентов смеси и рассчитывается по формуле: 2t t 2t (19) R s w12 w12 w1 w2 , где t1 и t2 – время удерживания разделяемых компонентов смеси; w1, w2 – ширина пиков разделяемых компонентов у основания. На практике удобнее использовать степень разделения пиков, учитывая ширину пиков на половине высоты, т. к. у неразделенных пиков ширина на основании определяется с большой погрешностью. При этом расчетная формула приобретает следующий вид: t , (20)
R
s
'
''
w
1/ 2
w1 / 2
где w1' / 2 , w1'' / 2 – ширина пиков разделяемых компонентов на половине высоты. Величина степени разделения зависит от трех параметров колонки: эффективности, селективности и коэффициента емкости. Эта зависимость выражается следующим уравнением:
R
s
1 эффективно сть N 4
селективно сть
29
k' ' 1 . k емкость
(21)
Следует учитывать, что разрешение пропорционально квадратному корню из эффективности, то есть для улучшения разделения в два раза требуется колонка, в четыре раза более эффективная, чем данная. При этом, увеличивая длину колонки в 4 раза, мы увеличиваем время анализа в 4 раза. Если α=1, то степень разделения равна нулю, т. е. разделение не происходит вне зависимости от числа теоретических тарелок. Из уравнения следует, что при подборе условий анализа и увеличения значения селективности от 1,1 до 1,2 разделение увеличится в 2 раза. Таким образом, селективность является весьма значимым членом уравнения. В свою очередь, если значение третьего множителя уравнения (21) равно нулю, то разделение веществ не происходит, т. е. оба компонента элюируются с колонки как несорбируемые вещества, т. к. отсутствует взаимодействие компонентов смеси неподвижной фазой. Следовательно, с ростом значения коэффициента емкости степень разделения возрастает, а скорость анализа уменьшается, что приводит к увеличению времени анализа. Для двух разделяемых веществ, пики которых по высоте отличаются друг от друга незначительно (соотношение высоты от 3:1 до 1:3), удовлетворительным считается разделение с Rs = 1,0. При проведении более точных анализов величина степени разделения должна находиться в интервале от 1,2 до 1,5.
АППАРАТУРНАЯ СХЕМА ДЛЯ
ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Прибор для газохроматографического разделения и получения хроматограммы называется газовым хроматографом. Схема установки наиболее простого газового хроматографа приведена на рис. 6. Газовый хроматограф состоит из газового баллона (1), содержащего подвижную инертную фазу (газ-носитель), чаще всего гелий, азот, аргон, водород и др. С помощью редуктора (2), уменьшающего давление газа до необходимого, газ-носитель поступает в колонку (4), представляющую собой трубку, заполненную сорбентом или другим хроматографическим материалом, играющим роль неподвижной фазы. 30
Рис. 6. Принципиальная схема газового хроматографа
Газ-носитель подается из баллона под определенным постоянным давлением, которое устанавливается при помощи специальных клапанов в стабилизаторе потока (2). Давление газа-носителя на входе и выходе из колонки фиксируется с помощью манометров (3 и 3'). Кроме того, в схеме прибора имеется расходомер (9), который позволяет измерять расход газа-носителя в единицах объема за единицу времени, т. е. определять скорость подвижной фазы. Анализируемую смесь вводят в прибор через устройство для ввода пробы (5), в котором перед вводом в колонку пробу дозируют. Газообразные пробы вводят, используя газовые краныдозаторы. Жидкие пробы вводят специальными инжекционными шприцами (0,5–20 мкл) в поток газа-носителя (в испаритель) через мембрану из силиконовой самоуплотняющейся резины. Проба должна испаряться практически мгновенно, иначе пики на хроматограмме расширяются и точность анализа снижается. Поэтому дозирующее устройство хроматографа снабжено нагревателем, что позволяет поддерживать температуру дозатора примерно на 50 °С выше, чем температура колонки. Температура колонок определяется главным образом летучестью пробы и может изменяться в пределах от 196 ºС (температура кипения жидкого азота) до 350 ºС. Температуру хроматографической колонки (4) контролируют с точностью до нескольких 31
десятых градуса и поддерживают постоянной с помощью термостата (6), устройство прибора и термостата позволяет изменять температурный режим в процессе проведения анализа. Идентификация и количественная оценка компонентов смеси, выходящих из колонки в потоке газа-носителя, осуществляется с помощью детектора (7). Комплект современного газового хроматографа включает несколько детекторов, как правило, это пламенноионизационный и детектор по теплопроводности (катарометр). Сигнал детектора преобразуется, обрабатывается и в виде графического изображения (хроматограммы) выводится на экран или распечатывается самописцем или компьютерным блоком (8).
АППАРАТУРНАЯ СХЕМА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности – от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами. На рис. 7 представлена блок-схема жидкостного хроматографа, включающая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде присутствующих в любом современном жидкостном хроматографе.
Рис. 7. Блок-схема жидкостного хроматографа
32
Емкость с исследуемым раствором (1), насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы – «stop-flow» требуют остановки насоса и поэтому менее удобны, чем петлевые дозаторы. Колонка (4) для ВЭЖХ. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5). Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора (6). Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др. Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В современных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером, который не только осуществляет сбор и обработку информации, но и управляет прибором. Принцип действия хроматографа заключается в следующем: проба с помощью инжектора вводится в верхнюю часть хроматографической колонки. С помощью насоса анализируемая смесь прокачивается элюентом через хроматографическую колонку, в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные компоненты. Вытекающий из колонки элюат, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, идентифицируется детектором, показания которого отображает регистратор. 33
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДАМИ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
При проведении качественного анализа того или иного образца необходимо учитывать характер и сложность поставленной задачи, а также имеющуюся априорную информацию об анализируемом объекте. В большинстве случаев аналитиком решается одна из трех наиболее распространенных задач качественного анализа: 1. Подтверждение подлинности индивидуального вещества или компонентов смеси. При этом, как правило, известны структуры компонентов смеси и состав смеси, например, анализ лекарственного средства согласно НД. 2. Подтверждение наличия или отсутствия в исследуемой смеси каких-либо конкретных соединений или соединений, относящихся к определенному классу веществ (групповая идентификация) при анализе смесей неизвестного состава, например, токсикологический анализ. 3. Идентификация индивидуальных веществ или компонентов смеси неизвестного состава, например, идентификация примесей в субстанциях или лекарственных средствах, токсикологический анализ. Для выполнения одной из этих задач необходимым является достаточное разделение компонентов анализируемой смеси, регистрация хроматограммы, в большинстве случаев наличие стандартных образцов. При проведении качественного анализа с использованием эталонных соединений (стандартов) используют метод сравнения и метод добавок (метод метки). Метод сравнения предусматривает сравнение параметров удерживания компонентов анализируемой смеси, как правило, относительных, с таковыми для стандартов. В случае затруднения идентификации методом сравнения используют метод добавок, который предусматривает добавление к анализируемой смеси раствора стандартного образца известной концентрации. После этого проводится повторное хроматографирование в тех же условиях, далее проводят сравнение хроматограммы процесса разделения без добавления и с добавлением 34
стандарта (метки). Сравнивают как времена удерживания, так и ширину пика на половине высоты, кроме того, рассчитывают относительное время удерживания компонента. Если пик принадлежит как определяемому веществу, так и предполагаемому добавленному стандарту, то произойдет увеличение высоты пика (площади), а ширина на половине высоты и время удерживания должны остаться прежними. Как правило, в анализе используются одновременно оба метода, дополняя друг друга. Еще одним вариантом идентификации компонентов смеси может быть сравнение параметров удерживания веществ с литературными данными или автоматическими базами данных. В этом случае, как правило, пользуются относительными параметрами удерживания веществ, например, индексами удерживания Ковача.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ В КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Для проведения обработки хроматограммы необходимо получить относительно симметричные пики. Асимметрия пика может быть вызвана двумя причинами: перегрузкой колонки и наличием остаточной адсорбционной активности твердого носителя, использованного для приготовления сорбента. При этом форма пиков будет различна: в первом случае происходит размытие фронта, а во втором – образование «хвоста». Для численного выражения этого процесса используют фактор асимметрии (фактор симметрии) пика (хвостовой фактор), который рассчитывается по формуле:
A s
W
0 , 05
,
(22)
2f
где W 0,05 – ширина пика на высоте 5 % (1/20) от базовой линии; f – расстояние от начала пика на высоте 5 % от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины. Для симметричного пика As = 1. В случае остаточной адсорбции As > 1, при «перегрузочных» пиках As < 1. Допустимой считается работа на колонке, если для всех компонентов смеси коэффициент асимметрии находится в интервале от 0,7 до 1,5. 35
Таким образом, коэффициент асимметрии является одним из параметров, характеризующих хроматографическую систему. Все приемы количественного анализа компонентов разделяемой смеси основаны на том, что площадь (S) пика прямо пропорционально связана с количеством вещества в анализируемой пробе, проходящим через детектор. Площадь пика измеряют разными способами умножением высоты пика (h) на его ширину, измеренную на половине его высоты (W 1 / 2 ), планиметрированием или с помощью интегратора и компьютерной программы. Площадь пика рассчитывается по формуле: S h W 1 / 2 ,
(23)
где h – высота пика; W 1 / 2 – ширина на половине высоты пика. Для определения содержания веществ в пробе используют в основном следующие методы: метод нормирования (метод внутренней нормализации); метод внутреннего стандарта; метод внешнего стандарта; метод стандартных добавок.
Метод нормирования (метод внутренней нормализации ) Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100% суммы площадей всех пиков (Si) на хроматограмме, т. е. на одной и той же хроматограмме измеряют площади каждого из пиков (Si) и определяют их сумму (Si). При этом полагают, что элюируются все компоненты анализируемой пробы и ни один из компонентов не остается прочно связанным с НФ колонки. Расчет содержания компонента ведут по формуле:
X
i
S
х
Si
100% ,
где Xi – содержание компонента, %; Sх – площадь пика компонента смеси; Si – сумма площадей всех пиков на хроматограмме. 36
(24)
В случае использования метода внутренней нормализации необходимо, чтобы все компоненты элюировались с колонки, т. е. не должно происходить удерживания ни одного компонента смеси на колонке. Метод внутренней нормализации дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.
Метод внутреннего стандарта Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества (Сст), пик (Sст) которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов (Sх) исследуемой смеси. Основываясь на положении о пропорциональности площади пика концентрации вещества, решают соотношение:
S S
х
fx
ст
С С
,
х
(25)
ст
где Sх – площадь пика определяемого вещества; Sст – площадь пика вещества-стандарта; Сст – концентрация вещества-стандарта в пробе; Сх – концентрация определяемого вещества в пробе; fx – коэффициент пропорциональности, который рассчитывается по формуле:
f x
C S . С S x
ст
ст
(26)
х
Количественное содержание вещества рассчитывается по следующей формуле:
С
х
f S С S х
ст
.
(27)
x
ст
При использовании метода внутреннего стандарта необходимо подбирать соединение, родственное компонентам смеси, кроме того, его пик должен достоверно отделяться от пиков анализируемых веществ. 37
Метод внешнего стандарта Метод внешнего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества. Для проведения исследования готовят раствор стандартного образца определяемого компонента с концентрацией, близкой к предполагаемой концентрации этого компонента в испытуемой пробе. Последовательно хроматографируют стандартный, испытуемый и снова стандартный растворы. Находят средние значения площадей пиков на хроматограммах и рассчитывают концентрацию определяемого компонента в испытуемом растворе по уравнению:
C
S х C ст , S ст
(28)
где Sх и Sст – средние значения площадей пиков на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов соответственно; С и Сст – концентрации определяемого и стандартного растворов соответственно. Для проведения анализа методом внешнего стандарта необходимо предварительно убедиться, что в используемом диапазоне концентраций площадь пика определяемого компонента линейно зависит от его концентрации. Этот метод является наиболее предпочтительным при проведении количественного анализа лекарственных средств.
Метод стандартных добавок Метод стандартных добавок основан на определении концентрации определяемого вещества путем сравнения выбранного параметра пика определяемого вещества на хроматограмме испытуемого раствора с аналогичным параметром пика определяемого вещества на хроматограмме испытуемого раствора с известной добавкой определяемого вещества. Метод предполагает введение в анализируемую смесь известного количества определяемого вещества, которое должно быть 38
соизмеримо с его предполагаемым содержанием в анализируемом образце. После проведения испытания сравнивают полученные параметры и рассчитывают содержание компонента смеси по формуле:
C x Сст
Sx S ст х S х
,
(29)
где Сст – концентрация стандартной добавки; Sх – площадь пика определяемого вещества для испытуемого раствора без стандартной добавки; Sст+х – площадь пика определяемого вещества для испытуемого раствора со стандартной добавкой.
39
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ Выберите один правильный ответ. 001. ВПЕРВЫЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА БЫЛИ ИЗЛОЖЕНЫ 1) М.С. Цветом 2) А. Мартином 3) А.А. Жуховицким 4) Д. Сингом 002. МОЛЕКУЛА ВЕЩЕСТВА, НАХОДЯСЬ В ПОДВИЖНОЙ ФАЗЕ, ДВИГАЕТСЯ СО СКОРОСТЬЮ 1) подвижной фазы 2) меньшей, чем у подвижной фазы 3) большей, чем у подвижной фазы 4) в два раза большей, чем у подвижной фазы 003. КОЭФФИЦИЕНТ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ОТРАЖАЕТ СТЕПЕНЬ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИРУЕМОГО КОМПОНЕНТА 1) в подвижной фазе 2) между подвижной и неподвижной фазой 3) в неподвижной фазе 4) в равном соотношении между подвижной и неподвижной фазах 40
004. РАЗДЕЛЕНИЕ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ ОСНОВАНО НА 1) меньшем сродстве разделяемых веществ к подвижной фазе и большей к неподвижной фазе 2) большем сродстве разделяемых веществ к подвижной фазе, чем к неподвижной фазе 3) различном сродстве разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам 4) большем сродстве разделяемых веществ к подвижной фазе и меньшем к неподвижной фазе 005. МЕХАНИЗМ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ, ОСНОВАННЫЙ НА НЕОДИНАКОВОЙ СПОСОБНОСТИ РАЗДЕЛЯЕМЫХ КОМПОНЕНТОВ ВСТУПАТЬ В СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПОВЕРХНОСТЬЮ АДСОРБЕНТА ЗА СЧЕТ АДСОРБЦИИ, ХАРАКТЕРЕН ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ 1) распределительной 2) адсорбционной 3) ионообменной 4) эксклюзионной 006. СПОСОБНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДЕЛИТЬ ДАННУЮ ПАРУ СОЕДИНЕНИЙ ОПРЕДЕЛЯЮТ КАК 1) эффективность 2) селективность 3) время удерживания 4) объем удерживания 007. МЕХАНИЗМ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ, ОСНОВАННЫЙ НА РАЗЛИЧИИ В КОЭФФИЦИЕНТАХ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗДЕЛЯЕМЫХ КОМПОНЕНТОВ МЕЖДУ ПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ И НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ СОБОЙ ЖИДКОСТЬ, ХАРАКТЕРЕН ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ 1) ионообменной 2) лигандообменной 41
3) флюидной 4) распределительной 008. ЕСЛИ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ГАЗ, НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ – ТВЕРДОЕ ВЕЩЕСТВО, ТО ТАКОЙ ВАРИАНТ ХРОМАТОГРАФИИ НАЗЫВАЕТСЯ 1) жидкостно-адсорбционная 2) газо-адсорбционная 3) газо-жидкостная 4) жидкостно-жидкостная 009. ЕСЛИ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ГАЗ, НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ – ЖИДКОСТЬ, ТО ТАКОЙ ВАРИАНТ ХРОМАТОГРАФИИ НАЗЫВАЕТСЯ 1) жидкостно-адсорбционная 2) газо-адсорбционная 3) жидкостно-жидкостная 4) газо-жидкостная 010. ЕСЛИ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ЖИДКОСТЬ, НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ – ТВЕРДОЕ ВЕЩЕСТВО, ТО ТАКОЙ ВАРИАНТ ХРОМАТОГРАФИИ НАЗЫВАЕТСЯ 1) газо-жидкостная 2) газо-адсорбционная 3) жидкостно-адсорбционная 4) жидкостно-жидкостная 011. ЕСЛИ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ЖИДКОСТЬ, НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ – ЖИДКОСТЬ, ТО ТАКОЙ ВАРИАНТ ХРОМАТОГРАФИИ НАЗЫВАЕТСЯ 1) газо-жидкостная 2) жидкостно-жидкостная 3) жидкостно-адсорбционная 4) газо-адсорбционная 42
012. ФРОНТ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ ИЗМЕРЯЕТСЯ 1) от линии старта до середины пластинки 2) от середины пластинки до линии финиша 3) от верхнего края пластинки до нижнего края пластинки 4) от линии старта до линии финиша 013. ОТНОШЕНИЕ РАССТОЯНИЯ, ПРОЙДЕННОГО ВЕЩЕСТВОМ, К ПУТИ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ – ЭТО 1) фактор асимметрии 2) фактор удерживания 3) путь, пройденный веществом 4) относительный фактор удерживания 014. ВЕЛИЧИНА ФАКТОРА УДЕРЖИВАНИЯ МОЖЕТ НАХОДИТЬСЯ В ИНТЕРВАЛЕ 1) от 0 до 0,1 2) от 0 до 1 3) от 1 до 10 4) от 10 до 100 015. ВЕЩЕСТВО ОБЛАДАЕТ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТЬЮ, ЕСЛИ ВЕЛИЧИНА ФАКТОРА УДЕРЖИВАНИЯ ИМЕЕТ ЗНАЧЕНИЕ 1) Rf = 0 2) Rf ≤ 1 3) 0 Rf 1 4) Rf ≥ 1 016. ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ ФАКТОР УДЕРЖИВАНИЯ ПРЕДСТАВЛЯЕТ ОТНОШЕНИЕ 1) пути свидетеля к пути растворителя 2) фактора удерживания вещества к пути свидетеля 3) фактора удерживания вещества к фактору удерживания свидетеля 4) фактора удерживания свидетеля к пути свидетеля 43
017. ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗДЕЛЕНИЯ ДВУХ КОМПОНЕНТОВ МЕТОДОМ ТСХ ИСПОЛЬЗУЮТ КРИТЕРИЙ РАЗДЕЛЕНИЯ, КОТОРЫЙ РАССЧИТЫВАЮТ ПО ФОРМУЛЕ l 1) R (1 2 ) / 2 l 2) R ( ) l 3) R ( 2 1 ) / 2 ( ) 4) R l 1
1
2
2
018. ФАКТОР УДЕРЖИВАНИЯ РАССЧИТЫВАЮТ ПО ФОРМУЛЕ t 1) N 5,545
W 1/ 2
2) R f
a b
l ( 2 1 ) / 2 4) d a
3) R
019. К МЕТОДАМ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ЗОН АДСОРБЦИИ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПЛАСТИНКАХ ОТНОСЯТ 1) облучение УФ-светом 2) термическую обработку 3) химическую обработку 4) все предыдущие ответы верны 020. УСТАНОВЛЕНИЕ ПОДЛИННОСТИ КОМПОНЕНТОВ РАЗДЕЛЯЕМЫХ МЕТОДОМ ТСХ ПРОВОДЯТ 1) по размеру зоны адсорбции 2) по интенсивности окраски зоны адсорбции 3) по форма зоны адсорбции 4) по величине фактора удерживания и относительного фактора удерживания 44
021. ВРЕМЯ ОТ МОМЕНТА ВВОДА ПРОБЫ ВЕЩЕСТВА В ХРОМАТОГРАФ ДО МОМЕНТА РЕГИСТРАЦИИ МАКСИМАЛЬНОЙ АМПЛИТУДЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПИКА – ЭТО 1) удерживаемый объем 2) коэффициент распределения 3) время удерживания вещества 4) относительное время удерживания вещества 022. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ РАССЧИТЫВАЕТСЯ ПО ФОРМУЛЕ 1)
t
' r
t
t
s
'
2) r t R
t 3) t t t st
' r
4)
t
' r
s
t
t
s
023. ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ УДЕРЖИВАНИЯ НЕ ЗАВИСЯТ 1) от скорости подачи подвижной фазы 2) от количества сорбента в колонке и от ее объема, занятого подвижной фазой 3) от перепада давления 4) все предыдущие ответы верны 024. ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ УДЕРЖИВАНИЯ ЗАВИСЯТ 1) от природы анализируемого вещества и веществастандарта 2) от типа сорбента 3) от температуры колонки 4) все предыдущие ответы верны 45
025. ОСНОВНЫМ ПАРАМЕТРОМ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИМ РАЗМЫВАНИЕ ЗОН ВЕЩЕСТВ, ПРИ ПРОХОЖДЕНИИ ИХ ЧЕРЕЗ КОЛОНКУ, ЯВЛЯЕТСЯ 1) эффективность 2) селективность 3) длина колонки 4) размер сорбента 026. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ КОЛОНКИ ИЗМЕРЯЕТСЯ 1) величиной времени удерживания 2) степенью разделения компонентов смеси 3) числом теоретических тарелок 4) площадью пиков 027. ЧИСЛО ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ТАРЕЛОК ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИЗ ХРОМАТОГРАММЫ ПО ФОРМУЛЕ t 1) N 5,545 W
2
W 2) N 5,545 1/ 2 t
t 3) N 5,545 W1/ 2
4) N 5,545
2
2
t
W
1/ 2
028. ВЫСОТА, ЭКВИВАЛЕНТНАЯ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ ТАРЕЛКЕ, РАССЧИТЫВАЕТСЯ ПО ФОРМУЛЕ 1) H = L/N 2) H = N/ L 3) H = L∙N 4) H = N∙ L 46
029. ПРИВЕДЕННАЯ ВЫСОТА, ЭКВИВАЛЕНТНАЯ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ ТАРЕЛКЕ, УЧИТЫВАЕТ СЛЕДУЮЩИЕ ПАРАМЕТРЫ КОЛОНКИ 1) число теоретических тарелок, температуру колонки 2) число теоретических тарелок, марку сорбента и диаметр зерна сорбента 3) число теоретических тарелок и диаметр зерна сорбента 4) число теоретических тарелок, приходящихся на длину колонки, и диаметр зерна сорбента 030. СЕЛЕКТИВНОСТЬ ЯВЛЯЕТСЯ МЕРОЙ 1) взаимного распределения двух и более компонентов смеси в ходе их хроматографического разделения 2) относительной подвижности двух и более компонентов смеси в ходе их хроматографического разделения 3) способности хроматографической системы разделить два и более компонента смеси 4) взаимного распределения двух и более компонентов смеси между подвижной и неподвижной фазами 031. ИНДЕКС УДЕРЖИВАНИЯ I (ИНДЕКС УДЕРЖИВАНИЯ КОВАЧА) – ЭТО ВЕЛИЧИНА, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ 1) относительное удерживание вещества 2) селективность хроматографической системы 3) абсолютное удерживание вещества 4) эффективность хроматографической системы 032. СТЕПЕНЬ РАЗДЕЛЕНИЯ ПИКОВ РАССЧИТЫВАЕТСЯ ПО ФОРМУЛЕ 1)
R
s
t 1
2
w
w1/ 2
1/ 2
2)
R
s
t 1
2
w
1/ 2
3)
R
s
w1/ 2
t t w w 1
2
1
2
1/ 2
1/ 2
47
4)
R
s
t 1
2
w
1/ 2
w1/ 2
033. ВЕЛИЧИНА СТЕПЕНИ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАВИСИТ ОТ ТРЕХ ПАРАМЕТРОВ 1) эффективности, селективности, времени удерживания 2) эффективности, селективности, коэффициента емкости 3) времени удерживания, селективности, коэффициента емкости 4) эффективности, времени удерживания, коэффициента емкости 034. РАСЧЕТ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТА СМЕСИ МЕТОДОМ ВНЕШНЕГО СТАНДАРТА ВЕДУТ ПО СЛЕДУЮЩЕЙ ФОРМУЛЕ
S х Сст 1) С х f x S
2) C
3)
С
х
4)
С
х
ст
S х C ст S ст
S
х
Si
100
S С S f х
ст
ст х
035. ПРИ ПРОВЕДЕНИИ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА МЕТОДАМИ ГЖХ И ВЭЖХ ИСПОЛЬЗУЮТ МЕТОД 1) градуировочного графика 2) внешнего стандарта 3) внутреннего стандарта 4) добавок (метод метки) или метод сравнения 48
036. КОЭФФИЦИЕНТ АСИММЕТРИИ ПИКА РАССЧИТЫВАЕТСЯ ПО ФОРМУЛЕ
W
1)
A
2)
A
W
3)
A
W
s
s
s
4) As
0 , 05
2f
2d 0, 05
d
W d
0, 05 2
037. ПЛОЩАДЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПИКА РАССЧИТЫВАЕТСЯ ПО ФОРМУЛЕ 1) S h /W 1 / 2 2) S h W 1 / 2 3) S h W 4) S h W 0,05 038. РАСЧЕТ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТА СМЕСИ МЕТОДОМ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК ВЕДУТ ПО ФОРМУЛЕ 1)
C С x
ст
S
S f S С S
ст х
2)
С
х
х
x
Sх
ст
x
ст
3) C
4)
С
х
S х C ст S ст
S
х
Si
100
49
039. РАСЧЕТ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТА СМЕСИ МЕТОДОМ НОРМИРОВАНИЯ ВЕДУТ ПО ФОРМУЛЕ 1)
С
S i 100
х
S
2)
С
х
3)
С
х
4)
С
х
x
S
х
S i 100
S S S
х
100
i х
100
Si
040. РАСЧЕТ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТА СМЕСИ МЕТОДОМ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА ВЕДУТ ПО ФОРМУЛЕ
S С S f S С 2) С f S S С 3) С f S С S 4) С S 1)
С
х
х
ст
ст
х
х
х
ст
x
ст
ст
х
ст
x
х
х
ст
х
ст
Установите соответствие. 041.
РЕЖИМ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
1) изократический 2) градиентный
ПАРАМЕТРЫ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ НА ПРОТЯЖЕНИИ ВСЕГО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА а) постоянный состав б) постоянные параметры в) непостоянный состав г) непостоянные параметры 50
042.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
1) основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества 2) основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве 3) основан на приведении к 100 % суммы площадей всех пиков на хроматограмме 043.
ГРУППА ПАРАМЕТРОВ УДЕРЖИВАНИЯ
1) первичные параметры удерживания 2) относительные параметры удерживания
МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ВЭЖХ АНАЛИЗЕ а) метод внутренней нормализации б) метод внутреннего стандарта в) метод внешнего стандарта
ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ В КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ а) время удерживания б) индекс удерживания в) объем удерживания г) объем удерживания несорбируемого компонента д) относительное время удерживания е) расстояние удерживания ж) относительный объем удерживания 51
044.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
1) физико-химический метод анализа веществ и их смесей, основанный на дифференциальной миграции, т. е. различной скорости перемещения молекул веществ, относительно неподвижной фазы с током подвижной фазы 2) разновидность жидкостной, адсорбционной, плоскостной хроматографии 3) объединяет все методические варианты с газообразной подвижной фазой 4) метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся под давлением через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом)
ВАРИАНТЫ ХРОМАТОГРАФИИ а) высокоэффективная жидкостная хроматография б) газовая хроматография в) тонкослойная хроматография г) хроматография д) гель-хроматография
52
ПРИМЕРЫ РЕШЕНИЯ СИТУАЦИОННЫХ ЗАДАЧ Образец № 1 Методом ГЖХ был проведен сравнительный анализ веществ на двух аналитических колонках «А» и «Б»: на колонке «А»: t – 11,75 мин, W0,5 – 0,42 мин, на колонке «Б»: t – 8,4 мин, W0,5 – 0,65 мин. Какая из колонок эффективней? Решение: 2
t 1. Расчет ведется по формуле N 5,545 W 2. N для колонки «А»= 5,545 (11,75/0,42)2 = 4340 3. N для колонки «Б»= 5,545 (8,4/0,65)2 = 926 Ответ: 4340 > 926, следовательно, более эффективна колонка «А». 0,5
Образец № 2 Оцените качество хроматографических колонок «А» и «Б» по величине ВЭТТ (Н): для колонки «А»: L – 1210 мм, ЧТТ – 1355, для колонки «Б»: L – 2450 мм, ЧТТ – 1580. Решение: 1. Расчетная формула ВЭТТ (H) = L/N 2. Н для колонки «А»=1210/1355=0,89 3. Н для колонки «Б»=2450/1580=1,55 Ответ: NA = 0,89 мм; NA = 1,55 мм, следовательно, более эффективна колонка «А». 53
Образец № 3 Хроматографированию был подвергнут образец мятного масла. На хроматограмме имеются следующие пики: 1-й (не идентифицирован) площадью 113 мм2; 2-й (не идентифицирован) – 225 мм2; 3-й (ментон) – 246 мм2; 4-й (ментилацетат) – 384 мм2; 5-й (ментол) – 1130 мм2. Рассчитайте содержание свободного ментола в образце. Решение: 1. Расчет содержания ведется по формуле: С х
S
х
S
100% . i
2. Сумма площадей пиков: 113 + 225 + 246 + 384 + 1130 = 2098 мм2 2. Содержание свободного ментола в образце, %: С х
S
х
S
100% i
1130 100% 53,9% . 2098
Ответ: содержание ментола – 53,9 %. Образец № 4 Для хроматографирования была взята смесь 0,1098 г камфоры и 0,1188 г нафталина – внутреннего стандарта. Площади полученных пиков: 5010 мм2 – камфора и 5840 мм2 – нафталин. Рассчитайте содержание камфоры в образце, если коэффициент пропорциональности (fx) – 1,063. Решение: С х
S а f 100 % 5010 0,1188 1,063 100 % 98,67% . 5840 0,1098 S a х
ст
х
ст
x
Ответ: содержание камфоры в образце – 98,67 %. 54
Образец № 5 Определения примеси изопропанола в ампициллине: внутренний стандарт – н-пропанол (fx = 2,56). Для анализа был взят раствор 0,3012 г ампициллина в 3 мл раствора н-пропанола концентрации 0,0002 г/мл. Площади пиков составили: стандарта (Sст) – 2431 мм2 и изопропанола (Sх) – 2112 мм2. Соответствует ли образец требованиям НД, если допустимое содержание изопропанола не более 0,5 %? Решение:
С%
S х C ст f x W 100 % S ст a x
2112 0 , 0002 2 , 56 3 100 0 , 44 % 2431 0 , 3012
Ответ: 0,44 % 0,5 %, соответствует требованиям НД. Образец № 6 Рассчитайте величину фактора удерживания (коэффициент подвижности) и относительного фактора удерживания (относительный коэффициент подвижности) изониазида, если после ТСХ анализа в системе хлороформ-метанол (9:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 16 см; расстояние, пройденное изониазидом от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 2,25 см; расстояние, пройденное СО изониазида от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 2,24. Решение: 1. Расчет фактора удерживания: a
Rf b
2,25 0,14 16
2. Расчет относительного фактора удерживания:
Rs
R fa 2,25 1,00 R fst 2,24
Ответ: Rf = 0,14; Rs = 1,00. 55
Образец № 7 Рассчитайте содержание диклофенака натрия в растворе для инъекций 25 мг/мл, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Раствор СО диклофенака натрия: точную навеску 0,125 г субстанции стандартного образца (СО) диклофенака натрия помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). Испытуемый раствор: 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят водой до метки (раствор А). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО диклофенака натрия получены следующие результаты: площадь пика диклофенака натрия на хроматограмме испытуемого раствора – 15367; площадь пика диклофенака натрия на хроматограмме раствора СО – 15491. Решение: S W x a ст Va 1000 15367 50 0,125 5 1000 Х х 24,8 . а х S ст Wст Wст 1 15491 50 25 Ответ: содержание диклофенака натрия в растворе для инъекций – 24,8 мг/мл.
56
СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ Задача № 1. При разделении смеси веществ А и Б использован следующий режим термостатирования хроматографа: 10 мин при 190 С, затем программирование со скоростью 4 С/мин. При этом пик А вышел при 211 С, а пик Б – 232 С. Найдите относительное время удерживания (tБ /tА). Ответ: tБ /tА = 1,344. Задача № 2. При разделении смеси веществ А и Б использован комбинированный режим работы термостата: изотермический 120 С в течение 8 минут, затем программирование со скоростью подъема температуры 1 С/мин. При этом время удерживания вещества А составило 11 мин, а вещества Б – 16 мин. При каких температурах выходят вещества А и Б из колонки? Ответ: А при 123 С, Б – 128 С. Задача № 3. Сравнительный анализ веществ был проведен методом ГЖХ на двух аналитических колонка «А» и «Б». На колонке «А» время удерживания составило 11,6 мин, при ширине пика на половине высоты 0,43 мин, на колонке «Б» – соответственно 8,3 мин и 0,61 мин. Какая из колонок эффективней? Ответ: для колонки «А» N – 4035 для колонки «Б» N – 1027 следовательно, более эффективна колонка «А». 57
Задача № 4. Температура разложения препарата «Глицирам» составляет 190 С. Для его анализа методом ГЖХ были предложены две методики: А – с программированием температуры от 90 С со скоростью 5 С/мин, при данном режиме основное действующее вещество выходит из колонки через 19,9 мин; ширина пика на половине высоты в этих условиях составляет 0,56 мин. Б – с изотермическим режимом при 130 С, с выходом вещества из колонки через 20,8 мин; ширина пика на половине высоты в этих условиях составляет 0,79 мин. Определите, какая из предложенных методик более предпочтительна для качественного анализа препарата «Глицирам». Ответ: для методики А: N = 7002 температура выхода вещества – 189,5 С; для методики Б: N = 3844 температура выхода вещества – 130 С. Несмотря на меньшую эффективность, методика Б более предпочтительна, т. к. в методике А пик выходит из колонки практически при температуре разложения вещества. Задача № 5. Оцените качество хроматографических колонок А и Б, если колонка А имеет следующие параметры: длина колонки (l) – 1200 мм, ЧТТ – 1350, а колонка Б – 2400 мм и 1571 соответственно. Ответ: Н = 0,89 мм; Н = 1,53 мм, более эффективна колонка А. Задача № 6. Хроматографированию был подвергнут образец мятного масла. На хроматограмме имеются следующие пики: 1-й (не идентифицирован) площадью 112 мм2; 2-й (не идентифицирован) – 221 мм2; 3-й (ментон) – 246 мм2; 4-й (ментилацетат) – 382 мм2; 5-й (ментол) – 1129 мм2. Рассчитайте содержание свободного ментола в образце. Ответ: 54,0 %. 58
Задача № 7. При хроматографическом анализе бромкамфоры на хроматограмме обнаружено два пика: камфоры (допустимая примесь) площадью 57 мм2 и бромкамфоры площадью 1929 мм2. Рассчитайте содержание бромкамфоры в исследуемом образце. Ответ: 97,1 %. Задача № 8. Для хроматографического анализа был взят образец масла эвкалипта массой 1,5932 г. На полученной хроматограмме был обнаружен пик цинеола площадью 1259 мм2. После добавления к исследуемому образцу стандартного образца цинеола массой 0,1561 г площадь пика цинеола составила 1467 мм2. Рассчитайте содержание цинеола в процентах в исследуемом образце. Ответ: 59,3 %. Задача № 9. Образец мятного масла массой 2,1553 г был подвергнут хроматографическому анализу. На полученной хроматограмме зафиксированы пики ментола площадью 1572 мм2 и ментилацетата площадью 783 мм2. После добавления к навеске стандартного образца ментола массой 0,1533 г площадь пика увеличилась до 1724 мм2. Образец (с добавкой ментола) был обработан 0,5 моль/л раствором гидроксида калия с целью гидролиза и вновь хроматографирован. При этом пик, соответствующий ментилацетату, на хроматограмме исчез, а пик ментола увеличился до 2093 мм2. Рассчитайте содержание свободного и связанного ментола в образце. Ответ: свободного ментола – 73,6 %, связанного – 17,3 %. Задача № 10. Технический скипидар согласно НД должен содержать не менее 60 % суммы пиненов. При ГЖХ-анализе образца на хроматограмме получены пики -пинена площадью 1993 мм2; -пинена – 1068 мм2; камфена – 863 мм2; борнилацетата – 158 мм2 и остальные пики суммарной площадью 296 мм2. Соответствует ли образец требованиям НД? Ответ: соответствует, 69,9 %. 59
Задача № 11. Диметилсульфоксид согласно НД должен содержать не менее 99 % основного вещества. При ГЖХ-анализе на хроматограмме зафиксированы следующие пики: примесь 1 (не идентифицирована) площадью 101 мм2; диметилсульфоксид – 11876 мм2; примесь 2 (не идентифицирована) – 57 мм2. Соответствует ли образец требованиям НД? Ответ: соответствует, 98,7 %. Задача № 12. ГЖХ-анализу был подвергнут образец масла эвкалипта. На хроматограмме обнаружено два массива пиков не идентифицированных веществ общей площадью 1876 мм2 и пик цинеола высотой 96 мм и шириной на половине высоты 25 мм. Рассчитайте содержание цинеола в образце. Ответ: 56,1 %. Задача № 13. При количественном ГЖХ-анализе камфоры в качестве внутреннего стандарта используется нафталин. Для калибровки была выбрана модельная смесь из 0,1053 г камфоры и 0,1186 г нафталина. Площади пиков на полученной хроматограмме составили соответственно 4953 мм2 и 5246 мм2. Рассчитайте значение коэффициента пропорциональности (fx). Ответ: fx = 1,063. Задача № 14. При количественном ГЖХ-анализе камфоры в качестве внутреннего стандарта используется нафталин. Для хроматографирования была взята смесь 0,1096 г камфоры и 0,1183 г нафталина. Площадь пиков на полученной хроматограмме составила 5009 мм2 и 5832 мм2, соответственно. Рассчитайте содержание камфоры в образце, если величина коэффициента пропорциональности (fx) составляет 1,063. Ответ: 98,5 %. Задача № 15. Согласно НД для определения примеси остаточного растворителя изопропанола в ампициллине методом ГЖХ в качестве внутреннего стандарта используется н-пропанол (fx = 2,56). 60
Для анализа был взят раствор 0,3000 г ампициллина в 3 мл раствора, содержащего н-пропанола в концентрации 0,0002 г/мл. Площади пиков составили: площадь стандарта (Sст) – 2400 мм2 и площадь изопропанола (Sх) – 2100 мм2. Соответствует ли образец ампициллина требованиям НД, если допустимое содержание изопропанола не более 0,5 %? Ответ: соответствует, 0,45 %. Задача № 16. Согласно НД для определения α-токоферола ацетата в препарате «Аевит» методом ГЖХ в качестве внутреннего стандарта используется сквалан (fi = 1,295). На хроматограмме смеси 10 мг сквалана с 1 мл препарат «Аевит» получены пики сквалана площадью 201 мм2 и α-токоферилацетата – 923 мм2. Соответствует ли препарат требованиям НД, если содержание α-токоферилацетата должно составлять 54,0–66,0 мг/ мл? Ответ: соответствует, 59,5 мг/мл. Задача № 17. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания амфотерицина, если после ТСХ анализа в системе метанол–пропанол–уксусная кислота (8:1:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 13 см; расстояние, пройденное амфотерицином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 5,85 см; расстояние, пройденное СО амфотерицина, – 5,90 см. Ответ: Rf = 0,45; Rs = 0,99. Задача № 18. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания димедрола, если после ТСХ анализа в системе метанол–25% раствор аммиака (100:1,5) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 15 см; расстояние, пройденное димедролом от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 8,25 см; расстояние, пройденное СО димедрола, – 8,23 см. Ответ: Rf = 0,55; Rs = 1,00. 61
Задача № 19. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания циннаризина, если после ТСХ анализа в системе хлороформ–метанол (90:10) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 10 см; расстояние, пройденное циннаризином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 7,81 см; расстояние, пройденное СО циннаризина, – 7,8 см. Ответ: Rf = 0,78; Rs = 1,00. Задача № 20. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания ликопина, если после ТСХ анализа образца таблеток с ликопином в системе гексан–ацетон (6:2) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 12 см; расстояние, пройденное ликопином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 9,62 см; расстояние, пройденное СО ликопина, – 9,7 см. Ответ: Rf = 0,80; Rs = 0,99. Задача № 21. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания доксициклина, если после ТСХ анализа в системе метанол–25% раствор аммиака (100:1,5) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 15 см; расстояние, пройденное доксициклином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 7,20 см; расстояние, пройденное СО доксициклина, – 7,25 см. Ответ: Rf = 0,48; Rs = 0,99. Задача № 22. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания изониазида, если после ТСХ анализа в системе метанол–25% раствор аммиака (100:1,5) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 12 см; расстояние, пройденное изониазидом от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 6,24 см; расстояние, пройденное СО изониазида, – 6,24 см. Ответ: Rf = 0,52; Rs = 1,00. 62
Задача № 23. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания цетиризина, если после ТСХ анализа в системе этилацетат–метанол–20% раствор аммиака (7:1,5:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 15 см; расстояние, пройденное цетиризином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 5,70 см; расстояние, пройденное СО цетиризина, – 5,65 см. Ответ: Rf = 0,38; Rs = 1,01. Задача № 24. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания астаксантина, если после ТСХ анализа образца капсул с астаксантином в системе диэтиловый эфир–петролейный эфир (3:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 10 см; расстояние, пройденное астаксантином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 3,7 см; расстояние, пройденное СО астаксантина, – 3,65 см. Ответ: Rf = 0,37; Rs = 1,01. Задача № 25. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания лютеина, если после ТСХ анализа в системе петролейный эфир–диэтиловый эфир–кислота уксусная (85:15:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 13 см; расстояние, пройденное лютеином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 6,30 см; расстояние, пройденное СО лютеина, – 6,41 см. Ответ: Rf = 0,48; Rs = 0,98. Задача № 26. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания бупивокаина, если после ТСХ анализа в системе хлороформ–метанол (90:10) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 14 см; расстояние, пройденное бупивокаином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 9,1 см; расстояние, пройденное СО бупивокаина, – 9,15 см. Ответ: Rf = 0,65; Rs = 0,99. 63
Задача № 27. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания β-каротина, если после ТСХ анализа образца облепихового масла в системе гексан–ацетон (6:2) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 10 см; расстояние, пройденное β-каротином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 9,3 см; расстояние, пройденное СО β-каротина, – 9,25 см. Ответ: Rf = 0,93; Rs = 1,01. Задача № 28. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания лидокаина, если после ТСХ анализа в системе метанол–30% раствор аммиака (100:1,5) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 17 см; расстояние, пройденное лидокаином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 10,95 см; расстояние, пройденное СО лидокаина, – 11,05 см. Ответ: Rf = 0,64; Rs = 0,99. Задача № 29. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания β-каротина, если после ТСХ анализа образца облепихового масла в системе петролейный эфир–диэтиловый эфир–кислота уксусная (85:15:1) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 15 см; расстояние, пройденное β-каротином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 11,20 см; расстояние, пройденное СО β-каротина, – 11,00 см. Ответ: Rf = 0,75; Rs = 1,02. Задача № 30. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания кетамина, если после ТСХ анализа в системе бутанол–метанол (40:60) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 15 см; расстояние, пройденное кетамином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 11,70 см; расстояние, пройденное СО кетамина, – 11,50 см. Ответ: Rf = 0,78; Rs = 1,02. 64
Задача № 31. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания астаксантина, если после ТСХ анализа капсул с астаксантином в системе гексан–ацетон (6:2) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 11 см; расстояние, пройденное астаксантином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 9,53 см; расстояние, пройденное СО астаксантина, – 9,61 см. Ответ: Rf = 0,87; Rs = 0,99. Задача № 32. Рассчитайте фактор удерживания и относительный фактор удерживания зеаксантина, если после ТСХ анализа в системе гексан–ацетон (6:2) были получены следующие данные: фронт подвижной фазы – 16 см; расстояние, пройденное зеаксантином от точки на линии старта до центра зоны адсорбции, – 5,00 см; расстояние, пройденное СО зеаксантина, – 4,95 см. Ответ: Rf = 0,31; Rs = 1,01. Задача № 33. Рассчитайте содержание ацикловира в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,19780 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. Раствор стандартного образца (СО) ацикловира. Точную навеску 0,05000 г СО ацикловира помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 подвижной фазы, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). 65
После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО ацикловира получены следующие результаты: площадь пика ацикловира на хроматограмме испытуемого раствора – 19497; площадь пика ацикловира на хроматограмме раствора СО – 19898. Средняя масса таблетки – 0,192. Ответ: 0,0476 г/таб. Задача № 34. Рассчитайте содержание морфина гидрохлорида (г/мл) в растворе для инъекций «Омнопон 2%», если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. Раствор СО морфина гидрохлорида. Точную навеску 0,30000 г морфина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл подвижной фазы и встряхивают в течение 10 мин. Доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. После хроматографирования по 10 мкл испытуемого раствора и раствора СО морфина гидрохлорида получены следующие результаты: площадь пика морфина гидрохлорида на хроматограмме испытуемого раствора – 1218; площадь пика морфина на хроматограмме раствора СО – 1134. Ответ: 0,0129 г/мл. Задача № 35. Рассчитайте содержание ремантадина в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,20440 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 66
5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. Раствор СО ремантадина. Точную навеску 0,05000 г СО ремантадина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 2,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО ремантадина получены следующие результаты: площадь пика ремантадина на хроматограмме испытуемого раствора – 19999; площадь пика ремантадина на хроматограмме раствора СО – 19896. Средняя масса таблетки – 0,195. Ответ: 0,04795 г/таб. Задача № 36. Рассчитайте содержание папаверина гидрохлорида (г/мл) в растворе для инъекций «Омнопон 2%», если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. Раствор СО папаверина гидрохлорида. Точную навеску 0,02000 г папаверина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл подвижной фазы и встряхивают в течение 10 мин. Доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. После хроматографирования по 10 мкл испытуемого раствора и раствора СО папаверина гидрохлорида получены следующие результаты: площадь пика папаверина гидрохлорида на хроматограмме испытуемого раствора – 2000; площадь пика папаверина гидрохлорида на хроматограмме раствора СО – 1750. Ответ: 0,000914 г/мл. 67
Задача № 37. Рассчитайте содержание кодеина (г/мл) в растворе для инъекций «Омнопон 2%», если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. Раствор СО кодеина. Точную навеску 0,03600 г кодеина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл подвижной фазы и встряхивают в течение 10 мин. Доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают. После хроматографирования по 10 мкл испытуемого раствора и раствора СО кодеина получены следующие результаты: площадь пика кодеина на хроматограмме испытуемого раствора – 1517; площадь пика кодеина на хроматограмме раствора СО – 1440. Ответ: 0,00152 г/мл. Задача № 38. Рассчитайте содержание лозартана в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,21390 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. Раствор СО лозартана. Точную навеску 0,05000 г СО лозартана помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 мл, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). 68
После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО лозартана получены следующие результаты: площадь пика лозартана на хроматограмме испытуемого раствора – 19696; площадь пика лозартана на хроматограмме раствора СО – 19894. Средняя масса таблетки – 0,193. Ответ: 0,0447 г/таб. Задача № 39. Рассчитайте содержание диклофенака натрия в растворе для инъекций 25 мг/мл, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят водой до метки (раствор А). Раствор СО диклофенака натрия. Точную навеску 0,12500 г СО диклофенака натрия помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО диклофенака натрия получены следующие результаты: площадь пика диклофенака натрия на хроматограмме испытуемого раствора – 17040; площадь пика диклофенака натрия на хроматограмме раствора СО – 15500. Ответ: 27,48 мг/мл. Задача № 40. Рассчитайте содержание бутамирата в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,21160 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. 69
Раствор СО бутамирата. Точную навеску 0,05000 г СО бутамирата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 мл подвижной фазы, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО бутамирата получены следующие результаты: площадь пика бутамирата на хроматограмме испытуемого раствора – 22449; площадь пика бутамирата на хроматограмме раствора СО – 19896. Средняя масса таблетки – 0,194. Ответ: 0,0517 г/таб. Задача № 41. Рассчитайте содержание пироксикама в капсулах по 20 мг, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску содержимого капсул 0,15100 г помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят подвижной фазой до метки. Раствор СО пироксикама. Точную навеску 0,20000 г СО пироксикама помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 15–25 мл этанола, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 1 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО пироксикама получены следующие результаты: площадь пика пироксикама хроматограмме испытуемого раствора – 21968; площадь пика пироксикама на хроматограмме раствора СО – 1023. Средняя масса содержимого капсулы – 0,155. Ответ: 22,04 мг/капсулу. 70
Задача № 42. Рассчитайте содержание вориконазала в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,18930 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. Раствор СО вориконазала. Точную навеску 0,05000 г СО вориконазала помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 мл, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО вориконазала получены следующие результаты: площадь пика вориконазала на хроматограмме испытуемого раствора – 20077; площадь пика вориконазала на хроматограмме раствора СО – 19894. Средняя масса таблетки – 0,201. Ответ: 0,0536 г/таб. Задача № 43. Рассчитайте содержание флударабина в концентрате 25 мг/мл для приготовления раствора для инъекций, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят водой до метки (раствор А). Раствор СО флударабина. Точную навеску 0,12500 г СО флударабина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 71
5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО флударабина получены следующие результаты: площадь пика флударабина на хроматограмме испытуемого раствора – 13942; площадь пика флударабина на хроматограмме раствора СО – 15497. Ответ: 22,49 мг/мл. Задача № 44. Рассчитайте содержание бикалутамида в таблетках по 0,05 г, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску 0,19780 г порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25–30 мл ЛУК, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки подвижной фазой. Раствор СО бикалутамида. Точную навеску 0,05000 г СО бикалутамида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15–20 мл, после чего объем раствора доводят до метки подвижной фазой (раствор А). 5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 2 мкл испытуемого раствора и раствора СО бикалутамида получены следующие результаты: площадь пика бикалутамида на хроматограмме испытуемого раствора – 19497; площадь пика бикалутамида на хроматограмме раствора СО – 19894. Средняя масса таблетки – 0,193. Ответ: 0,04781 г/таб.
72
Задача № 45. Рассчитайте содержание темозоломида в капсулах по 20 мг, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску содержимого капсул 0,15000 г помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют и доводят объем раствора водой до метки. Раствор СО темозоломида. Точную навеску 0,20000 г СО темозоломида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО темозоломида получены следующие результаты: площадь пика темозоломида хроматограмме испытуемого раствора – 19838; площадь пика темозоломида на хроматограмме раствора СО – 1026. Средняя масса содержимого капсулы – 0,155. Ответ: 19,98 мг/капсулу. Задача № 46. Рассчитайте содержание инозина в растворе для инъекций 25 мг/мл, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят водой до метки (раствор А). Раствор СО инозина. Точную навеску 0,12500 г СО инозина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). 73
После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО инозина получены следующие результаты: площадь пика инозина на хроматограмме испытуемого раствора – 16239; площадь пика инозина на хроматограмме раствора СО – 15495. Ответ: 26, 2 мг/мл. Задача № 47. Рассчитайте содержание омепразола в капсулах по 20 мг, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. Точную навеску содержимого капсул 0,15000 г помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят этанолом до метки. Раствор СО омепразола. Точную навеску 0,20000 г СО омепразола помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 15–25 мл этанола, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО омепразола получены следующие результаты: площадь пика омепразола хроматограмме испытуемого раствора – 19842; площадь пика омепразола на хроматограмме раствора СО – 1025. Средняя масса содержимого капсулы – 0,156. Ответ: 20,13 мг/капсулу. Задача № 48. Рассчитайте содержание папаверина гидрохлорида в растворе для инъекций 25 мг/мл, если растворы для ВЭЖХ анализа готовили по следующим схемам: Испытуемый раствор. 1 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, далее объем раствора доводят водой до метки (раствор А). 74
Раствор СО папаверина гидрохлорида. Точную навеску 0,12500 г СО папаверина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 15–25 мл воды, после чего объем раствора доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят до метки подвижной фазой и перемешивают (раствор Б). После хроматографирования по 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО папаверина гидрохлорида получены следующие результаты: площадь пика папаверина гидрохлорида на хроматограмме испытуемого раствора – 15243; площадь пика папаверина гидрохлорида на хроматограмме раствора СО – 15491. Ответ: 24, 6 мг/мл.
75
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная: 1. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч: Ч.1. Общая фармацевтическая химия; Ч.2. Специальная фармацевтическая химия: учеб. для вузов / В. Г. Беликов. – Пятигорск, 2003. – 714 с. 2. Арзамасцев, А.П. Фармацевтическая химия: учеб. пособие / Под ред. А. П. Арзамасцева. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2008. – 640 с. 3. Фармацевтическая химия: учеб. пособие: в 2 ч. / В. Г. Беликов. – 3-е изд. – М.: МЕДпрессинформ, 2009. – 616 с. Дополнительная: 1. Конюхов, В.Ю. Хроматография / В. Ю. Конюхов. – М.: Лань, 2012. – 224 с. 2. Сычев, К.С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии / К. С. Сычев. – М.: Техносфера, 2010. – 272 с. 3. Яшин, Я.И. Газовая хроматография / Я. И. Яшин, Е. Я. Яшин. – М.: ТрансЛит, 2009. – 528 с. Нормативные правовые акты: 1. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд. – М.: Медицина, 1987. – Вып. 1. – С. 25–113. 2. Государственная фармакопея РФ. – 12-е изд. – М.: НЦЭСМП, 2008. – 704 с. 3. Государственная фармакопея РФ. – 13-е изд. [Электронный ресурс]. – М.: НЦЭСМП, 2015. – URL: http://www.femb.ru.
76
ОТВЕТЫ К ТЕСТОВЫМ ЗАДАНИЯМ 001 – 1 006 – 2 011 – 2 016 – 3 021 – 3 026 – 3 031 – 1 036 – 1 002 – 1 007 – 4 012 – 4 017 – 1 022 – 2 027 – 3 032 – 4 037 – 2 003 – 2 008 – 2 013 – 2 018 – 2 023 – 4 028 – 1 033 – 2 038 – 1 004 – 3 009 – 4 014 – 2 019 – 4 024 – 4 029 – 4 034 – 2 039 – 4 005 – 2 010 – 3 015 – 3 020 – 4 025 – 1 030 – 4 035 – 4 040 – 2
041 1 – a, б 2 – в, г
042 1–в 2–б 3–а
043 1 – а, в, г, е 2 – б, д, ж
77
044 1–г 2–в 3–б 4–ж
ДЛЯ ЗАМЕТОК
78
ДЛЯ ЗАМЕТОК
79
Учебное издание
Курегян Анна Гургеновна Печинский Станислав Витальевич
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В АНАЛИЗЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Учебное пособие
Редакторы К. Н. Корянова, Г. Г. Курегян Компьютерная верстка Е. Е. Таракановой Оформление обложки Е. А. Могутиной Директор Издательства ВолгГМУ Л. К. Кожевников Санитарно-эпидемиологическое заключение № 34.12.01.543. П 000006.0107 от 11.01.2007 г. Подписано в печать 21.08.2017 г. Формат 60х84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 4,65. Уч. изд. л. 3,59. Тираж 390 экз. Заказ 256. Волгоградский государственный медицинский университет 400131 Волгоград, пл. Павших борцов, 1. Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ 357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 Издательство ВолгГМУ 400006 Волгоград, ул. Дзержинского, 45.
80