Мембранология

Министерство образования Российской Федерации Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Кафедра химии и технологии тонких органических соединений

Н.А. Брагина, А.Ф. Миронов

МЕМБРАНОЛОГИЯ

Учебно-методическое пособие

Москва 2002 г.

2

99

Учебно-методическое пособие

УДК 547.9(075.8)

Брагина Н.А., Миронов А.Ф. "Мембранология". - Учебно-методическое пособие. Рецензент: Академик РАН, профессор, Д.х.н. Мирошников А.И. / ИПЦ МИТХТ, 2002, стр.98, рис. 46.

Брагина Наталья Александровна Миронов Андрей Фёдорович

Представлен курс лекций и контрольные вопросы по специальной дисциплине "Мембранология" магистерской программы 550528 “Химия и технология биологически активных веществ”. Учебно-методическое пособие предназначено магистрам для подготовки к занятиям и экзаменам, а также студентам высшей инженерной школы для самообразования и бакалаврам для осознанного выбора профиля специальной подготовки на третьей ступени высшего образования.

МЕМБРАНОЛОГИЯ

Главный редактор В.Д. Капкин Компьютерная верстка Д.В. Брагин

ЛР код 221 серия ИД № 03507

ISBN 5 – 230 – 22694 – 3 Утверждено БИК МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Подписано в печать __________. Формат 60×90/16.

Печать ризограф. Тираж 100 экз. Заказ № ____________. © МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2002, ISBN 5 – 230 – 22694 – 3 Издательско-полиграфический центр МИТХТ им. М.В. Ломоносова. 117571 Москва, пр. Вернадского, 86.

98

ЛИТЕРАТУРА Основная: 1. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. 2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1988. 3. Введение в биомембранологию. Под ред. А.А. Болдырева. – М.: Издво МГУ, 1990. 4. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж.. Молекулярная биология клетки. В 5-ти т. - М.: Мир, 1987. 5. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х т. - М.: Мир, 1988. 6. Чупин В.В. Роль липидов в структурной организации мембран и взаимодействии с белками. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. – М., 1997. 7. Бергельсон Л.Д. Мембраны. Молекулы. Клетки. - М.: Наука, 1982. Дополнительная: 1. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н.. Динамическая структура липидного бислоя. - М.: Наука, 1981. 2. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. - М.: Наука, 1982. 3. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. - М.: Мир, 1980. 4. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. - М.: Наука, 1986. 5. Липосомы в биологических системах. Под ред. Г. Грегориадиса, А. Аллисона. - М.: Медицина, 1983.

3

Содержание 1. Введение: основные типы и роль мембранных структур в клетке ........ 4 Необходимость присутствия биологических мембран в клетке ........... 4 Типы клеточных мембран......................................................................... 5 Функции биомембран................................................................................ 8 Методы выделения биологических мембран ......................................... 8 Состав биологических мембран ............................................................ 10 2. Мембранные липиды: структура и свойства ......................................... 10 2.1. Основные классы липидов биологических мембран .................... 11 Минорные компоненты ........................................................................... 17 2.2. Структурообразование липидов ..................................................... 18 3. Искусственные мембраны: условия их образования и использование в качестве модельных систем................................................................. 32 Мономолекулярные слои на границе раздела фаз воздух-вода........ 33 Плоские бислойные мембраны (БЛМ) .................................................. 36 Липосомы................................................................................................. 37 4. Структура биологических мембран ........................................................ 40 Жидкостно-мозаичная модель строения биомембран ........................ 40 Асимметрия биомембран ....................................................................... 44 5. Мембранные белки .................................................................................. 46 Принципы структурной организации мембранных белков .................. 46 Выделение и очистка мембранных белков........................................... 47 Характеристика очищенных интегральных мембранных белков. ...... 52 Определение молекулярной массы мембранных белков................... 52 Определение вторичной и третичной структуры мембранных белков .................................................................................................................. 56 Третичная и четвертичная структура мембранных белков................. 61 6. Электрические свойства мембран.......................................................... 65 7. Мембранный транспорт........................................................................... 68 7. 1 Пассивный транспорт через мембраны......................................... 69 7.2. Активный транспорт через мембраны. .......................................... 80 7.3 Мембранный транспорт макромолекул и частиц ........................... 83 8. Участие мембран в передаче межклеточной информации ................. 88 ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................... 98

4

97

1. Введение: основные типы и роль мембранных структур в клетке

Таким образом, за проведение нервного импульса отвечает изменение проницаемости мембраны аксона. + Экспериментальные данные подтвердили тот факт, что катионы Na + и K проходят через мембрану нерва по разным каналам. Так, действие яда тетродотоксина, парализующего проведение нервного импульса, + блокирует проводимость Na -каналов, в то время как проводимость ио+ + нов K не затрагивается. Было подсчитано число Na -каналов в аксонах 2 кролика – оно не превышает 75 каналов на 1 мкм , скорость движения + Na соответствует механизму простой диффузии через белковый канал 8 -1 + (10 с ). Установлено, что число K -каналов много больше, но меньше проводимость этих ионов, что соответствует механизму транспорта ио+ нов K с помощью специальных переносчиков.

Биологические мембраны представляют собой специальные полупроницаемые барьеры, отделяющие внутриклеточное содержимое и содержимое внутриклеточных органелл от окружающей среды. Все биологические мембраны построены по единым принципам, а особенности структурной организации и функционирования обусловлены различиями в химическом составе мембран и специфичности межмолекулярных взаимодействий мембранных компонентов.

Необходимость присутствия биологических мембран в клетке В клетках прокариот (бактерии, риккетсии, микоплазмы) внутриклеточная дифференциация, а, следовательно, и внутриклеточные мембраны отсутствуют. Внутриклеточные органеллы характерны для клеток эукариот (растения, животные). Полагают, что одна из причин такого рода различий состоит в том, что линейные размеры клеток эукариот, как правило, на порядок больше размеров клеток прокариот. Вследствие этого удельная поверхность плазматической мембраны эукариот заметно меньше по сравнению с прокариотами. Развитая сеть внутриклеточных мембран позволяет увеличить удельную поверхность мембран в клетках эукариот и, таким образом, обеспечить оптимальные условия для протекания биохимических процессов на поверхности мембран и внутри отдельных компартментов. С химической точки зрения разделение клетки на отдельные отсеки исключительно выгодно для координированного и эффективного осуществления биохимических реакций. Во-первых, скорость ферментативных реакций увеличивается за счет локализации во внутриклеточных органеллах, внутренний объем которых значительно меньше общего объема клетки. Это приводит к увеличению концентрации ферментов и субстратов и, как следствие этого, скорости химических реакций. Во-вторых, мембраны внутриклеточных органелл могут физически разделять в пространстве прямые и обратные реакции метаболического цикла. Втретьих, большинство клеточных ферментов работают на поверхности мембран, что в значительной степени повышает эффективность катализа, так как трехмерная диффузия реагирующих веществ заменяется на двумерную. В-четвертых, в обычных условиях мембраны непроницаемы

5

4. После этих событий первоначальное значение потенциала очень быстро (тысячные доли секунды) восстанавливается, и аксон вновь готов к дальнейшему проведению импульса.

для многих веществ, в том числе для низкомолекулярных ионов, что позволило в процессе эволюции создать специальные механизмы преобразования энергии и передачи информации с использованием потенциальной энергии трансмембранного градиента концентраций некоторых веществ и ионов.

Мембранный потенциал, мВ

96

0

Типы клеточных мембран

Потенциал действия

Потенциал покоя

-70 0

1

2

3

Время, мс

Рис.46. Потенциал действия Аксон изолирован слоем шванновских клеток, подобных изоляционной ленте вокруг проводника, эта миелиновая оболочка не пропускает катионы. В результате перехода внутрь аксона большого количества ио+ + нов Na , в аксоне возникают продольные токи, т.е. ионы Na мигрируют в следующий соседний отсек аксона, находящийся в состоянии покоя. Потенциал в этом отсеке повышается, при достижении его значения + – 60 мВ открываются Na -каналы, потенциал достигает максимального значения и повторяется вся приведенная выше цепь событий в аксоне. Таким образом, по всей длине аксона распространяется волна потенциала действия. Этот процесс аналогичен тому, как огонь бежит по бикфордову шнуру. Скорость распространения - от 1 до 100 м/с в зависимости от типа аксона. Потенциал действия достигает конца аксона и дает сигнал для выброса в синаптическую щель нейромедиатора, который в следующей клетке возбуждает ту же цепь событий. После проведения импульса система возвращается в первоначальное равновесное состояние, гра+ + диенты концентраций катионов Na и K восстанавливает фермент + + Na ,K -АТФаза.

Эукариотические клетки содержат различные мембранные органеллы, причем каждая мембрана уникальна по своему составу, особенностям структурной организации и по характеру выполняемых функций. Рассмотрим кратко основные типы клеточных мембранных структур (рис.1). Плазматическая мембрана образует границу, на которой осуществляется контакт клетки с ее окружением. Она содержит компоненты, участвующие в межклеточных контактах и взаимодействиях, в системах гормонального ответа и транспорта как малых, так и больших молекул из клетки и внутрь нее. Плазматическая мембрана чрезвычайно эластична, благодаря чему животные клетки могут довольно сильно изменять свою форму без разрыва мембраны. Большинство растительных и бактериальных клеток, в отличие от животных, не способно менять свою форму, так как они окружены толстой, прочной и малоупругой оболочкой – клеточной стенкой. Плазматическая мембрана неоднородна по своему составу, она состоит из специализированных участков (апикальный, базолатеральный и синусоидный) которые имеют различное окружение. Плазматическая мембрана может иметь и специализированные структуры, например, микроворсинки, которые значительно увеличивают площадь поверхности мембраны, в результате чего повышается эффективность мембранного транспорта. Ядерная мембрана состоит из двух мембран, расстояние между которыми составляет от 40 до 70 нм. В некоторых местах наружная и внутренняя мембраны ядра смыкаются; здесь имеются поры, диаметр которых достигает 80 нм. Интересно, что расположение пор меняется на протяжении жизни клетки: в фазе роста они распределены беспорядочно по всей поверхности ядра, в остальных фазах клеточного цикла собираются в определенных местах, а во время деления – вовсе исчезают. Полагают, что поры позволяют комплексам мРНК-белок переходить из ядра в цитоплазму, а регуляторным белкам в обратном направлении. Ядерная мембрана выполняет не только защитную роль, но и служит передатчиком информации между ядром и остальной частью клетки.

6

95

тельно, и многие нейроны проводят сигналы пассивно, без усиления. Однако, для дальней связи такого пассивного распространения сигнала недостаточно, и поэтому у нейронов с длинными отростками в ходе эволюции выработался активный сигнальный механизм. Электрический стимул, сила которого превышает определенную пороговую величину, вызывает взрыв электрической активности, распространяющийся с большой скоростью вдоль плазматической мембраны нейрона. Эту бегущую волну возбуждения называют потенциалом действия или нервным импульсом. Потенциал действия передает информацию с одного конца нейрона на другой без затухания со скоростью до 100 м/с, а в некоторых случаях еще быстрее.

Рис.1. Схематическое изображение органелл эукариотических клеток животных и растений на основании данных электронной микроскопии Митохондрии осуществляют окислительное фосфорилирование, в результате чего в ходе окисления субстратов (NADH, сукцинат) образуется АТФ. Эти органеллы являются субклеточными частицами, которые образованы двумя мембранами – наружной и внутренней, разделенны-

Механизм передачи нервного импульса. 1. В состоянии покоя (при отсутствии возбуждения) между внутренней и наружной сторонами плазматической мембраны аксона поддерживается разность потенциалов (трансмембранный потенциал ∆Ψ), называемая потенциалом покоя, при котором суммарный ток различных ионов, пересекающих мембрану, равен нулю. Внутри мембраны присутствует отрицательный электрический заряд, ∆Ψ = – 70 мВ. При повышении потенциала до значения –60 мВ происходит возбуждение аксона, откры+ + + ваются потенциалзависимые каналы для катионов Na и K (Na -канал + считается быстрым, а K -канал медленным). 2. В начальный момент в мембрану аксона проникают в основном + ионы Na , что приводит к резкому увеличению мембранного потенциала и достижению его максимального значения (рис.46). Теперь для даль+ нейшего проникновения внутрь аксона ионам Na пришлось бы преодо+ левать градиент потенциала, поэтому поступление Na из наружной + среды прекращается и в этот момент Na -канал как бы закрывается. + + 3. Через K -канал во внешнюю среду вытекают ионы K по своему концентрационному градиенту до тех пор, пока внутри аксона не восстанавливается первоначальный отрицательный потенциал. Однако, про+ цесс поступления K во внешнюю среду продолжается несколько дольше, чем требовалось бы, и поэтому потенциал падает до уровня меньшего, чем значение потенциала покоя (рис.46). В этот момент аксон становится невозбудимым, т.е. лишается способности проводить нервный импульс.

94

7

Между смежными сегментами миелиновой оболочки остаются небольшие открытые участки аксона длиной около 1 мкм – перехваты Ранвье. Сигналы, проводимые нейронами, передаются от одной клетки к другой в местах контакта, называемых синапсами (места плотного контакта) (рис.45). Изменение электрического потенциала в пресинаптической мембране приводит к высвобождению нейромедиатора, который выходит через синаптическую щель и связывается с рецептором на постсинаптической мембране, что приводит к изменению электрофизиологического состояния постсинаптической клетки. Происходит превращение электрического сигнала в химический и далее химического – вновь в электрический.

ми некоторым промежутком. Наружная мембрана – гладкая, ее толщина равна примерно 7 нм, тогда как внутренняя мембрана образует многочисленные складки (кристы) и содержит ферменты, участвующие в транспорте электронов и синтезе АТФ. Внутренняя область митохондрий называется матриксом. Эндоплазматический ретикулум (ЭР) – это сложная сеть цистернообразных или трубчатых структур, которая занимает значительную часть внутреннего объема клетки. Основная роль ЭР состоит в том, что он служит местом биосинтеза белков (шероховатый ЭР, где расположены рибосомы), которые затем секретируются, включаются в лизосомы или в плазматическую мембрану. Области ЭР, не содержащие рибосом, называют гладким ЭР. Здесь протекают реакции детоксикации, биосинтез стеролов, десатурация жирных кислот. Аппарат Гольджи представляет собой сеть уплощенных мешков (цистерн), собранных в стопки. Основная его функция заключается в посттрансляционной модификации гликопротеинов, синтезированных в ЭР и предназначенных для секреции, включения в плазматическую мембрану или доставки в лизосомы. Эти органеллы содержат ферменты гликозидазы и гликозилтрансферазы, которые вступают в действие последовательно, по мере того как белок, подвергаемый процессингу, перемещается от начала аппарата Гольджи (цис-область) до его конца (транс-область). Фактически аппарат Гольджи состоит из совокупности отдельных мембран, образующих цистерны. Лизосомы ответственны за деградацию макромолекул и содержат ряд гидролитических ферментов, таких как протеазы и липазы. В лизосомах происходит также расщепление клеточных компонентов в ходе их жизненного цикла. Пероксисомы содержат окислительные ферменты, участвующие в деградации малых молекул, таких, как аминокислоты, ксантин, жирные кислоты. Их название связано с присутствием в них фермента каталазы, которая разлагает перекиси, образующиеся как побочные продукты при окислении. Хлоропласты – это органеллы, содержащие фотосинтетический аппарат. Они имеют наружную оболочку, образуемую двумя мембранами, и внутреннюю область – строму. В строме находятся тилакоидные мембраны, где локализованы компоненты системы фотосинтеза.

Окончание аксона нейрона А (пресинаптической клетки) Пузырьки, содержащие нейромедиатор Высвобождаемый нейромедиатор

Пресинаптическая мембрана Синаптическая щель Постсинаптическая мембрана Дендрит нейрона Б (постсинаптической клетки)

Рис.45. Синаптическая передача Причина возникновения электрического сигнала состоит в изменении электрического потенциала на плазматической мембране нейрона. Передача сигналов основана на том, электрическое возмущение, возникшее в одном участке клетки, распространяется на другие участки. Если нет дополнительного усиления, эти возмущения затухают по мере удаления от их источников. На коротких расстояниях затухание незначи-

93

8

Функции биомембран Основные функции, присущие биомембранам в клетке, состоят в следующем: 1. Мембраны представляют собой полупроницаемые барьеры – защитная функция для клеток и внутриклеточных органелл. 2. Мембраны осуществляют избирательный транспорт различных веществ внутрь клетки и из нее. 3. Передача информации посредством гормонов, медиаторов, нервного импульса. 4. Преобразование энергии (синтез АТФ осуществляется на внутренних мембранах митохондрий за счет энергии трансмембранного градиента концентраций протонов.) 5. Процессы молекулярного узнавания происходят на мембранах клеток, где располагаются рецепторы гормонов, молекулы иммунной системы. 6. Ферментативная деятельность мембран связана с координацией всех биохимических реакций, протекающих в клетке. Кроме основных, существуют и другие специальные функции мембран (мембраны кишечника, органов чувств, хлоропластов).

ками – нейронами. Существуют нейроны двух видов: чувствительные (передают высшим центрам нервной системы импульсы, возникающие на рецепторных мембранах под влиянием внешних раздражителей) и двигательные (передают импульсы от высших центров нервной системы к мышечным клеткам и секреторным органам). Любая нервная клетка состоит из тела и отростков различной длины. Тело клетки содержит все органеллы, присущие эукариотическим клеткам (ядро, митохондрии, ЭПР и др.), и служит биосинтетическим центром. Дендриты представляют собой систему ветвящихся отростков различной длины, которые отходят от тела нейрона и увеличивают поверхность, способную принимать сигналы от других клеток (рис.44).

Аксон (длина от долей миллиметра до метра и более)

Методы выделения биологических мембран Исследование мембран начинается с их выделения из природных источников и очистки от других клеточных компонентов. Для каждого типа клеточных мембран нужно подобрать условия препаративного выделения и очистки. 1. Процесс выделения клеток начинается с разрушения тканей и клеток, обычно путём гомогенизации. При работе с животными клетками этот процесс проводят в гомогенизаторах со стеклянными стенками и тефлоновым пестиком. При этом клетки разрушаются за счет сдвиговых усилий при продавливании суспензии через узкий зазор между пестиком и стенкой гомогенизатора. При такой обработке “срывается” плазматическая мембрана и разрушаются связи между различными органеллами при сохранении их целостности. Для разрушения клеток, имеющих стенку (таких как бактерии, клетки грибов и растительные клетки), требуются более жесткие условия. Например, обработка ферментами и буферами, растирание клеток в присутствии абразивных материалов, обработка ультразвуком и экструзия. Большое значение при разрушении клеток имеет правильный выбор среды. Для того чтобы сохранить целостность

Тело нейрона

Дендриты

Концевые веточки аксона

Рис.44. Строение нервной клетки Самый длинный из отростков называется аксоном; в процессе развития нервной клетки один из ее отростков начинает расти до тех пор, пока не достигает той точки, с которой ему предстоит поддерживать контакт. Длина аксона достигает размеров от долей миллиметра до 1.5 м (у человека). Аксон подобен телеграфному кабелю тем, что он хорошо изолирован. Изоляцию вокруг аксона создают специальные клетки, называемые шванновскими. Плазматическая мембрана этих клеток концентрическими слоями (до 100 слоев) плотно наматывается на аксон, образуя сегмент миелиновой оболочки длиной около 1 мм. Миелиновая оболочка состоит из липидно-белковых мембран, плохо пропускающих ионы, что практически полностью предотвращает утечку тока из аксона.

92

9

2+

биомембран для этого иона и постоянной работой ферментов Cа 2+ АТФаз. Резкое изменение в клетке концентрации ионов Cа происходит за счет специальных кальциевых каналов, которые в ответ на внешний 2+ стимул (например, деполяризацию) открываются и высвобождают Cа из внеклеточного пространства или из внутриклеточных депо, которыми служат цистерны ЭПР и иногда мембраны митохондрий. Белки-эффекторы. Синтез вторичных мессенджеров вызывает ответ биологической системы, который формируется через биохимическую модификацию специализированных молекул-эффекторов (рис.42). Ряд белковэффекторов осуществляет свои функции в результате реакций фосфорилирования своих субстратов цАМФ-зависимыми протеинкиназами. Молекула протеинкиназы состоит из двух субъединиц: регуляторной и каталитической. цАМФ связывается с регуляторной субъединицей, после чего происходит отделение каталитической субъединицы и фосфорилирование соответствующего белка. Диацилглицерины инициируют механизмы, в результате которых активируются два типа протеинкиназ: протеинкиназа С и цГМФ-зависимая киназа. Известно, что цГМФ активирует так называемые G-киназы, вызывающие фосфорилирование определенных белков, физиологическая роль которых пока не установлена. Таким образом, механизмы передачи информации в живых системах также универсальны, как передача генетического кода или трансформация энергии. Все громадное разнообразие сигналов, полученное различными рецепторами, преобразуется по единым механизмам за счет идентичности второй и третьей стадий передачи информации через мембрану (рис.42). Нервный импульс, синаптическая передача Природа создала два принципиально различных способа межклеточной сигнализации. Один из них состоит в том, что сообщения передаются при помощи электрического тока; во втором используются молекулы, передаваемые от одной клетки к другой (гормоны). В обоих случаях передача сигнала зависит от проницаемости мембран. Электрическая система передачи информации служит для передачи нервного раздражения и осуществляется специальными нервными клет-

мембранных органелл, следует использовать среду, изоосмотичную их внутреннему содержимому. Чаще всего для этого используют раствор 0.25 – 0.30 М сахарозы. 2. Разделение мембран в настоящее время чаще всего осуществляют различными методами центрифугирования. Мембранные частицы можно разделить по скорости их седиментации или по плавучей плотности. Первый метод называют зональным центрифугированием, и разделение происходит в соответствии со значениями коэффициента седиментации S; а второй – изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. На практике обычно применяют некий гибрид этих двух методов. Для выделения мембран из клеточных гомогенатов используют и другие методы: - Фазовое распределение. Разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их поверхностными свойствами – с этой целью формируют два или три несмешивающихся слоя водных растворов различных полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, фиколла), и мембранные частицы разделяются в соответствии с их сродством к этим фазам. - Непрерывный электрофорез в свободном потоке. В этом случае разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их электрическим зарядом. - Аффинная адсорбция. Разделение основано на биоспецифическом взаимодействии между мембранными компонентами и твердой фазой, к которой ковалентно присоединены антитела. Чаще всего метод используют для выделения мембранных белков. - Использование микрогранул силикагеля. Этот подход разработан специально для выделения плазматических мембран. Катионизированные микрогранулы силикагеля прочно адсорбируются на наружной поверхности плазматической мембраны интактных клеток, и фракция плазматических мембран, связанных с гранулами, легко отделяются в градиенте плотности сахарозы от других мембран за счет более высокой плотности гранул. 3. Определение чистоты мембранных фракций: наиболее объективным критерием чистоты выделенной мембранной фракции является присутствие в ней какого-либо уникального компонента, который содержится только в этой мембране или является в ней преобладающим. Обычно такими компонентами служат ферменты, называемые в этом случае маркерами. В ряде случаев более удобными мембранными мар-

10

91

керами являются специфические рецепторы лектинов, гормонов, токсинов или антител. Кроме того, если мембранная система хорошо охарактеризована, о чистоте можно судить по ее белковому составу. В некоторых случаях препарат характеризуют с помощью электронной микроскопии; а также по содержанию холестерина.

заны со стимулирующими рецепторами (Rs), а Gi-белки – с ингибирующими рецепторами (Ri). Взаимодействие сигнала с рецептором приводит к изменению конформации рецептора. Эта перестройка конформации рецептора передается G-белку, который в свою очередь изменяет конформацию и приобретает способность связывать ГТФ. Связывание G-белка ГТФ приводит к его активации, после чего он становится способен взаимодействовать с аденилатциклазой. При этом Gs-белки активируют аденилатциклазу, а Gi-белки, наоборот, ингибируют активность этого фермента. Аденилатциклаза осуществляет перевод АТФ в цАМФ, при этом две из трех фосфатных групп отделяются, а третий фосфат образует цикл с молекулой рибозы, соединяясь с ней через атомы кислорода (рис.43). Канал передачи информации включается при взаимодействии Gбелка с ГТФ и этого комплекса с аденилатциклазой. В ответ на это включение в клетке увеличивается или уменьшается концентрация вторичного мессенджера цАМФ, в результате чего информация проходит через мембрану. Согласно второму пути (рис.42), внешний сигнал после взаимодействия с рецептором через G-белок активирует фермент фосфодиэстеразу (фосфолипазу С), которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5дифосфат с образованием диацилглицерина и инозитолтрифосфата. 2+ Инозитолтрифосфат вызывает освобождение ионов Cа из мембран эндоплазматического ретикулума, по-видимому, связываясь со специальным рецептором. Несмотря на то, что процесс выброса ионов 2+ Cа из внутриклеточных депо под действием фосфоинозитидов обнаружен в целом ряде клеток, механизм, с помощью которого он открывает внутриклеточные кальциевые каналы, окончательно не выяснен. 2+ Кроме этого, для активации ионов Cа в клетке часто используется цАМФ. Так, адреналин приводит к повышению концентрации в клетках миокарда цАМФ, который открывает кальциевый канал, а вход в миоцит 2+ ионов Cа усиливает сокращение сердечной мышцы. Аналогичный механизм обнаружен в ряде мышечных клеток, в секреторных и нервных 2+ клетках. В настоящее время Cа признан универсальным вторичным мессенджером, участвующим практически во всех регуляторных процессах – от мышечного сокращения и нервного проведения сигнала до передачи митогенного стимула в клетках иммунной системы. Низкая кон2+ центрация ионов Cа в клетке поддерживается низкой проницаемостью

Состав биологических мембран Все биологические мембраны содержат липиды, белки и углеводы. Основными компонентами мембран являются белки и липиды, а на долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран. При этом углеводы всегда входят в состав гликопротеинов или гликолипидов. Кроме того, еще одним химическим компонентом биологических мембран является вода, молекулы которой прочно связываются с поверхностью мембран и образуют слой так называемой мембраносвязанной воды. Соотношение между белками и липидами в составе различных мембран может варьировать в достаточно широких пределах. Так, миелиновая мембрана выполняет роль изолятора, и содержание белков в ней невелико (около 18 %), а внутренняя мембрана митохондрий, где протекают многие биохимические процессы, характеризуется значительно более высоким содержанием белков (до 80 %).

2. Мембранные липиды: структура и свойства Совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако точного объяснения этому феномену пока не найдено. Наиболее поражает в мембранных липидах их огромное разнообразие – любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия все-таки не ясны. Основная функция мембранных липидов состоит в формировании бислойного матрикса, с которым взаимодействуют белки.

11

90

Роль вторичных мессенджеров выполняет небольшое число молекул. В настоящее время известно всего лишь два пути передачи сигнала, отличающихся по участию различных вторичных мессенджеров (рис.42). В первом случае это циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (рис.43). Во втором случае действует комбинация трех вторичных мессенд2+ жеров: Cа , инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Два последних вещества образуются из мембранных фосфолипидов. Кроме того, полагают, что в клетках нервной ткани роль вторичного мессенджера может играть циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) (рис.42). NH2

АТФ

O

N

N

O

O

NH2

цАМФ

N

N

N

N

-

O P O P O P O CH2 -

O

-

O

-

O

Структура O

OH

O P

+

CH2OCOR1

O

Название

H

O OH

Глицерофосфолипиды – это наиболее распространенные полярные липиды в мембранах. Одна из гидроксильных групп глицерина связана с полярной группировкой, содержащей фосфат, а две другие – с гидрофобными остатками. Номенклатура глицеридов основана на системе стереоспецифической нумерации (sn–система): если глицерин изобразить в проекции Фишера, так что центральная группа будет расположена слева, то атомы углерода будут нумероваться так, как показано на рис 2. В литературе встречается несколько систем стереоспецифических обозначений: sn, D/L и R/S. Природные фосфолипиды обычно имеют R- (или D)-конфигурацию. У большинства фосфоглицеридов фосфатная группа находится в sn-3положении глицерина; она обычно связана с какой-либо из групп (холиновой, этаноламиновой, мио-инозитольной, сериновой или глицериновой), представленных на рис.2.

CH2

аденилатциклаза

O

N

N

2.1. Основные классы липидов биологических мембран

OH

-

O

R 2OCO C H CH2

(ФК) (ФХ)

CH2CH2N (CH3)3

Фосфатидилхолин

CH2CH2NH2

Фосфатидилэтаноламин (ФЭА)

CH2 CH COOH

Фосфатидилсерин

(ФС)

Фосфатидилглицерин

(ФГ)

Фосфатидилинозит

(ФИ)

-

NH2 CH CH2OH

O

Рис.43. Химическая структура цАМФ Активация вторичных мессенджеров, как правило, связана с химическими реакциями переноса и рекомбинации фосфатных групп. Предшественниками вторичных мессенджеров являются высокофосфорилированные соединения. Так, усилительный фермент аденилатциклаза превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в цАМФ, а другой усилительный фермент – фосфолипаза C (фосфодиэстераза) – расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на диацилглицерин и инозитолтрифосфат. ГТФ превращается в цГМФ с помощью фермента гуанилатциклазы, которая в отличие от аденилатциклазы не связана с мембранными рецепторами. Было установлено, что G-белки образуют две группы: Gстимулирующие белки (Gs) и G-ингибирующие белки (Gi); Gs-белки свя-

O O P O

Фосфатидовая кислота

CH2

OH OH

OH OH

OH

OH O CH2 O P O CH2

CH2OCOR 1 R2OCO C H CH2

O

CHOH

-

O H C OCOR 2 Дифосфатидилглицерин (ДФГ)

O P O CH2 -

O

Рис.2. Глицерофосфолипиды

CH2OCOR 1

(Кардиолипин)

12

89

Длинные углеводородные цепи, находящиеся в sn-1- и sn-2положениях глицерина, могут присоединяться за счет сложноэфирной и простой эфирной связей. Эти цепи значительно различаются по длине, разветвленности и степени ненасыщенности. Жирные кислоты почти всегда содержат четное число атомов углерода в пределах от 14 до 20. Наиболее распространены кислоты С16, С18 и С20. Степень ненасыщенности может быть разной, но чаще всего встречаются ненасыщенные кислоты 18:1, 18:2, 18:3 и 20:4. Почти все природные кислоты характеризуются цис-конфигурацией двойных связей, эти связи являются несопряженными. Углеводородная цепь в цис-конфигурации имеет излом, что нарушает упаковку липидных молекул в бислое. В молекуле природных фосфолипидов обычно имеется одна насыщенная и одна ненасыщенная цепи. В случае животных клеток ненасыщенные цепи располагаются в sn-2-положении глицерина. В фосфолипидах некоторых бактериальных мембран обнаружены разветвленные цепи, а также цепи, содержащие циклы (например, циклопропан), и гидроксильные группы в βположении. У археобактерий глицерофосфолипиды имеют обращенную стереоконфигурацию, при которой фосфорильные группы находятся в sn-1-положении глицеринового остатка. Простейший представитель глицерофосфолипидов – фосфатидовая кислота (ФК), в которой фосфатная группа этерифицирована только остатком глицерина. Фосфатидовая кислота найдена во многих природных источниках – тканях животных, растений и микроорганизмах; ее содержание невелико (1-5% от общего количества фосфолипидов). ФК является предшественником в биосинтезе других фосфолипидов. Фосфатидилхолин (ФХ) является основным мембранным компонентом клеток высших животных и растений, его содержание достигает более 50% от суммы фосфолипидов. В бактериальных клетках ФХ не содержится. Фосфатидилэтаноламин (ФЭА) содержится в тканях животных и растений в меньших количествах, чем ФХ (15 –30% от общего количества фосфолипидов), но является одним из основных компонентом мембран бактериальных клеток. Фосфатидилсерин (ФС) является, как правило, минорным мембранным компонентом, но входит в состав мембран практически всех прокариотических и эукариотических клеток. Больше всего ФС найдено в мозге млекопитающих (около 15 % от суммы фосфолипидов), в тканях сердца, печени, почек содержание ФС составляет менее 10%. ФС участ-

В ответ на получение сигнала происходит биохимическая модификация специализированных молекул-эффекторов, через которые и формируется ответ биологической системы (рис.42). Следующий этап – передача информации в центр переработки с помощью вторичных мессенджеров (посредников). Именно по такому принципу функционируют нервная, гормональная и иммунная системы животных, на такие же стадии могут быть разложены и фотобиологические процессы, протекающие как в организмах животных, так и в растениях. Общий принцип действия всех систем приема и передачи информации – не только химическая модификация мембранных белков, но и изменение концентрации заряженных ионов внутри и вне клетки, формирование трансмембранного потенциала. В последнее время выяснилось, что этот процесс играет важную физиологическую роль не только в нервной ткани, но и при переработке информации в тромбоцитах, лимфоцитах, тучных клетках. Первым компонентом в схеме, представленной на рис.42, является рецептор. Рецептор, как правило, представляет собой интегральный белок. На поверхности мембраны он имеет своеобразное “приемное устройство”, способное распознавать сигнал и взаимодействовать с ним. При этом сам сигнал, будь это химическое вещество (гормон) или квант света, обычно не проникает внутрь клетки, а преобразуется в результате модификации мембранных белков, которая приводит к активации молекул посредников – вторичных мессенджеров. В общем виде передача сигнала через мембрану может быть сведена к трем основным стадиям: 1) взаимодействие рецептора с сигналом; 2) конформационная перестройка и изменение функции специализированных мембранных белков-посредников; 3) активация вторичных мессенджеров – сравнительно небольших молекул и ионов, диффузия которых в клетке к определенным субклеточным структурам обеспечивает стремительное распространение сигнала. G-белки и вторичные мессенджеры. От первого звена - рецептора (R) сигнал поступает на так называемые N- или G-белки – мембранные белки, активирующиеся при связывании гуанозинтрифосфата (ГТФ). G-белки способны передавать информацию “усилительному” ферменту, который, функционируя на внутренней стороне мембраны, активирует вторичные мессенджеры.

88

13

8. Участие мембран в передаче межклеточной информации

вует в процессах биосинтеза, а также является регулятором активности ряда мембраносвязанных ферментов. Фосфатидилинозит (ФИ) присутствует почти во всех животных и растительных тканях, а также в ряде микроорганизмов. Больше всего ФИ содержится в мозге млекопитающих и в нервных тканях. Фосфатидилглицерин (ФГ) является основным компонентом бактериальных мембран (70% от суммы фосфолипидов). Много ФГ (20-30%) содержится также в растениях, в животных тканях ФГ найден в минорных количествах (преимущественно в митохондриях). Дифосфатидилглицерин (ДФГ), называемый также кардиолипином, имеет в своем составе три остатка глицерина, четыре остатка жирных кислот и две фосфатные группы. ДФГ содержится в большом количестве во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и в некоторых бактериальных мембранах, но редко встречаются в других мембранах. Гликоглицеролипиды – это нейтральные липиды, у которых в sn3-положении глицерина находится углевод, присоединенный с помощью гликозидной связи, например, галактоза (рис.3). Гликоглицеролипиды широко представлены в мембранах хлоропластов растений (моногалактозилдиглицерид составляет половину от всех липидов тилакоидной мембраны), они обнаружены также в заметных количествах в сине-зеленых водорослях и бактериях. Для мембран грамположительных бактерий характерны гликоглицеролипиды с большим разнообразием сахаров. В мембранах животных клеток гликоглицеролипиды встречаются редко.

Важное свойство всех живых существ – способность воспринимать, перерабатывать и передавать информацию при помощи биологических мембран. Несмотря на громадное разнообразие различных систем получения и переработки информации, функционирующих в животных и растительных организмах, все они основаны на едином принципе. Процесс получения информации, как правило, начинается с взаимодействия сигнала (химического агента, кванта света, механического воздействия и т.п.) с рецептором – мембранным белком.

Рис.42. Схема трансмембранной передачи сигнала в клетке

87

14

Структура

H2COH O

HO

Название

O CH2 CHOCOR2

OH

Моногалактозилдиглицерид (МГДГ)

CH2OCOR1 OH H2COH O

HO OH

O

Дигалактозилдиглицерид

CH2 O

OH HO

O CH2

(ДГДГ)

CHOCOR2

OH

CH2OCOR1 OH H2C

SO3H O

OH

Сульфолипид

OH

O CH2 OH

CHOCOR2 CH2OCOR1

Рис.3. Гликоглицеролипиды Сфинголипиды также являются важными мембранными компонентами. Они представляют собой производные С18-аминоспирта – сфингозина, имеющего транс-конфигурацию двойной связи. N-ацилированное производное сфингозина принято называть церамидом. Церамид (гидрофобная часть) может быть связан с различными полярными головками, поэтому сфинголипиды разделяют на фосфосфинголипиды и гликосфинголипиды (рис.4).

но поглощать крупные частицы. Эту роль у млекопитающих выполняют 2 класса лейкоцитов – макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты, защищая организм от вторгшихся микроорганизмов. Макрофаги также утилизируют старые или поврежденные клетки и клеточные обломки. Важная особенность как экзоцитоза, так и эндоцитоза состоит в том, что секретируемые или поглощаемые макромолекулы локализуются в мембранных пузырьках и не смешиваются с другими макромолекулами или органеллами клетки. С помощью неизвестного механизма каждый пузырек сливается только со специфическими мембранными структурами, что гарантирует правильный перенос макромолекул. Экзоцитоз и эндоцитоз не повторяют друг друга в обратном порядке из-за наличия стадии слипания бислоев, и благодаря такому различию, по-видимому, могут регулироваться независимо друг от друга. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Как осуществляется пассивный транспорт гидрофобных и гидрофильных веществ? 2. Что такое облегченная диффузия? 3. Опишите механизм работы белков-переносчиков? 4. Что такое ионофоры, какой принцип их действия? 5. Опишите облегченную диффузию с участием мембранных каналов. 6. Приведите примеры каналообразующих ионофоров. 7. Какие источники энергии для активного транспорта используют клетки? + + 8. Назовите функции Na ,K -насоса в клетке. + + 9. Опишите механизм работы Na ,K -насоса в клетке. 10. Приведите другие примеры активного транспорта в клетке. 11. Что такое экзоцитоз и эндоцитоз? 12. В чем особенности индуцированного экзоцитоза? 13. Что такое адсорбционный эндоцитоз? Приведите примеры. 14. Что такое фагоцитоз и какова его роль в организме?

15

86

каймой. Окаймленные ямки и пузырьки обеспечивают протекание процесса, называемого опосредуемый рецепторами эндоцитоз или адсорбционный эндоцитоз: поглощаемые молекулы связываются со специфическими белками-рецепторами, локализованными в окаймленных ямках (рис.41). Этот процесс представляет собой избирательный концентрирующий механизм, позволяющий клеткам захватывать большие количества специфических лигандов без поглощения соответственно большого объема внеклеточной жидкости.

Название

Структура

Церамид (Сеr) Фосфосфинголипиды

H

O

+

CH3(CH2)12 CH CH CH OH CH3(CH2)n

C O

P OCH2CH2N (CH3)3 Сфингомиелин -

O O

NH C H CH2 O

Cer-1-фосфорилэтаноламин

P OCH2CH2NH2 -

O

Гликосфинголипиды β

D Gal

β

D Glc

Галактозилцерамид Глюкозилцерамид

Ганглиозиды Glc Glc

Gal

NeuNAc

Gal

GalNAc

GM3 GM2

NeuNAc Glc

Gal

GalNAc

NeuNAc

Gal

GM1

Рис.4. Сфинголипиды Рис.41. Схема адсорбционного эндоцитоза холестерина Примером данного процесса служит поглощение животными клетками холестерина из внеклеточной среды, за счет этого обеспечивается большая часть потребности клеток в холестерине для синтеза мембран. Если этот процесс по какой-то причине заблокирован, то холестерин накапливается в крови и увеличивает риск атеросклероза. Основная часть холестерина переносится кровью в виде комплексов с белком, которые известны под названием - ЛНП - липопротеины низкой плотности. Эти комплексы представляют собой большие сферические частицы (22 нм в диаметре), каждая из которых имеет сердцевину, заполненную 1500 молекулами холестерина, связанного сложноэфирными связями с длинными цепями жирных кислот. Сердцевина ЛНП окружена липидным бислоем, содержащим белок одного-единственного типа. Фагоцитоз у простейших организмов представляет собой форму питания, у млекопитающих большинство клеток не способно эффектив-

Фосфосфинголипиды имеют такие же полярные головки, как и глицерофосфолипиды, а их гидрофобная часть представлена церамидом. В плазматических мембранах животных клеток широко распространен сфингомиелин (церамид-1-фосфорилхолин). Основными жирнокислотными компонентами в миелине являются кислоты 24:1 и 24:0. В мембранах растительных и бактериальных клеток фосфосфинголипиды встречаются редко. Кроме сфингомиелина известны и другие фосфосфинголипиды, например церамид-1-фосфорилэтаноламин, церамид-1фосфорилинозитол и церамид-1-фосфорилглицерин. Гликосфинголипиды содержат углеводы, присоединенные с помощью гликозидной связи к концевой гидроксильной группе церамида. Их классифицируют в соответствии с размером углеводной части, которая может быть представлена всего лишь одним моносахаридным остатком или сложным углеводным полимером. Моногликозилцерамиды обычно называют цереброзидами. Среди них наиболее распространены галакто- и глюкоцереброзиды. Цереброзиды, в отличие от фосфолипи-

16

85

дов, являются нейтральными липидами, они найдены в тканях животных, растений и микроорганизмах. Ганглиозиды представляют собой класс анионных гликосфинголипидов - церамид связан с олигосахаридом, в состав которого входит один или несколько остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, NeuNAc). Структура ганглиозидов GM1, GM 2, GM 3 (всего обнаружено свыше 60 ганглиозидов) показана на рис.4. Впервые ганглиозиды были обнаружены в ганглиях, откуда и произошло их название. Наиболее богат ганглиозидами мозг, были обнаружены они и в других тканях (почки, печень, легкие и т.д.). Биологическое значение ганглиозидов до настоящего время установлено далеко не полностью. Ганглиозиды локализуются в плазматических мембранах и отвечают за контактное торможение, адгезию и электрофоретическую подвижность клеток, а также участвуют в процессах избирательного транспорта ионов и обладают иммунной активностью.

Эндоцитоз – клетки способны также поглощать макромолекулы и частицы, используя в обратной последовательности сходный механизм: поглощенное вещество постепенно окружается небольшим участком плазматической мембраны, которая сначала впячивается, а затем отщепляется, образуя внутриклеточный пузырек, содержащий захваченный клеткой материал (рис.40). В зависимости от размера образующихся пузырьков различают 2 типа процесса эндоцитоза: 1) пиноцитоз – поглощение жидкости и (или) растворенных веществ с помощью небольших пузырьков; 2) фагоцитоз – поглощение больших частиц, таких как микроорганизмы или обломки клеток. Большинство эндоцитозных пузырьков в конце концов сливается с первичными лизосомами. При этом образуются вторичные лизосомы, в которых переваривается большая часть макромолекулярного содержимого пузырьков. После этого основная часть мембранных компонентов пузырьков каким-то образом возвращается в плазматическую мембрану. Эндоцитоз

HO

HO

Холестерин

Ситостерин Рис.40. Схема эндоцитоза

HO

HO

Стигмастерин Рис.5. Стеролы

Эргостерин

Эндоцитоз, также как и экзоцитоз, представляет собой локальную ответную реакцию плазматической мембраны. Большинство животных клеток непрерывно осуществляют эндоцитоз фрагментов своей плазматической мембраны. Таким путем поглощается также внеклеточная жидкость и растворенные в ней вещества. При эндоцитозе одни пузырьки образуются из гладких участков плазматической мембраны, а другие – из ее окаймленных участков, называемых окаймленными ямками. Согласно данным электронной микроскопии эти участки со стороны цитоплазмы окружены щетинообразной

84

17

Например, для секреции инсулина клетки упаковывают его во внутриклеточные пузырьки, которые сливаются с плазматической мембраной и открываются во внешнеклеточное пространство, высвобождая при этом молекулы инсулина. Во всех эукариотических клетках имеются специальные везикулы, переносящие аналогичным образом от аппарата Гольджи к плазматической мембране ее вновь синтезированные компоненты. Таким образом, путь синтезированных в клетке молекул – это адсорбция на поверхности клетки в качестве ее новых компонентов, либо экзоцитоз в интерстициальную жидкость или в кровь питательных веществ и сигнальных молекул. Процесс слияния двух мембран состоит из двух фаз и начинается с того, что эти мембраны приходят в близкое соприкосновение друг с другом (слипание бислоев). Электронная микрофотография регистрирует при этом появление пятислойной мембранной структуры, однако ее существование кратковременно. Затем слипшиеся бислои быстро перестраиваются и объединяются, образуя одну непрерывную мембрану, вследствие чего секреторные пузырьки открываются во внеклеточное пространство. Процессы слипания и объединения бислоев представляют собой фундаментальные процессы, лежащие в основе эндоцитоза и экзоцитоза, деления и слияния клеток. Индуцированный экзоцитоз. Было установлено, что одни вещества непрерывно секретируются клетками, тогда как другие запасаются в секреторных пузырьках и высвобождаются только после получения клеткой соответствующего сигнала извне. Этот сигнал к секреции часто представляет собой химический медиатор, например, гормон, связывающийся с рецепторами на поверхности клетки. В результате происходит активация рецепторов, которая вызывает обычно кратковременное повышение концентрации сво2+ бодных ионов Cа в цитозоле, а это в свою очередь индуцирует про2+ цесс экзоцитоза. Представляется вероятным, что ионы Cа действуют в ограниченной области секретирующей клетки, инициируя локальный ответ части цитоплазмы и располагающейся над ней плазматической мембраны. Этот вывод был сделан в опытах с тучными клетками, секретирующими гистамин в ответ на связывание специальных лигандов с рецепторами на их поверхности. Если тучные клетки инкубировали в среде, содержащей растворенный стимулятор, то экзоцитоз наблюдался по всей клеточной поверхности. В другом случае стимулятор был закреплен на подложке, и экзоцитоз ограничивался местом контакта с подложкой.

Стеролы являются нейтральными липидами, которые присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. Самым распространенным из стеролов является холестерин (рис.5). Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой служит гидроксильная группа. Холестерин содержится в плазматических мембранах животных клеток (около 30 % общей массы липидов), в лизосомах, эндосомах, аппарате Гольджи. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. В мембранах дрожжей и других эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол (рис.5).

Минорные компоненты В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые относят к разряду минорных вследствие их малого содержания в мембранах. В очень малых количествах обнаруживаются свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Минорными компонентами также являются моноацил- и диацилглицерины (выполняют функцию вторичных посредников в передаче сигнала через мембрану). В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды, к которым относятся убихиноны и менахиноны – компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Объясните необходимость присутствия биологических мембран в клетках эукариот. 2. Укажите основные органеллы животных и растительных клеток и выполняемые ими функции. 3. Назовите основные этапы и методы выделении клеточных мембран. 4. Что такое мембранные маркеры? 5. Перечислите основные функции биомембран. 6. Каковы особенности состава биологических мембран? 7. Назовите основные классы мембранных липидов. 8. Приведите примеры полярных и нейтральных липидов. Какие функции выполняют эти липиды в мембранах? 9. В чем особенности жирнокислотного состава мембранных липидов? 10. Перечислите минорные компоненты биомембран.

18

83

+

2.2. Структурообразование липидов Поведение липидов в воде Наличие в молекуле липидов двух частей - гидрофильной полярной головки и длинных гидрофобных углеводородных заместителей определяет способность этих соединений к структурообразованию в воде. Липиды - амфифильные вещества, они плохо растворимы как в полярных, так и в неполярных растворителях. Самым энергетически выгодным состоянием является мономолекулярный слой на границе раздела между полярной и неполярной средой. Если поместить липиды в водную среду, их молекулы образуют агрегаты – мицеллы, в которых полярные головки липидов обращены наружу, а неполярные углеводородные цепи упрятаны внутрь. В неполярной среде мицеллы оказываются вывернутыми наизнанку, такие мицеллы называют обращенными (рис.6). При увеличении концентрации липидов в воде мицеллы слипаются, и при этом возникает плоский бимолекулярный слой (сокращенно бислой). Характерный признак липидов, которые образуют бислой – исклю-10 чительно низкая критическая константа мицеллообразования – 10 М. Толщина липидного бислоя определяется длиной углеводородных цепей и составляет 4-5 нм, но зависит от плотности упаковки липидных молекул в бислое. Неполярный растворитель + следы воды Полярная головка

Вода

+

нов H . Градиент концентраций H возникает на отдельных этапах транспорта электронов в процессе окислительного фосфорилирования у бактерий и в митохондриях высших организмов или фотосинтеза в хлоропластах растений, а также с помощью фотоактивируемого протонного насоса (бактериородопсина) у Halobacterium.

7.3 Мембранный транспорт макромолекул и частиц Транспортные белки обеспечивают проникновение через клеточные мембраны многих полярных молекул небольшого размера, однако они не способны транспортировать макромолекулы, например, белки, полинуклеотиды или полисахариды. Тем не менее, в большинстве клеток определенные макромолекулы могут проходить в двух направлениях через плазматические мембраны, а некоторые клетки даже способны поглощать большие клеточные частицы. Механизмы этих процессов значительно отличаются от механизмов транспорта небольших молекул или ионов. Экзоцитоз представляет собой механизм секреции макромолекул из клетки во внешнюю среду. При переносе макромолекул во внешнюю среду происходит последовательное образование и слияние окруженных мембраной пузырьков (везикул) с плазматической мембраной (рис.39): Экзоцитоз

H 2O n

Обращенная мицелла

Углеводородный хвост, Липид

Цитоплазма

Мицелла классического типа

Рис.6. Липидные мицеллы в воде и неполярных растворителях

Рис. 39. Схема экзоцитоза

19

82

3 Na

+

Участок связывания + K и уабаина

Градиент концентрации ионов натрия

Градиент концентрации ионов калия

ATP Участок + связывания Na

ADP + PI +

2 K

ЦИТОПЛАЗМА +

+

Рис.38. Схематическое изображение работы фермента Na ,K -АТФ-азы +

+

Работающий Na ,K -насос можно воссоздать из очищенного фермента АТФ-азы. Для этого АТФ-азу солюбилизируют в избытке детергента, подвергают очистке и смешивают с соответствующими фосфолипидами. После удаления детергента диализом образуются мембранные 2+ + пузырьки, которые в присутствии АТФ и Mg перекачивают катионы Na + и K в противоположных направлениях. + + Таким образом, биологическая функция Na ,K -насоса состоит в гидролитическом расщеплении АТФ и использовании высвобождающей+ ся при этом свободной энергии для перекачивания ионов K из окру+ жающей среды внутрь клетки, а ионов Na - из клетки во внешнеклеточное пространство. В различных клеточных мембранах важную роль играют АТФ-азы, + 2+ транспортирующие другие катионы (Н , Са ). + Н -АТФ-синтетазы. В плазматических мембранах аэробных бактерий и во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток присутствуют ферменты АТФ-синтетазы, которые катализируют синтез АТФ из АДФ и фосфата. Этот процесс осуществляется благодаря наличию на этих мембранах градиента концентраций прото-

При дальнейшем увеличении концентрации липидов в воде бислои, наслаиваясь друг на друга, образуют многослойные липидные структуры. Если такую взвесь осторожно перемешивать, то происходит замыкание этих структур с образованием частиц более или менее сферической формы – липосом. Липосомы состоят из ряда концентрических бимолекулярных липидных слоев, разделенных водным пространством; расстояние между слоями составляет 15-20 Å, диаметр липосом 5-50 мкм. Движущей силой образования липидМультиламеллярная фаза ных агрегатов в водной среде являются гидрофобные взаимодействия. Гидрофобными взаимодействиями называют спеДобавление воды цифический эффект, проявляющийся в водных средах при наличии в молекулах гидрофобных групп. Контакт с молекулами воды гидрофобных радикалов “невыгоден” молекулам воды, которые образуют воМоноламеллярные дородные связи межМногослойные липосомы липидные везикулы ду собой и другими гидрофильными групРис.7. Структуры, образуемые липидными пами в растворе. Побислоями в избытке воды этому термодинамически более выгодно в водном растворе объединение гидрофобных радикалов в агрегаты для сведения к минимуму их контактов с водой. К другим факторам, стабилизирующим гидратированные липидные агрегаты, относятся: -Ван-дер-ваальсовы силы - слабые короткодействующие силы притяжения между соседними гидрофобными цепями. Притяжение возникает за счет взаимодействия между индуцированными диполями.

20

81

-Водородные связи – образуются между полярными головками некоторых липидов (например, между молекулами ФЭА). В ряде случаев мостики между отрицательно заряженными липидами образуются с помощью двухвалентных катионов. Однако все эти силы по своей стабилизирующей способности значительно уступают гидрофобным взаимодействиям.

Na ,K -насос - Na ,K -АТФ-аза Натриево-калиевые насосы, имеющиеся в плазматических мембранах всех животных клеток, работают по принципу антипорта, активно вы+ + качивая катионы Na из клетки, а K - в клетку против градиентов их кон+ центраций (а в случае Na и против электрического градиента). + + + + Градиенты концентраций ионов Na и K , поддерживаемые Na ,K насосом, ответственны в клетке не только за ее мембранный потенциал (цитоплазма клетки заряжена отрицательно по отношению к внешнеклеточному пространству), но и за регуляцию клеточного объема (явление осмоса), а также за активный транспорт сахаров и аминокислот по механизму симпорта. + + Механизм работы Na ,K -насоса. Экспериментально установлено и до+ + казано, что источником энергии для работы Na ,K -насоса служит гид+ + + + ролиз АТФ. Na ,K -насос представляет собой фермент - Na ,K -АТФазу. Этот фермент состоит из 2-х субъединиц: трансмембранной, обладающей каталитической активностью (100000 Д), и ассоциированного с ней гликопротеина (45000 Д). Каталитическая субъединица имеет участ+ ки связывания на наружной поверхности цитоплазмы для ионов Na и + АТФ, а на внутренней – для ионов K и ингибитора фермента – уабаина (рис.38). Функция гликопротеина остается пока невыясненной. + + Установлено, что работа Na ,K -насоса происходит следующим образом (рис.38): + - Концевая фосфатная группа АТФ в присутствии ионов Na переносится на остаток аспарагиновой кислоты в молекуле фермента + + + Na ,K -АТФ-азы. Na -зависимое фосфорилирование, вероятно, изменяет конформацию АТФ-азы, что каким-то образом приводит к вы+ ведению катионов Na из клетки. - Связавшаяся с ферментом фосфатная группа затем гидролизуется в + присутствии ионов K (именно этот процесс ингибируется уабаином). + - K -зависимое дефосфорилирование, вероятно, обусловливает + транспорт K внутрь клетки и возвращение АТФ-азы в первоначальное состояние.

Фазовый переход гель-жидкий кристалл В зависимости от температуры липидный бислой может находиться в двух основных фазовых состояниях – кристаллическом (гелевая Lβфаза) и жидкокристаллическом (Lα-фаза). Иногда эти состояния называют “твердым” и “жидким”, имея в виду, что физический смысл перехода между ними заключается в плавлении или замораживании углеводородных цепей липидных молекул. Переход бислоя из кристаллического в жидкокристаллическое состояние (и обратно) происходит при строго определенной температуре, характерной для данного липида и называемой температурой фазового перехода гель–жидкий кристалл (Тф.п.). Температура фазового перехода зависит как от строения углеводородных цепей липидных молекул, так и от природы их полярных головок. Как правило, чем длиннее углеводородные цепи в молекуле, тем выше о Тф.п. (в гомологичном ряду Тф.п. возрастает на 15 – 20 С при увеличении длины насыщенной цепи на 2 метиленовых звена). Введение цисэтиленовой связи даже в одну углеводородную цепь липида резко понижает Тф.п. Различия в строении полярных головок липидов также существенно сказываются на Тф.п. Например, при одних и тех же углеводоо родных цепях Тф.п. для ФХ на 20 С ниже, чем для ФЭА. В случае отрицательно заряженных фосфолипидов Тф.п. зависит от степени ионизации полярных групп (обычно Тф.п. падает по мере увеличения степени 2+ ионизации) и присутствия двухвалентных катионов, особенно Са , в 2+ водной среде (как правило, связывание Са повышает Тф.п.). Современные представления о механизме фазовых переходов в мембранах основаны на рассмотрении молекулярной подвижности компонентов бислоя, и прежде всего, подвижности углеводородных цепей липидных молекул. При Т < Тф.п. углеводородные цепи липидных молекул

+

+

+

+

21

80

7.2. Активный транспорт через мембраны. Для перемещения вещества через мембрану против градиента его концентраций должна затрачиваться химическая энергия: ∆G=RTln C2/C1 В живых организмах градиенты концентраций некоторых ионов между двумя сторонами клеточных мембран (трансмембранные градиенты) очень сильно варьируют (рис.37): Ион Катионы + Na + K 2+ Mg Ca H

2+ +

Анионы Cl

Внутриклеточная концентрация, мМ

Внеклеточная концентрация, мМ

5–15 140 30 1–2 -7 (в свободном состоянии ≤ 10 м) 4·10-5 -7,4 (10 М или рН 7,4)

145 5 1–2

4

имеют максимально вытянутую трансоидную конформацию и находятся в состоянии наиболее плотной упаковки. Подвижность цепей в гелевой фазе бислоя очень ограничена, и они претерпевают лишь слабые торсионные колебания. При увеличении температуры Т > Тф.п. наблюдается резкое усиление вращательной и колебательной подвижности углеводородных цепей за счет повышения вероятности гош-трансизомеризации и, как следствие этого, возникновение кинков (изгибов) в цепях (рис.8). Такие кинки воздействуют на структуру бислоя, вызывая укорочение цепей и увеличение расстояния между отдельными липидными молекулами. Результатом этого является уменьшение толщины бислоя, сопровождающееся его латеральным растяжением.

Нагревание

2,5–5 (10

-7,4

4·10-5 М или рН 7,4)

Охлаждение

110

Рис.37. Сравнение концентраций ионов внутри и снаружи типичной клетки млекопитающего На создание таких градиентов клетка затрачивает до 50% энергии, потребляемой с пищей. Источниками энергии для активного транспорта в клетке могут быть: - Солнечный свет (бактериородопсин); + - Ионные градиенты (Na -зависимый симпорт глюкозы); - Гидролиз АТФ; - Векторный или направленный перенос групп (активный транспорт сахаров у некоторых бактерий происходит путем фосфорилирования этих веществ при переносе через плазматическую мембрану, в результате этой модификации сахара приобретают заряд и накапливаются в клетке).

Гелевое, или "кристаллическое", состояние липидного бислоя

Жидкокристаллическое состояние липидного бислоя

Рис.8. Термотропный переход липидного бислоя гель-жидкий кристалл В пределах плоскости липидного бислоя молекулы липидов способны свободно перемещаться. Такая миграция липидов вдоль поверхности бислоя называется латеральной диффузией. В жидкокристаллическом состоянии скорость латеральной диффузии очень высока: ее коэффи-9 -7 2 циент лежит в пределах 10 –10 см /с, т.е., за 1с молекула липида совершает от 1000 до 100 000 скачков с размером шага, равным ее поперечному сечению (1 нм). В гелевом состоянии скорость латеральной диффузии резко падает. В отличие от латеральной диффузии, миграция липидов с одной стороны бислоя на другую происходит чрезвычайно медленно. Этот процесс перескока липидов на противоположную сторо-

22

79

ну бислоя называется флип-флоп (flip–flop). Полупериод флип-флопа составляет величину порядка от нескольких часов до нескольких дней при толщине липидного бислоя 4-5 нм. Причина этого исключительно медленного перескока молекул заключается в том, что энергетически невыгодно переносить полярную головку липида через гидрофобную область бислоя. В ряде случаев скорость флип-флопа может возрастать под действием ряда факторов (необычная структура липидов, неустойчивое фазовое состояние и т.д.).

OH

OH

HO -

O

OC

OH

OH

OH

O

Методы изучения фазовых переходов гель-жидкий кристалл 1. Дифракция рентгеновских лучей и нейтронов. Принцип метода: рентгеновские лучи отражаются атомами, и если атомы расположены неким упорядоченным образом, то отражение от повторяющихся слоев атомов будет либо конструктивным (отраженные волны повторяются через равные интервалы), либо деструктивным, когда отраженные волны возникают хаотично, погашая друг друга. Конструктивная интерференция происходит, когда рассеиваемые волны (отраженные от слоев атомов) смещаются на кратное число длин волны (закон Брэгга): nλ = 2d sinθ, где n – целое число, λ - длина волны, нм d – расстояние между повторяющимися слоями, нм θ - угол дифракции. Измеряя углы рассеяния (θ) и зная длину волны λ (λ и d должны быть сопоставимы по величине), можно определить форму и размеры повторяющейся единицы кристалла образца. Бислойные структуры являются достаточно упорядоченными структурами для использования данного метода анализа. Образцы готовят в виде мультибислойных липосом в воде. Данные РСА позволили найти толщину бислоя, расстояния между углеводородными цепями. При переходе из гелевой фазы в жидкокристаллическую происходит уменьшение толщины углеводородной области бислоя, и это регистрируется дифракционными методами. Затем строят зависимость d=f(T) и по скачкообразному изменению величины d определяют Тф.п. (рис.9).

CH3

O

O

HO

Амфотерицин В +

H3N

OH

(а) (б) Рис.36. Модель мембранной поры, образованной молекулами амфотерицина В (а) и стеринов (б) Аламетицин и родственные соединения (содержащие остатки αаминомасляной кислоты и фенилаланинола) представляют собой особую группу каналообразователей. Аналогично амфотерицину В и GRA, аламетицин образует в мембранах серию ион-проводящих агрегатов с числом молекул антибиотика от 6 до 10. Агрегаты меньшего размера проводят только одновалентные катионы; в крупных агрегатах с радиусом 1.5 нм появляется анионная проводимость. Характерной особенностью этих каналов является работа в потенциал-зависимом режиме: канал открывается, когда приложен трансмембранный потенциал, при отсутствии потенциала канал закрыт. Аламетициновый канал представляет собой простейшую модель ионных каналов возбудимых мембран. Молекулярная структура этого канала до сих пор окончательно не установлена.

78

23

Предположительно, выключение GRA канала, т.е. его переход в непроводящее состояние, связано с изменением толщины мембраны: при увеличении толщины бислоя димер “голова к голове” диссоциирует до мономера, а двойная спираль частично расплетается. Экспериментально было установлено, что время жизни GRA канала увеличивается при уменьшении средней толщины мембраны (рис.35).

2. Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Метод ДСК позволяет определить термодинамические параметры перехода гель-жидкий кристалл для модельных и биологических мембран: Температуру, соответствующую началу перехода. Среднюю температуру перехода. Энтальпию перехода ∆Н – количество тепла, необходимое для его осуществления в расчете на количество вещества образца. Теплоемкость перехода Ср – количество тепла, необходимое для повышения температуры 1 моль образца на 1 градус. Принцип метода: Инертный стандарт и образец (помещенный в таблетку, изготовленную из этого же инертного стандарта) независимо друг от друга нагревают с постоянной скоростью таким образом, чтобы их температура была одинаковой. При этом регистрируют количество тепла для нагревания образца и стандарта. Количество тепла, необходимое для совершения эндотермического перехода бислоя из гелиевого в жидкокристаллическое состояние, превышает количество тепла, затрачиваемое для поддержания инертного стандарта при такой же температуре. Это отражает зависимость разности потоков тепла от температуры, исходя из которой определяют Тф.п. (рис.10). Площадь под пиком соответствует значению энтальпии фазового перехода ∆Н ф.п..

Рис.35. Возможные структурные перестройки грамицидина А в мембране Амфотерицин В – полиеновый антибиотик-макролид, образует в мембранах достаточно селективные поры с радиусом 0.4 нм, которые проницаемы для воды, ионов двухвалентных металлов, некоторых анионов, небольших нейтральных молекул. Амфотерицин В образует канал, состоящий из двух стыкующихся внутри мембраны полупор, каждая из которых представляет собой агрегат из чередующихся молекул амфотерицина В и стерина, ориентированных осями своих молекул перпендикулярно поверхности мембраны. В образовании полупоры участвует 8-16 молекул этого антибиотика, она стабилизирована внутри мембраны водородными связями (рис.36).

d, нм

∆Н

5

∆Н ф.п..

4 3 2

0

Т ф.п.

0

Т, С

Рис.9. Определение Тф.п. методом дифракции рентгеновских лучей

Т ф.п. средняя

0

Т, С

Рис.10. Определение Тф.п. методом ДСК

24

77

3. Спектроскопия Н-ЯМР. Наиболее полные сведения о динамических свойствах липидных бислоев можно получить при помощи методов ЯМР и ЭПР. 1 Принцип метода Н-ЯМР: Образцы – везикулы липидов в D2O (малый размер, увеличение разрешения). Осуществляют регистрацию спектров 1 H-ЯМР при различной температуре: T > Тф.п. Т < Тф.п. и Т = Тф.п.. Проводят отнесение сигналов в спектре, затем для каждого типа сигналов строят зависимость величины ∆ν1/2 - ширины сигнала на половине высоты пика от температуры ∆ν1/2=f(Т). Скачкообразное изменение величины ∆ν1/2 позволяет определить Тф.п.

Грамицидин A (GRA) представляет собой линейный пептид из 15 аминокислот с блокированными концевыми группами и чередующимися L- и D-конфигурациями аминокислотных остатков.

1

4. Методы с использованием молекулярных зондов (флуоресцентных и спиновых). Флуоресцентные зонды представляют собой полициклические ароматические соединения, которые ковалентно присоединяют к молекуле липида. Флуоресцентные характеристики оказываются очень чувствительными к молекулярному окружению и фазовому состоянию липидного бислоя. При Тф.п. происходит резкое, скачкообразное изменение параметров флуоресценции, что позволяет определить Тф.п. Для определения Тф.п. также используют метод ЭПР. Принцип этого метода сходен с методом ЯМР, но сигналы регистрируют только от парамагнитных зондов (липиды являются диамагнитными веществами). Спиновые метки представляют собой стабильные радикалы, имеющие неспаренный электрон. Энергия, поглощаемая зондом, регистрируется в виде сигнала, интенсивность и форма которого зависит от микроокружения парамагнитного зонда. При фазовом переходе гель-жидкий кристалл резко увеличивается вращательная способность зонда, и амплитуда сигнала резко возрастает. Это позволяет определить Тф.п. Метод ЭПР обладает высокой чувствительностью, поскольку магнитный момент электрона в 1000 раз превышает магнитный момент ядра. К недостаткам методов с использованием зондов можно отнести следующее: введение зондов искажает систему; информацию получают непосредственно только о микроокружении зонда.

2.3 нм М- ион металла OHC–L-Val–Gly–L-Ala–D-Leu–L-Ala–D-Val–L-Val–D-Val–L-Trp–D-Leu–LГрамицидин А Trp–D-Leu–L-Trp–D-Leu–L-Trp–NHCH2CH2OH Рис.34. Димерная структура грамицидина A в бислое GRA формирует в липидном бислое димерную структуру, похожую на α-спираль, своеобразный полый цилиндр с внутренним диаметром 0.3 нм, достаточным для внедрения катионов металлов. Гидрофобные аминокислотные остатки расположены снаружи спирали, а все карбонильные и амидные группы пептидной цепи участвуют в образовании внутри- и межмолекулярных водородных связей (рис.34). Установлено, что в бислое GRA участвует в сложном конформационном равновесии между образованием мономеров и одно- и двухтяжевых спиральных димеров. В плоскости липидного бислоя молекулы GRA могут свободно двигаться; в некоторый момент времени 2 молекулы GRA сближаются и образуют димер, по которому происходит транспорт ионов. Производительность одиночного канала GRA очень велика – до 9 10 ионов/с, что значительно превышает соответствующие показатели 5 для антибиотиков-переносчиков (10 ионов/с).

76

25

ность диффундировать через липидный бислой, и транспорт прекращается. Наличие подобной температурной зависимости для какого-либо ионофора позволяет относить его к подвижным переносчикам.

Биологическое значение фазового перехода гель-жидкий кристалл

Облегченная диффузия с помощью мембранных каналов. Мембранные каналы в клетке могут каналообразователи, а также ионофоры.

образовывать

белки-

Белки-каналообразователи формируют трансмембранные гидрофильные каналы, через которые молекулы растворенных веществ соответствующих размеров и заряда могут проходить через бислой путем простой диффузии. В отличие от транспорта, опосредуемого переносчиками, пассивный транспорт через белковые каналы представляет собой процесс, не достигающий насыщения и не имеющий Vmax. Транспорт через каналы может осуществляться с большей скоростью, чем облегченная диффузия (рис.30). Интересно, что одни каналы, сформированные транспортными белками, открыты постоянно, тогда как другие открываются только на короткое время (имеют “ворота”). Механизм открывания канала может срабатывать в ответ на связывание внешнеклеточного лиганда со специфическими поверхностными рецепторами клетки; изменение (понижение) мембранного потенциала; изменение внутриклеточной концентрации 2+ определенных ионов (например, Са ). Довольно часто каналы, снабженные воротами, имеют механизмы самозакрывания, с помощью которых канал может быстро захлопнуться, несмотря на то, что фактор, который вызвал их первоначальное открывание, еще действует. Пример – нервно-мышечное соединение, в котором импульс, идущий по нерву, стимулирует мышцу к сокращению. Этот процесс происходит менее чем за 1 с и состоит из последовательного открывания и закрывания по крайней мере 4 различных наборов каналов, имеющих ворота. Каналообразующие ионофоры. Наиболее хорошо изучены антибиотики-каналообразователи, среди них – грамицидин А, амфотерицин в, аламетицин.

Явление термотропного фазового перехода гель-жидкий кристалл имеет решающее значение для нормального функционирования биомембран в клетке. Для выполнения клеткой своих функций липидный бислой мембран должен находиться в жидкокристаллическом состоянии. Это необходимо, в первую очередь, для поддержания оптимальной активности мембранных белков-ферментов и обеспечения транспорта через мембраны. Было показано, что при замене ненасыщенных липидов на насыщенные в мембранах бактерий скорость прохождения веществ через мембрану уменьшалась в 20 раз. Клетки очень чутко реагируют на изменения температуры среды, и в процессе эволюции были выработаны определенные механизмы поддержания клеточных мембран в “жидком состоянии”. Так, прокариоты, клетки растений и впадающих в спячку млекопитающих при понижении температуры окружающей среды заменяют насыщенные липиды в мембранах на ненасыщенные. Теплокровные млекопитающие обеспечивают жидкое состояние своих мембран путем поддержания строго определенной температуры тела за счет обмена веществ. Полиморфизм липидов в водной среде Под термином полиморфизм понимают способность какого-либо вещества образовывать агрегаты различного строения. Фосфолипиды в водной среде могут образовывать не только бислойные, но и другие структуры, и это явление принципиально важно для функционирования биомембран. Липиды в водной среде формируют жидкие кристаллы, для них возможны следующие переходы: HI ↔ L ↔ HII (рис.11). L - ламеллярная фаза, в зависимости от температуры может находиться в жидкокристаллическом (Lα) и гелевом состояниях (Lβ). Именно в этой фазе находится основная масса липидов в биологических мембранах. HI - гексагональная фаза типа I: липидные молекулы формируют цилиндрические структуры, поверхность которых образована полярными головками и контактирует с водой. Сами цилиндры также упаковываются с образованием гексагональной решетки. В природных липидах этот тип структуры почти не встречается.

26

75

HII – гексагональная инвертированная фаза типа II: липиды также образуют цилиндры, но в этом случае полярные группы обращены внутрь цилиндра и формируют водный канал. Упаковка самих цилиндров также является гексагональной. Эта структура характерна для некоторых мембранных липидов. Многие очищенные мембранные липиды не образуют стабильных бислоев, а предпочитают находиться в гексагональной фазе HII. В качестве примера можно представить ненасыщенные ФЭА, а также моногалактозилдиглицерид. L

Валиномицин способен избирательно увеличивать проницаемость + + + липидных бислоев для ионов щелочных металлов (K , Rb , Cs ), но + 4 6 очень слабо взаимодействует с ионами Na (слабее в 10 – 10 раз). Это связано с его пространственным строением: депсипептидная цепь валиномицина формирует “ионную ловушку”, по размерам точно подогнан+ ную под ионы K (r=0.133 нм). Наружная часть молекулы валиномицина гидрофобна, что обеспечивает беспрепятственное передвижение ионофора через липидную мембрану (рис.33). Комплексы валиномицина с + + ионами K в любых средах сохраняют конформацию браслета, ион K во внутренней полости молекулы связывается с шестью карбонильными группами при помощи ион-дипольных взаимодействий.

HI

HII

HII Рис.11. Полиморфные структуры липидов в воде

Физические методы изучения липидного полиморфизма 1. Электронная микроскопия. А) Метод замораживания-скалывания. Приготовление образцов включает в себя несколько этапов: 1) липиды уравновешивают в условиях, подходящих для формирования необходимой структуры; 2) после этого быстро замораживают, чтобы организация этой структуры не успела измениться; 3) при помощи специальо ного ножа раскалывают образец при низкой температуре (-100 С) в глубоком вакууме, при этом обнажается внутренняя поверхность бислоя о (рис.12). На поверхность скола под углом 45 напыляют платину, а под

(а) (б) + Рис.33. Конформация валиномицина (а) и его K -комплекса (б) Установленный впервые на примере валиномицина принцип функционирования ионофоров оказался универсальным не только для мембранных переносчиков, но и для других типов молекулярных ловушек и катализаторов, которые широко используются в химии и технике. Аналогично валиномицину функционируют и другие антибиотики+ + ионофоры: циклические (энниатиновая группа, переносят ионы K , Na , + Cs ), с незамкнутыми структурами (моненсин, нигерицин, кальцимицин + + переносят ионы Са , Na ), макротетралиды (нонактин, монактин). Для данного типа ионофоров важное значение имеет температура мембраны. При температуре ниже значения температуры фазового перехода мембранных липидов подвижные переносчики теряют способ-

74

2) Ионофоры мембран бактериальных клеток. Ионофоры – это небольшие гидрофобные молекулы, которые растворяются в липидных бислоях и повышают их проницаемость для ионов. Большинство ионофоров синтезируется микроорганизмами, некоторые из них используются как антибиотики. Эти соединения широко применяют в мембранологии для повышения проницаемости мембран к определенным ионам в исследованиях на модельных бислоях, клеточных органеллах и интактных клетках. Ионофоры действуют, экранируя заряд транспортируемого иона таким образом, чтобы он мог свободно преодолеть гидрофобную область липидного бислоя. Ионофоры не связаны с источниками энергии, а лишь позволяют двигаться ионам по их электрохимическим градиентам. Классическим примером мембранных ионофоров является антибиотик депсипептидной природы валиномицин (выделен в 1955 г., строение как циклододекадепсипептида установлено М.М. Шемякиным и сотрудниками в 1963 г.). Молекула валиномицина построена из 3-х идентичных фрагментов, в каждый из которых входят остатки D-Val, L-молочной кислоты, L-Val, Dгидроксиизовалериановой кислоты. Конформация самого валиномицина в неполярных средах напоминает собой браслет, стабилизированный 6 внутримолекулярными водородными связями (С=О….N-H); в более полярных средах реализуется форма лишь с 3-мя водородными связями, а в водных растворах существует открытая форма, лишенная таких связей (рис.32).

Рис.32. Система внутримолекулярных водородных связей валиномицина в неполярных средах (а), в средах средней полярности (б) и в воде (в)

27

о

Рис.12. Раскалывание мембраны по методу замораживания-скалывания

углом 90 – углерод в качестве подложки. Платиново-углеродная реплика отражает рельеф мембраны, являясь ее точной копией. Таким образом для каждой фазы получают характерные микрофотографии: жидкокристаллическая ламеллярная фаза (Lα) выглядит всегда как гладкая поверхность; гелевая ламеллярная фаза (Lβ) – гладкая поверхность с некоторыми дефектами из-за плотной упаковки; гексагональная инвертированная (HII) – стопка цилиндров.

Б) Метод негативного контрастирования. Приготовление образцов состоит в том, что суспензию мембран наносят на медную сеточку, покрытую полимерной пленкой. На эту пленку напылён углерод в качестве подложки. Нанесенный образец обрабатывают контрастирующим раствором соли тяжелого металла (урана или вольфрама), излишки раствора удаляют. Метод достаточно быстрый – за 30 мин можно приготовить один образец. Метод может использоваться для наблюдения за трехмерной структурой мембранных белков. В) Криоэлектронная микроскопия. Приготовление образцов аналогично предыдущему методу, затем сеточку быстро замораживают, опуская в жидкий этан. Образец поддерживают при температуре жидкого азота и наблюдают под электронным микроскопом. Метод позволяет непосредственно визуально исследовать биологический материал и исключить артефакты. 2. Метод 31Р-ЯМР. Физические основы метода. Основными структурными элементами бислоя в мембранах являются фосфолипиды, которые содержат в своем составе, по крайней мере, один атом фосфора в полярной части молекулы (ФХ, ФЭА и др.). Некоторые фосфолипиды, такие как кардиолипин, ди- и трифосфоинозитиды содержат несколько атомов фосфора. Поэтому атом фосфора является идеальной природной меткой в соста31 ве фосфолипидов для использования метода Р-ЯМР при изучении 31 природных и модельных мембран. Метод Р -ЯМР обладает высокой

28

73

чувствительностью и имеет широкий диапазон химических сдвигов (около 700 м.д.). В составе бислоя молекулы фосфолипидов обладают высокой латеральной и вращательной подвижностью. В протяженных бислоях латеральное движение в пределах плоскости бислоя не сопровождается изменением ориентации фосфатных групп относительно любой заданной оси, включая линии напряженности магнитного поля ЯМР31 спектрометра. В данном случае сигнал в спектре Р -ЯМР характеризуется пиком в слабое поле и имеет плечо, направленное в сторону сильного поля (рис.13а). Наблюдаемая анизотропия химического сдвига, т.е. расстояние между пиком и плечом сигнала, составляет величину 40-50 м.д. При переходе в гексагональную фазу происходит изменение анизотропии движения липидных молекул, что находит отражение в спектрах 31 Р -ЯМР (рис.13б).

щью белков-переносчиков не может составлять их трансмембранное перемещение. Для объяснения этого процесса предложен особый механизм, названный "пинг-понг": при переносе транспортируемых молекул через бислой трансмембранные белки претерпевают обратимые конформационнные изменения (рис.31): Транспортируемое вещество

А

А "Понг"

А

А

А

Градиент концентрации А

А

a

Бислой

"Пинг"

Транспортный белок, осуществляющий облегчённую диффузию

А

А

А

Рис.31. Механизм транспорта "пинг-понг" с участием белка-переносчика

Гексагональная (H II)

б

- 50 ppm - Hz 31

Рис.13. Спектры Р -ЯМР в составе ламеллярной (а) и гексагональной (б) фаз

В ходе этого процесса белок-переносчик связывает вещество, находящееся в растворе с его высокой концентрацией по одну сторону мембраны, после чего в молекуле белка происходит изменение конформации ("понг" – "пинг"), в результате которого вещество А высвобождается по другую сторону мембраны. Свободный переносчик возвращается в исходное состояние ("пинг" - "понг") и цикл завершается. В организме облегченную диффузию регулируют гормоны путем изменения числа доступных белков-переносчиков. Инсулин регулирует интенсивность транспорта глюкозы в ткани, индуцируя поступление ее переносчиков, а также увеличивает поступление аминокислот в печень и другие ткани. Гормон роста отвечает за транспорт аминокислот во все клетки организма, а эстрогены стимулируют этот процесс в матке. Интересно, что в животных клетках существует, по меньшей мере 5 различных систем переносчиков аминокислот, каждая из которых специфична к определенной группе близкородственных аминокислот и может сущест+ вовать как система симпорта с ионами Na .

29

72

Скорость транспорта

V max Диффузия с помощью белка переносчика

V max/2

Диффузия с помощью каналообразующего белка

Концентрация транспортируемых молекул KM Рис.30. Кинетика диффузии с помощью каналообразующего белка и при участии белка-переносчика Процессы транспорта с участием переносчиков описываются законом, аналогичным уравнению ферментативной кинетики (рис.30): I = Imax∆c/(K+∆c), где Imax- максимально достигаемый поток вещества через мембрану; ∆c – градиент концентраций переносимого вещества; К – константа, описывающая сродство между переносчиком и переносимым веществом. Механизм действия переносчиков на молекулярном уровне 1) Белки-переносчики. Асимметричное распределение белков в мембране между внутренней и внешней частью бислоя достаточно стабильно (абсолютная асимметрия белков), т.е. основу механизма облегченной диффузии с помо-

В составе бислоя и инвертированной HII-фазы вращательные усредняющие внутримолекулярные движения липидных молекул одинаковы. Отличие между этими фазами состоит в том, что в составе HII -фазы латеральное движение липидных молекул представляет собой вращение вокруг оси цилиндров HII -фазы. Эти движения сопровождаются изменениями ориентации фосфатной группы, что приводит к уменьшению величины анизотропии химического сдвига в 2 раза и изменению сигна31 ла в спектрах Р -ЯМР. Сигнал липидов в составе HII -фазы имеет пик в сильном поле и плечо, направленное в слабое поле (рис.13). Полиморфные превращения различных классов фосфолипидов Полиморфизм фосфолипидов можно объяснить согласно следующей теории: структура мезофазы определяется динамической формой молекулы липида. Таким образом, зная геометрические размеры молекул липидов, можно предсказать, какие структуры будут образовывать в водной фазе данные липиды. Геометрические размеры молекул липидов описывает критический параметр упаковки v/(l·So), где v/l –площадь поперечного сечения углеводородной области молекулы (vмолекулярный объем углеводородной области молекулы; lмаксимальная длина углеводородной цепи), So – площадь поверхности для размещения полярной головки фосфолипида. Рассмотрим для примера сферическую мицеллу радиусом R, содержащую M молекул. Полная поверхность мицеллы может быть выра2 3 жена как M·Sо=4πR . Полный объем мицеллы составляет M·v=4/3πR . Выразив отсюда значение радиуса мицеллы R, получаем: R=3v/Sо. Поскольку значение радиуса мицеллы не может быть больше величины l (R≤ l), то условием упаковки липидов в сферические мицеллы будет следующее значение критического параметра упаковки: V/(l·So) ≤ 1/3 Аналогичные расчеты для мицелл цилиндрической формы приводят к значению v/(l·So) =1/2, а для бислойных структур - v/(l·So)= 1. Данные для различных классов липидов представлены на рис.14.

30

Липид

Фаза

71

Форма Молекулы

Лизофосфолипиды Детергенты Мицеллярная Фосфатидилхолин Сфингомиелин Фосфатидилсерин Фосфатидилинозитол Фосфатидилглицерол Фосфатидная кислота Кардиолипин Дигалактозилдиглицерид Фосфатидилэтаноламин (ненасыщенный) 2+ Кардиолипин – Са Фосфатидная кислота – 2+ Са (рН<6,0) Фосфатидная кислота (рН<3,0) Фосфатидилсерин (рН<4,0) Моногалактозилдиглицерид

Перевёрнутый конус

Критический параметр упаковки (v/l·So) <1/3 (Сфера) От 1/3 до 1/2 (Глобулярные структуры; стержни)

От 1/2 до 1

Бислойная

Цилиндр

>1

Гексагональная (HII)

Конус

Рис.14. Полиморфные фазы, форма молекул и критический параметр упаковки для некоторых мембранных липидов

нов через мембраны: 1) с помощью "переносчиков", 2) с помощью каналов (рис.29).

Канал Переносчик

Рис.29. Транспорт через мембраны с участием переносчиков и мембранных каналов Облегченная диффузия с помощью переносчиков. Под переносчиками подразумевают специфические молекулы или их ансамбли, которые связывают транспортируемый агент на одной стороне мембраны и в виде комплекса переносят его через гидрофобную зону бислоя. После диссоциации комплекса на противоположной стороне мембраны переносимое вещество оказывается в водной фазе, а переносчик возвращается в исходное положение (рис.29). Процесс переноса состоит из нескольких стадий: образование комплекса, движение комплекса, диссоциация комплекса, движение свободного переносчика. Облегченная диффузия с помощью переносчиков (а также активный транспорт) напоминают реакцию между ферментом и субстратом, но без образования ковалентных связей. Это сходство обусловлено следующим: 1) У переносчика имеется специфический участок связывания для переносимого вещества. 2) Процесс переноса характеризуется насыщением, т.е. существует величина Vmax – максимальная скорость переноса. 3) Существует величина K, аналогичная KM для ферментативной кинетики, которая характеризует сродство между переносчиком и переносимым веществом. 4) Вещества, сходные по структуре с переносимым веществом, являются конкурентными ингибиторами транспорта этого вещества.

70

O2 Гидрофобные N2 молекулы Бензол

CO2 Большие неГлюкоза заряженные полярные мо- Сахароза лекулы

+

Ионы

+

H ,Na + HCO3, K 2+ Ca , Cl 2+ Mg

Искусственный липидный бислой

Небольшие H 2O незаряженные Мочевина полярные молекулы Глицерол

31

счет транс-гошизомеризации в мембране образуются временные пустоты, по которым проходят через бислой диффундирующие молекулы небольшого размера. Примером простой диффузии служит явление осмоса. Суть этого процесса состоит в следующем: если два водных раствора разделены мембраной, которая пропускает лишь молекулы Н2О, но непроницаема для растворенного вещества, то молекулы Н2О будут самопроизвольно диффундировать в более концентрированный раствор.

Рис.28. Относительная проницаемость искусственного липидного бислоя для различных классов молекул 7.1.2. Облегченная диффузия. Клеточные мембраны, как и искусственные липидные бислои, способны пропускать Н2О и неполярные молекулы путем простой физической диффузии. Однако, клеточные мембраны проницаемы и для различных ионов и полярных молекул, таких как сахара, аминокислоты, нуклеотиды и многие другие метаболиты, которые проходят через искусственные бислои чрезвычайно медленно. Транспорт этих веществ осуществляется благодаря процессам, называемым облегченной диффузией. Облегченная диффузия включает два пути переноса веществ и ио-

Биологическое значение липидного полиморфизма В настоящее время полиморфизмом фосфолипидов биологических мембран объясняют такие процессы, как трансмембранный транспорт фосфолипидов и водорастворимых веществ, слияние мембран. Трансмембранный транспорт в биологических мембранах происходит благодаря тому, что в некоторый момент времени в мембране образуются участки небислойной гексагональной структуры HII, в составе которой липиды благодаря латеральной диффузии начинают двигаться вокруг оси цилиндра и таким образом оказываются на противоположной стороне бислоя. Слияние мембран – важный процесс для функционирования многих органелл клетки. Двойными мембранами окружены такие органеллы, как ядро, митохондрии, хлоропласты. Для обеспечения транспорта высокомолекулярных соединений необходимо образование пор за счет слияния двух мембран. Каким образом образуются такие зоны контакта? Под влиянием различных факторов часть липидов в составе бислоя организуется в небислойную гексагональную фазу HII: углеводородные цепи липидов оказываются экспонированными в водную фазу, что является энергетически невыгодным, следовательно, молекулы этих липидов будут искать более удобное окружение в соседней мембране. Таким образом элемент небислойной гексагональной структуры связывает обе мембраны, при этом образуются зоны контакта и мембраны сливаются. В зоне слияния находятся молекулы воды и растворенные в воде вещества. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Что является движущей силой образования липидных агрегатов в водной среде? 2. Опишите механизм фазового перехода гель-жидкий кристалл. 3. Объясните влияние различных факторов на значение Тф.п.. 4. Сравните скорости латеральной диффузии и флип-флопа липидов, объясните эти различия. 5. Какие методы изучения фазового перехода гель-жидкий кристалл вы знаете? Укажите их преимущества и недостатки. 6. Что такое полиморфизм липидов? 7. Что такое критический параметр упаковки? 8. Назовите методы изучения липидного полиморфизма. Какую информацию можно получить при помощи этих методов?

32

3. Искусственные мембраны: условия их образования и использование в качестве модельных систем Для изучения свойств индивидуальных липидов и липидных смесей были созданы многочисленные модельные мембранные системы. Мицеллы представляют собой простейшие агрегаты, которые образуют липиды в объемной фазе растворителя (рис.15). Способность липида к мицеллообразованию определяется соотношением размеров его полярной головки и углеводородного заместителя. В водной фазе легко образуют мицеллы те липиды, которые имеют объемную и (или) заряженную головку и относительно короткий углеводо-3 -5 родный хвост. Значения ККМ для этих липидов составляют 10 – 10 М, мицеллы имеют диаметр 3 - 6 нм и состоят из 50 – 100 молекул. Смешанные мицеллы образуют липиды с другими размерами молекул при наличии детергентов – поверхностно активных веществ. В настоящее время для биохимических исследований синтезировано и используется большое число детергентов различной химической структуры (см. далее рис.22). Использование мицелл в мембранологии в последние годы связано с изучением вторичной и третичб а ной структуры мембранных белков методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения – данные белки зав ключают в смешанные мицеллы из липидов и деРис.15. Различные типы тергентов для мицелл, образуемых лимоделирования пидами в воде их мембранного а) Цилиндрические окружения и реб) Сферические гистрируют их в) Эллипсоидальные спектральные ха-

69

7. 1 Пассивный транспорт через мембраны 7.1.1. Простая диффузия представляет собой перенос вещества через мембрану из области с большей его концентрацией в область с меньшей концентрацией. Этот процесс описывается законом простой диффузии (закон Фика): количество вещества (I), переносимого в единицу времени через единицу площади поверхности, прямо пропорционально градиенту концентрации растворенного вещества внутри мембраны: I = - Ddc/dx, Где I - поток переносимого вещества; 2 D - коэффициент диффузии, м /с (характеристика липидного бислоя и транспортируемой молекулы); с - концентрация вещества; х - толщина мембраны. Закон пассивной диффузии справедлив только для незаряженных, нейтральных молекул. Однако, теоретически, любая молекула за достаточно длительное время пройдет путем диффузии по градиенту ее концентраций через липидный бислой, лишенный белков. Скорости, с которыми различные молекулы диффундируют через такой бислой, очень сильно варьируют в зависимости от размера молекулы и ее относительной растворимости в жирах. Чем меньше размер молекулы и чем более она гидрофобна, тем быстрее эта молекула будет диффундировать через бислой (рис.28). Важно, что молекулы Н2О очень быстро диффундируют через липидный бислой. Это можно объяснить тем, что молекулы Н2О малы и незаряжены, и кроме того, биполярная структура молекул позволяет им легко пересекать полярные участки бислоя. Напротив, для всех заряженных частиц независимо от их размера липидные бислои в значительной степени непроницаемы: заряд ионов и высокая степень гидратации препятствует их прохождению через угле9 водородный участок бислоя. К примеру, искусственные бислои в 10 раз + + более проницаемы для Н2О, чем для катионов Na и К . Каким образом осуществляется пассивный транспорт? Жирорастворимые вещества растворяются в углеводородной области и таким образом диффундируют через бислой. Для объяснения транспорта гидрофильных веществ выдвинута теория "временных дырок": углеводородные цепи липидов находятся в постоянном движении, при этом за

68

33

В(С6Н5)4. Эти ионы гидрофобны и должны легко проникать через липидный бислой; гидрофобные эффекты и эффекты сольватации для них одинаковы, различие заключается только в их зарядах. Было показано, что транспорт анионов тетрафенилбората протекал гораздо быстрее, чем катионов тетрафенилфосфония. В результате экспериментов было доказано, что транспорт гидрофобных катионов через мембраны затруднен по сравнению с гидрофобными анионами, т.е. дипольный потенциал внутри липидного бислоя имеет положительное значение.

рактеристики. Кроме того, для изучения свойств мицеллярных систем могут быть использованы и другие методы спектроскопии в области 200 – 800 нм; а именно: поглощение в УФ и видимой области спектра, флуоресценция, круговой дихроизм (КД) и дисперсия оптического вращения (ДОВ). К недостаткам мицеллярных моделей следует отнести то, что они по своей организации далеки от биологических мембран, и, кроме того, мицеллы динамически очень подвижны, т.е. постоянно происходит обмен молекулами липидов между мицеллой и раствором, что оказывает негативное влияние на структуру белка, заключенного в мицелле.

–

Вопросы для самостоятельной работы. 1. Из каких составных частей складывается полный электростатический потенциал липидного бислоя? 2. Что такое поверхностный потенциал и почему его значения неодинаковы на разных сторонах мембраны? 3. Чем определяется величина трансмембранного потенциала и как ее можно измерить? 4. Что представляет собой потенциал внутренних диполей? 5. Почему скорость транспорта гидрофобных анионов через липидный бислой выше, чем у катионов?

7. Мембранный транспорт Избирательный транспорт различных веществ и ионов – одна из основных функций биологических мембран. Этот процесс обеспечивает активный обмен клетки и ее органелл с окружающей средой, служит основой всех биоэнергетических механизмов, определяет эффективность процессов рецепции, передачи нервного возбуждения и т.п., другими словами, делает клетку совершенной динамической системой. Мембранный транспорт подразделяют на 2 большие группы: 1. Пассивный транспорт веществ по их градиенту концентраций без затрат энергии извне. 2. Активный транспорт против градиента концентрации вещества, требующий специальных источников энергии.

Мономолекулярные слои на границе раздела фаз воздух-вода Многие молекулы с четко выраженными неполярными свойствами адсорбируются на границе раздела фаз воздух-вода, образуя слой толщиной всего в одну молекулу. Такой монослой можно исследовать либо непосредственно на границе раздела, либо после его переноса на какую-либо подложку. Фосфолипиды и другие амфифильные молекулы образуют ориентированные монослои, в которых полярные группы контактируют с водной фазой, а углеводородные цепи обращены в воздух. Фосфолипиды образуют нерастворимые монослои, поскольку концентрация липида в водной фазе пренебрежимо мала. Для формирования монослоя известное количество липида (обычно находящегося в летучем растворителе) наносят на водную поверхность. Такие монослои традиционно изучают с помощью пленочных весов Лэнгмюра (рис. 16). С одной стоБ роны кюветы имеется подвижА Чистая поный поплавок, поВоздух верхность зволяющий измерять площадь поВода верхности, на которой могут образовываться монослои. Весы ЛэнРис.16. Схема измерения поверхностного гмюра позволяют давления по методу Лэнгмюра точно измерить

34

67

площадь поверхности (А) и поверхностное давление (π) монослоя. Важным достоинством метода является возможность изменять эти параметры, поэтому данный метод оказался особенно полезным для изучения поверхностно-активных пептидов, а также таких ферментов, как липазы, которые функционируют на границе раздела липид-вода. В монослой можно включать белки, однако в большинстве случаев эта система малопригодна для изучения поведения интегральных мембранных белков. Для характеристики монослоев обычно используют диаграммы ''давление - площадь" (рис.17).

ΨD возникает за счет ориентации электрических диполей на поверхности бислоя. Рассмотрим вклад диполей функциональных групп в ΨD: 1. Дипольный момент фосфохолиновой группы. Остаток фосфохолина представляет собой электрический диполь с положительно заряженным N-концом и отрицательно заряженной фосфатной группой. Этот диполь имеет величину 18-25 Д и ориентирован приблизительно параллельно плоскости бислоя. В результате возникает перпендикулярная составляющая вектора дипольного момента, равная 3.0-9.5 Д, она создает отрицательный потенциал внутри гидрофобной области бислоя. 2. Дипольный момент карбонильных групп С=О сложноэфирных связей. Карбонильная группа всегда поляризована и имеет величину дипольного момента 1.8 Д. Согласно данным РСА и ИК-спектроскопии, углеводородные цепи в sn-1- и sn-2-положениях глицерина имеют разную конформацию, а карбонильные группы С=О в обоих положениях ориентированы относительно плоскости бислоя приблизительно одинао ково под углом ≥ 60 . 3. Дипольный момент мембраносвязанной воды. Молекулы воды прочно связаны с липидным бислоем за счет сил водородного связывания и создают на его поверхности гидратную оболочку. Согласно дан2 ным H-ЯМР по гидратации ФХ, в составе гидратной оболочки молекулы H2O организованы относительно упорядоченно. Дипольный момент молекулы H2O составляет 1.83 Д, за счет связывания с липидами молекулы Н2О ориентированы относительно плоскости бислоя таким образом, что создают положительный электрический потенциал внутри гидрофобной области бислоя. Таким образом, фосфохолиновая группа создает отрицательный потенциал внутри бислоя, а мембраносвязанная вода и карбонильные группы действуют в противоположном направлении, создавая там положительный потенциал. Вклад во внутренний дипольный потенциал липидного бислоя от молекул мембраносвязанной H2O и карбонильных групп превосходит вклад от разделенных зарядов фосфохолиновых групп. Присутствие внутреннего положительного электрического потенциала в липидных бислоях было обнаружено при изучении транспорта гидрофобных ионов через мембрану: сравнивали скорость прохождения + через бислой тетрафенилфосфония Р(С6Н5)4 и тетрафенилбората

Рис.17. Общий вид диаграммы ''давление - площадь" Они обладают двумя важными особенностями. Изломы отвечают кажущимся фазовым переходам из разреженной жидкоподобной или газоподобной фазы с низкой плотностью упаковки в более сжатое твердоподобное состояние с высокой плотностью упаковки. Фазовое поведение монослоев в каком-то смысле аналогично фазовым переходам бислоев. Точка коллапса описывает состояние, в котором молекулы упакованы в

66

35

мембран гетерогенен: в построении мембраны участвуют как нейтральные (ФХ, ФЭ), так и отрицательно заряженные (ФС, ФГ, ДФГ) липиды. Чем больше концентрация отрицательно заряженных липидов в составе бислоя, тем более отрицательным будет заряд на поверхности мембраны. В этом случае, если периферические белки имеют положительно заряженные группы, то наблюдается более сильное притяжение белков к поверхности липидного бислоя. Кроме этого, при увеличении отрицательного заряда на поверхности мембраны происходит увеличение кон2+ центрации катионов Са вблизи мембраны, что повышает активность протеолитических ферментов. Поверхностный потенциал ΨS может иметь различные значения на разных сторонах мембраны вследствие асимметрии липидного бислоя: внутренняя сторона мембраны имеет более отрицательный характер (ФХ, ФС), ΨS внешнего монослоя обусловлен наличием нейтральных липидов (ФХ, СМ, ФЭ).

монослое с максимальной плотностью. Дальнейшее сжатие монослоя приводит к его разрушению. По точке коллапса можно определить минимальную площадь поверхности, приходящейся на молекулу липида. Следует отметить, что давление π, измеренное для монослоя, на самом деле представляет собой разность между поверхностным натяжением на поверхности с нанесенным монослоем (γ) и поверхностным натяжением на границе раздела воздух-вода без монослоя (γо): π =(γо - γ) Самопроизвольное формирование монослоя на границе раздела воздух-вода естественно приводит к уменьшению поверхностного натяжения. Его можно рассматривать как отрицательное давление, возникающее благодаря взаимному притяжению молекул на границе раздела фаз, которое уменьшается под действием поверхностно-активных веществ, образующих монослой. Так, дипальмитоилфосфатидилхолин, являющийся основным компонентом легочного сурфактанта, уменьшает почти до нуля (γ=0) работу, затрачиваемую на изменение площади поверхности легкого при дыхании. Монослои в настоящее время используют для измерения поверхностных потенциалов, поверхностной вязкости и поверхностной радиоактивности. К достоинствам этой модели относят простоту получения и интерпретации полученных результатов, однако монослои по своей структуре отличаются от биологических мембран, а также не позволяют изучать процессы транспорта через мембраны.

2. Трансмембранный потенциал ∆Ψ представляет собой разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной. Величина ∆Ψ определяется разницей концентрацией катионов и анионов в водных фазах по разные стороны липидного бислоя. Концентрация заряженных частиц по разные стороны мембраны может быть неодинаковой в случае, если мембрана непроницаема для этих частиц; либо разность концентраций ионов (ионный градиент) создается за счет работы ферментов активного транспорта АТФ-аз. Величину ∆Ψ можно измерить, поместив два электрода по разные стороны мембраны, однако этот способ применим лишь для плоских модельных мембран и некоторых крупных клеток. Для биологических мембран (протеолипосомы, митохондрии, хлоропласты) используют специальные методы измерения ∆Ψ с использованием зондов: - Спинмеченные ЭПР-зонды на основе гидрофобных ионов перераспределяются через мембрану, путем измерения их концентрации рассчитывают ∆Ψ. - Оптические молекулярные зонды позволяют определить спектральные характеристики, которые зависят от ∆Ψ. 3. Потенциал внутренних диполей ΨD представляет собой разность потенциалов между поверхностью мембраны и ее углеводородной областью.

Монослои на твердой подложке. Монослои, образовавшиеся на границе раздела воздух-вода, можно перенести на твердую подложку, например, на алкилированное предметное стекло. Для этого достаточно просто прикоснуться этим стеклом к монослою (за счет алкилирования поверхность стекла становится гидрофобной). Полярные головки липидов после перенесения монослоя на такое стекло по-прежнему контактируют с водой. Таким образом, можно исследовать монослои, перенесенные на твердую подложку при разных значениях поверхностного давления π. Монослои на твердой подложке позволяют изучать непосредственно липидные монослои, взаимодействие монослоя с белками и другими молекулами, создавать системы антиген-антитело, исследовать мембранные каналы.

36

65

Плоские бислойные мембраны (БЛМ)

6. Электрические свойства мембран

Плоские мембраны обычно формируют путем нанесения акварельной кисточкой концентрированного раствора фосфолипида в таких растворителях, как декан, на перегородку из гидрофобного материала (например, из полистирола), в которой имеется небольшое отверстие (диаметром около 1 мм). Перегородка разделяет две камеры, содержащие водные буферные растворы. Большая часть растворителя переходит в воду, а липиды при соответствующих условиях самопроизвольно образуют бислойную пленку, затягивающую это небольшое отверстие (рис.18).

Прежде чем перейти к рассмотрению вопросов, касающихся транспорта через мембраны, необходимо рассмотреть электрические свойства липидного бислоя. Эти свойства важны для понимания механизмов перемещения ионов через мембрану, анализа распределения зарядов внутри мембраны и у ее поверхности. Как известно, липидный бислой снаружи ограничен полярными головками липидов, а внутри заполнен углеводородными радикалами, которые являются хорошими изоляторами. Электрические свойства липидного бислоя, его полный электростатический потенциал, складывается из 3-х основных частей: поверхностного (ΨS), трансмембранного (∆Ψ) и внутреннего дипольного (ΨD) потенциалов (рис.27).

Перегородка Отраженный свет Диаметр до 2 мм

Толщина 4-6 нм Падающий свет Толстая плёнка

Тонкая плёнка

Бимолекулярная мембрана

Рис.18. Процесс формирования БЛМ Такие мембраны часто называют бимолекулярными липидными мембранами (БЛМ), а поскольку они не отражают свет, то и черными липидными мембранами. БЛМ можно использовать для изучения мембранных белков (например, ионных каналов), но их недостаток состоит в том, что они содержат следовые количества растворителя. Кроме того, БЛМ весьма нестабильны, особенно в присутствии небольших количеств детергентов и других примесей. Чтобы устранить проблемы, связанные

Рис.27. Полный электростатический потенциал липидного бислоя 1. Поверхностный потенциал ΨS представляет собой разность потенциалов между водной фазой и поверхностью мембраны. Значение ΨS уменьшается по мере увеличения концентрации отрицательно заряженных липидов в составе бислоя. Липидный состав биологических

64

37

7. Какие методы возможно использовать для установления третичной и четвертичной структуры мембранных белков и почему?

с наличием следов растворителя и облегчить включение в мембраны интегральных белков, была разработана другая методика приготовления БЛМ: плоская мембрана формируется из монослоя на границе раздела фаз, либо на кончике небольшой пипетки при ее простом погружении в раствор, либо на небольшом отверстии в перегородке из гидрофобного материала. Важным преимуществом БЛМ является возможность проведения на них электрических измерений. Эта система особенно полезна для изучения пор, каналов или переносчиков, которые облегчают перенос заряда через бислой из одного водного компартмента в другой. В водные камеры помещают электроды, растворы в них можно легко заменять, а измерения тока и/или напряжения являются очень точными и отличаются высокой чувствительностью. Плоские бислойные мембраны на твердой подложке. Фосфолипидные бислои можно также формировать на твердых гидрофильных подложках (например, на оксидированных силиконовых пластинках), последовательно перенося два монослоя с границы раздела воздух-вода. Эти бислои удобны для физико-химических исследований индивидуальных липидов, и со временем, возможно, найдут применение для изучения мембранных белков. Особенно ценны эти модели для измерения латеральной диффузии мембраносвязанных молекул с помощью флуоресценции.

Липосомы Термин ''липосомы" относится к любым липидным бислойным структурам, имеющим водное содержимое (рис.7). Многие фосфолипиды при диспергировании в воде самопроизвольно образуют гетерогенную смесь везикулярных структур, состоящих из нескольких бислойных концентрических оболочек. Это были первые липосомы, которые удалось охарактеризовать, и сейчас их называют мультиламеллярными везикулами (МЛВ). Большой интерес представляют моноламеллярные везикулы, т.е. везикулы, образованные одинарным бислоем. Их подразделяют на малые моноламеллярные везикулы (ММВ) с диаметром от 200 до 500 Ǻ и большие моноламеллярные везикулы (БМВ) с диаметром от 500 до 5000 Ǻ. Можно также приготовить гигантские фосфолипидные везикулы размером с клетку, имеющие диаметр до 300 мкм.

38

63

Липосомы используют прежде всего как модельные системы, в которые можно встраивать различные белки, а также для создания систем доставки лекарственных препаратов. Важными характеристиками липосом являются их липидный состав, средний диаметр и степень гетерогенности по размерам. О распределении липосом по размеру можно судить по данным: 1) гель-проникающей хроматографии; 2) светорассеяния; 3) ультрацентрифугирования; 4) электронной микроскопии. Особый интерес для тех, кто исследует способность липосом включать в себя различные вещества, представляют такие параметры, как 1) внутренний водный объем, т.е. количество водорастворимого вещества в расчете на моль липида; 2) эффективность включения, или доля водного объема, включенного внутрь везикул. Первый параметр увеличивается с ростом диаметра липосом, а второй прямо пропорционален концентрации липида. Рассмотрим некоторые методы получения липосом и их характеристики.

Метод электронной микроскопии. Трехмерные кристаллы мембранных белков получить очень сложно, но многие из них образуют двумерные упорядоченные структуры. В некоторых случаях белки формируют такие структуры in vivo (например, бактериородопсин в пурпурной мембране). При подходящих условиях такие белки, как и многие другие, образуют "двумерные кристаллы" при их очистке и реконструкции в присутствии фосфолипидов. "Двумерный кристалл" – это, по-существу, тонкая пленка, представляющая собой липидную мембрану с включенными в нее белками. Такая пленка, получаемая с помощью особой техники, характеризуется упорядоченностью входящих в нее молекул. Подобные двумерные упорядоченные структуры можно использовать для получения трехмерной структурной информации с помощью электронной микроскопии и методов реконструкции изображения: трехмерное изображение получают в результате анализа образца при различных углах наклона по отношению к направлению пучка электронов. Точность информации зависит от качества кристаллов; в большинстве случаев достигается разрешение не более 1.5 – 2 нм. Несмотря на это, метод позволяет сделать выводы о пространственной организации молекулы белка, что особенно важно в случае больших белков, состоящих из нескольких субъединиц. Так, к примеру при исследовании трехмерной структуры фермента цитохром-средуктазы удалось установить общую форму молекулы и взаимное расположение ее субъединиц. Аналогичным образом методами РСА и электронной микроскопии были + + определены структуры бактериородопсина, цитохромоксидазы, K ,Na АТФ-азы, белка межклеточных контактов, рецептора ацетилхолина и др.

1. Малые моноламеллярные везикулы (ММВ) обычно готовят путем ультразвуковой обработки водных дисперсий фосфолипидов. Затем везикулы фракционируют по размеру методом гель-проникающей хроматографии или центрифугированием в градиенте глицерина. Другой способ приготовления таких везикул состоит в быстром введении в водную фазу раствора липида в этаноле. Кроме того, для приготовления ММВ можно использовать пресс Френча. Преимуществом таких везикул является их гомогенность, однако малый размер может быть и недостатком, так как при малом радиусе кривизны бислоя ММВ затрудняется упаковка в нем липидных молекул, что приводит к липидной асимметрии между наружным и внутренним монослоями. Внутренний водный объем ММВ довольно мал и лежит в пределах от 0,5 до 1 л/моль. 2. Большие моноламеллярные везикулы (БМВ) впервые были получены в 70-е годы, и с тех пор были разработаны многочисленные методы их приготовления. Выбор метода зависит от липидного состава везикул и их предполагаемого назначения. Например, методы, при которых происходит разбавление липосомной дисперсии, оказываются непригодными для инкапсуляции лекарственных препаратов, а методы, осно-

Вопросы для самостоятельной работы. 1. Какие существуют способы прикрепления мембранных белков к липидному бислою? 2. Назовите реагенты для солюбилизации мембранных белков. 3. Объясните требования к детергентам для солюбилизации мембранных белков. 4. Какие методы очистки возможны для мембранных белков? 5. Сравните методы определения молекулярной массы мембранных белков. 6. Опишите методы определения вторичной структуры мембранных белков и их физические основы.

62

39

для этого необходимо располагать методическим арсеналом и обладать экспериментальным искусством. Разрешение этого метода составляет 0.15 - 0.2 нм. К сожалению, оказалось, что интегральные мембранные белки очень трудно кристаллизовать. Будучи удаленными из своего естественного липидного окружения, неполярные участки белковых молекул склонны агрегировать с образованием неупорядоченных форм, непригодных для кристаллографического анализа. Необходимы специальные методы, позволяющие обойти эти трудности, и в этом был достигнут определенный прогресс. Установлено, что мембранные белки образуют кристаллы двух типов (рис.26).

ванные на использовании органических растворителей, не подходят для реконструкции белков. Внутренний объем БМВ намного больше, чем у ММВ, и лежит обычно в интервале от 5 до 20 л/моль. Чаще всего для получения БМВ используют следующие способы: А) Диализ или разбавление детергентных растворов представляет собой наиболее популярный метод для биохимических исследований, поскольку он пригоден для включения белков в образующиеся БМВ. Липид (или липид с белком) диспергируют избытком детергента, а затем детергент удаляют различными методами в зависимости от значения его ККМ. Размер липосом зависит не только от типа детергента или липида, но и от скорости удаления детергента. Б) Инфузия и обращенно-фазовое упаривание – это методы, связанные с использованием неполярных растворителей. Однако для приготовления модельных мембран, содержащих белки, эти методы непригодны. В) Методы слияния представляют собой несколько подходов, основанных на слиянии ММВ до образования липосом большего размера. Например, повторные операции замораживания-оттаивания (пригодны 2+ для реконструкции некоторых мембранных белков), использование Са для слияния ММВ, содержащих фосфатидилсерин. Г) Добавление фосфатидилхолинов с короткими цепями в количестве до 20 % от общего содержания липидов, при этом мультиламеллярные бислои превращаются в стабильные БМВ. Д) Добавление жирных кислот или детергентов при определенных условиях вызывает слияние ММВ с образованием БМВ. Добавление жирных кислот способствует также включению белков в бислой БМВ. Е) Быстрая экструзия мультиламеллярной дисперсии через поликарбонатные фильтры дает БМВ диаметром 600 – 1000 Ǻ. Этот метод имеет ряд существенных преимуществ. Ж) Кратковременное повышение рН приводит к образованию везикул (как ММВ, так и БМВ) из молекул фосфатидовой кислоты.

Тип I

Тип II

Рис.26. Два основных типа кристаллов мембранных белков Кристаллы типа I напоминают стопки мембран. В них осуществляется латеральное взаимодействие между неполярными участками, а мембраноподобные слои связывают полярные участки белков. Оказалось, что такие кристаллы нельзя исследовать с помощью РСА с высоким разрешением. Кристаллы типа II стабилизируются за счет контактирования полярных участков белковых молекул, а небольшие амфифильные соединения или детергенты в основном заполняют промежутки между ними. Важными факторами являются размер, заряд и другие свойства детергентов; если эти параметры неблагоприятны, то детергент может дестабилизировать кристаллическую структуру.

3. Моноламеллярные везикулы клеточных размеров Эти структуры образуются при обычной гидратации липидов и липидно-белковых смесей в растворах с низкой ионной силой. Размер везикул составляет от 0,1 до 300 мкм, а их внутренний водный объем достигает 300 л/моль. Эти везикулы остаются стабильными при центрифугировании, проводимом для разделения их по размерам. Кроме того, в

40

61

них можно вводить микроэлектроды для проведения электрических измерений.

несение сигналов в спектре 2D H-ЯМР к определенным остаткам аминокислот (рис.25б).

4. Мультиламеллярные везикулы По ряду своих характеристик эти структуры значительно уступают моноламеллярным везикулам и, как правило, редко используются. Эти везикулы осмотически активны, но сложность их внутренней организации затрудняет анализ результатов измерения осмотической активности. Таким образом, исследования модельных систем – монослоев, плоских бислоев и липосом вносят значительный вклад в изучение биологических мембран. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки, но в целом все они играют большую роль в углублении наших знаний о биологических мембранах.

a b Рис.25. Спин-спиновые (а) и диполь-дипольные (б) взаимодействия в пептидном фрагменте, анализируемые с помощью спектров COSY и NOESY 1 Одновременно с отнесением сигналов в спектре 2D H-ЯМР получают необходимую информацию для реконструкции пространственной структуры белка в растворе. Значения констант J между протонами Hα α β NС -Н, H-С С -H и величины ядерного эффекта Оверхаузера между протонами позволяют определить торсионные углы в остатках аминокислот. Анализ величин ядерного эффекта Оверхаузера между протонами аминокислотных остатков, удаленных по полипептидной цепи, дает возможность выявить элементы вторичной структуры. 3. Существенное значение имеет обнаружение внутримолекулярных водородных связей, характерных для вторичной структуры белка. Для этого изучают скорость обмена атомов водорода NH-групп с растворителем (например, D2O) и таким образом получают данные об их доступности внешней среде. 4. На заключительном этапе всю совокупность данных (константы спин-спинового взаимодействия, величины ядерного эффекта Оверхаузера и доступность протонов внешней среде) анализируют на ЭВМ при помощи специальных программ, учитывающих длины валентных связей, валентные углы, ван-дер-ваальсовы радиусы атомов и т.д. При этом обычно удается точно выяснить конформацию основной полипептидной цепи и наиболее вероятную ориентацию боковых радикалов. Метод ЯМР позволяет получать информацию о динамике поведения белковой структуры при изменении условий внешней среды (рН, Т, ионная сила) или при взаимодействии с другими молекулами.

Вопросы для самостоятельной работы. 1. Перечислите основные типы модельных мембранных структур. 2. Охарактеризуйте каждую модельную систему и проведите их сравнение с точки зрения изучения функций биологических мембран. 3. Какие способы приготовления моноламеллярных везикул вам известны? 4. Каковы преимущества липосомальных моделей?

4. Структура биологических мембран Жидкостно-мозаичная модель строения биомембран В стремлении понять то, как устроены биологические мембраны, многие исследователи давно пытались свести все разнообразие различных мембранных систем к одной универсальной модели, которая объясняла бы имеющиеся экспериментальные факты. Однако, возникали новые физико-химические методы исследований, которые открывали неизвестные ранее стороны в функционировании и структуре мембран, и это приводило к рождению новых идей и концепций о строении мембран. Возможность существования биологических мембран обусловлена уникальной способностью фосфолипидов формировать в воде стабильные бимолекулярные пленки. Первое предположение о липидной при-

1

Третичная и четвертичная структура мембранных белков. Основной метод определения третичной структуры водорастворимых белков – рентгеноструктурный анализ (РСА) кристаллических образцов. Метод РСА требует получения монокристаллов белков,

60

41

1. Важнейший этап – это отнесение сигналов протонов в спектрах 1 H-ЯМР. Сначала анализируют двумерные 2D H-ЯМР спектры пептида или белка, например COSY (корреляционная спектроскопия химических сдвигов), которые содержат всю информацию о спин-спиновых взаимодействиях между протонами молекулы, передаваемых через химические связи. Эффективность такого взаимодействия, характеризуемая константой спин-спинового взаимодействия J, резко уменьшается с увеличением числа ковалентных связей, разделяющих протоны, и обычно уже не наблюдается для четырех связей. В связи с этим сигналы протонов аминокислотных остатков классифицируют по типам спиновых систем в зависимости от числа атомов Н α β γ при атомах углерода С , С , С и т.д. (рис.25а). 1 2. Затем анализируют двумерные 2D H-ЯМР спектры ядерного эффекта Оверхаузера – NOESY, которые содержат всю информацию о диполь-дипольных взаимодействиях между пространственно сближенными протонами. Величина ядерного эффекта Оверхаузера обратно 6 пропорциональна шестой степени расстояния между ядрами (I~ 1/r ); она становится пренебрежимо малой при расстояниях свыше 4-5Ǻ. Основываясь на известной аминокислотной последовательности белка, спиновые системы протонов (отнесенные к определенным типам остатков аминокислот) "соединяют" между собой, выявляя диполь-

роде мембран было высказано в 1899 г. Э. Овертоном, который обратил внимание на корреляцию между скоростью, с которой небольшие молекулы проникают в растительные клетки, и их коэффициентом распределения между маслом и водой; это привело его к мысли о липидной природе мембран. В 1925 г. Гортер и Грендел предположили, что липиды в мембране эритроцитов образуют бимолекулярный слой (липидный бислой). Эта идея возникла на основе результатов элегантного и простого эксперимента. Ученые с помощью кюветы Ленгмюра измеряли площадь, занимаемую в монослое липидами, которые экстрагировали из мембраны эритроцитов, и пришли к выводу, что этого количества липидов достаточно для образования по всей поверхности мембраны сплошного слоя толщиной в две молекулы. По-видимому, этот вывод оказался правильным только благодаря взаимной компенсации методических ошибок, однако в историческом плане эта работа имела большое значение, поскольку с тех пор концепция липидного бислоя как структурной основы биомембран стала доминирующей и на самом деле оказалась верной.

1

С

γ

H

С

β

N

С

α

H

H

H

А

Наружная поверхность

Б Белок

Липоид β

H

H

С

C

Ni

Сi

Ci

Ni+1 С i+1

O

H

H

O

H

α

H

Липид

dβN α

dαN dNN дипольные взаимодействия между протонами NH (i + 1)-го аминокислотα β ного остатка и протонами NH, С Н и С Н предыдущего i-того остатка. Следуя таким образом вдоль полипептидной цепи, получают полное от-

Белок Внутренняя поверхность Рис.19. А. Модель Дэвисона-Даниелли Б. модель унитарной мембраны Робертсона Концепция бимолекулярной липидной мембраны получила дальнейшее развитие в предложенной в 1935 г. модели Дэвсона-Даниелли, или модели "сэндвича", в которой предполагалось, что белки покрывают поверхность липидного бислоя (рис.19А). Это была необыкновенно удачная модель, и в течение последующих 30 лет многочисленные экс-

42

59

периментальные данные, особенно полученные с помощью дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии, полностью подтвердили ее адекватность. Однако тогда же обнаружилось, что мембраны выполняют огромное множество функций, и чтобы объяснить этот феномен, исходная модель Дэвсона-Даниелли неоднократно подвергалась модификациям. В 1959 г. Дж. Д. Робертсон предположил, что все клеточные мембраны построены по единому принципу, и высказал концепцию унитарной (или единообразной) мембраны. Предложенная модель во многом сходна с классической моделью Дж. Даниелли: основу мембраны составляет липидный бислой, а нелипидные компоненты (прежде всего белки) в полностью развернутой конформации лежат на поверхности бислоя, связываясь с липидами за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (рис.19Б). В модели Робертсона нашла отражение еще одна важная структурная особенность мембраны – ее асимметрия. Последующий прогресс в мембранологии, в результате которого сформировались современные представления о структуре биомембран, в значительной мере был достигнут благодаря успехам в изучении свойств мембранных белков. Электронно-микроскопические исследования с применением метода замораживания-скалывания показали, что в мембраны встроены глобулярные частицы, а биохимикам с помощью детергентов удалось диссоциировать мембраны до состояния функционально активных "частиц". Данные спектральных исследований указывали, что для мембранных белков характерно высокое содержание αспиралей и что они, вероятно, образуют глобулы, а не распределены в виде монослоя на поверхности липидного бислоя. Неполярные свойства мембранных белков наводили на мысль о наличии гидрофобных контактов между белками и внутренней неполярной областью липидного бислоя. Тогда же были разработаны методы, позволившие выявить текучесть липидного бислоя. Сингер и Николсон свели воедино все эти идеи, предложив в 1972 г. новую модель молекулярной организации биомембран - жидкостно-мозаичную модель (рис.20). Согласно жидкостно-мозаичной модели: 1) Структурной основой биомембран является липидный бислой, в котором углеводородные цепи молекул фосфолипидов находятся в жидкокристаллическом состоянии. 2) В липидный бислой, имеющий вязкость растительного масла, погружены или встроены молекулы белков, способные передвигаться по мембране.

цию не только о вторичной структуре, но и об элементах третичной структуры (конфигурации дисульфидных связей, участии остатков Tyr в водородном связывании и др.). 1

3. Метод H-ЯМР. 1 При использовании современных подходов метод H-ЯМР спектроскопии позволяет полностью расшифровать пространственное строение пептида или небольшого белка с молекулярной массой 10000 – 15000 Д. Необходимыми условиями для этого являются наличие современной приборной базы (300 – 500 МГЦ), выбор правильной стратегии исследования данного белка и достаточное количество вещества (не менее 1 мкмоль белка). Определение вторичной и третичной структуры пептидов и белков основано на измерении ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) между протонами различных аминокислотных остатков и использовании величины ЯЭО в качестве меры расстояния между этими протонами – интенсивность этого взаимодействия обратно пропорциональна расстоянию между взаимодействующими ядрами, взятому в шестой степе6 ни (I ~ 1/r ). 1 На первом этапе исследования необходимо получение H-ЯМР спектра образца, в котором сигналы всех различных протонов разрешены. Однако, эту задачу невозможно осуществить с помощью методов 1 1 одномерного H-ЯМР. К примеру, в H-ЯМР спектре пептида, состоящего из 30 аминокислот, наблюдается 150-200 сигналов от различных магнитно-неэквивалентных протонов, причем все сигналы представляют собой перекрывающиеся мультиплетные системы. Для решения этой проблемы в 80-х годах были разработаны и в настоящее время широко 1 используются методы двумерной (а также многомерной) H-ЯМР спек1 троскопии. Двумерные H-ЯМР спектры представляют собой зависимость интенсивности сигналов от двух частот ω1 и ω2. Перенесение сигналов в плоскость приводит к увеличению разрешающей способности метода, решается проблема перекрывания сигналов. Эксперимент можно поставить таким образом, что по разным осям будут отложены разные взаимодействия – химический сдвиг и спин-спиновое взаимодейст1 вие. Трехмерные спектры H-ЯМР имеют в качестве третьей координаты 13 15 15 сигнал C- или N-ядер (используют N-меченные белки). Определение структуры белка проводят в несколько этапов.

58

43

6

Интенсивность комбинационного рассеяния

-4 2 -1 Молярная эллиптичность [Q]×10 град·см ·дмоль

- получать информацию о внутримолекулярных водородных связях в случае разбавленных растворов пептидов в четыреххлористом угле-1 роде или хлороформе (наличие полос поглощения при 3420 - 3480 см -1 отвечает свободным NH-группам, при 3300 - 3380 см – водородносвязанным NH-группам. 1

4 2

2

0

-2

-4

г

0,20

а

в

Рис.20. Модель жидкостно-мозаичной мембраны Сингера и Николсона

б

0,10

3 200

220

240 нм

Рис.23. Спектры КД поли-Lлизина в водных растворах в αспиральной (1), β-структурной (2) и неупорядоченной (3) конформациях

1630

1700

-1 см

Рис.24. Спектры комбинационного рассеяния: a- α-спираль, б- антипараллельная β-структура, в- параллельная βструктура, г- β-изгиб

Спектроскопию комбинационного рассеяния используют для количественной оценки различных типов вторичных структур. Подобно методу КД, сравнивают спектр образца с набором реперных спектров, характерных для определенных типов вторичных структур (рис. 24). Данным методом можно исследовать как образцы в твердом состоянии, так и в растворах, в т.ч. в обычной или тяжелой воде. Метод СКР дает информа-

В противоположность прежним моделям, рассматривающим мембраны как системы из жестко фиксированных компонентов, жидкостно-мозаичная модель представляет мембрану как "море" жидких липидов, в котором плавают "айсберги" белков. В зависимости от прочности связи с мембраной белки в рамках мозаичной модели подразделяются на два типа: периферические и интегральные.

К периферическим относятся белки, которые связаны с мембраной за счет полярных и ионных взаимодействий и относительно легко отделяются от нее в мягких условиях, например, при промывании буферными растворами с различными значениями рН или ионной силы, либо растворами, содержащими комплексообразующие вещества типа ЭДТА. Интегральные белки имеют на своей поверхности большие гидрофобные участки и располагаются внутри мембраны. Для выделения интегральных белков необходимо сначала разрушить липидный бислой. Жидкостно-мозаичная модель строения биомембран в настоящее время является общепризнанной, однако, следует помнить, что она все же представляет собой упрощенное и схематичное отражение столь сложной и разносторонней системы, как биологическая мембрана. Одним из постулатов этой модели является предположение о свободном движении молекул белков и липидов в двумерной фазе липидного бислоя. Однако вскоре выяснилось, что не все белки и липиды способны к свободному перемещению, в некоторых случаях их подвижность сильно ограничена. Во многих мембранах интегральные белки находятся в фиксированных положениях за счет высокой концентрации белка, вследствие его агрегации, образования липидных доменов, а также взаимодействия белков с цитоскелетом, образуемым внутренними структурами клетки. В некоторых мембранах значительные количества липидов могут находиться в сильно упорядоченном состоянии или, наоборот, в составе

44

57

небислойных фаз. Это означает, что распределение липидов вдоль поверхности мембраны не является гомогенным, как следовало бы ожидать в случае их свободной диффузии согласно жидкостно-мозаичной модели, а в значительной мере гетерогенно. Кроме того, жидкостно-мозаичная модель не объясняет высокую гетерогенность липидного состава биологических мембран. Необходимо отметить, что липиды биологических мембран различаются не только по структуре полярных групп, но и по степени ненасыщенности и длине углеводородных цепей, а также по способу их присоединения к глицериновому остатку (сложная эфирная, простая эфирная и винильноэфирная связь). Липидный состав биологических мембран всегда чрезвычайно гетерогенен и в его построении участвуют сотни химически индивидуальных липидных молекул. Данный факт не согласуется с представлениями о пассивной роли липидов в функционировании мембран в качестве структурной матрицы, в которой расположены мембранные белки.

сумму компонентов, отвечающих поглощению разных участков белковой молекулы: α-спиралей, β-слоев и случайных клубков. Определив тем или иным способом спектры каждой из этих структур, производят их суммирование, подбирая соответствующие коэффициенты таким образом, чтобы было достигнуто наилучшее соответствие измеренному спектру. Подобранные весовые коэффициенты представляют собой ту долю, которая приходится в молекуле на каждый из типов вторичной структуры. Эти методы были разработаны для водорастворимых белков, но их с успехом можно использовать и для изучения мембранных белков. Некоторые белки можно изучать in situ, используя суспензии мембран. Очищенные мембранные белки можно исследовать с помощью КД и в присутствии детергентов, если поглощение последних в дальней УФобласти не слишком велико, или в составе реконструированных везикул. К достоинствам этого метода относится его высокая чувствительность (объем исследуемого образца составляет 50 мкл – 1 мл, концентрация белка ~ 1мкмоль), а также возможность моделирования мембранного окружения исследуемого белка. Однако, метод КД не дает возможности определить расположение α-спиралей, β-структур и неупорядоченных клубков в полипептидной цепи. Кроме того, некоторые ароматические аминокислоты могут вносить дополнительный вклад в эффективное поглощение в данной области спектра и искажать результаты.

Асимметрия биомембран Для выполнения векторных функций клеточные мембраны должны быть асимметричными, т.е. наружная и внутренняя стороны мембраны должны отличаться по составу образующих их компонентов. В создании этой асимметрии участвуют как белковые, так и липидные компоненты мембраны: 1) Асимметрия белков в мембране является абсолютной в том смысле, что пространственная ориентация белковой молекулы в липидном бислое всегда является однозначной. Асимметрия белков в биомембранах определяется путями их биогенеза. (Пример – плазматическая мембрана клетки, белки-рецепторы, каналообразователи находятся на внешней стороне, ферменты – на внутренней). 2) Асимметрия липидов является относительной – как правило, одни и те же липиды находятся как в наружном, так и во внутреннем монослое, но концентрация этих липидов в каждом из монослоев неодинакова. (например, в наружном монослое биомембран больше ФХ, сфингомиелина, а внутренний монослой содержит больше ФЭА, ФС). Трансмембранное распределение липидов в мембранах определяется как путями их биогенеза, так и может складываться под влиянием различных условий среды по обе стороны мембраны. Существенное значение имеет кривизна мембраны – на участках высокой кривизны различия в упаковке молекул липидов могут служить причиной неодинакового распределения

2. ИК-спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (СКР). Эти методы не только позволяют получить сведения о конформации мембранных липидов, но и могут использоваться для исследования вторичной структуры белков. Колебательный спектр полипептидного остова зависит от типа вторичной структуры и дает информацию о содержании в молекуле α- и β-структур. Данными методами можно исследовать высушенные на воздухе пленки, водные суспензии мембран, а также очищенные белки как в присутствии детергента, так и в составе реконструированных везикул. ИК-спектроскопия позволяет: - надежно различать транс- и цис-амидные связи в пептидах (нали-1 чие полосы поглощения при 1550 см соответствует наличию трансконфигурации, отсутствие полос в этой области свидетельствует о цисконфигурации всех пептидных связей).

56

45

внесении радиационного повреждения в любое место полипептидной цепи. Ключевым моментом является то, что чем крупнее белковая молекула, тем больше вероятность ее повреждения и, следовательно, вероятность инактивации. Эта вероятность зависит не от формы молекулы, а от ее массы. Обычно для того, чтобы облегчить интерпретацию результатов, параллельно облучают белок с известной молекулярной массой. Если исследуемый белок содержит более одной субъединицы, возникают определенные трудности при анализе результатов. Повреждение одной субъединицы не обязательно сопровождается разрывом ковалентных связей в других субъединицах. Поэтому для ферментов, состоящих из разных субъединиц, обладающих неодинаковыми активностями, могут быть получены разные размеры мишени в зависимости от метода определения степени инактивации. Примечательной особенностью метода является то, что его можно использовать для изучения интегральных мембранных белков in situ. К ограничениям метода следует отнести необходимость использования высокоэнергетического излучения, что ограничивает широкое применение данного метода.

липидных молекул, отличающихся по стерическим требованиям и заряду (ФХ и ФЭА). Кроме трансмембранной асимметрии биомембранам присуща и латеральная гетерогенность липидного состава. Так, к примеру, плазматическая мембрана многих эукариотических клеток сильно поляризована и имеет четко выраженные макроскопические домены (базолатеральная и апикальная области эпителиальных плазматических мембран выполняют различные функции, имеют неодинаковый состав и физически разнесены по поверхности клетки). Таким образом, в настоящее время модель Сингера-Николсона нуждается в значительных уточнениях. Особенность современного этапа исследований по молекулярной организации биомембран состоит в том, что настала пора переходить от общих всеобъемлющих схем к построению детальных "топографических карт" конкретных мембранных систем, оценивая степень подвижности отдельных компонентов в мембране, их взаимное расположение, а также специфичность взаимодействия друг с другом. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Какие факты позволили выдвинуть концепцию бимолекулярной мембраны? 2. Перечислите достоинства и недостатки моделей “сэндвича”. 3. Какие физические методы внесли вклад в развитие представлений о строении биомембран? 4. Назовите основные положения жидкостно-мозаичной модели. 5. Сравните асимметрию белков и липидов в мембранах. 6. Что является недостатком жидкостно-мозаичной модели?

Определение вторичной и третичной структуры мембранных белков Для определения содержания α-спиралей и β-слоев в мембранных белках используют несколько методов. В отсутствии трехмерной организации на их основе можно попытаться построить соответствующие модели. Чаще всего используется метод кругового дихроизма (КД). Все более широкое применение находят инфракрасная (ИК) и рамановская спектроскопия, а также ЯМР. 1. Метод кругового дихроизма основан на измерении разности поглощения лево- и правополяризованного света; эта оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней УФ области (от 190 до 240 нм) КД определяется в основном поглощением амидов карбонильных групп полипептидного остова. При наличии участков вторичной структуры, например α-спиралей, спектр КД имеет вполне определенные особенности, связанные с особенностями электронного окружения амидных групп в этих структурах (рис.23). Анализируя спектр КД белков, его обычно представляют как

55

46

5. Мембранные белки Принципы структурной организации мембранных белков Основная роль липидов в составе мембран заключается в стабилизации бислойной структуры, а белки являются активными компонентами биомембран. На заре развития мембранологии полагали, что мембранные белки по своей структуре довольно гомогенны и уложены в виде βслоев по поверхности бислоя. Сейчас принято считать, что по крайней мере у трансмембранных белков те их участки, которые погружены в мембрану, содержат α-спирали. Еще один важный момент – способы прикрепления белков к мембране. Они схематически представлены на рис.21. 1. Связывание с белками, погруженными в бислой. Примеры: F1+ часть Н -АТФазы, которая связывается с F0-частью, погруженной в мембрану; некоторые белки цитоскелета. 2 .Связывание с поверхностью бислоя. Это взаимодействие имеет в первую очередь электростатическую природу (например, основный белок миелина) или гидрофобную (например, поверхностно-активные пептиды и, возможно, фосфолипазы). На поверхности некоторых мембранных белков имеются гидрофобные домены, образующиеся благодаря особенностям вторичной или третичной структуры. Указанные поверхностные взаимодействия могут использоваться как дополнение к другим взаимодействиям, например к трансмембранному заякориванию. 3. Связывание с помощью гидрофобного "якоря". Эта структура обычно выявляется как последовательность неполярных аминокислотных остатков (например, у цитохрома b5). Некоторые мембранные белки используют в качестве якоря ковалентно связанные с ними жирные кислоты или фосфолипиды. 4. Трансмембранные белки. Одни из них пересекают мембрану только один раз (например, гликофорин), другие – несколько раз (например, лактопермеаза, бактериородопсин).

Альтернативный способ определения молекулярной массы нативной формы мембранного белка состоит в равновесном ультрацентрифугировании. Распределение вещества в состоянии равновесия таково, 2 что наклон графика зависимости логарифма концентрации от r равен: 2

tg α = ω M(1 – Vρ)/(2RT), Где r – расстояние от центра ротора до данной точки в центрифужной пробирке, ω – частота вращения ротора. Если величина V известна или ее легко оценить, как для большинства растворимых белков, эта задача решается достаточно просто. Что касается мембранных белков, то в этом случае определяют наклон указанной прямой при разных значениях ρ, получаемых смешиванием H2O и D2O. Как и ранее, одновременно находят Mк и Vк и далее определяют молекулярную массу белка. Если в комплексе присутствует третий компонент (например, какое-то количество связанного липида), возникают дополнительные проблемы. В любом случае все описанные процедуры определения молекулярной массы весьма сложны и могут давать ошибочные результаты. Количество детергента, связанного с очищенными интегральными белками, может быть весьма существенным – от 0,3 до 1,5 от массы белка, и даже небольшие ошибки в этой величине приведут к значительному искажению молекулярной массы белка. 3. Метод радиационной инактивации. Метод радиационной инактивации для определения размера мишени все чаще применяется при исследовании мембранных белков. Изучать можно как очищенные белки, так и неочищенные препараты, в том числе интактные биомембраны. Суть метода состоит в определении доли белковых молекул, получающих повреждения при облучении. Для этого используют ферментативные методы связывания гормонов или других лигандов или спектральные методы. Процедура состоит в следующем. Образец, обычно замороженный, подвергают высокоэнергетическому облучению (например, облучают пучком электронов из синхротрона). Через разные промежутки времени отбирают пробы, размораживают их и проводят измерения. Повреждения белка под действием излучения (в частности, разрыв ковалентных связей) выявляют, например, с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Как показывает опыт, некоторые субъединицы полностью утрачивают биологическую активность при

54

47

0

S =M(1-Vρ)/(N6πηRc), Где: M- молекулярная масса белка, V- его парциальный удельный объем (величина, обратная плотности), η – вязкость раствора (~ 1 сантипуаз), ρ – плотность раствора (~ 1 г/мл), Rc- радиус Стокса (размер "эквивалентной гидродинамической сферы"). поскольку ρ и η известны, а Rc можно определить с помощью гельфильтрации, остаются только две неизвестные величины – V и M. Для водорастворимых белков V можно вычислить, исходя из аминокислотного состава или непосредственно измерить, либо просто принять равным 0 0,72-0,75 мл/г. Таким образом, измерив S , можно найти M. В ситуации с мембранным белком возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица – это белководетергентный комплекс, поэтому М и V в данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса, Мк и Vк. К сожалению, Vк нельзя оценить, не зная ничего о составе комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода. 1) Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка. Для этого используют спектральные методы или радиоактивно меченный детергент, а для выделения комплексов применяют различные методы, например, гель-фильтрацию. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение Vк получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят Мк, а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка. 0 2) Измеряют S в средах с разными значениями плотности раствора ρ. Такие среды обычно получают, использую смеси H2O и D2O. Из гра0 фика зависимости S от ρ находят как Мк, так и Vк. При этом предполагается, что Vк – это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента: Vк = (Доля белка) V белок + (Доля детергента)·V детергент, Оценив Vбелок и взяв Vдетергент из соответствующих таблиц, получают молекулярную массу белковой составляющей Mк.

(1) Связывание с другими "якорными" белками

(5) Одиночный трансмембранный сегмент

(2) В основном электростатическое связывание с бислоем

(3) В основном гидрофобное связывание, но практически без погружения в бислой

(6) Множественные трансмембранные сегменты

(4) Заякоривание с помощью короткого концевого сегмента

(7) Заякоривание с помощью ковалентно связанного липида

Рис.21. Способы прикрепления мембранных белков к мембране Различиями между наружными (периферическими) и внутренними (интегральными) мембранными белками не задается однозначно способ их прикрепления к бислою; эти различия определяют лишь относительную силу их связывания.

Выделение и очистка мембранных белков Главной особенностью мембранных белков является их низкая растворимость в воде, что чрезвычайно затрудняет их выделение и очистку. Более ста лет белковая химия развивалась как химия водорастворимых

48

53

белков, так что все ее методы приспособлены для исследования именно водных растворов белков. Поэтому для разделения мембранные белки предварительно переводят в растворимое состояние – солюбилизируют. С этой целью мембрану обрабатывают различными разрушающими агентами: - При солюбилизации белков с помощью органических растворителей белки обычно денатурируют и теряют свою биологическую активность. Исключение составляют спирты со средней длиной цепи (например, бутанол), с помощью которых иногда удаётся выделить мембраносвязанные ферменты с сохранением их активности. - Хаотропные соединения представляют собой вещества, нарушающие упорядоченную структуру воды и тем самым приводящие мембраны в состояние хаоса (например, мочевина, йодид натрия); их часто применяют в комбинации с другими солюбилизирующими агентами. - Детергенты наиболее широко используются для солюбилизации и фракционирования мембранных белков. Они представляют собой мылоподобные амфифильные соединения, способные к мицеллообразованию, молекула которых состоит из полярной и неполярной частей. Неполярной частью детергенты оттесняют липиды от белковых молекул и, не давая им слипаться друг с другом, переводят в водный раствор. Очень важен правильный выбор детергента, так как именно детергенты разрушают биомембрану, занимая место липидов, окружающих тот или иной белок, и определяют стабильность белка в растворе.

вышению электрофоретической подвижности из-за образования более компактного комплекса белок-ДСН. Данные эффекты весьма существенны. Например, лактопермеаза имеет кажущуюся молекулярную массу 33 000, если измерять ее с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН; в действительности же, как показывают результаты генетического анализа, ее молекулярная масса равна 46 000. Во многих случаях удается оценить молекулярную массу более точно, если построить график Фергюсона, представляющий зависимость электрофоретической подвижности от содержания акриламида как для стандартных белков, так и для исследуемого белка (этот график зависит от радиуса Стокса и в меньшей степени – от заряда комплекса, т.е. от количества связанного ДСН). 3. Возможное наличие четвертичной структуры. Некоторые мембранные белки агрегируют даже в присутствии ДСН (например, гликофорин А или белок оболочки бактериофага М13 при электрофорезе в ПААГ с ДСН находятся в основном в виде димеров). Иногда агрегация еще более усиливается при нагревании смеси белок-ДСН. Чтобы оценить способность белка к необратимой агрегации, следует провести сравнительный анализ результатов электрофореза в ПААГ с ДСН для прогретых и непрогретых проб. Сходная проблема иногда возникает изза присутствия детергента, использованного при очистке белка; этот детергент необходимо удалить и заменить на ДСН. Таким образом, есть основания считать, что в некоторых случаях оценка молекулярной массы интегральных белков с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН может оказаться неверной. К сожалению, простая альтернатива этому методу отсутствует, и правильную величину часто получают либо по данным о полной первичной последовательности (обычно последовательности соответствующего гена), либо с помощью точного гидродинамического анализа.

Требования к детергентам В течение последних десятилетий появилось значительное число детергентов, пригодных для очистки интегральных мембранных белков (рис.22). В принципе, идеальным был бы такой детергент, который не нарушал бы вторичную и третичную структуры мембранных белков, а лишь замещал бы все мембранные липиды, контактирующие с гидрофобными участками белковой молекулы. Конечной целью солюбилизации является встраивание белка в детергентную мицеллу; последующая стратегия очистки состоит в разделении таких белково-детергентных комплексов. Первая проблема – это подбор оптимальных условий солюбилизации исследуемого белка. Детергенты, денатурирующие белки, например, додецилсульфат натрия (ДСН), не подходят для решения такой деликатной задачи. С другой стороны, многие детергенты недостаточно эф-

2. Гидродинамические методы. Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. В случае водорастворимых белков обычно измеряют скорость седиментации с помощью либо аналитического ультрацентрифугирования, либо центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Коэффициент седиментации для водорастворимого белка равен:

52

49

матографии на ДЭАЭ-целлюлозе, сефарозе или гидроксилапатите, гельфильтрации, центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и т.д. Очень важен правильный выбор детергента, поскольку именно детергент разрушает биомембрану, занимая место липидов, окружающих тот или иной белок, и определяет стабильность белка в растворе.

фективно разрушают мембраны и образуют белоксодержащие смешанные мицеллы. Первоначально надеялись, что выбор необходимого детергента удастся систематизировать с помощью одного параметра, называемого гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ). Этот параметр, изменяющийся от 0 до 20, используется при получении сурфактантов в качестве мере относительной гидрофобности. Действительно, получены некие корреляции, из которых следует, что значение ГЛБ детергента может использоваться для предсказания его поведения в биологических системах. Вообще говоря, можно сказать, что детергенты со значением ГЛБ в диапазоне от 12,5 до 14,5 являются наиболее эффективными растворителями интегральных мембранных белков. Однако впоследствии выяснилось, что поиск оптимальных детергентов для конкретного мембранного белка требует учета многих факторов и всегда должен сопровождаться эмпирической проверкой. Таким образом, при выборе детергента следует учитывать следующие факторы: 1. Солюбилизация исследуемого белка должна быть максимальной. Критерием является переход белка в супернатант после центрифугирования, при котором происходит осаждение мембраны. 2. Солюбилизация белка в нужной форме. Обычно речь идет о сохранении его ферментативной активности, но иногда используются определенные спектральные характеристики или наличие конкретных белковых ассоциатов. Кроме того, необходимым условием является стабильность белка после солюбилизации. В некоторых случаях для поддержания биохимической активности вместе с детергентом добавляют экзогенные фосфолипиды, иногда для стабилизации белка добавляют глицерин или другой полиол. Имеет смысл использовать также ингибиторы протеаз и проводить солюбилизацию в условиях, сводящих к минимуму вероятность их протеолитического расщепления. 3. Возможность использования детергента в конкретной методике предполагает учет следующих моментов: - заряд детергента (ионообменная хроматография); - поведение при данном значении рН (например, соли желчных кислот часто выпадают в осадок при рН < 8); - ККМ и размер мицелл детергента; данные свойства особенно важны: детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, не удаляются при диализе или ультрафильтрации из-за слишком низкой концентрации мономеров детергента (а именно они достаточно малы для прохождения через поры мембран). По этой причине многие исследователи предпо-

Характеристика очищенных интегральных мембранных белков. Характеристика очищенных мембранных белков, даже самых простых, может составлять определенные трудности. Как и в случае растворимых белков, нужно определить число и молекулярную массу полипептидных субъединиц, их стехиометрию, размер и, возможно, форму молекулы, а также, если это необходимо, биохимическую активность.

Определение молекулярной массы мембранных белков. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии ДСН – обычная методика, но в случае интегральных мембранных белков при ее применении возникают особые проблемы. Суть этого метода состоит в том, что додецилсульфат натрия (ДСН) связывается с полипептидными цепями, и комплексы белок-ДСН разделяют в ПААГ в соответствии с их стоксовыми радиусами, которые в большинстве случаев зависят от молекулярной массы. Молекулярную массу определяют, сравнивая электрофоретическую подвижность данного комплекса и известного стандарта. Однако связывание ДСН с неизвестным белком может качественно отличаться от связывания со стандартами, и тогда будет получен неправильный результат. Это возможно в следующих случаях: 1. С интегральными белками, содержащими большой процент неполярных аминокислотных остатков, может связываться больше детергента (с большинством растворимых белков ДСН образует комплексы в соотношении 1,4 г ДСН на 1 г белка). Возникающий при этом дополнительный отрицательный заряд приводит к аномальному повышению электрофоретической подвижности, и определяемая величина молекулярной массы оказывается заниженной. 2. Связывающийся с ДСН мембранный белок может находиться в частично свёрнутом состоянии, что также приводит к аномальному по-

50

51

читают использовать детергенты с высокими ККМ, например, октилглюкозид, соли желчных кислот или цвиттер-ионные детергенты. - поглощение света детергентом; некоторые детергенты, например тритон Х-100, поглощают в ближней УФ-области, что делает невозможным определение концентрации белка по измерению оптической плотности при λ=280 нм. С учетом этих факторов становится понятно, почему во многих случаях при выделении интегральных мембранных белков приходится использовать набор детергентов. Например, для солюбилизации можно применять тритон Х-100, а разделение с помощью ДЭАЭ-целлюлозы лучше проводить в присутствии октилглюкозида. Детергенты можно менять на стадии хроматографии, во время центрифугирования в градиенте плотности или с помощью диализа. Иногда непригодный для солюбилизации детергент может быть очень эффективным для сохранения белка в растворе после замены детергента. Очистку почти всегда следует проводить при избытке детергента в растворе, иначе равновесие будет сдвинуто в сторону агрегации мембранных белков, а не в сторону образования белково-детергентных комплексов.

CH3

O H3C

OH Glu Glu Gal

Gal

Xyl

O

OH

H

CH2OH O

Октилглюкозид (октил-β-Dглюкопиранозид)

O HO OH OH

CH3

CH3 CH3

CH3 10

OH

Название

O H3C

-

O Na HO

(O CH2 CH2)9

+

CH3

Холат натрия (3α,7α,12αтригидрокси-5β-холанат натрия)

H3C

HO

H

H3C

HO

H

OH

OH

Рис.22. Детергенты, наиболее часто используемые для солюбилизации и реконструкции мембран Методы очистки мембранных белков

O

CH3

10

Тритон Х-100 п-(трет-октил)фениловый эфир полиэтиленгликоля Луброл РХ (додециловый эфир полиэтиленгликоля)

OH CH3

H3C HO

Дигитонин

H3C

(O CH2 CH2)9

Структурная формула

O

CH3

N H

O

+

S

CH3

O

N

-

O

ЧАПС (3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]пропансульфонат)

Для очистки интегральных мембранных белков и получения их в биохимически активной форме необходимы детергенты, позволяющие солюбилизировать белки и сохранять их в растворе. Соответствующие требования к детергентам и правила обращения с ними создают дополнительные проблемы помимо тех, с которыми обычно сталкиваются при очистке белков. Для выделения интегральных мембранных белков разработано много специальных методов, однако большинство схем очистки основано на тех же хроматографических и гидродинамических методиках, которые используются для растворимых белков. Это методы хро-