Гемостаз

ОТЕЧЕСТВЕННОЕ И ИМПОРТНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Российский НИИ гематологии и трансфузиологии

Гемостаз Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний Учебное пособие Под редакцией: проф. Н.Н.Петрищева проф. Л.П.Папаян Санкт-Петербург 1999

УДК 616-005.2:616.151.5-07 Авторский коллектив: Т.В. Вавилова, О.Г. Головина, М.С. Зайнулина, В.И. Иванов, И.В. Миндукшев, Л.П. Папаян, Н.Н. Петрищев, А.С. Шитикова, В.Л. Эмануэль. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. /Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. ISBN 0340-6245 В учебном пособии изложены современные представления о механизмах гемостаза, описаны наиболее доступные методы исследования тромбоцитарных, плазменных и сосудистых компонентов системы гемостаза, а также ряд информативных методов, которые еще не нашли широкого применения в клинических лабораториях. Большое внимание уделено алгоритмам диагностики нарушений гемостаза и вопросам обеспечения качества лабораторных исследований. Пособие предназначено для врачей-лаборантов, специализирующихся в области гемостазиологии, а также может быть полезным и врачам других специальностей. УДК 616-005.2:616.151.5-07 ISBN 0340-6245 © Издательство СПбГМУ, 1999 © Коллектив авторов, 1999 Настоящее пособие рассчитано на тех, кто решил ознакомиться с физиологией и патологией системы гемостаза и основными методами её исследования. Эти знания требуются не только врачам клинической и лабораторной диагностики. Они необходимы клиницистам любого профиля, поскольку нет такой специальности, при которой врач не сталкивался бы с больными, страдающими кровоточивостью или тромбозами. Понимание основ гемостаза позволяет лечащему врачу назначить больному адекватное лабораторное исследование и соответственно патогенетическое лечение. Преподавание основ физиологии и патологии гемостаза, практическое обучение методам оценки сосудисто-тромбоцитарных и коагуляционных реакций проводятся на специальном цикле "КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМОСТАЗИОЛОГИЯ" факультета постдипломного образования СПб Государственного Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова. Обучение

проходит на базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии. После окончания цикла слушатели получают удостоверение о повышении квалификации; сдавшим сертификационный экзамен выдается сертификат врача по клинической и лабораторной диагностике. Продолжительность цикла 2,5 мес., для иногородних слушателей возможно очно-заочное обучение. ЗАПИСЬ НА ОБУЧЕНИЕ – ПО ТЕЛ. 277-35-82 (ЛАБОРАТОРИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ). На базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии проводится также исследование больных, с целью установления причины повышенной кровоточивости или повышенной склонности к развитию тромбозов (тромбофилии). Запись на исследование системы гемостаза проводится по телефону 27735-82 с 10 до 16 часов по рабочим дням. ПОМНИТЕ, ЧТО КАЧЕСТВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА – ОСНОВА ЭФФЕКТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ!

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАЗА Тромбоцитарное звено гемостаза Адгезия и агрегация тромбоцитов Остановка кровотечения при повреждении стенки сосуда начинается с сосудисто-тромбоцитарных реакций. Уже через доли секунд после травмы в зоне повреждения наблюдается спазм сосудов и развивается цепь реакций кровяных пластинок, которая приводит к образованию тромбоцитарной пробки. Прежде всего, происходит прилипание (адгезия) тромбоцитов к коллагеновым волокнам, находящимся в сосудистой стенке, к другим адгезивным белкам субэндотелия (фактору Виллебранда, фибронектину, витронектину, ламинину, тромбоспондину), а также к поступающему из плазмы фибриногену (рис. 1). Из адгезировавших тромбоцитов высвобождается аденозиндифосфат (ADP) - важнейший индуктор агрегации кровяных пластинок. Под влиянием ADP циркулирующие кровяные пластинки присоединяются к уже фиксированным на раневой поверхности и друг к другу (агрегируют). Процесс агрегации вызывается также всеми активными субстанциями, которые высвобождаются в области повреждения не только из стимулированных при адгезии тромбоцитов, но и из форменных элементов крови и эндотелия (например, ADP из гемолизированных эритроцитов, активирующий пластинки фактор - PAF и ADP из стенки сосудов). Агрегация индуцируется и первыми малыми количествами тромбина, генерируемого по внешнему и внутреннему пути коагуляции. В результате в процесс вовлекается все большее число тромбоцитов, поступающих в зону повреждения. Однако на данной стадии, определяемой как стадия обратимой или первичной агрегации, связи между тромбоцитами еще не прочные, и часть из них может отрываться током крови. Позже на стадии необратимой или вторичной агрегации агрегаты уплотняются, становятся непроницаемыми для крови и плотно закрывают имеющийся дефект в сосудах малого и среднего размера. Таким путем достигается первичный гемостаз, т.е. ранняя начальная остановка кровотечения за счет спазма сосудов и образования тромбоцитарной пробки. Поэтому первичный гемостаз называют также сосудисто-тромбоцитарным. Уже на ранних стадиях тромбоцитарных реакций стимулируется коагуляционная активность тромбоцитов - в плазматической мембране становятся доступными коагуляционно активные фосфолипиды, которые принимают существенное участие во внутреннем пути свертывания крови. В связи с этим в дальнейшем на основе тромбоцитарной пробки формируется фибриновый сгусток. Тромбоцитарно-фибриновая гемо-статическая пробка может противостоять повышенному кровяному давлению после восстановления тока крови в поврежденных сосудах среднего размера. Таким образом, на этой стадии осуществляется окончательный, или вторичный

гемостаз. Необходимо остановиться на основных функциональных, биохимических и молекулярных процессах, которые развиваются в ходе осуществления тромбоцитарного гемост аза, поскольку без понимания механизма гемостатических реакций, протекающих в организме, невозможно адекватно интерпретировать результаты исследований при патологии. В фазе адгезии прилипание кровяных пластинок к субэндотелиальным структурам, прежде всего к коллагену (рис.1), различается по своему механизму в зонах циркуляции с малой скоростью тока (и низким напряжением сдвига) и с большой скоростью тока крови (и высоким напряжением сдвига). При низком напряжении сдвига (в случае повреждения стенок крупных артерий, вен) тромбоциты присоединяются к коллагену непосредственно через коллагеновые рецепторы их плазматической мембраны - гликопротеины la-lla (GPIa-lla). При высоком напряжении сдвига (при повреждении мелких артерий и артериол) прилипание кровяных пластинок к коллагену опосредовано высокомолекулярным кофактором адгезии - фактором Виллебранда (vWF), который в зоне повреждения поступает из плазмы, высвобождается из эндотелия, секретируется тромбоцитами. vWF при большой скорости тока крови способен соединяться, с одной стороны, с коллагеном, а с другой, - с тромбоцитарным рецептором GPIb. Таким путем формируется «ось адгезии»: коллаген -vWF - GPIb. Генетически обусловленное отсутствие или снижение числа названных адгезивных рецепторов в тромбоцитарной плазматической мембране приводит к развитию геморрагического диатеза из-за нарушения адгезии (и как следствие - последующих стадий первичного гемостаза). Однако подобные мембранные дефекты (дефицит GPIb при болезни Бер-нара-Сулье и особенно дефицит GPIa-lla) наблюдаются достаточно редко. В отличие от этого нарушение фазы адгезии из-за недостаточности или дефекта кофактора адгезии (vWF) является причиной наиболее часто встречающегося врожденного геморрагического заболевания - болезни Виллебранда.

Рис. 1. Тромбоцитарное звено гемостаза Сокращения, применяемые в рис.1: АА-арахидоновая кислота ADP - аденозиндифосфат Са2+е - ионы кальция экзогенные по отношению к тромбоцитам Са2+, - свободный цитоплазматический Са2+ тромбоцитов COG - циклооксигеназа DG-диацилглицерол DTS- плотная тубулярная система Fbg - фибриноген FN - фибронектин GP - гликопротеины: GP llb-llla,GP la-lla,GP Ib 5НТ - серотонин 1Рз- инозитол 1,4,5-трисфосфат MLCK - киназа легкой цепи миозина Р47 - плекстрин PC - фосфатидилхолин

РЕ - фосфатидилэтаноламин PG - простагландины (G2н2) PI - фосфатидилинозитол PIP - фосфатидилинозитол 4-фосфат РIР2 - фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат РКС - протеинкиназа С PLA2-фосфолипаза А2 PLC - фосфолипаза С PS - фосфатидилсерин TFPI -ингибитор пути тканевого фактора TSP - тромбоспондин ТХА2 - тромбоксан A2 TXSyn - тромбоксансинтетаза VN - витронектин vWF фактор Виллебранда I , II , III - положительные обратные связи активации тромбоцитов Для оценки реакций адгезии тромбоцитов в зонах с высоким напряжением сдвига протекающей крови используют антибиотики ристомицин и ристоцетин, которые по своим адгезивно-агрегационным свойствам оказались близкими к субэндотелиальным структурам сосудов, т.е. для взаимодействия их с тромбоцитами необходим и vWF. и GPIb. Поэтому состояние основных компонентов, участвующих в адгезии в области микроциркуляции, может быть оценено на основании агрегации кровяных пластинок in vitro с этими антибиотиками - она снижена или отсутствует как при болезни Виллебранда, так и при болезни Бернара-Сулье. Участие мембранных GPIa-IIa во взаимодействии с коллагеном в зонах с низким напряжением сдвига может быть определено в агрегационных исследованиях с коллагеном. Следующая стадия тромбоцитарных гемостатических превращений первичная агрегация - является результатом последовательных реакций активации кровяных пластинок в зоне повреждения. Стимуляция их вызывается и химическими, и физическими воздействиями на плазматическую мембрану. Тромбоциты могут активироваться при действии на их поверхность гемодинамических сил, возникающих при турбулентном токе или при повышении скорости движения крови в местах сужения просвета сосуда. Но большее значение имеет химическая мембранная активация, опосредованная рецепторами. Так, описанное взаимодействие субэндотелиальных субстанций с рецепторами пластинок в фазе адгезии приводит к дальнейшей передаче сигнала активации внутрь клетки. Кроме того, как указывалось выше, тромбоциты активируются при действии на них целого ряда растворимых естественных агонистов, которые присутствуют в зоне повреждения. Важно подчеркнуть, что способностью стимулировать кровяные пластинки обладают в основном те субстанции, для которых в плазматической мембране имеются соответствующие рецепторы. Исключением являются немногие вещества, способные проникать через

мембрану - арахидоновая кислота, ионофор А23187. Естественные агонисты разделяют на сильные и слабые, отличающиеся по механизму вызываемых ими реакций активации. К сильным агонистам относят коллаген и тромбин в больших дозах. Для осуществления их стимулирующего действия не нужны дополнительные линии усиления активации - так называемые положительные обратные связи (рис.1). Напротив, для эффекта слабых агрегирующих агентов, т.е. всех остальных естественных агонистов при больших и средних дозах (а также сильных агонистов в малых дозах) необходимы эти сложные обратные пути активации. Взаимодействие слабых агрегирующих агентов со своими рецепторами плазматической мембраны, прежде всего, приводит к развитию доступности фибриногеновых рецепторов - GPIIb-IIIa. После этого фибриноген, который является симметричной молекулой, в присутствии ионов Са2+ связывается с рецепторами двух близлежащих тромбоцитов. Необходимое для осуществления связей столкновение отдельных пластинок достаточно часто происходит в условиях тока крови в организме или в перемешиваемой плазме в агрегометре. При соблюдении всех этих дополнительных условий именно образование фибриногеновых мостов между рецепторами тромбоцитов обусловливает первичную агрегацию. Поэтому основными причинами ее нарушения являются снижение (или отсутствие) в тромбоцитарной мембране GPIIb-IIIa (при врожденном наследственном заболевании - тромбастении Гланцмана) и полное отсутствие фибриногена плазменного кофактора агрегации (при врожденной афибриногенемии). Тромбоцитарная секреция и вторичная агрегация. Первичная агрегация - это только одна из начальных ступеней в цепи гемостатических реакций тромбоцитов, и она не способна обеспечить эффективный гемостаз. Для этого необходимо осуществление всех последующих стадий и финальных функциональных реакций клетки - реализации ее коагуляционной активности, секреции, образования вторичных консолидированных агрегатов, непроницаемых для крови. Стимулы слабых агонистов для этого не достаточно сильны и для завершения гемостаза требуется включение ряда дополнительных механизмов активации с развитием положительных обратных связей, что «происходит следующим образом (рис.1). Изменения, вызываемые в плазматической мембране при взаимодействии рецепторов с экзогенными слабыми агонистами, при контакте мембран в процессе первичной агрегации и связи их с фибриногеном, в результате последующего начального повышения уровня свободного ионизированного 2+ цитоплазматического кальция (Са ) приводят к активации мембранной фосфолипазы А2 (PLA2). PLA2, в свою очередь, индуцирует цепь реакций простагландин-тромбоксановой системы, которая начинается с высвобождения из мембранных фосфолипидов арахидоно-вой кислоты и завершается образованием таких активных продуктов как лабильные простагландины (PGG2,PGH2) и особенно тромбоксан А2 (ТХА2). Последний является вазоконстриктором, ионофором и эндогенным агонистом агрегации.

Выделяясь из тромбоцитов и связываясь с рецепторами плазматической мембраны (как данной клетки, так и других кровяных пластинок, приносимых током крови), ТХА2 и PGG2 с PGH2 осуществляют первую положительную обратную связь, т.е. рекрутируют дополнительное количество фибриногеновых рецепторов, расширяют плацдарм агрегации и усиливают сигнал активации, передаваемый к внутренним эффекторным структурам клетки. При этом большое значение имеет способность ТХА2 активировать фосфолипазу С (PLC) и включать полифосфоинозитидный путь активации. ТХА2 является также ионофором и вызывает выделение в цитоплазму ионов Са2+ из плотной тубулярной системы (DTS), где они находятся в интактных кровяных пластинках. Повышение уровня Са2+ создает необходимые условия для всех Са2+-опосредованных ферментных реакций финальных стадий тромбоцитарного гемостаза. К этим реакциям прежде всего относится стимуляция тромбоцитарной актомиозиновой системы. Для последней, помимо повышения концентрации Са2+, необходима стимуляция процессов фосфорилирования белков этой системы, что также является результатом полифосфоинозитидного пути активации (рис.1). Этот путь начина-.ется со стимуляции фосфолипазы С (PLC) и завершается активацией протеинкиназы С (РКС) с образованием инозитолтрисфосфата (1Р3), способного, как и ТХА2, повышать уровень Са2+. PLC может быть стимулирована как в процессе первичной агрегации, так и прямо при взаимодействии сильных агонистов с их рецепторами в плазматической мембране. Необходимо отметить, что следующая обратная связь осуществляется именно через взаимодействие сильнейшего тромбоцитарного активатора - тромбина, который генерируется по внутреннему пути с участием фосфолипидов тромбоцитов. Фосфорилирование белков тромбоцитарной сократительной системы с участием активированной РКС, энергетическое обеспечение процесса и само сокращение актомиозина принципиально осуществляются теми же механизмами, что и в сократительной системе гладкомышечных клеток. Сокращение тромбоцитарного актомиозина имеет два важнейших последствия - благодаря этому процессу осуществляются секреторные реакции кровяных пластинок и происходит уплотнение тромбоцитарно-фибриновой пробки. Тромбоцитарные секреторные реакции имеют большое значение для завершения эффективного гемостаза. Сокращение актомиозина обеспечивает передвижение гранул хранения, контакт их мембран с мембранами открытой канальциевой системы (OCS) и плазматической, а также повышение внутриклеточного давления и выброс содержимого этих гранул в окружающую среду. Из 8 гранул (плотных телец) высвобождаются гемостатически активные субстанции, необходимые для усиления активации и агрегации тромбоцитов в зоне сосудистого повреждения. Через секрецию ADP, серотонина, адреналина после их связи с соответствующими мембранными рецепторами пластинок реализуется важнейшая вторая положительная обратная связь, которая вместе с первой, делает возможной развитие

вторичной агрегации при действии слабых агонистов. Из а гранул секретируется более 30 протеинов, которые играют большую роль не только в гемостатических реакциях, но и в других физиологических и патологических процессах организма. Такие белки этих гранул как фибриноген, фактор V, XIII, тромбоцитарный фактор 4 и др., принимают участие в процессах коагуляции; адгезивные протеины (фибриноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин, фибронектин, витронек-тин) в дальнейшем развитии процесса адгезии и укреплении фибрино-геновых связей агрегировавших тромбоцитов; фактор роста тромбоцитов (PDGF platelet derived growth factor) - в репарации поврежденных стенок сосудов, а в патологических условиях - в развитии атеросклероза. Из у гранул (лизосом) высвобождаются лизосомальные энзимы, принимающие участие в реканализации сосуда после завершения гемостаза. Итак, на основании изложенного понятно, почему рассмотренная фаза агрегации называется вторичной (в основе ее лежит более позднее высвобождение из тромбоцитов агрегирующих агентов) и необратимой (тромбоциты не могут отделяться от агрегата, поскольку они максимально сближены вследствие сокращения актомиозиновых структур, а фибриногеновые связи укреплены секретированными адгезивными протеинами). Фазу необратимой агрегации называют также фазой секреции и необратимой вторичной агрегации, т.к. секреторные реакции достигают в это время своей кульминации и являются основой развития этой фазы агрегации. О значении фазы секреции может, свидетельствовать нередко наблюдаемая и приводящая к кровоточивости недостаточность секреторного процесса, которая особенно часто бывает приобретенной, т.е. возникает в результате инфекционных, токсических, лекарственных, иммунных, радиационных воздействий. Среди тромбоцитопатий высвобождения выделяют два основных вида: функциональную тромбоцитопатию высвобождения при нарушении внутриклеточной передачи сигнала активации, чаще всего в простагландин-тромбоксановой системе, и структурную, связанную с неполноценностью гранул хранения - со снижением их числа и/или наполнения хранимыми в них субстанциями. Определение механизма нарушения секреции достаточно сложно, т.к. требует проведения тонких биохимических исследований. В клинических условиях факт нарушения тромбоцитарной секреции обычно устанавливают с помощью агрегометра на основании оценки характера агрегационных кривых с несколькими индукторами агрегации. О снижении или отсутствии секреции свидетельствует уменьшение или отсутствие второй волны агрегации с оптимальными средними дозами всех агрегирующих агентов и единственной волны агрегации с коллагеном, т.к. эти агрегационные феномены опосредованы секреторным процессом. Поскольку актомиозиновые филаменты пересекают всю цитоплазму тромбоцита и с внутренней стороны мембраны связаны с теми же трансмембранными гликопротеинами IIb-IIIa, с которыми с наружной стороны соединены межтромбоцитарные фибриногеновые (фибриновые)

мосты связи, то сокращение актомиозина в каждой кровяной пластинке, включенной в тромбоцитарно-фибриновую сеть, приводит к сокращению системы в целом, т.е. к уплотнению тромбоцитарных агрегатов и к ретракции тромбоцитарно-фибриновой пробки. Таким образом, завершается эффективный гемостатический процесс. Плазменно-коагуляционное звено гемостаза Внутренний и внешний пути свертывания крови Процесс свертывания крови важен для окончательного гемостаза, обеспечиваемого образованием вторичной гемостатической пробки. В этом процессе принимают участие плазменные белки, факторы свертывания крови, обозначаемые римскими цифрами (табл. 1). В ин-тактном сосуде факторы свертывания крови циркулируют в неактивной форме в виде проферментов сериновых протеаз. Повреждение сосудистой стенки вызывает цепь протеолитических процессов, в которых факторы свертывания трансформируются в свою активную форму (рис.2). Процесс свертывания крови представляют в виде каскадной реакции, которая начинается с первичного небольшого стимула и усиливается на каждой последующей стадии. В результате образуется большое количество конечного фермента, тромбина, который превращает фибриноген в фибрин. Фибрин стабилизирует первичную тромбоцитарную пробку и таким образом способствует окончательному гемостазу. Кроме этой ключевой функции, тромбин играет жизненно важную роль главного регуляторного фермента, регулирующего процесс свертывания крови с помощью ряда реакций положительной и отрицательной обратной связи. Существенно то, что в физиологических условиях тромбин генерируется быстро и только в месте повреждения сосудистой стенки. Принято считать, что субэндотелиальные субстанции, обнажившиеся в месте повреждения сосудистой стенки, взаимодействуют с циркулирующими коагуляционными факторами, начиная тем самым процесс активации свертывания через две взаимодействующие системы, известные под названием внешний и внутренний путь коагуляции. Как при внешнем, так и при внутреннем пути активация факторов свертывания крови происходит на фосфолипидных мембранах поврежденных клеток или активированных тромбоцитов, играющих роль матриц, где формируются протеазные комплексы. Помимо ускорения активации, формирование связанных с мембраной энзимных комплексов способствует регулированию процесса свертывания посредством защиты активированных протеаз от циркулирующих ингибиторов. В каждом из этих путей соответственно выделяют внешний и внутренний путь генерации Ха и общий путь коагуляции (см. ниже). При активации процесса свертывания крови по внешнему пути роль фосфолипидной матрицы выполняет тканевый фактор (тканевый тромбопластин), в состав которого входит апопротеин III и фосфолипид.

Тканевый тромбопластин высвобождается из поврежденных тканей, в том числе из стенки сосуда, в виде липопротеидных осколков клеточных мембран, то есть поступает в кровь извне, отсюда и название - внешний путь. При активации свертывания крови по внутреннему пути роль фосфолипидной матрицы выполняют фосфолипиды на наружной мембране активированных тромбоцитов. Последние являются составными частями крови, отсюда название - внутренний путь. Условно процесс свертывания крови можно разделить на три фазы: 1 - образование протромбиназы (активатора протромбина) - протеазного комплекса из активированных форм факторов Ха, Va, ионов кальция на поверхности фосфолипидов; 2 - образование тромбина 3 - образование нерастворимого фибрина. Отличительной особенностью первой фазы является участие различных факторов в образовании активной формы фактора X (Ха) при активации свертывания крови по внешнему или внутреннему пути. Оба пути замыкаются на факторе X и далее протекают одинаковым образом с неизменным набором факторов и обозначаются как общий путь свертывания крови (рис.2). Образование протромбиназы по внешнему пути запускается тканевым тромбопластином, на поверхности которого происходит трансформация неактивной формы фактора VII в активную (Vila). Далее активный комплекс, состоящий из тканевого тромбопластина и фактора Vila, при участии ионов кальция, активирует фактор X. Механизм активации фактора X па внутреннему пути представляет собой цепь последовательных реакций активации другой группы факторов, а именно факторов XII, XI, IX и VIII, и вызывается контактом крови с внутренними субэндотелиальными компонентами поврежденной сосудистой стенки. Начинается он с активации, так называемого, фактора контакта, фактора XII. Активированный фактор ХНа трансформирует пре-калликреин в калликреин, который по принципу положительной обратной связи еще больше усиливает активацию фактора XII. Фактор ХИа в присутствии высокомолекулярного кининогена (ВМК) активирует фактор XI. На этом заканчивается контактная фаза свертывания по внутреннему пути, которая в отличие от последующих не требует присутствия ионов кальция. Далее фактор Х1а на фосфолипидной поверхности активированных тромбоцитов в присутствии ионов кальция отщепляет пептид от фактора IX, образуя IXa. IXa вместе с фактором Villa и фосфолипидами образуют ферментный комплекс в присутствии ионов кальция. Этот комплекс, называемый теназой, превращает неактивную форму фактора X в активный Ха. Разделение на внешний и внутренний пути активации свертывания чисто условное, поскольку в организме оба процесса тесно взаимосвязаны, например, через активацию фактора IX активным фактором VII, а также посредством плазменного калликреина, который одновременно активирует

факторы XII и VII. Однако подобное разделение на внутренний и внешний пути активации значительно упрощает интерпретацию тестов, используемых для оценки состояния свертывания крови, в которых искусственно создаются условия для активации фактора X или по внутреннему, или по внешнему пути, что будет рассмотрено далее. Таблица 1 Фак Синоним тор

I II III V VII VIII IX X XI XII

Факторы свертывания крови Молеку Содержа Период Минималь Участие в лярная ние в полуный коагуляции по: масса плазме жизни в уровень, внутрен- внешн м кг/мл крови необходим нему ему ый для пути пути гемостаза 330.000 3000 4-5 дней 0,8 г/л + + 72.000 100 2-4дня 30% + + 220.000 0 7 ? +

Фибриноген Протромбин Тканевый тромбопластин Проакцелерин 330 000 Проконвертин 50.000 Антигемофиль 330.000 ный глобулин Фактор 56.000 Кристмаса Фактор 58.000 СтюартаПрауэра РТА-фактор 160.000 Фактор 80.000 Хагемана, фактор контакта

XIII Фибрин-стаби- 320.000 лизирующий фактор

10 0,5 0,1

24-34ч 2-4ч 12-184

10-15% 10% 20 - 35%

+ +

+ + -

5

20 -30 ч

20 - 30%

+

-

8

48 -56 ч

10-20%

+

+

5 30

60ч ? 50-70 ч снижение уровня кровоточи вость не вызывает Около 3 -5% 4-5 дней

+ +

-

+

+

10

Активированная форма фактора X вместе с фактором Va (акцелератором процесса), фосфолипидами в присутствии ионов кальция образует ферментный комплекс - протромбиназу. Под влиянием протромбиназы от протромбина отщепляются фрагменты 1+2 (F1+2), уровень которых определяет количество образовавшегося тромбина). После этого одноцепочная молекула протромбина трансформируется в мейзотромбин, а затем в двухцепочный активный фермент тромбин (фактор На). Далее под

действием тромбина происходит превращение фибриногена в фибрин.

Рис.2. Плазменно-коагуляционный гемостаз Процесс образования фибрина, в свою очередь, можно разделить на три стадии. В первую, протеолитическую, стадию тромбин отщепляет от молекулы фибриногена фибринопептиды А от а(А) и фибринопептиды В от р(В)-цепей, оставляя соответственно а- и бета-цепи, входящие в состав образующегося фибрин-мономера. Повышение в плазме фибрино-пептидов А и В свидетельствует об активации свертывающей системы крови и служит маркером тромбинемии. В следующую, полимеризационную, стадию мономерные молекулы соединяются друг с другом бок в бок и конец в конец, вначале образуя димеры, затем тетрамеры и более крупные олигомеры, которые по мере дальнейшего укрупнения трансформируются в волокна фибрина, (растворимый фибрин), который может быть растворен в 5М растворе мочевины. Полимеризация фибрин-мономеров происходит с постоянной скоростью. В условиях тромбинемии, когда образуется большее, чем в норме количество фибрин-мономеров, последние образуют комплексы, в том числе с фибриногеном, фибринопептидами А и В и ранними продуктами деградации фибрина (ПДФ), так называемые растворимые фибрин-мономерные комплексы, которые легко взаимодействуют с 50% этанолом и раствором бета-нафтола в 50% спирте и выпадают в осадок. Этот феномен обозначается как феномен паракоагуляции и используется для диагностики тромбинемии. В последнюю, стабилизационную, стадию фибриновая сеть стабилизируется ковалентными связями под действием фермента -фибринстабилизирующего фактора, фактора XIII, благодаря чему фибрин становится нерастворимым. Активация фактора XIII осуществляется тромбином в присутствии ионов Са.

Снижение уровня факторов свертывания (изолированный дефект при врожденных коагулопатиях или множественный при приобретенных коагулопатиях, например, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови) приводит к выключению, нарушению, соответствующих ступеней коагуляционного каскада. В результате нарушается образование вторичной гемостатической пробки, что клинически проявляется у больных повышенной склонностью к кровотечениям по коагуляционному типу (см. раздел алгоритм диагностики). Исключение составляет лишь дефицит фактора Хагемана (фактора XII), который характеризуется исключительно лабораторными нарушениями - удлинением времени свертывания крови и других тестов, характеризующих внутренний путь свертывания крови. При этом клинически у людей с этим дефектом никогда не бывает геморрагических проявлений, в силу чего данное состояние получило название «гемофилия-без гемофилии». Физиологические антикоагулянты и регуляция свертывания крови Установлено, что при свертывании 1 мл крови образуется тромбин в количестве, достаточном для коагуляции всего фибриногена в 3 литрах крови. Этого фатального эффекта в организме не происходит, благодаря действию определенных противосвертывающих систем, в которые входят клеточные и гуморальные компоненты. К клеточным компонентам, обеспечивающим поддержание крови в'жидком состоянии в циркуляции, прежде всего, относятся клетки РЭС и гепатоциты, которые специфически удаляют активированные факторы свертывания крови и фибриноген без какого либо влияния на их предшественники. Гуморальный компонент состоит из физиологических антикоагулянтов, которые тем или иным путем инактивируют (ингибируют) активные факторы свертывания крови (табл.2). Среди них наиболее значимыми для практики являются антитромбин III, протеины С и S. Антитромбин III инактивирует серино-вые протеазы, а именно, тромбин и все предшествующие его образованию активные факторы (за исключением факторов ViIIa и Va), путем образования с ними неактивных комплексов. Инактивация факторов Villa и Va - сильнейших катализаторов образования тромбина, осуществляется другими белками, так называемой системой протеинов С и S, которая активируется комплексом, образующимся при взаимодействии тромбина с тромбомодулином (специфическим рецептором сосудистой стенки). Активированный этим комплексом плазменный протеин С в присутствии своего кофактора протеина S протеолитически расщепляет факторы Villa и Va и таким образом прерывается реакция образования активного фактора X и тромбина. Указанные антикоагулянты синтезируются в печени. Но в отличие от антитромбина III, синтез протеинов С и S зависит от витамина К. При лечении непрямыми антикоагулянтами в первую очередь происходит снижение уровней протеинов С и S. И, если в исходном состоянии у больного имелся дефицит этих антикоагулянтов, то на фоне терапии имеющийся дефект

антикоагулянтов усугубляется. В результате у таких больных могут развиться рецидивирующие тромбозы. Снижение уровня естественных антикоагулянтов, как правило, сопровождает венозные тромбозы и может быть как следствием генетических нарушений (врожденные тромбофилии), так и результатом их потребления, например, во время диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Таблица 2 Основные физиологические антикоагулянты (Баркаган З.С., Введение в клиническую гемостазиологию, Из-во «Ньюдиамед-АО» Москва 1998) Наименование Механизмы действия антикоагулянта Антитромбин III Прогрессивно действующий ингибитор тромбина, (AT III) фактора X и в меньшей степени других ферментных факторов свертывания, плазменный кофактор гепарина Гепарин Сульфатированный полисахарид, образующий комплексы с AT III, переводящий последний в быстродействующий антикоагулянт Кофактор Слабый антикоагулянт, действие которого выявляется в гепарина II присутствии гепарина после удаления из плазмы AT III Протеин С

Витамин К-зависимая серинамидаза, инактиви-рующая факторы Villa и Va; эндогенный активатор плазминогена. Активируется комплексом «тромбомодулин-тромбин» Витамин К-зависимый кофактор протеина С

Протеин S

Ингибитор Ингибитор комплекса «тканевый фактор-фактор Vila тканевого пути фактор Ха - Са++ свертывания (TFPI) Антитромбопласт Ингибиторы комплекса факторов III-ViIa ины а.2 - Слабый ингибитор тромбина, плазмина, калликреина макроглобулин си. антитрипсин I Ингибитор тромбина, факторов IXa, XIa, XIIa, плазмина Ингибитор комплемента (Анти-СI)

Тоже I

Наряду с компонентами, проявляющими ингибиторное действие, гуморальная система включает также и фибринолитический механизм, направленный на растворение фибринового сгустка (фибринолиз). Активным ферментом фибринолиза является плазмин, который образуется из плазминогена, неактивного предшественника, циркулирующего в плазме крови.

Аналогично системе свертывания различают два пути активации плазминогена с образованием плазмина: внешний и внутренний. Активация по внешнему пути осуществляется за счет тканевого активатора плазминогена (t-PA), который синтезируется в клетках эндотелия, выстилающего сосуды. Секреция t-PA из клеток эндотелия происходит постоянно и усиливается при действии разных стимулов: тромбина, ряда гормонов и лекарственных препаратов (адреналина, вазопрессина и его аналогов, никотиновой кислоты и др.), физической нагрузки, стресса, шока, тканевой гипоксии, хирургической травмы и др. Плазминоген и t-PA -оба обладают выраженным сродством к фибрину. При появлении фибрина плазминоген и его активатор связываются с ним с образованием тройного комплекса (фибрин, плазминоген, t-PA), все составляющие которого расположены так, что происходит эффективная активация плазминогена. Таким образом, плазмин образуется прямо на поверхности фибрина, который далее подвергается протеолитической деградации. Пусковым механизмом активации фибринолиза по внутреннему пути является, как и в системе коагуляции, контакт с чужеродной поверхностью, в результате которого образуется фактор ХИа и калликреин. И фактор XIla, и калликреин активируют плазминоген с образованием плазмина. Калликреин, в свою очередь, активирует фактор XII, а появившийся плазмин переводит в активное состояние и фактор XII, и прекалликреин, что приводит к значительному усилению первоначальной реакции. Таким образом, происходит одновременная активация системы свертывания и фибринолиза, что способствует поддержанию необходимого баланса между коагуляцией и лизисом фибрина. Кроме этого активация плазминогена может происходить за счет активатора урокиназного типа (и-РА), который, в отличие от тканевого активатора, не имеет сродства к фибрину, но связывается со специфичными рецепторами на поверхности различных клеток, имеющих также рецепторы для плазминогена. Таким образом, образование плазмина происходит на поверхности клеток, в частности, эндотелия и ряда форменных элементов крови, непосредственно участвующих в образовании тромба. Плазмин - активный фермент, который приводит к протеолизу не только фибрина, но и фибриногена, факторов свертывания V, VIII и целого ряда других белков плазмы. Контролируют действие плазмина несколько ингибиторов, основным из которых является быстродействующий а2антиплазмин, синтезируемый в печени. Он образует неактивный комплекс со свободным плазмином, попавшим в циркуляцию. Поэтому в плазме в физиологических условиях свободный плазмин практически не обнаруживается. Плазмин, образованный на фибрине или на поверхности клеток защищен от действия ингибитора. Ингибиция фибринолиза осуществляется также на уровне активаторов плазминогена. Наиболее физиологически значимым является ингибитор активатора плазминогена эндотелиального типа (PAI-1). Он инактивирует как тканевой, так и урокиназный типы активаторов, синтезируется в клетках сосудистого эндотелия,

обнаружен также в тромбоцитах, моноцитах и многих других клетках. Секреция усиливается при действии тканевого активатора плазминогена, тромбина, цитокинов, медиирующих воспаление, бактериальных эндотоксинов и др. Повышенное содержание этого ингибитора сопровождает венозные тромбозы, отмечается при инфарктах миокарда, ряде других состояний, связанных с тромботическими проявлениями, что позволяет считать РАМ важной составляющей в регуляции баланса между коагуляцией и фибринолизом. При действии плазмина на фибрин и фибриноген образуются продукты деградации фибрина (ПДФн) или фибриногена (ПДФг), соответственно. Различают ранние и поздние ПДФ. Ранние ПДФ образуются на первых этапах протеолиза и отличаются более высоким молекулярным весом. Дальнейшая их деградация плазмином приводит к образованию поздних ПДФ с меньшим молекулярным весом, устойчивых к протеолизу. В случае деградации фибриногена ранние ПДФг обозначают как фрагменты X и Y, поздние - фрагменты D и Е. При деградации фибрина образуются значительно более сложные комплексы фрагментов, отличительной особенностью которых является наличие так называемых D-димеров участков молекул фибриногена, связанных прочной ковалент-ной связью в процессе образования нерастворимого фибрина, которая не разрушается под действием плазмина. D-димеры и D-фрагменты можно дифференцировать с помощью иммунологических методов, что и лежит в основе определения наличия ПДФн или ПДФг, образующихся при различных патологических состояниях. ПДФ оказывают определенное действие на все звенья гемостаза сосудистое, тромбоцитарное и коагуляционное. Мелкие пептиды, высвобождаемые в начале процесса расщепления, обладают вазоактивным действием. Они вызывают нарушение микроциркуляции, транскапиллярного обмена, увеличивают проницаемость сосудов, что приводит к выходу форменных элементов крови и белков плазмы за пределы сосудов. Кроме того, ранние ПДФ ингибируют полимеризацию фибрин-мономеров, вступая во взаимодействие с ними, благодаря чему нарушается образование фибрина. ПДФ обладают также выраженным антитромбиновым действием. Поздние ПДФ блокируют рецепторы мембраны тромбоцитов, вызывая их дисфункцию. Обнаружение повышенного уровня ПДФ всегда свидетельствует о наличии плазминемии, т.е. об активации фибринолиза. Таким образом, реакции фибринолиза, обусловленные взаимодействием различных активаторов и ингибиторов, находятся в тесной взаимосвязи с реакциями гемостаза и направлены на деградацию фибрина с целью поддержания равновесия между его образованием и лизисом для сохранения целостности и проходимости сосудов. Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что любое повреждение целостности сосудистой стенки,является мощным стимулом для активации системы гемостаза. Однако, благодаря приспособительным реакциям человеческого организма в нормальных условиях будет достигнуто

полное равновесие, которое позволит остановить кровотечение и при этом не разовьется состояние гиперкоагуляции. Несомненно, что нарушение равновесия, вследствие поломки в том или ином звене гемокоагуляции, может привести либо к развитию гиперкоагуляции, либо к гипокоагуляции. Роль эндотелия в тромбогенности и тромборезистентности сосудов Все вещества, секретируемые эндотелием и участвующие в гемостазе и тромбозе, можно, в известной степени условно, разделить на две группы тромбогенные и атромбогенные (рис.3). К веществам, индуцирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов, относятся фактор Вил-лебранда (vWF), фактор активации тромбоцитов (PAF), аденозин ди-фосфорная кислота (ADP), тромбоксан А2 (ТХА2). Адгезия тромбоцитов к эндотелию и субэндотелиальному матриксу - начальный этап гемостаза и тромбоза. В норме адгезии тромбоцитов к неповрежденному эндотелию не происходит, а в условиях патологии адгезия ограничивается как правило зоной прилежащей к области повреждения сосудистой стенки. Это связано с образованием эндотелиальными клетками простациклина, оксида азота (NO), экто-АОР-азы и других факторов, ингибирующих адгезию и агрегацию тромбоцитов.

Рис.3. Тромборегуляторы, образующиеся в сосудистой стенке Адгезия и агрегация тромбоцитов приводит к образованию тромбоцитарного тромба, который в нормальных условиях прочно связан с сосудистой стенкой. Этот этап гемостаза связан с активацией плазменных прокоагулянтов и образованием тромбина - ключевого фермента системы свертывания крови, под влиянием которого фибриноген превращается в фибрин. В эндотелии при определенных условиях образуется тканевый фактор (ТФ), инициирующий внешний (быстрый!) путь свертывания крови. Ингибиторы тромбиногенеза (ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогликаны и др.) предотвращают избыточное фибринобразование на луминальной поверхности сосудов при повреждении сосудистой стенки, а также (вместе с плазменными ингибиторами тромбиногенеза) драматическое

внутрисосудистое„свертывание крови. И, наконец, в эндотелии образуются активаторы и ингибиторы фибринолиза, процесса имеющего большое значение в «судьбе» тромба. При всем разнообразии в строении и механизмах действия тромбогенных и атромбогенных факторов есть общие закономерности в их образовании и участии в гемостазе и тромбозе. Многие из этих факторов, образующихся в эндотелии, выполняют функцию тромборегуляторов. Различают ранние и поздние тромборегуляторы. Тромборегуляторы не являются веществами строго специфичными с точки зрения их образования и действия; они оказывают влияние не только на гемостаз, но и на другие процессы: проницаемость, вазомоторные реакции (простациклин, NO, TXA2), ангиогенез, клеточную пролиферацию (тканевой активатор плазминогена) и т.д. Источниками тромборегуляторов при определенных условиях могут быть лейкоциты, макрофаги, клетки опухолей и другие клетки. Эндотелиальные клетки сосудов различных органов и тканей гетерогенны не только в плане структуры, но и секреции тромборегуляторов. Так, образование vWF в сосудах разных областей существенно различается: в легких, сердце, скелетных мышцах выявлен высокий уровень т-РНК vWF, а в почках и печени - низкий. Экспрессия t-PA ограничена in vivo приблизительно 3% васкулярного эндотелия, в эндотелии вен меньше образуется простациклина, чем в эндотелии артерий и т.д. На луминальной поверхности эндотелия имеются рецепторы ко многим биологически активным веществам циркулирующим в крови, а также к тромборегуляторам. Через взаимодействие их с рецепторами эндотелия осуществляется пара- и аутокринная регуляция их образования и секреции. Кроме того, на поверхности эндотелия имеются места связывания плазменных прокоагулянтов, антикоагулянтов и других плазменных белков. Тромборегуляторы эндотелиального происхождения, имеющие сравнительно большой период биологического полураспада, оказывают не только локальное, но и системное действие на клетки крови и кровеносные сосуды. Это относится прежде всего к тканевому фактору, простацикпину, тканевому активатору плазминогена и егомнгибитору. Вещества, секретируемые эндотелием, оказывают как прямое влияние на гемостаз (vWF, тромбомодулин и др.), так и опосредованное (эндотелии 1, супероксидный анион и др.) В регуляции гемостатической функции эндотелия большое значение имеют гормоны, цитокины, гемодинамические факторы. В физиологических условиях образование атромбогенных веществ в эндотелии преобладает над образованием тромбогеных, что обеспечивает сохранение жидкого состояния крови при повреждениях сосудистой стенки, в том числе незначительных, случайных, которые могут иметь место в норме. Секреция атромбогенных веществ определяет тромборе-зистентность кровеносных сосудов.

Эндотелий, адгезия и агрегация тромбоцитов В эволюционном плане наиболее древним механизмом гемостаза является адгезия клеток, содержащихся в гемолимфе и крови, к эндотелию. У беспозвоночных эту функцию выполняют блуждающие клетки – амебоциты, а у позвоночных, начиная с круглоротых - тромбоциты. Образование гемостатической пробки как уже отмечалось начинается с контакта тромбоцитов с тромбогенной поверхностью (адгезия); последующий рост гемостатической пробки (тромба) зависит от взаимодействия тромбоцитов друг с другом (агрегация). На поверхности тромбоцитов имеются рецепторы адгезии, относящиеся к семейству интегринов класса бета3 и бета1 и взаимодействующие с адгезивными экстрацеллюлярными белками (фибронектин, коллаген, фибриноген, тромбоспондин, ламинин, фактор Виллебранда и др.). vWF, который опосредует начальный контакт тромбоцитов с субэндотелием, синтезируется в эндотелии и мегакариоцитах; vWF секретируется в плазму и субэндотелий, а также депонируется в тельцах Weibel-Palade в эндотелиоцитах. Ген vWF локализован в 12-й хромосоме. При повреждении сосудистой стенки, вышедший из эндо-телиоцитов vWF связывается с субэндотелиальным матриксом (1-й этап), подвергается конформационным изменениям (2-й этап) и связывается с рецептором (GP Ib) тромбоцитов (3-й этап). Это связывание, которое является началом адгезии тромбоцитов, приводит к увеличению входа Са2+ и экспрессии рецепторов GP llb/llla, vWF взаимодействует с этими рецепторами; этот этап завершается распространенной, необратимой адгезией и агрегацией тромбоцитов. Особо следует отметить значение гемодинамических факторов для адгезии тромбоцитов с участием vWF. Адгезия тромбоцитов, опосредованная vWF, происходит наиболее интенсивно при высоких скоростях сдвига, т.е. в артериях. При многих заболеваниях, сопровождающихся острым и хроническим повреждением эндотелия (сахарный диабет, атеросклероз, опухоли различной локализации, гестоз и т.д.) уровень vWF в крови значительно повышается, что рассматривается как показатель дисфункции эндотелия. Увеличение синтеза и секреции vWF наблюдается под влиянием адреналина,вазопрессина. К факторам, стимулирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов и образующимся в эндотелии, относятся также фактор активации тромбоцитов (PAF), ADP, ТХА2. Фактор активации тромбоцитов, образующийся в эндотелии, взаимодействует с соответствующими рецепторами тромбоцитов, вызывает экспрессию рецепторов GP IIb/ IIIa с последующей активацией адгезии и агрегации. Кроме того, PAF проявляет вазомоторную активность, является медиатором воспаления. Аденозиндифосфорная кислота (ADP), выделяющаяся из поврежденных эндотелиоцитов и других клеток, ковалентно связывается с рецепторами тромбоцитов. Под влиянием ADP увеличивается концентрация

внутриклеточного Са2+, что и лежит в основе его индуцирующего агрегацию действия. Тромбоксан А2 - продукт метаболизма арахидоновой кислоты. Взаимодействуя с рецепторами тромбоцитов в конечном счете вызывает увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, их активацию и агрегацию. В отличии от простациклина ТХА2 имеет очень короткий период биологического полураспада, поэтому его эффект в основном местный. Как и PAF тромбоксан А2 оказывает вазоконстрикторное действие. К факторам, игибирующим адгезию тромбоцитов и их агрегацию относятся простациклин, оксид азота, экто-АОР-аза. Простациклин (PGI2) - продукт метаболизма арахидоновой кислоты. Синтез PGI2 в эндотелии происходит постоянно, но он не депонируется, а секретируется через луминальную поверхность в кровь. В отличие от других простагландинов PGI2 не разрушается полностью, проходя через легкие, и поэтому в случае локального увеличения его синтеза могут наблюдаться системные эффекты. Простациклин как тромборегулятор ингибирует адгезию и агрегацию тромбоцитов, активируя систему аденилатциклаза - цАМФ. Кроме этого PGI2 оказывает вазодилататорное действие, потенцирует эффекты гистамина, кининов. Увеличение продукции PGI2 наблюдается при повреждении эндотелия, гипоксии, под влиянием вазоактивных веществ (адреналин, гистамин, брадикинин, ан-гиотензин 2, эндотелии 1), цитокинов, тромбина, гемодинамических факторов. Оксид азота (NO), постоянно образуется и выделяется из эндотелия. Синтез NO определяется активностью эндотелиальной NO-синтетазы. Ацетилхолин, гистамин, эндотелии 1, ангиотензин 2, брадикинин, вазопрессин, эстрогены, тромбин усиливают синтез NO. Базальный уровень синтеза и секреции NO определяется напряжением сдвига, то есть зависит от скорости кровотока и вязкости крови. Продукты, выделяющиеся из тромбоцитов при их агрегации (ADP, серотонин), являются стимуляторами синтеза NO. Быстрое увеличение синтеза и выделения оксида азота наблюдается при активации эндотелия, сопровождающимся повышением концентрации внутриклеточного Са2+. Оксид азота, диффундирующий через луминальную поверхность эндотелиоцитов, препятствует адгезии и агрегации тромбоцитов через активацию системы гуанилатциклаза - ц-ГМФ. Период биологического полураспада NO меньше 1 секунды, он быстро инактивируется, связываясь с оксигемоглобином и особенно О2—, поэтому его биологические эффекты локальны. Однако в крови NO образует S-нитрозотиоловые и металлнитрозиловые комплексы циркулирующие в крови. По-видимому, при определенных условиях освобождающийся из этих соединений NO может оказывать системное действие. Экто-АОР-аза - представитель эндотелиальных экто-аденозиновых фосфатаз. Значение этого фермента в гемостазе заключается в том, что он расщепляет ADP, являющийся индуктором агрегации, до аденозина, который, напротив, ингибирует агрегацию и является к тому же вазоди-

лататором. Расмотренные эндотелиальные тромборегуляторы (vWF, PAF, ADP, ТХА2, PGI2, NO) влияют на тромбообразование на раннем этапе, еще до образования тромбина и поэтому их относят к группе ранних тромборегуляторов. Прокоагулянтная и антикоагулянтная активность эндотелия В норме на поверхности эндотелия не происходит свертывание крови (во всяком случае, бесспорных данных о непрерывном процессе фибринообразования нет). Трансформация поверхности эндотелия из антикоагулянтной в прокоагулянтную индуцируется тканевым фактором (ТФ), который активирует ф.\Л1, ускоряет активацию фактора X и таким образом запускается «внешний» путь свертывания крови. На поверхности эндотелия, как уже отмечалось ранее, имеются места связывания с плазменными прокоагулянтами. В норме в неповрежденном эндотелии ТФ не образуется. При повреждении сосудов, а также при гипоксии, действии цитокинов, эндотоксина, напряжении сдвига, под влиянием окисленных липопротеидов и других факторов происходит экспрессия синтеза ТФ. Через луминальную поверхность эндотелиоцитов ТФ секретируется и связывается с поверхностью эндотелия, а также циркулирует в крови. Источником ТФ в случае его увеличения в крови могут быть не только эндотелиоциты, но и другие клетки. Активация «внешнего пути» завершается образованием тромбина, на образование которого и активность влияют атромбогенные факторы, секретируемые эндотелием: ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогли-каны и др. Ингибитор тканевого пути свертывания (TFPI) синтезируется различными клетками, но основным его^источником является эндотелий. На поверхности эндотелиоцитов он связан с протеогликанами и мобилизуется под влиянием гепарина. TFPI связывается с ф.Ха внутри комплекса ТФА/Иа/Ха и ингибирует начальный этап гемокоагуляции - образование протромбиназы. Наряду с тромбомодулином, протеинами С, S, антитромбином и гепарином TFPI относится к естественным антикоагулянтам. Матрикс, окружающий эндотелий, содержит гепаран-сульфат, дерматан-сульфат и другие гликозаминогликаны, которые повышают активность связанного с клеткой /матриксом антитромбина III (ATIII) и гепаринкофактора II, тем самым ограничивая тромбиногенез. Тромбомодулин - гликопротеин в составе мембраны эндотелия, образует комплексное соединение с тромбином. Продукт взаимодействия превращает протеин С в активную форму, которая разрушает фА/Ша и ф-Va и тем самым ингибирует образование тромбина. Активность активированного протеина С увеличивается его кофактором протеином S, который образуется в эндотелии и в других клетках. В эндотелиоцитах также экспрессируются рецепторы для активированного протеина С.

Таким образом система тромбомодулин-протеин С выполняет антикоагулянтную функцию. Более того, модифицированный при взаимодействии с тромбомодулином, тромбин теряет способность превращать фибриноген в фибрин и вызывать агрегацию тромбоцитов. При повреждении сосудистой стенки тромбомодулин «отделяется» от эндотелия и поступает в кровь. Увеличение его в крови наблюдается у больных с претромботическими состояниями, васкулитами и т.д. Степень увеличения тромбомодулина в крови имеет диагностическое и прогностическое значение. Эндотелий и фибринолиз В эндотелии образуется и секретируется тканевой активатор плазминогена (t-PA) и его ингибитор - PAI-I (plasminogen activator inhibitor -I). t-PA, подобно vWF, секретируется постоянно, но «выброс» его из эндотелиоцитов может резко увеличиваться в определенных ситуациях (физическая нагрузка, катехоламинемия, венозная окклюзия и т.п.). PAI-I также постоянно продуцируется и секретируется эндотелиоцитами, причем находится в клетке в большом избытке по отношению к t-PA. В крови и субклеточном матриксе PAI-I связан с адгезивным гликопротеидом витронектином. В этом комплексе период биологического полураспада PAI-I увеличивается в 2-4 раза. Благодаря этому возможна концентрация PAI-I в определенном регионе и локальное угнетение фибринолиза. Ли-попротеиды очень низкой плотности, окисленные липопротеиды стимулируют продукцию РАМ. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ФИО) и эндотелии подавляют фибринолитическую активность главным образом за счет увеличения синтеза и секреции РАМ. При воспалении, ишемической болезни сердца, идиопатическом тромбозе глубоких вен и многих других патологических процессах и заболеваниях содержание РАМ в крови увеличено. На поверхности эндотелиальных клеток имеются рецепторы к плазминогену и t-PA, что благоприятствует местной активации фибринолиза. Липопротеид (а) блокирует рецептор плазминогена и тем самым снижает фибринолитический потенциал. Из эндотелиальных клеток выделен белок с М 40000 (аннексии II), который взаимодействуя с t-PA, увеличивает его способность активировать плазминоген. t-PA, связанный с поверхностью эндотелиоцитов, «защищен» от действия его фибринолитического ингибитора PAI-I. Протеолитическая система плазминоген- t-PA-PAI-1 имеет значение не только для фибринолиза, но и вовлекается во многие другие физиологические и патологические процессы: ангиогенез, овуляция, болезни соединительной ткани, сепсис, опухолевый рост, тромболитические и геморрагические расстройства и т.д. Нарушение участия эндотелия в регуляции фибринолиза является важным звеном в патогенезе многих заболеваний, в том числе атеросклероза, и оказывает существенное влияние на динамику тромбоза.

Гемодинамические факторы и секреция тромборегуляторов Эндотелиальные клетки постоянно испытывают воздействие гемодинамических факторов: силы трения (пристеночное напряжение сдвига), трансмуральное давление, напряжение и изгибы в связи с пульсацией. Имеются убедительные доказательства влияния гемодинамических факторов на тромбогенные свойства и тромборезистентность сосудов. Так, известно, что в зонах высокого давления выше тромбопластиновая и антиагрегантная активность сосудов, при перемещении фрагмента вен протеидов и других факторов происходит экспрессия синтеза ТФ. Через луминальную поверхность эндотелиоцитов ТФ секретируется и связывается с поверхностью эндотелия, а также циркулирует в крови. Источником ТФ в случае его увеличения в крови могут быть не только эндоте-лиоциты, но и другие клетки. Активация «внешнего пути» завершается образованием тромбина, на образование которого и активность влияют атромбогенные факторы, секретируемые эндотелием: ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогли-каны и др. Ингибитор тканевого пути свертывания (TFPI) синтезируется различными клетками, но основным его^источником является эндотелий. На поверхности эндотелиоцитов он связан с протеогликанами и мобилизуется под влиянием гепарина. TFPI связывается с ф.Ха внутри комплекса ТФ/Vlla/Xa и ингибирует начальный этап гемокоагуляции - образование протромбиназы. Наряду с тромбомодулином, протеинами С, S, антитромбином и гепарином TFPI относится к естественным антикоагулянтам. Матрикс, окружающий эндотелий, содержит гепаран-сульфат, дерматан-сульфат и другие гликозаминогликаны, которые повышают активность связанного с клеткой /матриксом антитромбина III (ATIII) и гепаринкофактора II, тем самым ограничивая тромбиногенез. Тромбомодулин - гликопротеин в составе мембраны эндотелия, образует комплексное соединение с тромбином. Продукт взаимодействия превращает протеин С в активную форму, которая разрушает ф.УШа и ф-Va и тем самым ингибирует образование тромбина. Активность активированного протеина С увеличивается его кофактором протеином S, который образуется в эндотелии и в других клетках. В эндотелиоцитах также экспрессируются рецепторы для активированного протеина С. Таким образом система тромбомодулин-протеин С выполняет антикоагулянтную функцию. Более того, модифицированный при взаимодействии с тромбомодулином, тромбин теряет способность превращать фибриноген в фибрин и вызывать агрегацию тромбоцитов. При повреждении сосудистой стенки тромбомодулин «отделяется» от эндотелия и поступает в кровь. Увеличение его в крови наблюдается у больных с претромботическими состояниями, васкулитами и т.д. Степень увеличения тромбомодулина в крови имеет диагностическое и прогностическое значение.

Эндотелий и фибринолиз В эндотелии образуется и секретируется тканевой активатор плазминогена (t-PA) и его ингибитор - PAI-I (plasminogen activator inhibitor -I). t-PA, подобно vWF, секретируется постоянно, но «выброс» его из эндотелиоцитов может резко увеличиваться в определенных ситуациях (физическая нагрузка, катехоламинемия, венозная окклюзия и т.п.). PAI-I также постоянно продуцируется и секретируется эндотелиоцитами, причем находится в клетке в большом избытке по отношению к t-PA. В крови и субклеточном матриксе PAI-I связан с адгезивным гликопротеидом витронектином. В этом комплексе период биологического полураспада PAI-I увеличивается в 2-4 раза. Благодаря этому возможна концентрация PAI-I в определенном регионе и локальное угнетение фибринолиза. Ли-попротеиды очень низкой плотности, окисленные липопротеиды стимулируют продукцию РАН. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ФИО) и эндотелии подавляют фибринолитическую активность главным образом за счет увеличения синтеза и секреции РАН. При воспалении, ишемической болезни сердца, идиопатическом тромбозе глубоких вен и многих других патологических процессах и заболеваниях содержание РАН в крови увеличено. На поверхности эндотелиальных клеток имеются рецепторы к плазминогену и t-PA, что благоприятствует местной активации фибринолиза. Липопротеид (а) блокирует рецептор плазминогена и тем самым снижает фибринолитический потенциал. Из эндотелиальных клеток выделен белок с М 40000 (аннексии II), который взаимодействуя с t-PA, увеличивает его способность активировать плазминоген. t-PA, связанный с поверхностью эндотелиоцитов, «защищен» от действия его фибринолитического ингибитора РАН. Протеолитическая система плазминоген- t-PA-PAI-1 имеет значение не только для фибринолиза, но и вовлекается во многие другие физиологические и патологические процессы: ангиогенез, овуляция, болезни соединительной ткани, сепсис, опухолевый рост, тромболитические и геморрагические расстройства и т.д. Нарушение участия эндотелия в регуляции фибринолиза является важным звеном в патогенезе многих заболеваний, в том числе атеросклероза, и оказывает существенное влияние на динамику тромбоза. Гемодинамические факторы и секреция тромборегуляторов Эндотелиальные клетки постоянно испытывают воздействие гемодинамических факторов: силы трения (пристеночное напряжение сдвига), трансмуральное давление, напряжение и изгибы в связи с пульсацией. Имеются убедительные доказательства влияния гемодинамических факторов на тромбогенные свойства и тромборезистентность сосудов. Так, известно, что в зонах высокого давления выше тромбопластиновая и антиагрегантная активность сосудов, при перемещении фрагмента вен в артерию продукция t-

PA и PGI2 увеличивалась, скорость тока крови в венулах влияет на размеры тромба и т.д. Наибольшее значение придается напряжению сдвига, который зависит от скорости кровотока и вязкости. Градиент сдвига, больше чем сама по себе его величина, влияет на реакции эндотелия; в регионах с высоким и низким напряжением сдвига градиент сдвига может быть одинаковым. Каким образом под влиянием гемодинамических факторов может изменяться синтез и секреция тромбогенных и тромборезистентных веществ? В настоящее время сформировалось представление о наличии в эндотелии чувствительных «механосенворов». Они могут быть расположены на поверхности эндотелиоцита, в цитоскелете, в местах адгезии или межклеточных соединений. При увеличении напряжения сдвига развиваются быстрые (< 1 мин) реакции (выделение NO, PGI2) и медленные (1-6 часов) реакции (увеличение образования NO-синтазы, t-PA, ТФ, тромбомодулина и других факторов). В механизме быстрых реакций большое значение имеют активация калиевых каналов (в течение миллисекунд), гиперполяризация мембраны эндотелиоцита, увеличение инозитолтрифосфата, диацилглице-рола, 2+ изменение Са , активация G-белков. Медленные реакции являются генопосредованными и отражают увеличение синтеза тромборегуляторов. В реальных условиях кровотока эндотелий одновременно испытывает воздействие гемодинамических и других факторов, которые модулируют эффекты друг друга. Так, например, под влиянием ИЛ-1 и ФИО в эндотелии вен и артерий происходит экспрессия ТФ, но при больших скоростях сдвига (т.е. только в артериях) одновременно усиливается продукция ингибитора ТФ и тромбомодулина. Следовательно, при одном и том же воздействии вероятность тромбоза вен значительно больше. При сдвиговом напряжении 15-20 дин/см2 секреция t-PA увеличивается, a PAI-1 - не изменяется. Повышение скорости сдвига (особенно в стенозированных сосудах) ведет к увеличению продукции NO и PGI2; при уменьшении скорости сдвига (застойные явления в венозном русле) уменьшается секреция эндотелина. Гемодинамические факторы при определенных условиях могут нарушать структуру и функцию эндотелия, т.е. действовать как патогенетические факторы, приводящие в конечном счете к нарушению баланса между тромбогенностью и тромборезистентностью, увеличению проницаемости эндотелия для макромолекул, аккумуляции липопротеидов, адгезии тромбоцитов, лейкоцитов и т.д. Таким образом, образование и выделение тромбогенных и атромбогенных веществ эндотелием - нормальный, постоянно протекающий во всех сосудах процесс. Однако в их количестве и соотношении имеются существенные различия как региональные, так и в различных отделах сосудистой системы в пределах одного региона. Различие гидродинамических характеристик в сосудах разной принадлежности, калибра и локализации определяет в значительной степени уровень их тромбогенности и тромборезистентности. Увеличение продукции и выделения тромбогенных

веществ - неспецифическая реакция на повреждение и активацию прежде всего эндотелия. При некоторых патологических процессах эта реакция сопровождается депрессией атромбогенных механизмов. Согласно общепринятой точке зрения, в физиологических условиях образование и выделение атромбогенных веществ преобладает над тромбогенными, и это является обязательным условием тромборезистентности сосудов. Если бы этого не было, даже незначительные изменения реологических свойств крови сопровождались бы адгезией тромбоцитов, активацией тромбиногенеза и нарушением кровотока прежде всего в сосудах микроциркуляторного русла. Поскольку тромборези-стентность обязательное условие нормальной микроциркуляции, ат-ромбогенные вещества должны образовываться постоянно. При функциональных нагрузках на сосуды и при активации или повреждении эндотелия образование и выделение оксида азота, простациклина, активатора плазминогена и, возможно, других факторов тромборезистентности возрастает, и это рассматривается как неспецифическая реакция. Уменьшение образования атромбогенных веществ - фактор риска тромбоза, но увеличение - еще не гарантия обратного. Атромбогенные вещества сосудистой стенки, ингибируя тромбиногенез, инактивируя прокоа-гулянты, активируя фибринолиз, препятствуя адгезии и агрегации тромбоцитов, не препятствуют гемостазу при повреждении сосудов, но ограничивают процесс тромбообразования, и в этом заключается значение тромборезистентности. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Исследование плазменного звена гемостаза Тесты, характеризующие «внутренний» путь свертывания крови Время свертывания венозной крови по Ли -Уайту Время свертывания венозной крови оценивает общую коагуляционную активность цельной крови по скорости образования в ней сгустка. Тест малочувствителен, так как результаты его будут в пределах нормы, например, при уровне фактора VIII 5% от нормы. Техника исследования. Сухой иглой без шприца из локтевой вены, выпустив первые капли крови на ватный тампон, берут кровь по 1 мл в 2 сухие стеклянные пробирки. Включают секундомеры сразу при соприкосновении крови с пробирками. Пробирки с кровью помещают в водяную баню при 37°С (возможно определение и при комнатной температуре). Через 2 минуты после получения крови, а затем каждые 30 секунд, пробирки осторожно наклоняют под углом 60-45°. При этом, если кровь не свернулась, то она растекается по стенке пробирки. Свертывание считается законченным, когда кровь не выливается при переворачивании пробирок вверх дном. Время свертывания выражается в минутах (среднее значение из 2-х

определений). Пределы нормальных колебаний: 4 мин 55 с -11 мин 55 с (Х= 8 мин 25 с). Возможные ошибки: Необходимо учитывать, что значительные колебания температуры помещения, если определение времени свертывания венозной крови проводится при комнатной температуре, влияют на результаты исследования. При низкой температуре время свертывания удлиняется. Изменение объема крови в пробирках также влияет на результаты определения. При большом объеме крови время свертывания ее замедляется, а при малом - ускоряется. Частый и значительный наклон пробирок приводит к ускорению свертывания вследствие быстрой активации фактора контакта. Большое значение имеет состояние стенки пробирки. Если стенки пробирок поцарапаны при обработке, плохо отмыты, то время свертывания ускоряется. Следующие исследования проводят с использованием цитратной плазмы. Для этого иглой без шприца берут кровь из локтевой вены в Центрифужную пробирку со стабилизатором - 3,8% раствором основного Цитрата натрия в соотношении 9 частей крови и 1 часть раствора Для исключения попадания тканевого тромбопластина первые капли крови сливают на ватный тампон и только после этого подставляют пробирку с цитратом натрия. Сразу после получения крови производят тщательное ее перемешивание со стабилизатором, переворачивая 2 раза пробирку, закрытую полиэтиленовой пробкой. Далее стабилизированную кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную плазму переносят в другую пробирку и в процессе работы хранят при комнатной температуре. Время рекальцификации плазмы Время рекальцификации плазмы - это время свертывания цитратной плазмы в термостатированных условиях (37°) после добавления к ней хлорида кальция, оно характеризует общую коагуляционную активность плазмы. Удлинение времени рекальцификации плазмы отмечается при значительных нарушениях в любой из фаз свертывания крови. В отличие от времени свертывания венозной крови это более чувствительный тест, благодаря отсутствию в плазме форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов), обладающих тромбопластической активностью Серьезными недостатками метода являются трудности, связанные со стандартизацией условий контактной активации и различным содержанием в плазме тромбоцитов, что приводит к значительному разбросу получаемых результатов. Техника исследования. Пробирку, содержащую 0,1 мл исследуемой цитратной плазмы и 0,1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, прогревают 1 минуту при 37°С. Затем добавляют 0,2 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и определяют время появления фибри-нового сгустка,

периодически наклоняя пробирку в водяной бане. Время рекальцификации плазмы - выражается в секундах (среднее значение из 2-х определений) Пределы нормальных колебаний: 84 с -122 с (Х=103 с.) Возможные ошибки. Несоблюдение стандартных условий центрифугирования при получения плазмы может привести к удалению из плазмы значительного числа тромбоцитов, что проявляется удлинением времени рекальцификации. Каолиновое время свертывания плазмы Каолиновое время свертывания плазмы, как и два предыдущих теста, относится к общим коагуляционным тестам. Присутствие каолина обеспечивает стандартную активацию факторов контактной фазы (факторов XII и XI), что обеспечивает большую чувствительность метода по сравнению с тестом определения времени рекальцификации. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,1 мл тестируемой плазмы, 0,1 мл веронал-ацетатного буфера и 0,1 мл 5% суспензии каолина, инкубируют 2 минуты при 37°С. После этого добавляют 0,2 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и определяют время образования фибринового сгустка. Каолиновое время свертывания плазмы выражается в секундах (среднее значение из 2-х определений) Пределы нормальных колебаний: 65с - 90 с (Х=77, 5 с) Возможные ошибки. Те же, что и при определении времени рекальцификации плазмы. На результаты определения, кроме того, оказывает влияние качество суспензии каолина. При грубодисперсной суспензии каолина может отмечаться ускорение образования фибринового сгустка. Активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ Активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ, определяет общую коагуляционную активность плазмы при стандартных условиях контактной активации. Благодаря добавлению препарата парциального тромбопластина (заменителя тромбоцитарных фосфолипи-дов), тест АПТВ, в отличие от каолинового времени свертывания плазмы, оценивает лишь участие факторов свертывания крови в образовании теназного и протромбиназного комплексов без влияния тромбоцитарных фосфолипидов исследуемого пациента. Удлинение АПТВ отмечается при активности факторов VIII=25-35%, 1Х=15-25 %, Xl=50-60 %, ХИ=50-60 %. Влияние на АПТВ других факторов (I, II, X) варьирует. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,1 мл исследуемой плазмы, 0,1 мл АПТВ-реагента, инкубируют 2 минуты при 37°С. После этого добавляют 0,1 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и

определяют время образования фибринового сгустка. Исследование проводят в двух параллельных пробах и рассчитывают среднее значение из 2-х определений. Результат оценивается в виде индекса АПТВ, как отношение АПТВ в исследуемой плазме к АПТВ в контрольной нормальной плазме. Пределы нормальных колебаний: 0,8 -1,1 (Х=0,95) Возможные ошибки. Результаты исследований зависят от качества суспензии каолина и парциального тромбопластина. Тест, характеризующий «внешний» путь свертывания крови Протромбиновое (тромбопластиновое) время Метод основан на том, что при наличии избытка тромбопластина и оптимального содержания кальция время образования сгустка в плазме зависит от активации свертывания по внешнему пути, преимущественно от активности факторов протромбинового комплекса - VII, V, X, II. При снижении активности одного или нескольких из перечисленных факторов, время образования сгустка в плазме замедляется. При достаточном содержании факторов удлинение протромбинового времени отмечается при лечении прямыми антикоагулянтами (гепарином) и при снижении содержания фибриногена ниже 1г/л, что подтверждается исследованием тромбинового времени и концентрации фибриногена. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,277% раствор хлорида кальция и суспензию тромбопластина в соотношении 2:1. Полученную смесь (или разведенную в соответствии с рекомендацией фирмы изготовителя тромбопластин-кальциевую смесь) помещают на водяную баню при +37° С и оставляют там до окончания работы. 0,1 мл исследуемой плазмы прогревают в стеклянной пробирке при температуре 37°С. Через 60 сек добавляют 0,2 мл прогретой тромбопластин кальциевой смеси, включают секундомер и определяют время свертывания. Исследование проводят в двух параллельных пробах и вычисляют среднее значение из 2-х определений (разница времени в пробах не должна превышать 1 сек). Результат оценивают в секундах и выражают обычно в виде протромбинового индекса (ПИ) по следующей формуле: ПИ, % = (ПВ контрольной плазмы / ПВ больного) х 100 Пределы нормальных колебаний:_ 93 % -108 % (Х=100%) На результаты определения протромбинового индекса в значительной степени влияет чувствительность используемого тромбопластина, что нередко приводит к несопоставимости данных, полученных с разными партиями реагента. В настоящее время с целью унификации результатов определения протромбинового теста предложено оценивать их в виде

международного нормализованного отношения (MHO, INR) в единицах по формуле: MHO =(ПВ больного / ПВ контрольной плазмы)мич При данном способе расчета учитывается чувствительность тромбопластина, выраженная международным индексом чувствительности МИЧ, ISI, (указан в маркировке фирмой изготовителем). Нормальное MHO близко к 1,0 и меньше 1,4. Увеличение MHO свидетельствует о нарастании гипокоагуляции. Разберем пример расчета MHO. Протромбиновое время плазмы больного составляет 24 сек. Протромбиновое время контрольной плазмы 12 сек. МИЧ (или ISI), указанный в инструкции к тромбопластину -1,08. Отсюда MHO для данного больного = (24 : 12) 1'08=2,11 Такой способ оценки протромбинового теста особенно важен при обследовании больных, получающих непрямые антикоагулянты, для которых недопустимы колебания показателей в зависимости от применяемых реагентов. Кроме того, определение MHO, в сравнении с протром-биновым индексом, позволяет более точно подобрать дозу антикоагулянта и уменьшить риск кровотечений, связанных с его передозировкой. В тех случаях, когда не приведен индекс чувствительности тромбопластина, может быть применен расчет протромбинового теста в процентах с использованием калибровочной кривой, построенной по результатам измерения протромбинового времени в разведениях контрольной нормальной плазмы. Калибровочная кривая, при этом, должна строиться для каждой новой серии тромбопластина. Тесты, характеризующие общий (конечный) путь свертывания крови Тромбиновое время Принцип метода основан на определении времени, необходимого для образования сгустка в плазме после добавления стандартного раствора тромбина. Тромбиновое время характеризует течение конечного этапа свертывания крови (скорость превращения фибриногена в фибрин) и зависит от содержания фибриногена и ингибиторов, блокирующих действие тромбина и превращение фибриногена в фибрин. Техника исследования. Пробирку с 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,05 мл физиологического раствора прогревают на водяной бане при 37°С в течение 30 секунд. Добавляют 0,1 мл раствора тромбопластина с активностью 30 сек, включают секундомер и определяют время появления сгустка. Повторяют определение не менее двух раз и вычисляют среднее значение. Результаты выражают в секундах . Пределы нормальных колебаний: 20,3 с - 31,5 с (Х= 29,9 с) Возможные ошибки. Использование раствора тромбина с активностью меньше или больше указанной. Для предотвращения этого обязателен контроль раствора тромбина на контрольной нормальной плазме или на

смеси плазм здоровых людей. Определение содержания фибриногена Для определения фибриногена в плазме используют различные методы, показания которых могут существенно отличаться друг от друга, особенно при гипо- или гиперфибриногенемии. Гравиметрический метод (по Р.А.Рутберг) Образующийся после свертывания плазмы фибрин быстро высушивается и по весу сгустка определяют содержание фибриногена. Техника исследования. 1,0 мл плазмы смешивают с 0,1 мл 5% хлорида кальция. Смесь инкубируют на водяной бане при 37° С. Через 20 минут после свертывания, образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем тщательного отжатия до тех пор, пока на фильтре не перестанут определяться следы влаги. Затем его взвешивают на торзионных весах. У здорового человека вес сгустка, полученного из 1,0 мл плазмы составляет -12 мг. Для определения содержания фибриногена в плазме вес полученного сгустка в мг умножают на коэффициент 0,2. Пределы нормальных колебаний: 2,0 - 4,0 г/л (Х= 3,0 г/л) Возможные ошибки. Ошибки метода могут быть связаны с потерей части сгустка на фильтре, недостаточным высушиванием фибрина, что ведет к завышению результатов; либо пересушиванием сгустка с ошибочным сдвигом в сторону снижения уровня фибриногена. Метод мало информативен, когда образуется рыхлый сгусток (при ДВС синдроме), при замедлении свертывания крови, например, при гемофилии, лечении гепарином или гирудином. Недостатком метода также является большой расход крови исследуемого больного. Хронометрический метод (по Клауссу) Определение содержания фибриногена по методу Клаусса производится согласно инструкции, прилагаемой к набору, который в России выпускают фирмы «Ренам», Москва и «Технология-Стандарт», Барнаул. Принцип метода основан на определении времени свертывания разведенной плазмы избытком высокоактивного тромбина. Время свертывания плазмы при этом зависит от концентрации в ней фибриногена. Концентрация фибриногена определяется по стандартной калибровочной плазме с известным содержанием фибриногена. Данный метод, в отличие от предыдущего, является более чувствительным и информативен при всех состояниях, при которых гравиметрический метод, как указывалось, дает ошибочные результаты Определение активности фактора XIII, фибрин-стабилизирующего фактора Определение активности фактора основано на учете времени рас-

творения в оксалате мочевины сгустка фибрина, полученного путем рекальцификации плазмы, к которой добавляют монойодуксусную кислоту для ингибиции активности ф.ХШ (фибриназы). Чем дольше не происходит растворение сгустка, тем выше активность фибриназы, физиологическая роль которой заключается в полимеризации фибрина. У больных, имеющих удлиненное время свертывания крови, время превращения фибриногена в фибрин замедлено. В связи с этим будет ускорено и растворение последнего в оксалате мочевины. С целью устранения влияния дефицита факторов «внутреннего пути» коагуляции в исследуемую плазму добавляют раствор тканевого тромбопластина. Техника исследования. К 0,2 мл плазмы добавляют 0,1 мл тканевого тромбопластина (ЮОмг/Юмл), используемого для определения протромбинового теста, 0,3 мл 0,277% раствора хлорида кальция и 0,1 мл 0,3% раствора монойодуксусной кислоты. Испытуемую смесь инкубируют на водяной бане при 37°С, через 20 минут добавляют 2,0 мл кислого ок-сапата мочевины и определяют время растворения сгустка фибрина. Активность фактора XIII выражают в процентах к норме, то есть к усредненному значению показателя времени растворения сгустка фибрин-мономера у здоровых лиц. Пределы нормальных колебаний: 70% -120 % (33 с - 49 с) (Х=100 %, 41 с) Исследование тромбоцитарного звена гемостаза Определение числа тромбоцитов Определение числа тромбоцитов в капиллярной, венозной крови, плазме должно проводиться с помощью соответствующих приборов или микроскопически в счетной камере Горяева. При последнем определении методом выбора является способ Брехера и соавторов с использованием фазовоконтрастного микроскопа (или фазовой насадки КФ-1, КФ-4) и разведением крови 1:100 гемолизирующим 1,5%-ным раствором ок-салата аммония. Разведение рекомендуется проводить в пробирке с помощью микродозаторов или микропипеток на 0,01 или 0,02 мл. В данном методе разрушение эритроцитов путем гемолиза не только облегчает подсчет тромбоцитов, уменьшая ошибку метода, но и позволяет в случае значительного изменения числа тромбоцитов при повторном исследовании больного делать в пробирке более адекватные разведения, а именно, 1:251:50 - при значительной тромбоцитопении и 1:300-1:500 - при тромбоцитозе и тромбоцитемии. Фиксация кровяных пластинок оксала-том аммония дает возможность осуществить достаточно полное их осаждение в камере Горяева без сопутствующего разрушения части клеток. Метод подсчета тромбоцитов в счетной камере должен сочетаться с оценкой морфологии кровяных пластинок в мазке крови. Нередко, пренебрегая этим, не выявляют такие диагностически важные данные как резкое

увеличение размера тромбоцитов при болезни Бернара-Сулье, появление крупных агранулированных («серых») пластинок при синдроме серых тромбоцитов, микроформ при синдроме Вискотта-Олриджа, почти полное отсутствие агрегатов тромбоцитов и отростков в пластинках при тромбастении Гланцмана. Предотвращение возможных ошибок. Для отличия тромбоцитов от частичек различных загрязнений, от дефектов на стекле счетной камеры необходимо пользоваться неповрежденными новыми камерами Горяева и обеспечить чистоту всех используемых средств (камер, пипеток, пробирок, раствора оксалата аммония и стабилизаторов крови при определении числа тромбоцитов в венозной крови). Забор крови в мерную пипетку или дозатор должен проводиться максимально быстро: из венозной крови немедленно после поступления в силиконированную или полиэтиленовую пробирку, из капиллярной -сразу после удаления первой выступившей из ранки капли крови. После разведения крови нужно хорошо перемешать суспензию клеток, переворачивая пробирку приблизительно 10 раз. Для обеспечения полного оседания тромбоцитов камеру Горяева помещают в увлажненную чашку Петри не менее чем на 20 минут. Точность метода зависит от площади счетной камеры, на которой подсчитываются тромбоциты. Лодсчет нужно производить на площади 25 больших квадратов в каждом из двух разведений, отдельно приготовленных в двух пробирках. Такая точность особенно необходима в функциональных тестах, основанных на определении разности содержания клеток в двух пробах (например, в ретенционных тестах, при определении индекса внутрисосудистой агрегации в методе Wu и Hoak). Для определения числа тромбоцитов в 1 мм3 (1 мкл) исходного образца (крови, плазмы) необходимо учитывать основные параметры камеры: ее высоту - 0,1 мм (поэтому подсчитанное в камере число тромбоцитов всегда нужно умножать на 10) и площадь 25 больших квадратов, равную 1 мм2 (поэтому числом подсчитанное на большей или меньшей площади, должно быть отнесено именно к 1 мм2, с помощью второго множителя). Третьим множителем является поправка на примененное при подсчете разведение, и обычно он равен 100, но может изменяться от 25 до 500. Методы определения длительности кровотечения Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллля-ров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого

звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100х109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht<0,20) из-за нарушения участия эритроцитов в процессе первичного гемостаза. Помимо решения диагностических задач тест рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т.к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее. В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения: проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению. К первым методам относится тест Duke, при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 3 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести. Тем не менее этот метод должен применяться при первичном обследовании больного с неустановленной причиной первичного геморрагического диатеза. Только при неизмененных результатах теста Duke могут использоваться методы определения длительности кровотечения с применением воздействий, затрудняющих течение первичного гемостаза. При патологических исходных значениях метод Duke в дальнейшем может быть применен для оценки эффективности проводимой ге-мостатической терапии. Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции. Веностаз достигается наложением на плечо обследуемого манжетки тонометра под давлением 40 мм рт.ст. В тесте Borchgrevink и Waaler на внутренней поверхности предплечья делают два разреза по 13 мм длиной и 1 мм глубиной. Существуют специальные приспособления, обеспечивающие стандартность наносимого повреждения. В норме длительность кровотечения

из такой ранки менее 9 мин 37 с и менее 12 мин 4 с у мужчин и женщин, соответственно). После выполнения этого исследования на предплечье остаются небольшие рубцы, что затрудняет его применение с целью мониторинга. А.С.Шитиковой предложена модификация метода Ivy (А.С.Шитикова. //Лаб. дело.-1975. - №10. - с. 597-602). Определение длительности кровотечения проводится в условиях веностаза, но с нанесением колотой ранки в области концевой фаланги III-IV пальца. Кроме венозного застоя, повышению чувствительности метода служит второй, затрудняющий гемостаз фактор - погружение кончика пальца с нанесенной ранкой в жидкость, что позволяет оценить не только длительность кровотечения, но и объем кровопотери. Чувствительность метода значительно выше, чем теста Duke. Техника исследования. В две пластиковых бакпечатки разового пользования наливают по 5 мл стерильного физиологического раствора пипеткой, предназначенной только для этой цели. Предплечье обследуемого свободно лежит на столе. На плечо накладываю манжетку тонометра и нагнетают воздух до 40 мм рт.ст. Это давление сохраняется в течение всего времени исследования. Обрабатывают спиртом концевую фалангу III или IV пальца и общепринятым способом с помощью скарификатора разового пользования производят укол в подушечку концевой фаланги точно на глубину 3,5 мм и одновременно включают секундомер. Кончик пальца с нанесенной ранкой погружают в верхнюю часть раствора, наблюдают в проходящем свете за вытекающим столбиком крови, и в момент полного прекращения кровотечения выключают секундомер. В случае большой кровопотери и сильного окрашивания кровью раствора палец перед концом кровотечения переносят в другой стаканчик для точного установления момента его завершения. С помощью пипеток на 5 и 0,2 мл (маркированных «для крови» и не используемых для другой цели) оценивают интенсивность кровотечения путем измерения добавочного объема жидкости сверх налитых 5 мл. Определение времени кровотечения необходимо повторить два раза, но одномоментно не более двух раз, т.к. после третьего укола длительность начинает увеличиваться. Диагностическое значение имеет наибольшая из установленных величин. При значительном увеличении времени кровотечения исследование следует прекратить на 10-15 минуте, а при большой кровопотере - и раньше. В случае отрицательных результатов исследования у больных с клиническими признаками геморрагического диатеза необходимо проводить повторные определения в разные сезонные периоды и особенно во время обострения заболевания, поскольку для болезни Виллебранда и многих тромбоцитопатий характерна волнообразность в изменении показателей. Пределы нормальных галебашй_дпительности кровотечения составляют у взрослых мужчин 70-196 с (Х=118 с), у женщин 87-208 с (Х=135

с). Объем кровопотери - 0,01-0,40 мл. При необходимости статистической оценки полученных данных должны обрабатываться Ig значений длительности кровотечения, поскольку они у здоровых лиц имеют характер lg-нормального распределения. Предотвращение возможных ошибок. Для минимизации нестандартности наносимого повреждения желательно, чтобы в лаборатории метод выполнял один квалифицированный лаборант. Нельзя усиливать гиперемию кожных покровов путем слишком энергичного протирания спиртом. Для устранения влияния на результат исследования спазма периферических сосудов в холодное время года больной, пришедший с улицы, должен находиться в помещении не менее двух часов. При значительном отклонении комнатной температуры от обычной (18-24°С) нужно контролировать температуру физиологического раствора, в который погружается палец, т.к. при его температуре ниже 16° и выше 33° время кровотечения удлиняется. При первичном обследовании больные не должны принимать ацетилсалициловую кислоту и другие, отрицательно влияющие на функцию тромбоцитов лекарства, по крайней мере за 7-10 дней до исследования. Метод не применим для оценки функции сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при коллаптоидном состоянии, выраженной анемии. Исследование адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов при контакте с поверхностью кожной ранки (ретенционный тест in vivo) К ретенционным тестам (тестам задержки) относятся методы, с помощью которых определяются адгезивные и агрегационные свойства кровяных пластинок при взаимодействии их с контактной поверхностью. Предлагаемый метод является модификацией теста Borchgrevink, который установил, что число тромбоцитов в капиллярной крови здоровых людей закономерно меньше, чем в венозной. В процессе кровотечения из кожной ранки указанное различие прогрессивно увеличивается. Это объясняется потреблением кровяных пластинок на раневой поверхности в результате образования тромбоцитарной пробки. Поэтому, если определить степень этого потребления в строго фиксированное время после нанесения повреждения, то оно будет характеризовать способность тромбоцитов взаимодействовать с субэндотелиальными элементами сосудистой стенки и агрегировать на поврежденной поверхности. Техника исследования._Немедленно после поступления венозной крови в сухую силиконированную или пластиковую пробирку в ней определяют число тромбоцитов. При этом с целью повышения точности метода набирают две мерные микропипетки и приготавливают два разведения в 1,5 % растворе оксалата аммония. Подсчет числа тромбоцитов в капиллярной крови проводится одновременно с определением длительности кровотечения. Для этого точно на 20 секунде после укола в палец до его погружения в физиологический раствор

хлорида натрия набирают одну мерную пипетку для подсчета количества тромбоцитов. Поскольку длительность кровотечения определяют дважды, то и при нанесении второй ранки указанную процедуру повторяют. На 20-й секунде капля должна выступать самостоятельно, и только, если этого не происходит, допускается легкое надавливание на концевую фалангу пальца. Определение процента тромбоцитов, задержавшихся на раневой поверхности за счет их адгезивно-агрегационной активности, проводится по формуле: (А-Б)/А х 100%, где А - число тромбоцитов в венозной крови х 109/л, Б - число тромбоцитов в капиллярной крови х 109/л. Пределы нормальных колебаний адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов у взрослых здоровых людей составляют 28-48% (Х=37%). Предотвращение возможных ошибок. Возможные ошибки, как и при определении длительности кровотечения, прежде всего могут быть связаны с нестандартной глубиной наносимой кожной ранки. В случае более глубокого повреждения кровь может поступать из артериовенозных анастомозов и содержание тромбоцитов в такой крови будет приближаться к венозному. Это создает ложное впечатление снижения активности кровяных пластинок. При слишком поверхностной ранке уменьшается и длительность кровотечения, и число потребленных на раневой поверхности тромбоцитов. Остальные ошибки, связанные с нарушением стандартности других условий исследования те же, что и при определении длительности кровотечения. Исследование агрегационной активности тромбоцитов Исследование агрегации кровяных пластинок в настоящее время проводят в основном двумя способами: методом Борна при помощи специальных приборов с графической или цифровой регистрацией развития процесса во времени и визуальным или микроскопическим методом без характеристики его динамики. Оценка агрегации тромбоцитов с применением нескольких экзогенных агрегирующих агентов (которые, как правило, являются естественными агонистами и играют значительную роль в осуществлении гемостаза в организме) позволяет объяснить некоторые особенности нарушений при различных видах врожденной и приобретенной тромбоцитарной патологии. Фотометрический метод исследования тромбоцитарной агрегации Наиболее распространенные приборы для исследования агрегации тромбоцитов в плазме (отечественный анализаторы агрегации тромбоцитов АТ-1, ФРМ-1) основаны на турбометрическом принципе. Установлено, что после добавления агрегирующего агента к богатой тромбоцитами плазме прогрессивно увеличивается число тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты, и снижается их концентрация в окружающей агрегаты среде. Последнее приводит к уменьшению оптической плотности исследуемой плазмы пропорционально степени агрегации или, соответственно – к повышению

пропускания через нее светового луча, т.е. – трансмиссии света. Поскольку снижение числа тромбоцитов обусловлено потреблением их в образующихся агрегатах, то связанное с этим изменение трансмиссии света может служить мерой агрегационного процесса. Повышение трансмиссии прямо пропорционально степени развившейся агрегации (в то время как оптическая плотность по мере прогрессирова-ния агрегации падает), поэтому увеличение агрегации во времени удобнее характеризовать однонаправленным с нею изменением трансмиссии. Трансмиссия света при прохождении через исследуемую тромбоцитарную плазму сразу после добавления агрегирующего агента (когда агрегации еще нет) условно принимается за 0%, а трансмиссия бестромбоцитной плазмы этого же человека - за 100%. При полной агрегации, захватившей все тромбоциты (100%-ная агрегация), в кювете агрегометра фактически образуется бестромбоцитная плазма (со взвешенными в ней агрегатами). Поэтому трансмиссия в этой стадии также оценивается как 100%-ная. Промежуточные степени агрегации соответственно имеют значения в диапазоне от 0 до 100% трансмиссии. Развитие агрегационного процесса зависит от функциональных свойств тромбоцитов, уровня фибриногена плазмы, наличия ионов Са2+ и условий, способствующих столкновению кровяных пластинок, что обеспечивается постоянным перемешиванием плазмы в кювете агрего-метра с помощью магнитной мешалки. Столкновения тромбоцитов чаще происходят в плазме с большей их концентрацией. Поэтому для оценки агрегационной активности отдельной клетки необходимо, чтобы в исследуемой плазме число кровяных пластинок было стандартизовано до определенного уровня - обычно до 200x109/л. Это достигается разведением богатой тромбоцитами плазмы с помощью бедной тромбоцитами плазмы этого же человека. При необходимости проведения исследований у больных с тромбоцитопенией должны быть получены нормальные значения показателей агрегации для плазмы здоровых людей, в которой число тромбоцитов снижено аналогичным разведением до уровня, имеющегося у больного. Однако для большинства агрегометров пороговым уровнем, ниже которого регистрация агрегации невозможна, является число тромбоцитов в плазме, равное 50x109/л. Стабилизация венозной крови 3,8% раствором основного цитрата натрия в соотношении 9:1 нередко приводит у здоровых людей еще до начала исследования (и в случае использования силиконированной или пластиковой посуды) как к видимой спонтанной агрегации, так и к падению числа тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме до (150-180)х109/л. Последнее также свидетельствует о спонтанной агрегации, которая обусловливает и потерю части тромбоцитов, и изменение функциональных свойств оставшихся. Этот процесс спонтанной агрегации, изменяющий результаты исследования индуцированной агрегации, особенно выражен у больных с тромбофилией, с тромбоэмболическими заболеваниями. На основании изложенного мы увеличили содержание цитрата натрия до 0,78%-ной

конечной концентрации в стабилизированной крови (соотношение крови и стабилизатора 4:1). При такой стабилизации число тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме здоровых людей закономерно находилось в пределах (250-450)х109/л, спонтанная агрегация не обнаруживалась и при микроскопическом контроле, и при оценке ее в агрегометре. В течение 10 мин в богатой тромбоцитами плазме здоровых людей, стандартизованной до 200x109/л, без добавления индуктора агрегации повышение трансмиссии (обусловленное спонтанной агрегацией в кювете агрегометра) составило только 3,9±0,3%. Техника исследования на агрегометре АТ-1 или ФРМ-1. Путем пункции локтевой вены прямо из иглы набирают кровь в мерную центрифужную силиконированную или пластиковую пробирку с 3,8% раствором основного цитрата натрия в соотношении 4:1. Стабилизированную кровь центрифугируют при 150д и комнатной температуре в течение 10 мин. Богатую тромбоцитами плазму силиконированной или пластиковой пипеткой переносят в другую пробирку, аналогичную вышеописанной, а часть этой плазмы (приблизительно половину) в такой же пробирке центрифугируют при 2300д и 20° С в течение 20 мин для получения обедненной тромбоцитами плазмы. Определяют число тромбоцитов в исследуемой плазме или методом Брехера и соавторов, или по установленной (для каждого агрегометра) зависимости между числом тромбоцитов в плазме и трансмиссией света этой же плазмы. Эта зависимость дает возможность по трансмиссии света богатой тромбоцитами плазмы обследуемого (при установлении 100%-ной трансмиссии в его бедной тромбоцитами плазме) приблизительно определить число тромбоцитов - или графически, или по формуле (рис.4).

Рис.4. Зависимость трансмиссии света и оптической плотности в анализаторе агрегации тромбоцитов (АТ-1) от числа кровяных пластинок в богатой тромбоцитами плазмы здоровых людей. Шкалы - логарифмические. Каждая точка - среднее из 8-10 определений

Показатели трансмисии бестромбоцитной плазмы каждого образца приняты за 100% трансимиссии. По рассчитанной пропорции, с учетом содержания тромбоцитов в плазме обследуемого и требуемой их концентрации, смешивают соответствующие объемы бедной и богатой тромбоцитами тестируемой плазмы так, чтобы содержание пластинок в последней составляло 200x109/л. В кювету агрегометра, куда помещена магнитная мешалка, наливают определенное количество исследуемой плазмы (обычно 0,45 мл), включают графическую регистрацию и через одну минуту прогревания вводят агрегирующий агент, как правило, в объеме 1/10 от объема плазмы. Запись проводят в течение 5 мин. Скорость движения ленты 15 мм/мин. Графическая регистрация процесса дает характерную агрега-ционную кривую (рис.5). Оценивая общий вид агрегационных кривых, получаемых с различными дозами ряда общепринятых индукторов агрегации, можно выделить следующие основные их типы.

Однофазная агрегация, нередко обратимая

Двухфазная необратимая агрегация: тип I тип II

Однофазная необратимая агрегация с длительным латентным начальным периодом Рис. 5. Основные типы агрегационных кривых Ось Х- время реакции Ось У - трансмиссия света Однофазная агрегация, нередко обратимая, развивается после применения малых доз агрегирующего агента. Введение индуктора агрегации практически сразу или после очень короткого латентного периода в

несколько секунд вызывает умеренное повышение трансмиссии света, которое после достижения определенной величины (обычно до 20-30% трансмиссии) постепенно начинает возвращаться к исходному уровню. Такая кривая отражает фазу первичной агрегации и процесс дезагрегации при отсутствии в связи с малой дозой агониста процесса тромбоцитарной секреции. Механизм развития первой волны связан со взаимодействием агонистов с их тромбоцитарными мембранными рецепторами, развитием доступности рецепторов для фибриногена, образованием фибриногеновых связей между этими рецепторами в прилежащих кровяных пластинках. К двухфазной необратимой агрегации следует относить те арегационные кривые, которые наблюдаются при средних дозах и характеризуются двухфазным течением процесса. При этом, в первом, наиболее типичном варианте двухфазной агрегации (тип I) наблюдается отчетливое разделение первой и второй волны латентным периодом, в течение которого нет дальнейшего изменения трансмиссии света. Установлено, что вторая волна вызывается высвобождением из кровяных пластинок эндогенных агонистов и поэтому ее отсутствие у больного свидетельствует о серьезном нарушении тробоцитарной секреции. Второй вариант двухфазной агрегационной кривой (тип II) наблюдается после введения больших доз агрегирующих агентов, которые вызывают быстрое развитие первой волны агрегации, быстрое и значительное индуцирование секреторного процесса, благодаря чему вторая волна развивается рано и непосредственно примыкает к первой без видимого латентного периода. Также относительно быстро достигается и суммарная максимальная величина агрегации, которая может составить 80-100% трансмиссии. Внешне при поверхностной оценке такая кривая производит ложное впечатление одноволновой, но, в действительности, она отражает двухфазный процесс. Это доказывается трансформацией кривой типа I в II при постепенном увеличении дозы агрегирующего агента. Отличительными признаками кривой типа II является очень высокая скорость и общая интенсивность процесса и, естественно, отсутствие дезагрегации. Кроме того, по ходу кривой может быть выявлено изменение ее наклона в связи с изменением скорости агрегации в момент развития второй волны. Однофазная необратимая агрегация после длительного начального латентного периода наблюдается при исследовании так называемой коллагеновой агрегации. При введении суспензии коллагена в кювету агрегометра после выраженного латентного периода (в течение которого индуцируются реакции тромбоцитарной секреции и из кровяных пластинок высвобождаются эндогенные агрегирующие субстанции) развивается единственная волна агрегации. Эта единственная волна по своему механизму соответствует второй волне двухфазных агрегационных кривых при применении средних и больших доз различных растворимых индукторов агрегации. Для количественной оценки агрегации и характеристики ее динамики

наибольшее значение имеют два параметра: максимальная степень изменения трансмиссии света при завершении каждой волны и скорость ее нарастания в начале развития агрегации. Ранняя точечная скорость измеряется в определенное фиксированное время от начала данной волны обычно на 30 с. Предпочтение отдают наиболее ранней скорости. Так, именно ранняя скорость первой волны ристомициновой агрегации лучше всего коррелирует с активностью фактора Виллебранда. Поскольку для средних доз большинства агрегирующих агентов характерна двух-волновая агрегация, каждая из волн характеризуется этими двумя параметрами. Оба параметра удобно и просто оценивать в процентах трансмиссии света. Несколько менее информативны временные показатели -время начала и окончания первой и второй волны (рис.6).

Рис. 6. Измерение основных параметров двухфазной агрегационной кривой Иногда, немедленно после применения малых и средних доз индукторов агрегации, удается отметить очень небольшой латентный период, но он выявляется не у всех здоровых людей. Однако в патологических условиях продолжительность этого интервала может увеличиваться, указывая на задержку мембранной активации. В некоторых случаях в течение этого латентного периода отмечается очень небольшое и кратковременное снижение трансмиссии. Для понимания этих наиболее ранних изменений после введения агониста следует уточнить то, что оптические свойства плазмы при развитии агрегации отражают суммацию двух одновременных, но разнонаправленных изменений: увеличения количества и размера тромбоцитарных агрегатов, что затрудняет прохождение света, и падения числа тромбоцитов, которое приводит к повышению трансмиссии. В самый начальный ранний период после введения индуктора агрегации изменение формы тромбоцитов из дискоидной в сферическую (так называемое набухание), появление отростков и первых малых агрегатов затрудняет прохождение света, связанное с доминированием перечисленных изменений.

(Оценка этого раннего периода снижения трансмиссии для характеристики изменения формы тромбоцитов и появления первых мелких агрегатов требует изменения условий исследования или применения специальных приборов - например, лазерного анализатора агрегации тромбоцитов). В период развернутой агрегации доминирующим влиянием на оптические свойства плазмы становится эффект снижения числа тромбоцитов в связи с потреблением их в агрегатах. При этом повышение трансмиссии начинается только при достаточно выраженной агрегации, т.е. тогда, когда величина агрегатов достигает размера 25-100 тромбоцитов в одном агрегате и существенно снижается число свободных кровяных пластинок. Предотвращение возможных ошибок. Такие существенные для течения агрегационного процесса условия как постоянство температуры (37°С), рН (7,4-8,0), интенсивности перемешивания реакционной смеси в кювете агрегометра, а также постоянство всех объемных отношений и конечных концентраций агрегирующих агентов обеспечиваются нормативными характеристиками прибора и неукоснительным соблюдением при работе методических инструкций. Одним из важнейших условий обеспечения клинически значимых объективных данных является получение богатой тромбоцитами плазмы без сопутствующей преждевременной активации клеток еще до начала агрегометрии. Этой цели служит правильное получение крови толстой и короткой иглой (диаметр 1,2 мм, длина менее 5 см), использование силиконированной или пластиковой посуды, адекватный режим центрифугирования при получении богатой и бедной тромбоцитами плазмы, завершение всех исследований в течение полутора-двух часов после получения ее из вены и надежная стабилизация крови. При выраженном изменении у больного показателя гематокрита необходимо проводить стабилизацию крови с коррекцией в соответствии со степенью этого отклонения по. формуле (при стабилизации в соотношении 1:4):

где VCT - необходимый объем цитрата нагрия, Уда - объем стабилизированной венозной крови, Ht - показатель геиатокритэ больного, содержание форменных элементов крови, л/л. Как и при других методах исследования сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза, больной в течение 7-10 дней не должен принимать нестероидные противовоспалительные препараты и другие средства, отрицательно влияющие в течение длительного времени на функцию тромбоцитов и эндотелий сосудов. Для исследования не пригодна плазма с признаками гемолиза, липемическая, содержащая примесь эритроцитов.

В заключение необходимо подчеркнуть следующее. Техническое выполнение регистрации агрегационного процесса в агрегометре представляется достаточно простой процедурой, но значительно сложнее обеспечить постоянство всех влияющих на него условий. К сожалению, нарушения некоторых их этих требований могут остаться не замеченными, а наличие графической записи производит ложное впечатление максимальной объективности. Для того, чтобы установить факт овладения исследователем этим в действительности достаточно сложным методом, необходимо неукоснительно выполнить следующее требование: сначала на плазме здоровых лиц должны быть получены и оценены пределы нормальных колебаний с относительно малым разбросом и хорошей воспроизводимостью данных в разные дни. Только после этого можно переходить к обследованию больных. При этом для заключения о наличии определенного типа тромбоцитарных нарушений рекомендуется подтверждение выявленных изменений при повторном обследовании больного. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов Визуальный метод оценки агрегации кровяных пластинок менее распространен, чем фотометрический, поскольку не имеет графической регистрации развития процесса во времени и не позволяет оценивать секреторные реакции. Тем не менее и визуальный метод имеет сбои преимущества, т.к. не требует специального оборудования и может быть выполнен с затратой минимального количества плазмы. При перемешивании на предметном стекле агрегирующих агентов и богатой тромбоцитами плазмы через некоторое время развивается агрегация кровяных пластинок. Появляющиеся агрегаты в определенный период достигают достаточно больших размеров и могут быть видны в проходящем свете с помощью лупы. Это - так называемый феномен «снежной бури», который в плазме здоровых людей с определенным количеством тромбоцитов развивается в одно и то же время при оптимальной дозе агрегирующего агента. При снижении агрегирующей активности кровяных пластинок время развития агрегации задерживается и, напротив, при активации их «снежная буря» появляется раньше. Поэтому при стандартных условиях исследования момент появления агрегации может служить для характеристики функциональной активности тромбоцитов. Техника исследования. Получение и стабилизация венозной крови такие же, как и в предыдущем методе. В педиатрической практике или, если не проводятся другие функциональные исследования тромбоцитов, общий объем стабилизированной крови может быть сокращен до 2-3 мл (в этом случае для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугируют при более мягком режиме). Богатую тромбоцитами плазму силиконированной или пластиковой пипеткой переносят в другую силиконированную или пластиковую пробирку, подсчитывают в ней число тромбоцитов и хранят до исследования при комнатной температуре не более

часа. Разными пипетками на предметное стекло наносят 0,02 мл исследуемой плазмы, 0,02 мл одного из агрегирующих агентов (ADP, ристомицина, коллагена, тромбина), смешивают плазму с агонистом и включают секундомер. Смесь перемешивают стеклянной палочкой так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром приблизительно в 2 см. Покачивая стекло круговыми движениями, в проходящем свете осветителя (ОИ-19) на черном фоне следят через лупу за появлением агрегатов. Секундомер выключают в момент, когда видны отчетливые агрегаты, раствор просветляется и часть агрегатов начинает прилипать к поверхности стекла. Реакцию повторяют два раза с каждым агрегирующим агентом. Различия между двумя параллельными определениями не должно превышать 2-5 сек. В случае необходимости еще большей экономии плазмы объем ее и раствора агрегирующего агента может быть снижен до 0,01 мл. При регистрации результатов исследования указывают конечную концентрацию применяемых индукторов агрегации. Оценка результатов исследования. Время агрегации нормальных тромбоцитов зависит от их числа - чем больше пластинок в богатой тромбоцитами плазме, тем быстрее развивается реакция. Поэтому пределы нормальных колебаний, как и средние величины времени агрегации, различны для разного содержания кровяных пластинок в плазме, они приведены в таблице 3 в диапазоне от 400 х109/л до 50 х109/л тромбоцитов. Промежуточные величины могут быть определены графически (рис.7). Рис.7. Зависимость времени агрегации тромбоцитов при визуальном определении, от их содержания в богатой тромбоцитами плазме здоровых людей Шкала - полулогарифмическая Агрегирующие агенты: 1 - ADP (0,5 х 4 W M); 2 - коллаген (разведение основной суспензии 1:2); 3 - ристомицин (0,8 мг/мл); 4- тромбин (0,015%); 5 - норадреналин (0,125 ЕД/мл).

Необходимость стандартизации числа тромбоцитов у каждого обследуемого была устранена следующим образом. Был вычислен относительный показатель агрегационной активности по формуле А/Б х 100%, где А - определенная графически средняя величина времени агрегации у здоровых лиц при числе тромбоцитов в плазме, которое имеется в плазме больного в день обследования, Б - установленное в тестируемой плазме время агрегации. При определении верхних и нижних границ нормальных колебаний относительной агрегационной активности получены очень близкие величины при всех исследованных уровнях тромбоцитов, что позволило принять общие пределы нормальных колебаний для исследованного диапазона содержания кровяных пластинок в плазме (табл.3). Таблица 3 Пределы нормальных колебаний времени визуальной агрегации тромбоцитов при различном их содержании в плазме здоровых людей Число тромбоцитов в плазме (х 10в/л) Агрегирующие агенты и их конечная 400 300 200 100 50 концентрация Время агрегации (с) ADP (0,5х10-4М) 37-27* 43-30 50-37 62-45 75-62 32** 37 44 54 69 Основная суспензия 34-26 35-27 36-27 37-32 39-35 коллагена (разведение 30 31 32 34 37 1 :2) Ристомицин (0,8 мг/мл) 37-27 41-31 50-38 63-47 74-56 32 36 44 55 65 Норадреналин (0,015%) 93-74 95-81 102-62 83 88 92 Тромбин (0,125ед/мл) 52-10 55-44 59-48 85-65 106-79 46 50 54 75 93

Относительная агрегационная активность (%) 86-119 100 87-117 100 87-117 100 91-111 100 89-114 100

*Пределы нормальных колебаний времени агрегации даны от большей величины к меньшей с тем, чтобы это соответствовало величинам относительной агрегационной активности ** Средняя арифметическая величина Для исключения ошибок, связанных с неточностью определения времени агрегации, необходимо, чтобы каждый исследователь выполнил контрольные исследования на плазме 5-10 здоровых лиц. Для проверки точности приготовления и сохранности реактивов такой контроль должен проводиться систематически на плазме 3 здоровых лиц. Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови Определение функциональной активности тромбоцитов представляет собой достаточно сложную задачу: с одной стороны, нужно в максимальной

степени сохранить интактное состояние пластинок до начала исследования, а с другой - создать стандартные оптимальные условия, необходимые для обеспечения полной реализации их функций после стимулирования in vitro. При многих преимуществах нефелометрических методов, сделавших их широко используемыми, они обладают одним существенным недостатком невозможностью проведения измерений в цельной крови. Это обусловливает необходимость центрифугирования образцов крови в ходе приготовления богатой тромбоцитами плазмы, в результате чего: • кровяные пластинки подвергаются значительным механическим воздействиям, которые могут существенно изменить их функциональную активность и привести к потере наиболее крупных и активных клеток; • нарушается естественное окружение тромбоцитов, что не позволяет учитывать влияние на них других форменных элементов крови, специфически модулирующих функции кровяных пластинок; значительно увеличиваются время и объём крови, необходимые для подготовки пробы к исследованию; • увеличивается вероятность значительного изменения концентрации лабильных медиаторов в пробе к моменту измерения. Кроме того, оптические методы не позволяют исследовать кровь больных с выраженной гиперлипидемией, часто встречающейся в кардиологической практике. В связи с этим, более корректными представляются методы оценки функциональной активности тромбоцитов, позволяющие проводить исследования непосредственно в цельной крови. Самыми простыми из них являются способы, основанные на регистрации убыли одиночных тромбоцитов в условиях перемешивания крови с каким-либо агрегантом. Существует целый ряд модификаций таких микрометодов, однако сравнительно низкая чувствительность и воспроизводимость препятствуют их широкому распространению в лабораторной практике. Значительным прогрессом в рассматриваемой области можно считать появление импедансного метода исследования функциональной активности кровяных пластинок. Импедансный метод определения индуцированной агрегации кровяных пластинок основан на измерении сопряженных с формированием тромбоцитарных агрегатов изменений комплексного сопротивления между электродами, помещенными в исследуемую пробу крови или богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Метод позволяет динамически исследовать поведение тромбоцитов в их естественной среде, что устраняет все перечисленные выше недостатки и ограничения нефелометрических способов и делает его наиболее объективным и перспективным современным средством изучения функционального статуса кровяных пластинок. На основе импедансного метода в последние годы выпущена серия агрегометров цельной крови для научных и клинико-диагностических лабораторий (агрегометры фирмы «Cronolog» (США), АИ-300 (СанктПетербург). В рассматриваемых приборах электроды датчиков при со-

прикосновении с перемешиваемой кровью покрываются сначала тромбоцитами в один слой. Если не добавлять индуктор агрегации, то дальнейшего взаимодействия между тромбоцитами и электродами не происходит и полное электрическое сопротивление между электродами (импеданс) остается постоянным. При внесении агониста развивается агрегация тромбоцитов, в результате чего наблюдается нарастание тромбоцитов на электродах. Утолщение покрывающего электроды слоя приводит к увеличению импеданса между электродами, последнее отображается (в случае агрегомегра АИ-300) на цифровом табло прибора с дискретностью 3 секунды, а также выводится в виде кривой агрегации на графический матричный индикатор прибора. При наличии самописца или компьютера процесс агрегации регистрируется на диаграммной ленте или экране монитора, соответственно. Измерения ведутся при перемешивании проб со скоростью 1100 об/мин (цельная кровь) и 600 об/мин (БТП) и температурной стабилизации образцов (37° С). Получение крови для исследования функциональной активности тромбоцитов является крайне важным моментом и его корректное проведение в значительной степени влияет на конечные результаты, особенно если речь идёт о клинических исследованиях. Получать крови следует в одно и то же время суток, поскольку активность тромбоцитов, как и всей системы гемостаза в целом, обнаруживает выраженные колебания на протяжении суток (суточные биоритмы) с максимумом около 9 часов. Все пациенты не должны получать в течение 1012 дней до момента исследования препаратов, влияющих на функциональную активность тромбоцитов. Забор производится из локтевой вены. Для исследования агрегации тромбоцитов кровь стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия в объемном соотношении: 9 частей крови на 1 часть раствора лимоннокислого натрия. Кровь, не встряхивая, тщательно перемешивают плавно вращая пробирку. В процессе исследования пробы сохраняют при комнатной температуре с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с клетками крови. Адекватное исследование агрегационной активности тромбоцитов возможно в цельной крови в течение 3 часов от момента забора крови, в БТП - в течение 2 часов после осаждения форменных элементов. Недопустим забор крови после длительного венозного стаза. Получение крови рекомендуется осуществлять либо вообще без наложения жгута или манжеты сфигмоманометра, либо, если это возможно, время венозного застоя не должно превышать 1 минуты. В противном случае выделяемые ише-мизированной сосудистой стенкой биологически активные соединения могут существенно изменять функциональный статус тромбоцитов. Если кровь из вены не набирается сразу после укола, повторные пункции одной и той же вены недопустимы. Вакуумная методика получения проб крови, используемая в современных одноразовых системах забора, при изучении функционального потенциала кровяных пластинок в достаточной степени унифицирована с рутинным способом отбора при свободном токе крови.

Как в момент получения крови, так и в ходе последующих манипуляций допускается контакт крови лишь с несмачиваемыми поверхностями. Для предотвращения контактной активации тромбоцитов необходимо производить силиконирование стеклянных поверхностей. Более эффективно использование в этих целях посуды и оборудования из неактивных в отношении клеток крови полимерных материалов. Индукторами агрегации, наиболее часто используемыми при анализе агрегации тромбоцитов, являются аденозиндифосфат (ADP), и коллаген. Кроме того, для проверки функциональных отклонений в действии фактора Виллебранда используется антибиотик ристоцетин/ристомицин. При изучении дефицита пула хранения наиболее полезна арахидоновая кислота, для проверки на максимальное выделение хранимых нуклеотидов - тромбин. Концентрации агонистов для исследования агрегации в цельной крови следует выбирать на пороговых значениях - т.е. в минимальных значениях, дающих полную агрегационную волну. Обычно анализы образцов проводятся при следующих конечных концентрациях индукторов: Индуктор агрегации ADP Коллаген Ристоцетин Тромбин Арахидоновая кислота

Конечная концентрация 2-10 мюM 0,5-4,0 мкг/мл 1,0-1,4мг/мл 1 единица/мл 1х10—3 М

Оптимальное соотношение объёмов индуктора агрегации и пробы составляет 1:9-1:12. Параметры агрегации тромбоцитов, определяемые при исследовании в общем случае агрегатограммы, получаемые в цельной крови, имеют вид сходный с кривыми агрегации, записанными в богатой тромбоцитами плазме. В связи с этим, их анализ проводится по общепринятым характерным точкам (рис.8).

Рис.8. Характерные параметры типичной агрегатограммы

В зависимости от условий и задач исследования возможно определение следующих параметров: А1- интенсивность (амплитуда) первичной агрегации, Ом; А2 - интенсивность (амплитуда) вторичной волны агрегации, Ом; А3 - интенсивность (амплитуда) максимальной агрегации, Ом; Т1 - время начала дезагрегации, мин; Т2 - время начала вторичной агрегации, мин; tg a1, - максимальная скорость первичной агрегации, Ом/мин; tg а2 - максимальная скорость вторичной агрегации, Ом/мин; Дополнительно измеряется латентный период. При его наличии допускается определение амплитуды процесса и его максимальной скорости к 5-6 минуте от момента ввода стимулятора, когда уже ясно видны чувствительность к дозе и интенсивность агрегации. Оценка результатов исследования при подобии, в целом, агрегатограмм, получаемых в цельной крови на импедансном агрегометре и в богатой тромбоцитами плазме на оптических приборах, в параметрах процесса агрегации в указанных биологических субстратах имеются и существенные различия. Для цельной крови отмечено замедление агрегации, по сравнению с плазмой: время достижения максимальной интенсивности увеличивается до 10-15 минут. При этом наблюдается значимая корреляционная связь между амплитудой и максимальной скоростью агрегации: r=0,96 (р<0,001) и r=0,86 (р<0,01) в случаях индукции процесса ADP и коллагеном, соответственно. Последнее обстоятельство позволяет в условиях острого дефицита времени сократить длительность анализа, ограничиваясь измерением только максимальной скорости агрегации. В цельной крови коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов начинается сразу после ввода агониста, без латентного периода, характерного для фотометрических измерений в богатой тромбоцитами плазме. При этом амплитуда процесса в среднем в 2 раза превышает интенсивность агрегации, вызываемой ADP в той же крови (конечные концентрации индукторов 4,0 мкг/мл и 5,0 (μM, соответственно). Как и в богатой тромбоцитами плазме, ADP, при достаточно низкой концентрации, вызывает в образцах цельной крови двухволновые агрегатограммы. Получение второй фазы зависит от концентрации индуктора, которая меняется от больного к больному, и возможно примерно в 10% случаев. При анализе кривых агрегации важно учитывать относительную степень агрегации при воздействии различных агонистов. Так, у страдающих болезнью Виллебранда нормальные агрегация тромбоцитов и выделение адениловых нуклеотидов наблюдаются при воздействии коллагена, ADP и арахидоновой кислоты, в то же время они незначительны или совсем отсутствуют при стимуляции ристоцетином. У больных тромбасте-нией кровяные пластинки не реагируют нормально при воздействии большинства индукторов. Однако тромбоциты способны синтезировать достаточно

простагландинов под воздействием арахидоновой кислоты, чтобы вызвать нормальное выделение ADP и в отсутствие агрегации! Так называемая «аспирино-подобная» патология отличается малой степенью или полным, отсутствием агрегации или выделения ADP в ответ на воздействие арахидоновой кислоты. Кроме того, отмечается снижение реакции на стимулирование ADP, коллагеном, причём выделение в случае аденозиндифосфата полностью отсутствует. Реакция на введение ристоцетина непостоянна, при малом или полностью отсутствующем выделении ADP. Интересные результаты получены при исследовании агрегационного статуса тромбоцитов в цельной крови в условиях гиперлипидемии. Так, при умеренной гинерхолестеринемии наблюдается значимая положительная корреляция между амплитудой индуцированной агрегации тромбоцитов (в случае стимуляции ADP и коллагеном) и уровнем фибриногена в плазме крови. У гиперлипидемических больных, перенесших острый инфаркт миокарда, повышенная коллаген-индуцированная агрегация в отличие от богатой тромбоцитами плазмы сохраняется в течение длительного периода (до 24 месяцев). Выявлено и достоверное повышение агрегационной активности кровяных пластинок на указанном индукторе у лиц возрастной группы 49-65 дет по сравнению с группой 35-48 лет, что хорошо коррелирует с возрастанием частоты атеросклеротического поражения сосудов и ИБС в пожилом возрасте. Приведенные факты свидетельствуют о высоких диагностических и информационных возможностях оценки функционального состояния тромбоцитов в цельной крови. Следует еще раз подчеркнуть, что для получения наилучших результатов, пациент не должен есть и курить в течение минимум 8 часов до момента проведения анализов агрегации тромбоцитов. Кроме того, испытуемый должен избегать принятия аспирина и других лекарств, известных влиянием на агрегацию кровяных пластинок, в течение 10-12 дней до времени исследования. Необходимо помнить, что источниками ошибок могут быть и реактивы, в частности, различна эффективность коллагеновых препаратов. Поэтому все реактивы периодически должны проверяться по обычному донорскому контролю. Определение адгезии кровяных пластинок Адгезия тромбоцитов к элементам сосудистой стопки является начальным этапом в процессах гемостаза, артериального тромбоза и атеросклероза, что определяет существенное информативное значение этого показателя при лабораторной диагностике и оценке эффективности лекарственной терапии широкого ряда гематологических и сердечнососудистых заболеваний. Существующие методы опенки адгезии кровяных пластинок либо крайне сложны и используются поэтому только в исследовательских целях,

либо недостаточно физиологичны (адгезия к стеклу) и специфичны (определяют, наряду с адгезией, агрегацию пластинок). Кроме того, слабая воспроизводимость делает их малопригодными для рутинной лабораторной практики. В связи с этим, представляет интерес разработанный в НИИ кардиологии (Санкт-Петербург) количественный метод определения адгезии тромбоцитов в цельной крови с помощью импедансного агрегометра. Метод основан на регистрации изменений модуля комплексного сопротивления пробы крови, стабилизированной ЭДТА, под действием коллагена (использование для предотвращения свертывания крови такого хелатора кальция, как ЭДТА, исключает индуцирование коллагеном процесса агрегации кровяных пластинок). Измерения проводятся с соблюдением условий и количественных соотношений, стандартных для определения агрегации тромбоцитов. Для характеристики процесса адгезии оценивают его амплитуду в ОМ. При добавлении коллагена к стабилизированной ЭДТА (7,0 тМ) цельной крови наблюдается изменение ее комплексного сопротивления в виде характерной кривой, связанное с прилипанием тромбоцитов к микрофибриллам коллагена (рис. 9А).

Рис.9. Адгезия (А) и агрегация (Б) тромбоцитов в крови одного донора. Конечная концентрация коллагена 4,0 мкг/мл В большинстве случаев отмечается продолжительная лаг-фаза процесса (до 3 минут). За ней следует быстрое нарастание импеданса крови с выходом на плато к 10-12 минуте. Аналогичные концентрации коллагена вызывают в крови тех же доноров стабилизированной цитратом натрия, агрегацию тромбоцитов с амплитудой в 2-3 раза превышающей величину адегезии (рис. 9Б). Чувствительность кровяных пластинок к фибриллярному коллагену широко варьирует: пороговая концентрация препарата, инициирующая процесс адгезии, колеблется у разных доноров от 4 до 20 мкг/мл крови. Исследование влияния ацетилсалициловой кислоты на функциональную активность тромбоцитов (рис.10) показало меньшую степень торможения аспирином процесса адгезии кровяных пластинок, чем их агрегации.

Это свидетельствует о различных механизмах, участвующих в реализации этих двух важнейших проявлений функциональной активности тромбоцитов. Аналогичные результаты получены и при изучении ингибирующего влияния RGD-содержащих пептидов, однако, их воздействие на процессы адгезии и агрегации оказалось значительно эффективней. Именно использование антагонистов тромбоцитарных рецепторов считается в последние годы наиболее действенным путем предотвращения тромбообразования.

Рис.10. Влияние ацетилсалициловой кислоты на коллаген-индуцированные агрегацию (1) и адгезию (2) тромбоцитов. Конечная концентрация коллагена 4,0 мкг/мл. По оси ординат - средняя амплитуда соответствующего процесса; по оси абсцисс - концентрация ацетилсалициловой кислоты; (п=12)

Метод малоуглового светорассеяния для оценки состояния тромбоцитов Кинетика агрегации тромбоцитов является сложным многостадийным процессом. При классической оценке агрегации в плазме богатой тромбоцитами (БТП) по светопропусканию (метод Борна) наблюдается двухстадийная кинетика, причем малые дозы агониста (ADP) вызывают обратимую агрегацию, а последующее увеличение дозы приводит к появлению второй стадии. Эту кинетику, возможно, представить, в несколько упрощенном виде, следующей схемой (рис.11). Агонисты вызывают повышение внутриклеточного кальция [Са +], (активируя Са2+, каналы мембраны кровяных пластинок и/или фосфоинозитольный цикл), что приводит к сферизации клеток (N0->NS). Увеличение [Ca2+]j вызывает кальмодулин-опосредованную активацию киназы легких цепей миозина (MLCK). Последующее фосфорилирование цепей миозина приводит к образованию псевдоподий (NS-»NP). Клетки с псевдоподиями способны при столкновении образовывать агрегаты, первоначально - димеры (2 NS-»D).

Рис. 11. Трансформация тромбоцитов при их возбуждении: No - диски, NS- сферизованные клетки, Np - клетки . с псевдоподиями, (первые две стадии - shape change), D - агрегаты (димеры), конечный процесс - свертывание (все клетки в едином агломерате) Кроме прямого прохождения этой цепи реакций, возможно формирование двух петель обратной связи, при участии цАМФ или цГМФ в качестве посредников. Эти соединения влияют на разные стадии процесса: так, рост уровня цГМФ при участии NO-синтазы приводит к исчезновению псевдоподий и дезагрегации клеток. Так или иначе, оба процесса вызывают появление рефрактерных клеток (М(). Эти клетки должны отличаться повышенным уровнем цАМФ и/или цГМФ, ингибирующее влияние которых может быть преодолено повышенной дозой сильных агностов (ADP, тромбин и т.д.). Из этого сжатого рассмотрения видно, что начальной (ключевой) реакцией тромбообразования, является активация тромбоцитов. Однако метод Борна слабо чувствителен к этой стадии трансформации клеток. На основе техники малоуглового светорассеяния, разработан новый метод, позволяющий, регистрировать стадии активации и исследовать агрегацию тромбоцитов при физиологической концентрации ионов калия (~1 тМ) (Патент Э.Ф. Деркачев, И.В. Миндукшев и др. Бюлл. изобретений, 10 (II), 298, 1998). Последовательность выполнения исследований методом малоуглового светорассеяния следующая: плазма богатая тромбоцитами (БТП) разбавляется в солевой среде (140 mM NaCI, 1 тМ СаС!2, 5 тМ tris-CI (pH=7,8)) в 30-80 раз, с конечной концентрацией тромбоцитов <107 кл/мл. Далее регистрацию малоуглового светорассеяния проводят на новом приборе «Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург). Принцип заключается в следующем. Свет от лазерного источника направлен под углом 90° на кювету. Регистрация интенсивности светорассеяния осуществляется фотодиодами в углах: 2 и 12 градусов, сигналы с фотодиодов поступают в первичный блок преобразования, а оттуда выводятся на самописец и ЭВМ. Кювета содержит 5 мл среды с БТП. Агрегация, дезагрегация и свертываемость регистрируется в 2 градусном углу, в 12 градусном угле кроме этих процессов, регистрируются активация тромбоцитов с полезной величиной сигнала 20-60%. На рисунке 12 показана динамика изменения интенсивности в двух углах: 2 (нижний график) и 12 градусов (верхний график), при действии ADP. Видно, что до внесения кальция в среду ([Са2+]0<30μМ) динамика

сигнала в угле 12 градусов имеет двухфазный характер, и отражает две реакции: сферилизацию клетки (I) и образование псевдоподий (II). Агрегация, после внесения кальция (III) и свертывание (IV) (в некоторых случаях спонтанная, или вызванная тромбином) регистрируется в обоих углах, причем, для агрегации, наблюдается инвертирование сигнала в 12-ти градусном угле при сохранении временных показателей в обоих углах регистрации. Достоинством метода является его достаточная простота применения, отсутствует процедура отмывания клеток от плазмы, возможность проводить исследования при сильно разбавленной плазме (>50 раз) в присутствии физиологической концентрации ионов кальция (-1 тМ), возможность создания модельных сред с заданными параметрами. Метод и новый прибор, в настоящее время, применяется в научных исследованиях, фармакологии и клинической практике: в Институте Эволюционной Физиологии и Биохимии (Санкт-Петербург), в Государственном Медицинском Университете (Санкт-Петербург), и Московском Гематологическом Центре.

Рис.12. Изменение интенсивности светорассеяния суспензии в двух углах-2 градуса (нижний график) и 12 градусов (верхний) в ходе трансформации представленной на рисунке. БТП-богатая тромбоцитами плазма. Методы исследования ретрактильной активности тромбоцитов Ретракция - активное сжатие, уплотнение фибринового сгустка в результате сокращения актомиозиновых структур тромбоцитов, входящих в тромбоцитарно-фибриновую сеть гемостатической пробки. Оценка ретракции используется как один из важных показателей функциональной активности кровяных пластинок, поскольку сократительные реакции развиваются только в полноценных клетках с нормальным рецепторным аппаратом, сократительной системой и энергетическим метаболизмом. В клинической практике используют две группы методов. В первой объектом

исследования является сгусток из крови, во второй - сгусток из плазмы. Особенность оценки результатов исследования ретракции сгустка крови связана с тем, что сокращение сгустка находится в прямой зависимости от ретрактильной, сократительной, активности каждого тромбоцита и от их концентрации, и в обратной - от числа других форменных элементов крови, прежде всего эритроцитов, уровня фибриногена, интенсивности процесса фибринообразования. Это, с одной стороны, приближает условия исследования in vitro к ситуации, имеющейся в организме, но, с другой, к сожалению, позволяет оценивать в этих методах ретрактильную активность кровяных пластинок только при условии нормальных значений всех других перечисленных переменных параметров, влияющих на конечный эффект сокращения. Исследование ретракции сгустка крови. В большинстве клинических методов исследования ретракции сгустка крови степень ретракции оценивают по объему выделившейся при этом процессе сыворотки. В предлагаемом методе исследование проводится в специальном аппарате, который может быть изготовлен стеклодувом из подручных средств (рис.13). Широкая часть аппарата, плотно закрываемая резиновой пробкой, сделана из верхней трети центрифужной пробирки и имеет у перехода в измерительную часть боковое отверстие для вливания крови. Измерительная часть, припаянная к верхней, представляет собой отрезок 5-миллилитровой пипетки (объемом на один мл), который запаян снизу на уровне одного из делений. В пробку вставлен стеклянный якорек в виде грибка; глубина его погружения в пробку рассчитывается так, чтобы при плотно закрытом аппарате поверхность площадки якорька находилась у верхнего уровня одного мл крови, налитой в широкую часть аппарата.

Puc 3. Аппарат для измерения в динамике ретракции сгустка крови После свертывания крови в основном положении аппарата якорь удерживает сгусток у пробки. Техника исследования. 1 мл венозной нестабилизированной крови быстро вливают с помощью мерной пипетки через широкую часть аппарата, который в этот момент перевернут измерительной частью вверх. После

полного свертывания крови аппарат переворачивают мерной частью вниз и в вертикальном положении помещают в термостат при температуре 37°С. Количество выделившейся сыворотки определяют или в динамике, на 20, 30, 40-й минуте после свертывания крови, или однократно в наиболее оптимальное для выявления недостаточности ретракции время - на 30-й минуте (табл.4). В поздние сроки, особенно через час и больше, из сгустка выделяется сыворотка вследствие фибринолиза, что маскирует результаты ретрактильного процесса. Поскольку при значительном изменении у больного показателя гематокрита количество выделившейся сыворотки зависит от степени этого отклонения, оценку ретракции сгустка проводят по процентному отношению количества выделившейся сыворотки в указанные интервалы времени к исходному объему плазмы; последний определяется по гема-токритному показателю больного. Таблица 4 Пределы нормальных колебаний показателей ретракции сгустка крови у взрослых людей в различные периоды после свертывания Время оценки по- Процентное отношение объема выделившейся сыворотки сле свертывания к исходному объему плазмы исследуемого образца крови: крови (мин) пределы колебаний X 20 30 40

24-60 32-72 44-79

42 52 62

Недостатком данного метода, как и всех других, в которых объектом исследования служит сгусток крови, является то, что по полученным показателям можно судить о ретрактильной активности кровяных пластинок только при нормальном их количестве, а также при неизмененном уровне эритроцитов, фибриногена, не нарушенном фибринообразова-нии. При использовании сгустка из плазмы на результат ретракции не влияют эритроциты, а также лейкоциты лейкемической крови; в плазме легко могут быть стандартизованы число тромбоцитов и уровень фибриногена, а нарушения фибриногенообразования устраняются введением в плазму раствора тромбина. Изложенное указывает на то, что для исследования именно ретрактильной активности кровяных пластинок целесообразно использовать и разрабатывать методы со сгустком из плазмы. Исследование ретрактильной активности тромбоцитов в сгустке из разведенной плазмы, модификация метода Benthaus и Kuhnke. Ретрактильная активность оценивается по уменьшению длины сгустка, образованного в мерном цилиндре из разведенной в 10 раз плазмы после свертывания ее тромбин-кальциевой смесью. Сгусток, полученный из

разведенной плазмы, в начале ретракции с трудом преодолевает силу сцепления с поверхностью цилиндра. Для уменьшения этой адгезии стенки цилиндра обрабатывают глицерин-желатиновой смесью. Вследствие указанного разведения плазмы исследование проводится при искусственно сниженном числе тромбоцитов, что делает метод более чувствительным для установления нарушения их ретрактильной активности. Для оценки последней абсолютно необходимой является стандартизация числа тромбоцитов в тестируемой плазме, что достаточно сложно в повседневной клинической практике. Поэтому нами получены пределы нормальных колебаний для показателей ретракции из плазм здоровых людей с различным содержанием кровяных пластинок, приготовленных путем смешивания в соответствующих пропорциях богатой и бедной тромбоцитами плазмы. С помощью полученной графической зависимости можно определять пределы нормальных колебаний ретракции для любого уровня тромбоцитов в исследуемой плазме от 50x10/л до 300x109/л и, таким образом, необходимость стандартизации числа тромбоцитов у каждого обследуемого больного устраняется. При оценке ретрактильной активности тромбоцитов удобнее пользоваться относительной величиной, а именно: процентным отношением длины сгустка у обследуемого больного к определяемой по кривой разведения средней величине этого показателя у здоровых лиц с таким же, как у больного, уровнем кровяных пластинок в плазме (рис.14). При таком способе выражения результатов верхние и нижние пределы нормальных колебаний относительной ретрактильной активности имеют близкие величины при различном содержании пластинок (табл.5). Техника исследования. Подготовка мерных цилиндров объемом 5 или 10 мл. Цилиндры моют хромпиком, высушивают в термостате и заливают при 37°С на 15 мин 10% раствором желатины в глицерине. Богатую тромбоцитами плазму получают вышеописанным способом из венозной стабилизированной крови. Определяют в ней число тромбоцитов. Таблица 5 Пределы нормальных колебаний ретрактильной активности тромбоцитов при различном их содержании в плазме здоровых людей Время наЧисло тромбоцитов в плазме (х 109/л) Относительная блюдения ретрактильная 300 150 100 50 после сверактивность % уменьшения длины сгустка тывания (в % к средней плазмы (мин) величине нормы) 20 22-32 13-20 9-15 5-9 77-123 27* 17 12 7 100 30 30-40 19-29 15-23 10-15 82-118 35 23 19 13 100 40 36-46 22-35 20-29 13-19 81-119 41 29 24 16 100 * средняя арифметическая величина

Рис. 14. Относительное уменьшение длины сгустка из плазмы крови здоровых людей на 20 минуте после его образования при различном содержании тромбоцитов В прогретую при 37°С центрифужную пробирку наливают 3,5 мл физиологического раствора натрия хлорида (рН 7,4) и 0,5 мл раствора кальция хлорида (0,025 М). Добавляют 0,5 мл раствора тромбина (10 ед/мл) и 0,5 мл исследуемой плазмы. Включают секундомер. Пробирку закрывают пробкой, быстро переворачивают два раза, содержимое переливают в подготовленный цилиндр, который помещают в водяную баню при 37°С. В процессе ретракции сгусток, занимавший вначале весь объем 5 миллилитрового цилиндра, начинает постепенно уменьшаться и подниматься кверху, оставаясь фиксированным у верхнего его края. Показатели регистрируют или в динамике каждые 10 мин в течение 40 мин или однократно в более раннее время - на 20-й минуте. Отмечают укорочение сгустка в делениях цилиндра, что соответствует его относительному укорочению в процентах, т.к. исходная длина сгустка -100 делений). Наиболее адекватным и диагностически значимым методом исследования ретрактильной активности тромбоцитов является прямое измерение силы сокращения сгустка из плазмы с помощью прибора - анализатора гемокоагуляции АГК1-02, разработанного в ВНИКИ медицинской лабораторной техники и в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии. В этом приборе в термостатированной кювете сгусток, образованный из плазмы при добавлении тромбин-кальциевой смеси, оказывается фиксированным между двумя металлическими дисками, из которых нижний, у дна кюветы, неподвижен, а верхний через измерительную систему связан с самопишущим прибором. При развитии ретракции на диски начинает действовать сила сокращения актомиозиновых тромбоцитарных структур. Постепенное нарастание величины ретракции регистрируется в виде кривой ретрактограммы и измеряется в единицах силы. Оценка величины силы ретракции, приходящейся на определенное число тромбоцитов (109/л) при фиксированном объеме пробы (т.е. по удельной ретрактильной активности), позволяет сравнивать результаты различных проб вне зависимости от общего числа тромбоцитов в них. Таким образом, зная число кровяных пластинок в

плазме обследуемого, можно определять их удельную ретрактильную активность без предварительной стандартизации числа клеток в пробе. Метод весьма чувствителен и позволяет регистрировать начало сокращения уже через 1-3 мин. После достижения максимальной величины ретракции при длительной регистрации может быть отмечен период уменьшения силы сокращения, связанный как с постепенным ослаблением ретрактильного процесса, так и с разрушением межтромбоцитарных фибриновых связей под влиянием фибринолитических факторов. В заключение необходимо еще раз подчеркнуть, что при освоении всех методов в каждой лаборатории рекомендуется получить свои пределы нормальных величин у людей разного пола для проверки постоянства соблюдения условий и степени овладения техникой исследования, для учета особенностей состояния гемостаза у здоровых лиц в данных климатических условиях и при преобладающем возрасте обследуемых. Маркеры дисфункции эндотелия Дисфункция эндотелия может быть следствием: нарушения гемодинамики, сопровождающегося изменением гидростатического давления, скорости и структуры потока, деформацией и окклюзией сосудов; • нарушения реологических свойств крови вследствие гемоконцентрации, внутрисосудистой агрегации форменных элементов крови, увеличения вязкости; • структурно-функциональных нарушений эндотелия, связанных с метаболическими расстройствами, действием цитокинов, иммунных комплексов и т.д. Одним из проявлений дисфункции эндотелия является изменение содержания в крови тромборегуляторов вследствие изменения их синтеза, секреции, лабилизации с поверхности эндотелиоцитов. Циркулирующие в крови тромбомодуляторы являются своего рода маркерами дисфункции эндотелия. В настоящее время в клинике наиболее часто для оценки тромбогенной активности и тромборезистентности сосудов используют определение vWF, t-PA, PAI-1, PGI2, тромбомодулина, ингибитора ТФ, секреция которых наиболее специфична для эндотелия, а также количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов. Содержание фактора Виллебранда в плазме Определение уровня плазменного фактора Виллебранда (vWF) проводят для диагностики болезни Виллебранда и дифференциации тяжелых форм этого заболевания с гемофилией А. Кроме того, vWF является одним из маркеров повреждений сосудистой стенки, имеющих место при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией гемостатических процессов. Одним из методов определения содержания vWF в плазме является

общепринятый «сэндвич» - метод твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип ИФА основан на специфическом взаимодействии антиген - антитело. Поликлональные антитела (AT) к vWF, предварительно адсорбированные на пластиковых планшетах, «захватывают» соответствующие им антигены из исследуемого образца, фиксируя их таким образом на планшете. Затем в лунки планшета добавляют моноклоналыные AT к vWF, конъюгированные с пероксидазой хрена - ферментом, который, вступая во взаимодействие в молярных соотношениях с определенным субстратом, в данном случае с ортофенилендиамином (ОФД), приводит к возникновению окраски, по интенсивности которой судят о количестве антигена в исследуемой пробе. Уровень vWF определяют в бестромбоцитной плазме, которую получают из венозной крови, стабилизированной 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 4:1. Кровь центрифугируют при комнатной температуре 8 минут при скорости 1000 об/мин (в лабораторной центрифуге ЦКЛ1). Богатую тромбоцитами плазму отсасывают и снова центрифугируют при 20°С в течение 20 минут при 4000 об/мин (в центрифуге К-23 «Janetzki» (Германия)) для получения бестромбоцитной плазмы. Все процедуры выполняют в пластиковой или силиконированной посуде. Бестромбоцитную плазму хранят до исследования при -20°С не более 3-4 месяцев. В качестве стандартной плазмы, необходимой для построения калибровочной кривой, используют референтную донорскую плазму с известным содержанием vWF или пул донорских бестромбоцитных плазм от 10-20 доноров. Для постановки анализа применяют планшеты, предназначенные для выполнения ИФА. Для проведения анализа необходимы реактивы, которые включают: 1. Буфер А: фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (0,14 М NaCI, 2,5 мМ KCI, 8 мМ Na2HPO4 , 1,5 мМ КН2РО4). 2. Буфер В: фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (0,5 М NaCI, 2,5 мМ KCI, 8 мМ Na2HPO4 , 1,5 мМ КН2РО4, 0,1% Tween-20). 3. Буфер С: цитратно-фосфатный буфер, рН 5,0 (3,4 мМ С6Н8О7, 6,8 мМ Na2HPO4). 4. Поликпональные AT к vWF человека (фирма "Dakopatts") в разведении 1:3000 на буфере А. 5. Моноклональные AT к vWF человека (разработка лаборатории онкоиммунологии НИИ онкологии и лаборатории свертывания крови Рос-НИИ гематологии и трансфузиологии, Петербург), конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:2000 на буфере В. 6. Субстрат для выявления активной пероксидазы: 0,05% раствор ОФД в буфере С с добавлением перекиси водорода непосредственно перед использованием до конечной концентрации 0,0198%. 7. 3 М раствор серной кислоты. Техника исследования. В каждую лунку планшета добавляют по ЮОмкл раствора поликлональных AT, инкубируют при +4°С в течение ночи. Проводят трехкратную отмывку лунок от не связавшихся AT с помощью

буфера В. Готовят пять последовательных двукратных разведений стандартной плазмы от 1:25 до 1:400 буфером В. Образцы исследуемой плазмы разводят буфером В в отношении 1:50. По 50 мкл каждого разведения стандартной плазмы и исследуемых проб помещают в лунки планшета, заполняя таким образом все лунки кроме 2-6, которые используют в качестве отрицательного контроля, добавляя туда буфер В. Для повышения точности анализа рекомендуется использовать для одного образца две соседние лунки, и при расчете результатов в качестве окончательного значения оптической плотности данной пробы брать среднее арифметическое из двух показателей. Затем в каждую лунку добавляют по 50 мкл моноклональных антител, содержащих ферментную метку. Проводят инкубацию при 37°С в течение 1,5 часа, за которой следует пятикратная отмывка планшета от остатков плазмы и не связавшихся AT с помощью буфера В. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора субстрата. Реакция окрашивания проходит в темноте при комнатной температуре. Развитие окраски контролируют визуально (обычно достаточная интенсивность окрашивания достигается в течение 5-30 мин). Останавливают реакцию окрашивания, добавляя в каждую лунку в той же последовательности, в которой прибавляли раствор субстрата, по 50 мкл раствора серной кислоты. Считывание результатов проводят не ранее, чем через 10 мин, и не позднее, чем через 30 мин, после остановки реакции окрашивания на любом спектрофотометре, предназначенном для обработки планшетов для ИФА при длине волны 492 нм. Оценка результатов. Содержание vWF в плазме выражают в процентах от нормы. Определение уровня vWF проводят с помощью калибровочной кривой, которая строится в билогарифмической системе координат на основании данных оптической плотности, полученных для последовательных двукратных разведений стандартной плазмы. Для построения калибровочных кривых существуют типовые программы. При невозможности использования таких программ, нормальную кривую строят на билогарифмической миллиметровой бумаге, откладывая по оси ординат величины оптической плотности, соответствующие разведениям стандартной плазмы, отмечаемым по оси абсцисс. За 100% содержания vWF условно принимают такое его количество, которое содержится в конечном разведении плазменного стандарта 1:100. Конечные разведения 1:50, 1:200, 1:400 и 1:800 составляют 200, 50, 25 и 12,5% vWF, соответственно. Линия, соединяющая полученные таким образом точки, является калибровочной кривой, по которой, зная оптическую плотность исследуемого образца, можно определить в нем процентное содержание vWF. В представленной ниже таблице приводятся данные оптической плотности последовательных разведений плазменного стандарта, использованные для построения калибровочной кривой в одной из постановок опыта.

Таблица 6 Показатель Концентрация фактора Виллебранда в% Ед. опт. плотности

Конечные разведения стандартной плазмы 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 200 100 50 25 12,5 2,720

1,788

0,991

0,562

0,309

Пределы нормальных колебаний: 58% -166% (Х=98%, 3=35,7) Возможные ошибки: Несоблюдение условий хранения образцов плазмы может привести к значительному снижению в них процентного содержания vWF. Определение эндотелиоцитов в крови Наличие циркулирующих в крови эндотелиоцитов впервые было показано Bouvier et al (1970). Эти же авторы продемонстрировали роль циркулирующих в крови клеток эндотелия как маркера повреждения сосудов. В настоящее время используются следующие методики определения циркулирующих в крови эндотелиоцитов: количественное определение клеток, иммуноцитометрические и иммуномагнитные методы. Наиболее доступным для практического использования является метод, предложенный Hladovec и Rossmann (1973). Принцип метода основан на выделении эндотелиальных клеток вместе с тромбоцитами с последующим их осаждением ADP. Венозная кровь в объемах 4-5 мл отбирается в пробирки. В качестве стабилизатора используется 3,8% раствор цитрата натрия из расчета 1:9. Тромбоцитарную плазму получают центрифугированием (1000 оборотов/мин, 10 мин). Тромбоциты отделяются путем добавления ADP (из расчета 0,4 мл раствора 1 мг/мл ADP на 1 мл суперна-тата), перемешивания смеси в течение 10 мин с последующим центрифугированием (1000 оборотов/мин, 10-15 мин). Бестромбоцитная плазма осторожно отделяется от осажденных тромбоцитов и повторно центрифугируется (1000 оборотов/мин, 20 мин). Полученная надосадочная жидкость сливается и к осадку добавляется 0,1 мл 0,9% NaCI, осадок осторожно отделяется стеклянной палочкой от стенок и дна пробирки. Подсчет количества клеток эндотелия осуществляется в двух сетках камеры Горяева. George F., Poncelet P et al. (1991) разработали цитометрический метод определения единичных эндотелиальных клеток в цельной крови. Этот метод основывается на использовании нового моноклонального антитела S-Endo, специфически реагирующего с эндотелиоцитами различного происхождения. Существует несколько типов моноклональных антител S-Endo: I, 2 и 3, однако лишь S-Endo-1 являются специфичными для циркулирующих в крови клеток эндотелия. Подсчет циркулирующих в крови эндотелиоцитов осуществляется путем сравнения с образцами крови с добавлением

известного количества эндотелиальных клеток пупочной вены. Выявлена хорошая корреляция между добавленными и подсчитываемыми эндотелиальными клетками (>90%), а минимум определения эндотелиальных клеток 0,2 клеток/мкл. Используя эту методику определения, авторы установили, что содержание эндотелиальных клеток в крови здорового человека <0,1 клеток/мкл. Повышение концентрации циркулирующих эндотелиальных клеток до 8 клеток/мкл определяется у пациентов после венепункции. Таким образом, иммуноцитометриче-ский метод с использованием S-Endo1 антител может быть использован для определения уровня циркулирующих эндотелиальных клеток при различной патологии. Циркулирующие эндотелиальные клетки могут быть изолированы из крови и идентифицированы с помощью специфических эндотелиальных антител, соединенных с иммуномагнитными элементами (George F., Brie-con С. et al., 1992). Специфические розетки, образуемые эндотелиальными клетками и иммуномагнитными элементами, могут быть затем изолированы с помощью магнита. Розетки клеток выявлялись с частотой >80%. Их эндотелиальное происхождение подтверждено обнаружением фактора Виллебранда и тромбомодулина, а также присутствием телец Weibei-Palade. Повышение количества циркулирующих эдотелиальных клеток в крови, отмеченное у больных ишемической болезнью сердца, эссенциальной гипертензией, гиперлипопротеидемией, сахарным диабетом I и II типа, у больных хирургического профиля до оперативных вмешательств, пациентов с посттромбофлебитическим синдромом, хронической никотиновой интоксикацией, отражает степень поражения сосудов и позволяет судить как о тяжести течения заболевания, так и оценить эффективность проводимой терапии.

АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА Кровотечения могут быть проявлением самостоятельного геморрагического заболевания, а также осложнением другой основной патологии или следствием местных сосудисто-тканевых повреждений. Причина геморрагического диатеза - нарушения в системе гемостаза, которые бывают первичными генетически обусловленными и вторичными приобретенными. Любое изолированное или сочетанное нарушение в одном или нескольких звеньях гемостаза может привести к развитию кровоточивости. Клинические проявления ее в некоторой степени сходны, что крайне затрудняет диагностику. В то же время точное определение причины нарушения системы гемостаза является необходимым условием для проведения адекватной гемостатической терапии. Диагностика геморрагического заболевания должна проводиться в соответствии с определенным принятым алгоритмом. Прежде всего, необходимо установить наличие геморрагического диатеза, а затем определить локализацию дефекта в системе гемостаза. Для установления диагноза большое значение имеет тщательно собранный анамнез. Этот первый этап ознакомления с историей заболевания является основой планирования дальнейшего лабораторного исследования. Заболевания системы крови, печени, почек, диспротеинемии, ревматизм, инфекционно-токсические и радиационные воздействия при отрицательном наследственном анамнезе указывают на большую вероятность вторичного системного нарушения, связанного с основным заболеванием или экзогенным воздействием. (Следует особо подчеркнуть, что заболевания, закономерно вызывающие изменения в системе гемостаза, должны быть исключены не только на основании сведений, полученных от больного, но и на основании тщательного объективного обследования больного). При опросе больного с кровоточивостью врач также должен помнить, что геморрагические проявления могут быть результатом длительного приема некоторых лекарственных препаратов, способных в той или иной мере нарушить гемостатический процесс (в частности, прием ацетилсалициловой кислоты, антикоагулянтов). Должна быть исключена возможность кровотечений, вызванных местными изменениями (например, при фиброматозе матки, при локальном расширении сосудов носовой перегородки или ее повреждением). Наличие у больного врожденного геморрагического заболевания устанавливается на основании совокупности характерных анамнестических и клинических данных (геморрагические проявления с детства, различная их локализация, закономерное повторение кровотечений на протяжении всей жизни больного, аналогичные случаи заболевания в семье). Для определения характера наследования в каждом отдельном случае необходимо выяснить возможные гемостатические нарушения у кровных родственников и

составить при положительном наследственном анамнезе родословное дерево. Однако следует помнить, что отрицательный семейный анамнез не исключает возможности выявления врожденного геморрагического заболевания. Оно может возникнуть в семье впервые (спорадические случаи), кроме того, нередко больные не располагают сведениями о своих родственниках. Установление врожденного геморрагического диатеза в случаях тяжелого течения заболевания не представляет особой сложности, в то время как умеренно протекающие формы длительно могут оставаться не диагностированными. При легко протекающих формах геморрагических диатезов кровоточивость может проявиться только после большой травмы или операции. Поэтому у больных с подозрением на врожденный геморрагический диатез особое внимание следует обратить на течение послеоперационного периода, в частности после удаления зуба, тонзиллэктомии. Анализ клинико-анамнестических данных и осмотр больного позволяют дифференцировать коагуляционный тип кровоточивости, в основе которого лежат изменения плазменно-коагуляционного звена гемостаза, от капиллярного, который наблюдается при нарушениях в сосудистом или тромбоцитарном звеньях, то есть при вазопатиях и тромбоцитопатиях (табл.7). У больных с дефектом в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза кровотечения обычно начинаются сразу после травмы, так как у них нарушено образование первичной гемостатической пробки. У этих больных может быть нарушен окончательный гемостаз вследствие недостаточной коагуляционной функции тромбоцитов и затруднения образования фибринового сгустка. Поздние кровотечения характерны для коагулопатий, обусловленных дефектом плазменных факторов свертывания крови. Между моментом нанесения травмы и началом кровотечения проходит значительный промежуток времени, у некоторых больных от нескольких часов до суток. Отсутствие кровоточивости сразу после травмы объясняется тем, что сосудистый спазм и образование тромбоцитарной гемостатической пробки у больных с плазменным дефектом не нарушены. Однако гемо-статическая пробка у них нестабильна из-за недостаточного образования плотного фибринового тромба, способного противостоять давлению крови и обеспечить гемостаз в сосудах среднего калибра. В результате через 1 - 2 часа после восстановления нормального уровня кровяного давления в зоне повреждения развивается кровотечение. Поэтому указания на продолжительные или вновь возникающие кровотечения через несколько часов после травмы или хирургической процедуры (в том числе и после удаления зуба) указывают на коагуляционный дефект.

Таблица 7 Определение характера кровоточивости по клиническим проявлениям Клинические проявления Гематомы (синяки) Гемартрозы

Характер кровоточивости Коагуляционный Большие

Капиллярный Небольшие поверхностные

Часто встречаются у тяже- Не характерны лых больных как основной признак Петехии Отсутствуют Типичные проявления Носовые кровоте- Наблюдаются редко Часто основной вид чения кровотечения Кровотечения при Отсутствуют Длительные поверхностных порезах Кровотечения Начинаются через несколь- Начинаются сразу после после экстракции ко часов после операции и операции и обычно зуба не останавливаются после останавливаются после наложения давящей повяз- наложения давящей поки вязки ПослеоперационПоздние кровотечения с Кровотечения в основном ные кровотечения образованием раневой во время операции гематомы Характерные про- Большие гематомы после Носовые и маточные явления при уме- травмы и опасные кровоте- кровотечения ренных формах чения после ранений и операций Существенные различия имеются в локализации кровотечений при геморрагических диатезах, обусловленных нарушениями в сосудистотромбоцитарном или плазменно-коагуляционном звеньях гемостаза. Для коагулопатий, связанных с нарушением синтеза плазменных факторов свертывания крови, типичны кровоизлияния в суставы и мягкие ткани. При гемофилии А и В у больных могут быть признаки ранее возникших кровоизлияний в суставы (утолщение суставной капсулы; ограничение объема движений; мышечные гематомы; атрофии; контрактуры; изменения, связанные с вовлечением в процесс нервов и др.). Но при легком течении заболевания эти признаки нередко отсутствуют. Заболеваниям, обусловленным сосудисто-тромбоцитарным дефектом, указанные проявления несвойственны. Наиболее характерными для них являются кровотечения из слизистых оболочек: носовые, маточные, желудочно-кишечные,

а также поверхностные экхимозы и петехии. Следует обратить внимание, что синяки на верхней части туловища и петехии, как правило, свидетельствуют о тяжелом течении геморрагического диатеза. Таким образом, на основании анализа клинико-анамнестических данных больного, страдающего повышенной кровоточивостью, могут быть получены ответы на следующие вопросы: 1) являются ли кровотечения у больного следствием нарушений в системе гемостаза или они связаны с местными сосудисто-тканевыми изменениями; 2) если имеется нарушение в системе гемостаза, то является ли оно врожденным или приобретенным; 3) насколько тяжелы геморрагические проявления и 4) каков тип кровоточивости - капиллярный или коагуляционный. Последнее в определенной степени диктует необходимость проведения направленных лабораторных исследований: плазменнокоагуляционных процессов - при коагуляционном характере нарушений и сосудисто-тромбоцитарных реакций - при капиллярном. Однако у любого первичного больного с геморрагическим диатезом, независимо от типа кровоточивости, в минимальном объеме должны быть выполнены тесты, характеризующие функцию всех компонентов системы гемостаза. Это необходимо для исключения сопутствующих нарушений в другом звене, а также для установления болезни Виллебранда и афибриногенемии заболеваний, в основе которых лежат изменения нескольких компонентов гемостаза и поэтому наблюдаются признаки того и другого типа кровоточивости. Кроме того, кровотечения из слизистых оболочек могут быть главным клиническим признаком и при ряде коагулопатий, таких как дефицит факторов VII и X. Сочетанные нарушения нередки при приобретенных формах кровоточивости, в частности они могут выражаться не только в дефиците прокоагулянтов, но и в повышении активности антикоагулянтных и фибринолитических компонентов плазмы. Поэтому, когда при выполнении минимальной ориентировочной коагулограммы (табл.8) получают данные, указывающие на преобладание того или иного вида нарушений, то это требует проведения дополнительных исследований. Таблица 8 Обязательный объем лабораторных исследований при первичном обследовании больных с геморрагическим заболеванием Тесты для характеристики плазменно- Тесты для характеристики коагуляционного звена гемостаза сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза Время свертывания венозной крови Длительность кровотечения Время рекальцификации плазмы Число тромбоцитов Каолиновое время свертывания плазмы Адгезивно-агрегационная Активированное парциальное тромбо- активность тромбоцитов пластиновое время (АПТВ) Одноступенчатое протромбиновое

время (протромбиновый индекс) Тромбиновое время Концентрация фибриногена Тест растворимости фибринового сгустка в мочевине (активность фактора XIII) Алгоритм диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза Геморрагические проявления при врожденной или приобретенной недостаточности тромбоцитарного звена гемостаза обусловлены тем, что имеются нарушения на той или иной ступени последовательно развивающихся гемостатических реакций: адгезии, агрегации, секреции кровяных пластинок и ретракции гемостатической пробки. С целью установления недостаточности функциональной активности тромбоцитов и определения ее характера исследование состояния тромбоцитарного гемостаза проводится в три этапа (табл.9). На I этапе, который доступен для применения в широкой медицинской практике, устанавливают факт нарушения в этом звене гемостаза. На II этапе, который проводят в биохимических лабораториях клиник и стационаров, определяют фазу тромбоцитарных реакций, где проявляется недостаточность. И, наконец, на III этапе в высокоспециализированных лабораториях могут быть установлены структурно-биохимические дефекты, лежащие в основе выявленных функциональных нарушений. Таблица 9 Этапы обследования больных с нарушениями тромбоцитарного звена гемостаза (без значительного изменения числа тромбоцитов) I. Установление факта 1. Определение типа кровоточивости нарушения в капиллярный, «смешанный» тромбоцитарном звене 2. Число тромбоцитов - чаще не изменено или умеренно снижено гемостаза 3. Длительность кровотечения - обычно увеличена 4. Адгезивно-афегационный (ретенционный) тест -результаты снижены II. Установление типа Оценка функциональных свойств тромбоцитов нарушения:

II. Определение структурно-биохимического дефекта Вид исследования Заболевание/синдром, при котором данное исследование необходимо или желательно: Оценка распределения Болезнь Бернара-Сулье, тромбоцитов по размеру, объему, дефицит пула хранения плотности Исследование морфологии Тромбастения, дефицит пула тромбоцитов, определение хранения, болезнь Бернара-Сулье содержания и плотности гранул хранения Оценка изменений Тромбастения, нарушение ультраструктурных элементов активации секреции тромбоцитов после их активации

Оценка процесса Болезнь Бернара-Сулье, распластывания тромбоцитов на тромбасте-ния поверхности стекла Оценка адгезии, Болезнь Бернара-Сулье, распластывания и агрегации болезнь Виллебранда, Тромбастения, тромбоцитов на субэндотелии тромбоцитопатия высвобождения препаратов артерий человека, аорты кролика Определение содержимого Дефицит пула хранения, гранул хранения после активации нарушение активации секреции тромбоцитов или их разрушения, а также высвобождения его в супернатант Исследование пула хранения и Дефицит пула хранения, метаболического пула адениновых нарушение активации секреции нуклеотидов Определение гликопротеинов Болезнь Бернара-Сулье, мембраны тромбоцитов тромбасте-ния Определение уровня, Болезнь Виллебранда мультимерного состава и функциональной активности фактора Виллебран-да в плазме и тромбоцитах Исследование ферментативной Тромбастения, нарушение активности тромбоцитов, прежде активации секреции всего тромбаксан-генерирующей системы, сАМР и энергетического метаболизма Определение конечных Нарушение активации продуктов (или реакции) активации секреции тромбоксан-генерирующей системы после действия различных активаторов и аналогов агонистов Определение мобилизации Нарушение активации 2 внутриклеточного Са * секреции I этап осуществляется на основании анализа анамнестических сведений и данных осмотра больного, позволяющих установить капиллярный или "смешанный" тип кровоточивости, а также посредством применения ориентировочных, скрининговых, тестов первичного гемостаза. К ним относятся определение первичной длительности кровотечения, числа тромбоцитов и их адгезивно-агрегационной активности в ретенцион-ном тесте. Совокупность результатов исследования скрининговых тестов позволяет дифференцировать количественные нарушения, обусловленные

выраженным изменением числа тромбоцитов, и качественные, связанные с недостаточностью функциональной активности кровяных пластинок. На этом этапе могут быть получены следующие варианты результатов исследования. Если у больного число тромбоцитов снижено, то, очевидно, основная причина нарушений тромбоцитарного аппарата связана с количественными изменениями, и дальнейшее гематологическое обследование должно быть направлено, прежде всего, на выявление причины этих отклонений. Необходимо установить, связана ли тромбоцитопения с нарушением процесса кроветворения, с повышенным разрушением или потреблением кровяных пластинок. Но и при очевидной количественной патологии определение функциональной активности тромбоцитов может быть целесообразным, так как существует ряд тромбоцитопатий, для которых характерна та или иная степень снижения содержания тромбоцитов. С другой стороны, при тромбоцитопении сопутствующие изменения функциональной способности кровяных пластинок могут усугублять недостаточность гемостаза, обусловленную количественным дефектом. Так, у некоторых больных с умеренной ^степенью тромбоцитопении (число тромбоцитов более 100хЮ9/л) исследование функции тромбоцитов может объяснить причину развития геморрагии и увеличение первичной длительности кровотечения. Реже повышение функциональной активности кровяных пластинок способствует определенной компенсации гемостатических нарушений. При значительном увеличении числа тромбоцитов необходимо также провести целенаправленное клиническое обследование больного для установления причины этого явления. Злокачественные новообразования, хронические воспалительные процессы, железодефицитная анемия могут явиться причиной реактивного тромбоцитоза. Хронические миелопролиферативные процессы (хронический миелолейкоз, миелофиброз, эссенциальная полицитемия) могут осложняться тромбоцитемией. Эссенциальная тромбоцитемия также является проявлением гемобластоза. В неясных случаях исследование функциональной активности тромбоцитов в комплексе с другими клиническими методами может помочь проведению дифференциального диагноза - при тромбоцитозе почти не бывает нарушения функции кровяных пластинок, в то время как при тробоци-темии оно закономерно. Проявления кровоточивости по капиллярному типу, увеличенная первичная длительность кровотечения при нормальном числе тромбоцитов в периферической крови указывают на наличие у обследуемого больного функциональных изменений в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза и на необходимость выполнения всех анализирующих тестов второго этапа. Следует отметить, что встречаются и другие более редкие варианты результатов первоначального исследования сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза. Так, у больного с геморрагическими проявлениями капиллярного типа могут быть получены нормальные значения длительности кровотечения и числа тромбоцитов. Нужно ли проводить исследования

дальше? Результаты скрининговых тестов как будто бы указывают на то, что нарушений в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза нет. Тем не менее, формальная логика не применима в данном случае, так как общие тесты, оценивающие определенную сумму реакций, являются мало чувствительными. В связи с этим при незначительных степенях нарушения первичного гемостаза вследствие компенсаторных влияний отклонения в общих тестах могут отсутствовать. Следует помнить также, что наличие геморрагии капиллярного типа - это объективный факт, диктующий необходимость соответствующего обследования. Вопрос о том, нужно ли его продолжать после получения отрицательных данных первых отборочных тестов, должен решаться различно в зависимости от тяжести геморрагии и от наличия данных, указывающих на системное нарушение гемостаза. Необходимо отметить, что легкое возникновение мелких синяков на коже у некоторых детей и женщин может наблюдаться без изменений в системе гемостаза. Поэтому, если геморрагические проявления небольшие, локальные, появились недавно, и в клинической картине заболевания нет указаний на возможность врожденного заболевания, то в таком случае отрицательные данные общих, отборочных, тестов позволяют временно прекратить дальнейшее исследование. Но при этом нужно предупредить больного о необходимости повторного лабораторного контроля при возобновлении кровоточивости или перед возможной хирургической операцией. Если геморрагические проявления значительные или распространенные, если имеются анамнестические данные о системном нарушении гемостаза, если больному предстоит операция, то лабораторное исследование в этой ситуации должно быть продолжено. После установления факта нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза следует приступить ко II этапу обследования с целью определения характера тромбоцитопатии. Исследования на этом этапе проводятся так, чтобы с помощью относительно простых, но клинически значимых тестов оценить функцию тромбоцитов во всех фазах первичного гемостаза, выявить основной определяющий дефект или характерное сочетание изменений. Анализ результатов минимального набора методов позволяет дифференцировать основные формы нарушений тромбо-цитарного гемостаза, обусловленные как собственно тромбоцитарным дефектом, так и недостаточностью плазменных кофакторов первичного гемостаза. Нарушение в фазе адгезии устанавливают на основании отсутствия или резкого снижения первой волны агрегации с ристомицином (ристоцетином). Если этот дефект корригируется добавлением фактора Виллебранда, содержащегося в бестромбоцитной плазме здоровых лиц, то можно считать, что недостаточность тромбоцитарного гемостаза, которая проявилась в геморрагиях и удлинении первичного времени кровотечения, обусловлена нарушением синтеза плазменного кофактора адгезии - фактора Виллебранда, что наблюдается, прежде всего, при болезни Виллебранда. Если подобной коррекции нет, то это свидетельствует, что нарушение взаимодействия тромбоцитов и фактора Виллебранда в присутствии

ристомицина связано с собственно тромбоцитарным дефектом - с отсутствием на мембране этих клеток гликопротеинового рецептора для фактора Виллебранда (GPIb), т.е. в данном случае следует думать о болезни Бернара-Сулье. Первое предположение о болезни Виллебранда подтверждается сочетанием выявленного дефекта в фазе адгезии со снижением коагуляционной активности фактора VIII, поскольку фактор Виллебранда является носителем молекулы фактора VIII и защищает последний от разрушения и элиминации в циркулирующей крови. Во втором случае болезнь Бернара-Сулье подтверждается, прежде всего, обнаружением в мазке крови гигантских тромбоцитов. Обычно у этих больных имеется и умеренная тромбоцитопения. О нарушении в фазе первичной агрегации при фотометрической оценке этого процесса свидетельствует резкое снижение или даже отсутствие и первой, и второй волн агрегации с оптимальными дозами ADP и других агрегирующих агентов, а также единственной волны агрегации с умеренными дозами коллагена. Такой тип изменений характерен для врожденной тромбастении Гланцмана, при которой в мембране тромбоцитов нет необходимых для развития агрегации гликопротеинов IIb-IIIa (GPIIb-IIa). Следует обратить внимание на то, что при отсутствии рецептора для фибриногена (GPIIb-IIIa) нарушена также и вторичная агрегация, поскольку и для нее необходимо образование фибриногеновых соединений между этими гликопротеиновыми рецепторами тромбоцитов. Нарушение механизма агрегации может быть связано также с отсутствием плазменного компонента, необходимого для формирующихся при агрегации межтромбоцитарных связей, то есть самого фибриногена, а не мест фиксации на плазматической мембране фибриногеновых молекул. Это приводит к сходной с тромбастенией картине агрегационных изменений, которые, однако, легко отличить на основании коагуляционных исследований, устанавливающих афибриногенемию. Для обеих форм патологии, связанных как с собственно тромбоцитарным дефектом тромбастенией, так и отсутствием плазменного кофактора агрегации афибриногенемией, характерна выраженная недостаточность ретракции, так как нарушено формирование непрерывных тромбоцитарно-фибриновых структур, в которых сокращение актомиозина кровяных пластинок приводит к сокращению всей системы в целом только в случае сохранности всех ее компонентов (т.е.СРПЬ - IIia или фибриногена, соответственно). Понятно, что при афибриногенемии все отклонения тром-боцитарных тестов корригируются in vitro добавлением фибриногена. Выявление третьей основной группы патологии тромбоцитарного гемостаза, в основе которой лежит недостаточность секреторного процесса, в клинических условиях проводится обычно на основании характерного отсутствия (или резкого снижения) второй волны агрегации с оптимальными дозами всех агрегирующих агентов и единственной волны агрегации с коллагеном. При графической регистрации агрегации именно эти феномены являются результатом секреции из тромбоцитов эндогенных агрегирующих

агентов. В отличие от предыдущей группы нарушений агрегации, при рассматриваемых тромбоцитопатиях высвобождения первая волна агрегации не изменена. Дифференцировать две основные подгруппы тромбоцитопатий высвобождения, обусловленных дефицитом гранул хранения или нарушениями в механизмах активации секреторного процесса, в известной степени можно на основании оценки агрегации с арахидоновой кислотой и большими дозами тромбина. Агрегация с арахидоновой кислотой не изменена при дефиците/дефекте гранул хранения и отсутствует при многих вариантах второй подгруппы тромбоцитопатий высвобождения. Противоположные результаты получают при использовании больших доз тромбина. Здесь агрегация отсутствует при дефиците пула хранения и может развиваться при функциональной тромбоцитопатий высвобождения, обусловленной в основном недостаточностью ферментов простагландинтромбоксанового пути активации, поскольку большие дозы тромбина стимулируют пластинки по фосфои-нозитидному пути. Более точное определение вариантных форм этой большой группы тромбоцитопатий требует использования сложных биохимических и морфологических методов (табл.9, III). Почти при всех вышеописанных формах тромбоцитопатий вторично нарушается и коагуляционная активность тромбоцитов. Это объясняется тем, что мембранная перестройка, приводящая к развитию коагуляцион-ной активности тромбоцитов, индуцируется как в период адгезивноагрегационных реакций, так и в период секреции. Изолированное врожденное нарушение содержания и доступности тромбоцитарного фактора 3 описано у единичных больных. Как правило, эта коагуляционная недостаточность связана с изменениями в других фазах тромбоцитарных превращений. Алгоритм диагностики нарушений плазменно-коагуляционного звена гемостаза У больного с коагуляционным типом кровоточивости должен быть установлен характер плазменного дефекта, что обычно проводится с помощью методов, определяющих активность каждого фактора свертывания крови. Такой способ диагностики является оптимальным, но он может быть осуществлен в настоящее время только в специализированных лабораториях по исследованию гемостаза, поскольку требует использование дорогостоящих плазм с изолированным дефицитом различных факторов свертывания крови. Однако диагноз коагулопатии может быть поставлен и в обычной лаборатории, исследующей процессы свертывания крови, на основании последовательного анализа широко распространенных коагуляционных методов. Но при этом необходимо принять во внимание, что анализ результатов проведенных исследований и установление диагноза не возможны без четкого представления о взаимодействии факторов в сложном процессе свертывания крови.

Напомним, что первая стадия свертывания крови - образование протромбиназы, может осуществляться пек внутреннему или по внешнему пути, которые различаются только по характеру реакций, непосредственно предшествующих активации фактора X. Первая группа реакций, известная как внутренний путь, включает в себя взаимодействие факторов XII, XI, IX, VIII, V, X и фосфолипидов кровяных пластинок, которое завершается образованием протромбиназы. Внутренний путь свертывания крови характеризуют следующие тесты: время свертывания венозной крови, время рекальцификации плазмы, каолиновое время свертывания и активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ). Особо следует подчеркнуть, что определение времени свертывания капиллярной крови не может быть использовано для характеристики внутреннего пути, поскольку техника этого исследования не исключает попадания в исследуемые образцы крови тканевого тромбопластина. Вторая группа реакций - это взаимодействие факторов VII, X, V и тканевого тромбопластина, обозначается как внешний путь, так как для активации фактора X и соответственно для образования протромбиназы по этому пути помимо плазменных факторов (VII, X, V), необходим внешний для крови компонент тканевый тромбопластин. Наиболее распространенным методом, оценивающим внешнюю систему свертывания крови, является тест одноступенчатого протромбинового времени (протромбиновый индекс). Третья группа реакций характеризуется тем, что образующаяся в ре; зультате активации факторов внутренней и внешней системы протром;биназа (комплекс факторов Ха, Va и фосфолипидов) превращает про?тромбин (фактор II) в тромбин (На), и далее под действием тромбина | происходит переход фибриногена в плотный и видимый фибриновый сгусток. К методам изучения процесса превращения фибриногена в фибрин относятся определение тромбинового времени, концентрации фибриногена и растворимости фибринового сгустка в мочевине. Последний тест позволяет судить об активности фактора XIII. Подобная систематизация методов имеет большое практическое значение, поскольку сопоставление результатов исследования в перечисленных тестах с учетом особенностей течения коагуляционных реакций в каждой тест системе позволяет диагностировать основные формы коагулопатий. Анализ данных лабораторного исследования в указанном объеме рекомендуется проводить следующим образом. Сначала оцениваются результаты тестов первой группы, характеризующих внутренний путь свертывания крови. Удлинение времени свертывания венозной крови, времени рекальцификации плазмы, каолинового времени свертывания и АПТВ, то есть нарушение первой группы тестов, прежде всего, является доказательством изменения факторов, принимающих участие во внутреннем пути активации свертывания крови, а именно: XII, XI, IX, VIII, X или V. Следует помнить, что на показателях этих тестов могут отразиться и снижение содержания фибриногена, и повышение антикоагулянтной

активности крови. Однако для того, чтобы нарушились значения тестов данной группы, степень изменений последних двух показателей должна быть существенной, что на практике встречается крайне редко. Кроме того, указанные изменения показателей фибриногена и антикоагулянтной активности крови всегда сопровождаются удлинением тромбинового времени и не наблюдаются при дефиците любого из факторов внутренней системы активации фактора Ха.

Рис.15. Алгоритм диагностики врожденных коагулопатий

Среди факторов внутреннего пути необходимо выделить две подгруппы. Одна из них - это факторы XII, XI, IX, VIII, участие которых ограничивается исключительно внутренним путем; вторая включает факторы X и V, которые являются общими и для внутреннего, и внешнего пути активации свертывания крови. Из этого следует, что для коагулопатий вследствие дефицита факторов XII, XI, IX, VIII характерным лабораторным признаком будет изолированное нарушение показателей тестов первой группы, оценивающих только внутренний путь свертывания крови. Поскольку ни один из перечисленных факторов (XII, XI, IX, VIII) не принимает участия в активации свертывания крови по внешнему пути, при недостаточности любого из них одноступенчатое протромбиновое время (вторая группа методов) всегда будет в пределах нормы, равно как и показатели тромбинового времени и концентрации фибриногена. Но показатели активности фактора XIII (фибринстабилизирующего фактора), оцениваемой по растворимости фибринового сгустка в мочевине, при этих состояниях могут быть снижены. В основном это наблюдается при гемофилии (дефиците факторов VIII, IX) и объясняется тем, что время, затрачиваемое на получение фибринового сгустка в указанном тесте (20 мин), недостаточно для полного превращения фибриногена в фибрин. В этих случаях повышенная растворимость фибринового сгустка в мочевине обусловлена не снижением активности фактора XIII, а неполноценностью сгустка фибрина вследствие коагулопатий. Иную лабораторную характеристику имеют коагулопатий из-за дефицита второй подгруппы факторов внутренней активации - X и V. Эти факторы необходимы для осуществления как внутреннего, так и внешнего пути активации свертывания крови. Поэтому при коагулопатиях, обусловленных нарушением их синтеза, наряду с патологическими показателями тестов, характеризующих внутренний путь свертывания крови, у больных выявляется и удлинение протромбинового времени (снижение протромбинового индекса), свидетельствующее о нарушении внешнего пути активации свертывания крови. Для осуществления второй группы реакций, а именно активации свертывания крови по внешнему пути, наряду с факторами X и V, требуется также присутствие фактора VII и тканевого тромбопластина. Фактор VII, в отличие от факторов X и V, не принимает участия во внутреннем пути активации коагуляции. В связи с этим у больных гипоконверти-немией (дефицит фактора VII) показатели тестов, используемых для характеристики процесса внутренней активации свертывания крови, находятся в пределах нормы, в то время как показатель, оценивающий внешний путь коагуляции (протромбиновый индекс), всегда нарушен. Изолированное удлинение протромбинового времени (снижение протромбинового индекса) характерно не только для коагулопатии вследствие нарушения синтеза фактора VII, но и для редкой формы врожденного геморрагического диатеза, обусловленной недостаточностью протромбина (фактора II). Если принять во внимание факт, что протромбин

является источником генерации тромбина как во внешнем, так и во внутреннем пути активации свертывания крови, то при его дефиците должны быть нарушены тесты, характеризующие оба пути коагуляции. Однако практически у больных с дефицитом протромбина в основном снижен только протромбиновый индекс, и лишь при выраженном его дефиците менее 5% может быть умеренное удлинение АПТВ. Нарушение третьей группы реакций, связанное с количественным или качественным дефектом синтеза фибриногена, проявляется при лабораторном исследовании изменением во всех трех группах тестов. У больных с указанной патологией удлинено время свертывания венозной крови, рекальцификации плазмы, каолиновое время, АПТВ, протромби-новое и тромбиновое время, что объясняется задержкой появления сгустка фибрина из фибриногена, единственным источником которого в этих тестах служит плазма больного. Снижена при этом или не определяется концентрация фибриногена, а также ускорена растворимость фибринового сгустка в мочевине в результате неполноценности фибриногена. Недостаточность фактора XIII не отражается ни на одном из тестов коагулограммы, поскольку этот фактор принимает участие в стабилизации фибрина уже после появления видимого сгустка на самом последнем этапе процесса свертывания крови. У больных с указанной коагуло-патией нарушение плазменно-коагуляционного звена гемостаза выявляется только с помощью специального исследования - определения способности нестабилизированного сгустка фибрина к растворению в мочевине, что отражает действие фактора XIII. Анализ вариантов сочетаний результатов описанного этапа лабораторных исследований, таким образом, позволяет выделить три группы коагулопатии, обусловленные недостаточностью факторов: 1)ХИ, XI, IX, VIII;2)X,V,I; 3) VII, II (рис.15). В дальнейшем для определения конкретного дефекта, обусловливающего коагулопатию, должны быть выполнены или специальные исследования активности отдельных факторов свертывания крови или заменно-перекрестные пробы, выполнение которых доступно для любой лаборатории (табл 10). В их основе лежит коррекция коагуляционного дефекта, выявленного у больного на этапе предварительного обследования, путем введения в исследуемую плазму одного из корригирующих компонентов, которые имеют известный набор факторов свертывания крови. Установлено, что плазма здорового человека после адсорбции сульфатом бария (ВаЗО4-плазма) содержит факторы XII, XI, VIII, V и I. Напротив, сыворотка здорового человека, полученная после свертывания крови, является источником факторов XII, XI, IX, VII и X. Если ,в результате проведенных исследований предполагалась недостаточность факторов XII, XI, IX или VIII, для которых характерно нарушение тестов, оценивающих внутренний путь, то могут быть получены следующие варианты заменно-перекрестных проб. При положительной коррекции от добавления ВаЗО4-плазмы и отсутствии таковой после до-

бавления сыворотки можно сделать вывод, что причиной коагулопатии является дефицит фактора VIII, отсутствующий в сыворотке. Если же коррекция достигнута сывороткой, но не ВаSО4-плазмой, то дефект обусловлен снижением фактора IX, который имеется в сыворотке, но отсутствует в ВаSО4-плазме. Может быть и другой исход заменно-перекрестных проб, когда коагуляционный дефект, имеющийся у больного, будет исправляться одновременно при добавлении и Ва5О4-плазмы, и сыворотки. Оба реагента содержат два общих фактора - XII и XI. Следовательно, в случае достижения указанного эффекта коррекции можно предположить дефицит фактора XII или XI. Для разграничения последних большое значение имеют анамнестические сведения. Известно, что у лиц с дефицитом фактора XII не бывает геморрагических проявлений, так называемая "гемофилия без гемофилии", в то время как недостаточность фактора XI клинически проявляется геморрагическим диатезом. Таблица 10 Диагностика коагуляционного дефекта с помощью заменно-перекрестных проб Недос таточ ность факто ра

VIII IX X VII V XI XII II* I*

Время рекальцификации или АПТВ, (Протромбиновое время для ф VII) без с корригирующим компонентом корригирующего компонента Нормальная BaSO Сыворотка

Протромбиновый индекс

4

плазма плазма (VII, IX, X, XI, (I, II, V, VII, (I, V, VIII, XII) VIII, IX, X, XI, XII) XI.XII) Удлинено " " " " " " " Не определяется

Инги Удлинено битор

Укорочено " " " " " " " "

Укорочено Удлинено " " Укорочено " " Удлинено Укорочено

Удлинено

Удлинено

Удлинено Укорочено " " Удлинено Укорочено Укорочено Удлинено Не определяется Удлинено

Не изменен Тоже Снижен Снижен Снижен Не изменен Не изменен Снижен Не определяется

*Изменения отмечаются при уменьшении содержания фактора II ниже 5 % ** Сгусток не образуется в системе, где источником фибриногена служит плазма больного, даже при добавлении тромбина. При коагулопатиях, обусловленных недостаточностью факторов X, V или I, для которых характерно нарушение тестов внутренней и внешней

системы свертывания крови, могут наблюдаться следующие варианты заменно-перекрестных проб. Первый - корригирующий эффект оказывает сыворотка (источник фактора X), в то время как добавление BaSO4-плазмы (источник факторов V и I) не сопровождается исправлением имеющегося у больного коагуляционного дефекта. Следовательно, коагулопатия обусловлена снижением активности фактора X. Второй вариант корригирующее действие оказывает Ва5О4-плазма, но не сыворотка. В этом случае причиной коагулопатии может быть дефицит как фактора V, так и фибриногена (фактора I), поскольку сыворотка данных факторов не содержит. Для дифференциации этих нарушений необходимо учитывать результаты исследования тромбинового времени и концентрации фибриногена. При недостаточности фактора V эти показатели всегда в пределах нормы, при коагулопатиях вследствие количественного или качественного нарушения синтеза фибриногена тромбиновое время значительно удлинено, а концентрация фибриногена или снижена, или вообще не определяется. Если необходимо уточнить, не обусловлена ли.коагулопатия недостаточностью фактора VII или II , то следует помнить, что этот дефект проявляется в основном снижением протромбинового индекса, то есть нарушением второй группы тестов внешней активации свертывания. Корригирующий эффект проверяется в тест системе одноступенчатого протромбинового времени. Укорочение последнего после добавления сыворотки свидетельствует о том, что коагулопатия обусловлена недостатком фактора VII, присутствующего в сыворотке. В отличие от дефицита фактора VII при недостаточности протромбина подобного корригирующего действия сыворотка не оказывает, поскольку протромбин в ней не содержится. Отсутствие коррекции при добавлении к плазме больного всех реагентов, в том числе и нормальной не адсорбированной плазмы здорового человека, является доказательством наличия в крови исследуемого больного ингибитора против фактора свертывания крови (чаще всего против фактора VIII). По такому алгоритму проводят исследование системы гемостаза для установления причины кровоточивости и дифференциации различных форм врожденных коагулопатии и тромбоцитопатий. Изложенные принципы диагностики врожденных форм патологии гемостаза являются основой и для определения приобретенных нарушений, которые в отличие от первых обычно имеют множественный комбинированный характер дефектов. Приобретенные нарушения гемостаза чаще всего наблюдаются при заболеваниях печени, почек, гемобластозах и при ДВС синдроме, осложняющем многие тяжелые виды патологии. В этих случаях должны быть проведены дополнительные исследования, направленные на оценку активности отдельных факторов свертывания крови, естественных антикоагулянтов (антитромбина III, протеинов С и S), определение маркеров тромбинемии (растворимых фибрин-мономерных комплексов, фрагментов

протромбина 1+2, фибринопептида А, комплексного соединения «тромбинантитромбин») и плазминемии (Д-димеров, комплексного соединения «плазмин-антиплазмин», продуктов деградации фибриногена). Кроме того, исследование системы гемостаза должно проводиться для контроля динамики выявленных нарушений в процессе проведения этиотропного и патогенетического лечения, а также для оценки отрицательного действия различных лекарств, которые могут существенно нарушать процессы гемостаза. Функциональное состояние системы гемостаза должно быть установлено и при изменении гемостатических процессов противоположной направленности, а именно, при повышении реактивности тромбоцитов и коагуляционного потенциала крови, что может приводить к тромбоэмболическим процессам. Однако дополнительные методы исследования гемостаза требуют дорогостоящих реактивов, специальной подготовки персонала и, как правило, проводятся в специализированных лабораториях. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Задачей любого лабораторного исследования является получение результата, максимально приближенного к истинному значению показателя в организме больного или максимально объективно отражающего состояние органов и систем. В настоящее время под контролем качества лабораторных исследований понимают совокупность планируемых и систематически проводимых мероприятий, дающих уверенность в том, что образцы биологического материала оцениваются правильно. Контроль качества включает методы и виды деятельности, направленные одновременно на управление процессом и устранение причин неудовлетворительных результатов. Анализ возможных ошибок при проведении лабораторного исследования должен основываться на знании этапов медицинского лабораторного исследования, требований Госстандарта, законах статистической оценки результатов исследований. Коагулология, как один из разделов лабораторной диагностики, подчиняется всем закономерностям и правилам оценки качества исследований, но система мер оценки качества, широко используемая в биохимических и гематологических исследованиях с 60-70 годов, пришла в коагу-лологию позже. Многие коагулологические исследования не являются результатом прямых измерений концентрации того или иного вещества, отсутствует методическая и инструментальная стандартизация многих исследований, отсутствуют (или очень дороги) контрольные материалы и т.д. Доаналитический этап Доаналитический этап лабораторного исследования начинается с

формирования у клинициста диагностической гипотезы и составления заказа на исследования. Все элементы доаналитического этапа должны быть максимально стандартизованы для предотвращения внесения субъективной ошибки в исследования. Важнейшим компонентом внелабораторной части доаналитического этапа является подготовка пациента и состояние его в момент исследования, забор, хранение и доставка в лабораторию биологического материала. Особое значение Доаналитический этап приобретает при проведении коагулологических исследований. Материалом для исследований является, как правило, венозная кровь, взятая пункцией вены у пациента натощак после 15-минутного отдыха. Пункция вены должна быть малотравматичной. Длительность венозного стаза не должна превышать 1 мин. Первая порция крови, насыщенная тканевым тромбопластином, не годится для оценки свертывающей системы, поэтому исследование проводится во второй пробирке или после слива 1,5-2,0 мл крови. Крайне нежелательно использование шприца: кровь должна поступать самотеком в пластиковую пробирку. Использование стеклянных (несиликонированных) пробирок недопустимо из-за адгезивных свойств стекла и контактной активации факторов свертывания. При невозможности пункции периферической вены забор крови может быть произведен из венозного катетера, но после тщательной предварительной промывки его физиологическим раствором и удаления 10-15 мл крови. Использование венозной крови, забранной из катетера, таит в себе опасность неадекватной оценки коагуляционного гемостаза из-за влияния гепарина, который используется для промывки катетера. Некоторые клинические ситуации (экстренные случаи, длительный лекарственный мониторинг, нежелательность или невозможность пункции периферических вен) заставляют обращаться к капиллярной крови как к материалу для исследования. В настоящее время созданы приборы, которые позволяют делать это с максимальной объективностью, экономно расходуют реагенты и проводят исследование в минимальном количестве крови. Такие коагулометры разработаны для исследования ПВ и АПТВ, в них используются специальные мембранные фильтры для отделения бестромбоцитарной плазмы. В амбулаторных условиях часто применяется ручной метод определения ПВ из капиллярной крови. Эта методика пригодна лишь для скрининговой оценки состояния гемостаза у пациентов с соматической патологией, но результаты такого исследования могут вводить клинициста в заблуждение при контроле за терапией оральными антикоагулянтами. Время с момента взятия крови до начала работы с ней должно быть сокращено до минимума, т.к. основные коагулологические исследования должны быть проведены в первые 2 часа ввиду неустойчивости факторов свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем, тромбоцитов в условиях in vitro. Важным элементом для правильной организации доаналитического

этапа является правильный подбор и использование стабилизатора. Основным стабилизатором в настоящее время признан 3,8% раствор цитрата натрия. Соотношение стабилизатора и крови должно зависеть от гематокрита и может быть рассчитано по таблице (табл.11). Таблица 11 Соотношение объема стабилизатора и венозной крови, взятой для исследования коагулологических показателей, в зависимости от гематокрита. Гематокрит, % 20-21 22-27 28-33 34-39 40-45 46-51 52-57 58-61 62-65

Объем стабилизатора, мл Объем крови вместе со стабилизатором, мл 1,4 10,0 .1,3 10,0 1,2 10,0 1,1 10,0 1,0 10,0 0,9 10,0 0,8 10,0 0,7 10,0 0,6 10,0

Цитрат натрия предотвращает свертывание, связывая плазменный кальций. В пробах с нормальным гематокритом половины взятого цитрата достаточно для блокирования процесса свертывания. Высокий гематокрит (малое количество плазмы) делает то же количество добавленного цитрата избыточным, нарушает соотношение цитрата и реактивов, используемых для рекальцификации при проведении исследований. С целью устранения этих проблем в пробах с высоким гематокритом возможно применение цитрата натрия меньшей концентрации - 3,2%. Так, например, фирмы, выпускающие реагенты для исследования ПВ, позволяют использовать для стабилизации крови цитрат натрия обеих концентраций. Описанные выше моменты относятся к той части доаналитического этапа, которая лежит вне стен лаборатории, однако это не снимает ответственности за его проведение с сотрудников лаборатории. Только постоянная разъяснительная работа среди лечащих врачей и совместный с ними контроль за работой процедурных сестер позволит добиться успеха и снизить до минимума влияние ошибок на доаналитическом этапе на результат исследования. Центрифугирование пробы, доставленной в лабораторию, имеет не менее важное значение, чем ее забор. Обязателен учет величины плеча используемой центрифуги и количества оборотов для расчета кратности ускорения - д. Для получения бестромбоцитарной плазмы используется ускорение 1000-1200 д, для плазмы, богатой тромбоцитами - 300 д. Желательно центрифугирование проб крови объемом по 5 мл. Это позволяет

получить адекватное отделение фракций. При безотлагательном проведении исследования перенос полученной плазмы в другую пробирку не обязателен, но возможен. Очень важно четко соблюдать методические указания и правила нормативно-технической документации по использованию богатой тромбоцитами и бестромбоцитарной плазмы при проведении тех или иных исследований. Правила работы с оборудованием, используемым для проведения коагулологических исследований, идентичны таковым для любых лабораторных работ. Все используемое оборудование, в том числе коагулометры, пипетки и дозаторы, должно соответствовать требованиям Госстандарта и быть поверенным не менее чем за 12 месяцев до применения. Если используются ручные методы исследования, это относится также к температурному режиму водяной бани (наличие контрольного термометра), секундомерам, весам. Ежедневно должен контролироваться и фиксироваться температурный режим холодильника, в котором хранятся реактивы. Проведение плановых поверок, ремонта и профилактики оборудования должно быть указано в соответствующих журналах и сертификатах. Аналитический этап исследования Обеспечение контроля качества исследований на аналитическом этапе исследования основывается на проведении мероприятий по внутрилабораторному контролю качества. Систематический контроль качества считается не только обязательным условием для аккредитации лаборатории, но и показателем профессиональной культуры и ответственности сотрудников. Практика показывает, что до 70% причин ошибок связано с недостаточно ответственным отношением специалистов к своей работе и только 30% - с низкой профессиональной подготовкой или недостаточным материально-техническим обеспечением. Ошибка врача в лаборатории имеет высокую цену - 7,5% лабораторных ошибок влекут за собой реальные опасности для пациентов. Врач клинической лабораторной диагностики всегда должен иметь возможность отстоять свое мнение, быть уверенным в результатах исследований, обезопасить больного от возможных последствий неправильно проведенного анализа. Внутрилабораторный контроль качества коагулологических исследований подчиняется тем же законам и проводится теми же методами, что и контроль любых лабораторных исследований (биохимических, гематологических и т.д.). Деятельность лабораторий в этой области регламентирована Приказом Минздрава РФ № 295 от 21.12.93 г. «Об утверждении положения об аккредитации клинико-диагностических лабораторий». К одним из основных критериев оценки деятельности лабораторий в этом приказе отнесены вопросы контроля качества: П.2.5. Наличие в лаборатории калибровочных и контрольных материалов, разрешенных Минздравом РФ к применению в здравоохранении. П.2.9. Наличие в лаборатории регулярного внутрилабораторного

контроля качества лабораторных исследований. П. 10. Участие во внешнем (межлабораторном) контроле качества, осуществляемом на федеральном и региональном уровне. Общие подходы к внутрилабораторному контролю качества и терминология Критерием качества служит погрешность измерения или исследования. Чем меньше погрешность, тем выше качество исследований. Различают систематическую, случайную и общую погрешность. Последняя включает в себя случайную и систематическую погрешности. Систематическая погрешность характеризует правильность исследования. Случайная погрешность характеризует воспроизводимость исследования. Общая погрешность определяется в том случае, когда невозможно точно дифференцировать систематическую и случайную погрешности. Это имеет место при малом числе исследований, например, при межлабораторном контроле качества. Точность измерений - качество измерений, отражающее близость их результатов к истинному значению измеряемой величины, при котором малы все виды погрешностей, как систематические и случайные (правильность и воспроизводимость близки к идеальным). Правильность - качество измерений, отражающее близость к нулю систематических погрешностей в их результатах, то есть соответствие среднего значения результатов измерений с истинной величиной измеряемого параметра. Причиной отклонения от правильного результата может быть один и тот же фактор, который называют систематической ошибкой. Сходимость - качество измерений, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполненных в одинаковых условиях. Воспроизводимость - качество измерений, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполненных в разных условиях. Различают воспроизводимость в серии (сходимость), во времени (день ото дня) и межлабораторную воспроизводимость. Причин плохой воспроизводимости больше, чем плохой сходимости, но в том и другом случае их может быть несколько, а все вместе их определяют термином случайная ошибка. Критерии качественного измерения для многих видов деятельности определены ГОСТ 16263-70 «Государственная система обеспечения единства измерений. Метрология. Термины и определения». Статистический анализ вероятных ошибок часто иллюстрируют на хорошо известном примере мишени._При многократной стрельбе по мишени (повторные лабораторные исследование одного и того же биологического материала) могут иметь место следующие варианты:

Мишень с указанием цели (правильного значения).

Правильная стрельба – попадание близко к цели, в область «десятки» - хорошая воспроизводимость и хорошая правильность.

Все стрелы попали близко друг к другу, но не достигли цели – плохая правильность стрельбы при хорошей воспроизводимости.

Стрелы летели в правильном направлении, но при этом попадали в разные части мишени. Такая ситуация характеризуется плохой сходимостью / воспроизводимостью при достаточной правильности. Стрелы вообще не попали в мишень. Такие, так называемые грубые, ошибки нельзя полностью исключить, но, используя соответствующие организационные меры, можно попытаться свести их к минимуму.

Главными аналитическими характеристиками лабораторного исследования являются воспроизводимость и правильность. По рекомендации Международной федерации клинической химии (IFCC) воспроизводимость выражается в виде стандартного отклонения или коэффициента ариации результатов повторных измерений одной и той же пробы, а правильность - в виде разности между средним значением серии повторных измерений и истинным значением. Статистические характеристики случайных величин оцениваются в рамках так называемого нормального распределения. Нормальное распределение характеризуется тем, что 68,26 % всех значений случайной

величины сосредоточено в пределах ± 1 σ (одного стандартного отклонения), 95,44 % всех значений - в пределах ± 2 σ, а 99,72 % случайных значений - в пределах ± 3 σ. Для оценки качества лабораторных исследований чаще всего рассчитываются следующие общепринятые статистические показатели: 1. среднее арифметическое значение в серии однотипных исследований (вариационный ряд); 2. стандартное или среднее квадратичное отклонение (σ - "сигма", SD, стандартная девиация, дисперсия); характеризует степень варьирования вариационного ряда; 3. коэффициент вариации (V или CV, %). Коэффициент вариации отражает воспроизводимость в относительном значении (процентах). Его легко можно использовать для характеристики и сравнения различных лабораторных показателей. Чем меньше коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость и сходимость результатов. Коэффициент вариации, характеризующий сходимость, всегда меньше, чем коэффициент вариации, характеризующий воспроизводимость изо дня в день. Допустимые пределы аналитической вариации для различных лабораторных исследований приведены в Приказе МЗ СССР № 545 от 23.04.85 г. в соответствии с Compendium metodorum in laboratories diagnostics CMLD-A-9.2. 4. допустимый предел ошибки (ДПО, %). При оценке результатов лабораторных исследований встает задача не только сравнить разные методы (способы, подходы и т.д.), но и сопоставить получаемые результаты с возможными биологическими вариациями. Допустимая ошибка связана с тем диапазоном, который свойственен исследуемой величине здоровых людей. Вопрос о медицинских допустимых пределах ошибок является сложным и окончательно нерешенным. При установлении ДПО необходимо ориентироваться на референтные величины. Однако эти величины определены не для всех компонентов, они зависят от многих факторов, в том числе от уровня лабораторной оснащенности и метода, использованного при определении данного показателя. Таблица 12 Допустимые пределы погрешности (коэффициента вариации, %) при проведении контроля качества коагулологических исследований (по Киселевскому Ю. С соавт., 1997) Уровень контроля ПВ АПТВ Фибриноген Внутрилабораторный - одновременная серия - неодновременная серия Внелабораторный

<2 <4

<3 <5

<5 <7

- региональный - межрегиональный

<5 <6

<5 <6

<8 <10

Указанные статистические параметры могут быть рассчитаны при наличии в лаборатории контрольного материала - плазмы с заранее известными значениями того или иного показателя свертывающей системы. Контроль качества по контрольным материалам является наиболее простым и надежным способом обеспечения качества выполняемых исследований. При использовании контрольных материалов контролируются все звенья технологической цепочки - лабораторная посуда, реактивы, погрешность дозирования, измерения и т.д. Современные калибровочные и контрольные материалы, используемые в коагулологии, готовятся высокотехнологическими промышленными методами на основе человеческой цитратной плазмы, полученной из крови большого количества доноров. Такой подход к приготовлению материала позволяет нивелировать индивидуальные особенности системы гемостаза и считать их референтными контрольными материалами. Выпускаются контрольные и калибровочные плазмы в лиофилизированной форме, имеют большой срок хранения и обрабатываются после растворения как обычные пробы. Могут применяться как для автоматических, так и для мануальных методов. Несмотря на тщательный контроль за донорами, кровь которых использована, работать с контрольными материалами необходимо с теми же предосторожностями от заражения СПИДом и гепатитом, как и при любой биологической пробе, т.к. ни один метод лабораторного контроля инфицированности не дает в настоящее время 100% гарантии. Калибровочные растворы и контрольные плазмы не являются синонимами и используются для различных целей. Калибровочные растворы используются для построения калибровочных графиков при мануальных исследованиях и для калибровки аппаратов при автоматических методах. В последнем случае паспортные данные калибраторов вводятся в коагулометр в режиме калибровки, что обеспечивает высокую точность последующих измерений, а также возможность устранять существующую погрешность, если калибровочный коэффициент выходит за допустимые пределы отклонений. Существуют калибровочные плазмы для определения активности протромбинового комплекса по Quick, фибриногена, факторов свертывания, калибровочная плазма для колориметрических методов (AT III, протеин С), калибровочная плазма для определения концентрации нефракционированного и низкомолекулярного гепарина и др. Референтное значение показателя устанавливается для каждого лота калибровочной плазмы. Аттестованные коммерческие контрольные материалы (контрольная плазма), применяемые в коагулологии, могут быть двух видов – нормальная и патологическая. Перечень показателей, которые могут быть оценены по контрольной референтной плазме, отличается в зависимости от технологии ее производства, характера тестирования, лота. Наиболее распространенные показатели референтных величин для нормальной плазмы: ПВ, АПТВ, ТВ, фибриноген, факторы свертывания, антитромбин III, протеины С и S,

плазминоген, а2-антиплазмин. Патологические контрольные плазмы характеризуются разными уровнями активности факторов свертывания и, следовательно, разными коагулологическими показателями. Кроме вышеперечисленных контрольных материалов используются и специальная контрольная плазма для мониторинга антикоагулянтной терапии (исследуются ПВ или АПТВ). Требуемая точность для такого рода контрольного материала - до ± 3-5%. Аттестованные контрольные материалы наиболее дорогие. За рубежом аттестация проводится в референтных лабораториях, по результатам исследований материал получает паспорт с указанием значений исследуемых параметров, перечнем методов и наборов реактивов. Многие фирмы-изготовители предупреждают о необходимости использования реагентов той же фирмы. Это объясняется тем, что в отличие от свежих проб пациентов, коммерческие контрольные материалы содержат различные искусственные добавки (стабилизаторы, активаторы, консерванты), которые могут влиять на результат исследования. Помимо нормальной и патологической контрольной плазмы в целом ряде случаев в коагулологии используется неаттестованный контрольный материал. Для таких материалов известен лишь их грубый диапазон (норма, патология). Примером могут служить сливные плазмы или сыворотки, которые могут готовиться в самой лаборатории и использоваться для контроля воспроизводимости. Положительным моментом в использовании сливного материала является то, что он абсолютно идентичен пробам пациента, имеет очень низкую стоимость, прозрачен, не имеет ошибки разведения. Однако сливные плазмы не могут быть использованы для контроля на правильность, имеют ограниченную стабильность и высокую опасность инфицирования. Трудно иметь сразу большую партию сливной плазмы. Проведение внутрилабораторного контроля качества Система внутрилабораторного контроля качества позволяет эффективно выявлять ошибки, связанные с такими варьирующими факторами, как реагенты, в том числе организация в лаборатории «домашних реактивов», калибраторы, расходные материалы, обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы. Считается, что такие факторы как правильность калибровки, выбранный аналитический принцип, качество закупаемых реагентов и приборов, соблюдение времени и температуры реакции, точность пипетирования реагентов и проб, частота проведения калибровок эффективнее контролируются извне. Принцип проведения внутреннего контроля состоит в следующем: с выбранной периодичностью проводят исследования одного и того же контрольного материала по оцениваемой методике, а результаты этих измерений заносят на контрольную карту. Наиболее распространенным является использование контрольной карты Shewhart. Принцип построения

контрольной карты, предложенной в 50-ые годы, основан на теории вероятности, и предполагает, что при последовательном проведении исследований на одном и том же материале 1. примерно 5% результатов (или каждый 20-ый результат) может быть за пределами горизонтальных линий, отсекающих ±2 стандартных девиации, 2. результаты должны достаточно равномерно распределяться по обе стороны от линии среднего значения и примерно 2/3 результатов должны лежать в пределах ±1 стандартная девиация, 3. результаты за пределами ±3 стандартных девиаций должны быть редкими и не превышать 0,25% от общего количества результатов (не чаще, чем каждый 333-ый результат). Для построения контрольной карты Shewhart необходимо многократное (чаще всего на протяжении 20 дней в серии ежедневных исследований по данной методике) исследование контрольного материала. Из результатов рассчитывают среднюю арифметическую (Хср) и стандартное отклонение (a, SD), на основании которых вычисляют контрольные пределы и строят карту контроля качества, где проводят несколько горизонтальных линий соответственно вычисленному среднему, двум и трем стандартным отклонениям. При каждом последующем исследовании данного контрольного материала наносят его значение на контрольную карту, имея в виду, что по оси абсцисс откладываются дни исследования, а по оси ординат - результат исследования (рис.16). Для каждого уровня контрольного материала (норма/патология) и для каждого теста строится своя контрольная карта.

Рис.16. Контрольная карта Shewhartdnn фибриногена (гравиметрический метод), построенная на основании Хср = 3,09 г/л, п=40,а = 0,30 г/л, CV = 9,7% и заполненная далее в течение 8 дней. Удобно вести для каждого теста две контрольные карты на одной странице для двух уровней контрольного материала (норма/патология). При нанесении двух дополнительных линий, ограничивающие предел ±1 о от средней величины, мы получаем модификацию карты, которая называется контрольной картой Westgard. При использовании аттестованного коммерческого контрольного материала для построения контрольной карты можно сразу, не дожидаясь накопления серии до n > 20, оценивать результаты. В этом случае, так называемое, должное значение для используемой модификации метода, указанное в инструкции к контрольному материалу, следует принять за

среднюю арифметическую (Хср), доверительный предел - за предел Хср ± 1 о и самостоятельно рассчитать два других предела (Хср ± 2 а и Хср ± 3 о), необходимых для построения контрольной карты. Важно помнить, что модификация используемого метода должна соответствовать паспортным данным контрольного материала и что наилучшего результата можно достичь, используя реагенты и контрольную плазму или сыворотку одной и той же фирмы. После набора собственных данных из 20-30 значений необходимо рассчитать на их основе собственное среднее значение и сравнить его с аттестованным (паспортным). Среднее значение не должно отклоняться от аттестованного более чем на половину допустимого значения σ. К сожалению, часто (особенно в коалулологии) лаборатории не имеют постоянного коммерческого аттестованного материала или пользуются модификацией метода, неописанного в инструкции к имеющемуся контрольному материалу. В таком случае могут быть использованы сливные контрольные плазмы или неисследованный коммерческий контрольный материал для построения контрольной карты Shewhart. Для анализа сливного или неисследованного контрольного материала рекомендуется для каждого метода и каждого уровня контрольного материала (норма/патология) предприйять следующие действия: - разлить материал по аликвотам и заморозить при -20°С или ниже; - провести единую серию измерений (n = 20-30), включая исследования в ежедневную серию измерений; - по полученным результатам рассчитать среднее арифметическое значение (Хср) , стандартное отклонение (а) и коэффициент вариации (CV, %), - сильно отклоняющиеся от среднего значения результаты (выбросы) могут сдвинуть среднее значение и увеличить стандартное отклонение. Поэтому, если после проведения расчета выясняется, что какой-либо результат отклоняется от Хср более чем на 3 а, он должен быть исключен из расчета. После этого Хср, а и CV должны быть пересчитаны заново. Однако таких результатов должно быть не более одного. - рассчитанный CV надо сравнить с допустимым для данного параметра. Если рассчитанный CV больше, то необходимо исследовать причины плохой воспроизводимости и устранить их. Полученные окончательно величины могут служить основанием для построения контрольной карты по данному конкретному контрольному материалу: Хср ± 2а и Хср ± 3а. Далее можно работать с данным контрольным материалом и данной модификацией метода, следуя всем правилам оценки результатов измерения контрольных проб. Описанным способом можно приготовить сливные бестромбоцитарные плазмы для коагулологических исследований. Оценка контрольных карт. Построение контрольной карты выявляет погрешности в воспроизводимости и правильности исследования. Если воспроизводимость и правильность проводимых измерений стабильны и

удовлетворительны, то все следующие результаты измерения контрольного материала должны подчиняться некоторым правилам, которые являются следствиями закона нормального распределения. Получаемые результаты должны приблизительно поровну располагаться по обе стороны от среднего значения, не должны непрерывно возрастать или убывать и не должны сильно отклоняться от среднего значения. Распространенным принципом оценки контрольных карт являются правила Westgard, которые используются для оценки типа ошибки - случайная или систематическая (табл.13). Следует помнить, что правила, выявляющие систематическую ошибку, реагируют на случайную ошибку, и наоборот. Таблица 13 Правила Westgard для оценки результатов внутреннего контроля качества с использованием контрольных карт (печатается по Долгову В.В. с соавт.) Критерий и его описание Тип ошибки I2SD один результат в серии вышел за предел Хср ± 2 а 13SD - один результат в серии вышел за предел Хср ± 3 а случайная R4SD - разница между двумя измерениями в серии случайная превышает 4 а 22SD - два последовательных измерения в серии вышли систематическая за предел Хср + 2 а или Хср - 2 а. 4lSD - четыре последовательных измерения в серии систематическая вышли за предел Хср + 1 а бли Хср - 1 а. 10Х - десять последовательных измерений лежат по систематическая одну сторону от средней линии (Хср). Может применяться самостоятельно ! Критерий I2SD - сигнал для применения других критериев! В приведенной нами контрольной карте (рис.16) активен критерий 13so - необходимо искать случайную или систематическую ошибку. Другой способ оценки контрольных карт - применение критериев Buttner. 1. Предупредительные критерии: 6 результатов подряд находятся по одну сторону от линии среднего арифметического значения 3 результата подряд находятся вне пределов Хср ± 1 а 1 результат находится вне пределов Хср ± 2 а 2. Контрольные критерии: 8 результатов подряд отклоняются по одну сторону от среднего арифметического значения 4-5 результатов подряд находятся вне пределов Хср ± 1 а 3 результата

находится за пределами Хср ±2 a 1 результат находится за пределами Хср ± 3 а При появлении результатов, соответствующих предупредительным критериям ответ анализа можно выдать на отделение, но необходимо тщательно проанализировать все этапы работы: калибровочные растворы, работу измерительных приборов, расчеты и т.д. При появлении результатов, соответствующих контрольным критериям, анализы задерживаются и принимаются меры для выявления и исключения ошибок. Карты Shewhart - не единственный, но наиболее часто используемый наглядный вариант оценки работы лаборатории по проведению внутрилабораторного контроля качества. * Кроме представленных выше способов проведения внутреннего контроля качества существуют другие варианты оценки исследований без использования контрольного материала. Однако они имеют право на жизнь только как дополнительные и проводятся в лабораториях, где один и тот же параметр исследуется в большой серии (например, определение протромбинового времени в условиях крупной поликлиники или стационара с однородным контингентом обследуемых). Необходимо помнить, что по современным представлениям адекватной системой оценки может быть только система, использующая контрольные материалы. Карта по ежедневным средним (контроль правильности). Для некоторых коагулологических исследований в качестве дополнительного можно рекомендовать контроль по ежедневным средним, в котором используются результаты исследования образцов пациентов. Преимуществами этого метода является то, что он, с одной стороны, не требует специального контрольного материала, с другой стороны, позволяет выявлять ошибки не только на аналитическом этапе, но и некоторые ошибки, возникающие на преаналитическом этапе (например, связанные с взятием или предварительной обработкой проб пациентов). Однако прежде, чем приступить к ведению карт по ежедневным средним, нужно учесть следующее: Обследуемый изо дня в день контингент должен быть достаточно однородным (т.е. не должно быть сильных количественных и качественных изменений обследуемых лиц). 1. Если в лаборатории в определенные дни происходит смена обследуемого контингента, то средние значения по этим дням в расчет принимать не следует. 3. Если усреднять все полученные значения, то даже один сильно патологический результат может существенно изменить среднее значение. Поэтому в расчет должны приниматься только те значения, которые укладываются в определенные пределы (диапазон усреднения). 4. Пределы усреднения могут быть установлены достаточно произвольно. Как правило, рекомендуется использовать нормальный диапазон или брать шире его в 1,2 - 2,0 раза. 5. Диапазон усреднения не должен быть слишком узким, так как это снижает чувствительность данного метода контроля к выявлению ошибок, но

и не должен быть слишком широким, так как при этом будет большой разброс средних изо дня в день. 6. Минимальное количество усредняемых ежедневно результатов должно быть не менее 15, лучше 50 - 70, это зависит от теста и от нагрузки в лаборатории. 7. Большая часть пациентов должна иметь результаты в области усреднения. Не имеет смысл вести контроль качества по ежедневным средним, если результаты данного теста значительно отклоняются от средней величины. 8. Необходимо обрабатывать достаточно большие массивы данных. Ручной расчет очень трудоемок, желательно проводить автоматизированный контроль. Карты по ежедневным средним анализируются по тем же правилам, что и карты по контрольным материалам. Для построения карт по ежедневным средним (карты аналогичные картам Shewhart ) необходимо выполнить следующие действия: 1. В течение 20 дней ежедневно рассчитывать среднее по результатам пациентов, попавших в диапазон усреднения; 2. По этим значениям рассчитать среднюю, дисперсию и коэффициент вариации; 3. Если рассчитанный коэффициент вариации (CV) существенно больше, чем CV, получаемый изо дня в день по контрольным материалам, значит количество усредняемых в день результатов пациентов недостаточно и требуется увеличение количества усредняемых результатов, иначе ведение карты по ежедневным средним теряет смысл. Карта по дубликатам (контроль воспроизводимости) может применяться в лабораториях, где какой-либо компонент исследуется в большой серии (более 30 проб). В таком случае рекомендуется включать исследование проб одного и того же пациента, как с нормальными, так и с патологическими уровнями содержания исследуемого компонента, в каждую серию и через 20-30 проб в длинной серии. Рассмотрим вариант построения такой карты для оценки ПВ в лаборатории, которая ежедневно обрабатывает 40-60 проб. Для построения карты по дубликатам необходимо выполнить действия в два этапа: 1. Измерить ежедневно дважды ПВ в пробе одного пациента с интервалом не более 20 мин.(чтобы избежать изменения активности протромбинового комплекса во времени). Такие ежедневные исследования пробы в дубликатах необходимо провести не менее 10-20 раз. По полученным результатам вычисляется стандартное отклонение (б) и коэффициент вариации (CV). Рассчитанный CV сравнивается с допустимым CV для данного параметра. Если рассчитанный CV больше, то необходимо исследовать причину плохой воспроизводимости и устранить ее. 2. За каждый день рассчитать разность между полученными в этот день результатами измерения дубликатов контрольного материала (разность берется по модулю, т.е. без знака). По полученным ежедневным разностям

нужно рассчитать среднюю,, разность между дубликатами за период наблюдения, а на ее основании - предупредительную и контрольную границы с использованием коэффициентов: при проведении ежедневно двух исследований в серии предупредительной границей будет средняя разность, умноженная на 2,45, а контрольной границей - на 3,22. Предупредительная и контрольная границы параллельны оси X. Ось X соответствует нулевой разнице. Так, если средняя разность в дубликатах 20 пар исследований ПВ составила 0,8 сек., то предупредительная границы будет соответствовать 1,96 сек., а контрольная граница -2,58 сек. Ежедневные значения разницы между дубликатами (также по модулю) наносятся на эту карту (рис.17). Чем меньше различия в дубликатах (парах исследований), тем уже контрольные и предупредительные границы и «жестче» требования к последующим измерениям.

Рис. 17. Карта по дубликатам для ПВ, определенного на коагулометре. Правила интерпретации карты по дубликатам: «Строгие» правила: - Ни одна из разностей не должна выходить за контрольную границу. Две разности подряд не должны выходить за предупредительную границу Предупредительные правила: Две разности из последовательных 20 не должна выходить за предупредительную границу. Три-четыре разности подряд не должны лежать вблизи предупредительной границы. Карты по дубликатам позволяют обнаружить изменение воспроизводимости в течение дня. Желательно одновременное ведение карты Shewhart «по средним» для контроля правильности и воспроизводимости. Приведенные выше способы могут быть использованы в лаборатории коагулологии при проведении ручных методов исследования или использовании наиболее простых моделей коагулометров, являющихся приборами, которые лишь фиксируют время образования фибринового сгустка. Автоматические и полуавтоматические анализаторы имеют индивидуальные встроенные программы контроля качества и проведение исследования без обеспечения действия этих программ невозможно. Трудности внутрилабораторного контроля качества коагулологических исследований состоят в том, что в условиях отсутствия аттестованного

контрольного материала сложно проводить другие виды контроля из-за нестабильности во времени компонентов свертывающей системы в сливной плазме, осутствия во многих лабораториях достаточного количества проб (за исключением повсеместно исследуемого ПВ), особенно с патологическими значениями. Не уточнены данные о коэффициенте вариации для многих методик, оценка компонентов свертывающей системы остается качественной или косвенной. Наиболее четко поддающимися внутрилабораторному контролю параметрами являются показатели, основанные на определении времени образования фибринового сгустка: ПВ, АПТВ, тромбиновое время, фибриноген по методу Клаусса, а так же - число тромбоцитов. Эти исследования составляют основу и действующих в настоящее время систем внешней оценки качества как у нас в стране, так и за рубежом. Внешний контроль качества Внешний контроль качества - это система объективной оценки результатов исследований в лаборатории, осуществленная внешней организацией с целью обеспечения сравнимости результатов, получаемых в разных лабораториях (6). В отличие от внутреннего контроля, который организует и проводит ежедневно сама лабораториям который выявляет в основном случайную ошибку, внешний контроль проводится периодически сторонней организацией и направлен на выявление ошибки систематической. Принципиально система внешнего контроля может быть построена по двум принципам: либо искомое значение («цель») устанавливается референтным методом в референтной лаборатории, либо искомое значение рассчитывается на основании статистической обработки результатов, полученных от участвующих в исследовании лабораторий. Федеральная система внешней оценки качества (ФСВОК), работая по последнему принципу, включает в оценку количественное определение фибриногена, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. В качестве контрольных образцов используются лиофилизированные образцы плазмы крови человека с нормальным и патологическим уровнями измеряемых показателей производства НИИ гематологии и переливания крови (г.Вятка) и ТОО "Технология" (г.Барнаул). Проводится три цикла ежегодно. Результаты измерений, информация об использованных методах анализа, значения протромбинового времени и АПТВ в нормальной плазме, используемое в лаборатории для расчета значений их индексов, вписываются в соответствующие формы. С целью представления результатов лабораторий в соизмеримых единицах значения протромбинового времени и АПТВ пересчитываются в соответствующие индексы. Ниже приведены примеры представления результатов оценки качества исследования ПВ и АПТВ в лаборатории Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им.акад.И.П.Павлова.

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ КОАГУЛОЛОГИЯ Цикл 3-98 Лаборатория: 00057 С-Петербургский мед.университет им.Павлова, центральная КДЛ Определяемый показатель: ИНДЕКС АПТВ ОЦЕНКА ПРАВИЛЬНОСТИ (гистограммы средних значений):

ОЦЕНКА размаха):

ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

(гистограммы

относительного

РЕЗУЛЬТАТЫ ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА Код пула

К09

Ваше среднее значение, усл. ед. 1.08 Референтное значение (среднее по Вашему методу) 1.03 Ваше смещение, % +4.7 Диапазон допустимых значений (P3±1.64s в 0.85-1.24 лог.шкале) Число лабораторий с Вашим методом 121 Коэффициент межлабораторной вариации, % 11.45 Среднее всех лабораторий, усл. ед. 1.03 Число всех лабораторий 179 Коэффициент межлабораторной вариации, % 10.66 Ваш относительный размах, % 0.00 Допустимый относительный размах, % 7.47

L09 1.84 1.71 +7.2 1.33-2.21 122 15.54 1.72 178 15.97 1.36 5.12

Средний относительный размах по Вашему методу, % 3.04 Средний относительный размах всех лабораторий, % 2.90

2.08 2.10

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ КОАГУЛОЛОГИЯ Цикл 3-98 Лаборатория: 00057 С-Петербургский мед.университет им.Павлова, центральная КДЛ Определяемый показатель: ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС ОЦЕНКА правильности (гистограммы средних значений) ОЦЕНКА ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ (гистограммы относительного размаха):

РЕЗУЛЬТАТЫ ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА Код пула

К09

Ваше среднее значение, усл. ед. 1.05 Референтное значение (среднее по Вашему методу) 1.08 Ваше смещение, % -2.4 Диапазон допустимых значений (Р3±1 .64s в 0.89-1.31 лог.шкале) Число лабораторий с Вашим методом -347 Коэффициент межлабораторной вариации, % 12.04 Среднее всех лабораторий, усл. ед. 1.06 Число всех лабораторий 517 Коэффициент межлабораторной вариации, % 12.41 Ваш относительный размах, % 3.39

L09 1.96 1.87 +4.8 1 .39-2.54 338 18.42 1.86 503 17.46 0.00

Допустимый относительный размах, %

7.62

6.83

Средний относительный размах по Вашему методу, % Средний относительный размах всех лабораторий, %

3.10

2.77

3.35

2.73

Оценка правильности исследования проводится на основании сравнения среднего из двух измерений лаборатории с диапазоном допустимых значений, который определяется как +/- 1,64 стандартных отклонения от среднего значения в группе лабораторий с одинаковым методом анализа, рассчитанного после отброса крайних значений. Количественное выражение этого сравнения - смещение, %. Оценка воспроизводимости производится на основании расчета относительного размаха от нуля до значения, отделяющего 5% лабораторий данной группы с наибольшими значениями размаха. В приведенном примере имеют место удовлетворительные показатели как правильности, так и воспроизводимости, что говорит об отсутствии в лаборатории на момент оценки систематической ошибки, но не застраховывает от ошибки случайной. Постаналитический этап Особенно ответственным и сложным в проведении исследований свертывающей системы является постаналитический этап - этап интерпретации полученных результатов. Оценка результатов отдельных исследований должна проводиться клиницистом на основании конкретного результата у пациента и обязательно в сравнении с референтными значениями для данной лаборатории - по нормальной референтной плазме или пулу донорской плазмы, которые оцениваются каждый раз одновременно с плазмой больного. Комплексная оценка коагулограммы в целом - задача, решить которую можно только совместными усилиями специалиста по клинической лабораторной диагностике и лечащего врача на основе анамнеза, клинических данных и правильно выполненных исследований. Таким образом, система контроля качества в лаборатории коагулологических исследований должна рассматриваться как комплекс мер, включающих в себя контроль за проведением доаналитического этапа, состоянием оборудования и реагентов, применение правил внутрилабораторного контроля качества к максимальному числу методов, профессионально грамотную оценку результатов исследований. Используемый вид контрольных карт зависит от метода, контрольного материала, способа регистрации результатов (ручной, коагулометр). Необходимо помнить, что определение источника ошибок для конкретного исследования в условиях конкретной лаборатории - задача, которая может быть решена только внутри лаборатории на основании тщательного анализа всех звеньев лабораторного диагностического процесса.

СОДЕРЖАНИЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАЗА....................................................................... 2 Тромбоцитарное звено гемостаза (А.С.Шитикова)................................. 2 Плазменно-коагуляционное звено гемостаза (Л.П.Папаян)..................10 Внутренний и внешний пути свертывания крови..............................10 Физиологические антикоагулянты и регуляция свертывания крови (Л.П.Папаян, О.Г.Головина)................................15 Роль эндотелия в тромбогенности и тромборезистентности сосудов (Н.Н.Петрищев)...............................20 Эндотелий, адгезия и агрегация тромбоцитов................................22 Прокоагулянтная и антикоагулянтная активность эндотелия...................................................................................................24 Эндотелий и фибринолиз........................................................................25 Гемодинамические факторы и секреция тромборегуляторов.................................................................................26 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА.....................29 Исследование плазменного звена гемостаза (Л.П.Папаян)...................29 Тесты, характеризующие «внутренний» путь свертывания крови...................................................................................29 Тест, характеризующий «внешний» путь свертывания крови...................................................................................31 Тесты, характеризующие общий (конечный) путь свертывания крови...................................................................................33 Определение содержания фибриногена.................................................33 Исследование тромбоцитарного звена гемостаза..................................36 Определение числа тромбоцитов (А.С.Шитикова)...........................36 Методы определения длительности кровотечения (А.С.Шитикова)..........................................................................................37 Исследование адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов при контакте с поверхностью кожной ранки (ретенционный тест in vivo) (А.С.Шитикова).........................40 Исследование агрегационной активности тромбоцитов (А.С.Шитикова)........41 Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов (А.С.Шитикова)....49 Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови (В.И Иванов).......................................53 Определение адгезии кровяных пластинок (В.И Иванов.)................58 Метод малоуглового светорассеяния для оценки состояния тромбоцитов (И.В. Миндукшев)........................................60 Методы исследования ретрактильной активности тромбоцитов (А.С.Шитикова)........................................63 Маркеры дисфункции эндотелия...........................................................69 Содержание фактора Виллебранда в плазме (О.Г.Головина).....69 Определение эндотелиоцитов в крови (М.С Зайнулина.).................72

АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА........................................................................................................74 Алгоритм диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза (А.С.Шитикова)..............................78 Алгоритм диагностики нарушений плазменно-коагуляционного звена гемостаза (Л.П.Папаян)................................................................................84 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА (В.Л.Эмануэль, Т.В.Вавилова)...93 Доаналитический этап............................................................................93 Аналитический этап исследования.......................................................96 Общие подходы к внутрилабораторному контролю качества и терминология.......................................................................97 Проведение внутрилабораторного контроля качества...............103 Внешний контроль качества...............................................................110 Постаналитический этап....................................................................115

Реагенты для оценки гемостаза • ФИРМА "ТЕХНОЛОГИЯ-СТАНДАРТ" (Барнаул, Россия) специализируется на изготовлении и поставке реагентов и наборов для оценки системы гемостаза. Постоянно в ассортименте более 30 наименований продукции собственного производства для работы на коагулометрах и агреаометрах, а также для мануального выполнения анализов. Преимуществом наших наборов и реагентов является: => наиболее широкий в России спектр продукции для оценки патологии гемостаза; о наиболее конкурентоспособные цены при высоком качестве продукции; возможность использования любого набора на протяжении длительного срока; => возможность сопровождения продукции справочным руководством, ориентированным на наши наборы реагентов (З.С.Баркаган, А.П. Мрмот. Основы диагностики нарушений гемостаза. -М.: "Ньюдиамед-АО", 1999. - 224 с.). НАБОРЫ ДЛЯ КОАГУЛОМЕТРА: Метод исследования Набор реагентов Состав набора кефалин, легкая фракция каолина, буфер, АПТВ (АЧТВ) АПТВ-тест хлорид кальция Протромбиновый Техпластин-S стандартизированный по ISI (1.1) тест растворимый тромбопластин, контрольная нормальная плазма Тромбиновый тест Тромбин-тест тромбин, стандарт-плазма, буфер Содержание Фибриноген- тромбин, стандарт-плазма, буфер

фибриногена тест Определение Антитромбинантитромбина III тест Определение волчаночного Люпус-тест антикоагулянта Скрининг нарушений в системе протеина Парус-тест С

тромбин, стандарт-плазма, гепарина, буфер

сорбент

тромбопластин, кефалин, тромбоцитин, буфер, хлорид кальция

активатор протеина С, кефалин, каолин, стандарт-плазма, буфер, хлорид кальция

Данный перечень диагностических наборов адаптирован к применению на оптических, оптико-механических и механических коагулометрах фирм МЕЛТ, ЮНИМЕД, СОЛАР, Behnk Electrunik, Amelung, Organon Teknika, Sarstedt u dp. РЕАГЕНТЫ ДЛЯ АГРЕГОМЕТРА: АДФ, адреналин, коллаген, ристомицин ДРУГИЕ НАБОРЫ И РЕАГЕНТЫ:__________________ Нормальная и патологическая контрольные плазмы, РФМК-тест (определение РФМК в плазме по фенантролиновому тесту), КЛАМПИНГтест (определения ранних ГЩФ и РФМК в сыворотке крови - тест склеивания стафилококков), Фактор V-PC-тест (определение резистентное™ фактора Va к активированному протеину С), ГЕПАРИНтест (определение чувствительности плазмы к гепарину), АГРЕСКРИН-тест (скрининг нарушений тромбоцитарного гемостаза на стекле), ХРОМОТЕХПлазминоген (определение плазминогена с хромогенным субстратом на плазмин), ФИБРИНОЛИЗ-тест (исследование ХНа-калликреин-зависимого и спонтанного фибринолиза эуглобулинов), Квик-Фг-тест (мануальное определение протромбинового времени и концентрации фибриногена), дефицитная по фактору VIII плазма, тромбин, тромбопластин, кефалин, каолин (легкая фракция), гепасорб I и II (сорбенты для удаления гепарина из плазмы крови), реагенты из змеиных ядов, стрептокиназа, трис-HCI буфер, цитрат натрия, хлорид кальция, силикон. Более подробную информацию можно получить, обратившись по адресу: 656055, Россия, г. Барнаул, а/я 3603. Фирма "ТехнологияСтандарт" Тел. (385-2) 260-501, 260-653; факс (385-2) 266-868.

Общество больных гемофилией НПО "РЕНАМ" 095) 214-9057 212-2912 основано в 1990 г. Производит недорогие и удобные в использовании диагностические

реактивы. ГЕМОСТАЗ: Полностью готовые к работе наборы и реагенты: * Тромбопластин, Тромбопластин с МИЧ=1.5 для определения протромбинового времени, протромбина по Квику; * АЧТВ (Активированное частичное тромбопластиновое время); * Тромбин-тест; * Активности факторов свертывания VIII и IX; * Фибриноген-тест (по Клауссу); * Антитромбин III (по Абильгаард и фотохромный метод); * Протеин-С * ХПа зависимый фибринолиз; * РФМК-Тест (о-фенантролиновый метод); * Плазминоген (фотохромный метод); Унифицированный ВОЗ Гемиглобинцианидный Метод. • Набор калибровочных растворов гемиглобинцианида (50, 100, 150 и 200 г/л) • Сухой трансформирующий реагент на 2000 определений • Сухой трансформирующий реагент (800 опр.) с калибратором • Набор контрольных растворов гемоглобина (80, 120 и 160 г/л) АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ • Коллаген, АДФ, Ристоцетин; Преимуществом диагностических наборов НПО "РЕПАМ" является их полная комплектация готовыми к употреблению реагентами, необходимыми для проведения анализов, что значительно упрощает проведение работы. Все наборы реагентов зарегистрированы в МЗ РФ, прошли успешную апробацию и постоянно применяются в ведущих медицинских учреждениях страны. 125167 Москва Новый Зыковский пр. 4а тел./факс (095)214-90-57 , 212-29-12, 212-51-03

ORGANON TEKNIKA (ГОЛЛАНДИЯ) АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Исследование гемостаза на сегодняшний день получает все большее распространение. Необходимость выявления нарушений в этой системе в обычной клинической практике становится очевидной для врачей всех профилей. К счастью, ситуация облегчается тем, что на смену трудоемким и субъективным ручным методам в "водяной бане" приходят эффективные и удобные в работе коагулометры. КРОВОТЕЧЕНИЕ ТРОМБОЗ ORGANON TEKNIKA Фирма Органон Техника входит в фармацевтическое подразделение концерна "AKZO NOBEL", Голландия, и представлена более чем в 100 странах национальными компаниями и специальными агентствами. Органон Техника предлагает все необходимое для современной лаборатории исследования гемостаза -автоматическое и полуавтоматическое оборудование, широкий спектр реагентов и методик, необходимые аксессуары, сервис и послепродажную поддержку. Высокое качество продукции фирмы подтверждено сертификатами, в т. ч. ISO 90Q1. КОАГУЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗАТОРЫ Модельный ряд коагулометров фирмы способен удовлетворить любым потребностям: от 10 анализов в неделю до сотен исследований в день. Приборы отличаются высокой чувствительностью, надежностью и удобством в работе. Результаты исследований выдаются в различных единицах и удобной для интерпретации форме. ФОТООПТИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП В коагулометрах фирмы Органон Техника используется фотооптический измерения, основанный на анализе изменения пропускания света образцом в процессе образования сгустка. Достоинства этого метода: высокая чувствительность и точность, отсутствие кросс-контаминации между последовательными образцами, автоматическое определение внесения реагентов. Coag-A-Mate ХМ Коагулометр для лабораторий с невысоким объемом исследований. Имеет две независимых панели для исследований, четыре позиции для подготовки реагентов (две с магнитными мешалками) и четыре позиции для

подготовки образцов. Одновременно исследуются четыре независимых пробы или две парные, причем в этом случае контролируется отклонение результатов. В памяти прибора до 15 стандартных (концентрационных) кривых. Для контроля работы прибора предусмотрен режим самодиагностики. Coag-A-Mate XM Полностью автоматизированная открытая система, выполняющая одновременно коагуляционные и хромогенные тесты, в произвольном порядке. Приоритетное тестирование экстренных проб (STAT). Контроль качества. Производительность - 100 Т/час. ТЕСТЫ НА СВЕРТЫВАЕМОСТЬ КРОВИ ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ: Simplastin Excel (300, 500 Т)-Величина ISI (International Sensitivity Index) = 2.0. Стабильность - 7 дней. Simplastin Excel S (300, 500 Т)- Более низкий IS! -1.2Стабильность - 7 дней. АКТИВИРОВАННОЕ ПАРЦИАЛЬНОЕ ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ Automated APTT (300, 500 Т) Стабильность - 7 дней. Platelin® L Kit (150, 500 Т) - Жидкий, готовый к работе реагент. Стабильность - 30 дней. Platelin LS (300, 1000 Т) Высокочувствителен к гепарину и волчаночным антителам. Стабильность -30 дней. ТРОМБИНОВОЕВРЕМЯ Thromboquik® (150 Т) - Стандартизированное определения тромбинового времени (ТВ). 3-4 ед NIH/мл. Стабильность - 7 дней. ФИБРИНОГЕН Fibriquik® kit (50 Т) - количественный тест для определения фибриногена классическим методом Клаусса. Стабильность - 7 дней. Отдельные KOMnoneHTbiiFibriquik Thrombin Reagent (300 Т) - 100 ед. NIH/мл, Fibriquik Veronal BufferОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ -Фактор Дефицитная плазма ( ФДП) по II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII (100 Т) • КОНТРОЛЬНЫЕ И КАЛИБРОВОЧНЫЕ ПЛАЗМЫ • ХРОМОГЕННЫЕ (КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ) ТЕСТЫ • ВОЛЧАНОЧНЫЕАНТИКОАГУЛЯНТЫ-У\регс\и\Ь LA • ЛАТЕКСНЫЕ ТЕСТЫ: Fibrinosticon® (60, 180 Т) - латексный агглютинационный иммуноассоциированный тест для качественного и полуколичественного определения продуктов деградации фибрина (D-димеров) в плазме крови человека.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ ТЕСТЫ Thrombonostika - Protein С, Protein S Fibrinostika - FbDP, FgDP, общие продукты деградации, все формы фибрина, растворимый фибрин и фибриноген. Представительство «Акзо Нобель» «Органон Техника» 197061, Санкт-Петербург, 125445, Москва, ул. Дивенская, 3 ул. Смольная, 24Д тел. (812) 325-27-26 Коммерческая Башня факс (812)325-28-58, «Меридиан» 325-28-59 тел. (0951 960-28-90 Киев тел. {044)224-15-52 факс (044) 225-43-36 oiyawZteknika DiaMed

Мы предлагаем Вам воплощение новейших технологий: приборы LX-2,CD-1,CD-2,CD-4,CD-6 V Весь спектр диагностических тестов V Простота в работе V Экономичность V Швейцарское качество! Представительство DiaMed AG (Швейцария) в России: ДиаМед-Восток 191186 г. Санкт-Петербург, Невский проспект, 1 ХМДК, офис 625 тел/факс (812)-314-68-76 тел. (812)-314-68-81

КОАГУЛОМЕТРЫ АГРЕГОМЕТРЫ РЕАКТИВЫ - одно-, двух-, и многоканальные - отечественные и импортные. - для исследования системы гемостаза. А ТАКЖЕ ШИРОКИЙ СПЕКТР ОБОРУДОВАНИЯ, РЕАКТИВОВ И РАСХОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ: • высококачественные реагенты для биохимических исследований • анализаторы биохимические, гематологические для иммуноферментного анализа • центрифуги, шейкеры, весы, термостаты • лабораторная посуда • реактивы, расходный материал

191123, Санкт-Петербург, а/я 26 Тел.: (812) 259-1791, 259-1238 Тел./факс: (812) 186-3550 E-mail: [email protected]