Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей

Ф.И. Ершов, А.Л. Коваленко, М.Г. Романцов, С.Ю. Голубев

ЦИКЛОФЕРОН КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ

Москва - Санкт-Петербург 1998 3

Российская Академия медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Научно-технологическая фармацевтическая фирма “Полисан”

Ф.И. Ершов, А.Л. Коваленко, М.Г. Романцов, С.Ю. Голубев

ЦИКЛОФЕРОН КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ Руководство для врачей

Москва -Санкт-Петербург 1998 4

Ершов Ф.И., Коваленко А.Л., Романцов М.Г., Голубев С.Ю. Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей. М.; СПб., 1998. 109 с. - ISBN 5-88874-040-3. В руководстве суммированы результаты многолетних исследований фармакологии и терапии отечественного индуктора интерферона - циклоферона (регистрационный № 95/211/5), обладающего широким спектром биологической активности. Представлены результаты экспериментальных и клинических исследований препарата, проведенных в ведущих научных и медицинских учреждениях РФ. Рассчитано на широкий круг врачей, фармацевтов, биологов, аспирантов и студентов медицинских вузов и всех интересующихся лекарственными средствами нового поколения.

Авторский коллектив: Ю.В. Аспель, Л.Е. Алексеева, В.Н. Анисимов, В.В. Бржеский, Г.В. Богоявленский, И.А. Виноград, Н.А. Виноград, С.Г. Вишнев, В.И. Головкин, Н.С. Голубев, С.Ю. Голубев, Ю.Н. Громыко, Д.К. Ермоленко, Ф.И. Ершов, В.А. Исаков, А.В. Каземирский, Е.Ю. Карпович, С.Е. Колбасов, А.Л. Коваленко, Н.В. Корнилов, Т.А. Куляба, А.Д. Лавлинский, Г.М. Манихас, С.И. Моисеев, Э.В. Москалев, К.А. Новоселов, М.Г. Романцов, Т.Н. Саватеева, М.М. Сафронова, А.Е. Семенов, Е.Е. Сомов, В.П. Сухинин, И.А. Поляков, Л.П. Царевский, В.Н. Хрулев, А.А. Щипкова

Рецензенты: профессор В.В. Малиновская; доктор биологических наук А.Н. Наровлянский.

ISBN 5-88874-040-3

© Ф.И. Ершов, А.Л. Коваленко, М.Г. Романцов, С.Ю. Голубев, 1998 5

Феликс Иванович Ершов, Алексей Леонидович Коваленко, Михаил Григорьевич Романцов, Сергей Юрьевич Голубев ЦИКЛОФЕРОН КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ Руководство для врачей Редактор Н.Н. Мартынюк. Подписано в печать 06.01.1998 г. Формат 60×90 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Ризограф. Усл. печ. л. 6,8. Уч.-изд. л. 7,5. Тираж 150 экз. Заказ . Калининградский государственный университет, 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14. 6

ВВЕДЕНИЕ Циклоферон изначально отнесен нами к разряду индукторов интерферона, так как прежде всего бросалась в глаза его ярко выраженная способность быстро “включать” систему интерферона в клетках, органах и тканях широкого круга экспериментальных животных. В результате многолетних доклинических исследований циклоферон выдвинулся в число наиболее активных низкомолекулярных синтетических индукторов интерферона. Циклоферону оказались свойственны черты классических противовирусных химиопрепаратов и стимуляторов иммунного ответа. При введении в организм больных циклоферон одновременно действует на возбудителя заболевания (этиотропный эффект) и стимулирует специфическую (иммунитет) и неспецифическую (интерферон) резистентность. Такая полифункциональность действия во многом объясняет выявленный к настоящему времени универсально широкий спектр терапевтической эффективности циклоферона и уже определившиеся показания его клинического применения. Сам по себе факт соединения в одном препарате этиотропных, иммуномодулирующих и патогенетических свойств позволяет отнести его к новому поколению лекарственных средств, перспективных для дальнейшего клинического применения. Краткие сведения о препарате 1. Название препарата 2. Состав препарата: 3. Лекарственная форма 4. Способ применения 5. Основные показания

- циклоферон - водорастворимый синтетический аналог природного алкалоида из культуры Citrus grandis - ампулы, содержащие 12,5% раствор - внутривенные или внутримышечные инъекции - вирусные инфекции (грипп, ОРЗ, герпес, гепатиты А, В, С; ВИЧ-инфекция, инфекции ЦНС); урогенитальные хламидиозы; ревматоидные и реактивные артриты; рассеяный склероз; вторичные иммунодефицитные и другие состояния 7

6. Сроки хранения 7. Стандартная упаковка 8. Фирма-производитель

- 2 года при комнатной температуре - коробка, содержащая 5 ампул, лист-вкладыш - научно-технологическая фармацевтическая фирма “Полисан” (Санкт-Петербург, Россия)

На 17 Международном конгрессе по химиотерапии, (Западный Берлин, ФРГ) препарат получил 1-ю премию. Имеется лицензия РФ и патенты ФРГ и США. Представленные результаты клинического использования циклоферона следует рассматривать лишь как первый пласт потенциальных возможностей этого препарата. Сейчас уже можно утверждать, что в обозримом будущем область клинического применения циклоферона значительно расширится и этот препарат займет достойное место в лечении онкологических, гинекологических, аутоиммунных и других заболеваний. Руководитель отдела интерферонов НИИЭММ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, член-корреспондент Российской Академии медицинских наук, профессор Ф.И. Ершов

8

Заведующий кафедрой профилактической медицины Калининградского государственного университета, профессор М.Г. Романцов член-корреспондент Академии Естествознания РФ

ИНФОРМАТИВНО-РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ ИНТЕРФЕРОНОВ В КЛЕТОЧНЫХ И МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ Среди многочисленных цитокинов, обладающих контрольнорегуляторными функциями, особое место отводят интерферонам (ИФН). К настоящему времени известно около 20 ИФН, различающихся по структуре и биологическим свойствам и составляющих три типа (α, β, γ), объединенных в два вида: 1-й - α и β, 2-й - γ. Они относятся классу индуцибельных белков и представляют собой гликопротеиды с молекулярной массой 2030 кД. Интерфероны защищают организм от инфицирования вирусами, бактериями, простейшими, потенцируют лимфокины, ингибируют рост злокачественных клеток. Противовирусное действие интерферонов осуществляется через систему клеточного синтеза нуклеиновых кислот с помощью ряда ферментов и ингибиторов, приводящих к деградации чужеродной генетической информации. Тип 1 составляют ИФН-α, секреция которых осуществляется макрофагами и микрофагами (полиморфно-ядерными лейкоцитами, ПЯЛ) и индуцируется вирусами или синтетическими полинуклеотидами и ИФН-β, секреция которого осуществляется фибробластами. Тип 2 включает ИФН-γ, или иммунный, который синтезируется сенсибилизированными лимфоцитами при активации их неспецифическими митогенами. При индукции ИФН синтезируются два его типа, которые обладают видотканевой специфичностью. Использование комплекса ИФН заданной специфичности, а не отдельных пептидов открывает возможность коррекции патологических процессов. Продукция ИФН закодирована в генетическом аппарате клетки. Интерферонообразование регулируется 21 парой хромосом. Ген для ИФН-α расположен в 9 хромосоме, а для ИФН-γ в 11 хромосоме. Основные механизмы действия ИФН заключаются в следующем: после связывания молекулы ИФН со специфическим рецептором сигнал передается внутрь клетки и потенцирует появление нескольких ферментативных активностей. В результате этого происходит формирование одного из факторов инициации трансляции, что блокирует процессы синтеза белка (Samuel C. E., 1984). С другой стороны, активируется специфическая внутриклеточная рибонуклеаза, приводящая к быстрой деградации матричных РНК (Verhaegen-Lewalleb. et al., 1982). В совокупности эти процессы приводят к обратимой приостановке синтетических процессов в клетке. Опираясь на такое обощенное представление о механизмах действия ИФН, до9

вольно легко объяснить антивирусные и антипролиферативный эффекты ИФН: ингибированием процессов транскрипции и трансляции обусловливается прекращение репликации вирусов (антивирусный эффект) или торможение размножения клеток (антипролиферативный эффект). Эти эффекты, присущие ИФН, делают его универсальным фактором неспецифической резистентности, обеспечивают защиту организма от внутриклеточных агентов, таких как вирусы, хламидии, микоплазмы; воздействуя на чужеродные нуклеиновые кислоты путем их распознавания и элиминации, опосредованно поддерживающим нуклеиновый гомеостаз. ИФН - это единая система регуляции функций клеток и межклеточных взаимодействий полипептидными молекулами. В процессе воспаления, иммунного ответа, иммунопатологических состояний ИФН выполняют роль короткодистантных медиаторов межклеточного взаимодействия. Независимо от того секретируются ИФН или только экспрессируются они связываются со специфическими рецепторами на клетках-мишенях. ИФН не обладает ферментативной и химической активностью, а действие их проявляется опосредованно через клетки-мишени с помощью вторичных мессенджеров. И в этом ИФН подобны гормонам, оказывая действие на клетку-продуцент (аутокринное действие) и на соседние с ней клетки, а также на отдаленные от нее клетки (эндокринное действие). Такие сложные межклеточные взаимодействия позволяют рассматривать цитокины вообще, а ИФН в частности как “микроэндокринную систему”. В связи с этим ИФН отводят важную роль медиаторов, обеспечивающих связь между нейроэндокринной и иммунной системами. Действие ИФН реализуется по сетевому принципу, т.е. передаваемая клеткой информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных цитокинов. Один медиатор часто вызывает секрецию мишени второго клеткой-мишенью и т.д., что получило название цитокинового каскада. Включение каскада обусловливает синэргетические или антагонистические действия медиаторов, индукцию выработки ими друг друга, а также трансмодуляцию поверхностных рецепторов к другим медиаторам. Контрольно-регуляторные функции ИФН многообразны и направлены на сохранение гомеостаза. Широко известно противовирусное, антимикробное, антипролиферативное, гормоноподобное, радиопротекторное и иммуномодулирующее действие. Среди проявлений иммуномедиаторных свойств ИФН стоит особо выделить: 1. Увеличение числа Fc-рецепторов к JgG на мембранах макрофагов под действием ИФН, что способствует выполнению таких важных функций, как фагоцитоз и антителозависимость цитотоксичность (Vogel J et al., 1983). 10

2. Воздействуя на активность естественных киллеров, ИФН являются основными модуляторами системы естественной цитотоксичности (Herberman et al., 1982). 3. Усиление экспрессии на поверхности клеток антигенов гистосовместимости 1-го класса под действием ИФН-α и ИФН-β (Zin Kernagel R., Doherty P., 1974). 4. ИФН-α/β является мощным ингибитором Т-супрессоров, а ИФН-γ активирует их и индуцирует синтез растворимого фактора супрессии иммунного ответа (Noma T., Dorf M., 1985). 5. Усиление экспрессии антигенов гистосовместимости 2-го класса под действием ИФН-γ (Basham T.Y., Merigan T. C., 1983) приводит к увеличению функциональной активности антигенпрезентирующих клеток, усилению сенсибилизации Т-хелперов, увеличению цитотоксичности моноцитов, повышению секреции лимфокинов, таких как фактор некроза опухоли и интерлейкин-2 (Dlackman M., Morris A., 1985). Этим перечислением не исчерпываются все функции ИФН. Исследования последних лет открывают новые свойства системы ИФН, напрямую или косвенно связанные с функционированием иммунной системы (регуляция активности трофобластов Roberts., Cross J., 1992), нейроэндокринные функции (Plata-Salaman., 1992), регуляция роста и дифференцировки клеток (Kimchi A., 1992). Антивирусные свойства в большей степени выражены у ИФН-α и ИФН-β, в то время как иммунорегуляторные и антипролиферативные - у ИФН-γ. Посредством реализации этих свойств и сочетания их с функциями ингибирования основных клеточных репродуктивных процессов достигается высокая эффективность и универсальность ИФН как факторов, обеспечивающих защиту организма от широкого спектра инфекционных агентов (вирусы, микроорганизмы, грибы), а также при аутоиммунной и неопластической патологии. По значимости система ИФ приближается к системе иммунитета, а по универсальности превосходит ее. Иммуномодулирующее действие ИФН реализуется через усиление экспрессии поверхностных антигенов главного комплекса гистосовместимости 1-го и 2-го классов, повышающее эффективность иммунного распознавания измененных клеток; рекрутирование эффекторных клеток путем модулирования процессов их дифференцировки, созревания и пролиферации; активации эффекторных клеток; становление гуморального иммунитета, экспрессию JgG-FcR, более того, ИФН-γ является незаменимым фактором дифференцировки В-клеток. Показано (Фрейдлин И.С., 1995), что ИФН-γ резко усиливает эффекторные функции макрофагов, их антимикробную и противоопухолевую активность за счет повышения продукции супероксидных и нитрооксидных радикалов. Кроме того, усиление иммунного фа11

гоцитоза и антиопосредованной цитотоксичности макрофагов под влиянием ИФН-γ связано с усилением экспрессии Fcγ-рецепторов LgG. Очевидно, это участие ИФН-системы в поддержании гомеостаза обусловлено антигенами, подключающими эту систему к активной функциональной деятельности (Сидорова Л.Д., 1993). Практически любой антиген является интерфероногеном, в то числе и аутоантиген. Следовательно, высвобождение ИФН является не только маркером активации макрофагов, ПЯЛ, лимфоцитов и других клеток, но и определяет контрольно-регуляторные межклеточные взаимодействия в связи со значительными изменениями адгезивных свойств мембран клеток и экспрессии рецепторов для медиаторов, что существенно для механизмов формирования патологического процесса, его течения и исхода. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТРОЙ, ПОДОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ Эксперименты выполнялись на белых беспородных крысах, белых мышах обоего пола. Длительность карантина для всех животных составляла четырнадцать дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям, были исключены из исследования. Клетки с животными помещались в отдельные комнаты. Световой режим: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 19-25˚ C, относительная влажность - 50-70%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. При изменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий концентрацию СО2 - не более 0,15 объемных %, аммиака - не более 0,001 мг/л. В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. Перечень регистрируемых показателей включал: измерение массы тела; учет потребления животными воды и пищи; измерение ректальной температуры; проведение физиологических тестов - "открытое поле", изучение 12

спонтанной двигательной активности животных, проведение электрокардиографического обследования и измерение систолического артериального давления. Были изучены секреторная функция почек и антитоксическая функция печени (проба с феноловым красным и гексеналовый тест). Лабораторные исследования включали: проведение гематологических и биохимических исследований, изучена коагулограмма, миелограмма, а также проведено исследование мочи животных. Перечисленные лабораторные исследования были проведены до начала исследования, на 30-й и на 180-й день, а при выявлении статистически значимых сдвигов - через 30 дней после отмены препарата. Забор крови у животных осуществлялся после 14-15-часового голодания. Патоморфологическому исследованию подлежали все животные, получавшие максимальную дозу, и все контрольные животные - в конце исследования. Патоморфологическое исследование включало некропсию, макроскопическое исследование, взвешивание и гистологическое исследование внутренних органов. Некропсия выполнялась под непосредственным наблюдением патоморфолога. После эфтаназии животные были тщательно обследованы на предмет наружных патологических признаков. Осмотр мест инъекций (кожи, подкожной жировой клетчатки, вены) позволил оценить местно-раздражающее действие исследуемого препарата. Было проведено исследование состояния грудной и брюшной полостей, микроскопическое исследование внутренних органов. Проведенные экспериментальные исследования острой токсичности показали, что лекарственная форма препарата циклоферон при введении экспериментальным животным не оказывает токсического действия. Величины ЛД50 при в/ж введении мышам и крысам разного пола колеблются от 7000 до 11000 мг/кг, при в/м - от 1500 до 2000 мг/кг, а при в/в - от 900 до 1300 мг/кг. В/в и в/м введение беспородным собакам в дозе 500 мг/кг, что в 50-60 раз превышает максимальную терапевтическую дозу, не вызывает существенных изменений общего состояния, поведения и структуры внутренних органов. Следовательно, результаты токсикометрии, данные некропсии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления позволяют отнести лекарственную форму препарата циклоферон к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (Hodge Н. et al., 1975). Состояние животных, переживших острую интоксикацию, свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические в десятки раз.

13

В/в введение экспериментальным животным массированных, заведомо опасных доз препарата (более 1000 мг/кг, что в 100 раз больше максимальной терапевтической) вызывает передозировку и отравление, в патогенезе которого существенную роль играют нарушения центральной нервной системы и угнетение спонтанного дыхания по центральному типу. Нельзя также исключить развитие сердечных аритмий. Лечение передозировки должно быть направлено на восстановление функции дыхания и ускоренное выведение препарата из организма. Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по показателям острой токсичности для клинических исследований лекарственной формы препарата циклоферон (Саватеева Т.Н., Стройкова Г.С., Колпинская Н.Д., Агапова В.Ф., 1995). Учитывая малую токсичность препарата, показанную в остром эксперименте, рекомендации нормативных документов Фармакологического комитета и правил GLP, а также, исходя из длительности применения препарата у человека (4 недели и более) и величины эффективной терапевтической дозы (10 мг/кг), для оценки подострой токсичности был выбран срок 1 месяц, а хроническое введение осуществляли на протяжении 6 месяцев. В опытах на грызунах (крысы обоего пола) препарат вводился внутримышечно ежедневно на протяжении 180 дней в трех дозах: терапевтической - 10 мг/кг, предполагаемой максимальной - 500 мг/кг (в 50 раз большей терапевтической) и промежуточной - 100 мг/кг. Выбор регистрируемых показателей в каждом случае определялся научной целесообразностью и требованиями нормативных документов. Эксперименты проводились в соответствии с Протоколом исследования. Внутримышечное введение циклоферона. Экспериментальные исследования Внутримышечно лекарственную форму препарата циклоферон различной концентрации (в зависимости от дозы) вводили 1 раз ежедневно в течение 6 месяцев в трех дозах: терапевтической - 10 мг/кг; максимальной 500 мг/кг и промежуточной - 100 мг/кг. Экспериментальная программа (протокол исследования) Животные: крысы самцы, крысы самки. Путь введения: внутрижелудочный. 14

Дозы: 1-я - терапевтическая (10 мг/кг); 2-я - в 10 раз больше терапевтической (100 мг/кг); 3-я - в 100 раз больше терапевтической (500 мг/кг). Частота введения: 1 раз в день в течение 180 дней. Растворитель: подсолнечное масло. Число животных: по 20 в каждой группе. 1-я доза - 20 самцов, 20 самок; 2-я доза 0 - 6 20 самцов, 20 самок; 63-я доза - 20 самцов, 20 самок. Общее количество - 160, из них 40 - контрольная группа. Таблица 1 Регистрируемые показатели Показатели Общее состояние Взвешивание, потребление воды Гематологические, биохимические исследования Физиологические исследования Макроскопическое исследование и взвешивание внутренних органов Гистологические исследования

Животные Все Все

Регистрация Ежедневно 1 раз в неделю

Все

До опыта, через месяц и в конце опыта

Все

До опыта, через месяц и в конце опыта Погибшие - после гибели, остальные - в конце опыта Погибшие - после гибели, остальные - в конце опыта

Все Все погибшие; все контрольные; все, получавшие максимальную дозу

Рандомизацию и содержание животных осуществляли в соответствии с требованиями GLP (РД64-126-91).

Влияние циклоферона на массу тела экспериментальных животных Влияние препарата циклоферон на массу тела белых крыс, потребление корма и воды было изучено в течение 180 дней введения, а затем также через 30 дней после отмены препарата. Отмечено, что вес животных, получавших препарат, равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольной, так и в опытных группах. В эти же временные сроки, через 2 часа после введения препарата, учитывали потребление воды и пищи животными. 15

Отмечено, что животные из контрольной и опытных групп потребляли корм одинаково в течение всего времени наблюдения, включая и восстановительный период. Половых различий или различий, связанных с уровнем дозирования, не наблюдалось. Потребление воды несколько возрастало в течение эксперимента. При этом существенной разницы исследуемых показателей в экспериментальных группах, по сравнению с контролем, не отмечалось. Данные измерения ректальной температуры крыс проводили с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ±1%) (табл. 2). Таблица 2 Влияние препарата на температуру тела белых крыс Сроки исПрепарат, мг/кг следоваФиз. раствор 10 100 500 ния (дни) M F M F M F M F Фон 36,2±0,3 36,6±0,2 36,1±0,3 36,3±0,2 35,9±0,4 36,3±0,4 36,4±0,3 36,2±0,2 30-й 35,4±0,5 35,8±0,3 36,7±0,3 35,9±0,7 36,5±0,6 36,5±0,6 36,5±0,4 36,0±0,4 180-й 36,7±0,3 36,4±0,3 36,1±0,5 36,6±0,4 36,7±0,4 36,7±0,4 36,3±0,5 36,4±0,4

Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий у животных из опытных и контрольной групп. Детоксицирующую функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна. Эксперимент проводился в теплом и тихом помещении. Животное взвешивали и внутрибрюшинно вводили раствор гексенала в дозе 90 мг\кг, растворитель - 0,9% р-р NaCl. Данные представлены в таблице 3. Таблица 3 Влияние препарата на продолжительность гексеналового сна у белых крыс Сроки исПрепарат, мг/кг следоваКонтроль 10 100 500 ния (дни) M F M F M F M F Фон 48,9±6,7 47,3±7,2 46,2±5,7 60,1±8,0 50,6±8,3 52,6±6,5 39,8±7,4 47,5±6,1 30-й 61,3±7,6 60,8±6,3 58,3±6,4 61,2±7,9 53,6±7,2 60,8±6,3 62,5±8,6 60,6±7,5 180-й 62,7±6,8 75,2±6,3 52,6±7,4 63,6±6,3 59,4±6,5 74,7±7,4 55,9±5,2 61,2±6,4

Установлено, что препарат не изменяет продолжительность гексеналового сна, т.е. не оказывает отрицательного влияния на детоксицирующую функцию печени. Влияние препарата на параметры функционального 16

состояния почек Анализы мочи и оценка функциональной активности почек по секреции фенол-красного проведены в фоне и через 30 и 180 дней после начала введения препарата. Таблица 4 Влияние препарата циклоферона на секреторную функцию почек белых крыс (количество выделенной краски в мг/100 г веса, М±m) Сроки исследоваФиз. раствор ния (дни) M F Фон 0,090± 0,090± 0,005 0,004 30-й 0,082± 0,095± 0,006 0,005 180-й 0,100± 0,110± 0,004 0,010

10 M 0,095± 0,010 0,090± 0,006 0,100± 0,010

Препарат, мг/кг 100 F M F 0,090± 0,100± 0,090± 0,006 0,005 0,006 0,098± 0,095± 0,087± 0,002 0,005 0,003 0,090± 0,120± 0,080± 0,005 0,010 0,006

500 M 0,090± 0,008 0,091± 0,005 0,110± 0,008

F 0,095±0, 006 0,092± 0,005 0,100± 0,006

В ходе проведения эксперимента отмечено, что существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении препарата циклоферон белым крысам не наблюдалось. Отмеченное у самок опытных групп некоторое возрастание диуреза (при тестировании через 180 дней) в восстановительный период нормализовалось. Изучение влияния циклоферона на показатели периферической крови и характер миелограммы Биохимические и гематологические исследования проводились у фоновой группы до начала введения препарата, затем через 30 и 180 дней после ежедневного введения. Кровь получали после одномоментного гильотинирования с последующим извлечением бедренной кости для исследования миелограммы. При микроскопировании мазков лимфоциты имеют сильно пикнотическое ядро, иногда обнаруживается значительная азурофильная зернистость. Основная масса сегментоядерных клеток имеет нежную, нейтрофильную, не вполне ясно выраженную зернистость в мазках. Ядра эозинофильных клеток образованы из рыхлого хроматинового вещества и имеют почти круглую форму. Ядра эозинофилов и нейтрофилов образуются по кольчатому типу, поэтому нередко встречаются кольцеобразные ядра у палочковидных форм. Моноциты сильно отличаются от лимфоцитов. Последние равны по величине двум эритроцитам, имеют большое бобовидное ядро и широкую протоплазматическую кайму, которая окрашива17

ется в синий или фиолетовый цвет с нежной грануляцией. Кровяные пластинки лежат большими кучками. Следует отметить, что на 30 и 180 сутки исследования происходило умеренное, но статистически значимое увеличение количества гемоглобина, абсолютного количества эритроцитов, абсолютное и относительное увеличение количества лимфоцитов и тромбоцитов периферической крови. Показатели коагулограммы за весь период наблюдения у подопытных животных достоверно не отличались от таковых в фоновой и контрольной группах. Патологических сдвигов не выявлено. Следовательно, длительное применение препарата циклоферон стимулирует лимфоцитарный и мегакариоцитарный ростки кроветворения. При микроскопировании органы кроветворения крыс содержат круглоядерные клетки, нейтрофильные и эозинофильные миелоциты, полинуклеарные нейтрофилы и эозинофилы, нормобласты и гигантские клетки. Основная масса клеток костного мозга состоит из круглоядерных клеток, полинуклеаров и переходных форм с большей или меньшей перешнуровкой ядра. Одноядерные клетки достаточно разнообразны, ядра их мелкие, расположены центрально или эксцентрично, в ряде случаев полностью заполняют клетку. Полинуклеарные формы чаще нейтрофильны и реже эозинофильны. Нейтрофильная грануляция нежна и не очень обильна. Эозинофильная грануляция хорошо выражена. Базофилы имеют круглое или лопастное ядро. Гигантские клетки с гомогенной плазмой и многочисленными мелкими центрально лежащими ядрами попадаются редко. Нормобласты имеют типичные ядра и протоплазму. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в костном мозге крыс, получавших препарат, происходило умеренное, но статистически достоверное увеличение общего количества клеток, а также клеток эритроцитарного ростка, лимфоцитов и мегакариоцитов по сравнению с таковыми показателями интактных животных. Патологических сдвигов костномозгового кроветворения не отмечалось. При изучении биохимического гомеостаза экспериментальных животных отмечено, что и у самцов и у самок опытных групп не выявлено достоверно значимых результатов показателей биохимического гомеостаза по сравнению с фоном и контролем. Влияние препарата циклоферон на двигательную активность животных В таблице 5 представлены данные по влиянию препарата на спонтанную двигательную активность крыс (СДА). Крысы по одной помещались в регистрационную камеру автоматического регистратора Coulburn

18

Insteuments, где за каждые 5 минут на протяжении 35 минут у них регистрировалось количество движений. Таблица 5 Влияние препарата циклоферона на СДА белых крыс Время наблюдения, мин

День регистрации Фон

Самцы 30

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 0-35

50,0±18,8 45,4±29,1 45,2±21,2 22,8±5,1 30,4±12,0 32,0±14,1 18,0±14,1 243,8±66,1

28,4±8,3 37,0±17,3 49,4±16,5 31,6±15,6 3,8±2,4* 14,2±9,4 16,8±13,9 181,2±64,2

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 0-35

83,0±29,1 36,6±16,9 25,4±12,0 30,8±16,9 22,8±12,1 16,0±6,8 25,6±9,0 226,2±62,3

63,0±26,8 47,2±23,1 37,2±17,1 22,6±5,1 27,8±13,7 13,6±9,6 22,4±5,4 233,8±81,1

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 0-35

85,0±41,9 65,8±19,0 70,8±25,7 95,0±29,9 21,6±12,0 56,0±26,1 30,4±16,1 14,2±7,1 12,6±6,8 34,0±17,5 22,4±11,1 26,4±9,8 17,6±7,5 28,0±13,0 260,4±105,7 319,0±84,9

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 0-35

78,4±33,2 82,3±22,7 52,4±32,6 78,3±25,7 35,2±24,2 66,3±16,1 25,8±18,5 35,3±23,3 22,1±13,8 19,3±7,3 22,4±11,1 18,4±9,8 19,8±8,53 22,1±8,7 256,1±102,4 322,0±63,4

180 Контроль 14,8±7,6 24,5±22,4 9,8±2,8 10,3±10,6 1,5±1,7* 3,0±3,4* 0,8±0,8 64,5±25,8* 10 мг/кг 21,5±2,2* 25,8±12,9 29,3±15,4 30,8±23,2 36,8±20,4 25,5±23,5 14,5±11,2 184,0±72,2 100 мг/кг 50,8±15,0 27,6±12,0 41,6±17,1 38,6±7,5 14,6±11,6 20,0±17,8 6,0±5,6 199,2±67,0 500 мг/кг 85,7±25,6 82,6±22,0 44,2±20,5 25,1±13,6 17,5±8,3 15,6±7,4 16,2±9,2 286,9±63,4

Фон

Самки 30

180

92,2±20,1 74,4±12,0 45,2±18,8 25,4±15,4 5,8±2,6 11,2±9,2 5,2±2,6 260,4±42,2

39,6±13,7 28,4±5,8* 21,0±11,6 21,0±15,1 17,4±4,9 2,6 ±1,3 6,0±3,4 136,0±38,5

29,6±9,7* 20,2±6,8* 15,2±6,0 15,4±9,4 3,2±1,9 3,6±3,0 5,8±3,4 93,0±31,0*

64,0±16,7 23,2±8,9 42,4±12,6 43,8±14,3 20,6±8,8 38,0±13,7 41,6±13,7 13,0±5,1 14,2±8,6 22,4±7,5 22,2±9,6 18,6±12,2 27,0±15,2 5,8± 2,8 22,6±18,4 26,6±7,3 15,0±9,2 21,4±14,1 9,2±6,0 12,8±7,5 7,6±3,0 234,6±40,5 112,6±12,8* 160,8±62,1 107,2±23,8 98,2±35,5 71,0±10,7 57,8±12,4 17,0±8,6 24,0±12,0 21,2±13,7 396,4±44,7

44,0±28,2 42,8±16,5 71,2±16,7 47,2±24,8 84,4±16,8 35,8±26,8 28,5±13,5 40,0±27,6 37,0±11,9 41,0±17,8 12,4±4,4 24,4±18,4 36,4±15,5 17,8±8,3 314,0±90,9 159,4±105,3

56,3±18,2 63,4±25,4 53,5±19,4 42,7±16,3 23,4±7,2 25,0±13,3 17,5±7,4 281,8±54,7

34,2±18,3 51,4±23,0 64,8±31,3 38,0±14,3 27,1±8,3 23,5±9,2 21,0±10,2 260,0±74,3

53,7±24,1 44,7±18,5 38,9±19,3 40,7±20,7 24,6±11,3 17,4±8,1 20,6±8,3 240,6±94,8 19

Как видно из таблицы 5, у самцов при введении 10 мг/кг препарата отмечена более высокая СДА через 30 и 180 дней после начала введения по сравнению с животными контрольной группы. При введении 100 мг/кг препарата СДА крыс была также выше, чем у контрольных животных. У самок наблюдалась более высокая СДА по сравнению с контрольными животными при введении 10 мг/кг препарата через 180 дней и через 30 дней при введении 100 мг/кг. Однако выявленная тенденция к увеличению СДА ни в одном случае не была статистически значимой. Изучение влияния препарата циклоферон на структуру поведения крыс в "открытом поле" выявило, что достоверных изменений в структуре поведения животных всех экспериментальных групп не наблюдалось. Отмечалось характерное для животных, вторично помещаемых в ситуацию "открытого поля", изменение поведенческого рисунка, в основном за счет удлинения латентного периода, носившего недостоверный характер. Влияние препарата на суммационно-подпороговый показатель и сердечно-сосудистую деятельность Данные по влиянию препарата циклоферон на суммацию подпороговых импульсов представлены в таблице 6. Таблица 6 Влияние препарата на порог возбудимости белых крыс Препарат, мг/кг Физ. раствор 10 100 500

Пол M F M F M F M F

Фон 11,5±1,1 7,9±1,1 10,0±1,1 9,0±0,5 9,2±0,8 9,1±0,5 9,8±1,0 9,6±0,8

День наблюдения 30-й 10,3±0,9 9,7±1,0 9,5±0,9 9,2±0,6 9,1±0,5 9,1±0,6 9,2±0,6 9,0±0,5

180-й 12,1±0,7 7,7±1,3 12,0±1,6 10,1±2,6 11,9±1,6 8,5±0,8 10,6±1,6 10,2±1,0

Из таблицы видно, что введение препарата в течение 180 дней ни в одной из исследованных доз не влияло на порог возбудимости животных. Данные по влиянию на систолическое артериальное давление представлены в таблице 7. 20

Таблица 7 Влияние препарата на систолическое артериальное давление (мм рт. ст.) Препарат, мг/кг

Пол

Фон 112,0±12,9 127,0±8,6 112,0±4,3 119,0±6,5 134,0±17,2 149,0±3,2 126,0±17,2 137,0±3,2

M F M F M F M F

Физ. раствор 10 100 500

День наблюдения 30-й 102,0±6,5 100,0±6,5* 102,0±6,5 96,0±2,2* 102,0±4,3 106,0±10,8* 111,0±6,4 112,0±10,8*

180-й 104,0±8,0 92,0±6,3* 113,0±8,4 95,0±7,4* 104,0±6,3 102,0±4,2* 118,0±7,6 105,0±6,4*

* достоверные отличия от контроля (р<0,05).

У самок, в отличие от самцов, во всех экспериментальных группах, включая контрольную, наблюдалось снижение АД по отношению к фоновым данным, отмеченное при тестировании через 30 и 180 дней после введения. Эти изменения связаны скорее всего с сезонными колебаниями величины АД и большей реактивностью самок, чем самцов. Данные о влиянии препарата на частоту сердечных сокращений и характер электрокардиограммы представлены в таблице 8. Таблица 8 Влияние циклоферона на характер ЭКГ крыс Показатели ЧСС, уд/мин Р, мв R, мв S, мв Т, мв PQ, мс QT, мс

Препарат, мг/кг Физ. раствор M F 384±9

412±17

0,09± 0,02 0,60± 0,05 0,04± 0,03 0,15± 0,02 46,0± 1,1 53,0± 2,2

0,10± 0,02 0,66± 0,09 0,01± 0,01 0,18± 0,03 48,0± 1,1 57,0± 3,2

10

100

M

F M Фоновые данные 488±22 456±34 444±26 0,09± 0,02 0,58± 0,12 0,07± 0,05 0,12± 0,03 45,0± 2,2 55,0± 3,2

0,10± 0,01 0,65± 0,11 0,02± 0,02 0,18± 0,01 47,0± 2,2 58,0± 1,1

0,08± 0,01 0,65± 0,09 0,04± 0,04 0,14± 0,03 46,0± 1,1 61,0± 3,2

500 F

M

F

472±34

464±32

453±28

0,09± 0,03 0,62± 0,15 0,02± 0,02 0,18± 0,01 45,0± 2,2 62,0± 3,2

0,10± 0,02 0,64± 0,10 0,03± 0,02 0,17± 0,01 47,0± 1,5 56,0± 2,6

0,09± 0,02 0,60± 0,12 0,05± 0,03 0,14± 0,03 44,0± 1,6 60,0± 2,6 21

Окончание табл. 8 Показатели ЧСС, уд/мин Р, мв R, мв S, мв Т, мв PQ, мс QT, мс ЧСС, уд/мин Р, мв R, мв S, мв Т,мв PQ, мс QT, мс

Препарат, мг/кг Физ. раствор M F 430±23

436±17

0,10± 0,02 0,60± 0,06 0,04± 0,04 0,15± 0,02 46,0± 1,1 59,0± 4,3

0,09± 0,01 0,70± 0,09 0,01± 0,01 0,20± 0,03 47,0± 1,1 64,0± 3,2

413±15

416±34

0,08± 0,01 0,60± 0,08 0,08± 0,06 0,19± 0,02 43,0± 1,1 56,0± 2,1

0,11± 0,03 0,54± 0,02 0,02± 0,02 0,14± 0,02 46,0± 1,1 61,0± 4,2

10

100

M

F 30 дней 482±26 490±13 0,11± 0,02 0,70± 0,09 0,05± 0,05 0,15± 0,04 44,0± 1,1 64,0± 3,2

0,10± 0,01 0,62± 0,06 0,04± 0,02 0,17± 0,01 47,0± 1,1 63,0± 4,3 180 дней 413±34 428±36 0,09± 0,01 0,68± 0,11 0,08± 0,06 0,13± 0,01 43,0± 1,1 62,5± 2,2

0,08± 0,01 0,64± 0,10 0,04± 0,04 0,17± 0,05 47,0± 1,1 64,0± 5,2

500

M

F

M

F

500±7

512±13

492±18

508±25

0,08± 0,01 0,60± 0,06 0,03± 0,03 0,13± 0,02 49,0± 2,2 60,0± 3,2

0,11± 0,03 0,60± 0,11 0,04± 0,04 0,17± 0,02 45,0± 2,2 64,0± 3,2

0,10± 0,03 0,64± 0,07 0,04± 0,02 0,18± 0,04 46,0± 2,0 62,0± 3,5

0,09± 0,02 0,71± 0,10 0,05± 0,04 0,20± 0,04 48,0± 1,8 60,0± 4,0

400±11

416±13

0,06± 0,01 0,55± 0,11 0,08± 0,04 0,10± 0,02 47,5± 1,1 62,5± 2,1

0,10± 0,1 0,62± 0,04 0,07± 0,04 0,18± 0,04 48,0± 1,1 66,0± 2,1

420± 22 404±30 0,11± 0,02 0,58± 0,09 0,06± 0,03 0,13± 0,02 46,0± 1,0 58,0± 2,0

0,08± 0,1 0,55± 0,10 0,08± 0,04 0,16± 0,05 48,0± 1,0 64,0± 3,4

Из представленных в таблице данных следует, что исследуемый препарат не вызвал изменений частоты сердечных сокращений и характера ЭКГ. Влияние препарата на офтальмологические показатели При офтальмологическом исследовании у животных оценивали состояние слизистых оболочек, наличие правильных роговичных рефлексов, измеряли величину зрачка и ширину глазной щели. В течение 180-дневного наблюдения у животных контрольной и опытных групп отечности или ги22

перемии слизистых не отмечалось, за исключением незначительных травматических повреждений, отмеченных в картах ежедневного наблюдения. Исследованные параметры ни у животных контрольной группы, ни у подопытных животных практически не менялись в течение всего периода наблюдения (табл. 9). Таблица 9 Влияние препарата циклоферон на величину зрачка и ширину глазной щели у белых крыс (мм, М±м) Показатели pd ps fd fs pd ps fd fs pd ps fd fs

Физ. р-р М F 1,12± 0,02 1,15± 0,07 2,70± 0,16 2,71± 0,21

1,13± 0,03 1,16± 0,06 2,72± 0,17 2,70± 0,23

1,12± 0,03 1,15± 0,06 2,71± 0,16 2,70± 0,20

1,13± 0,03 1,16± 0,06 2,72± 0,16 2,70± 0,23

1,13± 0,02 1,18± 0,08 2,72± 0,21 2,73± 0,21

1,15± 0,03 1,18± 0,08 2,72± 0,21 2,72± 0,22

Препарат, мг/кг 10 100 M F M F Фон 1,11± 1,12± 1,13± 1,12± 0,02 0,04 0,02 0,04 1,13± 1,16± 1,17± 1,16± 0,03 0,08 0,07 0,06 2,65± 2,78± 2,81± 2,76± 0,13 0,21 0,17 0,18 2,70± 2,83± 2,84± 2,78± 0,14 0,14 0,16 0,15 30-й день 1,11± 1,12± 1,13± 1,12± 0,04 0,04 0,03 0,04 1,13± 1,16± 1,17± 1,16± 0,04 0,08 0,07 0,08 2,65± 2,78± 2,81± 2,76± 0,13 0,20 0,16 0,18 2,70± 2,82± 2,84± 2,78± 0,14 0,16 0,16 0,15 180-й день 1,12± 1,14± 1,14± 1,14± 0,04 0,04 0,04 0,04 1,15± 1,18± 1,18± 1,18± 0,05 0,08 0,08 0,08 2,70± 2,80± 2,82± 2,80± 0,18 0,24 0,22 0,22 2,70± 2,82± 2,84± 2,80± 0,16 0,16 0,18 0,22

500 M

F

1,11± 0,05 1,15± 0,08 2,68± 0,13 2,74± 0,12

1,12± 0,04 1,14± 0,07 2,75± 0,14 2,76± 0,20

1,11± 0,04 1,14± 0,10 2,82± 0,20 2,75± 0,18

1,13± 0,06 1,15± 0,08 2,72± 0,16 2,78± 0,16

1,15± 0,04 1,17± 0,10 2,77± 0,20 2,82± 0,22

1,16± 0,05 1,19± 0,08 2,81± 0,24 2,78± 0,18

Примечание: р - величина зрачка; f - ширина глазной щели; s - слева; d - справа. 23

Патоморфологическое исследование органов и тканей экспериментальных животных В разделе представлены обобщенные данные некропсии крыс всех исследованных групп, так как по результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами не установлено. Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков 6 отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно, деформации или отека конечностей нет. Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие. Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски. Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции. Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров. Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная. Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски. Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая. 24

Форма и величина печени изменений не представляют. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная. Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции. Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы. Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество. Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко выделяется темно окрашенное мозговое вещество. Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски. Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности. Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет. В таблице 10 представлены данные по массовым коэффициентам органов белых крыс всех экспериментальных групп. Таблица 10 Массовые коэффициенты (МК) органов белых крыс при введении препарата циклоферон (М±m) МК Сердце Легкие с трахеей Тимус Печень Селезенка

Физ. раствор M F 3,7±0,1 3,5±0,1

Препарат, мг/кг 10 100 250 M F M F M F 3,8±0,1 3,8±0,01 3,8±0,1 3,5±0,05 3,7±0,10 3,5±0,10

8,9±0,3 9,1± 0,2 8,8± 0,1 8,7± 0,4 9,1± 0,2 8,4± 0,5 9,1± 0,4 8,5± 0,5 1,44± 1,50± 1,39± 1,29± 1,26± 1,32± 1,30± 1,31± 0,08 0,06 0,08 0,08 0,11 0,08 0,09 0,07 41,6± 39,8± 40,5± 38,8± 38,9± 40,1± 39,3± 40,4± 1,2 2,4 2,5 2,1 0,8 1,7 0,8 1,2 6,0±0,2 6,3±0,3 5,2±0,5 6,0±0,3 6,4±0,5 6,0±0,3 6,0±0,4 6,1±0,4

Окончание табл. 10 25

МК Почка (лев.) Надпочечник (лев.) Головной мозг Яички или яичники

Физ. раствор M F

10 M

4,2±0,1 4,2±0,1 0,16± 0,20± 0,01 0,02 7,24± 7,21± 0,02 0,08 13,4± 0,65± 0,21 0,06

4,2±0,1 0,21± 0,04 7,47± 0,11 14,2± 0,3

Препарат, мг/кг 100 F M 4,4±0,2 0,25± 0,01 7,48± 0,15 0,72± 0,08

4,1±0,1 0,15± 0,04 7,24± 0,09 14,0± 0,3

250 F

M

F

4,3±0,2 0,20± 0,02 7,23± 0,12 0,78± 0,09

4,1±0,1 0,18± 0,04 7,30± 0,10 13,8± 0,5

4,2±0,2 0,21± 0,03 7,20± 0,13 0,76± 0,08

Из представленных данных следует, что достоверных отличий массовых индексов органов крыс контрольной группы от опытных, как и патологических сдвигов, нет. Результаты гистологического исследования Объекты фиксировали в 10-15% формалине или жидкости Карнуа и заливали в парафин. Головной мозг фиксировали в 96% спирте и заливали в целлоидин. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, срезы головного мозга окрашивали по Нисслю. При просмотре гистологических препаратов изучаемых органов контрольных животных и животных, получавших максимальную дозу препарата, различий не обнаружено. Цитоархитектоника коры больших полушарий головного мозга не нарушена, очагов выпадения нет. Сосуды мозговых оболочек умеренно полнокровные; кортикальные сосуды равномерного диаметра, содержат единичные эритроциты. Признаки острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Ядра нейронов светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. В цитоплазме определяется достаточное количество хроматофильной зернистости Ниссля: пылевидной в цитоплазме нейронов 2-3-го слоев и более крупной - в цитоплазме нейронов 5-го слоя коры больших полушарий. Нейроны разных ядерных образований среднего и продолговатого мозга содержат крупные глыбки тигроида. Ядра нервных и глиальных клеток не изменены - ядерная мембрана тонкая, содержание хроматина нормальное, ядрышки четкие. Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкций эластических волокон средней оболочки нет. Поперечная исчерченность миофибрилл во всех отделах сердца отчетливая, ядра кардиомиоцитов содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Избыточного разрастания стромы (кардиофиброза) нет. 26

Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов без изменений. Острые воспалительные изменений легочной ткани отсутствуют. Трабекулярное строение печени на срезах, полученных из объектов разных долей печени, нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина. Ядерная мембрана тонкая. Синусоиды печени полнокровные. Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые, четкие. Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры надпочечников отчетливо выражены, клеточные ядра содержат достаточное количество хроматина. Цитоплазма клеток пучковой зоны вакуолизирована за счет содержания большого количества липидов. Клетки мозгового вещества крупные, овальной формы, объединенные в гроздья и тяжи. Лимфоретикулярные элементы лимфатических узлов и селезенки с четкими ядрами, деструкции или атрофии фолликулов нет. В красной пульпе селезенки видны очаги кроветворения с единичными мегакариоцитами. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка выстлана многослойным плоским эпителием, клетки которого изменений не представляют. Покровный эпителий слизистой тела желудка образован слизистыми цилиндрическими клетками, дефектов эпителиальной выстилки нет. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка не изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия слизистой пищевода нет. Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат светлые, четкие ядра, цитоплазма слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части железы базофильные, ядра, расположенные в средней части, четкие, с достаточным количеством хроматина. Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные. Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные. Строение подчелюстных желез нарушений не представляет. Эпителиальные клетки концевых отделов и выводных протоков с четкими ядрами, деструкции клеток нет. 27

Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами/тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержит меньшее количество лимфоцитов, а также светлые эпителиальные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная. В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Клетки семенных канальцев яичек самцов находятся на разных стадиях сперматогенеза. Эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие. Следовательно, по результатам некропсии и гистологического исследования введение препарата циклоферон в дозах 10, 100 и 500 мг/кг в течение 180 дней крысам обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей на местах инъекций, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов. Таким образом, применение препарата циклоферон у крыс обоих полов внутримышечно один раз в сутки в течение 180 дней в дозах 10, 100 и 500 мг/кг не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не вызывает пирогенный эффект, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата. При этом препарат циклоферон у крыс (как самцов, так и самок) способствует умеренной, но статистически значимой активации процессов лимфо-, эритро- и тромбоцитопоэза, что свидетельствует о его гемопоэтическом эффекте.

ВНУТРИВЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА КРЫСАХ Эксперименты проводились в соответствии с Протоколом исследования. Препарат вводили в/в ежедневно в хвостовую вену крыс в дозах 10, 100 и 250 мг/кг на протяжении 180 дней. Все полученные экспериментальные данные были подвергнуты статистической обработке. Влияние препарата циклоферон на массу тела белых крыс, потребление корма и воды Полученные результаты представлены в таблицах 11-12. 28

Таблица 11 Влияние введения препарата циклоферона на массу тела белых крыс (г, М±m) Сроки исследования (дни) Фон 7-й 14-й 21-й 30-й 180-й

Физ. раствор М F 184± 3,1 191± 2,0 199± 3,9 204±2,5 212± 4,6 215±2,6 225± 3,8 228±3,0 240± 7,2 240± 3,0 320± 330± 8,8 10,2

Препарат, мг/кг 10 100 M F M F 175± 4,1 169± 2,0 191± 3,1 181± 3,0 186± 4,0 179± 2,7 206±3,6 193± 3,1 197± 3,6 191± 3,2 218± 3,1 205± 2,6 208± 3,6 202± 3,8 231± 3,1 214± 2,6 219± 3,8 214± 4,0 239± 3,5 228± 3,0 340± 330± 340± 320± 10,8 12,4 20,2 16,2

250 M 170± 1,5 182±3,1 194± 2,6 205± 2,6 217± 2,6 320± 20,8

F 170± 2,6 181± 2,1 194± 3,1 205± 3,1 216± 3,6 335± 15,6

Вес животных равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольных, так и в опытных группах. Раз в неделю, через 2 часа после инъекции, для учета потребления воды и пищи крысы высаживались в обменные клетки фирмы "Texnoplast Gazzada" на сутки. Таблица 12 Влияние препарата циклоферон на потребление корма белыми крысами (г/сутки) Сроки исследования (дни) Фон 7-й 14-й 21-й 30-й 90-й 180-й

Физ. раствор М F 18,0 18,0 17,5 17,8 16,5 18,0 16,5 16,5 21,3 17,4 18,6 17,8 20,0 18,2

M 18,0 18,5 16,5 16,0 19,1 19,2 19,4

Препарат, мг/кг 10 100 F M F 16,5 20,5 20,0 17,0 19,0 17,5 17,0 19,0 19,5 18,0 20,5 17,5 17,4 20,6 20,1 17,6 17,4 18,4 17,8 20,4 20,6

250 M 18,0 19,0 18,5 18,0 19,6 19,2 19,6

F 16,0 19,0 17,5 16,5 18,3 18,6 18,2

Потребление корма и воды возрастало в течение эксперимента. При этом существенной разницы в исследуемых показателях в экспериментальных группах по сравнению с контрольными не отмечалось. Влияние препарата циклоферон на ректальную температуру и длительность гексеналового сна

29

Данные измерения ректальной температуры крыс с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ±1%) представлены в таблице 13. Таблица 13 Влияние препарата циклоферон на температуру тела белых крыс (С0, M±m) Сроки Препарат, мг/кг исследоваФиз. раствор 10 100 250 ния (дни) М F M F M F M F Фон 36,6±0,4 36,4±0,7 35,9±0,5 36,1±0,7 35,3±0,4 36,6±0,3 35,6±0,8 36,1±0,6 30-й 35,4±0,6 36,7±0,3 36,1±0,5 36,9±0,2 35,1±0,5 36,8±0,2 36,2±0,4 35,9±0,2 180-й 36,5±0,6 36,7±0,5 36,0±0,5 36,3±0,4 35,6±0,5 36,6±0,4 36,0±0,5 36,3±0,4

Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий между таковой у животных опытных и контрольной групп, при этом, можно с уверенностью говорить об апирогенности лекарственной формы препарата циклоферон. Детоксикационную функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна, эксперимент проводился в теплом и тихом помещении. Животных взвешивали и внутрибрюшинно вводили раствор гексенала в дозе 90 мг/кг, растворитель - 0,9% NaCl. Данные представлены в таблице 14. Таблица 14 Влияние препарата циклоферон на продолжительность гексеналового сна у белых крыс (мин, M±m) Сроки исследования (дни) Фон 30-й 180-й

Физ. раствор М F 36,9 ± 6,0 46,8± 8,7 57,6±6,9

Препарат, мг/кг 10 100 M F M 41,5± 5,7 41,8± 6,1 44,5± 6,8 46,7± 4,2 42,6±6,2 36,5±5,2

250 F -

M 40,5± 6,3 43,4±4,8 37,8±6,2

F -

Оказалось, что препарат не изменяет продолжительность гексеналового сна, т.е. не оказывает отрицательного влияния на детоксицирующую функцию печени. Влияние препарата циклоферон на параметры функционального состояния почек Таблица 15 30

Влияние препарата циклоферон на секреторную функцию почек белых крыс (количество выделенной краски в мг/100 г веса, M±m) Сроки исследования (дни) Фон 30-й 180-й

Препарат, мг/кг Физ. раствор М F 0,090± 0,087± 0,006 0,005 0,080± 0,081± 0,004 0,003 0,093± 0,100± 0,006 0,008

10 M 0,098± 0,009 0,080± 0,004 0,096± 0,010

100 F 0,082± 0,004 0,081± 0,004 0,095± 0,006

M 0,090± 0,006 0,099± 0,009 0,106± 0,012

F 0,080± 0,006 0,088± 0,008 0,095± 0,010

250 M 0,080± 0,006 0,090± 0,008 0,094± 0,006

F 0,090± 0,008 0,083± 0,004 0,102± 0,006

Анализы мочи и оценка секреторной функции почек по секреции фенол-красного проведены в фоне и через 30 и 180 дней после начала введения препарата. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений со стороны выделительной функции почек при в/в введении препарата циклоферон белым крысам в течение всего срока исследования. Влияние препарата на суммационно-подпороговый показатель и сердечно-сосудистую деятельность Данные по влиянию препарата циклоферон на суммацию подпороговых импульсов представлены в таблице 16. Таблица 16 Влияние препарата циклоферон на порог возбудимости у белых крыс (в, M±m) Препарат, мг/кг Физ. раствор 10 100 250

Пол M F M F M F M F

Фон 11,2±0,4 10,7±1,18 13,5±1,6 9,9±2,2 13,2±3,0 10,2±1,9 10,6±1,0 10,6±1,0

День наблюдения 30-й 7,5±0,5* 8,2±0,6 10,5±1,6 8,2±1,3 10,6±0,9* 9,6±0,9 7,8±0,65* 6,0±1,0*

180-й 8,2±0,6* 7,2±1,0* 12,0±1,8 10,1±2,2 10,5±1,0* 8,7±1,1 9,0±0,7 7,2±1,0*

* - достоверные отличия (р<0,05) по сравнению с фоном.

Во всех экспериментальных группах животных, включая контрольную, наблюдалось равнозначное снижение величины СПП по отношению к фоновым данным.

31

Данные по влиянию препарата циклоферон на систолическое артериальное давление представлены в таблице 17. Таблица 17 Влияние препарата циклоферон на систолическое артериальное давление у белых крыс (мм рт. ст., M±m) Препарат, мг/кг Физ. раствор 10 100 500

Пол M F M F M F M F

Фон 108,0±3,3 114,0±2,5 112,0±8,8 123,0±3,4 123,8±7,9 122,0±8,2 114,0±7,2 108,0±3,2

День наблюдения 30-й 180-й 137,0±9,1 110,0±8,3 133,0±7,5* 130,0±6,5* 122,0±6,5 118,0±8,2 119,0±2,4 105,0±7,1* 117,0±7,3 110,0±7,8 126,0±3,4 112,0±4,2 130,0±7,1 120,0±8,0 134,0±5,8* 122,0±5,4*

* - достоверные отличия от фона (р<0,05).

У самок контрольной группы наблюдалось незначительное, но достоверное повышение систолического артериального давления. Данные о влиянии препарата циклоферон на частоту сердечных сокращений и характер электрокардиограммы свидетельствовали, что исследуемый препарат не вызывал значимых изменений сердечной деятельности крыс. Выявленное увеличение длительности интервала PQ в сравнении с контролем у самцов, получавших циклоферон в дозе 100 мг/кг, и урежение ЧСС по сравнению с фоновыми данными у самцов в группе, которой вводили препарат в дозе 250 мг/кг, а также учащение сердечного ритма (по сравнению с контролем) у самок при в/в введении препарата в дозе 250 мг/кг не имеют характерной пропорциональной зависимости типа "доза эффект", незначительны в количественном выражении, не выходят за пределы нормальных физиологических колебаний (±2%) и соответствуют величинам, присущим здоровым белым крысам. Влияние препарата на показатели периферической крови и характер миелограммы Биохимические и гематологические исследования проводились до начала введения препарата, через 30 и 180 дней после ежедневного введения. Кровь получали после одномоментного гильотинирования с последующим извлечением бедренной кости для исследования миелограммы.

32

При микроскопировании мазков крови лимфоциты имели сильно пикнотическое ядро, иногда обнаруживалась значительная азурофильная зернистость. Основная масса сегментоядерных клеток имела нежную, нейтрофильную, не вполне ясно выраженную зернистость в мазках. Ядра эозинофильных клеток были образованы из рыхлого хроматинового вещества и имели почти круглую форму. Ядра эозинофилов и нейтрофилов образуются по кольчатому типу, поэтому нередко встречались кольцеобразные ядра у палочковидных форм. Моноциты сильно отличались от лимфоцитов. Последние были равны по величине двум эритроцитам, имели большое бобовидное ядро и широкую протоплазматическую кайму, которая окрашивалась в синий или фиолетовый цвет с нежной грануляцией. Кровяные пластинки лежали большими кучками. К 30 и 180 дню у крыс обоего пола, получавших препарат, наблюдалось достоверное увеличение количества гемоглобина, эритроцитов, моноцитов и тромбоцитов периферической крови, укладывающееся в физиологическую норму варьирования. При микроскопировании мазков костного мозга органы кроветворения крыс содержали круглоядерные клетки, нейтрофильные и эозинофильные миелоциты, полинуклеарные нейтрофилы и эозинофилы, нормобласты и гигантские клетки. Основная масса клеток костного мозга состояла из круглоядерных клеток, полинуклеаров и переходных форм с большей или меньшей перешнуровкой ядра. Одноядерные клетки были достаточно разнообразны, ядра их мелкие, расположены центрально или эксцентрично, в ряде случаев полностью заполняли клетку. Полинуклеарные формы были чаще нейтрофильны и реже эозинофильны. Нейтрофильная грануляция была нежна и не очень обильна. Эозинофильная грануляция хорошо выражена. Базофилы имели круглое или лопастное ядро. Гигантские клетки с гомогенной плазмой и многочисленными мелкими центрально лежащими ядрами попадались редко. Нормобласты имели типичные ядра и протоплазму. Костный мозг крыс как контрольной, так и опытных групп по своему количественному составу соответствовал видовой физиологической норме. Вместе с тем в костном мозге крыс, получавших препарат, происходило умеренное, но статистически достоверное увеличение общего количества клеток, а также клеток эритроцитарного ростка, лимфоцитов и монокариоцитов. Это свидетельствует о физиологической стимуляции процессов эритро-, лимфо- и тромбопоэза под воздействием препарата циклоферон. При исследовании биохимических показателей крови выявлено, что колебания значений изученных показателей находятся в пределах физиологической нормы. Достоверных отличий между группами не выявлено. Половых различий не наблюдалось. 33

Таким образом, длительное внутривенное введение лекарственной формы препарата циклоферон не оказывает токсических эффектов на основные системы организма. Влияние препарата циклоферон на офтальмологические показатели При офтальмологическом исследовании у животных оценивали состояние слизистых оболочек, наличие правильных роговичных рефлексов, измеряли величину зрачка и ширину глазной щели. В течение 180-дневного наблюдения у животных контрольной и опытных групп отечности или гиперемии слизистых не отмечалось, за исключением незначительных травматических повреждений, отмеченных в картах ежедневного наблюдения. Таблица 18 Влияние препарата циклоферон на величину зрачка и ширину глазной щели у белых крыс (мм, M±m) Показатели

pd ps fd fs pd ps fd fs

Физ. р-р М F 1,14± 0,03 1,22± 0,05 2,70± 0,15 2,70± 0,21

1,13± 0,03 1,10± 0,02 2,80± 0,15 2,70± 0,10

1,19± 0,06 1,14± 0,08 3,67± 0,11 3,78± 0,11

1,08± 0,06 1,02± 0,06 3,30± 0,15 3,41± 0,10

Препарат, мг/кг 10 100 250 M F M F M F Фон 1,18± 1,00± 1,04± 1,04± 1,03± 1,10± 0,03 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 1,21± 1,75± 1,02± 1,12± 1,08± 1,12± 0,03 0,04 0,04 0,02 0,05 0,04 3,80± 3,00± 2,96± 3,05± 3,00± 3,50± 0,21 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 3,20± 3,06± 3,10± 3,10± 3,10± 3,60± 0,21 0,15 0,10 0,10 0,15 0,15 30-й день 1,12± 1,10± 1,08± 1,00± 1,15± 0,92± 0,06 0,08 0,02 0,04 0,07 0,04 1,14± 1,06± 1,13± 0,98± 1,14± 0,96± 0,02 0,08 0,07 0,04 0,07 0,04 3,50± 3,17± 3,55± 3,40± 3,50± 3,05± 0,10 0,17 0,10 0,10 0,21 0,15 3,65± 3,39± 3,45± 3,26± 3,35± 3,06± 0,10 0,22 0,15 0,15 0,15 0,15 Окончание табл. 18 Препарат, мг/кг

34

Показатели pd ps fd fs

Физ. р-р М F 1,15± 0,04 1,13± 0,06 3,05± 0,21 3,12± 0,20

1,10± 0,05 1,10± 0,07 2,96± 0,22 3,02± 0,21

10 M F 180-й день 1,13± 1,11± 0,04 0,05 1,11± 1,12± 0,05 0,08 2,85± 3,04± 0,18 0,24 2,92± 2,92± 0,16 0,18

100

250

M

F

M

F

1,13± 0,04 1,12± 0,07 3,25± 0,22 3,14± 0,20

1,09± 0,05 1,10± 0,10 2,96± 0,22 3,07± 0,21

1,14± 0,04 1,10± 0,08 3,10± 0,20 3,02± 0,18

1,16± 0,05 1,19± 0,06 3,27± 0,24 3,14± 0,22

Примечание: р - величина зрачка; f - ширина глазной щели; s - слева; d - справа.

В таблице 18 представлены результаты измерения величины зрачка и ширины глазной щели, указанные параметры ни у животных контрольной группы, ни у подопытных животных практически не менялись в течение всего периода наблюдения. Патоморфологическое исследование Представлены обобщенные данные некропсии крыс всех исследованных групп, так как по результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами не установлено. Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно. Деформации или отека конечностей нет. Выстриженная кожа на месте введения препарата гладкая, бледной окраски. Подкожная клетчатка и мышцы на месте введения не уплотнены; отека, инфильтрации, изменения цвета мышц не было. Стенка вены гладкая, без уплотнений. Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие. Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой 35

капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски. Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции. Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров. Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная. Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски. Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая. Форма и величина печени изменений не представляют. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная. Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции. Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы. Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество. Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко выделяется темноокрашенное мозговое вещество. Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски. Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности. 36

Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет. В таблице 19 представлены данные по массовым коэффициентам органов белых крыс из всех экспериментальных групп. Таблица 19 Массовые коэффициенты (МК) органов у белых крыс при введении препарата циклоферон (M±m) Препарат, мг/кг МК

Сердце Легкие с трахеей Тимус

Физ. раствор M F

10

100

250

F M F M F 30 дней 3,9± 0,3 4,3± 0,4 4,5± 0,5 3,8± 0,6 4,4± 0,2 3,6± 0,3 3,9±0,06 4,0±0,05

7,5± 0,5 6,9± 0,1 1,36± 1,4± 0,3 0,2 Печень 36,2±1,2 30,8±0,6 Селезенка 4,8±0,1 4,9±0,2 Почка (лев.) 5,8±0,3 6,0±0,1 Надпочечник 0,11± 0,10± (лев.) 0,01 0,02 Головной мозг 7,4±0,2 7,6±0,2 Яички или 7,21± 0,30± яичники 0,20 0,02 Сердце 4,1±0,2 3,8±0,1 Легкие с трахеей 7,0±0,3 7,3±0,4 Тимус 1,2±0,1 1,25±0,1 Печень 32,6±1,2 33,4±1,7 Селезенка 5,2±0,3 5,1± 0,3 Почка (лев.) 6,2±0,3 6,1±0,4 Надпочечник 0,14± 0,12± (лев.) 0,04 0,02

M

7,4± 0,4 6,8± 0,6 7,1± 0,1 7,3± 0,4 7,3± 0,4 7,4± 0,5 1,36± 1,44± 1,62± 1,51± 1,51± 1,48± 0,18 0,21 0,46 0,42 0,42 0,17 36,2±2,1 34,1±2,7 30,6±1,8 31,5±1,5 32,8±2,1 35,4±1,2 5,4±0,4 5,2±0,6 5,0±0,1 4,8±0,6 5,2±0,3 5,1±0,5 5,7±0,7

6,3±0,4

6,5±0,5

6,7±0,7

5,8±0,4

5,8±0,5

0,10± 0,03

0,10± 0,05

0,12± 0,06

0,13± 0,04

0,13± 0,05

0,15± 0,04

7,6±0,4 7,44± 0,36

7,4±0,2 0,33± 0,07

7,6±0,1 7,40± 0,18

7,4±0,2 0,32± 0,06

4,5±0,5

4,1±0,3

4,1±0,1

3,9±0,2

7,9±0,3 7,26± 0,3 -

8,0±0,2 0,28± 0,06 180 дней -

-

-

7,1±0,5 1,6±0,5 30,0±0,2 5,2±0,4

7,4±0,6 1,9±0,6 31,6±1,8 5,6± 0,4

7,3±0,4 1,5±0,4 33,0±1,1 5,7± 0,4

7,5±0,5 1,4±0,07 34,2±1,2 6,0± 0,4

-

-

5,0±0,2

6,1±0,3

5,1±0,4

5,6±0,4

-

-

0,12± 0,04

0,09± 0,01

0,14± 0,04

0,11± 0,04

Окончание табл. 19 Препарат, мг/кг 37

МК Головной мозг Яички или яичники

Физ. раствор M F 7,6±0,1 7,12± 0,15

7,8±0,2 0,36± 0,06

10

100

250

M

F

M

F

M

F

-

-

7,5±0,3 7,28± 0,30

8,1±0,5 0,32± 0,04

7,7±0,2 8,18± 0,23

8,0±0,4 0,35± 0,10

Достоверных отличий массовых индексов органов крыс контрольной группы от опытных нет. Результаты гистологического исследования Объекты фиксировали в 10-15% формалине или жидкости Карнуа и заливали в парафин. Головной мозг фиксировали в 96% спирте и заливали в целлоидин или парафин. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, срезы головного мозга окрашивали по Нисслю. При просмотре гистологических препаратов изучаемых органов контрольных животных и животных, получавших максимальную дозу препарата, различий между группами не обнаружено. Цитоархитектоника коры больших полушарий головного мозга не нарушена, очагов выпадения нет. Сосуды мозговых оболочек умеренно полнокровные; кортикальные сосуды равномерного диаметра, содержат единичные эритроциты. Признаки острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Ядра нейронов светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. В цитоплазме определяется достаточное количество хроматофильной зернистости Ниссля: пылевидной - в цитоплазме нейронов 23-го слоев и более крупной - в цитоплазме нейронов 5-го слоя коры больших полушарий. Нейроны разных ядерных образований среднего и продолговатого мозга содержат крупные глыбки тигроида. Ядра нервных и глиальных клеток не изменены - ядерная мембрана тонкая, содержание хроматина нормальное, ядрышки четкие. Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкций эластических волокон средней оболочки нет. Поперечная исчерченность миофибрилл во всех отделах сердца отчетливая, ядра кардиомиоцитов содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Избыточного разрастания стромы (кардиофиброза) нет. Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов 38

без изменений. Острые воспалительные изменения легочной ткани отсутствуют. Трабекулярное строение печени на срезах, полученных из объектов разных долей печени, нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина. Ядерная мембрана тонкая. Синусоиды печени полнокровные. Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые, четкие. Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры надпочечников отчетливо выражены, клеточные ядра содержат достаточное количество хроматина. Цитоплазма клеток пучковой зоны вакуолизирована за счет содержания большого количества липидов. Клетки мозгового вещества крупные, овальной формы, объединенные в гроздья и тяжи. Лимфоретикулярные элементы лимфатических узлов и селезенки с четкими ядрами, деструкции или атрофии фолликулов нет. В красной пульпе селезенки видны очаги кроветворения с единичными мегакариоцитами. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка выстлана многослойным плоским эпителием, клетки которого изменений не представляют. Покровный эпителий слизистой тела желудка образован слизистыми цилиндрическими клетками, дефектов эпителиальной выстилки нет. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка не изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия слизистой пищевода нет. Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат светлые, четкие ядра, цитоплазма слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части железы базофильные, ядра, расположенные в средней части, четкие, с достаточным количеством хроматина. Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные. Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные. Строение подчелюстных желез нарушений не представляет. Эпителиальные клетки концевых отделов и выводных протоков с четкими ядрами, деструкции клеток нет. Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами/тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержит меньшее количество лимфоцитов, а также светлые эпителиаль39

ные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная. В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Клетки семенных канальцев яичек самцов находятся на разных стадиях сперматогенеза. Эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие. Место введения препарата - кожа, подкожная клетчатка и стенка вены изменений не представляли. Безальная мембрана эпидермиса была четкой, слоистое строение эпидермиса нарушений не представляло, сосуды сосочкового слоя дермы имели обычный диаметр, отека или воспаления нет. Поперечная исчерченность мышцы отчетливая, ядра без изменений. Стенка вены в месте введений изменений не представляла. Все слои отчетливо выражены, эндотелий имеет четкие ядра. Таким образом, по результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное внутривенное введение препарата циклоферон в дозах 10, 100 и 250 мг/кг в течение 180 дней крысам обоего пола не вызывает дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов. МЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ НА ТКАНИ Местное действие препарата циклоферон изучали при наружном и внутримышечном применении. При наружном - действие препарата оценивали на модели мерцательного эпителия пищевода лягушки и при внесении растворов препарата в конъюнктивальный мешок глаза кролика. При внутримышечном - по клиническим проявлениям и характеру патоморфологических изменений в мышцах. Цитотоксический эффект циклоферона изучали на болотных лягушках Rana temporaria массой 25 г. После обездвиживания (разрушением спинного мозга) и фиксации животных на пробковом столе вскрывали грудную клетку, выделяли пищевод и рассекали в каудальном направлении. Над глоточной частью пищевода устанавливали две штанги. В опытах регистрировали время прохождения пробковой кошкой участка пищевода (10 мм), ограниченного штангами, до и после внесения растворов препарата циклоферон в различных концентрациях. Продолжительность воздействия - 2 мин. 40

Влияние препарата циклоферон на слизистые оболочки глаза изучали на кроликах, которым два раза в день в течение 10 дней в конъюнктивальный мешок левого глаза закапывали по 2-3 капли 12,5% раствора лекарственной формы препарата, а в правый глаз - такое же количество дистиллированной воды. Местное действие циклоферона при внутримышечном применении изучали на 12 кроликах. Из них четырем в область правой ягодичнобедренной группы мышц вводили по 1,5 мл раствора циклоферона 25 мг/кг, четырем другим таким же образом раствор препарата - 12,5 мг/л, а остальным кроликам соответствующее количество 0,9% изотонического раствора хлорида натрия. Исследования на слизистой пищевода лягушек В опытах на лягушках установлено, что нанесение на слизистую пищевода раствора лекарственной формы, содержащего в 1 мл 25 и 50 мг препарата циклоферон, не отражается на функции мерцательного эпителия лягушки (табл. 20). Таблица 20 Действие растворов препарата циклоферон на двигательную функцию мерцательного эпителия пищевода лягушки Концентрация растворов, мг/мл

Количество опытов

12,5 (лек. форма) 25,0 50,0 100,0 250,0

10 10 10 8 6

Время прохождения (с) меткой участка пищевода длиной 10 мм После нанесения растворов, через Исходное 13 мин 7-10 мин 22,4±1,4 28,0±1,6 2,4±1,8 25,1±1,2 22,2±1,6 23,0±1,9 21,3±1,5 19,6±1,2 23,3±1,2 24,2±1,4 37,0±2,0 34,7±2,1 90-120 паралич 22,5±1,5

Пороговой оказалась концентрация 100 мг/мл, а раствор 250 мг/мл вызывал торможение движения ресничек и паралич двигательной функции реснитчатого эпителия. Аналогично угнетающее действие оказывает гипертонический раствор поваренной соли 100 мг/мл. Исследования на слизистой глаз у кроликов В опытах на кроликах 10-дневное закапывание в глаза 12,5% раствора лекарственной формы препарата циклоферон не вызывало явлений альте41

рации и других признаков воспаления слизистых оболочек. При патогистологическом изучении как в опыте, так и в контроле не было выявлено изменений в строении оболочек глаза. В роговице четко различались передний эпителиальный слой, собственное вещество и слой эндотелиальных клеток. Передний эпителиальный слой образован многослойным плоским неороговевающим эпителием. Толщина этого слоя была одинаковой в опыте и контроле. Целостность эпителиального пласта сохранялась на всем протяжении. Гистологическое строение конъюнктивы век под действием препарата не изменялось. Она была образована многослойным плоским эпителием. В эпителиальном пласте были рассеяны бокаловидные клетки, секретирующие слизь. Под эпителием находился слой рыхлой соединительной ткани, в котором встречались небольшие скопления лейкоцитов. У всех животных в конъюнктиве отсутствовали явления отека, гиперемии и воспалительной инфильтрации. После однократных мышечных инъекций растворов циклоферона 25 и 12,5% никаких клинических проявлений, свидетельствующих о повреждающем действии препарата, обнаружено не было. На вскрытии при визуальном осмотре мышц в месте введения препарата обнаружены небольшие кровоизлияния; уплотнения, отек и размягчение мышечных волокон макроскопически не были выявлены. При микроскопическом изучении в месте введения растворов препарата циклоферон обеих концентраций обнаружены локальные области некроза мышечных волокон, небольшой отек, кровоизлияния и признаки развивающейся воспалительной реакции. Такие же патологические изменения имели место в мышечной ткани после введения физиологического раствора. Таким образом, при однократном введении циклоферона в указанных концентрациях развиваются патологические изменения, степень распространения и характер которых сходен с изменениями, наблюдаемыми после внутримышечного введения физиологического раствора.

42

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ (ЦИРКУЛЯЦИЯ И ВЫВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА) Продолжительность циркуляции препарата циклоферон в крови и элиминацию из организма изучали на двух собаках с удаленным мочевым пузырем и выведенными на кожу передней брюшной стенки мочеточниками. Раствор лекарственной формы вводили внутримышечно, внутривенно и внутрь в дозах 10 мг/кг. Содержание препарата в крови и моче определяли по интенсивности характерной дублетной полосы 430-440 нм в спектре флуоресценции. Спектры были получены на спектрофлуорофотометре Shimadzu 5000 (в слое 1 см) при возбуждении в максимуме полосы возбуждения циклоферона (350). Спектральная ширина щелей обоих монохроматоров составляла 5 нм, скорость сканирования (20 нм/мин) обеспечивала отсутствие временных искажений. Для уменьшения рассеянного света, а также фоновой флуоресценции использовались скрещенные поляризаторы. Калибровочная кривая строилась по интенсивности флуоресценции для растворов циклоферона (концентрация изменялась в пределах трех порядков) в воде. Предварительно было установлено, что содержащиеся в биологических жидкостях белки не вызывают эффективного тушения флуоресценции циклоферона. Поскольку ширина полосы флуоресценции не зависела от концентрации, использование пиковых интенсивностей в максимуме приводило к значительно более высокой точности, чем интегральных. Пробы крови и мочи отбирали одновременно через различные промежутки времени в течение 48 часов. Сроки исследования и результаты определения приведены в таблице 21. Таблица 21 Концентрация препарата циклоферон в крови собак после введения его животным различными путями Способ Сроки отбора проб (ч) и результаты определения содержания препарата в крови, мкг/мл введения 0,25 0,5 1 2 3 4 5 6 8 24 36 48 в/м 30 62 35 20 18 12 10 8 1 следы следы 0 в/в 75 125 65 45 35 21 10 6 следы следы следы 0 п/о 0 0 0 7 13 18 16 15 12 следы следы 0

Препарат циклоферон, введенный внутримышечно, быстро проникает в кровь. При таком пути введения максимальный уровень содержания пре43

парата в крови (62 мкг/мл) достигается через 30 мин, затем он постепенно снижался и через 8 часов не превышал 1 мкг/мл. Период двукратного снижения концентрации в крови (Т50%) составлял 0,9-1,1 часа. После внутривенных инъекций циклоферона препарат определяли в крови в течение 6 часов. При этом максимальные концентрации были в два раза выше, чем при внутримышечном (125 мкг/мл, а Т50% - 0,75-1,0 час). После перорального введения циклоферона в той же дозе (10 мг/кг) препарат начинал улавливаться в крови только через 2 часа (7 мкг/мл). Максимальное повышение концентрации до 18 мкг/мл наблюдалось через 3 часа, затем уровень концентрации постепенно снижался, но на низких цифрах от оставался более продолжительное время, чем при внутримышечном введении. Из организма циклоферон выводится в неизменном виде, главным образом почками. Наибольшие концентрации препарата в моче после внутримышечного введения наблюдались через 30 минут. Максимальный уровень концентрации в моче был в 3-6 раз выше, чем в крови. В дальнейшем почечная экскреция циклоферона постепенно уменьшалась, и в заметно снижающихся концентрациях препарат определялся в течение 24 часов, а в следовых количествах (1-4 мкг/мл) - до 36 часов. Через 48 часов препарат в моче не обнаруживался. Т50% для циклоферона в моче при внутримышечном введении составлял 3-3,5 часа, при внутривенном - 2-2,5 часа. При пероральном применении сохранялся тот же характер почечной экскреции циклоферона, что и при других путях введения, но препарат в моче определялся в соответственно более низких концентрациях (Сmax = 28 мкг/мл). ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ЦИКЛОФЕРОНА В разделе представлены результаты изучения динамики выведения препарата циклоферон из организма человека. Исследования проводили на группе практически здоровых добровольцев мужского пола из 5 человек. Препарат вводили однократно парентерально (внутримышечно) в дозе 500 мг. Через определенные промежутки времени (40 минут, 1, 2, 3, 4, 6, 12, 40, 72 и 200 часов) отбирали пробы крови и определяли в них содержание препарата. Изучено также содержание препарата в моче этих добровольцев. Концентрация препарата в биологическом материале определялась методом спектрофлуорометрии с использованием прибора СФЛ-2. 44

Молекула циклоферона при УФ-возбуждении в широкой спектральной области (200-390 нм) обладает интенсивной полосой флуоресценции (квантовый выход 0,8) в области 400-500 нм. Возбуждение на длинноволновом краю полосы поглощения циклоферона (380 нм) не затрагивает большинства компонентов плазмы крови и позволяет проводить определение достаточно селективно. Для достоверного определения содержания циклоферона в исследуемых образцах были построены градуировочные кривые. Концентрацию препарата определяли по интенсивности испускания на длине волны 448 нм, погрешность определения концентрации препарата не превышает 5%, воспроизводимость результатов для нескольких проб была порядка 5%. Экспериментальные данные по содержанию препарата в образцах плазмы и сыворотки крови приведены в таблице 22, из которой видно, что концентрация препарата в крови достигает максимального значения менее чем за 40 минут (0,65 часа), составив 0,108 - 0,110 отн. ед. и 522 - 544х105 мг/мл, и начинает снижаться, через 2 часа от момента введения препарата концентрация его в крови снизилась в 9,8 и 11,4 раза, составив 53 и 48,6х105 мг/мл, а через 16 часов она уже составила 2,3х105 мг/мл и соответственно 0,001 отн.ед. Таблица 22 Содержание циклоферона в плазме и сыворотке крови добровольцев в зависимости от времени после введения препарата Время отбора проб (часы) 0,65 1 2 3 4 6 12 16 48 72 200

Содержание препарата в плазме крови в сыворотке крови 5 отн.ед. 10 мг/мл отн.ед. 105 мг/мл 0,108 522,0 0,110 554,0 0,060 207,0 0,064 234,0 0,025 53,0 0,025 48,6 0,013 23,2 0,0138 24,2 0,006 13,4 0,007 13,4 0,003 8,6 0,0032 8,6 0,002 4,0 0,002 4,0 0,001 2,3 0,001 2,3 0,002 3,6 0,0014 9,0 0,0396 59,8 0,042 64,6 0,0344 0,20 0 0,0

Через 48 часов во всех пробах наблюдается нарастание концентрации препарата до 3,6х105 мг/мл в плазме и до 9,0х105 мг/мл в сыворотке крови, составив 0,7 и 1,6% от 0,65 часов, через 72 часа концентрация препарата составила соответственно 59,8х105 мг/мл и 64,6х105 мг/мл, т.е. 11,4 и 11,6% 45

от 0,65 часа. Через 200 часов в сыворотке крови препарат определяется, а в плазме его следы 0,20х105 мг/мл. Циклоферон циркулирует в кровеносном русле, находясь как в свободном, так и в связанном с белками плазмы крови состоянии. Вероятно, часть препарата, связанная с фибриногеном, увлекается при свертывании крови вместе с образовавшимся фибрином. Можно также предположить, что циклоферон накапливается в органах и тканях ретикуло-эндотелиальной системы и выводится из организма лишь через 90-100 часов. В таблице 23 приведены данные по содержанию препарата в моче добровольцев, которые коррелируют с приведенной в последней графе результатами по содержанию препарата в плазме крови. Отмечено, что при концентрации препарата в плазме порядка 15-30 мг/мл концентрация в моче составляет лишь 0,1-0,2 мг/мл, а по мере уменьшения содержания препарата в крови до 5-10 мг/мл его концентрация в моче увеличивается до 10-70 мг/мл, что свидетельствует о его выведении через почки. Таблица 23 Содержание циклоферона в моче в зависимости от времени отбора проб (в сравнении с концентрацией препарата в плазме крови этих же лиц) Номер истории Время Концентрация препарата болезни отбора, час в сыворотке крови, отн. ед 75 81 82 116 117

3 6 3 6 3 6 3 6 3 6

0,081 1,06 0,120 1,45 0,090 0,830 0,055 0,640 0,060 0,880

Концентрация препарата, мг/мл в моче в плазме 0,20 20 19 10 0,25 30 70 10 0,20 30 11 13 0,10 15 60 5 0,10 21 13 5

Таким образом, период полувыведения препарата составляет 30-50 минут, через 48-72 часа наблюдается достоверное увеличение содержания препарата в крови, составляющее от 2 до 3 % от максимального значения, через 200 часов - в крови обнаруживается лишь следы препарата. Изменение концентрации препарата в крови коррелирует с содержанием его в моче, свидетельствуя о выведении его через почки.

46

ТЕМПЕРАТУРНАЯ РЕАКЦИЯ ЖИВОТНЫХ НА ВВЕДЕНИЕ РАСТВОРА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ Изучение температурной реакции животных на введение раствора лекарственной формы препарата циклоферон проведено в соответствии с требованиями фармакопеи на кроликах массой 1,5-2 кг. Препараты разбавляли 0,9% изотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 5 и 10 мг/мл и вводили в ушную вену в объеме 1 мг/кг. Таблица 24 Температурная реакция кроликов на внутривенное введение лекарственной формы препарата циклоферон Температура, °С Номер Дозы, Номер Максимальпартии мг/кг кроли- Исход- После введения препарата через ный подъем ка температуры ная 1ч 2ч 3ч 1 39,3 39,3 39,3 39,3 0 1 5,0 2 39,4 39,3 39,2 39,2 0 3 39,1 39,2 39,1 39,0 0,1 4 39,5 39,6 39,4 39,6 0,1 1 10,0 5 39,5 39,6 39,5 39,5 0,1 6 39,1 39,4 39,3 39,3 0,3 7 39,4 39,0 39,4 39,3 0 2 10,0 8 39,4 39,4 39,4 39,5 0,1 9 39,3 39,4 39,4 39,4 0,1 10 39,0 39,3 39,1 39,2 0,2 3 10,0 11 39,5 39,6 39,7 39,5 0,1 12 39,2 39,2 39,1 39,1 0 13 39,3 39,5 39,5 39,5 0,2 4 10,0 14 39,2 39,1 39,2 39,2 0 15 39,3 39,3 39,4 39,3 0,1 16 39,0 39,3 39,6 39,3 0,6 5 10,0 17 39,1 39,4 39,2 39,7 1,1 18 39,9 39,5 39,9 39,5 1,0 19 39,2 39,5 39,4 39,3 0,3 6 10,0 20 39,5 39,7 39,8 39,7 0,3 21 39,0 39,2 39,1 39,2 0,2 22 39,2 39,0 39,9 39,2 0 7 10,0 23 39,5 39,2 39,0 39,1 0 24 39,5 39,2 39,2 39,0 0 25 39,5 39,9 39,9 39,9 0,4 8 10,0 26 39,3 39,5 39,6 39,5 0,1 27 39,3 39,5 39,6 39,5 0,3 47

Результаты испытаний показывают, что лекарственная форма препарата циклоферон не обладает выраженными пирогенными свойствами. Внутривенное введение препарата в дозах 5 и 10 мг/кг не вызывало подъема ректальной температуры кроликов более чем на 0,6°С. Однако после внутривенного введения одной из восьми испытанных партий наблюдался подъем температуры, превышающий 0,6°С. С учетом этого обстоятельства предложен тест на пирогенность. В качестве тестирующей дозы на пирогенность выбрана доза циклоферона 10 мг/кг массы тела кролика в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия для инъекций внутривенно. Препарат считают выдержавшим испытание, если ни у одного из трех кроликов повышение температуры не превышает 0,6°С, а по сумме трех измерений не более чем на 1,4°С.

ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФЕРОНА В связи с тем, что интерферон способен оказывать противоопухолевый и антиканцерогенный эффект (Kisner D.L et al., 1985; Напалков Н.П. с соавт., 1988), целесообразным представлялось изучение противоопухолевой активности циклоферона в опытах на животных. В данной работе исследовалось влияние циклоферона на рост широко применяемых при испытаниях противоопухолевой активности различных лекарственных препаратов перевиваемых опухолей - опухоли Эрлиха и лейкоза L1210 у мышей и лимфосаркомы Плисса у крыс. Исследование проводилось в соответствии с установленными Фармакологическим комитетом принципами экспериментальной оценки противоопухолевых препаратов (Софьина З.П., Сыркин А.Б., 1980). Результаты опытов подвергались стандартной статистической обработке. Проведено три серии опытов на 6-8-недельных мышах-самках СВА, 6NMRI и DBA/2. В экспериментах использовался асцитный вариант карциномы Эрлиха и лейкоз L1210. Животным перевивали подкожно по 0,2 мл асцитной жидкости карциномы Эрлиха или внутрибрюшинно по 0,2 мл асцитной жидкости лейкоза. Мышей рандомизированно разделяли на группы в соответствии с задачами экспериментов. В 1-й серии опытов изучено влияние циклоферона на рост карциномы Эрлиха у мышей СВА. Опыты проведены на 4 группах животных. Подопытным животным вводили подкожно циклоферон в разовых дозах 50 и 100 мг/кг на 3, 4, 8, 12, 15-й и 19-й дни после перевивки. Для сравнения другой группе подопытных животных вводили известный цитостатик цик48

лофосфан в дозе 50 мг/кг 1-кратно внутрибрюшинно на 3-й день после перевивки опухоли. Контрольным мышам вводили физиологический раствор в те же сроки, что и циклоферон. За животными следили в течение всей жизни. Во 2-й серии опытов изучено влияние циклоферона и его комбинации с циклофосфаном на рост карциномы Эрлиха у мышей NMRI. Опыты проведены на 5 группах животных. Циклоферон вводили подопытным животным в разовой дозе 10 мг/кг однократно с 3-го дня после перевивки или 5кратно с 3-дневными интервалами. При многократном введении оценивался комбинированный эффект циклоферона и циклофосфана, который вводился так же, как и в 1-й серии опытов. Отдельная группа подопытных животных получала только циклофосфан. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Опыт был завершен на 17-й день после перевивки. В 3-й серии опытов изучалось 0 влияние циклоферона на рост перевиваемого лейкоза L1210. 6х106 клеток лейкоза L1210 были перевиты внутрибрюшинно мышам DBA/2 в объеме 0,2 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Мыши были рандомизированно разделены на 4 группы и начиная с 1-го дня после перевивки получали подкожно 0,2 мл 0,9% раствора хлористого натрия (1-я группа; контроль) или подкожно циклоферон в дозах 10 мг/кг каждый 3-й день (с 2-дневными перерывами между инъекциями; 2-я группа), или циклоферон в такой же дозе и циклофосфан в дозе 50 мг/кг в/бр однократно на 1-й день опыта (3-я группа), или только циклофосфан в дозе 50 мг/кг в/бр на 1-й день опыта (4-я группа). Ежедневно регистрировалось время гибели животных с опухолью. Кроме того, в двух сериях опытов на 6-8-недельных крысах-самках ЛИО изучено влияние циклоферона на рост лимфосаркомы Плисса. Животным перевивали подкожно по 0,2 мл взвеси опухолевой ткани. Крыс рандомизированно разделяли на группы по 10 животных в соответствии с задачами эксперимента. В 4-й серии изучено воздействие многократного введения циклоферона на рост лимфосаркомы Плисса. Наблюдали 4 группы животных. Подопытным крысам вводили подкожно циклоферон в разовых дозах 50 и 100 мг/кг на 3, 4, 8, 12, 15-й и 18-й дни после перевивки. Для сравнения другой группе подопытных животных на 3-й день перевивки вводили однократно циклофосфан в дозе 50 мг/кг. Контрольным крысам вводили физиологический раствор хлористого натрия. За животными наблюдали в течение всей их жизни. В 5-й серии опытов изучалось влияние циклоферона и его комбинации с циклофосфаном на рост лимфосаркомы Плисса. Опыты были проведены 49

на 5 группах животных. Схемы введения и дозы препаратов были такими же, как описанные выше для опыта с мышами NMRI (2-я серия опытов). Во всех опытах препараты растворяли в 0,9% растворе хлористого натрия. Регистрировалось время появления пальпируемых опухолей и время гибели животных с опухолями. Кроме того, на каждый 3-4-й день опыта измеряли два взаимоперпендикулярных диаметра опухоли у каждой мыши или крысы и вычисляли ее объем по формуле Шрека. В опытах на мышах NMRI изучали также митотическую активность в опухолях на 17-й день после перевивки. Три опухоли из каждой группы были фиксированы в 10% формалине и после обычной гистологической обработки залиты в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм были окрашены гематоксилином и эозином и на них подсчитано число митозов на 1000 клеток. Результаты исследования подвергнуты статистическому анализу. Влияние циклоферона на рост карциномы Эрлиха у мышей СВА Таблица 25 Влияние циклоферона на рост карциномы Эрлиха у мышей СВА День опыта 7-й 10-й 12-й 14-й 18-й 22-й 26-й 28-й Средняя продолжительность жизни (сутки)

Контроль 103±32 636±133 314±82 1392±290 993±269 1137±269 7782±1741 7984±1554 33±2,9

Воздействие, средний объем опухоли, мм3 Циклоферон, Циклоферон, Циклофосфан, 50 мг/кг 100 мг/кг 50 мг/кг 135±27 353±79 125±46 665±228 361±82 506±173 480±204 637±204 146±71 1332±391 1485±284 760±284 1638±500 1330±215 1765±771 2521±635 2393±1438 2784±927 6658±1777 5807±1438 3938±509 5186±1194 6973±1177 5589±749 36±1,4

42±0,6*

31±2,7

Результаты опыта представлены в таблице 25. Судя по данным, представленным в таблице, циклоферон не оказывал существенного влияния на рост карциномы Эрлиха у мышей СВА. Однако в дозе 100 мг/кг на 27,3% увеличивал продолжительность жизни мышей с перевитой опухолью (p<0,05).

50

Влияние циклоферона и его комбинации с циклофосфаном на рост карциномы Эрлиха у мышей NMRI Учитывая, что циклоферон в дозах 50 и 100 мг/кг не оказывал существенного противоопухолевого эффекта, в данной серии препарат вводили в меньшей разовой дозе - 10 мг/кг однократно или 5-кратно. При многократном введении изучался также комбинированный эффект циклоферона и циклофосфана (табл. 26). Таблица 26 Влияние циклоферона и его комбинации с циклофосфаном на рост карциномы Эрлиха у мышей NMRI Воздействие, средний объем опухоли, мм3 День опыта Контроль Циклоферон Циклоферон Циклоферон 1 раз 5 раз 5 раз, циклофосфан 1 раз 7-й 68,6±23,5 68,6±13,8 68,1±32,8 9,3±6,9 10-й 312,9±101,9 279,9± 124,8 298,0±126,6 31,7±29,3* 12-й 772,1±187,0 435,9± 104,3 865,5±224,1 198,1±195,3 14-й 1831,7±1136,2 1629,6± 672,5 1402,5±281,6 630,6±314,8 17-й 1560,6± 170,7 1576,0± 908,2 2223,9±716,6 420,5±416,3 *

Циклофосфан 1 раз

6,3±2,3* 69,6±50,9* 1176,7±1176,7 2883,0±2883,0 1076,9±1075,8

Циклофосфан, известный противоопухолевый цитостатик, используемый как препарат сравнения, оказывал достоверный ингибирующий эффект только на 7-й и 10-й день опыта, тормозя рост опухоли на 78-91%. Однократное введение циклоферона приводило к существенному торможению роста опухолей на 7-й и 12-й дни опыта (на 59 и 44%, соответственно), хотя этот эффект носил характер тенденции. При многократном введении циклоферона ингибирующий эффект в различные сроки опыта колебался и не превышал 20% (p<0,05). Наибольший ингибирующий эффект отмечен при комбинации введения циклоферона и циклофосфана, особенно на 10-й и 17-й дни опыта, когда торможение роста опухолей составляло соответственно 90 и 73%. В другие сроки опыта обнаружена тенденция к торможению роста опухоли (на 66-86%). Данные изучения митотической активности в опухолях мышей различных групп представлены в таблице 27. Циклоферон при однократном введении не влияет, а при многократном введении - угнетает митотическую 51

активность опухоли Эрлиха. Аналогичный эффект оказывает комбинация циклоферона с циклофосфаном. Таблица 27 Влияние циклоферона на митотическую активность опухоли Эрлиха Воздействие Физ. раствор Циклоферон, 10 мг/кг×1 Циклоферон, 10 мг/кг×5 Циклофосфан, 50 мг/кг×1

Митотический индекс, % 23,0 14,3 9,0 9,0

Р* >0,05 <0,05 <0,05

Влияние циклоферона на рост лейкоза L1210 у мышей DBA/2 Средняя продолжительность жизни контрольных мышей с перевитым лейкозом составила 7,3±0,11 суток, при введении циклоферона - 67,5±0,25 суток, циклофосфана - 9,8±0,22 суток, а при их комбинации - 69,1±0,24. Достоверное торможение опухолевого роста, по сравнению с контролем, отмечено только в группах животных, получавших циклофосфан в комбинации с циклофероном. Влияние циклоферона на рост лимфосаркомы Плисса у крыс Результаты опыта представлены в таблице 28. Применение циклоферона в большей дозе тормозит рост лимфосаркомы Плисса в ранние сроки после начала опыта. Так, на 10-й день после перевивки опухоли ее объем под влиянием циклоферона (100 мг/кг) был меньше, чем в контроле, на 30,3% (p<0,05). Однако в более поздние сроки после прекращения введения препарата объем опухоли в контрольной и подопытных группах существенно не различался. Применение известного цитостатика циклофосфана оказало выраженное тормозящее влияние на рост лимфосаркомы Плисса у крыс. Таблица 28 Влияние циклоферона на рост лимфосаркомы Плисса у крыс День опыта 7-й 10-й 52

Воздействие, средний объем опухоли, см3 Контроль Циклоферон, Циклоферон, Циклофос50 мг/кг 100 мг/кг фан, 50 мг/кг 4 ± 0,6 6 ± 0,7 3 ± 0,5 0,7 ± 0,2* 33 ± 2,3 27 ± 2,3 23 ± 2,3* 9 ± 1,5*

47 ± 7,8 70 ± 11,8 89 ±0,4

12-й 14-й 18-й

36 ± 3,2 65 ± 5,6 57 ± 6,2

38 ± 4,9 21 ±2,6* 69 ± 6,8 42 ± 4,2* 68 ±7,3 81 ± 7,8 Окончание табл. 28

Воздействие, средний объем опухоли, см3 Контроль Циклоферон, Циклоферон, Циклофос50 мг/кг 100 мг/кг фан, 50 мг/кг

День опыта Средняя продолжительность жизни (сутки)

17,1± 1,5

16,8 ±0,8

16,8 ± 0,6

22,2 ± 0,7

* Различие с контролем (физ. раствор) достоверно, р<0,05.

Влияние комбинации циклоферона с циклофосфаном на рост лимфосаркомы Плисса у крыс Циклофосфан, используемый как препарат сравнения, оказывал достоверный ингибирующий эффект во все сроки регистрации (с 7-го по 18-й день опыта), тормозя рост опухоли на 42-100% (табл. 29). Однократное введение циклоферона не приводило к торможению роста опухоли. При многократном введении циклоферона статистически достоверный ингибирующий эффект (37%) был обнаружен на 7-й день опыта и тенденция к торможению - на 9-й день опыта. Наибольший ингибирующий эффект отмечен при комбинации введения циклоферона и циклофосфана, когда торможение роста опухоли на 7-й и 9-й дни опыта достигало 96100%, против 46-67% в остальные сроки опыта. Таблица 29 Влияние циклоферона и его комбинации с циклофосфаном на рост лимфосаркомы Плисса у крыс День опыта

Контроль

7-й 9-й 11-й 14-й 16-й

40,0±1,0 48,0±3,0 57,0±3,6 75,0± 17,4 100,0±17,4

Воздействие, средний объем опухоли, мм3 Циклоферон Циклоферон Циклоферон 1 раз 5 раз 5 раз, циклофосфан 1 раз 0 49,0±3,0* 25,0±4,0 56,0±5,0 42,0±5,0 2,0±1,5* 63,0±5,0 61,0±5,0 19,0±10,0* 89,0±9,7 86,0±14,7 29,0±6,0* 92,0 94,5±16,5 54,0±10,0*

Циклофосфан 1 раз 0 0,3±0,2* 4,6±1,3* 26,0±3,7* 54,5±9,0* 53

18-й

97,0

-

74,0*

29,0±6,0*

57,0±8,6*

* Различие с контролем (физ. раствор) достоверно, р<0,05.

Таким образом, изучение влияния циклоферона на рост опухоли Эрлиха и лейкоза L1210 у мышей и лимфосаркомы Плисса у крыс показало, что данный препарат оказывает противоопухолевый эффект, выраженность которого колеблется в зависимости от типа опухоли, вида и линии животных, дозы и режима введения циклоферона. Так, в опытах на мышах циклоферон в дозе 10 мг/кг оказывал некоторое тормозящее действие на рост опухоли Эрлиха у мышей NMRI, но в дозах 50 и 100 мг/кг не влиял на рост опухолей у мышей СВА. Циклоферон не оказал также существенного влияния на рост лейкоза L1210. В опытах на крысах противоопухолевое действие циклоферона в дозе 10 мг/кг было более выражено, чем на мышах, причем эффект при многократном введении был большим, чем при однократном. Наибольший эффект отмечался при комбинации циклоферона с циклофосфаном. Это свидетельствует о том, что циклоферон может усиливать эффект известных цитостатиков. Выполненные исследования обосновывают возможность проведения клинических исследований циклоферона на противоопухолевую активность у больных с онкогематологической патологией, в том числе в комбинации с циклофосфаном, и позволяют представить "Проект инструкции по клиническому изучению противоопухолевого действия циклоферона при самостоятельном применении и в сочетании с циклофосфаном".

Заключение Проведенные экспериментальные исследования общей токсичности (острой, подострой, хронической, местного раздражающего действия) лекарственной формы препарата циклоферон (12,5% ампульный раствор по 2 мл) показали, что препарат и в условиях острого введения, и при длительном применении в течение 6 месяцев не оказывает токсического действия на организм теплокровных лабораторных животных. Следует отметить, что планирование и проведение всей работы осуществлялось в строгом соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета Минздрава России и международными стандартами в области доклинического изучения безопасности новых фармакологических средств - системы GLP (Good Laboratory Practicee). Это позволило всесторонне исследовать влияние препарата на основные функциональные системы и органы подопытных животных.

54

Прежде всего, достигнутые величины среднесмертельных доз препарата (LD50(в/ж)=7000-11000мг/кг, LD50(в/м)= 1500-2000 мг/кг, LD50(в/в)= 9001300 мг/кг для крыс и мышей) позволяют однозначно отнести препарат циклоферон к малотоксичным лекарственным веществам. При этом токсические дозы превышают средние терапевтические в десятки-сотни раз, что свидетельствует о большой широте терапевтического действия, хорошей переносимости и безвредности препарата. Подострое (30 дней) и хроническое (180 дней) ежедневное в/м и в/в введение лекарственной формы препарата циклоферон экспериментальным животным в дозах, превышающих рекомендованные для человека в 5100 раз, не оказывало вредного воздействия на основные адаптационные системы (нервную, сердечно-сосудистую, кроветворную, выделительную, дыхательную), обмен веществ, общее состояние и развитие, основные гомеостатические параметры организма. При этом объективно регистрировалось положительное влияние препарата на процессы эритро-, лимфо- и тромбоцитопоэза. Следует отметить также отсутствие у лекарственной формы препарата циклоферон раздражающего действия на стенку вены, покровные ткани (кожу, подкожную клетчатку), мышцы и апирогенность вводимых растворов, т.е. свидетельствует об универсальном характере безвредности препарата. Циклоферон плохо всасывается из желудочно-кишечного тракта, а при внутримышечном введении быстро проникает в кровь, достигая максимальных концентраций через 30 мин. (Т50%=0,9-1,1ч). После в/в инъекций циклоферон в крови в течение 6 ч. (Т50%=0,75-1,0 ч). После в/м введения препарат практически полностью экскретируется за 36 ч (элиминация из организма осуществляется главным образом за счет почечной экскреции). Препарат не обладает канцерогенной, мутагенной, тератогенной и эмбриотоксической активностью (данные специфических исследований). Все это свидетельствует о безвредности лекарственной формы препарата циклоферон и возможности проведения расширенных клинических исследований и применения препарата в клинике внутренних болезней. Таким образом, лекарственная форма нового препарата циклоферон при однократном (остром) пероральном, внутримышечном и внутривенном введении является нетоксичной и обладает большой широтой терапевтического действия, лекарственная форма препарата циклоферон апирогенна при парентеральном введении, не оказывает раздражающего действия на покровные ткани, мышцы и стенку вены в местах инъекций. Циклоферон при длительном (подостром и хроническом) 6-месячном внутри55

мышечном и внутривенном введении в дозах, превышающих терапевтическое в 10-100 раз, не оказывает побочных эффектов и безопасен для организма. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЦИКЛОФЕРОНА В ТЕРАПИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Экспериментальное исследование циклоферона В эксперименте на животных на моделях in vitro и in vivo проведено изучение нового оригинального отечественного высокоэффективного синтетического индуктора ИФН - циклоферона. На модели хламидийной инфекции у неполовозрелых мышей применение циклоферона увеличивало индекс эффективности в 2-4 раза по сравнению с животными, получавшими традиционно применяемый тетрациклин. В опытах in vitro препарат подавлял размножение ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4, проявляя дозозависимый эффект. Изучение защитного действия циклоферона в опытах на неполовозрелых мышах, зараженных вирусом клещевого энцефалита, продемонстрировало выраженный профилактический эффект препарата (коэффициент эффективности 95%). В опытах использовали перевиваемую культуру клеток МТ-4, выделенную в Японии при клонировании культуры клеток НИТ-78. Как видно из таблицы 30, циклоферон в концентрации от 10 до 100 мкг/мл подавлял размножение ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4, проявляя дозозависимый эффект. Следовательно, результаты изучения воздействия циклоферона на ВИЧ- инфекцию in vitro свидетельствуют о его клинической перспективности. Таблица 30 Определение анти-ВИЧ-1 активности циклоферона in vitro Доза препарат, мкг/мл 10 50 100

Количество антигенположительных клеток, % 30 0 0

Ингибиция ВИЧ -1 43 100 100 Таблица 31

56

Индекс эффективности циклоферона при хламидийной инфекции Препарат ЦФН ЦФН Тетрациклин

Время введения после инфицирования Через 24 часа Через 24 и 96 часов Ежедневно

Лимфоузлы Легкие 3-и сутки 7-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 4,7 1,3 3,6 3,2 4,4 2,6 3,4 3,9 0,9 0,6 1,8 1,0

Таким образом, результаты, суммированные в таблице 31, свидетельствуют о перспективности применения циклоферона для лечения хламидийных инфекций, так как применение препарата увеличивает индекс эффективности в 2 - 4 раза по сравнению с группой животных, получавших традиционно применяемый тетрациклин. Исследование антипромоторной активности циклоферона Известно, что явление дезинтеграции ткани и ее проявление в виде снижения силы сцепления клеток относятся к промоторной стадии канцерогенеза и, весьма вероятно, что вызванное дезинтеграцией ткани нарушение тканевого гомеостаза составляет главную сущность процесса промоции. В связи с этим представлялось целесообразным изучить влияние циклоферона, индуктора ИФН, являющегося мощнейшим медиатором гомеостаза, на силу сцепления клеток in vitro и in vivo. Измерение силы сцепления клеток проводили с помощью микроманипулятора по методу Комана (D. L. Coman, 1944) в модификации Е.А. Модяновой (1980), используя гепатоциты и альвеолярный эпителий легких мышей линии СВА. Мышам предварительно вводили циклоферон внутрибрюшинно ежедневно в течение 6 суток (суммарно 1 г/кг массы тела). Результаты изучения антипромоторной активности циклоферона на модели гепатоцитов и альвеолярного эпителия легких показали, что препарат проявил себя как классический адгезионный фактор - контактин, увеличивая силу сцепления клеток в 2 раза в печени и в 1,5 раза - в легких in vitro и in vivo. Клинические исследования на добровольцах показали, что циклоферон в дозах 250 (курсовая доза 1250 мг) и 500 мг (курсовая доза 2500 мг), вводимый парентерально в течение пяти дней, не оказывает токсического воздействия на основные жизненно важные системы организма (сердечнососудистую, дыхательную, выделительную, нервную), а также на показатели гомеостаза.

57

Отмечено влияние препарата на показатели Т-клеточного иммунитета и макрофагально-фагоцитарную систему, а также на индукцию в организме раннего альфа-ИФН и гамма-ИФН. Установлен дозо- и интервалозависимый эффект препарата, что необходимо учитывать при применении препарата и при проведении дальнейших клинических исследований. В последнее десятилетие парентеральные генноинженерный ИФН и высокоочищенный лейкоцитарный ИФН начали успешно применяться в медицинской практике в области терапии вирусных инфекций и онкологии. Однако их широкое использование сдерживает ряд объективных факторов: - ограниченная клиническая эффективность; - потенциальная пирогенность и аллергенность: - опасность возникновения аутоиммунных процессов; - многократность введения суточной дозы. Всех этих недостатков лишены низкомолекулярные индукторы интерферона, в частности, циклоферон, обладающий способностью вызывать образование альфа-, бета- и гамма-ИФН в организме. Основными продуцентами «собственного» эндогенного ИФН являются иммунокомпетентные клетки-лейкоциты, макрофаги, фибробласты, а также эпителиальные клетки. Из более 100 известных индукторов интерферона природного и синтетического происхождения циклоферону нет равных по эффективности, широте спектра действия и безвредности. Активная выработка интерферонов в организме - залог устойчивости к возникновению заболеваний и быстрой локализации очага инфекции в случае его возникновения. Снижение уровня выработки интерферонов в организме человека обусловливается целым рядом причин: - агрессивная антибиотико- и гормонотерапия; - послеоперационный период; - алкоголизм и наркомания; - ожоговая болезнь; - хронические инфекции; - новообразования; - воздействие радиации; - стресс и физические перегрузки. Возникающие в результате воздействия одной или нескольких причин вторичные иммунодефициты приводят к снижению интерферонового статуса, что осложняет лечение многих заболеваний. Циклоферон проводит коррекцию иммунного статуса организма, нормализуя выработку ИФН и 58

состояние иммунной системы как в случае иммунодефицитов, так и при аутоиммунных состояниях. Показания к применению ЦИКЛОФЕРОНА у взрослых: - комплексная терапия ВИЧ-инфекции и СПИДа; - онкопатология (в том числе онкогематология); - комплексная терапия нейровирусных инфекций (серозный менингит, клещевой энцефалит, нейроборрелиоз, рассеянный склероз, арахноидиты и пр.); - лечение вирусных гепатитов (В, С и Д) и цитомегаловирусной инфекции: - лечение и профилактика герпесвирусных инфекций различной локализации; - терапия вторичных иммунодефицитных состояний различной этиологии (послеоперационный период, ожоги, хронические бактериальные и грибковые инфекции и т. п.); - хламидиозы (венерическая лимфогранулема, урогенитальный хламидиоз и пр.); - микоплазмоз (уреаплазмоз); - язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; - лечение болевого синдрома при ревматоидных артритах; - кожные болезни (нейродермиты, экзема, дерматозы). Совместимость. Циклоферон совместим и хорошо сочетается со всеми лекарственными препаратами, традиционно применяемыми при лечении заболеваний (антибиотики, химиопрепараты и др.). Побочные действия: не описано. Противопоказания: беременность. Оценка эффективности применения циклоферона для лечения ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом В период 1992-1997 гг. в городском центре по профилактике и борьбе со СПИДом г. С.-Петербурга циклоферон получили 40 пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции. Следует отметить, что 11 больных получили два курса терапии циклофероном, в связи с чем общее число лиц получивших один курс лечения циклофероном, составило 29 человек. Характеристика пролеченных больных представлена в таблице 32. В основном это были молодые люди в возрасте до 40 лет (20 человек), в том числе трое детей до 14 лет. Продолжительность болезни: до 5 лет - 11 человек, от 6 до 10 лет - 15 человек и более 10 лет - 3 пациента.

59

Распределение больных по стадиям заболевания, представленное в таблице 32, осуществлено в соответствии с классификацией СDС (США, 1993) и принятой в России классификацией ВИЧ-инфекции, предложенной В.И. Покровским (1989). Основная группа лиц относилась к стадии А1-А2 (8 человек) и имела начальные признаки ВИЧ-инфекции, а также значительной оказалась группа В1-В2 (16 человек). Все пациенты прошли общепринятое клиническое и лабораторное обследование в городском центре по профилактике и борьбе со СПИДом (Центр СПИДа). Диагноз ВИЧ-инфекции установлен клинически, эпидемиологически, серологически в ЕLISA, а также с помощью обнаружения антител к антигенным детерминантам ВИЧ в реакции иммуноблотинга. Иммунологическое обследование включало проведение гемограммы, определение относительного и абсолютного содержания субпопуляций Тлимфоцитов (СD3+, СD4 +, СD8 +), В-лимфоцитов в лимфоцитотоксическом тесте с моноклональными антителами, коэффициента СD4 +/СD8 +, числа натуральных киллеров. Таблица 32 Общая характеристика ВИЧ-инфицированных, леченных циклофероном Возраст (лет)

Количество пролеченных больных

до 20

4

21-30

8

31-40

12

41-50

5

Всего

29

Стадия заболевания и количество больных по классификации: CDC (США), 1993 г. В.И. Покровского, 1989 г. А1-3 I-O A2-5 IIA-1 A3-1 IIБ-3 В1-3 IIB-9 B2-13 IIIA-9 B3-2 IIIБ-3 С1-0 ШВ-4 С2-1 IV-0 C3-1 29 Всего

В 1996-1997 гг. в специальных исследованиях по оценке эффективности циклоферона были проведены (ограниченно) работы по определению вирусной нагрузки: определялась экспрессия количества ВИЧ-1 РНК - копий/мл с помощью амплификатора фирмы “Ла Рощ” (количественная ПЦР). Эти исследования были выполнены в Лондоне совместно с английскими учеными.

60

Курс циклоферона состоял из 5 внутримышечных инъекций 2 мл 12,5% раствора в 1, 2, 4, 6 и 8 дни лечения. Препарат вводился как монотерапия у 29 ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом. Все больные отмечали хорошую переносимость препарата, отсутствие пирогенных реакций после введения циклоферона. В одном случае (3,4%) отмечалась болезненность в месте инъекции, которая исчезла через 6 часов. Все пациенты констатировали улучшение общего состояния, сна и аппетита, повышение жизненного тонуса, работоспособности. Трое больных (10,3%) видели цветные сны, четкие, запоминающиеся. 30% пациентов из числа получавших препарат и перенесших в осенне-зимний период грипп или ОРВИ отметили, что заболевание протекало непривычно легко и выздоровление наступило быстрее обычного. В одном случае ребенок 4 лет (стадия III В по В.И. Покровскому) после лечения циклофероном имел кратковременное улучшение самочувствия на фоне отсутствия положительной иммунологической динамики. Спустя месяц после лечения пациент скончался на фоне ухудшения всех витальных функций. Ухудшение состояния и смерть больного не связаны с назначением препарата, который на данной стадии болезни не мог оказать должный положительный эффект. Анализируя динамику изменения иммунологических и гематологических показателей (табл. 33), следует отметить, что число СD4+-клеток повысилось после одного курса циклоферона у 15 (51,2%) из 29 больных, СО8+ - у 13 (44,8%), коэффициент СD4+/СD8+ - у 9 (31%) человек. Причем важно подчеркнуть, что повышение СD4+-клеток на 10% отмечено у 3, на 20-50% - у 6, на 51-100% - у 2, и более чем на 100% - у 4 пациентов. Таблица 33 Изучение иммунологических и гематологических показателей у ВИЧ-инфицированных, получивших один курс циклоферона Изученные показатели Иммунологические Гематологические + + + + CD4 CD8 CD4 /CD8 Эритроци- Лейкоциты, Лимфоциты, (n=29) (n=29) (n=29) ты (n=25) % (n=27) % (n=29) Повышение 14 13 9 8 12 15 Понижение 10 11 12 12 12 8 Без изменений 5 5 8 5 5 6 Динамика показателей после лечения

Число СD8+ повысилось на 10% - у 3, на 20-50% - у 7, на 51-100% - у 2 и более чем на 100% - у 1 больного. На фоне применения циклоферона более значительное увеличение числа СD4+ и СD8+-лимфоцитов отмечено на ранних стадиях ВИЧ-инфекции - А1-А2 и В1-В2 (табл. 34). В том случае, 61

когда показатели Т-клеточного иммунитета были исходно значительно снижены, циклоферон, как правило, не оказывал положительного влияния на динамику иммунологических и гематологических показателей. Таким образом, назначение циклоферона сопровождалось у большинства леченных больных не только стабилизацией клинической картины основного заболевания, но и улучшением иммунологических и гематологических показателей. 11 пациентов получили два курса циклоферона с интервалом 6 месяцев. Стадии ВИЧ-инфекции по классификации СDС (США, 1993): А2 - 4 человека, В1 - 1 человек, B2 - 6 человек. Динамика изменения лабораторных показателей у пролеченных больных представлена в таблице 35. Видно, что после 1-го курса циклоферона СD4+ и СD8+ повысились у 8 и 6 человек соответственно, коэффициент СD4+/СD8 +- у 5 больных. Число эритроцитов увеличилось у 4, а лейкоцитов и лимфоцитов - у 6 и 8 пациентов соответственно. После 2-го курса лечения циклофероном повышенное число СD4+ и СD8+ отмечено у 8 больных. Анализ гемограммы показал, что число лиц с повышенными показателями эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов существенно уменьшилось. Таблица 34 Влияние циклоферона на иммунологические показатели у больных ВИЧ-инфекцией (n=29) Стадия болезни (CDC, США) А1-А2 (n=8) A3 (n=1) B1-B2(n=16) B3 (n=2) C2 (n=2)

Иммунологические показатели в абсолютных числах (изменение числа клеток) CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ B-лимфоциты 478/540*(+62) 585/660(+75) 0,81/0,81 393/367(-26) 140/287(+147) 150/374(+224) 0,97/0,76 220/319(+99) 489/580(+91) 727/836(+109) 0,72/0,69 593/543(-50) 360/176(-184) 577/330(-247) 0,60/0,55 425/162(-263) 349/321 (-28) 470/503(+33) 0,74/0,63 Таблица 35

Динамика лабораторных показателей у ВИЧ-инфицированных, получавших два курса циклоферона Динамика изменения показателей Повышение Понижение Без изменений

62

Изученные показатели Иммунологические Гематологические + + + + CD4 CD8 CD4 /CD8 ЭритроЛейкоци- Лимфоцициты ты, % ты, % 8/8* 6/8 5/0 4/1 6/3 8/5 3/1 5/1 3/5 6/6 4/6 2/4 0/0 0/0 3/4 1/2 1/0

Примечание. * числитель - число больных после первого курса ЦФН (n=11), знаменатель - число больных после второго курса ЦФН (n=9).

Из 11 человек, которым было проведено два курса лечения циклофероном, стойкая клинико-иммунологическая ремиссия сохранялась у 8 пациентов. В трех случаях отмечалось прогрессирование ВИЧ-инфекции с ухудшением состояния и лабораторных показателей крови (табл. 36). Важными, на наш взгляд, были исследования, выполненные в 19961997 гг. Изучалась эффективность циклоферона как монотерапии, так и сочетанное использование препарата с антиретровирусными средствами в строго контролируемых условиях. Для этого были отобраны больные с ВИЧ-инфекцией, в анализе крови которых содержание СD4+ клеток было от 200 до 500 в 1 мкл, число лейкоцитов от 3,0 до 10,0 х 10g/л. Пациенты не должны были в последние 6 месяцев получать противовирусные препараты, им были объяснены принципы исследования, и все они устно заявили о добровольном согласии на исследование. Было сформировано 4 группы больных ВИЧ-инфекцией Таблица 36 Анализ лабораторных показателей ВИЧ-инфицированных, получавших лечение циклофероном без эффекта (n=3) Показатели ВозСта- Курс ЦФН Гематологические Иммунологические раст дия Эрит. Тромб Лей- Нейтр. Лимф., СОЭ, CD4+ CD8+ CD4+ CD20+ боль- болезни % % мм/ч / (В×1012/ Тыс. коц., ного, (CDC, CD8+ лимф) л ×109/л лет США) 29 А2, 1 I 3,4/ 314 4,3/4,5 54/51 31/ 14/7 530/28 450/ 1,18/ 420/230 год 3,4* 31 0 210 1,34 А3 1 II 3,5/ 4,6/ 68/58 19/ 23 20/7 192/31 200/32 0,96/ 200/237 год 3,4 4,3 6 6 0,98 36 А2, 5 I 5,0/ 126 4,6/ 47/34 32/ 6/3 309/ 353/ 0,88/ 250/389 лет 4,5 3,7 50 407 518 0,79 В2, 5 II 4,2/ 4,8/ 55/32 27/ 21/3 230/ 600/ 0,39/ 290/340 лет 4,1 3,9 45 390 660 0,44 39 В2, 5 I 3,7/ 236/ 4,2/ 34/38 48/ 49/ 383/ 645/ 0,59/ 442/300 лет 3,3 115 4,4 30 59 312 528 0,59 С3, 6 II 3,8/ 3,8/ 42/57 17/19 34/ 155/ 265/ 0,59/ 226/340 лет 3,0 7,0 53 306 545 0,59

Примечание. * числитель - значение показателей до лечения, знаменатель - после лечения.

Группа 1 - назначены плацебо (таблетки) + инъекции стерильного физиологического раствора. Это контрольная группа. Группа 2 - инъекции циклоферона + плацебо (таблетки);

63

Группа 3 - инъекции циклоферона + азидотимидин (АЗТ, таблетки) + дидеоксицитидин (ДДЦ, таблетки); Группа 4 - АЗТ (таблетки) + ДДЦ (таблетки) + инъекции физиологического раствора. Схемы назначения лекарственных препаратов: - таблетки плацебо назначались по 1 таблетке 4 раза в день в течение 20 дней; - азидотимидин (ретровир) - по 1 капсуле (100 мг) 4 раза в день в течение 20 дней; - дидеоксицитидин - по 1 таблетке (0,75 г) 3 раза в день в течение 20 дней; - инъекции назначались в каждой группе; инъекции плацебо содержали стерильный физиологический раствор (4 мл) и не должны были попадать в инъекционный шприц перед тем, как медработник входит в палату для больных (слепой плацебо контроль); - инъекции циклоферона (4 мл) назначались по схеме: 1, 2, 4, 6, 8,10,13, 16, 19, 22-й дни терапии, причем первые две инъекции делались больному после 2-й инъекции циклоферона (физиологического раствора), поэтому весь курс комбинированной терапии составлял 22 дня. Все лабораторные исследования были проведены до начала лечения, сразу после окончания терапии и через 1 месяц после второго обследования. Так, у пациентов 1-й группы (контрольная, плацебо) после окончания лечения снижалась вирусная нагрузка, незначительно увеличивалось число СD4+ клеток. Снижение вирусной нагрузки и увеличение СD4+ клеток у пациентов этой группы, по-видимому, обусловлено наличием начальных проявлений ВИЧ-инфекции (стадия А1-А2). Во 2-й группе (ЦФН, монотерапия) после курса циклоферона отмечалось существенное снижение вирусной нагрузки (в 3,6 раза - на 28%). Число СD4+ возросло на 62%, через месяц стало 1630 клеток. Монотерапия циклофероном оказала положительное стабильное влияние на изученные показатели у обоих пациентов. В 3-й группе (ЦФН + АЗТ + ДДЦ) после лечения в 2 раза возросли показатели вирусной нагрузки, хотя абсолютные значения ее были невелики (1962 и 4214 соответственно). Число СD4+ клеток незначительно увеличилось (+40, на 20%), после 1 месяца вновь уменьшилось до 170. Возможно, на такой динамике СD4+ клеток сказываются изначально низкие их показатели (200), а также токсическое воздействие на органы кроветворения комбинации противовирусных препаратов. Больной №6 отреагировал на лечение двукратным снижением вирусной нагрузки и снижением числа 64

СD4+лимфоцитов на 49%. Через месяц СD4+ клеток стало 890, т.е. в 1,5 раза больше, чем до лечения. Следует отметить, что это тяжелый больной ВИЧ-инфекцией в стадии С2 (IV, СПИД). Однако и в этом случае можно отметить положительное влияние включения циклоферона в сочетанную терапию с противовирусными препаратами. Нельзя исключить, что циклоферон уменьшил токсическое воздействие этих лекарств на лейкопоэз. Анализ 4-й группы (АЗТ + ДДЦ) показывает, что у больных после лечения противовирусными препаратами показатели вирусной нагрузки возросли, причем у больного №8 довольно значительно (в 6,6 раза). Число СD4+ клеток у больной №7 увеличилось на 150 (+31%), а через месяц стало 680 в 1 мкл крови (+41%). Пациент №8 отреагировал на лечение незначительным повышением числа СD4+ клеток (+80), через 1 месяц их стало 1070 (больше, чем до лечения, в 1,9 раза). Более подробная клиническая характеристика пациентов 1-4 групп , а также динамика изменения иммунологических показателей в зависимости от вида терапии приводится ниже. Определенный интерес представляют результаты многолетнего наблюдения больных ВИЧ-инфекцией, которые получают длительно циклоферон в своеобразном профилактическом режиме, с целью стабилизации процесса и профилактики прогрессирования заболевания. Так, больной Г-в, 9 лет, наблюдается с февраля 1993 г. Диагноз: ВИЧинфекция, стадия 2 В (по В.И.Покровскому). При определении иммунного статуса (10 исследований) среднее число СD4+ было 420. Больному проведено 2 курса циклоферона (по 5 инъекций внутримышечно, по 2 мл). Отмечен оральный кандидоз однократно. Показатели СD4+ клеток: июль 1993 г. - 637, март 1994 г. - 635, ноябрь 1994 г. - 894. С 1994 г. пациент получает по 1 инъекции циклоферона один раз в 10 дней. Стадия ВИЧ-инфекции не меняется, число СD4+ клеток равно 516-1017 в 1 мкл. Больной М., 37 лет, наблюдается 3 года. Диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия 3 А (по В.И.Покровскому). Получает по 1 инъекции (внутримышечно) циклоферона каждые 10 дней. Состояние все время удовлетворительное, ВИЧ-инфекция не прогрессирует. Иммунограмма сделана 8 раз: содержание СD4+ клеток от 420 до 710 в 1 кмл крови. В нескольких случаях циклоферон назначали пациентам с содержанием СD4+ клеток менее 200 в 1 мкл крови. Больным проводился курс из 10 инъекций циклоферона в течение 22 дней (по схеме): Больной М., 35 лет (стадия СЗ / III В). Число СD4+ лимфоцитов увеличилось с 180 до 210.

65

Больной В., 41 год (стадия ВЗ / III В). После курса циклоферона число СD4+ возросло с 90 до 210 в 1 мкл крови. Однако получено лишь временное улучшение. Конечные показатели эффективности Выбор конечных показателей оценки эффективности имеет решающее значение. До настоящего времени рекомендаций по этому вопросу не опубликовано. На основании данных об естественном течении ВИЧинфекции и ее стадийности в качестве конечных показателей эффективности можно принять следующие. Смерть. Этот конечный показатель, несмотря на его достаточную объективность, затруднительно использовать, даже если исследование проводят на больных с картиной далеко зашедшего СПИДа. Поэтому в большинстве случаев смерть не следует рассматривать как конечный показатель. Оппортунистические заболевания, связанные со СПИДом. К таким заболеваниям относятся оппортунистические инфекции и злокачественные новообразования. Применение этого конечного показателя рекомендуется при проведении испытаний как на больных, к моменту включения в исследование страдавших СПИДом, так и на больных без клинической картины СПИДа на стадии, предшествующей началу КИ. Параметрами оценки служат как характер, так и сроки возникновения указанных состояний, в том числе время их первого появления. Следует тщательно дифференцировать присоединение нового заболевания от рецидивов перенесенного ранее. Каждое заболевание и процедуры их диагностики должны быть подробно описаны в протоколе исследования. Необходимо направить усилия на тщательную стандартизацию профилактики оппортунистических инфекций; все профилактические мероприятия, проведенные каждому из больных, должны быть документированы. Клинические проявления собственно ВИЧ-инфекции. Проявления поражений ЦНС у ВИЧ-инфицированных лиц характерно для СПИДа. Выявление данного поражения требует тщательного неврологического и нейрорентгенологического обследования, которое должно быть описано в протоколе. Как правило, этот конечный показатель используют в сочетании с оппортунистическими инфекциями и злокачественными новообразованиями. Оппортунистические инфекции и другие состояния, не определяемые наличием СПИДа. Примерами могут служить кандидоз полости рта (подтвержденный микробиологически), инфицирование ВПГ (подтвержденное вирусологически или фотографически), диарея, волосистая лей66

коплакия (подтвержденная фотографически). Каждое из этих патологических состояний и соответствующие диагностические процедуры следует детально описать в протоколе . Должны быть выявлены критерии установления достоверного, определенного и предположительного диагноза. Виремия. Использование виремии как конечного показателя эффективности становится все более распространенным с развитием техники выявления и количественной оценки виремии. Методом выявления вируса может служить его выделение из цельной крови или плазмы либо РНКполимеразная цепная реакция. Методика по возможности должна быть количественной. Очевидно, что без значительного прогресса в методологии техника определения виремии остается слишком трудоемкой, чтобы можно было обследовать всех больных, участвующих в клинических исследованиях третьей фазы. Однако при проведении второй фазы КИ определение виремии дает возможность быстро оценить анти-ВИЧ активность нового ЛС. Используемый метод следует тщательно описать в протоколе исследования и валидировать для каждого из Центров. Желательно, чтобы все Центры по возможности пользовались одной центральной лабораторией. Развитие резистентности следует выявлять путем одновременного исследования проб, взятых до, во время и после лечения. Подсчет СD4+ Т-лимфоцитов. Показано, что как абсолютное и относительное содержание СD4+Т-лимфоцитов, так и темп снижения этих показателей обладают несомненной прогностической значимостью. Согласно положениям СDС (но не принятым в Европе или положениям ВОЗ), содержание СD4+ Т-лимфоцитов < 200 в 1 мкл крови признается диагностическим критерием СПИДа. Недостаток метода - вариабельность результатов в одном Центре или между разными Центрами, так же, как и у одного и того же больного. Если число СD4+ клеток используют в КИ в качестве критерия оценки эффективности, применяемый метод должен быть подробно описан и валидирован. Рекомендуется определять и абсолютное содержание СD4+ клеток, и отношение СD4+/СD8+. Результат разового определения не может служить свидетельством улучшения либо ухудшения течения заболевания. Условия взятия проб крови также должны быть стандартизованы. Определение антигена р24. Наличие в периферической крови р24 одного из внутренних антигенов вириона ВИЧ - непрямой признак виремии. В нескольких исследованиях, однако, не было обнаружено связи между уровнем р24 в крови и прогрессированием заболевания. Таким образом, определение антигена р24 в качестве критерия эффективности не представляется надежным, хотя и может быть использовано как показатель антивирусной активности. 67

Другие косвенные маркеры. Для оценки динамики ВИЧ-инфекции часто используют такие лабораторные показатели, как сывороточный уровень - микроглобулина, неоптерина (белок острой фазы). Возможно, в качестве косвенного маркера будут использовать определение цитокинов. До сих пор четкой и воспроизводимой корреляции между этими показателями и прогрессированием заболевания у отдельного больного не найдено. Все методы должны быть валидированы. Качество жизни. В связи с тем, что многие ЛС, используемые для лечения ВИЧ-инфекции, цитотоксичны или обладают выраженным нежелательным действием, терапия этими средствами может влиять на качество жизни больного в неблагоприятном направлении. Таким образом, во время лечения следует применять методы оценки качества жизни больного. Выводы и практические рекомендации 1. Использование циклоферона в терапии ВИЧ-инфекции сопровождается стабилизацией клинических проявлений заболевания, улучшением состояния, а также гематологических и иммунологических показателей больных. 2. Циклоферон как монопрепарат оказывает иммуномодулирующее и противовирусное действие при лечении ВИЧ-инфицированных (стадии А1- В2/ 2 В - 3 Б) в тех случаях, когда нет значительного снижения числа СD4+ клеток (250-500). Курс циклоферона по 4 мл внутримышечно в 1, 2, 4, 6 и 8-й дни лечения. Хорошо зарекомендовало назначение циклоферона по схеме: - по 4 мл препарата в 1, 2, 4, 6, 8,10,13,16,19 и 22-й дни лечения. Первые две инъекции вводятся внутривенно, остальные - внутримышечно. Повторные курсы циклоферона рекомендуется проводить через 6 месяцев под иммунологическим контролем. 3. Циклоферон хорошо сочетается со всеми основными лекарственными формами. Циклоферон рекомендуется использовать в сочетании с противовирусными препаратами (азидотимидин, дидеоксицитидин, дидеоксиинозин, ацикловир и др.), когда имеются признаки активной репликации ВИЧ (высокие показатели вирусной нагрузки), у больных с обострениями различных оппортунистических заболеваний. Особенно перспективным представляется сочетанное использование циклоферона с ингибиторами протеаз (криксивел и др.) и противоретровирусными средствами. Такая комбинация препаратов с различным механизмом действия оказывает синергидный эффект (противовирусный, иммуномодулирующий), что позволит снизить дозы азидотимидина и уменьшить его токсическое воздействие на организм. 68

4. Циклоферон может использоваться (курсами) у больных с выраженной иммуносупрессией в промежутках после окончания противовирусной (противоопухолевой) терапии с целью улучшения гематологических и иммунологических показателей, повышения качества жизни больных. 5. Получен первый положительный опыт применения циклоферона с целью профилактики прогрессирования ВИЧ-инфекции при введении 2-4 мл препарата 1 раз в 10 дней в течение длительного времени. 6. Циклоферон может оказаться перспективным профилактическим средством при сомнительных контактах и контактах с заведомо ВИЧинфицированными партнерами. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦИКЛОФЕРОНА В ТЕРАПИИ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ При герпесе развиваются иммунодефицитные состояния, обусловленные недостаточностью различных звеньев иммунной системы и неспособностью ее элиминировать вирус из организма. Терапия герпетической инфекции представляет значительные трудности, связанные со способностью вируса длительное время персистировать в организме. Под наблюдением находилось 17 больных герпетической инфекцией: рецидивирующий герпес лица отмечен у 4 больных; рецидивирующий герпес гениталий - у 13 пациентов. Рецидивы возникали 1-2 раза в месяц, длительностью 4-6 дней, давность заболевания от 2 до 7 лет. Также под наблюдением находилось 15 больных с различными формами герпетической инфекции, возраст больных колебался от 32 до 58 лет. У 13 диагностирована генерализованная форма, у двух - герпетические поражения слизистых оболочек. Обострения отмечались 4-5 раз в год, сопровождались обильными высыпаниями, болевым синдромом. Эта группа больных была отобрана для проведения комбинированной терапии циклофероном с вифероном (рекомбинантный альфа-2-интерферон в свечах с мембраностабилизирующими препаратами). Двое больных до терапии циклофероном с вифероном получали лечение ацикловиром без эффекта. В качестве группы сравнения наблюдалось 10 человек, страдающих рецидивирующим герпесом, которым проводили терапию 5% кремом зовиракс. В таблице 37 представлена терапевтическая эффективность циклоферона. Отмечено стойкое улучшение общего самочувствия - значительное, а в ряде случаев полное исчезновение продромальных явлений, обусловленных вирусемией. Результаты лечения оценивали по следующим критериям: увеличение длительности ремиссии в 2,5 раза, сокращение сроков разрешения высыпаний в 2 раза, исчезновение клинических проявлений. 69

Таблица 37 Изучение терапевтической эффективности циклоферона Препарат

Всего больных

Циклоферон Зовиракс

17 10

Результаты лечения Улучшение Без Число % эффекта 14 82,4 3 7 70,0 3

В динамике наблюдения положительный клинический эффект после терапии циклофероном с вифероном по авторской схеме начал проявляться к 5-7 дню лечения (исчезновение высыпаний и отпадение корочек). Отсутствие обострений и рецидивов отмечено в течение 6-8 месяцев. Таблица 38 Продукция альфа- и гамма-типов интерферона у больных герпесом на фоне лечения циклофероном Показатели ИНФ, МЕ/мл Альфа-ИНФ Гамма-ИНФ

До лечения 46,7±2,6 13,3±1,3

После лечения 170,0±2,2 42,7±2,5

Контроль 469,3±12,3 168,0±18,5

По окончании лечения циклофероном отмечен интерферониндуцирующий эффект препарата. Усиление продукции альфа- и гамма-типов интерферона лейкоцитами крови наблюдали соответственно в 3,6 и 3,2 раза (табл. 38) нормализация показателей Т-клеточного ответа и тенденция к нормализации показателей периферической крови (табл. 39). Таблица 39 Динамика иммунологических показателей больных герпетической инфекцией на фоне лечения циклофероном Показатели, 10g/л Т-лимфоциты Т-лимфоциты активные В-лимфоциты Лимфоциты Нейтрофилы Моноциты

70

До лечения (исходный фон) 0,8±0,12 0,73±0,08 0,16±0,04 1,5±0,12 2,3±0,17 0,21±0,03

После окончания лечения 1,26±0,4 1,1±0,12 0,21±0,04 3,1±0,2 2,6±0,2 0,26±0,03

Контроль 1,3±0,09 1,3±0,09 0,24±0,03 1,7±0,11 3,1±0,2 0,33±0,03

Переносимость была хорошей, аллергических и других побочных реакций на введение препарата не отмечено. Таким образом, циклоферон может быть рекомендован для лечения герпетической инфекции, а комбинированная терапия с вифероном дает стойкий клинический эффект и обеспечивает длительную защиту от обострения и рецидивов. Одним из наиболее частых проявлений герпетическккой инфекции является поражение тканей глаза (офтальмогерпес), составляющий от 20 до 50 % всех воспалительных заболеваний роговицы. Более чем у половины всех больных он склонен к рецидивам и нередко оставляет после себя тяжелые последствия (Сомов Е.Е., 1996). Трудности в лечении герпетических поражений глаз обосновывают актуальность новых эффективных препаратов для терапии этого заболевания. В решении задачи освобождения организма “хозяина” от вируса можно условно выделить два направления: селективное воздействие на различные этапы репродукции ВПГ и повышение резистентности к вирусу на уровне клетки и организма инфицированного “хозяина” (Чижов Н.П., 1988). В рамках первого направления созданы и успешно применяются в клинической практике ряд химиопрепаратов с различным механизмом действия. Наиболее представительная группа соединений - аномальные нуклеозиды. Они являются антиметаболитами, т.е. неприродными соединениями, которые включаются в синтез вирусной ДНК, приводя к образованию дефектного генома и, следовательно, неинфекционного вируса. Они действуют на стадии репликации ДНК вируса, угнетая вирусную ДНК-полимеразу и обрывая синтез растущей цепи ДНК. Эта группа соединений включает в себя пиримидиновые аналоги нуклеозидов: иодоксиуридин, бромвинилдезоксиуридин, цитозинарабинозид, а также пуриновые аналоги: ацикловир, ганцикловир. Действие этих соединений реализуется в инфицированной клетке посредством вирусиндуцируемого фермента - тимидинкиназы (Balzarini et al., 1993), полифункционального комплекса, обладающего дополнительной дезоксицитидинкиназной, тимидинкиназной и фосфотрансферазной активностью (Jamielson A. T. et al., 1974, 1976; Chen M. S., Prusoff W.N., 1978). Тимидинкиназа последовательно фосфорилирует аналоги нуклеозидов до моно- ди- и трифосфатов. Последние являются активной формой препаратов, угнетающих репликацию вирусной ДНК герпесвирусов (Whitley R. J., Gnann J. W., 1992). Второе направление представлено большой и разнообразной группой препаратов, которые не действуют непосредственно на вирус, но изменяют метаболизм клетки так, что репродукция вируса становится невозможной. Наиболее часто используемые в терапии герпетической инфекции интерферон и его индукторы отличаются универсальным противовирусным эффектом. Полагают, что антивирусная активность интерферона опосредова71

на клеточными ферментами (2,, 5,, - олигоаденилатсинтетазой и протеинкиназой), которые синтезируются после обработки клеток интерфероном. Первый их них синтезирует семейство 2,, 5, - олигоаденилатов, которые активируют латентную эндонуклеазу, вызывающую деградацию вирусных мРНК. Вероятно, с этим связано отчетливое ингибирующее действие на репродукцию ВПГ 2,, 5, - олигоаденилатов в опытах in vivo и in vitro, показанное в работе Fujinura (1989). Из большого количества соединений, природных и синтетических, которые являются индукторами интерферона, в терапии герпетической инфекции используются: полудан (синтетический комплекс полирибоадениловой и полирибоуридиновой кислот, поли(А) -поли (У)), пирогенал и продигиозан (липополисахариды бактериального происхождения), а также препараты, представляющие собой нативную двуспиральную РНК - ларифан (репликативная форма фага F2) и ридостин (дрожжевая двуспиральная РНК). Экспериментальное исследование герпетического кератита на кроликах и морских свинках позволило выявить значительное усиление эффективности противовирусных препаратов типа аномальных нуклеозидов при сочетании их с индукторами интерферона, такими как ридостин и ларифан (Львов Н. Д. и др., 1989). В последние годы врачи офтальмологи испытывают все большую потребность в новых средствах лечения вирусных заболеваний глаз. Одним из направлений такой терапии служит местное применение индукторов эндогенного интерферона. В настоящее время отдельные препараты (полудан, пирогенал, продигиозан и др.) получили достаточно широкое клиническое применение (Сомов Е.Е., 1996). Эффективность их местного введения (и подконъюнктивальные инъекции) объясняют стимуляцией местного интерфероногенеза непосредственно в тканях глаза, преимущественно в его сосудистой оболочке, а также проникновением эндогенного интерферона через гематоофтальмический барьер (Каспаров А.А., 1994). В настоящее время в терапии герпес-вирусных инфекций наиболее широко применяются*: Полудан - комплекс полиадениловой и полиурициловой кислот. Применяется при герпетических кератитах, конъюнктивитах, иридоциклитах, невритах зрительного нерва. На курс лечения от 5 до 25 инъекций. Препарат индуцирует ИНФ-α и γ-типов. Обладает защитным эффектом при герпесвирусных и арбовирусных инфекциях. Выпускается в виде лиофилизированного ампульного порошка *

См.: Противовирусные средства (Ершов Ф.И., 1993); Терапия герпетической инфекции (Исаков В.А., 1993); Офтальмогерпес (Каспаров А.А., 1994).

72

по 10 мг; в виде мази в тюбиках по 10 г. Содержание полудана в лекарственной форме не ниже 50 %. Полигуацил - высокомолекулярный индуктор интерферона, представляет собой комплекс полирибогуаниловой и полирибоцитидиловой кислот. Выпускается в ампулах по 10 мг лиофилизированного порошка. Препарат индуцирует поздний интерферон, пик продукции (60-120 МЕ/мл) отмечается через 18-24 часа. В органах, богатых лимфоидной тканью, максимум продукции ИФН отмечается через 48 часов. Преимущественно препарат индуцирует α-тип ИНФ. Гипореактивная фаза начинает выявляться на 3 сутки после индукции и длится 5-6 дней, после чего организм снова приобретает способность синтезировать ИНФ. Продигиозан - высокомолекулярный липополисахарид, выделенный из Bact. prodigiosum. Выпускается в ампулах по 1 мл 0,005% раствора. Относится к группе бактерицидных препаратов с противовирусной активностью и средством, стимулирующим специфические и неспецифичческие факторы резистентности организма. Противопоказания: поражение ЦНС, коронарная недостаточность. Побочное действие: температурная реакция, ломота, боль в суставах, мышцах, головная боль. Обострение хронических заболеваний кишечника. Ларифан - первый препарат из группы дс-РНК, обладающий интерфероногенным действием, представляет собой двуспиральную РНК фага F2 Е.coli. Выпускается в ампулах по 10 мг лиофилизированного стерильного порошка; в виде мази 0,05 % в тубах по 25 г. Препарат индуцирует α/β - тип ИФН, максимальное значение ИФН регистрируется в крови через 6-8 часов и достигает 60-120 МЕ/мл; через 24 часа - в сыворотке крови не определяется. Обладает выраженным иммунотропным действием: стимулирует специфические и неспецифические звенья иммунитета, а также выраженным антибактериальным и антитуморогенным эффектом. Препарат не рекомендуется применять при заболеваниях почек. Ридостин - высокомолекулярный индуктор ИНФ природного происхождения; дс-РНК, полученная из лизата киллерных дрожжей S. cervisine. Выпускается в лиофилизированном виде в ампулах по 8 мг. Индуцирует в организме ранний α/β-интерферон. Максимум накопления в сосудистом русле отмечено через 6-8 часов и составляет 30-130 МЕ/мл. Не определяется в кровотоке через 24 часа. По действию препарат аналогичен ларифану.

73

Имунофан* - синтетический препарат, содержащий в качестве действующего вещества гексапептид. Показана его иммуномодулирующая активность, дезинтоксикационное и противовоспалительное действие. Препарат снижает интенсивность пероксидации липидов, оказывает влияние на выработку активных форм кислорода нейтрофилами периферической крови, стимулирует продукцию противовирусных и антибактериальных антител у больных острыми и хроничческими инфекциями. Индукторы интерферона (циклоферон и полудан) в терапии экспериментального герпетического кератита Появление нового высокоэффективного индуктора эндогенного интерферона альфа/бета типа - циклоферона, производимого НТФФ “Полисан”, закономерно поднимает вопрос о возможностях его использования в офтальмологической практике, в частности в лечении вирусных заболеваний глаз. Материалом для исследования послужили 13 здоровых кроликов альбиносов. У животных моделировали герпетический кератит путем нанесения культуры вируса простого герпеса на предварительно надсеченную роговицу левого глаза. Насечки (по две равной длины 2-2,5 мм) были выполнены скарификатором по взаимно перпендикулярным плоскостям в оптической зоне роговицы. В работе использовали вирус простого герпеса 1 типа штамма ЕС, выделенный от больной, страдающей рецидивирующим herpes labialis. Особенностью этого штамма является способность вызывать менингоэнцефалит при периферических путях заражения (Львов Н.Д., 1989). Интактный правый глаз кроликов оставался контрольным. Все животные были разделены на три группы (соответственно по 5, 3 и 5 кроликов). Третья группа кроликов, не получавших лечения, являлась контрольной. Все кролики находились под ежедневным врачебным наблюдением, а на 4, 9, 11, 13, 16 и 23-й день эксперимента их осматривал врачофтальмолог. Офтальмологическое обследование включало осмотр глаз в боковом (фокальном) освещении с использованием 0,1 % - раствора флюоресцеина-натрия - известного витального диагностикума нарушения целостности эпителия роговицы. При этом интенсивность прокрашивания роговицы определяли по четырехбалльной шкале: 0 - отсутствие прокрашивания; 1 - едва заметное нестойкое прокрашивание; 2 - выраженное поверхностное прокрашивание инфильтрата; 3 - резко выраженное прокра*

См.: Слепцова О.С. с соавт. // Офтальмологический журнал. 1997. №1. С. 5-8.

74

шивание воспалительного инфильтрата во всю толщу. Также по четырехбалльной шкале измеряли и плотность васкуляризации роговицы: 0 - отсутствие врастания сосудов в прозрачные слои роговицы; 1 - врастание в роговицу единичных сосудов; 2-вросшие в роговицу сосуды образуют “венчик”, в котором дифференцируются отдельные сосуды; 3-вросшие сосуды образуют сплошной красный “ореол” в прозрачных участках роговицы. Аналогично описанным выше способом определяли и выраженность острого иридоциклита: 0 - отсутствие его признаков; 1 - стушеванность рисунка радужки; 2 - то же в сочетании с миозом; 3 - резко выраженное воспаление переднего отдела сосудистой оболочки глаза в сочетании с выпотом фибрина в переднюю камеру или образованием гипопиона. Оценку воспалительных изменений конъюнктивы производили, ориентируясь на следующие параметры: 0 - отсутствие воспалительных изменений; 1 - воспалительная инъекция сосудов конъюнктивы; 2 - то же в сочетании с выраженной слизистым или слизисто-гнойным отделяемым из конъюнктивальной полости; 3 - то же в сочетании с хемозом. На 4, 9, 14, 20 и 25-е сутки развития инфекции у животных брали мазки с зараженного глаза и использовали для прямого вирусовыделения. Материал смыва разводили в 1 мл питательной среды, содержащей 1% сыворотки крупного рогатого скота, 5 мкг/мл фугизона, 80 мкг/мл гентамицина и готовили ряд разведений: от 10-1 до 10-4. Культуру клеток карциномы легкого человека А549 засевали в 96луночные планшеты по 100 мкл в лунку в концентрации 2Χ105 кл/мл и культивировали при 370С в атмосфере 5% СО2 до образования монослоя. Клеточный монослой отмывали от ростовой среды раствором Хенкса и в каждую лунку добавляли по 100 мкл соответствующих разведений вирусного инокулята, инкубировали 1 час при 370С в атмосфере 5 % СО2, затем доводили объем до 200 мкл поддерживающей средой, содержащей 1 % сыворотки крупного рогатого скота, 5 мкг/мл фунгизона, 80 мкг/мл гентамицина. На каждое разведение исследуемого материала отводилось по 4 лунки. Учет результатов проводился на 7 сутки по наличию специфического вирусного ЦПД, с определением титров вируса, вызывающих поражение клеток в культуре. Для выделения вируса из ткани мозга участок ствола мозга, изолированного на 11 день после заражения, объемом 1 см3 был растерт в ступке и разведен в 3 мл поддерживаемой среды. Материал был центрифугирован в течение 30 мин при 6 000 об/мин, и из надосадка приготовлены серии разведений от 10-1 до 10-5.

75

Гистологическое и электронномикроскопическое исследование течения офтальмогерпеса Глазные яблоки животных, погибших в ходе опыта и выживших до конца эксперимента, фиксировали в жидкости Буэна, обезвоживали и заливали в парафин. Из приготовленных блоков готовили срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и анализировали под световым микроскопом. Морфологическому исследованию подвергали комплексы, состоящие из роговицы, конъюнктивы, радужной оболочки и передних отделов сетчатки. Параллельные препараты готовили для исследования под электронным микроскопом. Для этого участки роговицы фиксировали 2,5 % раствором глутарового адельгида на какодилатном буфере с последующей дофиксацией четырехокисью осмия и контрастированием уранилацетатом, обезвоживанием и заливкой в эпон. Ультратонкие срезы тканей контрастировали цитратом свинца и исследовали под электронным микроскопом JEM-100S при ускоряющем напряжении 80 кВ. Клиническое течение экспериментального герпетического кератита У всех кроликов в зоне “инфицированных” насечек роговицы на третий день эксперимента развился острый кератит, клинически выраженный в виде герпетического древовидного (у 8 животных: 61,5%) или не имеющего специфики округлого инфильтрата, достигающего 4-5 мм в диаметре (38,5%). Во всех случаях роговичные изменения сопровождались выраженной воспалительной реакцией со стороны конъюнктивы (хемоз, смешанная инъекция сосудов, слизистое отделяемое). Далее воспалительные явления нарастали, формировался глубокий стромальный роговичный инфильтрат, прокрашивающийся раствором флюоресцеина-натрия и достигающий максимальной выраженности к 9-11 дню эксперимента. Одновременно развивались и явления иридоциклита: миоз, отек радужки (у 2 кроликов: 15,4%) и образование фибрина (и даже гипопиона) в передней камере. Следует отметить, что на 9-й день после заражения, у 6 животных (46,2%) на фоне максимально выраженных воспалительных изменений глазного яблока наступила генерализация герпетического процесса с развитием менингоэнцефалита, приведшего к их гибели. У остальных же выживших кроликов с 13-го дня заболевания наблюдалось постепенное уменьшение явлений раздражения глазного яблока: стихание явлений увеита, уменьшение хемоза, гиперемии конъюнктивы. Воспалительный инфильтрат роговицы постепенно уменьшался в размерах, начиналась его 76

медленная эпителизация. В те же сроки на фоне уменьшения интенсивности смешанной инъекции сосудов глазного яблока наблюдали рост новообразованных сосудов среднего калибра в роговицу в виде плотного “частокола” по направлению от нижних отделов лимба в оптическую зону, к воспалительному инфильтрату (у 6 кроликов: 85,7%). При этом вокруг инфильтрата роговицы (преимущественно по его верхнему краю) неоваскуляризация роговицы была выражена максимально. В дальнейшем, начиная с 18-го дня наблюдения, отмечали запустевание большинства новообразованных сосудов, проходящих через периферические отделы роговицы от лимба к инфильтрату роговицы. При этом сохранялись лишь отдельные крупные сосуды, а также сеть новообразованных капилляров непосредственно у воспалительного инфильтрата роговицы. Завершался рассматриваемый процесс полной эпителизацией роговицы с формированием нежных субэпителиальных помутнений на месте воспалительного инфильтрата и облитерацией всех новообразованных сосудов роговицы. Правый, контрольный глаз у всех животных на протяжении эксперимента оставался интактным. Клиническое течение экспериментального герпетического кератита имело особенности в группах кроликов, на фоне лечения индукторами интерферона. Динамика герпетического кератита в контрольной группе кроликов Полученные при обследовании животных результаты представлены в таблице 40. Установлено, что размеры воспалительного инфильтрата роговицы животных оказались максимальными на 9-й день наблюдения, однако в рассматриваемой группе кроликов воспалительный инфильтрат имел все же больший объем. С 11-го дня наблюдения размеры инфильтрата существенно уменьшились, обозначилась тенденция к его рассасыванию. Прокрашивание инфильтрата, отмеченное с 4-го дня заболевания, оказалось максимальным на 9-й день, однако уже на 11-й день эксперимента воспалительный инфильтрат роговицы вовсе не прокрашивался. Следует также отметить, что прокрашивание инфильтрата на 9-й день наблюдения в рассматриваемой группе кроликов было более выраженным, чем в опытах. На фоне уменьшения размеров и “активности” воспалительного инфильтра роговицы в контрольной группе кроликов также развилась его васкуляризация. Однако у последних врастание в роговицу сосудов отмечено только с 13-го дня заболевания. 77

Воспалительные изменения конъюнктивы, выявленные с 4-го дня наблюдения, достигали максимума на 9-й день эксперимента, а затем, по мере рассасывания воспалительного инфильтрата роговицы, быстро уменьшались. У одного кролика на 13-й день наблюдения отмечен интенсивный фолликулез в сводах конъюнктивы обоих глаз (наиболее выраженной на левом, зараженном), проследить динамику которого из-за скорой генерализации инфекции и гибели животного не удалось. Признаки иридоциклита, появившиеся и максимально выраженные на 9-й день заболевания, в дальнейшем имели тенденцию к уменьшению.

78

Таблица 40 Динамика экспериментального герпетического кератита в контрольной группе кроликов (n=5) Контролированные параметры 4 Характеристика воспалительного инфильтрата роговицы: размеры (мм) диаметр прокрашивающихся участков (мм) плотность васкуляризации (баллы) Характеристика воспалительной реакции окружающих тканей глаза: выраженность иридоциклита (баллы) выраженность воспаления конъюнктивы (баллы) Развитие генерализации процесса (%)

Время после моделирования кератита (сут.) 9 11 13 16

23

2,01±0,52 6,13±0,73 1,76±0,63 5,13±0,76 0 0

3,0 0,0 0,0

3,0 0,0 1,0

0 0 0

0 0 0

0 0,25±0,01 1,01±0,02 1,58±0,12 0 0

0,1 0,1 60,0

0,1 0,1 -

0 0 80,0

0 0 Таблица 41

Динамика экспериментального герпетического кератита на фоне применения циклоферона (n=5) Контрольные параметры 4 Характеристика воспалительного инфильтрата роговицы: размеры (мм) диаметр прокрашивающихся участков (мм) интенсивность прокрашивания (баллы) плотность васкуляризации (баллы) Характеристика воспалительной реакции окружающих тканей глаза: выраженность иридоциклита (баллы) выраженность воспаления конъюнктивы (баллы) Развитие генерализации процесса (%)

1,20±0,41 1,22±0,33 1,40±0,12 0

Время после моделирования кератита (сут.) 9 11 13 16 5,71±0,72 5,70±0,73 2,50±0,28 0,50±0,06

3,03±0,52 3,03±0,52 2,66±0,34 2,01±0,32

1,10±0,32 1,10±0,32 1,33±0,21 3,03±0,43

1,20±0,24 1,20±0,24 1,66±0,21 2,03±0,32

23 2,13±0,41 2,13±0,41 0,66±0,03 1,00±0,23

0 0 0 0 0,27±0,05 0,20±0,03 0,93±0,02 1,42±0,23 1,55±0,24 0,44±0,06 1,11±0,34 0,33±0,05 0 40,0 79

Следует отметить, что в рассматриваемой группе животных значительно чаще, чем у кроликов, получавших препараты интерфероногенов, развивалась генерализация герпетической инфекции, возникал менингоэнцефалит с последующей гибелью животных (80,0%). При этом три кролика погибли на 11-й день и один - на 16-й день эксперимента. Эти обстоятельства не позволили достоверно оценить дальнейшую клиническую динамику офтальмогерпеса у единственного выжившего “контрольного” животного. Влияние циклоферона на течение экспериментального герпетического кератита Полученные результаты представлены в таблице 41. Установлено, что воспалительный инфильтрат роговицы, достигший максимальной выраженности на 9-й день эксперимента, уже с 11-го дня (после трех инъекций циклоферона) начал уменьшаться в размерах. При этом наиболее заметная динамика наблюдалась в отношении прокрашивания инфильтрата: его площадь на 11-й день заболевания уменьшилась в 5 раз, хотя интенсивность прокрашивания деэпителизированных участков инфильтрата несколько увеличилась. В дальнейшем с 13-го дня наблюдения (после четырех инъекций исследуемого препарата) выявлено существенное уменьшение размеров инфильтрата, а также площади и интенсивности его прокрашивания. Вместе с тем на 23-й день эксперимента увеличились размеры воспалительного инфильтрата роговицы. Характеризуя неоваскуляризацию роговицы, следует отметить, что наиболее информативным ее параметром является плотность (интенсивность), которая прогрессивно нарастала с 9-го к 13-му дню заболевания, а затем постепенно уменьшалась к 23-му дню эксперимента, в то же время размер вросших в инфильтрат сосудов не изменялся. Воспалительная реакция со стороны конъюнктивы кроликов (хемоз, инъекция сосудов), нарастала к 9-му и 11-му дню эксперимента, а затем (табл. 41) достоверно уменьшалась к 23-му дню заболевания (после окончания курса введения циклоферона). Причем на 16-й день эксперимента (на фоне шести инъекций препарата) явления раздражения конъюнктивы, как и интенсивность прокрашивания воспалительного инфильтрата роговицы, усиливались, этому предшествовало увеличение размеров инфильтрата роговицы (описание выше). Признаки иридоциклита, появившиеся на 9-й день наблюдения, в рассматриваемой группе кроликов вскоре полностью исчезли и возобновились лишь на 23-й день эксперимента. У двух кроликов, получивших по две подконъюнктивальных инъекции циклоферона, на 7-й и 9-й дни эксперимента наблюдалась генерализация

80

герпетической инфекции с развитием острого менингоэнцефалита и последующим летальным исходом. Влияние полудана на течение экспериментального герпетического кератита Данные обследования 3 кроликов получавших подконъюнктивальные инъекции полудана, представлены в таблице 42. Максимального размера воспалительный инфильтрат роговицы достиг к 9-му дню заболевания, незначительно уменьшился на 11-й день, а затем наметилась отчетливая тенденция к его рассасыванию. При этом наибольшая площадь прокрашивания инфильтрата роговицы отмечена на 11-й день эксперимента (после трех инъекций полудана). Максимальная интенсивность прокрашивания сохранялась до 16-го дня наблюдения. При этом величина инфильтрата роговицы и интенсивность его прокрашивания к моменту завершения эксперимента была несколько меньше, чем у животных, получавших циклоферон. Начало васкуляризации роговицы отмечено на 11-й день эксперимента. Ее плотность, которая достигла максимума развития на 13-16-й день. И лишь к 23-му дню заболевания отмечена тенденция к запустеванию сосудов вокруг инфильтрата роговицы. Следует отметить, что незначительная воспалительная реакция со стороны конъюнктивы, с максимальным развитием на 4-9-й дни эксперимента, уже с 11-го дня наблюдения начала уменьшаться, а с 13-го дня была полностью купирована. В то же время явление иридоциклита в этой группе животных имело затяжное течение, сохраняясь и наблюдаясь до 16 дня заболевания. На 11-й день эксперимента (на фоне трех инъекций полудана) у одного животного (33,3%) развилась генерализация герпетической инфекции с развитием менингоэнцефалита и летальным исходом. Характеристика лечебной эффективности используемых препаратов При сравнительном анализе влияния исследуемых препаратов на клиническую динамику воспалительного инфильтрата роговицы установлено, что хотя величина инфильтрата, площадь и интенсивность его прокрашивания и были на 9-й день эксперимента более выражены у кроликов, получавших циклоферон, в дальнейшем явления кератита у них имели более благоприятное течение, чем на фоне лечения полуданом (табл. 43). Следует отметить, что максимальное развитие воспалительных явлений в роговице у кроликов, получавших полудан, наступало позже (на 3 сутки), в сравнении с первой группе животных. Как и васкуляризация воспалитель81

ного инфильтрата роговицы, отмеченная в первой группе кроликов на 9-й, а во второй - на 11-й день заболевания.

82

Таблица 42 Динамика экспериментального герпетического кератита на фоне применения полудана (n=3) Контрольные параметры 4 Характеристика воспалительного инфильтрата роговицы: -размеры (мм) -диаметр прокрашивающихся участков (мм) -интенсивность прокрашивания (баллы) -плотность васкуляризации (баллы) Характеристика воспалительной реакции окружающих тканей глаза: -выраженность иридоциклита (баллы) -выраженность воспаления конъюктивы (баллы) Развитие генерализации процесса (%)

Время после моделирования кератита (сут.) 9 11 13 16

23

2,0; 2,0; 2,0 4,0; 4,0; 5,0 4,0; 3,9 0,1; 2,0 0,001; 3,0 0,09; 3,0 2,0; 2,0; 2,0 5,0; 4,0; 0 4,0; 3,9 1,3; 0,01 0,001; 2,8 0,09; 0 2;2;2 3;0;2 2;3 2;3 2;3 1;0 0;0;0 0;0;0 1;1 2;2 1;3 0;3 0;0;0 1;1;1 0

0;0;0 1;1;1 0

1;1 1;1 33,3

2;2 0;0 -

1;3 0;0 -

0;3 0;0 -

Таблица 43 Сравнительная эффективность циклоферона и полудана в лечении герпетического кератита у кроликов Исследуемый препарат

n Начало эпителизации

Циклоферон

5

11

Полудан

3

13

Контроль

5

11

Контролированные временные параметры (интервал, сут) Инфильтрат роговицы Уменьшение Начало расса- Начало васку- Обратное раз- конъюнктивита сывания ляризации витие сосудов и иридоциклита 12 11 9 16 (11-13) 14 11-13 11 23 (11-16) 19 11 13 16 (16-23)

Генерализация инфекции (%) 40,0 33,3 80,0 83

Воспалительные изменения конъюнктивы были минимальными и менее продолжительными (не дольше 11-го дня наблюдения) в группе кроликов, получавших полудан. В то же время явления острого иридоциклита, возникшего на 9-й день заболевания, у животных, получавших циклоферон, уже через 3 дня полностью исчезли, тогда как на фоне лечения полуданом они сохранялись до 16-го дня эксперимента. При этом в первой группе кроликов на 23-й день наблюдения вновь были отмечены признаки воспаления переднего отдела сосудистой оболочки глаза. В контрольной группе генерализация герпетической инфекции глаза с развитием описанных выше исходов отмечена у 80% животных, против 40,0 и 33,3% животных, получавших циклоферон и полудан. Вместе с тем интенсивность воспалительных изменений роговицы, конъюнктивы и переднего отдела сосудистой оболочки глаза у животных контрольной группы была несколько меньшей в сравнении с группой животных, получавших циклоферон и полудан. Таким образом, введение циклоферона привело к раннему уменьшению инфильтрата роговицы (начало васкуляризации и обратного развития сосудов) в сравнении с применением полудана (составив соответственно 9 и 11,16 и 23 дня), а уменьшение воспалительных изменений (явления конъюнктивита и придоциклита) наблюдали в группе животных, получавших циклоферон на 12-е сутки, тогда как у животных, получавших полудан, эти явления отмечены с 14-го дня, против 19-го дня начала стихания воспалительного процесса в группе контрольных животных. Результаты патоморфологического исследования глаза контрольных животных и животных, подвергшихся воздействию препаратов При исследовании роговицы пораженного глаза наблюдалась дискомплексация эпителиального пласта с разрушением базальной мембраны, инфильтрацией эпителия и подлежащей соединительной ткани круглоклеточными элементами и нейтрофилами. Местами была отмечена полная деструкция пласта роговицы (язва). На поверхности роговицы наблюдали детрит, в котором обнаружены гиперхромные ядра, характерные для герпетического процесса. Вблизи патологических очагов отмечали новообразование сосудов и отек боуменовской мембраны, которая была вдвое шире по сравнению с нормальной. При этом наблюдалась резко выраженная гиперемия сосудов и воспаление конъюнктивы. В подлежащей соединительной ткани выявлены многочисленные нейтрофилы. Патологии сетчатки и радужки выявлено не было. 84

У животных, получавших циклоферон, отмечено усиление местной воспалительной реакции: в передней камере глаза обнаружены многочисленные лейкоциты. Роговица была истончена, ее поверхностный эпителиальный слой на большом протяжении оказывался слущенным. В конъюнктиве обнаруживали язву. Значительное количество лейкоцитов отмечали на боуменовской мембране. На введение полудана у животных также отмечалось усиление местной воспалительной реакции и гнойный экссудат в передней камере глаза. Мощная воспалительная реакция сопровождалась дегенерацией эпителия. В строме эпителия обнаружены нейтрофилы и явно выраженное новообразование сосудов. Начиная с 10 дня после заражения в контрольных и опытных группах животных гистологически наблюдали процессы регенерации роговицы на фоне уменьшения отека, запустенения вновь образованных сосудов роговицы с изменением структуры эпителия. Воспалительная реакция в этот период оказывалась слабой и была представлена остаточными нейтрофилами. Роговица к этому сроку была выстлана однослойным регенерирующим эпителием, закрывающим пораженную область. Также отмечали расширение пространства между волокнами боуменовской мембраны. К исходу опыта процессы регенерации и репарации поврежденной роговицы у всех групп животных были закончены. О перенесенной инфекции можно было судить лишь по остаточным изменениям. Эпителий роговицы был полностью восстановлен, однако субэпителиальная ткань оставалась слегка отечной. Воспалительной инфильтрации обнаружено не было. Общая структура глаза не отличались от нормальной. Под эпителием были выявлены остатки мелких запустевших новообразованных сосудов. На заключительном этапе эксперимента электронно-микроскопически были выявлены различия в структуре эпителиальных клеток роговицы в зависимости от степени остаточной васкуляризации боуменовской мембраны. Выявлены клетки ткани с большим количеством митохондрий по сравнению с интактной тканью, что является следствием глубоких изменений метаболизма клеток эпителия в процессе восстановления слоя роговицы. Таким образом, в результате нанесения культуры вируса простого герпеса на предварительно надсеченную роговицу у всех кроликов получена модель герпетического эпителиального и стромального кератита, имеющего одинаковое фазное течение. Существенных различий в течении патологического процесса у животных, прошедших лечение индукторами интерферона (полуданом и циклофероном по предложенной схеме) и животных, не подвергавшихся воздействию препаратов, обнаружено не было. Эти результаты согласуются с 85

данными других авторов (Львов Н.Д. и др., 1979), использовавших в аналогичных исследованиях другие индукторы интерферона (ларифан и ридостин) и обнаруживших высокую их эффективность в лечении офтальмогерпеса при комбинации со специфическими противовирусными препаратами. На фоне подконъюнктивального введения индукторов интерферона отмечена тенденция к снижению частоты генерализации инфекционного процесса с развитием менингоэнцефалита и гибелью животных, а также уменьшение при введении циклоферона сроков рассасывания воспалительного инфильтрата роговицы, его эпителизации и васкуляризации, по сравнению с животными, получавшими полудан. Клиническое изучение циклоферона в терапии офтальмогерпеса (предварительные исследования) Герпетические поражения глаз отличаются тяжелым, упорным рецидивирующим течением, нередко приводят к значительному нарушению зрительных функций, длительной временной или стойкой утрате трудоспособности. По материалам ВОЗ, герпесвирусные заболевания глаз являются главной причиной слепоты среди всех инфекционных поражений глаз (до 60% всей роговичной слепоты). Выделяют герпетические поражения конъюнктивы, склерозы, сосудистой оболочки, сетчатки, зрительного нерва. Описана ассоциированная герпес-вирусно-бактериальная инфекция органа зрения. Офтальмогерпес осложняется стафилококковой и синегнойной инфекцией. Следует отметить, что эпителиальный дефект роговой оболочки при офтальмогерпесе является важным фактором, предшествующим вторичной бактериальной инфекции, следовательно, ускорение эпителизации имеет большое прогностическое значение. Лечение офтальмогерпеса представляет трудную задачу. Этим объясняется обилие лекарственных препаратов и методов его лечения. Особое место в лечении офтальмогерпеса занимают интерфероны и их индукторы, стимулирующие неспецифические факторы иммунитета. В качестве интерфероногенов (ИГ) используются низкомолекулярные сополимеры поливинилпирролидона-ПВП (синоним гемодез), ИДУ-керецид. Отмечено более эффективное лечение ИГ по сравнению с ИФ и ИДУ. Побочных эффектов авторы не отмечают ни в экспериментальных, ни в клинических исследованиях. Описан быстрый, на 3-4-е сутки лечения, положительный эффект применения ИГ и при эпидемическом кератоконъюнктивите, вызываемом аденовирусом. 86

Исследованиями последних лет установлено, что патологическое состояние иммунной системы организма является основополагающим в возникновении и развитии тяжелых хронических заболеваний. Ряд работ свидетельствует о количественном и функциональном дефиците Т-лимфоцитов при рецидивирующем офтальмогерпесе. Отмечена патогенетическая связь тяжести герпесвирусного процесса в глазу с функциональным состоянием центрального органа иммунитетатимусом, контролирующим созревание и развитие иммунокомпетентных клеток. Вместе с тем изменения иммунного гомеостаза предполагает коррекцию показателей нарушенного иммунного статуса прежде всего препаратами, относящимися к иммунокорректорам. В 1987 году американские ученые назвали иммуномодуляторы модификаторами биологического ответа (biologic response modifiers B R Ms). Это очень широкое понятие, включающее препараты, стимулирующие и угнетающие иммунный ответ. Иммунокорректорами обозначают вещества, стимулирующие иммунный ответ при его снижении или восстановливающие иммунный гомеостаз при повышениии функции какого-либо звена системы иммунитета, повышающие или снижающие иммунные реакции в зависимости от дозы и условий применения. Исследования проведены на базе офтальмологического отделения Калининградского военного госпиталя после тщательного обследования больных и клинико-лабораторной вирификации диагноза. Все больные были информированы о проведении клинического исследования и разделены на две группы. В первой группе 18 больных получали циклоферон по разработанной схеме. Во второй 25 больных получали традиционную (базисную с плацебо) терапию. Достоверные различия между группами по полу, возрасту, срокам заболевания отсутствовали. Все больные находились в остром периоде заболевания или обострении хронического процесса (период рецидива). Ни один из больных в течение 2-3 месяцев до настоящего исследования не принимал препаратов интерферона, иммуномодуляторов, стероидных гормонов. Проводили стандартное офтальмологическое обследование с измерением остроты зрения, рефрактометрией, исследованием чувствительности роговицы, поля зрения, показателей внутриглазного давления. В динамике наблюдения проведено изучение показателей контрастной чувствительности органа зрения для контроля восстановления зрительных функций.

87

По степени поражения роговицы условно выделили 4 степени тяжести поражения: до 25 % площади роговицы - 1-я степень, до 50 % - 2-я, до 75 % - 3-я и при тотальном поражении - 4 степень. Использован метод клинического наблюдения и общеврачебного осмотра, клинические, биохимические исследования крови по стандартным методикам. До и после лечения проводили исследования показателей иммунологической реактивности по стандартным методам. Циклоферон применялся по схеме: Внутривенно по 250 мг один раз в сутки через день в течение 7-10 дней в зависимости от тяжести воспалительного процесса. Курсовая доза составляла от 1250 до 2500 мг. Также использовали электрофорез циклоферона эндоназально с положительного полюса, через день в течение 10 суток. Анализ клинических результатов показал, что лечение циклофероном дало положительный эффект у 17 больных (94,4%). При сравнении результатов лечения по стандартным критериям выявлено достоверное уменьшение сроков стихания воспалительных явлений и эпителизации при применении циклоферона. Этот эффект отмечен главным образом при поверхностных кератитах. Острота зрения повысилась в первой группе у 11 (91,6%) больных, не изменилась у 1-го больного. Во второй группе острота зрения повысилась у 3 больных, не изменилась у 3. Назначение циклоферона по 2,0 мл внутривенно через день в течение 510 дней не вызывает у больных осложнений, ухудшения симптоматики основного заболевания и самочувствия. Показатели внутриглазного давления, поля зрения, рефракция не ухудшались. Не отмечено аллергических реакций на препарат и возникновения побочных эффектов, требующих отмены препарата. Дважды, в наиболее тяжелых клинических случаях (угроза перфорации роговицы) препарат применен по 2,0 мл внутривенно ежедневно в течение 10 дней. Побочного действия не отмечено. По данным А.А.Каспарова (1994), Е.Е.Сомова (1996), при лечении офтальмогерпеса высокоэффективен первый отечественный интерфероноген - полудан. Препарат обладает высоким ингибирующим действием на ВПГ при отсутствии токсического эффекта. Отмечено, что полудан и ацикловир (3% мазь) обладают равными возможностями при лечении древовидных кератитов. При раннем назначении полудана в виде субконъюнктивальных инъекций излечиваются до 60 % 88

больных с наиболее тяжелыми (глубокими) формами герпетического поражения роговицы. Токсических эффектов при лечении полуданом не отмечено. Установлено, что при лечении полуданом, так же как и при лечении ИДУ, ацикловиром, гарантировать отсутствие рецидивов не представляется возможным. Таблица 44 Результаты лечения больных с поверхностными герпетическими кератитами Препарат

Стандартная терапия с плацебо Циклоферон **Полудан

Число больных

Эпителизация

25 12 65

16,3±1,2* 7,7±0,8* 8,6±0,9

Средний срок (в днях) Резорбция Начало инфильтрата ремиссии 21,8±2,0* 11,8±0,7* 12,5±1,0

10,6±1,1* 3,8±0,3 4,0±0,3

Койко-день

22,4±1,4* 12,9±1,6* 14,6±12

Примечания. ** Данные А.А.Каспарова (1994); * р<0,001 в сравниваемых показателях. Таблица 45 Результаты лечения больных с глубокими герпетическими кератитами Препарат Циклоферон **Полудан

Число больных 6 201

Терапевтический эффект (%) Выраженный Частичный ОтсутствоПобочные вал эффекты 66,6 16,6 16,6 60,0 24,0 16,0 1-2

Примечания. ** Результаты лечения полуданом больных с глубокими герпетическими кератитами по А.А.Каспарову (1994 г).

Аллергические реакции при применении полудана крайне редки (1-2 %) и исчезают при отмене препарата на 1-3 сутки. При исходном уровне обследования у больных отмечено повышение титров сывороточного интерферона в 1,6 и 6,5 раз (соответственно в слезной жидкости и сыворотке крови) в сравнении со здоровыми лицами. По окончании курса лечения уровень сывороточного интерферона в слезной жидкости нормализовался, а в сыворотке крови наметилась тенденция к его снижению (18,0 против 26,0 МЕ/мл). 89

Таблица 46 Показатели выработки эндогенного сывороточного интерферона у больных, получавших циклоферон Период наблюдения Исходный фон 2-е обследование 3-е обследование Окончание курса лечения

Выработка сывороточного интерферона (МЕ/мл) В слезной жидкости В сыворотке крови 6,8 26,0 4,5 33,0 6,0 37,0 4,0 18,0

Установлено, что при лечении поверхностных форм герпетического кератита выздоровление отмечено у всех больных, причем срок лечения почти в два раза ниже, чем в контрольной группе. Острота зрения повысилась у 11 больных, в одном случае она не изменилась, но установлено повышение контрастной чувствительности в области средних и высоких пространственных частот, что косвенно свидетельствует о повышении прозрачности роговицы. При глубоких герпетических поражениях роговицы циклоферон не уступает по эффективности полудану. Предварительные данные исследования не позволяют делать окончательных выводов по применению препарата. Таким образом, циклоферон 12,5 % в виде внутривенных инъекций достаточно эффективен при поверхностных формах герпетических поражений глаз и эффективен при более тяжелых, стромальных поражениях роговицы. По предварительным данным, циклоферон не менее эффективен, чем полудан. Имеются возможности повышения эффективности применения циклоферона в лечении тяжелых форм офтальмогерпеса. Перспективным является сочетанная терапия циклофероном с различными комбинациями противовирусных препаратов. Эти исследования будут продолжены.

90

Официальные препараты, применяемые для лечения различных клинических форм герпетической инфекции Таблица 47 Препарат Ацикловир (ациклогуанозы, зовиракс, виролекс)

Показания к применению Генерализованные формы ВПГ-инфекции (поражение ЦНС, внутренних органов и т.д.); поражение кожи и слизистых оболочек, в т.ч. гениталий; офтальмогерпес; профилактика обострений ВПГинфекции у больных с иммунодефицитами различной этиологии, часто рецидивирующие поражениями гениталий

Генерализованные формы ВПГ-инфекции (поражение ЦНС); герпетическая инфекция новорожденных; офтальмогерпес Рибавирин (ри- Генерализованные формы ВПГ-инфекции; герпетичебамидил, вираские поражения кожи и слизол, виремид и зистых оболочек, в т. ч. генит.д.) талий; офтальмогерпес

Видарабин (Вира-А, Ара-А; аденин-арабинозид)

Генерализованные формы Цитарабин (Ара-Ц, цитозар) ВПГ-инфекции (поражение ЦНС) (из-за высокой токсичности и иммуносупрессивного эффекта применяется только при указанных формах

Побочный эффект Слабость, сонливость, тремор, тошнота, рвота, нарушение функции почек, крайне редко острая почечная недостаточность, аллергические реакции, повышение уровня трансаминаз, билирубина, мочевины, креатинина. При приеме препарата указанные побочные эффекты развиваются крайне редко. При применении крема небольшое шелушение и сухость кожи. Крайне редко эритема. В местах нанесения 3% глазной мази незначительное жжение, редко поверхностная точечная кератопатия, не требующие прекращения лечения Слабость, тремор, галлюцинации, психозы, снижение аппетита, диарея

Головные боли, повышение уровня билирубина в сыворотке крови, анемия

Анемии, лейкопении, тромбоцитопении, лихорадка, миалгия, боли в костях, грудной клетке, макулопапулезная сыпь, конъюнктивит, слабость

91

ВПГ-инфекции) Окончание табл. 47 Препарат Фоскарнет (фосфоноформат, фоскавир)

Показания к применению Терапия ВПГ-инфекции у ВИЧ-инфицированных при развитии резистентности к ацикловиру; герпетические поражения кожи и слизистых оболочек, в т.ч. гениталий

Побочный эффект Повышение уровня креатинина, острая почечная недостаточность, гипокальцитемия, гиперфосфатемия, гипокалилемия, гипомагнитемия, нефрогенный диабет, развитие контактных дерматитов Контактные дерматиты

Герпетические поражения кожи и слизистых оболочек, в т.ч. гениталий ВПГ-инфекция кожи и слизи- Понос, головная боль, явления Бонафтон стых оболочек, в т.ч. генита- контактного дерматита лий; офтальмогерпес Генерализованные формы Алпизарин ВПГ-инфекции; герпетиче–– ские поражения кожи и слизистых оболочек, в т.ч. гениталий; офтальмогерпес Герпетические поражения Хелепин кожи и слизистых оболочек, в –– т.ч. гениталий Герпетические поражения Флакозид кожи и слизистых оболочек, в –– т.ч. гениталий Офтальмогерпес Жжение, контактный дерматит Флореналь век Жжения в месте применения Герпетические поражения Оксолин кожи и слизистых оболочек, в препарата т.ч. гениталий; офтальмогерпес Герпетические поражения Жжения в месте применения Теброфен кожи; офтальмогерпес препарата Отек конъюнктивы, слезотечеИдоксиуридин Офтальмогерпес ние, фотофобия, боли в глазу, (офкерецид, герредко помутнение роговицы плекс и др.) Тромонтадин

92

Таблица 48 Варианты рациональной лекарственной терапии острых герпетических кератитов Основные препараты Химиопрепараты различных групп: Ацикловир (Зовиракс) Видарабин (Ара-А) Офтан-ИДУ (Керецид)

Возможные побочные действия Жжение, точечная кератопатия

Оптимальные комбинации препаратов Интерфероны и их индукторы (особенно полудан), антиоксиданты

Токсичен незначительно; -”точечная кератопатия, ал-”лергизирующее действие Трифтортими- Раздражающее действие как и -”дин (ТФТ) у ИДУ Интерфероногены Вирулекс Раздражение Антиоксиданты Бонафтон тканей глаз Жжение, дерФлореналь матоз век, возможно раз-”витие аллергической реакции КратковреТеброфен менное жжение слизистой -”оболочки глаза КратковреОксолин менное жжение слизистой _”_ оболочки глаза ДНКаза Интерфероногены: Крайне редко Ацикловир, чигаин, Полудан вызывает алИДУ

Эффективность использования (+/-) Поверхност- Глубокие ные формы формы +

+

+

+

+

-

+

-

+

+ +

+

+/-

+

-

+

-

+

-

+

+ 93

лергическую реакцию действия

Основные препараты

Возможные побочные действия

Пирогенал

Иногда плохая переносимость при субконъюнктивальных инъекциях, обострение кератита

Продигиозан

Необходимо определить переносимость препарата

Поверхност- Глубокие ные формы формы Окончание табл. 48 Оптимальные комбинации препаратов

-

+

-

-

+

-

+

+/-

+

+/-

+

-

+

-

+

-

Интерфероны: Ацикловир, ИДУ Лейкоцитарный или ТФТ; антиоксиальфаданты интерферон активностью 200 ЕД/мл Лейкоцитарный альфа-интерфе-”рон активностью 10000МЕ/мл (интерлок) α2В-ИФН Реа- Усиление роферон (1 млн ЕД говичного синдрома, -”в 1 ампуле) отек и гиперемия конъюнктивы Берафон (аналоАцикловир гичен реаферону) Специфические иммунные средства: Антивирусные хиПротивокоремиопрепараты вой гамма94

Эффективность использования (+/-) Поверхност- Глубокие ные формы формы

глобулин Нормальный иммуноглобулин Чигаин

-

-”-

+

-

-

Индукторы интерферона (полудан)

+

-

Влияние циклоферона на репаративный остеогенез при переломах в эксперименте Проблема лечения больных с диафизарными переломами длинных костей продолжает оставаться актуальной до настоящего времени. Это обусловлено как большой частотой переломов среди всех повреждений опорно-двигательной системы, так и большим количеством неблагоприятных исходов лечения. Неудовлетворительные исходы лечения при закрытых диафизарных переломах наблюдаются у 10-34% пострадавших. Причинами неблагоприятных исходов лечения наиболее часто являются нарушения консолидации перелома (медленное сращение, формирование ложного сустава), приводящие к стойкой утрате трудоспособности людей молодого возраста. Отечественными и зарубежными травматологами предложено большое число методов, способствующих оптимизации репаративной регенерации костной ткани при переломах трубчатых костей. Однако большинство из них не нашли широкого клинического применения либо из-за низкой эффективности, либо из-за сложности и необходимости использования громоздкого оборудования. Эффективных фармакологических препаратов, оказывающих воздействие на формирование костной мозоли, до сегодняшнего дня предложено не было. В настоящем исследовании приведены результаты изучения циклоферона в эксперименте на животных с изолированными переломами длинных костей. Препарат циклоферон перед введением животным разводили дистиллированной водой. Вводили подкожно в дозе 100 мг/кг массы тела через 24 часа после экспериментального перелома, затем на вторые, четвертые, шестые, восьмые и десятые сутки. Экспериментальные животные: беспородные половозрелые белые крысы- самцы массой тела от 180 до 220 г, содержащиеся в обычных условиях вивария. Операции осуществляли под общим обезболиванием (3 мл 1% раствора гексенала внутрибрюшинно). Операционное поле обрабатывали обычным способом. Поднакостнично обнажали участок бедренной кости в средней трети диафиза, остеотомировали (пересекали) ее и сразу же фиксировали отлом95

ки спицей Киршнера, проведенной интрамедулярно антероградно. Рану послойно ушивали наглухо, дополнительную иммобилизацию не применяли. В эксперименте использованы две группы животных: 1-я - крысы, которым вводили цикоферон (опыт); 2-я - крысы, которым подкожно вводили физиологический раствор (контроль). В каждую группу вошли по 32 животных. Крыс выводили из опыта еженедельно со дня операции до 8 недель по 4 животных на каждый срок. После операции, а также после забоя всем животным осуществляли рентгенографию оперированной конечности. У забитых животных производили забор правой бедренной кости для определения содержания фосфатов в минеральном матриксе. Содержание фосфора определялось по методу Фиске и Себероу. Критерии оценки эффективности препарата: - динамика консолидации фрагментов по данным рентгенограмм оперированной конечности; - уровень содержания фосфатов в минеральном матриксе правой бедренной кости в опыте и контроле. В результате наблюдения за поведением животных установлено, что после операции двигательная активность крыс контрольной группы восстанавливалась до нормальной через 3 - 3,5 недели. Следует отметить, что уже с первых суток после операции крысы сами подходили к воде и корму. Нагружать оперированную конечность крысы начали через 2 - 2,5 недели. Животные опытной группы с первых суток после операции хорошо ели обычный корм, через 1,5 недели после операции начинали активно нагружать оперированную конечность. Их двигательная активность возросла до нормальной через 2 - 2,5 недели, т. е. в среднем на 7 суток раньше, чем в контрольной группе. При анализе рентгенограмм установлено, что в контрольной группе изолированный перелом бедренной кости срастался через 7 - 8 недель, когда формировалась муфтообразная костная мозоль, включавшая концы обоих фрагментов. В эти же сроки переставала прослеживаться плоскость перелома. В опытной группе аналогичные рентгенологические признаки консолидации отмечены в среднем на 7 суток раньше (р< 0,001). Содержание фосфатов в минеральном матриксе 64 образцов, полученных при забое экспериментальных животных после моделирования перелома правой бедренной кости, определяли по методу Фиске и Себероу. Полученные данные сглаживали сплайнами с параметрами модели Р=0,5. Установлено, что после изолированного перелома бедренной кости у животных контрольной группы содержание фосфатов в остеотомированной бедренной кости колеблется вокруг тренда, величина которого снижается после травмы до 32 суток (на 12%), после чего увеличивается (на 1%). 96

После удаления тренда получена волнообразная кривая с расстояниями между максимумами 12±4 суток. Содержание фосфатов в правой бедренной кости у животных опытной группы колеблется вокруг тренда, величина которого снижается только до 14-х суток (на 7 %), после чего начинает резко увеличиваться до нормального уровня. После удаления тренда получается волнообразная кривая с расстояниями между максимумами 10,4±3,7 суток. Увеличение содержания фосфатов в костной ткани животных опытной группы с 15-х суток свидетельствует об активном формировании и обызвествлении фиброзно-хрящевой мозоли и построении костной, после чего наступает этап ремоделирования вновь образованной костной ткани с упорядочением костных балочек, нарастанием рентгенологической плотности мозоли и постепенным исчезновением ренгенологически выявляемого просветления, соответствующего плоскости перелома. Таким образом, результаты, полученные при экспериментальных исследованиях, можно объяснить высокими остеоиндуктивными свойствами используемого препарата циклоферон, который оказывает влияние на процесс минерализации костной ткани при изолированных переломах трубчатых костей. Парентеральное введение препарата стимулирует у экспериментальных животных репаративный остеогенез, протекающий в области перелома трубчатой кости. Следовательно, циклоферон может быть рекомендован для клинического изучения как средство, ускоряющее остеогенез при переломах костей. Эффективность терапии циклофероном нейровирусных инфекций Наиболее частой формой клещевого энцефалита является серозный менингит. Сходные с ним проявления имеет серологически верицированный в 1985 г. в России клещевой боррелиоз - болезнь Лайма (Коренберг Э.И. и др., 1990; Деконенко Е.П. и др., 1991). Дифференциальная диагностика этих этиологически разных заболеваний, вызываемых укусом клещей одного рода, трудна и основывается на данных серологических исследований, которые можно использовать лишь в поздние сроки от начала болезни (Караванов А.С. и др., 1990). Изменение показателей интерферонового статуса при серозных менингитах, в том числе клещевой природы, коррелируют с тяжестью течения болезни и наиболее выражены в острой стадии болезни (Ширшова Е.В., 1989; Устинова О.Ю. и др., 1990). Следует отметить, что повышение интерферонового уровня защиты является необходимым условием лечения нейровирусных инфекций. 97

Ранее в экспериментах на животных показан выраженный защитный и лечебно-профилактический эффект низкомолекулярного индуктора интерферона - циклоферона - в лечении клещевого энцефалита (Чижов Н.П., Ильенко В.И., 1992). Обладая иммуномоделирующими свойствами, циклоферон может при клещевом боррелиозе успешно сочетаться с антибиотикотерапией. Целью данного исследования явилось изучение эффективности циклоферона в комплексной терапии серозных менингитов клещевой природы. Обследован 51 человек (27 мужчин и 24 женщины) с различными клиническими формами серозных менингитов клещевой природы. Циклоферон получали 30 человек, 21 больному проводили стандартную базисную терапию с плацебо. Исследования выполнены двойным слепым (плацебоконтролируемым) методом. Эффективность циклоферона оценивали по клинико-лабораторным показателям неврологического и интерферонового статуса. Возраст больных колебался от 19 до 42 лет. Обследовано 35 человек с диагнозом серозный менингит клещевой природы. С менингиальной формой клещевого боррелиоза - 19 больных и 16 больных - со смешанной формой (клещевой энцефалит + клещевой боррелиоз). Клинически определяли симптоматику острого менингита, синдромы энцефалопатии. Лабораторный диагноз верифицирован серологическим исследованием парных сывороток в реакциях непрямой гемагглютинации с антигеном клещевого энцефалита, торможения гемагглютинации с антителами к иммуноглобулину М клещевого энцефалита, реакцией непрямой иммунофлуорисценции с антигеном клещевого боррелиоза. Препарат назначали внутримышечно по 2 мл (250 мг) один раз в день по следующей схеме: 1, 2, 4, 6-й и 8-й дни. Курсовая доза составила 1250 мл (1,25 г). В качестве плацебо использовали физиологический раствор. Обследование включало общесоматический и неврологический осмотры, клинические, биохимические, иммунологические анализы крови и ликвора. Трижды - в остром и подостром периодах заболевания (соответствовало до, в середине и по окончании лечения циклофероном) - у больных определяли интерфероновый статус. Исследовали следующие параметры: уровень суммарного интерферона в крови, а также α и γ-типов интерферонов, способность лейкоцитов крови больных продуцировать интерферон αи γ-типа in vitro под воздействием циклоферона. Для оценки функциональной активности каждого звена системы интерферона (α/β и γ) вычисляли коэффициент относительной диффузии (К), который характеризует состояние клеток-продуцентов интерферона и отражает возможность выхода индуцированного интерферона из клетки во

98

внеклеточную жидкость. Для здоровых лиц, не имевших признаков заболевания, Кα равен 0,7-1,2, Кγ - 0,5-0,7. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов вариационной статистики (Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н., 1990). Эффективность циклоферона в комплексном лечении оценивали на основе динамики клинического статуса, нормализации температуры, улучшения общего самочувствия, санации ликвора и показателей интерферонового статуса. Установлено, что в контрольной группе показатели интерферонового статуса были следующими: содержание интерферона в сыворотке 0 ЕД/мл, способность к образованию α/β-интерферона 48,6±3,9 ЕД/мл, способность к образованию γ-интерферона - 19,9±2,2 ЕД/мл. В процессе лечения циклофероном у больных с менингеальной формой клещевого энцефалита уже в ранние сроки повышаются содержание α-интерферона в крови и снижается интерфероногенез, хотя в целом способность к продукции γ-интерферона остается в 1,5 раза выше по сравнению со здоровыми. У 4 больных циклоферон стимулировал избирательно α-звено интерферона. По мере стихания воспалительного процесса падает содержание в крови γ-интерферона, вместе с тем способность к его продукции сохраняется на высоком уровне (33,4±2,1 ЕД/мл), что указывает на потенциальную возможность легко воспроизводить его в случае дефицита. Таблица 49 Показатели интерферонового статуса при менингеальной форме клещевого энцефалита в процессе лечения циклофероном (ЕД/мл) Срок обследования До начала лечения После лечения

Способность к образованию интерферона α/β-ИФН γ-ИФН

Сывороточный интерферон α/β-ИФН γ-ИФН

Коэффициент относительной диффузии Кα Кγ

25,8±1,8

40,7±2,4* 11,1±1,1* 14,3±1,2*

0,43

0,35

28,0±1,9

33,4±2,1* 19,5±1,5*

0,59

0,02

0,8±0,1*

* р<0,05 - 0,001 в сравниваемых показателях.

Динамика интерферонового статуса у больных клещевым боррелиозом (табл. 50) характеризовалась снижением способности к образованию α-интерферона и повышением содержания γ-интерферона в крови. При этой нозологической форме циклоферон стимулирует и α- и γ-интерфероногенез уже в ранние сроки (К=0,78, К=0,75). Это особенно выражено у 99

больных, имевших исходно низкие титры α- и γ-интерферона. Например, при способности к продукции α-интерферона - 6,7 ЕД/мл и γ-интерферона - 0,7 ЕД/мл и отсутствия сывороточного интерферона в середине лечения циклофероном способность к образованию α- и γ-интерферона возрастает соответственно до 16,8 и 0,9 ЕД/мл и 26,2 ЕД/мл. Таблица 50 Показатели интерферонового статуса при менингеальной форме клещевого боррелиоза в процессе лечения циклофероном (ЕД/мл) Срок обследования До начала лечения В середине лечения После лечения Р 1-2 Р 2-3 Р 1-3

Способность к образоСывороточный ванию интерферона интерферон α/β-ИФН γ-ИФН α/β-ИФН γ-ИФН

Коэффициент относительной диффузии Кα Кγ

21,6±1,5

21,6±1,5

10,5±1,1

5,1±0,5

0,49

0,32

22,0±1,4

20,8±1,5

17,2±1,2

15,7±1,3

0,78

0,75

14,9±1,3 <0,001 <0,001

14,6±1,2 <0,01 <0,01 -

8,5±0,9 <0,001 <0,001 -

11,6±1,0 <0,001 <0,05 <0,001

0,57 -

0,79 -

Следует отметить, что при смешанной форме заболевания в процессе лечения циклофероном значительно снижается способность к образованию α-интерферона при неизменном содержании в крови. В ранние сроки повышается содержание сывороточного γ-интерферона, а по окончании лечения даже повышается способность к его образованию. Нормализуется функциональная активность α-звена (К=0,7), а γ-звено интерферона сохраняет высокий потенциал к его продукции, превышающий таковой у здоровых лиц. Таблица 51 Показатели интерферонового статуса при смешанной форме (клещевой энцефалит и клещевого боррелиоз) в процессе лечения циклофероном (ЕД/мл) Срок обследования До начала лечения В середине лечения 100

Способность к обраСывороточный зованию интерферона интерферон α/β-ИФН γ-ИФН α/β-ИФН γ-ИФН

Коэффициент относительной диффузии Кα Кγ

58,0±3,1

20,3±1,4

19,8±1,3

7,8±0,8

0,34

0,38

40,0±2,5

20,7±1,3

21,2±1,5

9,9±1,0

0,53

0,48

После лечения Р 1-2 Р 2-3 Р 1-3

25,6±1,7 <0,001 <0,001 <0,001

26,6±1,6 <0,01 <0,01

18,7±1,4 -

3,7±0,4 <0,001 <0,001 <0,001

0,70 -

0,14 -

Таким образом, у больных, получавших циклоферон, отмечено значительное регрессирование неврологической симптоматики острого периода заболевания. Катамнез в течение 6 месяцев у 15 больных, лечившихся циклофероном, характеризовался отсутствием астенических состояний, хронической энцефалопатии и прогредиентных форм заболеваний. Циклоферон действует на оба звена интерферона, но преимущественно стимулирует α-интерферон. Циклоферон является корректором системы интерферона в организме человека. На основании проведенных клинических испытаний циклоферон может быть рекомендован для лечения серозных менингитов клещевой природы. Эффективность циклоферона в комплексном лечении генитальных инфекций Исследованиями последних лет показана и патогенетически обоснована высокая эффективность интерферона (ИФН) и его индукторов в лечении вирусных и бактериальных инфекций. Вместе с тем данные об эффективности клинического применения ИФН и его индукторов в комплексе со специфическими химиопрепаратами при лечении генитальных инфекций весьма ограничены. Нами изучена эффективность лечения больных генитальными инфекциями индуктором ИФН - циклофероном - в комбинациии с экзогеннным ИФН, специфическими антибиотиками и химиопрепаратами с оценкой показателей клинического и микробиологического (элиминация возбудителя) выздоровления. Под наблюдением находились 36 больных (19 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 9 до 43 лет с воспалительными заболеваниями мочеполовых органов хламидийной, герпетической и смешанной хламидийно-герпетической этиологии (группа I). Контрольную группу составили 25 пациентов с аналогичными диагнозами, получавших такое же лечение по тем же схемам, но без циклоферона и экзогенного ИФН (группа II). Больные лабораторно обследовались до начала и после проведенного лечения. Все больные I группы получали циклоферон в различных сочетаниях с экзогенными ИФН (реальдирон, виферон), пртивохламидийными (доксицилин, рулид), противогерпетическими (зовиракс) препаратами. Ранее, до начала лечения, всем больным неоднократно проводилось как местное ле-

101

чение, так и общая антибактериальная терапия, однако это не привело к выздоровлению. В зависимости от этиологического диагноза заболевания и назначенного курса лечения больные были разделены на четыре группы. Лечение больных хламидийной моноинфекцией урогениталий (группа IА) с одновременным применением циклоферона (2,0 мл в/м через сутки 5 инъекций) и доксициклина (0,3 г в сутки - 10 суток) обеспечило клиническое выздоровление и элиминацию возбудителя - С. Тгасhomatis, т. е. имело место клиническое и микробиологическое выздоровление. Эффективность лечения больных генитальным герпесом (группа IВ) с использованием комбинированной схемы (циклоферон по указанной выше схеме и зовиракс в капсулах по 0,2 х 5 раз в сутки) в течение 10 дней была несколько ниже. У четырех пациентов зарегистрировано значительное клиническое улучшение (исчезновение местной симптоматики, в соскобном материале из урогениталий не выявлено герпетического антигена) после окончания курса лечения. У трех больных, несмотря на некоторое клиническое улучшение, не наступило элиминации возбудителя, который определялся в соскобном материале при исследовании препаратов с помощью ИФА через 2 недели после окончания лечения. Большую группу (23 человека) составили больные с хроническим течением воспалительных заболеваний мочеполовых органов. При лабораторном обследовании у них установлена хламидийно-герпетическая этиология заболевания с наличием у части обследованных коринебактерий, трихомонад, грибов рода Candida. Лечение этой группы больных проводили в два этапа. Одиннадцать больных (группа IС) в течение первого курса получали рекомбинантный ИФН внутримышечно по 2 млн. ЕД (курсовая доза 20 млн. ЕД) в сочетании с зовираксом и циклофероном по указанной выше схеме. Второй курс лечения назначали сразу после первого и он предусматривал применение циклоферона по 2 мл в/м через сутки - 5 инъекций с одновременным назначением доксициклина (100 мг × 3 раза в сутки) или рулида (150 мг × 2 раза в сутки) в течение 10 суток. Вторая группа (12 человек) с сочетанной хламидийно-герпетической инфекцией (группа ID) получала лечение двумя курсами, по той же схеме, что и больные группы IС за исключением приема экзогенного ИФН. Проведенные по окончании двух курсов лечения контрольные клинические и лабораторные исследования выявили некоторые различия в эффективности лечения в группах IС и ID. Так, в группе IС у 7 из 11 больных отмечено клиническое и этиологическое выздоровление. Симптомы воспаления исчезли, общее состояние было хорошее, хламидийного и герпетического антигена в соскобном материале из мочеполовых органов у них обнаружено не было. У четырех больных хотя и было зарегистрировано 102

улучшение общего состояния и местных проявлений заболевания, однако не отмечено лабораторного (этиологического) выздоровления, т.е. в соскобном материале из гениталий определялись антигены хламидий и/или герпеса. При комплексном обследовании больных с сочетанной хламидийногерпетической инфекцией гениталий из группы ID, проведенном после окончания второго курса лечения, зарегистрирована более низкая эффективность лечения. Так, клиническое выздоровление и отсутствие антигеновозбудителей в соскобном материале отмечено у 6 больных из 12, получавших лечение. У остальных 6 больных при улучшении общего состояния и снижении интенсивности проявлений воспалительного процесса, не установлено элиминации возбудителей. Лабораторные и клинические обследования больных воспалительными заболеваниями мочеполовых органов из группы II, получавших аналогичное лечение, но без циклоферона и экзогенных ИФН (контроль), выявили значительно меньшую эффективность лечения. Среди больных с хламидийной моноинфекцией урогениталий лечение доксициклином по упомянутой выше схеме обеспечило клиническое выздоровление и элиминацию С trachomatis у 5 из 7 больных. Несколько ниже оказалась эффективность лечения и герпетической инфекции гениталий. Отсутствие герпетического антигена в соскобном материале было зарегистрировано лишь у половины из 6 больных генитальным герпесом. В группе из 12 больных с воспалительными заболеваниями мочеполовых органов со смешанной хламидийно-герпетической этиологией и бактериальной микстинфекцией лишь у 7 отмечена элиминация хламидий и у 5 не обнаруживался герпетический антиген после проведенного курса лечения. Таким образом, применение индуктора ИФН-циклоферона в сочетании с одновременным лечением больных воспалительными заболеваниями мочеполовых органов хламидийно-герпетической этиологии препаратами специфического действия и экзогенным ИФН значительно превышало эффективность терапии по сравнению с лечением только препаратами специфического действия. В терапии генитального герпеса наиболее эффективен ацикловир (зовиракс). Он применяется как монопрепарат, так и в сочетании с иммуномодуляторами. Мы использовали при лечении 45 больных ГГ ацикловир (20 больных) и циклоферон - 25 больных. Циклоферон назначали 1 раз в сутки по 2 мл 12,5 % раствора в 1, 2, 4, 6-й и 8-й дни лечения (основная группа). Пациенты контрольной группы получали ацикловир по 200 мг 5 раз в сутки в течение 5 дней. Диагностику заболевания осуществляли на основании анемнеза, клиники, кольпоскопии и методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ). 103

Все больные (35 женщин и 10 мужчин) были в возрасте 24 - 42 лет, частота рецидивов ГГ составляла 5-8 раз в год, длительность заболевания от 1 года до 5 лет. Герпетические высыпания локализовались у женщин преимущественно в области больших и малых половых губ, промежности. У мужчин на головке полового члена, крайней плоти и теле полового члена. Таблица 52 Продолжительность основных клинических проявлений генитального герпеса Продолжительность симптомов (в днях) Группа Основная (n=25) Контрольная (n=20)

Симптомы Местные субъективные проявления (боль, жжение, зуд) Интоксикация Везикулярная стадия Эрозивная стадия Стадия эпителизации (образование корочек) Продолжительность рецидива

4,1 0,8 1,8 2,2*

3,8 1,0 1,6 2,1*

2,6

2,4

6,6

6,4

Примечание. * - образование эрозии отмечено у 30 % больных основной и 40% лиц контрольной группы, что, на наш взгляд, обусловлено сравнительно поздним (на 2-е сутки рецидива) назначением указанных препаратов.

Как видно из таблицы при сопоставлении динамики основных клинических симптомов различий выявлено не было. Это указывает на высокую эффективность нового препарата циклоферона при лечении рецидивов ГГ. Динамика изменений иммунологических показателей представлена в таблицах 53 и 54. В группе больных, получавших циклоферон (основная), после лечения отмечено достоверное увеличение показателей субпопуляции Т-лимфоцитов и естественных киллеров, по сравнению с пациентами, получавшими ацикловир (контроль). Следует отметить, что после лечения циклофероном показатели активности естественных киллеров достигли нормы. Таблица 53 Характеристика иммунограммы больных, получавших циклоферон (n = 25) 104

Показатели СДЗ (40-60%)** ЛФ СД4+ (30-40%) ЛФ СД8+ (10-20%) ЛФ Естественные киллеры (30-35%)

До лечения 31,6±1,88 20,2±2,16 11,4±2,4 20,4±2,88

После лечения 48,6±4,16* 34,4±2,18* 14,2±3,86* 36,1±1,15* Окончание табл. 53

Показатели Супрессорная активность лимфоцитов: спонтанная (10-30%) Кон А индуцированная (до 30 ед) РБТЛ: спонтанная (200-400 имп/мин) Кон А индуцированная (4000-12000 имп/мин) Иммуноглобулины классов: G (7-16 г/л) М (0,5-2,0 г/л) А (0,8-3,6 г/л)

До лечения

После лечения

12,2±1,16 30,7±1,88

25,2±3,4* 46,4±4,7*

184±35 4011±392

3102±44 6012±608

5,4±1,48 0,82±0,026 0,94±0,08

14,6±1,16* 3,1±0,63* 2,9±0,88*

+

Примечание. * р<0,05; ** указана норма. Таблица 54 Иммунологические показатели у больных генитальным герпесом, получавших ацикловир (n = 20) Показатели СД3 ** ЛФ СД4+ ЛФ СД8+ ЛФ Естественные киллеры Супрессорная активность лимфоцитов: спонтанная Кон А индуцированная РБТЛ: спонтанная Кон А индуцированная Иммуноглобулины классов: G М А +

До лечения 33.7±2,16 21,4±3,42 12,3±1,87 21,6±3,89

После лечения 39,4±2,08 25,3±1,16 14,1±0,82 28,3±2,31

10,1±1,96 33,1±1,38

26,3±4,2* 37,6±2,26*

178±24 3836±483

288±47 5618±513

7,1±1,33 0,53±0,016 1,1±0,31

13,6±1,88* 2,8±0,76* 2,4±0,41*

Примечание. * р<0,05; ** показатели нормы указаны в таблице 53.

105

Результаты лечения оценивали по следующим показателям: увеличение продолжительности ремиссии в 2 - 2,5 раза, сокращение в 2 раза сроков разрешения высыпания, исчезновение других симптомов. Все пациенты отметили со второго дня терапии стойкое улучшение самочувствия, исчезновение субъективных симптомов. Увеличение продолжительности ремиссии в 2 - 2,5 раза отмечено у 20 больных (80%), получавших циклоферон, и у 17 (85%), получавших ацикловир. Вместе с тем следует подчеркнуть, что курс терапии циклофероном в 3 - 3,5 раза дешевле аналогичного лечения ацикловиром. Известно, что в фазе клинико-иммунологической ремиссии с целью профилактики рецидивов ГГ можно использовать противогерпетическую вакцину. Для вакцинотерапии были отобраны 32 больных рецидивирующим ГГ в возрасте от 21 до 39 лет обоего пола. Частота рецидивов составляла 1 раз в 4-6 недель (часторецидивирующая форма ГГ), продолжительность болезни от 2 до 12 лет. Курс вакцинотерапии составлял 5 инъекций по 0,2 мл через 72 часа. За сутки до введения вакцины больным назначали инъекции циклоферона (5 инъекций по схеме). Через 10 дней повторяли курс вакцинотерапии совместно с циклофероном. Вакцину в сочетании с циклофероном назначили 17 больным, а 15 - только вакцину. Во время лечения рецидивов заболевания не было. Однако в течение 1 месяца после проведенной терапии у 3 больных (17,6 %), получавших вакцину и циклоферон, а также у 6 больных (40%), получавших только вакцину, были зарегистрированы рецидивы ГГ, которые купировались ацикловиром. Продолжительность ремиссии увеличилась в 2,5 - 3,5 раза после применения вакцины в сочетании с циклофероном у 2 пациентов (11,7%), а у 12 (70,7%) - в 4 - 6 раз. Таким образом, новый отечественный индуктор интерферона циклоферон может быть рекомендован для лечения больных герпетической инфекцией для купирования рецидивов, профилактики обострений заболевания с использованием вакцины с циклофероном. Применение циклоферона при смешанных урогенитальных инфекциях Широкое применение реконструктивных хирургических методик в лечении заболеваний и последствий травм коленного сустава обусловлено развитием ортопедии и доступностью квалифицированной ортопедической помощи. Используемые в настоящее время реконструктивные операции на коленном суставе, такие как корригирующие околосуставные остеотомии и артропластика биологическими и небиологическими материалами, наносят организму пациента значительный повреждающий эффект. Они приводят к 106

истощению и декомпенсации защитно-приспособительных возможностей организма и поэтому в послеоперационном периоде требуется применение интенсивной терапии, направленной на восстановление гомеостаза и предупреждение осложнений. С целью повышения неспецифической резистентности организма больного в клинике Российского НИИТО им. Р.Р. Вредена до оперативного лечения применяется терапия циклофероном. Препарат вводили в виде 12,5% раствора внутривенно или внутримышечно. Для проведения лечебнопрофилактического курса циклоферон применяли один раз в сутки на 1, 2, 4, 6, 8, 10-й и 12-й день. Для закрепления эффекта возможно повторение курса лечения. По данным исследований фирмы “Полисан”, выявлены хорошая переносимость препарата у больных, отсутствие побочных эффектов, хорошая сочетаемость с другими лекарствами. Циклоферон быстро попадает в ткани организма, проникает через гематоэнцефалический барьер, оказывает эффективное пролонгированное действие в очагах инфекции. В отделе экспериментально-клинической хирургии Российского НИИТО им. Р.Р. Вредена предоперационная циклоферонотерапия проведена 27 пациентам с заболеваниями коленного сустава и сочленяющихся в нем костей. Более половины больных (15 человек) страдали гонартозом, 4 больных - с околосуставными опухолями, 3 - сложными суставами бедренной или большеберцовой костей, по 2 больных с постиммобилизационными контрактурами коленного сустава и ревматоидным полиартритом; 1 больной с анкилозом коленного сустава. Впоследствии этим пациентам выполнены хирургические вмешательства на пораженном сегменте: 12 больным эндопротезирование коленного сустава, 8 - корригирующие околосуставные остеотомии бедренной или большеберцовой костей, внеочаговый остеосинтез ложного сустава - 3 пациентам, мобилизующие операции на коленном суставе - 2, реэндопротизирование коленного сустава - 2. Таблица 55 Оценка функции коленного сустава при лечении циклофероном, балл Признаки

До лечения

Боль при ходьбе Боль в покое Дистанция ходьбы Ходьба по лестнице Подъем с кресла Дополнительная опора Амплитуда движений: активных пассивных сгибательная контрактура

20 5 4 0 3 3 3 3 3

Результат после лечения Хороший Удовлетворительный 35 35 15 15 4 4 4 1 4 3 5 3 5 5 5

4 4 5 107

Сила мышц Боковая стабильность Передне-задняя стабильность Всего:

2 2 1 49

3 3 1 89

1 3 1 79

Стойкий положительный эффект при лечении больных с поражениями коленного сустава за весь период наблюдения (более года) отмечен у 23 больных (71,9%). Ни у одного из них не возникла необходимость в повторной госпитализации. По данным рентгенологического обследования отмечена стабилизация патологического процесса и отсутствие признаков его прогрессирования как в бедренно-большеберцовом, так и в бедренно-надколенном сочленениях. Исследование иммунного статуса в динамике наблюдения (табл. 56) свидетельствовали о нормализации показателей у больных, прошедших курсовое лечение циклофероном. Таблица 56 Динамика показателей иммунного статуса на фоне лечения циклофероном, % Показатели Т-лимфоциты Т-лимфоциты активные В-лимфоциты ФИ ФЧ

До лечения 73 51,2 12,3 76,2 3,0

После лечения Здоровые 1 неделя 5 недель 3 месяца 6 месяцев 70,1 72,2 64,5 71 64-70 47,3 10,2 71,6 3,0

56,0 10,2 71,6 3,2

48,0 7,5 74,0 3,2

67 21,0 73 3,5

59-66 15-17 83-96 2,7-3,7

Примечание. ФИ - фагоцитарный индекс; ФЧ- фагоцитарное число.

У всех больных отмечена хорошая переносимость циклоферона, отсутствовали аллергические проявления и не отмечено изменений в виде инфильтратов, эритем в месте введения препарата. Таким образом, учитывая высокую эффективность (до 85 %) циклоферона у больных с ДДЗ коленного сустава, проявляющуюся в первую очередь в купировании болевого синдрома, целесообразно его применение и у больных с ДДЗ другой локализации (тазобедренного, плечевого, локтевого, голеностопного суставов). Среди больных исследуемой группы в послеоперационном периоде наблюдали единичные осложнения технического характера, связанные с особенностями применяемых конструкций и материалов. Воспалительных осложнений не отмечено. Таким образом, применение циклоферона оправда108

но для профилактики послеоперационных осложнений при хирургическом лечении больных с патологией коленного сустава на фоне иммунодефицита. Опыт применения высоких доз препарата циклоферон у больных раком молочной железы IV клинической стадии С целью изучения эффективности противоопухолевого антипролиферативного действия препарата у больных раком молочной железы методом случайной выборки были сформированы две группы больных по 8 человек. Критерии отбора - IV клиническая стадия при отсутствии эффекта от проводимой стандартной химиотерапии. В 1-й группе применяли стандартную лечебную терапию СМФ, эффект от которой достоверно не отличался от ожидаемого. Во 2-й группе параллельно с СМФ-терапией дополнительно применяли циклоферон 12 инъекций по 1000 мг (8 мг в/в в сутки) в течение 30 дней (1,2,4,6,8, II, 14, 17, 20, 23, 25 и 30 дни). На время проведения курса препарат антиэстрогенового ряда (тамоксифен или ориметен) был отменен только во 2-й группе. Установлено, что у 6 из 8 человек (75 %) во 2-й группе усиления эффекта химиотерапии отмечено не было. У двух оставшихся больных (25 %) возраст 59 и 75 лет отмечен выраженный противоопухолевый эффект, проявившийся в уменьшении вторичного отека кожи, исчезновении внутрикожных метастаз, внутриопухолевый распад у одной больной без признаков прогрессии заболевания. Немаловажным фактом использования циклоферона является стабилизация гематологических и биохимических показателей. Так как интерферон может усиливать чувствительность и количество рецепторов эстрогенов, представляется клинически целесообразным исследовать применение циклоферона у больных раком молочной железы старше 55 лет в сочетании с базовой полихимиотерапией и после нее в сочетании с антиэстрогеновыми препаратами. Эффективность циклоферона в терапии острых лейкозов Все больные острым лейкозом в соответствии с программой клинического изучения препарата циклоферон, получавшие лечение в период ремиссий заболевания (n=22), были разделены на 4 группы: 1-я - больные острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ), получавшие стандартную химиотерапию в ремиссии (n=9); 2-я - больные ОНЛЛ, получавшие кроме стандартной химиотерапии курсы лечения циклофероном (3 введения: 1, 2, 109

4-й день после окончания курса химиотерапии по 2,0 мл 12,5% раствора внутривенно) (n=7); 3-я - больные острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), получавшие стандартную химиотерапию в период ремиссии (n=4); 4-я - больные ОЛЛ, получавшие кроме стандартной химиотерапии в период ремиссии заболевания курсы лечения циклофероном (n=2). Кроме того, 2 больным ОЛЛ и 1 больному ОНЛЛ, имеющим частичную ремиссию и резистентность к химиотерапии, наряду с программами химиотерапии проводили курсы лечения циклофероном (5-я группа, n=3). В 1-й группе больных в исследуемый период было отмечено развитие рецидива заболевания у 3 (33%) пациентов, общая и безрецидивная выживаемость - 67%. Во 2-й группе больных (группа с циклофероном) рецидив заболевания не развился ни у одного больного, общая и безрецидивная выживаемость 100%. В 3-й группе больных в исследуемый период ремиссия сохраняется у всех больных -100%. В 4-й группе - рецидив развился у 1 (50%) больного. Таблица 57 Наблюдаемые больные Группа 1-я

2-я

3-я

4-я

110

Возраст 35 62 17 16 52 58 24 29 46 48 24 22 43 36 40 16 62 59 24 16 34 16

Пол ж ж м м м ж ж ж ж м м м м ж м м ж м м м ж м

Форма ОЛ ОНЛЛ, М5 ОНЛЛ, М2 ОНЛЛ, М5 ОНЛЛ, М3 ОНЛЛ, М2 - // - // - // ОНЛЛ, М3 ОНЛЛ, М3 ОНЛЛ, М5 ОНЛЛ, М2 - // - // ОНЛЛ, М5 - // ОЛЛ - // - // - // - // - // -

Лечение ХТ - // - // - // - // - // - // - // - // ХТ+Цф - // - // - // - // - // - // ХТ - // - // - // ХТ+Цф - // -

Исход заболевания рецидив, смерть ремиссия рецидив ремиссия - // - // - // рецидив смерть на фоне ремиссии ремиссия - // - // - // - // - // - // - // - // - // - // рецидив ремиссия

5-я

29 61 44

м м м

- // - // ОНЛЛ

- // - // - // -

прогрессия - // отсутствие эффекта

Применение циклоферона положительно влияло на показатели клеточного иммунитета (таблица 58). Таблица 58 Показатели Т-клеточного иммунитета у наблюдаемых больных, % Показатели клеточного иммунитета CD3+ CD4+ CD8+ CD22+ DR+ CD16+ CD25+ CD7+ CD4+/CD8+

До химиотерапии 56,3±4,2 23,6±2,8 23,9±3,9 16,1±4,4 25,7±6,0 13,3±3,8 19,9±4,7 19,2±4,1 1,13±0,12

После химиотерапии 51,0±7,7 13,2±2,1 15,3±2,3 15,1±4,2 12,6±1,6 13,8±2,0 14,1±2,2 19,1±4,2 1,07±0,13

После курса циклоферона 60,1±4,2 30,0±2,3 16,1±2,2 13,3±3,5 19,1±4,8 18,6±2,6 14,5±2,3 21,4±1,5 1.88±0,1

Наблюдали нарастание Т-лимфоцитов с различной фенотипической направленностью под воздействием терапии циклофероном (СD3+, СD4+, CD16+ в пределах от 3,8 до 6,4%). Таким образом, предварительные клинические результаты позволяют сделать следующие выводы: Циклоферон при внутривенном применении у больных острым лейкозом не оказывает побочных эффектов и не вызывает осложнений. Не выявлено влияния циклоферона на биохимические показатели крови. Циклоферон нивелирует отрицательный эффект химиотерапии на показатели клеточного иммунитета. В группе больных острым нелимфобластным лейкозом добавление к стандартной химиотерапии в ремиссии курсов лечения циклофероном снижает риск рецидива заболевания и улучшает показатели общей и безрецидивной выживаемости, хотя эти результаты носят пока предварительный характер из-за малочисленности групп больных и короткого времени наблюдения за больными. В группе больных острым лимфобластным лейкозом говорить о результатах применения циклоферона пока преждевременно из-за малочисленности наблюдений, но нельзя исключить негативного влияния последнего на течение заболевания.

111

Наиболее перспективным, по-видимому, является применение циклоферона у больных острыми нелимфобластными лейкозами на этапе постремиссионного лечения.

Библиографический список 1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Материалы и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М: Высшая школа, 1991. 2. Биохимические методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. акад. АМН СССР А.А. Покровского. М.: Медицина, 1969. 3. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. М.: Медицина, 1974. 4. Додсон Р., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 5. Кигель Г.Б., Харабад Жах-Ян Я. Показатели биологической нормы для лабораторных животных. Ростов-н/Д, 1978. 6. Государственная фармакопея СССР. М., 1983. 7. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (РД 64-126-91). М.: МЗ России, ФК, 1992. 8. Проблемы нормы в токсикологии / Под ред. проф. И.М. Трахтенберга. М.: Медицина, 1991. 9. Прозоровский В.Б., Прозоровская М., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакол. токсикол. 1978. № 4. С. 497-502. 10. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническом изучению новых лекарственных средств. Часть 1,3. Фармакологический комитет. М., 1975. 1981. 11. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М.: Медицина, 1975. 318 с. 12. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ (временные методические рекомендации). М.: МЗ СССР, ФК, 1985. 13. Лабораторные методы исследования в клинике /Под ред. проф. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. 14. Напалков Н.П., Яковлев Г.М., Анисимов В.Н., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Перспективы применения препаратов тимуса для профилактики рака // Вопр. онкологии, 1988. Т. 34. № 5. С. 515-521. 15. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США, М.: Медицина, 1980. 16. Drug registration requirements in Japan (5-th edition). Tokyo: Yakuji Nippo LTD, 1993. 17. Guideline for the format and content of nonclinical pharmacology / toxicology of the aplication. U. S. A., U. S. department of health and human services /U. S. government printing tice, 1987. 112

18. The rules governing medical products in the European Community. Volume III. Guidelines on the quality, safety and of medical products for human use. Luxenburg, Office for official publications of the European Community, 1989. 272 p. 19. Methods of determination of chemical substances toxicity and danger / Edited by I.V. Sanotsky M.: Medicine, 1986. 343 p. 20. Nonclinical laboratory studies - GLP Federal Registered. 43, 247, December 22. 1978. P. 59986-60024. 21. Paged G. E., Thomson R. Standard Operating Procedures in Toxicology. Lancaster: MTP Press, 1979. 22. Kisner D. L., Smyth J. F. (eds.) Interferon alpha-2: pre-clinical and clinical evaluation //Martinus Nijhoff Publ. Boston. 1985.

113

СОДЕРЖАНИЕ Введение ………………………………………………………………….. 3 Информативно-регуляторная роль интерферонов в клеточных и межклеточных взаимодействиях …………………………………………... 5 Исследование острой, подострой и хронической токсичности ……….. 8 Внутривенное введение препарата. Экспериментальные исследования на крысах …………………………………………………….. 24 Местное действие лекарственной формы на ткани …………………… 36 Экспериментально-клинические исследования. Изучение фармакокинетики (циркуляция и выведение препарата) …………………. 39 Исследование фармакокинетики циклоферона ……………………….. 40 Температурная реакция животных на введение раствора лекарственной формы ………………………………………………………. 43 Исследования противоопухолевой активности циклоферона ………... 44 Экспериментальное и клиническое изучение циклоферона в терапии ВИЧ-инфекции …………………………………………………… 52 Экспериментальные и клинические исследования циклоферона в терапии герпетической инфекции ………………………………………... 65 Влияние циклоферона на репаративный остеогенез при переломах в эксперименте ………………………………………………………………. 89 Эффективность терапии циклофероном нейровирусных инфекций … 91 Эффективность циклоферона в комплексном лечении генитальных инфекций ……………………………………………………… 95 Применение циклоферона при смешанных урогенитальных инфекциях ………………………………………………………………….. 100 Опыт применения высоких доз препарата циклоферон у больных раком молочной железы IV клинической стадии ……………………….. 103 114

Эффективность циклоферона в терапии острых лейкозов ………….. 103 Библиографический список …………………………………………… 106

115