Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов

ХИМИЯ ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКИХ СИНТЕЗАТОРОВ Л. М. ХАЛИМСКАЯ Новосибирский государственный университет

ВВЕДЕНИЕ

THE CHEMICAL SYNTHESIS OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS USING AUTOMATIC SYNTHESIZERS L. M. KHALIMSKAYA

The modern solid phase method of chemical synthesis of protein and nucleic acid fragments is described. General schemes of the formation of these biopolymers, which are used on automatic synthesizers, are presented.

© Халимская Л.М., 2000

Описан современный твердофазный метод химического синтеза фрагментов белков и нуклеиновых кислот. Приведены принципиальные схемы получения этих биополимеров, используемые в автоматических синтезаторах.

www.issep.rssi.ru

Белки и нуклеиновые кислоты – два важнейших класса биологически активных веществ, входящих в состав живых клеток. Биологические функции белков чрезвычайно разнообразны. Все биохимические реакции катализируются белками-ферментами. Многие гормоны, токсины, некоторые антибиотики являются белками или их более короткими фрагментами – пептидами. Существуют белки, осуществляющие транспорт различных молекул и ионов через клеточные мембраны или с током крови. Важную роль играют защитные белки, которые помогают организму бороться с болезнями, структурные белки, составляющие основу многих тканей, двигательные белки, белки-рецепторы, регуляторные белки и пептиды, а также пищевые белки. Биологическая функция нуклеиновых кислот заключается в хранении и передаче генетической информации в живых клетках. За последние 40 лет в области химического синтеза этих биополимеров достигнуты значительные успехи. Синтезировано множество пептидов, которые используют в медицине и сельском хозяйстве. Химическим путем удается получать улучшенные аналоги природных пептидов с более избирательным, усиленным или длительным действием. Осуществлен также синтез некоторых небольших белков, например гормона инсулина и некоторых ферментов. В настоящее время достаточно быстро можно синтезировать искусственные фрагменты нуклеиновых кислот разной длины и любого состава (такие фрагменты называются олигонуклеотидами), а затем соединить их в более длинные цепи с помощью специальных ферментов. Полученные таким образом гены и их фрагменты широко используются в генетической инженерии, биотехнологии, а также для диагностики инфекционных и генетических заболеваний. Большие надежды связаны с их применением для направленного воздействия на генетический аппарат клетки (генотерапия). С помощью синтетических фрагментов ДНК можно модифицировать природные гены, вводя в них определенные

ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

37

ХИМИЯ изменения. Таким способом можно вводить направленные модификации в структуру белка, кодируемого данным геном (белковая инженерия). Это открыло путь к созданию белков, обладающих измененной биологической активностью, например к получению ферментов с улучшенными свойствами. Указанные пути улучшения старых и создания новых белков открывают широкие перспективы для медицины и биотехнологии. СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

NH2CHCOOH R Аминокислота

R

Глицин Аланин

–CH3

Валин

–CH(CH3)2

Лейцин

–CH2CH(CH3)2

Изолейцин

–CH(CH3)(C2H5)

–Н

Фенилаланин

CH2

Тирозин

CH2

CH2

CH2

Аминокислоты в белках соединены между собой пептидными связями:

R1

R2

–CH2OH –CH(OH)CH3

Аспарагиновая кислота

–CH2COOH

Глутаминовая кислота

–(CH2)2COOH

Аспарагин

–CH2CONH2

Глутамин

–CH2CH2CONH2

Лизин

–(CH2)4NH2

O P OH O B O

O B O X H

O X

Нуклеозид

Нуклеотид

Если Х = ОН – это рибонуклеозид и рибонуклеотид, входящие в состав РНК. При Х = Н – это дезоксирибонуклеозид и дезоксирибонуклеотид, они входят в состав ДНК. Структура азотистых гетероциклов нуклеиновых кислот:

NH2 N

N

N

(CH2)3NH C NH2 NH

B=

O

(A)

N –(CH2)2SCH3

Цистеин

–CH2SH

NH NH2 O

N

O CH3

HN N (U)

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , ТО М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0

N (C)

O

O

N

(G)

HN

Метионин

NH2

N N

N

CH2 HN

Rn

В состав нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов входят пять нуклеотидов, отличающихся между собой строением азотистого гетероцикла В. Три из них – производные аденина (А), гуанина (G) и цитозина (С) входят в состав и ДНК и РНК, производное тимина (Т) – только в ДНК, урацила (U) – только в РНК. Нуклеотиды в отличие от нуклеозидов содержат остаток фосфорной кислоты:

OH

Треонин

Ri

Пептидная связь

CH2

Гистидин

CHCOOH

OH

N

38

H2C

HO

Триптофан

Аргинин

HN

NH2CHCO NHCHCO … NHCHCO … NHCHCOOH

Белки и нуклеиновые кислоты являются биополимерами, состоящими из мономерных остатков – аминокислот (белки) или нуклеотидов (нуклеиновые кислоты). В состав белков и пептидов входят 20 канонических аминокислот, которые отличаются между собой структурой радикала R:

Серин

Существует также одна иминокислота – пролин:

O

N (T)

ХИМИЯ В нуклеиновых кислотах нуклеотиды соединены между собой фосфодиэфирными связями:

OH 1 O B

O P O OH

O X 2 O B

O P O OH

O X O P … O

i O B

OH O X O P … O

n O B

OH HO X Строение нуклеиновых кислот, а также основные достижения их химии и биохимии описаны в статьях Д.Г. Кнорре [1, 2]. Задачей химического синтеза белков и нуклеиновых кислот является соединение входящих в их состав мономеров в строго определенной последовательности. Схематически образование пептидной связи можно представить как конденсацию двух аминокислот с отщеплением молекулы воды:

NH2CHCOOH + HNHCHCOOH R1

−H2O

R2 NH2CHCO NHCHCOOH R1 R2

Для образования межнуклеотидной связи также должно произойти соединение двух нуклеотидов с отщеплением молекулы воды:

OH O P O

OH

1 O B

O P O

OH

OH O X H + HO O P O

1 O B

O X −H2O 2

O B

O P OH 2 O B O

OH HO X

HO X

Образующийся димер реагирует далее со следующим мономером (аминокислотой или нуклеотидом) с образованием тримера и т.д. Для проведения этих реакций необходимо выполнение следующих условий. 1. Нужно добиться селективности соединения мономерных звеньев. Например, карбоксильная группа первой аминокислоты должна прореагировать с аминогруппой второй аминокислоты, тогда как другие амино- и карбоксильная группы не должны участвовать в реакции. То же и в случае конденсации нуклеотидов – гидроксильная группа первого нуклеотида должна взаимодействовать с фосфатным остатком второго, но не наоборот. Для этого фрагменты, которые не участвуют в реакции, нужно блокировать с помощью специальных защитных групп. 2. Сами по себе карбоксильная и аминогруппы в аминокислотах (так же, как и фосфатная и гидроксильная группы в нуклеотидах) не реагируют друг с другом. Для проведения конденсации мономеров нужно активировать карбоксильную (фосфатную) группу. 3. Поскольку синтез проводится в несколько стадий, каждая реакция должна проходить с очень высоким выходом. В противном случае общий выход будет катастрофически падать с ростом длины целевого продукта. Например, для получения фрагмента длиной десять звеньев нужно провести девять реакций конденсации. При 90%-ном выходе на каждой стадии общий выход продукта составит 0,99 ⋅ 100 = 39%. Для синтеза фрагмента длиной 20 звеньев понадобится провести 19 реакций конденсации, и общий выход продукта составит всего 0,919 ⋅ 100 = 13,5%. Чтобы добиться получения значительного количества вещества при синтезе протяженных фрагментов белков и нуклеиновых кислот, выход на каждой стадии должен составлять 96–98%. 4. Все процессы – введение и удаление защитных групп, активация и конденсация – должны проводиться в мягких условиях, то есть без использования высоких температур, а также концентрированных растворов кислот или щелочей, что могло бы привести к образованию побочных продуктов и разрушению имеющихся и вновь образованных химических связей. В настоящее время разработано большое число методов синтеза пептидов и олигонуклеотидов, удовлетворяющих этим условиям, подобраны удобные защитные группы и предложены способы активации карбоксильной и фосфатной групп. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ТВЕРДОФАЗНОГО МЕТОДА СИНТЕЗА Синтез протяженных фрагментов белков и нуклеиновых кислот состоит из большого числа стадий. После проведения каждой химической реакции нужно выделить

ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

39

ХИМИЯ полученный продукт, очистив его от не вступивших в реакцию исходных веществ и других примесей. Это делает процесс длительным и трудоемким, а также приводит к значительным потерям на каждой стадии выделения. Американский ученый Роберт Меррифилд в 1962 году предложил оригинальную идею твердофазного метода синтеза, которая позволила резко упростить и ускорить проведение процесса. Идея заключается в том, что первый мономер (аминокислоту или нуклеозид) присоединяют к нерастворимому полимерному носителю (твердой фазе), который помещают в колонку-реактор. Раствор, содержащий второй мономер и другие необходимые реагенты, пропускают через колонку. При этом образовавшийся продукт реакции также оказывается присоединенным к твердой фазе. Затем колонку промывают растворителем для удаления непрореагировавших веществ и побочных продуктов, после чего через реактор пропускают следующий мономер, повторяя процедуру многократно до завершения синтеза желаемого продукта. Таким образом, растущая полимерная цепь в процессе синтеза закреплена на твердой фазе, и все реакции с другими компонентами, находящимися в растворе, протекают на поверхности носителя. Этот прием позволяет заменить сложные и трудоемкие процедуры разделения и очистки промежуточных продуктов элементарными операциями промывки полимера. Синтез включает в себя несколько принципиальных стадий. Стадия 1. Получение защищенных мономеров, которые являются исходными блоками для построения цепочки белка или олигонуклеотида. Для этого те фрагменты молекул, которые не должны подвергаться химическим превращениям, блокируют специальными защитными группами. Стадия 2. Присоединение концевого мономера (защищенной таким образом аминокислоты или нуклеозида) к полимерному носителю. Гранулы носителя с присоединенным концевым мономером вносят в колонку-реактор. Стадия 3. Удаление защитной группы с концевого мономера. Для этого через колонку пропускают раствор реагента, вызывающего отщепление защитной группы. Стадия 4. Проведение конденсации, для чего через колонку пропускают раствор второго мономера в смеси с активирующим реагентом. Стадии 3 и 4 повторяют многократно до получения биополимера необходимой длины. Затем проводят стадии 5 и 6. Стадия 5. Обработка носителя реагентами, приводящими к отщеплению синтезированного продукта от твердой фазы и удалению всех защитных групп.

40

Стадия 6. Выделение и очистка синтезированного фрагмента белка или нуклеиновой кислоты с помощью различных хроматографических и электрофоретических методов. (Из-за неполноты протекания реакций к концу синтеза на носителе накапливаются более короткие фрагменты цепи, поэтому необходима тщательная очистка конечного продукта.) СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ ТВЕРДОФАЗНЫМ МЕТОДОМ Р. Меррифилд осуществил синтез нескольких пептидов и фермента рибонуклеазы твердофазным методом, за что в 1984 году ему была присуждена Нобелевская премия. Рассмотрим применение принципиальной схемы твердофазного метода к синтезу пептидов. Стадия 1. Получение защищенных аминокислот. Для блокирования аминогрупп часто используют трет-бутилоксикарбонильную группу (сокращенное английское обозначение – Вoc):

O R'O C Cl + NH2CHCOOH R O R'O C HNCHCOOH + HCl (Boc)

R

R' = (CH3)3C Таким образом защищают аминогруппы всех аминокислот, входящих в данный пептид или белок. Некоторые боковые радикалы R аминокислот содержат функциональные группы (например, амино- или карбоксильные), способные участвовать в реакциях с образованием побочных продуктов, поэтому их также необходимо блокировать. Стадия 2. Присоединение концевой аминокислоты к полимерному носителю, например к полистиролу с введенными в него хлорметильными группами. Стадия 3. Удаление Вoc-защитной группы с присоединенной к полимерному носителю аминокислоты мягкой кислотной обработкой полимера. Стадия 4. Проведение реакции образования пептидной связи. Через колонку пропускают раствор, содержащий аминокислоту с защищенной аминогруппой в смеси с реагентом, который обеспечивает активацию карбоксильной группы. В качестве такого реагента Меррифилд использовал дициклогексилкарбодиимид C6H11N=C=NC6H11 .

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , ТО М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0

ХИМИЯ BocNHCHCOOH + Cl

CH2 P

трансформироваться при наращивании олигомерной цепи, поэтому их нужно предварительно блокировать. Затем одну из гидроксильных групп нуклеозида защищают диметокситритильной группой (DMTr):

(2)

Rn BocNHCHCOO CH2 P

H+ (3)

C6H5

Rn H2NCHCOO CH2 P Rn

BocNHCHRn − 1COOH

Rn - 1

O B*

Ar OH

…

Rn

P – Полимерный носитель Затем вновь удаляют защитную группу (стадия 3), добавляют следующий защищенный мономер и активирующий реагент (стадия 4) и т.д. Стадии 3 и 4 повторяют до тех пор, пока не закончится синтез требуемого пептида. Каждый цикл длится несколько часов. В настоящее время в пептидном синтезе применяют более эффективные конденсирующие реагенты на основе солей фосфония и урония, что позволяет сократить время синтеза одной пептидной связи (стадия 4) до 10–15 мин. После окончания синтеза удаляют защитные группы, введенные в боковые радикалы R, затем в более жестких кислых условиях отщепляют с полимерного носителя полученный пептид (стадия 5) и проводят его очистку (стадия 6).

Основной вклад в развитие олигонуклеотидного синтеза внес Г. Корана, осуществивший в начале 60-х годов химический синтез фрагментов нуклеиновых кислот заданной последовательности и получивший за эту работу в 1968 году Нобелевскую премию. В 1970 году он впервые синтезировал полный ген аланиновой транспортной РНК. В 1975 году Р. Летсингер предложил новый метод образования межнуклеотидной связи, на основании которого в начале 80-х годов М. Карузерс разработал так называемый твердофазный амидофосфитный метод синтеза олигонуклеотидов (см. ниже). С этого времени начались бурное развитие этого метода и его автоматизация. Рассмотрим основные стадии процесса. Стадия 1. Получение защищенных исходных мономеров для олигонуклеотидного синтеза. В трех из четырех входящих в состав ДНК нуклеозидов (A, G и С) гетероциклы содержат аминогруппы, которые могут

OH (DMTr)

Ar = CH3O

В* – защищенный гетероцикл В связи с тем что реагент содержит объемные заместители, реакция протекает только по одной стерически более доступной ОН-группе нуклеозида. В качестве мономеров, используемых для синтеза фрагментов ДНК, применяют амидофосфиты нуклеозидов, поэтому метод синтеза называют амидофосфитным. Эти соединения, содержащие трехвалентный фосфор, являются более активными по сравнению с производными пятивалентного фосфора. Амидофосфитные мономеры получают из защищенных нуклеозидов:

O B*

DMTrO

Cl

DMTrO

+ R'O P

O B*

−HCl

NR2

OH

O R'O P

CH3 R=

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК ТВЕРДОФАЗНЫМ АМИДОФОСФИТНЫМ МЕТОДОМ

O B*

Ar C O

Ar

C6H11N=C=NC6H11 (4)

BocNHCHCO NHCHCOO CH2 P

C6H5

Ar C Cl + HO

CH

R' = CNCH2CH2

NR2

CH3 Стадия 2. Присоединение концевого нуклеозида к полимерному носителю осуществляют через так называемую якорную группу, которая связывает нуклеозид с твердой фазой (обычно остаток янтарной кислоты). В качестве полимерного носителя используют стеклянные гранулы. Стадия 3. Удаление защитной группы с присоединенного к полимеру нуклеозида с помощью мягкой кислотной обработки:

DMTrO

n O B*

H+

HO

n O B*

O

O

P

P

Якорная группа

P – Полимерный носитель Стадия 4. Образование межнуклеотидной связи. Конденсация гидроксильной группы связанного с полимером нуклеозида с амидофосфитным производным

ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

41

ХИМИЯ второго нуклеозида осуществляется в присутствии активирующего реагента – тетразола. Затем атом трехвалентного фосфора должен быть окислен до пятивалентного состояния иодом в присутствии воды:

DMTrO

n−1 O B*

+

HO

O

n O B*

O

R'O P

−HNR2 HN N N N (Тетразол)

P

NR2 DMTrO

n−1 O B*

O

DMTrO

n−1 O B*

O

R'O P O

I2 + H2O

R'O P O n O B*

O

n O B*

O

O

P

P

После этого снова удаляют диметокситритильную группу с полученного продукта (стадия 3) и проводят конденсацию со следующим мономером и окисление (стадия 4). Эти процедуры повторяют до окончания синтеза целевого фрагмента ДНК. Каждый цикл длится несколько минут. После окончания синтеза продукт реакции отщепляют от полимерного носителя обработкой концентрированным аммиаком, при этом удаляются все щелочелабильные защитные группы (стадия 5). Затем, как и в случае пептидов, проводят тщательную очистку полученного фрагмента ДНК (стадия 6). Аналогичный метод применяют для синтеза РНК, однако при этом приходится использовать дополнительные стадии введения и удаления защитной группы, связанные с присутствием в рибонуклеозидах еще одной гидроксильной группы.

Автоматические синтезаторы включают в себя реактор, содержащий носитель с присоединенным к нему первым мономером, и сосуды с необходимыми мономерами, реагентами и растворителями. С помощью насоса растворы из этих сосудов поочередно подаются в реактор в соответствии с имеющейся программой и заданной последовательностью синтезируемого фрагмента белка или нуклеиновой кислоты. В настоящее время автоматические синтезаторы пептидов и олигонуклеотидов выпускают различные, в том числе и отечественные, фирмы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Для современной биоорганической химии синтез пептидов и олигонуклеотидов, содержащих 30–40 мономерных звеньев, не является сложной задачей. Как правило, твердофазным методом синтезируют олигонуклеотиды длиной около 40 звеньев. Использование специальных ферментов позволяет соединять их в гены, включающие до 2 тыс. пар нуклеотидов. Путем экспрессии генов с помощью методов генетической инженерии сейчас получают значительные количества труднодоступных белков и пептидов, а также их аналогов. ЛИТЕРАТУРА 1. Кнорре Д.Г. Биохимия нуклеиновых кислот // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 8. С. 30–35. 2. Кнорре Д.Г. Химические инструменты в современной биологии: (На примере антисмысловых воздействий на генетические структуры) // Там же. № 12. С. 25–31. 3. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. 4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высш. шк., 1998. 5. Пептиды: Основные методы образования пептидных связей / Под ред. Э. Гросса, И. Майенхофера. М.: Мир, 1983. 6. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы генетической инженерии. М.: Изд-во МГУ, 1994.

Рецензенты статьи А.А. Богданов, Н.Л. Клячко АВТОМАТИЗАЦИЯ СИНТЕЗА ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Важным преимуществом твердофазного метода синтеза является простота операций. Процесс синтеза состоит из повторяющихся стадий пропускания защищенных мономеров, реагентов и растворителей через колонку с полимерным носителем, к которому присоединена растущая цепь. Это делает возможной автоматизацию процесса.

42

*** Людмила Михайловна Халимская, кандидат химических наук, доцент Новосибирского государственного университета. Область научных интересов – использование различных производных олигонуклеотидов для направленного воздействия на генетический аппарат клеток. Автор 25 научных публикаций, в том числе двух методических и одного учебного пособия.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , ТО М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0