Метод. рекомендации к вып. работ по курсу Биофизический практикум

1

Московский ордена Трудового Красного Знамени инженернофизический институт (государственный университет) Министерства высшего и профессионального образования РФ.

Качановский Е.А., Ушаков В.Л.

Методические рекомендации к выполнению работ по курсу “Биофизический практикум”

Москва – 2002 г.

Учебное пособие “Методы исследования биологических объектов”

2

Содержание. I) Выделение молекул ДНК из клетки, определение степени ее очистки, конформации и концентрации в растворе. II) Дополнение к лабораторной работе № 9 “Реакция Белоусова - Жаботинского”. Качественные периодические реакции. III) Оптическая активность биологических молекул. IV) Количественное определение белка в растворе.

3

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1 Выделение ДНК. Цель работы: познакомиться с основными принципами и практическими приемами выделения и очистки ДНК из тканей животного и растительного происхождения.

Введение Теоретическая часть работы взята из УСПЕХИ СОВРЕМЕННОМ БИОЛОГИИ ТОМ 91, (1981), ВЫП. 1, с.49 – 59/ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ВЫСШИХ РАСТЕНИИ Мирошниченко Г. П., Дьяченко Л. Ф. К настоящему времени мы располагаем довольно большим набором методов экстракции и очистки растительных ДНК, причем эти методы продолжают совершенствоваться и модифицироваться применительно к новым объектам исследования. Использование того или иного метода выделения ДНК диктуется, во-первых, спецификой изучаемого материала, а во-вторых, тем, какая преследуется цель: получение суммарной, ядерной, хлоропластной ДНК или других ее препаратов. Ядерная ДНК, как правило, представляет наибольший интерес, поскольку служит матрицей для транскрипции генов. В приложении 5 приведена схема регуляции транскрипции генов. Метод выделения ДНК должен быть относительно простым, хорошо воспроизводимым и давать возможность быстрого получения достаточных количеств удовлетворительно очищенных препаратов ДНК. В связи с разнообразием живых объектов универсальных методов выделения ДНК (а тем более из высших растений) не существует. При выделении ДНК из растений приходится сталкиваться с целым рядом методических сложностей, связанных с низким содержанием ДНК в растительном материале, трудностью разрушения клеток, а также с большим количеством примесей (полисахаридов, пигментов, дубильных веществ), затрудняющих очистку ДНК. При этом надо учитывать структурные особенности и регуляцию функционирования внутриклеточных ферментативных систем. Например, внутри лизосом, где происходит расщепление протеинов и липидов, для работы протеаз создается за счет работы протонных насосов кислый pH=4, в то время, как внутрицитоплазменный порядка 7,2. Роль основных внутриклеточных посредников и их вид приведены в приложении 7. В приложении 8 указаны примеры рецепторов-протеинкиназ, механизм действия которых основан на регуляции активности белков за счет их фосфорилирования. Выход ДНК зависит от природы исходного материала и обусловлен содержанием ДНК в данной ткани, а также наличием и характером примесей, препятствующих очистке ДНК. Для растительных объектов выход ДНК обычно ниже, чем для тканей животных (например, при выделении ДНК из свежих листьев ценой больших усилий удается получить до 0,1 мг/г листьев). Качество получаемого препарата ДНК определяется задачами дальнейшей работы. В любом случае ДНК должна содержать минимальное количество примесей полисахаридов и белков (не более 2—3%), что отражается на так называемых спектральных характеристиках препаратов ( А260/А230 ≥ 2,0; А260/А280 ≥ 1,8—1,9). Содержание РНК в чистых препаратах ДНК также не должно превышать 2—3%. Любой полученный препарат ДНК должен соответствовать определенным критериям чистоты, нативности и полимерности. Получение ДНК из митохондрий и пластид растительной клетки достаточно специфично. В данной работе приведено рассмотрение методов, используемых для выделения и очистки препаратов суммарной ДНК, а также ядерных ДНК из тканей высших растений. Удобнее всего выделять ДНК из молодых тканей и органов высших растений (например, из проростков или луковиц). В ряде случаев наиболее доступным в больших количествах растительным материалом служат листья. Однако уже перечисленные трудности получения высокоочищенных препаратов ДНК из растений встречаются прежде всего при работе именно с листьями. При выделении препаратов суммарной ДНК из листьев необходимо учитывать, что

4

при этом часть ДНК будет представлена хлоропластной ДНК (см. приложение 1). Как показали авторы, крупные листья содержат вдвое большее количество хлоропластной ДНК по сравнению с ядерной. Для средних листьев количество хлоропластной ДНК примерно одинаково с ядерной ДНК, для малых листьев треть всей ДНК листа находится в хлоропластах. Предпочтительно выделять ДНК из свежего растительного материала, который сразу замораживают жидким азотом, что способствует ингибированию ДНКаз. Замороженные жидким азотом ткани и органы растений иногда хранят до выделения ДНК при -20°С. Замороженный материал можно также размельчить до порошкообразного состояния, лиофилизировать и хранить при комнатной температуре без доступа влаги. Разработан даже способ выделения ДНК из растительных объектов, фиксированных спиртом. Начальный этап процесса выделения ДНК - разрушение клеточных оболочек. Существующие способы разрушения тканей можно разделить на три группы: 1) механическое растирание, размалывание, гомогенизация; 2) применение ферментов, специфически расщепляющих компоненты клеточных стенок; 3) сочетание механического разрушения с ферментной деградацией. Для гомогенизации тканей используют специальные измельчители с ножами, вращающимися при высоких скоростях: 10-40 тыс. об/мин. Этот способ предпочтительно применять для молодых, легко разрушающихся растительных тканей. Фиксированный материал гомогенизируют в присутствии этанола. Удовлетворительного механического разрушения тканей удается достичь при растирании их в охлажденной ступке с отмытым соляной кислотой кварцевым песком, порошкообразной окисью алюминия, измельченным стеклом. Метод широко применяется для разрушения различных тканей, в частности вегетативных и генеративных органов гороха, мышиного горошка, табака, яблони, ландыша, меристематических тканей лука, проростков салата. Его используют также и для разрушения лиофилизированного материала. Меньшее распространение получил способ разрушения клеток различными прессами. В последнее годы начали интенсивно развиваться ферментативные методы разрушения клеточных оболочек, приводящие к получению протопластов. Несомненное их преимущество - отсутствие нежелательных жестких механических воздействий, приводящих к деградации высокополимерных молекул ДНК. Это весьма существенно, если для дальнейшей работы требуется высокополимерная ДНК, например для изучения репликации ее в клетке. Кроме того, при использовании протопластов увеличивается выход ДНК за счет снижения потерь на различных этапах очистки от полисахаридов, что дает возможность уменьшить количество исходного материала до нескольких граммом. Однако при всех своих достоинствах этот метод выделения ДНК из протопластов сопряжен с трудностью получения самих протопластов. Учитывая химический состав клеточных стенок, для их лизиса используют различные пекто- и целлюлолитические ферменты. Сначала ткань мацерируют, используя пектиназы. Самая активная среди известных пектиназ - мацерозим, выделенный из гриба Rhyzopus, несколько менее активен препарат пектинол R-10. Разрушение клеточных стенок проводят в среде, содержащей 0,4-0,7М маннит или сорбит, с помощью так называемых целлюлазных комплексов - сложных систем ферментов, в состав которых входят С1-фермент и Схфермент, а также целлобиаза, гидролизующие различные типы связей в молекулах полисахаридов. Эффективность действия целлюлазного комплекса зависит от наличия в нем всех трех, а возможно, и большего количества отдельных компонентов. Целлюлазные комплексы, выделенные из различных источников, известны обычно под своими фирменными названиями. Широко используются, например, препараты «Оnozuka R-10» (Япония) и «Сеllulysin» (США), полученные из Trichoderma viride, «Сеllulase» (США) - из Aspergillus niger; отечественная промышленность производит ферментные препараты целлокандин, целловиридин, целлолигнорин, а также ксиланигрин и ксиланазу, выделяемые из различных микроорганизмов. Эти препараты также могут быть использованы для получения протопластов из высших растений.

5

Как правило, для успешного лизиса клеточных стенок экспериментально для каждой ткани подбирают состав и концентрацию растворов, рН, состав и концентрации ферментов, время и температуру инкубации. Для целого ряда тканей уже разработаны оптимальные условия получения протопластов. По данным литературы, выход протопластов составляет более 95%. Протопласты легко разрушаются осмотическим шоком или детергентами. При этом в гомогенат переходят интактные ядра и различные клеточные органеллы. Лизис протопластов можно также проводить в присутствии детергентов, например, тритона Х-100, нонидета Р-40. Получение растительных протопластов используется как промежуточный этап препаративного выделения хлоропластной и ядерной ДНК. При этом лизат протопластов центрифугируют в градиенте плотности сахарозы для разделения субклеточных органелл и получения из них чистых препаратов ДНК. Следует отметить, что требования к протопластам, предназначенным для выделения из них ДНК, отличаются от требований, предъявляемых при необходимости их дальнейшего культивирования, когда на первый план выступает проблема сохранения жизнеспособности протопластов. Суммируя сказанное выше, можно заключить, что выбор метода разрушения растительной ткани определяется конечной задачей работы, спецификой ткани и другими причинами. Для разрушения нежных эмбриональных тканей удобно использовать гомогенизацию, растирание в ступке. Фиксированный материал или ткани с прочными клеточными оболочками следует измельчать в ступках или мельницах при замораживании жидким азотом. Для выделения отдельных типов ДНК (ядерной, хлоропластных) наиболее целесообразны ферментативные методы разрушения клеточных оболочек. Для получения высокополимерного препарата ДНК необходимо ингибировать освобождающиеся при разрушении клеток нуклеазы. Примерный состав клеток приведен в приложении 2. Для снижения активности нуклеаз процесс выделения проводят на холоду (от 0° до +2°С), в неоптимальной для их действия щелочной среде. При гомогенизации тканей в среду вводят ингибиторы: ЭДТА, цитрат натрия и другие соединения, связывающие ионы Мg2+, необходимые для действия ДНКаз. В разной степени ДНКазы подавляют ион арсената, фторид и хлорид натрия в высокой концентрации, фенол, парааминосалициловая кислота (4амино-2-гидроксибензойная кислота), детергенты, бентонит. Активным ингибитором ДНКаз служит ауринтрикарбоновая кислота в концентрациях 10-50 мМ. Кроме того, вследствие термолабильности ДНКазы частично денатурируют в результате прогревания лизатов тканей при 55-60°С. Для получения препарата суммарной ДНК после разрушения ткани проводят лизис клеточных и ядерных мембран. В качестве лизирующего агента чаще всего применяют додецилсульфат натрия (SDS) (н-С12Н25SО4Nа) в концентрациях 1-5%. SDS способствует лизису мембран и ядер, увеличивает выход и улучшает депротеинизацию ДНК. Депротеинизирующий эффект SDS заключается в том, что при связывании его с белком образуются растворимые комплексы. SDS интенсивно разрушает водородные и гидрофобные связи в молекулах белков, растворяет многие ранее не растворимые белки. Комплексы белка с SDS приобретают значительный отрицательный заряд из-за сульфогрупп иона додецилсульфата.

6

Мембрана Гидрофильный участок белка

Солюбилизированный белок Рис. 1. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.

Кроме SDS, для лизиса тканей применяют и другие детергенты: 1%-ный триизопропилнафталинсульфонат (изо-С3Н7)3С10Н4SО3Nа, 1%-ный цетилтриметиламмоний бромид (С16Н24(СН3)3N+Br-) (цетавлон), 4%-ный додецилсаркозинат натрия (С11Н21СОN(СН3)СН2СООNа) (саркозил). Каждый из них обладает своими достоинствами и недостатками. SDS выпадает в осадок на холоду и в присутствии калия. Саркозил растворим на холоду, но образует нерастворимые соли с Мg2+и Мn2+. Триизопропилнафталинсульфонат активно ингибирует нуклеазы, но также образует нерастворимые соли с магнием и марганцем. Кроме того, последние два детергента интенсивно поглощают свет при 260 нм. Додецилсаркозинат натрия применяют в том случае, когда планируется дальнейшая очистка ДНК в хлориде цезия, так как в отличие от SDS он растворим в этой соли. Помимо детергентов, в лизирующие смеси иногда вводят протеолитические ферменты бактериального происхождения, не теряющие активности при повышенной температуре (до 60°С). Особенно эффективна протеиназа К («Sigma», США), которая обладает очень широкой субстратной специфичностью. Активация этого фермента более чем в 7 раз в присутствии мочевины и SDS обусловлена главным образом денатурацией белковсубстратов в этих условиях. В литературе описаны некоторые приемы, используемые в ряде случаев при лизисе и обеспечивающие на последующих этапах выделения ДНК из растений ее очистку от окрашенных примесей. Характерная особенность высших растений - наличие в их тканях большого количества полифенольных соединений, к которым относятся водорастворимые пигменты и дубильные вещества. Лизис клеток сопровождается окислением полифенолов за счет активации клеточных полифенолоксидаз. В результате возникают окрашенные продукты, которые наряду с имеющимися в клетках водорастворимыми растительными пигментами способны необратимо связываться с ДНК, препятствуя ее дальнейшей очистке. Окрашенные примеси в препаратах ДНК могут влиять на результаты количественного определения ДНК в препарате химическими методами, на определение РНК в ДНК орциновым методом и белка по Лоури, а также на величину отношения А260/А280, т. е. характеристики окрашенных препаратов ДНК не будут отражать их истинных свойств. Универсальных методов очистки растительных ДНК от окрашенных примесей, к сожалению, не существует. Имеются указания на эффективность обработки размельченных растительных тканей диметилсульфоксидом ((СН3)2SО2) при - 40°С для удаления пигментов

7

и нуклеаз перед экстракцией ДНК. На последних этапах выделения очищенную от полисахаридов и белков окрашенную ДНК можно пропустить через сефадекс G-50. При этом пигменты выходят из колонки после ДНК. Желтую и коричневую окраску препаратов ДНК иногда удается устранить обработкой 2-метоксиэтанолом на последних этапах очистки. Одновременно удаляются некоторые полисахариды и белки. Однако при использовании 2метоксиэтанола наблюдаются значительные потери ДНК. Более эффективная очистка от окрашенных примесей достигается, если для предотвращения окисления полифенольных соединений в лизирующую смесь добавляют антиокислители (например, аскорбиновую кислоту в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол или 8-оксихинолин). С этой же целью при лизисе используют диэтилдитиокарбамат ((С2Н5)2NCSSNa), ингибирующий полифенолоксидазы. Иногда его применяют в сочетании с поливинилпирролидоном, который связывает полифенольные соединения. Таким способом можно получать чистые препараты ДНК из растений, отличающихся высоким содержанием дубильных веществ (например, из хвощей и папоротников). Иногда помимо добавления в лизирующую смесь поливинилпирролидона и диэтилдитиокарбамата требуется дальнейшая очистка ДНК от пигментов, например методом гель-фильтрации. Однако следует отметить, что без использования вышеупомянутых соединений на начальных этапах выделения все попытки очистить ДНК от пигментов на последующих стадиях могут оказаться безрезультатными. После лизиса обычно проводят многократную депротеинизацию полученного лизата. При этом происходит разрушение химических связей, поддерживающих третьичную и четвертичную структуру белка (виды и энергия связей в биологических молекулах приведены в приложении 3). Для этого к нему добавляют различные соединения, обеспечивающие диссоциацию нуклеопротеидных комплексов (NаС1, NаС1О4, мочевину), а затем агенты, денатурирующие белки. Выбор депротеинизирующих агентов определяется конкретными условиями и задачами дальнейшей работы с выделяемыми препаратами ДНК. Несмотря на широкое распространение, методы депротеинизации ДНК фенолом и хлороформом обладают рядом серьезных недостатков. Один из них состоит в разрушении высокополимерных молекул ДНК на фрагменты при механическом встряхивании с этими депротеинизирующими агентами. Кроме того, имеются сведения, что фенол избирательно экстрагирует сателлитную ДНК АТ-типа, вызывает увеличение потерь ДНК при выделении. Обработка фенолом на 10% снижает вязкость ДНК, понижает температуру плавления, приводит к изменениям богатых ГЦ-парами участков. При использовании хлороформа могут происходить потери связанной с мембранами или гетерохроматиновой ДНК. При количественном определении потерь нуклеиновых кислот за счет двукратной обработки фенолом и хлороформом оказалось, что теряется примерно четвертая часть ДНК. При двукратной обработке хлороформом потери ДНК составляют 16%. Хлороформ избирательно экстрагирует однонитчатую ДНК: ~54% при трех обработках. Потерь ДНК, вызываемых обработкой фенолом или хлороформом, удается избежать при использовании препаративных градиентов СsСl. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности дает возможность получать высокоочищенные препараты ДНК. Наличие СsСl в высокой концентрации (2-4 М) вместе с 5 М мочевиной иногда приводит к полной диссоциации нуклеопротеидных комплексом. Принцип метода очистки состоит в том, что ДНК и примеси (РНК, белки, полисахариды) различаются по плавучей плотности. Плотность СsСl и условия центрифугирования подбирают так, чтобы РНК осаждалась на дно, белок всплывал на поверхность, а ДНК располагалась близко к центру пробирки. Этот метод не является простым или экономичным в смысле времени и оборудования, однако ценность его заключается в том, что он очень эффективен при наличии малых количеств исходного материала. После очистки равновесным центрифугированием в СsСl препараты ДНК содержат <1% РНК, <1% белка, характеризуются высоким гиперхромизмом, гомогенностью по молекулярному весу. Кроме того, очистка в градиенте СsСl позволяет избавиться от некоторых примесей, влияющих на скорость реассоциации ДНК. Эффективная очистка препаративных количеств ДНК растений может быть проведена в градиенте плотности смеси СsСl и бромистого этидия. Бромистый этидий делает полосу ДНК видимой и позволяет ингибировать гидролиз ДНК.

8

В отличие от методов выделения ДНК с использованием центрифугирования в градиенте СsСl методы с применением депротеинизации хлороформом и фенолом требуют дополнительной очистки препарата от примесей РНК. Традиционный способ очистки ДНК от РНК - ферментативная деградация последней в присутствии панкреатической РНКазы А; в ряде случаев дополнительно используют РНКазу Т 1. Одновременно с РНКазой иногда рекомендуется применять α-амилазу для удаления оставшихся в препарате полисахаридов. Внесенные в раствор ДНК ферменты удаляют депротеинизацией фенолом или хлороформом, а ДНК осаждают изопропанолом. При использовании методов выделения растительных ДНК, в основу которых положена методика Мармура, удается получать удовлетворительно очищенные препараты ДНК, однако выход ДНК относительно невысок (10—20 мг/кг свежих листьев). Исходный материал 1. Лизис: 0,3 М NaCl + 0,015 М цитрат Na + 0,1 М ЭДТА + 0,1 М трис-НСl (рН 8) + 2 %-ный SDS ↓ 2. Депротеинизация: 1 М NaCl + смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1) ↓ Центрифугирование ↓ ↓ Денатурированные белки, Нуклеиновые кислоты, часть полисахаридов часть полисахаридов ↓ 3. Осаждение спиртом: 96 % этанол (2 объема) ↓ ↓ Раствор (часть полисахаридов, Осадок (нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды) полисахариды) ↓ 4. Обработка РНКазой: (0,015 М NaCl + 0,015 М цитрат Na) + NaCl до 0,15 М, РНКаза, 1-2 часа, 37°C ↓ 5. Депротеинизация ↓ 6. Осаждение изопропанолом: 3 М ацетат Na + 0,001 М ЭДТА (рН 7) (0,1 объем) + изопропанол ↓ ↓ Раствор (полисахариды, Осадок (ДНК) олигонуклеотиды) ↓ 7. Переосаждение спиртом ↓ ДНК Для более эффективной очистки ДНК и увеличения выхода ее из ткани используют различные дополнительные приемы. Один из них - применение сильного катионного детергента бромистого цетилтриметиламмония (цетавлона). Использование цетавлона для очистки ДНК основано на том, что при его взаимодействии с полианионами (в том числе с нуклеиновыми кислотами) образуются нерастворимые в воде комплексы. Эти комплексы растворимы в солях, когда концентрация соли превышает некоторое критическое значение, зависящее от природы соли, структуры и молекулярного веса нуклеиновой кислоты. Критическая концентрация соли, при которой осаждаются соответствующие цетавлоновые комплексы, для ДНК выше, чем для

9

РНК, полисахаридов и белков. На основании этих общих соображений цетавлон может быть применен на любых стадиях выделения ДНК, начиная с добавления его в лизирующую смесь. Достоинством методов, использующих цетавлон при очистке ДНК, служат относительная простота и быстрота выделения, а также высокая эффективность очистки. Недостаток заключается прежде всего в относительно небольшом выходе (не более 30—40 мг/кг свежего материала) и некоторой нестандартности методики. Весьма перспективным оказалось использование при работе с растительными объектами хроматографии на гидроксилапатите (ГАП). Принцип хроматографической очистки и разделения ДНК на ГАП основан на том, что однонитчатые и двунитчатые молекулы нуклеиновых кислот и молекулы белков неодинаково прочно связываются с частицами фосфата кальция и поэтому смываются с колонки ГАП при разных концентрациях фосфатного буфера. Далее в общих чертах описываются процедуры получения экстрактов из различных тканей. Ткани животных

Ткань разрезают на кусочки, удаляют, насколько это возможно, соединительную ткань и жир. Разрезанную ткань помещают в лопастной гомогенизатор, добавляют 2-3 объема холодного экстрагирующего буфера в расчете на 1 г ткани. Смесь гомогенизируют в течение 30 с. Гомогенизацию повторяют, если остались куски неразрушенной ткани. В процессе доведения рН до нужного значения перемешивают гомогенат 10 - 15 мин, а затем переносят его в центрифужные пробирки. Центрифугируют при 5000—10000 g в течение 60 мин (2·105 — 3·105 g·мин). Экстракт сливают через фильтр «Мirасlоth» (Сhiсорее Мills, Inс., N. J.), марлю или стеклянную вату с целью удаления частиц жира и других крупных частиц. Эритроциты

Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором NаС1 (0,9%, 0,15 М) и повторного центрифугирования. Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема воды на 1 объем отцентрифугированных клеток). Около 90% белка, переходящего в раствор, составляет гемоглобин. Мягкие растительные ткани К растительной ткани добавляют только 0,5 - 1 объем холодного буфера, содержащего 20 30 mМ меркаптоэтанола и гомогенизируют в течение 30 с. Вместо этого можно пропустить материал через бытовую соковыжималку, предварительно промытую буфером. Гомогенат следует отцентрифугировать как можно скорее, чтобы уменьшить его потемнение в результате окисления (2·105— 3·105 g·мин). Жидкость осторожно сливают с поверхности осадка. При необходимости для адсорбции фенолов полезно добавить порошкообразный поливинилпирролидон. Дрожжи

1. Полностью разрушить клетки можно с помощью гомогенизатора Мэнтона— Гаулина (Gaulin Corp. Mass.) или мельницы «Vibrogen Cell Mill» (Вühler, Тübingen), используя около двух объемов буфера на 1 г сырой массы. 2. Автолиз толуолом. Применяют различные методы с использованием толуола ; однако не все они пригодны для работы с коммерческими дрожжами. В основе этих методов лежит обработка дрожжей толуолом, обычно при температуре 35—40 °С. Через 20—30 мин дрожжи «разжижаются» вследствие экстракции компонентов клеточной стенки. После этого к дрожжам добавляют буфер и перемешивают их в течение нескольких часов или оставляют на ночь на холоде. Так как метод автолитический и структуры клеточной стенки разрушаются под действием ферментов, во время обработки может произойти деградация некоторых клеточных ферментов. Вместо толуола можно использовать этилацетат, но он не годится для работы со штаммами дрожжей, имеющими более прочные клеточные стенки. Бактерии

Бактериальные клетки можно разрушить ультразвуком, с помощью шаровой мельницы или пресса Френча, хотя не все эти способы удобны для приготовления больших объемов экстракта. В случае небольших объемов клетки можно растирать с окисью алюминия. Грамположительные бактерии обычно чувствительны к лизоциму.

10

ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Водяная баня или термостат. Центрифуга. Весы лабораторные. Холодильник. Сосуд Дьюра с жидким азотом. Ледяная баня (t= 0 – 4 oC). РАСТВОРЫ И РЕАКТИВЫ.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Лизирующий буфер: 0,1 М ТРИС·НСl, 0,1 М ЭДТА, 0,3 М NaCl; рН=8,1. 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS). Раствор 10 SSС: 1,5 М NaCl, 0,15 М цитрати натрия; рН=7,2. Смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1. Этанол. 4 М NaCl. ХОД РАБОТЫ. ПРОЦЕДУРА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК.

1. Растительный материал промыть водопроводной водой, высушить на фильтровальной бумаге, взвесить 5-10 г. Измельчить и растереть в фарфоровой чашке в жидком азоте до мелкого гомогенного порошка. 2. Порошок переносят в лизирующий буфер из расчета на 1 г измельченного материала 1-2 мл буфера. 3. Добавить в суспензию 10%-ный раствор додецилсульфата натрия до его конечной концентрации 2%. Образуется вязкий лизат. 4. Лизат прогреть 10 мин при температуре порядка 60 оС (при этом инактивируются нуклеазы). 5. Суспензию перенести в ледяную баню (t=0-4 оС) и все дальнейшие операции провести на холоде. 6. Добавлением 4 М NaCl довести концентрацию NaCl в суспензии до 1 М. Добавить равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Встряхивать (осторожно!) до полной гомогенизации раствора. 7. Раствор центрифугировать 10 мин в центрифуге при 1000 об/мин. Осторожно отсосать прозрачную водную фазу. (см.Рис.) Процедуру повторить 2-3 раза. Отобранную водную фазу объединить. Затем к отобранному раствору осторожно по стенке добавить 2 объема этилового спирта. ДНК при этом выпадает в осадок. Отцентрифугировать осадок при 5000 об/мин в течение 5 мин или намотать преципитат ДНК на стеклянную палочку. Выделенную ДНК растворить в 0,01 SSС. 8. После растворения переосадить ДНК еще раз этанолом (двумя объемами). Снова растворить в 0,01 SSС. Для длительного хранения перевести раствор ДНК в 1 SSС. 9. Провести тестирование нативности и молекулярного веса ДНК в соответствии с указаниями лабораторных работ №2 и №3. Рис.2. Распределение компонентов смеси после встряхивания со смесью хлорофма с изоамиловым спиртом и центрифугирования. І - водный слой, содержащий ДНК. ІІ - промежуточный слой. ІІІ – хлороформ. ІV – осадок.

I II III . IV

11

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ. 1. 1.Каковы основные химические различия ДНК из разных биологических объектов? 2. Как происходит ферментативный гидролиз ДНК и какими способами можно его подавить? 3. На каких принципах основано разделение ДНК и белков? 4. С чем связано выращивание проростков пшеницы в темноте? Почему выгодно использовать для выделения ДНК проростки пшеницы, а не зрелые растения? 5. С чем связано основное отличие способов выделения ДНК из растительных и животных тканей? 6. Способы разрушения клнток. 7. Что такое солюбилизация белков? Принцип работы детергентов. 8. Для чего используют лизирующий буфер. Что такое буферная емкость? Две основные буферные системы в живых организмах. 9. Почему операции после нагревания лизатов необходимо проводить на холоде? 10. 10.Почему ДНК переосаждается этанолом? 11. 11.Почему раствор ДНК хранят в 1 SSС, а не в дистиллированной воде или 0,01 SSС? 12. Что такое ПАВ? 13. Что такое ионная сила, ее зависимость от концентрации и заряда ионов? 14. Размер и энергия ковалентных связей: одинарная, двойная и тройная углеродная связь. Сопоставление с размерами атомов углерода, водорода, азота, кислорода. 15. Виды и энергия (в эв) связей в биологических молекулах. Сравнение с тепловой энергией при 25 ºС. 16. Размеры, количество и тип ДНК в клетках млекопитающих и растений. 17. Характерный размер и функции хлоропластов растений. 18. Характерный размер и функции митохондрий млекопитающих. Сопоставление с размером клеточного ядра и самой клетки. Размер других внутриклеточных органелл. 19. Состав, функции и размер внутриклеточных органелл и цитоскелета клеток. 20. Внутриклеточная и межклеточная сигнализация. Два основных внутриклеточных посредника. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Б.Албертс и др. Молекулярная биология клетки. В 3-х тт. Изд-во Мир, 1994. 2. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М., Наука, 2000. 3. Ченцов Ю.С. Общая цитология. Изд-во МГУ, 1995. 4. Льюин Б. Гены. Изд-во Мир, 1987. 5. Сингер М, Берг П. Гены и геномы. . Изд-во Мир, 1998. 6. А.Ленинжер "Основы биохимии", Мир, 1985.

12

Дополнение к лабораторной работе № 9 “Реакция Белоусова Жаботинского”. Качественные периодические реакции. Йодные часы. 1. Раствор коммерческий 50%-ный раствор перекиси водорода - Н2О2. Брать 1 мл. 2. 2,5 мл раствора №2. (Для приготовления 100 мл раствора в 50-60 мл воды влить 1,1 мл конц. Н2SО4 и добавить 4,28 г КIО3. Подогреть до растворения соли. Охладить и долить воды до 100 мл.) 3. Смешать 200 – 400 мкл раствора крахмала - 4 мг/мл с 2,4 мл малоновой кислоты (11,7 г/250 мл) и 2 мл раствора сульфата марганца (1,142 г MnSO4·H2O в 100 воды). Проведение: В стакан отмерить пп.2, а затем одновременно влить растворы по пп.1 и 3, при энергичном перемешивании. Наблюдается порядка 32 колебаний. Реакция Белоусова – Жаботинского. 1. Стандартный раствор. (К 9,6 г сульфата церия (III) – Се2(SО4)3·8Н2О добавить около 100 мл воды и 15 мл конц. Н2SО4 и 11,7 г малоновой кислоты. Смесь перемешивать при нагревании до полного растворения осадка в течении 4 – 5 часов. Постепенно довести объем до 250 мл.) 2. Раствор окислителя. (Навеску 300 мг КВrO3 растворить в 2,5 мл воды при нагревании. Добавить около 400 мкл раствора индикатора – комплекса железа с фенантролином.) (1 г о-фенантролина, 5 мл серной кислоты (1:3) и 0,8 г соли Мора в 50 мл воды). Окисленная форма индикатора обладает бледно-голубой окраской, а окисленная – красная Проведение: В стакан отмерить 5 мл стандартного раствора, а затем влить при энергичном перемешивании быстро охлажденный раствор окислителя, пока не выпал осадок КВrO3. Пальцы: В чашку Петри диаметром 12 см вылить 7,5 мл ранее смешанного раствора. Ртутное сердце (амеба). В емкости с полукруглым дном (часовое стекло) смешать 2 мл конц. азотной кислоты с 12 мл воды (разбавление 1:6), добавить каплю металлической ртути, а рядом поместить кристалл или кусочек бихромата калия. Будут наблюдаться периодические подергивания капли металла.

13

Лабораторная работа №10 Оптическая активность биомолекул. Цель: ознакомиться с явлением оптической активности биомолекул и поляризационным методом ее определения. Введение. Подавляющее большинство сложных молекул, содержащих более трех атомов, не имеют плоскости и центра симметрии. Такие молекулы дисимметричны, хиральны ("хиральность"- несовпадение некоторой структуры с ее зеркальным отражением). Хиральные вещества могут фигурировать в двух формах – правой и левой. Эти две конфигурации нельзя совместить друг с другом никаким поворотом системы как целого в пространстве, они относятся друг к другу, как правая и левая рука. Хиральность – свойство объекта быть несовместимым со своим отображением в идеальном плоском зеркале. В химии рассматривается хиральность индивидуальных молекул и их агрегатов. Хиральные молекулы существуют в виде пар энантиомеров, различающихся только знаком оптического вращения, которое связано с конфигурацией. В мире биологических молекул чаще всего приходится встречаться с хиральностью, определяемой так называемым асимметричным атомом углерода, обычно отмечаемым звездочкой. В насыщенных органических соединениях четыре валентных связи углерода расположены под тетраэдрическими углами друг к другу. Если две валентности из четырех связывают одинаковые группы, как, например, в молекуле СХ 2YZ, то плоскость СYZ является плоскостью симметрии и хиральность отсутствует. Атом углерода асимметричен, если все четыре группы, с которыми он связан, различаются - С XYZV (например, приведенная ниже на рисунке молекула CHClBrI). Такая молекула не имеет ни плоскости, ни центра симметрии. Поэтому большинство аминокислот обладают хиральностью. В обычном химическом синтезе из исходных симметричных молекул синтезируемое вещество всегда получается в виде рацемической смеси, содержащей по 50 % правого и левого антипода. Это следует из второго начала термодинамики, поскольку рацемат отвечает максимальной энтропии. Удельное вращение вещества [] – это вращение раствора вещества, выраженное в градусах при его концентрации, равной 1 г/мл, и при толщине слоя раствора, равной L дм. Практически обычно пользуются более разбавленными растворами (концентрацией С) и более короткими трубками (длиной L). Правое вращение обозначают знаком «+», а левое – знаком «-». Наблюдаемое вращение  пересчитывают на удельное по формуле: []·С·L =  Для обозначения пространственной структуры химических соединений применяется специальная стереохимическая номенклатура. (Правила ИЮПАК, раздел Е) Наиболее общий подход к обозначению конфигурации энантиомеров – использование R,S–системы. В основе этой системы лежит правило последовательности, которое однозначно устанавливает старшинство заместителей (старшинство численно равно заряду ядра). Старшими считаются те из них, у которых с рассматриваемым хиральным элементом (например, асимметричным атомом углерода, двойной связью, циклом) непосредственно связан атом с бóльшим атомным номером. Если эти атомы одинаковы по старшинству, то рассматривают “второй слой”, в который входят атомы, связанные с атомами “первого слоя”, и т.д., до появления первого различия; номера атомов, связанных двойной связью, при определении старшинства удваивают. Перечень заместителей в порядке возрастания старшинства для 75 радикалов приведен ниже:

14

H; CH3 ; C2H5; C3H7; C4H9; C5H11; C6H13; (CH2)2CH(CH3)2; CH2CH(CH3)2; CH2CH=CH2 ; CH2C(CH3)3; CH2CCH; CH2C6H5; CH(CH3)2; CH=CH2; CH(CH3)C2H5; C6H11; CH=CHCH3; C(CH3)3; C(CH3)=CH2; CCH; C6H5; п- C6H4CH3 ; п- C6H4NO2; мC6H4CH3; 3,5 - C6H3(CH3)2; м- C6H4NO2; 3,5 - C6H3(NO2)2; СCСH3; о- C6H4CH3; 2,6 C6H3(CH3)2; C(C6H5)3; о- C6H4NO2; 2,4 - C6H3(NO2)2; С(О)Н; С(О) CH3; С(О)C6H5; СООН; СООСН3 ; СООС2Н5; СООСН2C6H5; трет- СООС(СН3)3; NH2; NH3+; NHСН3 ; NHС2Н5 ; NHС6Н5; NHC(O)СН3 ; NHC(O)С6Н5; NHC(O)OCH2С6Н5; N(СН3)2; N(С2Н5)2; N(СН3)3+; N=NС6Н5; NO; NO2; OH; OСН3; OС2Н5 ;OCH2 С6Н5; OС6Н5;OC(O)H; OC(O)CH3; OC(O)С6Н5; OS(O)CH3; OS(O2)CH3; F; SH; SCH3 ; S(O)CH3; S(O2)CH3; S(O2)OH; Cl; Br; I. Обозначение R (от латинского слова rectus – правый) получает тот из энантиомеров, в котором при рассмотрении модели со стороны, противоположной младшему заместителю, старшинство остальных заместителей падает по часовой стрелке. Падение старшинства против часовой стрелки соответствует S-обозначению (от латинского sinister – левый). R-бромиодхлорметан S-2-хлор-2-метилмасляная кислота 53

I 1

H

7

Сl

C

35

Br

Для углеводов, -гидроксикислот, -аминокислот, широко используют также D,L – систему, основанную на сравнении конфигурации рассматриваемого асимметричного центра с конфигурацией соответствующего энантиомера глицеринового альдегида. Исторически сложилось, что исходным для L и D-ряда органических соединений служит глицериновый альдегид (альдотриоза). СНО

СНО

Н  С ОН

НО  СН

СН2О

СН 2О

D-(+)-глицериновый альдегид

L-(-)-глицериновый альдегид

(правовращающий)

(левовращающий)

R-глицериновый альдегид

S-глицериновый альдегид

СОО-

СОО-

Н  С NН3+

+

СН3

Н3N  С Н СН3

D--аланин L--аланин S-аланин R-аланин []D20 = 14,2 (10г в 100 мл строения 6н Существуют также и другие системы для обозначения пространственного HCl) молекул. ГЛЮКОЗА

15

В природе встречается только D-глюкоза, которая выделена в виде двух анамеров -D- и -D-глюкопиранозы (соответственно формулы I и II). Первая кристаллизуется из воды при температуре ниже 30 С в виде моногидрата,  []D20 = +112,2. -аномер кристаллизуется из пиридина или некоторых других растворителей, []D20 = +18,9.Растворение кристаллов сопровождается таутомерными превращениями, за протеканием которых можно следить по изменению во времени величины оптического вращения. В водном растворе устанавливается динамическое равновесие между несколькими таутомерами - и -формами D-глюкофуранозы (формулы соответственно III и IV) и Dглюкопиранозы, открытой альдегидной (V) и ее гидратной формой (VI). В равновесном состоянии присутствует 38% -формы (формула I) и 62% -формы (формула ), содержание других таутомеров – менее 1%. Равновесное []D20 = +52,7. Самопроизвольное изменение величины оптического вращения свежеприготовленных растворов оптически активных соединений называется мутаротацией.

Самый устойчивый таутомер - -Dглюкопираноза в конформации кресла.

Однако вышеприведенные процессы не ограничивают круг всех возможных процессов в растворе глюкозы. Если наблюдать за растворами глюкозы достаточно длительное время, то можно обнаружить процесс изомеризации моносахаридов. Он протекает под действием разбавленных растворов щелочей, слабых органических оснований (пиридин, хинолин), анионитов, некоторых ферментов, в ряде случаев под действием кислот, например винной, уксусной, лимонной, разбавленной серной и др. Так, из D-глюкозы в 0,035%-ном растворе аОН при 35С за 100 часов образуется смесь, содержащая 57% исходной D-глюкозы, 28% D-фруктозы и 3% D-маннозы. СНО  НСОН  НОСН  НСОН  НСОН  СН2ОН

D-глюкоза

 

НСОН  СОН  НОСН  НСОН  НСОН  СН2ОН

 

СНО  НОСН  НОСН  НСОН  НСОН  СН2ОН

D-маннозы



СН2ОН  С=О  НОСН  НСОН  НСОН  СН2ОН

D-фруктоза

Эти реакции протекают одновременно, но с различными скоростями обычно самая быстрая – эпимеризация кетоз. Наиболее медленная реакция – превращение альдоз в кетозы. Основания – более эффективные катализаторы данных превращений, чем кислоты, причем действие гидроксидов Ва и Са более эффективно, чем гидроксидов а или К, а Са(ОН)2 оказывает более сильное каталитическое влияние, чем Ва(ОН) 2. Предполагается, что эти реакции протекают через стадию образования енола (в фигурных скобках).

16

Углеродные атомы в молекулах моносахаридов нумеруют таким образом, чтобы атом углерода карбонильной группы имел наименьший номер. Для глюкозы это группа СНО. Соответственно D-ряд гексоз обусловлен положением группы ОН при 5С. Сахароза Примером более сложных молекул являются дисахариды. Среды них шире всего распространена сахароза (свекловичный или тростниковый сахар). Химическое название D-глюкопиранозил--D-фруктофуранозид. Формула С12Н22О11, молекулярная масса 342,31, [D20 = +66,5º. Химическая структура представляет собой шестичленный цикл глюкозы соединенный кислородным эфирным мостиком с пятичленным циклом фруктозы (невосстанавливающий дисахарид) (Рис. А). Среди крупных молекул встречаются и другие случаи оптической изомерии (Рис.Б).

А

Б

17

Лабораторная работа №14 Количественное определение белка методом Лоури Цель работы ознакомление с наиболее распространенным методом количественного определения белка. ВВЕДЕНИЕ. Живые организмы имеют в своем составе свыше 70 микроэлементов. На долю углерода, водорода, кислорода, азота, фосфора, серы, кальция, натрия, калия, железа, йода приходится около 99.5 % всего массового содержания элементов в организме, на остальные более 60 элементов только 0.5 % и их называют микроэлементами. Химический состав живых организмов принципиально отличается от элементного состава неживых объектов, хотя иногда и удается теоретически проследить генетическую связь между живыми организмами и средой их обитания. Два щелочных иона Na+ и K+ и два щелочно-земельных иона Mg2+ и Ca2+ - все вместе составляют более 99% количества ионов металлов в теле человека. Все микроэлементы принимают участие в жизненно важных функциях, и их удаление приводит к нарушению гомеостаза организма. Среди одновалентных ионов особое внимание заслуживают натрий и калий, среди двухвалентных магний и кальций. Двухвалентные катионы в основном действуют, как вторичные мессенджеры или как кофакторы в различных биохимических реакциях. Около трети всех ферментов, как в клетках эукариот, так и прокариот, содержит ионы металлов в качестве кофакторов (киназ и др.), зачастую образуя инертный комплекс с тяжелым металлом, который и формирует активный центр фермента. Однако следует помнить что для функционирования практически всех биологических систем необходим определенный солевой фон (живые клетки поддерживают гомеостаз), то есть в живом организме почти все компоненты существуют в виде комплексов, обычно заряженных. Существует специальная наука: бионеорганическая химия (неорганическая биохимия), которая изучает комплексы ионов металлов с белками, нуклеиновыми кислотами, липидами и низкомолекулярными природными веществами. Бионеорганическая химия исследует роль этих ионов в выполнении биологических функций металлоферментов и других комплексов. Данные, характеризующие среднее содержание ряда металлов в организме человека, приведены ниже (г на 70 кг): Ca K Na Mg Fe Zn Cu Mn Mo Co Cr 1050 245 105 35 4,25 1,9 0,15 0,020 0,015 0,003 0,0015 Избыток или недостаток таких микроэлементов, как переходные металлы и селен, приводит к тяжелым патологиям.[Химическая энциклопедия. т.1, с.287, М.: "Советская энциклопедия",1988]. С целью систематизации химических взаимодействий, приводящих к образованию комплексных соединений, применяют принцип «жестких» и «мягких» кислот и оснований (ЖМКО). Этот метод разработан на основе исследований комплексообразования между катионами переходных металлов с органическими и неорганическими лигандами, которое удалось рассмотреть с позиций кислотно-основные взаимодействий. В соответствии с ним кислотно-основные взаимодействия протекают таким образом, что «жесткие» кислоты предпочтительно связываются с «жесткими» основаниями, а «мягкие» кислоты – с «мягкими» основаниями. При оценке «жесткости» и «мягкости» кислот и оснований учитывают их химический состав и электронное строение, а также сравнительную устойчивость образуемых ими кислотно-основных комплексов: А + :В ↔ А:В, где А – кислота Льюиса, :В – основание, А:В – кислотно-основной комплекс. Например:

18

Кислота Основание Кислотно-основной комплекс Н+ + ОН↔ Н2О СО2 + Н2 О ↔ Н2СО3 АlCl3 + Cl↔ [AlCl4]BF3 + (C2H5)2O ↔ (C2H5)2O:BF3 Zn(OH)2 + 2 OH↔ [Zn(OH)4]22S + S ↔ [S2]2Ag+ + 2 CN↔ [Ag(CN)2]«Жесткие» кислоты – акцепторы (принимают электроны) с низкой поляризуемостью, высокой электроотрицательностью, трудно восстанавливаются, их незаполненные граничные орбитали имеют низкую энергию; «мягкие» кислоты – акцепторы с высокой поляризуемостью, низкой электроотрицательностью, легко восстанавливаются, их свободные граничные орбитали имеют высокую энергию. «Жесткие» основания – доноры (отдают электроны) с низкой поляризуемостью, высокой электроотрицательностью, трудно окисляются, их занятые граничные орбитали имеют низкую энергию; «мягкие» основания – доноры с высокой поляризуемостью, низкой электроотрицательностью, легко окисляются, их занятые граничные орбитали имеют высокую энергию. Самая «жесткая» кислота – протон, самая «мягкая» - CH3Hg+; наиболее «жесткие» основания F- и ОН- , наиболее «мягкие» I - и Н-. Сопоставление устойчивости кислотно-основных комплексов для различных оснований по отношению к Н+ и CH3Hg+, а также для кислот по отношению к F- и I- позволило разделить известные кислоты и основания на группы. Группы кислот и основания. «Промежуточные» «Мягкие» Кислоты + + + + 2+ 2+ 2+ 2+ H , Li , Na , K , Be , Mg , Ca , Fe , Co2+, Ni2+, Cu2+, CH3Hg+, Cu+, Ag+, Au+, Sr2+, Al3+, Ga3+, Cr3+, Ln3+, Si4+, Zn2+,Pb2+,Sn2+, Bi3+, Hg+,Hg2+, Pt2+, Pt4+, BH3, 4+ 4+ 4+ 3+ Ti , Zr , Th , BF3, AlCl3, AlH3, Rh , B(CH3)3, SO2, Ga(CH3)3, R+, RSe+, RTe+, I+, RCO+, CO2, NC+, Hhal. NO+, R3C+, C6H5+ Br+, RO+, I2, Br2, ICN, карбены, тринитробензол, хиноны. Основания H2O, OH-, CH3COO-, ROH, RO-, C6H5NH2, C5H5N, N3-, H-, I-, CN-, CO, R3P, (RO)3P, 2R2O, NH3, RNH2, N2H4, F , Cl , NO2 , SO3 , Br , R3As, R2S, RSH, RS-, SCN-, 232ClO4 , CO3 , PO4 , SO4 . S2O32-, R-, C2H4, C6H6, «Жесткие»

Предпочтительное связывание «жестко-жестких» и «мягко-мягких» реагентов в рамках теории возмущения объясняется тем, что взаимодействие между орбиталями с близкой энергией более эффективно, чем между орбиталями, разнящимися по энергии, то есть подчеркивается преимущество электростатического («жестко-жесткого») или ковалентного (мягко-мягкого») взаимодействия. Принцип ЖМКО используют для учета специфических взаимодействий и особенностей протекания конкурирующих процессов, для направленного создания экстрагентов, детоксикантов, лекарственных препаратов, а также объяснения связывания металлов в биохимических и геологических объектах. Принцип сформулирован Р.Пирсоном в 1963 году. Принцип ЖМКО позволяет описывать широкий круг реакций с позиций кислотноосновного взаимодействия, в том числе реакции комплексообразования и образования металлоорганических соединений (соединения содержащие связь Ме-С). Однако следует знать, что принцип ЖМКО не является абсолютным, каждая пара веществ взаимодействует в соответствии со своими индивидуальными особенностями, что позволяет существовать применяемым в аналитической химии высокоспецифическим

19

реагентам применяемым для селективного определения веществ (Fe2+ - о-фенантролин; Ni2+ - диметилглиоксим и др.) Количественно стабильность комплексов описывается с помощью ступенчатых констант образования (устойчивости) – К. М + А ↔ МА К1 = [МА]/[М][А] МА + А ↔ МА2 К2 = [МА2]/[МА][А] МАn-1 + А ↔ МАn Кn = [МАn]/[МАn-1][А] Можно пользоваться полными константами образования – β: М + А ↔ МА β1 = К1 = [МА]/[М][А] М + 2А ↔ МА2 β2 = К1∙К2 = [МА2]/[М][А]2 М + nА ↔ МАn βn = К1∙К2 … Кn = [МАn]/[М][А]n Константы βn и Кn – термодинамические характеристики устойчивости комплекса в растворе. Величины, обратные βn или Кn называются константами диссоциации или нестойкости. Различают термодинамическую стабильность комплексных соединений – меру возможности образования комплекса или его превращения в другие соединения в равновесных условиях – и кинетическую, описывающую скорость реакций комплексов, ведущих к достижению равновесия. Термодинамическая стабильность комплекса характеризуется терминами «устойчивый», «неустойчивый», кинетическая – терминами «лабильный» и «инертный». Если при комнатной температуре реакция комплекса протекает за время смешения реагентов (около 1 минуты), комплекс относят к лабильным. Если реакция протекает с измеримой скоростью и половина времени жизни комплекса более двух минут, то такие комплексы называют инертными. Например наблюдается резкое различие в константах скорости изотопного обмена молекул воды во внутренней координационной сфере для инертного комплекса [Cr(H2O)6]3+и для лабильного [Ni(H2O)6]2+. Работа практически всех ДНК-специфичных ферментов - рестриктазы, ДНК и РНК полимеразы, топоизомеразы и т.д. зависит от ионов Сa2+, Mg2+, Zn2+. Так в тимоцитах крыс существует 3 вида эндонуклеаз: α, β, γ. Из них α и β- эндонуклеазы не требуют для работы двухвалентных ионов. Для γ- эндонуклеазы, играющей главную роль в процессах апоптоза, нужны ионы Сa2+ (3 ммоль) и Mg2+(3 ммоль), в то время как ионы Zn2+ (0.04 ммоль) ингибируют её деятельность. Известно семейство низкомолекулярных (6.5 кДа) металлосвязывающих белков металлотионеинов, локализованных, как правило, в цитоплазме и обнаруживаемых также в клеточном ядре. Особенностью их строения являются высокое содержание цистеина (20 из 61 аминокислоты), который является мягким основанием, и отсутствием ароматических аминокислот и гистидина. Металлотионеины осуществляют неспецифическую защиту, участвуя в метаболизме и детоксификации тяжёлых металлов, как необходимых организму (цинк, медь), например при средних концентрациях 10 -7-10-8 М (для меди 10-12 М) для водорослей, так и токсичных при концентрациях металлов, превышающих в среднем на 2 порядка оптимальные для нормального развития организмов концентрации. Синтез металлотионеинов в клетках млекопитающих легко индуцируется различными воздействиями: ионами тяжёлых металлов (Zn2+, Cu2+, Cd2+, Be2+, Mn2+, Hg2+, Au+, Ag+, Co2+, Ni2+, Pt2+), стероидными гормонами, цитотоксическими химическими соединениями, цитокинами, липополисахаридами, факторами роста, ионизирующим излучением и т.д. В молекулах белка (или других биологических молекулах) имеются четыре главных типа донорных атомов в лигандах: кислород, алифатический азот, ароматический азот, сера. Все ионы щелочных, щелочноземельных и лантаноидных металлов, Mn2+, Be2+, Al3+, Cr3+, Fe3+ (жесткие и промежуточные кислоты) предпочитают взаимодействовать с кислородом и алифатическим азотом; ионы Zn2+, Pb3+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Fe2+ (промежуточные кислоты) с ароматическим азотом и с серой цистеина; ионы Cd2+, Hg2+, Tl+, CH3Hg+ (мягкие кислоты) с серой. Обратим внимание, что такая классификация условна и речь скорее идёт о предпочтении в связывании металлов с тем или иным донором в соответствии с принципом ЖМКО. Подобный подход справедлив и при рассмотрении биологически активных соединений.

20

Ионы натрия и калия участвуют в поддержании необходимого мембранного клеточного потенциала и осмотического давления клетки за счёт работы натрий-калиевого АТФ-азного насоса клетки. Магний Мg2+ широко распространён в тканях и является фактором активации АТФаз, как для клеток эукариот, так и для клеток прокариот. После калия магний является следующим наиболее распространённым внутриклеточным неорганическим катионом, но в отличие от калия он осмотически не свободен, а связан влабильные комплексы. Магний является мембранным и рибосомным стабилизатором, играя роль противоиона для полианионов, таких как липиды или ДНК, имеющей отрицательно заряженные фосфатные группировки в каждом звене цепи. Его присутствие увеличивает вероятность правильного спаривания звеньев в молекуле ДНК, при этом магний способен сохранять часть гидратной оболочки, он также необходим для работы ДНК-полимеразы. Ион Мg2+ участвует в работе NMDA рецептора нервных клеток. В больших дозах (2 мкМ) он блокирует некоторые типы К+ каналов в сердечных и скелетных мышцах, яйцеклетках. В прокариотических клетках существует порядка трёх транспортных систем для ионов магния. Цитоплазматический уровень ионов Ca2+ в прокариотических и эукариотических клетках около 100 пМ, и увеличивается при стимуляции специфичных рецепторов. В эукариотических клетках показано два типа передачи сигналов с участием ионов Са 2+. Первый относится к электрически активным клеткам и связан с секрецией нейромедиаторов при поглощении ионов Са2+ нервными окончаниями при деполяризации плазматической мембраны. Второй, инозитолфосфатный, проявляется во всех клетках эукариот и связан с высвобождением Са2+ из внутриклеточных хранилищ при взаимодействии сигнальной молекулы с рецептором клеточной мембраны. При его высвобождение из них, он в комплексе с кальмодулином активирует протеинкиназы, способные к фосфорилированию белков или влияет на механизмы действия другого внутриклеточного посредника цАМФ (циклический аденозинмонофосфат). Ионы Zn2+ являются необходимыми компонентами более 100 ферментов, например, таких как дегидрогеназа, карбоангидразы, щелочная фосфатаза. Они участвуют в метаболизме нуклеиновых кислот и клеточном делении, поскольку необходимы для работы ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, ревертазы, являются блокаторами эндонуклеаз и т.д.. Некоторые белки,, принимающие участие в регуляции генов, содержат образования, называемые “цинковыми пальцами”, в которых 30 аминокислот сложены в одну структурную единицу вокруг атома цинка, связывающего два остатка гистидина и два остатка цистеина. В основе многих физиологических клеточных процессов, в особенности для нервных клеток, лежит работа ионных каналов биологических мембран. Ионные каналы – это интегральные белки (гликопротеиды), пронизывающие липидный бислой мембраны и способные при адекватных внешних воздействиях избирательно менять проницаемость мембран для определённых ионов - Na+, K+, Ca2+, Cl-. Поступление металлов зависит от перепада градиента концентрации через клеточные мембраны. Анионы в клетке представлены в основном ионами Сl-, HCO3-, Н2PO4- и НPO42-(при рН 7), белками, нуклеиновыми кислотами, метаболитами, несущими фосфатные и карбоксильные группы и т.д. Наличие хлорных каналов указывает на важную роль аниона хлора Cl- в жизнедеятельности животных клеток, при этом средняя концентрация ионов Cl - внутри животной клетки 5-15 мМ, вне 110 мМ. Формирование трансмембранных ионных градиентов используется клетками для осуществления различных транспортных процессов, например, сахаров и аминокислот, синтеза АТФ и т.д. У бактерий и растений большинство систем активного транспорта, приводящихся в действие ионными градиентами, используют в качестве котранспортируемого иона H+, а не Na+, как клетки животных. Как уже упоминалось, из всех катионов в клетке явно преобладают натрий, калий, кальций и магний (см. таблицу), причём поскольку ионы кальция Са 2+ служат внутриклеточным посредником в разнообразных клеточных реакциях, включая секреторные процессы и пролиферацию, то концентрация свободных ионов Са2+(активность) в цитозоле клетки очень низка (порядка 10-7 М), по сравнению с содержанием его во внутриклеточных компартментах и во внеклеточной жидкости 10-3 М для клеток эукариот. Внутриклеточная

21

концентрация ионов Мg2+ в животной клетке 0.5 мМ в свободном состоянии и 20 мМ в связанном с белками и другими веществами Что касается остальных микроэлементов в частности металлов, то большая их часть находится в связанном состоянии, например с белком, и количество свободных ионов всех остальных металлов незначительно. Например в щитовидной железе человека накапливается йод, в виде йодсодержащей аминокислоты – тироксина. При недостатке этого элемента может развиваться кретинизм или зоб, которые раньше были широко распространены в некоторых континентальных районах Земли. Селен необходим для зрения и накапливается в зрительных органах. Однако при избытке селена поступающего с пищей, он начинает замещать серу в метионине с образованием селенометионина. Все микроэлементы в живых организмах можно рассматривать как образующие инертные комплексные или элементорганические соединения. В свою очередь для качественного и количественного определения или выделения органических веществ из биологических сред широко применяют методы основанные на комплексообразовании исследуемых молекул со специально вводимыми катионами. Для количественного определения белков широко используется метод Лоури. В основе двустадийной реакции, описанной Лоури, лежит восстановление реактива Фолина комплексом, образующимся при взаимодействии белка с ионами меди в щелочном растворе. Реактив Фолина представляет собой кислый раствор гетерополикислоты. Гетерополикислоты получают в водных растворах, по реакции t H3PO4 + 12Na2MoO4 + 12H2SO4  H3[PMo12O40] + 12Na2SO4 + 12 H20 причем  в состав гетерополикислоты совместно входят Мо и W. Гетерополикислоты и их некоторые соли хорошо растворяются в воде и кислородсодержащих органических растворителях. Из водных растворов выделяются в виде кристаллогидратов H3PO4·12(Mo,W)O3·nH2O, где n-порядка 30. Они сравнительно устойчивы в кислых и нейтральных водных растворах, однако разлагаются в щелочной среде. Соли меди в щелочных растворах образуют осадки гидроокиси Cu(OH)2. Причем произведение растворимости для этого осадка [Cu2+][OH-]2 = 8,3·10-20. Чтобы удержать ионы меди в таком растворе следует применять специальные добавки: соли лимонной (цитрат) или винной (тартрат) кислот. Ионы меди в этих условиях образуют с цитрат-ионом заряженные комплексы при соотношении 1:1, с константой устойчивости lg К1= 5,90. Щелочные медьсодержащие растворы способны вступать в химическую реакцию с растворенным белком с образованием окрашенных в синий цвет продуктов реакции (комплексные соединения меди с белком). Ниже приведена одна из возможных структур этих продуктов реакции. Гетероциклические аминокислоты типа гистидина и триптофана, а также тиоаминокислоты будут образовывать конечно структуры с другой координацией. Эта реакция называется биуретовой и может применяться для качественного и количественного определения белка в растворе. Предел обнаружения белка для этой реакции составляет (1 – 2) мг/мл. Н2NCH(R1)CONHCH(R2)CONHCH(R3)CONHCH(R4)COOH NaOH  Н2NCH(R1)C(O-)=NCH(R2)C(O-)=NCH(R3)C(O-)=NCH(R4)COO O C  C

R4HC

NaOH  Cu (OH ) 2

  -

OC

O N Cu

R3HC

H N H

CHR1 N

N C O

COCHR2

22

Процесс взаимодействия реактива Фолина с белковым медьсодержащим комплексом распадается на две стадии. На первой быстропротекающей стадии при смешении кислого раствора реактива Фолина с щелочным белковым раствором наблюдается разрушение гетерополикислот и образование неких соединений содержащих Мо(VI), W(VI) и белок. На следующей, медленно протекающей стадии восстановления Мо(VI) и W(VI) за счет двойных связей белковой молекулы, наблюдается развитие окраски. (Бензольное кольцо тирозина по своей природе является восстановителем). Продукты восстановления окрашены в синий цвет за счет образования Мо(V) и W(V), например молибденовая синь Мо2О5·3МоО3. Интенсивность окраски, образующейся в результате завершения реакции Лоури, пропорциональна концентрации белка в пробе. Нижний предел обнаружения в этом случае снижается вплоть до 10 мкг/мл. Однако образующаяся окраска неустойчива и постепенно исчезает. Следует также принимать во внимание что наличие некоторых веществ препятствует применению реакции Лоури на практике. Например наличие сульфата аммония свыше 0,15 % мешает развитию окраски (на биуретовую реакцию не влияет), а присутствие соединений ЭДТА приводит к образованию окрашенных продуктов без всяких белков. Любая пептидная связь обладает поглощением света, особенно в УФ диапазоне. Некоторые аминокислоты, особенно содержащие ароматические остатки, усиливают окраску пептида и сдвигают ее в видимую область. Полный гидролиз белков снижает окраску (например у альбумина) более чем на 2/3. К такому же эффекту приводит расщепление дисульфидных связей, например путем окисления надмуравьиной кислотой (в плазмине общая интенсивность окраски снижается примерно на 1/3). За поглощение света в зависимости от длины волны отвечают разные участки белковой молекулы. ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ. 1. Спектрофотометр СФ-26 ("Спекол-10"). 2. Термостат. 3. Колбы, пипетки и пр. РАСТВОРЫ И РЕАКТИВЫ. 1. Реактив А: 2 % раствор Na2CO3 в 0,1 н растворе NaOH. 2. Реактив В: 0,5 % раствор CuSO4·5H2O в 1% растворе цитрата или тартрата натрия. 3. Реактив С: 50 мл реактива А смешивают с 1 мл реактива В (готовить непосредственно перед использованием). 4. Реактив Фолина: 100 г Na2WO4·2H2O и 25 г Na2МоO4·2H2O растворяют в 700 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл 85 %раствора ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной HCl. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 часов. В охлажденную смесь добавляют 150 г Li2SO4, 50 мл воды и несколько капель брома. Избыток брома удаляют кипячением смеси в течение 15 минут. Полученный раствор охлаждают, фильтруют и разбавляют дистиллированной водой до 1 л. Реактив разводят водой так, чтобы его кислотность была равна 1 н ,и используют для проведения реакции. 5. Стандартный раствор альбумина - 200 мкг/мл. 6. Раствор белка неизвестной концентрации. 7. Раствор 0,01 ssc. ХОД РАБОТЫ. 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего от 20 до 80 мкг белка, смешивают с 2 мл реактива С и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Затем приливают 0,2 мл реактива Фолина, смесь энергично перемешивают и пробы оставляют при комнатной температуре на 40 минут в темноте. Интенсивность развившейся синей окраски измеряют при 750 нм относительно контрольной пробы. Одновременно с опытными образцами той же обработке подвергают стандартные пробы и контрольную пробу, содержащую вместо раствора белка равный объем дистиллированной воды (см. таблицу).

23

ТАБЛИЦА. Состав проб: №№ проб

Содержание белка в пробе мкг

Конт. 1 2 3 4 5

20 40 60 80 Неизв. конц.

Объем стандартного раствора белка, мл 0,1 0,2 0,3 0,4 0,4

Объем воды, мл

Объем реактива С, мл

0,4 0,3 0,2 0,1 -

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Объем реактив а Фолина, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Показания СФ

Построить по результатам измерений калибровочную кривую (зависимость оптической плотности от концентрации альбумина) и по ней определить неизвестную концентрацию белка. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ. 1. Методы определения концентрации белков, пределы их измерения и чем обусловлены эти ограничения? 2. Можно ли определять концентрации других белков по калибровочной кривой, полученной по раствору альбумина? 3. Почему полный гидролиз белков снижает окраску более, чем на 2/3? 4. Что такое координационная связь, координационное число? Как зависит координационное число от валентности атомов? 5. Что такое орбитали s, p, d, f и чем они отличаются друг от друга? 6. Эффект расщепления уровней. Зависимость магнитных (диамагнитнитизм или парамагнетизм) свойств, окраски соединений от характера координационной связи. 7. Для каких ионов наиболее характерно образование координационной связи? Что такое гибридизация? Гибридизация sp3, dsp2. 8. Лабильные и инертные комплексные соединения. 9. Какие элементы наиболее часто входят в состав ферментов? Приведите примеры. 10. Особенности биологических молекул выступающих в качестве лигандов. 11. Почему реакцию с реактивом Фолина следует проводить в темноте? 12. Для чего нужен реактив С? Что произойдет с окраской раствора, если реактив Фолина добавить без реактива С? ЛИТЕРАТУРА. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Методы вирусологии и молекулярной биологии. - М.:Мир,1972. Дж. Бейли. Методы химии белков. - М.:Мир,1965. Р.Скоупс Методы очистки белков. - М.:Мир,1985. Б.Албертс Молекулярная биология клетки. т.1 - М.:Мир,1993. М.В.Волькенштейн Биофизика. - М.:Наука,1989. А.Ленинджер Основы биохимии. - М.:Мир,1985. Н.Л.Глинка Общая химия. – Л.:Химия,1988. Н.Л.Глинка Задачи и упражнения по общей химии.  М.Интеграл-пресс,1997.

24

Кварц Любой кристалл можно рассматривать как одну большую молекулу. В частности окись кремния SiO2 образует кристалл, сложенный из тетраэдров SiO4. Одна из возможных модификаций (кварц) обладает оптической активностью, несмотря на то, что их кристаллы сложены из совершенно одинаковых молекул. По отношению к поляризованному свету различают две разновидности кварца. Кристаллы одной из них – правовращающего кварца – вращают плоскость поляризованного света вправо, когда свет проходит в направлении главной кристаллографической оси, а кристаллы другой разновидности – левовращающего кварца – влево (примерно на 22о/мм для желтого цвета). Следовательно, кварц является оптически активным веществом. Кристаллы этих двух разновидностей кварца различаются также по небольшим трапезоидным площадкам (S), которые появляются у правовращающего кварца справа, а у левовращающего – слева. Вследствие асимметрии этих площадок кристалл правовращающего кварца не совмещается с кристаллом левовращающего кварца. Эти кристаллы относятся друг к другу, как предмет к своему зеркальному изображению (энантиоморфные формы). Получение энантиомеров. Простейшим способом получения чистых антиподов является их выделение из реакционных смесей, даже рацемических - расщепление. 1. Из природных живых организмов сразу выделяются оптически активные соединения, поскольку живые организмы синтезируют и используют обычно только один из двух возможных энантиомеров. 2. Самым первым и простым способом расщепления является кристаллизация. Несмотря на одинаковые физические константы (кроме вращения плоскости поляризации) иногда, но достаточно редко, удается разделить при кристаллизации рацемат на энантиомеры. Например, кристаллизацией натрийаммонийтартрата удается получить смесь кристаллов двух видов, которую можно разделить вручную, получив чистые энантиомеры солей винной кислоты. 3. Другой подход заключается в селективном разрушении одного из компонентов рацемата. В частности, грибок Penicillium glaucum, внесенный в смесь винных кислот, уничтожает только D-(+)-изомер. 4. Чаще всего расщепление рацемата проводят с помощью оптически активных реагентов, которые обычно выделяют из природного биологического сырья. Действуя на рацемическую смесь (D,L)-изомеров соединением L', получаем продукты DL' и LL'. Эти соединения уже не являются зеркальными антиподами (ими были бы DL' и D'L). Поэтому физико-химические свойства DL' и LL' различаются, и можно разделить эти соединения, например, кристаллизацией. Существует стандартный подход к разделению рацемической кислоты (±)-НА с помощью сложных органических оснований (алкалоиды, выделяются из некоторых растений) - кокаин, морфин, стрихнин, хинин и т.п. При их взаимодействии с кислотой образуются хорошо кристаллизующиеся соли. Проведением фракционной кристаллизации можно выделить чистые оптически активные фракции, из которых с помощью сильных минеральных кислот осаждаются слабые органические кислоты в виде (+)- или (-)-изомера. Для разделения рацемических оснований следует использовать оптически активную кислоту, например, молочную. Для разделения спиртов приходится проводить их химическую модификацию, с образованием кислот. Например, реакция спирта с фталевым ангидридом, приводит к образованию алкилфталата, который уже и реагирует с алкалоидом.

25

5. Из природных оптически активных соединений можно получить другие оптически активные соединения. Примером может служить важный в промышленности многостадийный синтез L-аскорбиновой кислоты (витамина С) из D-глюкозы или L-сорбозы; в его ходе перед стадией окисления четыре группы ОН защищают, превращением в ацетали, реакцией с ацетоном. Ацеталь содержит группировку (СН3)2С(ОR)2. Ацетали устойчивы в щелочных средах и очень легко гидролизируются в кислых. Поляризация света. Плоскополяризованную световую волну можно представить как комбинацию левого и правого поляризованных по кругу лучей с соответствующими векторами E l и Er. Если взаимодействие левого и правого поляризованных по кругу лучей со средой одинаково (это характерно для изотропных сред), то векторы имеют одинаковые величины (рис.a). Когда поляризованный свет проходит через анизотропную (хиральную) среду, то один из этих лучей распространяется быстрее другого, в результате чего суммарный вектор оказывается повернутым на некоторый угол , nl > nr nl = nr тем больший, чем больше разность скоростей   =  a б l = r l r распространения света в среде, то есть показателей преломления nl и nr лучей, поляризованных по кругу влево и вправо. Это явление называется двойным круговым (циркулярным) лучепреломлением . Левый и правый поляризованные по кругу лучи по-разному поглощаются средой, то есть l  r, где l и r - коэффициенты экстинции для лучей nl = nr nl  nr с левой и правой круговой поляризацией. l  r l  r Суммирование соответствующих им векторов в г неравной величины El и Er дает результирующий вектор, конец которого описывает эллипс (рис. в), то есть плоскополяризованный свет после прохождения через хиральную среду становится эллиптически поляризованным. Это явление называется круговым дихроизмом. Количественной мерой этого явления служит угол эллиптичности , тангенс которого равен отношению осей эллипса. Поскольку угол  очень мал по величине, то принимают tg    и, проводя преобразования, получают  = ·l/·(l - r) в радианах, где  - длина волны падающего света в вакууме, l - толщина слоя в см. Так как оба явления - двойное круговое лучепреломление и круговой дихроизм происходят одновременно, то суммарный эффект прохождения плоскополяризованного света через хиральную среду описывается эллипсом с вращающейся главной осью (рис.г). Для характеристики оптически активных веществ методом поляриметрии используют величины удельного и молярного оптического вращения . Величины оптического вращения зависят от длины волны применяемого света. Эта зависимость называется дисперсией оптического вращения. Поглощение и показатель преломления. Предположим, что монохроматическое излучение направлено через тонкую пластинку толщиной у (Рис. 1). Здесь нас интересует амплитуда электрического поля прошедшей волны на расстоянии у от пластины. Поскольку наблюдаемое в момент t электрическое поле на расстоянии у образовалось ранее при колебаниях зарядов (электроны, протоны и т.п.) в пластине в момент [t-(y/c)] (где с - скорость света в вакууме), то очевидно,

26

что если пластина никак не влияет на падающее излучение, то выражение для напряженности электрического поля (Е) на расстоянии у можно записать в виде: Е(в точке у) = Ео соs[ (t - y/c)] = Re {Eo exp[ i (t - y/c)]} Однако если скорость движения волны уменьшается при прохождении пластины, то из обычного определения показателя преломления n’ n =

скорость света в вакууме скорость света в пластине

следует, что после прохождения пластины волна уже будет запаздывать на время t = (n - 1)(y) / c так что выражение для электрического поля в точке у теперь примет вид: Е(в точке у) = Ео соs{ [t - (n - 1)(y)/c - y/c]} = Re{Eo exp{ i[t - (n - 1)(y)/c - y/c]}} = = Re{exp[- i(n - 1)(y)/c] Eo exp[i (t - y/c)]} влияние показателя электрическое поле создаваемое волной преломления n 1 если пластина отсутствует. Это уравнение показывает что с помощью комплексной системы обозначения легко выделить член описывающий поведение волны при отсутствии преломления и член определяющий уменьшение скорости света при прохождении через среду. Во время прохождения волны через пластинку кроме уменьшения скорости будет наблюдаться уменьшение dI интенсивности I. Для достаточно тонкой пластины можно ожидать что изменение интенсивности пропорционально интенсивности падающего света толщине пластины dу и концентрации поглощающих молекул m (в молях на литр) dI = - k I m dy  где k - константа пропорциональности характерная для данного вещества. Это уравнение в интегральной форме известно как закон Бера ln (I /Io) = - k m y «Пропускание» = I /Io = 10-(k m y/2303) = 10- m y = 10-D = e-(2303  y N/N°) где  называют молярным коэффициентом погашения (молярным коэффициентом экстинкции) Io - интенсивность падающего на пластину света D - поглощение или оптическая плотность N - число молекул в 1 см3 и Nо - число Авогадро. Поскольку интенсивность электромагнитного излучения пропорциональна квадрату амплитуды электрического поля прошедшей через пластину волны и, кроме того, (е-х)½ = е-х/2 то уравнение можно теперь дополнить включением в него члена описывающего поглощение энергии: Е(в точке у) = exp[-2303  (y) N/2No] Ео соs{ [t - (n - 1)(y)/c - y/c]} = =Re {exp[-2303  (y) N/2No] exp[- i(n - 1)(y)/c] Eo exp[i (t - y/c)] влияние показателя электрическое поле создаваемое волной преломления n 1 если пластина отсутствует. Рассмотрение первых двух множителей вышеприведенного уравнения показывает что значительная экономия при записи может быть достигнута путем введения комплексного «показателя преломления» n, описывающего оптические свойства среды, в которой распространяется излучение: n = n - in Его вещественная часть n равна отношению скорости электромагнитного излучения в вакууме к фазовой скорости излучения в данной среде, мнимая часть n - показатель поглощения (часто обозначается как æ) – характеризует уменьшение интенсивности излучения в среде в результате поглощения.

27

Показатели преломления и поглощения среды являются функциями частоты, а в случае анизотропных сред они зависят и от направления распространения излучения. В этом случае они будут тензорами второго ранга Тогда уравнение упрощается: Е(в точке у) = Re{exp[-i (n - 1)(y)/c] Eo exp[i (t - y/c)]} где n = 2303 c N  /2  No В этом модернизированном уравнении «мнимая» часть n комплексного «показателя преломления» n прямо пропорциональна молярному коэффициенту погашения для поглощения энергии веществом, в то время как «действительная» часть n комплексного «показателя преломления» является обычным показателем преломления. Вышеизложенное решение основано на допущении, что электромагнитная волна замедляется, и что ее энергия частично теряется при прохождении через тонкую пластину вещества. Если же мы теперь предположим, что заряды (электроны, протоны и т.п.) в веществе ведут себя подобно пружинкам под действием возбуждающих и тормозящих сил при внесении в переменное электрическое поле падающей электромагнитной волны, то легко понять, почему энергия поглощается веществом. Ответ заключается в том, что энергия растрачивается на преодоление сил трения при возбуждении колебаний пружины. Значительно труднее понять, почему падающая волна замедляется, и ответ на этот вопрос несколько выходит за рамки обсужденного материала. Для этого требуется провести расчет напряженности электрического поля, возникающего в месте нахождения отдаленного наблюдателя в результате одновременного когерентного вынужденного движения равномерно распределенных в пластине зарядов на пружинках при наличии тормозящих сил. Оказывается, что результирующее электрическое поле, образованное от всех этих пружин (в предельном случае очень тонкой бесконечной пластины) может быть записано очень просто в виде синусоидальной волны, которая на 90 не совпадает по фазе с падающей волной. Поэтому в результате суммирования электрического поля этой рассеянной волны и падающего (возбуждающего) электрического поля также должна образовываться синусоидальная волна, фаза которой в общем случае отличается от фазы падающей волны.

Рис.1 Взаимосвязь рассеяния вперед и преломления.

28

Волна I после прохождения через тонкую пластинку вещества ослабляется и сопровождается рассеянной вперед волной S, которая смещена относительно нее по фазе на 90°. Эту рассеянную вперед волну можно рассматривать как сумму всех элементарных волн W, рассеянных частицами в пластинке. Результирующая волна R образуется при сложении падающей и рассеянной вперед волн. Она слегка отстает по фазе. Здесь опущен математический аппарат, имеющий отношение к предыдущим рассуждениям и рисунку, поскольку он служит только для нахождения константы пропорциональности в N q2 n 1  2 , n  n '  in " ( o   2 )  if 2 o m уравнении: Где ωо- собственная резонансная частота колебаний частиц пластинки, ω- циклическая частота поля падающей волны, f- коэффициент «трения» среды , q- заряд электрона, N- число молекул в единице объема, εо- диэлектрическая проницаемость и m- масса электрона (или иного заряда). Строго говоря, даже единичный атом может иметь много дискретных "собственных" частот ωо, так что на практике для оценки (n-1) необходимо в правую часть уравнения включить сумму многих членов, соответствующих разным ωо. Зависимость показателя преломления n' и молярного коэффициента погашения ε (который пропорционален n") от частоты приведена ниже на Рис.II. Рис.2 Зависимость показателя поглощения n" и показателя преломления n' [отложена отрицательная величина -(n' - 1)] от длины волны падающего электромагнитного излучения 0,6

5M NaCl

n" (ж )

чистая вода

0,4

0,2

0 5M NaCl -0,2

-0,4

-0,6

чистая вода

кристалл NaCl

-(n' - 1) -0,8 0,1

1

10

100

Длина волны, мкм

Происхождение терминов «поглощение» и «дисперсия» теперь очевидны n"пропорционален молярному коэффициенту поглощения и n - показателю преломления, изменение которого приводит к «дисперсии» (разложению) белого света на цветные компоненты при прохождении через призму. Большая часть применений показателя преломления или оптической плотности основаны либо на измерениях n' и n" (или чаще ε) в зависимости от (возбуждающей) частоты падающего света либо на использовании n' или n" для измерения числа центров рассеяния в единице объема  (или, чаще,концентрации поглощающих молекул).

29

Техника измерения. Оптическое вращение измеряют с помощью поляриметра. Луч источника света (натриевой или ртутной лампы) при прохождении через поляризатор - призму Николя или пленки - поляризуется в плоскости. Поляризованный свет пропускается через кювету с веществом и попадает в анализатор (тоже призма Николя). Если плоскость поляризации обеих призм расположены друг относительно друга под прямым углом, то поляризованный свет в отсутствии оптически активного вещества через анализатор не проходит. Чтобы поляризованный свет не проходил через анализатор после помещения в прибор оптически активного вещества, анализатор необходимо повернуть на некоторый угол вправо или влево. Этот угол и представляет собой и наблюдаемое оптическое вращение, которое затем пересчитывается в удельное  или молярное вращение . Приборы. 1. Поляриметр круговой СМ-2. Основная погрешность поляриметра в диапазоне измерений от 0 до ±35° составляет ±0,04°. Источник света – лампа ДНАС 18-04.2 (натриевая лампа, основная линия излучения (D) равна 589,3 нм). Измерения следует начинать не ранее чем через 10 минут после включения лампы поляриметра. 2. Автоматический поляриметр фотоэлектронный А1-ЕПО. Основная погрешность измерений от 0 до ±25º составляет ±0,01º. Измерения следует начинать не ранее чем через 30 минут после включения прибора. Источником света служит натриевая лампа. Оборудование. 1. Набор кювет 25 мм (2,5 мл); 50 мм (5 мл); 100 мм (10 мл). На трубке кюветы отгравирована ее фактическая длина в мм между торцами. 2. Две контрольные поляриметрические кварцевые пластинки, предназначенные для проверки поляриметра, на них также отгравированы фактические углы вращения, а именно –21,137º и +21,250º. 3. Аналитические весы ВЛР-200. 4. Пипетки, колбы. Растворы и реактивы. Способы выражения концентрации Молярность (М) - количество молей растворенного вещества содержащегося в 1 литре раствора. Массовый процент (с) - количество граммов растворенного вещества содержащегося в 100 г раствора. Эмпирическая зависимость между концентрациями, с учетом изменения плотности раствора от концентрации, исходя из данных (Справочник химика. 2-е изд. Л.Химия, 1964. Т.3. с.575.) для 20 оС, выглядит следующим образом Сахароза М = 0,0291745 х + 0,000110479 х2 + 0,000000496462 х3 (0 - 20 масс.%) Глюкоза М = 0,0554168 х + 0,000208617 х2 + 0,000000847472 х3 (0 - 30 масс.%)

30

Рабочее задание. 1. Ознакомиться с прибором - поляриметром, измеряющим угол поворота плоскости поляризации образца. Понять сущность его работы. 2. Обнаружить вращение плоскости поляризации у выданных растворов. Продемонстрировать линейную зависимость между углом поворота и концентрацией оптически активного вещества. Определить неизвестную концентрацию. Порядок выполнения работы. 1) Определение нулевого отсчета производят в кювете, наполненной дистиллированной водой. Следует следить за отсутствием пузырей воздуха на пути светового луча. В случае работы на СМ-2, вращением втулки наблюдательной трубки устанавливают окуляр по глазу на резкое изображение линии раздела полей сравнения. После этого поворачивают анализатор и добиваются равенства яркостей полей сравнения в чувствительном положении. Измерение следует повторить не менее 5 раз и вычислить среднее арифметическое. Полученное значение является нулевым отсчетом. 2)Провести измерения с двумя контрольными поляриметрическими кварцевыми пластинками. Поправка на температуру, отличную от стандартной в 20 °С, рассчитывают по формуле: Dt = D20[1 + 0,000143(t – 20)] где t – установившаяся рабочая температура в измерительной камере, °С. D20 – значение угла вращения кварцевой пластинки при температуре 20 °С, град. :

Dt – значение угла вращения кварцевой пластинки при рабочей температуре, град.

После введения поправки на нулевой отсчет следует убедиться в правильности работы прибора. 3)Приготовить стандартные растворы (сахар или L-лизин). Для этого необходимо на аналитических весах взвесить пустую колбу, поместить в нее около 1 г вещества и взвесить, добавить еще 10 мл воды (или 5 мл при использовании кювет длиной в 50 мм) и опять взвесить. Взбалтыванием раствора добиться полного растворения (раствор должен быть прозрачным), рассчитать массовую концентрацию – с. Изготовить подобным образом второй раствор из 0,5 г вещества. 4)Заполнить кюветы стандартными растворами, провести измерения. Поскольку угол вращения плоскости поляризации прямо пропорционален длине кюветы и концентрации оптически активного вещества, то при использовании одинаковых кювет можно построить линейный калибровочный график зависимости угла вращения как функцию концентрации раствора  = f(с), проходящий через начало координат. 5) Заполнить кювету раствором с неизвестной концентрацией. Провести измерения и по углу вращения с помощью графика определить неизвестную концентрацию.

31

Контрольные вопросы. 1. 2. 3.

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Что обозначает термин «хиральность». L,D и R,S классификация для белков и углеводородов. Могут ли вещества быть оптически активными, если у них отсутствует асимметричный атом углерода? Живые организмы усваивают L-аминокислоты и D-углеводы. Почему в природе не накапливаются D-аминокислоты и L-углеводы? Какие живые организмы используют D-аминокислоты? Атом азота в аммонийных основаниях [NR1R2R3R4]+ ассиметричен. Почему основания [NR1R2R3Н]+ обычно не проявляют хиральных свойств, чем это вызвано? Что такое мутаротация, где в настоящей работе она встречается? Сколько оптических изомеров образует НООССН(ОН)СН(ОН)СООН - винная кислота? Объясните. Зависимость показателя преломления среды от частоты световых волн. Что такое фазовая и групповая скорость световых волн? Их зависимость от частоты света. Рассеяние Томпсона и Рэлея. Пространственная и временная когерентность световых волн. Определение возраста человека по измерению оптической активности биомолекул. Пределы измерения доз ионизирующей радиации методом определения оптической активности. Поляризованность света в природе. Четвертьволновые пластины и поляроидные пленки. От чего зависит угол поворота плоскости поляризации поляризованного света при прохождении через раствор, содержащий оптически активные биомолекулы? Способы измерения оптической активности биомолекул. Определение конформации белка методами ДОВ и КД. Список литературы.

1. 2. 3. 4. 5.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике. – М.: Мир, т.3-4. Волькенштейн М.В. Биофизика. – М.:Наука,1981. Моррисон Р., Бойд Р. Органическая химия.  М. Мир,1974. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.Мир, 1980. Маршелл Э. Биоорганическая химия. .  М. Мир,1981

32

Приложение 1. Свойства L--аминокислот

Название

Химическая структура

Сокращенное обозначение (рекомендуемое ИЮПАК)

Молярное вращение раствора в 5 н HCl [MD24-26]

Изоэлектрическая точка pI

pK

Моноаминомонокарбоновые кислоты Глицин

СН2(Н2)СООН

Gly (G)

-

5,97

Аланин

СН3СН(Н2)СООН

Ala (A)

13,0

6,00

Аминомасляная (некодируемая геномом)

СН3СН2СН(Н2)СООН

Abu

21,2

5,98

Валин

(СН3)2СНСН(Н2)СООН

Val (V)

33,1

5,96

Норвалин (некодируемая геномом)

СН3(СН2)2СН(Н2)СООН В белках отсутствует

Nva

28,2

Лейцин

(СН3)2СНСН2СН(Н2)СООН

Leu (L)

21,0

Норлейцин (некодируемая геномом)

СН3(СН2)3СН(Н2)СООН

Nle

32,1

Изолейцин

СН3СН2СН(СН3)СН(Н2)СООН

Ile (I)

58,8

Фенилаланин

С6Н5СН2СН(Н2)СООН

Phe (F)

-7,4

5,97 (6,04) 5,98 (6,04) 6,08 5,94 (6,02) 5,48 (5,91)

2,34 (COOH) 9,6 (NH2) 2,34 (COOH) 9,6 (NH2)

2,32 (COOH) 9,69 (NH2) 2,36 (COOH) 9,72 (NH2) 2,36 (COOH) 9,6 (NH2) 2,39 (COOH) 9,76 (NH2) 2,32 (COOH) 9,76 (NH2) 2,58 (COOH) 9,24 (NH2)

Моноаминодикарбоновые кислоты Аспарагиновая

НООССН2СН(Н2)СООН

Asp (D)

33,8

2,77

1,88 (COOH) 3,65 (COOH) 9,6 (NH2)

33

Глутаминовая

НООС(СН2)2СН(Н2)СООН

Glu (E)

46,8

3,22 (3,08)

Аспарагин (амид)

H2NCOСН2СН(Н2)СООН

Asn (N)

37,8

5,41

Глутамин (амид)

H2NCO(СН2)2СН(Н2)СООН

Gln (Q)

46,5 (1н HCl)

5,65

37,5

9,70 (9,74)

37,9

9,59 (9,74)

Орнитин (некодируемая геномом) Лизин

Диаминомонокарбоновые кислоты H2N(СН2)3СН(Н2)СООН Orn в организме играет важную роль (биосинтез мочевины) H2N(СН2)4СН(Н2)СООН

Lys (K)

2,19 (COOH) 4,25 (COOH) 9,67 (NH2) 2,02 (COOH) 3,8 (NH2) 2,17 (COOH) 9,13 (NH2) 5,65 (NH2) 1,94 (COOH) 8,65 (2NH2) 10,76 (5NH2) 2,18 (COOH) 8,95 (NH2) 10,5 (NH2)

Аминокислоты Аргинин

HN=С(Н2)NH(CH2)3СН(Н2)СООН

Arg (R)

48,1

11,15 (10,76)

2,18 (COOH) 9,09 (NH2) 13,2 (гуанидин)

Гидроксиаминокислоты Серин

СН2(ОН)СН(Н2)СООН

Ser (S)

15,9

5,68

Треонин

СН3СН(ОН)СН(Н2)СООН

Thr (T)

-17,9

5,64 (6,16)

Тирозин

п-НОС6Н4СН2СН(Н2)СООН

Tyr (Y)

-21,5 (1 н HCl)

5,66 (5,63)

7,9

5,02 (5,07)

-530 (1 н HCl)

5,03

2,21 (COOH) 9,15 (NH2) 2,71 (COOH) 9,62 (NH2) 2,2 (COOH) 9,11 (NH2) 10,07 (OH)

Тиоаминокислоты Цистеин

СН2(SH)СН(Н2)СООН

Cys (C)

Цистин (некодируемая

S2[СН2СН(Н2)СООН]2

(Cys)2

1,71 (COOH) 8,33 (NH2) 10,78 (SH) 1,0 (COOH)

34

геномом)

Формирование пространственной структуры белков

Метионин

СН3S(CH2)2СН(Н2)СООН

Met (M)

2,1 (COOH) 8,02 (NH2) 8,71 (NH2) 2,28 (COOH) 9,21 (NH2)

34,6

5,74

Pro (P)

-69,5

6,30

Hyp

-66,2

5,74

His (H)

18,3

7,47 (7,6)

1,77 (COOH) 9,00 (NH2) 6,0 (имидазол)

Trp (W)

13,0 (1 н HCl)

5,89

2,38 (COOH) 9,39 (NH2)

Гетероциклические аминокислоты Пролин N H

COOH

N H

COOH

1,99 (COOH) 10,6 (NH2)

HO Гидроксипролин (некодируемая геномом) N

CH2CH(NH2)COOH

Гистидин N H CH2CH(NH2)COOH Триптофан

H H3NCH2COOH + H+  H3NCH2COO-  H2NCH2COO- + H+ Кислота рК=2,34 цвиттер-ион основание рК=9,6 [H=][HA]=4,57·10-3[H2A+] [H+][A-]=2,51·10-10[HA]

35

Приложение 1. Соотношение митохондриальной, хлоропластной и ядерной ДНК в различных типах клеток. Митохондриальная (как правило кольцевые ДНК) Число Число митох Размер одной копий Число Доля ондри митох. ДНК в ДНК в хромо митохон. йв нуклеотидных. мито-сом ДНК клетк парах. хондри е и 22 84000 4 до15 – 18 32 (1 – (7000 – 84000) (2 – 50) % 50)

Размер ядерной ДНК Вид

Длина (число нуклеотидных пар)

Дрожжи S.cereevisiae

2,7·107 (106 107)

Зеленые водоросли chlamydomon as

1,6·1010 2,7·1010

Высшие растения (вегетативны е клетки) Лук Кукуруза, листья Махорка, ткань Е.gracilis Животные Бабочка Lesandra nivescens Крысы, печень Мыши, клетки

1

Голосемянные 1,6·1010 Покрытосемян ные 2,7·1010 3·1010

16

1010

20

16000 (линейная ДНК)‫٭‬

150000 - 2500000

Хлоропластная (как правило кольцевые ДНК) Размер Число Число одной копий Доля хлорохлороп.. в хлоропл. пластов ДНК в хлороп ДНК в клетке нукл. ласте парах. -

-

-

-

1

180000

80

7%

10 - 30

120000 – 200000 (около 120 генов)

20 - 40

400000

20 - 40

15%

15

135000

40

3%

-

-

-

-

Около 10%

1000 Менее 1%

16000 - 19000 380 382 1000 6·109

40

100 500

5 - 10 16200

1%

2 0,2% (5 – 10) Менее 1%

36

L-линия Лягушки, яйцеклетки Человек Ооцит (развивающая яйцеклетка) Человек,Неlа

3·109 -180·109 5,8·109

18 28

107

46

200 печен ь

5 - 10 16569 37 генов (22-тРНК, 2рРНК, 13 белков)‫٭‬

99% Менее 1%

30000 0 5,8·109

46

800

16600

10

1%

отим йеиссерпскэ тюялварпу КНД йонредя зи вонег 05 (‫٭‬хондриальных генов. В скобках указаны вариации для разных штаммов.

37

Таблица Cвойства пуриновых и пиримидиновых оснований Основание Цитозин Урацил

Тимин

Аденин

Гуанин

Сокращенное Форма молекулы обозначение C Катион Нейтральная Анион U Нейтральная Моноанион Дианион Т Нейтральная Моноанион Дианион А Дикатион Катион Нейтральная Анион G Катион Нейтральная Моноанион Дианион

макс, нм 275 268 283 258 282 273 265 293 280 265 265 260 270 250 245 275 273

макс.10

рК

10,03 6,09 8,09 8,20 5,90 7,17 7,90 5,19 5,97 10,95 13,16 13,32 13,26 11,49 10,88 8,24 10,20

4,5 – 4,7 12,1 – 12,3 9,35 – 9,50 13,9 9,9 13,9 0,1 4,1 9,1 3,2 9,3 12,5

НУКЛЕОЗИДЫ Природные гликозиды, молекулы которых состоят из остатка пуринового или пиримидинового основания, связанного через атом азота с остатком D-рибозы или 2дезокси-D-рибозы в фуранозной форме; в более широком смысле – природные и синтетические соединения, в молекулах которых гетероцикл через атом азота или углерода связан с любым моносахаридом, иногда сильно модифицированным. Пуриновые нуклеозиды

Пиримидиновые нуклеозиды

H

H

H

H

Аденозин (Х=ОН) Гуанозин (Х=ОН) Дезоксиаденозин (Х=Н) Дезоксигуанозин (Х=Н)

Уридин (R=Н, Х=ОН) Цитидин (Х=ОН) Тимидин (R=СН3, Х=Н) Дезоксицитидин (Х=Н)

38

Таблица Свойства нуклеозидов Нуклеозид

D

Среда

Цитидин С

+34,2о (2 масс.%)

Кислая

Дезоксицитидин

Уридин U

Тимидин T

Аденозин A

Дезоксиаденози н

Гуанозин G

Дезоксигуанозин

+82,4о (1,31 масс.% щел.) +9,6о (2 масс.%)

+32,8о (1,04 масс.%) -61о

-26,0о (1 масс.%)

-72о (1,4 масс.% щел.) -30,2о (0,2 масс.%)

макс, нм 280

макс.10-3

рК

13,4

Щелочная

271 229,5 273

9,1 8,3 9,2

4,15 12,5

Кислая

280

13,2

Нейтральная

271

9,0

Щелочная

271

9,1

Кислая

262

10,1

Нейтральная

262

10,1

Щелочная

262

7,45

Кислая

267

9,65

Нейтральная

267

9,65

Щелочная

267

7,4

Кислая

257

14,6

Нейтральная

260

14,9

Щелочная

259

15,4

Кислая

258

14,5

Нейтральная

260

15,2

Щелочная

261

14,9

Кислая

256

12,3

Нейтральная

253

13,6

Щелочная

256 - 266

11,3

Кислая

255

12,1

Нейтральная

254

13,0

Щелочная

260

9,2

Нейтральная

4,3 13

9,2 12,5

9,8 13

3,5 12,5

3,8

1,6 4,2 12,4

2,5

39

МИНОРНЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ Вероятно обладают регуляторными и структурообразующими свойствами. У позвоночных они составляют 1 – 2 % от общего числа нуклеозидов, а у растений их доля доходит до 3 – 8 %.

Длины волн спектра и соответствующие им окраски. Интервалы длин волн поглощаемого света, нм 400-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-605 605-730 730-760

Цвет поглощаемого излучения Фиолетовый Синий Зеленовато-синий Сине-зеленый Зеленый Желто-зеленый Желтый Оранжевый Красный Пурпурный

Дополнительный цвет (наблюдаемый цвет раствора) Желто-зеленый Желтый Оранжевый Красный Пурпурный Фиолетовый Синий Зеленовато-синий Сине-зеленый Зеленый

40

РИС.1 Фрагмент двойной спирали ДНК. Пунктиром показаны водородные связи между азотистыми основаниями

РИС.2 Строение нуклеотида, в состав которого входят остатки фосфорной кислоты, а также фрагменты циклического сахара и азотистого основания.

O

O НN

N

H2N

H2N

HO—CH2

HO—CH2

HO

OH

HO

OH

РИС.3 Молекулярная и анионная форма нуклеозида гуанозина. Пунктирной линией разделены фрагменты циклического сахара и азотистого основания.

_

41 Аденозин

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

2 1 1 H2A+ 2 HA 3 A3

0

5

10

15

рН

Тимидин

Уридин 1,2 1

1

2

0,8

1 H2U 2 HU3 U2-

0,6 0,4

3

0,2 0 2

7

1

2 1 H2T 2 HT-

0,6 0,4 0,2 0

3 T2-

3 2

рН

12

1,2 1 0,8

7

Цитидин

рН

12

Гуанозин 1,2

1,2

3

2

2

1

1

1

0,8

0,8

1 H2С+ 2 НС

0,6

3 C-

1 H3G+ 2 H2G 3 HG4 G2-

0,6 0,4

1

0,4

4

0,2

3 0,2

0 2 0 2

7

12

рН

7

12 pH

РИС.4 Расчетные кривые области существования ионных форм нуклеозидов.

Рис.5 Предлагаемое изображение комплементарных пар А-Т и Г-Ц в ДНК

Где с помощью индекса

42

Р обозначена отрицательно заряженная фосфатная группа

43

Рис. 6 Схема, иллюстрирующая различные уровни упаковки хроматина, которые, повидимому, отражают последовательные этапы формирования высококонденсированной метафазной хромосомы.[Альбертс Б. И др. Молекулярная биология клетки т.2 М.:Мир 1994, с.121] КоК

 2нм  

Короткий участок двойной спирали ДНК (линкерная ДНК)

1ыйуровень  упаковки 11нм   в 6,7 раз

3 нуклеосомы Хроматин в форме "бусин на нити" (ДНК "накручена" на белковый гистон) ≈200 нуклеотидов на нуклесому

 2ойуровень 30нм  упаковки  в 40 раз

Хроматиновая фибрилла 30 нм, состоящая из упакованных нуклеосом

3ийуровень упаковки 300нм (петельный) в 680 раз

4ыйуровень 700нм упаковки в 12000 раз

    

    

 1400нм  

Часть хромосомы в растянутом виде (фибриллы связаны белками. В основании концов петель находится ДНК топоизомераза II)

Конденсированный участок метафазной хромосомы

Целая метафазная хромосома (сверху покрыта негистоновыми белками (рибонуклеопротеинами) и РНК)

45

Приложение 2. Состав клетки. (Албертс, 1994).

46

47

Приложение 3. Виды и энергия связей в биологических молекулах. Силы, стабилизирующие третичную структуру глобулярных белков (Ленинжер, 1985). Вторичную структуру полипептидов формируют и поддерживают: внутрицепочечные водородные связи, которые скрепляют α-спираль и межцепочечные водородные связи, стабилизирующие β-конформацию цепей, образующих складчатые слои. При наличии соответствующей аминокислотной последовательности α -спираль и βконформация - это самые устойчивые структуры, которые может иметь данный участок цепи; иными словами, они являются структурами с наименьшей свободной энергией. Для стабилизирования третичной структуры глобулярных белков существуют четыре типа взаимодействий, сочетание которых обеспечивает правильное взаимное расположение всех витков и петель в глобулярных белках (рис. 3) при соблюдении нормальных биологических условий (температура, рН, концентрация ионов). 1. Водородные связи между R-группами остатков, расположенных в соседних петлях полипептидной цепи. Например, гидроксильная группа остатка серина в одном участке полипептидной цепи может образовать водородную связь с атомом азота в кольце остатка гистидина, находящегося в соседней петле той же цепи.

Рис. 3. Силы, стабилизирующие третичную структуру глобулярных белков. 2. Электростатическое притяжение между противоположно R-группами. Например, отрицательно заряженная карбоксильная группа (—СОО—) остатка глутаминовой кислоты может притягиваться положительно заряженной ε-аминогруппой (—NН3+) остатка лизина, расположенного в соседней петле. 3. Гидрофобные взаимодействия. Гидрофобные R-группы некоторых аминокислотных остатков избегают контактов с водным окружением и стремятся собраться вместе внутри глобулярной структуры, где они защищены от соприкосновения с водой. 4. Ковалентные поперечные связи. Соседние петли полипептидной цепи в некоторых белках, например в рибонуклеазе, содержат остатки цистина, которые образуют внутрицзпочечные ковалентные поперечные связи между соседними петлями. Такие ковалентные поперечные связи, конечно, намного прочнее, чем перечисленные выше нековалентные взаимодействия, однако они встречаются не во всех белках. Следовательно, те белки, у которых нет дисульфидных поперечных связей, поддерживают свойственную им третичную структуру при помощи множества слабых нековалентных взаимодействий и разного рода контактов, в совокупности придающих структуре достаточную прочность. Хотя нативная третичная структура каждого глобулярного белка отвечает минимуму свободной энергии и потому является самой устойчивой конформацией, какую только может принять данная полипептидная цепь, третичную структуру глобулярных белков не следует считать абсолютно жесткой и неподвижной. Многие глобулярные белки в норме претерпевают

48

конформационные изменения при выполнении ими биологических функций. Например, молекула гемоглобина изменяет свою конформацию при связывании кислорода и возвращается к исходной конформации после его освобождения. Кроме того, молекулы многих ферментов претерпевают конформационные изменения при связывании субстратов - это составляет часть их каталитического действия. Полипептидный остов глобулярных белков характеризуется определенной степенью гибкости, вследствие чего эти белки подвержены локальным внутренним флуктуациям, т.е. они как бы «дышат». Свертывание полипептидных цепей происходит с очень высокой скоростью.В живых клетках белки образуются из аминокислот с очень высокой скоростью. Например, в клетках Е.соli полная биологически активная молекула белка, содержащая 100 аминокислотных остатков, может быть построена за 5 с при 37°С. Однако расчеты показывают, что если полипептидная цепь из 100 аминокислотных остатков будет беспорядочно «перебирать» все возможные углы вращения вокруг каждой одинарной связи остова, пока не «найдет» свойственную ей биологически активную конформацию, то на это потребуется по меньшей мере 1050 лет! Таким образом, белки не могут принимать правильную конформацию, сворачиваясь совершенно случайным образом по принципу «проб и ошибок». Должны существовать более короткие и прямые пути. Мы не знаем в точности, как и по какому пути проходит процесс самопроизвольного свертывания белка; начинается ли этот процесс на одном из концов цепи, в середине или же в нескольких точках одновременно. Однако, самопроизвольное свертывание полипептидных цепей в правильную третичную структуру, очевидно, должно быть высококооперативным. Это означает, что если какой-то минимальный отрезок цепи свернулся надлежащим образом, то это сильно увеличивает вероятность правильной укладки всех остальных участков цепи.

49

50

51

52

Приложение 4. Фосфат и бикарбонат - важные биологические буферные системы. (Ленинжер, 1985). У всех живых организмов внутриклеточные и внеклеточные жидкости обычно имеют характерную и постоянную величину рН, которая поддерживается с помощью различных биологических систем. Однако первая линия защиты живых организмов, препятствующая изменениям их внутреннего рН, обеспечивается буферными системами. Две наиболее важные буферные системы у млекопитающих - это фосфатная и бикарбонатная системы. Фосфатная буферная система, играющая важную роль в поддержании рН внутриклеточной жидкости, представляет собой сопряженную кислотно-основную пару, состоящую из иона Н2РO4- (донора протона) и иона НРО42-(акцептора протона). Н2РО4Донор протона

Н+ + НРО42Акцептор протона

=

Фосфатная буферная система работает точно так же, как ацетатная, с той разницей, что она функционирует в другом интервале значений рН. Эта система обладает максимальной эффективностью вблизи рН 6,86, поскольку величина рК' ионов Н2РО4- равна 6,86. Фосфатная буферная пара Н2РО4- - НРО42- способна сопротивляться изменениям рН в интервале между 6,1 и 7,7 и может, следовательно, обеспечивать достаточную буферную емкость внутриклеточной жидкости, величина рН которой лежит в пределе 6,9-7,4. Главной буферной системой плазмы крови служит бикарбонатная система, представляющая собой сопряженную кислотно-основную пару, состоящую из молекулы угольной кислоты (Н2СО3), выполняющей роль донора протона, и бикарбонат-иона (НСО3-), выполняющего роль акцептора протона: Н2СО3 = Н+ + НСО3Эта система, которая имеет свою собственную константу равновесия K 1' :

K  ' 1

[ H  ][HCO3 ] [ H 2 CO3 ]

,

и функционирует в качестве буфера так же, как и другие сопряженные кислотно-основные пары. Ее уникальная особенность состоит, однако, в том, что один из ее компонентов, а именно угольная кислота (Н2СО3), образуется в результате взаимодействия растворенной в воде (р) двуокиси углерода с водой в соответствии с обратимой реакцией: С0 2 (р) + Н 2 0 = Н2 С0 3 , константа равновесия, которой равна K 2' :

K 2' 

[ H 2 CO3 ] [CO2 ( p)][H 2 O]

Поскольку при нормальных условиях двуокись углерода представляет собой газ, величина [СО2(р)], т. е. концентрация растворенной СО2, определяется равновесием с СО2 газовой фазы (г): С02 (г) = С0 2 (р), характеризуемым константой равновесия К3’, равной

K 3' 

[CO2 ( p)] [CO2 ( г )]

53

Величина рН бикарбонатной буферной системы зависит от концентрации растворенных в ней компонентов Н2СО3 и НСОз-, выполняющих роль донора и акцептора протонов. Поскольку, однако, концентрация Н2СО3 в свою очередь зависит от концентрации растворенной СО2, а последняя - от парциального давления СО2 в газовой фазе, величина рН бикарбонатного буфера, находящегося в контакте с газовой фазой, в конечном счете определяется концентрацией ионов НСОз- в водной фазе и парциальным давлением СО2 в газовой фазе. Бикарбонатная буферная система функционирует как эффективный физиологический буфер вблизи рН 7,4, потому что донор протона Н2СО3 в плазме крови находится в подвижном равновесии с большим резервным объемом газообразной СО2 в воздушном пространстве легких. В любых условиях, когда кровь почему-либо вынуждена поглощать избыток ионов ОНи рН повышается, количество угольной кислоты (Н2СО3), частично превратившейся в НСО3- в результате взаимодействия с ионами ОН -, быстро восстанавливается за счет большого запаса газообразной СО2 в легких. СО2 (г) растворяется в крови, образуя СО2 (р), которая вступает в реакцию с водой, что приводит к образованию Н2СО3. И наоборот, когда величина рН крови почему-либо уменьшается, некоторое количество НСО3- буферной системы связывается с избытком ионов Н+ и образуется избыток Н2СО3. Эта Н2СО3 распадается, выделяя растворенную СО2, которая в свою очередь переходит в газовую фазу в легких и в конце концов выдыхается организмом. По мере того как кровь протекает через многочисленные капиллярные сосуды Как работает бикарбонатная система крови. Рис. 4. Между СО2 в воздушном пространстве легких и бикарбонатным буфером в плазме крови, протекающей через капилляры легких, устанавливается равновесие. Так как концентрация растворенной СО2 может быть быстро отрегулирована путем изменений скорости дыхания, бикарбонатная буферная система крови находится почти в равновесии с обширным потенциальными резервуаром СО2.

Водная фаза Н+ + НСО3-

Н2СО3

Н2О +

+ Н2О

СО2(р)

Воздушное пространство в легких

СО2(г)

Буферная система крови включает три взаимосвязанных обратимых равновесия между газообразной СО2 в легких и бикарбонат-ионом (НСОз-) в плазме крови (рис. 4). Когда ионы Н+ попадают в кровь при ее протекании через сосуды тканей, их концентрация сразу же повышается. Это приводит к тому, что равновесие реакции 3 (рис. 4) смещается и устанавливается новое равновесие, соответствующее более высокой концентрации Н2СО3, что в свою очередь приводит к повышению концентрации СО2 (р) в крови. В результате давление СО2 в газовой фазе легких тоже повышается и лишняя СО2 выдыхается. Наоборот, когда в плазму крови поступает некоторое количество ионов ОН-, события происходят в обратной последовательности. Понижение концентрации ионов Н+ вызывает диссоциацию части молекул Н 2 СО 3 на ионы Н + и НСО 3 - , а это в свою очередь приводит к растворению в плазме крови некоторого дополнительного количества СО2 (г), содержащегося в легких. Таким образом, высокая интенсивность процесса дыхания, т. е. высокая скорость вдыхания воздуха и выдыхания СО2, может обеспечить достаточно быстрые сдвиги этих равновесий, что обусловливает сохранение постоянной величины рН в крови.

54

Величина рН плазмы крови поддерживается на удивительно постоянном уровне. В норме плазма крови имеет рН, близкий к 7,40. Нарушение механизмов, регулирующих величину рН, наблюдающиеся, например, при тяжелых формах диабета вследствие ацидоза, обусловленного «перепроизводством» метаболических кислот, вызывает падение рН крови до величины 6,8 и ниже, что в свою очередь, может приводить к непоправимым последствиям и смерти. При некоторых других заболеваниях величина рН крови иногда достигает столь высоких значений, что она уже не поддается нормализации. Поскольку повышение концентрации ионов Н+ всего лишь на 1,18·10-7 М (приблизительная разница между кровью при рН 7,4 и кровью при рН 6,8) может оказаться опасным для жизни, возникает вопрос: какие молекулярные механизмы обеспечивают поддержание величины рН в клетках со столь высокой точностью? Величина рН влияет на многие структурные и функциональные свойства клетки, однако к изменениям рН особенно чувствительна каталитическая активность ферментов. Kаждый из ферментов проявляет максимальную активность при определенном значении рН, которое называется оптимумом рН. Приложение 5.Регуляция транскрипции генов.

55

Приложение 6. Сигнальные последовательности для регуляции транспорта белков.

56

Приложение 7. Внутриклеточные посредники.

Рис. Два главных механизма, с помощью которых рецепторы клеточной поверхности, сопряженные с G-белками, запускают образование внутриклеточных посредников. В обоих вариантах связывание внеклеточного лиганда изменяет конформацию цитоплазматического домена рецептора так, что он связывается с G-белком, который затем активирует (или ингибирует) определенный фермент плазматической мембраны. В некоторых случаях G-белок взаимодействует не с ферментом, а с ионным каналом. В сАМР-пути активируемый Gs-белком фермент синтезирует циклический АМР. В Са2+пути с помощью фермента образуется растворимый посредник, который освобождает из внутриклеточных хранилищ ионы Са2+. И сАМР, и Са2+ связываются в клетке с другими специфическими белками, изменяя их активность.

57

Синтез и расщепление cАМФ

АТР

Аденилатциклаза

Пирофосфат сАМР

cАМР фосфодиэстераза

5’-АМР Рис. Синтез и расщепление сАМР. Пирофосфатаза делает синтез сАМР необратимой реакцией, гидролизуя освобождаемый пирофосфат.

58

Рис. Современная модель, иллюстрирующая, каким образом белковые рецепторы могут функционально сопрягаться с аденилатциклазой через стимулирующий G-белок – Gs. Пока сигнальный лиганд остается связанным, рецепторный белок может активировать все новые молекулы Gs-белка, усиливая таким образом ответ. Дополнительный механизм усиления (который в некоторых сигнальных системах имеет большее значение) заключается в удержании связанного GTP на -субъединице Gs-белка на протяжении многих секунд, так что все это время аденилатциклаза остается активированной. Согласно другой модели, аденилатциклаза остается связанной с G s и в активированном, и в неактивном состоянии.

59

Рис. Важнейшие механизмы, позволяющие клетке поддерживать очень низкую концентрацию свободных ионов Са2 + в цитозоле, несмотря на их высокую концентрацию во внеклеточной жидкости. Са2+ активно откачивается из цитозоля во внеклеточное пространство (А) и в окруженные мембраной внутриклеточные органеллы, запасающие Са2+ (Б). Кроме того, свободные ионы кальция прочно связываются различными внутриклеточными молекулами. Митохондрии тоже способны откачивать Са из цитозоля, но делают это эффективно только при очень высокой концентрации Са2 +, создающейся обычно при повреждении клетки.

60

Рис. Две ветви инозитолфосфолипидного пути. Как полагают, активированный рецептор связывается со специфическим G-белком (Gр), заставляя его -субъединицу диссоциировать и активировать фосфолипазу С, которая расщепляет РIР2 с образованием InsP3 и диацилглицерола. Диациглицерол (при участии не показанных на схеме связанных ионов Са 2+ и фосфатидилсерина) активирует С-киназу. Оба фермента - и фосфолипаза С, и С-киназа -присутствуют в клетках как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме; в процессе активации одна из них или обе они перемещаются из цитозоля на внутреннюю поверхность плазматической мембраны. Эффект InsP3 можно имитировать экспериментально на интактных клетках обработкой Са2 + -ионофором, а эффект диацилглицеролаобработкой моноацилпроизводными диацилглицерола или форболовыми эфирами, которые связываются с С-киназой и активируют ее.

61

Приложение 8. Рецепторы-протеинкиназы

Тирозин-специфические протеинкиназы

Серин/треонин-специфические протеинкиназы

Рис. Размеры и локализация каталитических доменов некоторых протеинкиназ, рассмотренных в этой главе. Во всех случаях каталитический домен (выделен цветом) состоит примерно из 250 аминокислотных остатков и имеет сходную аминокислотную последовательность; это позволяет предполагать происхождение их всех от общего предшественника. Три представленные здесь тирозин-специфические киназы – трансмембранные белки-рецепторы, которые при связывании специфического внеклеточного лиганда активируются и фосфорилируют ряд белков внутри клетки (в том числе и самих себя) по остаткам тирозина. Обе цепи рецептора инсулина кодируются одним геном, продукт которого – белок-предшественник – расщепляется на две цепи, связанные дисульфидными мостиками. Внеклеточная часть рецептора PDGF, по-видимому, сложена в пять иммуноглобулиноподобных доменов – возможно, этот белок относится к суперсемейству иммуноглобулинов. (разд.) Регуляторные субъединицы А-киназы (см. рис.) и киназы фосфорилазы (см. рис.), в норме ассоциированные с этими киназами, на схеме не показаны.