МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
Одобрено на заседании Ученого Совета
Программа составлена в соответствии с
факультета
государственным образовательным стандартом высшего профессионального
Декан биологического факультета
образования по специальности 012300
А.П.Савченко_________________
«Биохимия»
«___»__________________2002 г. УДК 577.15/17 ББК 28.072.534я73 Автор-составитель Н.М. Титова
Энзимология, кинетика и термодинамика ферментативных реакций: Рабочая программа ЭНЗИМОЛОГИЯ, КИНЕТИКА И ТЕРМОДИНАМИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
дисциплины. Красноярск: РИО. КрасГУ, 2002. 10 с. (экспресс-издание) Предназначена для специальности 012300 «Биохимия» очной формы обучения
Рабочая программа дисциплины для специальности 012300 «Биохимия»
КрасГУ, 2002
Красноярск 2002
2
I. ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ II. СОДЕРЖАНИЕ КУРСА
Цель курса – показать фундаментальную роли ферментов (энзимов) в обмене веществ и энергии,
молекулярных
механизмах
наследственности,
регуляции
и
интеграции
метаболических процессов в живых организмах.
Введение. Катализ и катализаторы. Ферменты как особые представители катализаторов.
Задачи курса – ознакомить студентов с современными представлениями о структурной
Краткие исторические сведения о развитии энзимологии. Применение ферментов в
организации
промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Новые пути практического использования
ферментов,
механизмах
ферментативного
катализа,
внутриклеточной
локализации ферментов и их кинетических свойствах; регуляции активности ферментов in
ферментов. Иммобилизованные ферменты. Инженерная энзимология.
vivo в норме и при различных патологических процессах; использовании ферментов как
Термодинамическая характеристика ферментативных реакций. Первый и второй
эффективных биокатализаторов в медицине, промышленности, сельском хозяйстве.
законы термодинамики. Энтальпия. Энтропия. Свободная энергия. Свободная энергия как
Студенты должны уметь использовать знания, полученные при знакомстве с лекционным
мера термодинамической возможности реакции. Зависимость величины свободной энергии
материалом, учебниками, монографической литературой, периодикой, при изучении
от концентрации газа, растворенного вещества, концентрации водородных ионов,
биохимии и других биологических дисциплин; применять полученные знания при
температуры. Связь между изменениями свободной энергии и константой равновесия.
постановке экспериментальной работы; понимать, что кинетические свойства ферментов
Способы определения свободной энергии. Сопряженные реакции и их истолкование
предопределяют их возможности в регуляции метаболизма.
(эндергонические и экзергонические реакции). Богатые энергией (макроэргические)
Место курса в системе естественнонаучного образования – энзимология развивается на
соединения.
стыке биологических и физических дисциплин. Первоначально являющаяся разделом
Кинетика
биохимии, энзимология в настоящее время – самостоятельная наука, оказывающая влияние
ферментативной кинетики. Константа скорости реакции. Порядок реакции. Молекулярность
на получение
реакции.
фундаментальных знаний в различных областях биологии. Успешно
ферментативных Скорость
реакции
реакций. нулевого,
Основные первого
закономерности и
второго
химической
порядков.
и
Кинетика
применяются ферменты в промышленности, биотехнологических процессах, сельском
ферментативных реакций. Работы Анри, Брауна, Михаэлиса-Ментен, Бриггса, Холдейна.
хозяйстве, медицине.
Кинетическая кривая. Скорость ферментативных реакций, способы выражения. Зависимость
Требования к уровню освоения содержания курса – программа курса написана в
скорости реакции от концентрации фермента. Причины отклонения от линейности. Влияние
соответствии с требованиями действующего Государственного стандарта. Для освоения
концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций. Условие стационарности.
курса необходима должная общебиологическая и химическая подготовка. Освоение курса
Уравнение Михаэлиса-Ментен. Субстратная константа – Кs и константа Михаэлиса – Км.
включает прослушивание лекций, выполнение лабораторных работ, решение задач по
Максимальная скорость реакции. Число оборотов фермента. Определение кинетических
ферментативной кинетике, ознакомление с основной и частью дополнительной литературы,
констант (метод Лайнуивера-Берка, Вульфа-Хайнса, Иди-Хофсти, Эйзенталя и Корниш-
самостоятельную проработку некоторых тем, прохождение рубежных контролей, сдачи
Боуден). Ингибиторы ферментов. Кинетическая классификация ингибиторов. Необратимое и
экзамена.
обратимое ингибирование. Типы ингибирования – конкурентный, неконкурентный, как
бесконкурентный, смешанный. Константа ингибирования – Кi, методы ее определения.
эффективных и специфичных биокатализаторах, их свойствах, организации внутри клеток,
Графический анализ разных типов ингибирования. Частные случаи ингибирования –
участии в осуществлении различных метаболических путей в живых организмах, регуляции
торможение субстратом и продуктом реакции. Возможные механизмы этих видов
активности ферментов как внутри-, так и внеклеточными сигналами.
ингибирования. Расчет кинетических констант. Влияние температуры на скорость
Дипломированный
специалист
должен
иметь
представление
о
ферментах,
ферментативных реакций. Энергия активации. Активированные фермент-субстратные Формы проведения занятий : лекции, лабораторные занятия, коллоквиумы, решение задач,
комплексы. Многостадийность ферментативной реакции. Понятие температурного оптимума
контрольные работы, тест-опросы на каждом лабораторном занятии.
ферментативной реакции. Термическая инактивация ферментов. Влияние концентрации водородных
3
ионов
на
скорость
ферментативных 4
реакций.
Понятие
рН-оптимума
ферментативной реакции. Выявление групп активного центра при изучении влияния рН на
изомеризации и расщепления связей: тиаминдифосфат, биотин, кобамидные коферменты.
скорость ферментативной реакции. Двухсубстратные ферментативные реакции. Различные
Роль металлов в функционировании ферментов. Истинные металлоэнзимы (СОД,
механизмы
карбоксипептидаза А, цитохромоксидаза и др.). Металлоэнзимные комплексы (NAD-
присоединения
субстратов
к
ферменту:
неупорядоченное
связывание,
упорядоченное связывание, механизм «пинг-понга». Кинетика двухсубстратных реакций,
зависимая изоцитратдегидрогеназа).
обработка экспериментальных данных.
Ферментативный катализ. Сущность явления катализа. Гомогенный и гетерогенный
Общие правила работы с ферментами. Способы количественного выражения активности.
катализ. Взаимодействие метаболитов с активными центрами. Ферментсубстратный
Единицы
активность
комплекс, стадии образования и распада, доказательства существования. Природа сил,
каталитического центра. Способы регистрации ферментативной активности – по конечной
стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
точке, непрерывный. Методы определения активности ферментов: колориметрический,
(водородные
спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный,
электростатические взаимодействия, силы Ван-Дер-Ваальса). Факторы, определяющие
иммунохимический и др. Методы выделения и очистки ферментов. Фракционное
эффективность и специфичность ферментативного катализа: эффект сближения, ориентации,
высаливание, фракционирование органическими растворителями, избирательное осаждение.
напряжения, индуцированного соответствия, кислотно-основного и ковалентного катализа.
Адсорбция на гелях. Хроматография (ионообменная, тонкослойная, аффинная). Гель-
Использование энергии связывания фермента с субстратом в катализе. Работы Э.Фишера,
фильтрация. Электрофорез, изоэлектрофокусирование. Критерии чистоты ферментных
Дж. Кошланда, В. Дженкса. Методы изучения механизмов ферментативных реакций:
препаратов (ультрацентрифугирование, электрофорез, растворимость, кристаллизация).
изотопный
Химическая структура ферментов. Ферменты – простые и сложные белки. Уровни
специфических ингибиторов. Химические модели. Механизм действия протеолитических
структурной
ферментов
ферментов.
Удельная
организации
активность,
ферментов
–
молекулярная
первичный,
активность,
вторичный,
супервторичный
связи,
обмен, на
гидрофобные
взаимодействия,
спектрофотометрический,
примере
лизоцима
и
координационные
кинетический
карбоксипептидазы
методы, А.
связи,
использование
Механизм
действия
(надвторичный), доменный, третичный, четвертичный. Методы изучения различных уровней
аминотрансфераз. Каталитические антитела (абзимы), как примитивные ферменты.
организации
Аллостерические ферменты. Понятие аллостерических центров. Десенсибилизация как
ферментов
–
оптические,
РСА,
кинетические,
генно-инженерные, молекул
способ доказательства разобщенности аллостерических и активных центров. Понятие
ферментов, проблема сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию.
кооперативности. Типы кооперативных взаимодействия: гомотропные, гетеротропные,
Структура и роль шаперонов. Роль доменов в пространственной организации молекул
положительные, отрицательные. Кинетика аллостерических ферментов. Коэффициент Хилла
ферментов.
характеристики
– мера отклонения от гиперболического закона Михаэлиса-Ментен. Способы расчета
(коферментсвязывающие, регуляторные, обеспечивающие связь с мембранами). Активный
коэффициента Хилла: метод Хилла, метод Б. Курганова с соавторами. Модели
центр ферментов. Якорный (субстратсвязывающий) и каталитический сайты активных
аллостерических
ферментов.
центров. Активные центры простых и сложных ферментов. Методы определения
последовательная
модель
аминокислот, входящих в активные центры ферментов. Химическая модификация, действие
эффекторов на кривую зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации
ингибиторов, квазисубстраты, алкилирование, блокирование SH-групп. Роль серина,
субстрата.
гистидина, лизина, тирозина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот в
кооперативных свойств у аллостерических ферментов с помощью коэффициента крутизны –
активных центрах. Структура активных центров на примере ЛДГ, СОД, карбоксипептидазы
Rх. Преимущества аллостерических ферментов с положительной кооперативностью по
А. Использование методов РСА для изучения топографии активных центров.
сравнению
компьютерное
Кофакторы.
моделирование.
Классификация
Классификация,
Принципы
доменов,
пространственной
их
биохимические
организации
функциональные
функции.
Коферменты
окислительно-
Совместное
с
кооперативность,
Согласованная
действие
аллостерическими и
модель
Немети-Кошланда-Филмера.
ферментами,
различных
аллостерических
ферментами, подчиняющимися
Моно-Уаймена-Шанжё,
Влияние
эффекторов.
проявляющими кинетике
аллостерических Оценка
отрицательную
Михаэлиса-Ментен
в
восстановительных реакций – NAD, NADP, FMN, FAD, железопорфирины, убихиноны,
регуляции метаболических путей в клетке.
аскорбиновая кислота. Коферменты – переносчики групп: нуклеозидфосфаты, фосфаты
Принципы регуляции ферментативных процессов. Локализация ферментов в клетке.
сахаров, HSCoA, пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота. Коферменты синтеза,
Понятие компартментализации на примере лизосомальных, митохондриальных ферментов.
5
6
Изоферменты: классификация, номенклатура, биологическая роль. Образование ферментов
Работа 6. Влияние оксалата натрия на активность лактатдегидрогеназы. Определение типа
из неактивных предшественников (проферментов, зимогенов). Регуляция активности
ингибирования и Кi.
ферментов внутриклеточными сигналами. Уровни организации ферментов – мономерные,
Работа 7. Выделение и очистка лактатдегидрогеназы из эритроцитов кролика.
олигомерные ферменты; надмолекулярные комплексы: мультиферментный комплекс,
Работа 8.
мультиферментный конъюгат; ферментные ансамбли: адсорбционные, интегральные.
аспартаткарбамоилтрансферазы.
Изостерическая регуляция (регуляция субстратом, кофактором и продуктом реакции).
Работа 9. Влияние мочевины, додецилсульфата натрия и п-хлормеркурибензоата на
Аллостерическая
активность лактатдегидрогеназы.
регуляция.
Регуляция
активности
фосфофруктокиназы.
Изучение кинетических свойств аллостерических ферментов на примере
Ретроингибирование – ингибирование анаболических путей их конечными продуктами.
Работа 10. Определение активности цитозольной и мембраносвязанной форм каталазы и
Типы ретроингибирования. Химическая модификация ферментов – быстрый механизм
глутатионпероксидазы в эритроцитах кроликов.
регуляции активности ферментов внешними сигналами. Типы химической модификации ферментов (фосфорилирование-дефосфорилирование, аденилирование-деаденилирование,
Самостоятельная работа
ацетилирование-деацетилирование). Регуляция активности гликогенфосфорилазы путем
Тема 1. Методы выделения и очистки ферментов.
фосфорилирования-дефосфорилирования.
Тема 2. Стратегия изучения первичной структуры ферментов.
Три
механизма
регуляции
активности
глутаминсинтетазы. Полифункциональные ферменты. Преимущества, возникающие в
Тема 3. Генетическая инженерия и энзимология.
результате белок-белковых взаимодействий. Регуляция активности мультиферментных
Тема 4. Совместное действие аллостерических эффекторов (ингибиторов и активаторов) на
комплексов (метаболонов) на примере ферментов гликолиза и цикла лимонной кислоты.
активность аллостерических ферментов.
Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Репрессия и индукция.
Тема 5. Классификация и номенклатура ферментов.
Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Носители для иммобилизации:
Решение задач
природные и синтетические. Методы иммобилизации: физические (адсорбция, включение в
Тема 1. Термодинамическая характеристика ферментативных реакций.
гель, микрокапсулы, липосомы, ферментные пленки), химические (ковалентное сшивание с
Тема 2. Кинетика ферментативных реакций.
носителем,
Тема 3. Общие правила работы с ферментами.
сшивка
би-
или
полифункциональными
реагентами).
Применение
иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине, биомониторинге окружающей
Тема 4. Аллостерические ферменты.
среды.
Тема 5. Биосинтез ферментов и его регуляция на уровне транскрипции и трансляции.
Классификация ферментов. Принцип классификации ферментов. Характеристика классов и важнейших групп ферментов. Основные положения систематической и тривиальной
III. ФОРМЫ КОНТРОЛЯ Коллоквиумы, рубежный контроль, контрольные работы, тест-опросы, экзамен.
номенклатуры ферментов. Лабораторные занятия Работа 1. Влияние температуры на активность каталазы эритроцитов и плазмы крови.
IV. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КУРСА
Работа 2. Влияние концентрации водородных ионов на активность лактатдегидрогеназы. Работа 3. Изучение зависимости скорости каталазной реакции от концентрации пероксида
Список литературы Основной 1. Березин И.В., Клёсов А.А. Практический курс химической и ферментативной
водорода. Работа 4. Определение Км и Vмах для пирувата и NADH лактатдегидрогеназы сердечной
кинетики. – М.: Изд-во МГУ, 1978.
мышцы и печени.
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3-х тт. – М.: Мир, 1982.
Работа 5. Влияние аминотриазола на активность каталазы эритроцитов и лейкоцитов.
3. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1979.
7
8
4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высш. шк., 1980.
Энзимология, кинетика и термодинамика ферментативных реакций
5. М.:Кретович В.Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986.
Составитель : Титова Надежда Митрофановна, канд. биол. наук, профессор кафедры
6. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978.
биохимии и физиологии человека и животных
7. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. – М.: Наука, 1992. 8. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир, 1980.
Редактор О.Ф. Александрова
9. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.:
Корректура автора
Мир, 1986. 10. Номенклатура ферментов. – М.: ВИНИТИ, 1979. Дополнительной 1. Белки и пептиды: В 2 т. - М.: Наука, 1995. – Т.1. – 448 с. 2. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. – М.: Мир, 1983. 3. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. – М.: Мир, 1983. 4. Керридж Д., Типтон К Биохимическая логика. – М.: Мир, 1974. 5. Проблема белка. Том 1: Химическое строение белка/Е.М. Попов, П.Д. Решетов, В.М. Липкин и др. – М.: Наука, 1996. – 496 с. 3. Проблема белка. Том 2: Пространственное строение белка /Е.М. Попов, В.В. Демин, Е.Д. Шибанова. – М.: Наука, 1996. – 480 с.
Подписано в печать 20.02.2003
4. Резанов А.Я. Механизмы регуляции биокатализа. – К.: Выща шк., 1989.
Тиражируется на электронных носителях
5. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.
Заказ 253
6. Справочник биохимика: Пер. с анг./ Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. –М.:
Дата выхода 25.02.2003
Мир, 1991. – 544 с. 7. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков: Учеб. для биол. спец. вузов /Под ред. А.С. Спирина. – М.: Высш. шк., 1996. – 335 с. 8. N.C. Price, L. Stevens. Fundamental of Enzymology. The Cell and Molecular Biology of
Адрес в Internet: www.lan.krasu.ru/studies/editions.asp Отдел информационных ресурсов управления информатизации КрасГУ 660041 г. Красноярск, пр. Свободный, 79, ауд. 22-05, e-mail:
[email protected]
Catalytic Proteins. Third Edition. – Oxford, University Press, 2002. – 478 p. Издательский центр Красноярского государственного университета 660041 г. Красноярск, пр. Свободный, 79, e-mail:
[email protected]
9
10