Как сливаются биологические мембраны

БИОЛОГИЯ КАК СЛИВАЮТСЯ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Ю. А. ЧИЗМАДЖЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

HOW ARE BIOLOGICAL MEMBRANES FUSING TOGETHER Yu. A. CHISMADZHEV

The process of membranes fusion during exocytosis is reviewed, along with the methods of studying fusion kinetics. The mechanism of lipid bilayer fusion is described. A model of protein-lipid fusion during exocytosis is presented. Описаны процесс слияния мембран в ходе экзоцитоза, а также методы изучения его кинетики. Рассмотрен механизм слияния липидных бислоев. Представлена модель липид-белкового комплекса, ответственного за образование и развитие пары слияния.

Основной функцией биологических мембран является отделение клеток и органелл от окружающей среды. Мембраны поддерживают клетку в неравновесном состоянии, обеспечивая сохранение перепадов концентраций и электрического потенциала. Свободная энергия, запасенная таким образом в клетке или во внутриклеточных органеллах, расходуется на осуществление многих жизненно важных функций – от генерации и распространения нервного импульса до химического синтеза и совершения механической работы. Разрушение плазматической мембраны несет клетке немедленную смерть. В то же время в любой живой клетке постоянно происходят трансформации мембран, сопровождающиеся локальным и кратковременным нарушением их целостности и последующим замыканием с образованием новых структур. Эти процессы, называемые слиянием и делением мембран, происходят при каждом акте экзо- и эндоцитоза, при делении клеток и митохондрий, оплодотворении, образовании многоядерных клеток при дифференцировке, при инфицировании оболочечными вирусами. Искусственно вызванное слияние мембранных образований широко используют при решении различных биотехнологических и биомедицинских задач. Хотя слияние и деление – это родственные процессы, сегодня известно гораздо больше именно о слиянии, которому и посвящен наш рассказ. Важно отметить, что, несмотря на многообразие явлений слияния, между ними есть немало общего. Это позволяет думать, что в их основе лежат единые физические принципы.

© Чизмаджев Ю.А., 2001

СЛИЯНИЕ МЕМБРАН ПРИ ЭКЗОЦИТОЗЕ

4

www.issep.rssi.ru

Рассмотрим процесс экзоцитоза на примере тучных клеток, секретирующих гистамин, гепарин и серотонин. Эти клетки и находящиеся в них гранулы настолько велики, что с помощью электронной микроскопии удается наблюдать весь ход экзоцитоза, который проиллюстрирован схематически на рис. 1, а. В исходном состоянии мы имеем клетку и секреторную гранулу (состояние 1 ), удаленную от плазматической мембраны. В ответ на определенный стимул гранула приходит в тесный контакт с плазматической мембраной (состояние 2 ).

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 5 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ а

б Клетка Внеклеточная среда

Гранула 1 2 Белки слияния 3

Гранула Пора слияния

20 нм

Рис. 1. Схематическая иллюстрация процесса экзоцитоза: а – показаны секреторная гранула (1 ), клетка, пора слияния и белки слияния; б – электронная микрофотография поры слияния. Стрелками показана пора слияния. На микрофотографии видно, что мембраны в этом месте стянуты друг к другу и формируют так называемый димпл

На микрофотографии (рис. 1, б ) видно, что в зоне контакта плазматическая мембрана выгибается в сторону гранулярной, образуя так называемый димпл, вершина которого представляет собой сильно искривленную мембрану. В этой области, порядка 10 нм, липидные домены гранулярной и плазматической мембран находятся в близком контакте. Предполагается, что именно здесь происходят слияние мембран и образование поры слияния (состояние 3 ), которая обеспечивает возможность выхода содержимого гранулы в окружающую среду. Таким образом, слияние подразумевает объединение мембран и установление связи через пору слияния между внутригранулярным пространством и внеклеточной средой. На электронных микрофотографиях удается увидеть только достаточно крупные поры, около 50 нм в диаметре (рис. 1, б ). Стенки этих пор образованы сильно изогнутыми липидными бислоями. В окрестности поры слияния видны белковые макромолекулярные структуры, в том числе нитевидные образования, построенные из актина. Предполагается, что именно они способствуют образованию димплов. К сожалению, с помощью электронной микроскопии не удается зарегистрировать малую пору, чтобы разобраться в механизме ее образования в ходе перезамыкания исходных мембран. Принципиально новые возможности открылись после того, как был разработан метод пэтч-клампа (отведение тока при помощи микропипетки), который произвел буквально революцию в клеточной биологии [1]. Метод пэтч-клампа удивительно красив и прост. Крошечная стеклянная микропипетка прижимается к плазматической мемб-

ране до тех пор, пока не образуется плотный контакт, обеспечивающий электрическую и химическую изоляцию внутренности пипетки от окружающего раствора. Кусочек мембраны, который находится на кончике пипетки, деликатно разрушается, в результате чего возникает электрический и химический доступ внутрь клетки (рис. 2, а). Усилитель тока, включенный между двумя электродами, один из которых находится в пипетке, а другой – в окружающем клетку растворе, позволяет поддерживать определенный мембранный потенциал и измерять электрический ток, состоящий из омической и емкостной компонент. Последняя отвечает переносу ионов, которые необходимы для заряжения мембранной емкости до определенного потенциала. Полный перенесенный заряд пропорционален площади мембранного конденсатора. Следовательно, если с плазматической мембраной сливается гранула, находящаяся в цитоплазме, и тем самым увеличивается суммарная площадь клеточной поверхности, это может быть обнаружено методом пэтч-клампа путем регистрации емкостного тока. Зарядка мембранного конденсатора гранулы происходит через пору слияния, проводимость которой определяет кинетику емкостного тока. Регистрируя этот ток как функцию времени, можно установить, как именно изменяется радиус поры. Измерения показали, что пора открывается скачком, ее радиус при этом составляет ∼ 0,2 нм, затем она закрывается, открывается вновь и, наконец, размер поры начинает быстро нарастать. Измерения емкости гранулы на стадии быстрых переходов между открытым и закрытым состояниями поры показали, что площадь гранулы за это

Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . К А К С Л И В А Ю Т С Я Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е М Е М Б РА Н Ы

5

БИОЛОГИЯ близкое расстояние, чтобы они самопроизвольно слились? Ответить на него удалось с помощью бислойных липидных мембран (БЛМ).

а Усилитель тока

СЛИЯНИЕ ПЛОСКИХ БЛМ Электрод

Гранула

Микропипетка Клетка

Белки слияния Пора слияния

б

1

2 4

I

M1

3 M2

II

5

III

Рис. 2. Методы изучения слияния БЛМ: а – пэтчкламп; б – конструкция трехкамерной измерительной ячейки для изучения слияния БЛМ. 1, 2, 3 – электроды; 4, 5 – стержни

время заметно возрастает. Этот рост достигается за счет переноса ∼105 липидных молекул из плазматической мембраны в мембрану гранулы. Из этого наблюдения следует, что стенки самых малых пор выстланы липидами, что обеспечивает связность системы по липидной компоненте и значительный липидный поток, движущей силой которого является, по-видимому, разность натяжений между плазматической мембраной и мембраной гранулы. Эти результаты служат дополнительным аргументом в пользу предположения, что слияние мембран происходит в области вершины димпла, стенки образующейся поры слияния включают в свой состав липиды и, возможно, какие-то белки, причастные к процессу слияния. Таким образом, мы пришли к выводу, что формирование тесного локального контакта мембран – это функция белка. Теперь попробуем ответить на следующий вопрос: достаточно ли свести липидные бислои на

6

Общая картина процесса. Плоские БЛМ являются очень удобной и эффективной моделью, которая помогла решить множество задач биофизики мембран (см. [2] и [3]). Плоская БЛМ обычно формируется в ячейке, состоящей из двух камер, разделенных тонкой тефлоновой перегородкой, в которой имеется маленькое отверстие диаметром порядка 1 мм. Ячейку заполняют раствором электролита, в камеры вводят электроды и на перегородку в области отверстия наносят каплю раствора фосфолипидов в органическом растворителе, например в н-декане. Капля самопроизвольно растекается, при этом избыток липида и растворителя вытесняется на периферию отверстия, формируя так называемый мениск, а в центре отверстия возникает липидный бислой толщиной около 4 нм. Естественно было применить эту модель для изучения слияния мембран, создав вместо одного бислоя два расположенных соосно. Это было реализовано с помощью трехкамерной ячейки, изображенной на рис. 2, б. Мембраны М1 и М2 формируются на отверстиях в перегородках, стержни 4 и 5 позволяют повышать давление в отсеках I и III и тем самым выдавливать бислои навстречу друг другу. Во всех отсеках находятся электроды, подключенные к измерительной аппаратуре, которая позволяет регистрировать омический и емкостный токи, а также измерять плотность поверхностного заряда любого монослоя до и после слияния. Площадь бислоев определяется визуально с помощью микроскопа. Эта методика требует от исследователя незаурядного мастерства, но зато позволяет наблюдать и изучать всю последовательность стадий процесса слияния. После приведения в контакт двух бислоев удается выявить одни и те же характерные стадии процесса слияния (рис. 3, А ). Выдавливание мембран навстречу друг другу из исходного положения (состояние 1 ) с помощью перепада гидростатического давления приводит к постепенному уменьшению толщины водной прослойки между ними вплоть до установления равновесного плоскопараллельного контакта (состояние 2 ). При этом гидростатическое давление и молекулярное притяжение, сближающие бислои, уравниваются с действующими в противоположном направлении силами гидратационного и электрического отталкивания. Пока все выглядит просто и понятно, а дальше начинаются удивительные вещи. Оказывается, состояние 2 является метастабильным, то есть спустя некоторое время происходит самопроизвольный переход из 2 в 3. В ходе этой стадии два

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 5 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ А

1

2

3

4

б

в

г

∆p

Б Полярные головки Гидрофобное ядро а

Рис. 3. А – последовательность промежуточных состояний, которая наблюдается при слиянии двух плоских липидных бислоев; Б – схема возникновения и развития сталка. Объяснения в тексте

ма интеркаляции необходимо приложить к исходным бислоям фантастическое давление, которое эквивалентно создаваемому водяным столбом в 100 км высотой. Это связано с тем, что требуются громадные усилия, чтобы перенести полярные головки фосфолипидов через гидрофобный слой мембраны. Оценка оценкой, но хотелось бы подтвердить ее прямыми экспериментами. Это было сделано следующим образом. Исходные бислои формировали из разных фосфолипидов – один из нейтральных, а другой из заряженных. Затем их слили, получили контактный бислой и измерили плотность поверхностного заряда на его монослоях. Предсказание совершенно очевидно: если работает механизм встраивания, то оба монослоя контактной мембраны должны стать равно заряженными с половинной от исходной плотностью заряда (рис. 4, а). Результат оказался совершенно другим: один монослой остался

бислоя, находившиеся в тесном контакте, превращаются в один бислой, обеспечивающий непрерывность внешних монослоев мембран в пределах всей системы. Можно сказать, что здесь произошло полуслияние: мембраны объединились, но водные объемы камер I и III по-прежнему разъединены. Термин “полуслияние” отражает и то обстоятельство, что слились только внешние монослои мембран. Чтобы убедиться в этом, достаточно пометить липиды во внешнем монослое одной мембраны, включив в нее например, какое-то количество заряженных липидов, тогда как другая мембрана таковых не содержит. Измерения поверхностного потенциала показали, что после завершения полуслияния заряженные липиды обнаруживаются во внешнем монослое второй мембраны. Состояние 3 является довольно устойчивым. Разрушить контактный бислой и тем самым завершить процесс слияния (состояние 4 ) можно прикладывая к контактному бислою электрическое поле. В результате возрастает вероятность появления в нем поры, развитие которой приводит к разрушению бислоя (подробно описано в [3], [4]). Эта стадия фактически завершает процесс слияния, так как теперь объединены и мембраны, и водные объемы отсеков I и III. Механизм полуслияния. Перейдем к рассмотрению самой интригующей стадии процесса – полуслиянию (рис. 3, Б ) [5]. Можно представить несколько механизмов превращений двух соприкасающихся бислоев в один. Например, пусть липидные молекулы одного бислоя расступаются, и между ними внедряются липиды из второго бислоя (рис. 4, а). Энергетические расчеты, однако, показывают, что для реализации этого механиз-

а

б

Рис. 4. Иллюстрация двух возможных путей полуслияния: а – интеркаляция, б – выдавливание монослоев

Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . К А К С Л И В А Ю Т С Я Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е М Е М Б РА Н Ы

7

БИОЛОГИЯ нейтральным, а другой сохранил прежний заряд. Отсюда следует очевидный вывод – контактный бислой формируется из удаленных монослоев исходных мембран, а близлежащие монослои отступают из области контакта (рис. 4, б ). Визуальные наблюдения показывают, что полуслияние начинается из одной точки. Это подтверждается также измерениями емкости системы в реальном времени. В состоянии плоскопараллельного контакта емкость относительно мала, так как она определяется двумя последовательно включенными конденсаторами, каждый из которых эквивалентен одному бислою. В течение некоторого времени ожидания емкость остается постоянной, после чего она начинает расти и выходит на значение, равное емкости бислоя. Опыты показали, что времена ожидания полуслияния имеют порядок от секунд до минут и в существенной степени зависят от липидного состава мембран. Рост емкости во времени, очевидно, отражает динамику роста зародыша контактного бислоя. Теперь обсудим, как представляется сегодня этот зародыш, какова его структура, как он возникает и развивается. Модель сталков. Прежде всего заметим, что полуслияние энергетически выгодно, так как переход из состояния 2 в 3 (рис. 3, А ) уменьшает суммарную поверхность системы: вместо двух бислоев мы получаем один. Однако состояния 2 и 3 отделены активационным барьером, который определяет время ожидания монослойного слияния. Преодолеть этот барьер помогают тепловые флуктуации. Высота барьера во многом определяется свойствами промежуточных состояний, через которые осуществляется переход 2 3. Их выбор диктуется тем, какие деформации претерпевает бислой в ходе тепловых флуктуаций. Напомним, что липидный бислой – жидкий кристалл. Латеральная (вдоль бислоя) подвижность липидных молекул велика, в этом направлении мембрана течет как обычная жидкость. В перпендикулярном к поверхности направлении липидный бислой гораздо ближе к твердому телу, он с трудом поддается сжатию. Кроме того, липидный бислой обладает жесткостью на изгиб, чтобы его согнуть, необходимо приложить изгибающий момент сил. Именно эти виды деформаций – латеральное смещение молекул и их изгиб, которые активируются тепловой энергией среды, – существенны для возникновения зародыша полуслияния и его роста. После этих вводных замечаний будет легче пояснить механизм полуслияния, проиллюстрированный на рис. 3, Б, где изображена последовательность состояний на пути от двух бислоев (а) к одному контактному бислою (г). Предполагается, что под действием тепловых флуктуаций происходят локальные деформации изгиба и латерального сдвига, в результате которых образуются вспучивания, экспонирующие в раствор гид-

8

рофобные «хвосты» липидных молекул (б ). Притяжение таких гидрофобных пятачков на соседних мембранах приводит к формированию между ними перемычки (в), которую назвали сталком (от англ. stalk – стебелек). Сталк обладает высокой энергией, так как формирующий его липидный бислой сильно изогнут. Расширение сталка, сопровождающееся слиянием удаленных монослоев, приводит к образованию контактного бислоя. Однако, чтобы сталк спонтанно расширялся, его энергия должна убывать по мере расширения. Расчет энергии сталка показал, что она зависит от природы липидов и их склонности к изгибным деформациям. Молекулярная геометрия липидов. В мембранологии распространено понятие “молекулярная форма липида”, отражающее соотношение размеров полярной головки и гидрофобной части молекулы в плане. Подчеркнем, что под формой липидных молекул подразумевается не просто конформация отдельной молекулы, а эффективная форма липида в построенном из него монослое, которая в значительной степени отражает взаимодействие молекул между собой и с окружающим раствором. Так, молекула лизолипида (например, LPC), у которой голова шире хвоста, – это конус, фосфатидилхолин (PC) – цилиндр, а фосфатидилэтаноламин (РЕ), у которого голова уже хвоста, – обратный конус (рис. 5). При переходе от отдельных молекул к описанию монослоя в целом принято характеризовать его так называемой спонтанной кривизной. Она определяется как та кривизна, которую приобрел бы свободный монослой. Спонтанная кривизна монослоя отличается, конечно, от реальной геометрической кривизны, которая обусловлена не формой входящих в него молекул, а совокупностью действующих на него внешних сил и моментов. Итак, монослой, содержащий LPC, стремится стать выпуклым, а содержащий РЕ – вогнутым. Принято считать, что в первом случае монослой обладает положительной спонтанной кривизной, а во втором – отрицательной. На рис. 5 проиллюстрирована тенденция липидных молекул в зависимости от их формы образовывать различные небислойные структуры. Так, молекулы-конусы (например, LPC) способствуют возникновению пор, а обратные конусы (например, РЕ) – возникновению сталков. Следовательно, введение в близлежащие монослои LPC должно тормозить слияние, а введение РЕ способствовать ему. В свою очередь, включение LPC в удаленные монослои должно способствовать разрушению контактного бислоя. Эксперименты показали, что все эти предсказания качественно верны. Разработанная теория сталков подтвердила справедливость этой модели количественно. Она показала, что при достаточно большой отрицательной спонтанной кривизне рост сталка энергетически выгоден.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 5 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ а

I

II

III

б

Рис. 5. Форма липидных молекул и предпочтительная структура монослоя: а – эффективная форма липидных молекул, б – характерные дефекты в бислойной мембране

Подводя итоги исследований слияния в модельных системах, отметим следующие принципиальные результаты. Прежде всего удалось показать, что липидные бислои могут самопроизвольно сливаться, если они приведены в тесный контакт. Кроме того, установлено, что процесс перезамыкания мембран протекает через две последовательные стадии. В ходе первой возникает перемычка (сталк) между близлежащими монослоями, которая расширяется, формируя контактный бислой. Этому процессу способствует отрицательная спонтанная кривизна близлежащих монослоев. Вторая стадия – переход от полуслияния к полному слиянию требует разрушения контактного бислоя, чему способствует положительная спонтанная кривизна удаленных монослоев или повышенное натяжение. Таким образом, теперь мы знаем, какие именно характеристики мембран определяют их способность к слиянию – это спонтанная кривизна и натяжение. Данный вывод, полученный в модельных системах, носит в действительности общий характер, то есть он должен приниматься во внимание и при рассмотрении механизмов слияния мембран биологических, когда в процессе участвуют белки. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Слияние биологических мембран – это многостадийный процесс, в ходе которого принимают участие мно-

жество белков и липиды. Первейшая роль белков состоит в том, что они приводят в тесный локальный контакт мембраны партнеров слияния. К сожалению, до сих пор не выяснено, какие именно белки (и как) выполняют эту сложную работу. С липидной компонентой дело обстоит лучше: с помощью модельных систем удалось выяснить, при каких условиях они подвержены самопроизвольному полуслиянию. Если предположить, что и в области локального контакта биомембран происходит полуслияние, то остается понять, каким образом разрушается контактный бислой. Наиболее популярная гипотеза сводится к тому, что белки слияния создают дополнительное натяжение или изгибающий момент в контактном бислое, разрыв которого приводит к образованию поры слияния. Проверка этой гипотезы – дело ближайшего будущего. ЛИТЕРАТУРА 1. Регистрация одиночных каналов / Под ред. Б. Сакмана, Э. Неера. М.: Мир, 1987. 448 с. 2. Антонов В.Ф. Биофизика мембран // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 6. С. 4–12. 3. Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин // Там же. 2000. Т. 6, № 8. С.12–17. 4. Антонов В.Ф. Липидные поры: Стабильность и проницаемость мембран // Там же. 1998. № 10. С. 10–17. 5. Черномордик Л.В., Меликян Г.Б., Чизмаджев Ю.А. // Биол. мембраны. 1987. Т. 4. С. 117–164.

Рецензент статьи Ю.А. Владимиров *** Юрий Александрович Чизмаджев, доктор химических наук, профессор кафедры биофизики МГУ, член-корреспондент РАН, зав. лабораторией биоэлектрохимии Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН. Область научных интересов – биофизика мембран. Автор 260 научных трудов и трех монографий.

Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . К А К С Л И В А Ю Т С Я Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е М Е М Б РА Н Ы

9