Молекулярная неврология

УДК 616-055.5/7:577.2 Б Б К Р252.215

Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е. А., Красильников В. В. Молекулярная неврология.Часть 1. Заболевания нервно-мышечной системы. СПб, "Интермедика", 2000 - 320 стр. ISBN 5-89720-026-2

Предлагаемая читателю обзорная монография является одной из первых попыток систематизации накопленной к настоящему времени информации в области молекулярной неврологии. Первая часть моно­ графии посвящена анализу молекулярно-генетических основ нервно-мы­ шечных заболеваний. Основное внимание в книге уделено тем наследст­ венным болезням нервной системы, для которых расшифрована природа первичного молекулярного дефекта. После клинического описания каж­ дого заболевания, подробно представлена история картирования и иден­ тификации мутантного гена, дана его молекулярная характеристика; опи­ саны типы и распростанённость мутаций, идентифицированных у паци­ ентов, с указанием используемых в клинической практике методов мо­ лекулярной диагностики данного патологического состояния; дан обзор существующих модельных генетических линий животных. Особое внима­ ние уделено описанию первичного биохимического дефекта, лежащего в основе патогенеза заболевания. Рассмотрены подходы к разработке патогенетических методов терапии, включая генную терапию. Книга ад­ ресована врачам, преподавателям и студентам, специализирующимся в области неврологии, а также педиатрам и медицинским генетикам. Мо­ нография может быть использована в качестве справочного руководст­ ва при составлении специализированных учебных циклов по молекуляр­ ной неврологии для студентов медицинских вузов и слушателей системы последипломного образования.

© В.Н. Горбунова О Оформление "Интермедика" ISBN 5-89720-026-2

Посвящается памяти основателя отечественной нейро/енетнки академика Сергея Николаевича Да виден ко ва

При подготовке рисунков 1, 2, 4, 5, 16, 17, 18 и 19 использо­ вали Color atlas of genetics (Passarge E., 1995). Рисунок 7 подго­ товлен по иллюстрациям двух статей (Nigro et al., 1996; Vainzof et al.f 1996). Рисунок 9 взят из работы (Chamberlain J.S., 1999). Рисун­ ки 10 и 11 любезно предоставлены профессором В. С. Барановым. При подготовке рисунков 12 и 13 использовали работы (Bonnemann et al., 1996) и (McNally et al., 1996), соответственно. Рисунок 15 взят из работы (Nowak et al., 1999). Рисунок 20 подготовлен по работе (Harris et al., 1996). Рисунок 21 подготовлен по работе (Bulman D. Е., 1997). Рисунки 22 и 23 взяты из работы (Tanaka et al., 1996).

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ

11

Глава 1 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ И МИОПАТИИ

19

1.1. Общая характеристика

19

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера и дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии

зо

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7 8. 9. 10.

31

Клиническая характеристика заболевания 31 Картирование и идентификация гена DMD 34 Мутации в гене DMD и их диагностика 36 Структура и функции дистрофина 44 Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD, апо-дистрофины 49 Дистрофин-ассоциированный комплекс белков 53 Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии 59 Семейство DMD-родственных генов 67 Линии мышей, моделируюшие миодистрофию Дюшенна/Беккера 72 Генотерапия миодистрофии Дюшенна/Беккера 80

б) Мышечная дистрофия врожденная прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма (MIM: 253800) 85 1.3. Конечностно-поясные мышечные дистрофии

87

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомнодоминантная, типы: 1A (MIM:159100); 1В; 1С; аутосомно-рецессивная, типы: 2A(MIM:253600); 2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119); 2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400) 88

1. 2. 3. 4. 5.

Общая генетическая характеристика 89 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнодоминантная, форма LGMD1C 90 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, форма LGMD2A 91 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, форма LGMD2B 93 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, формы LGMD2C-2F (саркогликанопатии) ....95

6) Мышечная дистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом (MIM: 226670) 100 1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина (MIM: 158900) 102 1.5. Миодистрофии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины (эмеринопатии) 107 а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300).... 108 1. 2. 3. 4. 5.

Клиническая характеристика заболевания Картирование и идентификация гена EMD Структура гена STA и типы мутаций Структура и функции эмерина Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы)

108 108 110 112 114

б) Скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией (MIM: 181350) 115 1.6. Врожденные непрогрессирующие миопатии

117

а) Мышечная дистрофия врожденная мерозин-дефицитная (MIM: 156225) 118 б) Миопатия врожденная, обусловленная недостаточностью а 7 интегрина Ы D 121 в) Нитчатая (немалиновая) миопатия, тип 1 (MIM: 161800); тип 2 (MIM: 256030) 122 1. 2. 3. 4.

Клиническая характеристика заболевания 122 Роль а-актинина и а-тропомиозина в патогенезе немалиновой миопатии 123 Молекулярные основы аутосомно-рецессивной медленно прогрессирующей немалиновой миопатии 125 Актиновая миопатия 126

г) Болезнь центрального стержня (MIM: 117000)

130

д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400) е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810)

132 137

1.7. Миопатии с цитоплазматическими и ядерными включениями в мышечных клетках а) Миопатия окулофарингеальная (MIM: 164300) б) Миопатия дистальная с накоплением десминовых включений (MIM: 125660). Десмин-родственная миопатия (OMIM: 601419) в) Миопатия с инклюзионными тельцами, аутосомно-доминантная (MIM: 147420); аутосомно-рецессивная (OMIM: 601073) 1.8. Митохондриальные миопатии

140 141

144

146 147

а) Миопатии митохондриальные с делециями и дупликациями митохондриальной ДНК (MIM: 550000, 160550); синдром Кернса-Сейра (MIM: 530000) 154 1.9. Метаболические миопатии

157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, Мак-Ардла болезнь (MIM: 232600) 158 б) Миопатия с дефицитом карнитин пальмитоилтрансферазы I (MIM: 255110) 160 в) Миопатия напряжения (MIM: 102770) 161 г) Миопатия, обусловленная недостаточностью фосфоглицератмутазы (MIM: 261670) 162

ГЛАВА 2 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МИОТОНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ

165

2.1. Общая характеристика

165

2.2. Миотонические синдромы

169

а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900)

169

1 2. 3. 4. 5. 6.

Клиническая характеристика заболевания Картирование и идентификация гена DM Молекулярная природа мутаций в гене DM Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM Биохимическая характеристика продукта гена DM Молекулярные основы патогенеза миотонической дистрофии 7 Характеристика других генов, участвующих в патогенезе миотонической дистрофии 8. Модельные линии животных

169 170 170 173 174 176 178 179

Ь) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь Беккера (MIM: 255700) 181 2.3. Периодические параличи

185

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа (MIM:170500; 168300; 168350; 170600) 185 б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа (MIM: 170400) 188 в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа (MIM: 170600) 190

ГЛАВА 3 БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА

191

3.1. Общая характеристика

191

3.2. Спинальные мышечные атрофии

198

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия Кугельберга-Веландер (MIM: 253400) 199 1. Клиническая характеристика заболевания 2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика SMA-области 3. Идентификация и молекулярная характеристика гена SMN

199 206 208

4. Идентификация мутаций у пациентов со спинальной мышечной атрофией 210 5. Характер экспрессии гена SMN 211 6. Функции белка выживания двигательных нейронов 213 7 Молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии 215 8. Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии других генов, расположенных в SMA-области 216

б) Спинально-бульбарная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди (MIM: 313200) 219 3.3. Наследственные полинейропатии 225 а) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200; 159440; 145900) 229 б) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220; 145900); нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (MIM: 162500) 231 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Картирование гена СМТ1А 231 Молекулярно-генетическая характеристика СМТ1А-области 231 Нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва 233 Идентификация гена РМР22 234 Мутации в гене РМР22 236 Генетические модели болезни Шарко-Мари-Тус IА типа 237

в) Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия (MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490) г) Болезнь Шарко-Мари-Тус, нейронального типа II (MIM: 118210, 600882,158580, 601472) д) Нейропатия Шарко-Мари-Тус, тип IV (MIM: 214400; 601382; 601596) е) Наследственная сенсорная нейропатия, тип1(М1М: 162400) 3.4. Боковой амиатрофический склероз (MIM: 105400) 1. 2.

Клиническая характеристика заболевания Метаболизм глутамата при боковом амиотрофическом склерозе

238 241 242 244 245 245 247

3. 4. 5. 6. 7.

Картирование и идентификация гена ALS1 Мутации в гене SOD1 Модельные линии животных Патогенетические механизмы действия мутаций в гене SOD1 Другие генетические формы бокового амиотрофического склероза

248 250 251 252 255

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

256

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

257

СЛОВАРЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ

зоз

ВВЕДЕНИЕ В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в области молекулярной генетики человека, позво­ лившие от формального описания генов и менделевских за­ конов наследования перейти к их детальной идентификации. Определена организация основных элементов генома чело­ века, построены подробные цитогенетические карты, являю­ щиеся основой для выявления, изоляции и анализа индиви­ дуальных генов человека. Проведено секвенирование пол­ ной нуклеотидной последовательности молекулы ДНК чело­ века, длина которой достигает 3.5 миллиарда пар основа­ ний. Это означает, что в ближайшие годы будут открыты все гены человека, число которых по разным оценкам составля­ ет от 80 до 100 тысяч. В настоящее время известна цитогенетическая локализация около 30 ООО генов человека и рас­ шифрована молекулярная природа более 10 000 этих генов. Около 1000 из них связаны с моногенными наследственны­ ми заболеваниями. Открытие гена означает не только нахождение в гено­ ме человека определенного участка ДНК, собственно и яв­ ляющегося геном, но обязательную изоляцию и определение нуклеотидной последовательности полноразмерной кодиру­ ющей области гена, так называемой молекулы комплемен­ тарной ДНК (кДНК). Клонирование кДНК, то есть ее введе­ ние в бактериальную или дрожжевую систему, позволяет по­ лучать неограниченное количество копий этой молекулы и осуществлять различные манипуляции in vitro, направленные на расшифровку структурной и функциональной организации гена. Именно клонированная кДНК получила название «гена в пробирке». Определение экзон-интронной структуры гена, ответственного за развитие определенного наследственного заболевания, и секвенирование нуклеотидной последователь­ ности его кодирующих и регуляторных областей создают ос­ новы для молекулярной идентификации мутаций у пациен­ тов и разработки программ, направленных на профилактику

11

данного состояния на базе досимптоматической и пренатальной диагностики. Кроме того, знание нуклеотидной последо­ вательности гена позволяет прогнозировать аминокислотную последовательность кодируемой полипептидной цепи и ре­ конструировать третичную структуру, доменную организацию и функциональные свойства белка, являющегося первичным биохимическим дефектом при соответствующем наследствен­ ном заболевании. Небольшие фрагменты этого белка могут быть получены путем искусственного синтеза полипептидных молекул или путем клонирования кодирующих участков гена в экспрессионных системах. В дальнейшем эти фрагменты могут быть использованы для конструирования антител, с помощью которых проводится не только исследование тканеспецифического распределения белкового продукта гена в норме и при патологии, но также изоляция этого белка в препаративных количествах для прямого биохимического анализа. Таким образом, открытие гена создает реальные предпосылки для изучения молекулярных основ этиологии и патогенеза наследственного заболевания, а также для раз­ работки патогенетических методов терапии. Идентификации гена человека часто предшествует опи­ сание гомологичного гена у экспериментальных животных, в частности у мышей. И наоборот, если гомологичный ген мыши не был известен, его идентификация проводится вскоре пос­ ле описания соответствующего гена человека. На следую­ щем этапе появляется возможность искусственного констру­ ирования модельных линий трансгенных животных путем направленного разрушения гомологичного гена в ранних за­ родышах мышей («нокаут») или введения в этот ген специ­ фических мутаций. Отбор особей, содержащих модифици­ рованный ген в зародышевых клетках, и последующая се­ лекционная работа завершаются созданием генетической линии животных со специфическими мутациями в заданном гене. Подобные трансгенные линии мышей являются очень удобными обьектами для изучения молекулярных и биохи­ мических основ патогенеза наследственных заболеваний 12

человека, а также для разработки специфических методов предупреждения и лечения таких состояний. Одним из важнейших итогов проводимых исследова­ ний является определение молекулярных основ клинической и генетической гетерогенности. Оказалось, что один и тот же клинический фенотип может быть обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, различные мутации одного и того же гена могут приводить к различному течению забо­ левания и даже реализоваться в нозологически самостоя­ тельные типы болезней, образующие так называемые аллельные серии. В настоящее время точная диагностика, а значит профилактика и терапия многих наследственных болезней возможна только с учетом данных молекулярно-генетического анализа. Эти положения могут быть проиллюстрированы на при­ мере многих сотен наследственных заболеваний. Данная монография посвящена описанию молекулярно-генетических основ наследственных болезней нервной системы. Моногра­ фия состоит из пяти частей, каждая из которых будет выпу­ щена в виде отдельного издания. При делении материала на части мы руководствовались не только клиническими, но так­ же и молекулярно-генетическими принципами. Первая часть посвящена заболеваниям нервно-мышечной системы и вклю­ чает: болезни мышц —мышечные дистрофии, миопатии, миотонические синдромы и периодические параличи, а также заболевания с преимущественным поражением перифери­ ческого двигательного неврона — проксимальные спинальные мышечные атрофии, полинейропатии, боковой амиатрофический склероз. В настоящее время известно более 5000 моногенных заболеваний. В значительном проценте случа­ ев моногенные болезни сопровождаются различными дефек­ тами нервной системы. Разумеется, рамки настоящего изда­ ния не позволяют остановиться на всех наследственных за­ болеваниях с поражением нервной системы. Основное вни­ мание будет уделено тем болезням, для которых мутантные гены уже открыты и расшифрована природа первичного мо13

пекулярного дефекта. Мы коротко остановимся на клинике каждого из этих заболеваний, подробно опишем историю кар­ тирования и идентификации гена, ответственного за разви­ тие заболевания, представим его молекулярную характери­ стику, типы и распространенность мутаций, идентифициро­ ванных у пациентов, методы молекулярной диагностики дан­ ного состояния, дадим обзор существующих модельных ге­ нетических линий животных. Особое внимание будет уделе­ но описанию первичного биохимического дефекта, лежаще­ го в основе патогенеза заболевания; в тех случаях, когда это возможно, остановимся на разрабатываемых программах генной терапии. Краткость клинического описания рассматриваемых заболеваний обусловлена существованием в отечественной литературе достаточного количества посвященных этим во­ просам монографий, руководств и обзоров (Давиденков, 1925; Калмыкова, 1976; Гехт, Ильина, 1982; Бадалян и др., 1988; Гринио, Агафонов, 1997; Лобзин и др., 1998; Вельтищев, Темин, 1998). Однако во всех этих изданиях практичес­ ки отсутствуют сведения о молекулярно-генетических осно­ вах заболеваний нервной системы. Наиболее полно генети­ ческие аспекты освещены в руководстве по наследственным болезням нервной системы, выпущенном в 1998 году под редакцией академика РАМН Ю. Е. Вельтищева и профессо­ ра П. А. Темина. Современный обзор по молекулярным ос­ новам прогрессирующих миодистрофий опубликован в жур­ нале Неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова (Иллариошкин, Иванова-Смоленская, 1998). Тем не менее в целом сведения по молекулярной неврологии в русскоязычной ли­ тературе носят чрезвычайно фрагментарный характер. В то же время молекулярная неврология — это одна из наиболее динамично развивающихся областей медицинской генетики, в которой накоплен огромный фактический материал. Этот материал, по нашему мнению, достаточен для определен­ ных обобщений. Мы не претендуем на полноту охвата всех исследований, проводимых в области молекулярной невро14

логии, но постарались отразить основные тенденции в раз­ витии этой науки. Большая часть результатов, изложенных в данной монографии, имеет фундаментальное значение, хотя часть сведений может устареть уже к моменту выхода книги из печати. В мировой литературе имеются расхождения в назва­ нии многих моногенных болезней, существуют определенные трудности в их клинической диагностике, а некоторые ред­ кие заболевания, выделяемые в самостоятельные формы лишь на базе молекулярно-генетического анализа, отечест­ венным специалистам практически неизвестны. С учетом этого в большинстве случаев после названия каждого опи­ сываемого заболевания мы указали его энциклопедический номер (MIM), соответствующий составленному В. Мак-Кьюсиком каталогу генов и моногенных болезней человека («Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes»). Исключение составляют только те заболевания, которые были выделены в самостоятельные нозологические формы после выхода последнего издания каталога в 1997 г. Номера MIM позволя­ ют, на наш взгляд, избегать путаницы в определении конкрет­ ного моногенного заболевания. Обозначения генов также соответствуют каталогу В. Мак-Кьюсика. В большинстве слу­ чаев рядом с названием гена в скобках мы даем расшифров­ ку его обозначения, подчеркивая те буквы, которые входят в аббревиатуру. В монографии использована одна из универсальных систем обозначения мутаций, рассчитанная на запись ами­ нокислотных замен в белках. При этом каждая аминокислота обозначается однобуквенным символом (табл. 1). Располо­ женный в центре номер соответствует месту замены в це­ почке первичного продукта трансляции, слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа — мутантный. Например, запись C283Y означает замену цистеина на тиро­ зин в 283 положении белка. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Бук15

вой X обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например, запись R49X означа­ ет прекращение трансляции на месте аргинина в 49 положе­ нии белка. Таблица 1 Символы аминокислот Аминокислоты Алании Аргинин Аспарагин Аспарагиновая кислота Asn и/или Asp Цистеин Глутамин Глутаминовая кислота Gin и/или Glu Глицин Гистидин Изолейцин Лейци Лизин Метионин Фенилаланин Пролин Серин Треонин Триптофан Тирозин Валин

Трехбуквенный символ Ala Arg Asn Asp Asx Cys Gin Glu Glx Gly His He Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

Однобуквенный символ A R N D В С Q E Z G H I L К M F P S T

w Y V

Книга адресована врачам-неврологам, педиатрам, ме­ дицинским генетикам, преподавателям и учащимся медицин­ ских вузов, а также слушателям факультетов усовершенст­ вования врачей, специализирующимся в области невроло­ гии. Чтение монографии требует знания основ молекуляр16

ной генетики человека в объеме учебных пособий — В. Н. Горбунова, В. С. Баранов «Введение в молекулярную диаг­ ностику и генотерапию наследственных заболеваний» (СПб.: «Специальная литература», 1997) или В. Н. Горбунова «Мо­ лекулярные основы медицинской генетики», (СПб.: «Интер­ медика», 1999). Для облегчения восприятия материала кни­ га снабжена словарем генетических терминов, составленным в алфавитном порядке.

Глэвэ 1 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ И МИОПАТИИ 1.1. Общая характеристика Наследственные заболевания, в основе которых лежит первичное нарушение мышечной ткани, объединены в боль­ шую группу, именуемую миопатиями. В основе клиники ле­ жит атрофия мышц, мышечная слабость, снижение глубоких рефлексов. Типичны системность поражения поперечно-по­ лосатых мышц и прогрессирующий характер течения заболе­ вания. Миопатии — наиболее часто встречающаяся патоло­ гия в большой группе наследственных нервно-мышечных за­ болеваний. Будучи сходными по клиническим признакам, ми­ опатии являются разнородными заболеваниями, отличающи­ мися типом наследования, особенностями мышечного мета­ болизма, иногда специфическими изменениями структуры мышечного волокна. Сходство клинических проявлений ми­ опатии, в первую очередь, относится к особенностям пере­ движения больных, их типичной походке, моторике верхних конечностей, туловища, обусловленных начальным вовлече­ нием в патологический процесс мышц тазового и плечевого пояса, проксимальных отделов конечностей, туловища. Ат­ рофии мышц, сопровождающиеся прогрессирующей мышеч­ ной слабостью, постепенно усиливаются, вовлекая в симме­ тричный процесс всё новые мышечные группы. Дегенератив­ ные изменения, происходящие в мышечной ткани, ведут к развитию мышечных и сухожильных ретракций, усиливающих Деформации конечностей. Особенно опасны для жизни боль­ ного поражения сердечной мышцы и мускулатуры, участву­ ющей в процессе дыхания. Сходство клинической картины миопатии относится только к кардинальным признакам. Каж­ дое из нозологически самостоятельных заболеваний имеет

19

клинические особенности, позволяющие с достаточной точ­ ностью установить диагноз. За последние годы в изучении наследственной мышеч­ ной патологии отмечены существенные сдвиги, благодаря внедрению современных методов анализа тонкой структуры мышечной ткани и особенностей ее метаболизма. Но наибо­ лее значительные успехи связаны с разработкой современ­ ных генетических технологий, позволяющих осуществлять поиск и идентификацию дефектных генов с последующей воз­ можностью проведения молекулярной диагностики мутаций у пациентов и описанием первичных биохимических нару­ шений, лежащих в основе развития патологических процес­ сов. В свете этих достижений более оптимистичными пред­ ставляются подходы к рациональному лечению некоторых форм миопатии, включая перспективы использования ген­ ной терапии. Общим свойством генов, дефектных при миопатиях, является их экспрессия в скелетных мышцах. С использова­ нием современных молекулярно-генетических технологий построена предварительная карта генов, экспрессирующихся в скелетных мышцах человека (Pallavicini et al., 1997). В процессе построения этой карты были идентифицированы 1945 индивидуальных генов, 725 из которых не имели гомо­ логии с уже известными генами человека. Затем была опре­ делена хромосомная локализация 267 этих неизвестных ге­ нов. Кроме того, для построения геномного транскрипцион­ ного профиля скелетных мышц человека была использова­ на информация о положении на карте дополнительных 242 экспрессирующихся последовательностей^ соответствующих известным генам. Оказалось, что некоторые гены кластерированы на разных хромосомах. Хромосомы 17, 19, 21 и X значительно обогащены генами, экспрессирующимися в мыш­ цах, по сравнению с другими хромосомами. Избирательная концентрация экспрессирующихся генов в некоторых хромо­ сомах и в специфических районах отдельных хромосом мо­ жет быть обусловлена существованием батарей генов, нахо20

дящихся под контролем одних и тех же механизмов, прини­ мающих участие в регулировании тканеспецифической экс­ прессии генов. В табл. 2 представлены данные по локализации генов, ответственных за наследственные миопатии, указаны пер­ вичные биохимические дефекты и дана краткая функциональ­ ная характеристика этих белков. Таблица 2 Молекулярно-генетическая характеристика наследственных миодистрофий и миопатии Нозологическая форма, MIM Миодистрофия Дюшенна; -Беккера, Х-сцепленная, 310200

Миодистрофия врожден­ ная, прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма, аутосомнорецессивная, 253800 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1А, 159100 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1В Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1С Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнорецессивная 2А, 253600

Ген,

Белок, функции

локализация DMD Хр21.2

FCMD, MUSC?

дистрофии - сарколеммный белок цитоскелета, связы­ вающий актин с экстракле­ точным матриксом через дистрофин-ассоциированный комплекс белков; аподистрофины рецепторная тирозинкиназа?

9q31-q33 LMNB1?

ламин В1? белок ядерной ламины

5q22.3-q31.3 LMNA?

ламин А/С? белок ядерной ламины

1q11-q21 CAV3

кавеолин-3 - дистрофинассоциированный белок мышечных кавеол

Зр25 CAPN3

15q15.1-q21 1

кальпаин-3 - мышечная протеаз

Продолжение Табл.2 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2В, 253601; миопатия дистальная Миоши, 254130 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2С, 253700 Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2D, 253700; первичная адхалинопатия, 600119

DYSF, ММ

2р13.3-2р13.1 SGG, ySG

13q12 ADL, DAG2, SGA, ctSG 17q21

Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2Е, 600900

SGB, PSG

Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2F, 601411

SGD, 8SG

Миодистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом, аутосомнорецессивная,226670 Лице-лопаточно-плечевая миодистрофия ЛандузиДежерина, аутосомнодоминантная IA, 158900

4q12

5q33 PLEC1

у-саркогликан белок дистрофинассоциированного комплекса а-саркогликан, адхалин белок дистрофинассоциированного комплекса р-саркогликан белок дистрофинассоциированного комплекса 8-саркогликанбелок дистрофинассоциированного комплекса плектин - белок соединяющий цитоскелет клетки с мембраной

8q24.13-qter FSHD1

4q35-qter

Миодистрофия ЭмериДрейфуса, Х-сцепленная, 310300

EMD, STA

Миодистрофия ЭмериДрейфуса, аутосомнодоминантная, 181350

EDMD-AD, LAMA 1q11-q23

Миодистрофия врожден­ ная мерозин-дефицитная, аутосомно-рецессивная, 156225

дисферлин - цитоплазмат ческий белок, взаимодей­ ствующий с ядерной и плазменными мембранами

эмерин - ядерный ламинаассоциированный белок

Xq28

LAMA2

6q22-q23

ламин А/С- белок ядерной ламины мерозин, ламинин 2 белок базальной ламины, связанный с дистрофинассоциированным комплексом белков

Продолжение Табл.2 Миопатия врожденная, интегрина7рЮдефицитная, аутосомнорецессивная

ITGA7

Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнорецессивная, 256030

NEB

12q13

2q21.2-q22

Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнодоминантная, 161800

NEM1, TPM3

Миопатия немалиновая, аутосомно-доминантная; миопатия актиновая

АСТА1

Болезнь центрального стержня; злокачествен­ ная гипертермия, аутосомно-доминантная, 117000

RYR1

Миопатия миотубулярная 1, Х-сцепленная, 310400 Миопатия Бетлема, аутосомно-доминантная, 158810; (120220; 120240; 120250)

Миопатия окулофарингеальная, аутосомнодоминантная, 164300 Миопатия дистальная с накоплением десмин вых включений, аут сомно-доминантная, 125660 Миопатия десминРодственная, аутосомноДоминантная,601419 Миопатия с инклюзионными тельцами, ауто­ сомно-рецессивная, 601073

интегрин p1D, ot7 - рецептор ламинина 2

1q23-q25.1

1q42

19q12-q13.2 MTM1, CG2

небулин - интегральный компонент тонких и толстых нитей саркомера тропомиозин-3 - главный белковый компонент латеральных Z-дисков а-актин - основной белковый компонент тонких нитей саркомера рецептор 1 рианодина кальций высвобождающий канал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц миотубулярин - мышечная тирозин-серин-фосфатаза

Xq28 COL6A1,

а 1, 2 и 3 субьединицы микрофибриллярного кол­ лагена VI типа мышц, COL6A3, 21q22.3, 2q37 выполняющего роль моста между клетками и внеклеточным матриксом. COL6A2

OPMD, PABP2 14q11.2-q13 DES

поли(А)-связывающий белок 2 десмин - белок семейства промежуточных филамент типа III

2q35 CRYA 11q21-q23 IBM2

9p1-q1

аВ-кристаллин - мажорный белок хрусталика, присутствующий в мышцах

Продолжение Табл.2 МакАрдла болезнь, аутосомно-рецессивная; гликогеноз V типа, 232600

PYGM

Миопатия, обусловленная СРТ-дефицитом аутосомно-рецессивная; гипераммониемия 255110

СРТ1

Миоаденилат дезаминазы дефицит, аутосомнодоминантная; миопатия напряжения, 102770 Миопатия, обусловленная PGAM М-дефицитом, аутосомно-рецессивная, 261670

фосфорилаза мышечная

11q13 карнитин-палмитоилтрансфераза 1

1р13-р11 AMPD1

АМФ-дезаминаза-1, мышечная

1р21-р13 PGAMM, PGAM2

фосфоглицератмутаза, мышечная М

7р13-р12.3

Значительная часть генов, связанных с наследствен­ ными болезнями мышщ, кодирует белки, ассоциированные с мембранами мышечных волокон. Одной из основных функ­ ций подобных белков является стабилизация мембраны за счет связывания цитоскелета мышечной клетки с внеклеточ­ ным матриксом. Это, в первую очередь, относится к стержневидному белку дистрофину, дефектному при миодистофиях Дюшенна и Беккера, получивших общее название дистрофинопатий. Дистрофии — полифункциональный белок, при­ надлежащий к спектрин/ос-актининовому суперсемейству бел­ ков цитоскелета. Он участвует в поддержании целостности мембраны мышечного волокна при его сокращении и в фор­ мировании нейромышечного синапса. Дистрофин является якорным белком для актиновых филамент, обеспечивающих жесткость цитоскелета миотубул. Располагается дистрофин под сарколеммой мышечного волокна. Его связь с экстра­ клеточными белками осуществляется через комплекс транс­ мембранных дистрофин-ассоциированных белков. При миодистрофии Дюшенна/Беккера, так же как при аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных и при некоторых формах конечностно-поясных миодистрофий происходит разрушение 24

дистрофин-ассоциированного комплекса белков, причем в по­ следних двух случаях первичным биохимическим дефектом часто оказывается один из белков дистрофин-ассоциирован­ ного саркогликанового субкомплекса: у-, а-, р- или 8-саркогликан. Подобные миодистрофии объединяют в группу саркогликанопатий. Следует подчеркнуть, что разрушение дистрофинового комплекса является одним из центральных звеньев в этио­ логии дилатационных кардиомиопатий. При этом наследст­ венные формы подобных заболеваний могут быть связаны с определенными дефектами как в гене дистрофина, так и в других генах, кодирующих белки дистрофин-ассоциирован­ ного комплекса, такие как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны (Towbin, 1998). Не исключено, что и приобретенные формы дилатационной кардиомиопатий, индуцированные энтеровирусами, в определенной степени обусловлены нарушением нормальной работы дистрофина и ассоциированного с ним комплекса белков (Badorf et al., 1999). Все эти факты свиде­ тельствуют о центральной роли дистрофин-ассоциированного комплекса белков в функционировании миоцитов и кардиомиоцитов. Еще одна тяжелая форма миодистрофии плечевого и тазового пояса обусловлена дефектом другого белка, ассоциированного с дистрофином и также локализованного в сарколемме мышечных волокон — кавеолина-3. Мутации в гене CAV3 нарушают образование кавеол в плазматической мембране мышечных клеток. Неожиданным оказалось обнаружение не структурного, а энзиматического дефекта в специфической мышечной протеазе — кальпаине-3 — при более м я г к о й форме данной миодистрофии. Наиболее простым объяснением может быть возможность участия этой протеазы в деградации или дестабилизации структурных компонентов цитоскелета, экстраклеточного матрикса или Дистрофинового комплекса. Не исключается также вероятная роль этого белка в слиянии миобластов и в контроле генной экспрессии. При другой мягкой форме конечностно-поясной 25

м и о д и с т р о ф и и д е ф е к т н ы м о к а з ы в а е т с я дисферлин — ц и т о п л а з м а т и ч е с к и й белок с н е и з в е с т н о й ф у н к ц и е й , способный взаимодействовать с ядерной мембраной и с мембранами сарко- и эндоплазматического ретикулума. Нарушение работы плектина — большого структурного якорного белка, соединяющего в кератиноцитах и в скелетных мышцах ц и т о с к е л е т к л е т к и с м е м б р а н о й , п р и в о д и т к необычной форме миодистрофии, сочетающейся с буллёзным эпидермолизом. В предлагаемом руководстве в отдельную группу заболеваний выделены миопатии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с ядерной ламиной. Эмерин — белок, ассоциированный с ламинином ядерной м е м б р а н ы , о к а з ы в а е т с я дефектным при Х-сцепленной форме м ы ш е ч н о й дистрофии с к о н т р а к т у р а м и Э м е р и Дрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная форма этого з а б о л е в а н и я с в я з а н а с д е ф е к т о м в гене LMNA, кодирующим два белка ядерной ламины — ламин А и С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена LMNA и они активно взаимодействуют с э м е р и н о м . Н е и с к л ю ч е н о , что а у т о с о м н о - д о м и н а н т н а я форма мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным вариантом одной из доминантных форм конечностно-поясной миодистрофии, ген которой LGMD1B картирован в той же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. А к т и в н о обсуждается возможность участия гена L M N B 1 , кодирующего еще один белок семейства ядерных ламинов — В 1 , в контроле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-поясной миодистрофии — LGMD1A, так как оба мутантных гена расположены в одной и той же области 5q23.3-q31.3. Миопатии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины, иногда объединяют в группу эмеринопатий. В самостоятельную клиническую группу выделяют врож­ денные непрогрессирующие миопатии, при которых дефект­ ными, как правило, оказываются гены, экспрессирующиеся 26

в раннем эмбриогенезе и кодирующие белки, участвующие в процессах роста, дифференцировки и пролиферации миобластов. Две из них обусловлены дефектами белков базальной ламины. Так, в основе развития врожденной миопатии, сочетающейся с гипомиелинизацией белого вещества моз­ га, лежит дефект мышечного белка ламинина 2, связанного с субсаркомерным цитоскелетом посредством олигомерного комплекса дистрофин-ассоциированных белков. Еще одна редкая форма врожденных миопатии связана с недостаточ­ ностью рецептора ламинина в мышцах. Патологические процессы при некоторых врожден­ ных миопатиях сопровождаются накоплением в клетках не­ растворимых включений. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клетках пациентов присутствуют нитеобраз­ ные патологические фибриллярные структуры, причиной образования которых является латеральная экспансия Zдисков. Эти экспансии могут возникать вследствие дефек­ тов различных белковых компонентов тонких и толстых нитей саркомера скелетных мышц. Одна из доминантных форм заболевания связана с мутациями в гене тропомиозина В. Наиболее частая аутосомно-рецессивная медлен­ но прогрессирующая немалиновая миопатия обусловлена мутациями в гене гигантского интегрального белка сарко­ мера — небулина. При наиболее тяжелых доминантных формах заболевания, часто заканчивающихся летальным исходом в младенческом возрасте, дефектным оказыва­ ется ген мышечного ос-актина. Определенные гистологические аномалии в мышеч­ ных клетках характерны также для пациентов с болезнью Центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обоих случаях дефектными оказываются белки, участвую­ щие в контроле дифференцировки мышечных волокон. Мембранным мышечным белком является рецептор рианодина 1, нарушение работы которого приводит к разви­ тию болезни центрального стержня/злокачественной гипер­ термии. Рецептор рианодина функционирует как кальций27

высвобождающий канал саркоплазматического ретикулу. ма скелетных мышц. Он необходим для нормального раз* вития и созревания мышц, а также его функции связаны с сокращением-расслаблением миофибрилл. Первичным биохимическим дефектом при миотубулярной миопатии, также сопровождающейся нарушениями нормального про­ цесса созревания мышц, является миотубулярин — один из новых членов семейства тирозинфосфатаз, участвую­ щих в регуляции роста, пролиферации и дифференцировки клеток. Различные варианты миопатии Бетлема обус­ ловлены дефектной структурой микрофибриллярного кол­ лагена VI типа, выполняющего в эндомизии и перимизии скелетных мышц роль моста между клетками и внеклеточ­ ным матриксом. Предполагается, что дефекты коллагена типа VI могут оказывать влияние на процессы дифференцировки миобластов либо, что более вероятно, на струк­ турную организацию внеклеточного матрикса. При целом ряде миопатии причиной дистрофических процессов является накопление в цитоплазме и/или в ядрах м ы ш е ч н ы х клеток г и с т о л о г и ч е с к и идентифицируемых включений, молекулярные механизмы формирования которых могут быть совершенно р а з л и ч н ы м и . Так при окулофарингеальной миопатии тубулофиламентные включения образуются за счет небольшого увеличения полиаланиновой цепочки в поли(А)-связывающем белке 2, присутствующем в клетках главным образом в димерной или в олигомерной формах. Показано, что полиаланиновые олигомеры чрезвычайно устойчивы к химической денатурации и энзиматической деградации. Возможно, олигомеры поли(А)связывающего белка 2, составленные из достаточного числа мутантных молекул, могут накапливаться в ядрах в качестве филаментных включений и вызывать гибель клеток. Подобная агрегация мутантных белков с удлиненными полиглютаминовыми треками обнаружена в ядрах нейронов по крайней мере при четырех нейро-дегенеративных заболеваниях, о б у с л о в л е н н ы х э к с п а н с и е й C A G - п о в т о р а : при хорее 28

Гентингтона, двух формах спиноцеребеллярной атаксии и при денторубральной паллидо-люисовой атрофии (данные нозологические формы будут рассмотрены во второй части монографии). Накопление в саркоплазме сердечной и скелетных мышц плотных гранулофиламентных агрегатов, содержащих десмин, является причиной развития аутосомно-доминантной миопатии, дебютирующей во взрослом возрасте слабос­ тью проксимальных и дистальных мышц конечностей в соче­ тании с кардиомиопатией и катарактой. Десмин принадлежит семейству промежуточных филамент типа III, участвующих в поддержании структурной целостности мышц. Образование патологических десмин-содержащих агрегатов может быть следствием аномалий в самом десмине или во взаимодей­ ствующем с ним белке — аВ-кристаллине. Это мажорный бе­ лок хрусталика, присутствующий также в сердечной и в ске­ летных мышцах. Описаны и другие формы миопатии с филаментными включениями в мышечных волокнах. Однако мо­ лекулярная природа образования этих включений остается пока неизвестной. Мутации мтДНК, в том числе делеции и дупликации, приводящие к дефициту одного или нескольких ферментов в митохондриальной респираторной цепи, а также мутации в генах тРНК ответственны за наследственные заболевания, получившие название митохондриальных энцефаломиопатий. Мышечная слабость часто выступает в качестве одного из ведущих симптомов при этих болезнях, которые, как прави­ ло, носят мультисистемный характер. Митохондриальные энцефаломиопатий не обязательно обусловлены дефектами в мтДНК, а могут быть связаны как с доминантными, так и с рецессивными мутациями в аутосомных генах. И наконец, недостаточность активности ряда мышеч­ ных ферментов служит причиной развития относительно до­ брокачественных метаболических миопатии. Остановимся более подробно на каждом из перечис­ ленных выше заболеваний. 29

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера и дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии Миодистрофия Дюшенна и аллельный ей вариант мио­ дистрофии Беккера — наиболее частая и хорошо изученная форма тяжелой нервно-мышечной патологии. Ген, ответст­ венный за эти два заболевания, был открыт методами обрат­ ной генетики около 15 лет тому назад. Это открытие сопро­ вождалось не только идентификацией белка, дефектного при миодистрофии Дюшенна/Беккера и получившего название дистрофин, но и выявлением целой серии его укороченных изоформ — апо-дистрофинов, способных выполнять в раз­ личных типах клеток спецализированные функции, отличные от функций дистрофина. Вслед за открытием дистрофина было описано более десятка других до этого неизвестных белков, тесно связанных с дистрофином и образующих так называе­ мый дистрофин-ассоциированный комплекс. Оказалось, что основной причиной развития патологических процессов при дюшенно-подобных миопатиях является разрушение транс­ мембранного дистрофин-ассоциированного комплекса бел­ ков. Подобная деструкция может происходить вследствие генетических дефектов либо в самом дистрофине, как это наблюдается у больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера, либо в других белках дистрофин-ассоциированного комплек­ са и это в свою очередь может явиться причиной развития гораздо более редких аутосомно-рецессивных дюшенно-по­ добных миопатии. Однако мутации в генах, кодирующих бел­ ки дистрофин-ассоциированного комплекса, сопровождающи­ еся, как правило, частичным или полным его разрушением, не всегда реализуются в форме таких миопатии, а часто мо­ гут приводить к различным вариантам конечностно-поясных и некоторых других мышечных дистрофий, о чем речь пой­ дет ниже. В большинстве случаев точная диагностика ауто­ сомно-рецессивных дюшенно-подобных миопатии возможна только на базе молекулярно-генетического анализа. 30

Не исключено, что разрушение дистрофин-ассоцииро­ ванного комплекса белков может происходить не только в оезультате генетических дефектов, но и вследствие вирус­ ных инфекций. Это, в частности, доказано в отношении виру­ са Коксаки, способного разрушать дистрофии и ассоцииро­ ванный с ним комплекс белков в кардиомиоцитах, и это, повидимому, является одним из начальных молекулярных ме­ ханизмов патогенеза наиболее частой приобретенной фор­ мы дилатационной кардиомиопатий. Учитывая особую значимость миодистрофии Дюшенна и дистрофинопатий среди нервно-мышечных заболеваний, мы постарались дать наиболее полный обзор молекулярногенетических исследований, проводимых в последние годы в этой области неврологии. На примере дюшенно-подобных миодистрофии особенно отчетливо может быть прослежена связь между открытием гена и расшифровкой молекулярных основ патогенеза, а значит, и разработкой методов точной диагностики (включая пренатальную), профилактики и тера­ пии моногенных заболеваний.

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200) 1. Клиническая характеристика заболевания Х-сцепленная рецессивная псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна, впервые подробно описан­ ная G.Duchenne в 1868 г., — одна из наиболее частых и зло­ качественных форм нервно-мышечной патологии детского возраста, характеризующаяся началом клинических прояв­ лений в первом пятилетии жизни, прогредиентным течением заболевания с последующей инвалидизацией и летальным исходом, как правило, в конце второго — начале третьего Десятилетия жизни. Обобщенные данные о распространенн ° с т и миодистрофии Дюшенна в разных популяциях указы­ вают на относительно высокую частоту этой формы, колеб­ лющуюся от 9,7 до 32,6 случаев на 100 000 родившихся живь, м и мальчиков. Для Санкт-Петербурга она составляет не 31

менее 18,9 на 100 ООО (Красильников, 1989). Примерно 1/з единичных случаев миодистрофии Дюшенна должна быть обусловлена вновь возникшими мутациями (при условии ра­ венства частоты мутирования в мужских и женских гаметах, а также нулевой фертильности больных). Последнее обсто­ ятельство имеет принципиальное значение для оценки по­ вторного риска при медико-генетическом консультировании соответствующих семей. Долгое время в литературе обсуж­ дался вопрос о взамоотношении миодистрофии Дюшенна и мышечной дистрофии Беккера (Беккера-Кинера), впервые описанной в 1955 г. (Becker, Kiener, 1955), протекающей со сходной клинической картиной, но отличающейся относитель­ но доброкачественным течением. К настоящему времени получены данные, однозначно указывающие на то, что обе формы являются результатом мутаций в одном и том же локусе. Так называемые женские случаи миодистрофии Дюшен­ на/Беккера возможны у девочек с Х-аутосомной транслока­ цией либо числовой аномалией Х-хромосомы (моносомия X). Сходные с миодистрофией Дюшенна клинические проявле­ ния могут отмечаться у лиц женского пола с дюшенно-подобными аутосомно-рецессивными формами миопатии (см. ниже). В части случаев субклинические проявления мио­ дистрофии Дюшенна/Беккера в виде «малой болезни» от­ мечаются у гетерозиготных носительниц мутантного гена. На наличие «малых признаков» у женских родственников больных миодистрофией Дюшенна указывал еще С. Н. Давиденков (Давиденков, 1934). Клиническая симптоматика носительства может проявляться умеренным снижением мы­ шечной силы и сухожильных рефлексов, утолщением (за счет псевдогипертрофии) икроножных мышц, поясничным гипер­ лордозом, варусной деформацией стоп, другими симпто­ м а м и . Данное обстоятельство хорошо объясняется гипо­ тезой Л а й о н , предполагающей случайную инактивацию одной из Х-хромосом в ж е н с к о м зачатке в раннем эмбрио­ генезе и соответственно преобладанием в подобных слу-

32

чаях среди функционально активных Х-хромосом, несущих м утантный аллель. Клиническая картина миодистрофии Дюшенна достаточ­ но хорошо изучена (Дрознина, 1970; Гринио, 1976). Заболева­ ние характеризуется сравнительно ранним началом и относи­ тельно быстрым прогрессированием процесса. Первые призна­ ки заболевания в виде мышечной слабости появляются в воз­ расте 2—5 лет. У части детей отмечается задержка темпов мо­ торного развития уже на 1—2-м году жизни. Дети начинают ис­ пытывать затруднения при ходьбе по лестнице, вставании с пола, перестают бегать. Очень типичной становится переваливающа­ яся («утиная») походка, заключающаяся в раскачивании в та­ зобедренных суставах. Рано возникают псевдогипертрофии за счет разрастания жировой и соединительной ткани, захватыва­ ющие главным образом икроножные, дельтовидные и ягодич­ ные мышцы. В последующем постепенно появляются гипотро­ фии мышц бедер и тазового пояса, нередко внешне скрытые из-за развитой подкожной жировой клетчатки. Процесс носит отчетливо восходящий характер: мышечная слабость и гипотро­ фии распространяются на мышцы спины, плечевого пояса, про­ ксимальных отделов верхних конечностей. Характерны «кры­ ловидные лопатки», симптом «свободных надплечий». Из-за уси­ ливающейся слабости к 9—12 годам дети, как правило, пере­ стают ходить, постепенно превращаясь в «кресельных пациен­ тов». Становятся заметными вторичные деформации скелета, усиливаются атрофии и сухожильные ретракции. Наиболее ран­ ние изменения обнаруживаются в ахилловых сухожилиях, при­ водящие в последующем к патологической деформации стоп. Возможны контрактуры в локтевых, коленных и тазобедренных оуставах. Первым из глубоких рефлексов исчезает коленный, затем—рефлексы с двуглавой и трехглавой мышц. Дольше дру­ гих сохраняется ахиллов рефлекс. Для миодистрофии Дюшенн а типично поражение сердечной мышцы в виде кардиомиопа^ и . При ЭКГ-исследовании обнаруживаются углубление зубца ' П а т ология зубца R, блокада ножки пучка Гиса. Особеннос­ тью данной формы миопатии является нередко наблюдаемая Заказ № ПО

33

умственная отсталость, как правило, неглубокая. Причиной ле­ тального исхода являются обычно пневмонии, которые боль­ ные не в силах перенести из-за включения в процесс дыхатель­ ной мускулатуры. Лабораторная диагностика миодистрофии Дю­ шенна/Беккера включает использование различных методов: электрофизиологических, биохимических, гистологических, а в последние годы — гистохимических и молекулярно-генетических. Электромиографическое исследование, а также изучение мышечных биоптатов обнаруживает признаки первично-мышеч­ ного поражения. Удобным и информативным тестом является определение сывороточной креатинкиназы, уровень активнос­ ти которой в случае миодистрофии Дюшенна в десятки раз пре­ вышает нормальные значения. Следует подчеркнуть, что дан­ ный тест может быть использован в до- или субклинической ста­ дии заболевания. 2. Картирование и идентификация гена DMD Ген миодистрофии Дюшенна — DMD (Duchenne muscular dystrophy) — один из первых генов человека, идентифициро­ ванных методами позиционного клонирования. Успешному кло­ нированию гена предшествовало описание достаточно редких пациентов, имеющих в области локализации гена цитогенетически идентифицируемые структурные перестройки — транс­ локации и делеции. Так, в частности, у нескольких девочек, стра­ дающих заболеванием, сходным по клинике с миодистрофией Дюшенна, были обнаружены различные реципрокные Х-аутосомные транслокации, причем во всех случаях точка разрыва Х-хромосомы оказалась локализована в области р21 (Burghes et al., 1987; Boyd et al., 1988; Bodrug et al., 1989). Было высказа­ но предположение, нашедшее подтверждение в последующих исследованиях, что клиника миодистрофии Дюшенна у этих де­ вочек развивается вследствие разрушения транслоцированного гомолога DMD-гена, локализованного в области Хр21, в со­ четании со специфическим характером лайонизации нормаль­ ной Х-хромосомы. На следующем этапе изолированные после­ довательности ДНК, примыкающие к точкам разрывов Х-хро34

мосомы при транслокациях или отсутствующие у пациентов с делециями, были использованы в качестве зондов для поиска и анализа полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном миодистрофии Дюшенна. Одним из первых таких зондов была последовательность RC8, локализованная методами соматиче­ ской гибридизации в области Хр22.3-р21 на расстоянии около 10сМ от DMD-гена (Murrey et al., 1982). В дальнейшем была изо­ лирована целая серия подобных последовательностей ДНК. Среди них фрагмент гена орнитинтранскарбомилазы (ОТС), зонды р754, XJ1-8, а также внутригенные зонды серии pERT (Francke et al., 1985; Bakker et al., 1985; Kunkel et al., 1985). С помощью этих ДНК-зондов было обнаружено большое число полиморфных сайтов рестрикции, ассоциированных с DMD-reном, и определены генетические расстояния между ними. В табл. 3 показано расположение некоторых полиморфных мар­ керов относительно DMD-гена и суммированы результаты не­ скольких исследовательских групп по оценке частот рекомби­ нации между этими локусами (Murray et al., 1982; Boyd et al., 1988; Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990). Таблица 3 Расположение полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном дистрофина Локус

ДНК-зонд

DXS84

р754

DXS206

рХЛ-8

Границы гена

Расстояния в сМ

3.7 + 0 . 6

DYS MSA *) DXS142

PERT84

DXS164

PERT87

5' DMD

1.0 + 0 . 4

3' DMD

1.9+ 0 . 6

МР1Р *) DXS41

р99-6

DXS270

J-Bir

DXS28

1 2 . 0 + 1.1

*) микросателлитные маркеры, фланкирующие ген дистрофина.

Описание большого количества полиморфных марке­ ров, сцепленных с DMD-геном, и точное физическое карти­ рование области его локализации способствовало изоляции специфической мРНК из скелетных мышц плода, клонирова­ нию и секвенированию полноразмерной кДНК длиной в 14 тысяч пар нуклеотидных оснований (Koenig et al., 1987; Monaco, Kunkel, 1988). DMD — самый крупный из известных в настоящее время генов, его размер 2.5 миллиона пар ос­ нований, и он занимает около 2% Х-хромосомы. Кодирую­ щая часть гена DMD разделена на 79 экзонов и составляет менее 1% геномной области (Roberts et al., 1992с; 1993). 3. Мутации в гене DMD и их диагностика Более чем в 60% случаев у больных мальчиков с мио­ дистрофией Дюшенна/Беккера обнаруживаются протяженные делеции в гене DMD, захватывающие от одного до несколь­ ких соседних экзонов и сосредоточенные обычно в двух «го­ рячих» районах — в области 5'-конца гена (экзоны 6—19) и в З'-конце (экзоны 40—53), при этом 30% делеций локализо­ ваны в проксимальной части гена и 7 0 % — в дистальной (Koenig et al., 1989; Dunnen et al., 1989; Liechti-Gallati et al., 1989; Oudet et al., 1992). Считается, что в 30% семей с еди­ ничными случаями миодистрофии Дюшенна/Беккера болезнь развивается вследствие спонтанного возникновения в гаме­ тах мутаций в DMD-гене и матери таких больных не являют­ ся гетерозиготными носителями этих мутаций. В подобных семьях риск повторного рождения больного ребенка мини­ мален и не превышает общепопуляционной частоты. В ос­ тальных 7 0 % семей матери больных мальчиков гетерозигот­ ны по мутациям DMD-гена, и при каждой беременности та­ ких женщин риск повторного рождения больного сына состав­ ляет 50%. Очень часто концы делеций локализованы в цент­ ральной части гена DMD. Так, в интроне 44, протяженностью 160—180 кб, расположено около 4 0 % точек разрыва всех де­ леций. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать «семей-

36

ными» мутациями. Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются как изолированные случаи. Считается, что повторный риск рождения больного ребенка с прокси­ мальной вновь возникшей делецией составляет 30%, тогда как с дистальной — только 4% (Passos-Bueno et al., 1992). По-видимому, значительная часть делеций в гене DMD возникает при мейотической рекомбинации. Частота мейотической рекомбинации в гене дистрофина составляет 10%, что в 4 раза больше, чем можно было ожидать на основании длины гена (Qudet et al., 1992). С использованием 10 внутригенных полиморфных маркеров показано существование двух горячих точек рекомбинации в гене DMD. Одна из них между экзонами 44 и 51 с пиком в 44-м интроне, другая между ни­ троном 7 и 5'-концом DMD. Локализация горячих точек ре­ комбинации очень сходна с распределением точек разрывов делеций у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера. Эти результаты дают основание предполагать участие одного и того же молекулярного механизма, лежащего в основе об­ разования делеций и повышения частоты рекомбинации в гене DMD. В нескольких случаях показано, что один из концов де­ леций, локализованных в интроне 43, расположен внутри ТНЕ1 элемента, принадлежащего семейству ретротранспозонов (Pizzuti et al., 1992). Эти элементы, размером 2.3 кб, фланки­ рованные 350-нуклеотидными длинными терминальными по­ вторами (LTR), встречаются в геноме человека около 10 ООО раз. Гипотеза о том, что нестабильность гена DMD вы­ звана присутствием транспозоно-подобного элемента, при­ влекается также для объяснения нескольких случаев обна­ ружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, при­ надлежащих одной и той же родословной, у которых предпо­ ложительно должна быть мутация общего происхождения (Miciak et al., 1992). В некоторых случаях удалось проследить присутствие Alu-элементов, локализованных в точках разры­ вов внутригенных структурных перестроек. Так, при секве­ стровании концевых участков дупликаций в гене DMD в 2 слу37

чаях из 8 были обнаружены Alu-элементы (Ни et al., 1989). В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между негомологичными последовательностями. Делеции в гене DMD часто возникают в процессе про­ лиферации зародышевых клеток, следствием чего является гонадный мозаицизм — появление нескольких генераций половых клеток (ооцитов) с мутантными и нормальными ал­ лелями (Darras et al., 1988; Bakker et al., 1989). Гонадный мо­ заицизм представляет серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медикогенетического консультирования семей с миодистрофией Дюшенна. Предполагается, что такие мутации могут возни­ кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам примерно 6—7% всех спора­ дических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семь­ ях, в которых у матери больного миодистрофией Дюшенна не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спо­ радического случая рождения ребенка с миодистрофией Дюшенна и при отсутствии прямых молекулярных доказа­ тельств гетерозиготного носительства мутации в гене дистро­ фина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al., 1992). Мутации возникают преимущественно в оогенезе (Bakker et al., 1989), несмотря на то, что теоретическая вероятность отцовского происхож­ дения делеций в гене дистрофина выше за счет большего числа репликаций ДНК, происходящих в процессе созрева­ ния мужских половых клеток (Giannelli, 1988). Отмечены особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях (Beggs et al., 1990; Abbs et al., 1991) и в популяциях России и стран СНГ (Baranov etal., 1993). Так, в результате объединенных межлабораторных исследований 38

показано, что соотношение делеций в 3'- и в 5'-районах «гооячих» точек возникновение мутаций в различных популя­ циях Западной Европы составляет 3.5:1, тогда как в России только 2:1. У некоторых пациентов может быть делетирован не только весь ген дистрофина, но достаточно протяженные соседние области. Прямой корреляции между тяжестью те­ чения заболевания и длиной делеций не отмечается, но раз­ личия между формами Дюшенна и Беккера в общем случае связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считыва­ ния (Malhotra et al., 1988; Koenig et al., 1989). При миодистро­ фии Дюшенна делеций сопровождаются сдвигом рамки счи­ тывания и вследствие этого преждевременной терминацией трансляции, тогда как при форме Беккера такого сдвига не происходит. Поэтому у пациентов с миопатией Дюшенна про­ дукт гена либо полностью отсутствует, либо деградирует вско­ ре после синтеза. У больных с формой Беккера такой белок, как правило, присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном виде. Эта гипотеза оказалась справедливой для 94% делеций с картированными точками разрывов. Ис­ ключения из этого правила связаны со сложным характером экспрессии гена DMD.

Рис. 1. Расположение кДНКовых зондов гена дистрофина После клонирования гена появилась возможность ис­ пользовать кДНКовые зонды для анализа изменчивости внут Ригенных полиморфных сайтов рестрикции. На рис. 1 пока­ зано расположение этих зондов относительно кДНК-гена дист Рофина. кДНКовые зонды явились прекрасными маркера­ ми для выявления делеций в DMD-гене (Dunnen et al., 1989). табл. 4 указаны некоторые полиморфные сайты рестрикЧии » выявляемые с помощью этих кДНК-овых зондов. Распо39

ложение относительно гена DMD геномных районов, гибридизующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зонда­ ми, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfj I изображено на рис. 2.

Рис. 2. Расположение относительно гена дистрофина геномных районов, гибридизирующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зондами, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfi 1 Таблица 4 кДНКовые полиморфные сайты рестрикции Аллели (кб) минорная мажорная 2.0 2.1

Районы кДНК

Рестриктаза

0-2а

Xmn1

ЗЬ-5а

EcoR1

9.4

9.7

5Ь-7

EcoRY EcoR1 Xmn1 EcoRY Pvu11 Taq1

7.3 10.5 4.7 12 9.3 2.1

10 13 4.4 14 11 1.7

9 -10

разработаны очень эффективные методы диагностики делеций в гене DMD, основанные на мультиплексной (мно­ жественной) полимеразной цепной реакции (Chamberlain et al., 1988а; 1990; Beggs et al., 1989; 1990;. Abbs et al., 1991). Одновременная амплификация 18 экзонов и промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех протяженных де­ леций гена (рис. 3). На этом рисунке у пациентов под номе­ рами 1—5 делетированы соответственно экзоны 51-60, 4244,47-52,43-60 и 13-19. Идентификация делеций в гене DMD у больного является бесспорным подтверждением диагноза миодистрофии Дюшенна/Беккера. Кроме того, в семьях с генотипированной делецией возможна прямая пренатальная диагностика заболевания, которая обычно проводится в пер­ вом триместре беременности. В некоторых случаях делеций в DMD находят у пациентов, клинически отнесенных к дру­ гим формам миопатии: аутосомно-рецессивной миодистро­ фии Фукуяма (Arahata et al., 1989; Francke et al., 1989), спи­ нальной амиотрофии (Clarke et al., 1989), тазовопоясной ми­ одистрофии Лейдена-Мебиуса (Arikawa et al., 1991). Во всех этих случаях проводится корректировка диагноза в пользу миодистрофии Дюшенна/Беккера.

ГЧ

Ри

I

с

о

м

14

О

Э

с 3. Идентификация делеций в гене дистрофина методом множественной полимеразной цепной реакции

Однако для обнаружения гетерозиготного носительства делеции у матери больного ребенка метод мультиплексной ПЦр не может быть использован. В ряде случаев носительство деле­ ции удается установить по появлению фрагментов ДНК необыч­ ного размера (junction fragments) при проведении блот гибриди­ зации рестрицированной геномной ДНК с внутригенными кДНКзондами. Однако такие фрагменты обнаруживаются не более чем в 17% случаев делеций в гене DMD. Для выявления гетеро­ зиготного носительства делеций, дупликаций или инсерций в гене DMD в общем случае был разработан метод обратной ПЦР (RT PCR), основанный на изоляции специфической мРНК, обрат­ ной транскрипции и использования образовавшейся кДНК в качестве матрицы для проведения мультиплексной амплифи­ кации всей кодирующей области гена (Roberts et al., 1990). По­ сле электрофоретического разделения продуктов амплифика­ ции фрагменты ДНК необычного размера образуются при лю­ бых структурных внутригенных перестройках, находящихся как в гемизиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Таким обра­ зом, обратная ПЦР является наиболее эффективным методом молекулярной диагностики делеций не только у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, но и у их родственников. Ген миодистрофии Дюшенна может быть вовлечен так­ же в другие структурные перестройки (Ни et al., 1989). Так, у 5% пациентов наблюдаются дупликации одного или несколь­ ких экзонов. В относительно небольшом проценте случаев у больных обнаружены микроделеции, захватывающие от 1 до нескольких нуклеотидов, а также много нонсенс-мутаций, повидимому, из-за присутствия в гене DMD большого количе­ ства глютаминовых триплетов, мутации в которых часто при­ водят к образованию стоп-кодонов. Крайне редки миссенсмутации (Roberts et al., 1992а; 1992b). Молекулярная диагностика мутаций неделеционного типа чаще всего осуществляется косвенными методами. В началь­ ный период исследований для этих целей использовали внутригенные полиморфные сайты рестрикции (табл. 3 и 4). В даль­ нейшем в гене миодистрофии Дюшенна были обнаружены мно42

^численные микросателлитные гипервариабельные последоаательности, отличающиеся очень высоким уровнем информа­ тивности (Beggs, Kunkel, 1991; Feener et al., 1991). В табл. 5 пред­ ставлена характеристика полиморфных микросателлитных по­ второв, локализованных в гене DMD. Наиболее удобными для пренатальной диагностики миодистрофии Дюшенна являются аллельные варианты динуклеотидных СА повторов в интронах 49 и 50 — STR-49; STR-50 (Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990; 1991;Beggs etal., 1989; 1990; 1991; Clemens etal., 1991;Oudet etal., 1991; Евграфов, Макаров, 1991). Таблица 5 Микросателлитные полиморфные маркеры гена дистрофина Повтор

Маркер

DYSI DYSII DYSIII DYSIV DYSMSB DYSMSA DMD-44 DMD-45 UMD-49

Уровень гетерозиготности (PIC) 5'-нетранслируемая 0.586 - 0.786 область Локализация

(ТА)11(СА)6 (СА)23 (ТА)11(СА)10 TACA(TG)5(TA)4TG 5'-нетранслируемая 0.25 (TG)29 область 0.57 интрон 1 (TG)21 (CA)n (CA)n (CA)n (CA)n (CA)n (CA)8TA(CA)7 (TTGA)n

интрон 44 интрон 45 интрон 49 интрон 50 З'-нетранслируемая область З'-нетранслируемая область

>0.8 >0.8 >0.8 >0.8 0.35 0.46

З'-нетранслируемая 0.17 область

Для всех представленных в табл. 5 вариабельных по* второв разработана простая и эффективная система их ге* нотипирования с помощью ПЦР, то есть для всех этих сайтов подобраны системы праймеров из уникальных смежных об* ластей ДНК. Для того чтобы избежать ошибок косвенной диагностики, связанных с возможностью внутригенной реком­ бинации, необходимо использовать несколько полиморфных маркеров, фланкирующих ген DMD. 4. Структура и функции дистрофина Основным продуктом гена DMD в мышцах является структурный белок с молекулярной массой в 427 кД — дис­ трофин, имеющий стержневидную форму с длиной около 125 нм. Это полифункциональный белок, участвующий в форми­ ровании нейромышечного синапса и в поддержании целост­ ности мембраны мышечного волокна при его сокращении (Sealock, Froehner, 1994). Дистрофин относится к числу минорных белков, его со­ держание по отношению к общему белку мышц составляет всего 0.002% и поднимается до 5% среди мембранных бел­ ков цитоскелета. В мышцах дистрофин локализован на цитоплазматической поверхности сарколеммы. В нейромышечных соединениях он является компонентом постсинаптической мембраны и участвует в синаптогенезе. В мышечно-сухожильных соединениях дистрофин ко-локализован с талином, винкулином и утрофином — продуктом аутосомного го­ молога гена DMD (см. ниже).Мышечно-сухожильные соеди­ нения являются основным сайтом силовой трансмиссии. Это также место локализации контакта между актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом, при этом дистрофин и утрофин концентрируются именно в точках данных специа­ лизированных контактов. Дистрофин принадлежит к спектрин/ос-актининовому суперсемейству белков цитоскелета (Koenig et al., 1988). Он состоит из 4 отдельных доменов (рис. 4), обнаружива­ ющих много общих черт со спектрином и ос-актинином. Так,

44

isl-концввой домен дистрофина имеет сходство с большим семейством актинсвязывающих белков, и в частности — с isi-концевыми доменами а-актинина и р-спектрина. Во всех типах клеток эти белки выполняют структурную роль при физиологических, статических и динамических клеточных процессах. Наиболее крупный домен, обеспечивающий гибкость молекулы, имеет структуру трехгранного стерж­ ня. Он образован 24 слегка повторяющимися сегментами, каждый из которых содержит около 110 аминокислотных остатков, а-актинин содержит четыре подобных повтора, а спектрины — 17 или более. Следующий за стержневым участком цистеин-богатый домен, состоящий из 150 ами­ нокислот, сходен с СООН-фрагментом А-актинина и содер­ жит два неполных Са 2 + -связывающих мотива. Для послед­ него 420-аминокислотного С-концевого домена не найде­ но гомологии с другими белками. Последовательности цистеин-богатого и С-концевого доменов дистрофина высо­ коконсервативны, что указывает на их особую функцио­ нальную значимость. В С-концевом домене обнаружены многочисленные потенциальные сайты фосфорилирования, в том числе для МАР-киназы, p34cdc2-, СаМ- и казеино­ вой киназы. Это предполагает возможность участия дис­ трофина в трансдукции сигналов через сарколемму мы­ шечного волокна (Michalak et al., 1996).

Рис. 4. Модель молекулы дистрофина ст

После расшифровки аминокислотной последовательнои белка была предложена схема его функционирования,

45

согласно которой дистрофин в цитоплазме клетки распоп^ гается под сарколеммой мышечного волокна в виде перепле* тенного антипараллельного димера (рис. 5). N-конец дистро. фина связан с цитоплазматическим актином, причем имеет большее сродство (аффинитет) не с саркомерным, а с немы* шечным F-актином. Таким образом, дистрофин не связан напрямую с сократительным аппаратом мышечного волок­ на, а соединен с субмембранной сетью цитоплазмы, образо­ ванной н е м ы ш е ч н ы м а к т и н о м (Ervasti, Campbell 1991; Monaco, 1989). Точнее, дистрофин взаимодействует с G-актиновыми мономерами и способствует G->F актиновой транс­ формации, которая стимулируется Са + -зависимым присутст­ вием кальмодулина (Fabbrizio et al., 1995b). Дистрофин явля­ ется якорным белком для актина и таким образом он вовле­ чен в контроль деформации поверхности клеточной мембра­ ны и в развитие F-актиновой сети, обеспечивающей жест­ кость цитоскелета миотубул.

Рис. 5. Расположение дистрофина под сарколеммой мышечного волокна С-конец дистрофина соединен с трансмембранным комплексом, состоящим из белков с молекулярными веса­ ми 156, 59, 50, 43, 35 и 25 кД (Ervasti, Campbell, 1991). Эти 46

* ки получили название дистрофин-ассоциированных белков (DAP) или дистрофин-ассоциированных гликопротеинов (DAG). Дистрофин-гликопротеиновый комплекс уча­ ствует в регуляции внутримышечного уровня кальция, обес­ печивая связь кальциевого комплекса с цитоскелетом клет­ ки, и не исключено, что сам этот комплекс является каль­ циевым каналом. 156DAG, 50DAG, 43DAG и 35DAG содер­ жат аспарагин-связанные олигосахариды, то есть являют­ ся гликопротеинами. 156DAG дополнительно содержит тер­ минально сиализированные серин/треонин-связанные оли­ госахариды, что, по-видимому, обеспечивает его повышен­ ную устойчивость к действию протеаз. При этом сам дис­ трофии и 59DAP относятся к элементам цитоскелета, 156DAG располагается на внешней стороне мембраны, в то время как остальные белки комплекса интегрированы с мембраной. У больных с миодистрофией Дюшенна/Бекке­ ра и с другими аутосомно-рецессивными дюшенно-подобными миодистрофиями, а также с некоторыми формами конечностно-поясных миодистрофии этот комплекс оказы­ вается частично или полностью разрушенным. Дистрофии способен взаимодействовать с рядом дру­ гих белков, не входящих в описанный выше комплекс. Так, лигандом для дистрофина служит ацикулин — неэнзиматический белок, родственный фосфоглюкомутазе первого типа. В мышцах ацикулин ведет себя подобно типичному дистрофин-связанному белку, располагаясь в сарколемме. Недавно было показано, что дистрофии ассоциирован так­ же с синтетазой окиси азота нейронального типа — nNOS (Brenman et al., 1995). В скелетных мышцах nNOS соеди­ няется с сарколеммой через дистрофин-гликопротеиновый комплекс белков. Еще одним ассоциированным с дистроФином белком является мышечный кавеолин-3 — сарколеммный белок, являющийся главным компонентом каве0Л плазменных мембран. Сконструированы антитела на различные антигенные Детерминанты дистрофина, нашедшие широкое примене47

ние для его иммунодетекции непо­ средственно в белковом лизате мышц и на г и с т о л о г и ч е с к и х п р е п а р а т а х (Hoffman et al., 1989а; 1989b; Arahata et al., 1989). В последнем случае спе­ цифическая о к р а с к а на дистрофин а. располагается по периферии клеток (рис. 6). Как правило, у больных с ми­ одистрофией Дюшенна либо вовсе не обнаруживается иммунореактивных форм белка, либо мутантный белок обнаруживается лишь при использо­ вании определенных антисывороток, чаще всего на аминотерминальную часть белка. В мышцах гетерозигот наблюдаются локальные области от­ сутствия иммуноокрашивания на дис­ трофин. При форме Беккера биохими­ ческие аномалии дистрофина выявля­ ются в виде прерывистого характера окрашивания мышц, что свидетельст­ вует о дефектах в структуре цитоске­ лета миофибрилл. Иммунологический Рис. 6. Иммуноанализ является наиболее простым гистохимический анализ дистрофина способом диагностики гетерозиготно­ го носительства мутаций в гене DMD в мышечных у родственниц пробанда. Однако для клетках его осуществления необходимо про­ водить биопсию мышц. В настоящее а — норма, б — миодистрофия время иммуногистохимические мето­ ды анализа с применением антисыво­ Дюшенна, роток на разные районы дистрофина в — гетерозиготы активно используются не только при (стрелками медико-генетическом консультирова­ показаны зоны нии и проведении пренатальной диа­ отсутствия гностики (Bieber et al., 1989; Ginjaar дистрофина). 48

etal., 1989; Bulman et al., 1991), но и при изучении молеку­ лярных основ патогенеза миодистрофии (Hurko etal., 1989). У некоторых пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохимическом окрашивании мышц обнаруживают­ ся редкие дистрофин-положительные волокна. При этом в случае использования антител с антигенными детерминан­ тами, кодируемыми делетированным участком гена, окра­ шивания не происходит, и это позволяет отвергнуть гипо­ тезу соматического м о з а и ц и з м а . Наиболее вероятный механизм такого явления — возникновение второй сома­ тической делеций в мышечной ткани, компенсирующей едвиг рамки считывания, происходящий вследствие основ­ ной делеций. В результате мутантный локус может цели­ ком транскрибироваться и транслироваться с образовани­ ем стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al., 1992). 5. Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD. аподистрофины В соответствии с современными представлениями ог­ ромный ген DMD находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что транскрипция DMD осуществляется со сред­ ней скоростью 2.4 кб в минуту, так что для образования пол­ норазмерного РНК-транскрипта требуется 16 часов (Tennyson et al., 1995). Одновременно до окончания синтеза РНК, то есть ко-транскрипционно, начинается сплайсирование пер­ вичного РНК-транскрипта. При этом скорость накопления "Фанскриптов на З'-конце гена уменьшается по сравнению с бЧонцом, возможно, за счет преждевременной терминации транскрипционных комплексов. По крайней мере, восемь независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию ° M D В разных тканях и на разных стадиях эмбрионального Развития (табл. 6).

Таблица 6 Изоформы дистрофина Изоформы Размер дистрофина мРНК(кб)

Локализаци промотора

Экспрессия

мышечный

14

мозговой

14

5'-UTR область сердечная и скелетные мышцы кора и гиппокамп 1 интрон

мозговой 1 - Dp71

14 4.5-4.8

1 интрон 63 интрон

клетки Пуркинье повсеместно, кроме мышц

2-Dp116

5.5

56 интрон

периферические нервы

3 - Dp40

2.2

Dpi 40 Dp260

7.5

повсеместно, кроме мышц 44 интрон

эмбриональные нейроны сетчатка

Один промотор мышечного типа (М) и два мозгового, активные в кортикальном отделе мозга (С) и в клетках Пур­ кинье (Р) соответственно, экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как пять других промото­ ров (среди них R, ВЗ, S, G) обеспечивают экспрессию по­ следних доменов взаимоисключающим способом, главным образом в немышечных и в немозговых тканях. Основным продуктом DMD в сердечной и скелетных мышцах является 14-кб РНК-транскрипт. В различных отделах мозга продуци­ руются три полноразмерные формы дистрофина с разных промоторов, а соответствующие транскрипты различаются по первому экзону (Chamberlain et al., 1988b; Nudel et al., 1989; Boyce et al., 1991). Один из промоторов мозгового типа (С) расположен в первом интроне DWD на расстоянии более 90 кб от мышечного промотора (Celly et al., 1990; Gorecki et al., 1992). 14-кб мРНК — продукты дистрофинового гена мышеч-

50

н ого и мозгового типа, различающиеся по структуре первого экзона, одновременно присутствуют в нейронах коры и гиппокампа, и дополнительный полноразмерный транскрипт иден­ тифицирован в клетках Пуркинье. В последнем случае транс­ крипт также отличается от двух известных продуктов по струк­ туре первого экзона, который оказался локализован в большом интроне между мышечным промотором и вторым экзоном гена. Все образующиеся при этом формы дистрофина имеют неболь­ шие отличия в N-концевом участке белка. В немышечных тканях и в клеточных линиях найдено множество укороченных форм дистрофина — апо-дистрофинов, образующихся за счет альтернативной транскрипции — Dp40, Dp71, D p i 16, D p i 4 0 , Dp260. Цифры в названии этих белков соответствуют молекулярным весам соответствующих апо-дистрофинов. Dp71, или апо-дистрофин-1, по-видимому, является основным продуктом гена DMD в немышечных тка­ нях, включая ткани мозга (Lederfein et al., 1993а; 1993b; Bar etal., 1990). В Dp71 присутствует С-концевой домен дистро­ фина и часть цистеин-богатого, а также 7 дополнительных аминокислот на N-конце белка. Содержание этого белка в некоторых тканях сопоставимо с количеством дистрофина в мышцах, и особенно обильно он представлен в клетках Шванна, где дистрофии отсутствует (Blake et al., 1992). В скелет­ ных мышцах взрослых Dp71 отсутствует, тогда как в мышцах плода наряду с дистрофином экспрессируется и апо-дистрофин-1. Уровень мРНК Dp71 в культуре дифференцирующих­ ся миобластов сохраняется стабильным, тогда как содержа­ ние белка в процессе дифференцировки значительно возра­ стает, что указывает либо на его большую стабильность по сравнению с полноразмерным дистрофином, либо на возмож­ ность изменений в эффективности трансляции (Tennyson et a '-i 1996). мРНК-транскрипт Dp71 более устойчив по сравне­ нию с полноразмерным транскриптом, так как период его полураспада составляет около 20 часов, тогда как для мРНК Дистрофина — только 16 часов (Tennyson et al., 1995). Иден­ тифицированы различные изоформы апо-дистрофина-1, об-

51

разующиеся за счет альтернативного сплайсинга последних экзонов гена DMD. Характерным для Dp71 является сплайсирование экзона 78. D p i 16 и D p i 4 0 и Dp260 в дополнение к С-концевым доменам имеют дистальные области стержневого домена дистрофина различной протяженности. Все эти белки так­ же связаны с клеточными мембранами, однако их функ­ ции остаются в значительной степени неясными. Апо-дистрофин-2 — D p i 16, преимущественно экспрессируется у взрослых в периферических нервах. Размер мРНК самого маленького апо-дистрофина-3 (Dp40) составляет 2.2 кб (Tinsley et al., 1993). Чисто нейрональной изоформой дис­ трофина является D p i 4 0 (Morris et al., 1995). Наиболее интенсивная экспрессия этого белка в мозге наблюдается в эмбриональном периоде. Трансляция D p i 4 0 начинается с 51 э к з о н а гена дистрофина, а промотор и первый экзон этой последовательности локализованы в 44 интроне гена DMD. Показано, что снижение интеллекта, которое харак­ терно для части больных с миодистрофией Дюшенна, до­ стоверно коррелирует с делециями в районе экзонов 4052 гена DMD. Эти делеции могут затрагивать синтез или функции D p i 4 0 . В плексиформном слое сетчатки глаза избирательно э к с п р е с с и р у е т с я изоформа дистрофина Dp260. Этот апо-дистрофин участвует в контроле нормаль­ ной электрофизиологической функции сетчатки (D'Souza et al., 1995). Апо-дистрофины, так же как и полноразмер­ ные дистрофины, способны взаимодействовать с белками дистрофин-ассоциированного комплекса. Однако из-за отсутствия в их структуре N-терминальной части дистро­ фина эти белки не способны взаимодействовать с акти­ ном и потому их функции не связаны с поддержанием це­ лостности мембран мышечных волокон. Уровень транскрипции полноразмерного мышечного дистрофина в процессе дифференцировки миобластов воз­ растает примерно в 10 раз. Однако активность мышечного промотора в зрелых миофибриллах в 30 раз ниже, чем в 52

незрелых мышечных волокнах — миотубулах, что указы­ вает на существование дополнительных транскрипционных элементов, вовлеченных в регуляцию экспрессии гена DMD s мышцах (Klamut et al., 1996). Одним из них является 5-кб энхансер, локализованный внутри первого мышечного интрона. Этот элемент специфическим образом активирует­ ся в мышцах. В генно-инженерных опытах in vitro было по­ казано, что мышечный DMD-энхансер обеспечивает повы­ шенный уровень экспрессии генов-репортеров независи­ мо от своего положения и ориентировки. По-видимому, существуют и дополнительные подобные элементы в дру­ гих частях гена DMD. Высококонсервативные последовательности шести экзонов, кодирующих С-конец дистрофина, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающих­ ся изоформ дистрофина, осуществляющих различные функ­ ции. Очевидно, что продукты дистрофинового гена могут вза­ имодействовать со множеством различных белков и не толь­ ко в мышечных и нейрональных тканях (Monaco, 1989). В настоящее время функции многочисленных изоформ дистро­ фина, обильно экспрессирующихся в различных специали­ зированных тканях и способных взаимодействовать со мно­ жеством белков и не только мышечного или нейронального происхождения, изучены явно недостаточно. 6. Риртрпфин-ассоииированный комплекс белков Связь цитоскелета мышечной клетки с экстраклеточ­ ным матриксом осуществляется за счет взаимодействия полноразмерного дистрофина с дистрофин-ассоциированным комплексом белков. При разрушении этого комплек­ са мышечные волокна теряют свою структурную целост­ ность и погибают. Кроме того, связывание различных изоФ°рм дистрофина с сарколеммой необходимо для их нор­ мального функционирования в центральной нервной сис­ теме. Оказалось, что дистрофин-ассоциированный к о м ­ плекс белков имеет гораздо более сложную структуру, чем

53

это представлялось вначале, и в нем могут быть выделены три отдельных субкомплекса — дистрогликановый, саркогликановый и синтрофиновый (рис. 7).

Рис.

7. Дистрофин-ассоциированный комплекс белков

В первый субкомплекс входят два гликопротеина, яв­ ляющиеся коровыми белками для всего комплекса — боль­ шой экстраклеточный белок ct-дистрогликан (156DAG) и не­ посредственно взаимодействующий с ним трансмембранный р-дистрогликан (43DAG или АЗа). Заякоревание дистрофина на внутренней поверхности сарколеммы обеспечивается за счет его связывания с цитоплазматическим хвостом р-дистрогликана (Suzuki et al., 1994). а-дистрогликан, взаимодей­ ствуя с компонентом базальной мембраны ламинином 2 (или мерозином), обеспечивает связь между внеклеточным матриксом и сарколеммой, а через дистрофин — и с цитоскелетом клетки. Ламинин-связанный а-дистрогликан, соединен­ ный с экстраклеточным участком р-дистрогликана, форми54

рует дистрогликановый субкомплекс (Suzuki et al., 1995). Уча­ сток связывания дистрофина с р-дистрогликаном, начинаю­ щийся в цистеин-богатом районе дистрофина и захватываю­ щий часть концевого С-домена, имеет огромное значение для функционирования полноразмерных и укороченных изоформ дистрофина. Так, одна из редких миссенс-мутаций в гене DMD — C3340Y, сопровождающаяся заменой консерватив­ ного цистеина в дистрогликан-связывающем домене, приво­ дит к тяжелой форме миодистрофии Дюшенна в комплексе с умственной отсталостью и отсутствием b-волны на электроретинограмме (Lenk et al., 1996). Участок связывания дис­ трофина с р-дистрогликаном содержит три пептидных моти­ ва, найденных в других неродственных дистрофину белках — WW, EF, ZZ. Эти мотивы кодируются экзонами (63), (65-66), (68-69), соответственно. Интересно, что р-дистрогликан спо­ собен связываться с src-гомологичным доменом SH3 одного из адапторных белков (Grb2). SH3 — высококонсервативная некаталитическая последовательность, участвующая в обра­ зовании стабильного комплекса между scr-киназами и дру­ гими сигнальными молекулами, включая рецепторы. Пред­ полагается, что b-дистрогликан взаимодействует с WW-участ­ ком дистрофина посредством атипичных ЭНЗ-связывающих модулей (Yang et al., 1995). EF-последовательность может уча­ ствовать в связывании кальция. ZZ-мотив способен связывать бивалентные катионы металлов, в частности цинка. Показано, что а- и р-дистрогликаны являются альтер­ нативными продуктами одного гена DAG1, картированного в области 3р21 (Ibragimov-Beskrovnaya et al., 1992; 1993). Со­ ответствующий белковый продукт, транслирующийся с мРНК размером 5.5 кб, расщепляется на две нековалентно-ассоЦиированные субъединицы — а и р . Ген DAG1, состоящий из Двух разделенных большим интроном экзонов, экспрессирувтся во множестве типов тканей. В опытах на мышах пока­ зан высокий уровень экспрессии этого гена в раннем эмбри­ огенезе. Дистрогликаны обнаруживаются в децидуальной ткан и уже на периимплантационной стадии развития (Yotsumoto 55

et al., 1996). По-видимому, в этот период они выполняют роль медиаторов для адгезии между децидуальными клетками или между децидуальными и трофобластными клетками. Присут­ ствие дистрогликанов необходимо для формирования одной из первых оболочек зародыша — Рейхеротовской мембра­ ны (Williamson et al., 1997). Роль дистрогликанов в различных специализированных тканях во многом остается неясной. В нейромышечных соединениях а-дистрогликан явля­ ется функциональным рецептором для агрина — нейронально секретируемого гликопротеина, индуцирующего кластерирование ацетилхолиновых рецепторов и последующую реор­ г а н и з а ц и ю п о с т с и н а п т и ч е с к о г о цитоскелета (Sealock, Froehner 1994). В ряде работ было показано, что в культиви­ руемых миотубулах антидистрогликановые антитела ухудша­ ют кластерирование ацетилхолиновых рецепторов (Campanelli et al., 1994; Gee et al., 1994). Показано, что домен агрина, ответственный за кластерирование ацетилхолиновых рецеп­ торов, физически отделен от домена, осуществляющего связь с дистрогликаном (Gesemann et al., 1996). Поэтому представ­ ляется более вероятным, что дистрогликан трансдуцирует сигнал от агрина для начала кластерирования ацетилхолино­ вых рецепторов через промежуточный белок, которым, по всей видимости является перлекан (Peng et al., 1999). Не ис­ ключено, что именно через эту связь осуществляется учас­ тие дистрофина в синаптогенезе. Другой саркогликановый субкомплекс формируется четырьмя трансмембранными белками и включает а-саркогликан (50DAG или адхалин или А2), р-саркогликан (43DAG или АЗЬ), у-саркогликан (35DAG или А4) и 5-саркогликан (35DAG). В этот субкомплекс, по-видимому, входит 25DAP (А5 или саркоспан). Связь саркогликанового субкомплекса с дистрофином осуществляется посредством его взаимодействия с цитоплазматическим участком 35DAG. Для сохранения ста­ бильности всего саркогликанового комплекса особое значе­ ние имеет карбокси-терминальный район у-саркогликана. В настоящее время все гены, кодирующие саркогликаны, кар56

тированы и клонированы. Мутации в саркогликановых генах являются причиной развития различных аутосомно-рецессивн ь 1 Х дюшенно-подобных и конечностно-поясных миодистрофии. Третий синтрофиновый субкомплекс образован четырь­ мя ассоциированными с дистрофином цитоплазматическими белками — тремя 59DAP, получившими название синтрофинов или А1 триплета (а-А1, р1 -А1 и р2-А1), а также минор­ ными белками комплекса, относящимися к группе дистробревинов (АО). Синтрофины связываются с участком С-кон­ цевого домена дистрофина, кодируемым экзонами 73-74, альтернативно сплайсирующимися во многих типах тканей на разных стадиях развития (Suzuki et al., 1994; Ahn, Kunkel, 1995). В частности, р1-синтрофин специфически связывает­ ся с расположенной в концевом С-домене последовательно­ стью из 53 аминокислот, кодируемой 74 экзоном дистрофи­ на. а-синтрофин связывается с другим участком дистрофи­ на, локализованным в непосредственной близости от сайта связывания р1-синтрофина (Suzuki et al., 1995). Возможно, дистробревин участвует в связи между дистрофином и саркогликановым субкомплексом. Синтрофины, по-видимому, являются сигнальными медиаторами, так как они содержат протеин-связывающие домены (PDZ). Они могут опосредо­ вать соединение дистрофин-ассоциированного комплекса белков с киназами, натриевыми каналами и nNOS. Предпо­ лагается также их участие в пострансляционных модифика­ циях DAP-комплекса в мышцах в ответ на изменение меха­ нического стресса. Синтрофины, локализованные в нейромышечных соединениях, и в первую очередь р2-синтрофин, по-видимому, принимают участие в синаптогенезе. Дистробревины относятся к семейству дистрофинРодственных белков. Их гомология с дистрофином в обла­ сти цистеин-богатого домена достигает 57%. Ген дистробРевина картирован в области 18q12.1-12.2 и кодирует се­ мейство белков, главными изоформами которых в мышЧах являются дистробревин-1 (94 кД), дистробревин-2 (62 КД) и дистробревин-3 (42 кД) (Sadoulet-Puccio et al., 1996; 57

Metzinger et al., 1997). Обнаружено не менее 5 различных транскриптов гена дистробревина, три из которых присут­ ствуют в м о з г е . Фосфорилированный по тирозину дистробревин с молекулярной массой 94 кД имеет 9 0 % гомоло­ гии с 87 кД постсинаптическим белком электрического ска­ та Torpedo (Wagner et al., 1993). He исключено участие дистробревинов в синаптогенезе, так как они вычищаются в к о м п л е к с е с ацетилхолиновыми р е ц е п т о р а м и . Хотя у Torpedo дистробревин также ассоциирован с синтрофинами и дистрофином, прямого взаимодействия между этим к о м п л е к с о м и ацетилхолиновыми рецепторами не обнару­ жено. Иммуногистохимические исследования показывают, что уровни дистробревина в сарколемме пациентов с мио­ дистрофией Дюшенна и, в меньшей степени, Беккера рез­ ко с н и ж е н ы . Однако присутствия дистрофина недостаточ­ но для правильной локализации дистробревинов в сарко­ л е м м е , так как аналогичное снижение наблюдается и у пациентов с конечностно-поясными мышечными дистро­ ф и я м и , обусловленными дефектами в саркогликановых генах. В целом организация дистрофин-гликопротеинового комплекса очень сходна со структурой кадхеринов или интегринов, а сам этот комплекс является важнейшим эле­ ментом архитектуры мышечных клеток. Очевидно, что во многих типах клеток позвоночных белки дистрофинового семейства выполняют критическую роль в поддержании ас­ социированных с мембраной комплексов в местах меж­ клеточных контактов. Но на этом их функция не ограничи­ вается. Наличие многочисленных сайтов фосфорилирования в цистеин-богатом домене, присутствующем во всех дистрофин-родственных белках, и возможность его связы­ вания с кальцием, магнием и кальмодулином доказывают активное участие этих белков в передаче сигналов через мембрану мышечного волокна (Michalak et al., 1996).Для большинства дистрофин-ассоциированных белков выпус­ каются в настоящее время коммерческие антитела. 58

На рис. 8 схематически изображены связи между бел­ ками дистрофин-ассоциированного комплекса.

Рис. 8.

Связи между белками дистрофин-ассоциированного комплекса

7. Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные аутосомно-реиессивные миопатии Анализ корреляций между клиническим течением ми­ одистрофии Дюшенна/Беккера и делециями без сдвига рам­ ки считывания, затрагивающими специфические домены белкового продукта DMD, позволяет строить своеобразную «патофункциональную» карту дистрофина (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что N-концевые делеций приводят к гете­ рогенным, но достаточно серьезным формам Б е к к е р а . Делеций проксимальной части стержневого домена связа­ ны с очень м я г к и м или атипичным фенотипом, тогда как Дистальные делеций этого же домена дают типичные фор-

59

мы Беккера. За некоторым исключением делеции двух Сконцевых доменов реализуются в виде миодистрофии Дю­ шенна. У больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера коли­ чественное содержание всех белков гликопротеинового комплекса, в том числе и внеклеточного альфа-дистрогликана (156DAG), значительно понижено и одновременно повышен уровень кальция скелетных мышц, "аким обра­ з о м , аномальная экспрессия дистрофина может оказывать влияние на внешние компоненты мышечных вогокон вслед­ ствие разрушения дистрофин-ассоциированно'о комплек­ са, нарушения целостности или эластичности сарколеммы, ведущего либо к ее механическому повреждению, либо к изменению механизмов регуляции кальция. Потеря экс­ траклеточного гликопротеина является, по-видимому, пер­ вым шагом в молекулярной цепи патогенеза данных форм миодистрофии. Не исключено, что делеции в некодируюдих облас­ тях DMD, специфическим образом нарушающее экспрес­ сию определенных изоформ дистрофина вследствие изби­ рательного разрушения промоторных областей для соот­ ветствующих транскриптов, могут реализоваться в сцеп­ ленные с полом заболевания, не сопровождающиеся мы­ шечной дистрофией. Так, было показано, что делеции об­ ласти локализации мышечного промотора, а также точковые мутации в 5'-сайте сплайсинга первого экзона DMD являются причиной одной из форм тяжелой Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатии, протекающей без прояв­ лений симптомов мышечной слабости (Muntoni etal., 1995а; Milasin et al., 1996). Распространенность дилатационной кардиомиопатии в США составляет 36.5 на 100 000. При­ мерно для 2 0 % подобных случаев показано менделевское наследование различного типа — аутосомно-доминантное, аутосомно-рецессивное и сцепленное с полом. При этом не наблюдается никаких клинических различий между се­ мейными и спорадическими случаями заболевания. Гене60

тический анализ семей, в которых наблюдалась сегрега­ ция по сцепленной с полом форме дилатационной кардио­ миопатий, показал, что ген, ответственный за развитие заболевания, локализован в той же области Х р 2 1 , где на­ ходится ген DMD (Towbin et al., 1993). Спустя некоторое время у ряда больных с семейной Х-сцепленной формой дилатационной кардиомиопатий, так же как и в нескольких спорадических случаях у мужчин, были идентифицирова­ ны мутации в гене DMD. Это были либо делеции,затрагивающие регуляторную область и первый экзон DMD, либо сплайсинговые мутации, локализованные в начале перво­ го интрона гена дистрофина (Yoshida et al., 1993; Muntoni et al., 1995b; Milasin et al., 1996). У трех пациентов с Х-сцеп­ ленной дилатационной кардиомиопатией из двух неродст­ венных японских семей была обнаружена уникальная инсерция транспозоно-подобного элемента L1 в первом экзоне гена DMD (Yoshida et al., 1998). В дальнейшем были определены начальные этапы молекулярного патогенеза подобных форм дилатационной кардиомиопатий. Оказа­ лось, что идентифицированные мутации приводят к полно­ му отсутствию мышечной изоформы дистрофина у боль­ ных. Кроме того, в миокарде пациентов отсутствует экс­ прессия двух других полноразмерных изоформ мРНК дис­ трофина, транскрибирующихся с промоторов мозгового типа. В отличие от этого, в скелетных мышцах наблюдает­ ся достаточно высокий уровень двух полноразмерных изо­ форм дистрофина мозгового типа и потому сохраняется дистрофин-гликопротеиновый комплекс. В сердечной мыш­ це не происходит компенсаторной экспрессии дистрофина с альтернативных промоторов и дистрофин-гликопротеино­ вый комплекс полностью разрушен, несмотря на присутст­ вие там апо-дистрофина-1. В результате у пациентов раз­ вивается дилатационная кардиомиопатия без каких-либо проявлений слабости скелетной мускулатуры. п

Вскоре вслед за описанием молекулярного дефекта Ри Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатий у боль61

ных с аутосомно-рецессивными формами заболевания были обнаружены мутации в двух группах генов. Одни гены оказались связаны с белками дистрофин-ассоциированного комплекса, такими как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны, другие гены — с белками цитоскелета мышечной клет­ к и : метавинкулином, актином, мышечным белком, участ­ вующим в позитивной регуляции миогенеза, так называе­ мым LIM-белком (Towbin, 1998). Примечательно, что иден­ тифицированные у пациентов мутации в актиновом гене приводили к дефекту того домена актина, который участ­ вует во взаимодействии с дистрофином. Дефект 5-саркогликана найден в линии хомячка BI014.6 с кардиомиопатией. Все эти факты свидетельствуют о центральной роли дис­ трофин-ассоциированного комплекса в функционировании кардиомиоцитов. Не исключено, что и приобретенные фор­ мы дилатационной кардиомиопатии, доля которых дости­ гает 3 0 % от общего числа дилатационных кардиомиопатии, связана с нарушением нормальной работы дистрофина. Энтеровирусы, и в частности вирусы К о к с а к и , способны индуцировать дилатационную кардиомиопатию. Оказалось, что единственным белком человека, который расщепляет­ ся вирусной протеазой 2А, является дистрофин. Это было предсказано на базе компьютерного анализа и подтверж­ дено в опытах in vitro (Badorf et al., 1999). Дистрофин так­ же расщепляется в культивируемых миоцитах, зараженных вирусом К о к с а к и , и in vivo в сердечной мышце инфициро­ ванных мышей. При этом в инфицированных миоцитах от­ сутствует не только дистрофин, но и ассоциированные с ним гликопротеины — а-саркогликан и р-дистрогликан. Очевидно, что разрушение дистрофинового комплекса яв­ ляется одним из центральных звеньев в этиологии дилата­ ционных кардиомиопатии. Экспрессия дистрофина и Dp260 обнаружена во внеш­ нем плексиформном слое сетчатки глаза, где фоторецепторные клетки взаимодействуют с нейронами ганглиев, в то время как другой апо-дистрофин — Dp71 — экспресси62

пуется на внутренней ограничивающей мембране сетчат­ ки и на ее сосудах (Fillers et al., 1993; Howard et al., 1998). у некоторых пациентов с миодистрофией Дюшенна /Бек­ кера и у мышей генетических линий mdx с мутациями в гене Dmd выявлен аномальный характер электроретинограмм, причем степень аномалий зависит от типа мутаци­ онных повреждений.У трансгенных мышей с направленно разрушенным экзоном 52 гена Dmd и отсутствием экспрес­ сии Dp260 изменена локализация р-дистрогликана и обна­ руживаются аномалии на электроретинограмме ( К а т е у а et al., 1998). Показано, что присутствие каждого из двух аподистрофинов — Dp71 и Dp260 — необходимо для пра­ вильной локализации р-дистрогликана, а это взаимодейст­ вие, в свою очередь, имеет важное значение для исполне­ ния нормальной электрофизиологической функции сетчат­ ки. Не исключено, что некоторые мутации в гене DMD, со­ провождающиеся образованием дефектных форм дистро­ фина и аподистрофинов Dp71 и Dp260, могут быть ответ­ ственны за развитие Х-сцепленной формы ночной слепо­ ты, ген которой также картирован в области Х р 2 1 . Кроме того, полноразмерный дистрофии и его укоро­ ченная форма D p i 16 активно экспрессируются во внутрен­ них и внешних волосковых клетках улитки, где эти белки преимущественно располагаются на латеральной поверх­ ности и в синаптических районах (Dodson et al., 1995). Ген, ответственный за развитие одной из моногенных форм нейросенсорной тугоухости, также картирован в области Хр21 недалеко от DMD (Lalvani et al., 1994). Возможно, дистрофины участвуют в трансдукции акустического сигнала в нейрональный и некоторые их дефекты или дефекты дист Рофин-гликопротеинового к о м п л е к с а ответственны за °пределенные типы нейросенсорной тугоухости. Не исклю­ чено также, что делеций в 44-м интроне, «горячей» точке Вн Утригенной рекомбинации, специфически разрушающие п Ромоторную область для наиболее интенсивно экспресСи Рующегося в раннем эмбриогенезе нейронального апо63

дистрофина D p i 4 0 , могут приводить к одной из форм Х-сцепленной изолированной умственной отсталости, ген которой также локализован в области Х р 2 1 . Предполагается, что среди семей с миодистрофией дюшенновского типа в 6.8% случаев наследование осуществ­ ляется по аутосомно-рецессивному типу (Zatz et al., 1989). По оценкам этих же авторов, доля мальчиков с аутосомнорецессивным типом наследования среди изолированных слу­ чаев миодистрофии Дюшенна составляет 2.5-4%. Аномалии дистрофин-связанных белков в сарколемме — первый об­ щий шаг в патологическом процессе, ведущем к некрозу мы­ шечных клеток, не только при Х-сцепленной форме миодист­ рофии Дюшенна, но и при тяжелых аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных миодистрофиях, так же как и при миоди­ строфии Фукуяма. Дюшенно-подобные формы миодистрофии представ­ ляют собой генетически гетерогенную группу аутосомнорецессивных заболеваний. Чаще всего такие семьи выяв­ ляют потому, что в них наблюдаются девочки с клиникой миодистрофии Дюшенна. При этом у больных девочек не находят каких-либо структурных аномалий, затрагивающих Х-хромосому. В частности, необычно высокая частота тя­ желой прогрессирующей мышечной дистрофии с аутосомно-рецессивным характером наследования описана в Ту­ нисе (Ben Hamida et al., 1983). Из 93 диагностированных пациентов 75 принадлежали 17 семьям, в которых присут­ ствовали больные обоих полов, и 18 принадлежали 11 се­ мьям, в которых больными были только девочки. Оказа­ лось, что в большинстве случаев аутосомно-рецессивные дюшенно-подобные формы миодистрофии обусловлены мутациями в генах, кодирующих белки дистрофин-ассоци­ ированного комплекса. В табл. 7 суммированы данные по локализации таких генов и их связи с наследственными заболеваниями.

Таблица 7 Связь генов, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного комплекса, с наследственными заболеваниями Ген

Белок а-саркогликан, адхалин

SGA, aSG,

Заболевание

Лока­ лизация 17q21

первичная адхалинопатия; SCARMD*); конечностнопоясная миодистрофия 2D; дилатационная кардиомиопатия

ADL, DAG2

р- саркогликан

SGB,

pSG

4q12

конечностно-поясная миодистрофия 2Е; ARMD**

у-саркогликан

SGG,

ySG

13q12

конечностно-поясная миодистрофия 2С; SCARMD; дилатационная кардиомиопатия

S-саркогликан

SGD, 8SG

5q33

конечностно-поясная миодистрофия 2F

а- дистрогликан

DAG1

3p21

дилатационная кардиомиопатия

р- дистрогликан Дистробревин

DAG1

3p21

не найдено

DRP3

18q12.1-1 не найдено 2.2

Ламинин 2, мерозин

LAMA

6q22-q23

*)

миодистрофия врожденная мерозин дефицитная

S C A R M D — т я ж е л а я детская а у т о с о м н о - р е ц е с с и в н а я

мышечная дистрофия. **)

ARMD

аутосомно-рецессивная

мышечная дистрофия

Дюшенновского типа.

В ряде семей с тяжелой формой детской аутосомноРецессивной мышечной дистрофией (SCARMD), впервые описанной в большой тунисской семье, при сохранении нор­ мальных уровней дистрофина наблюдали выраженный дефи­ цит a-саркогликана, называемого иначе адхалином или 50DAG (Matsumura etal., 1992; Piccolo et al., 1995). Во многих

5

^ к а з № 170

65

таких семьях этот дефект является вторичным. В относитель­ но небольшом проценте семей подобный дефект является первичным, то есть обусловлен мутациями в гене а-саркогликана -aSG или ADL, картированном в области 17р21 (McNally et al., 1994). Такая форма очень варьирующей по степени тяжести аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии получила на­ звание первичной адхалинопатии. Для пациентов с первич­ ной адхалинопатией характерным является преимуществен­ ное поражение проксимальных мышц, высокие уровни сыво­ роточной креатинкиназы, нормальное содержание дистрофи­ на, сохранный интеллект. Дебют и степень выраженности клинических симптомов могут варьировать от ранних и тя­ желых форм до поздних с минимальными проявлениями мышечной слабости. Примерно в 25% случаев у больных с первичной адхалинопатией обнаруживается однотипная миссенс-мутация R77C в гене ADL (Roberds et al. 1994). Пациен­ ты с этой мутацией были найдены в семьях различного этни­ ческого происхождения из Франции, Германии, Африки, США. В дальнейшем эта форма миопатии была классифицирова­ на, как один из генетических вариантов конечностно-поясных миодистрофии, обусловленных наследственными дефек­ тами белков саркогликанового комплекса. Аномально низкий уровень экспрессии саркогликанов и дистрогликанов обнаружен у пациентов в Японии с врож­ денной аутосомно-рецессивной прогрессирующей мышеч­ ной дистрофией типа Фукуяма, сочетающейся с умствен­ ной отсталостью (см. ниже). Однако и в данном случае эти дефекты являются вторичными, так как прослежено сцеп­ ление заболевания с маркерами длинного плеча хромосо­ мы 9 (9q31-q33). Картированы и клонированы гены, кодирующие другие белки саркогликанового субкомплекса. Мутации в этих генах сопровождаются разрушением этого субкомплекса и реали­ зуются либо в виде различных форм миодистрофии плечево­ го и тазового пояса (Lim et al., 1995), либо в виде аутосомно66

рецессивной мышечной дистрофии (ARMD) дюшенновского типа (Bonnemann et al., 1995). DAG1 рассматривался в качестве кандидатного гена при различных аутосомно-рецессивных формах миодистрофии. Однако до сих пор в этом гене не обнаружено никаких мута­ ций, приводящих к наследственным миопатиям. По-видимо­ му, важная роль дистрогликанов в формировании оболочек плода приводит к тому, что большая часть мутантов по DAG1 гену погибают в раннем эмбриогенезе. Мы уже упоминали о том, что дефекты в а-дистрогликане обнаруживаются у неко­ торых пациентов с аутосомно-рецессивными формами дила­ тационной кардиомиопатий. При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц более 500 пациентов с различными формами миопатии, у которых был сохранен нормальный уровень дистрофина, в 10% случаев наблюдали отсутствие окрашивания на ос-саркогликан (Duggan et al., 1997). В 60% этих случаев были об­ наружены мутации в саркогликановых генах. Большая часть из них (58%) оказалась локализована в гене адхалина, 27% и 13% в генах р- и у-саркогликанов, соответственно. Чаще все­ го такие мутации обнаруживаются у пациентов с тяжелыми дюшенно-подобными формами миодистрофии, дебютирующи­ ми в детском возрасте. Среди проксимальных форм с поздним началом подобные мутации были найдены в 6% случаев. 8. Семейство DMD-родственных генов Обнаружен аутосомный гомолог гена DMD, локализо­ ванный в области 6q24, — ген UTRN или DRP1, кодирующий дистрофин-родственный белок с молекулярной массой в 395 кД — утрофин (табл. 8). Показано, что утрофин в ряде случа­ ев может выступать в качестве функционального гомолога Дистрофина. Геномная область, занимаемая UTRN, почти втрое меньше гена DMD и составляет 900 кб. Размеры РНК"Фанскриптов этих двух генов близки — величина мРНК DMD составляет 14 кб, a UTRN — 13 кб (Blake et al., 1996). Ген UTRN активно экспрессируется в нейромышечных и в мы-

67

шечно-сухожильных соединениях, в мозге и в дополнение к этому во многих других висцеральных тканях, в первую оче­ редь — в легких. Интересно подчеркнуть, что регуляция экс­ прессии генов DMD и UTRN осуществляется, по-видимому, аналогичным образом. Так, обнаружен 5.5-кб транскрипт это­ го гена, преимущественно экспрессирующийся в сенсорных ганглиях и в мозге, кодирующий 113 кД белок G-утрофин, го­ мологичный апо-дистрофину периферических нервов D p i 16 (Blake et al., 1995). Описан также 80 кД утрофин, который, п о - в и д и м о м у , является а у т о с о м н ы м г о м о л о г о м Dp71 (Fabbrizio et al., 1995a). Кроме того, в области Xq22 идентифицирован другой небольшой ген, гомологичный З'-концу DMD — DRP2 (Roberts et al., 1996). Этот ген занимает 45 кб геномной ДНК, его ко­ дирующая область разделена на 24 экзона. Продуктом гена DRP2 является 110-кД белок, состоящий из 956 аминокислот. Ген DRP2 преимущественно экспрессируется в головном и в спинном мозге, и его продуктом является белок, родствен­ ный D p i 16. Прослежена эволюционная связь между дистрофин-родственными генами млекопитающих и их предшест­ венниками у беспозвоночных (Roberts,Bobrow, 1998). По-ви­ димому, у большинства беспозвоночных имеется один ген, кодирующий высококонсервативный дистрофин-родственный белок, в дополнение к гену дистробревина (DRP3), имеюще­ му более отдаленное сходство с дистрофином. Дистрофинродственный ген и ген дистробревина произошли от гена-пред­ шественника путем более ранней дупликации. У позвоноч­ ных дистрофин-родственный ген подвергался серии дупли­ каций, приведших к образованию покрайней мере трех от­ дельных генов (DMD, UTRN и DRP2), способных выполнять различные специализированные функции. Недавно был изолирован ген морского ежа, который, по-видимому, является предшественником генов дистрофи­ на и утрофина (Wang et al., 1998). Более чем 300-кД продукт этого гена содержит покрайней мере 3 из четырех доменов дистрофина. В этом гене также обнаружено несколько про68

моторов и его наименьший продукт, по-видимому, родстве­ нен D p i 16. Предложена модель, согласно которой ген DRP2, кодирующий Ор116-родственный белок, также эволюциони­ ровал от этого гена-предшественника путем дупликации его небольшой части. В настоящее время никаких мутаций в ге­ нах UTRN, DRP2 и DRP3 не описано. Таблица 8 Семейство DMD-родственных генов Ген DMD

Размер Основной Локализация Размер продукт гена (кб) мРНК (Кб) Хр21 2500 14 дистрофии

UTRN, DRP1

6q24

900

13

утрофин

DRP2

Xq22

45

2.8

дистрофин-родственный белок 2

DRP3

18q12.1-12.2

дистробревин

395-кД утрофин также относится к спектрин/а-актининовому семейству белков. Он имеет доменную организацию, гомологичную дистрофину. При этом сходство его актин-связывающего, цистеин-богатого и С-концевого доменов с соот­ ветствующими доменами дистрофина достигает 85—88%. На­ ибольшие различия касаются стержневого домена, состоя­ щего в утрофине из 22 повторяющихся спектрин-подобных сегментов, прерванных двумя петлеобразными районами. G-утрофин содержит уникальный N-конец, небольшой фраг­ мент стержневого домена, включающий два спектрин-подоб­ ных повтора и последний петлеобразный район, а также цистеин-богатый и С-концевой домены утрофина. Показано, что утрофин подобно дистрофину способен взаимодействовать с компонентами дистрофин-гликопротеинового комплекса и

69

выполнять сходные функции, то есть дистрофин и утрофин, по-видимому, являются функциональными гомологами. Дру­ гой дистрофин-родственный белок, кодируемый геном DRP2, содержит короткий пролин-богатый район, два спектрин-подобных повтора стержневого домена и последовательность, гомологичную последующим доменам дистрофина и утрофина — цистеин-богатому и С-концевому. Найдено большое сходство между D p i 16 изоформой дистрофина и дистрофинродственным белком drp2 (Roberts et al., 1996). Хотя точные функции G-утрофина и drp2 неизвестны, они могут подобно апо-дистрофинам связываться с р-дистрогликаном. В раннем эмбриогенезе утрофин присутствует в сарко­ лемме скелетных мышц, занимая сходное с дистрофином положение (Clerk et al., 1993). По-видимому, высокая скорость деления клеток в этот период не позволяет транскрибиро­ ваться такому крупному гену, как DMD. Однако в дальней­ шем дистрофин постепенно замещает утрофин в сарколем­ ме мышц и начиная с 26 недель беременности утрофин там уже не обнаруживается, а экспрессируется только в нейромышечных и мышечно-сухожильных соединениях, причем его локализация в этих сайтах отлична от локализации дистро­ фина. В сердечной мышце утрофин находят в интерколярных дисках, тогда как дистрофин располагается преимущест­ венно по периферии кардиоцитов. Можно считать доказанным участие утрофина в синаптогенезе. Показано, что взаимодействие сс-дистрогликана с агрином и перлеканом, стимулирующее в дальнейшем клас­ терирование ацетилхолиновых рецепторов, осуществляется в тех случаях, когда этот гликопротеин находится в комплек­ се с утрофином. На рис. 9 изображена структура утрофинассоциированного комплекса белков в нейромышечных со­ единениях. Оказалось, что утрофин, в отличие от дистрофи­ на, способен взаимодействовать с рапсином, содержащим 43кД цинк-фингерный домен и принимающим непосредствен­ ное участие в перекрестной сшивке ацетилхолиновых рецеп­ торов с образованием микрокластеров (Phillips et al., 1993). 70

Индукция образования больших кластеров происходит с уча­ стием а-дистрогликана, по-видимому, посредством его взаи­ модействия с ламинином (Chamberlain, 1999). Утрофин мо­ жет играть роль стабилизатора подобных кластеров для уста­ новления точечных контактов между рецепторными агрега­ тами и цитоскелетом. Трансгенное разрушение рапсинового гена у мышей сопровождается образованием аберрантных нейромышечных соединений в результате потери способно­ сти к кластерированию ацетилхолиновых рецепторов, что и приводит к ранней гибели животных (Gautam et al., 1995). Таким образом, рапсин обеспечивает связь между ацетилхолиновыми рецепторами и агрин-связанным утрофин-ассоциированным гликопротеиновым комплексом (Apel et al., 1995). Еще одним отличием утрофин-ассоциированного ком­ плекса белков является его ассоциация с микротрубочками, осуществляемая посредством взаимодействия цистеин-богатого домена утрофина со специфической серин/треонинкиназой (MAST).

Рис. 9. Структура утрофин-ассоциированного комплекса белков в нейромышечных соединениях

Интересно подчеркнуть, что з мышцах пациентов с миодистрофией Дюшенна утрофин присутствует в сарко­ лемме, причем в положениях, характерных для дистрофи­ на. Это связано с посттрансляционными изменениями, а не с увеличением скорости его транскрипции. Подобные нарушения в регуляции распределения утрофина наблю­ даются при дерматомиозитах и полрмиозитах. По-видимо­ му, перераспределение утрофина возникает при регене­ рации мышцы и может служить компенсаторным механиз­ м о м , частично защищающим мышечное волокно от даль­ нейших раундов дегенерации и регенерации. 9. Линии мышей, моделирующие миодистоофию Дюшенна/Беккера Успешному анализу особенностей организации гена дистрофина и изучению молекулярных основ патогенеза миодистрофии Дюшенна способствовали параллельные ис­ следования, выполненные на модельной линии мышей — mdx. Эта модель была получена в результате отбора мута­ ции, спонтанно возникшей в одной из линий мышей дикого типа (Bulfield et al., 1984). В мышцах и в мозге у мышей этой линии резко снижено количестЕО Dmd-мРНК и не об­ н а р у ж и в а ю т с я и м м у н о л о г и ч е с к и е формы дистрофина. Идентифицирована нонсенс-мутация в экзоне 23 гена Dmd у животных линии mdx, в результате <оторой транслирует­ ся лишь 2 7 % дистрофинового полипептида. У mdx мышей, так же как у больных с миодистрофией Дюшенна, значи­ тельно повышен уровень сывороточной креатинкиназы. Несмотря на это, заметных фенотипинеских отклонений от нормы у мутантных мышей не наблодается. Однако при гистологическом исследовании скелетных мышц конечно­ стей и диафрагмы животных обнаруживаются зоны экстен­ сивной дегенерации и регенерации с многочисленными патологическими признаками мышечной дистрофии, вклю­ чая некрозы, вариации по величине мышечных волокон, центральную, а не периферическую локализацию ядер в 72

регенерирующих волокнах. У модельных mdx мышей, так же как и у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, оказывается разрушен ассоциированный с дистрофином гликопротеиновый комплекс. Дополнительно путем индуцированного мутагенеза и селекции были получены еще четыре линии mdx-мышей, в которых проведена молекулярная идентификация мутантных аллелей в гене Dmd (Сох et al., 1993b; lm et al., 1996). Фено­ тип мышей всех пяти mdx-линий по характеру мышечной па­ тологии очень сходен. Из-за присутствия различных точковых мутаций в гене Dmd животных этих линий ни в их мыш­ цах, ни в мозге не экспрессируется полноразмерный дистро­ фии. Две из этих мутаций нонсенс типа, то есть создают преж­ девременный стоп-кодон, а три нарушают процесс сплайсин­ га первичного РНК-транскрипта. В результате различного расположения мутаций относительно внутренних промоторов гена Dmd исследуемые мутантные линии различаются по набору экспрессирующихся укороченных изоформ дистрофи­ на. Таким образом, эти генетические линии представляют собой идеальную систему для анализа функций множествен­ ных изоформ дистрофина. У мутантных мышей, не экспрессирующих основной продукт гена DMD в немышечных тканях — апо-дистрофин-1, уровень дистрофин-ассоциированных белков в мозге значи­ тельно снижен, что указывает на важную роль этой укоро­ ченной изоформы дистрофина для формирования и/или ста­ билизации DAP-комплекса в центральной нервной системе (Greenberg et al., 1996). На базе mdx-мышей были сконструированы трансген­ ные линии животных, в которых при отсутствии дистрофи­ на наблюдается эктопическая экспрессия Dp71 (Сох et al., 1994; Greenberg et al., 1994). Оказалось, что, в отличие от mdx-мышей, у трансгенных животных апо-дистрофин-1 при­ сутствует в сарколемме скелетных мышц. Кроме того, при экспрессии Dp71 содержание дистрофин-ассоциированных белков — 59DAP, 50DAG и 43DAG — поднимается до нор73

мальных уровней и апо-дистрофин-1 оказывается спосо­ бен таким же образом, как и дистрофин, взаимодейство­ вать с этими белками, реконструируя дистрофин-гликопротеиновый комплекс. Несмотря на это, признаки мышечной дистрофии, характерные для mdx-мышей — некрозы, ва­ рьирующая величина миофибрилл и центральное располо­ жение ядер в регенерирующих волокнах, а также высокий уровень сывороточной креатинкиназы, не только сохраня­ ются при трансгенозе D p 7 1 , но даже в некоторой степени усиливаются. Таким образом, само по себе восстановле­ ние дистрофин-гликопротеинового комплекса недостаточ­ но для предотвращения мышечной дистрофии. Для сохра­ нения целостности мышечной мембраны, по-видимому, необходимо взаимодействие N-концевого участка дистро­ фина с актиновыми филаментами цитоскелета миофиб­ рилл. Отсутствие клинических проявлений миодистрофии у mdx мышей частично может быть объяснено компенсатор­ ным действием утрофина. В частности, с этим, по-видимо­ му, связан тот парадоксальный факт, что у mdx-мышей, в отличие от больных миодистрофией Дюшенна, не наблю­ дается сердечной недостаточности. Действительно, в сер­ дечной мышце мышей в норме уровень утрофина оказал­ ся в четыре раза выше, чем у человека. У дистрофин-дефицитных мышей, так же как и у пациентов с миодистро­ фией Дюшенна/Беккера, содержание утрофина в сарколем­ ме мышц значительно повышено, причем это связано с посттрансляционными изменениями, а не с увеличением скорости его транскрипции. Для изучения роли комплементарного действия дис­ трофина и утрофина в патогенезе миодистрофии Дюшенна была сконструирована серия трансгенных линий мышей с различными сочетаниями дефектов в генах Dmd и Utrn (Deconinck et al., 1997; Grady e t a l . , 1997; Gilbert e t a l . , 1998; Rafael et al., 1998) (табл. 9). Оказалось, что аденовирусное введение трансгена, специфически экспрессирующего в 74

скелетных мышцах укороченную форму утрофина (Tg Utm), приводит к коррекции гистологических аномалий в линиях mdx (Tinsley et al., 1996; Deconinck et al., 1997c). Укорочен­ ный трансген кодирует 200-кд белок, содержащий функци­ онально значимые амино- и карбокситерминальные доме­ ны утрофина, но не имеющий большей части его стержне­ вого спектрин-подобного района. Трансген работает под контролем а-актининового промотора, обеспечивающего специфическую экспрессию в скелетных, но не в сердеч­ ной мышце. В диафрагме и в конечностях мышей линии (Tg Utm; mdx) экзогенный утрофин располагается в сарко­ лемме мышц. У трансгенных животных, в отличие от mdxмышей, значительно сокращена площадь некротических зон и миофибрилл с варьирующей величиной и центральным расположением ядер в регенерирующих волокнах скелет­ ных мышц. Кроме того, у них понижено содержание сыво­ роточной креатинкиназы и улучшены механические свой­ ства мышц, что определяется по м н о г и м показателям, включая уровень спонтанной активности животных. Пол­ ностью восстанавливается нормальный внутриклеточный гомеостаз кальция, нарушенный у mdx-мышей и у пациен­ тов с миодистрофией Дюшенна. При трансгенозе укорочен­ ных форм утрофина, по-видимому, происходит восстанов­ ление дистрофин-ассоциированного комплекса белков, так как при иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц таких животных с использованием анти-ос-саркогликановых антител появляется специфическое окрашивание в сарко­ лемме. Инактивация гена Utrn у мышей не приводит к какимлибо заметным фенотипическим аномалиям (Deconinck et al., 1997b). Животные с (1Лгп-/-)-генотипом развиваются нормаль­ но и имеют незначительные дефекты, обусловленные неболь­ шими постсинаптическими аномалиями в нейромышечных соединениях. При скрещивании мышей из линий mdx и Utrn-/- удалось получить животных, у которых одновременно Дефектными оказались оба гена — Dmd и Utrn (Grady et al., 75

1997a; 1997b). В отличие от мышей родительских линий, осо­ би линии (Utrn-Л; mdx), называемой также Dko, представля­ ют из себя истинную фенокопию миодистрофии Дюшенна. У таких животных наблюдается тяжелая мышечная дистрофия с контрактурами суставов, кардиомиопатией, заметной за­ держкой роста, кифозом. Погибают они на сроке от 6 до 20 не­ дель постнатального развития. У мышей линии Dko при ульт­ развуковом исследовании наблюдаются структурные анома­ лии в нейромышечных и мышечно-сухожильных соедине­ ниях. При этом в нейромышечных соединениях белки дис­ трофин-ассоциированного комплекса — р-дистрогликан и р2-синтрофин, а также белки ацетилхолино-рецепторных (AchR) комплексов, в том числе рапсин, имеют нормаль­ ную локализацию. Таким образом, у двойных мутантов на­ блюдается тяжелая прогрессирующая мышечная дистрофия при сохранении качественно нормального развития синаптической системы. Удивительным оказалось то, что дистрофин/утрофиндефицитные животные с введенным трансгеном, экспрессирующим в скелетных мышцах укороченную форму утро­ фина, не имеют аномалий, характерных для мышей линии (Utrn-/-; mdx) (Rafael et al., 1998). Они нормально развива­ ются и даже спустя год не проявляют каких-либо клиниче­ ских симптомов миодистрофии, несмотря на то что в сер­ дечной мышце таких животных дистрофин и утрофин пол­ ностью отсутствуют. Показано также, что, в отличие от дистрофин/утрофин-дефицитных животных, у мышей линии (Тд Utrn; Utrn-/-; mdx;) появляется окрашивание на а-саркогликан в сарколемме мышц и восстанавливается экспрес­ сия некоторых белков, необходимых для нормального раз­ вития мышц. Очевидно, что присутствие укороченной фор­ мы утрофина в сарколемме мышц мутантов, не имеющих нормального дистрофина и утрофина, способно восстано­ вить дистрофин-ассоциированный комплекс белков, нор­ мальное развитие и функционирование дефектных мышц.

76

Таблица 9 Характеристика мышей, дефектных по дистрофиновому (Dmd) и/или утрофиновому (Utrn) генам Линии Характер Экспрессия Экспрессия Фенотип утрофина мышей дефекта дистрофина точковые укороченная норма физически mdx мутации нормальны, форма в Dmd гистологические аномалии мышц физически TgUFrn; точковые укороченная норма + мутации укороченная нормальны, форма mdx в Dmd + форма коррекция трансген в скелетных гистологических Utrn мышца аномалий мышц отсутствие физически Шгп -/- «нокаут» норма экспрессии Utrn нормальны, небольшие постсинаптические аномалии в нейромышечных соединениях Utrn -/-; точковые укороченная отсутствие тяжелая форма экспрессии mdx мутации миодистрофии с форма в Dmd + контрактурами «нокаут» суставов, Utrn задержкой роста, кифозом и преж­ девременной смертью Tg utrn; точковые укороченная отсутствие физически Utrn(-/-); мутации экспрессии + нормальны, форма в Dmd + mdx укороченная значительная «нокаут» коррекция форма в Utrn + миодистрофии скелетных трансген и сопут твующих мышца Utrn симптомов, небольшие нейромышечные дефекты

Мы уже подчеркивали критическую роль дистроглика­ нов в поддержании всего дистрофин-ассоциированного ком­ плекса белков. Трансгенные мыши, гомозиготные по нуле­ вым аллелям дистогликанового гена (Dag1neo2), погибают в раннем эмбриогенезе в результате грубых пороков разви­ тия, возникающих вследствие разрушения Рейхеротовской мембраны. У таких эмбрионов нарушена локализация двух критических структурных элементов этой оболочки — ламинина и коллагена IV. Недавно были получены химерные мыши с недостаточ­ ностью дистрогликанов, путем инъекции в бластоцисты эмб­ риональных стволовых клеток (ЭСК), в которых предваритель­ но в условиях культивирования были направленно разруше­ ны оба аллеля гена Dag1 (Cote et al., 1999). У таких мышей развивается прогрессирующая патология мышц, имеющая большое сходство с тяжелой миодистрофией человека. У них наблюдается выраженный кифосколиоз и деформация конеч­ ностей при нормальном развитии костной системы. В боль­ шинстве мышечных волокон химерных мышей дистрофин-ассоциированный комплекс белков полностью отсутствует и не наблюдается иммуноокрашивания на а-дистрогликан, дистро­ фин или а-саркогликан. Удивительным оказалось то, что при этом сохраняется ультраструктура базальных мембран мышц с правильной локализацией в них ламинина. Фенотип химер­ ных мышей во многих отношениях напоминает фенотип двой­ ных мутантов по дистрофину и утрофину. Однако, в отличие эт мышей линии (Utrn-/-; mdx), у химерных животных оказа1ись разрушены многие нейромышечные соединения. Это эще раз доказывает ведущую роль в развитии синаптичес:ой системы р-дистрогликана и, возможно, р2-синтрофина, 1рисутствующих у двойных мутантов по дистрофину и утроЬину и отсутствующих у химерных животных. По-видимому, истрогликаны совершенно необходимы для выживания мыючных волокон, дифференцировки нейромышечных соедиений и синаптогенеза, но не являются обязательными для юрмирования базальных мембран мышц. 78

С использованием методов трансгенного моделирова­ ния исследовали роль нейрональной синтетазы окиси азота (nNOS) в патогенезе миодистрофии Дюшенна. При отсутст­ вии дистрофина у больных, также как и у mdx-мышей, nNOS, соединенная в норме с сарколеммой через комплекс дистрофин-гликопротеиновых белков, занимает неправильное положение внутри мышечного волокна, где она продолжает продуцировать окись азота. Было высказано предположение, что одним из элементов сложного патогенетического пути при миодистрофии Дюшенна является токсичность свободных радикалов, обусловленная неправильной цитозольной лока­ лизацией nNOS. Однако это предположение не нашло под­ тверждения, так как у трансгенных mdx-мышей с инактивированным геном nNOS (nNOS-дистрофин нулевые мутанты) сохраняются основные патологические характеристики mdx мышей (Crosbie et al., 1998). В заключение хотелось бы упоминуть об очень перспек­ тивных экспериментах по медикаментозной коррекции ано­ малий мышц в линии мышей mdx (Barton-Davis et al., 1999). Мы уже упоминали о том, что причиной развития дистрофи­ ческого процесса у этих животных является нонсенс-мута­ ция в гене Dmd. Оказалось, что в присутствии антибиотика гентамицина может происходить ошибочное проскакивание стоп-кодона при трансляции белков. По-видимому, введение определенных доз этого препарата в развивающиеся мыш­ цы мутантных животных может в каком-то проценте случаев приводить к проскакиванию нонсенс-мутации в гене Dmd и продолжению синтеза белка с образованием функциональ­ ного дистрофина. Напомним, что нонсенс-мутации в гене DMD являются частой причиной развития миодистрофии Дюшен­ на и возможность гентамициновой терапии подобных случа­ ев заболевания представляется очень заманчивой. По-ви­ димому, в самое ближайшее время будут начаты клиничес­ кие испытания возможности такого лечения не только в от­ ношении миодистрофии Дюшенна, но и, возможно, других мо­ ногенных заболеваний, обусловленных ошибочным образо79

зованием стоп-кодонов и преждевременным прекращением трансляции соответствующих белков. 10. Генотерапия миодистрофии Дюшенна/Беккера В последние годы большое внимание уделяется разра­ ботке методов генотерапии миодистрофии Дюшенна. Эти ис­ следования пока не достигли стадии клинических испытаний. Они проводятся на мутантных культурах клеток и модельных линиях экспериментальных животных, в первую очередь на линиях мышей mdx, а также на одной из линий охотничьих собак (золотых ретриверов), у которых также обнаружена мутация в гене дистрофина. При этом были опробованы раз­ личные способы введения генетического материала, вклю­ чая перенос миобластов, использование ретровирусных и аденовирусных векторов, а также прямую инъекцию плазмидной ДНК в мышцы. Успешный перенос гена дистрофина в составе ретровирусного вектора выполнен на культуре клеток млекопита­ ющих (Dickson et al., 1991). Наиболее перспективными для переноса 14кб кДНК дистрофина, по-видимому, являются аденовирусные мини-хромосомы, сочетающие в себе элемен­ ты плазмидной ДНК, аденовирусные сигналы начала репли­ кации и сигналы упаковки, а также содержащие р-галактозидазный ген-репортер и регуляторные элементы полноразмер­ ного гена дистрофина (Kumar-Singh, Chamberlain, 1996). В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципиаль­ ная возможность генокоррекции миодистрофии Дюшенна (Acsadi et al., 1991). Появление дистрофина человека в сар­ колемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генно-инженер­ ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистрофина (14 кб) или его делетированную, но функциональ­ но активную форму, так называемый мини-ген размером 6.3 кб (Wells etal., 1992; Сох et al., 1993а; Acsadi et al., 1991; 1995). Мини-ген был сконструирован на базе кДНК пациента с очень мягким течением миодистрофии Беккера, вызван80

ной делецией 4 6 % дистрофина. Эта огромная по протяжен­ ности делеция, целиком локализованная внутри стержнево­ го домена, практически не затрагивала функциональной ак­ тивности белка (England et al., 1990). После внутривенного введения фрагментов гена Dmd в составе рекомбинантного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной ДНК в скелетных и сердечной мышцах животных (SratafordPerricaudet etal., 1992). Повышение экспрессии дистрофина, происходящее у mdx-мышей в результате трансгеноза пол­ норазмерного гена Dmd, предотвращает развитие аномаль­ ных механических свойств мышц диафрагмы, связанных с их дистрофией (Сох et al., 1993а). При этом 50-кратное уве­ личение уровня экспрессии дистрофина не вызывало ника­ ких побочных токсических эффектов. Несмотря на эти очевидные успехи, проблема генноинженерной коррекции миодистрофии Дюшенна еще далека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии миодист­ рофии Дюшенна по сравнению с клеточной терапией — пе­ ресадкой здоровых эмбриональных миобластов. Пока не ут­ верждена ни одна программа клинических испытаний генотерапевтического лечения миодистрофии Дюшенна. Основ­ ные проблемы генокоррекции данного наследственного за­ болевания связаны с (1) огромным количеством дистрофинположительных мышечных клеток, (2) сложным характером регуляции экспрессии DMD гена, (3) необходимостью обес­ печения системы эффективной доставки гена дистрофина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно важно, в мышцы сердца и диафрагмы, а возможно, и в раз­ личные отделы мозга, а также (4) с иммунологическими ос­ ложнениями, возникающими при использовании вирусных векторов. В связи с этим наряду с совершенствованием пря­ мых, вирус-опосредованных и липосомных способов введе­ ния чужеродных ДНК разрабатываются иные подходы к ге­ нокоррекции миодистрофии Дюшенна, такие как: использо­ вание макрофагов, нагруженных плазмидами; модификация

6 Заказ № 170

81

культивированных сателлитных клеток, полученных с единич­ ных мышечных волокон; совместное выращивание фибробластов и миобластов, их модификация и генетическая транс­ формация фибробластов в миобласты; конструирование мини-хромосом, при котором ген дистрофина в составе YACвектора вводится в сферобласты и проводится инфузия этой конструкции в культивируемые миобласты. Один из подходов в генотерапии миодистрофии Дюшен­ на основан на трансфекции в мышечные клетки антисмысловых РНК с целью посттрансляционной коррекции сдвига рамки считывания (Matsuo, 1996). Эта технология основана на том наблюдении, что делеции в гене DMD у пациентов с мягкими формами миодистрофии Беккера, как правило, не сопровождаются сдвигом рамки считывания. В опытах in vitro показано, что в сарколемме культивируемых миотубул mdxмышей появляется экспрессия дистрофина после трансфек­ ции в них олигонуклеотидов, комплементарных З'-сайту сплай­ синга 22 интрона гена Dmd (Dunckley et al., 1998). Путем пря­ мого секвенирования соответствующих последовательностей кДНК, полученных из этих клеток методом обратной ПЦР (RTPCR), показано, что при сплайсинге происходит точное вы­ резание области, включающей мутантный сайт и заключен­ ной между 22 и 30 экзонами. При этом образуется новый РНК-транскрипт дистрофина, который может кодировать про­ дукт, достаточно функциональный для предотвращения раз­ вития наиболее тяжелых проявлений миодистрофии. В 1995 г. исследования по генотерапии миодистрофии Дюшенна начаты в рамках программы «Геном человека» и в нашей стране. С использованием метода бомбардировки кле­ ток и тканей конъюгированными с плазмидами частицами зо­ лота или вольфрама, разогнанными до высоких скоростей, полноразмерная кДНК дистрофинового гена была успешно трансфецирована в скелетные мышцы мышей линии mdx (Zelenin et al., 1997). Иммуногистохимический анализ пока­ зал, что в некоторых клетках мышц мутантных животных по­ является дистрофин (рис. 10). Доля дистрофин-положитель82

ных волокон в области бомбардировки поднимается при этом до 2.5-5% (по сравнению с 0.5% в контроле) и сохраняется на этом уровне, по крайней мере, в течение двух месяцев. В некоторых экспериментах доля цельнокрашенных дистрофинположительных волокон в скелетных мышцах увеличивалась от 2 7 % через 2—3 недели до 82% через 2 месяца после бал­ листической трансфекции (Михайлов и др., 1998). По-види­ мому, в некоторых случаях происходит нерегулируемая экс­ прессия трансфецированного гена. Однако экспрессия дис­ трофина не нормализует полностью дифференцировку воло­ кон. Большой процент цельнокрашенных миофибрилл деге­ нерирует, в других сохраняется центральное положение ядер.

Рис. 10. Иммуногистохимический анализ дистрофина в мышечных клетках мышей линии mdx до (а) и после (б) введения кДНК-овых конструкций гена DMD В отличие от липосомного способа введения, еще бо­ лее успешной оказалась трансфекция полноразмерной кДНК дистрофина (pHSADy) с помощью синтетических микросфер MF-2 (Баранов и др., 1998; Baranov et al., 1998). После одно­ кратной инъекции MF-2/pHSADy в четырехглавую мышцу бе­ дра введенная конструкция обнаруживается методом ПЦР во многих тканях, включая скелетные мышцы, сердце, мозг, легкие, причем присутствие нагруженных плазмидой микро­ сфер определяется методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) в 60—70% ядер. Неожиданно высоким оказы-

83

вается уровень дистрофин-положительных волокон в контралатеральной по отношению к инъецированной четырехглавой мышце mdx-мышей спустя 60 дней после введения (рис. 11).

Рис. 11.

Число дистрофин-положительных волокон

Многие проблемы в генотерапии миодистрофии Дюшен­ на могли бы быть преодолены при использовании принципи­ ально иного метода коррекции генного дефекта, основанно­ го на специфической активации у больных аутосомного го­ молога DMD — гена UTRN (Tinsley, Davies 1993; Blake et al., 1996). Сходная ртратегия изменения регуляции экспрессии фетального гемоглобина была использована для компенса­ ции дефекта глобиновых цепей у больных с серповидно-кле­ точной анемией (Perrine et al., 1993). Характер экспрессии утрофина в раннем эмбриогенезе позволяет предполагать, что этот белок может функционировать как фетальная изоформа дистрофина. Возможно при этом, что утрофин ока­ жется способен заменить дистрофин, если удастся изменить характер экспрессии UTRN-гена у пациентов в тех клетках, в которых в норме ген DMD экспрессируется. Для направлен84

ного изменения регуляции работы гена утрофина с помощью определенных химических стимуляторов необходимо преж­ де всего детальное знание его промоторной области. Реали­ стичность такого подхода для лечения миодистрофии Дюшен­ на проверяется в настоящее время в опытах по трансгенозу на модельных объектах, в первую очередь, на mdx-мышах. Мы уже упоминали о том, что при трансгенном введении кон­ струкции, обеспечивающей экспрессию в скелетных мышцах укороченной формы утрофина, в линию дистрофин/утрофиндефицитных мышей, наиболее полно фенокопирующую миодистрофию Дюшенна, наблюдается коррекция основных клинических симптомов миодистрофии (Rafael et al., 1998). Очевидно, что присутствие укороченной формы утрофина в сарколемме мышц мутантных животных, не имеющих эндо­ генного дистрофина и утрофина, способно восстановить дистрофин-ассоциированный комплекс белков, нормальное раз­ витие и функционирование дефектных мышц. Значение этих результатов для разработки программ генотерапии миодист­ рофии Дюшенна трудно переоценить.

б) Мышечная дистрофия врожденная прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма (MIM: 253800) В 1960 г. впервые Фукуяма описал 6 семей с врожден­ ной прогрессирующей миодистрофией дюшенновского типа, сочетающейся с в ы р а ж е н н о й у м с т в е н н о й отсталостью (Fukujama et al., 1960). Характер наследования этой формы миодистрофии соответствовал аутосомно-рецессивному. Представлены результаты клинико-генеалогического анали­ за более 200 семей с этим заболеванием в Японии (Fukujama et al., 1981). Прогрессирующей мышечной слабости часто сопутствуют мышечная гипотония, эпилептиформные припад­ ки, гидроцефалия. Патоморфологически обнаруживаются микрополигирия, фиброглиальная пролиферация мягкой и паутинной оболочек. Кроме миодистрофии типа Фукуяма известны три клинически различающихся синдрома, при ко-

85

торых врожденная миопатия сочетается с пороками разви­ тия, такими как лиссэнцефалия, гидроцефалия, аномалии глаз. Это синдром Валькера-Варбурга (гидроцефалия, агирия, дисплазия сетчатки: HARD-синдром, MIM 236670), описанная в Финляндии болезнь МЕВ (muscle-eye-brain disease, MIM 253280) и врожденная мышечная дистрофия с центральной гипомиелинизацией, обусловленная дефектом мерозина (см. ниже, MIM 156225). При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц больных с миодистрофией Фукуяма примерно в 13% случа­ ев обнаруживаются аномалии дистрофина (Beggs et al., 1992). Для объяснения этого было высказано предположение, что дистрофин и продукт гена FCMD (Fukujama type congenital muscular dystrophy) взаимодействуют. Раннее начало и бо­ лее тяжелое течение заболевания наблюдается у пациентов, которые одновременно гетерозиготны по FCMD и гемизиготны по мутациям DMD-гена. Предполагается, что такой ком­ бинированный фенотип встречается среди мужчин в Японии с частотой 1:175000. У пациентов с миодистрофией Фукуяма обнаруживает­ ся аномально низкий уровень экспрессии многих белков дис­ трофин-ассоциированного комплекса, включая дистрогликаны — трансмембранный 43DAG и экстраклеточный 156DAG, и саркогликаны (Matsumura et al., 1993). Кроме того, содер­ жание ламинина в скелетных мышцах и в периферических нервах пациентов также оказывается сниженным. Однако генетический анализ семей дает основания предполагать, что эти нарушения являются вторичными по отношению к основ­ ному биохимическому дефекту, так как найдено сцепление гена FCMD с микросателлитными маркерами, локализован­ ными в области 9q31 -q33 (Toda et al., 1993). Ближайшие флан­ кирующие маркеры D9S58, D9S59 и D9S2107. Не исключе­ но, что в этой области локализован ген, кодирующий еще один белок дистрофин-ассоциированного комплекса (DAP), дис­ функция которого обусловливает клинику миодистрофии Фу­ куяма. Перекрывание клинических симптомов при миодист86

рофии Фукуяма и при мягких формах синдрома ВалькераВарбурга и результаты анализа гаплотипов больных по мар­ керам, сцепленным с геном FCMD, не противоречат предпо­ ложению об аллельной природе этих двух заболеваний (Toda et al., 1995). Дальнейший генетический анализ, выполненный с ис­ пользованием техники микросателлитного картирования, позволил сузить область локализации гена FCMD до менее чем 100 кб. Кандидатным для FCMD рассматривается в на­ стоящее время расположенный в той же области ген мышеч­ ной рецепторной тирозинкиназы — MUSC (muscle specific kinase) (Toda et al., 1996). Впервые гомолог этого гена — MuSC — был идентифицирован у мышей (Valenzuela et al., 1995). Показано, что MuSC специфическим образом экспрессируется в скелетных мышцах и в нейромышечных соедине­ ниях. При разрушении этого гена путем трансгеноза у мы­ шей не формируются нейромышечные синапсы (DeChiara et al., 1996). Предполагается, что кодируемая геном MUSC рецепторная тирозинкиназа является критическим сигналом для агрина, участвующего в активации всех ступеней каскада, ведущего к образованию синапса, включая организацию постсинаптической мембраны, синапс-специфическую транскрип­ цию и пресинаптическую дифференцировку.

1.3. Конечностно-поясные мышечные дистрофии Это гетерогенная г р у п п а заболеваний с преиму­ щественной локализацией дистрофического процесса в мышцах плечевого и тазового пояса. Выделяют следующие клинические типы: тазобедренный Лейдена-Мёбиуса; лопаточно-бедренный Эрба; поздний аутосомнодоминантный и квадрицепс-миопатию (Вельтищев и др. 1998). О п и с а н а т а к ж е н е о б ы ч н а я ф о р м а а у т о с о м н о рецессивной мышечной дистрофии плечевого и тазового пояса в сочетании с буллезным эпидермолизом.

87

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомнодоминантная, типы: 1A(MIM:159100); 1В; 1С; аутосомно-рецессивная, типы: 2А (MIM-.253600); 2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119); 2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400) Заболевание начинается в юношеском возрасте с 11—20 лет, возможно и более раннее начало. Мышечная слабость, утомляемость равиваются постепенно, поэтому точно определить дебют заболевания не всегда удается. Слабость сочетается с симметричными атрофиями мышц тазового пояса. Больные начинают испытывать затрудне­ ния при беге, быстрой ходьбе, прыжках. Ограничение дви­ гательных возможностей начинает выделять их из группы сверстников. Это особенно отчетливо выявляется на за­ нятиях физкультурой в школе. В дальнейшем появляются затруднения при подъеме на лестницу, вставании со стула и особенно с пола. Появляются так называемые вспомо­ гательные движения, меняющие формулу нормального дви­ гательного акта. Начинаясь с тазового пояса и ног, мышеч­ ная слабость распространяется на плечевой пояс и туло­ вище. Меняется осанка, опускаются надплечья, появляют­ ся «крыловидные» лопатки. Туловище отклоняется назад, усиливается поясничный лордоз, выпячивается живот, по­ является «осиная» талия. Больной ходит раскачиваясь из стороны в сторону, с трудом отрывая стопы от пола. Рань­ ше других атрофируются поясничные и ягодичные мышцы, четырехглавая мышца бедра. Псевдогипертрофии, если и бывают, то не столь выраженными, как при форме Дюшенна. Лицевая мускулатура обычно не страдает. Сухожильные и периостальные рефлексы снижаются, а затем полностью ис­ чезают. Снижение рефлексов начинается с коленных, а за­ тем с двуглавых мышц. Дистальные отделы конечностей еще долго сохраняют свои функции. Течение заболевания про­ грессирующее, менее злокачественное по сравнению с миодистрофией Дюшенна. Способность к самостоятельно­ му передвижению может сохраняться до 20—30 лет. 88

1. Общая генетическая характеристика LGMD — (limb-girdle muscular dystrophy) — гетероген­ ная группа заболеваний с варьирующей экспрессивностью мутантного гена. В настоящее время идентифицированы три аутосомно-доминантных формы заболевания: LGMD1A — LGMD1C и шесть аутосомно-рецессивных форм: LGMD2A — LGMD2F (Bushby et al., 1995; Van der Kooi et al.,1997; Bashir et al., 1998). Форма 1A связана с геном, расположенным в длинном плече хромосомы 5 в области 5q22.3-31.3 (Speer et al., 1992). Активно обсуждается возможность участия в кон­ троле этого заболевания гена LMNB1, расположенного в той же цитогенетической области и кодирующего один из белков семейства ядерных ламинов — В 1 . Ген, ответственный за миодистрофию LGMD1B, ассоциированную с кардиологическими дефектами, расположен в длинном плече хромосомы 1 — в области 1q11-q22 (van der Kooi et al., 1997). В этой же области локализован ген LMNA, кодирующий две другие альтернативно сплайсирующиеся изоформы ядерных ламинов А и С. Показа­ но, что ген LMNA дефектен при аутосомно-доминантной фор­ ме мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса (Bonne et. AL, 1999).Несмотря на выраженные клинические различия между этими двумя заболеваниями (отсутствие контрактур и преиму­ щественная слабость проксимальных отделов конечностей при обсуждаемой форме конечностно-поясной миодистрофии), не исключена их аллельная природа.Третья аутосомно-доминант­ ная форма миодистрофии плечевого и тазового пояса LGMD1С обусловлена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), располо­ женном в области Зр25 (Minetti et al., 1998). Пациенты с а у т о с о м н о - р е ц е с с и в н ы м и ф о р м а м и LGMD2A и LGMD2B имеют мягкий фенотип и часто клиниче­ ски могут быть отнесены к типу Эрба. Форма 2А связана с мутациями в гене CAPN3, расположенном в длинном плече хромосомы 15. CAPN3 кодирует одну из субъединиц специ­ фической мышечной протеазы — кальпаина-3. Форма 2В ока­ залась аллельным вариантом миопатии Миоши и обусловле­ на мутациями в гене DYSF, локализованном в коротком плече 89

хромосомы 2. Продукт этого гена — дисферлин, являющийся цитоплазматическим белком, способным связываться с эндоили саркоплазматическим ретикулумом, а также с ядерной мем­ браной. Гены, ответственные за более тяжелые формы ауто­ сомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии LGMD2C — LGMD2F, кодируют белки саркогликанового дистро­ фин-ассоциированного субкомплекса: у-, ос-, р- и 6-саркогликаны, соответственно (Roberds et al., 1994; Lim et al., 1995; Bonnemann et al., 1995; Noguchi et al., 1995; Nigro et al., 1996b). При исследовании бразильских семей с аутосомно-рецессивными формами тазово-поясной мышечной дистрофии, в каждой из которых наблюдали не менее 3 пациентов, в 3 3 % семей болезнь была обусловлена мутациями в гене кальпаина 3 (форма 2А), в 33% — в гене дисферлина (форма 2В), в 17% — в гене ос-саркогликана (форма 2D), в 10% семей — в гене усаркогликана (форма 2С) (Passos-Bueno et al., 1996а). Следует подчеркнуть, что дифференциальная диагностика раз­ личных генетических форм конечностно-поясных и аутосомнорецессивных дюшенно-подобных форм миодистрофии возможна в настоящее время только на базе молекулярного анализа. Генетическое разнообразие конечностно-поясных миоди­ строфии, по-видимому, не ограничивается описанными выше формами. Так, на основании анализа большой финской семьи, в которой одновременно наблюдали больных с двумя различ­ ными формами заболевания — тяжелой конечностно-поясной и мягкой дистальной миопатией с поздним началом, высказано предположение, что в первом случае это результат проявления доминантного гена в гомозиготном, а во втором случае — в гетерозиготном состоянии (Udd et al., 1992). Остановимся бо­ лее подробно на тех формах миодистрофии плечевого и тазо­ вого пояса, для которых гены уже идентифицированы. 2. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнодоминантная. форма LGMD1C Мы уже упоминали о том, что форма LGMD1С обуслов­ лена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), расположенном в коротком плече хромосомы 3 (Minetti et al., 1998). Кавео90

лин-3 или кавеолин М — специфичная для мышц форма се­ мейства белков, являющихся главными компонентами кавеол — присутствующих в большинстве типов клеток субкомпартментов плазматических мембран. Кавеолы являются динамическими структурами, участвующими в выполнении целого ряда функций, включая эндоцитоз и сигнальную трансдукцию. Предполагается, что кавеолины (VIP-21) играют структурную роль в образовании неклатриновых везикул, в том числе в образовании кавеоловых мембран, организуя и концентрируя специфические кавеолин-взаимодействующие липиды и белки на кавеоловых микродоменах. Подобно дистрофину, кавеолин-3 локализован в сарко­ лемме мышечных волокон. При субклеточном фракциониро­ вании кавеолин-3 осаждается вместе с белками дистрофинассоциированного комплекса и иммунопреципитируется дистрофиновыми антителами, что указывает на то, что кавео­ лин-3 и дистрофии являются частью дискретного комплекса. При анализе гена CAV3 у 82 пациентов с аутосомно-доминантной формой прогрессирующей конечностно-поясной миодистрофей были найдены две миссенс-мутации — G55S и C71W (McNally et al., 1998). Предполагается, что мутации в гене CAV3 влияют на процесс олигомеризации кавеолина-3 и на взаимодействие с некоторыми кавеолин-ассоциированными сигнальными молекулами, такими как гетеротримерные G-белки, H-Ras, Src-семейство тирозинкиназ, эпидермальный фактор рос­ та R, протеинкиназа С и синтетаза окиси азота (eNOS). В результате нарушается образование кавеол в плазматичес­ кой мембране мышечных клеток, что и ведет к развитию дан­ ной формы конечностно-поясной миодистрофии. 3. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнореиессивная. форма LGMD2A При генетическом анализе группы семей французско­ го происхождения с мягкой формой конечностно-поясной миодистрофии было обнаружено сцепление локуса LGMD2A с маркером D15S25, локализованным в проксимальной час91

ти длинного плеча хромосомы 15 (Beckmann et al., 1991). Последующая идентифицикация фланкирующих маркеров, расположенных на расстоянии около 7 сМ друг от друга, поз­ волила изолировать YAC-клоны, содержащие LGMD2A-reH, и использовать их для уточнения цитогенетической локализа­ ции гена в области 15q15.1-q21.1 методом флюоресцентной гибридизации in situ (Fougerousse et al., 1994). В дальнейшем в этой области был идентифицирован ген CAPN3 (caleain-3), ответственный за развитие данной формы конечностно-по­ ясной миодистрофии (Richard et al., 1995). CAPN3 кодирует большую субъединицу кальций-активируемой нейтральной специфической мышечной протеазы — кальпаина-3. Коди­ рующая часть гена CAPN3 разделена на 24 экзона, занима­ ющих более 40 кб геномной ДНК. В гене идентифицировано 4 микросателлитных повтора и 14 Alu-последовательностей. CAPN3 специфически экспрессируется в скелетных мышцах с образованием мРНК-транскрипта размером 3.4-3.6 кб. Обнаружено более двух десятков мутаций в гене CAPN3 у больных с формой 2А миодистрофии плечевого и тазового пояса. Около половины из них приводят к преждевременной терминации трансляции. Миссенс-мутации затрагивают кон­ сервативные остатки или аминокислоты, расположенные в функционально значимых участках доменов. Необычным яв­ ляется то, что шесть разных мутаций найдено у пациентов из одной маленькой изолированной инбредной популяции жи­ телей острова Реюньона (LaReunion). Данные генеалогичес­ кого анализа, свидетельствующие о присутствии в данном случае «эффекта основателя», находятся в противоречии с результатами молекулярного анализа. Это противоречие по­ лучило название парадокса Реюньона. Для его объяснения предложена дигенная модель наследования формы 2А конеч­ ностно-поясной миодистрофии, не получившая пока экспе­ риментальных подтверждений. Кальпаины относятся к семейству внутриклеточных нелизосомных цистеиновых протеаз. Они включают два по­ всеместно экспрессирующихся белка — типа 1 и 2, два спе92

цифических желудочных белка и мышечную форму типа 3. Кальпаины являются гетеродимерами, состоящими из боль­ шой субъединицы, кодируемой соответственно генами CAPN1, CAPN2 и CAPN3, соединенной с маленькой субъеди­ ницей, общей для всего семейства. Большие субъединицы раз­ делены на 4 домена, один из которых (II) имеет сходство с цистеин-протеазами, содержащими гистидиновые, цистеиновые и аспарагиновые остатки в активных сайтах. Домен IV имеет кальций-связывающие сайты. Кроме того, в кальпаине-3 присутствуют три уникальных района, два из которых содержат сигнал ядерной транслокации. Обнаружение энзиматического, а не структурного дефекта при миодистрофии является неожиданной находкой. Наиболее простым объяс­ нением может быть то, что данная мышечная протеаза уча­ ствует в деградации или дестабилизации структурных компо­ нентов цитоскелета, экстраклеточного матрикса или дистро­ финового комплекса. Более вероятной кажется возможность участия этого белка в слиянии миобластов. Ядерная локали­ зация кальпаина-3 не исключает его роли в контроле генной экспрессии. Однако все эти гипотезы требуют эксперимен­ тальной проверки. Независимо от реальных механизмов па­ тогенного действия мутаций в гене CAPN3, обнаружение де­ фекта в энзиматическом белке дает основание для оптимиз­ ма в плане разработки фармакотерапии для данной формы конечностно-поясной миодистрофии. 4. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнореиессивная. форма LGMD2B В ряде семей с клинически сходной конечностно-пояс­ ной миодистрофией обнаружено сцепление мутантного гена не с маркерами хромосомы 15, а с короткими полиморфны­ ми тандемными повторами, локализованными в области 2р13 короткого плеча хромосомы 2 — D2S134 и D2S136. Это ука­ зывает на существование другого гена — LGMD2B, мутации в котором могут приводить к мягкой аутосомно-рецессивной форме заболевания типа 2В (Bashir et al., 1994). В этой же области генома локализован ген MM (Miyoshi myopathy), от93

ветственный за дистальную форму миопатии с аутосомнорецессивным типом наследования, известную как миопатия Миоши. Болезнь дебютирует в ювенильном или молодом воз­ расте в виде слабости икроножных мышц. Оказалось, что конечностно-поясная миодистрофия типа 2В и миопатия Миоши являются аллельными заболева­ ниями, обусловленными мутациями в гене DYSF (dystrophyassociated fer-1 -like) (Bashir et al., 1998). Продукт этого гена — дисферлин — имеет высокий процент гомологии с белком fer-1 Caenorhabditis elegans, дефектным у мутантов с нару­ шенным сперматогенезом. Дисферлин — цитоплазматический белок, состоящий из 2080 аминокислот, имеет большой заряженный гидрофильный район и один мембран-связывающий район на С-конце, обеспечивающий возможность его ассоциации с саркоплазматическим ретикулумом (Liu et al., 1998). В цитоплазматическом домене дисферлина идентифи­ цированы последовательности, характерные для белков, вза­ имодействующих с ядерной мембраной. Кроме того, цитоплазматический компонент этого белка содержит 4 мотива, гомо­ логичные С2 доменам — внутриклеточным белковым моду­ лям, состоящим из 80—130 аминокислотных остатков и уча­ ствующим, по-видимому, в связывании кальция и фосфолипидов. Обнаружено 9 мутаций в гене DYSF у пациентов с дистальными и проксимальными формами конечностно-по­ ясной миодистрофии. 5 из этих мутаций приводят к прежде­ временной терминации трансляции. Имеется выраженный фенотипический полиморфизм среди больных, несущих оди­ наковые мутации. Так, описаны семьи, у одних членов кото­ рой болезнь протекает по типу миопатии Миоши, тогда как у других — в виде конечностно-поясной миодистрофии 2В. Недавно было показано, что описанная более 30 лет тому назад генетическая линия мышей SJL является естест­ венной моделью обсуждаемой формы конечностно-поясной миодистрофии (Bittner et al., 1999). Мыши этой линии облада­ ют повышенной восприимчивостью к индуцируемым аутоим­ мунным болезням, таким как экспериментальные аутоиммун94

ные энцефалиты (ЕАЕ) и воспалительные болезни мышц. У мутантных животных часто развиваются спонтанные воспа­ лительные миопатии, при этом в мышцах повышена способ­ ность к регенерации. На линии SJL на протяжении многих лет проводился широкий объем экспериментальных иссле­ дований, касающихся различных аутоиммунных болезней человека, изучались процессы регенерации и транспланта­ ции мышц. С использованием набора из 40 микросателлитных мар­ керов мышиный ген, ответственный за фенотип мутантных животных, был картирован в 6 хромосоме в области, синтенной району локализации гена DYSF человека. Оказалось, что у мутантных животных экспрессия дисферлина в мышцах составляет не более15% по сравнению с нормой. Это послу­ жило основанием для изоляции и клонирования кДНК гомо­ логичного гена мыши — Dysf. При изучении кодирующей об­ ласти этого гена у мутантных животных была найдена гомо­ зиготная делеция 171 нуклеотида, сопровождающаяся отсут­ ствием протяженного участка четвертого С2 домена в соот­ ветствующем белке и нарушением протеолитической стабиль­ ности дисферлина. Таким образом, обнаружение в линии SJL мутации, определяющей развитие прогрессирующей дегене­ ративной болезни мышц, требует пересмотра эксперимен­ тальных результатов, полученных на этой генетической ли­ нии животных. 5. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнорецессивная. формы LGMD2C-2F (саркогликанопатии) Гены, ответственные за более тяжелые формы аутосомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии LGMD2C — LGMD2F, кодируют белки саркогликанового дис­ трофин-ассоциированного субкомплекса: у-, а-, р- и 8-саркогликаны соответственно (Roberds et al., 1994; Lim et al., 1995; Bonnemann et al., 1995; Noguchi et al., 1995; Nigro et al., 1996b). Все четыре белка имеют ряд общих характеристик. Они Nгликозилированы, содержат короткий внутриклеточный до-

95

мен, один трансмембранный и большой внеклеточный доме­ ны с С-терминальным кластером цистеиновых остатков. В качестве примера на рис. 12 и 13 представлена структура (5и у-саркогликана соответственно с указанием локализации мутаций, идентифицированных у больных с тяжелыми фор­ мами аутосомно-рецессивной конечностно-поясной миоди­ строфии. У всех пациентов с мутациями в любом из саркогликановых генов отсутствует а-саркогликан. Это может быть первичным дефектом при форме 2D или вторичным — при формах 2С, 2Е и 2F. При этом наблюдается корреляция меж­ ду клиническим фенотипом и степенью сохранности сарког­ ликанового комплекса, определяемой главным образом ти­ пом мутационного повреждения. Независимо от формызаболевания у пациентов с тяжелым течением этот комплекс, как правило, полностью разрушен. Ген а-саркогликана (адхалина) — ocSG (обозначаемый также как ADL или SGA или DAG2), картирован в коротком плече хромосомы 17 в облас­ ти 17р21 (McNally et al., 1994). Мутации в этом гене приводят к первичной адхалинопатии, варьирующей по степени тяже­ сти аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии — аллельному варианту конечностно-поясной миодистрофии LGMD2D (Passos-Bueno et al., 1995). В описанной ранее тунисской семье, так же как и в ряде других случаев, обнаружено сцепление заболевания с мар­ керами, локализованными в области 13q12 (Ben Othmane et al., 1992; Sewry et al., 1994). В этой области картирован ген усаркогликана, мутации в котором ответственны за развитие тяжелой детской аутосомно-рецессивной мышечной дистро­ фии — аллельному варианту конечностно-поясной миодист­ рофии LGMD2C (Noguchi et al., 1995). У ряда пациентов с тя­ желым течением заболевания в тунисских, а также в четы­ рех бразильских семьях в гене ySG была обнаружена одно­ типная мутация — del521-T, сопровождающаяся сдвигом рам­ ки считывания — рис. 13 (Vainzof et al., 1996). У пациентов, гомозиготных по этой мутации, у-саркогликан в биоптатах мышц полностью отсутствует и в различной степени умень96

Рис. 12. Схематическое представление бета-саркогликана с указанием мутаций, идентифицированных у пациентов с формой 2Е конечностно-поясной миодистрофии шено содержание а- и р-саркогликанов. Интересно отметить, что у трех сибсов в одной из бразильских семей, в отличие от всех других пациентов с данной мутацией, болезнь протека­ ла в очень мягкой форме и наблюдалась корреляции между клиническим фенотипом и сохранением саркогликанового комплекса при полном отсутствии у-саркогликана. При скри­ нинге мутаций в гене ySG у 50 пациентов из США и Италии с

7 Заказ № 170

97

Рис. 13. Схематическое представление гамма-саркогликана с указанием мутаций, идентифицированных у пациентов с формой 2С конечностно-поясной миодистрофии. тяжелой формой аутосомно-рецессивной миодистрофии были идентифицированы четыре гомозиготные мутации, сопровож­ дающиеся сдвигом рамки считывания (McNally et al., 1996). Одна из них del521-T, другая — инсерция тимидина после 87 нуклеотида, и две оставшиеся мутации — микроделеции, локализованные в З'-конце гена — del801-TG и del793-TG. У пациентов с последними двумя мутациями полностью отсут­ ствует не только а- и у-, но и р-саркогликан. По-видимому, 98

карбокси-терминальный район у-саркогликана имеет важное значение для сохранения стабильности всего саркогликанового комплекса. У пациентов с тяжелой дюшенно-подобной аутосомнорецессивной миодистрофией из больших неродственных цы­ ганских семей, проживающих в разных странах Западной Европы, в гене ySG обнаруживается однотипная гомозигот­ ная миссенс-мутация — C283Y, затрагивающая консерватив­ ный цистеиновый остаток в карбокси-терминальном районе экстраклеточного домена белка — рис. 13 (Piccolo etal., 1996). Для этих больных характерны ранний дебют, повышенный уровень сывороточной креатинкиназы, отсутствие а- и у-сар­ когликана в мышцах при нормальном уровне дистрофина. У всех гомо- и гетерозиготных носителей данная мутация на­ ходится в абсолютном неравновесии по сцеплению с одним из аллелей внутригенного высокополиморфного маркера D13S232. Анализ полиморфизма по фланкирующим марке­ рам позволил определить гаплотип общего предка, у которо­ го мутация, по-видимому, возникла от 60 до 200 поколений тому назад. Полученные данные согласуются с предположе­ нием о миграции предков цыган из Индии. Картирован и клонирован ген р-саркогликана — PSG. Он локализован в области 4q12, его кодирующая часть раз­ делена на 6 экзонов — рис. 12. Мутации в этом гене сопро­ вождаются разрушением саркогликанового субкомплекса и реализуются в виде конечностно-поясной миодистрофии формы 2Е (Lim et al., 1995) либо в виде аутосомно-рецессивной дюшенно-подобной миодистрофии (Bonnemann et al., 1995). Первые две мутации в этом гене, одна из которых при­ водит к сдвигу рамки считывания, а другая к образованию преждевременного стоп-кодона, были идентифицированы в спорадическом случае у девочки с дюшенно-подобной мио­ дистрофией (рис. 12). Одновременно у нескольких неродст­ венных пациентов из Южной Индианы с мягкой формой ко­ нечностно-поясной миодистрофии была обнаружена общая миссенс-мутация — Т151R, находящаяся в гомозиготном со99

стоянии. При скрининге мутаций в гене (3SG у 15 неродствен­ ных пациентов бразильского происхождения с тяжелым те­ чением конечностно-поясной миодистрофии также были обнаружены четыре мутации в двух семейных и в двух спо­ радических случаях (Bonnemann et al., 1996). Три из них присутствовали у пациентов в гомозиготном состоянии и толь­ ко одна сопровождалась сдвигом рамки считывания. Примеча­ тельно, что все три мутации миссенс-типа были локализованы в экзоне 3, кодирующем экстраклеточный домен — рис. 12. При генетическом анализе негритянских семей бразиль­ ского происхождения с тяжелыми формами конечностно-пояс­ ной миодистрофии был обнаружен шестой ген, ответственный за аутосомно-рецессивные формы заболевания (Passos-Bueno et al., 1996b). В области 5q33-34 был идентифицирован ген — 8SG, кодирующий новый компонент саркогликанового субкомп­ лекса — 6-саркогликан (Nigro et al., 1996а). Все 8 пациентов из 4 неродственных бразильских семей оказались гомозиготны по однотипной мутации —делеции одного нуклеотида в экзоне 7 — del656C, приводящей к сдвигу рамки считывания (Nigro et al., 1996b). При секвенировании полноразмерной кДНК пациентов никаких других мутаций не было найдено. Таким образом, было доказано, что именно этот ген ответственен за форму 2F ко­ нечностно-поясной миодистрофии. Интересно подчеркнуть, что мутация в 6-саркогликановом гене, активно экспрессирующемся в сердечной и ске­ летных мышцах, найдена в хорошо известной линии сирий­ ского хомячка — BI014.6, используемой в качестве генети­ ческой модели аутосомно-рецессивной кардиомиопатии. Для животных этой линии характерны прогрессирующие некрозы миокарда и сердечная недостаточность.

б) Мышечная дистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом (MIM: 226670) Необычная форма аутосомно-рецессивного буллезного эпидермолиза в сочетании с мышечной дистрофией пле­ чевого и тазового пояса (MD-EBS — muscular dystrophy — 100

epidermolis bullosa simplex). Пузыри появляются в неонатальном периоде, особенно на коже пальцев рук и ног, позднее — на волосистой части головы, лице и туловище. При этом ва­ рианте буллезного эпидермолиза кожные трещины располо­ жены очень близко к плазматической мембране базальных кератиноцитов, что затрудняет установление природы дефек­ та (внутриклеточный? внеклеточный?) путем электронно-ми­ кроскопического исследования биопсийного материала. С возрастом развивается дистрофия ногтей. Прогрессирующая мышечная слабость дебютирует в возрасте 1—2 лет. Боль­ ные могут доживать до 30—40 лет. Характер локализации и широкий спектр дефектов, на­ блюдаемых у больных с буллезным эпидермолизом, сочета­ ющимся с мышечной дистрофией, дали основание предполо­ жить, что первичное биохимическое нарушение при этом заболевании связано с каким-то промежуточным структур­ ным белком, ассоциированным с филаментами. В качестве такого кандидата был исследован плектин — ассоциирован­ ный с промежуточными филаментами большой якорный бе­ лок, соединяющий цитоскелет клетки с мембраной. Плектин является критическим белком для связывания кератиновой филаментной сети с гемидесмосомальными комплексами. Оказалось, что у исследуемых пациентов в образцах кожи и мышечной ткани полностью отсутствуют иммунореактивные формы плектина (Gache et al., 1996; Smith et al., 1996). Кроме того, у больных отсутствует близкородственный плектину гемидесмосомальный белок HD1, экспрессирующийся в норме также и в Z-дисках скелетных мышц. Изоляция и секвенироваие кДНКовой последовательности гена плекти­ на крысы позволила провести скрининг банка данных экспрессирующихся последовательностей ДНК человека. Одна из таких последовательностей EST 25263 имела 8 4 % гомо­ логии с кДНК плектина крысы. Олигонуклеотидные праймеры, соответствующие этой EST-последовательности, были использованы для скрининга панели монохромосомных, а затем делеционно-транслокационных соматических гибрид101

ных клонов. Таким образом, ген плектина человека — PLEC1 (plectin 1) был картирован в длинном плече хромосомы 8 в области 8q24.13-qter. Методами генетического анализа было показано, что во всех исследованных семьях заболевание косегрегирует с полиморфными маркерами этой области. Сходная ПЦР-стратегия была использована для изоляции из библиотеки кератиноцитов человека полноразмерной кДНК, а затем и геномной последовательности гена PLEC1. У одного из пациентов с описываемой формой мышеч­ ной дистрофии удалось идентифицировать гомозиготную дуп­ ликацию 8 нуклеотидов в кодирующей части гена плектина. Эта дупликация приводила к сдвигу рамки считывания и об­ разованию преждевременного терминирующего кодона. У аналогичных больных из двух других семей были идентифи­ цированы две различные гомозиготные делеции в гене плек­ тина, одна из которых 2719del9 приводит к отсутствию трех аминокислот в консервативной части гена, и другая — 5866С сопровождается сдвигом рамки считывания. Обнаружение у пациентов с буллезным эпидермолизом, сочетающимся с мышечной дистрофией, дупликаций и делеций в кодирующей части гена PLEC1 явилось подтверждением гипотезы о том, что именно этот ген мутантен при данном заболевании (Pulkkinen et al., 1996). Таким образом, потеря экспрессии одного мультифункционального белка, каким является плектин, может одновременно приводить к развитию дефектов в мышечной и кожной тканях.

1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина (MIM: 158900) Первые признаки болезни появляются в 12—20 лет, хотя не исключается возможность более раннего проявле­ ния. Данную клиническую форму отличает своеобразная фор­ мула поражения мышечной системы. Преимущественно по­ ражается мускулатура лица, плечевого пояса и проксималь­ ных отделов верхних конечностей. Слабость мускулатуры лица проявляется неполным смыканием век, которое можно 102

заметить в начале болезни во время сна. Мимика лица ста­ новится бедной лицо приобретает «маскообразный» вид. Больной испытывает затруднения при наморщивании лба, за­ жмуривании глаз. Из-за слабости круговой мышцы рта и дру­ гих мимических мышц невозможен свист, надувание щек и другие мимические движения. Особый порядок вовлечения в процесс мускулатуры плечевого пояса приводит к появле­ нию симптома «крыловидных» лопаток. Раньше других пора­ жаются трапециевидные, ромбовидные, грудные и широчай­ шие мышцы спины. Длительное время сохраняется функция дельтовидных, над- и подкостных мышц, мышц, поднимающих лопатки. Плечевой пояс поражается раньше и более значи­ тельно, мускулатура тазового пояса и проксимальных отде­ лов нижних конечностей включается позже. От начала появ­ ления слабости плечевого пояса до развития слабости ног может пройти 15—20 лет. На нижних конечностях страдают подвздошные, большие ягодичные, приводящие мышцы бе­ дер. Икроножные мышцы остаются сохранными. Следует под­ черкнуть, что нижние конечности вообще могут остаться интактными. Псевдогипертрофии не характерны для этой фор­ мы миодистрофии. Течение заболевания относительно бла­ гоприятное. Больные долгое время сохраняют способность к самообслуживанию и трудовой деятельности. Распространенность миодистрофии Ландузи-Дежерина составляет примерно 2:100000, тип наследования — аутосомно-доминантный. По некоторым данным, женщины болеют примерно в три раза чаще мужчин. В ряде бразильских се­ мей с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией прослеже­ на антиципация (Zatz et al., 1995). При генетическом анализе семей с мышечной дистро­ фией Ландузи-Дежерина было обнаружено сцепление мутантного гена FSHD1 (facioscapulohumeral dystrophy 1) с микросателлитным маркером Mfd22 — локус D4S171 (Wijmenga et al., 1990), а также с гипервариабельным ДНК-зондом рНЗО — локус D4S139 (Upadhyayava et al., 1991), картированными в дистальном конце длинного плеча хромосомы 4 в области 103

4q35-qter. Локализация гена FSHD1 в районе 4q35 была под­ тверждена при анализе точек разрыва транслокации (Х;4), обнаруженной у пациента 4 лет со слабостью лицевых мышц (Mathews et al., 1991). Совместные исследования, выполнен­ ные несколькими лабораториями на 65 семьях, в которых наблюдали более 500 больных, также подтвердили сцепле­ ние гена FSHD1 с ДНК-маркерами области 4q35 (Sarfarazi et al., 1992). При этом все сцепленные ДНК-маркеры оказались локализованы проксимальнее гена FSHD1, за исключением, возможно, D4S139, для которого найдено наиболее тесное сцепление с исследуемым геном. Обнаружение в области локализации мутантного гена большого числа полиморфных ДНК-маркеров позволяет проводить досимптоматическую и пренатальную диагностику лице-лопаточно-плечевой миоди­ строфии типа IA в семьях высокого риска. Особенно эффек­ тивным при этом оказывается анализ микросателлитных по­ лиморфных маркеров D4S139, D4S163, D4S171 и D4S809. У пациентов часто присутствуют структурные перест­ ройки в дистальной части 4q, легкодиагностируемые мето­ дом блот-гибридизации по Саузерну (Wijmenga et al., 1992). Используемая при этом в качестве зонда ДНК, клонирован­ ная в космидном векторе р13Е-11, локализована дистальнее D4S139. Примечательно, что эта ДНК была изолирована в процессе поиска гомеобоксных генов. У нормальных инди­ видуумов клон гибридизуется с полиморфным EcoR1 фраг­ ментом, размер которого обычно превышает 28 кб. У паци­ ентов чаще обнаруживают более короткие EcoR1 фрагмен­ ты, величиной от 14 до 28 кб. Не исключено, что, в отличие от синдрома Мартина-Белл или миотонической дистрофии, обус­ ловленных экспансией тринуклеотидных тандемных повторов, наследственный дефект у этих больных связан с сокращени­ ем числа подобных последовательностей, тесно сцепленных или расположенных внутри гена FSHD1. Обсуждается воз­ можность участия гомеобоксного гена или генов в контроле заболевания. До сих пор было известно, что мутации в го­ меобоксных генах вызывают врожденные уродства. Если ока104

жется, что лице-лопаточно-плечевая миодистрофия есть ре­ зультат перестроек в гомеобоксном гене, это будет первый пример фенотипического проявления в позднем онтогенезе гена, участвующего в контроле развития. В области 4q35 идентифицирован 3.3-кб тандемный повтор D4Z4, тесно сцепленный с геном FSHD1 (Hewitt et al., 1994). Каждая копия этого повтора содержит две гомеобоксные последовательности с внутренними стоп-кодонами и сдвигами рамки считывания и два известных повторяющих­ ся элемента (LSau и hhspm3), связанных с гетерохроматино­ выми районами ДНК, часто вовлеченными в контроль «эф­ фекта положения». Показано, что число копий на геном D4Z4подобных повторов заметно увеличилось в эволюционном ряду на протяжении последних 25 миллионов лет. Хотя D4Z4 не является кодирующей последовательностью и не содер­ жит фрагментов гена FSHD1, выявленная корреляция меж­ ду делециями в этом локусе и болезнью позволяет предпола­ гать участие «эффекта положения» в патогенезе лице-лопаточно-плечевой миодистрофии. Однако этот эффект не про­ слеживается для единственного пока гена (FRG1), иденти­ фицированного в теломерном районе длинного плеча хро­ мосомы 4 (van Deutekom et al., 1996a). В области 10q26 также расположен повтор, имеющий высокую степень гомологии cD4Z4. Наличие подобных гомо­ логичных повторов является причиной высокой нестабиль­ ности субтеломерных районов длинного плеча хромосом 4 и 10. Так, в датской популяции в 2 0 % случаев обнаруживаются микроперестройки между повторяющимися элементами этих двух областей (van Deutekom et al., 1996b). Перестройки со­ здают новые рестрикционные сайты, что необходимо учиты­ вать при проведении диагностики заболевания методом ана­ лиза длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Микропе­ рестройки между повторяющимися последовательностями областей 4q35 и 10q26 часто обнаруживаются и у пациентов с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Молекулярный анализ области локализации FSHD1 гена, проведенный у трех 105

пациентов,показал наличие гибридных кластеров 4q35- и 10д26-производных повторяющихся элементов (Lemmers et al., 1998). При популяционном анализе у двух неродствен­ ных индивидуумов в теломерной области длинного плеча хро­ мосомы 4 были обнаружены делеции хромосомного сегмен­ та, расположенного проксимальнее повторов и идентифици­ руемые зондом р13Е-11.Эти делеции не затрагивали локус FSHD. Однако у одного из этих индивидуумов был ребенок с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Оказалось, что у ребенка произошла экспансия унаследованной от отца деле­ ции в область повторов. Эти данные согласуются с гипотезой о критической роли эффекта положения в этиологии заболе­ вания и о влиянии длины и структуры повторов на экспрес­ сию соседних генов. Описаны случаи гонадного мозаицизма у пациентов с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией (Weiffenbach etal., 1993). В одной из семей диагноз лице-лопаточно-плечевой миодистрофии был поставлен лишь одному из монозиготных близнецов (Tawil et al., 1993). При этом никто из его родст­ венников не был болен, у самого же пациента диагноз был подтвержден на молекулярном уровне после обнаружения уникальной перестройки в области 4q35. Наиболее вероят­ ное обьяснение этому — возникновение постзиготической мутации в гене FSHD1 после образования близнецовой пары. У одной из пациенток с четко прослеживаемой наслед­ ственной формой заболевания обнаружены аномалии про­ цесса окисления, связанные с дефектом комплекса III элек­ трон-транспортной цепи, кроме того, в печени не выявлялся цитохром b — компонент комплекса III, при наличии типич­ ных пиков для всех других цитохромов (Slipetz et al., 1991). Электронно-микроскопическое исследование печени паци­ ентки показало присутствие большого числа увеличенных митохондрий с паракристаллическими включениями. При этом делеций или других крупных структурных перестроек в митохондриальной ДНК не обнаружено. Остается, однако, неясным, являются ли выявленные аномалии окислительно106

го процесса типичными для лице-лопаточно-плечевой мио­ дистрофии. Описана доминантно наследуемая лопаточно-плечевая миодистрофия, дебютирующая в возрасте от 12 до 40 лет, при которой не наблюдается поражения мускулатуры лица (MIM 600416). Данные генетического анализа семей с подоб­ ной формой миодистрофии с использованием микросателлитных маркеров, тесно сцепленных с геном FSHD1 (вклю­ чая маркер D4S139), не исключают возможности того, что это заболевание является аллельным вариантом миодистро­ фии Ландузи-Дежерина (Jardine et al., 1994). И наоборот, в некоторых семьях, клинически отнесенных к лице-лопаточ­ но-плечевой миодистрофии, при молекулярном анализе не удается обнаружить сцепления мутантного гена с маркера­ ми дистального района длинного плеча хромосомы 4 (Gilbert etal., 1993), что может рассматриваться как доказательство генетической гетерогенности заболевания и существования еще одного локуса, мутации в котором могут приводить к сход­ ной клинической картине.

1.5. Миодистрофии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины (эмеринопатии) В отдельную группу заболеваний мы выделили миопа­ тии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с ядерной ламиной. Эти заболевания получили общее назва­ ние эмеринопатии. Эмерин — белок, ассоциированный с ламинином ядерной мембраны, оказывается дефектным при Х-сцепленной форме мышечной дистрофии с контрактурами Эмери-Дрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная форма этого заболевания обусловлена дефектами в гене LMNA, кодирующем два белка ядерной ламины — ламин А и С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплай­ синга гена LMNA, и они активно взаимодействуют с эмерином. Не исключено, что аутосомно-доминантная форма мы107

шечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным вариантом одной из доминантных форм конечностно-пояс­ ной миодистрофии -LGMD1B, ген которой картирован в той же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. Активно об­ суждается возможность участия гена LMNB1, кодирующего еще один белок семейства ядерных ламинов — В 1 , в контро­ ле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-пояс­ ной миодистрофии -LGMD1A, так как оба мутантных гена расположены в одной и той же цитогенетической области 5q23.3-q31.3. Если эти предположения будут подтвержде­ ны, то формы 1А и1В аутосомно-доминантной конечност­ но-поясной миодистрофии также могут быть отнесены к группе эмеринопатий.

а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300) 1. Клиническая характеристика заболевания Начальные признаки заболевания отмечаются в воз­ расте 4—5 лет. Поражаются мышцы тазового пояса при интактности дистальных сегментов. Рано развиваются ретрак­ ции ахилловых сухожилий (и постцервикальных мышц), а в последующем контрактуры в локтевых суставах. Псевдоги­ пертрофии отсутствуют. Нередко наблюдается кардиомипатия с нарушением сердечной проводимости. Наиболее час­ тая причина летального исхода — остановка сердечной мыш­ цы. Заболевание отличается медленно прогрессирующим те­ чением. Тип наследования: Х-сцепленный рецессивный, хотя описаны редкие случаи аутосомно-доминантного наследова­ ния. Клинически эти две генетически различные формы ми­ одистрофии очень сходны. 2. Картирование и идентификация гена EMD При семейном генетическом анализе мутантный ген был картирован в дистальной части длинного плеча Х-хромосо­ мы в области Xq28 (Thomas et al., 1986; Yates et al., 1986). В дальнейшем было показано наиболее тесное сцепление EMD 108

(Emery-Dreifuss muscular dystrophy) с генами цветовой сле­ поты RCP/GCP, что позволило отнести кандидатный ген в теломерный район Xq28. В результате одновременного генотипирования по нескольким маркерам этого района, прове­ денного в больших семьях с миодистрофией Эмери-Дрейфу­ са, и с учетом уже опубликованных данных была составлена наиболее вероятная генетическая карта области локализа­ ции EMD: DXS52/DXS15 — 2сМ — (RCP/GCP, EMD) — ЗсМ — F8C — 2сМ — DXS115 (Yates et al., 1993). Фрагменты геном­ ной ДНК, полностью перекрывающие район между DXS15 и F8C, были клонированы в дрожжевых, а затем в космидных векторах, что позволило составить физическую карту этой геномной области, составляющей около 2 миллионов пар ос­ нований (Willard et al., 1994). Оказалось, что этот район ха­ рактеризуется чрезвычайно высокой плотностью генов, рас­ положенных в каждом из участков ДНК размером от 10 до 20 кб. Более 30 различных генов было картировано между DXS15 и F8C (Bione et al., 1993). Обилие кодирующих после­ довательностей очень затрудняло идентификацию кандидатного гена. Была определена группа генов, которые не только картируются в этой области, но в норме экспрессируются в тканях, дефектных при миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Так, для 27 генов, расположенных между DXS15 и F8C, был опре­ делен уровень мРНК транскриптов в различных дифферен­ цированных тканях. По результатам этих исследований было отобрано 8 генов, для каждого из которых наблюдалась вы­ сокая экспрессия в скелетных мышцах, в сердце и/или в моз­ ге (Bione et al., 1993). Примечательно, что 7 из них были рас­ положены кластером на растоянии около 45 кб от генов цве­ товой слепоты, то есть в наиболее вероятном районе лока­ лизации EMD. Для каждого гена этой группы были секвенированы полноразмерные кДНК и определены открытые рам­ ки считывания. Поиск кандидатного гена осуществляли ме­ тодом обратной ПЦР (RT-PCR), то есть проводили амплифи­ кацию и секвенирование кДНКовых последовательностей, полученных путем обратной транскрипции мРНК больных. 109

мРНК изолировали из лимфобластозных культур клеток, по­ лученных от пяти неродственных мальчиков с Х-сцепленной семейной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Во всех этих случаях были обнаружены различные мутации в одном и том же гене — STA (Bione et al., 1994). В двух культурах были идентифицированы внутригенные делеции 2 и 29 пар оснований, в одной — инсерция двух нуклеотидов. Эти три мутации приводили к сдвигу рамки считывания, образованию стоп-кодонов и преждевременной терминации трансляции. Одна из мутаций нарушала сплайсинг первичного РНК-транскрипта и приводила к инсерции в мРНК интронной области размером в 214 пар оснований. Пятая мутация — замена А на G, разруша­ ла инициирующий AUG-кодон. В этом случае трансляция начи­ налась со следующего AUG в положении 275. В результате про­ дуцировался белок с N-концевой делецией 72 аминокислот. Та­ ким образом, все идентифицированные мутации сопровожда­ лись либо полным отсутствием продукта STA-гена, либо от­ сутствием части этого белка. Полученные результаты дока­ зывают полную идентичность генов EMD и STA. 3. Структура гена STA и типы мутаций Кодирующая часть гена STA разделена на 6 экзонов, распределенных на площади около 2 кб. По-видимому, STA относится к числу генов домашнего хозяйства (hause-keeping genes), так как он экспрессируется в большом спектре про­ анализированных тканей на разных стадиях онтогенетичес­ кого развития. Наивысший уровень экспрессии наблюдается в скелетных мышцах, в сердце и в ряде других тканей, вклю­ чая толстый кишечник, тестикулы, яичники, поджелудочную железу. Отсутствие при миодистрофии Эмери-Дрейфуса кли­ н и ч е с к и х нарушений во многих немышечных тканях с высоким нормальным уровнем экспрессии STA, по-видимо­ му, свидетельствует о возможности тканеспецифической ком­ пенсации дефектов белкового продукта этого гена со сторо­ ны других функционально сходных белков.

110

Наиболее частый тип мутаций в гене STA у пациентов с миодистрофией Эмери-Дрейфуса — небольшие внутригенные структурные перестройки. Идентифицированы также и протяженные делеций, включающие целиком ген эмерина (Small et al., 1998). Все описанные к настоящему времени мутации приводят либо к полному отсутствию, либо к обра­ зованию укороченного продукта STA-гена вследствие преж­ девременной терминации трансляции. Содержание эмерина у женщин носительниц мутаций в гене STA часто значимо отклоняется от 50%, что свидетельствует о разном уровне экс­ прессии нормальных и мутантных аллелей (Manilal et al., 1998). Полное секвенирование насыщенного кодирующими последовательностями 219-кб района Xq28 между локусами ц в е т о в о й с л е п о т ы (RCP/GCP) и г л ю к о з о - 6 - ф о с ф а т дегидрогеназы (G6PD) (Chen et al., 1996) позволило расшиф­ ровать молекулярный механизм возникновения делеций все­ го гена STA, идентифицированной у одного из пациентов с мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса (Small et al., 1997). В непосредственной близости от STA со стороны центроме­ ры расположен 26-кб филаминовый ген (FLN1), разделенный на 48 экзонов и кодирующий актин-связывающий белок 280. Фланкируют этот 48-кб FLNI/STA-район два больших инвер­ тированных повтора размером 11.3 кб. Уровень гомологии между этими повторами превосходит 99%. Оказалось, что причиной возникновения делеций является ошибочное спа­ ривание между большими инвертированными повторами с последующей двойной рекомбинацией между рядом ошибоч­ но спаренных повторов и внутренними последовательностя­ ми ДНК. Более частым следствием этих событий является инверсия FLN1/STA области, присутствующая в гетерозигот­ ном состоянии у 3 3 % женщин. Внутрихроматидная рекомби­ нация вследствие неправильного спаривания двух инверти­ рованных повторов служит причиной возникновения частых инверсий, зарегистрированных также при тяжелых формах гемофилии А и синдрома Хантера (Lakich et al., 1993; Lagerstedt et al., 1997). 111

4. Структура и функции эмерина Ген STA кодирует серин-богатый белок, состоящий из 254 аминокислот, для которого не найдено гомологов сре­ ди других белков с известными функциями. Так как это новый белок, авторы предложили называть его эмерином. Два района эмерина — 39 аминокислот на N-конце и 34 — на С-конце, обнаруживают сходство ( 4 1 % гомологии) с белками неизвестной функции — тимопоиетинами, что, в свою очередь, обусловливает и некоторые его структур­ ные особенности. К р о м е того, обнаружено сходство по аминокислотной последовательности эмерина с ядерным ламина-ассоциированным белком — LAP2 (Furukawa et al., 1995). В целом белок гидрофильный, но имеет на С-конце гидрофобный домен достаточной протяженности, чтобы служить в качестве мембранного якоря. В эмерине при­ сутствует большое количество сайтов фосфорилирования и только один возможный сайт N-гликозилирования. Сиг­ нального пептида не обнаружено. Идентифицирована так­ же и RGD-последовательность (аргинил-глицил-аспартил — мотив клеточной адгезии), важная для взаимодействий между белками внеклеточного матрикса. По-видимому, эмерин может быть мембранным белком с коротким отри­ цательно заряженным С-хвостом и большим N-терминальным цитозольным доменом. Подобные белки, способные заякореваться хвостовой частью на мембранах, обнару­ жены в различных клеточных компартментах. В том числе большое количество таких белков (синаптобревин, синтаксины) присутствует в органеллах секреторного пути, вовле­ ченного в транспорт везикул. При биохимическом фрак­ ционировании показано полное отсутствие эмерина в рас­ творимых фракциях. Это согласуется с предположением о том, что эмерин является одним из членов семейства ядер­ ных мембранных ламина-ассоциированных белков (LAPs). На рис. 14 схематически представлена организация эме­ рина и тимопоэтинов на ядерной мембране. Показано, что эмерин ассоциирован с внутренней мембраной ядер и эта 112

связь осуществляется посредством С-терминального гид­ рофобного домена (Cartegni et al., 1997).

Рис. 14. Организация эмерина и тимопоэтинов на ядерной мембране Большой фрагмент кДНК гена STA был введен в экспрессионную систему Е. coli, и продукт этой конструкции был использован в качестве иммуногена для получения панели из 12 моноклональных антител, реагирующих по крайней мере с 4 различными антигенными детерминантами гидрофильно­ го района эмерина (Manilal et al., 1996). Во всех исследован­ ных тканях все варианты антител идентифицировали один и тот же 34-кД белок, локализованный по краям ядер. В био8 Заказ № 170

113

птатах мышц пациентов с мышечной дистрофией Эмери-Дрей­ фуса этот белок не мог быть обнаружен ни методами иммуногистохимии, включая иммунофлюоресцентную микроско­ пию, ни с использованием метода Вестерн блот-гибридизации. Таким образом, при наличии соответствующих ан­ тител иммунологические методы могут быть использова­ ны в качестве наиболее простых диагностических тестов для данного заболевания. В сердце и в культивируемых кардиомиоцитах эмерин обнаруживается также в интеркалярных дисках. 5. Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы) Нередко пациентам с доброкачественным течением миодистрофии ошибочно ставится диагноз лопаточно-перонеального синдрома или плече-перонеальной миопатии. Это гетерогенная группа аутосомно-доминантных нейро-мышечных заболеваний, характеризующихся слабостью мышц пле­ чевого пояса и перонеальной мускулатуры. Клинически вы­ деляют две формы — нейрогенную (лопаточно-перонеальная спинальная мышечная атрофия MIM: 181405, ген SPSMA) и первично мышечную (лопаточно-перонеальная мышечная дистрофия MIM: 181430, ген SPMD). Локус SPMD картиро­ ван в длинном плече хромосомы 12 (Wilhelmsen et al., 1996). При генетическом анализе большой семьи с аутосомно-до­ минантной нейрогенной формой лопаточно-перонеального синдрома ген SPSMA был картирован в области 12q24.1q24.31, примерно на 20 сМ ближе к теломере по сравнению с локусом SPMD (Isozumi etal., 1996). Определен 19-сМ интер­ вал наиболее вероятной локализации гена между маркера­ ми D12S338 и D12S366, что является предпосылкой для иден­ тификации гена SPSMA методами позиционного клонирова­ ния. Антиципация по дебюту и тяжести течения заболевания, наблюдаемая в исследуемой родословной, дает основания предполагать возможное участие динамических мутаций в генетическом контроле данного состояния. В непосредствен­ ной близости от области локализации гена SPSMA картиро114

ван ген SCA2, ответственный за одну из форм спиноцеребеллярной атаксии, обусловленной экспансией внутригенного CAG-повтора. В области поиска SPSMA локализова­ ны следующие гены: N O S 1 , продуктом которого является нейротрансмиттер, участвующий в образовании окиси азо­ та и играющий важную роль в морфо- и синаптогенезе нерв­ ной системы; АТР5В, кодирующий АТФ-синтазу; АТР2А2/ АТР2В, кодирующий Са 2 + -зависимую АТФазу; MYL2, коди­ рующий легкую цепь 2 миозина. Эти гены рассматривают­ ся в качестве кандидатных для SPSMA. Верификация диагноза миодистрофии Эмери-Дрейфу­ са в сомнительных случаях может быть достигнута только при использовании иммунологических или молекулярно-генетических методов исследования. Однако необходимо иметь в виду, что в ряде семей заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу и не связано с дефектами эмерина. Так, при полном секвенировании гена STA, выполненном у пациентов из 17 семей с миодистрофией Эмери-Дрейфуса, мутации не были обнаружены в трех семьях (Manilal et al., 1998). При этом уровень эмерина у больных, принадлежа­ щих этим семьям, соответствовал норме.

б) Скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией (MIM: 181350) Аутосомно-доминантная миодистрофия Эмери-Дрейфу­ са или скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией клинически не отличается от Х-сцепленной формы заболе­ вания. При генетическом анализе, выполненном с исполь­ зованием 280 высокоинформативных микросателлитных маркеров в большой французской семье, насчитывающей 54 индивидуума, 17 из которых были больными, удалось кар­ тировать мутантный ген EDMD-AD (Emery-Dreifuss muscular dystrophy — autosomal dominant) в области 1q11-q23 в 8-cM интервале между маркерами D1S2346 и D1S2125 (Bonne et al., 1999). Анализ гаплотипов по микросателлитным марке­ рам этого интервала, проведенный в четырех других семьях

115

с подобной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса, под­ твердил генетическую однородность исследуемой выбор­ ки больных. Локализованный ранее в области 1q21.2-q21.3 ген LMNA, кодирующий белки ядерной ламины — ламин А и С, был исследован в качестве кандидатного гена для EDMD-AD. С использованием методов прямого секвенирования двух а м п л и ф и ц и р о в а н н ы х э к з о н о в (1 и 7) и SSCP-анализа остальных 10 экзонов были идентифицированы точечные мутации в гене LMNA у пациентов всех пяти отобранных семей, причем эти мутации отсутствовали у их здоровых р о д с т в е н н и к о в . Одна и з этих м у т а ц и й с о з д а в а л а преждевременный стоп-кодон, три другие сопровождались заменой консервативных аминокислот. При этом одна из миссенс-мутаций — R527P — независимо встретилась в двух неродственных семьях. Таким о б р а з о м была д о к а з а н а идентичность генов LMNA и EDMD-AD. Ламины А и С, образующиеся в результате альтерна­ т и в н о г о сплайсинга первичного РНК-транскрипта гена LMNA, относятся к семейству промежуточных филамент, присутствующих в клетках на стадии конечной дифференцировки. Они формируют часть ядерной ламины — фиб­ розный слой на нуклеоплазменной стороне внутренней ядерной мембраны, служащей каркасом для ядерной обо­ лочки. Ламины имеют стержневой домен, участвующий в образованиии димеров,и карбокси-терминальный глобу­ лярный домен.Они взаимодействуют с хроматином и ин­ тегральными белками внутренней ядерной мембраны, в том числе с эмерином. При иммуногистохимическом анализе биоптатов сердечной мышцы было показано, что локализа­ ция ламина. А/С и эмерина у больных в исследуемых семьях не изменена. По-видимому, идентифицированные мутации в гене LMNA не приводят к серьезным нарушениям структуры ядерной оболочки, но изменяют ее функции. Ранее при генетическом анализе, выполненном в трех семьях с аутосомно-доминантной конечностно-поясной ми116

одистрофией, ассоциированной с кардиопатией (LGMD1B), мутантный ген был картирован в той же области 1q11-q22, где расположен ген LMNA (van der Kooi et al., 1997). Несмот­ ря на значительные клинические отличия конечностно-пояс­ ной миодистрофии 1В от аутосомно-доминантной миодист­ рофии Эмери-Дрейфуса, выражающиеся в отсутствии кон­ трактур и гипертрофии икроножных мышц, а также в преиму­ щественной слабости проксимальных отделов конечностей, не исключена аллельная природа этих заболеваний и воз­ можность участия в патогенезе LGMD1B каких-то иных спе­ цифических мутаций в гене LMNA. Возможно также, что еще одна форма аутосомно-доминантной конечностно-поясной миодистрофии- 1А-связана с мутациями в гене LMNB1, ко­ дирующим другой компонент ядерной ламины — ламин В 1 , так как мутантный ген LGMD1А картируется в той же области 5q22.3-31.3 длинного плеча хромосомы 5, где расположен ген LMNB1. Конечно, эти предположения требуют эксперимен­ тального подтверждения. Однако очевидно, что компоненты ядерной мембраны вносят определенный вклад в патогенез некоторых нейромышечных заболеваний.

1.6. Врожденные непрогрессирующие миопатии В самостоятельную клиническую группу традиционно выделяют врожденные непрогрессирующие миопатии. Две из них обусловлены дефектами белков базальной ламины. При врожденных миопатиях дефектными, как правило, оказыва­ ются гены, экспрессирующиеся в раннем эмбриогенезе и кодирующие белки, участвующие в процессах роста, диффе­ ренцировки и пролиферации миобластов. Примерно в поло­ вине случаев врожденных аутосомно-рецессивных мышеч­ ных дистрофий с ранним дебютом у больных обнаруживает­ ся недостаточность по а2-цепи ламинина 2 (мерозина), лока­ лизованного в базальной мембране поперечно-полосатых мышц и связанного с цитоскелетом клетки через комплекс дистрофин-ассоциированных белков. В некоторых случаях это 117

снижение является вторичным, как например при миодист­ рофии Фукуяма. Мутации в гене ламинина 2 приводят к раз­ витию врожденной мерозин-дефицитной миодистрофии, со­ четающейся с гипомиелинизацией белого вещества мозга. Еще одна редкая форма непрогрессирующей врожденной миопатии вызвана наследственной недостаточностью рецеп­ тора ламинина в мышцах — а7 интегрина (31D. Мы уже упоминали о том, что патологические процес­ сы при некоторых врожденных миопатиях сопровождаются образованием в клетках гистологически идентифицируемых аномалий. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клет­ ках пациентов присутствуют нитеобразные патологические фибриллярные структуры, причиной развития которых явля­ ется латеральная экспансия Z-дисков. Эта экспансия при различных формах немалиновой миопатии может возникать вследствие нарушений в структуре интегральных белков тон­ ких филамент, таких как небулин и актин, а также других вза­ имодействующих с ними белков, в первую очередь тропомиозина В. Определенные гистологические аномалии в мышеч­ ных клетках характерны также для пациентов с болезнью центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обо­ их случаях дефектными оказываются белки, участвующие в контроле дифференцировки мышечных волокон. Различные варианты еще одной врожденной миопатии Бетлема обуслов­ лены дефектной структурой микрофибриллярного коллагена VI типа, оказывающего влияние как на процессы дифферен­ цировки миобластов, так и на структурную организацию вне­ клеточного матрикса.

а) Мышечная дистрофия врожденная мерозиндефицитная (MIM: 156225) В «классическом» варианте мерозин-дефицитной мио­ патии клинические проявления ограничиваются только ске­ летными мышцами без каких-либо симптомов поражения цен­ тральной нервной системы, хотя при магнитно-резонансной томографии выявляются изменения в белом веществе моз-

118

га, обусловленные гипомиелинизацией (Banker, 1994; Mercuri et al., 1995). Болезнь проявляется в виде мышечной слабос­ ти, гипотонии, задержки моторного развития. Дети поздно на­ чинают садиться и ходить, при этом оказываются не способ­ ны передвигаться по неровной местности и на большие рас­ стояния без посторонней помощи. В сыворотке крови наблю­ дается повышенное содержание креатинкиназы. В биоптатах мышц больных отмечаются гистологические аномалии, свидетельствующие об умеренном течении дистрофическо­ го процесса. Ламинин-2 преимущественно локализован в базальной мембране поперечно-полосатых мышц. Он состоит из тяже­ лой ос2 цепи и двух легких цепей (J1 и у 1 , кодируемых разны­ ми генами. Ламинин-2 экспрессируется достаточно поздно в эмбриогенезе и на более ранних стадиях его функции, повидимому, выполняет ламинин-1. Ламинин-2 является есте­ ственным лигандом для а-дистрогликана. Зрелая а-цепь ламинина-2 состоит из 3088 аминокислотных остатков, сигналь­ ный пептид содержит 22 аминокислоты (Vuolteenaho et al., 1994). При некоторых формах врожденных мышечных дис­ трофий содержание ламинина-2 в скелетных мышцах и в пе­ риферических нервах резко снижено. В некоторых случаях это снижение является вторичным. При исследовании 20 семей с врожденной аутосомнорецессивной миодистрофией, не относящейся к типу Фукуя­ ма, в 13 было обнаружено полное отсутствие ламинина-2 (Hillaire et al., 1994). Последующий генетический анализ, про­ веденный в этих мерозин-дефицитных семьях, с использо­ ванием метода картирования у пациентов областей генома, гомозиготных по высокополиморфным микросателлитным маркерам, показал, что мутантный ген, ответственный за данную форму врожденной миодистрофии, локализован в той же области 6q22, где расположен ген LAMA2 (laminin alpha 2). В дальнейшем локализация гена LAMA2 в области 6q22q23 была подтверждена многими методами, включая метод флюоресцентной гибридизации in situ (Vuolteenaho etal., 1994). 119

LAMA2 — это очень крупный ген, занимающий 260 кб геномной ДНК. Его кодирующая часть разделена на 64 экзо­ на, два из которых очень маленькие — 6 и 12 п.о. (Zhang et al., 1996). Идентификация специфических мутаций в гене LAMA2 у пациентов явилась окончательным доказательством его причастности к развитию болезни (Helbling-Leclerc et al., 1995; Nissenen et al., 1996; Allamand et al., 1997). Различные мутации в гене LAMA2 могут приводить к разным клиничес­ ким формам заболевания от тяжелых, при которых ламинин2 полностью отсутствует, до промежуточных и мягких, при которых наблюдается количественное снижение белка или присутствуют его дефектные варианты. Так, у двух родствен­ ных пациентов с мягким течением врожденной мышечной дистрофии обнаружена сплайсинговая мутация, сопровож­ дающаяся делецией 63 аминокислот в IV домене белка. Этот домен ответственен за формирование глобулярной структу­ ры на коротком плече сс2-цепи ламинина-2, отсутствие кото­ рой, по-видимому, сопровождается разрушением ламининовой сети в мышечных мембранах и нарушением связи белка с дистрофин-гликопротеиновым комплексом (Allamand et al., 1997). При молекулярном обследовании родственников боль­ ных с мерозин-дефицитной миодистрофией выявляется до­ стоверное превышение гетерозиготных носителей мутаций в гене LAMA2. Для объяснения наблюдаемого преимущества гетерозигот привлекается гипотеза отбора, происходящего либо на уровне гамет, либо среди ранних зародышей на доимплантационной стадии развития. Мутация в гомологичном гене Lama2, кодирующем а2цепь ламинина мышей, описана у животных генетической линии dy2j с мягкими проявлениями мышечной дистрофии (Xu et al., 1994). Эта ЛИНИЯ является одним из аллельных ва­ риантов классической линии мышей с врожденной мышеч­ ной дистрофией — dy, впервые описанной почти 40 лет на­ зад. Показано, что молекулярной основой наблюдаемого фенотипа в линии dy2j является нарушение процесса сплай­ синга первичного РНК транскрипта Lama2 и трансляция по120

липептида с делецией в домене VI ламинина-2, не способно­ го, по-видимому, обеспечить достаточную стабильность мышц при раундах сокращения и расслабления.

б) Миопатия врожденная, обусловленная недостаточностью а 7 интегрина (J1D Аутосомно-рецессивная непрогрессирующая врожден­ ная миопатия с задержкой моторного развития (самостоя­ тельная ходьба после 2 лет), сочетающаяся с мышечной ги­ потонией, нередко — кривошеей. В развитии и функционировании скелетных мышц кри­ тическую роль играет базальная ламина мышечных волокон. Рецептором ламинина в мышцах является а 7 субъединица интегрина (31D. Интегрины — семейство гетеродимерных мембранных гликопротеинов, опосредующих широкий спектр межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий. Из­ вестно 16 а- и 8 р-цепей интегринов. В свою очередь а-цепи делятся на 2 группы различающиеся по наличию инсерции около 180 аминокислот в экстраклеточном домене. Для того чтобы проанализировать роль а 7 субъеди­ ницы интегрина p1D в патогенезе болезней мышц, прово­ дили и м м у н о г и с т о х и м и ч е с к о е исследование биоптатов мышц 117 пациентов с неклассифицированными форма­ ми врожденных миопатии. У трех пациентов было обнару­ жено отсутствие иммунореактивных форм исследуемого белка при нормальном уровне экспрессии а2 ламинина (Mayer et al., 1997). Оказалось, что у всех трех пациентов имеются мутации в кодирующей части гена а7 интегрина |J1 D — ITGA7 (integrin alpha 7), локализованного в области 12q13 (Wang et al., 1995). Один пациент был компаунд-гетерозиготой по двум сплайсинговым мутациям, одна из которых при­ водила к инсерции 7 аминокислот в консервативном цистеин-богатом районе белка, другая сопровождалась делецией 98 нуклеотидов. Эта же делеция в компаунде с делецией 1 нуклеотида была обнаружена у другого неродственного больного. У третьего пациента было резко снижено содер­ жание мРНК-транскрипта ITGA7 Таким образом, было до121

казано, что мутации в гене ITGA7 ответственны за некото­ рые редкие формы мягких врожденных миопатии. Получена трансгенная линия мышей с направленно раз­ рушенным геном а7 интегрина — Itga7 Мутантные живот­ ные имеют признаки врожденной миопатии, сходной с той, которая наблюдается у пациентов с дефицитом а7 интегрина p1D(Hayashi et al., 1998).

в) Нитчатая (немалиновая) миопатия, тип 1 (MIM: 161800); тип 2 (MIM: 256030) 1. Клиническая характеристика заболевания Считается, что немалиновая миопатия наиболее часто встречающаяся форма врожденных непрогрессирующих ми­ опатии. Нередко это заболевание диагностируется благода­ ря ряду дизэмбриогенетических внешних признаков. У боль­ ных часто отмечается удлиненный лицевой череп, низко рас­ положенные ушные раковины, готическое небо, гипоплазия нижней челюсти, деформации грудной клетки по типу «кури­ ной» и позвоночника в виде кифосколиоза. Характерна так­ же амимия, обусловленная включением в процесс лицевой мускулатуры. Больные плохо морщат лоб, не полностью смы­ кают веки, не могут свистеть, надувать щеки. Часто наблю­ дается носовой оттенок голоса. Мышечная гипотония и мы­ шечная слабость проявляются с первых месяцев жизни и как при любой диффузной мышечной слабости имеет место симп­ том «запрокидывания» головы при попытке поднять лежа­ щего на спине ребенка за руки. Выражены симптомы «сво­ бодных» надплечий, «треножника» и др. Отстают темпы мо­ торного развития. В первые три года возможны повторные пневмонии. Дети начинают ходить с полутора лет, не могут бегать, прыгать. В дальнейшей жизни больные остаются ин­ валидами, однако способность к самостоятельному передви­ жению сохраняется, что дает возможность приспособиться к самообслуживанию и даже приобрести специальность. Тече­ ние заболевания в целом относительно стационарное. Мы­ шечная сила более снижена в проксимальных отделах конеч122

ностей, и отчетливо преобладает слабость в руках. Глубокие рефлексы снижены и в течение жизни могут угасать. Разви­ тия сухожильных ретракций, как правило, не отмечается. Весьма характерны мышечные атрофии. Немалиновая миопатия получила свое название в свя­ зи с особыми нитеобразными структурами, обнаруживаемы­ ми при гистологическом анализе в мышечных клетках боль­ ных. Патологический фибриллярный материал сходен с ве­ ществом, образующим Z- диски и, возможно, является тропомиозином В. Наряду с тропомиозином В, а-актинин явля­ ется главным белковым компонентом Z-дисков и немалино­ вого тела, образующегося, по-видимому, в результате лате­ ральной экспансии Z-дисков. Чаще всего немалиновая миопатия наследуется по аутосомно-рецессивному типу, хотя описаны и доминантные формы заболевания. Оказалось, что не менее трех генов изолированно участвуют в контроле немалиновой миопатии: доминантные формы заболевания связаны с мутациями в гене ос-тропомиозина — ТРМЗ и в гене мышечного а-актина — АСТА1, тогда как типичная непрогрессирующая или медленно прогрессирующая рецессивная форма обусловле­ на мутациями в гене небулина — NEB (Laing et al., 1995; Pelin et al., 1999; Nowak et al., 1999). 2. Роль а-актинина и ос-тропомиозина в патогенезе немалиновой миопатии При различных формах немалиновой миопатии часто обнаруживается снижение или отсутствие актин-связанного белка а-актинина в мышечных клетках, тогда как в немышеч­ ных клетках пациентов никаких аномалий актина или а-акти­ нина не отмечается (Wallgren-Petersson et al., 1990). Было высказано предположение, что гены мышечного а-актини­ на — ACTN2 и ACTN3, расположенные в хромосомах 1q42q43 и 11q13-q 14 соответственно, ответственны за некоторые формы немалиновой миопатии. Однако в дальнейшем это предположение не нашло экспериментального подтвержде­ ния. Так, с использованием техники микросателлитного кар123

тирования было исключено сцепление рецессивной формы заболевания с геном ACTN2 (Tahvanainen et al., 1994). Мало­ вероятно также, что эта форма немалиновой миопатии обус­ ловлена дефектом гена ACTN3. Хотя а-актинин 3 отсутствует при многих формах миопатии, этот дефект не является пер­ вичным. При проведении обширного иммуно-скрининга с ис­ пользованием образцов биоптатов мышц 55 контрольных ин­ дивидуумов и 118 пациентов с различными формами нейро­ мышечных заболеваний (среди них 74 пациента с миопатиями и 20 — с нейрогенными болезнями) экспрессии гена ACTN2 у больных не было обнаружено ни в одном случае, тогда как а-актинин 3 отсутствовал в 19% исследованных образцов (North et al., 1999). При этом никакой корреляции между биохимическим дефектом и клиническим фенотипом выявлено не было. Оказалось, что в 96 % случаев отсутст­ вие а-актинина 3 связано с наличием двух высокополиморф­ ных гомозиготных мутаций в гене ACTN3: миссенс-мутации Q523R и нонсенс-мутации R577X. В разных популяциях час­ тота нонсенс-мутации R577X варьирует от 2 2 % до 52%. Вы­ явлено сильное неравновесие по сцеплению между двумя этими мутациями. В подавляющем большинстве случаев в популяциях встречается сочетание либо двух мажорных, либо двух минорных аллелей. Суммарная частота аллелей 523R/ 577R и 523Q/577X составляет всего лишь около 4%. При семейном генетическом анализе было обнаруже­ но сцепление гена NEM1(nemaline myopathy J J , ответствен­ ного за доминантную форму заболевания, с геном АРОА2, картированным в области 1q21-q23 (Laing et al., 1992). Неда­ леко от APOA2 в районе 1q23-q24 локализован ген а-субъединицы немышечного тропомиозина — ТРМЗ. У человека идентифицировано 4 гена тропомиозина. Для каждого из этих генов показан альтернативный сплайсинг, сопровождающий­ ся образованием множественных изоформ соответствующих белков. Ген ТРМЗ преимущественно экспрессируется в мы­ шечных волокнах первого типа. Этот ген также был исследо­ ван в качестве кандидатного для NEM1. В одной из семей с 124

доминантно наследуемой немалиновой миопатией у больных была обнаружена миссенс-мутация в гене ТРМЗ, косегрегирующая с заболеванием (Laing et al., 1 9 9 5 ) . Эта мутация со­ провождается заменой аминокислоты в актин-связывающем центре немышечного тропомиозина. Полученные данные делают весьма вероятной гипотезу об идентичности генов ТРМЗ и N E M 1 . Эта гипотеза была подтверждена в дальней­ шем при обнаружении в гене ТРМЗ гомозиготной нонсенсмутации у пациента с рецессивным типом наследования не­ малиновой миопатии (Tan et al., 1 9 9 9 ) . Таким образом, мута­ ции в гене а-тропомиозина могут явиться причиной разви­ тия как доминантных, так и рецессивных форм заболевания. З.Молекулярные основы аутосомно-реиессивной медленно прогрессирующей немалиновой миопатии В ряде семей с аутосомно-рецессивным типом насле­ дования и типичным течением непрогрессирующей или мед­ ленно прогрессирующей немалиновой миопатии, дебютиру­ ющей в младенческом возрасте, было обнаружено сцепле­ ние мутантного гена N E M 2 с маркерами длинного плеча хро­ мосомы 2. В области 2q21.2-q22 локализован ген небулина — N E B (Zeviani et al., 1 9 8 8 ) . Кодирующая часть гена N E B разде­ лена на 1 8 7 экзонов, распределенных на площади около 4 0 0 кб. Размер кДНК гена N E B составляет 2 0 . 8 кб. Огромный по своим размерам саркомерный белок небулин, составляющий около 3 — 4 % всего микрофибрилляр­ ного белка, является наряду с актином и титином интеграль­ ным компонентом тонких филамент поперечно-полосатых мышц (Wang et al., 1 9 9 6 ) . Молекулярная масса небулина ва­ рьирует от 6 0 0 до 8 0 0 кД, и полипептид, состоящий из 6 6 9 0 аминокислот, содержит 1 8 5 копий 35-аминокислотных моду­ лей, кодируемых отдельными экзонами гена N E B . 3 T H повто­ ряющиеся модули классифицированы на 7 различных типов. 1 2 0 - к Д карбокси-терминальный район небулина высококон­ сервативен и гомологичен одному из филаментных белков сердечной мышцы (nebulette). На С-конце небулина распола­ гаются два уникальных домена — серин-богатый, содержа125

щий многочисленные сайты фосфорилирования, и ЭНЗ-домен. Модули М 163-М 176 являются компонентами 1-диска, тогда как М177-М 185 входят в Z-мембрану. Прикрепление небулина к Z-дискам саркомера осуществляется посредст­ вом его взаимодействия с ЭНЗ-гомологичной последователь­ ностью. Таким образом, С-терминальный район небулина, локализованный в I-Z-I диске, участвует в регуляции образо­ вания и интеграции Z-мембраны в саркомере. Множество изоформ небулина, образующихся за счет альтернативного сплайсинга гена NEB, определяют молекулярное разнообра­ зие Z-дисков. Особенно интенсивный дифференциальный сплайсинг наблюдается в районе повторяющихся модулей М176 — М 1 8 2 . Был проведен молекулярный анализ З'-района кДНК гена NEB, включающего экзоны 163—172, в 22 семьях раз­ личного этнического происхождения с рецессивной формой небулиновой миопатии (Pelin et al., 1999). Поиск мутаций осу­ ществляли с использованием методов однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) и обратной ПЦР (RT-PCR). При этом анализе было идентифицировано 6 различных му­ таций у больных из 5 семей различного этнического проис­ хождения. Все мутации сопровождались сдвигом рамки счи­ тывания и образованием укороченных на 25-80 кД форм не­ булина. Иммунофлюоресцентный анализ с использованием антител на С-терминальную часть белка показал, что укоро­ чение небулина ведет к потере разнообразия типов волокон и это, по-видимому, является основной причиной развития патологических процессов, ведущих к образованию немали­ новых тел. 4. Актиновая миопатия Относительно недавно были описаны 3 пациента с тя­ желой формой врожденной миопатии, в мышечных биоптатах которых наблюдались большие накопления тонких филамент, расположенные под сарколеммой мышечного волокна (Goebrl et al., 1997). Двое из этих пациентов умерли в мла126

денческом возрасте, третий дожил до 7.5 года. Наблюдае­ мые у пациентов филаментные образования интенсивно ок­ рашивались антителами на актин, и потому заболевание по­ лучило название актиновой миопатии. Ген а-актина скелет­ ных мышц — АСТА1, локализованный в области 1q42, был исследован в качестве кандидатного для новой формы мио­ патии (Nowak et al., 1999). У всех трех пациентов были найде­ ны гетерозиготные миссенс-мутации в кодирующей области гена АСТА1. Поскольку у двух из обследованных пациентов наряду с филаментными образованиями наблюдались нема­ линовые тела, было высказано предположение, что некото­ рые тяжелые формы немалиновой миопатии могут быть кли­ ническими вариантами актиновой миопатии. У детей с тяже­ лыми формами немалиновой миопатии уже при рождении от­ мечается выраженная гипотония и слабость мышц, недоста­ ток спонтанных движений, затруднения при кормлении и ды­ хательная недостаточность. Такие дети часто погибают в мла­ денческом или в раннем детском возрасте. Для проверки выдвинутого предположения был прове­ ден поиск мутаций в гене АСТА1 у 59 больных с различными формами немалиновой миопатии, включая тяжелую (Nowak et al., 1999). В результате у больных из 14 неродственных семей было идентифицировано 15 различных миссенс-мутаций, затрагивающих все 6 кодирующих экзонов гена АСТА1. Во всех этих семьях, за исключением одной, мутации у боль­ ных присутствовали в гетерозиготном состоянии, что под­ тверждает доминантный характер наследования заболева­ ния. В 7 случаях удалось доказать возникновение мутации de novo. В одной из семей с относительно мягким течением заболевания было прослежено рецессивное наследование.У большинства носителей мутаций немалиновая миопатия про­ являлась в очень тяжелой форме и приводила к гибели детей в младенческом возрасте (8 семей) или в первом десятиле­ тии жизни (3 семьи). Таким образом, было доказано, что на­ следуемые по аутосомно-доминантному типу тяжелые фор­ мы немалиновой миопатии, а также некоторые рецессивные 127

формы заболевания могут быть обусловлены мутациями в гене а-актина, то есть являются аллельными вариантами актиновой миопатии. На рис. 15 схематически изображена модель F-актина, взаимодействующего с миозином. Взаимодействие между Fактином тонких филамент и миозином толстых филамент лежит в основе сокращения и расслабления мышечных во­ локон. F-актин состоит из 6 отдельных субъединиц актина. В центре комплекса расположен а-актин. Кружками указана локализация аминокислотных замен, идентифицированных у больных с актиновой и немалиновой миопатией. Иденти­ фицированные мутации могут быть разделены на два типа: (1) замещения остатков, расположенных в гидрофобных кла­ стерах или в корах — L94P, M132V, V163L и V370F, и (2) — на поверхности молекулы — G 1 5 R , H40Y, N115S,G182D, R183C, R256H, E259V, Q263L, N280K и D286G. Некоторые из этих мутаций, идентифицированные у пациентов с наиболее тя­ желыми формами заболевания, локализованы в функцио­ нально-значимых сайтах актиновой молекулы. Так, глицин в 15 положении а-актина (G15) принимает участие в образо­ вании водородных связей с (3-фосфатами АТФ и АДФ, амино­ кислотные остатки G182 и R183 локализованы в сайтах свя­ зывания с ДНКазой I, а Н40 и V370 — в сайтах связывания с миозином. Аспарагиновая кислота в 286 положении прини­ мает непосредственное участие во взаимодействиях субъе­ диниц F-актина, и можно предположить, что ее замещение приводит к дестабилизации всего комплекса. Аминокислоты R183 и N280, расположенные на поверхности а-актина, спо­ собны формировать ионные взаимодействия с другими час­ тями актина. В этой связи интересно подчеркнуть, что в ана­ логичных взаимодействиях принимают участие две амино­ кислоты в актине сердечной мышцы — R312 и Е361 — и каж­ дая из них вовлечена в мутацию при одном из наследствен­ ных вариантов дилатационной кардиомиопатии (Olson et al., 1998). Однако, несмотря на очевидную связь между харак­ тером мутационного повреждения в гене АСТА1 и тяжестью 128

течения актиновой миопатии, в ряде случаев не удается ис­ ключить зависимость фенотипического проявления мутаций от каких-то других факторов как эндогенного, так и экзоген­ ного порядка.

Рис. 15. Модель F:-актина и миозина с указанием локализации аминокислотных замен, идентифицированных у больных с немалиновой миопатией 9 Заказ № 170

Подводя итоги, можно заключить, что молекулярной основой развития патологических процессов и, в частности, образования немалиновых тел при различных формах нема­ линовой миопатии являются дефекты в структуре небулина, актина и, возможно, других белков тонких филамент, а так­ же взаимодействующих с ними белков, таких как тропомиозин и а-актинин. Подобные дефекты ведут к нарушению фи­ зиологического взаимодействия этих белков в Z-дисках, и эти нарушения являются критическими для развития немалино­ вой миопатии.

г) Болезнь центрального стержня (MIM: 117000) Заболевание выделено как самостоятельная нозологи­ ческая форма из группы врожденных непрогрессирующих миопатии, благодаря своеобразным морфологическим изме­ нениям мышечных волокон, обнаруживаемым в биопатах при специальной окраске с использованием электронной микро­ скопии. Гистологическим маркером болезни центрального стержня является отсутствие митохондрий на свежезаморо­ женных срезах скелетных мышц в центре многих волокон первого типа. На биохимическом уровне имеет место высво­ бождение фосфата из глюкозо-6-фосфата. Начальные при­ знаки болезни проявляются в раннем возрасте общей мы­ шечной гипотонией, мышечной слабостью, задержкой тем­ пов моторного развития. Интеллектуальное развитие не стра­ дает. Статус в первые месяцы укладывается в понятие «вя­ лый ребенок». Самостоятельная ходьба начинается с задерж­ кой на 4—6 месяцев и характеризуется неуверенностью и частыми падениями. Мышечная слабость локализуется пре­ имущественно в проксимальных отделах верхних и нижних конечностей. Слабость мышц спины и грудной клетки может способствовать развитию костных деформаций в виде ско­ лиоза позвоночника, воронкообразной или «куриной» груд­ ной клетки. Атрофии мышц выражены умеренно, псевдогипертрофий не бывает. Глубокие рефлексы сохраняются, хотя могут быть в той или иной степени снижены. Сухожильные 130

ретракции отсутствуют. Течение заболевания доброкачест­ венное, отмечены даже улучшения в виде нарастания мы­ шечной силы в юношеском возрасте. Витальный прогноз бла­ гоприятный. В ряде семей болезнь центрального стержня сочетается со злокачественной гипертермией — аутосомнодоминантно наследуемой повышенной чувствительностью к анестезии, обусловленной, по-видимому, дефектами в сис­ теме окислительного фосфорилирования (Frank et al., 1978). Злокачественная гипертермия, в свою очередь, часто соче­ тается с доминантно наследуемой миопатией, отличной от болезни центрального стержня. Семейный анализ сцепления заболевания с различны­ ми ДНК-маркерами позволил отнести мутантный ген CCD (central core disease) в область 19q12-q13.2 (Haan etal., 1990; Kaush et al., 1991). Было высказано предположение, что бо­ лезнь центрального стержня обусловлена мутациями в гене рецептора-1 рианодина (RYR1 — ryanodine receptor 1), рас­ положенном в той же области генома (Mulley et al., 1993). Это предположение было подтверждено при обнаружении ряда мутаций в гене RYR1 у пациентов с болезнью централь­ ного стержня (Zhang et al., 1993; Quane et al., 1993). Таким образом была доказана идентичность генов CCD и RYR1. Рецептор рианодина — кальций-высвобождающий ка­ нал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц (рис. 16). Рецептор рианодина необходим для развития и созрева­ ния мышц, а также его функции связаны с сокращением-рас­ слаблением миофибрилл. Трансгенные мыши с направленно разрушенным геном Ryr1 погибают в перинатальном перио­ де и имеют значительные аномалии в развитии скелетных мышц (Takeshima et al., 1994). ДНК-маркеры RYRI-гена косегерегируют с некоторыми формами злокачественной ги­ пертермии. Оказалось, что около 50% случаев злокачествен­ ной гипертермии являются аллельными вариантами болезни центрального стержня и обусловлены различными миссенсмутациями в гене RYR1. Причем одна из этих мутаций — R163C — встречалась у различных неродственных пациен131

тов, как с гипертермией, так и с болезнью центрального стерж­ ня, что указывает на возможность участия иных генетичес­ ких или средовых факторов в формировании подобной кли­ нической гетерогенности (Quane et al., 1993).

Рис. 16. Схема работы рецептора рианоцина Некоторые пациенты с наследственной гипертрофиче­ ской кардиомиопатией, обусловленной мутациями в гене тя­ желой цепи р-миозина (MYH7), имеют выраженную мышеч­ ную слабость и гистологические аномалии, сходные с теми, которые наблюдаются при болезни центрального стержня. У одного из таких пациентов найдена миссенс-мутация — L908V в гене MYH7, что доказывает возможность участия данного гена в контроле некоторых форм болезни центрального стерж­ ня (Fananapazir et al., 1993).

д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400) Данная форма врожденной миопатии отличается осо­ быми образованиями, выявляемыми гистологически и гистохимически. Мышечные волокна в своей центральной час­ ти изменены, отличаются повышенной ферментативной ак­ тивностью и похожи на эмбриональные мышечные клетки. В этом же отделе мышечного волокна обнаруживаются скоп­ ления мышечных ядер. Мышечные волокна уменьшены в раз132

мерах и отличаются повышенной активностью окислитель­ ных ферментов. Клинические проявления отмечаются с пер­ вых месяцев жизни в виде диффузной мышечной гипотонии, атрофии и генерализованной слабости мышц. Глубокие ре­ флексы медленно снижаются. Течение, как правило, медленно прогрессирующее, не исключена и стабилизация процесса. Все это сближает клинические данные с таковыми при дру­ гих врожденных миопатиях. Однако следует отметить, что заболевание имеет некоторые отличительные черты, способ­ ствующие клинической диагностике. К ним можно отнести поражение глазодвигательных мышц, приводящее к косогла­ зию, и двусторонний, различной выраженности птоз. Миотубулярная миопатия — генетически гетерогенная группа кли­ нически сходных заболеваний. В разных семьях прослеживается различный характер наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный и Х-сцепленный рецессивный. В последнем случае за­ болевание характеризуется ранним началом и более тяже­ лым течением. При рождении больного ребенка наблюдает­ ся снижение или отсутствие спонтанных движений и наруше­ ние дыхания вследствие задержки или остановки нормаль­ ного развития мышечных волокон. Болезнь проявляется уже в пренатальном периоде и часто сопровождается многоводием и слабым шевелением плода. У облигатных гетерозигот часто наблюдаются выкидыши и мертворождения. большин­ ство пациентов погибают от дыхательной недостаточности в возрасте 4—5 месяцев. Некоторые мальчики доживают до взрослого периода за счет лучшей респирации после рожде­ ния. Причины подобной клинической гетерогенности неизве­ стны. Описана косегрегация сцепленной с полом миотубулярной миопатии с маркерами области Xq28, в том числе с ге­ ном фактора VIII свертывания крови — F8C (Thomas et al., 1987; 1990). Ген МТМ1 (myotubular myopathy 1) локализован проксимальнее F8C (Lehesjoki etal., 1990), ближайшими флан­ к и р у ю щ и м и м и к р о с а т е л л и т н ы м и м а р к е р а м и являются 133

DXS304 и DXS305 (Dhal et al., 1994). Маркеры DXS455 и DXS1684 наиболее информативны для диагностики аллельного состояния гена МТМ1. Открытию гена сцепленной с по­ лом миотубулярной миопатии способствовало описание па­ циентов, несущих микроделеции в области локализации этих маркеров (Dhal et al., 1995). Так, обнаружение делеции у де­ вочки с относительно благоприятным течением миотубуляр­ ной миопатии позволило ограничить вероятный район лока­ лизации гена МТМ1 600 тысячами пар оснований. Затем при идентификации точек разрыва перекрывающихся микроде­ леции у двух мальчиков, характеризующихся миотубулярной миопатией и аномалиями полового развития, этот район в проксимальной области Xq28 дистальнее маркера DXS304 был сужен до 430 кб (Ни et al., 1996). Полученные результаты ПОЗВОЛИЛИ использовать стратегию позиционного клонирова­ ния для изоляции гена МТМ1. Фрагменты ДНК из области перекрывания двух таких микроделеции были клонированы в дрожжевых и космидных векторах (Laporte et al., 1996). Для нахождения транскрибируемых последовательностей в кло­ нированных ДНК использовали три различных подхода: (1) отбор из тканеспецифических библиотек генов кДНКовых последовательностей, гибридизующихся с геномными марке­ рами, сцепленными с геном МТМ1, (2) улавливание экзонов и (3) частичное секвенирование клонированных геномных последовательностей с последующим компьютерным поиском кодирующих областей. В результате было отобрано пять эк­ зонов и шесть кДНК-клонов, содержащих частично перекры­ вающиеся фрагменты ДНК. Кроме того, три района секвенированных космидных последовательностей соответствовали кодирующим областям ДНК. При сопоставлении мест лока­ лизации этих элементов был идентифицирован неизвестный ранее ген — C G 1 , занимающий протяженную центральную часть области перекрывания двух микроделеции. Этот ген состоит из 7 экзонов и преимущественно экспрессируется в скелетных мышцах; размер мРНК составляет 4.6 кб. CG1 рассматривался как наиболее вероятный кандидат для МТМ1. 134

Однако предположение не нашло подтверждения, так как ни у одного из 28 пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией мутаций в кодирующей части гена CG1 обнару­ жено не было. Возможно, этот ген является кандидатным для каких-то других наследственных заболеваний, обусловлен­ ных повреждением области Xq28, таких как синдром Вайсмана, Х-сцепленная умственная отсталость (MRX3) или отопалато-дигитальный синдром (OPD). Второй идентифицированный ген — CG2, состоящий из 15 экзонов, отсутствовал у одного из пациентов с микроделециями и был частично делетирован у другого. До­ полнительный скрининг 12 тканеспецифических библиотек и компьютерный анализ базы данных EST-последовательностей позволили идентифицировать фрагмент кДНК раз­ мером в 3.4 кб с сигналом полиаденилирования и откры­ той рамкой считывания. Этот фрагмент к Д Н К способен кодировать полипептидную цепь, состоящую из 621 ами­ нокислоты. Причем в клонах кДНК, изолированных соот­ ветственно из библиотеки печени и скелетных мышц, при­ сутствовали альтернативные сайты полиаденилирования. Оказалось, что ген CG2 идентичен М Т М 1 , так как были обнаружены различные мутантные аллели этого локуса у пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией. На­ ряду с миссенс-мутациями описаны небольшие делеций и инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания. Иссле­ дование 4 0 % кодирующей области гена МТМ1 позволило идентифицировать мутации у 12% пациентов. Продукт гена CG2, получивший название миотубулярин, имеет высокую гомологию по последовательности с одним из белков Saccharamyces cerevisiae и Caenorhabditis elegans (53% и 56% соответственно). Кроме того, анализ базы дан­ ных EST-последовательностей показал, что в геноме чело­ века существует по крайней мере восемь других не описан­ ных ранее генов, высокогомологичных МТМ1. Определена хромосомная локализация и характер экспрессии большин­ ства из них (Laporte et al., 1997). Один из этих генов локали135

зован дистальнее МТМ1 в Xq28. Миотубулярин содержит рай­ он (РТР), сходный с активным центром тирозинфосфатаз. Эти белки вовлечены в регуляцию путей сигнальной трансдукции, участвующих в контроле процессов роста, пролиферации и дифференцировки клеток. Оказалось, что миотубулярин спо­ собен гидролизовать синтетический аналог тирозинфосфата в реакции in vitro, ингибируемой ортованадатом. По-видимо­ му, миотубулярин является членом нового семейства тиро­ зинфосфатаз (DSP), обладающих двойной специфичностью как по отношению к тирозину, так и по отношению к серину. Дефекты этого белка сопровождаются нарушениями нормаль­ ного процесса созревания мышц, что и приводит к развитию миотубулярной миопатии. Другие гомологи миотубулярина не имеют функционального РТР-активного сайта. МТМ1 принад­ лежит к семейству высококонсервативных генов, обнаружен­ ных не только в геноме млекопитающих, но и у различных видов дрожжей, а также у дрозофилы (Laporte et al., 1997). Сравнение этого ряда генов позволяет реконструировать филогенетическое дерево и определять консервативные ос­ татки, наиболее существенные для выполнения общих функ­ ций соответствующих белков. Прямое секвенирование 92% кодирующей части МТМ1 гена у мальчиков с миотубулярной миопатией, диагностиро­ ванной на основе гистологического анализа биоптатов мышц, позволило идентифицировать 26 мутаций, 50% которых были локализованы в экзонах 4 и 12 (de Gouyon et al., 1997). У большинства пациентов обнаруживаются точковые мутации, 4 из которых нарушают процесс сплайсинга. Одна из миссенс-мутаций затрагивает высококонсервативную аминокис­ лоту, присутствующую во всех гомологичных белках других исследованных видов начиная с дрозофилы. У остальных па­ циентов найдены делеции размером от нескольких нуклеотидов до 2—6 экзонов. Три мутации встретились более чем у одного пациента. В параллельном исследовании было про­ ведено скринирование всей кодирующей области МТМ1 гена методом SSCP-анализа у 85 неродственных пациентов 136

(Laporte et al., 1997). В 55 случаях удалось идентифициро­ вать мутантные аллели. Большие делеций обнаружены толь­ ко у трех пациентов. 5 точковых мутаций найдены у многих пациентов и, по-видимому, они обьясняют 27% всех случаев заболевания. Более половины мутаций нарушают фермен­ тативную активность миотубулярина, вследствие преждевре­ менной терминации трансляции либо в результате аминокис­ лотных замен в фосфатазном домене белка. Остальные миссенс-мутации кластерированы в двух консервативных райо­ нах миотубулярина, что является указанием на присутствие в этом белке других функциональных доменов, не связан­ ных непосредственно с реакцией фосфорилирования.

е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810) Генетически гетерогенная группа врожденных миопа­ тии с аутосомно-доминантным типом наследования. Заболе­ вание характеризуется врожденной мышечной гипотонией, укладывающейся в картину синдрома «вялого ребенка». В последующем наблюдается медленно прогрессирующая ат­ рофия мышц с возможным развитием кардиомиопатий и множественных контрактур суставов (Bethlem, van Wijngaarden, 1976; Arts et al., 1978). В биоптатах мышц наблюда­ ется атрофия волокон I типа. При генетическом анализе датских семей с данной фор­ мой миопатии обнаружено сцепление локуса, ответственно­ го за развитие заболевания, с областью 21q22.3, в которой расположен кластер генов, кодирующих а1 и ос2 цепи колла­ гена типа VI (Jobsis et al., 1995; Jobsis et al., 1996a). В боль­ шой франко-канадской семье, в которой одновременно на­ блюдали 19 пациентов, показано сцепление исследуемого локуса с маркерами D2S336 и D2S395, локализованными в 17-сМ области 2q37, в которой расположен ген аЗ цепи кол­ лагена того же типа VI (Speer et al., 1996). В настоящее вре­ мя идентифицировано19 типов коллагенов, состоящих из более чем 30 полипептидных цепей, кодируемых разными генами. Генетические дефекты некоторых типов коллагенов

137

связаны с рядом моногенных заболеваний, таких как несо­ вершенный остеогенез, синдром Элерса-Данлоса (тип IV и VII), синдром Альпорта, некоторые формы хондродисплазий. При этих заболеваниях нарушаются процессы посттрансля­ ционного созревания либо протеолитического расщепления коллагеновых цепей, что приводит к неправильному спари­ ванию мономеров либо к образованию мультимерных ансам­ блей большего размера. Зрелые молекулы коллагеновых белков состоят из трех равномерно скрученных полипептидных а-цепей, образую­ щих структуру трехгранного стержня. Разные типы коллаге­ нов могут быть образованы либо тремя одинаковыми а-цепями, либо двумя или тремя различными полипептидами в соотношении 2:1 или 1:1:1 соответственно. Любая а-цепь со­ держит коллагеновый домен, на всем протяжении которого за исключением короткого С-терминального участка каждая третья аминокислота является глицином (Gly). Таким обра­ зом, молекулярная формула коллагенового домена может быть записана как (Gly-X-Y)n, где X и Y — аминокислоты неGly типа. Различные коллагеновые а-цепи различаются по количеству (Gly-X-Y) мотивов в коллагеновом домене и по конкретному содержанию аминокислот в X и Y положениях. Некоторые коллагены содержат также неколлагеновые доме­ ны. Присутствие глицина, самой небольшой из аминокислот, в каждом третьем положении коллагеновых полипептидных цепей существенно для их правильного скручивания в трой­ ную спираль, так как глицин при этом занимает ограничен­ ное пространство в центре триплекса. Поэтому любые мута­ ции, приводящие к замене глицина на другую аминокислоту, будут сопровождаться локальным нарушением структуры тройной спирали. Все коллагеновые молекулы способны об­ разовывать супрамолекулярные агрегаты, частично стаби­ лизированные за счет взаимодейсвий между триплексными доменами. Коллагены типов l,ll, III, V, VI и XI формируют фибриллыдо есть являются фибриллярными коллагенами. Кол­ лагены типа IV агрегируются, образуя слои базальных мемб138

ран, коллагены VIII формируют десцеметовую мембрану и коллагены типа VII участвуют в образовании латерально аг­ регированных антипараллельных димеров, являющихся глав­ ным компонентом опорных фибрилл. На рис. 17 изображена структура коллагена. Предполагается, что среди большого се­ мейства коллагенов широко экспрессирующийся микрофиб­ риллярный коллаген VI типа выполняет роль моста между клетками и внеклеточным матриксом. Этот тип коллагена при­ сутствует не только в эндомизии и перимизии скелетных мышц, но и во многих других тканях.

Рис. 17. Структура коллагена При секвенировании амплифицированных фрагментов кодирующих областей генов COL6A1 (collagen 6 alpha 1) и COL6A2, полученных от пациентов с миопатией Бетлема, 139

ассоциированной с областью 21q22.3, в трех семьях были обнаружены две гетерозиготные миссенс-мутации. Одна со­ ответственно в гене COL6A1, а другая однотипная мутация в двух семьях — в гене COL6A2 (Jobsis et al., 1996b). Обе му­ тации разрушали Gly-X-Y мотив в стержневом домене колла­ гена путем замещения глицина либо на валин, либо на се­ рии. Гетерозиготное состояние по делеции одного нуклеотида в гене COL6A1 также приводит к развитию миопатии Бетлема (Lamandiet al., 1998). Эта мутация сопровождается преж­ девременной терминацией трансляции, при этом мутантная мРНК оказывается нестабильной и почти полностью отсутст­ вует в фибробластах и в скелетных мышцах больных. При гаплонедостаточности по а1-цепи образуется уменьшенное количество структурно нормального коллагена VI. Предпо­ лагается, что структурные дефекты коллагена типа VI или уменьшение его содержания могут оказывать влияние на про­ цессы дифференцировки миобластов либо, что более вероят­ но, на структурную организацию внеклеточного матрикса. Повидимому, в скелетных мышцах коллаген VI является критичес­ ким белком, участвующим в клеточно-матриксной адгезии.

1.7. Миопатии с цитоплазматическими и ядерными включениями в мышечных клетках Миопатии, дебютирующие во взрослом возрасте, при которых наблюдается накопление в цитоплазме и/или в яд­ рах мышечных клеток патологических белковых агрегатов, также, по нашему мнению, могут быть выделены в самостоя­ тельную группу, несмотря на то что молекулярные механиз­ мы формирования этих включений при разных заболевани­ ях могут значительно различаться. В последнее время широ­ ко обсуждается роль подобных образований в развитии нейродегенеративных процессов при таких разных заболевани­ ях, как болезнь Альцгеймера, некоторые семейные формы болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склеро-

140

за, а также болезни, связанные с экспансией CAG-повтора, такие как хорея Гентингтона, болезнь Кеннеди, целая серия спиноцеребеллярных атаксий. Более подробно эти вопросы будут обсуждаться во второй и пятой частях монографии. В общем виде можно сказать, что накопление нерастворимых белковых агрегатов в клетках тесно связано с их апоптозом и, по-видимому, является причиной избирательной гибели определенных типов клеток или даже тканей. В данном раз­ деле мы подробно обсудим три формы миопатии, при кото­ рых наиболее отчетливо прослеживается связь между нали­ чием белковых агрегатов в мышечных клетках и их гибелью. Это окулофарингеальная и десмин-родственные миопатии, а также моногенные миопатии с инклюзионными тельцами.

а) Миопатия окулофарингеальная (MIM: 164300) Эту форму аутосомно-доминантной миопатии следует отнести к относительно редким, возникающим в зрелом воз­ расте и медленно текущим заболеваниям. Клинически бо­ лезнь проявляет себя как «локальная миопатия». Поража­ ются мышцы, осуществляющие движения глазных яблок и мышца, поднимающая верхнее веко. Фарингеальные расст­ ройства обусловлены включением в процесс констрикторов глотки, что затрудняет глотание. Типична симметричность процесса. Начальные признаки болезни относятся к 30—40 гг. в виде двустороннего опущения верхнего века с появлением ограничения движения глазных яблок. Как правило, на дип­ лопию больные не жалуются. Объяснение этому находят в медленном и симметричном развитии парезов глазодвига­ тельных мышц. Значительно утежеляют заболевание и ухуд­ шают прогноз фарингеальные симптомы. Начинаясь с дизфагии, они имеют тенденцию к нарушению функций в виде афагии. Следует иметь в виду существование окулярной ми­ опатии, при которой фарингеальные расстройства не выра­ жены. Этот вариант миопатии рассматривается одними ис­ следователями как самостоятельное заболевание, други­ ми — как дебют окулофарингеальной миопатии. Диагности-

141

чески значимым признаком заболевания является появле­ ние в ядрах волокон скелетных мышц необычных тубулофиламентных включений. При электронно-микроскопическом анализе образцов биоптатов мышц пациентов наблюдаются увеличенные митохондрии с необычными кристовидными включениями. С использованием техники микросателлитного карти­ рования ген OPMD (oculopharyngeal muscular dystrophy) был локализован в 5-сМ интервале в области 14q11.2-q13 в непо­ средственной близости от двух тандемно расположенных ге­ нов тяжелых цепей b-миозина шестого и седьмого типов — MYH6 и MYH7 (Brais et al., 1995). Было высказано предполо­ жение, что один из этих генов дефектен при окулофарингеальной миодистрофии. Однако в дальнейшем эта гипотеза не нашла подтверждения. Конструирование космидной биб­ лиотеки геномной ДНК, заключенной между двумя ближай­ шими маркерами — D14S990 и D14S1457, фланкирующими ген OPMD, явилось основой для изоляции из этой области более 30 кДНКовых последовательностей, три из которых имели высокий процент гомологии с бычьим геном поли(А)связывающего белка 2 (Brais et al., 1998). Ранее ген поли(А)-связывающего белка 2 человека (РАВР2 — eoly(A)-banding grotein 2) был картирован методом флюоресцентной гибридизации in situ в области 14q11. Псевдоген РАВР2 расположен в области Xq12-q13. Кодирующая часть РАВР2 разделена на 7 экзонов. Обнаружено большое число транскрипционных изоформ гена, образующихся за счет альтернативного сплайсинга. В частности, интроны 1 и 6 представлены более чем в 60% транскриптов. Высокий уро­ вень экспрессии гена РАВР2 наблюдается во многих тканях, в том числе и в скелетных мышцах. Продукт этого гена лока­ лизован исключительно в ядрах, где он действует как фактор полиаденилирования мРНК. Локализация и характер экспрессии РАВР2 дали осно­ вание для его исследования в качестве кандидатного гена, ответственного за окулофарингеальную миопатию. Однако 142

при молекулярном анализе около 93% кодирующей части гена РАВР2 методами SSCP-анализа и обратной ПЦР (RT-PCR) мутаций у пациентов выявить не удалось. При этом анализе первый экзон гена РАВР2 не был исследован, так как он со­ держит трудно поддающуюся амплификации 400-нуклеотидную GC-богаую область, включающую стартовый кодон. Ока­ залось, что в этой области локализован (GCG)6-noBTop, ко­ дирующий 6 первых аланинов в цепочке из 10 аланиновых остатков в поли(А)-связывающем белке 2. Анализ этой об­ ласти с использованием специально разработанных условий амплификации показал, что у пациентов с окулофарингеальной миодистрофией наблюдается мейотически стабильная экспансия GCG-повтора до 8—13 триплетов, причем чаще всего встречается (GCG)9-noBTop (Brais et al., 1998). Таким образом, было доказано, что гены OPMD и РАВР2 идентич­ ны. При обширных популяционных исследованиях, проведен­ ных в Канаде, был обнаружен полиморфизм по количеству GCG триплетов в первом экзоне РАВР2 гена. В 98% нормаль­ ных хромосом содержится (GCG)6-noBTop, тогда как в 2% — (GCG)7-noBTop. Оказалось, что пациенты с аутосомно-рецессивным вариантом заболевания несут (GCG)7-noBTop в го­ мозиготном состоянии, а в наиболее тяжелой форме болезнь протекает у гомозигот по (GCG)9-noBTopy, а также у компаунд-гетерозигот по (GCG)7/(GCG)9 аллелям. Следовательно, (GCG)7-noBTop является примером аллеля, который может действовать либо как модификатор при доминантной форме болезни, либо как рецессивная мутация. Окулофарингеальная миодистрофия является первым примером заболевания, обусловленного очень короткой экс­ пансией тринуклеотидного GCG-повтора, расположенного в кодирующей части гена. В настоящее время описано два дру­ гих редких наследственных заболевания, связанных с уве­ личением полиаланиного трека в белковых продуктах соот­ ветствующих генов: одна из доминантных форм синполидактилий и аутосомно-доминантная черепно-ключичная дисплазия. Однако в двух последних случаях мутации не вызваны 143

экспансиями какого-либо тринуклеотидного повтора, а явля­ ются дупликациями смеси синонимических кодонов в генах HOXD13 и ос-1 цепи кор-связывающего фактора (CBFA1) со­ ответственно. Полиаланиновые треки найдены во многих ядерных белках, таких, например, как НОХ-белки, однако их функции пока неизвестны. Алании является высоко гидро­ фобной аминокислотой, присутствующей в корах белков. Предполагается, что полиаланиновые треки играют важную роль в процессе полимеризации. Показано, что полиалани­ новые олигомеры черезвычайно устойчивы к химической денатурации и энзиматической деградации. Поли(А)-связывающий белок 2 присутствует в клетках, главным образом в димерной или олигомерной формах. Возможно, РАВР2-олигомеры, составленные из достаточного числа мутантных мо­ лекул, могут накапливаться в ядрах в качестве филаментных включений и вызывать гибель клеток. Подобная агрега­ ция в ядрах нейронов мутантных белков с удлиненными полиглютаминовыми треками обнаружена по крайней мере при четырех заболеваниях, обусловленных экспансией CAG-noвтора: при хорее Гентингтона, двух формах спиноцеребеллярной атаксии и при денторубральной паллидо-люисовой атрофии. Не исключено, что молекулярные механизмы пато­ физиологии некоторых болезней экспансии связаны с воз­ можностью накопления в ядрах клеток мутантных гомополимерных доменов. Поскольку ген РАВР2 экспрессируется во многих типах тканей, остается неясным, с чем связан специ­ фический характер накопления подобных филаментных вклю­ чений у пациентов с окулофарингеальной миопатией.

б) Миопатия дистальная с накоплением десминовых включений (MIM: 125660). Десмин-родственная миопатия (OMIM: 601419) Аутосомно-доминантная форма миопатии, дебютирую­ щая во второй декаде или во взрослом возрасте слабостью проксимальных и дистальных мышц конечностей, а также мышц шеи и носоглотки. Нередко отмечается кардиомиопа-

144

тия и катаракта. В саркоплазме сердечной и скелетных мышц больных обнаруживаются плотные гранулофиламентные аг­ регаты, в которых накапливается десмин — белок, принад­ лежащий семейству промежуточных филамент типа III. Про­ межуточные филаменты наряду с актиновыми микрофиламентами и тубулиновыми микротрубочками представляют собой третий класс хорошо охарактеризованных элементов цитоскелета. Десминовые филаменты специфичны для мы­ шечных клеток. Они участвуют в дифференцировке миофибрилл и в поддержании структурной целостности скелетных мышц (Fuchs et al., 1998). С генетической точки зрения десмин-родственная миопатия представляет собой гетерогенную группу заболеваний. С использованием методов гибоидизации in situ ген десмина — DES (desmin). был локализован в длинном плече хромосомы 2 в районе 2q35 (Viegas-Pequignot et al., 1989). Для того чтобы определить потенциальную роль гена DES в развитии десмин-родственной миопатии, была определена нуклеотидная последовательность его кодирующей области — кДНК. В трех больших семьях с десмин-родственной миопа­ тией мутаций в гене DES у больных не были найдено (Vicart et al., 1996). Однако в дальнейшем у пациентов из двух дру­ гих подобных семей были идентифицированы миссенс-мутации в гене DES, сопровождающиеся аминокислотными за­ менами в высококонсервативном карбокси-терминальном конце стержневого домена десмина (Goldfarb et al., 1998). Гетерозиготная миссенс-мутация А337Р найдена у пациен­ тов со взрослой формой миопатии. Тогда как пациенты из другой семьи, характеризующиеся дебютом в детском воз­ расте и более злокачественным течением миопатии, сочета­ ющейся с кардиомиопатией, оказались компаунд-гетерозиготами по двум миссенс-мутациям — А360Р и N393I. Генетический анализ с использованием 280 микросателлитных маркеров, выполненный в большой французской семье, где на протяжении трех поколений наблюдали паци­ ентов с десмин-родственной миопатией, позволил локализо10 Заказ № 170

145

вать второй мутантный ген — DRM (desmin-related myopathy), в 26-сМ интервале в области 11q21-q23 (Vicart et al., 1998). В этом районе содержится ген CRYAB (crystallin alpha В)» коди­ рующий аВ-кристаллин — 20-кД мажорный белок хрустали­ ка, присутствующий также в ряде других тканей, включая сердечную и скелетные мышцы. Показано, что аВ-кристаллин взаимодействует с десмином в сердечной мышце. Это доказывает его участие в образовании сети промежуточных филамент. аВ-кристаллин принадлежит к семейству малых белков теплового шока (shsp) и обладает активностью моле­ кулярного шаперона. Наблюдается гиперэкспрессия этого белка в сердечной мышце при стрессовых ситуациях. У всех больных из исследуемой французской семьи обнаружена однотипная миссенс-мутация — R120G, в вы­ сококонсервативной позиции гена CRYAB. Трансфекция мутантной к Д Н К гена CRYAB в культивируемые клетки мышц приводит к образованию внутриклеточных агрегатов, со­ держащих десмин и аВ-кристаллин, подобно тому как это происходит в мышечных волокнах больных с десмин-родственной миопатией. Таким образом, доказана идентич­ ность генов CRYAB и DRM. Аутосомно-доминантная врож­ денная катаракта связана с миссенс-мутацией R116C в гене CRYAA, кодирующем otA-кристаллин. Примечательно, что 116 позиция в аА-кристаллине соответствует 120-й пози­ ции в осВ-кристаллине. Это еще раз указывает на высокую функциональную значимость аргинина в данном положе­ нии а-кристаллинов. Поздний дебют заболевания может быть объяснен, по-видимому, тем, что R120G мутация ока­ зывает повреждающий эффект на мышцы после длитель­ ного периода сократительной активности.

в) Миопатия с инклюзионными тельцами, аутосомно-доминантная (MIM: 147420); аутосомно-рецессивная (OMIM: 601073) Гетерогенная группа миопатии с уникальными гисто­ логическими особенностями мышечных волокон, включа146

ющими обрамленные вакуоли с концентрированными мем­ бранными телами и инклюзионными тельцами в цитоплаз­ ме и ядрах, состоящими из скрученных филамент диамет­ ром 15—18 н м , без сопутствующих воспалительных ин­ фильтратов. Заболевание дебютирует в возрасте около 50 лет в виде прогрессирующей мышечной слабости плечево­ го и тазового поясов. В последующем развиваются атро­ фии мышц дистальных сегментов конечностей, шеи и туло­ вища. Характерна хроническая респираторная недостаточ­ ность. Описаны как аутосомно-рецессивная, так и аутосом­ но-доминантная формы заболевания. Аутосомно-рецессив­ ная форма специфически распространена среди еврееввыходцев из Персии. При генетическом анализе 9 таких с е м е й о б н а р у ж е н о с ц е п л е н и е м у т а н т н о г о гена IBM2 (inclusion body myopathy 2) с маркерами центромерной области хромосомы 9 (9p1-q1) (Mitrani-Rosenbaum et al., 1996). Локализация гена I B M 1 , связанного с доминантной формой инклюзионной миопатии, в настоящее время не­ известна.

1.8. Митохондриальные миопатии В отечественной литературе подробное описание митохондриальных болезней представлено в недавно вышед­ шем руководстве, посвященном наследственным болезням нервной системы (Вельтищев и др. 1998). Согласно данно­ му руководству, под митохондриальными болезнями пони­ мается «гетерогенная группа заболеваний, обусловленных генетическими, структурными и биохимическими дефекта­ ми митохондрий». В большинстве своем митохондриаль­ ные болезни носят синдромальный характер, при этом мышечная слабость часто занимает одно из ведущих мест в структуре синдромального поражения. Поэтому мы со­ чли возможным дать описание этих болезней в данной ча­ сти монографии. 147

Среди митохондриальных миопатии первоначально были выделены мегакониальная (MIM: 255140), плеокониальная (MIM: 262900) и гиперметаболическая (MIM: 238800) формы миопатии. В первом случае имеет место увеличе­ ние размеров митохондрий, во втором — их числа, в тре­ тьем — гиперактивность митохондриальных ферментов. Следует отметить, что при некоторых митохондриальных миопатиях у одного и того же больного увеличение числа митохондрий может сочетаться с увеличением их разме­ ров. Иногда митохондрии содержат аномальные квадриламинарные структуры. Клиническая картина митохондриальных миопатии скла­ дывается из слабости мышц, начинающейся с мышц тазово­ го пояса, и постепенной их атрофии. Для митохондриальных миопатии характерно медленно прогрессирующее течение. У больных может наблюдаться гипотония, гипорефлексия, за­ держка моторного развития, гепатомегалия, макроглоссия. Описаны ранние формы заболевания, напоминающие по кли­ ническому течению детскую спинальную амиотрофию Верднига-Гоффмана, обычно с летальным исходом. Митохондриальные миопатии могут проявлять себя клинически не толь­ ко синдромом миопатии с диффузной слабостью, но и при­ ступами, напоминающими пароксизмальный паралич. Отли­ чительной особенностью гиперметаболической миопатии (бо­ лезнь Люфта) являются помимо мышечной слабости такие симптомы, как диффузная потливость, полидипсия, астения с резко усиленным основным обменом при нормальной функ­ ции щитовидной железы. Митохондриальные миопатии могут спровождаться тремя типами нарушений на биохимическом уровне: (1) де­ фектами в утилизации субстратов, обусловленными недо­ статочностью карнитина, карнитин палмитоилтрансферазы (см. ниже) или различных компонентов пируват-дегидрогеназного комплекса; (2) дефектами в митохондриаль-

148

ной системе окислительного фосфорилирования, как в слу­ чае болезни Люфта или при недостаточности мтАТФазы и (3) дефектами в компонентах митохондриальной дыхатель­ ной цепи, таких как белок негемного железа (nonheme iron protein), цитохромоксидаза, цитохром р и NADH-CoQ-peдуктаза (Land et al., 1981). Наследственные формы митохондриальных миопатии не обязательно связаны с дефек­ тами в митохондриальной ДНК (мтДНК), а могут быть обус­ ловлены доминантными или рецессивными мутациями в аутосомных генах (Harding et al., 1988). В данном разделе мы остановимся на заболеваниях, обусловленных только генетическими дефектами митохондрий, и, кроме того, та­ ких, для которых проведена идентификация молекулярно­ го дефекта. В значительном проценте случаев при подоб­ ных митохондриальных болезнях наблюдается гетероплазмия, то есть сосуществование в клетках в различных про­ порциях мутантных и нормальных митохондрий. Это свя­ зано с особенностями репликации и сегрегации мтДНК.Уровень гетероплазмии в разных тканях одного и того же па­ циента может быть различен. Более 15 лет тому назад был полностью секвенирован митохондриальный геном, состоящий из 16 569 нуклеотидов и содержащий 22 гена транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белковых генов, кодирующих субъ­ единицы пяти комплексов окислительного фосфорилиро­ вания. 56 субъединиц этих комплексов кодируется ядер­ ными генами. 7 субъединиц NADH-дегидрогеназы комплек­ са I дыхательной цепи кодируются митохондриальными ге­ нами (MTND1 -7) и около 35 — ядерными. Три субъединицы (I-III) цитохромоксидазы С кодируется митохондриальной ДНК и десять — ядерной. На рис. 18 схематически пред­ ставлена организация митохондриального генома и указа­ ны мутации, идентифицированные у пациентов с различ­ ными типами митохондриальных болезней.

149

Рис. 18. Организация митохондриального генома с указанием мутаций, идентифицированных у пациентов с различными типами митохондриальных болезней Точковые мутации в митохондриальных генах MTND1-7 являются причиной развития синдрома Лебера — наследст­ венной атрофии зрительных нервов — LHON (MIM 535000). 150

Атрофия зрительного нерва при синдроме Лебера часто со­ четается с неврологической симпоматикой в виде ранней дистонии, периферической полиневропатии, тремора, атак­ сии. Заболеванию могут сопутствовать головные боли, сер­ дечная аритмия. Наиболее частыми при синдроме Лебера являются нуклеотидные замены в положениях 11778, 3460, 15257 и 14484 мтДНК. Эти мутации рассматриваются в каче­ стве первичных, и они обнаруживаются более чем у 90% па­ циентов с митохондриальной формой этого заболевания. Кроме того, описано около 20 других точковых мутаций в ге­ нах MTND1-7, которые также приводят к атрофии зрительно­ го нерва. Эти мутации рассматриваются в качестве вторич­ ных, так как при их сочетании с первичными мутациями фор­ мируется плейотропный фенотип синдрома Лебера. Другие мутации в мтДНК (делеций, дупликации, точко­ вые мутации), приводящие к дефициту одного или несколь­ ких ферментов в митохондриальной респираторной цепи, являются первичными молекулярными дефектами при раз­ личных наследственных болезнях, получивших название ми­ тохондриальных энцефаломиопатий (Shoffner, Wallace, 1995). Как правило, это мультисистемные заболевания с преиму­ щественным вовлечением в патологический процесс высо­ ко-аэробных, постмитотических тканей, таких как сердечная и скелетные мышцы, а также центральная нервная система. Точковые мутации в мтДНК, кодирующей тРНК, также явля­ ются частой причиной таких болезней. Более 25 мутаций за­ регистрировано в 10 из 22 митохондриальных генов тРНК (Wallace et al., 1995). Некоторые из этих мутаций связаны с неврологическими синдромами, такими как митохондриаль­ ные энцефаломиопатий включая лактоацидоз в сочетании с инсульт-подобными эпизодами — MELAS синдром; миоклонус-эпилепсия с «рваными» красными волокнами мышц, об­ разование которых обусловлено скоплением аномальных ми­ тохондрий по краю мышечного волокна — MERRF-синдром; прогрессирующая офтальмоплегия — СРЕО-синдром. Дру­ гие мутации в митохондриальных генах тРНК приводят к изо151

лированным миопатиям, кардиомиопатиям или мультисистемным заболеваниям. Некоторые специфические мутации свя­ заны с определенным клиническим фенотипом, тогда как другие мутации в разных семьях могут выражаться по-раз­ ному. Ген MTTL1, кодирующий лейциновую T PHK ( L e u ) ( U U R ) , яв­ ляется «горячей точкой» для подобных мутаций. По крайней мере 11 различных мутаций идентифицировано в этом гене у пациентов с MELAS-синдромом, прогрессирующей офталь­ моплегией, диабетом в сочетании с глухотой, с миопатией или кардиомиопатией. Примером может служить A3243G за­ мена в гене MTTL1. У 80% пациентов с MELAS-синдромом обнаруживается подобная мутация. При этом доля мутант­ ных митохондриальных геномов варьирует у пациентов от 56% до 95% и значительно выше,чем у здоровых родствен­ ников пробандов. В контрольных группах подобной мутации не обнаруживается. У ряда пациентов найдена мутация в положении 3271 того же гена. Мутации в этом митохондриальном гене обнаружены при ряде других заболеваний, та­ ких как MERRF синдром (С3256Т), кардиомиопатия с/или без слабости скелетной мускулатуры (A3260G, СЗЗОЗТ), митохондриальная энцефаломиопатия (С3252С) и диабет II типа в сочетании с нейросенсорной тугоухостью. В то же время в гене MTTL2, кодирующем другую лейциновую TPHK (Leu)(CUN) , описано всего несколько мутаций, в том числе G12315A, у пациента с прогрессирующей офтальмоплегией, слабостью конечностей, нейросенсорной тугоухостью и пигментной ре­ тинопатией, а также A12320G — у пациента с миопатией (Fuetal.,1996). Точные молекулярные основы подобных раз­ личий во взаимоотношениях генотип-фенотип остаются не­ понятными. Мутации в митохондриальном гене треониновой тРНК(ТГ1Г) в положении 15924 и 15923 обнаружены у пациентов, умер­ ших в первые дни после рождения от тяжелой дыхательной недостаточности, обусловленной лактоацидозом (Yoon et al., 1991). В другой семье наблюдали гомоплазмию по 15924 му­ тации у здоровой женщины и у ее сына, умершего в возрасте 152

4 месяцев от тяжелого лактоацидоза с выраженными дефек­ тами митохондрий в сердечной и в скелетных мышцах. Био­ химический, гистологический и клинический анализы не вы­ явили каких-либо аномалий у его матери (Zheng et al., 1989). Более того, подобная мутация обнаружена у 1 1 % нормаль­ ных доноров, тогда как 15923 мутация не найдена среди ев­ ропейцев, азиатов и африканцев (Brown et al., 1992). При молекулярном анализеЮ ядерных и 25 митохондриальных кандидатных генов у пациентов с недостаточностью цитохромоксидазы С были найдены мутации в гене сериновой TPHK (Ser)(UCN) в подгруппе больных с синдромальной энцефа­ лопатией (Jaksch et al., 1998). Потеря субъединиц цитохромоксидазы С, кодируемых митохондриальными генами, на­ блюдается при летальной кардиоэнцефаломиопатии новорож­ денных, а также при синдроме Лейгха — младенческой не­ кротической энцефалопатии (MIM 308930). Однако в послед­ них двух случаях первичный дефект связан с мутациями в ядерных генах, продукты которых участвуют в биогенезе ком­ плекса цитохромоксидазы С, — S C 0 2 и SURF1 соответст­ венно (Papadopoulou et al., 1999; Zhu et al., 1998). Недавно был разработан высокоэффективный метод, ос­ нованный на градиентном денатурирующем гель-электрофоре­ зе, позволяющий одновременно сканировать мутации во всех 22 митохондриальных генах тРНК и во фланкирующих облас­ тях, а также обнаруживать гетероплазмию (Sternberg et al., 1998). При анализе этим методом 35 пациентов с клиническим диа­ гнозом митохондриальной энцефаломиопатий у 25 были обна­ ружены мутации по крайней мере в одном из генов тРНК. Всего было выявлено 46 мутаций (41 замена нуклеоида, 4 коротких инсерции и одна небольшая делеция). 20 из этих мутаций были описаны впервые. По 40 мутациям наблюдалась гомоплазмия, по 6 — гетероплазмия. 22 мутации оказались локализованы в генах тРНК и 24 во фланкирующих районах, из них 12 мутаций в митохондриальных генах, кодирующих белки, 2 мутации в ге­ нах рибосомальной РНК и 10 — в некодирующих районах. Та­ ким образом, мутации в генах тРНК являются основной причи153

ной митохондриальных энцефаломиопатий и, как правило, по ним наблюдается гомоплазмия. Описано много случаев энцефаломиопатий, связанных с различными протяженными делециями и дупликациями митохондриальной ДНК. Среди них ведущее место занимает синдром Кернса-Сейра. Для подобных митохондриальных болезней характерна гетероплазмия, причем тяжесть тече­ ния заболевания, как правило, коррелирует с количеством мутантных митохондрий.

а) Миопатии митохондриальные с делециями и дупликациями митохондриальной ДНК (MIM: 550000,160550); синдром Кернса-Сейра (MIM: 530000) При исследовании 123 пациентов с различными митохондриальными миопатиями и энцефалопатиями у 32 были обнаружены делеции митохондриальной ДНК (рис. 18) в мы­ шечной ткани (Moraes et al., 1989). Величина этих делеций варьировала от 1.3 до 7.6 кб, 11 пациентов имели одинако­ вую делецию размером 4.9 кб. Впервые мутации в мтДНК были идентифицированы у пациентов с митохондриальной миопатией (Holt et al., 1988). При анализе 25 таких больных у 9 в мышечных клетках была обнаружена гетероплазмия, то есть существование двух популяций мтДНК — нормального размера и с делецией около 7 кб. В одной большой итальян­ ской семье с пятью больными с диагнозом митохондриаль­ ной миопатии, сочетающейся с катарактой (MIM: 160550) были обнаружены множественные делеции мтДНК, начало кото­ рых было локализовано в небольшой 12-нуклеотидной обла­ сти на 5' конце D-loop района — сайта активного взаимодей­ ствия ядерной и мтДНК (Zeviani et al., 1989). Анализ был про­ веден путем амплификации и секвенирования этой области мтДНК. Не исключено, что мутации в ядерных генах, контролиующих взаимодействие ядерной и мтДНК, могут приводить к специфическому наследуемому разрушению целостности митохондриального генома. 154

Различные делеций митохондриального генома были обнаружены в другой семье, где пробанд имел атаксию, эпи­ зодическую кетоацидозную кому и миопатию. При этом де­ леций обнаружены не только у пробанда, но и у его здоровой матери и у ее сестры (Cormier et al., 1991). Выявлен дефект окис­ лительного фосфорилирования в скелетных мышцах и в лим­ фоцитах больного. Все делеций локализованы между генами СОХ II и цитохрома р. Делеций наследуются по аутосомно-доминантному типу. Предполагается, что за митохондриальные делеций ответственен фактор, кодируемый ядерным геном, воз­ можно, приводящий к нарушениям в системе репарации. В одной финской семье с офтальмоплегией и миопати­ ей у 9 ее членов также были обнаружены делеций мтДНК различной протяженности (Suomalainen etal., 1992). Наиболь­ ший процент делетированной мтДНК найден в мозге, скелет­ ных мышцах и в сердце. Тяжесть течения заболевания кор­ релирует с количеством мутантной мтДНК. У некоторых па­ циентов с митохондриальными миопатиями присутствуют не делеций, а дупликации мтДНК (Poulton et al., 1988). Основной причиной развития синдрома Кернса-Сейра, характеризующегося прогрессирующей хронической офталь­ моплегией, пигментной дегенерацией сетчатки, кардиомипатией, а также дебютирующими в более позднем возрасте атак­ сией и мышечной слабостью, являются протяженные деле­ ций митохондриальной ДНК размером примерно от 2 до бо­ лее чем 7 кб (Zeviani et al., 1988; Johns et al., 1989; FischelGhodgian et al., 1992). При этом наблюдается выраженная гетероплазмия и доля мутантных мтДНК в мышечной ткани обычно варьирует в пределах от 45% до 75%. В фибробластах больных процент мутантных митохондрий значительно ниже. Делеций часто включают 8993 позицию мтДНК, явля­ ющуюся мутантным сайтом в гене АТФ-синтетазы комплек­ са V (МТАТР6) при NARP-синдроме (нейропатия, атаксия, пиг­ ментный ретинит — MIM: 551500 и 516060). Неожиданным оказалось то, что одна и та же делеция размером в 4977 нуклеотидов была идентифицирована при 155

двух очень разных митохондриальных болезнях: при синдро­ ме Кернса-Сейра и при синдроме Пирсона (MIM: 557000), ведущим симптомом которого является нарушение экзокринной функции поджелудочной железы (Fischel-Ghodgian et al., 1992). Однако процентное содержание делетированной мтДНК в разных тканях пациентов значительно различается при этих двух заболеваниях. В первом случае мутантная мтДНК преимущественно обнаруживается в мышцах и в ЦНС, тогда как ее распределение при синдроме Пирсона не имеет выраженной тканеспецифичности. Описаны случаи, когда у больных с клиническим диагнозом синдрома Пирсона появ­ ляются симптомы синдрома Кернса-Сейра. Показано, что в этих случаях у пациентов меняется характер гетероплазмии и мутантная мтДНК преимущественно локализуется в мышеч­ ных тканях. Таким образом, не столько размер делеций и их локализация в геноме митохондрий, сколько распределение мутантной мтДНК в разных тканях имеет критическое зна­ чение для клинического проявления последствий этих мута­ ций. У некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра иден­ тифицированы точковые мутации в генах тРНК, и в частнос­ ти в гене лейциновой тРНК (Leu>(CUN). Интересным представляется вопрос о причинах возник­ новения делеций в мтДНК. В ряде случаев делеции возника­ ют вследствие мутаций в ядерных генах и наследственная передача соответствующих заболеваний подчиняется зако­ нам Менделя. Однако возникновение других делеций может быть связано со структурными особенностями митохондриального генома. Так, показано, что у некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра точки разрывов делеций локали­ зованы внутри прямого канонического повтора длиной от 13 до 18 нуклеотидов, расположенного в различных районах митохондриального генома (Johns et al., 1989). Иногда ока­ зывается, что последовательности, граничащие с делециями, способны образовывать шпилечные структуры, что также рассматривается как фактор дестабилизации мтДНК. Выска­ зано предположение, что делеции в мтДНК являются резуль156

татом более сложных генетических перестроек (Poulton et al., 1994). Оказалось, что у многих пациентов с синдромом Кернса-Сейра в мтДНК наряду с делециями присутствуют опре­ деленные дупликации, причем эти дуплицированные облас­ ти часто отсутствуют у пациентов с прогрессирующей офталь­ моплегией (СЕРО). По-видимому, баланс между перестрой­ ками в мтДНК является центральным звеном в патогенезе этой уникальной группы заболеваний. Несмотря на то что в мышечной ткани пациентов с син­ дромом Кернса-Сейра процент мутантной мтДНК достаточ­ но высок, в культуре сателлитных клеток, полученных из биоптатов тех же самых мышц пациентов, мутантные митохон­ дрии обнаруживаются редко (Shoubridge et al. 1998). Выска­ зано предположение, что восстановление нормального гено­ типа мтДНК в мышцах больных может быть достигнуто путем стимуляции регенерации мышечных волокон, так как имен­ но сателлитные клетки ответственны за этот процесс. Для испытания этой гипотезы была проведена повторная биопсия одного и того же участка мышц больного с синдромом Керн­ са-Сейра. Оказалось, что в регенерирующих волокнах, обра­ зовавшихся после первой биопсии, наблюдается гомоплазмия по мтДНК дикого типа, тогда как в большинстве нерегенерирующих волокон процент мутантной мтДНК сохранется на прежнем уровне. Эти результаты позволяют надеяться на возможность улучшения функции мышц у подобных пациен­ тов путем инкорпорации сателлитных клеток в мышечные волокна.

1.9. Метаболические миопатии Наследственные дефекты различных мышечных фер­ ментов являются причиной развития относительно доброка­ чественных метаболических миопатии. В качестве примера мы рассмотрим миопатии, обусловленные недостаточностью мышечной фосфорилазы (болезнь Мак-Ардла), карнитин пальмитоилтрансферазы I, миоаденилат дезаминазы (миопатия Спряжения) и фосфоглицератмутазы. 157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, МакАрдла болезнь (MIM: 232600) Гликогеноз 5 типа, или болезнь Мак-Ардла, проявля­ ется уже в детском возрасте прогрессирующей мышечной слабостью, патологической утомляемостью мышц, а также болезненными тоническими судорогами, возникающими при утомлении. Тонические спазмы возникают чаще при физической нагрузке в условиях ишемии. Тоническое со­ кращение может быть генерализованным и сопровождать­ ся побледнением, сердцебиением, повышенным потоотде­ лением. Течение заболевания медленно прогрессирующее, приводящее к формированию мышечных контрактур. Био­ химической основой заболевания является дефицит мы­ шечной фосфорилазы, составляющей 5% всего раствори­ мого белка мышц. При этом мышечная фосфорилаза у ча­ сти больных может присутствовать, хотя активность ее, как правило, резко снижена. Найдена очень низкая концент­ рация пиридоксина в мышцах больных. Пиридоксинфосфат — ковалентно связанный кофактор гликогенфосфорилазы, одна молекула витамина связывается с лизиновым остатком каждой субьединицы фермента. Хромосомная принадлежность гена PYGM (ghosphorylase glycogen muscle) была установлена путем гибридизации геномной ДНК, изолированной из отдельных хромосом, с олигонуклеотидными ДНК-зондами, соответ­ ствующими карбокси-терминальному району мышечной фо­ сфорилазы. Хромосомы отбирали методом лазерного сортинга из клеточных линий, содержащих различные транс­ локации. Таким образом удалось показать, что ген PYGM расположен в 11-й хромосоме (Lebo et al., 1984). В даль­ нейшем локализация гена была уточнена методом сомати­ ческой гибридизации. При этом был использован набор кле­ точных клонов, содержащих различные терминальные де­ леции 11-й хромосомы. Метод флюоресцентной гибриди­ зации in situ позволил уточнить локализацию гена PYGM в проксимальном районе 11 q 13 (Lebo et al., 1990). Одновре158

менно из тканеспецифической экспрессионной библиоте­ ки генов мышц человека были выделены кДНКовые клоны мышечной фосфорилазы и с их помощью изолирована спе­ цифическая мРНК размером 3.4 кб (Gautron et al., 1987). Определена интрон/экзонная структура гена PYGM (Burko et al., 1987). ВЗ'-области гена PYGM найден полиморфизм по сайту рестрикции для M s p 1 , информативность которого оказалась достаточна для проведения пренатальной диа­ гностики в 7 5 % семей высокого риска. Затем были описа­ ны более информативные внутригенные мини- и микроса­ теллитные повторы, легкогенотипируемые методом ПЦР (Iwasaki et al., 1992). При гликогенозе 5 типа мРНК гена PYGM либо отсут­ ствует, либо ее содержание значительно снижено. В по­ следнем случае равмер транскрипта чаще всего нормаль­ ный. По-видимому, крупные делеций и другие структурные перестройки в области PYGM гена встречаются нечасто. При молекулярном обследовании 40 неродственных паци­ ентов с синдромом Мак-Ардла в гене PYGM были иденти­ фицированы 3 различные точковые мутации, одна нонсенс типа — R49X и 2 миссенс — G204S и K542W (Tsujino et al., 1993а). Все три мутации встречались неоднократно у раз­ ных пациентов и в разных сочетаниях. Нонсенс-мутация R49X, возникающая в результате замены тимина на гуа­ нин в 49-м кодоне первого экзона и приводящая к образо­ ванию стоп-кодона на месте аргинина в белке, оказалась наиболее мажорной. 18 пациентов из 40 исследуемых были гомозиготны по этой мутации. Две другие миссенс-мутации в экзонах 5 и 14 соответственно также могут быть от­ несены к классу мажорных. Так, 6 из 40 пациентов были компаунд-гетерозиготами по трем известным мутациям и у 11 пациентов был идентифицирован один из этих трех мутантных аллелей. Только у пяти больных мутации в PYGM гене не были обнаружены. В дальнейшем было идентифи­ цировано еще несколько точковых мутаций в гене PYGM у больных с синдромом Мак-Ардла (Tsujino et al., 1995). 159

б) М и о п а т и я с д е ф и ц и т о м к а р н и т и н п а л ь м и т о и л т р а н с ф е р а з ы I (MIM: 255110) Заболевание относится к группе метаболических ауто­ сомно-рецессивных миопатии с недостаточностью карнитин пальмитоилтрансферазы I — фермента энергетического ме­ таболизма, участвующего в митохондриальном бета-окисле­ нии длинноцепочечных жирных кислот путем их конъюгации с L-карнитином. Этот шаг необходим для прохождения жир­ ных кислот через мембрану митохондрий. При недостаточ­ ности фермента у больных наблюдаются мышечные боли в сочетании с миоглобинурией, часто индуцируемые физичес­ кими упражнениями, голодом или жирной пищей. В зависи­ мости от дебюта клинические проявления заболевания мо­ гут быть различными. Для взрослых пациентов характерны мышечная слабость с периодическими нарушениями поход­ ки, судорожные сокращения мышц (типа крампи), миоглобинурия. При дебюте заболевания в детском возрасте у боль­ ных развивается гипераммониемия, наблюдается повышен­ ный уровень сывороточных трансаминаз и свободных жир­ ных кислот плазмы, гепатомегалия, некетонная гипоглицемия и кома. Недостаточность по карнитин пальмитоилтрансферазе I — одно из немногих наследственных заболеваний, которые коррегируются диетой, содержащей среднецепочечные триглицериды. Клонирована и секвенирована полноразмерная кДНК гена СРТ1 (carnitine palmitoyltranferase I ) , кодирующая белок, состоящий из 658 аминокислот, включая 25 остатков лидерного МН2-пептида (Finocchiaro et al., 1991). С использовани­ ем кДНКовых зондов ген СРТ1 был картирован методами соматической гибридизации и флюоресцентной гибридиза­ ции in situ в области 1р13-р11 (Minoletti et al., 1992). Идентифицированы две мажорные миссенс мутации в СРТ1 гене у больных, страдающих недостаточностью карни­ тин пальмитоилтрансферазы I. Одна из них — замена С на Т в 439 положении, приводящая к замене серина на лейцин в 113 положении белка. Эта мутация обнаруживается у взрос160

лых пациентов с относительно поздним началом заболева­ ния (Taroni et al., 1993). Вторая мутация, найденная при дет­ ской форме заболевания, заключается в замене аргинина на цистеин в 631 положении белка (Taroni et al., 1992). Инте­ ресно отметить, что эта мутация часто обнаруживается в со­ четании с двумя другими мутациями в СРТ1 гене — G1203A и V368I, которые сами по себе не приводят к заболеванию, а являются относительно редкими формами полиморфизмов. Однако эти же полиморфные мутации с повышенной часто­ той встречаются и при взрослых формах заболевания. Повидимому, сами эти замены не инактивируют фермент, но способны усиливать эффект мутаций, повреждающих актив­ ность фермента.

в) Миопатия напряжения (MIM: 102770) Наследственная недостаточность АМФ-дезаминазы является причиной одной из форм миопатии напряжения, характеризующейся икроножными болями и слабостью верх­ них конечностей после упражнений. Миоаденилат дезаминаза, или аденозинмонофосфат (АМФ) дезаминаза, играет важ­ ную роль в пуриновом нуклеотидном цикле. Ее дефицит, повидимому, является наиболее общей причиной метаболиче­ ских миопатии у человека и особенно состояний, провоциру­ емых физической нагрузкой. Уровень фермента на порядок выше в скелетных мышцах, чем в других тканях. Обобщен­ ный опыт показывает, что в 1—2% исследуемых мышечных биоптатов наблюдается дефицит АМФ-дезаминазы. В норме активность АМФ-дезаминазы на 95% ингибируется ГТФ. Ге­ нетически детерминированное снижение чувствительности фермента к этому ингибированию, по-видимому, является основой развития наследственной первичной подагры. Тканеспецифические изоформы АМФ-дезаминазы об­ разуются за счет дифференциальной экспрессии двух генов в сочетании с альтернативным сплайсингом первичного транскрипта одного из этих генов. С использованием мето­ дов соматической гибридизации и гибридизации in situ ген

AMPD1 (adenosine monophosphate deaminase 1) локализован в области 1p21-p13 (Sabinaetal., 1990). Ген состоит из 16 эк­ зонов, расположенных в участке геномной ДНК размером 20 тысяч пар оснований. В 0.6—2% мРНК гена AMPD1, экспрессирующегося в скелетных мышцах взрослых, в резуль­ тате альтернативного сплайсинга отсутствует экзон 2. Одна­ ко образующаяся при этом делетированная форма фермен­ та функционально активна. У большинства пациентов с миопатией напряжения, обусловленной недостаточностью АМФ-дезаминазы, одновре­ менно присутствуют две мутации в гене AMPD1 в cis-положении (Morisaki et al. 1992). Одна из них — нонсенс-мутация в 12-м кодоне второго экзона, приводящая к преждевремен­ ной терминации синтеза фермента, что согласуется с отсут­ ствием иммунореактивных форм белка у обследованных па­ циентов. Вторая — миссенс-мутация в 48-м кодоне третьего экзона. Этот полиморфный мутантный аллель встречается с частотой 12% среди представителей белой расы, с частотой 19% среди американцев африканского происхождения и пол­ ностью отсутствует среди японцев. Популяционная частота этого аллеля может обьяснить 2% зарегистрированных слу­ чаев дефицита АМФ-дезаминазы в биоптатах мышц. Присут­ ствие в гомозиготном состоянии полиморфной миссенс-мутации у неродственных пациентов с недостаточностью АМФдезаминазы, одновременно гомозиготных по нонсенс-мута­ ции, по-видимому, является результатом «эффекта основате­ ля», приведшего к распространению в Западной Европе этой комбинации аллелей в гене AMPD1. Клиническая гетерогенность недостаточности АМФ-дезаминазы частично может быть свя­ зана с изменчивостью в характере сплайсинга первичного РНК транскрипта в скелетных мышцах (Morisaki et al., 1993).

г) Миопатия, обусловленная недостаточностью фосфоглицератмутазы (MIM: 261670) К основным клиническим признакам данной формы миопатии можно отнести следующие: мышечная слабость, 162

миалгия (часто по типу крампи), провоцируемая физически­ ми нагрузками, миоглобинурия, повышенная активность сы­ вороточной креатинкиназы, почечная недостаточность. Фосфоглицератмутаза — димер, две изоформы кото­ рого — медленно мигрирующая мышечная (М) и быстро миг­ рирующая мозговая (В) содержатся в различных тканях в разных пропорциях. Эти изоформы кодируются разными ге­ нами. Семейство включает также бифосфоглицератмутазу. Полноразмерная кДНК мышечной субъединицы фер­ мента клонирована (Shanske et al., 1987). Блот гибридизация по Саузерну геномной ДНК с кДНКовыми зондами выявила существование мультигенного семейства PGAM в геноме человека, причем в разных тканях происходит специфичес­ кая транскрипция различных PGAM генов. В-субьединица преимущественно экспрессируется в красных клетках кро­ ви, в печени и в мозге, тогда как М-субъединица — в мышцах и обе субъединицы экспрессируются в сердце. Ген мышеч­ ной фосфоглицератмутазы — PGAMM (gihosphoglycerate rnutase М) картирован в области 7р13-р12 (Mattei et al., 1989). Ген содержит 3 экзона, распределенных на площади 2.83 кб геномной ДНК. Бифосфоглицератмутазный (BPGM) ген кар­ тирован в области 7q22-q34 и имеет высокий процент гомо­ логии с PGAMM-геном и одинаковое количество и располо­ жение интронов. При сравнении генов, кодирующих мышеч­ ные ферменты, обнаружена консервативная последователь­ ность из 9 пар оснований в 5'-нетранслируемой области (GGGGCTGGG). По-видимому, эта последовательность свя­ зана с экспрессией мышечных ферментов. Идентифицировано три точечных мутации в PGAMMгене у больных с миопатией, обусловленной недостаточнос­ тью фосфоглицератмутазы (Tsujino et al. 1993). При этом одна из них — нонсенс-мутация в 78-м кодоне, преимущественно встречается среди пациентов афро-американского происхож­ дения. Первый зарегистрированный пациент европейского происхождения оказался гомозиготен по миссенс-мутации в 90-м кодоне гена PGAMM. 163

ГЛАВА 2 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МИОТОНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ 2.1. Общая характеристика В данной группе болезней мышц будут рассмотрены миотоническая дистрофия, миотония Томсена и периодичес­ кие параличи. Для всех заболеваний, включенных в группу миотоний, специфичен феномен миотонии, состоящий в не­ произвольном тоническом спазме мышц, возникающем вслед за резким произвольным сокращением. Расслабление насту­ пает лишь через несколько секунд (до 30 сек.). Описанный феномен типичен для начального («стартового») движения. Повторные сокращения этих мышечных групп совершаются с меньшим затруднением, а затем вообще нормализуются. Медленные, слабые движения, как правило, не сопровожда­ ются миотоническим спазмом. Периодические параличи характеризуются своеобраз­ ными клиническими проявлениями в виде внезапной, при­ ступообразной утраты способности производить активные движения. При этом мышцы утрачивают способность к со­ кращению. Страдает вся скелетная мускулатура. В зависи­ мости от содержания калия в сыворотке крови различают гипер-, гипои нормокалиемические формы заболевания. Следует подчеркнуть, что уровень калия в сыворотке крови меняется только во время пароксизма. При всех формах периодического паралича наблюдаются специфические из­ менения морфологии мышечной ткани в виде дегенерации центральной части миофибрилл с последующим образовани­ ем вакуолей. В табл. 10 представлена общая характеристика генов, ответственных за миотонические синдромы и периодические параличи. 165

Таблица 10 Молекулярно-генетическая характеристика миотонических синдромов и периодических параличей Нозологическая форма, MIM Миотоническая дистрофия, 160900

Белок, функции Ген, локализация миотонин-протеинкиназа DM, DMPK цАМФ-зависимая серии/ треонинкиназа +

DMAHP 19q13.2-q13.3 Миотония врожденная CLC1 Томсена, 160800; Беккера болезнь, 255700 5q12.2-q13 Паралич HYPP, периодический SCN4A гиперкалиемический II, 170500; парамиотония Эйленбурга, 168300; атипичные не индуцируемые холодом миотонии, 17q23.1-q25.3 168350; 170600 Паралич HOKPP, периодический CACNL1A гипокалиемический I, 1q31-q32 170400

гомеодоменны транскрипционный фактор хлорный канал скелетных мышц

натриевый канал тип 4, альфа

кальциевый канал 1_типа, альфа 1

С генетической точки зрения миотоническая дистро­ фия относится к группе болезней экспансии. Подобные за­ болевания обусловлены динамическими мутациями — уве­ личением (или экспансией) выше допустимого критичес­ кого уровня числа копий повторяющихся элементов в мес-

166

тах локализации микрои минисателлитных последователь­ ностей. Если подобные последовательности расположены в значимых областях генов, их экспансия может сопровож­ даться нарушением регуляции работы гена или образова­ нием аномального продукта, обладающего определенной агрессивной функцией по отношению к тем клеткам, в ко­ торых этот ген экспрессируется. И то и другое может явить­ ся причиной развития патологических процессов и реали­ зоваться в виде наследственных заболеваний. Подробная характеристика болезней экспансии будет представлена во второй части монографии. Миотонии, не сопровождающиеся мышечной дистро­ фией, и периодические параличи обусловлены мутациями в генах ионных каналов: в хлорном канале скелетных мышц при миотонии Томсена, в вольтаж-зависимых натриевом и кальциевом каналах L-типа при гипери гипокалиемических периодических параличах соответственно. Вольтаж-за­ висимые ионные каналы являются частью семейства мак­ ромолекул, функции которых включают контроль и поддер­ жание внутриклеточного электропотенциала, секрецию и сигнальную трансдукцию (Bulman, 1997). На рис. 19 изоб­ ражена структура трансмембранных вольтаж-зависимых калиевых и натриевых ионных каналов. Фундаментальной особенностью эволюционно родственного суперсемейст­ ва вольтаж-зависимых К+, Na+ и Са2+ каналов является присутствие ряда из шести трансмембранных сегментов (S1-S6), формирующих отдельный домен. Один такой до­ мен представлен в калиевых каналах и четыре подобных домена образуют альфа1 субъединицы натриевых и каль­ циевых каналов. Предполагается, что сегмент 4 обладает вольтаж-сенсорной функцией и в каждом третьем или чет­ вертом положении этого сегмента присутствует основная аминокислота. Отдельные каналы высококонсервативны. Кроме того, в различных ионных каналах также присутст­ вуют консервативные районы, что является признаком их эволюционно родственного происхождения.

167

Рис. 19. Структура трансмембранных вольтаж-зависимых ионных каналов Характерным для генов ионных каналов является то, что мутации, затрагивающие разные участки этих белков, могут приводить к такому различному течению заболева­ ний, что клинически они могут быть отнесены к разным нозологическим формам. Так, разные мутации в одном и том же гене, кодирующем альфа-субъединицу мышечного натриевого канала, могут быть причиной развития семи клинически самостоятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмальной миоплегии, парамиотонии и миотонии. Это в полной мере относится и к генам кальциевых каналов. Мутации в гене альфа-субъединицы кальциевого канала скелетных мышц являются п р и ч и н о й развития гипокалиемического периодического паралича. В то же в р е м я р а з н ы е м у т а ц и и в гене альфа1 А-субъединицы нейронального Са2+-канала P/Q-типа могут реализоваться в виде таких разных заболеваний, как спиноцеребеллярная атаксия типа 6, наследственная эпизодическая атаксия и семейная гемиплегическая мигрень. 168

2.2. Миотонические синдромы а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900) 1. Клиническая характеристика заболевания Клиническая картина миотонической дистрофии пред­ ставляет собой сочетание миотонии, миопатии, сердечно­ сосудистых нарушений и эндокринно-вегетативных расст­ ройств. Начало заболевания относится к детскому возрасту, хотя более типичен дебют на втором-третьем десятилетии жизни. Первая клиническая симптоматика определяется при­ знаками миотонического спазма и затруднения разгибания пальцев рук при резких, быстрых движениях. Симптом мио­ тонического «ровика», обусловленный повышенной механи­ ческой возбудимостью, легче получить на дельтовидной, ик­ роножной и мышцах языка. Течение болезни неуклонно про­ грессирующее. На фоне усиливающегося миотонического синдрома развивается мышечная слабость и атрофические проявления, сходные с миопатиями. Однако, в отличие от последних, формула распределения мышечной слабости иная. Слабеют мышцы лица, в частности круговая мышца глаза, мышца, поднимающая веко, жевательные мышцы, а также сгибатели шеи, плечелучевая и перонеальная на конечнос­ тях. Атрофии мышц ладоней приводят к своеобразной «обе­ зьяньей лапе». Мышечная слабость и атрофии возникают од­ новременно. Постепенно из-за снижения мышечной силы миотонический синдром становится менее ярким. Глубокие рефлексы постепенно снижаются и в дальнейшем угасают. Достаточно типично наличие катаракты, та или иная степень интеллектуальной недостаточности. Нередко миотонической дистрофии сопутствуют различные эндокринные и вегетатив­ ные нарушения. В разных популяциях заболевание встречается с час­ тотой 1 на 8—40 тысяч, наследуется по аутосомно-доминантному типу и характеризуется высокой пенетрантностью му­ тантных аллелей и феноменом антиципации — более ран169

ним началом и нарастанием тяжести симптомов заболева­ ния в семье в последующих поколениях. Мужчины болеют в три раза чаще женщин. 2. Картирование и идентификация гена DM Ген м и о т о н ч е с к о й д и с т р о ф и и DM ( d y s t r o p h i a myotonica) — один из первых аутосомных генов человека, для которого методами генетического анализа была иденти­ фицирована группа сцепления (Eiberg et al., 1983; O'Brien et al., 1983). Он расположен в области 19q13.2-q13.3 и его бли­ жайшими проксимальными маркерами являются гены аполипопротеина С2 (АРОС2) и мышечной креатинкиназы (СКММ) (Harley et al., 1991). Микросателлитный маркер D19S63 наиболее информативен для проведения пренатальной и досимптоматической диагностики миотонической дис­ трофии (Cobo et al., 1992). Ген миотонческой дистрофии со­ стоит из 15 экзонов, распределенных на площади в 13 кб ге­ номной ДНК. Эта область ДНК полностью просеквенирована (Shaw et al., 1993; Mahadevan et al., 1993). Ген DM активно экспрессируется во всех типах мышечных клеток, а также в других тканях, дефектных при миотонической дистрофии, в частности в мозге и в сердце. Обнаружено несколько раз­ личных изоформ мРНК гена DM в мышцах плода и новорож­ денных, что доказывает возможность альтернативного сплай­ синга первичного РНК-транскрипта. 3. Молекулярная природа мутаций в гене DM Как мы уже отмечали, миотоническая дистрофия отно­ сится к группе так называемых болезней экспансии, так как в подавляющем большинстве случаев молекулярной основой заболевания служат значительные экспансии числа копий тринуклеотидного CTG-повтора, расположенного в З'-нетранслируемой части гена DM. Впервые предположение о моле­ кулярных основах заболевания было высказано после обна­ ружения у больных с миотонической дистрофией необычно­ го рестрикционного EcoRI-фрагмента, гибридизующегося с 170

одним из геномных ДНК-зондов, изолированных из области локализации гена DM (Harley et al., 1992). При проведении с использованием этого зонда блот гибридизации по Саузерну в норме обнаруживаются два рестрикционных фрагментам то время как у большинства пациентов один из этих фраг­ ментов замещен на более крупный. Размеры этого необыч­ ного фрагмента могут варьировать у разных пациентов и даже в тех случаях, когда больные принадлежат одной семье. На­ блюдается достоверная положительная корреляция между тяжестью течения, а также более ранним началом заболева­ ния и длиной этого фрагмента. Одновременно методами по­ зиционного клонирования был идентифицирован микросателлитный CTG-повтор, локализованный в З'-нетранслируемой области гена DM. Длина этого повтора оказалась значитель­ но больше у больных с миотонической дистрофией (Brook et al., 1992). Этот повтор при рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI попадал именно в тот из фрагментов, гибридизующихся с использованным ДНК-зондом, длина кото­ рого оказывалась большей у больных. Таким образом, была расшифрована природа необычного рестрикционного EcoRIфрагмента. Изолированный CTG-повтор в популяции также отли­ чается крайней нестабильностью — количество копий в кла­ стере варьирует от 5 до 30—37 При этом для многих популя­ ций характерен двухвершинный характер распределения ал­ лелей. Так, в отечественных популяциях доминируют аллели с 5 (42.5%) и с 11—13 (37%) повторами (Малышева и др., 1998). Однако у больных с миотонической дистрофией мини­ мальное количество триплетов значительно больше и состав­ ляет не менее 50 при наиболее мягких формах болезни, от 100 до 1000 у пациентов с классическим течением и с дебю­ том во взрослом возрасте, в то время как при врожденных формах заболевания количество CTG-триплетов может до­ стигать трех тысяч. Определение размера CTG-повтора методами ПЦР или блот-гибридизации по Саузерну позволяет проводить прямую 171

молекулярную диагностику миотонической дистрофии. Око­ ло 90% хромосом с экспансированными CTG-повторами в отечественных популяциях имеют одинаковый гаплотип по двум внутригенным полиморфным сайтам рестрикции. Этот же гаплотип характерен для 9 1 % хромосом с CTG(5) и для подавляющего большинста хромосом с CTG(15) (Малышева и др., 1998). Интересно отметить, что транскрибируемый не­ стабильный CTG-(5-30) мотив в З'-нетранслируемой области гена DM обнаружен только в геноме человека, несмотря на то что фланкирующие нуклеотиды присутствуют в гомологич­ ном гене мыши. Недавно в геноме человека был идентифицирован еще один нестабильный патогенетический транскрибируемый, но не транслируемый CTG-повтор (Koob et al., 1999). Этот по­ втор расположен в области 13q21, и его экспансия является причиной развития одной из генетических форм спиноцеребеллярной атаксии (SCA8). Это неожиданная находка, так как до сих пор все доминантные спиноцеребеллярные атаксии были связаны с экспансиями CAG-повторов, кодирующих полиглютаминовые треки, входящие в состав различных бел­ ков. Удлиненные полиглютаминовые треки способны изби­ рательно индуцировать образование устойчивых к протеолизу ядерных агрегатов в определенных типах нейронанальных клеток, чаще всего в клетках Пуркинье мозжечка. Накопле­ ние подобных ядерных включений оказывает цитотоксический эффект и является причиной развития специфических нейродегенеративных процессов, приводящих к различным формам спиноцеребеллярных атаксий. Очевидно, что пато­ генетический механизм действия экспансированного нетранслируемого CTG-повтора при форме 8 спиноцеребеллярной атаксии совершенно иной и он, по-видимому, сходен с меха­ низмом действия таких же динамических мутаций при мио­ тонической дистрофии. Для этих двух заболеваний характе­ рен сопоставимый уровень экспансий CTG-повтора и очень высокая митотическая и мейотическая нестабильность экспансированных повторов, особенно заметная при прохожде172

нии мутантного аллеля через женский гаметогенез. Эти осо­ бенности отличают форму 8 от других типов спиноцеребеллярных атаксий. Различия в фенотипических проявлениях экспансий CTG-повторов, приводящих к таким клинически разным заболеваниям, как миотоническая дистрофия и спиноцеребеллярная атаксия, обусловлены особенностями функ­ ционирования тех генов, работа которых нарушается вслед­ ствие возникновения этих мутаций. 4. Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM Итак, мутационным механизмом миотонической дистро­ фии является амплификация CTG-повтора в З'-нетранслируемой области гена DM. По-видимому, начальным предраспо­ лагающим к мутационному событию фактором служит пере­ ход от аллеля с пятью CTG-повторами к аллелям, состоящим из 19—30 триплетов. Популяционная частота этого гетеро­ генного класса аллелей — (CTG)-19—30 — достигает 10% и, по-видимому, эти аллели составляют резерв для повторных мутаций. У больных отмечается также черезвычайно высо­ кая соматическая нестабильность CTG-повтора (Ashizawa et al., 1993), что согласуется сданными о различном характере экспансии у некоторых однояйцовых близнецов (Fu et al., 1992). В эмбриональном периоде подобная нестабильность особенно заметна между 13 и 16 неделями беременности. Наибольшая экспансия характерна для сердечной мышцы, при этом степень гетерогенности не коррелирует с началь­ ной величиной экспансированного CTG-повтора (Martorell et al., 1995). В отличие от мышц, в клетках перифирической кро­ ви больных наблюдается большая нестабильность (CTG)-noвтора в сторону его экспансии (Martorell et al., 1995). Даль­ нейший анализ нестабильности CTG-повтора, проведенный на протяжении 1—7 лет на клетках крови 111 пациентов с варьирующим течением миотонической дистрофии, показал прямую зависимость уровня гетерогенности от времени и на­ чальной длины повтора (Martorell et al., 1995). Не исключено, что определенный вклад в формирование соматического мо173

заицизма вносят индивидуальные генетические факторы, а также факторы окружающей среды. Хорошо прослеживаемой клинической особенностью болезней экспансии, и в частности миотонической дистро­ фии, является антиципация. Расшифрована молекулярная природа этого явления. Оказалось, что аллели, связанные с относительно небольшими экспансиями CTG-повтора, при которых отсутствуют или наблюдаются лишь слабые клини­ ческие проявления заболевания, обладают высокой мейотической нестабильностью. Их прохождение через гаметогенез сопровождается дальнейшим значительным нарастанием числа триплетов в нестабильных повторах и в следствие это­ го более резким снижением функции соответствующего гена (Buxton et al., 1992). Еще одной особенностью наследования бопезней экспансии является геномный импринтинг — раз­ ное течение заболевания в зависимости от того, получил боль­ ной мутантный аллель от матери или от отца. Так, при миото­ нической дистрофии амплификация CTG-области встречается в материнском гаметогенезе значительно чаще, чем в отцов­ ском. Это особенно справедливо для тяжелых врожденных форм заболевания. В опытах in vitro с использованием геномных клонов, содержащих локус DM с экспансированными CTG-повторами, исследовали роль одного из ключевых ферментов репа­ рации — мутазы S2 (продукта гена MSH2), в нестабильности тринуклеотидных повторов, ответственных за целый ряд тя­ желых нейродегенеративных болезней (Pearson et al., 1997). Оказалось, что мутаза S2 способна специфическим образом связываться со структурами, образованными смещением комплементарных нитей ДНК в области локализации таких повторов и, таким образом, может принимать участие в их экспансии. 5. Биохимическая характеристика продукта гена DM Ген миотонической дистрофии кодирует белок, получив­ ший название миотонин-протеинкиназы — Mt-PK, и поэтому 174

ген DM обозначается иногда как DMPK (dystrophia myotonica grotein kinase). Этот белок (Mt-PK), состоящий из 624 амино­ кислот, относится к семейству серин/треонин протеинкиназ, родственных цАМФ-зависимым протеинкиназам (Fu et al., 1992). Молекулярный вес полноразмерной изоформы Mt-PK, транслируемой с первого AUG-кодона гена DMPK, составля­ ет 72 кД (Timchenko et al., 1995). Наиболее консервативен каталитический домен этого белка, содержащий специфиче­ скую киназную и нуклеотид-связывающую конценсусные по­ следовательности. Значительно менее консервативен боль­ шой N-терминальный домен. Промежуточный домен с высо­ ким содержанием альфа-спиралей имеет небольшое сходст­ во с филаментными белками. По-видимому, миотонин-протеинкиназа, подобно другим протеинкиназам данного типа, играет критическую роль в регуляции клеточной дифферен­ цировки и в репликации ДНК, а сам ген DMPK имеет функ­ ции рецессивного супрессора опухолей. Это согласуется с данными о повышенной частоте у пациентов с миотоничес­ кой дистрофией пиломатриксом (опухолей тканей, производ­ ных нервного гребня), паратиреоидных аденом и небольших карцином кишечника (Harris et al., 1996). С использованием набора моноклональных антител на каталитический и альфа-спиральный домены Mt-PK в скелет­ ных мышцах человека обнаружены три изоформы миотонинпротеинкиназы — основная с м.в. 55 кД и минорные с м. в.72 и 80 кД (Pham et al., 1998). 5 типов антител на каталитичес­ кий и 5 на альфа-спиральный домены идентифицировали толь­ ко минорные изоформы, причем 72-кД белок присутствовал во всех исследованных тканях, тогда как 80-кД изоформа белка с варьирующей экспрессивностью обнаруживалась главным образом в скелетных мышцах и в интеркалярных дисках сердечной мышцы. Два типа моноклональных анти­ тел на каталитический домен обнаруживали только мажор­ ную 55-кД изоформу белка, присутствующую исключительно в скелетных мышцах. Ни один из типов моноклональных ан­ тител не подтвердил ко-локализации Mt-PK с ацетилхолино175

выми рецепторами в нейромышечных соединениях. Метода­ ми субклеточного фракционирования и седиментационного анализа показано, что основная часть Mt-PK в скелетных мышцах и в мозге имеет цитозольную локализацию. 6. Молекулярные основы патогенеза миотонической дистрофии У больных, по крайней мере со взрослой формой забо­ левания, наблюдается уменьшение экспрессии гена DMPK как на уровне мРНК, так и на белковом уровне (Fu et al., 1993). В опытах, проведенных на культурах клеток, показа­ но, что в соматических гибридах, содержащих 19-ю хромосо­ му с экспансированным CTG-повтором, снижен синтез пер­ вичного РНК-транскрипта гена DMPK и нарушен его процессинг (Carango et al., 1993). Наиболее вероятным представля­ ется, что экспансия CTG-повтора влияет не на транскрип­ цию как таковую, а на посттранскрипционную модификацию мРНК гена DMPK. Обнаружение повышенных уровней удли­ ненных транскриптов гена DMPK в ядрах клеток пациентов с миотонической дистрофией позволяет предполагать возмож­ ность нарушения каких-то этапов процессинга мутантного первичного РНК-транскрипта, таких как полиаденилирование или транспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Wang et al., 1995b; Taneja et al., 1995). Доминантный характер наследования миотонической дистрофии, по-видимому, связан с дефици­ том дозы зрелого продукта гена DMPK. Не исключено, что повышение количества или активности миотонин-протеинкиназы может оказывать терапевтический эффект на взрос­ лых пациентов. Однако в целом данные по влиянию экспансированного CTG-повтора на экспрессию гена DMPK носят противоречивый характер. Более привлекательной кажется другая гипотеза, каса­ ющаяся молекулярных механизмов патогенного действия динамических мутаций при миотонической дистрофии. По­ казано, что экспансированные CTG-повторы формируют на­ иболее сильные из известных естественных элементов ук176

ладки нуклеосом (Wang, Griffith, 1995). При этом эффектив­ ность образования нуклеосом возрастает с увеличением дли­ ны повтора. Можно предположить, что экспансированные блоки повторов способны менять локальную структуру хро­ мосом, что, в свою очередь, может сопровождаться наруше­ нием экспрессии DMPK и/или других близко расположенных генов. Это предположение нашло экспериментальное под­ тверждение. Так, недалеко от CTG-повтора была идентифи­ цирована последовательность, гиперчувствительная к дей­ ствию ДНКазы I. При обработке ДНКазой I нормальной ДНК в этом сайте происходит разрыв. Однако мутантные после­ довательности ДНК с большими экспансированными CTGповторами оказываются устойчивы к действию фермента (Often, Tapscott, 1995). Наиболее простым объяснением дан­ ного феномена является то, что увеличение длины CTG-по­ втора в гене DMPK нарушает локальную структуру хромати­ на, вследствие чего этот гиперчувствительный сайт стано­ вится недоступен для действия ДНКазы I. Предложены и не­ которые другие гипотезы для объяснения механизма повреж­ дающего действия экспансированного CTG-повтора. В опытах in vitro идентифицирована группа белков, спо­ собных специфически связываться с CTG-повторами, нахо­ дящимися как в однонитевой, так и в двунитевой форме (Yano Yanagisawa et al., 1995; Richards et al., 1993; Timchenko et al., 1996). При этом белки, связывающиеся с двунитевыми зон­ дами, имеют, как правило, ядерную локализацию. Кроме того, обнаружен цитоплазматический белок, специфически взаи­ модействующий с РНКовыми CUG-триплетами — CUG-BP (Timchenko et al., 1996). Возможно, именно этот белок вовле­ чен в патогенез миотонической дистрофии. Несмотря на значительные успехи в расшифровке при­ роды мутаций при миотонической дистрофии, остается неяс­ ным, происходит ли дисфункция или приобретение новой функции гена DMPK на уровне взаимодействия ДНК со струк­ турой хроматина и/или на уровне регуляции процессинга пер­ вичного РНК-транскрипта. По-видимому, в разных тканях

12 Заказ № 170

177

определяющими могут быть различные нарушения, которые в комплексе и формируют плейотропный фенотип заболевания. 7. Характеристика других генов, участвующих в патогенезе миотонической дистрофии Сложность клинического фенотипа миотонической дистрофии в сочетании с противоречивыми данными, ка­ сающимися действия GTG-экспансии на экспрессию DMPK локуса, привели к необходимости исследования соседних генов, которые могут быть вовлечены в этиологию заболе­ вания. Область локализации гена DMPK насыщена актив­ но транскрибирующимися последовательностями. У чело­ века, так же как и у мыши, в непосредственной близости от гена DMPK в проксимальной области расположен ак­ тивный ген — DMR-N9, обозначаемый иногда геном 59 — рис. 20 (Jansen et al., 1992; Jansen et al., 1995). Этот ген экспрессируется главным образом в мозге и в testis. Функ­ ция белкового продукта DMR-N9 неизвестна. Высказано предположение, что экспансия CTG-повтора влияет на аль­ тернативную экспрессию генов DMPK и DMR-N9.

Рис. 20. Структурная организация DM-района Более вероятным представляется участие в контро­ ле м и о т о н и ч е с к о й дистрофии гена DMAHP (dystrophia myotonica associated homeodomain protein) (или STX5), pac-

178

положенного в непосредственной близости с З'-конца от DMPK и кодирующего так называемый DM-ассоциированный гомеодоменный белок. DMAHP экспрессируется во многих типах тканей, включая скелетные мышцы, фибробласты, лимфоциты, сердце и мозг. Известно, что родст­ венные гомеодоменные белки дрозофилы являются транс­ крипционными факторами, регулирующими экспрессию генов как на транскрипционном уровне, так и на уровне трансляции посредством их связывания с ДНК и/или с РНК соответственно. CTG-повтор локализован внутри CpG-ocтровка в З'-нетранслируемой области гена DMPK, и не ис­ ключено, что разрушение этого элемента за счет экспан­ сии повтора может нарушать экспрессию ассоциирован­ ного с этим островком гена(ов). Ранее идентифицирован­ ный гиперчувствительный сайт для ДНКазы I почти цели­ ком расположен в промоторной области этого гена и изме­ нения в этом сайте, вызванные экспансией CTG-повтора, могут изменять экспрессию DMAHP. Это предположение было подтверждено при обнаружении в этом сайте энхансера, регулирующего транскрипцию DMAHP (Klesert et al., 1997). При анализе экспрессии DMAHP в клетках пациентов с миотонической дистрофией, в которых отсутствует гипер­ чувствительный сайт ДНКазы I, обнаружено 2—4-кратное снижение устойчивых DMAHP-транскриптов по сравнению с контролем, причем уровень снижения коррелирует с дли­ ной экспансированного повтора. Не исключено, что нару­ шение работы двух соседних генов DMPK и DMAHP фор­ мирует сложный фенотип миотонической дистрофии. 8. Модельные линии животных Предположение об участии нескольких соседних ге­ нов в контроле миотонической дистрофии согласуется с данными по трансгенному разрушению гомологичного гена Dmpk у мышей. У нулевых мутантов ( Dmpk(-/-)) 72-кД изоформа миотонин-протеинкиназы полностью отсутствует. У таких животных в позднем возрасте развивается прогрес-

179

сирующая миодистрофия с патологическими чертами, сход­ ными с теми, которые характерны для пациентов с мягким течением миотонической дистрофии (Jansen et al., 1996; Reddy et al., 1996). У взрослых особей наблюдаются ульт­ раструктурные изменения в мышцах, варьирующая вели­ чина мышечных волокон, с повышенной частотой дегене­ рации и фиброзов. Частота дегенерирующих волокон у взрослых мутантов повышена на 5 0 % по сравнению с мо­ лодыми животными. У мышей с гиперэкспрессией DM-npoтеинкиназы, полученных путем трансгеноза нормального гена DMPK человека в ранние зародыши Dmpk(-/-) мутан­ тов, развивается изолированная гипертрофическая кардиомиопатия, несмотря на то что 72-кД изоформа миотонинпротеинкиназы присутствует в большом количестве. Одна­ ко во всех подобных моделях отсутствуют ведущие симп­ томы миотонической дистрофии, включая атрофию мышеч­ ных волокон, миотонию, катаракту и мужское бесплодие. Эти результаты показывают, что продукт гена DMPK необ­ ходим для поддержания нормальной структуры и функцио­ нирования скелетных мышц. Однако инактивация или из­ менение характера экспрессии DMPK-гена не являются единственными критическими условиями, необходимыми для развития заболевания. В опытах на трансгенных животных показано, что вве­ дение геномных областей, содержащих районы DM локуса человека с экспансированным CTG-повтором, не приво­ дит к фенотипу, сходному с миотонической дистрофией. Однако в соматических и зародышевых клетках трансген­ ных мышей наблюдается гипермутабильность введенного повтора как в сторону экспансий, так и в сторону делеций (Gourdon et al., 1997; Monckton et al., 1997). При этом не­ стабильность была умеренной при введении 45-кб конст­ рукции, включающей наряду с мутантным геном DMPK с 55 CTG-повторами два фланкирующих гена — DMR-N9 и DMAHP. Значительно более выраженная мутабильность наблюдалась в трансгенных линиях мышей, полученных в 180

результате введения в ранние зародыши З'-нетранслируемой области DMPK с более длинным повтором, состоящим из 162 триплетов. Для этих линий характерны также эф­ фекты, связанные с родительской передачей мутантного аллеля и нарушением сегрегации. Половые и межлиней­ ные различия в мутационной активности указывают на су­ ществование в геноме человека d s n trans-действующих генетических элементов, модулирующих устойчивость этой области. Показано, что соматическая нестабильность CTGповтора увеличивается с возрастом трансгенных живот­ ных, но не зависит от тканеспецифического уровня транс­ крипции любого из трех генов — Dmahp, Dmpk и Dmr-n9, а также не зависит от пролиферативной способности различ­ ных тканей (Lia et al., 1998).

b) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь Беккера (MIM: 255700) Врожденная миотония Томсена — относительно ред­ кое заболевание, встречающееся с частотой 0.3—0.7 на 100 000. Начальные симптомы болезни могут относиться как к раннему детству (1—3 года), так и к школьному воз­ расту (8—10 лет). Нередко начальные признаки болезни просматриваются родителями ребенка, так как он не все­ гда может ощутить недостаток своей моторики. К ранним симптомам относится болезненное сведение икроножных мышц при охлаждении и мышечной нагрузке. Первыми страдают мышцы нижних конечностей, затем к ним присо­ единяются верхние, могут вовлекаться в процесс жеватель­ ные мышцы, мышцы языка, шеи. Весьма специфичен симп­ том повышенной мышечной механической возбудимости: миотонический «ровик», который возникает в мышце при нанесении удара молоточком. Особенно хорошо феномен «ровика» выражен при ударе молоточком по мышцам язы­ ка. Своеобразен внешний вид больного, обусловленный хо­ рошо развитой мышечной системой, что придает телосло­ жению черты атлетического. При этом у больных опреде-

181

ляется мышечная слабость. Сухожильные рефлексы обыч­ но снижены, может наблюдаться их миотоническая харак­ теристика. Течение заболевания медленно прогрессирую­ щее. Больные приспосабливаются к своему дефекту и при правильной профессиональной ориентации приобретают специальность и социально адаптируются. Витальный про­ гноз благоприятный. Врожденная миотония включает аутосомно-доминантную форму — болезнь Томсена, и аутосомно-рецессивную форму — болезнь Беккера. Согласно классификации Беккера, выделяют пять различных типов доминантных миотоний (Becker, 1977). Тип I — классическая болезнь Томсена. Тип II характеризуется мышечными болями и флюктуирующим те­ чением. При типе III заметна миотоническая чувствительность к холоду, особенно круговой мышцы глаза и круговой мышцы рта. Эта форма отличается от врожденной парамиотонии от­ сутствием холод-индуцируемого паралича. Тип IV характери­ зуется промежуточным течением и меньшей вовлеченнос­ тью мышц лица. Тип V — изолированная перкуссионная мио­ тония языка. Считается, что рецессивная форма врожден­ ной миотоний — болезнь Беккера, встречается чаще и про­ текает тяжелее, чем форма Томсена. Как правило, эта фор­ ма диагностируется в возрасте 4—12 лет, причем у мальчи­ ков еще позднее — до 18 лет. Болезнь дебютирует с пораже­ ния мышц нижних конечностей, достигая через несколько лет верхних конечностей, мышц лица, включая жевательную му­ скулатуру. Чувствительность по отношению к холоду менее выражена, чем при доминантной форме заболевания. Описание генетической линии мышей ard, являющей­ ся естественной моделью врожденной миотоний, способ­ ствовало идентификации гена человека, ответственного за миотонию Томсена. Оказалось, что у мутантных мышей от­ сутствует мембранный белок мышц, выполняющий функ­ ции хлорного канала. Примечательно, что и у пациентов с врожденной миотонией значительно снижена хлорная про­ водимость в сарколемме биоптатов межреберных мышц. 182

Ген, кодирующий главный хлорный канал скелетных мышц млекопитающих, был клонирован в 1991 году (Steinmeyer et al., 1991а). У мышей ген хлорного канала С1с-1 локали­ зован в хромосоме 6 в районе, синтенном области 7 q 3 1 q35 генома человека. Показано, что в линии ard произош­ ло разрушение мышиного гена С1с-1 в результате внедре­ ния в кодирующую область транспозоно-подобного элемен­ та семейства ETn (Steinmeyer et al., 1991b). Таким обра­ з о м , было доказано, что дефект хлорного канала мышц является первичным в патогенезе данной формы миото­ нии у мышей. Вслед за этим, по гомологии с геном главно­ го хлорного канала скелетных мышц крысы, из экспрессионной библиотеки мышц человека был изолирован кДНКовый клон, содержащий около 8 0 % кодирующей последо­ вательности соответствующего гена человека — CLC1 (С! channel 1) (Koch et al., 1992). Методом соматической гиб­ ридизации ген CLC1 был картирован в области 7q32-qter. С учетом описанных выше обстоятельств был выпол­ нен анализ сцепления врожденной миотонии в семьях с доминантной и рецессивной формами заболевания с вы­ сокополиморфными динуклеотидными повторами гена Тклеточного рецептора В (TCRB), локализованного в длин­ ном плече хромосомы 7 (Adballa et al., 1992). Оказалось, что оба мутантных гена THD (Thomsen disease) и MCR (myotonia congenita, recessive), ответственных за форму Томсена и Беккера соответственно, картируются в том же районе 7 q 3 1 , где расположен гена муковисцидоза — CFTR. Ген CFTR кодирует белок, также являющийся хлорным ка­ налом. Этот белок участвует в регуляции хлорного потока через апикальные мембраны эпителиальных клеток. Од­ нако было показано, что миотония Томсена и Беккера не связаны с мутациями в гене CFTR. Этот ген расположен по отношению к генам THD и MCR на расстоянии более 24 сМ. В настоящее время можно считать доказанным, что обе формы заболевания являются аллельными варианта­ ми и обусловлены мутациями в гене хлорного канала ске-

183

летных мышц — C L C 1 . При рецессивных формах функция этого хлорного канала полностью иьактивирована. Доми­ нантный эффект мутаций при болезни Томсена обьясняется гомомультимерной структурой канала, при которой субъ­ единица, кодируемая мутантным аллелем, связывается с функциональной субъединицей, кодируемой нормальным аллелем, и таким образом ее инактивирует. В 15% хромосом пациентов с болезнью Беккера об­ наруживается миссенс-мутация в гене CLC1, вызванная T-G трансверсией и сопровождающаяся заменой фенилаланина на цистеин в трансмембранном домене D8 хлорно­ го канала. Эта мутация может быть легко диагностирова­ на методом рестрикционного анализа (Koch et al., 1993). Описаны и другие рецессивные миссенс-мутации в гене CLC1 — V236L, G285E, I556N (Kubisch et al., 1998). При болезни Томсена также были идентифицированы миссенсмутации в гене C L C 1 . Первая из HVX — G-A транзиция, сопровождающаяся заменой глицина на глютаминовую кислоту в 180 позиции белка (George et al. 1993). Во всех известных белках, функционирующих как хлорные каналы, положение этого глицина консервативно, что указывает на его функциональную значимость. Затем была описана це­ лая серия других доминантных миссенс-мутации — V286A, F307S, А313Т (Kubisch et al., 1998). Анализ экспрессии мутаций на модельной системе Xenopus показал, что доминантные мутации сдвигают воль­ таж-зависимость хлорного канала в сторону положитель­ ных потенциалов. Подобный сдвиг сохраняется и для гетеромерных каналов, образующихся из мутантных и нормаль­ ных субъединиц и присутствующих у пациентов с болезнью Томсена. Этим и объясняется доминантно-негативный эф­ фект подобных мутаций. Рецессивные мутации также сдви­ гают чувствительность хлорного канала в сторону положи­ тельных значений. Однако в этом случае при ко-экспрессии в системе in vitro мутантных и нормальных аллелей гена CLC1 подобного сдвига в работе хлорных каналов не на184

блюдается. Таким образом, вольтаж-зависимость гетеромерных хлорных каналов далеко не всегда занимает про­ межуточное положение между значениями, характерны­ ми для соответствующих гомомерных каналов, и это хоро­ шо коррелирует с уровнем пенетрантности и характером наследования различных форм врожденных миотонии.

2.3. Периодические параличи Периодические параличи представляют собой группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в генах вольтаж-зависимых ионных каналов.

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа (MIM: 170500; 168300; 168350; 170600) Гиперкалиемическая форма пароксизмальной миоплегии возникает при повышении уровня сывороточного калия. Начало заболевания относится к первому пятилетию жизни. Приступам мышечной слабости могут предшествовать ощу­ щения тяжести в конечностях. Пароксизм миоплегии разви­ вается в течение нескольких минут и длится на протяжении 30 минут. Более продолжительные приступы встречаются редко. В миоплегический синдром может включаться мими­ ческая и артикуляционная мускулатура. В отличие от гипокалиемического пароксизма, при гиперкалиемическом при­ ступы возникают днем. Голодание, переохлаждение, физи­ ческое переутомление способствуют возникновению мио­ плегии. Провоцировать приступ может прием внутрь раство­ ра хлористого калия. В редких случаях уровень экстракле­ точного калия поднимается настолько высоко, что могут воз­ никнуть кардиологические проблемы. Частота приступов сни­ жается у пациентов, достигших 35—40-летнего возраста. Вы­ деляют три типа адинамического эпизода: в комбинации с миотонией, без каких-либо признаков миотонии и в комби­ нации с парамиотонией. Ранее последнюю форму обознача­ ли в качестве самостоятельной нозологической единицы —

185

врожденной парамиотонии Эйленбурга. В тяжелых случаях продолжительность эпизодов параличей может достигать нескольких месяцев. При снижении частоты параличей на­ блюдается тенденция к прогрессирующей миопатии. В опытах in vitro было показано, что небольшое увели­ чение содержания внеклеточного калия может оказывать триггерный эффект на тетродотоксин-чувствительный натри­ евый канал в дефектных мышцах больных, страдающих гиперкалиемическими параличами в сочетании с миотонией (Lehmann-Horn et al., 1987). В норме эти концентрации калия могут быть недостаточны для переключения канала. Ген альфа-субъединицы мышечного натриевого канала взрослых SCN4A— (sodium channel 4 alpha) картирован в длинном пле­ че хромосомы 17 в области 17q23.1-q25.3 (Fontaine etal., 1990; George et al., 1991). Он распределен на площади в 35 кб ге­ номной ДНК и кодирует белок размером в 1836 аминокислот (Wang et al., 1992; George et al., 1992). При генетическом анализе семей с гиперкалиемическими параличами было показано тесное сцепление, а чаще полное отсутствие рекомбинации, между мутантным геном HYPP (hyperkalemic geriodic paralysis) и ДНК-маркерами, расположенными в непосредственной близости или внут­ ри гена SCN4A(Ptacek et al., 1991; 1992; Koch et al., 1991; McClatchey et al., 1992). Подтверждением того, что гиперкалиемические периодические параличи и врожденная парамиотония Эйленбурга являются аллельными заболе­ ваниями, обусловленными генетическими нарушениями работы натриевого канала мышц, явилась молекулярная идентификация мутаций в гене SCN4A. В настоящее вре­ мя у пациентов с гиперкалиемическими параличами иден­ т и ф и ц и р о в а н ы 4 р а з л и ч н ы е м и с с е н с - м у т а ц и и в гене SCN4A, две из которых — Т704М и M1592V, по-видимому, являются мажорными (Ptaceketal., 1991; McClatchey et al., 1992; Feero et al., 1993). Кроме того, описано 10 миссенсмутации у пациентов с парамиотонией Эйленбурга и все

186

они приводят к заменам аминокислот либо в четвертом домене белка, либо в области между шестым сегментом третьего домена и четвертым доменом (Lehmann-Horn et al., 1993). Интересно отметить, что мутации в гене SCN4A, идентифицированные при холод-индуцируемой врожденной парамиотонии, являются первыми температур-чувствительными мутациями у человека, описанными на молекуляр­ ном уровне. Врожденную парамиотонию без холод-индуцируемых параличей также выделяли раньше в самостоятельную группу. Однако обнаружение у подобных пациентов из Гер­ мании однотипной миссенс-мутации в гене SCN4A—V1293I явилось доказательством аллельной природы данной фор­ мы заболевания, парамиотонии Эйленбурга и гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Koch et al., 1995). Аллельными вариантами являются также атипичные не холод-индуцируемые миотонии — флюктуирующая, перма­ нентная и ацетозольамид-чувствительная, так как при каж­ дом из этих заболеваний описаны различные миссенс-му­ тации в гене SCN4A. Недавно показано, что некоторые формы гипокалиемических периодических параличей так­ же могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Bulman, 1997). Таким образом, различные мутации в одном и том же гене SCN4A могут быть причиной развития семи клинически самосто­ ятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмаль­ ной миоплегии, парамиотонии и миотонии. На рис. 21 по­ казана локализация идентифицированных у пациентов с перечисленными выше типами заболеваний миссенс-мутаций в гене SCN4A, приводящих к аминокислотным заме­ нам в различных доменах натриевого канала мышц. Моле­ кулярный анализ причин наблюдаемой фенотипической изменчивости является основой для физиологического анализа функционирования данного ионного канала.

187

Рис. 21. Распределение мутаций в альфа-субъединице натриевого канала скелетных мышц при различных формах наследственных параличей и парамиотоний Имеется аутентичная модель гиперкалиемического периодического паралича на определенной породе лоша­ дей (Quarter), одним из определяющих свойств которых является гипертрофия мускулатуры. При этом описана миссенс-мутация в гомологичном гене натриевого канала мышц, частота которой среди данной породы лошадей до­ стигает 3 0 % (Rudolph et al., 1992).

б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа (MIM: 170400) Наиболее часто встречается гипокалиемическая пароксизмальная миоплегия или гипокалиемический перио­ дический паралич. Начало заболевания колеблется от 3 до 20 лет, чаще это второе десятилетие жизни. Приступы ми-

188

оплегии обычно возникают утром или ночью. Проснувшись, больной не в состоянии совершить активное движение. Реже плегия носит характер не общий, а гемипаретический, то есть имеет место очаговая слабость. Парезы носят признаки периферических. Снижается мышечный тонус, угасают глубокие рефлексы. Чувствительность не претер­ певает каких-либо нарушений. Длительность миоплегии от нескольких часов до 3—4 суток. Сознание никогда не утрачивается. Выход из миоплегии происходит посте­ пенно, начиная с дистальных отделов к о н е ч н о с т е й . В к а ч е с т в е факторов, провоцирующих п а р о к с и з м г и п о к а лиемической миоплегии, называют прием обильной пищи, богатой углеводами, переохлаждение, физичес­ кие н а г р у з к и . Для м у ж ч и н характерна полная пенетрантность, тогда как вероятность проявления заболевания у женщин составляет лишь 5 0 % . Анализ сцепления мутантного гена с микросателлитными ДНК-маркерами, проведенный в семьях различного этнического происхождения с гипокалиемическим перио­ дическим параличом, позволил локализовать ген НОКРР (hypokalemic periodic garalysis) в длинном плече хромосо­ мы 1 в области 1q31-q32 (Fontaine et al., 1994). В этой же районе расположен ген CACNL1 A3 (Са cannal, type LJ_, alpha 3), кодирующий альфа-субъединицу дигидропиридин-чувствительного кальциевого канала скелетных мышц. Предпо­ ложение об идентичности генов НОКРР и CACNL1A3 на­ шло подтверждение при обнаружении у пациентов с гипокалиемической пароксизмальной миоплегией трех различ­ ных миссенс-мутаций в гене CACNL1A3 (Ptaceket al., 1994; Jurkat-Rott et al., 1994). Однако не во всех семьях с гипо­ калиемическим периодическим параличом прослеживает­ ся сцепление мутантного гена с маркерами длинного пле­ ча хромосомы 1 (Plassart et al., 1994). Как уже указыва­ лось, в одной из семей обнаружена новая миссенс-мута­ ция в гене SCN4A, затрагивающая высококонсервативный остаток в вольтаж-чувствительном сегменте S4 альфа-субъ189

единицы натриевого канала скелетных мышц (Bulman, 1997). Таким образом, некоторые формы этого заболева­ ния могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии.

в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа (MIM: 170600) Нормокалиемическая форма миоплегии начинается в первом десятилетии жизни. Тяжесть миоплегического паро­ ксизма весьма вариабельна, включение при пароксизме жевательной и мимической мускулатуры непостоянно. Уро­ вень калия в сыворотке крови во время приступа миопле­ гии, до и после него не отклоняется от нормы. Клиническая картина характеризуется довольно типичными миоплегическими пароксизмами, длительность которых составляет от нескольких часов до нескольких недель. При электронно-ми­ кроскопическом анализе скелетных мышц больных наблю­ дается расширение саркоплазматического ретикулума. Дан­ ная форма является наиболее редкой. Наследуется заболе­ вание по аутосомно-доминантному типу. Локализация мутантного гена пока неизвестна.

ГЛАВА 3 БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА 3 . 1 . Общая характеристика В данную группу заболеваний включены проксималь­ ные детские спинальные амиотрофии, спинально-бульбарная мышечная атрофия позднего возраста, или болезнь Кенне­ ди, наследственные полинейропатии и боковой амиотрофический склероз. Общая молекулярно-генетическая характе­ ристика этих болезней представлена в табл. 11. Таблица 11 Молекулярно-генетическая характеристика болезней с преимущественным поражением периферического двигательного неврона Нозологическая форма, Ген, MIM локализа­ ция SMN1 Спинальная амиотрофия, тип I, болезнь Верднига-Гоффмана, 253300; тип II, хроническая, + 253550; NAIP тип III, болезнь Кугельберга-Веландер, 253400 +

Белок, функции

белок выживания двигательных нейронов - белок РНП-комплекса, участвующий в метаболизме и процессинге мРНК +

ингибитор нейронального апоптоза

белок сплайсинга H4F5 5q12.2-q13

Спинально-бульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди); синдром тестикулярной феминизации, 313200 Болезнь Шарко-Мари-Тус тип 1 В, 118200;159440; синдром Дежерин-Сотта, 145900 Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IА, 118220; синдром Дежерин-Сотта, 145900 Нейропатия наследственная со склонностью к парезам, 162500 Болезнь Шарко-Мари-Тус Х-сцепленная, 302800; 304040 Боковой амиотрофически склероз, 105400

Продолжение табл. 11 андрогеновый рецептор

AR

Xq11-q12 СМТ1В, MPZ, МРР, 1q23-q25 СМТ1А, РМР22

17р11.2 HNPP, РМР22

главный структурный белок периферического миелина Р(0)

Ртр-22 - интефальный белок компактного миелина периферической нервной системы

периферический белок миелина 22

17р11.2 СМТХ1, СХ32

коннексин 32

Xq13-q21 ALS1, SOD1

Cu/Zn-супероксид-дизмутаза

21q22.1-q22.2

Клинически выделяют три типа спинальной мышечной атрофии. Первый тип детской спинальной амиотрофии — бо­ лезнь Верднига-Гоффмана, II тип — хронический или промежу­ точный и III тип — болезнь Кугельберга-Веландер. Оказалось, что клинически гетерогенная группа проксимальных детских спинальных амиотрофии представляет собой аллельные вари­ анты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных ге­ нов, локализованных в необычной чрезвычайно нестабильной области генома человека, получившей название SMA (spinal

192

muscular atrophy) области. SMA-область в длинном плече хро­ мосомы 5 размером около 850 кб характеризуется присутстви­ ем различных повторяющихся низкокопийных элементов, мно­ жественных копий отдельных генов, необычных экспрессируещихся интрон-содержащих псевдогенов, функциональные копии которых разбросаны по всему геному. Около 93% больных со спинальной мышечной атрофией любого типа несут гомозиготные делеций в гене выживания двигательных нейронов — SMN1, расположенном в SMA-области. Остальные пациенты содержат подобные делеций в гете­ розиготном состоянии, при этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо сплайсинговые мутации, либо миссенс-мутации, локализованные, как правило, в З'-конце гена SMN1. Белок выживания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в ядрах клеток, причем ядерная форма белка найдена в структурах, ассоциированных с гетерогенными ядер­ ными рибонуклеопротеиновыми частицами, предположительно участвующими в метаболизме и процессинге мРНК. Мутантные формы белка утрачивают способность к олигомеризации. Наличие гомозиготных делеций или повреждающих мута­ ций в SMN1 является необходимым, но недостаточным услови­ ем для развития болезни, так как в небольшом проценте случа­ ев гомозиготные делеций в гене SMN1 присутствуют у асимптоматичных родственников больных. В непосредственной близо­ сти от SMN1 идентифицированы еще три гена, часто вовлекае­ мые в делеций у пациентов с различными формами спинальных амиотрофий. По-видимому, два из них имеют отношение к патогенезу заболевания. Это ген ингибитора нейронального апоптоза — NAIP — и ген H4F55. Продукт гена H4F55, так же как белок выживания двигательных нейронов, ко-локализован с малыми ядерными рибонуклеопротеиновыми комплексами, участвующими в процессе сплайсинга. Гены NAIPn H4F55 делетированы соответственно у 50% и у 90% больных с I типом за­ болевания. Нельзя исключить вклад в патогенез спинальной мышечной атрофии и экспрессирующегося гена SMN2, гомоло­ гичного SMN1 и также расположенного в SMA области.

Согласно современным представлениям, для развития спинальной мышечной атрофии необходима утрата или му­ тационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1, NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоя­ нии мутаций (обычно — делеций) в гене SMN1, при этом раз­ личия между клиническими формами спинальной мышечной атрофии определяются тремя основными факторами: нали­ чием или отсутствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных мутаций, существование которых в настоя­ щее время не может быть исключено) и числом центромерных копий гена SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае болезни II и III типа). По некоторым оценкам, до 30% взрослых форм спинальных мышечных атрофии не связаны с мутациями в SMA-области. Особенно отчетливо отсутствие такой связи просле­ живается на аутосомно-доминантных вариантах заболевания. Среди них мышечная атрофия Шарко-Мари-Тус, обозначае­ мая также как дистальная наследственная моторная нейропатия типа II (MIM 158590). Ген НММ2,ответственный за это заболевание картирован в длинном плече хромосомы 12 в области 12q24e 13-сМ интервале между маркерами D12S86 и D12S340 (Timmerman et al., 1996). К спинальным мышечным атрофиям позднего возрас­ та относится болезнь Кеннеди — спинально-бульбарная мы­ шечная атрофия. Это сцепленное с полом нейродегенеративное заболевание обусловленно увеличением длины микросателлитного CAG-повтора, расположенного в гене адренорецептора(АР) и кодирующего цепочку из полиглютаминов. Подробная молекулярно-генетическая характеристика подоб­ ных заболеваний, относящихся к группе болезней экспансии, будет представлена во второй части монографии. Для болез­ ней, вызванных экспансией CAG-повтора, характерна мед­ ленно прогрессирующая деградация нейронов в специфиче­ ских отделах мозга. Дегенеративным процессам предшест­ вует накопление в ядрах нейронов нерастворимых устойчи­ вых к протеолизу белковых агрегатов. Наличие подобных 194

ядерных и/или цитоплазматических включений доказано в отношении по крайней мере шести подобных заболеваний, включая спинально-бульбарную мышечную атрофию. Эти образования, состоящие из гранул и филамент, окрашивают­ ся специфическими антителами только на те участки соот­ ветствующих белков, которые содержат полиглютаминовые треки. По-видимому, процессинг мутантных белков при бо­ лезнях, вызванных экспансией CAG-повтора, сопровожда­ ется образованием укороченных фрагментов с удлиненны­ ми полиглютаминами, способных транспортироваться в ядра и накапливаться там в составе белковых агрегатов. Ядерные включения окрашиваются также антителами наубикитин, что доказывает их устойчивость к убикитин-опосредованному протеолизу. Накопление подобных агрегатов в нейрональных клетках индуцирует апоптоз и является одной из основных при­ чин развития специфических нейродегенеративных процессов. Наследственные полинейропатии включают в себя раз­ личные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Дежерин-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа за­ болеваний со сходной клинической картиной. Перонеальная мышечная атрофия, — или болезнь Шарко-Мари-Тус, — наи­ более распространенная наследственная периферическая нейропатия у человека. Известны аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и сцепленные с полом формы забо­ левания. Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейропатии с аутосомно-доминантным характером наследова­ ния. При II типе полинейропатии с аутосомно-доминантными и аутосомно-рецессивными формами наследования болезнь дебютирует в более позднем возрасте. Ill аутосомно-доминантный тип наследственной сенсорной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Дежерина-Сотта. Выде­ ляют также моторные и сенсорные нейропатии с Х-сцепленным доминантным и рецессивным типом наследования. Молекулярный анализ показал, что существуют две генетические формы заболевания со сходной клинической картиной полинейропатии I типа — 1А и 1В. Более чем в 195

половине случаев болезнь развивается вследствие гипер­ продукции интегрального мембранного белка компактного миелина периферической нервной системы, получившего название Р т р - 2 2 — периферический миелиновый белок22. Гиперпродукция белка происходит вследствие дупли­ каций области локализации гена РМР22, присутствующих у 7 0 — 9 0 % пациентов с типом IA болезни Шарко-Мари-Тус. Таким о б р а з о м , это заболевание является уникальным случаем наследуемой частичной трисомии, при которой идентифицирован главный и, возможно, единственный ген, связанный с данной патологией. В гораздо более редких случаях у пациентов обнаруживаются гетерозиготные му­ тации в гене РМР22, также приводящие к клинике мотор­ ной и сенсорной нейропатии I типа. Интересно отметить, что гипопродукция периферического миелинового белка22, происходящая вследствие делеции области локализа­ ции гена РМР22, является причиной другой формы доми­ нантной нейропатии с в о з м о ж н ы м р а з в и т и е м парезов вследствие сдавления ствола нерва. Вторая генетическая форма полинеропатий I типа — IB связана с дефектами главного структурного белка пе­ риферического миелина — Р(0). Р(0) составляет более 5 0 % всего белка, присутствующего в оболочках периферичес­ ких нервов. В центральной нервной системе Р(0) не обна­ ружен. Это интегральный мембранный белок, связываю­ щий соседние ламеллы посредством гомофильных взаимо­ действий, что обеспечивает компактизацию и стабилиза­ цию всего миелинового комплекса. Большинство мутаций, идентифицированных у пациентов с формой IB болезни Шарко-Мари-Тус, сопровождаются заменой или потерей одной из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), иг­ рающем значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. В то же время синдром Дежерина-Сотта не явля­ ется генетически самостоятельной нозологической фор­ мой, а представляет собой аллельные варианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1А и 1В. 196

Из всех доминатно наследуемых форм болезни ШаркоМари-Тус около 2 0 % составляет II тип нейрональной поли­ нейропатии, также представляющий генетически гетероген­ ную группу заболеваний. II тип болезни Шарко-Мари-Тус вклю­ чает по крайней мере четыре формы — 2A-2D. Несмотря на клиническое сходство аксональных и нейрональных форм заболевания, между ними, по-видимому, существуют фунда­ ментальные различия, поскольку СМТ2-гены не является аллельными вариантами ни одного из СМТ1-генов, картиро­ ванных к настоящему времени. Х-сцепленная доминантная форма болезни ШаркоМари-Тус обусловлена мутациями в гене бета коннексина 32 (Сх32), активно экспрессирующемся в периферической нерв­ ной системе. Коннексины участвуют в образовании межкле­ точных каналов за счет совмещения мембранных пор. По этим каналам может осуществляться прямой обмен неболь­ шими молекулами и ионами между соседними клетками и роль таких контактов особенна важна в синаптической передаче. Недавно было показано, что наследственные дефекты дру­ гих бета коннексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных форм изолированной нейросенсорной тугоухости. В связи с этим уместно вспомнить, что тугоухость как симптом часто входит в комплекс невральной полинейропатии. Идентификация других генов, ответственных за наслед­ ственные формы полинейропатии, пока не проведена, одна­ ко не исключено, что один из аутосомно-рецессивных вари­ антов болезни Шарко-Мари-Тус связан с дефектом белка 2 периферического миелина. Последним из заболеваний в этой главе мы рассмотрим боковой амиотрофический склероз, который в 10% случаев носит семейный характер с чертами аутосомно-доминантного наследования с неполной пенетрантностью. В значительном проценте семейных случаев заболевания первичным биохими­ ческим дефектом оказывается Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза (СОД1). Предложено несколько возможных механиз­ мов для объяснения патогенного действия мутаций в гене SOD1 197

и избирательной гибели двигательных нейронов при семейном боковом амиотрофическом склерозе. Наиболее вероятным кажется предположение о том, что дестабилизация конформационной структуры мутантной СОД1 сопровождается ее агре­ гацией и формированием комплексов, преципитирующих в дви­ гательных нейронах. Такая возможность не исключена, если учесть, что Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза относит­ ся к числу мажорных белков, составляющих от 0.5% до 1 % всех цитоплазматических белков нейронов. Более того, в астроцитах и клетках Шванна спинного мозга некоторых пациентов, умерших от бокового амиотрофического склероза, обнаружи­ ваются внутриклеточные включения, подобные тельцам Леви, обладающие СОД1 -иммунореакгивностью. Эти находки позво­ ляют предполагать единый патогенетический механизм для та­ ких разных заболеваний, как боковой амиотрофический скле­ роз, болезни мышц, обусловленные накоплением цитоплазма­ тических и/или ядерных включений, нейродегенеративные за­ болевания, вызванные экспансией полиглютаминового трека, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, прионовые болез­ ни. Данную проблему мы предполагаем обсудить более подробно в заключительной, пятой части монографии.

3.2. Спинальные мышечные атрофии Наследственно обусловленное поражение мышечной си­ стемы вторичного характера, возникающее в результате денервационного процесса, относят к группе мышечных атрофии. Денервация при спинальных амиотрофиях происходит на уров­ не моторных клеток передних рогов спинного мозга или в соче­ тании с их аналогами — двигательными ядрами черепных нер­ вов. Отмеченная локализация патологического процесса обус­ ловливает развитие вялых параличей, составляющих основу клинического синдрома. Детские спинальные мышечные атро­ фии в зависимости от особенностей клинических проявлений и преимущественной локализации параличей делят на прокси­ мальные и дистальные. Более редкая детская дистальная спинальная амиотрофия в настоящей работе не обсуждается в связи с отсутствием сведений о характере молекулярного дефекта. 198

Достаточно изученной и более многочисленной явля­ ется группа проксимальных детских спинальных амиотрофий. Выделяют три типа детских спинальных амиотрофий. Все три типа объединяет аутосомно-рецессивный характер наследо­ вания, локализация патологического процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга, симметричные пе­ риферические параличи конечностей, прогрессирующее те­ чение болезни, ранняя инвалидизация и летальный исход, обусловленный вовлечением в процесс мышечной системы, обеспечивающей дыхание. Дети, страдающие спинальными амиотрофиями, отличаются нормальным интеллектом. Параклинические методы, используемые для диагнос­ тики заболевания и определения уровня поражения перифе­ рического отдела нервной системы, дают сходные результа­ ты. Исследование мышечных биотоков (ЭМГ-показатели) чет­ ко определяют локализацию процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга. Учитывая системность про­ цесса, любая из исследуемых скелетных мышц обнаружива­ ет специфические изменения. Данные мышечной биопсии указывают на характерную для спинального процесса пучко­ вую мышечную атрофию. Биохимические исследования, на­ правленные на определение активности сывороточных фер­ ментов, участвующих в мышечном метаболизме, определя­ ют вторичный характер поражения скелетных мышц.

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия КугельбергаВеландер (MIM: 253400) 1. Клиническая характеристика заболевания Общая частота спинальных мышечных атрофии —1 на 6—10 тысяч новорожденных. Распространенность заболева­ ния: от 2 до 3.3 на 100 000 населения. Частота гетерозигот­ ного носительства:1 на 40—60. Это второе после муковисци199

доза наиболее частое сублетальное моногенное заболева­ ние с аутосомно-рецессивным типом наследования. Извест­ ны ранние формы, проявляющиеся с рождения, а также состо­ яния, симптомы которых возникают в более поздний период с относительно мягким прогрессированием. Особенности клини­ ки детской спинальной амиотрофии хорошо представлены в оте­ чественной литературе (Савельева—Васильева,1972). Различают три типа спинальной мышечной атрофии. Первый тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Верднига-Гоффмана. В связи с быстрым прогресси­ рованием заболевание получило название «острая форма детской спинальной амиотрофии». Иногда ее называют «ран­ няя или врожденная детская спинальная амиотрофия». Пер­ вые признаки болезни могут проявить себя уже во внутриут­ робном периоде недостаточно активным шевелением плода. В этих случаях мышечная слабость и гипотония отмечаются с первых дней жизни. Неврологический статус ребенка укла­ дывается в широкое понятие «вялый ребенок», не ограни­ ченное спинальной амиотрофией. Как правило, с первых дней жизни вялые парезы всей поперечно-полосатой мускулату­ ры (мышцы шеи, туловища, конечностей) снижают физиоло­ гическую мышечную гипертонию конечностей, обусловлива­ ют угнетение рефлексов новорожденных. Даже жизненно важные защитный и сосательный рефлексы могут быть сни­ жены или отсутствовать. Своеобразна поза больного. Она напоминает позу лягушки. Верхние конечности отведены в плечевых суставах, слегка согнуты в локтевых и пронированы в лучезапястных. Нижние конечности отведены в тазобе­ дренных суставах, согнуты в коленных и голеностопных. Сто­ пы согнуты, отведены. Грудная клетка обычно деформирова­ на. Она имеет вид «колокола» — верхняя апертура умень­ шена в размере, нижняя расширена. Типична деформация грудины. Она может иметь килевидную или воронкообраз­ ную форму. Мышечный тонус диффузно снижен, активные движения конечностей ограничены. Ограничение касается как проксимальных, так и дистальных отделов. Нет четкой 200

диссоциации между парезами верхних и нижних конечнос­ тей. Парезы всегда симметричны. Пассивно поднятые конеч­ ности падают. При пассивном удержании ребенка в верти­ кальном положении отсутствует опора на нижние конечнос­ ти. Лежа на спине больной ребенок никогда не принимает типичную для раннего возраста позу с поднятыми вверх ниж­ ними конечностями. Глубокие рефлексы — коленные и ахил­ ловы, как правило, отсутствуют. Если сохраняются рефлек­ сы на верхних конечностях, то они бывают очень низкими. Мышечные атрофии при достаточно хорошо развитом под­ кожном жировом слое могут быть не видны. Мышечная сла­ бость распространяется и на дыхательную мускулатуру. Ос­ лабление функции межреберных мышц и диафрагмы в ка­ кой-то мере компенсируется активным участием в дыхании мускулатуры живота. Включение в патологический процесс диафрагмы ведет к ослаблению экскурсии грудной клетки. Полный паралич диафрагмы обуславливает парадоксальное дыхание и угрожает жизни ребенка. Характерен тихий голос пациентов. Вовлечение в процесс двигательных ядер череп­ но-мозговых нервов затрудняет акт сосания. Отчетливее других можно наблюдать поражение XII пары, в виде атро­ фии языка и фибриллярных подергиваний. Недостаточная функция мимической мускулатуры находит свое выражение в своеобразном «кукольном» лице ребенка. Психическое раз­ витие не страдает. Течение болезни носит неуклонно прогрес­ сирующий характер. Иногда кратковременная остановка на­ растания параличей ошибочно принимается за улучшение. Темпы моторного развития резко отстают от нормаль­ ных критериев. Дети плохо удерживают голову. Не способны самостоятельно поворачиваться в постели, вставать на ноги и стоять. В тех случаях, когда ребенок сидит, будучи поса­ женным, он опирается на руки, а позвоночник кифозируется. Деформация позвоночника в начале болезни ликвидиру­ ется при изменении позы. В дальнейшем же сколиоз, кифоз, кифосколиоз грудного и поясничного отделов становятся фиксированными. Продолжительность жизни больных неве201

лика. Обычно они погибают на первом гс>ДУ жизни. Причиной смерти является дыхательная недостаточность на фоне по­ вторных пневмоний и ателектазов. ИВЛ продлевает жизнь на короткое время. Следует отметить, что хорошие условия жизни, тщательный уход за больным ребенком способны про­ длить его жизнь на месяцы, но не на годы. II тип детской спинальной амиотрофии именуется хро­ ническим или промежуточным. Его отличают чуть более позднее начало, относительно медленное прогрессирование, лучшая жизнеспособность и ряд клинических призна­ ков. Внутриутробное развитие плода не вызывает беспо­ койства. Шевеление, как правило, наступает своевремен­ но и продолжается достаточно активно на протяжении всей беременности. Дети рождаются доношенными. В периоде новорожденное™ и в первое полугодие ж и з н и темпы пси­ хомоторного развития соответствуют возрастным критери­ ям. Доречевое развитие оказывается нормальным. Пер­ вые признаки болезни в виде мышечной слабости возни­ кают постепенно и не всегда сразу улавливаются родите­ лями. Начало болезни следует отнести к 6—14 месяцам жизни и крайне редко позднее. Можно отметить опреде­ ленную последовательность в развитии парезов. Сперва страдают проксимальные отделы нижних конечностей, а затем в процесс вовлекаются верхние конечности, муску­ латура шеи и туловища. Преимущественное поражение ног остается на протяжении всей жизни пациента. В типичном случае начало заболевания относится ко второму полуго­ дию первого года ж и з н и . Ребенок утрачивает те движения, которые он ранее выполнял без труда. Так, если он само­ стоятельно садился, вставал на ноги, переступал, то эти функции, требующие хорошей мышечной силы, постепен­ но утрачиваются, и новые не приобретартся. В начальном периоде болезни атрофии не определяРтся, костные де­ формации не выражены. Глубокие рефлексы снижаются. Вначале угасает коленный рефлекс. На первый план вы­ ступает мышечная слабость и гипотония. В тех случаях, 202

когда ходьба возможна (самостоятельная или с посторон­ ней помощью), походка раскачивающаяся, с опорой на вну­ тренние поверхности стоп. Бег невозможен. В разверну­ том периоде болезни клиническая симптоматика становит­ ся выраженной и достаточно стандартной. Заболевание носит системный характер — страдает симметрично вся поперечно-полосатая мускулатура. Однако преимущест­ венное поражение определенных мышечных групп созда­ ет типичные деформации конечностей, грудной клетки, по­ звоночника. Так, в нижних конечностях отмечаются сгибательные контрактуры в тазобедренных и коленных, разгибательные и отводящие в голеностопных суставах. Нижние конечности принимают вид Х-образных. На верхних конеч­ ностях из-за контрактур ограничивается разгибание пред­ плечья и супинация кисти. Слабость мышц спины ведет к деформации позвоночника в виде кифосколиоза, иногда с ротаторным компонентом. Грудная клетка принимает фор­ му воронкообразной, реже — килеобразной («куриной»). Весьма характерным клиническим п р и з н а к о м является тремор верхних конечностей, усиливающийся при актив­ ных движениях. Тремор может быть выражен очень слабо, и его не всегда замечают родители. В этом периоде болез­ ни дети не способны ходить, садятся с посторонней помо­ щью, опора на ноги отсутствует. Мышечные атрофии ста­ новятся отчетливыми. Они охватывают мускулатуру ниж­ них и верхних конечностей, грудной клетки и живота. Утра­ чиваются все глубокие рефлексы. Черепно-головная ин­ нервация поражается незначительно. Преимущественно вовлекаются в процесс ядра XII, XI и в меньшей степени VII пары. Мускулатура лица грубо не страдает, можно от­ метить лишь недостаточную мимическую активность. Поч­ ти всегда можно обнаружить признаки атрофии языка и фибриллярные подергивания. Голос и плач больных не громкий, что можно объяснить не столько слабостью голо­ совых связок, сколько недостаточной функцией дыхатель­ ной мускулатуры. Последняя является причиной частых 203

пневмоний, которые переносит ребенок на протяжении жизни и приводят к летальному исходу. Интеллект больно­ го никогда не страдает, что отличает детскую спинальную амиотрофию от некоторых других ранних форм нервномышечных заболеваний. На всем протяжении заболева­ ния характерен общий гипергидроз. В процессе заболева­ ния усиливаются парезы, нарастают атрофии, становятся более грубыми костные деформации как результат нару­ шения трофики. Наряду с мышечными атрофиями умень­ шается подкожный жировой слой, становятся заметнее фасцикулярные подергивания мышц. Значительно реже в процессе усиливающихся атрофии увеличивается подкожножировой слой, тогда атрофии преимущественно можно наблюдать только в языке. Течение заболевания неуклон­ но прогрессирующее. Продолжительность жизни может до­ стигать 15—18 лет. Любая интеркуррентная инфекция утя­ желяет течение болезни. Ill тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Кугельберга-Веландер. Заболевание рассматри­ вается как мягкая форма. Это относится к клиническим проявлениям, более медленному прогрессированию и боль­ шей продолжительности жизни. Начальные проявления мы­ шечной слабости отмечаются на втором году ж и з н и , хотя эти сроки могут быть более поздними. Периферические парезы нижних конечностей обнаруживаются тогда, когда к движениям ребенка предъявляются достаточно высокие требования. Это — ходьба, бег, прыжки, вставание с пола, подъем по лестнице. Нагрузка оказывается подчас непо­ сильной. Изменяется походка, ребенок раскачивается при ходьбе, опирается на внутренние поверхности стоп. Опо­ ра при ходьбе осуществляется на выпрямленные в колен­ ных суставах конечности. Сгибание ног в коленных суста­ вах, очень легкое приседание ведут к падению. Использу­ ются вспомогательные движения при вставании, переме­ не положения из горизонтального в вертикальное. Утрачи­ вается способность прыгать и бегать, если она ранее име204

лась. В развернутой стадии болезни дети отличаются осо­ бенностями телосложения. Широкое межлопаточное про­ странство дополняется крыловидными лопатками. Как пра­ вило, усилен поясничный лордоз, выпячен вперед живот, уплощена в передне-заднем направлении грудная клетка. Эти деформации выражены не столь грубо, как подобное имеет место при предыдущих формах. Парезы конечнос­ тей и мускулатуры шеи и туловища носят симметричный генерализованный характер. Порядок вовлечения мышеч­ ных групп стереотипен. Первыми страдают проксимальные отделы нижних конечностей и мышцы таза. Далее слабость охватывает мышцы проксимальных отделов верхних конеч­ ностей и плечевого пояса. Постепенно становится замет­ ной слабость остальных мышц конечностей, спины, живо­ та. Ранее других угасают коленные рефлексы, затем двухи трехглавых мышц верхних конечностей. Брюшные и подош­ венные рефлексы могут длительное время быть сохран­ ными или незначительно сниженными. Стопы имеют склон­ ность к плосковальгусной деформации. Атрофии мышц но­ сят диффузный характер. Фасцикулярные подергивания наблюдаются в различных мышечных группах, наиболее ча­ сто в области надплечий, спины, груди. Гипотония опреде­ ляется во всех мышечных группах, что способствует избы­ точным движениям в суставах. Контрактуры в конечнос­ тях появляются только в поздних стадиях заболевания, в период, когда самостоятельное передвижение больных ста­ новится невозможным. Респираторные инфекции у боль­ ных могут наблюдаться на протяжении всей ж и з н и . Череп­ ные нервы грубо не страдают, могут иметь место легкая атрофия языка и фасцикуляции. Продолжительность жиз­ ни больных более высокая, чем в предыдущих группах и достигает 2—3 десятилетий. Подтверждение диагноза лю­ бого из трех типов детской спинальной амиотрофий дают показатели электрофизиологического и морфологическо­ го исследований мышц. Электромиограмма свидетельству­ ет о патологическом процессе в моторных клетках перед205

них рогов спинного мозга. В мышечных биоптатах обнару­ живается т а к называемая пучковая атрофия. 2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика SMA-обпасти Локус, ответственный за развитее всех трех форм дет­ ской спинальной мышечной атрофии, картируется в районе 5q12.2-q13, и сами эти заболевания представляют собой аллельные варианты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных генов (Daniels et al., 1992)- Картированию гена SMA (spinal muscular atrophy) способствовало обнаружение его тесного сцепления с высокоинформативным динуклеотидным микросателлитным повтором, локализованным в длинном плече хромосомы 5 (Lein et Э1. 1991). Фланкирую­ щими маркерами SMA, расположенными на расстоянии око­ ло 2 сМ друг от друга, являются с дистальной стороны ДНКмаркер D5S6 и с проксимальной — геИ МАР1 В, кодирующий белок, ассоциированный с микротруб
206

тура этой области напоминает структуру 600-кб-сегмента HLA класса III хромосомы 6, содержащего гены С4А и С4В ком­ племента, CYP21 ген стероидной гидроксилазы 21 и псевдоген этого гена CYP21P, псевдоген рибосомального белка — RPL32PH 2 других локуса ХА и ХВ, гомологичных гену тенансцина, функциональная копия которого локализована в 9q33. При этом гены С4 могут быть представлены в 1—3 копиях по типу мультилокусных полиморфных локусов САТТ1 и AG1СА SMA-области. Псевдогены HLA III области экспрессируются, но при трансляции не образуется функциональных про­ дуктов. Мутационные повреждения СУР21-гена, главным образом делеций и конверсии между CYP21 и CYP21Р, явля­ ются причиной адрено-генитального синдрома, частота кото­ рого (1:12 ООО) сопоставима с частотой спинальной мышеч­ ной атрофии. Таким образом, этот район 6р, подобно SMAобласти 5q, содержит множественные копии отдельных ге­ нов, экспрессирующиеся интрон-содержащие псевдогены и локус, гомозиготные делеций или конверсии которого явля­ ются причиной развития аутосомно-рецессивного заболева­ ния — адрено-генитального синдрома. Наличие большого числа повторяющихся элементов в SMA-области затрудняет клонирование ДНК и большинство космидных, фаговых и YAC-клонов, изолированных из этих районов, содержат множественные внутренние делеций и/ или дупликации. Поиск кандидатного гена для SMA был ос­ ложнен также в связи с присутствием в этой области боль­ шого числа необычных разбросанных по всему геному псев­ догенов, имеющих высокий процент гомологии с экзонами функциональных генов. Примерами таких необычных псев­ догенов являются независимо идентифицированные в раз­ ных лабораториях в SMA-области и в 5р13-р14 — областях последовательности, имеющие 90% идентичности с экзона­ ми гена бета-глюкуронидазы, функциональная копия которо­ го локализована в хромосоме 7. Обнаружены две «вариант­ ные» формы гена РМСН, кодирующего промеланин-концентрирующий гормон. Функциональный ген РМСН расположен 207

в 12-й хромосоме. В SMA-области также локализован экспрессирующийся псевдоген нейронального кадхерина — но­ вого члена семейства кадхериновых генов, функциональная копия которого картирована в 5р13-р14 (Thompson et al., 1995). Большинство псевдогенов имеют как экзонные, так и интронные области, а также содержат множественные стоп кодоны, препятствующие образованию функциональных бел­ ковых продуктов. Однако сами последовательности псевдо­ генов включаются в процессированные мРНК, транскриби­ руемые с SMA-области. Поэтому при идентификации коди­ рующих последовательностей в SMA-области с использова­ нием современных методов позиционного клонирования не­ обходимо исследовать, действительно ли отобранный экзон является частью функционального гена, который может бать кандидатным для SMA, или это фрагмент нефункционально­ го псевдогена. Доказательство функциональности экспрес­ сирующихся последовательностей требует использования достаточно трудоемких методов. 3. Идентификация и молекулярная характеристика гена SMN Несмотря на эти сложности, из SMA-области методом улавливания экзонов было изолировано достаточно много кодирующих последовательностей (Thompson et al., 1995; van der Steege et al., 1995a). Эти экзоны были использованы для скрининга различных тканеспецифических библиотек генов. Результатом данной работы явилась изоляция 20 кДНК-клонов, 17 из которых были дуплицированы в SMA или в других областях генома либо содержали высокоповторяющиеся по­ следовательности. Одна из трех оставшихся уникальных кДНК — XS2G3 — не имела гомологии ни с одним из извест­ ных генов. Более того, область геномной ДНК, гибридизующейся с этим кДНК-зондом, оказалась полностью делетирована более чем у 50% пациентов со спинальной мышечной атрофией типа I. При проведении подобного анализа у 245 здоровых людей, включая 143 облигатных гетерозигот,

208

гомозиготная делеция была обнаружена только у двух роди­ телей пациентов со спинальной мышечной атрофией. На ос­ новании этих результатов было высказано предположение, что XS2G3 является частью гена, кандидатного для SMA. Ме­ тодом нозерн блот-гибридизации было показано, что этот ген экспрессируется во множестве тканей. Большое количество 6.5-кб транскрипта обнаруживается в скелетных мышцах, два типа мРНК размером примерно 1.9 и 1.2 кб найдены в под­ желудочной железе. Одновременно с этими исследованиями в двух разных лабораториях методами позиционного клонирования из SMAобласти были изолированы два различных экспрессирующихся функциональных гена, полностью делетированные у боль­ шинства больных со спинальной мышечной атрофией. Наи­ более значимым из них оказался ген, расположенный в локусе D5S125 и названный авторами геном выживания дви­ гательных нейронов — SMN (survival motor neurons) (Lefebvre et al. 1995). Размер гена составляет 20 ООО пар оснований, его кодирующая часть разделена на 8 экзонов, причем вось­ мой экзон не транслируется. SMN — высококонсервативный ген. Его ортологи найдены у нематоды Caenorhabditis elegans и у дрожжей Schizosaccharomyces pombe. Ген SMN оказался дуплицирован в области 5q12.2-q13. Его копия, располагающаяся несколько ближе к центроме­ ре, — SMN C или SMN2 — также транскрибируется, хотя и от­ личается от теломерной копии гена — SMN* или S M N 1 — на­ личием пяти точечных мутаций. При этом в кодирующей об­ ласти гена обнаружены только две замены — одна из них в экзоне 7, а другая в экзоне 8. Эти две мутации позволяют отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследования методом SSCP анализа. Ген первоначально был назван CBCD541 по аналогии с первым вариантом названия теломерной копии — tBCD541. Ген SMN2 экспрессируется, но, в отличие от гена SMN1, его кДНК подвергается альтер­ нативному сплайсингу с утратой экзона 7. Оказалось, что ген SMN2 может отсутствовать либо, наоборот, быть представ-

лен несколькими копиями (Lefebvre et al. 1995). У разных ин­ дивидуумов число копий SMN2 на диплоидный геном варьи­ рует в пределах от 0 до 5. В общей популяции ген SMN2 от­ сутствует у 6.7% индивидуумов, представлен одной копией у 13.3%, двумя копиями — у 73.3% и у 6.7%индивидуумов чис­ ло копий на диплоидный геном больше двух (Velasco et al., 1996). С использованием метода твердофазного мини-секвенирования показано присутствие трех различных доми­ нантных гаплотипов по соотношению количества теломерных и центромерных копий SMN-гена в группе нормальных инди­ видуумов и в семьях больных (Schwartz et al., 1997). 4. Идентификация мутаций у пациентов со спинальной мышечной атрофией Около 93% больных со спинальной мышечной атрофи­ ей любого типа несут гомозиготные делеции области локали­ зации теломерной копии гена — SMN1. Остальные пациенты содержат подобные делеции в гетерозиготном состоянии, при этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо сплайсинговые мутации, реализующиеся в виде инсерций/ делеций в мРНК гена SMN1, либо миссенс-мутации, локали­ зованные чаще всего в З'-районе гена S M N 1 . У одного из пациентов с первым типом спинальной мышечной атрофии идентифицирована дукпликация 11 нуклеотидов в 6 экзоне гена SMN1 (Parsons et al., 1996). Полученные данные были убедительно подтверждены в последующих исследованиях (Brahe et al., 1996; Williams et al., 1996) и дали основание для того, чтобы именно данную теломерную копию гена SMN счи­ тать ответственной за заболевание. Показано, что при делеции теломерной копии гена SMN центромерная копия экспрессируется более интенсивно. Примерно у 5% больных центромерная копия SMN2 оказы­ вается вовлеченной в гомозиготную делецию. Эта цифра со­ поставима с процентом лиц контрольной группы, не имею­ щих центромерной копии SMN2. Среди всех обследованных больных со спинальной мышечной атрофией не обнаружены

210

случаи одновременной делеций обоих гомологичных SMNгенов. Возможно, такая аберрация проявляется как доми­ нантная леталь еще в эмбриогенезе. Наличие гомозиготных делеций или повреждающих мутаций в SMNI-гене, является необходимым, но недостаточным условием для развития бо­ лезни, так как в небольшом проценте случаев обнаружива­ ются гомозиготные делеций в гене SMN1 у здоровых родст­ венников больных (Cobben et al., 1995; Wang et al., 1996). Описано несколько полиморфизмов в гене SMN1 (Wang et al., 1996; Velasco et al., 1996). Один из них в экзоне 7 может быть при проведении молекулярной диагностики ошибочно принят за делецию этого экзона. Другая полиморфная нейт­ ральная мутация приводит к образованию гибридного гена SMN, в котором экзон 7 теломерной копии гена сочетается с экзоном 8 SMN2. Такая аберрация, по-видимому, возникает за счет генной конверсии между теломерной и центромерной копиями SMN. Поскольку экзон 8 не транслируется, гиб­ ридный ген может быть полностью функционален. 5. Характер экспрессии гена SMN Теломерная и центромерная копии гена SMN активно экспрессируются во многих типах тканей с образованием мРНК размером в 1700 п.о. (Liu, Dreyfuss, 1996). Особенно высокие уровни экспрессии наблюдаются в мозге, почках и в печени, умеренные — в скелетных и сердечной мышцах и низкие уровни экспрессии характерны для фибробластов и лимфоцитов. С использованием набора антител, сконструированных на разные детерминанты белка, показано, что белок выжи­ вания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в ядрах клеток (Liu, Dreyfuss, 1996). Ядерная форма белка най­ дена в структурах, названных темами (gem от 'Gemini of the coiles bodies'). Эти новые структуры внутри спиральных тел размером 0.1-1 микромикрон выявляются пока только анти­ телами против белка выживания двигательных нейронов. Повидимому, они ассоциированы с гетерогенными ядерными

211

рибонуклеопротеинами, предположительно участвующими в метаболизме и в процессинге мРНК. Показано, что гемы вну­ три спиральных тел ко-локализованы со сплайсеосомальными факторами. С использованием метода иммуноблота показано, что характер экспрессии гена SMN заметно меняется в постнатальном периоде по сравнению с эмбриональным (Burlet et al., 1998). Во всех тканях плода, за исключением скелетных мышц, белок выживания двигательных нейронов имеет диф­ фузное распределение в цитоплазме. При иммуногистохимическом анализе мышц обнаруживается пятнистое окраши­ вание, что позволяет предполагать ассоциацию SMN-белка с большими цитоплазматическими структурами, сходными по величине с темами. Седиментационный анализ показывает, что SMN-белок тесно ассоциирован с тяжелыми комплекса­ ми, не связанными с мембранами. Эти результаты указыва­ ют на важную роль белка выживания двигательных нейро­ нов в эмбриональном развитии. Иммуногистохимический анализ показал, что в фибробластах, лимфобластах и в мышцах пациентов не наблюда­ ется резкого снижения количества SMN-белка (особенно при наиболее тяжелом первом типе заболевания), однако число гемов значительно уменьшено, причем это уменьшение по­ ложительно коррелирует с тяжестью течения заболевания (Coovert et al., 1997). Подобный анализ гемов в культивируе­ мых первичных фибробластах больных может быть исполь­ зован как очень эффективный диагностический тест. Кроме того, в отличие от других тканей, в спинном мозге пациентов с первым типом заболевания наблюдается резкое, почти 100-кратное снижение общего количества продукта гена SMN, что находится в соответствии с клиническим течением этой формы спинальной мышечной атрофии. Заметно снижено ко­ личество этого белка и в скелетных мышцах больных. Идентификация крысиного гомолога SMN и конструи­ рование антител на продукт этого гена позволили провести исследование характера его экспрессии в ЦНС с использо212

ванием иммуногистохимического анализа и метода гибриди­ зации in situ с мРНК (Battaglia et al., 1997). У новорожденных и взрослых животных белок выживания двигательных нейро­ нов локализован главным образом в цитоплазме нейронов и особенно обильно представлен в нижних двигательных ней­ ронах. Присутствие мРНК гена SMN зарегистрировано в пла­ стинке дуги IX грудного позвонка. Подобный характер экс­ прессии гена SMN не противоречит предположению о том, что отсутствие белка выживания двигательных нейронов, наблюдаемое у подавляющего большинства пациентов со спинальными амиотрофиями, является причиной специфи­ ческой дегенерации нейронов. Обнаружены два альтернативных транскрипта гена SMN: полноразмерный и с делецией области, соответствую­ щей экзону 7 (Gavrilov et al., 1998). Делетированная изоформа транскрибируется исключительно с гена SMN2. В норме количество полноразмернй изоформы РНК-транскрипта в лимфобластозных клеточных линиях вдвое выше по сравне­ нию с делетированной. В культурах клеток пациентов с лю­ бой формой спинальной мышечной атрофии полноразмер­ ная изоформа составляет лишь 55—60% по сравнению с нор­ мой. При этом клетки пациентов со спинальной мышечной атрофией типа I и II продуцируют соответственно на 2 7 % и на 2 1 % больше альтернативного транскрипта, в то время как в клетках пациентов с типом III заболевания количество аль­ тернативного транскрипта на 5 4 % меньше по сравнению с контролем. Эти данные подтверждают вклад SMN2-reHa в патогенез спинальной мышечной атрофии. 6. Функции белка выживания двигательных нейронов Продуктом гена SMN является ранее неизвестный бе­ лок, состоящий из 294 аминокислот, с молекулярным весом 38 кД. Этот белок содержит домен модулярной олигомеризации, кодируемый экзоном 6 (Lorson et al., 1998). Подавляю­ щее большинство идентифицированных миссенс-мутаций в гене SMN1 приводят к аминокислотным заменам именно в 213

этом домене или в непосредственной близости от него. При этом наблюдается прямая корреляция между степенью на­ рушения процесса олигомеризации и тяжестью течения спи­ нальной мышечной атрофии. Продукт центромерной копии SMN2, кодируемый экзонами 1—6, но не 7, имеет уменьшен­ ную способность к самоассоциации. По-видимому, наруше­ ние способности к олигомеризации является первичным би­ охимическим дефектом при спинальной мышечной атрофии и течение заболевания определяется содержанием в клет­ ках компетентных по олигомеризации форм белка выжива­ ния двигательных нейронов. В карбокси-терминальном районе SMN-белка иденти­ фицирован высококонсервативный тирозин-глициновый трип­ лет (YxxG)3, сходный по структуре с RGG-боксами РНК-связывающих белков (Talbot et al., 1997). Примечательно, что пять миссенс-мутации расположены именно в этой (Уххв)-триплицированной области, что является дополнительным указа­ нием на ее функциональную значимость (Lefebvre et al., 1995; Talbot et al., 1997; Hahnen et al., 1997). Эти данные также рас­ сматриваются как косвенные подтверждения возможного участия белка выживания двигательных нейронов в метабо­ лизме мРНК. Однако они не объясняют, почему мутации в гене SMN ведут к такому специфическому нейромышечному поражению. Биохимический анализ подтвердил критическую роль продукта гена SMN в процессинге РНК и его участие в биоге­ незе рибонуклеопротеинового к о м п л е к с а сплайсеосом (Lefebvreet al., 1998). Район белка выживания двигательных нейронов, кодируемый экзоном 2, непосредственно участ­ вует в связывании РНК, а также обладает связывающей ак­ тивностью по отношению к однонитевой и двунитевой ДНК (Lorson, Androphy, 1998). Этот домен гомологичен факторам связывания нуклеиновых кислот, включая некоторые белки, содержащие высокомобильные группы (НМб).Обнаружение в этом домене миссенс мутации, резко уменьшающей РНКсвязывающую активность SMN-белка, у одного из пациентов 214

со спинальной мышечной атрофией доказывает функциональ­ ную значимость его взаимодействия с нуклеиновыми кисло­ тами. С другой стороны, в ряде экспериментов выявлена антиапоптозная роль белка выживания двигательных нейронов. В геноме человека в области 10q23 идентифицирован еще один ген, кодирующий ядерный белок, родственный про­ дукту гена SMN (Talbot et al., 1998). Этот ген экспрессируется во многих тканях и особенно активно в скелетных мышцах. Показано, что новый белок, кодируемый SMN-родственным геном и обозначаемый как SPF30, также входит в комплекс сплайсеосом. Его гиперэкспрессия в культуре HeLa клеток индуцирует апоптоз. Исследование SPF30 имеет важное зна­ чение для понимания функционирования SMN-родственных белков и их участия в патогенезе спинальной мышечной ат­ рофии. 7. Молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии В настоящее время возможна прямая молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии более чем у 98% пациентов. Она основана на амплификации и анализе экзо­ на 7 гена S M N 1 , отсутствующего у подавляющего большинст­ ва больных. Экзоны 7 генов SMN1 и SMN2 дифференцируют методом SSCP-анализа. Однако следует учитывать, что при­ мерно в 4% образцов ДНК, полученных от бессимптомных членов семей со спинальной мышечной атрофией, присут­ ствует полиморфная мутация в экзоне 7, которая может быть интерпретирована в условиях SSCP-анализа как делеция экзона 7 (Wang et al., 1996). Дискриминация этих двух ситуаций приобретает особую важность при проведе­ нии пренатальной диагностики. В данном случае анализ должен быть дополнен исследованием делеций экзона 8. В последнее время разработан еще более удобный метод диагностики спинальной мышечной атрофии, основанный на рестрикционном анализе определенных ПЦР-продуктов экзонов 7 и 8 (van der Steege et al., 1995b).

215

8. Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии другиу генов, расположенных в SMA-области В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN1 идентифицировано еще три гена, расположенных в 500-кб инвертированной дупликации, перекрывающей SMAобласть. Один из них NAIP — ген ингибитора нейронального апоптоза также представлен в SMA-области несколькими высокогомологичными копиями, хотя, по-видимому, только одна из них содержит полный набор экзонов (Roy et al., 1995). Этот ген имеет высокий процент гомологии с бакуловирусными генами, вовлеченными в ингибирование апоптоза в инфицированных клетках насекомых. Оказалось, что коди­ рующая последовательность XS2G3, идентифицированная в процессе поиска гена SMA (Thompson et al., 1995), компле­ ментарна экзону 7 и фланкирующим интронным областям NAIP-гена (Mahadevan et al., 1995). От 4 0 % до 70% больных с тяжелой клинической формой спинальной мышечной атро­ фии первого типа и от 14% до 2 2 % пациентов со II и III типа­ ми имеют в гомозиготном состоянии делецию специфичес­ ких экзонов NAIP-гена (Roy et al., 1995; Velasco et al., 1996). Однако и у бессимптомных облигатных гетерозигот подоб­ ная делеция обнаруживается в 2% случаев. Таким образом, утрата NAIP сама по себе недостаточна для развития болез­ ни. Имеются ли точковые мутации в NAIP-гене у пациентов со спинальной мышечной атрофией, в настоящее время не­ известно. Подавляющее большинство пациентов (96%) с го­ мозиготными делециями экзона 5 NAIP-гена также несут де­ леции гена SMN1. Однако описаны редкие пациенты, у кото­ рых при наличии гомозиготной делеции в гене NAIP сохране­ ны экзоны 7 и 8 гена S M N 1 . Ближе всех к SMN1 оказался расположен другой ген H4F5, делетированный у 9 0 % больных со спинальной амиотрофией I типа (Scharf et al., 1998). H4F5 активно экспрес­ сируется с образованием двух альтернативных транскриптов во многих тканях, включая спинной мозг и централь­ ную нервную систему. Продукт этого гена, по-видимому, 216

участвует в связывании нуклеиновых кислот и, подобно продукту гена SMN, ко-локализован с малыми ядерными ринуклеопротеиновыми комплексами (мяРНП), участвую­ щими в процессе сплайсинга. H4F5-reH также рассматри­ вается как возможный модификатор тяжести течения спи­ нальной мышечной атрофии. Третий ген, расположенный по соседству от SMN1 и также представленный несколькими копиями, — BTF2p44 — кодирует р44 субъединицу базального транскрипционного фактора II (van der Steege et al., 1995a; Carter et al., 1997). Этот белок, являющийся субьединицей комплекса РНК полимеразы II, участвует в транскрипции и репарации, сопряжен­ ной с транскрипцией. Оказалось, что одна из копий этого гена делетирована по крайней мере у 15% пациентов со спиналь­ ной мышечной атрофией. Однако никакой корреляции меж­ ду тяжестью течения заболевания и делецией гена BTF2p44 не обнаружено. Для изучения связи между характером мутационных повреждений и типом заболевания был проведен молекуляр­ ный анализ делеций в генах SMN1 и NAIP у пациентов из 187 семей, при этом в 77 семьях наблюдали больных с ти­ пом I спинальной мышечной атрофии, в 69 — с типом II и в 41 —с типом III (Rodriguesetal., 1996). Делеций в каждом из изученных генов могут встречаться как при тяжелых, так и при очень мягких типах спинальной мышечной атрофии. 93.5% пациентов оказались гомозиготны по делециям хотя бы части теломерной копии S M N 1 , причем в подавляющем большинстве случаев были делетированы оба экзона: 7 и 8. Изолированные делеций экзона 8 не были найдены ни у од­ ного больного. У облигатных гетерозиготных носителей по­ добных делеций в теломерной копии SMN1 не найдено. У всех оставшихся пациентов, кроме двух, присутствовали обе ко­ пии гена SMN и по крайней мере одна копия гена NAIP. У одного больного была обнаружена гомозиготная делеция по экзону 5 NAIP-гена и у другого — гомозиготная делеция по экзонам 7 и 8 центромерной копии SMN2. Следует подчерк217

нуть, что гомозиготные делеции в NAIP-гене обнаруживают­ ся у 1.9% фенотипически нормальных носителей, причем, как правило, эти гетерозиготы оказываются родителями пациен­ тов с I типом заболевания. Кроме того, гомозиготные деле­ ции центромерной копии SMN2 были найдены у 19 из 358 обследованных контрольных индивидуумов и не обнаруже­ ны ни у одного из 373 облигатных гетерозигот. Гомозиготные делеции в SMA-области большей протяженности связаны с более тяжелыми формами заболевания. Так, случаи одно­ временных делеций в генах SMN и NAIP значительно чаще встречаются среди пациентов с первым типом заболевания, в то время как пациенты со II и III типами не различаются по характеру делеций. Показано, что около 5 0 % больных со спинальной мы­ шечной атрофией I типа на каждой из гомологичных хромо­ сом 5 несут только одну копию мультилокусных микросателлитных маркеров С212 и AG1-CA (Wirth et al., 1995). 10% та­ ких пациентов несут гемизиготную делецию в области лока­ лизации этих маркеров. AG1-CA расположен в 5'-конце гена SMN1, а С212 — проксимальнее SMN1 в последнем интроне гена H4F5. Для AG1 -СА, так же как и для САТТ1, обнаружена сильная аллельная ассоциация с самыми тяжелыми форма­ ми заболевания. У пациентов со II и III типами количество копий этих маркеров достоверно больше, чем с первым ти­ пом заболевания. Если учесть, что ген SMN1 у подавляюще­ го большинства пациентов со спинальной мышечной атрофи­ ей делетирован, увеличение числа копий данных маркеров может быть связано с эффектом дозы центромерной копии SMN2. Действительно, у родителей пациентов с I типом за­ болевания, как правило, сохранены 2 копии SMN2, в то вре­ мя как у 66.5% и 7 5 % родителей больных с типами II и III обнаруживается от трех до пяти копий этого гена соответст­ венно (Velasco et al., 1996). Согласно современным представлениям, для развития спинальной мышечной атрофии необходима утрата или му­ тационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1, 218

NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоя­ нии мутаций (обычно делеций) в гене S M N 1 , при этом разли­ чия между формами спинальной мышечной атрофии опре­ деляются тремя основными факторами: наличием или отсут­ ствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных мутаций, существование которых в настоящее время не мо­ жет быть исключено) и числом центромерных копий гена SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае болезни II и III типа). Сходная ситуация генетического кон­ троля определенной функции зарегистрирована для генов, вовлеченных в систему апоптоза у Drosophila melanogaster. Наблюдается функциональный избыток генов апоптоза, так что потеря одного из них может компенсироваться другим геном. В результате для получения мутантной линии мух, де­ фектных по системе апоптоза, необходимо возникновение мутаций одновременно в двух генах reaper и hid, лежащих в одном и том же районе геномной ДНК (Grether et al., 1995).

б) Спинально-бульбарная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди (MIM: 313200) Сцепленная с полом рецессивная спинально-бульбар­ ная мышечная атрофия характеризуется поздним дебютом (после 40 лет), медленным прогрессированием, участием в процессе бульбарной группы черепных нервов, нисходящим распространением параличей. Клиническая картина болез­ ни имеет четкие границы и порядок вовлечения в процесс различных мышечных групп, что облегчает ее клиническую диагностику. Периферические парезы начинаются с прокси­ мальных отделов верхних конечностей и мускулатуры надплечий. Слабость сопровождается атрофиями пораженных мышечных групп и выраженными фасцикуляциями. Ранее других снижаются сухожильные рефлексы двухи трехглавых мышц. Типичен тремор пальцев рук. В дальнейшем слабость появляется в проксимальных отделах нижних конечностей, снижаются коленные и ахилловы рефлексы. Типично вовле­ чение в процесс двигательных ядер черепных нервов. Стра-

219

дает мимическая мускулатура и мышцы, иннервируемые бульбарной группой черепных нервов, обусловливающие ди­ зартрию и дисфагию. Описаны эндокринные нарушения в виде гинекомастии, обусловленной дефектом функциониро­ вания гипоталамуса. Впервые спинально-бульбарная мышеч­ ная атрофия была описана у 9 мужчин в двух неродственных семьях и с тех пор получила название болезни Кеннеди (Kennedy et al., 1968). При семейном генетическом анализе найдено сцепле­ ние гена SBMA (spinal and bulbar muscular atrophy) с марке­ ром DXYS1, локализованным в области Xq21.3-q22 (Fischbecket al.,1986). С использованием большого числа микросателлитных полиморфных маркеров удалось точнее ло­ кализовать ген SBMA в области Xq12 (Ferlini et al., 1991). Природа молекулярного дефекта, лежащего в основе разви­ тия болезни Кеннеди, была расшифрована при обнаружении у пациентов необычно длинного CAG-повтора в гене андрогенового рецептора-AR, локализованного в той же цитогенетической области (La Spada, Fischbeck, 1991; La Spada et al., 1991). CAG-повтор, кодирующий цепочку из глютаминовых остатков, расположен в первом экзоне гена AR. В норме наблюдается полиморфизм по длине CAG-повторов со сред­ ним числом, равным 22+-3. У пациентов с болезнью Кенне­ ди было обнаружено 11 аллелей с числом повторов, варь­ ирующим в диапозоне от 40 до 52. Во всех исследованных семьях аномалии по длине данного повтора ко-сегрегировали с заболеванием. Ген AR клонирован, и определена полная нуклеотидная последовательность его кДНК (Chang et al.,1988; Lubahn et al.,1988). Ген AR кодирует адренорецептор с молекулярной массой 110-112 кД, имеющий три главных функциональных домена. N-терминальный домен, кодируемый первым экзоном, осуществляет модуляторные функции. ДНК-связывающий домен кодируется экзонами 2 и 3. Андроген-связывающий домен кодируется пятью последующими экзонами. Раз­ личные мутации в гене адренорецептора, прежде всего мис220

сенс и нонсенс типа, а также делеций приводят к синдрому тестикулярной феминизации, характеризующемуся генетиче­ ски детерминированными нарушениями половой дифферен­ цировки, при которых у индивидуумов с кариотипом 46, XY наружные половые органы сформированы по женскому типу. CAG-повтор, кодирующий полиглютаминовый трек в пер­ вом домене адренорецептора, не оказывает никакого влияния на функции связывания ДНК и/или андрогена. Никакой корре­ ляции между величиной CAG-повтора и связыванием андроге­ на in vitro не наблюдается. В то же время выявлена четкая за­ висимость между длиной этого повтора и тяжестью течения болезни Кеннеди. При позднем дебюте и мягких клинических проявлениях симптомов заболевания число повторов у па­ циентов, как правило, не превышает 40. Около 30% экспансированных CAG-аллелей оказываются нестабильны при на­ следственной передаче. Наблюдается как сокращение числа триплетов, так и их увеличение, при этом нестабильность бо­ лее выражена в мужском мейозе (La Spada et al., 1992). В первом интроне гена AR идентифицирован второй полиморфный тринуклеотидный повтор — (GGC)n. Проведе­ но сопоставление уровня полиморфизма по (CAG)n и (GGC)n повторам у 113 пациентов со спинально-бульбарной мышеч­ ной атрофией и у 173 контрольных индивидуумов в Японии (Tanaka et al., 1996). Среднее число С AG-повторов в нормаль­ ных Х-хромосомах составило 21+-3, в мутантных — 47+-3. В контрольных Х-хромосомах найдено 7 различных аллелей по GGC-повтору с рангом изменчивости от 11 до 17 триплетов. Наиболее часто (79%) встречался аллель (GGC)16, тогда как частота аллеля (GGC)17 составила лишь1%. В мутантных хромосомах было найдено только 2 аллеля с 16 и 17 GGCповторами с частотами 61%и39%, соответственно. На рис. 22 и 23 представлены результаты этих исследований. Обнару­ женное неравновесие по сцеплению между двумя типами тринуклеотидных повторов в гене AR указывает на значитель­ ный вклад эффекта основателя в формирование пула мутант­ ных по гену AR хромосом в японской популяции. 221

Рис. 22. Распределение величины CAG-повтора в контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов с болезнью Кеннеди (темные столбики).

Рис. 23. Распределение величины CGC-повтора в контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов с болезнью Кеннеди (темные столбики).

Проведена прямая оценка частоты возникновения му­ таций в области локализации CAG-повтора в нормальных ал­ лелях гена AR путем типирования с помощью ПЦР состояния повтора в отдельных зародышевых клетках (Zhang et al., 1994). Всего было протипировано около 4300 сперматозоидов, по­ лученных от 110 доноров. Предварительно частота мутаций этой области была оценена, как 6.7x10 3 . Скорость мутаций для аллелей (CAG) 22-24 сопоставима с той, которая наблю­ дается при семейном анализе. Частота экспансии аллелей с 28—31 повторами оказалась в 4.4 раза ниже частоты их со­ кращения, что согласуется с результатами аналогичных экс­ периментов с геном миотонической дистрофии — DM, но на­ ходится в значительном противоречии с наблюдаемой час­ тотой экспансии при отцовской передаче аллелей с 29—44 повторами (6 из 11 — 54%). То есть реальное увеличение числа повторов при прохождении через мужской гаметогенез оказалось в 175 раз больше скорости экспансии, непо­ средственно наблюдаемой в мужских зародышевых клет­ ках (54% по сравнению с 0.31%). Для объяснения этого па­ радокса авторы привлекают идею различных мутационных механизмов, ведущих к увеличению числа экспансированных повторов и к их сокращению. В опытах in vitro показано, что андрогеновый рецептор, так же как и другие белки, содержащие полиглютаминовые треки, способен специфически взаимодействовать с ключе­ вым ферментом клеточного гликолиза — глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназой (Koshy et al., 1996). Агрегация и протеолитический процессинг мутантных форм андрогенового рецептора зависят от длины глютаминового повтора, причем степень нарушения этих процессов коррелирует с уровнем цитотоксичности (Merryet al.,1998). Мутантные формы белка с удлиненными полиглютаминовыми треками обладают по­ вышенной устойчивостью к протеолизу (Abdullahetal.,1998). Даже после обработки таких белков 2М мочевиной глютамин-содержащие фрагменты сохраняют устойчивость к про­ теолизу. Более того, в культуре COS клеток, трансфециро223

ванных фрагментами кДНК гена AR с экспансированными CAG-повторами, образуются аберрантные ассоциированные с ядрами 75-кД белковые производные с удлиненными полиглютаминовыми треками. Такие клетки почти вдвое менее жизнеспособны по сравнению с COS-клетками, трансфецированными нормальной кДНК гена AR, причем их гибель но­ сит характер апоптоза. Подобные нейроно-токсические про­ изводные могут образовываться de novo либо вследствие токсического накопления белков, теряющих способность к правильной диспозиции в клетке при наличии в них удлинен­ ных глютаминовых повторов. Введение кДНКовых конструкций гена AR с экспансированным CAG-повтором (CAG)52 в клетки нейробластомы мыши (NB2a/d1) также сопровождается образовани­ ем наряду с полноразмерным адренорецептором с м. в. 114-116 кД его С-терминально-укороченной формы с м. в. 74 кД (Butler et al.,1998). По-видимому, в этом укорочен­ ном фрагменте белка сохранен ДНК-связывающий домен, но отсутствует гормон-связывающий. В этом случае не ис­ ключено, что токсичность 74 кД изоформы адренорецептора в двигательных нейронах связана с возможностью инициации транскрипции в этих клетках специфических генов в отсутствие гормонального стимула. С использованием иммунофлюоресцентной микро­ скопии показано, что после гормональной активации адренорецептор дикого типа транслоцируется в ядра, тогда как мутантный белок главным образом остается в цито­ плазме в форме плотных агрегатов, и лишь небольшая его часть обнаруживается в ядрах. Этим может быть объясне­ но наблюдаемое уменьшение транскрипционной активно­ сти в NB2a/d1 клетках, трансфецированных мутантными конструкциями, по сравнению с клетками, трансфецированными кДНК гена AR дикого типа. Сконструирована серия трансгенных мышей, несущих ген AR человека с экспансированными CAG-повторами. При ис­ пользовании для трансгеноза кДНКовых конструкций с 45 и 66 224

CAG-триплетами никаких фенотипических аномалий у мышей не наблюдается и введенные последовательности оказывают­ ся стабильными (Bingham et al.,1995). В отличие от этого, при использовании для трансгеноза геномных конструкций экспансированного AR-гена в составе искусственных дрожжевых хро­ мосом (YAC) введенные последовательности даже с 45 CAGповторами обладают значительной мейотической нестабильно­ стью со средней скоростью экспансии около 10% за поколение, причем эта нестабильность более выражена при материнской передаче (в отличие оттого, что наблюдается у человека) и уве­ личивается с возрастом самки (LaSpadaet al., 1998). Сущест­ венное понижение порога для длины CAG-повтора, при кото­ рой возникает подобная нестабильность, указывает на важ­ ную роль в этом процессе геномных последовательностей, флан­ кирующих ген AR. Идентификация цис-действующих элементов, допускающих подобную нестабильность, и транс-активирующих факторов, способных ее модулировать, могут пролить свет на понимание молекулярных основ контроля общей нестабильно­ сти тринуклеотидных повторов у человека.

3.3. Наследственные полинейропатии Наследственные полинейропатии включают в себя раз­ личные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Дежерина-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа заболеваний со сходной клинической картиной. Патологиче­ ский процесс затрагивает главным образом нижний двига­ тельный неврон. Страдает либо тело мотонейрона, либо, что бывает чаще, его аксональная часть. Сходство клинических проявлений заключается в симметричности парезов, дистальной их локализации, преимущественным вовлечением в про­ цесс перонеальной группы мышц. Моторные нарушения час­ то сочетаются с сенсорными расстройствами. Парезы сопро­ вождаются мышечными атрофиями, которые в первую оче­ редь затрагивают стопы, голени, затем кисти. Соответствен­ но первыми снижаются, а затем утрачиваются ахилловы и коленные рефлексы. Дистальные парезы следует рассмат15 Заказ № 170

225

ривать как дебют заболевания, в дальнейшем в процесс мо­ гут вовлекаться мышцы проксимальных отделов и даже туло­ вища. Течение наследственных полинейропатий медленно прогрессирующее. Степень прогрессирования и тяжесть за­ болевания в значительной мере зависит от типа нейропатии. Перонеальная мышечная атрофия или болезнь ШаркоМари-Тус— наиболее распространенная наследственная пе­ риферическая нейропатия у человека. Известны аутосомнодоминантные, рецессивные и сцепленные с полом формы заболевания. Общая частота всех типов невральных амиот­ рофии Шарко-Мари-Тус составляет 1 на 2500. В границах синдрома выделяют две наиболее значимые формы. Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейро­ патии с аутосомно-доминантным характером наследования. Соответствующие гены получили название HMSN I (hereditary motor and sensory neuropathy I) или CMT1 (Charcot-Marie-Iooth 1). Дебют заболевания относится к первому десятилетию жизни. Начальными симптомами является слабость дистальных отделов нижних конечностей или их деформация в виде эквиноварусных стоп из-за укорочения икроножных мышц. В дальнейшем появляется слабость дистальных отделов верх­ них конечностей. У большинства больных выявляется эссенциальный тремор пальцев рук. Одновременно снижаются глубокие рефлексы. Снижение поверхностной чувствитель­ ности возникает не постоянно и чаще в более поздней ста­ дии болезни. Атрофиям подвергаются главным образом мыш­ цы стоп, голеней, кистей. Заболевание медленно прогресси­ рует. Для заболевания типично снижение скорости проведе­ ния по нерву. С генетической точки зрения эта клинически однородная группа состоит по крайней мере из 3 заболева­ ний, каждое из которых связано с дефектами разных генов — СМТ1А, С М Т 1 В и С М Т 1 С . II тип моторной и сенсорной нейропатии (СМТ2) с ауто­ сомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами на­ следования характеризуется более поздним дебютом по срав­ нению с I типом полинейропатий. Обычно процесс начинает226

ся с дистальных отделов конечностей в виде слабости и утом­ ляемости главным образом передней группы мышц голеней. Снижение или угасание рефлексов выражены в меньшей сте­ пени, чем при I типе полинейропатии, как и уровень чувстви­ тельных нарушений. Скорость проведения по нерву нормаль­ ная. При морфологическом исследовании обнаруживается дегенерация аксонов. Для аутосомно-рецессивной формы моторно-сенсорной нейропатии II типа типично раннее начало и более тяжелое и прогрессирующее течение. Начальные признаки болезни проявляются в первом десятилетии жизни, чаще в возрасте 3—5 лет. Парезы, имеющие все признаки периферических, захватывают дистальные отделы сперва нижних, а затем и верхних конечностей. Атрофии мелких мышц голеней и стоп, а также предплечий и кистей сопровождаются контрактура­ ми, приводящими к деформациям. Стопы принимают поло­ жение эквиноварусных, кисти согнуты в средних и концевых фалангах. Отмеченные дефекты моторики рано затрудняют самообслуживание ребенка. Двигательные нарушения соче­ таются с сенсорными. Страдает главным образом поверхно­ стная чувствительность по полиневритическому типу. Ill тип аутосомно-доминантной наследственной сенсор­ ной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Дежерина-Сотта. Для последней характерно появление с 6—7 лет слабости дистальных отделов конечностей, постепенно прогрес­ сирующей и переходящей затем на проксимальные отделы. В таком же направлении угасают глубокие рефлексы. Появляют­ ся атрофии мышц, вторичные костные деформации. Типично уплотнение нервных стволов (утолщается локтевой, седалищ­ ный нервы). Могут отмечаться боли в конечностях. Однако при молекулярно-генетическом анализе заболевания было показа­ но, что синдром Дежерина-Сотта не является самостоятельной нозологической формой, а представляет собой аллельные ва­ рианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1Аи 1В. Выделяют также моторные и сенсорные нейропатии с Х-сцепленным частично доминантным и Х-сцепленным ре227

цессивным типом наследования. В первом случае стеноти­ пические проявления более выражены у лиц мужского пола и отсутствует передача мутантного гена от отца к сыну. Кли­ ническая картина соответствует наследственной моторносенсорной нейропатии I типа (HMSN1). У гетерозиготных де­ вочек клинические проявления заболевания могут быть не­ значительны. Данные биопсии нервных волокон показывают первичную атрофию с вторичной демиелинизацией. Клини­ ческая картина Х-сцепленной рецессивной полинейропатий нередко сочетается с умственной отсталостью и неблагопри­ ятным витальным прогнозом. На этом генетическая гетерогенность наследственных полинейропатий не ограничивается. В настоящее время иден­ тифицировано 3 и картировано не менее 13 генов, ответствен­ ных за различные варианты этих заболеваний (табл. 12). Таблица 12 Локализация генов, ответственных за различные варианты наследственных полинейропатий Ген СМТ1А, РМР22 СМТ1В, MPZ, МРР СМТХ1,СХ32 СМТХ2 СМТХЗ СМТ2А СМТ2В СМТ2С OMT2D СМТ4А СМТ4В CMTND HSN1

Локализация 17р11.2 1q23-q25 Xq13-q21 Хр22.2 Xq26 1р36-р35 3q13-q22 ?

7р14 8q13-q21.1 11q23 5q23-33 9q22.1-q22.3

MIM 118220, 145900 118200, 145900 302800 302801 302802 118210 600882 158580 601472 214400 601382 601596

а) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200; 159440; 145900) Ключевым моментом для картирования, а в дальней­ шем и идентификации гена, дефектного при невральной ами­ отрофий Шарко-Мари-Тус 1В типа, явилось обнаружение в ряде семей косегрегации заболевания с определенными ал­ лелями генов, локализованных в центромерном районе длин­ ного плеча хромосомы 1 (Bird et al., 1980; Guiloff et al., 1982). В этих же семьях было обнаружено сцепление заболевания с генами антитромбина III —АТЗ, альфа-субъединицы слюн­ ной амилазы — AMY1, аполипопротеина А2 — АРОА2 и Fcфрагмента иммуноглобулинового кластера генов IgG — FCGR2A, расположенных в районах 1q23-q25,1р21 ив 1q21q23 (два последних гена соответственно) (Griffits et al., 1987; 1988; Lebo et al., 1989). Описание редких пациентов с болез­ нью Шарко-Мари-Тус 1В типа, несущих небольшие хромосом­ ные перестройки в области 1q23-q25 — микроделеции и транслокации, — способствовало сужению области поиска дефектного гена с 18сМ до 6 сМ, что соответствовало сокра­ щению физического интервала с 15% хромосомы 1 до 3% (Lebo et al., 1991). Был использован целый комплекс цитогенетических и молекулярных методов для более точного кар­ тирования гена СМТ1В (Qharcot-Marie-Iooth 1 В), включая сортинг хромосом, флюоресцентную гибридизацию in situ, спот-блот анализ, изоляцию с помощью пульсирующего гельэлектрофореза и клонирование крупных фрагментов геном­ ной ДНК из области поиска гена. Наиболее вероятным кандидатом на роль гена, дефект­ ного при типе IB болезни Шарко-Мари-Тус, оказался находя­ щийся в тесном сцеплении с FCGR2A и АРОА2 ген перифе­ рического миелинового белка МРР (myelin protein peripheral), известный также как ген миелинового гликопротеина Р(0) — MPZ (myelin protein zero) (Oakey et al., 1992). Ген MPZ высо­ коконсервативен и специфическим образом экспрессирует­ ся в миелин-формирующих клетках Шванна. Он состоит из 6 экзонов, распределенных на площади около 7 кб геномной 229

ДНК (Lemke, Axel 1985; Hayasaka et al., 1993a). Первые 28 аминокислот, кодируемых MPZ, не представлены в зрелом белке и образуют сигнальный пептид, направляющий продви­ жение Р(0) к эндоплазаматическому ретикулуму. Р(0) — глав­ ный структурный белок периферического миелина с молеку­ лярным весом 28 кД, составляет более 5 0 % всего белка, при­ сутствующего в оболочках периферических нервов. Этот ин­ тегральный мембранный белок связывает соседние ламеллы посредством гомофильных взаимодействий, что обеспе­ чивает компактизацию и стабилизацию всего миелинового комплекса. Тремя другими главными компонентами этого комплекса являются основной и протеолипидный белки мие­ лина, а также гликопротеин, ассоциированный с миелином. В центральной нервной системе Р(0) не обнаружен. Картирование гена MPZ в области 1q22-q23 явилось основанием для его анализа в качестве кандидатного гена при болезни Шарко-Мари-Тус 1В. При молекулярном обсле­ довании пациентов из разных семей с невральной амиотрофией Шарко-Мари-Тус 1В типа, были обнаружены многочис­ ленные мутации в гене MPZ (Hayasaka et al., 1993b; Kulkens et al., 1993; Su et al., 1993). Большая часть этих мутаций отно­ сится к миссенс-типу, описаны также небольшие делеции и мутации, нарушающие процесс сплайсинга. Дефекты лока­ лизованы главным образом в высококонсервативном райо­ не гена, полностью идентичном у крыс, коров и человека. Следствием этих мутаций является замена или потеря одной из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), играющем значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. Одна из миссенс-мутации — К96Е, по-видимому, является мажор­ ной. У гетерозигот по К96Е наблюдается типичная клиника полинейропатий. Две мутации в MPZ-гене были обнаружены у пациентов с синдромом Дежерина-Сотта. Одна из них со­ провождалась аминокислотной заменой во внеклеточном, а другая — в трансмембранном домене Р(О). Эти находки под­ твердили генетическую идентичность некоторых форм синд­ рома Дежерин-Сотта и болезни Шарко-Мари-Тус IB типа. 230

6) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220; 145900); нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (MIM: 162500) 1. Картирование гена СМТ1А Более чем в половине семей с типичным течением бо­ лезни Шарко-Мари-Тус I типа не обнаруживается сцепления с генетическими маркерами хромосомы 1, и в частности с геном Fy, определяющем группу крови Даффи. Это позволило выдви­ нуть предположение о существовании двух генетических форм заболевания 1А и 1В со сходной клинической картиной, а сле­ довательно, и о наличии другого, отличного от MPZ гена, ответ­ ственного за развитие невральной амиотрофий Шарко-МариТустипа 1А — СМТ1А. Действительно, оказалось, что в тех се­ мьях, где не обнаруживается сцепления с геном Fy, наблюдает­ ся косегрегация заболевания с определенными аллелями двух маркерных локусов перицентрического района короткого пле­ ча хромосомы 17 — D17S58 и D17S71 (Middleton-Price et al., 1990; Nicholson et al., 1989). При более детальном генетическом анализе сцепления, выполненном в одной большой бельгийской семье, в которой на протяжении многих поколений наблюдали больных с моторно-сенсорной нейропатией, было показано, что ген СМТ1А локализован в области 17р12-р11.2 между марке­ ром D17S71 и геном MYH2, кодирующим полипептид-2 тяжелой цепи миозина скелетных мышц (Timmerman et al., 1990). В даль­ нейшем были идентифицированы многочисленные фланкиру­ ющие ДНК-маркеры и составлена карта области локализации СМТ1А-гена настолько подробная, что расстояние между дву­ мя соседними маркерами не превышает 0.5 сМ (Patel et al 1990; Lebo et al., 1992). 2. Молекулярно-генетическая характеристика СМТ1Аобласти Значительный прогресс в понимании молекулярно-генетических основ невральной амиотрофий Шарко-Мари-Тус 231

1А типа связан с обнаружением у многих неродственных па­ циентов гетерозиготных дупликаций различной протяженно­ сти, расположенных в коротком плече хромосомы 17 в обла­ сти локализации дефектного гена — в так называемой СМТ1А-области (Lupski et al., 1991). При моногенном забо­ левании подобное нарушение, сопровождающееся сегмент­ ной трисомией, описано впервые. Наличие таких дуплика­ ций в геноме человека, по-видимому, является одним из возможных механизмов доминантного типа наследования. Частота дупликаций в области 17р11.2 у пациентов с бо­ лезнью Шарко-Мари-Тус I типа достигает 68%, причем в некоторых случаях удается проследить возникновение по­ добной перестройки de novo (Wise et al., 1993). Ни у одного из исследованных пациентов с типом II невральной амиот­ рофии Шарко-Мари-Тус дупликаций в 17 хромосоме не было найдено. Молекулярный анализ дупликаций этой области позволяет проводить дифференциальную диагностику па­ циентов с периферическими нейропатиями. Наиболее ин­ формативным методом молекулярной диагностики дупли­ каций является идентификация с помощью гель-электро­ фореза в пульсирующем поле необычных рестрикционных фрагментов (junction), образующихся на границах вовле­ ченных в перестройку участков Д Н К . У разных пациентов дупликации могут включать р а з л и ч н ы е Д Н К - м а р к е р ы , фланкирующие ген СМТ1 А, и наиболее частым из них ока­ зывается D17S122. Дупликации представляют собой пря­ мые тандемные повторы, что было показано с использо­ ванием различных молекулярных методов анализа (Valentijn et al., 1992а; Pentao et al., 1992). Минимальная оценка размера дупликаций составляет 1100 кб. В то же время описаны пациенты, у которых размер дуплицированного фрагмента настолько велик, что перестройка видна при цитогенетическом анализе. В видимые дупликации ока­ зываются вовлеченными все ДНК-маркеры, дуплицированные у пациентов с более короткими перестройками, плюс дополнительные маркеры, фланкирующие с двух сторон 232

СМТ1А-область. В гораздо более редких случаях СМТ1Аобласть оказывается не дуплицированной, а делегирован­ ной (Chance et al., 1993). Сопоставления между расстояниями на генетической и физической картах показывают, что район 17р11.2 являет­ ся горячей точкой рекомбинации, и это может быть причи­ ной его генетической нестабильности. Эта гипотеза в даль­ нейшем нашла экспериментальное подтверждение. Так, в об­ ласти 17р12-р11.2 было идентифицировано несколько низкокопийных повторов, один из которых — СМТ1A-REP — явля­ ется достаточно протяженным и составляет 17 килобаз (Pentao et al., 1992; Chance et al., 1994). У одного из пациен­ тов данный повтор фланкировал дуплицированную область размером 1.5 Мб на нормальной хромосоме и был представ­ лен дополнительной копией на хромосоме с дупликацией. По­ добное расположение CMTIA-REP-повторов согласуется с предположением о том, что возникновение дупликаций de novo может происходить в мейозе за счет неравного кроссинговера, обусловленного ошибочным выстраиванием этих последовательностей при спаривании гомологичных хромо­ сом. Делеций СМТ1 А-области, по-видимому, являются реципрокными продуктами неравного кроссинговера. В прямых экспериментах по изучению родительского происхождения дупликаций было показано, что во всех 9 проанализирован­ ных спорадических случаях дупликации возникли в сперма­ тогенезе и явились следствием неравного обмена между не­ сестринскими хроматидами (Palau etal., 1993). Показано, что в редких случаях материнского происхождения делеций 17р11.2 области являются следствием внутрихромосомных перестроек (LeGuern et al., 1996). 3. Нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва У пациентов, несущих делеций в СМТ1 А-области, на­ блюдается склонность к периодическим парезам с утратой чувствительности вследствие сдавления ствола нерва, уси-

233

ливающихся при травматических повреждениях. В большин­ стве случаев пациенты с данной формой нейропатии восста­ навливаются за несколько дней или недель, но часто могут наблюдаться рецидивы с тенденцией к сохранению парезов в течение более длительного периода. При исследовании биоптатов периферических нервов наблюдаются фокальные утоньшения миелиновой оболочки в участках нервного во­ локна между соседними перехватами Ранвье. Оказалось, что подобная доминантная форма нейропатии со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (HNPP — MIM 162500) чаще всего связана с делециями об­ ласти 17р11.2 (Cance et al., 1993; LeGuern et al., 1994). Раз­ мер делеций, как правило, составляет 1.5 Мб и они включа­ ют те же самые ДНК-маркеры, которые оказываются вовле­ ченными в дупликации при болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа. 4. Идентификация гена РМР22 Параллельно с анализом молекулярной природы мута­ ций, лежащих в основе развития невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тус IA типа, проводились интенсивные поиски модели этого заболевания среди существующих генетичес­ ких линий мышей. Было высказано предположение, что аутосомно-доминантно наследуемая гипомиелиновая нейропатия у мышей в мутантной линии Trembler (Тг) может служить по­ добной моделью (Vance, 1991). Основаниями для этого пред­ положения явились два факта — сходство между фенотипом мутантных мышей и клиническими симптомами заболевания, а также локализация мышиного гена Тг на 11 хромосоме, синтенной 17-й хромосоме человека, где предположительно кар­ тировался ген СМТ1 А. В двух независимо полученных гене­ тических линиях Trembler удалось идентифицировать 2 раз­ личные точковые мутации в одном и том же гене Gas-З, ко­ дирующем потенциально рост-регулирующий миелиновый белок с молекулярным весом 22 кД (Suter et al., 1992). Се­ мейство мышиных генов Gas, кодирующих белки негативно­ го контроля роста клеток (арест-специфические белки рос-

234

та), было клонировано методом субтрактивной гибридизации на основе различной экспрессии в покоящихся и делящихся клетках (Schneider et al., 1988). 6 из этих генов картировано и один из них — Gas-З оказался локализован в 11-ой хромо­ соме на 44 сМ проксимальнее мышиного гена р53. Gas-З ко­ дирует мембранный белок, получивший название Ртр-22 — периферический миелиновый белок-22. С помощью мышиного гена Gas-З удалось изолировать кДНК и геномные клоны гена РМР22 (peripheral myelin protein22) человека (Patel et al., 1992). Было показано, что ген РМР22 локализован в области 17р12-р11.2, дуплицированной у па­ циентов с болезнью Шарко-Мари-Тус 1А типа (Timmerman et al., 1992; Matsunami et al., 1992). Этот ген активно экспресси­ руется в клетках Шванна и в тканях периферических нервов. Белковый продукт гена РМР22 локализован главным обра­ зом в компактном миелине периферической нервной систе­ мы, состоит из 160 аминокислот и является интегральным мембранным белком с 4 трансмембранными доменами. Окончательным доказательством идентичности генов СМТ1А и РМР22 явилось обнаружение специфических мутаций в РМР22-гене у тех относительно немногих пациентов с болез­ нью Шарко-Мари-Тус IA типа, у которых СМТ1 А-область не дуплицирована (Valentijn et al., 1992b; Roa et al., 1993a). Одна из этих миссенс-мутаций в гене РМР22 — L16P оказалась гомологичной той, которая была идентифицирована в гене Gas-З мышиной линии Trembler (Valentijn etal., 1992b). В пред­ варительных исследованиях, проведенных в данной семье, было показано тесное сцепление мутантного гена с ДНК-мар­ керами, локализованными в районе 17р11.2, что позволило отнести этих больных к типу 1А невральной амиотрофий Шар­ ко-Мари-Тус. Однако у большинства пациентов в этой семье болезнь протекала в крайне тяжелой форме, и на основании клинических, нейрофизиологических и морфологических кри­ териев многим из них мог быть поставлен диагноз синдрома Дежерина-Сотта (Hoogendijk et al., 1993). Кроме того, две дру­ гие миссенс-мутаций в РМР22-гене — М69К и S72L иденти235

фицированы в семьях с клиническим диагнозом болезни Дежерина-Сотта, что еще раз свидетельствует о том, что этот синдром не является самостоятельной нозологической фор­ мой (Roa et al., 1993b). Одна из пациенток с тяжелой формой болезни Шарко-Мари-Тус I типа оказалась компаунд гетерозиготой по рецессивной миссенс-мутации в РМР22-гене и 1.5Мб делеции, локализованной в 17р12-р11.2 (Roa et al., 1993b). Ее сын, гетерозиготный по миссенс-мутации в РМР22 гене, был здоров. В то время как двое родственников этой женщи­ ны, гетерозиготные носители 1.5-Мб делеции, были больны наследственной нейропатией со склонностью к парезам вследствие сдавления ствола нерва. 5. Мутации в гене РМР22 Преобладающим типом мутационных повреждений в гене РМР22 у пациентов с невральной амиотрофией ШаркоМари-Тус 1А типа являются дупликации. По данным разных авторов, они были обнаружены в 68% (Wise et al.,1993), 9 2 % (lonasescu etal., 1993), 82% (Mostacciuoloetal., 1995) и в 9 1 % семей с СМТ1 (lonasescu et al., 1995), а также в 9 из 10 спо­ радических случаев заболевания (Hoogendijk et al., 1992). Таким образом, СМТ1А является уникальным случаем на­ следственной частичной трисомии, при которой идентифици­ рован главный и, возможно, единственный ген, связанный с данной патологией. Другим локусом, гиперэкспрессия кото­ рого приводит к тяжелым неврологическим состояниям, повидимому, является недавно идентифицированный по ана­ логии с геном minibrain (mnb) Drosophila melanogaster ген MNB, кодирующий серинтреонинпротеинкиназу, играющую сущест­ венную роль в постэмбриональном нейрогенезе (Guimera et al., 1996). MNB локализован в бенде 21 q22.2, входящем в кри­ тический для синдрома Дауна район (DSCR), трисомия по которому и определяет фенотип заболевания. Ген MNB ак­ тивно экспрессируется в тех структурах мозга, которые по­ ражаются при синдроме Дауна. Все это дает основания пред­ полагать, что гиперэкспрессия MNB может быть определяю-

236

щим следствием трисомии хромосомы 21 в развитии синдро­ ма Дауна. 6. Генетические модели болезни Шарко-Мари-Тус IA типа Мы уже упоминали о том, что спонтанно отобранные генетические линии мышей Trembler с гипомиелиновой нейропатией, наследуемой по аутосомно-доминантному типу, могут рассматриваться в качестве моделей болезни ШаркоМари-Тус 1А типа, так как у мутантных животных присутству­ ют мутации в гене Gas-З, гомологичном гену РМР22 челове­ ка (Vance, 1991). Идентифицированные у мышей мутации затрагивают домены, предположительно ассоциированные с мембраной. Кроме того, методом направленного разруше­ ния гена («нокаут») получена трансгенная линия Ртр22-дефицитных мышей с доминантно наследуемой периферичес­ кой нейропатией (Adlkofer et al., 1995). Хотя генетические линии Trembler, так же как и транс­ генная линия Ртр22-дефицитных мышей, являются адекват­ ными моделями данной формы полинейропатии, обусловлен­ ной точковыми мутациями в гене РМР22, они не могут ис­ пользоваться для анализа молекулярных последствий гипер­ экспрессии этого гена. Для анализа фенотипических послед­ ствий мутаций подобного типа была сконструирована транс­ генная линия мышей, содержащих около 8 дополнительных экспрессирующихся копий гена РМР22 человека (Huxley et al., 1996). Эта линия была создана путем прямой инъекции в пронуклеус соответствующей генетической конструкции, на­ ходящейся в составе дрожжевого вектора (YAC). Дрожжевые искусственные хромосомы являются идеальными векторами для создания подобных модельных линий животных, так как они содержат регуляторные элементы, обеспечивающие вы­ сокий уровень тканеспецифической экспрессии. Оказалось, что у мутантных животных этой трансгенной линии развива­ ется доминантно наследуемая нейропатия, сходная с болез­ нью Шарко-Мари-Тус I типа с прогрессирующей слабостью передних конечностей и значительной демиелинизацией пе-

237

риферической нервной системы с появлением луковицеподобных образований. Уровень экспрессии введенного гена РМР22 оказывает прямое влияние на степень демиелинизации, не меняя при этом ее характер. Гистологический и электрофизиологический анализ пяти подобных трансген­ ных линий мышей, несущих от одной до семи дополнитель­ ных копий гена РМР22, показал, что патологический про­ цесс находится в прямой зависимости от уровня экспрес­ сии трансгена (Huxley et al., 1996). Когда отношение меж­ ду человеческими и мышиными мРНК оказывается мень­ ше 0.8, никаких аномалий не наблюдается. При значениях этого соотношения, лежащих в диапозоне от 0.8 до 1.5, поведенческих признаков нейропатии у мышей не обнару­ живается, однако выявляются гистологические аномалиии и нарушения в скорости проведения нервного импуль­ са. При соотношениях, больших 1.5, между уровнями экс­ прессии периферического миелинового белка-22 челове­ ка и мыши у трансгенных животных развивается тяжелая форма нейропатии. Таким образом, линии мышей с гипер­ экспрессией гена РМР22 являются наиболее адекватны­ ми моделями для болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа и пер­ спективны для разработки и испытания различных тера­ певтических подходов применительно к данному заболе­ ванию, включая отработку методов генной терапии.

в) Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия (MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490) Хорошо доказано существование Х-сцепленных доми­ нантных форм болезни Шарко-Мари-Тус. Так, в одной из се­ мей было прослежено наследование заболевания на протя­ жении 6 поколений (Woratz, 1964). У 1 0 больных отцов в этой семье рождались только больные дочери (15 человек), в то время как все их 8 сыновей были здоровы. У больных мате­ рей, которых в этой семье насчитывалось 26, рождались как здоровые, так и больные дети, причем среди последних было 23 сына и 21 дочь. У мужчин болезнь протекала тяжелее, чем

238

у женщин, то есть наблюдалось частичное доминирование мутантных аллелей. Примеры подобных семей не являются единичными (Phillips et al., 1985; Fischbeck et al., 1986). При генетическом анализе подобных семей было най­ дено тесное сцепление мутантного гена СМТХ1 с ДНК-мар­ керами, локализованным в проксимальной части длинного плеча X хромосомы — Xq13-q21 (Bone et al., 1986; Gal et al., 1985). Ближайшим проксимальным маркером гена СМТХ1 является ген PGK1, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу, а дистальным — DXS72 (Goonewardena et al., 1988; Bergofen et al., 1993). Одновременно в той же области Х-хромосомы был картирован ген Сх32, кодирующий один из бета-коннексинов (Corcos et al., 1992). Группа белков, получивших название коннексины, была изолирована из клеточных фракций, обо­ гащенных структурами, образующими канальные контакты между соседними прикрепленными к субстрату клетками (gap junction). Подобные регионально специализированные струк­ туры на плазменных мембранах контактирующих клеток впер­ вые были охарактеризованы с помощью электронной микро­ скопии. Коннексины участвуют в образовании межклеточных каналов за счет совмещения мембранных пор (Sosinsky, 1995). По этим каналам может осуществляться прямой об­ мен небольшими молекулами и ионами между соседними клетками и роль таких контактов особенна важна в синаптической передаче. Коннексины, изолированные из различных тканей, представляют собой разные белки. Их классифика­ ция производится по молекулярному весу и эта цифра выне­ сена в название белка. Кроме того, на основе структурного сходства все коннексины делят на 2 группы: альфа и бета. Коннексин 32 — это бета-белок с молекулярным весом 32 кД, обильно представленный в клетках печени. Ген Сх32 актив­ но экспрессируется в периферической нервной системе. Цитогенетическая локализациия гена и характер его экспрес­ сии явились основаниями для исследования Сх32 в качестве кандидатного гена, дефектного при Х-сцепленной форме до­ минантной полинейропатии (Bergofen et al., 1993). 239

При прямом секвенировании кодирующих областей гена СХ32 у пациентов из различных семей с Х-сцепленной доми­ нантной формой болезни Шарко-Мари-Тус были идентифи­ цированы различные точковые мутации и микроделеции (Guern et al., 1995; Nelis et al., 1996). Таким образом идентич­ ность генов СМТХ1 и СХ32 была доказана. Недавно было показано, что наследственные дефекты двух других бета-коннексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных форм изолированной нейросенсорной тугоухости (Zelante et al., 1997; Xia et al., 1998). Напомним, что тугоухость как симп­ том нередко входит в комплекс полинейропатий. В ряде семей сцепленные с полом формы невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тус наследуются по рецессивному типу. Еще в прошлом веке была описана семья, в которой на протяжении 4 поколений наблюдали 20 больных мужчин (Heringham, 1889). Три подобные семьи были описаны в 1944 году (Erwin, 1944). При генетическом анализе этих семей, выполненном сравнительно недавно, было показано, что в одной из них мутантный ген СМТХ2 сцеплен с маркерами короткого плеча Х-хромосомы, локализованными в Хр22.2, тогда как в двух других семьях заболевание обусловлено мутациями в другом гене СМТХЗ, тесно сцепленном с мар­ керами длинного плеча Х-хромосомы — Xq26 (2.11) (lonasescu et al., 1992). В длинном плече Х-хромосомы картируется ген, свя­ занный с необычной рецессивно наследуемой формой моторно-сенсорной нейропатии Шарко-Мари-Тус II типа, сопро­ вождающейся нейросенсорной тугоухостью и/или умственной отсталостью. Это заболевание получило название синдрома Ковчока (Cowchock). Несмотря на явные клинические отли­ чия, не исключено, что этот синдром связан с реорганизацией областей ДНК, смежных с геном СМТХ1 или двух других СМТгенов, расположенных на Х-хромосоме (Fischbeck et al., 1986). К числу болезней, обусловленных реорганизацией смежных генов (contiguous gene syndrome), следует, по-ви­ димому, отнести и те случаи, когда рецессивная, сцепленная 240

с полом перонеальная амиотрофия Шарко-Мари-Тус сочета­ ется с наследуемой по тому же типу атаксией Фридрейха, а в некоторых семьях и дополнительно с тугоухостью (Schmickel, 1986).

г) Болезнь Шарко-Мари-Тус, нейронального типа II (MIM: 118210, 600882,158580, 601472) Несмотря на клиническое сходство аутосомно-доминантных гипертрофических (или аксональных) и нейрональных форм болезни Шарко-Мари-Тус, между ними, по-види­ мому, существуют фундаментальные различия, поскольку гены СМТ2 не являются аллельными вариантами ни одного из генов С М Т 1 , картированных к настоящему времени (Hentatiet al., 1992). Из всех доминатно наследуемых форм заболевания СМТ1 составляют около 6 0 % и СМТ2 — около 20%. Болезнь Шарко-Мари-Тус второго типа является гене­ тически гетерогенной группой заболеваний, включающей 4 формы: A-D. Локус СМТ2Абыл картирован при генетичес­ ком анализе 6 больших семей с нейрональным типом болез­ ни Шарко-Мари-Тус (Ben Othmane et al., 1993a). Обнаруже­ ние сцепления заболевания с микросателлитными маркера­ ми дистального района короткого плеча хромосомы 1 позво­ лило определить наиболее вероятное место локализации гена СМТ2А в районе 1р36-р35 между маркерами D1S244 и D1S228. Второй локус СМТ2В картирован в длинном плече хромосомы 3 в области 3q13-q22 (Kwon et al., 1995). Клини­ чески отличающаяся форма СМТ2С не связана с локусом короткого плеча хромосомы 1 (СМТ2А), однако ген, ответст­ венный за эту форму болезни Шарко-Мари-Тус второго типа, еще не картирован (Yoshioka et al., 1996). Новая форма доминантной полинейропатии ШаркоМари-Тус второго типа описана в большой семье, насчиты­ вающей 38 членов, 14 из которых являлись больными (lonasescu et al., 1996). Заболевание характеризуется отно­ сительно поздним дебютом: от 16 до 30 лет, более выражен­ ной слабостью верхних конечностей по сравнению с нижни-

ми, отсутствием или снижением сухожильных рефлексов и медленным прогрессированием. Генетический анализ этой семьи, выполненный с использованием 167 микросателлитных маркеров, позволил картировать локус CMT2D в корот­ ком плече хромосомы 7 в области 7р14. Расстояние между ближайшими фланкирующими маркерами D7S1808 и D7S1806 составляет 6.8 сМ. В этом же цитогенетическом интервале картируется семейство генов Т-клеточных гамма рецепторов, которые являются наиболее вероятными канди­ датами для полинейропатий CMT2D. В коротком плече хро­ мосомы 7 картирован ген, ответственный за дистальную фор­ му спинальной мышечной атрофии с преимущественным во­ влечением верхних конечностей (Christodoulou et al., 1995). Не исключено, что этот вариант дистальной полинейропатий аллелен CMT2D. Генетический анализ большой бельгийской семьи с ау­ тосомно-доминантной дистальной моторной полинейропатией II типа и отсутствием электрофизиологических и нейропатологийеских признаков сенсорных аномалий (дистальная HMISTII) позволил картировать ген, ответственный за данную форму заболевания, в длинном плече хромосомы 12 в обла­ сти 12q24 (Timmerman et al., 1996). Ближайшие фланкирую­ щие маркеры гена HMN II — D12S86 и D12S340 находятся на расстоянии около 13 сМ друг от друга.

д) Нейропатия Шарко-Мари-Тус, тип IV (MIM: 214400; 601382; 601596) Аутосомно-рецессивные формы болезни Шарко-МариТус встречаются значительно реже, чем доминантные или сцепленные с полом. Считается, что доминантные формы заболевания встречаются в 10 раз, а сцепленные с полом в 2-2.5 раза чаще, чем рецессивные (Skre, 1974). В общем слу­ чае при рецессивном наследовании болезнь носит более ге­ нерализованный характер, первые клинические симптомы появляются раньше и носят значительно более выраженный характер. Начало заболевания относится к возрасту 2—3 лет.

242

Симметричные парезы сперва отмечаются в нижних конеч­ ностях, затем через 1—2 года появляется слабость верхних конечностей. Типичны парезы дистальных отделов ног и рук. Первыми слабеют разгибатели стоп и пальцев. Меняется ходь­ ба, которая приобретает характер «степпажа». В руках так­ же страдают разгибатели кисти и пальцев рук. Парезы очень рано сопровождаются эквиноварусными деформациями стоп. Кисти и пальцы рук принимают положение сгибания. Атро­ фии стоп, кистей, голеней и предплечий становятся замет­ ными на ранних сроках болезни. Утрата глубоких рефлексов начинается с дистальных отделов и в течение болезни рас­ пространяется в восходящем направлении. Расстройство чув­ ствительности вначале поверхностной, а затем и глубокой происходит по полиневритическому типу. В клиническом и, по-видимому, в генетическом отношении это неоднородная группа заболеваний. В некоторых семьях тяжелая аутосом­ но-рецессивная невральная амиотрофия сочетается с врож­ денной нейросенсорной тугоухостью (Cornell et al., 1984), в других — с атаксией и денторубральным тремором (Bouchard et al., 1980). Чаще всего при рецессивном типе наследова­ ния болезнь протекает в форме тяжелой перонеальной мы­ шечной атрофии, не осложненной какими-либо дополнитель­ ными нарушениями — так называемый 4Атип полинейропа­ тии Шарко-Мари Туе. Некоторые клинически однородные ре­ цессивные формы болезни имеют большее распространение в определенных генетических изолятах, особенно если там допу­ стимы родственные браки (Alan, 1939; Beighton et al., 1971). При генетическом анализе большой тунисской семьи с рецессивной нейропатией 4А типа обнаружено сцепле­ ние заболевания с генетическими маркерами длинного плеча хромосомы 8 (Ben Othmane et al., 1993b). Наиболее вероятный район локализации гена С М Т 4 А — 8q13-q21.1 (табл.12) и б л и ж а й ш и й г е н е т и ч е с к и й Д Н К - м а р к е р — D8S164. В этом же районе локализован ген РМР2, кодиру­ ющий белок 2 периферического миелина. По-видимому, РМР2 является наиболее вероятным кандидатным геном 243

для СМТ4А. Генетический анализ, выполненный в другой большой инбредной семье, насчитывающей 10 больных с необычной аутосомно-рецессивной формой болезни Шар­ ко-Мари-Тус, сочетающейся с фокальным скручиванием миелиновых оболочек, позволил картировать мутантный ген — СМТ4В — в области 11q23 в 4-сМ интервале между маркерами D11S1332 и D11S917 (Bolino et al., 1996). Еще один ген — CMTND, связанный с подобной формой забо­ левания, был картирован в области 5q23-33. Этот резуль­ тат был получен при проведении генетического анализа с использованием 200 микросателлитных (СА)п-маркеров в большой алжирской семье с похожей формой болезни Шар­ ко-Мари-Тус (LeGuern et al., 1996). Интервал наиболее ве­ роятной локализации соответствующего кандидатного гена также составляет 4 с М , ближайшими маркерами являются D5S658 и D5S402. Полученные данные являются основой для идентификации методами позиционного клонирования генов, ответственных за аутосомно-рецессивные формы полинейропатией.

е) Наследственная сенсорная нейропатия, тип I (MIM: 162400) Аутосомно-доминантное заболевание, относящееся к группе наследственных дегенерации с поражением чувстви­ тельных нейронов. Основными симптомами заболевания являются множественные трофические язвы, нередко при­ водящие к ампутации пальцев. Болезнь развивается вслед­ ствие прогрессирующей дегенерации дорзальных корешков ганглиев и двигательных нейронов, сопровождающейся по­ терей чувствительности дистальных сегментов конечностей, особенно болевой и температурной. Позднее развивается мышечная слабость, преимущественно в кистях и стопах с варьирующей по степени нейросенсорной тугоухостью. Ти­ пичны хронические язвы, остеомиелит с отторжением кост­ ных фрагментов, в том числе метатарзальных костей. Дебют обычно во второй декаде жизни или позднее.

244

При генетическом анализе 4 австралийских семей, в которых прослежено наследование заболевания на протяже­ нии 2—4 поколений, обнаружено сцепление мутантного гена HSN1 с микросателлитными маркерами длинного плеча хро­ мосомы 9 (Nicholson et al., 1996). В процессе этой работы члены исследуемых родословных, в одной из которых насчи­ тывалось 67 человек, были протипированы по 127 высокопо­ лиморфным микросателлитным маркерам, распределенным по всем аутосомам. Определение ближайших фланкирующих маркеров — D9S318 и D9S176 позволило авторам отнести ген HSN1 в область 9q22.1-q22.3. Локус D9S287 обнаружи­ вает максимальное сцепление с геном HSN1. Размер наибо­ лее вероятного интервала локализации гена составляет 4.9 сМ. Два фрагмента ДНК, полностью перекрывающие этот интервал, клонированы в YAC-векторах. Все это является ос­ новой для позиционного клонирования и идентификации гена HSN1.

3.4. Боковой амиатрофический склероз (MIM: 105400) 1. Клиническая характеристика заболевания Заболевание отличается своеобразным сочетанием поражения периферического и центрального двигательного невронов. Таким образом, клиническая картина складывает­ ся из мышечных атрофии, носящих системный характер при наличии высоких сухожильных и периостальных рефлексов, а также патологических стопных знаков. Боковой амиотрофический склероз начинается в среднем возрасте и носит прогрессирующий характер. В зависимости от течения и кли­ нических проявлений различают: классическую форму с на­ чалом парезов верхних конечностей, параплегическую и бульбарную. Патоморфологические исследования нервной системы свидетельствуют об изменениях крупных моторных клеток спинного мозга и их аналогов, расположенных в ство­ ле мозга — ядрах XII, X, VII пар черепных нервов и «склеро245

тических» изменениях пирамидных путей в боковых столбах спинного мозга. Это основные точки приложения патологи­ ческого процесса, но не единственные. Находят изменения в области задних продольных пучков, в коре различных от­ делов мозга, ядрах головных нервов и др. Клетки коры атро­ фируются, гибнут и превращаются в «клетки-тени». Это ка­ сается клеток 3 и 5-го слоев, страдают и крупные клетки пе­ редних рогов спинного мозга. Изменения находят в вегета­ тивных центрах ствола и спинного мозга. Измененными ока­ зываются и оболочки сосудов головного мозга. Мышечные атрофии носят системный характер, их сопровождают фасцикуляции, которые можно выявить и в сохранных мышеч­ ных группах. Атрофии начинаются с дистальных отделов ко­ нечностей. В дебюте заболевания парезы преобладают над атрофиями. Характерно преобладание слабости в разгиба­ телях по сравнению со сгибателями. В терминальной стадии в процесс вовлекаются все мышечные группы и, что особен­ но трагично, дыхательная мускулатура. Больные погибают от расстройств дыхания спинального характера. Поражение пирамидной системы находит свое выражение в появлении мышечной гипертонии, ригидности мышц, клонуса стоп, па­ тологических стопных рефлексов. Сухожильные и периостальные рефлексы повышаются. Таким образом, клиническая картина характеризуется парадоксальным сочетанием мы­ шечных атрофии, фасцикуляций и патологически повышен­ ных глубоких рефлексов. Типично повышение нижнечелюст­ ного рефлекса. Весьма характерны мышечные спазмы типа crampi. В зависимости от формы бокового амиотрофического склероза меняется клиническая картина. Особенно отли­ чается бульбарная форма. Процесс в этом случае локализу­ ется в нижней части мозгового ствола. В первую очередь страдают ядерные структуры: нарушается речь от дизартрии до анартрии, появляются атрофии и фибрилляции мышц язы­ ка, затрудняется глотание, расстраивается дыхание. В этих случаях имеют место бульбарные дыхательные нарушения, являющиеся причиной гибели больных. Двигательная актив246

ность может не нарушаться в течение всей жизни. Длитель­ ность болезни от 4 до 12 лет. Течение, как правило, медленно прогрессирующее. Клинические формы бокового амиотрофического скле­ роза весьма многообразны и наряду с «классическими» проявленими описаны формы с деменцией, с паркинсонизмом и деменцией, ювенильный боковой амиотрофический склероз, сочетающийся или не сочетающийся с деменцией. В 1 0 % слу­ чаев заболевание носит семейный характер с чертами аутосомно-доминантного наследования. Описаны и аутосомнорецессивные формы заболевания. Для доминантных форм бокового амиотрофического склероза характерна неполная пенетрантность, величина которой зависит от возраста па­ циентов. Так, у 5 0 % носителей мутантного аллеля болезнь проявляется до 46 лет и у 9 0 % — до 70 лет. Семейные фор­ мы клинически не отличаются от спорадических, но в послед­ нем случае болезнь дебютирует в среднем на,-№йат позд­ нее. Различают 3 формы семейного бокового амиотрофиче­ ского склероза, каждая из которых наследуется по аутосомно-доминантному типу. Первый тип характеризуется быстро прогрессирующей потерей двигательных функций и леталь­ ным исходом в течение 5 лет с момента дебюта заболева­ ния. Патоморфологические изменения ограничиваются пе­ редними рогами спинного мозга и пирамидными путями. При второй форме семейного бокового амиотрофического скле­ роза находят дополнительные аутопсийные изменения в зад­ них столбах и грудном отделе спинного мозга, а также в кортико-спинальных путях. Третий тип сходен со вторым, за ис­ ключением гораздо более длительного течения болезни: до 10, а иногда и до 20 лет. 2. Метаболизм глутамата при боковом амиотрофическом склерозе В спинномозговой жидкости больных с боковым амиотрофическим склерозом наблюдаются повышенные концент­ рации глутамата и аспартата. Глутамат, первичный нейро247

трансмиттер возбудимости в мозге, может оказывать специ­ фический нейротоксический эффект и может индуцировать дегенерацию нейронов in vivo и in vitro. В мозге транспорт глутамата через плазматические мембраны обеспечивают высокоаффинные глутаматные транспортеры, играющие су­ щественную роль в прекращении действия глутамата как про­ водника возбудимости, а также в поддержании его внекле­ точной концентрации ниже нейротоксического уровня. При изучении нейрональной ткани пациентов с боковым амиотрофическим склерозом обнаружено достоверное снижение максимальной скорости транспорта высокоафинного глута­ мата в синаптосомы из спинного мозга, двигательной и сен­ сорной зон коры головного мозга, исключая зрительную зону, стриатум и гиппокамп (Rothstein et al., 1992). При этом аф­ финность глутаматного транспортера, а также внутриклеточ­ ный транспорт других молекул, таких как фенилаланин или гамма-аминомасляная кислота, у больных с боковым амиотрофическим склерозом не изменены. Подобного дефекта при каких-либо других нейродегенеративных заболеваниях до сих пор не было обнаружено. Поскольку у больных с боковым амиотрофическим склерозом метаболизм глутамата нарушен, была высказана гипотеза о том, что первичным биохимичес­ ким дефектом при этом заболевании является высокоаффин­ ный транспортер глутамата. 3. Картирование и идентификация гена ALS1 Однако генетические исследования опровергли эту ги­ потезу. При анализе генетического сцепления заболевания с различными ДНК-маркерами, проведенном более чем в 150 семьях с боковым амиотрофическим склерозом, удалось определить наиболее вероятные районы локализации различ­ ных дефектных генов. Один из них был картирован в хромо­ соме 11, другой — в хромосоме 21 (Siddique et al., 1989). В дальнейших исследованиях были представлены убедительные доказательства сцепления гена ALS1 (amyotophic lateral sclerosis 1) с ДНК-маркерами, расположенными в дисталь248

ной части сегмента 21 q22.1 -q22.2 (Siddique et al., 1991). Было обнаружено тесное сцепление ALS1 с геном SOD1, кодирую­ щим Cu/Zn-связывающую супероксиддисмутазу (СОД) и распо­ ложенным в той же области хромосомы 21 (Rosen et al., 1993). Известны 3 формы супероксиддисмутазы с различной иммунологической специфичностью. Главный растворимый цитоплазматический Си-/гп-содержащий фермент СОД1 ко­ дируется геном, расположенным в длинном плече хромосо­ мы 2 1 . Mn-содержащий фермент СОД2 кодируется геном, картированным в области 6q25. Он преимущественно нахо­ дится в митохондриях и потому отсутствует в эритроцитах. Ген экстраклеточной СОДЗ картирован в области 4р15.2 (Siddique, Deng, 1996). Последние две формы супероксиддис­ мутазы не связаны с боковым амиотрофическим склерозом. СОД1 с молекулярной массой в 16 кД имеет гомодимерную структуру. В каждом из мономеров СОД1, состоя­ щем из 153 аминокислот, присутствует активный сайт, содер­ жащий по одному атому меди и цинка. Главной функцией этого фермента является детоксикация нестабильного и высоко­ активного супероксида (02.-) до кислорода и перекиси водо­ рода, которая, в свою очередь, расщепляется до воды глютатионпероксидазой или каталазой. Отрицательно заряженный 02.направляется к Си 2 -содержащему активному сайту по положительно заряженному электростатическому каналу, сформированному 21 высококонсервативными аминокислот­ ными остатками. Помимо диезмутазной активности С0Д1 об­ ладает также пероксидазной активностью и, возможно, металл-связывающей. Уместно напомнить, что содержание С0Д1 повышено при синдроме Дауна. Это повышение связано с эффектом дозы гена, возникающим вследствие трисомии по хромосо­ ме 2 1 . Отсутствие в мозге больных глутатионпероксидазной активности, в норме компенсирующей эффект повышенной С 0 Д 1 , приводит к увеличению концентрации перекиси водо­ рода в нервных клетках, следствием чего является возник­ новение угрозы для липидов со стороны свободных радика249

лов. Роль перекисного окисления липидов при старении и при сходных изменениях, происходящих у больных с синдромом Дауна, хорошо известна. Получена трансгенная линия мы­ шей с повышенным содержанием СОД1 (Epstein et al., 1987). Эта линия используется в качестве модели для изучения би­ охимических эффектов СОД1 при синдроме Дауна. Учитывая токсический эффект свободных радикалов на нервные ткани и их роль в формировании нейродегенеративных заболеваний, было проведено исследование SOD1 в качестве кандидатного гена для бокового амиотрофического склероза. В первых же исследованиях были выявлены мис­ сенс-мутации в SODI-гене у пациентов с боковым амиотро­ фическим склерозом, что и явилось доказательством иден­ тичности генов SOD1 и ALS1 (Deng et al., 1993). 4. Мутаиии в гене SOD1 Миссенс-мутации в экзонах 1, 2, 4 и 5 гена SOD1 най­ дены у больных не только с семейными, но и со спорадичес­ кими случаями бокового амиотрофического склероза (Jones et al., 1993). Одна из этих мутаций — A4V — встречалась неоднократно у многих неродственных пациентов. Иденти­ фикация более 20 различных мутаций в гене SOD1 позволи­ ла обьяснить около 2 0 % семейных случаев бокового амиот­ рофического склероза. Впоследствии было выявлено еще не­ сколько десятков новых мутаций в Cu/Zn-супероксиддисмутазном гене у пациентов с семейными формами бокового амиотрофического склероза (Pramatarova et al., 1995). Сре­ ди 49 таких мутаций 45 миссенс-типа одна нонсенс-мутация, одна делеция и два мутантных аллеля приводили к наруше­ нию процесса сплайсинга (Siddique, Deng, 1996). В третьем экзоне гена, формирующем активный центр белка и элект­ ростатический канал, никаких нарушений не обнаружено. Предполагается, что доминантные мутации в SODI-гене вы­ зывают структурную нестабильность СОД1 за счет форми­ рования мутантных и нормальных гетеродимеров, а также мутантных гомодимеров. Следствием структурной нестабиль-

250

ности является снижение активности фермента до 3 0 — 7 0 % по сравнению с нормой. В настоящее время описано более 60 различных доминантных мутаций в гене SOD1 у пациен­ тов с боковым амиотрофическим склерозом. Характер мутационных повреждений в SODI-гене вли­ яет на клинические особенности проявления бокового амио­ трофического склероза, прежде всего на возраст начала и длительность течения заболевания. Так, пенетрантность од­ ной из миссенс-мутаций — D90A, расположенной в 4-м экзо­ не гена SOD1, составляет не более 38%, что не исключает возможности ее рецессивного наследования (Anderson et al., 1995). Другая миссенс-мутация — I113T обнаружена в не­ скольких спорадических случаях бокового амиотрофическо­ го склероза. Детальный анализ соответствующих семей по­ казал, что это унаследованная, а не вновь возникшая мута­ ция, обладающая крайне низкой пенетрантностью и экспрес­ сивностью. Мутация D90A преимущественно распростране­ на в Швеции и в Финляндии и может встречаться в семьях как с рецессивным, так и с доминантным характером насле­ дования. Так, эта мутация была идентифицирована в 20 ис­ следованных семьях с рецессивным и в 8 с доминантным ха­ рактером наследования, что доказывает участие эффекта основателя в ее распространении (Al-Chalabi etal., 1998). Для объяснения этого парадокса выдвинуто предположение о существовании другого тесно сцепленного с SOD1 гена, ко­ дирующего некий протективный фактор, способный модифи­ цировать токсический эффект мутантых форм СОД1. 5. Модельные линии животных Дальнейший успех в исследовании молекулярных ос­ нов патогенеза бокового амиотрофического склероза свя­ зан с конструированием трансгенных линий мышей с му­ тациями в гене супероксиддисмутазы (Dal Canto, Gurney, 1994; Ripps et al 1995; Wong et al., 1995). В четырех таких линиях удалось добиться экспрессии одного из мутантных аллелей, идентифицированных у пациентов с боковым ами-

251

отрофическим склерозом, — A4V, G93A, G37R и G86R со­ ответственно. В пятую трансгенную линию был введен нор­ мальный ген SOD1 человека. Гиперэкспрессия любого из введенных мутантных аллелей, в отличие от гиперэкспрес­ сии аллеля дикого типа, приводила спустя 3—4 месяца к развитию у мышей фенотипа, сходного с боковым амиот­ рофическим склерозом. Интересные данные были получе­ ны в опытах по трансгенному разрушению гомологичного Sod1 — гена у мышей (Reaume et al., 1996). Было показа­ но, что отсутствие супероксиддисмутазной активности у трансгенных животных не препятствует нормальному раз­ витию двигательных нейронов, но значительно увеличива­ ет скорость гибели клеток при повреждении аксонов. Повидимому, функции Cu/Zn-СОД связаны с защитой нейро­ нов и, возможно, других типов клеток в условиях физиоло­ гического стресса. У трансгенных мышей со специфичес­ кой мутацией G85R в гене Sod1 появлению фенотипических аномалий предшествует образование в цитоплазме астроцитов и двигательных нейронов белковых СОД1 -содер­ жащих включений, имеющих плотный центральный кор, а также более мелких СОД1-иммунореактивных белковых аг­ регатов (Bruijn et al., 1997). 6. Патогенетические механизмы действия мутаций в гене SQD1 Предложено несколько возможных механизмов для объяснения действия мутаций в SODI-гене при семейном боковом амиотрофическом склерозе. Согласно первой ги­ потезе, снижение активности СОД1 ведет к накоплению токсических супероксидных радикалов. По другой гипоте­ зе, активность СОД1 может быть повышена, в результате чего увеличивается уровень перекиси водорода в клетках, и при его взаимодействии с металлами, такими как Fe, по­ являются высокотоксичные гидроксильные радикалы. При изучении кристаллической структуры СОД1 обнаружено, что мутации, как правило, расположены не в каталитичес-

252

ком центре, а затрагивают участки консервативного взаи­ модействия, важные для правильной конформации белка и образования димерных контактов. Это в некоторой сте­ пени объясняет доминантный характер наследования бо­ кового амиотрофического склероза. В эритроцитах гете­ розиготных носителей мутаций активность СОД составля­ ет около 5 0 % нормы, что находится в соответствии с пред­ положением о нарушении образования димерной структу­ ры зрелого белка. В опытах in vitro было показано, что мутантные формы СОД1 значительно быстрее, чем нормальные, катализируют уменьшение содержания перекиси водорода, то есть дейст­ вуют как пероксидазы (Wiedau-Pazos et al., 1996). Возмож­ но, увеличение пероксидазной активности мутантной СОД1 является приобретенной токсической функцией, играющей критическую роль в патогенезе семейных форм бокового амиотрофического склероза, ассоциированных с СОД1. Пред­ ложены и другие гипотезы для объяснения механизма изби­ рательной гибели двигательных нейронов при боковом амиотрофическом склерозе. В прямых экспериментах показано, что каждая из двух миссенс-мутаций в гене SOD1 — G85R и G93A, ис­ пользованных для успешного моделирования бокового ами­ отрофического склероза на трансгенных животных, при­ водит к образованию мутантного белка, способного взаи­ модействовать с несвойственными для СОД1 метаболита­ ми (Kunst et al., 1997). В частности, мутантные формы С О Д 1 , в отличие от форм дикого типа, взаимодействуют с транслокон-ассоциированным белком дельта (TRAPdelta) и с лизил-тРНК-синтетазой (KARS). Оба эти белка активно экспрессируются в э м б р и о г е н е з е в тканях головного и спинного мозга. Взаимодействия между мутантным СОД1 и белками TRAPdelta и KARS могут реализоваться в виде нарушения клеточной локализации или функционирования одного или нескольких из этих трех белков. Подобный при­ мер не является исключением. Аберрантные взаимодей253

ствия мутантных белков показаны для некоторых других доминантных нейродегенеративных заболеваний, в част­ ности для хореи Гентингтона и денто-рубральной паллидолюисовой дегенерации. Доминантный характер наследова­ ния бокового амиотрофического склероза, по-видимому, определяется тем, что мутации в SOD1 приводят к образо­ ванию продукта, обладающего новыми функциями, нару­ шающими нормальный метаболизм С О Д 1 . Дестабилизация конформационной структуры мутантной СОД1 может сопровождаться ее агрегацией и форми­ рованием комплексов, преципитирующих в двигательных нейронах. Такая возможность не исключена, если учесть, что СОД1 относится к числу мажорных белков, составляю­ щих от 0.5 до 1% всех цитоплазматических белков нейро­ нов. Более того, в астроцитах и в клетках Шванна спинно­ го мозга некоторых пациентов, умерших от бокового ами­ отрофического склроза, обнаруживаются внутриклеточные включения, подобные тельцам Леви. Эти образования об­ ладают СОД1-иммунореактивностья>. Мы уже отмечали, что подобные образования формируются в астроцитах и в дви­ гательных нейронах трансгенных мышей со специфичес­ кой мутацией в гене S o d 1 . Причем по мере прогрессирования двигательных нарушений, сходных с клиникой боко­ вого амиотрофического склероза, количество нераствори­ мых белковых в к л ю ч е н и й возрастает и о д н о в р е м е н н о уменьшается концентрация глиального глютаматного транс­ портера (GLT-1). Подобно тельцам Леви при болезни Паркинсона и синильным бляшкам при болезни Альцгеймера эти цитоплазматические включения содержат убикитин и синуклеин, пептидный фрагмент которого обладает значи­ тельными амилоидогенными свойствами. Накопление не­ растворимых убикитин-устойчивых белковых агрегатов в клетках центральной и периферической нервной системы рассматривается в настоящее время как один из общих патогенетических механизмов процесса нейродегенера-

254

ции. Однако это предположение требует дальнейшей экс­ периментальной проверки. 7. Другие генетические формы бокового амиотрофического склероза Следует подчеркнуть, что далеко не во всех семьях с боковым амиотрофическим склерозом находят сцепление заболевания с локусами 21 хромосомы. Это неудивительно, если учесть клиническую гетерогенность заболевания. Так, в большой тунисской семье с ювенильной формой бокового амиотрофического склероза и рецессивным характером на­ следования найдено сцепление гена ALS2 с ДНК-маркерами длинного плеча хромосомы 2, что позволило отнести ген ALS2 в область 2q33-q35 и поместить его между генами COL3A1 и CRYG, находящимися на расстоянии 20-25 сМ друг от друга (Hentati et al., 1992; Hentati et al., 1994). В Пакистане описана рецессивная форма бокового ами­ отрофического склероза с дебютом в возрасте от 3 до 23 лет. Локус ALS4, ответственный за данную рецессивную форму бокового амиотрофического склероза типа IV, еще не иден­ тифицирован, но исключено его сцепление с маркерами длин­ ного плеча хромосом 2 и 2 1 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящем издании мы ограничились описанием толь­ ко моногенных форм и потому не включили сюда такую боль­ шую группу нервно-мышечных заболеваний, как миастении. Мы вернемся к описанию этой патологии в пятой части моногра­ фии при рассмотрении молекулярно-генетических основ мультифакториальных болезней нервной системы, в этиологии ко­ торых наряду с генетическими компонентами значительный вклад вносят средовые факторы. Во второй части монографии будут расмотрены заболевания с преимущественным пораже­ нием мозжечка, пирамидной и экстрапирамидной системы. Отдельная глава будет посвящена болезням экспансии. В тре­ тьей части мы рассмотрим вопросы молекулярной нейроонкологии. Основное внимание в этой книге будет уделено описа­ нию генетических основ канцерогенеза применительно к опу­ холям нервной системы. Отдельная глава будет посвящена молекулярно-генетической характеристике болезней нервной системы, связанных с дефектами онкогенов. В заключитель­ ном разделе этой книги коснемся вопросов лечения и прежде всего генотерапии опухолей нервной системы. Четвертая часть монографии будет посвящена патологии нервной системы в структуре синдромального поражения: наследственные дефек­ ты обмена аминокислот и углеводов, лизосомные болезни на­ копления и др. В этой книге мы коротко остановимся на наибо­ лее частых хромосомных болезнях человека с преимуществен­ ным вовлечением в патологический процесс нервной системы. В пятой части мы планируем рассмотреть принципиальные под­ ходы к расшифровке молекулярно-генетической природы фор­ мирования риска развития некоторых мультифакториальных заболеваний нервной системы, прежде всего таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, ин­ сульт, некоторые формы эпилепсии и миоклонус-эпилепсии, прионовые болезни. В заключительном разделе этой части остано­ вимся на общих метаболических основах патогенеза тех болез­ ней нервной системы, молекулярная природа которых стала известна после идентификации соответствующих генов. 256

Список литературы Бадалян Л. О. Детская неврология. М.: Медицина, 1984. 571с. Бадалян Л. О., Темин П. А., Заваденко Н. Н. и др. Прогрессирующие мышечные дистрофии у детей и подростков: проблемы патоге­ неза, диагностики, лечения и профилактики (обзор). М., ВНИИМИ серия: охрана материнства и детства), 1988. 64 с. Баранов А. Н., Киселев А. В., Иващенко Т. Э. и др. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека, доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2 // Генетика. 1998. Т. 34.С.1—6. Баранов В. С, Тарасенко О. В., Баранов А. Н. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в мышечных волокнах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигипептидов // Генетика. 1998. Т. 34. № 7. С. 876—882. Вельтищев Ю. Е., Темин П. А., Белозеров Ю. М. и др. Наследствен­ ные болезни нервной системы. М.: Медицина. 1998.496 с. Гехт Б. М., Ильина Н. А. Нервно-мышечные болезни. М.: Медицина, 1982. 352 с. Горбунова В. Н. Молекулярные основы медицинской генетики. СПб.: Интермедика. 1999.211 с. Горбунова В. Н., Баранов В. С. Введение в молекулярную диагнос­ тику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Спе­ циальная литература, 1997.287 с. Гринио Л. П. Клинические формы, вопросы патогенеза и медикогенетического консультирования дюшенновской миодистрофии. Дис. докт. мед. наук. М.: 1976. Гринио Л. П., Агафонов Б. В. Миопатии. М.: Медицина, 1997.216 с. Давиденков С. Н. Наследственные болезни нервной системы. Гос. изд-во Украины. 1925. Давиденков С. Н. Проблема полиморфизма наследственных болез­ ней нервной системы. Л.: Изд-во ВИЭМ. 1934.138 с. Давиденков С. Н. Клинические лекции по нервным болезням. Медгиз. 1952. 254 с. Дрознина Т. А. Клинико-генетические исследования псевдо-гиПертрофической формы прогрессирующей мышечной дистрофии. Дис. канд. мед. наук. Л. 1970.

Евграфов О. В., Макаров В. Б. ДНК-диагностика наследственных заболеваний // Итоги науки и техники. Генетика человека. 1991 Т. 9. С. 53—126. Зеленин А. В., Тарасенко О. В., Колесников В. А. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции// Генетика. Т. 34. № 6. С. 730—736. Зинченко А. П., Лобзин В. С, Бузиновский И. С. Наследственные формы миотоний и миотонические синдромы. Киев. Здоровье, 1979.152 с. Иллариошкин С. Н., Иванова-Смоленская И. А. Молекулярные ос­ новы прогрессирующих мышечных дистрофий //Журн. неврол. и психиатр. 1998. Т. 98. С. 55—62. Красильников В. В. Медико-генетическое консультирование семей с больными мышечной дистрофией Дюшенна. Дис. канд. мед. наук. М. 1989. Лобзин В. С, Сайкова Л. А., Шиман А. Г. Нервно-мышечные болез­ ни. СПб.: Гиппократ, 1998. 224 с. Малышева О. В., Иващенко Т. Э., Васильева Т. Н. и др. Изучение аллельного полиморфизма и анализ гаплотипов гена мышеч­ ной протеинкиназы у жителей Северо-Западного региона Рос­ сии и у больных миотонической дистрофией // Генетика. 1998. Т. 34. № 2. С. 295—299. Михайлов В. M., Зеленин А. В., Штейн Г. И. и др. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической транс­ фекции кДНК гена дистрофина человека// Цитология. 1998. Т.40. С. 394—400. Савельева-Васильева Е. А. Детская спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана (клинико-генетическое исследование). Дис. докт. мед. наук. Л. 1972. Шишкин С. С. Наследственные нервно-мышечные болезни. M. 1997. 132 с. Abbs S., Roberts R. G., Mathew С. G., Bentley D. R., Bobrow M. Accurate assessment of introgenic recombination frequency within the Duchenne muscular dystrophy gene// Genomics. 1990. Vol.7. P. 602—606. Abbs S., Yau S. C, Clark S., Mathew C. G., Bobrow M. A convinient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions: 258

a comparative analysis with cDNA hybridisa-tion shows mistyping by both methods// J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 304—311. Acsadi G., Dickson G., Love D. R. et al. Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA construction// Nature, 1991. Vol. 352. P. 815—818. Acsadi G., Massie В., Jani A. Adenovirus-mediated gene transfer into striated muscles//J.Mol.Med. 1995. Vol. 73. P. 165—180. Adballa J. A., Casley W. L, Hudson A. J. et al. Linkage analysis of candidate loci in autosomal dominant myotonia congenita// Neurology. 1992. Vol. 42. P. 1561—1564. Adlkofer K., Martini R., Aguzzi A. et al. Hypermyelination and demyelinating perepheral neuropathy in Pmp22-deficient micce// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 274—280. Ahn A. H., Kunkel L. M. The structural and functional diversity of dystrophin// Nature Genet, 1993. Vol. 3. P. 283—291. Ahn A. H., Kunkel L. M. Syntrophin binds to an alternatively spliced exon dystrophin//J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 363—371. Alan W. Relation of hereditary pattern to clinical severity as illustrated by peroneal atrophy//Arch. Intern. Med. 1939. Vol. 63. P. 1123— 1131. Al-Chalabi A., Andersen P. M., Chioza B. et al. Recessive amyotrophic lateral sclerosis families with the D90A SOD1 mutation share a common founder: evidence for a linked protective factor// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 2045—2050. Allamand V, Sunada Y., Salih M. A. M. et al. Mild congenetal muscular dystrophy in two patients with an internally deleted laminin alpha2chain// Hum. Mol. Genet.1997. Vol. 6. P. 747—752. Anderson P. M., Nilsson P., Ala-Hurula V. et al. Amyotrophic lateral sclerosis associated with with homozygosity for an Asp90Ala mutation in Cu/Zn-superoxide dismutase// Nature Genet. 1995. Vol. 10. P. 61—66. Apel E. D., Roberds S. L., Campbell K. P., Merlie J. P. Rapsyn may function as a link between the acetylcholine receptor and the arginbinding dystrophin-glycoprotein complex// Neuron, 1995. Vol. 15. P. 115—126. Arahata K., Hoffman E. P., Kunkel L. M. et al. Dystrophin diagnosis: comparison of dystrophin abnormalities by immunofluorescence and

259

immunoblot analysis// Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 7154—7158. Arikawa E., Hoffman E. P., Kaido M. et al The frequency of patients with dystrophin abnormalities in a limb-girdle patient population// Neurology, 1991. Vol. 41. P. 1491—1496. Arts W. F., Bethlem J., Volkers W. S. Futher investigations on benign myopathy with autosomal dominant inheritance// J. Neurol. 1978. Vol.217. P. 201—206. Ashizawa T, Dubel J. R., Harati Y. Somatic instability of CTG repeat in myotonic dystrophy// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 2674—2678. Badorf C, Lee G. H., Lamphear B. J. et al. Enteroviral protease 2A cleaves dystrophin: evidence of cytoskeletal disruption in an acquired cardiomyopathy// Nature Med. 1999. Vol. 5. P. 320—323. Bakker E., Good N., Wrogemann K. et al. Prenatal diagnosis and carrier detection of Duchenne muscular dystrophy with closely linked RFLPs// Lancet. 1985. March 23. P. 655—658. Bakker E., Veenema H., Dunnen J.T. et al. Germinal mosaicism increase the recurrence risk for 'new' Duchenne muscular dystrophy mutations//J. Med. Genet. 1989. Vol. 26. P. 553—559. Banker B. Q. In Engel A. G., Franzini-Amstrong C. (eds), The congenital muscular dystrophy// McGraw-Hill Book Company. 1994. N. Y. P. 1275—1289. BarS., Bamea E., Levy Z.et al. A novel product of the Duchenne muscular dystrophy gene which greatly differs from the known isoforms in its structure and tissue distribution// Biochem. J. 1990. Vol. 272. P. 557—560. Baranov V. S., Gorbunova V. N., Malisheva О. V. et al. Dystrophin gene analysis and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in the Russia// Prenat. Diagn. 1993. Vol. 13. P. 323—333. Baranov V., Zelenin A., Tarasenko O. et al. Human dystrophin gene expression in mdx muscles after in vivo ballistic transfection, application of synthetic oligopeptide complexes and cationic liposomes// NATO ASI Series. 1998. Vol. H 105 Gene Therapy. P. 219—223. Barton-Davis E.R., Gordier L., Shoturma D.I. et al. J. Clin. Invest. 1999. Vol. 104. P. 375—381.

260

Bashir R., Britton S.f Strachan T. et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 37—42. Bashir R.f Strachan Т., Keers S. et al. A gene for autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy maps to chromosome 2p// Hum. Molec. Genet. 1994. Vol. 3. P. 455—457. Battaglia G., Princivalle A., Forti F., Lizier C, Zeviani M. Expression of the SMN gene, the spinal muscular atrophy determining gene, in the mammalian central nervous system// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol.6. P. 1961—1971. Becker R.E. Myotonia congenita and syndromes associated with myotonia. In, (ed.): Topick in Human Genetics. 1977. Vol. III. Stuttgart: Georg Thieme. Beckmann J. S., Richard I., Hillaire D. et al. Localisation of a gene for limb-girdle muscular dystrophy to chromosome 15// (Abstract). Cytogenet. Cell Genet. 1991. Vol. 58. P. only. Beggs A. H., Koenig M., Boyce F. M., Kunkel L. M. PCR primers for the dystrophin gene that complement existing ones to detect over 98% of DMD/BMD deletion// Nucleic Acids Res. 1989. Vol. 9. P. 1 Beggs A. H., Koenig M., Boyce F. M., Kunkel L. M. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 45—48. Beggs A. H., Neimann P. E., Arahata K. et al. Possibvle influences on the expression of X chromosome-linked dystrophin abnormalities by heterozygosity for autosomal recessive Fukujama congenital muscular dystrophy// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol. 89. P. 623—627. Beighton P. H. Recessively inherited Charcot-Marie-Tooth syndrome in identical twins// Birth Defects Orig. Art. Ser. 1971. Vol. Vll(2). P. 105 only. Ben Hamida M., Fardeau M., Attia N. Severe childhood muscular dystrophy affecting both sexes and frequent in Tunisia// Muscle Nerve. 1983. Vol. 6. P. 469—480. Ben Othmane K., Ben Hamida M., Pericak-Vance et al. Linkage of Tunisian autosomal recessive Duchenne-like muscular dystrophy to the pericentromeric region of chromosome 13q// Nature Genet.1992. Vol.2. P. 315—317.

261

Ben Othmane К., Midddleton L.T., Loprest L J . et al. Localization of a gene (CMT2A) for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 to chromosome 1p and evidence of genetic heterogeneity// Genomics. 1993a. Vol. 17. P. 370—375. Ben Othmane K.f Hentati F., Lennon F. et al. Linkage of a locus (CMT4A) for autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease to chromosome 8// Hum. Molec. Genet. 1993b. Vol. 2. P. 1625—1628. Bethlem J., van Wijngaarden G.K. Benign myopathy with autosomal dominant inheritance: a report on three pedigrees// Brain. 1976. Vol.99. P. 91—100. Bieber F. R., Hoffman E. P., Amos J. A. Dystrophin analysis in Duchenne muscular dystrophy: use in fetal diagnosis and in genetic counse­ ling//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 362—367. Bione S. et al. Transcriptional organization of a 450-kb region of the human X chromosome in Xq28// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 10977—10981. Bione S., Maestrini E., Rivella S. et al. Identification of a novel X-linked gene responsible for Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 323—327. Bird T. D., Ott J., Giblett E. R. Linkage of Charcot-Marie-Tooth neuropathy to the Daffy locus on chromosome Ml (Abstr.) Am. J. Hum. Genet. 1980. Vol.32. P. 99A, only. Bittner R. E., Anderson L. V. В., Burkhardt E. et al. Dysferlin deletion in SJL mice (SJL-Dysf) defines a natural model for limb girdle muscular dystrophy 2B// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 141—142. Blake D.J., Love D.R., Tinsley J. et al. Characterization of a 4.8-kb transcript from the Duchenne muscular dystrophy locus expressed in schwannoma cells// Hum. Mol. Genet. 1992. Vol. 1. P. 103— 109. Blake D. J. f Schofield J. N., Zuellig R. A. et al. G-utrophin, the autosomal homologue of dystrophin Dpi 16, is expressed in sensory ganglia and brain// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 3697—3701. Blake D. J., Tinsley J. M., Davies К. E. Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin// Brain Pathology. 1996. Vol. 6. P. 37—47. Bodrug S. E., Burghes A. H. M., Ray P. M., Worton R. G. Mapping of four translocation breakpoints within the Duchenne muscular dystrophy gene//Genomics. 1989. Vol. 4. P. 101—104. 262

Bolino A., Brancolini V., Bono F. et al. Localization of a gene responsible for autosomal recessive demyelinating neuropathy with focally folded myelin sheaths to chromosome 11q23 by homozygosity mapping and haplotype sharing// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1051— 1054. Bone L. J., Dahl N., Lensch M. W. et al. X-linked neuropathy: gene localization with DNA probe//Ann. Neurol. 1986. Vol. 20. P. 527— 532. Bonne G., Di Barletta M. R., Varnous S. et al. Mutations in the gene encoding lamin A/C cause autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Nature Genet. 1999. Vol. 21. P. 285—288. Bonnemann C. G., Modi R.f Noguchi S. et al. Beta-sarcoglycan (A3b) mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss of the sarcoglycan complex// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 266— 273. Bonnemann C. G., Passos-Bueno M. R., McNally E. M. et al. Genomic screening for beta-sarcoglycan gene mutations: missense mutations may cause severe limb-girdle muscular dystrophy type 2E (LGMD 2E)//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1953—1961. Boyce F. M., Beggs A. H., Feener C, Kunkel, L. M. Dystrophin is transcribed in brain from a distant upstream promoter// Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 1276—1280. Boyd Y., Cockburn D., Holt S. et al. Mapping of 12 translocation breakpoints in the Xp21 region with respect to the locus for Duchenne muscular dystrophy// Cytogenet. Cell Genet. 1988. Vol. 48. P. 28—34. Brahe C, Clermont O., Zappata S. et al. Frameshift mutation in the survival motor neuron gene in a severe case of SMA type// Hum. Mol. Gnet. 1996. Vol. 5. P. 1971—1976. Brais В., Xie Y.-G., Sanson M. et al. The oculopharyngeal muscular dystrophy locus maps to the region of the cardiac alpha and beta myosin heavy chain genes on chromosome 14q11.2-q13// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 429—434. Brais В., Bouchard J.-R, Xie Y.-G. et al. Short GCG expansions in the PABP2 gene cause oculopharyngeal muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 18. P. 164—167. Brenman J. F., Chao D. S., Xia H., Aldape K., Bredt D. S. Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from sceletal 263

muscle in Duchenne muscular dystrophy// Cell. 1995. Vol. 82. P. 743—752. Brook J. D., McCurach M. E., Harley H. G. et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of trinucleotide (CTG) repeat at the 3-prime end of a transcript encoding a protein kinase family mem­ ber// Cell. 1992. Vol. 68. P. 799—808. Brown M. D., Torroni A., Shoffner J. M., Wallace D. C. Mitochondrial tRNA-thr mutation and lethal infantile mitochondrial myopathy//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 446—447. Bruijn L. I., Becher M. W.f Lee M. K. et al. ALS-linked SOD 1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD 1-containing inclusions// Neuron. 1997. Vol. 18. P. 327—338. Bulfield G., Siller W. G.f Wight P. A. L, Moore K. G. X chromosome linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse// Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. Vol. 81. P. 1189—1192. Bulman D. E., Morphy E. G., Zubrzycka-Gaarn E. E.f Worton R. G., Ray P. N. Differentiation of Duchenne and Becker muscular dystrophy phenotypes with aminoand carboxy-terminal antisera specific for dystrophin//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 295— 304. Bulman D. E. Phenotype variation and newcomers in ion channel disorders//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1679—1685. BurghesA. H. M., Logan C, HuX. etal. AcDNA clone from the Duchenne/ Becker muscular dystrophy gene// Nature. 1987. Vol. 328. P. 434— 436. Burlet P., Huber C, Bertrandy S. et al. The distribution of SMN protein complex in human fetal tissues and its alteration in spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1927—1933 Bushby К. M. D., Beckmann J. S. The limb-girdle muscular dystrophies: proposal for a new nomenclature// Neuromusc. Disord. 1995. Vol. 5. P. 337—343. Buxton J., Shelbourne P., Davies J. et al. Detection of an unstable fragment of DNA specific to individuals with myotonic dystrophy// Nature. 1992. Vol. 355. P. 547—548. Campanelli J. T, Roberds S. L, Campbell K. P., Scheller S. H. A role for dystrophin-associated glycoproteins for and utrophin in agrininduced AChR clustering//Cell. 1994. Vol. 77. P. 663—674. 264

Celly J., Hamard G., Koulakoff A. et al. Dystrophin gene transcribed from different promotor in neuronal and glial cells// Nature. 1990. Vol. 344. P. 64—65. Carango P., Noble J. E., Marks H. G.f Funanage V. L. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic dystrophy// Genomics. 1993. Vol. 18. P. 304—308. Cartegni L, di Barletta M. R.f Barresi R. et al. Heart-specific localization of emerin: new insights into Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 2257—2264. Carter T. A., Bonnemann C. G., Wang С. H. et al. A multicopy transcription-repair gene, BTF2p44, maps to the SMA region and demonstrates SMA associated deletions// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 229—236. Chamberlain J. S., Gibbs R. A., Ranier J. I., Nguyen P. N., Caskey С. T. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification// Nucleic Acids Res. 1988a. Vol.16. P. 11141—11156. Chamberlain J. S., Pearlman J. A., Muzny D.M. et al. Expression of the murine Duchenne muscular dystrophy gene in muscle and brain// Science. 1988b. Vol. 239. P. 1416—1418. Chamberlain J. S. The dynamics of dystroglycan// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 256—258. Chance P. F, Alderson M. K., Leppig K. A. etal. DNA deletion associated with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies// Cell. 1993. Vol. 72. P. 143—151. Chance P. F., Abbas N., Lensch N. W. et al. Two autosomal dominant neuropathies result from reciprocal DNA duplication/deletion of a region on chromosome 11ll Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 223— 228. Chen J. D., Hejtmanick J. F., Romeo G.et al. A genetic linkage map of five marker loci in and around the Duchenne muscular dystrophy locus//Genomics. 1989. Vol. 4. P. 105—109. Chen et al. Long-range sequence analysis in Xq28: thirteen known and six candidate genes in 219.4 kb of high GC DNA between the RCP/ GCP and G6PD in Xq28// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 659— 668.

265

Christodoulou К., Kyriakides Т., Hristova A. H. et al. Mapping of a distal form of spinal muscular atrophy with upper limb predominance to chroosome 7p// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1629—1632. Clarke A., Davies К. E., Gardner-Medwin D., Burn J., Hodgson S. V. Xp21 DNA probe in diagnosis of muscular dystrophy and spinal muscular atrophy// Lancet. 1989. Febr. 25. P. 443. Clerk A., Morris G. E., Dubowitz V, Davies К. E., Sewry C. A. Destrophinrelated protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal muscle// Histochem. J. 1993. Vol. 25. P. 554—561. Cobben J. M., van der Steege G., Grootscholten P. M. et al. Deletions of the survival motor neuron gene in unaffected siblings of patients with spinal muscular atrophy//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 57. P. 805—808. Cobo A., Grinberg D., Balcells S. et al. Linkage disequilibrium detected between myotonic dystrophy and anonymous marker D19S63 in the Spanish population// Hum. Genet. 1992. Vol. 89. P. 287—291. Coovert D. D., Le Т. Т., McAndrew P. E. et al. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1205—1214. Cormier V, Rotig A., Colonna M. et al. Autosomal dominant deletion of the mitochondrial genome in a case of progressive encephalomyopathy// Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 643—648. Corcos I.A., Lafreniere R.G., Begy C.R. et al. Refined localization of human connexin 32 gene locus, CJB1, to Xq13.1//Genomics. 1992. Vol. 13. P. 479—480. Cote P. D., Moukhles H., Lindenbaum M.f Carbonetto S. Chimeric mice dificient in dystroglycans develop muscular dystrophy and have disrupted myoneural synapses// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 338—342. Cox G. A., Cole N. M., Matsumura K. et al. Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity// Nature. 1993a. Vol. 364. P. 725—729. Cox G.. A., Phelps S. F., Chapman V. M., Chamberlain J. S. New mdx mutation disrupts expression of musculo and nonmuscule isoforms of dystrophin// Nature Genet. 1993b. Vol. 4. P. 87—93. Cox G.. A., Sunada Y, Campbell K. P., Chamberlain J. S. Dp71 can restore the dystrophin-associated glycoprotein complex in muscle

266

but fails to prevent dystrophy// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 333— 339. Crosbie R. H.f Straub V, Yun H.-Y. et al. Mdx muscle pathology is independent of nNOS perturbation// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 823—829 Dal Canto M. C, Gurney M. E. Development of central nervous system pathology in a murine transgenic model of human amyotrophic lateral sclerosis//Am. J. Pathol. 1994. Vol. 146. P. 1271—1279. Daniels R. J., Thomas N. H., MacKinnon R. N. et al. Linkage analysis of spinal muscular atrophy//Genomics. 1992. Vol. 12. P. 335—339. Darras В. T, Blattner P., Harper J. F. et al. Intragenic deletions in 21 Duchenne muscular dystrophy (DMD)/Becker muscular dystrophy (BMD) families studied with the dystrophin cDNA: location of breakpoints on Hindi 11 and Bgl11 exon-containing fragment maps, meiotic and mitotic origin of the mutations// Am. J. Hum. Genet. 1988. Vol. 43. P. 620—629. DeChiara Т. M., Bowen D. C, Valenzuela D. M. et al. The receptor tyrosine kinase MuSK is required for neuromuscular junction formation in vivo// Cell. 1996. Vol. 85. P. 501—52. Deconinck A. E., Rafael J. A., Skinner J. A. et al. Utrophin-dystrophin deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy// Cell. 1997a. Vol. 90. P. 717—727. Deconinck A. E., Potter A. C, Tinsley J. M. et al. Postsynaptic abnormalities at the neuromuscular junctions of utrophin-deficient mice//J. Cell. Biol. 1997b. Vol. 136. P. 883—894. Deconinck N., Tinsley J., De Backer F. et al. Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophindeficient muscles of mice// Nature Med. 1997c. Vol. 3. P. 1216— 1221. de Gouyon В. M., Zhao W., Laporte J. et al. Characterization of mutations in the myotubularin gene in twently six patients with X-linked myotubular myopathy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1499— 1504. Deng H.-X., Hentati A., Tainer J. A. et al. Amyotrophic lateral sclerosis and structural defect in Cu,Zn superoxide dismutase// Science. 1993. Vol. 261. P. 1047—1051. Dhal N., Samson F, Thomas N. et al. X-linked myotubular myopathy (MTM1) maps between DXS304 and DXS305, closely linked to the 267

DXS455 VNTR and new, highly informative microsatellite marker (DXS1684)// J. Med. Genet. 1994. Vol. 31. P. 922—924. Dhal N., Hu L, Chery M. et al. Myotubular myopathy in a girl with a deletion at Xq27-q28 and unbalanced X inactivation assigns the MTM1 gene to 600-kb region//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 56. P. 1108—1115. Dickson G., Love D. R., Davies К. E. et al. Human dystrophin gene transfer: production and expression of a functional recombinant DNA-based gene// Hum. Genet. 1991. Vol. 88. P. 53—58. Dodson H. C, Piper T. A., Clarke J. D. W., Quinlivan R. M., Dickson G. Dystrophin expression in the hair cells of the cochlea// J. Neurocytology. 1995. Vol. 24. P. 625—632. D'Souza V. N., Nguyen Т. M., Morris G. E. etal. A novel dystrophin isoform is requered for normal retinal electrophysiology// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 837—842. Duggan D. J., Gorospe J. R., Fanin M., Hoffman E. P., Angelini C. Mutations in the sarcoglycan genes in patients with myopathy// New Eng. J. Med. 1997. Vol. 336. P. 618—624. Dunckley M. G., Manoharan M., Villiet P. et al. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1083—1091 Dunnen J. T. D., Grootscholten P. M., Bakker E. et al. Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene:FIGE and cDNA analysis of 194 cases reaveals 115 deletions and 13 duplications// Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 835—847. Eiberg H., Mohr J., Neilsen L. S., Simonsen N. Genetics and linkage relationships of the C3 polymorphism: discovery of C3-Se linkage and assignment of LES-C3-DM-Se-PEPD-Lu synteny to chromosome 19//Clin. Genet. 1983. Vol. 24. P. 159—170. England S. В., Nicholson L. V. В., Johnson M. A. et al. Very mild muscmlar dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin// Nature. 1990. Vol.343. P. 180—182. Epstein C. J., Avraham К. В., Lovett M. et al. Transgenic mice with increased Cu/Zn-superoxide dismutase activity: animal model of dosage effects in Down syndrome// Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. Vol. 84. P. 8044—8048. Ervasti J. M., Campbell K. P. Membrane organization of the dystrophynglycoprotein complex//Cell. 1991. Vol. 66. P. 1121—1131. 268

Erwin W. G. A pedigree of sex-linked recessive perioneal atrophy// J. Hered. 1944. Vol. 35. P. 24—26. Essen A. J. f Abbs St., Baiget M. et al. Paternal origin and germ-line mosaicism of deletions and duplications of the dystrophin gene: European study// Hum. Genet. 1992. Vol. 88. P. 249—257. Fabbrizio D., Latouche J., Rivier F, Hugon G., Mornet D. Re-evaluation of the distribution of dystrophin and utrophin in sciatic nerve// Biochem. J. 1995a. Vol. 312. P. 309—314. Fabbrizio E., Bonet-Kerrache A. et al. Dystrophin, the protein that promotes membrane resistance//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995b. Vol.213. P. 295—301. Fananapazir L, Dalakas M. C, Cyran F., Cohn G., Epstein N. D. Missence mutations in the beta myosin heavy-chain gene cause central core desease in hypertrophic cardiomyopathy// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 3993—3997. Feener C, Boyce F. M., Kunkel L. M. Rapid detection of CA polymorphisms in cloned DNA: application to the 5' region of dystrophin gene//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 621—627. Feero W. G., Wang J., Barany F. et al. Hyperkalemic periodic paralysis: rapid molecular diagnosis and relationships of genotype to phenotype in 12 families// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 668—673. Finocchiaro G., Taroni F., Rocchi M. et al. cDNA cloning, sequence analysis, and chromosomal localization of the gene for human carnitine palmitoyltransferase//Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 661—665 Fischel-Ghodgian N., Bohlman M. C, Prezant T. R. et al. Deletions in blood mitochondrial DNA in Kearns-Sayre syndrome// Pediatr. Res. 1992. Vol. 31. P. 557—560. Fontaine В., Khurana T. S., Hoffman E. P. et al. Hyperkalemic periodic paralysis and the adult muscle sodium channel alpha-subunit ge­ ne//Science. 1990. Vol. 250. P. 1000—1002. Fontaine В., Vale-Santos J., Jurcat-Rott K. et al. Mapping of the hypokalemic periodic paralysis (HypoPP) locus to chromosome 1q31-q32 in three European families// Nature Genet. 1994. Vol. 6. P. 267—272. Fougerousse F, Broux O., Richard I. et al. Mapping of a chromosome 15 region involved in limb girdle muscular dystrophy// Hum. Molec. Genet. 1994. Vol. 3. P. 285—293. 269

Francis M. J., Nesbit M. A., Theodosiou A. M. et al. Mapping of retrotransposon sequences in the unstuble region surrounding the spinal muscular atrophy locus in 5q13// Genomics. 1995. Vol. 27. P. 366—369. Francke U., Ochs H. D., de Martinville B. et al. Minor Xp2 chromosome deletion in a male associated with expression of Duchenne muscular dystrophy, chronic granulomatose deseases, retinits pigmentosa, and MvLeod syndrome//Am. J. Hum. Genet. 1985. Vol. 37. P. 250— 267. Francke U., Darras В. Т., Hersh J. H., Berg В. O., Miller R. G. Brother/ sister pairs affected with early-onset, progressive muscular dystrophyimolecular studies reveal etiologic heterogeneity//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 63—72. Fu Y.-H., Pizzuti A., Fenwick R. G. et al. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy// Science. 1992. Vol. 255. P. 1256—1258. Fu Y.-H., Friedman D. L, Richards S. et al. Decreased expression of myotonin-protein kinase messenger RNA and protein in adult form of myotonic dystrophy// Science. 1993. Vol. 260. P. 235—238. Fu K., Hartlen R., Johns T. et al. A novel heteroplasmic tRNAIeu(CUN) mtDNA point mutation in a sporadic patient with mitochondrial encephalomyopathy segregates rapidly in skeletal muscle and suggests an approuch to therapy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1835—1840. Fuchs E., Cleveland D. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease// Sci. 1998. Vol. 279. P. 514—519. Fukujama F, Osawa M., Suzuki H. Congenital progressive muscular dystrophy of the Fukujama type clinical, genetic and pathological considerations// Brain Dev. 1981. Vol. 3. P. 1—30. Furukawa K., Pante N., Aebi U.f Gerace L. Clonning of a cDNAfor laminaassociated polypeptide 2 (LAP2) and identification of regions that specify targeting to the nuclear envelope// EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 1626—1636. Gache Y, Chavanas S., Lacour J. P. et al. Defective expression of plectin/ HD1 in epidermolysis bullosa simplex associated with muscular dystrophy//J. Clin. Invest. 1996. Vol. 97. P. 2289—2298.

270

Gal A., Mucke J., Theile H. et al. X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: suggestion of linkage with a cloned DNA sequence from proximal Xq// Hum. Genet. 1985. Vol. 70. P. 38—42. Gautam M., Noakes P. G., Mudd J. et al. Failure of postsynaptic specialization to develop at neuromuscular junctions of rapsyndeficient mice// Nature. 1995. Vol. 377. P. 232—236. Gautron C, Daegelen D.f Mennecier F. et al. Molecular mechanisms of McArdle's disease (muscle glycogen phosphorylase deficiency)// J. Clin. Invest. 1987. Vol. 79. P. 275—281. Gavrilov D. K., Shi X., Das K., Gilliam Т. C, Wang С. H. Differential SMN2 expression associated with SMA severity// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 230—231. Gee S. H., Montanaro R, Lindenbaum M. H., Carbonetto S. Dystroglycanalpha, a dystrophin-associated glycoprotein is a functional agrin receptor// Cell. 1994. Vol. 77. P. 675—686. George A. L, Ledbetter D. H.f Kallen R. G., Barchi R. L. Assignment of a human skeletal muscle sodium channel alpha-subunit gene (SCN4A) to 17q23.1-25.3//Genomics. 1991. Vol. 9. P. 555—556. George A. L, Komisarof J., Kallen R. G., Barchi R. L. Primary structure of the adult human skeletal muscle voltage-dependent sodium channel//Ann. Neurol. 1992. Vol. 31. P. 131—137. George A. L, Crackower M. A., Adballa J. A. et al. Molecular basis of Thomsen's disease (autosomal dominant myotonia congenita)// Nature Genet. 1993. Vol. 3. P. 305—310. Gesemann M.f Cavalli V, Denzer A. J. Alternative splicing of agrin alters its binding to heparin, dysroglycan, and the putative agrin rece­ ptor// Neuron. 1996. Vol.16. P. 755—767. Giannelli, F. Theoretical expectations for deletional mutations in Duchenne muscular dystrophy//Am. J. Med. Genet. 1988. Vol. 31. P. 991—992. Gilbert J. R., Stajich J. M., Wall S. et al. Evidence for heterogeneity in facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)// Am. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 53. P. 401—408. Gilbert R., et al. Efficient utrophin expression following adenovirus gene transfer in dystrophic muscle// Biochem. Biophys. Res. Com. 1998. Vol. 242. P. 244—247.

271

Ginjaar H. В., Bakker Е., Dunnen J. Т. et al. Immunological study of dystrophin in Duchenne fetus// Lancet. 1989. Nov. 18. P. 1212— 1213. Goebrl H. H., Anderson J. R.f Hubner C. et al. Congenetal myopathywith excess of thin filaments//Neuromusc. Disord. 1997. Vol. 7. P. 160— 168. Goldfarb L. G., Park K.-Y, Cervenakova S. et al. Missense mutations in desmin associaed with familial cardiac and skeletal myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 402—403. Goonewardena P., Welihinda J., Anvert M. et al. A linkage study of the locus for X-linked Charcot-Marie-Tooth disease// Clin. Genet. 1988. Vol. 33. P. 435—440. Gorecki D. C, Monaco A. P., Deny J. M. J. Expression of four alternative dystrrophin transcripts in brain regions regulated by different promoteers//Hum. Mol. Genet. 1992. Vol.1 (7). P. 505—510. Goto Y, No пака l.f Horai S. A mutation in the tRNA-leu (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies// Nature. 1990. Vol. 348., P. 651—653. Goto Y., Horai S. Matsuoka T. et al. Mitochondrial myopathy, encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS): of a correlative study of the clinical features and mitochondrial DNA mutation// Neurology. 1992. Vol. 42. P. 545— 550. Gourdon G., Radvanyi F., Lia A.-S. et al. Moderate intergenerational and somatic instability of a 55-CTG repeat in transgenic mice// Nature Genet. 1997. Vol. 15. P. 190—192. Grady R. M., Teng H., Nichol M. C. et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy//Cell. 1997a. Vol.90. P. 729—738. Grady R. M., Merlie J. P., Sanes J. R. Subtle neuromuscular defects in utrophin-deficient mice//J. Cell Biol. 1997b. Vol. 136. P. 871—882. Greenberg D. S., Sunada Y., Campbell K. P., Yaffe D., Nudel U. Exogenous Dp71 restores the dystrophin associated proteins but does not alleviate muscle damage in mdx mice// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 340—344. Greenberg D. S.f Schatz Y, Levy Z. et al. Reduced levels of dystrophin associated proteins in the brain of mice deficient for Dp71// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1299—1301. 272

Grether M. E., Abrams J. M., Agapite J., White K., Steller H. The head involution defective gene of Drosophila melanogaster functions in programmed cell death// Genes Develop. 1995. Vol. 9. P. 1694— 1708. G riff its L. R.f Zwi M. В., McLeod J. G., Nicholson G. A. Linkage studies on Charcot-Marie-Tooth neuropathy type Ml (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1987. Vol. 46. P. 624 only. G riff its L. R., Zwi M. В., McLeod J. G., Nicholson G. A. Chromosome I linkage studies in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type Ml Am. J. Hum. Genet. 1988. Vol. 42. P. 756—771. Guern E., Magi S.f Parry G. et al. New connexin 32 mutations associated with X-linked Charcot-Marie-Tooth disease// Neurology. 1995, Vol.45. P. 1863—1866. Guiloff R. J., Thomas P. K., Contreras M. et al. Evidence for linkage of type I hereditary motor and sensory neuropathy to the Daffy locus on chromosome 1//Ann. Hum. Genet. 1982, Vol. 46. P. 25—27. Guimera J., Casas C, Pucharcos C. et al. A human homologue of Drosophila minibrain (MNB) is expressed in the neuronal regions affected in Down syndrome and maps to the critical region// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1305—1310. Haan E. A., Freemantle C. J., McCure J. A., Friend K. L., Mulley J. C. Assigment of the gene for central core desease to chromosome 19// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 187—190. Hahnen E., Schonling J., Rudnik-Schoneborn S. et al. Missence mutations in exon 6 of the survival motor neuron gene in patients with spinal muscular atrophy (SMA)//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 821—825. Harding A. E., Petty R. К. H., Morgan-Hughes J. A. et al. Mitochondrial myopathies: a genetic study of 71 cases// J. Med. Genet. 1988. Vol. 25. P. 528—535. Harley H. G., Brook J. D., Flojd J. et al. Detection of linkage disequilibrium between the myotonic dystrophy locus and anew polymorphic DNA marker// Am. J. Hum Genet. 1991. Vol. 49. P. 68—75. Harley H. G., Brook J. D., Rundle S. A. et al. Expansion of an unstable DNA region and phenotypic variation in myotonic dystrophy// Nature. 1992. Vol. 355. P. 545—546.

18 Заказ № 170

273

Harris S. Moncrieff C, Johnson K. Myotonic dystrophy: will the real gene please step forward Ml Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1417—1423. Hayasaka K., Himuro M., Wang Y. et al. Structure and chromosomal localization of the gene encoding the human myelin protein zero (MPZ)//Genomics. 1993a. Vol. 17. P. 755—758. Hayasaka K., Himuro M., Sato W. et al. Charcot-Marie-Tooth neuropathy type IB is assotiated with mutations of the myelin P(O) gene// Nature Genet. 1993b. Vol. 5. P. 31—34. Hayashi Y. K. Chou F.-L, Engvall E. et al. Mutations in the integrin alpha7 gene cause congenetal myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 94—97. Hentati A., Lamy C, Melki J. et al. Clinical and genetic heterogeneity of Charcot-Marie-Tooth disease// Genomics. 1992a. Vol. 12. P. 155— 157. Hentati A., Bejaoui K., Pericak-Vance M. A. et al. The gene locus for one from of juvenile amyotrophic lateral sclerosis maps to hromosome 211 (Abstr.) Am. J. Hum. Genet. 1992b. Vol. 51 (suppl.). P. A33 only. Hentati A., Bejaoui K., Pericak-Vance M. A. et al. Linkage of recessive familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 2q33-q35// Nature Genet. 1994. Vol. 7. P. 425—428. Helbling-LeclercA.,fehang X.,Topaloglu H. et al. Mutations in the laminin alpha 2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenetal muscular dystrophy// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 216—218. Heringham W. P. Muscular atrophy of the perioneal type affecting many members of a family// Brain. 1889. Vol. 11. P. 230—236. Hewitt J. E., Lyle R. Clark L. H. et al. Analysis of the tandem repeat locus D4Z4 associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy//Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 1287—1295. Hillaire D., Leclerc A., Faure S., et al. Localization of mersoin-negative congential muscular dystrophy to chromosome 6q2 by homozygosity mapping//Hum. Mol. genet. 1994. Vol. 3. P. 1657—1661. Holt I. L., Harding A. E. Morgan-Hughes J. A. et al. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies// Nature. 1988. Vol. 331. P. 717—719. f

f

f

f

274

Hoogendijk J. R, Hensels G. W., Gabreels-Festen A.A.W.M. et al. De novo mutation in hereditary motor and sensory neuropathy type Ml Lancet. 1992. Vol. 339. P. 1081—1082. Hoogendijk J. E., Janssen E. A. M.f Gabreels-Resten A. A. W. M. et al. Allelic heterogeneity in hereditary motor and sensory neuropathy type 1a (Charcot-Marie-Tooth disease type la)// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 1010—1015. Howard P. L., Dally G. Y, Wong M. H. et al. Localization of dystrophin isoform Dp71 to the inner limiting membrane of the retina suggests a unique functional contribution of Dp71 in the retina// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1385—1391 Hu L. J. f Laporte J., Kress W. et al. Deletion in Xq28 in two boys with myotubular myopathy and abnormal genital development define a new contiguous gene syndrome in a 430 kb region// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 139—143. Ни X., Burghes A. H. M., Bulman D. E., Ray P. N., Worton R. G. Evidence for mutation by unequal sister chromatid exchange in the Duchenne muscular dystropy gene// Ami. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 44. P. 855—863. HurkoO., Hoffman E. P., McKee L.f Jhons D. R., Kunkel L. M. Dystrophin analysis in clonal myoblasts derived from a Duchenne muscular dystrophy carrier//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 44. P. 820—826. Huxley C, Passage E., Manson A. et al. Construction of a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A by pronuclear injection of human YAC DNA// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 563—569. Huxley C, Passage E., Robertson A. M.f Youl B. Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 449—458 Ibragimov-Beskrovnaya O., Ervasti J.M., Leveille C.J. et al. Primary structure of dystrophin-asociated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix// Nature. 1992. Vol. 355. P. 696—702. Ibragimov-Beskrovnaya O., Milatovich A., Ozcelik T. et al. Human dystroglycan: sceletal muscle cDNA, genomic structure, origin of tissue-specific forms and chromosomal localization// Hum. Mol. Genet. 1993. Vol. 2. P. 1651—1657.

275

Im W. В., Phelps S. F., Copen E. H. et al. Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different muta­ tions// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol 5. P. 1149—1153. lonasescu V. V., Trofatter J., Haines J. L. et al. X-linked recessive Charcot-Marie-Tooth neuropathy: clinical and genetic study// Muscle Nerve. 1992. Vol. 15. P. 368—373. lonasescu V. V, lonasescu R., Searby C. Screening of dominantly inherited Charcot-Marie-Tooth neuropathy// Musle Nerve. 1993. Vol. 16. P. 1232—1238. lonasescu V. V. Charcot-Marie-Tooth neuropathy: from clinical description to molecular genetics// Musle Nerve. 1995. Vol. 18. P 267—275. lonasescu V., Searby C, Sheffield V. C. et al. Autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth axonal neuropathy mapped on chromosome 7p (CMT2D)//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1373—1375. Isozumi K., DeLong R., Kaplan J. et. al. Linkage of scapuloperoneal spinal muscular atrophy to chromosome 12q24.1-q24.31//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1377—1382. Iwasaki H., Stewart P. W., Dilley W. G. et al. A minisatellite and microsatellite polymorphism within 1.5 kb at the human muscle glycogen phosphorylase (PYGM) locus can be amplified by PCR and have combined informativeness of PIC 0.95// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 7—15. Jaksch M., et al. A systematic mutation screen of 10 nuclear and 25 mitochondrial candidate genes in21 patients with cytochrome с pxydase (COX) deficiency shows tRNA(Ser)(UCN) mutations n subgroup with syndromal encephalopathy// J. Med. Genet. 1998. Vol. 35. P. 895—900. Jansen G., Mahadevan M., Amemia C. et al. Characterization of the myotonic dystrophy region predicts multiple protein isoformencoding mRNAs// Nature Genet. 1992. Vol. 1. P. 261—238. Jansen G., Bachner D., Coerwinkel M. et al. Structural organization and developmental expression pattern of the mouse Wd-repeat gene Dmr-N9 immediately upstream of the myotonic dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 843—852. Jansen G., Groenen P. J. T. A., Bachner D. et al. Abnormal myotonic dystrophy protein kinase levels produce only mild myopathy in mice// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 316—324.

276

Jardine P. E.,Upadhyayava M., Maynard J., et al. A scapular onset muscular dystrophy without facial involement: possible allelism with facioscapulohumeral muscular dystrophy// Neuromusc. Disord. 1994. Vol. 4. P. 477—482. Jobsis G. J., Barth P. G., Boers J. M. et al. Bethlem myopathy: clinical and genetic aspects// Neurology. 1995. Vol. 45. P. 881 S. Jobsis G. J., Barth P. G., Boers J. M. et al. Genetic localization of Bethlem myopathy// Neurology. 1996a. Vol. 46. P. 779—782. Jobsis G. J., Keizers H., Vreijling J. P. et al. Type VI collagen mutations in Bethlem myopathy, an autosomal dominant myopathy with contractures// Nature Genet. 1996b. Vol. 14. P. 113—115. Johns D. R., Rutledge S. L, Stine О. C, Hurko O. Direct repeated sequences associated with pathogenic of mitochondrial DNA deletions// Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 8059—8062. Jones С. Т., Brock D. J. H., Chancellor A. M., WArlow C. P., Swingler R. J. Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) mutations and sporadic amyotrophic lateral sclerosis// Lancet. 1993. Vol. 342. P. 1050— 1051. Jurkat-Rott K., Lehmann-Horn R, Elbaz A. et al. A calcium channel mutation causing hypokalemic periodic paralysis// Hum Mol. Genet. ( 1994. Vol.3. P. 1415—1419. Kameya S., Araki E., Katsuki M. et al. Dp260 disrupted mice revealed prolonged implicit time of the b-wave in ERG and loss of accumulation of [beta]-dystroglycan in the outer plexiform layer of the retina//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 2195—2203 Kaush K.f Lehmann-Horn R, Janka M. et al. Evidence for linkage of the central core desease locus to the proximal long arm of human chromosome 19//Genomics. 1991. Vol. 10. P. 765—769. Klamut H. J., Bosnoyan-Collins L. O., Worton R. G., Ray P. N., Davis H. L. Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the human dystrophin gene// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1599—1606. Klein C. J., Coovert D. D., Bulman D. E. et al. Somatic reversion/ suppression Duchenne muscular dystrophy (DMD): evidence supporting a frame-restoring mechanism in rare dystrophin-positive fibers//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 50. P. 950—959.

277

Klesert Т. R., Otten A. D., Bird T. D. et al. Trinucleotide repeat expansion at the myotonic dystrophy locus reduces expression of DMAHP// Nature Genet. 1997. Vol. 17. P. 402—406. Koch M. C, Ricker K., Otto M. et al. Confirmation of linkage of hyperkalemic periodic paralysis to chromosome 17//J. Med. Genet. 1991.28. P. 583—586. Koch M. C, Steinmeyer K.f Lorenz C. et al. The skeletal muscle chloride channal in dominant and recessive human myotonia//Science. 1992. Vol. 257. P. 797—800. Koch M. C, Ricker K., Otto M. et al. Evidence for genetic homogeneity in autosomal recessive generalized myotonia (Becker)// J.Med. Genet. 1993. Vol. 30. P. 914—917. Koch M. C, Baumbach K., George A. L, Ricker K. Paramyotonia congenita without paralysis on exposure to cold: a novel mutation in the SCN4A gene (Val1293lle)// Neuroreport. 1995. Vol. 6. P. 2001—2004. Koenig M., Beggs A. H., Moyer M. et al. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystropy: correlation with type of deletion//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 498—506. Koenig M., Hoffman E. P., Bertolsln C. J. et al. Complete cloninig of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DND gene in normal and affected individuals// Cell. 1987. Vol. 50. P. 509—517. Koenig M.f Monaco T, Kunkel L.M. The complete sequence of dystropin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein// Cell. 1988. Vol. 53. P. 219—228. koob M. D., Moseley M. L, Schut L. J. et al. An untraslated CTG expansion causes a novel form of spinocerebellar ataxia (SCA8)// Nature Genet" 1999. Vol. 21. P. 379—384. Kubisch C, Schmidt-Rosel T, Fontaine B. et al. CIC-1 chloride channel mutations in myotonia congenita: variable penetrance of mutations shifting the voltage dependence// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1753—1760 Kulkens T, Bolhuis P. A., Wolterman R. A. et al. Deletion of the serin 34 codon from the major peripheral myelin protein P(O) gene in CharcotMarie-Tooth disease type IB// Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 35— 39.

278

Kumar-Singh R., Chamberlain J. S. Encapsidated adenovirus minichromosomes allow delivery and expression of a 14 kb dystrophin cDNAto muscle cells// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 913—921. Kunkel L. M.f Monaco A. P., Middlesworth W., Ochs H. D., Latt S. A. Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with an X chromosome deletion// Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. Vol. 82. P. 4778—4782. Kunst С. В., Mezey E., Browstein M. J., Patterson D. Mutations in SOD1 associated with amyotrophic lateral sclerosis cause novel protein interactions// Nature Genet. 1997. Vol. 15. P. 91—94. Kwon J. L, Elliott J. L, Woon-chee Y. et al. Assignment of a second Charcot-Marie-Tooth type II locus to chromosome 3q//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 57. P. 853—858. Laing N. G., Majda В. T, Akkari P. A. et al. Assignment of a gene (NEM1) for autosomnal dominant nemaline myopathy to chromosome 1// Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. P. 50, 576—583. Laing N. G.f Wilton S. D., Akkari P. A. et al. A mutation in the alpha tropomyosin gene ТРМЗ associated with autosomal dominant nemaline myopathy// Nature Genet.. 1995. Vol. 9,. P. 75—79. Lakich D., Kazazian H. H., Antonarakis St. E., Gitschier J. Inversion disrupting the factor VIII gene are common cause of sever haemophilia N1 Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 236—241. Lalvani A. K., Brister J. R., Fex J. et al. A new nonsyndromic X-linked sensorineural hearing inpairment linked to Xp21.2//Am.J. Hum. Genet. 1994. Vol. 55. P. 685—694. Lamandi S. R., Bateman J. F.f Hutchison W. et al. Reduced collagen VI causes Bethlem myopathy: a heterozygous COL6A1 nonsense mutation results in mRNA decay and functional haploinsufficiency// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 981—989 Land J. M., Morgan-Hughes J. A., Clark J. B. et al. Mitochondrial myopathies: biochemical studies revealing a deficiency of NADHcytochrome b reductase activity// J. Neurol. Sci. 1981. Vol. 50. P. 1—13. Laporte J. f Hu L. J., Kretz C. et al. A gene mutated in X-linked myotubular myopathy defines a new putative tyrosine phosphatase family conserved in yeast// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 175—182.

279

Laporte J., Guiraud-Chaumeil C, Vincent M.-C. et al. Mutations in the MTM1 gene implicated in X-linked myotubular myopathy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1505—1511. Laporte J., Blondeau F., Buj-Bello A. et al. Characterization of the myotubularin dual specificity phosphatase gene family from yeast to human// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1703—1712 Lebo R. V., Gorin F., Fletterick R. J. et al. High-resolution chromosome sorting and DNA spot-blot analysis assign McArdle's syndrome to chromosome 11//Science. 1984. Vol. 225. P. 57—59. Lebo R. V. and 39 others. Chromosome I Charcot-Marie-Tooth locus in Fc-gamma-RII gene region// (Abstr.). Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45 (suppl.). P.A148 only. Lebo R. V, Anderson L. A., DiMauro S. et al. Rare McArdle disease locus polymorphic site on 11q13 contains CpG sequence// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 17—24. Lebo R. V, Lynch E. D., Wiegant J. et al. Multicolor fluorescence in situ hibridization and pulsed field electrophoresis dissect CMT1В gene region// Hum. Genet. 1991. Vol. 88. P. 13—20. Lebo R. V., Lynch E. D., Bird T. D. et al. Multicolor in situ hibridization and linkage analysis order Charcot-Marie-Tooth type I (CMT1A) gene-region markers//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 50. P. 42— 55. Lederfein D., Levy Z., Augier N. et al. A 71-kilodalton protein is a Duchenne muscular dystrophy gene major product of the in brain and other nonmuscle tissue// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993a. Vol. 89. P. 5346—5350. Lederfein D.f Yaffe D., Nudel U. A housekeeping type promotor, located in the 3-prime region of the Duchenne muscular dystrophy gene, controls the expression of Dp71, a major product of the gene// Hum. Mol. Genet. 1993b. Vol. 2. P. 1883—1888. Lefebvre S., Burglan L., Reboullet S. et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene// Cell. 1995. Vol. 80. P. 165—185. Lefebvre S., Bbrglen L., Frfiza J. et al.The role of the SMN gene in proximal spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1531—1536. LeGuern E., Sturtz F, Gugenheim M. et al. Detection of deletion within 17p11.2 in 7 French families with hereditary neuropathy with liability 280

to pressure palsies (HNPP)// Cytogen. Cell Genet. 1994. Vol. 65. P. 261—264. LeGuern E., Gouider R., Ravise N. et al. A de novo case of hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP) of material origin: a new mechanism for deletion in 17p11.2111 Hum. Mol. Genet. 1996a. Vol.5. P. 103—106. LeGuern E., Guilbot A., Kessali M. et al. Homozygosity mapping of an autosomal recessive form of demyelinating Charcot-Marie-Tooth disease to chromosome 5q23-q33//Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 1685—1688. LehesjokiA.-E., Sankila E.-M., Miao J. etal. X-linked neonatal myotubular myopathy: one recombination detected with four polymorphic DNA markers from Xq28//J. Med. Genet. 1990. Vol. 27. P. 288—291. Lehmann-Horn R, Kuther G., Ricker K. et al. Adynamia episodica hereditaria with myotonia: a non-inactivating sodium current and the effect of extracellular pH// Muscle Nerve. 1987. Vol. 10. P. 363— 374. Lehmann-Horn R, Rudel R., Ricker K. Workshop report: Non-dystrophic myotonias and periodic paralysis// Neuromusc. Disord. 1993. Vol. 3. P. 161—168. Lein L. L., Boyce F. M., Kleyn P. et al. Mapping of a gene encoding a dystrophin cross-reactive protein in close proximity to the spinal muscular atrophy locus//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49 (suppl.). P. 412 only. Lemke G., Axel R. Isolation and sequence of а с DNA encoding the major structural protein of peripheral myelin// Cell. 1985. Vol. 40. P. 501—508. Lemmers R. J. L. R, van der Maarel S. M., van Deutekom J. С. T. et al. Interand intrachromosomal sub-telomeric rearrangements on 4q35: implications for facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) aetiology and diagnosis// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1207— 1214. Lenk U., Oexle K., Voit T. et al. A cystein 3340 substitution in the dystroglycan-binding domainof dustrophin associated with Duchenne muscular dystrophy, mental retardation and absence of the ERG b-wave// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 973—975. Lia A.-S., Seznec H., Hofmann-RadvanyM H. et al. Somatic instability of the CTG repeat in mice transgenic for the myotonic dystrophy region 281

is age dependent but not correlated to the relative intertissue transcription levels and proliferative capacities // Hum. Mol. Genet.1998. Vol.7. P. 1285—1291. Liechti-Gallati S., Koenig M., Kunkel L M . et al. Molecular deletion patterns in Duchenne and Becker type muscular dystrophy// Hum. Genet. 1989. Vol. 81. P. 343—348. Lim L. E., Duclos F., Broux O. et al. Beta-sarcoglycan: characterization and role in limb-girdle muscular dystrophy linked to 4q12// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 257—265. Liu J., Aoki M., Ilia I. et al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 31—36. Liu Q., Dreyfuss G. A novel nuclear structure containing the survival of motor neurons protein// EMBO J. 1996. Vol. 15. P. 3555—3565. Lorson C. L., Androphy E. J. The domain encoded by exon 2 of the survival motor neuron protein mediates nucleic acid binding// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1269—1275. Lorson C. L., Strasswimmer J., Yao J.-M. et al. SMN oligomerization defect correlate with spinal muscular atrophy severity// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 6 3 - 6 6 . Lupski J. R., Montes de Oca-Luna R., Slaugenhaupt S. et al. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Cell. 1991. Vol. 66. P. 219—232. Mahadevan M. S., Amemiya C, Jaansen G. et al. Structure and genomic sequence of the myotonic dystrophy (DM kinase) gene// Hum. Mol. Genet. 1993. Vol. 2. P. 299—304. Mahadevan M. S., Komeluk R. G., Roy N., McKenzie A., Ikeda J.-E. SMA genes: deleted and duplicated// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 112—113. Malhotra S. В., Hart K. A., Klamut H. J. et al. Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy// Science. 1988. Vol. 242. P. 755—759. Manilal S., thi Man N., Sewry C. A., Morris G. E. The Emery-Dreifuss muscular dystrophy protein, emerin, is a nuclear membrane prote­ in// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 801—808.

282

Manilal S., Recan D., Sewry C. A. et al. Mutations in Emery-Dreifuss muscular dystrophy and their effects on emerin protein expression// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 855—864. Martorell L, Martinez J. M., Carey N. Johnson K., Baiget M. Comparison of CTG repeat length expansion and clinical progression of myotonic dystrophy over a five year period// J. Med. Genet. 1995. Vol." 32. P. 593—596. Martorell L. . Monckton D. G., Gamez J.et al. Progression of somatic CTG repeat length heterogeneity in the blood cells of myotonic dystrophy patients// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 307—312. Mathews K. D. Mills K. A., Leysens N. J. et al. Characterization of the facioscapulohumeral dystrophy locus on 4q35// (Abstract). Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49 (suppl.). P. 350 only. Matsumura K. Tome F. M. S. Collin H. Deficiency 50K dystrophinassociated glycoprotein in severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy// Nature. 1992. Vol. 359. P. 320—322. Matsumura K., Nonaka I., Campbell K. P. Abnormal expression of dystrophin-associated proteins in Fukujama-type congenital muscular dystrophy// Lancet. 1993. Vol. 341. P. 521—522. Matsuo M. Duchenne/Becker muscular dystrophy: from molecular diagnosis to gene therapy// Brain Dev. 1996. Vol.18(3). P. 167— 172. Mattei M.-G. Castella-Escola J., Ojicius D. et al. In situ mapping of the phosphoglycerate mutase muscular form to the human chromosome 711 (Abstract). Cytognet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1041 only. Mayer U. et al. Absence of integrin alpha 7 causes a novel form of muscular dystrophy// Nature Genet. 1997. Vol. 17. P. 318—323. McClatchey A. I., McKenna-Yasec D., Cros D. et al. Novel mutations in families with unusual and variable disorders of the skeletal muscle sodium channel// Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 148—152. McNally E. M., Yoshida M., Mizuno Y, Ozawa E., Kunkel L. M. Human adhalin is alternatively spliced and gene is located on chromosome 17p21// Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 9690—9694. f

f

f

f

f

f

f

McNally E. M. Duggan D., Gorospe J. R. et al. Mutation that disrupt the carboxyl-terminus of gamma-sarcoglycan cause muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1841—1847. f

283

McNally E. M., de Moreira E., Duggan D. J. et al. Caveolin-3 in muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 871—877. Melki J., Lefebvre S., Burglan L. et al. De novo and inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophy// Science. 1994. Vol. 264. P. 1474—1477. Mercuri E., Muntoni F.f Berardinelli A. et al. Somatosensory and visual evoked potentials in congenital muscular dystrophy: correlation with MRI changes and muscle merosin status// Neuropediatrics. 1995. Vol. 26. P. 3—7. Metzinger L., Blake D. J., Squier M. V. et al. Dystrobrevin deficiency at the sarcolemma of patients with muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1185—1191. Michalak M., Fu S. Y, Milner R.E. et al. Phosphorylation of the carboxylterminal region of dystrophin// Biochem. Cell Biol. 1996. Vol. 74(4). P. 431—437. Miciak A., Keen A., Jadayel D., Bundey S. Multiple mutation in an extended Duchenne muscular dystrophy family// J. Med. Genet. 1992. Vol. 29. P. 123—126. Middleton-Price H. R., Harding A. E., MonteiroC, Berciano J., Malkolm S. Linkage of hereditary motor and sensory neuropathy type I to the pericentromeric region of chromosome 17//Am. J. Hum. Genet. 1990.Vol.46. P. 92—94. Milasin J., Muntoni F.f Severini G. M. M. et al. A point mutation in the 5' splice site of the dystrophin gene first intron responsible for X-linked dilated cardiomyopathy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 73— 79. Minetti C, Sotgia F., Bruno С et al. Mutations in the caveolin-3 gene cause autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. P. 365—368. Minoletti F., Colombo I., Liras Martin A. et al. Localization of the human gene for carnitine palmitoyltransferase to 1p13-p11 by nonradioactive in situ hybridization// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 1372—1374. Mitrani-Rosenbaum S.,ArgovZ., BlumenfeldA. et al. Hereditary inclusion body myopathy maps to chromosome 9p1-q1// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 159—163. Monaco T. Dystrophin, the protein product of the Duchenne/Becker muscular dystrophy gene//TIBS. 1989. Vol. 14. P. 412—415. 284

Monaco Т., Kunkel L M. Cloning of the Duchenne/Becker muscular dystrophy locus//Advances in Hum. Genet. 1988. Vol. 17. P. 6 1 — 98. Monckton D. G., Coolbaugh M. I., Ashizawa K.T., Siciliano M.J., Caskey С. T. Hypermutable myotonic dystrophy CTG repeats in transgenic mice// Nature Genet. 1997. Vol.15. P. 193—196. Moraes С. Т., DiMauro S., Zeviani M. et al. Mitochondrial DNA deletions in progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome// New Engl. J. Med. 1989. Vol. 320. P. 1293—1299. Morisaki Т., Gross M., Morisaki H. et al. Molecular basis of AMP deaminase deficiency in skeletal muscle// Proc. Nat. Acad. Sci. 1992. Vol.89. P.6457—6461. Morisaki Т., Morisaki H., Newby L. K.f Holmes E. W. Alternative splicing: A mechanism for phenotypic rescue of a common inherited de­ fect//J. Clin. Invest. 1993. Vol. 91. P. 2275—2280. Morris G. E., Simmons C, Man N. T. Apo-dystrophins (Dpi40 and Dp71) and dystrophin splicing isoforms in developing brain// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 215 (1). P. 361—367. Mostacciuolo M. L, Schiavon R, Angelini C. et al. Frequency of duplication at 17p11.2 in families of northest Italy with Charcot-MarieTooth disease type Ml Neuroepidemiology. 1995. Vol. 14. P. 49—53. Mulley J. C, Kozman H. M., Phillips H. A. et al. Refined genetic localization for central core desease//Am. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 52, P. 398—405. Muntoni R, Melis M. A., Ganau A., Dubowitz V. Transcription of the dystrophin gene in normal tissues and in skeletal muscle of a family with X-linked dilated cardiomyopathy//Am. J. Hum. Genet. 1995a. Vol. 56. P. 151—157. Muntoni R, Wilson L, Marrosu G. et al. A mutation in the dystrophin gene selectively affecting dystrophin expression in the heart// J. Clin. Invest. 1995b. Vol. 96. P. 693—699. Murray J. C, Davies К. E., Harper P. S. et al. Linkage relationship of a cloned DNA sequence on the short arm of the X chromosome to Duchenne muscular dystrophy// Nature. 1982. Vol. 300. P. 69—71. Nelis E.f Warner L. E., De Vriendt E. et al. Comparision of single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for detection of mutations in Charcot-Marie-Tooth type 1 disease and related neuropathies// Eur. J. Hum. Genet. 1996. Vol. 4. P. 329—333. 285

Nicholson G. A., Mesterovic N., Ross D. A. et al. Linkage of the gene for Charcot-Marie-Tooth neuropathy// (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1052—1053. Nidholson G. A., Dawkins J. L.t Blair LP. et al. The gene for hereditary sensory neuropathy typel (HSN-1) maps to chromosome 9q22.1q22.3// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 101—104. Nigro V., Piluso G., Belsito A. et al. Identification of a novel sarcoglycan gene at 5q33 encoding a sarcolemmal 35 kDa glycoprotein// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1179—1186. Nigro V., Moreira E. S., Piluso G. Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy, LGMD2F, is caused by a mutation in the deltasarcoglycan gene// Nature Genet. 1996, Vol. 14. P. 195—198. Nissenen M., Helbling-Leclerc A., Zhang X. et al. Substitution of a conserved cystein-996 in a cystein-rich motif of the laminin alpha2chain in congential muscular dystrophy with partial deficiency of the protein//Am. J. Hum. Genet. 1996. Vol. 58. P. 1177—1184. Noguchi S., McNally E. M., Ben Othmane K. et al. Mutations in the dystrophin-associated protein gamma-sarcoglican in chromosome 13 muscular dystrophy// Science. 1995. Vol. 270. P. 819—822. North K. N., Yang N., Wattanasirichaigoon D. et al. A common nonsense mutation results in a-actinin-3 deficiency in the general population// Nature Genet. 1999. Vol. 21. P. 353—354. Nowak K. J., Wattanasirichaigoon D., Goebel H. H. et al. Mutations in the skeletal muscle a-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 208— 212. Nudel U., Zuk D., Einat P. et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain// Nature. 1989. Vol. 337. P. 76—78. Olson Т. M., Michels V. V., Thibodeau S. N. et al. Actin mutations in delated cardiomyopathy, a heritable form of heartfailure// Science. 1998. Vol. 280. P. 750—752. Often A. D., Tapscott S. J. Triplet repeat expansion in myotonic dystrophy alters the adjacent chromatin structure// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 5465—5469. Palau F., Lofgren A., De Jonghe P. et al. Origin of the de novo duplication in Charcot-Marie-Tooth disease type IA: unequal nonsisterchromatid

286

exchange during spermatogenesis// Hum. Molec. Genet. 1993. Vol. 2. P. 2031—2036.. Pallavicini A., Zimbello R., Tiso N. et al. The preliminary transcript map of a human skeletal muscle// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1445—1450. Papadopoulou L. C, Sue С. M., Davidson M. M. et al. Fatal infantile cardioencephalomyopathy with COX deficiency and mutations in SC02, a COX assemble gene// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 333—337. Parsons D. W.f McAndrew P. E., Monani U. R. An 11 base pair duplication in exon 6 of the SMN gene products a type I spinal muscular atrophy (SMA) phenotype: further evidence for SMN as the primary SMAdetermining gene// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1727—1732. Passarge E. Col<5r atlas of genetics// N.-Y. Georg Thieme Verlag Stuttgart. 1995.411 p. Passos-Bueno M.R., Bakker E., Kneppers A. L. J. et al. Different mosaicism frequencies for proximal and distal Duchenne muscular dystrophy (DMD) mutations indicate difference in etiology and recurrence risk//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 1150—1155. Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Roberds S. et al. A common missense mutations in the adhalin gene in three unrelated Brazilian families with a relatively mild form of autosomal recessive limbgirdle muscular dystrophy//Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1163— 1167. Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Marie S. K. et al. Main clinical features for the three mapped autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy and estimated proportion of each form in 13 Brazilian families// J. Med. Genet. 1996a. Vol. 33. P. 97—102. Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Vainzof M. et al. Linkage analysis in autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy (AR LGMD) maps a sixth form to 5q33-34 (LGMD2F) and Indicates that there is at least one more subtype of AR LGMD// Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 815—821. Patel P.I., Franco В., Garcia C. et al. Genetic mapping of autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease in a large French-Acadian kindred: identification of new linked markers on chromosome 17// Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 46. P. 801—809.

287

Patel P. I., Franco В., Cook J. et al. Construction of a physical map on mouse and human chromosome I: comparison of 13 Mb of mouse and 11 Mb of human DNA//Hum. Mol. Genet. 1992. Vol.1. P. 613— 620. Patel P. I., Roa В. В., Welcher A. A. et al. The gene for the peripheral myelin protein PMP-22 is a candidate for Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Nature Genet. 1992a. Vol. 1. P. 159—165. Pelin K., Hilpela P., Donner K. et al. Mutation in the nebulin gene associated with autosomal recessive nemaline myopathy// Proc. Nat. Acad Sci. 1999. Vol. 96. P. 2305—2310. Peng H. В., Xie H., Rossi S. G., Rotundo R. L. Acetylcholinesterase clustering at the neuromuscular junction involves perlecan and dystroglycan//J. Cell Biol. 1999. Vol. 145. P. 911—921. Pentao L, Wise C. A., Chinault A. C, Patel P. I., Lupski J. R. CharcotMarie-Tooth type IA duplication appears to arise from recombination at repear sequences flanking the 1.5 Mb monomer unit// Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 292—300. Perrine S., Ginder G. D., Faller D. V. et al. A short-term trial of butyrate to stimulate fetal-globin-gene expression in the beta-globin disorders// New Engl. J. Med. 1993. Vol. 328. P. 81—86. Piccolo F, Jeanpierre M., Leturcq F. et al. A founder mutation in the gamma-sarcoglycan gene of Gypsies possibly predating their migration out of India// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 2019— 2022. Pham Y. C. N., thi Man N., Lam L. T, Morris G. E. Localization of myotonic dystrophy protein kinase in human and rabbit tissues using a new panel of monoclonal antibodies// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1957—1965. Phillips W. D., Noakes P. G., Roberds S. L, Campbell K. P., Merlie J. P. Clustering and immobilization of acetylcholine receptors by the 43kD protein: a possible role for dystrophin-related protein// J. Cell Biol. 1993. Vol. 123. P. 729—740. Piccolo F, Roberds S. L., Jeanpierre M. et al. Primary adhalinopathy: a common cause of autosomal recessive muscular dystrophy of variable severity// Nature Genet. 1995. Vol. 10. P. 243—245. Pillers D.-A., Bulman D. E., Weleber R. G. et al. Dystrophin exprexion in the human retina is required for normal function as defined by electroretinography// Nature Genet. 1993. Vol. 4. P. 82—86. 288

Pizzuti A., Pieretti M., Fenwick R. G., Gibbs R. A., Caskey СТ. A transposon-like element in the deletion-prone region of the dystrophin gene// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 594—600. Plassart Т., Elbaz A., Santos J. V. et al. Genetic heteroheneity in hypokalemic periodic paralysis (hypoPP)// Hum. Genet. 1994. Vol. 94. P. 551—556. Poulton J., Deadman M. E., Gardiner R. M. et al. Duplications of mitochondrial DNA in myopathy//Lancet. 1988. Vol. I. P. 236—240. Poulton J., Morten K. J., Weber K. et al. Are duplication of mitochondrial DNA characteristic of Kearns-Sayre syndrome// Hum. Mol. Genet. 1994. Vol.3. P. 947—951. Pramatarova A., Figlewicz D. A., Krizus A. et al. Identification of new mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase gene of patients with familial amyotrophic lateral sclerosis//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 56. P. 592—596. Ptacek L. J., Tyler F, Trimmer J. S., Agnew W. S., Leppert M. Analysis in a large hyperkalemic periodic paralysis pedigree support tight linkage to a sodium channel locus//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49. P. 378—382. Ptacek L. J., George A. L., Barchi R. L. et al. Mutations in an S4 segment in the adult skeletal muscle sodium channel cause paramyotonia congenita// Neuron. 1992. Vol. 8. P. 891—897. Ptacek L. J., Tawil R., Griggs R. C. et al. Dihydropyridine receptor mutations cause hypokalemic periodic paralysis// Cell. 1994. Vol. 77. P. 863—868. Pulkkinen L.f Smith F. J. D., Shimizu H. et al. Homozygous deletion mutations in the plectin gene (PLEC1) in patients with epidermolysis bullosa simplex associated with late-onset muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1539—1546. Quane K. A., Healy J. M. S., Keating К. E. et al. Mutations in the ryanodine receptor gene in central core desease and malignant hyperthermia// Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 51—55. Oudet C.f Hanauer A., Clemens P., Caskey Th., Mandel J.-L. Two hot spots of recombination in the DMD gene correlate with the deletion prone regions// Hum. Mol. Genet. 1992. Vol. 1 (8). P. 599—603. Rafael J. A., Tinsley J. M., Potter A. C, Deconinck A. E., Davies К. E. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues

utrophin-dystrophin deficient mice// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 79—82. Reaume A. G., Elliott J. L, Hoffman E. K. et al. Motor neurons in Cu/Zn superoxide dismutase-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 43—47. Reddy S., Smith D. B. J., Rich M.M. et al. Mice lacking the myotonic dystrophy protein kinase develop a late onset progressive myopathy// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 325—335. Richard I., Broux O., Allamand V. et al. Mutations in the proteolytic enzime calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2NI Cell. 1995. Vol. 81. P. 27—40. Ripps M. E., Huntley G. W., Hof R. P., Morrison J. H., Gordon J. W. Transgenic mice expressing an altered murine superoxide dismutase gene provide an animal model of amyotrophic lateral sclerosis// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 689—693. Roa В. В., Garcia C. A., Pentao L. et al. Evidence for a recessive PMP22 point mutation in Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Nature Genet. 1993a. Vol. 5. P. 189—194. Roa В. В., Dyck P. J., Marks H. G., Chance P. F., Lupski J. R. DejerineSottas syndrome associated with point mutation in the peripheral myelinprotein 22 (PMP22) gene// Nature Genet. 1993b. Vol. 5. P. 269—273. Roberds S. L, Leturcq F, Allamand V. et al. Missense mutations in the adhalin gene linked to autosomal recessive muscular dystrophy// Cell. 1994. Vol. 78. P. 625—633. Roberts R. G., Bentley D. R.f Barby T. F. M., Manners E., Bobrow M. Direct diagnosis of carriers of Duchenne and Becker muscular dystrophy by amplification of lymphocyte RNA// Lancet. 1990. Vol. 336. P. 1523—1526. Roberts R. G., Bobrov M., Bentley D. R. Point mutation in the dystrophin gene// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992a. Vol. 89. P. 2331—2335. Roberts R. G., Passos-Bueno M. R., Bobrov M., Vainzof M., Zatz M. Point mutation in a Becker muscular dystrophy patient// Hum. Mol. Genet. 1992b. Vol. 2. P. 75—77. Roberts R. G., Coffey A. G., Bobrow M., Bentley D. R. Determination of the exon structure of the distal portion of the dystrophine gene by vectorette PCR//Genomics. 1992c. Vol. 13. P. 942—950. 290

Roberts R. G., Coffey A. G., Bobrow M., Bentley, D. R. Exon structure of the human dystrophine gene//Genomics. 1993. Vol. 16. R 1—3. Roberts R. G., Freeman Т. C, Kendall E. et al. Characterization of DPR2, a novel human dystrrophin homologue// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 223—226. Roberts R. G. f Bobrow M. Dystrophins m vertebrates and invertebrates//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol.7. P. 589—595. Rodrigues N. R., Owen N.. Talbot K. et al. Gene deletion in spinal muscular atrophy//J. Med. Genet. 1996. Vol. 33. P. 93—96. Rothstein J. D., Martin L. J., Kuncel R. W. Decreased glutamate transport by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis// New Engl. J. Med. 1992. Vol. 326. P. 1381—1384. Roy N.f Mahadevan M. S.f McLeon M. et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy//Cell. 1995. Vol. 80. P. 167—178. Rudolph J. A., Spier S. J., Byrns G. et al. Periodic paralysis in Quarter horses: a sodium channel mutation dessemeneited by selective breeding Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 144—147. Sabina R. L, Morisaki Т., Clarke P. et al. Characterization of the human and rat myoadenylat deaminase genes// J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 9423—9433. Sadoulet-Puccio H. M., KhuranaT. S., Cohen J. В., Kunkel L. M. Clonning and characterization of the human homologue of the dystrophinrelated phosphoprotein found at the Torpedo electric organ post­ synaptic membrane// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5 P. 489—496. Sarfarazi M., Wijmenga C, Upadhyayava M. et al. Regional mapping of facioscapulohumeral muscular dystrophy gene on 4q35: combined analysis an international consortium//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 396—403. Scharf J. M.f Endrizzi M. G., Wetter A. Identification of a candidate modifiying gene for spinal muscular atrophy by comparative genomics// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 83—86. Schneider C, King R. M., Philipson L. Genes specificallyy expressed at growth arest of mammalian cells// Cell. 1988. Vol. 54. P. 787—793. Schoffner J. M., Wallace D. C. Oxidative phosphorilation diseases// In: ScriverC. R., BeaudetA. L, Sly W. S., Valle D. (eds).The Metabolic

291

and Molecular Bases of Inherited Disease. 1995. McGraw-Hill.N.Y. Vol. 1. P. 1535—1609. Schwartz M., Sorensen N., Hansen F. J. et al. Quantification, by solidphase minisequencing, of the telomeric and centromeric copies of the survival motor neuron gene in families with spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol .6. P. 99—104. Sealock R., Froehner S. C. Dystrophin-associated proteins and synapse formation: is a-dystroglycan the agrin receptor?// Cell. 1994. Vol. 77. P. 617—619. Sewry C. A., Sansome A., Matsumura K., Campbell K. P., Dubowitz V. Deficiency of the 50 kDa dystrophin-associated glycoprotein and abnormal expression of utrophin in two South Asian cousins with variable expression of severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy// Neuromusc. Disord. 1994. Vol. 4. P. 121— 129. Shaw D. A., McCurach M. E., Rundle S. A. et al. Genomic organization and transcriptional units at the myotonic dystrophy locus// Genomics. 1993. Vol. 18. P. 673—679. Shanske S., Sakoda S., Hermodson M.A., DiMauro S., Schon E. A. Isolation of a cDNA encoding the muscle-specific subunit of human phosphoglycerate mutase// J. Biol. Chem. 1987 Vol. 262. P. 14612—14617. Shoubridge E. A., Johns Т., KarpatM G. Complete restoration of a wild-type mtDNA genotype in regenerating muscle fibres in a patient with a tRNA point mutation and mitochondrial encephalomyopathy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 2239—2242. Siddique Т., Pericak-Vance M. A., Brooks B. R. et al. Genetic linkage analysis in familial amyotrophic lateral sclerosis// (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1080 only. Siddique Т., Figlewicz D. A., Pericak-Vance M. A. et al. Linkage of a gene causing familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 21 and evidence of geneticlocus heterogeneity// New Engl. J. Med. 1991. Vol. 324. P. 1381—1384. Siddique Т., Deng H-X. Genetics of amiotrophic lateral sclerosis// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1465—1470. Skre H. Genetic and clinical aspects of Charcot-Marie-Tooth's disease// Clin.Genet. 1974. Vol. 6. P. 98—118.

292

Slipetz D. M., Aprille J. R., Goodyer R R., Rozen R. Deficiency of complex III of the mitochondrial respiratory chain in a patient with facioscapulohumeral desease//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 502—510. Small K., Iber J., Warren S. T. Emerin deletion reveals a common Xchromosome inversion mediated by inverted repeats// Nature Genet. 1997. Vol. 16. P. 96—99. Small K., Warren S. T. Emerin deletions occurring on both Xq28 inversion backgrounds// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 135 139. Smith F. J. D., Eady R. A. J., Leigh I. M. et al. Plectin deficiency results in muscular dystrophy with epidermolysis bullosa// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 450—457. Sosinsky G. Mixing of connexins in gap junction membrane channels.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 9210—9214. Speer M. C, Tandan R., Rao P. N. et al. Evidence for locus heterogeneity in the Bethlem myopathy and linkage to 2q37// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol.5. P. 1043—1046. Steinmeyer K., Ortland C, Jentsch T. J. Primary structure and functional expreddion of a developmental^ regulated skeletal muscle chloride channel// Nature. 1991a. P. Vol. 354. P. 301—304. Steinmeyer K., Klocke R., Ortland C. et al. Inactivation of muscle chloride channel by transposon insertion in myotonic mice//Nature. 1991b. Vol. 354. P. 304—308. Sternberg D., Dananl O, Lombns A. et al. Exhaustive scanning approach to screen all the mitochondrial tRNA genes for mutations and its application to the investigation of 35 independent patients with mitochondrial disorders// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 33— 42. Su Y., Brooks D. G., Li L. et al. Myelin protein zero gene mutated in Charcot-Marie-Tooth type IB patients// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 10856—10860. Suomalainen A., Majander A., Haltia M. et al. Multiple deletions of mitochondrial DNA in several tissues of the patient with severe retarded depression and familial progressive external ophthalmoplegia//J. Clin. Invest. 1992. Vol .90. P. 61—66. Suter U., Moskow J. J., Welcher A. A. A leucine-to-proline mutation in the putative first transmembrane domain of the 22 kDa peripheral

293

myelin protein in the trember-J mouse// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol .89. P. 4382—4386. Suzuki A., Yoshida M., Hayashi K., Mizuno Y, Hagiwara Y, Ozawa E. Molecular organization at the glycoprotein-complex-binding site of dystrophin. Three dystrophin-associated proteins bind directly to the carboxy-terminal portion of dystrophin// Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 220. P. 283—292. Suzuki A., Yoshida M., Ozawa E. Mammalian alphaland betal-syntrophin bind to the alternative splice-prone region of the dystrophin COOH terminus//J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 373—381. Tahvanainen E., Beggs A. H., Wallgren-Pettersson C. Exclusion of two candidate loci for autosomal recessive nemaline myopathy//J. Med. Genet. 1994. Vol. 31. P. 79—80. Takeshima H.f lino M., Takekura H. et al. Exitation-contraction uncoupling and muscular degeneration in mice lacking functional skeletal muscle ryanodine receptor gene// Nature. 1994. Vol. 369. P. 556— 559. Talbot K., Ponting C. P., Theodosiou A. M. et al. Missense mutation clustering in the survival motor neuron gene: a role for conserved tyrosine and glycine rich region of the protein in RNA metabolism?// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 497—500. Talbot K., Miguel-Aliaga I., Mohaghegh P. et al. Characterization of a gene encoding Survival Motor Neuron (SMN)-related protein, a constituent of the spliceosome complex// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol.7. P. 2149—2156. Tan P. et al. Homozygosity for a nonsense mutation in the a-tropomiosine gene ТРМЗ in a patient with severe nemaline myopathy// Neuromuscul. Disord. 1999. Vol. 7.427—428. Taneja K. L, McCurrach M., Schalling M., Housman D., Singer R. H. Foci of trinucleotide repeat transcripts in nuckei of myotonic dystrophy cells and tissue// J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 995— 1002. Taroni F, Verderio E., Fiorucci S. et al. Molecular characterization of inherited carnitine palmitoyltransferase II deficiency// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vo. 89. P. 8429—8433. Taroni F, Verderio E., Dworzak F. et al. Identification of the common mutation in the carnitine palmitoyltransferase II gene in familial

294

recurrent myoglobinuria patients// Nature Genet. 1993. Vol. 4. P. 314—320. Tawil R., Storwick D., Weiffenbach B. et al. Chromosome 4q rearragement in monozygotic twins discordant for facioscapulohumeral muscular dystrophy//Hum. Mutat. 1993. Vol. 2. P. 492—494. Tennyson C. N., Klamut H. J., Worton R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is ^transcriptionally spliced// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 184—190. Tennyson C. N.. Dally G. Y, Ray P. N., Worton R. G. Expression of the dystrophin isoform Dp71 in differentiating human fetal myogenic cultures//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1559—1566. Thomas N. S. T, Williams H.f Elsas L. J. et al. Localisation of the gene for Emery-Dreifuss muscular dystrophy to the distal long arm of the X chromosome// J. Med. Genet. 1986. Vol. 23. P. 596—598. Thomas N. S. Т., Sarfarazi M., Roberts K. et al. X-linked myotubular myopathy (MTM1): evidence for linkage to Xq28 DNA markers// (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 1987. Vol. 46. P. 704 only. Thomas N.S.T., Williams H.f Cole G. et al. X-linked neonatal centronuclear/ myotubular myopathy: evidence for linkage to Xq28 DNA marker loci//J. Med. Genet. 1990. Vol. 27. P. 284—287. Thompson T. G.f DiDonato C. J., Simard R. L. et al. Anovel cDNAdetects homozygous microdeletions in greater than 50% of type I spinal muscular atrophy patients// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 5662. Timchenko L. T, Nastainczyk W., Schneider T. etal. Full-length myotoninprotein kinase (72 kDa) displays serine kinase activity// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 5366—5370. Timchenko L. Т., Timchenko N. A., Caskey С. T, Roberts R. Novel proteins with binding specificity for DNA CTG repeats and RNA CUG repeats: implications for myotonic dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 115—121. Timmerman V, Raeymaekers P., De Jonghe P. et al. Assignment of the Charcot-Marie-Tooth neuropathy type I (CMT1 a) gene to 17p11.2p12//Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 47. P. 680—685. Timmerman V, Nelis E., Van Hul W. et al. The peripheral myelin protein gene PMP-22 is conteined within the Charcot-Marie-Tooth disease type IA duplication// Nature Genet. 1992. Vol. 1. P. 171—175.

295

Timmerman V.f De Jonghe P., Simokovic S. et al. Distal hereditary motor neuropathy type II (distal HMNII): mapping of a locus to chromosome 12q24// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1065—1069. Tinsley J. M.f Blake D. J., Davies К. E. Apo-dystrophin-3: a 2.2-kb transcript from the DMD locus encoding the dystrophin glycoprotein binding site// Hum. Molec. Genet. 1993. Vol. 2. P. 521—524. Tinsley J. M., Davies К. E. Utrophin: a potential replacement for dystrophin?// Neuromusc. Disord. 1993. Vol. 3 (5/6). P. 537—539. Tinsley J. M., et al. Amelioration of the dystrophic phenotype of mdx mice using a truncated utrophin transgene// Nature. 1996. Vol. 384. P. 349—352. TodaT, Kanazawa I., Nakamura J. Localization of the gene responsible for Fukujama type congenital muscular dystrophy to chromosome 9q31 -33 by linkage analysis// (Abstract). Human Genome Mapping Workshop 93.1993. P. 20 only. Toda T, Yoshioka M.f Nakahori Y. et al. Genetic identity of Fukujama type congenital muscular dystrophy and Walker-Warburg syndrome//Ann. Neurol. 1995. Vol. 37. P. 99—101. Toda T, Miyake M.f Kobayashi K. et al. Likage disequilibrium mapping narrows the Fukujama type congenital muscular dystrophy (FCMD) candidate region to less than 100 kb//Am. J. Hum. Genet. 1996. Vol.59. P. 1313—1320. Towbin J. A., Hejtmanicik F, Brink P. et al. X-linked cardiomyopathy (XLCM): molecular genetic evidence of linkage to>the Duchenne muscular dystrophy (dystrophin) gene at the Xp21 locus// Circulation. 1993. Vol. 87. P. 1854—1865. Towbin J. A. The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies// Curr. Opin. Cell Biol. 1998. Vol. 10. P. 131—139. Tsujino S., Shanske S., DiMauro S. Molecular genetic heterogeneity of myophosphorylase deficiency (McArdle's disease)// New Eng. J. Med. 1993a. Vol. 329. P. 241—245. Tsujino S., Shanske S., Sakoda S., Fenichel G., DiMauro S. The molecular genetic basis of muscle phosphoglycerate mutase (PGAM) deficiency//Am. J. Hum. Genet. 1993b. Vol. 52. P. 472— 477. Tsujino S., Shanske S., DiMauro S. Two novel mutations (E654K, L396P) in Caucasian patients with myophosphorylase deficiency (McArdle's disease)// Hum. Mutat. 1995. Vol. 6. P. 276—277. 296

Udd В., Rapola J., Nokelainen R, Aricawa E., Somer H. Nonvacuolar myopathy in a large family with both late adult onset distal myopathy and sever proximal muscular dystrophy// J. Neurol. Sci. 1992. Vol. 113. P. 214—221. Upadhyayava M., Lunt P. W., Sarfarazi M. et al. A closely linked DNA marker for facioscapulohumeral desease on chromosome 4q// J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 665—671. Vainzof M.f Passos-Bueno M. R., Canovas M. et al. The sarcoglycan complex in the six autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1963—1969. Valentijn L. J., Bolhuis P. A., Zorn I. et al. The peripheral myelin gene PMP-22/GAS-3 is duplicated in Charcot-Marie-Tooth disease type IA// Nature Genet. 1992a. Vol. 1. P. 166—170. Valentijn L. J. f Baas R, Wolterman R. A. et al. Identical point muations of PMP-22 in Trembler-J mouse and Charcot-Marie-Tooth disease type IA// Nature Genet. 1992b. Vol. 2. P. 288—291. Valenzuela D. M., Stitt T. N., DiStefano P. S. et al. Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury// Neuron. 1995. Vol. 15. P. 573—584. Vance J. M. Hereditary motor and sensory neuropathies//J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 1—5. van der Kooi A. J., et al. Genetic Localization of a newly recognized autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy with cardiac involvement (LGMD1B) to chromosome 1q11-21//Am. J. Hum. Genet. 1997. Vol. 60. P. 891—895. van der Steege G., Draaijers T. G., Grootscholten P. M. et al. A provisional transcript map of the spinal muscular atrophy (SMA) critical region// Eur. J. Hum. Genet. 1995a. Vol. 345. P. 985—986. van der Steege G., Grootscholten P. M., van der Vlies P. et al. PCRbased DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy//Lancet. 1995b. Vol. 345. P. 985—986. van Deutekom J. С. Т., Bakker E., Lemmers R. J. L. F. et al. Identification of the first gene (RRG1) from the FSHD region human chromosome 4q35// Hum. Mol. Genet. 1996a. Vol. 5. P. 581—590. van Deutekom J. С. Т., Bakker E., Lemmers R. J. L. F. et al. Evidence for subtelomeric exchange of 3.3 kb tandem repeat units between chromosomes 4q35 and 10q 26: implications for genetic counselling 297

and etiology of FSHD1//Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 1997— 2003. Velasco E., Valero C, Valero A., Moreno F., Hernandes-Chico C. Molecular analysis of the SMN and NAIP genes in Spanish spinal muscular atrophy families and correlation between number of copies of CBCD541 and SMA phenotype// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 257—263. Vicart P., Dupret J.-M., Huzan J. et al. Human desmin gene: cDNA sequence, regional localization and exclusion of the locus in a familial desmin-related myopathy// Hum. Genet. 1996. Vol. 98. P. 422— 429. Vicart P., Caron A., Guicheney P. et al. A missence mutation in the alphaBcrystallin chaperone gene cause a desmin-related myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 92—95. Viegas-Pequignot E., Lin L. Z., Dutrilaux B. et al. Assignment of human desmin gene to band 2q35 by nonradioactive in situ hybridization// Hum. Genet. 1989. Vol. 83. P. 33—36. Vuolteenaho R., Nissenen M., Sainio K. et al. Human laminin M chain (merosin): complete primary structure, chromosomal assignment and expression of the M and A chain in human fetal tissues// J. Cell Biol. 1994. Vol. 124. P. 381—394. Wallace D. C, Lott M. Т., Brown M. D. et al. Report of the committe on human mitochondrial DNA// In: Cuticchia A. J. (ed.). Human Gene Mapping 1995: A Compendium.-1995.John Hopkins Univ. Press. Baltimore. P. 910—954. Wallgren-Petersson C, Arjomaa P., Holmberg C. Alfa-actinin and myosin light chains in congenetal nemaline myopathy// Pediat. Neurol. 1990. Vol.6. P. 171—174. Wang С. H., Xu J., Carter T. A. et al. Characterization of survival motor neuron (SMNt) gene in asymptomatic carriers of spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 359—365. Wang J., Rojas С. V., Zhou J. et al. Sequence and genomic structure of the human adult skeletal muscle sodium channel alpha-subunit gene on 17q//Biochem. Biophys Res. Commun. 1992. Vol. 182. P. 794— 801. Wang J., Pansky A., Venuti J. M. et al. A sea urchin gene encoding dystrophin-related proteins//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 581— 588. 298

Wang К., Knipfer M., Huang Q.-Q. et al. Human skeletal muscle nebulin sequence encodes a blueprint for thin filament architekture: sequence motifs and affinity profiles of tandem repeats and terminal SH3// J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 4304—4314. Wang W., Wu W., Desai Т., Ward D. C, Kaufman S. J. Localization of the alpha 7 integrin gene (ITGA7) on human chromosome 12q13: Clustering of integrin and Hox genes iimplies parallel evolution of these gene families// Genomics. 1995. Vol. 26. P. 568—570. Wang Y. H., Griffith J. Expanded CTG triplet blocks from the myotonic dystrophy gene create the srongest known natural nukleosome positioning elements//Genomics. 1995a. Vol. 25. P. 570—573. Wang Y. H., Pegoraro E., Menegazzo E. Myotonic dystrophy: evidence for a possible dominant-negative RNA mutation// Hum. Mol. Genet. 1995b. Vol. 4. P. 599—606. Wang J., Pansky A., Venuti J. M. et al. A sea urchin gene encoding dystrophin-related proteins//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 5 8 1 — 588. Weiffenbach В., Dubois J . , Storwick D. et al. Mapping the facioscapulohumeral muscular dystrophy gene is complicated by chromosome 4q35 recombination events// Nature Genet. 1993. Vol. 4. P. 165—169. Wells D. J., Wells К. E., Walsh R S. et al. Human dystrophin expression corrects the myopathic phenotype in transgenic mdx mice// Hum. Mol. Genet. 1992. Vol. 1. P. 35—40. Wiedau-Pazos M., Goto J. J., Rabizadeh S. et al. Altered reactivity of superoxide dismutase in familial amyotrophic lateral sclerosis// Science. 1996. Vol. 271. P. 515—518. Wijmenga C, Frants R. R.f Brouer O. F. et al. Location of facioscapulohumeral muscular dystrophy gene on chromosome All Lancet. 1990. Vol. 336. P. 651—653. Wijmenga C, Hewitt J. E., Sandkuijl L A. et al. Chromosome 4q DNA rearrangements assoiated with facioscapulohumeral muscular dystrophy// Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 26—30. Wilhelmsen К. C, Blake D. M.t Lynch T. et al. Chromosome 12-linked autosomal dominant scapuloperoneal muscular dystrophy// Ann. Neurol. 1996. Vol. 39. P. 507—520.

299

Willard H.F. et al. Report of the fifth international workshop on human X chromosome mapping// Cytogenet. Cell Genet. 1994. Vol. 67. P. 295—358. Williamson R. A., Henry M. D., Daniels K. J. et al. Dysroglycan is essential for early embryonic development: disruption of Reichert's membrane in Dag1-null mice// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 831—841. Wirth В., Hahnen E., Morgan K. et al. Allelic association and deletions in autosomal recessive proximal spinal muscular atrophy: association of marker genotype with disease severity and candidate cDNAs// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1273—1284. Wise C. A., Garcia C. A., Davis S. N. et al. Molecular analysis of unrelated Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease patients suggest a high frequenccy of the CMT1A duplication//Am. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 53. P. 853—863. Wong P. C, Pardo C. A., Borchelt D. R. et al. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria// Neuron. 1995. Vol. 14. P. 1105—1116. Xia J.-h., Liu C.-u., Tang B.-S. et al. Mutations in the gene encoding gap junction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 370—373. Xu H., Wu X. R., Wewer U. M., Engwall E. Murine muscular dystrophy caused by a mutation in the laminin beta2 (Lama2) gene// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 297—302. Yoon K. L., Aprille J. R., Ernst S. G. Mitochondrial tRNA-thr mutation in fatal infantile respiratory enzyme deficiency// Biochem. Biophys. Commun. 1991. Vol. 176. P. 1112—1115. Yoshida K., Ikeda S.I., Nakamura A. et al. Molecular analysis of the Duchenne muscular dystrophy gene in patients with Becker muscular dystrophy presenting with dilated cardiomyopathy// Muscle Nerve. 1993. Vol. 16. P. 1161—1166. Yano-Yanagisawa H., Li Y, Wang H.f Kohwi Y. Single stranded DNA binding proteins isolated from mouse brain recognize specific trinucleotide repeat sequences in vitro// Nucleic Acids Res. 1995. Vol. 23. P. 2654—2660. Yates J. R. W.( Affara N. A., Jamieson D. M. et al. Emery-Dreifuss muscular dystrophy: localisation to Xq27.3.qter confirmed by linkage to the factor VIII gene// J. Med. Genet. 1986. Vol. 23. P. 587—590. 300

Yates J. R. W., Warner J., Smith J. A. et al. Emery-Dreifuss muscular dystrophy: linkage to markers in distal Xq28//J. Med. Genet. 1993. Vol.30. P. 108—111. Yoshida K., Nakamura A., Yazaki M. et al. Insertional mutation by transposable element, L1, in the DMD gene results in X-linked dilated cardiomyopathy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. Yoshioka R., Dyck P. J., Chance P. F. Genetic heterogeneity in CharcotMarie-Tooth neuropathy type 211 Neurology. 1996. Vol. 46. P. 569— 571. Yotsumoto S., Fujiwara H., Horton J. H. et al. Clonning and expression analyses of mouse dystroglycan gene: specific expression in maternal decidua at the peri-implantation stage// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol.5. P. 1259—1267. Zatz M.f Passos-Bueno M. R., Rapoport D. Estimate of the proportion of Duchenne muscular dystrophy with autosomal recessive inheritance//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 32. P. 407—410. Zatz M.f Marie S. K., Passos-Bueno M. R. et al. High proportion of new mutations and possible anticipation in Brazilian facioscapulohumeral muscular dystrophy families//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 56. P. 99—105. Zhang X.,Vuolteenaho R., Tryggvason K. et al. Structure of the human laminin alpha-2-chain gene (LAMA2), which is affected in congenital muscular dystrophy// J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 27664— 27669. Zhang Y, Chen H. S., Khanna V. K. et al. A mutation in the human ryanodine receptor gene associated with central core desease// Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 46—50. Zheng X., Shoffner J. M., Lott M. T. et al. Evidence in a lethal infantile mitochondrial disease for a nuclear mutation affecting respiratory complex I and IV// Neurology. 1989. Vol. 39. P. 1203—1209. Zhu Z., et al. SURF1, encoding a factor involved in biogenesis of cytochrome с oxidase, is mutated in Leigh syndrome// Nature Genet. 1998.Vol.20. P. 337—343. Zelenin A. V, Kolesnikov V. A., Tarasenko O. A. et al. Bacterial betagalactosidase and human dystrophin genes are expressed in mouse skeletal muscle fibers after ballistic transfection// FEBS. 1997. Letters 414. P. 319—322.

301

Zelante L, Gasparini P., Estivill X. et al. Connexin 26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans.// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1605—1609. Zeviani M., Darras В. Т., Rizzuto R. et al. Cloning and expression of human nebulin cDNAs and assignment of the gene to chromosome 2q31-q32//Genomics. 1988a. Vol. 2. R 249—256. Zeviani M., Moraes С. Т., Moraes С. T. et al. Deletions of mitochondrial DNA in Kearns-Sayre syndrome// Neurology. 1988b. Vol. 38. P. 1339—1346. Zeviani M., Servidei S.f Bertini E. et al. An autosomal-dominant disorder with multiple deletions of mitochondrial DNA starting at the D-loop region// Nature. 1989. Vol. 339. P. 30^—311.

СЛОВАРЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ Аллель: одно из возможных альтернативных состояний гена — дикого типа (нормальный): состояние гена, при котором его функция не изменена. —доминантный: аллель, одна доза которого определяет сте­ нотипическое проявление контролируемого признака. — мутантный: состояние гена с нарушенной функцией. — рецессивный: аллель, фенотипически проявляющийся только в гомозиготном состоянии и маскирующийся в при­ сутствии доминантного аллеля. Аллельные серии: моногенные наследственные заболевания, вы­ званные различными мутациями в одном и том же гене, но относящиеся к разным нозологическим группам по своим клиническим проявлениям. Амплификатор ДНК (термоциклер): прибор, необходимый для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР); позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптималь­ ные временные и температурные параметры для каждой про­ цедуры цикла. Амплификация (в данном контексте): искусственный специфиче­ ский синтез большого числа копий небольшого фрагмента ДНК на базе ПЦР. Антикодон: последовательность из трех нуклеотидов в молекуле транспортной РНК, комплементарная кодирующему трипле­ ту в молекуле мРНК. Антиципация: нарастание тяжести течения заболевания в ряду поколений. Библиотека генов: набор клонированных фрагментов ДНК, пол­ ностью перекрывающих исходную молекулу ДНК, выделен­ ную из какого-либо специфического источника. — скрининг (библиотеки генов): выделение из библиотеки генов клонов, содержащих комплементарные зонду последо­ вательности ДНК. Блот-гибридизация по Саузерну: метод идентификации участков ДНК, содержащих комплементарные ДНК-зонду последова­ тельности, среди электрофоретически разделенных фрагмен-

303

тов ДНК, фиксированных на твердом матриксе (нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтрах). Болезни — моногенные: обусловлены дефектом одного гена; —доминантные: болезни, для развития которых достаточ­ но присутствия одного мутантного аллеля в гетерозиготном состоянии. — рецессивные: болезни, для развития которых необхо­ димо присутствие двух доз мутантного аллеля в гомозигот­ ном состоянии или в состоянии компаунда. — сцепленные с полом: обусловленные дефектом гена, локализованного в Х-хромосоме. — мультифакториальные: имеющие в своей основе как ге­ нетические, так и средовые компоненты. — экспансии: обусловленные динамическими мутациями. Вектор (ДНК): модифицированные плазмидные, фаговые, вирус­ ные, дрожжевые или бактериальные ДНК, обеспечивающие проникновение экзогенной ДНК в клетки хозяина. —дрожжевой (YAC): плазмидный вектор, содержащий в сво­ ем составе центромерные и теломерные последовательнос­ ти хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и реп­ ликации в эукариотических клетках хозяина; обладают наи­ большей клонирующей способностью. —космидный: плазмидный вектор с элементами фага лямб­ да, отвечающими за упаковку ДНК в фаговой частице. Вестерн блот-гибридизация (иммуноблот): метод идентифика­ ции с помощью меченых антител электрофоретически раз­ деленных антигенов, фиксированных на твердом матриксе (нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтрах). Гамета: гаплоидная половая клетка. Гаплотип: совокупность аллелей разных локусов или разных мута­ ций одного гена в гамете. Ген: транскрибируемый участок молекулы ДНК, способный транс­ лироваться с образованием функционального продукта. —»домашнего хозяйства» (house-keeping депе):ген, экспрессирующийся в большинстве тканей человека.

304

— «мишень»: ген, подвергающийся искусственной сайт-спе­ цифической модификации. — онкоген: ген, мутационные изменения которого в сомати­ ческих или зародышевых клетках человека могут явиться при­ чиной возникновения злокачественного новообразования. — ортологичный: ген животного, гомологичный гену чело­ века. — протоонкоген: немутантная форма онкогена. — «репортер» (маркерный): хорошо изученный неиндуцибельный клонированный ген, белковый продукт которого об­ ладает высокой активностью, позволяющей легко определять экспрессию гена экспериментально. — структурный: ген, кодирующий РНК или белок. — тканеспецифический: ген, экспрессирующийся в опре­ деленных типах тканей либо на определенных стадиях онто­ генеза. — «химерный»: ген, искусственно сконструированный из элементов разного происхождения. Генетическая гетерогенность: отсутствие прямой корреляции между фенотипом и генотипом, обусловленное: (1) сходст­ вом клинического течения заболеваний, вызванных мутаци­ ями в разных локусах, (2) различным фенотипическим про­ явлением разных мутаций одного и того же гена, (3) разли­ чиями в проявлении одной и той же мутации на разном гене­ тическом и средовом фоне. Генетическая карта: система классификации элементов генома, основанная на их хромосомной принадлежности и взаимном расположении. — микросателлитных маркеров: карта сцепления вариа­ бельных микросателлитных повторов. — сцепления: генетическая карта, выраженная в единицах рекомбинации сантиморганах (сМ). — физическая: генетическая карта, расстояние в которой измеряется в парах нуклеотидов. — цитогенетическая: система классификации элементов ге­ нома относительно цитогенетически идентифицируемых уча­ стков хромосом.

20 Заказ № 170

305

Генетическая линия (животных): гомогенная по фенотипу инбредная линия животных, целиком состоящая из гомозигот или гетерозигот по какому-либо локусу с установленным типом наследования. — модельная: генетическая линия животных, мутантная по локусу, гомологичному гену определенного наследственного заболевания человека. Генетический изолят: группа индивидуумов, изолированная от основной популяции географическими, этническими, рели­ гиозными или иными барьерами, с повышенным уровнем инбридинга в силу предпочтительности образования супру­ жеских пар между членами группы. Генетический код: соответствие последовательности из трех нуклеотидов в молекуле мРНК определенной аминокислоте в молекуле полипептидной цепи. Генетический маркер (индексный): картированный элемент ге­ нома, обладающий высокой популяционной изменчивостью. Генетическое сцепление: локализация генов на одной хромосоме. Генная терапия: лечение путем введения в ткани или в клетки па­ циента смысловых последовательностей ДНК с целью кор­ рекции генных дефектов, либо придания клеткам новых функ­ ций, способствующих устранению патологических процессов. Геном: полная генетическая система клетки, определяющая харак­ тер онтогенетического развития организма и наследствен­ ную передачу в ряду поколений всех структурных и функцио­ нальных признаков. Геномный импринтинг: различное фенотипическое проявление мутации в зависимости от ее прохождения через отцовский или материнский гаметогенез. Генотип: совокупность элементов генома. Генотипирование: определение аллельного состояния локуса. — молекулярное: описание аллеля в терминах нуклеотидной последовательности ДНК. Гетерозигота: особь с различными типами аллелей — нормаль­ ным и мутантным — в каком-либо локусе.

306

Гибридизация нуклеиновых кислот: процесс образования двунитевой структуры в молекулах ДНК за счет комплементарных связей по правилу А-Т, Г-Ц. — in situ: гибридизация с мечеными ДНКили РНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах. — FISH: вариант метода, при котором в качестве зондов используются препараты ДНК или РНК, меченные флюорохромами. Гомозигота: особь с аллелями одинакового типа (нормальными или мутантными) в каком-либо локусе. — компаунд: гомозиготная особь с различными аллелями одного типа (нормальными или мутантными) в каком-либо ло­ кусе. Денатурация (плавление) ДНК: переход ДНК из двунитевой фор­ мы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур или при повышении концентрации со­ лей в буфере. Дезокситрифосфаты: молекулы, состоящие из дезоксирибозы, одного из нуклеотидных оснований и трех остатков фосфор­ ной кислоты — предшественники синтеза ДНК. Группа сцепления: группа локусов, расположенных на одной хро­ мосоме. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК): вещество наследствен­ ности; нитевидная молекула, в которой остов из чередующих­ ся остатков дезоксирибозы и фосфорной кислоты ковалентно соединен с 4 азотистыми основаниями, расположенными в варьирующем порядке — аденином (А), тимином (Т), гуа­ нином (Г) и цитозином (Ц);может существовать как в однонитевой, так и в двунитевой форме за счет образования водо­ родных связей между комплементарными парами оснований по правилу А-Т, Г-Ц. — геномная: тотальная ДНК, выделенная из любого биоло­ гического источника; — комплементарная (кДНК): ДНК, образующаяся при об­ ратной транскрипции мРНК, содержит только кодирующие об­ ласти генов.

307

— митохондриальная (мтДНК): ДНК, локализованная в ми­ тохондриях. — плазм идная: ДНК, входящая в состав плазм иды. — рекомбинантная: химерные молекулы ДНК, составлен­ ные из фрагментов разного происхождения. — чужеродная: ДНК иного индивидуального или видового происхождения. — экзогенная: фрагменты ДНК, отсутствующие в геноме оп­ ределенного организма или клетки. ДНК-диагностика: молекулярные методы диагностики мутаций. — метод аллель-специфических олигонуклеотидов (ASO): амплификация фрагментов ДНК и последующая дотили слотгибридизация с мечеными аллель-специфическими олигонуклеотидами. — рестрикционный анализ: метод молекулярной диагнос­ тики мутаций, случайным образом затрагивающих сайты ре­ стрикции. — CMC (Cemical Mismatch Cleavage-анализ: метод хими­ ческого расщепления некомплементарных сайтов; основан на способности некоторых химических агентов специфичес­ ки разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания. — DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) -ана­ лиз: метод денатурирующего градиентного гель-электрофо­ реза; основан на зависимости свойств плавления небольших двунитевых молекул ДНК от соотношения А-Т и G-C пар в амплифицированном фрагменте. — HA(Heteroduplex analysis) -анализ: анализ гетеродуплексов, образующихся при амплификации фрагмента ДНК с му­ тацией, находящейся в исходной матричной молекуле в ком­ паунде или в гетерозиготном состоянии. — SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)-aHaлиз: метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК; основан на анализе электрофоретической по­ движности амплифицированных и денатурированных ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по простран­ ственной организации молекул.

308

ДНК-зонд: любая однонитевая ДНК ограниченного размера, исполь­ зуемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди пула разнообраз­ ных молекул ДНК. — геномный: клонированный фрагмент геномной ДНК, изо­ лированной из определенной цитогенетической области. — кДНК-овый: клонированный фрагмент кДНК. — олигонуклеотидный: искусственно синтезированная олигонуклеотидная последовательность. ДНК-полимераза: фермент комплементарного синтеза ДНК. — термофильная: ДНК-полимераза, выделенная из термо­ фильных бактерий. Инсерция: встраивание чужеродной ДНК в векторную, хромосом­ ную или иную молекулу ДНК. Интеграция (ДНК): встраивание экзогенной или эписомной ДНК в хромосомную ДНК. Инбридинг: повышенная степень родства между родителями. Интрон: некодирующая область гена, вырезаемая в процессе сплайсинга при образовании мРНК из первичного РНК транс­ крипта. Кариотип: полный набор хромосом клетки (у человека в норме 46,ХХ или 46,XY). Картирование: нахождение места локализации элемента генома на генетической карте. Килобаза (кб): единица измерения длины молекулы ДНК, равная одной тысяче пар оснований. Клонирование: встраивание чужеродной ДНК в векторную моле­ кулу ДНК или РНК и введение этой конструкции в фаговые, бактериальные или эукариотические клетки хозяина. Кодон: последовательность из трех нуклеотидов в молекуле мРНК, соответствующая аминокислоте или сигналу терминации трансляции. — стоп (нонсенс): сигнал терминации трансляции полипеп­ тидной цепи (UGA, UAG, UAA).

309

— инициирующий (стартовый): AUG триплет в мРНК, коди­ рующий метионин, с которого начинается образование поли­ пептидной цепи в процессе трансляции. Комплементарность (нуклеотидных пар): образование водород­ ных связей по правилу А-Т, Г-Ц в двунитевой молекуле ДНК. Локус: область локализации элемента генома в хромосоме или в молекуле ДНК. — полиморфный (вариабельный): локус, частоты гетерозигот по которому в популяции превышают определенный уро­ вень (чаще всего 10%). — гипервариабельный: локус, частоты гетерозигот по ко­ торому в популяции превышают 90-95%. Мегабаза (мб): единица измерения длины молекулы ДНК, равная миллиону пар оснований. Метилирование: модификация цитозиновых остатков ДНК с обра­ зованием 5-метилдезоксицитидина. Мутаген: химический или физический агент, повышающий частоту мутаций. Мутагенез: возникновение мутаций. — индуцированный: возникновение мутаций под воздейст­ вием внешних факторов. — направленный (сайт-специфический): искусственное введение в геном сайт-специфических модификаций путем инсерции экзогенной ДНК в гомологичный сайт геномной ДНК без какого-либо нарушения нуклеотидной последовательно­ сти в месте встраивания. — спонтанный: мутагенез, не связанный с воздействием внешних факторов. — эндогенный: мутагенез, обусловленный особенностями структуры генома (ДНК). Мутация: изменение в последовательности ДНК. — делеция: выпадение сегмента ДНК. — динамическая: превышение допустимого числа повторя­ ющихся элементов в мини-сателлитных последовательностях, локализованных в кодирующих или регуляторных областях гена.

310

— дупликация: дублирование сегмента ДНК. — инверсия: переворот на 180° сегмента ДНК. — инсерция: вставка сегмента ДНК. — молчащая (нейтральная или полиморфная): мутация, не имеющая фенотипического выражения. — миссенс: замена нуклеотида в кодирующей части гена, приводящая к замене аминокислоты в соответствующем бел­ ковом продукте. — нонсенс: замена нуклеотида в кодирующей части гена, сопровождающаяся образованием стоп-кодона и прекраще­ нием трансляции. — регуляторная: мутация в 5'или в З'-нетранслируемых об­ ластях гена, нарушающая регуляцию работы гена. — со сдвигом рамки считывания (фреймшифт): мутация, приводящая к сдвигу считывания триплетов в процессе транс­ ляции полипептидной цепи. — сплайсинговая: мутация, затрагивающая сайты сплайсин­ га или создающая новые сайты сплайсинга в интронных об­ ластях гена. — точечная: мутация, затрагивающая от одного до несколь­ ких нуклеотидов. — транзиция: точечная замена пиримидина на другой пи­ римидин или пурина на другой пурин. — трансверсия: точечная замена пиримидина на пурин и наоборот. Неравновесие по сцеплению: неслучайное распределение в га­ метах комбинации аллелей двух локусов одной хромосомы в определенной популяции. Нозерн блот-гибридизация: метод идентификации молекул РНК, содержащих комплементарные ДНК-зонду последовательно­ сти, среди электрофоретически разделенных РНК, фиксиро­ ванных на твердом матриксе (нитроцеллюлозных или нейло­ новых фильтрах). Нуклеаза S 1 : фермент деградации однонитевых ДНК. Олигонуклеотиды: небольшие однонитевые молекулы ДНК.

311

ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов): внутривидовая изменчивость подлине фрагментов геномной ДНК, образующихся после воздействия специфической эн­ донуклеазой. — ПДРФ-анализ: исследование методами блот гибридиза­ ции или ПЦР частоты встречаемости полиморфного сайта ре­ стрикции среди определенной группы людей или в популя­ ции. Первичный биохимический дефект: белковый продукт гена, му­ тации в котором вызывают наследственное заболевание. Плазмиды: небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные к автономной репликации, которые могут присут­ ствовать в различном числе копий в бактериальных клетках; часто используются в качестве векторных молекул. Плейотропизм: множественные фенотипические изменения, вы­ званные мутацией одного гена. Повторы (ДНК): последовательности ДНК, многократно встречаю­ щаяся в геноме. — сателлитные: относительно короткие, не превышающие 200 пар оснований, высокоповторяющиеся последовательно­ сти ДНК, расположенные тандемными блоками и занимаю­ щие около 10% генома. — микро-: сателлитные ДНК с длиной повторяющегося эле­ мента в диапазоне от 1 до 4 нуклеотидов; — мини-: сателлитные ДНК с длиной повторяющегося эле­ мента в диапазоне от 5 до 100 нуклеотидов. Alu: последовательности ДНК размером около 300 п.о., повторен­ ные в геноме человека несколько сотен тысяч раз; содержат сайт рестрикции для фермента Alul, имеют характерную димерную структуру и фланкированы прямыми повторами дли­ ной от 7 до 20 п.о. Позиционное клонирование: молекулярные методы поиска и иден­ тификации гена в заданной цитогенетической области. — прогулка и прыжки по хромосоме: методы позиционно­ го клонирования, основанные на последовательном поиске генных последовательностей среди клонированных перекры­ вающихся фрагментов ДНК из области локализации гена.

312

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амп­ лификация ДНК: избирательный синтез in vitro большого чис­ ла копий (порядка миллиона) небольшого фрагмента ДНК размером обычно от 50 до нескольких тысяч нуклеотидов по матричной молекуле ДНК. — ассиметричная: амплификации, при которой концентра­ ция одного из олигопраймеров значительно превосходит кон­ центрацию другого праймера, в результате чего синтезиру­ ется преимущественно только одна цепочка ДНК. — количественная: ПЦР, дополненная количественной оцен­ кой результатов амплификации. — мультиплексная: одновременная амплификация несколь­ ких участков матричной ДНК. — обратная (RT-PCR): ПЦР, при которой в качестве матрич­ ной ДНК используется кДНК, полученная путем обратной транскрипции эктопической мРНК либо мРНК, изолирован­ ной из экспрессирующих тканей. Полиморфизм: генетическая изменчивость локуса в определен­ ной популяции. Пренатальная диагностика: диагностика состояния плода в пери­ од внутриутробного развития. —доимплантационная: диагностика состояния зародыша на стадии развития, предшествующей его имплантации в стенку матки. — молекулярная: основанная на использовании методов ДНК—диагностики. — косвенная: идентификация мутантных хромосом в се­ мьях высокого риска и у плода с помощью молекулярных мар­ керов. — прямая: молекулярная идентификация мутаций в семь­ ях высокого риска и у плода. Праймеры: необходимые для проведения полимеразной цепной реакции небольшие однонитевые молекулы ДНК, комплемен­ тарные З1 концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК.

313

Промотор: основной регулятор работы гена; расположен в 5'-нетранслируемой области; место взаимодействия ДНК с РНКполимеразой. Псевдогенгмутационно измененная последовательность ДНК, име­ ющая высокую степень гомологии с функциональным геном, но неспособная транскрибироваться или продуцирующая не­ активный генный продукт. Рамка считывания: нуклеотидная последовательность, выражен­ ная в кодирующих триплетах, начинающаяся со стартового кодона и заканчивающаяся нонсенс-кодоном. — закрытая: рамка считывания, внутри которой в результа­ те мутации возник стоп-кодон. — открытая (ORF): участок молекулы ДНК между иницииру­ ющим и стоп-кодонами. — сдвиг рамки считывания: мутация, приводящая к сдвигу считывания триплетов в процессе трансляции полипептидной цепи. Рестриктаза (эндонуклеаза): фермент бактериального происхож­ дения, разрезающий на фрагменты двунитевую молекулу ДНК в местах, соответствующих специфической последователь­ ности из 4—12 нуклеотидов. — сайт рестрикции: специфическая последовательность из 4—12 нуклеотидов, узнаваемая эндонуклеазой; место взаи­ модействия рестриктазы с ДНК. Рекомбинация (кроссинговер): обмен участками гомологичных хромосом в процессе мейоза. — гомологичная: рекомбинация между гомологичными уча­ стками хромосом. — негомологичная: рекомбинация между негомологичны­ ми участками хромосом. Репарация: исправление дефектов синтеза ДНК. Репликация: осуществляемый с помощью ДНК-полимеразы син­ тез комплементарных нитей ДНК по матричной молекуле ДНК; процесс самовоспроизводства молекул ДНК. Репрессия (гена): ферментативное ингибирование транскрипции или трансляции.

314

Рибонуклеиновая кислота (РНК): нитевидная молекула, в кото­ рой остов из чередующихся остатков рибозы и фосфорной кислоты ковалентно соединен с 4 азотистыми основаниями, расположенными в варьирующем порядке — аденином, урацилом, гуанином и цитозином. — матричная (мРНК): молекулы РНК, состоящие из после­ довательностей, комплементарных экзонам генов; образуют­ ся в результате сплайсинга и концевых модификаций из мо­ лекул первичного РНК-транскрипта; — эктопическая (незаконная) мРНК: мРНК, присутству­ ющая в специализированных клетках в следовых количест­ вах. — РНК-транскрипт (первичный): молекулы РНК, образую­ щиеся в процессе транскрипции. — транспортные (тРНК): 20 участвующих в процессе транс­ ляции молекул РНК, каждая из которых способна транспор­ тировать только одну аминокислоту, что определяется в точ­ ном соответствии с генетическим кодом структурой антикодона. — рибосомальные (рРНК): молекулы РНК, входящие в со­ став рибосом. РНК-полимераза: фермент комплементарного синтеза РНК по матрице ДНК. Сайт: определенное место в молекулах ДНК, РНК или белка, обла­ дающее специфической функцией. Сантиморган (сМ): единица измерения генетического расстояния; два гена, локализованные в одной хромосоме, находятся на расстоянии 1 сМ друг от друга, если вероятность рекомбина­ ции между ними в процессе мейоза составляет 1%. Секвенирование: определение нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Синтения: сходный порядок расположения ортологичных генов на определенных участках хромосом у разных видов организ­ мов. Соматические гибриды: гибридные клетки, образующиеся в ре­ зультате искусственного слияния диплоидных клеток разно­ го видового происхождения; техника соматической гибриди-

315

зации используется для определения хромосомной принад­ лежности отдельных генов или групп сцепления. Сплайсинг: процесс вырезания последовательностей, компле­ ментарных интронам, из молекулы первичного РНК-транс­ крипта. —альтернативный: тканей эмбриоспецифические различия по характеру вырезания интронов одного и того же гена при процессинге мРНК. — сайт сплайсинга: каноническая последовательность динуклеотидов, расположенная на границе экзон-интронных об­ ластей; необходима для правильного сплайсинга. —донорный: последовательность GTf расположенная в на­ чале интрона. — акцепторный: последовательность AG, расположенная в конце интрона. Тотипотентность: способность эмбриональных клеток дифферен­ цироваться во все типы клеток взрослого организма. Трансген: чужеродный ген, искусственно введенный в культивиру­ емые клетки или в ранние зародыши. Трансгеноз: искусственный межили внутривидовой перенос генов в составе определенных генетических конструкций. Трансгенные животные: экспериментальные животные, получен­ ные в результате искусственного введения чужеродных ге­ нетических конструкций или целых клеток в оплодотворен­ ную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих с по­ следующей их пересадкой псевдобеременным самкам. — «нокаут» мыши: модельные трансгенные животные с вы­ ключенным геном-мишенью; выключение гена достигается за счет направленного разрушения отдельных экзонов (так на­ зываемые нулевые варианты) либо путем сайт-специфичес­ кого введения определенных мутаций. — химера: трансгенное животное, состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и введенных в зародыш тотипатентных эмбриональ­ ных стволовых клеток. — зародышевые трансмиттеры: химерные животные, у которых транфецированные в зародыш эмбриональные ство-

316

ловые клетки дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам. Трансдукция: введение экзогенных ДНК с помощью фаговых век­ торов. Транскрипция: синтез молекул первичного РНК-транскрипта, ком­ плементарных определенным участкам молекулы ДНК (ге­ нам). —альтернативная: экспрессия гена с разных промоторов в процессе онтогенетической дифференцировки тканей и в раз­ ных специализированных клетках организма. — обратная: комплементарный синтез ЦИК по матрице РНК. Транскрипционная система: искусственно сконструированная бесклеточная система, обеспечивающая возможность син­ теза и процессинга первичного РНК-транскрипта in vitro. Транскрипционный фактор: фермент активации и/или репрессии генной активности, способный взаимодействовать с молеку­ лами ДНК. Трансляция: синтез полипептидной цепи по молекуле мРНК. Трансляционная система: искусственно сконструированная бес­ клеточная система, обеспечивающая возможность трансля­ ции и процессинга белков in vitro. Транспозон: мобильный элемент генома, способный менять свою внутрихромосомную локализацию. Трансфекция: процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки. Трансформация: введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки. — ко-трансформация: одновременное введение в бактери­ альные клетки плазмиды и сегмента чужеродной ДНК. Улавливание экзонов (exon trapping): функциональная диагнос­ тика генов, основанная на идентификации открытых рамок считывания, промоторных участков, сайтов сплайсинга, полиА сигнальных последовательностей. Хромосомы: локализованные в ядрах структуры, содержащие суперскрученные за счет взаимодействия с гистоновыми бел­ ками молекулы ДНК. — аутосомы: неполовые хромосомы. 317

— гаплоидный (набор хромосом): набор хромосом поло­ вых клеток, состоящий из всех аутосом и одной из половых хромосом (X или Y). — диплоидный (набор хромосом): двойной набор хромо­ сом соматических клеток; в кариотипе женщин наборы ауто­ сом и Х-хромосом гомологичны друг другу, в кариотипе муж­ чин наряду с двумя гомологичными наборами аутосом при­ сутствует по одной X и Y хромосоме. — половые: X и Y хромосомы; в кариотипе особей разного пола набор половых хромосом различен (XX — женский пол, XY — мужской) Экзон: кодирующий участок гена. Экспрессионная система: модифицированная клеточная культу­ ра (бактериальная, дрожжевая или эукариотическая) с экс­ прессией трансгена. Экспрессия: активированное состояние гена, то есть способность к транскрипции и трансляции. Элемент генома: участок ДНК, дифференцируемый по функцио­ нальному признаку или по композиции нуклеотидных осно­ ваний. — мобильный: элемент генома, топография и количество кото­ рого может варьировать в различных клетках, тканях и у раз­ ных индивидуумов. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК): тотипатентные куль­ туры клеток, устанавливаемые из бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей; клеточный вектор. Эндоцитоз: проникновение какого-либо вещества или частицы внутрь клетки путем впячивания клеточной мембраны. Эписома: внехромосомная суперскрученная кольцевая эукарио­ тическая молекула ДНК. Эффект основателя: распространение вновь возникшей мутации в генетическом изоляте. СЕРН-коллекции родословных: перевиваемые культуры клеток от членов обширных семей, родословные которых насчиты­ вают сотни человек. Коллекции созданы в Центре по изуче­ нию полиморфизма человека во Франции.

318

COS-клетки: модифицированная культура фибробластов почек африканской зеленой мартышки, обеспечивающая высокий уровень экспрессии внехромосомных трансфецированных генетических конструкций. CpG островки: последовательности ДНК от 500 до 2000 и.о., пред­ ставленные в виде кластеров неметилированных CpG дупле­ тов и G/C боксов. EST (expressed sequnce tag): короткие секвенированные после­ довательности ДНК, изолированные из кДНКовых библиотек генов. MIM: шестизначный номер, соответствующий отдельному менделирующему локусу в каталоге генов человека МакКьюсика. STS (sequence tagged sites): короткие секвенированные последо­ вательности ДНК с известной геномной локализацией.

В. Н. ГОРБУНОВА Е. А. САВЕЛЬЕВА-ВАСИЛЬЕВА, В. В. КРАСИЛЬНИКОВ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕВРОЛОГИЯ Часть I ЗАБОЛЕВАНИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ СИСТЕМЫ

Корректор Комарова Л.Н. Дизайн обложки Романова Н.Ф. Верстка Романова Н.Ф.

ISBN 5-89720-026-2

Изд. лиц. № 065259 от 30 июня 1997 г. Подписано в печать 30.06.2000. Формат 60x88/16 Печать офсетная. Гарнитура «AGLetterica». Усл. печ. л. 20 Тираж 1000 экз. Заказ 170.

Издательство «Интермедика» 194100, Санкт-Петербург, а/я 8 e-mail: [email protected]

Отпечатано в ГИПП "Искусство России" 198099, Санкт-Петербург, ул. Промышленная, д. 38, к. 2

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия

В. Н. ГОРБУНОВА Е. А. САВЕЛЬЕВА-ВАСИЛЬЕВА, В. В. КРАСИЛЬНИКОВ

М О Л Е К У Л Я Р Н А Я Н Е В Р О Л О Г И Я

Часть I ЗАБОЛЕВАНИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ СИСТЕМЫ

«ИНТЕРМЕДИКА» Санкт-Петербург 2000