Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжёлых металлов: Методическое пособие

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра общей биологии

А.Д. Буракаева А.М. Русанов В.П. Лантух

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжелых металлов

Оренбург 1999

ББК28.4 + 38.761.2 я 7 Б -90 УДК 579 + 628.543.3/9 (07)

Введение Еще В.И. Вернадский (1965 ) отмечал поразительную способность живых организмов концентрировать отдельные элементы из окружающей среды, которую он назвал концентрационной функцией. В частности, многие ионы металлов играют чрезвычайную важную роль во множестве самых разнообразных биологических процессов. Например, ионы калия, магния, марганца, железа, кобальта, меди, молибдена и цинка входят в состав ферментов, катализируемых такие реакции как перенос групп, окислительновосстановительные или гидролитические процессы, причем в этих процессах участвуют не только металло-содержащие ферменты, но и другие белковые системы, осуществляющие накопление и контроль за концентрацией ионов металлов, а также транспортирующие их в соответствующий участок клетки для включения в нужную ферментную систему или систему макромолекулярной организации клетки. В общем все металлы можно условно разделить на 2 группы - существенные и несущественные для организма. Для клетки необходимы все перечисленные металлы, они называются "элементами жизни", но когда организму их не хватает, их место занимают вредные для здоровья человека, вызывающие различные заболевания, так называемые тяжелые металлы. Одним из источников загрязнения водоемов, приводящих к ухудшению качества воды и нарушающих условия обитания в них гидробионтов, являются сточные воды заводов, содержащие разбавленные растворы тяжелых металлов. Состав их чрезвычайно разнообразен, он изменяется в процессе появления новых производств и усовершенствования существующих. В сточных водах предприятий металлургической, машиностроительной, приборостроительной, автомобильной и других отраслей промышленности содержится значительное количество загрязняющих веществ, в состав которых входят ионы металлов: Cr(VI), Fe(III), Zn(II), Cu(II), Ni(II), Al(III)-, а также различные органические вещества - спирты, кислоты, поверхностноактивные вещества и нефтепродукты. Тяжелые металлы в природных водах находятся в растворенном и адсорбированном состоянии. Попадая в воду в ионной форме, они накапливаются в осадках в виде гидрооксидов, карбонатов, сульфидов или фосфатов. Содержание различных металлов в водоемах варьирует в широких пределах. Высокие концентрации тяжелых металлов обнаруживаются в верхних слоях воды.

2

По токсичности тяжелые металлы располагаются в следующей последовательности: ртуть, серебро, медь, кадмий, цинк, свинец, хром, никель, кобальт / 1 /.. Однако этот порядок может изменяться в зависимости от вида организма и от того, присутствуют ли эти элементы в растворе в виде свободного иона, недиссоциированной соли, либо входят в состав органических или неорганических комплексных соединений. Недиссоциированные соли и ионы, образующие комплексы, обычно менее токсичны, чем свободные ионы в тех же концентрациях. При оценке влияния металла на организмы важно учитывать также их валентность. Так, шестивалентный хром значительно токсичнее, чем трехвалентный / 12 /. В настоящее время ГОСТ 28.74-82 "Вода питьевая" предусматривает следующие предельно допустимые концентрации металлов (мг/л): сульфаты – 500; свинец- 0,05; стронций - 7,0; железо - 0,3;марганец – 0,1; медь - 1,0; алюминий – 0,5; молибден - 0,25; селен – 0,001; фтор – 1,5. Имеется много исследований по очистке вод от различных вредных примесей. Достигнуты крупные успехи по разработке и внедрению способов биологической очистки бытовых и ряда других отходов. В то же время несмотря на то, что микробиологическая трансформация и детоксикация отдельных металлов и их соединений уже достаточно полно изучена, биологическая очистка от них промышленных сточных вод находится на стадии разработки и становления. Проводимая в настоящее время очистка стоков от тяжелых металлов химическими, физическими, электрохимическими способами дорога громоздка, причем не всегда обеспечивается высокая степень очистки. Следует отметить, что при традиционных методах обезвреживания и озоления отходов в целом затраты в 3 раза превышают стоимость биологического разложения, Расходы на строительство и эксплуатацию станций биологической очистки также ниже, чем для большинства предприятий по традиционной обработке отходов. Перспективны микробиологические методы сорбции и осаждения ионов металлов. Для извлечения металлов из растворов могут быть использованы представители различных таксономических групп. Так, клетки Thiobacilus ferrooxidans извлекают из раствора ионы Cd(II), Co(II), Cu(II), Cr(VI), Fe(III), Ni(II), Ag+, Au(III); цианобактерии - Cd (II), Au(III); клетки хлореллы – Cd(II), Ni(II), Co(II), Zn(II), Sr(II), Mo(II); дрожжи Candida lipolytica, Candida utilis, Rhodotorula mucilaginosa – Cd(II), Co(II), Cu(II), Ni(II), Zn (II); мицеллиальные грибы рода Aspergillus – Co (II), Ra(II).

3

1 Механизм адаптации микроорганизмов к тяжелым металлам Микроорганизмы по разному реагируют на тяжелые металлы. Ряд микроорганизмов способны осуществлять активный транспорт тяжелых металлов внутрь клеток / 31 /. Проницаемость клеток служит ведущим фактором в проявлении токсичности металлов. В некоторых случаях возникает более толерантные к тяжелым металлам резистентные штаммы, т.е. такие, для воздействия на которые необходима более высокая концентрация токсического вещества, чем для воздействия на родительские штаммы. Часто эта резистентность определяется образованием белковых или ферментативных систем в клетке, что обусловлено генетическими изменениями, связанными с хромосомами и внехромосомными элементами генетического аппарата плазмидами и транспозонами. Плазмиды клеток микроорганизмов несут гены, которые определяют резистентность к различным тяжелым металлам. Иногда устойчивость обусловлена специфическим связыванием металла смежными остатками цистеина в молекуле металлотионинов, синтез которых может индуцироваться тяжелыми металлами либо стрессовыми факторами. Металлотионины - это белки, специфические связывающие тяжелые металлы в живых организмах. Металлотионины I и II -низкомолекулярные, кодируемые генами, идентифицированы в клетках цианобактерий и грибов. Существуют еще фитохелатины, которые образуются в растительных клетках и образуют только ферментативным путем / 13 /. Некоторые ионы металлов иммобилизируются клеточной оболочкой или связываются слоем слизи, покрывающем клетку. Одной из форм резистентности является также осаждение ионов металлов в форме сульфидов и фосфатов. Такие, например, ионы как Cd (II) активно транспортируются в некоторые штаммы бактерий по Mn(II) и PО43транспортной системе соответственно. Приобретая плазмиду резистентности клетка блокирует такое высоко аффинное поглощение токсичных ионов через эти энергозависимые транспортные каналы. В резистентных штаммах образуются целые комплексы белково-ферментных систем, обуславливающих связывание и редокс-превращение металла, а также АТФ-зависимые каналы, ответственные за "выкачивание" токсичных ионов из клетки / 32 /. Специфические, ферментативные окислительно-восстановительные превращения металлов достоверно известны только для нескольких переходных металлов и наиболее изученными являются марганец и железо. Эрлихом доказано, что бактериальное загрязнение марганца (II) при формировании железо-марганцовых конкреций катализируется конститутивными оксидазами в реакциях: MnO2 + 1/2 O2 + H2O = MnO2 + 2H+ , MnO + MnO2 + 1/2 O2 = 2MnO ,

4

а также в каталазной реакции: Mn2+ + H2O2= MnO2 + 2H+ Ряд морских бактерий обладает способностью восстанавливать четырехвалентный марганец ферментативным путем и при этом редоксэквивалентны переносятся к MnO2 через электрон-транспортную цепь(цитохром b,с,о). Закисное железо может окисляться ферментативным путем с использованием ЭТЦ бактерий, однако часто наблюдается его автоокисление. Клетка может связывать железо специфическими легандами и жирными кислотами, а устойчивость к железу (II) определяется ее высокоаффинными хранилищами сидерофорами. Восстановление железа в виде Fe2O3 ферментами бактерий также впервые отмечено в работах Эрлиха, хотя в настоящее время наиболее известной подобной ферментативной системой является феррицианидредуктаза. Марганец и железо являются существенными для жизнедеятельности элементов и присутствие в микроорганизмах редокс-ферментов их превращения неудивительно. То же самое относится и к меди. В природных условиях встречается большое количество толерантных микроорганизмов, которые адсорбируют до 30-40% ионов металлов на своей поверхности. В экспериментах по непрерывному культивированию бактерий Zooglea, выделенных из отработанных вод, в течение 10 мин. накапливалось 170 мг меди на 1г сухой биомассы (экстраклеточный полисахарид). В штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisia (естественных и лабораторных) обнаружена резистентность к ионам меди, обусловленная закодированными в хромосомах зон металлотионинов, которые, связывая металл, препятствуют его токсическому действию. На кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова группой исследователей обнаружен и выделен ванадийтионин из цианобактерий Anacysis nigulans. Показано, что он является цитоплазматическим белком с молекулярной массой 10 кДа, являющимся, видимо, металлотионином II, специфически связывающий ионы ванадия. Грибы-микромицеты способны удалять ионы тяжелых металлов благодаря аккумуляцией их клеткой. Причем наибольшей активностью обладают хитин и пигменты / 9 /. Микроорганизмы чрезвычайно чувствительны к водным растворам серебра, т.к. ионы серебра, связываясь с поверхностью клеток ингибируют дыхание и окислительное фосфорилирование. Резистентность микроорганизмов к серебру, как и у меди, определяется наличием специфических плазмид и эффективность выражается в виде уменьшения связывания ионов Ag+. Повидимому некоторые псевдомонады проявляют резистентность путем восстановления ионов серебра в токсичной концентрации до металлического состояния. Высокое сродство устойчивых бактерий к ионному серебру можно использовать для извлечения серебра из водных растворов. Было показано, что смешанная культура микроорганизмов (Pseudomonos maltophilia, Saureus, Corynebacterium) способна накапливать

5

более 300 мг серебра на 1 г сухой биомассы при начальной скорости накопления 21 мг А на г клеточной массы. Широко распространенные бактерии серебряных рудников Th.ferrooxidans и Th. thiooxidans накапливают около 250 мг Аg на 1 г сухой биомассы. Количество связанного серебра зависит от условий проведения реакций - от рН, регулирующего степень ионизации поверхностных групп клетки, и от присутствия анионных лигандов в среде. Так, ЭДТА, сульфат, хлорид, фосфат, глутамат,и карбонат ингибируют связывание ионов серебра клетками микроорганизмов. Помимо с ионного серебра штаммы бактерий способны связываться с коллоидными частицами металлического серебра. Ион ртути (II) ближайший сосед и стереохимический аналог золота (Au+). Бактерии очень чувствительны к ионам ртути, который является сильнейшим сульфгидрильным ядом (вообще из всех ионов металлов наиболее токсичными являются Ag+ и Hg (II).Резистентные штаммы бактерий содержат уникальную ферментативную систему защиты от ртути и ее соединений. Известно, что в настоящее время естественный цикл биогенной трансформации ртути состоит из трех белковых систем, выполняющих следующие функции: а) ферментативное восстановление двухвалентной ртути (II) до металлического состояния (Hg0 ). б) деметилирование ртутьорганических соединений в) метилирование Hg (II) до метил- и диметил-ртути. На первом этапе ион ртути свободно проникает сквозь клеточную стенку грамположительных бактерий, грамотрицательных и в ртуть Hg(II) резистентных бактериях связываются со ртуть-специфическим белком в периплазматическом пространстве и затем с мембранно-связанным белком.(М.м. 12500) цитоплазматической мембраной. В обоих случаях связывание идет через II-группы. Мембранный переносится с Hg(II) через мембрану во внутриплазматическое пространство, где он связывается с цистеиновыми аминокислотным остатком ртуть-редуктазы(АДРН: Hg (II) оксидоредуктаза, КФ 1.16.1.1. (рядом с активным центром). Ртуть-рудуктаза-флавопротеид, состоит из двух разных субъединиц с М.м.58700, содержит в активном центре дисульфид и двух цистеиновых остатков (цис135-цис140). В результате стериохимического окисления НАДФН происходит восстановление Hg (II) по следующей реакции: Hg(SR)2 + NADPH + H+ → Hg0 + 2RSH + NADP+ Сначала происходит восстановление кофактора фермента FАD до FАDН2, который восстанавливает дисульфид активного центра до двух свободных сульфгидрильных групп Hg (II) связывается с этими двумя SНгруппами цистеиновых остатков и восстанавливается до Hg0 (при этом в активном центре восстанавливается дисульфидная связь. В дальнейшем нетоксичная Hg0 диффундирует из клетки и являясь летучим компонентом, испаряется прежде, чем произойдет ее реокисление. Ртуть-редуктаза кодируется

6

плазмидным или транспозонным геном с изученной последовательностью мер оперона и является индуцибельным ферментом. По своей структуре (дисульфид в активном центре) этот необычный фермент гомологичен флавопротеиноксидо-редуктазе, глутатионоксидоредуктазе и липоамиддегидрогеназе. В хемолитотрофной бактерии Th.ferrooxidans также обнаружена ртутьредуктаза, защищающая клетки от повреждения ионами ртути при рН=2,5. По-видимому, следует ожидать обнаружение резистентных штаммов бактерий и грибов и к другим ионам металлов и их соединений.

7

2 Микробиологические методы осаждения ионов металлов из сточных вод 2.1 Роль сульфатвосстанавливающих бактерий в очистке сточных вод В результате деятельности сульфатвосстанавливающих бактерий из сточных вод осаждаются сульфиды кобальта, никеля, кадмия, железа, свинца, цинка и другие / 11 /. Осаждать сульфиды металлов способны не только облигатные сульфатредукторы, но и микроорганизмы, использующие менее окисленные соединения серы в дыхательной цепи, селекционированные штаммы бактерий pода Pseudomonas, обладающие способностью к сульфатредукции. В результате их деятельности хорошо растворимые токсичные сульфаты восстанавливаются до практически нерастворимых, выпадающих в осадок форм. Сульфатредукторы - одна из самых древних физиологических групп бактерий. Результаты их деятельности обнаружены при анализе пород верхнего архейского возраста Алданского щита Сибири (3х109 лет) и отложений железа в районе Мичикопотен и Вуменривер в Канаде (2,75x109 лет). Эти находки более точно определяют время появления сульфатредуцирующих бактерий в интервале 2,8 - 3,7х109 лет. Предполагают, что первые проявления микробного метаболизма связаны с возникновением бактериального фотосинтеза. Фотосинтезирующие серные бактерии перевели восстановленные формы серы в сульфаты, а сульфаты затем стали использоваться сульфатредукторами в качестве акцепторов электронов. Следовательно, сульфатное дыхание старше кислородного. Впервые сульфатредуцирующие бактерии были описаны Бейеринком в 1895 году. Классификация их была предложена Posgate, Campbell (1966 ), которые определили в этой группе всего 2 рода: Desulfovibrio и Desulfotomaculum. В настоящее время известно 8 родов сульфатвосстанавливающих бактерий: Desulfovibrio и Desulfotomaculum, Desulfomonas, Desulfobacter, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfosacina, Desulfonema. По морфологии они очень разнообразны. Это споровые и аспорогенные формы (таблица 1). В основу систематики этих бактерий положеная способность усваивать различные органические соединения, спорообразование и морфология клеток. Общими свойствами этих бактерий, объединяющими их в единую физиологическую группу, является строгий анаэробиоз и способность к диссимиляторному восстановлению сульфатов. Большинство сульфатредуцирующих бактерий хорошо растут при температуре 25-30 0С. Для отдельных видов оптимальная температура несколько выше (37-46 0С). Но рост культур часто возможен при изменении температуры в пределах от 3-15 до 35-40 0С. Известны и термофильные виды, растущие при температуре выше 65 0С. Есть также данные, что при высоком давлении

8

(1000 атм) некоторые сульфатредуцирующие бактерии сохраняют оптимальное значение рН для роста 7,0-7,5, однако развитие возможно при изменении рН примерно от 4,2-до10,5 , хотя и не всех видов. Редуцирующие сульфат бактерии являются облигатными анаэробами. В среде для выращивания этих микроорганизмов часто добавляют редуцирующие вещества (дитионин и др.). Обычно среды содержат также в значительном количестве сульфаты и железо(FeS), который выпадает в осадок. Это имеет значение для детоксикации сероводорода, а также позволяет судить о росте сульфатредуцирующих бактерий, т.к. осадок сульфида имеет черный цвет. В то же время присутствие небольшого количества сульфида может быть важно для роста сульфатредуцирующих бактерий, поскольку он относится к числу восстановителей. Компонентами многих сред, в которых выращиваются сульфатредуцирующие бактерии является дрожжевой экстракт, причем в довольно большей концентрации (0,1% и более). Однако далеко не все сульфатредуцирующие бактерии нуждаются в дрожжевом экстракте. Сульфатредуцирующие бактерии могут расти и на средах без витаминов. Показано, что первоначальной стадией биохимического восстановления 2SO4 являются транспорт экзогенного сульфата через бактериальную мембрану. При диссимиляторном восстановлении сульфата последний соединяется с АТФ с участием АТФ-сульфурилазы и продуцирует очень активную молекулу АФС (аденозин-фосфосульфат), а также пирофосфат. Затем АФС быстро конвертирует с помощью цитоплазматической АФС-редуктазы в сульфит (SO32-), который восстанавливается в H2S, при температуре до 1040С. Важными субстратами для питания сульфатвосстанавливающих бактерий являются лактат, пропионат, бутират, 2-метилбутират, глутамат, серин, аланин, аргинин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, и лизин. Конечным продуктом окисления лактата и пропината является ацетат. В последнее время появляются сообщения о том, что некоторые представители сульфатредукторов, считавшиеся ранее совершенно обособленной группой облигатно-анаэробных бактерий, могут использовать в качестве акцептора электронов не только сульфаты, но также нитраты и нитриты с таким же выходом энергии или даже большим, чем при редукции сульфатов. Показано, что 7 штаммов Desulfovibrio способны к нитратредукции в присутствии в среде небольших количеств сульфатов. Нитратредукция невозможна в отсутствии сульфатов. Однако, когда концентрация сульфатов увеличивалась до 35 мМ в среде, нитратредукция ингибировалась. При высоких концентрациях сульфатов идет ингибирование нитратредукции сульфидами. Дальнейшие исследования показали, что сульфатредукцию вызывают не только облигатные, но и факультативные анаэробы, а именно они находят применение в практике очистки промышленных сточных вод. Из шахтных вод выделены две культуры бактерий, отнесенные к Ps.stutzeri и P.mendocina; они способны в анаэробных условиях восстанавливать сульфаты и нитраты.

9

Обе культуры - подвижные грамоотрицательные палочки. В аэробных условиях в качестве источника азота они усваивают мочевину, пептон, аспарагин, а в качестве анаэробных - ассимилируют также азот из KNO3 и (NH4)2SO4 и др. Описаны и другие виды сульфатвосстанавливающих бактерий, способных к к восстановлению нитратов. Клошниковой Т.М. с сотруд. (1992 ) из сточных вод предприятий были выделены штаммы рода Pseudomonas. Наиболее сильно восстанавливают сульфаты род Putida. Штамм обладает каталазной активностью и может быть отнесен, согласно классификации к факультативным анаэробам. Он растет при содержании сульфатов до 5 г/л и электронно-восстановительном потенциале - 350 мВ. В примерах технологического применения бактериальной сульфатредукции - образование нерастворимых сульфидов металлов при взаимодействии стоков с сероводородом, являющимся продуктом жизнедеятельности сульфатредуцирующих микроорганизмов - положен принцип стимуляции развития сульфатредуцирующих бактерий в анаэробных условиях обогащением среды доступным для них органическим веществом / 14 /. В способе биохимической очистки сточных вод от ионов ртути сульфатвосстанавливающие бактерии в анаэробных условиях восстанавливают сульфаты до сероводорода, который осаждает ионы ртути в виде нерастворимого сульфида ртути. Биохимической очистке подвергают модельную сточную воду следующего состава (мг/л): ХПК 150; сульфаты - 300; фосфаты - 1,5; нитраты - 18,0; Hg (II) - 10. Содержание Hg (II) за 24 часа снизилось с 10 до 1-2 мг/л, а степень очистки составила 80-90%. В параллельном опыте к активному илу, содержащему сульфатвосстанавливающие бактерии, дополнительно прибавили тионовые, аммонифицирующие, денитрифицирующие бактерии, состава 20% от сульфатвосстанавливающих бактерий. Содержание Hg (II) в очищенной воде составляет в этом примере менее 0,1 мг/л, степень очистки возрастает до 99 %. При обработке стоков химико-фотографической промышленности сульфатвосстанавливающие бактерии в анаэробных условиях обеспечивают полное извлечение ионов серебра с одновременной очисткой от органических соединений.В способе очистки сточных вод от ионов висмута сточные воды горнообогатительного комбината подвергли обработке в анаэробных условиях активным илом, содержащим сульфатвосстанавливающие бактерии, метанообразующие и бактерии рода Leptothrix. Процесс очистки проводили при рН=4,0-5,0. Эффективность очистки стопроцентная, к тому же использование предлагаемого способа позволяет удалить из сточных вод Ca (II) и Fe (III).Одним из наиболее существенных пюллютантов в ряду тяжелых металлов стоит ванадий. интерес к этому металлу обусловлен важностью его загрязнителя. Большая часть производимого ванадия применяется в черной металлургии, его соединения используются в разных отраслях промышленности. Готовое поступление ванадия в окружающую среду из антропогенных источников составляет 170000 т за счет промышленности и транспорта и 100000 т за счет энергетических предприятий. В контексте этих фак-

10

торов возрастает значение исследований, направленных на изучение механизмов его детоксикации. Фекальные сточные воды, образующиеся в системе мазутных котлов электростанций, содержат кроме ванадия железо, медь, никель, а также значительное количество сульфатов. Обрабатывают ванадий-содержащие стоки активным илом в анаэробных условиях, который содержит сульфатвосстанавливающие бактерии . Использование предлагаемого способа очистки обеспечивает очистку стоков от ионов металлов до остаточного содержания ванадия в очищенных стоках 0,05-0,1 мг/л, что соответствует ПДК. Имеющиеся в системе с ванадием медь и железо образуют нерастворимые сульфиды, которые удаляются одновременно с ванадием. Так, например, при обработке раствора, содержащего ванадий 100 мг/л, железо 80 мг/л, медь- 5 мг/л, никель - 10 мг/л, после контакта с сульфатвосстанавливающими бактериями степень извлечения составляет 99, 95% для ванадия; 99,90 - для железа; 100% - для меди и никеля. Сульфатредукцию осуществляют не только сульфатвосстанавливающие бактерии известных родов, но также метанообразующие архебактерии и некоторые гетеротрофные микроорганизмы / 21 /. Имеются данные о роли гетеротрофных микроорганизмов в растворении оксидов свинца, меди, марганца, кадмия, цинка, урана, за которыми следует микробиологическое и фотохимическое разложение в аэробных условиях. Еще более эффективно процесс осаждения металлов происходит с аппаратов с иммобилизированными сульфатредуцирующими микроорганизмами. Чаще иммобилизация осуществляется по принципу адсорбции на заполняющем аппарат пористом материале, например, полиуретане, керамике, полихлорвиниле и других пленках, натянутых вдоль всего объема реактора. Аппараты с фиксированными на пористом материале микроорганизмами получили название анаэробных фильтров. В способе биохимической очистки сточных вод от ионов цинка очистке подвергаются сточные воды завода химических волокон, имеющие следующий состав (мг/л): Zn(II) - 4-5; ХПК -400-600; СПАВ - 26-30; БПК 280-350; SO32 - 6-7; NH4+ - 15-25. Для осуществления способа сточные воды фильтруют через неаэрируемый биофильтр с открытой поверхностью зернистой загрузки

11

Таблица 1 - Сульфатвосстанавливающие бактерии Роды и виды Desulfovibrio D. africanus D. baarsii D. desulfuricans D. gigas D. vulgaris D. salexigens Desulfotomaculum D. acetoxidans D. nigrificans D. orients D. ruminis Desulfomonas D. pigra Desulfobacter D. postgatei

Морфология и размеры клеток, мкм

Искривленные па- Полярное (один лочки сигмоидные жгутик или пуили спиралевидные чок) 0,5-1,0 х 2,0-10,0

Прямые или изогнутые палочки 0,3-1,5 х 3,0-9,0 образуют эндоспоры Прямые и слегка изогнутые палочки 0,8-1,0 х 2,5-10,0 Палочки и элипсовидные 1,0-2,0 х 1,7-3,5

Desulfobulbus D. propionicus Desulfococcus D. multivarans

Элипсовидные 1,0 – 1,3 х 2,0 Сферические 1,5-2,0

Desulfosarcina D. variabilis

Неправильной формы, образуют пакеты 1,0-1,5 х 1,5-2,5 нити (иногда более 1 мм в длину) из палочковидных клеток 2,5-8,0 х 2,5-13,0

Desulfonema D. limicola D. magnum

Расположение жгутиков

Содержание ГЦ в ДНК в% 46,1-61,2

Перитрихальное реже полярное

37,0-45,5

Неподвижны

66,0 67,0

полярное (один жгутик или жгутиков нет)

45,9

нет жгутиков или полярное некоторые штаммы подвижны полярное (но не всегда обнаруживаются подвижные формы) жгутиков нет, но способны к скользящему движению

59,9 57,4 34,5-41,6

34,5-41,6

Примечание - К роду Desulfovibrio относят также D.baculatus и D.thermophilus, но данные микроорганизмы имеют форму прямых палочек. Возможно они являются представителями другого рода сульфатредуцирующих бактерий.

12

. Микроорганизмы иммобилизируются тонким слоем на поверхности частичек ПАУ, образовывая вторичную биопленку, на которой происходит биосорбция трудноокисляемых органических соединений, а также адсорбция внеклеточных ферментов и кислорода, повышенная степень окисления плохо адсорбирующихся веществ и продуктов метаболизма. В нижних слоях биофильтра протекают анаэробные процессы сульфатредукции под воздействием Desulfovibrio, Desulfotoculum и других, продуцирующих сероводород. Процесс проводили при рН >7,2 , при котором H2S присутствует в среде в виде гидросульфидов, которые, реагируя с ионами цинка , образуют нерастворимый сульфат металла. В очищенной воде цинк отсутствовал, ХПК - 20; БПК - 2,0; СПАВ - 0-0,01; SO42 - 7152; S2O32 - 0; NH4+ - следы. В способе очистки сточных вод от тяжелых металлов очистку осуществляют накопительными культурами сульфатвосстанавливающих бактерий, иммобилизированных на сетчатой стеклоткани (в качестве носителя). последовательно обработанной 0,2-0,5 % - процентным ПАВ (НПАВ) и 0,05-10% раствором карбоксиметилцеллюлозы./16 /. Предварительная обработка носителя позволяет осуществить эффективное закрепление на нем бактериальных клеток в анаэробных условиях, активизировать прирост клеток в анаэробных условиях и тем самым сократить время наращивания биомассы. Кроме того, сульфатвосстанавливающие бактерии в иммобилизированном состоянии проявляют повышенную устойчивость против против бактериального воздействия высоких доз медно-аммиачных комплексов и ионов тяжелых металлов. Способ осуществляется на установке, состоящей из смесителя стоков, биотенка и отстойника. При очистке сточных вод гальванического производства (рН = 4,5; ХПК=945, 2 мг/л, содержащих (мг/л): сульфаты 125,05; азот аммонийный - 135,2; хром(VI) - 156; цинк (II) - 23,2; кадмий (II) 18,4; железо (III) -52,4. Степень очистки от ионов тяжелых металлов составляет - 100%, к тому же способ позволяет снизить продолжительность очистки в 7-12 раз. Эффективный способ очистки сточных вод от тяжелых металлов, включающий сорбцию на носителе с иммобилизированными микроорганизмами, отличающийся тем, что в качестве носителя используют окисленный уголь, а в качестве микроорганизмов Acinetobacter coаsulficus Ps. denitrificans, Ps.londa в соотношении 1:1:1, причем в процессе иммобилизации сначала к углю добавляют фосфоритовую муку в количестве 1 г на 50 г угля и после перемешивания вводят гашеную известь, рН=7,0. Сорбент вносят в количестве 100-250 г на 1 г металла, содержащегося в сточной воде. На основании проведенных исследований предложено несколько технологий очистки промышленных сточных вод от тяжелых металлов и их соединений при внезапном возникновении экстремальных условий: залповый выброс загрязнителей-токсикантов, резкое снижение рН и температуры сточных вод, в результате чего популяция СВБ в любом участке может подвергаться риску быстрой гибели / 15 /, Они находятся на стадии внедрения. С целью обеспечения оптимальных условий для жизнедеятельности бактерий рекомендовано выращивать их в емкостях из полупроницаемой

13

мембраны, погруженной в очищаемую сточную воду. Мембрана пропускает растворенный сероводород в сточную воду, но предохраняет микроорганизмы от непосредственного воздействия сульфатвосстанавливающих бактерий и тяжелых металлов. В качестве полупроницаемой мембраны используют полученные искусственно органические (целлофан, коллодий) или неорганические осадочные (гексациано-феррат меди) пленки, выстилающие емкость из мелкопористого материала. В таблице 2 показано осаждение ионов ртути в водопроводной воде смешанной культурой сульфатвосстанавливающих бактерий в целлофановой емкости (опыт) и в емкости из трехслойной хроматографической бумаги (контроль) при исходной концентрации ртути (II) 200,0 мг/л в объеме воды по 7 литров в контроле и в опыте. Таблица 2 – Осаждение ионов ртути в водопроводной воде сульфатвосстанавливающими бактериями Варианты Время Опыт Контроль

Концентрация Hg (II)/HgSO4 , мг/л 15 мин 30 мин 1 час 2 час 11,1 6,6 4,7 4,1 16,6 16,6 16,6 16,6

4 час 2,5 16,6

5 час 0,2 !6,6

Определение Hg (II) диазоновым методом показало, что в контрольном варианте осаждение ионов ртути практически прекратилось по истечении 15 мин., тогда как в опыте за 4 часа 45 мин. концентрация ионов ртути уменьшилась в 50 раз с момента прекращения в контроле и в 100 раз - от начала эксперимента. Дальнейшее изучение показало, что микроорганизмы в опытном варианте сохранили жизнедеятельность в течение 1,5 суток до полного израсходования запаса сульфатионов в культуральной жидкости при полном отсутствии ионов ртути в воде. При обеспеченности органическим веществом и сульфатами культура сульфатредуцирующих бактерий может осуществлять свою жизнедеятельность довольно длительный срок. Использование устройства по предлагаемому способу позволяет включить его в работу на любом этапе технологической цепи очистных сооружений, внедрение его не предусматривает капитальных затрат на переоборудование существующих очистных сооружений. Способ прост и эффективен, позволяет производить запуск и остановку, интенсификацию и торможение процесса микробиологической сульфатредукции, предохраняет микроорганизмы от гибели при залповых сбросах вредных веществ в воду, в аварийной обстановке на очистных сооружениях при поступлении в стоки высоких концентраций ионов тяжелых металлов. Таким образом, в биотехнологии очистки сточных вод от тяжелых металлов особенно важное значение имеют сульфатредуцирующие бактерии. Однако, применение сульфатов в качестве окислителя органических веществ при очистке сточных вод пока затруднительно из-за чрезмерной токсичности образующегося сероводорода, неумения и нежелания с ним работать, высо-

14

кой его реакционной способности, что требует биореакторов из коррозионно стойких материалов. В то же время использование сульфата как окислителя очень важно при очистке сточных вод, содержащих ионы тяжелых металлов, которые, связываясь с сероводородом, осаждаются в виде сульфидов. Такой осадок во много раз меньше того, который образуется в результате сорбции ионов тяжелых металлов на биомассе, и может служить сырьем для извлечения содержащихся в нем элементов.

2.2 Биологическая очистка хромсодержащих сточных вод Реакции с сероводородом - не единственный путь внеклеточного осаждения металлов из растворов. Так, например, хром можно извлекать из раствора путем его восстановления Cr (VI) → Cr (III) , сопряженного с окислением органических субстратов, с помощью хромвосстанавливающих микроорганизмов рода Aeromonas, Escherichia, Pseudomonas., Enterobacter, Thiobacillus и других микроорганизмов. Практически для осаждения хрома из сточных вод применяют микробную ассоциацию, содержащуюся в активном иле канализационных отстойников. В составе ассоциации имеются факультативно анаэробные бактерии, восстанавливающие Pseudomonas dechromaticans, Ps. chromatophila, Aeromonas dechromaticans. Промышленные и бытовые воды, подлежащие дехромированию, часто сами служат источниками органических субстратов. Хром в шестивалентной форме имеет наибольшее промышленное использование вследствие кислотных и окислительных свойств и способности образовывать интенсивное окрашивание и нерастворимые соли. Установлено, что контакт с Cr (VI) и его соединениями приводит к раздражению, разъеданию кожных и слизистых оболочек, вызывает дерматит, и "хромовые" язвы, приводит к заболеванию раком легких. Значительное количество хрома поступает в водные объекты со сточными водами гальванических производств, красильных предприятий, концентрации Cr (VI) колеблется в пределах 100-250 г/л. Экономический ущерб, причиняемый хромосодержащими отходами гальванических производств ежегодно достигает 70 тысяч рублей (на 1998 год). Ранее в России был разработан уникальный способ биологического восстановления хромосодержащих сточных вод микроорганизмами: Pseudomonas dechromaticans Rom с выделением в осадок образовавшейся гидроокиси хрома. Способ запатентован в США, Англии, Франции, Германии, Италии и внедрен для малоконцентрированных по Cr ((VI) стоков на автозаводе "Коммунар" в г. Запорожье, а также на Актюбинском заводе хромовых соединений для обезвреживания подземных вод, загрязненных Cr(VI). С целью исследования влияния высоких концентраций хрома на биохимическую очистку сточных вод и механизма удаления ионов хрома (VI) с использованием сульфатредуцирующих бактерий донных отложений сульфатного пруда-накопителя, проводили в стеклянных реакторах, строго со-

15

храняя анаэробные условия протекания процесса. Для развития сульфатредуцирующих бактерий в реакторы вводили питательную среду Постгейта. Отдельные серии опытов по очистке реальной сточной воды гальванического производства, содержащей хром, никель, медь и цинк проводили на пилотной установке непрерывного действия, состоящей из биотенка проточного типа и отстойника. Характерной особенностью исследуемого биохимического процесса является существенная зависимость скорости снижения концентрации ионов хрома (VI) от их начального содержания в воде. Так, весьма быстро (в течение 3 часов) и полное извлечение хрома из воды наблюдается в опытах, когда его начальная концентрация не превышает 100 мг/л. Однако при более высоких концентрациях хрома скорость его удаления существенно замедляется. Известен способ биохимической очистки сточных вод от соединений Cr (VI) до Cr (Ш) с помощью штамма Bact. Dechromaticans / 26 /. Этот способ наиболее известен и позволяет восстановить хроматы и биохроматы до гидроксида хрома в анаэробных условиях до 1 г хромата на 1 г сухого вещества за 3 суток. В способе биологической очистки сточных вод от шестивалентного хрома хромвосстанавливающая биомасса иммобилизируется на термостабильном носителе-субстрате из фенол-формальдегидного пенопласта в виде крошки в смеси с сульфитным щелоком. Квасниковым Е.И. и др. (1985) из промышленных хромсодержащих сточных вод выделена новая бактерия рода Аeromonas с грамотрицательным типом клеточной стенки, факультативно-аэробную, оксидазоположительную, нечувствительную к 2,4-диамино-6,7-диазопропилпиридину, нелюминесцирующую, образующая газ, содержащая 59 ± 0,2 мол.% ГЦ пар в ДНК. Бактерия требует наличия в среде 3% NaCl. Растет при рН 5,0-9,0 (опт. 6,8-7,0) и 445 0С (оптимальная температура 340С). От описанных аэромонад бактерия отличается смешанным способом жгутикования, вариабельностью окраски по Граму, отсутствием каталазной активности. Положительная окраска по Граму обуславливается наличием кристаллической микрокапсулы. Из-за обнаружения высокой способности бактерий восстанавливать нетоксичные ионы хрома (VI) ее предложено назвать Aeromonas dechromatica sp.nova. Типовой штамм В-2373 депонирован во ВНИИ генетики промышленных микроорганизмов. Практически для осаждения хрома из сточных вод применяют микробную ассоциацию, содержащуюся в активном иле, в составе ассоциации имеются факультативно-анаэробные бактерии, восстанавливающие хром (VI): Ps.Aeromonas dechromaticans, Ps. chromatophila, Aeromonas dechromatica sp.nova. Квасниковым Е.М. и др. (1993 ) исследовано 650 штаммов 9 видов Pseudomonas. Штаммы, наиболее устойчивые к высоким концентрациям Cr (VI) (от 75 мг до 250 мг) транспортировали его в Cr (VI) со скоростью 0,8-1,0 мг на 1 г бактериальной биомассы. Наиболее активные штаммы были обна-

16

ружены в сточных водах и иле очистных сооружений промышленных предприятий. Их не удалось выявить в пробах почвы и воды, незагрязненных соединениями хрома / 19 /. Разработана биотехнология очистки промышленных стоков, содержащих переменно-валентные тяжелые металлы. Сущность рекомендуемого способа заключается в следующем. Селекционированный штамм Aeromonas dechromatica или Pseudomonas рutida предварительно выращенные в лаборатории совместно с адаптированным активным илом, вносятся в биореактор, в который поступают промышленные стоки. В качестве дополнительного питания добавляют небольшое количество органических отходов, содержащих компоненты, пригодные для питания используемых бактерий, но лишенные токсических веществ. Могут быть использованы и углеводороды, хорошо усваиваемые исследуемыми бактериями. Процесс очистки сточных вод ускоряется во много раз при изменении минеральных или органических носителей. В последнее время положительные результаты получают иммобилизацией Aeromonas dechromatica КС-11, Aeromonas dechromatica ТГ-463, иммобилизированные на кукурузных кочерыжках или целлюлозолигнине - отходе биотехнологической переработки соломы. Под воздействием спонтанно развивающихся целлюлозоразлагающих бактерий среда обогащается легкоусвояемыми и углеводами и другими веществами. Анализы показали, что при внедрении разработанной биотехнологии содержание постоянновалентных и переменновалентных металлов в промышленных стоках снижается до норм, установленных ГОСТом и до нуля. В Люберецком НПО "СОЮЗ" / ЛНПО "Союз" были проведены исследования и создана опытная установка по обезвреживанию высококонцентрированных (до 250 мг/л по Cr) хромосодержащих электролитов (рисунок 1) . Процесс обезвреживания проводят в две стадии. На 1 стадии удаляют из электролита Cr (VI) и другие металлы (Cu, Ni, Zn, Fe), смесь разделяют на 2 фазы, причем осадок затем отправляли на переработку в хромсодержащий агломерат, а жидкую фазу на II стадию процесс восстановления Cr (VI) специфическими микроорганизмами. Для этого в жидкую фазу вводят хозяйственно-бытовую воду, органический субстрат, специфический активный ил, способный восстанавливать Cr (VI) и перемещение проводят до полного перевода Cr (VI) в Cr(III). Разделяют смесь на жидкую фазу и осадок. Часть осадка возвращают на стадию восстановления Cr (VI), а часть с Cr(OH)3 обезвреживают и отправляют на переработку в карбид хрома. Фильтрат и жидкую фазу направляют на дальнейшую аэробную очистку от оставшихся неокисленных органических веществ. В результате такой обработки получено два вида биошламов, из которых возможно получение двух видов товарных продуктов. Первый вид - это биошлам, содержащий медь, цинк, никель, железо, хром, которые в дальнейшем могут перерабатываться в лигатуру для специальных чугунов. Полученный агломерат отвечает требованиям ВТУ -14-04-93. Второй вид - это био-

17

шлам, содержащий гидроокись для переработки в карбид хрома. ВТУ 7729194-65. Таким образом, на предлагаемой установке с использованием микроорганизмов Ps. dechromaticans Rom обеспечивается обезвреживание Cr (VI) в концентрации 70-250 г/л.

сточная вода I стадия Нейтрализация (известью) сорбция Cr(VI) и других тяжелых металлов на биосорбенте

Отстаивание после фильтрования II стадия

осадок на переработку Фильтрат

на биологическое Восстановление Cr(VI)

Специальный ил Хозяйственные воды аэробная очистка

Фильтрация Осадок на переработку в карбид хрома

Фильтрат / жидкая фаза

Рисунок 1 – Блок-схема обевреживания хромсодержащих электролитов

18

На основании имеющихся литературных данных способы очистки сточных вод от Cr (VI) при помощи микробиологического метода являются перспективными, простыми и дешевыми, так как в качестве питательной среды для микроорганизмов используется бытовая сточная вода (бесплатный питательный субстрат), обычное, химически незащищенное оборудование, уменьшение объемов осадка в 60 раз по сравнению с осадками при химическом обезвреживании / 5 /.

2.3 Биологическая очистка сточных вод ,содержащих железо, марганец, мышьяк и ртуть Другой пример - микробиологическое восстановление селена Se (VI) и Se (IV) до нерастворимого элементного состояния благодаря наличию у представителей многих систематических групп фермента селенредуктазы, причем конститутивного фермента. Предложены способ и устройство для извлечения селенатов из сточных вод при помощи микроорганизмов. Процесс протекает последовательно в двух зонах.. В первой зоне поддерживаются аэробные условия, при этом одновременно достигается метаболизация нитратов биомассой. Во второй, бескислородной зоне происходит биовосстановление селенатов до элементарного селена, который далее отфильтровывается. Часть биомассы из первой зоны при необходимости рециркулируется во вторую зону в качестве источника питательных веществ и акцептора электронов. Предусмотрено создание третьей, сульфатовосстанавливающей зоны, где образуется сероводород, направляемый во вторую зону в качестве дополнительного восстановителя для селенатов. Некоторые микроорганизмы способны получать энергию при окислении закисного железа в окисное Fe2+ → Fe3+. Такой способностью обладают значительное число микроорганизмов, относящихся к различным систематическим группам; как автотрофные, так и гетеротрофные. К хемолитотрофным бактериям, окисляющим железо принадлежат прежде всего Thiobacillus ferrooxidans, впервые выделенный в 1947 г. из кислых дренажных вод шахт битуминозных углей. Морфология Th. ferrooxidans типична для тиобацилл. Это грамотрицательные небольшие палочки 0,4-0,5 х 1,0-4,0 мкм, подвижны, имеют жгутики полярно расположенные. Размножаются бинарным делением. Аэроб, но может окислять в анаэробных условиях серу, восстанавливая при этом окисное железо. Оптимум рН для роста - 1,8-3,5. Th. ferrooxidans очень устойчив к ряду тяжелых металлов - Cu, Zn, Cd, Cr и др., способен расти в присутствии 6% медного купороса (CuSO4). T. ferrooxidans растет в автотрофных условиях, окисляя закисное железо. Помимо Fe(II) окисляет и некоторые другие металлы с переменной валентностью, а именно, Cu (II), Zn (II), V(IV) , Sb(III), Se(II). Окислять Fe (II) может и Leptospirillum ferrooxidans. Это небольшая спирилла, выделена из сульфитных месторождений. По ряду физиологиче-

19

ских свойств и распространении в природе данная бактерия похожа на Th. ferrooxidans . Однако ее рост возможен только на минеральных средах с солями закисного железа, а соединения серы, саму серу, также сульфидные минералы L. ferrooxidans не окисляет. Представители р. Sulfolobus (Sul. ucidocaldarius, Sul. brierelyi) способны окислять и серу, и двухвалентное железо, также сульфидные минералы. Известны также термофильные бактерии, похожие на тиобацилл, окисляющие двухвалентное железо. Однако все микроорганизмы кроме Th. ferrooxidans способны окислять закисное железо с использованием для получения энергии молекулы серы и ее соединения. Данные относительно того как происходит окисление железа хемолититрофными бактериями имеются только для Th. ferrooxidans. Результаты процесса отражает уравнение: 2Fe2+ + 0,5O2 + 2H+ →2Fe3+ + H2O , при рН = 1,5 В окислении железа Th. ferrooxidans видимо участвует особый белок, содержащий медь и сохраняющий стабильность при рН = 2,0. Этот белок растицианин. Fe2+

растицианин

цитохром с

цитохром а

O2

Кинетика окислительного процесса определяется многими факторами. Однако наиболее важными из них являются биомасса и ее активность. Полагают, что взаимодействие железа с растицианином осуществляется в периплазме, со стороны которой расположен цитохром с. Th. ferrooxidans cодержит также железо Fe (III) - цитохром с- редуктазу. Фермент этот получен в очищенном состоянии. Он термостабилен и проявляет максимальную активность при рН = 5,7-6,0 . В микробиологическом способе извлечения железа из водного раствора, растворенное в воде Fe (II) окисляется до Fe (III) при помощи бактериальных клеток Leptothix, Gallionella, Toxothix, Siberocystis, Siderocapsa spp., иммобилизированных в непрерывном режиме. При прохождении воды через слой носителя содержащееся в ней железо (II) под воздействием бактерий превращается в нерастворимые соединения Fe(III), которые выносятся наружу. Предлагаемый способ позволяет в непрерывном режиме и с высокой эффективностью обрабатывать большие объемы воды. Причины накопления микроорганизмами оксидов железа и марганца (часть видов окисляет также двухвалентный марганец Mn (II), могут быть различными. Некоторые виды способны использовать органическую часть комплексных соединений, содержащих железо, которых известно довольно много. Освобождаясь из подобных комплексов окисное железо может выпа-

20

дать в осадок. Если же оно находится в закисной форме, то в нейтральной и щелочной среде оно быстро окисляется химическим путем и при участии микроорганизмов. В результате также происходит накопление его окислов. Возможна концентрация оксидов железа вокруг клеток микроорганизмов в результате чисто aдсорбционных процессов. Это объясняется тем, что на поверхности клеток находятся вещества, обладающие отрицательным зарядом. Напротив, коллоидные формы окисного железа заряжены положительно. Третья, и в ряде случаев основная причина концентрации железа микроорганизмами состоит в том, что они окисляют железо (II) продуктами своего метаболизма. Установлено, что некоторые бактерии относятся к Arthrobacter, Leptothix, Metallgenium, переводят закисное железо в окисное в результате взаимодействия его с перекисью водорода, которую образуют 2Fe2+ + H2O2 + 2H+ → 2Fe3+ + 2H2O Тем самым предупреждается накопление соединений перекиси водорода, которое ингибирует рост микроорганизмов. Хотя показано, что некоторые бактерии, окисляющие закисное железо, синтезируют каталазу, но возможно, что ее недостаточно для быстрого разложения перекиси водорода. Показано, что при участии перекиси водорода и каталазы некоторые микроорганизмы из числа Arthrobacter, Leptothix, Metallgenium способны окислять и марганец: Mn2+ + 2H2O2 → MnO2 + 2H2O Кроме того, возможна обменная реакция между диоксидом марганца (MnO2), находящаяся на поверхности клетки и железом, имеющимся в среде: Mn4+ + Fe2+ → Mn2+ + Fe3+ При высокой концентрации перекиси водорода и кислой реакции среды может осуществляться и восстановление марганца: MnO2 + 2H2O2 + 2H+ → Mn2+ + 2H2O + O2 Есть также данные об окислении только марганца бактериями из числа псевдомонад и бацилл, а также грибами, распространенными в почве. Но энергетическую функцию этот процесс так же, как и окисление, не носит. Процесс окисления Fe2+ → Fe3+ был использован в способе биологической очистки сточных вод от мышьяка железобактериями Leptothix, Galionella для осаждения мышьяка из стоков обогатительных фабрик. Роль микроорганизмов в этом способе косвенная, так как способ основан на окислении железобактериями Fe (II) до Fe (III) и химическим осаждением последним мышьяка. Окислительную деятельность железобактерий можно использовать для осаждения мышьяка из растворов, содержащих небольшие коли-

21

чества этого элемента (0,3-0,4 мг/л). При содержании мышьяка 4 мг/л известный способ не обеспечивает необходимую ПДК степень очистки. С целью повышения степени очистки используют прямое окисление бактериями As(III) в As(V) с последующей обработкой фосфатами и известковым молоком. Окисление осуществляют микроорганизмами Alcaligenes dechromatica, Pseudomonas putida. Сточная вода, содержащая 2-3 г/л As(III) после очистки содержит полностью окисленный мышьяк (пятивалентный), который затем осаждают фосфатами и известковым молоком. Таким образом, окислительно-восстановительные процессы обуславливают растворимость переменно-валентных элементов, и это обстоятельство берется за основу при разработке микробиологической технологии очистки от железа, марганца, хрома, мышьяка, в то время, как при разработке адсорбционной технологии учитывается сродство тяжелых металлов (меди, ртути др.) к высокомолекулярным полимерам клетки, в частности, к белку.

22

3 Аккумуляция металлов микроорганизмами Сорбция клеточными стенками и накопление внутри клеток микроорганизмов (бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей, водорослей) позволяет удалить из разбавленных растворов до 100% Pb, Hg, Cu, Ni, Co, Mn, Cr, V; до 96-98% Au и Ag и до 93% Se. При этом набор сорбируемых ионов чрезвычайно широк, сорбционная способность по большинству ионов также сравнительно высока, что позволяет рассматривать эти организмы как эффективные и дешевые сорбенты для очистки водной среды от загрязнений / 33 /. Накопление металлов клетками микроорганизмов носит двухфазный характер: а) начальная фаза не зависит от энергетического состояния клетки и обусловлена сорбцией металлов компонентами клеточной стенки, среди которых особенно активны как сорбенты хитин и хитозан. б) последующая, более медленная фаза – энергозависимое внутриклеточное накопление, происходящее с участием мембранных переносчиков ионов. Адсорбция положительно связанных металлов на поверхности клеток, как полагают, связана с присутствием отрицательно заряженных групп анионов: PО43-, COO-, HS-, OH-. Адсорбция происходит быстро, обратимо, не зависит от температуры и энергетического метаболизма. Грибы и дрожжи адсорбируют уран из сточных вод в таком количестве, что он может составлять 10-15% и 18,5% от веса сухой биомассы соответственно, что в 2 раза больше, чем поглощение урана ионнообменными смолами в промышленности. В способе очистки сточных вод от металлов: ионов меди (II), серебра, хрома (III), присутствующих в концентрациях 3-60 мг/л, 40-195 мг/л и 10 мг/л соответственно в сточную воду вводят 3-60 мг/л фильтр-картона с сорбированным штаммом дрожжей Sac. carlsbergensis. Параллельно ставят контрольный опыт с «чистым картоном», не использованным в производстве. Отходы производства пивоваренной промышленности, содержащие фильтркартон с сорбированным штаммом дрожжей Saccharomyces bergensis сорбируют, металлы со степенью очистки от ионов меди за 3-4 часа 99,8-100%, серебра за 2-4 часа контакта на 99-100%, ионов хрома за 94 часа контакта на 95%. Отходы производства значительно быстрее и полнее сорбировали ионы металлов, чем «чистый» картон / 4 /. В способе биологической очистки водных растворов от хрома сорбцией мицелием грибов Aspersillus flaeres при исходной концентрации хрома (VI) 11,4 г/л и хрома (III) 0,39 г/л, степень очистки составляет 72,8% / 27 /. В способе биологической очистки сточных вод от металлов путем контактирования с мицеллием грибов р. Aspergillus в течение 24-46 часов с последующим отделением биомассы фильтрованием содержащую, марганца – 30,0%; хрома –5,52%; никеля – 3,1%; при общей концентрации 7 мг/мл, сте-

23

пень очистки составила 69-99%, причем сорбционная емкость двухсуточного мицелия зависела от рН очищаемого раствора / 13 /. В способе извлечения ванадия из раствора обработку ведут микроводорослями Chlorеlla vulgaris Larg 1 (адаптированного к ванадию) при соотношении ванадия-водоросли 2,0-2,2, рН=2,5-5,0. Способ реализуется следующим образом. Chlorеlla vulgaris Larg 1 из коллекции института физиологии растений АН СССР предварительно адаптировали к ванадию, добавляя в питательную среду ванадат натрия в концентрации 2,6*10-4 г/л. Техногенные растворы представляли сложные системы, содержащие катионы различных металлов: ванадия 500-2000 мг/л, марганца 100-150 мг/л, никеля 20-80 мг/л, рН=1,8. К исходному раствору добавляли водоросли Chlorеlla vulgaris в виде пасты. Способ обеспечивает эффективное извлечение ванадия при высоких концентрациях (до 2 г/л ) и сопутствующих металлов (Fe до 1,5 г/л, Al до 2,8 г/л) / 29 /. Динамика поглощения металла в процессе совместного культивирования бактерий и цианобактерий показывает, что в смешанной культуре может происходить более эффективная очистка ванадиевых стоков, чем в чистой культуре. При однократном добавлении металла, содержание ванадия в культуральной жидкости в ранних вариантах смешанно-раздельного культивирования снижается на вторые сутки в 1,5-2,0 раза, а на девятые сутки – в 2,6 раза . Применение способа очистки воды от мышьяка с использованием штамма несовершенного гриба Scopulariopsis brevicaulis, относящегосяк pоду Penicillium, дает возможность извлечь мышьяк из раствора концентрацией 512 г/л, практически на 99,8%.Другим преимуществом использования гриба является его способность одновременно переводить мышьяк в газообразное состояние ,что является неотъемлемой частью безотходной технологии получения мышьяковых соединений типа зеркала элементарного мышьяка путём пропускания газа через кварцевую трубку, нагретую до определённой температуры . Всё это делает возможность осуществления замкнутой системы очистки промышленных стоков, содержащих мышьяк, с одновременной утилизацией полученных его соединений / 10 /.. Таблица 3 - Динамика поглощения ванадия смешанно-раздельным культивированием Содержание ванадия в среде, мг/мл Объекты A. variabilis + Ps. Fluoresceus + A. Putida

24

2-сутки 19 12 27

9-сутки 75 18 45

A. nidulaus + Ps. Fluoresceus + Ps. Putida

120 47 85

350 61 120

Примечание - Исходная концентрация ванадия составляла 700 мкг/мл. На основе плодовых тел грибов ,вызывающих гниение древесины, были получены адсорбенты, используемые затем для извлечения металлов, в частности Cu (II). Биосорбент из Ganodermna lucidum был использован в биореакторе для обработки стоков, содержащих редкоземельные элементы. Адсорбция металлов на данном биосорбенте является следствием химических взаимодействий с клеточной стенкой гриба, которая представляет собой набор биополимеров, в том числе и хитина. На поверхности клеточной стенки закреплены ионогенные различной природы и лиганды на основе гликанов, фосфогликанов и белков. BNF Metaly Technology Centre и British Texstile Technology Group ведут с 1989 г. исследования по биосорбции металлов грибами. Показана перспективность использования биосорбентов, отличающихся определённой селективностью к радионуклидам и исключительно высокими сорбционными свойствами для ограничения круговорота радионуклидов и тяжелых металлов в природе. Предлагается организовать международную кооперацию для их промышленного производства с ориентацией на конвертируемые предприятия военно-промышленного комплекса. Эта инициатива поддержана рядом ученых России, Украины, Германии, Беларуссии. При ликвидации последствий аварий на объектах ядерной энергетики, связанных с выбросами больших количеств радионуклидов в окружающую среду, значительные трудности представляет концентрирование носителей радиоактивности в ограниченном объёме для последующего захоронения. Наиболее перспективными сорбентами с точки зрения ведущих специалистов-радиохимиков являются продукты из биологического возобновляемого сырья микробного (также и растительного) происхождения. В качестве сырья могут служить отходы микробиологических производств - отходы продукции гидролитических ферментов, антибиотиков. В настоящее время в России разработано несколько технологий получения биосорбентов, проявляющих относительную селективность к различным радионуклидам и многим вредным в экологическом отношении элементам (берилий, ртуть, кадмий, свинец, медь, хром и т. д.) Сравнительные исследования, выполненные в РНЦ «Курчатовский институт» и в институте физики АН Беларуссии, показали, что по сорбции цезия (Cs-137), биосорбенты не уступают лучшему из известных молекулярных сит клиносорбу (ФРГ); по сорбции стронция (Sr-85) биосорбенты превосходят клиносорб в 1,4 раза, а активированный уголь – в 6,7 раз; по сорбции плутония (Pu-239) биосорбенты превосходят клиносорб в 4-5 раз, а активированный уголь - в 16,2 раза.

25

В конечном итоге процессы сорбции и десорбции лежат в основе действия любых видах сорбентов. При этом конкретные механизмы разделения веществ могут быть различнымый ионный обмен, молекулярно-ситовое, диффузия в гель, распределение между фазами и т. д. Формально сорбционные характеристики сорбентов можно описать с помощью нескольких величин: - относительной сорбцией (S отн); - сорбцией или сорбционной ёмкостью (S); - коэффициента распределения (К), характеризующего распределение вещества между сорбентом и раствором Указанные величины характеризуют любые виды сорбентов и позволяют проводить сравнительный анализ их сорбционных характеристик. Однако для практического использования сорбентов в экологических целях важным могут оказаться и другие факторы, такие как стоимость, доступность, сезонность и сроки годности при хранении; затраты на захоронения сорбентов; возможности использования вторичных материальных ресурсов – отходов микробиологических производств; технология получения сорбентов должна быть экологически чистой т.е. не создавать новые отходы, для утилизации которых потребуется разрабатывать новые сорбент; технология получения сорбентов должна вписываться в существующие промышленные инфраструктуры и являться логическим продолжением этих производств, когда вторичные материальные ресурсы превращаются в целевой продукт, а весь процесс становится малоотходным, с замкнутым циклом производства; при производстве технических сорбентов целесообразно не использовать дорогие реактивы, сырьё, материалы и пищевые продукты; технология должна быть энерго-, материально- и ресурсосберегающей, что должно обеспечивать получение достаточно дешевых сорбентов одноразового пользования, т.е. чтобы возникли проблемы их регенерации; процесс утилизации использованных сорбентов должен быть прост, надежен, технологичен, желательно, чтобы используемый сорбент можно было сжечь с образованием минимального количества золы; сорбенты должны иметь относительную селективность с целью снижения расхода при использовании. Авторы считают, что в связи с тяжелой ситуацией во многих странах мира целесообразно организовать международную кооперацию для промышленного производства биосорбентов и ведущую роль могли бы взять на себя конвертируемые предприятия ВПК. С целью объединения своих усилий был создан Международный институт экологии и здоровья человека (Югославия). В условиях взаимодополняющих друг друга коопераций возможна организация следующего производства: а) технических сорбентов – для сорбции нуклидов, тяжелых металлов, диоксинов токсинов из техногенных растворов, промстоков, для использования в качестве защитного пояса на случай чрезвычайной ситуации, при захоронении особо опасных отходов;

26

б) сорбентов для пищевых производств (в первую очередь для очистки воды до питьевых кондиций); в) сорбентов для медицины-радиопроекторов, перевязочные средства для больных. Биосорбенты – живые и мёртвые клетки микроорганизмов, их компоненты и внеклеточные метаболиты – могут быть применены различными способами. Созданы биофильтры с живыми микроорганизмами, иммобилизованными на угле. Разработан биосорбент М, получаемый обработкой биомассы Penicillium chrisogenum мочевиноформальдегидным поликондесатом. Биосорбент М изготавливают в виде зерен размером 0,3-0,8 мм и используют для извлечения урана, емкость сорбента составляет 5 мг в пересчете на 1 г биомассы. В США разработан бактериальный сорбент АМТ-биоклем для извлечения тяжелых металлов, включая Au, Pt, Ag. В Японии разработаны биосорбенты ЯХ-1 и ЯХ-2 на основе хитина и хитозана. Название хитин (от греч. слова, означающего «покров») предложил в 1823 году Одье, который выделил из майского жука материал, напоминающий рог. Строение хитина впервые было изучено Леддерхозе в 1878 году, который получил из хитина Arthropoda - аминосахар, названный глюкозамином и уксусную кислоту и показал, что эти соединения присутствуют в хитине в эквимолярных количествах. То, что хитин входит в состав грибов было установлено в 1895 году, с этого времени об этом биополимере написано более 20 обзоров. В 1977 году появилась первая монография о хитине, а в апреле 1977 года состоялась первая международная конференция о хитине и хитозане. Оказалось, что хитин и его производные могут найти широкое применение в связи с потребностями практики, в том числе как адсорбент, используемый для очистки сточных вод и для извлечения из водной среды следовых количеств металлов. Этот полисахарид используют как носитель для получения иммобилизированных ферментов. Необходимо отметить, что до сих пор основным природным источником получения хитина служат панцири крабов и других ракообразных, в том числе эуфазид. Химический синтез хитина является весьма трудоёмким и пока представляется экономически невыгодным. Поэтому очень важны исследования, посвященные разработке способов получения хитина из микроскопических грибов, т.к. в настоящее время панцири крабов стали дефицитным сырьём. В последние годы для получения хитина и его производных предложено использовать отходы от ряда микробиологических производств, например, мицелий Aspergillus niger, оставшийся после выделения из культуральной жидкости лимонной кислоты. Установлено, что получение с использованием этого сырья производных хитина является экономически выгодным процессом. Некоторое увеличение сорбции по сравнению с нативной биомассой даёт обработка кислым хлороформ-метанолом, при которой происходит полное удаление липидов и некоторого количества растворимых в метаноле углеводов и белков. Активация сорбции в этом случае связана с гибелью нативной структуры клеточной поверхности, вызванной действием растворите-

27

лей. Результаты по изучению сорбции ионов VО2 (II) A.niger показали, что сорбция ионов урана значительно возрастает при обработке мицелия щелочью, что позволило высказать предположение о значительной роли деацетилированного хитина в этом процессе. Достаточно необычными являются полученные данные о том, что обработка щелочью, которая приводит к удалению из клеточной стенки соединений, содержащих карбоксил ион (–СООН) и фосфатные группы не улучшает сорбциею ионов свинца мицелиальными грибами Agpergillus niger ВКМ F-B-36, Blakesleatrispora BKM F-978. Природа сорбции хитином зависит от свойств сорбируемого иона, например, урана или свинца. Существенную роль в этом процессе играет не только объём аморфных областей полимера, но их доступность для сорбента. Поэтому, вероятно, сорбция возрастает при удалении «защитного» слоя поверхностных липидов, которые обычно у грибов представлены предельными углеводородами. Значительной активации сорбции способствует полная пространственная «дезорганизация» биополимеров, связанная с обезжириванием компартментов клетки. Этим, возможно, объясняется известный факт , что «убитая» биомасса грибов сорбирует лучше, чем нативная. Как известно, добавление к активному илу компонентов, адсорбирующих металлы, уменьшает вредное влияние поступающих в высоких концентрациях металлов. Павленко Н.И. и другими (1991), проведены исследования по изучению сорбции живым и мёртвым илом ионов меди, свинца, в зависимости от времени контакта биомассы активного ила и концентрации металлов. Результаты показали, что при небольшой биомассе 1,45 мг/л, до 60% металлов сорбировалось в течение 1 часа. При увеличении биомассы до 2,7г/л основная часть металла сорбировалась в первые 20 минут. Существенно повысить биосорбционную способность ила, ускорить процесс сорбции металлов, можно, используя гранулированный либо термически обработанный ил. Исследованные биосорбционные свойства сухого ила площадок Лисичанского НПЗ показали, что насыщение ионами меди мертвого ила происходило в первые 3 мин., при этом сорбционная емкость составляла 1,94 мг Cu2+ на 1 г ила и была в 8 раз выше по сравнению с живым илом. Еще более удивительную картину представляет внутриклеточное поглощение металлов бактериями. Так, например, Ps. aеruginosa менее чем за 10 секунд поглощает из раствора 100 мг/л раствора урана. Ховрычев М.П.(1973) изучал поглощение ионов меди клетками Candida. Эта культура по своей устойчивости в ряду неблагоприятных факторов приближается к плесневым грибам. Исходя из того, что живые клетки за 10 мин. включали около 10% и только за 2 часа происходило полное насыщение клеток медью, можно сказать, что процесс включения меди клетками не является простой адсорбцией клеточной поверхностью, т.к. известно, что в случае адсорбции включение большей части вещества происходит за 2-5 мин. Именно это происходит при поглощении меди убитыми клетками. Полученные данные о зависимости поглощения ионов меди (II) клетками от температуры, подтверждают, что ионы меди проникают в клетку не путем простой диффузии, т.к. известно, что в

28

случае диффузии на каждые 10о С ускоряет процесс в 1,3-1,4 раза. Экспериментальные данные показали, что при увеличении температуры от 200С до 30oС скорость поглощения увеличилась более чем в три раза. Дальнейшее же увеличение до 42о C ингибировало процесс поглощения, что, по-видимому, связано с подавлением физиологической активности клеток при неблагоприятной температуре. Зависимость скорости поглощения Cu (II) от концентрации ионов меди в среде соответствует кинетике насыщения и описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Эти данные могут указывать на то, что процесс поглощения Cu (II) клетками дрожжей активный, причем характер его напоминает процессы ферментативного поглощения субстрата микроорганизмами. Причем, процесс этот специфичен, т.к. ионы других металлов, за исключением Hg (II) и Pb (II), не влияли на поглощение Cu (II). Поглощение ионов меди клетками является энергозависимым процессом. На это указывают результаты опытов по подавлению поглощения Cu (II) ингибиторами энергетического обмена и стимулированием этого процесса при добавлении энергетического субстрата – глицерина. У живых клеток поглощение ионов меди, по-видимому, регулируется соответствующими системами, активность которых зависит от физиологического состояния культуры. Поэтому возраст культуры оказывал значительное влияние на поглощение меди. По-разному происходит взаимодействие клеточных поверхностей Candida utilis с ионами Ag (II) и Cu (II). Полученные результаты показали, что ионы Ag (II) связываются клетками Candida utilus очень быстро за 2-5 мин. Характер включения живыми и мертвыми клетками одинаков. Это указывает на то, что связывание ионов Ag+ является физико-химической адсорбцией клеточной поверхностью. Адсорбционный характер включения ионов Ag+ клетками, подтверждается тем, что процесс не зависит от температуры , связанное серебро легко удаляется из клеток отмыванием растворами HCl и ЭДТА, с повышением концентрацией серебра в среде, количество связанного серебра обнаружено во фракции клеточных стенок и мембран. Адсорбционный характер связывания клетками ионов некоторых тяжелых металлов (Cо , Pb, Hg) был показан ранее. Интересно отметить, что характер включения иона Cu (II), этой же культурой как отмечалось выше был отличным от связывания ионов серебра, он является энергозависимым. Однако, этот факт можно объяснить, сделав следующее допущение. Поскольку ионы меди являются необходимым элементом клетки, входя в состав некоторых ферментов (цитохромоксидазы,аскорбатоксидазы, тирозиназы и др.), то возможно, что клетки обладают ферментными системами, ответственными за поглощение меди. Для работы этих ферментов необходима энергия. Представляется вероятным, что ферментные системы, ответственные за перенос меди в клетку, способны функционировать и при тех относительно высоких концентрациях меди. Об активном характере поглощения Co, Ni, Zn сообщалось и др. исследователями. В способе золота из воды в сточные воды ювелирной фабрики прибавляли суспензии культур дрожжи pода Saccharomyces (или pода Candida, или

29

pода Rodotorula), бактерии pода Escherichia. Способ позволяет извлекать из водных растворов высокодисперсное золото практически полностью (на 9899%). Процессы адсорбции, гетерокоагуляции и перекристаллизации коллоидного золота в бактериальной суспензии связаны с редокс-превращениями мембранной дыхательной цепи и трансмембранным электрохимическим потенциалом цитоплазматической мембраны бактериальной клетки. Несмотря на многочисленные данные по селективному взаимодействию различных форм золота с микроорганизмами, остается непонятным биологический смысл этого явления. Что касается ионного золота, можно предположить, что его комплексы в некоторых случаях могут служить акцепторами электронов в анаэробных условиях. А.Е. Шиловым (1989) высказано предположение, что микроорганизмы могут использовать комплексы золота в качестве катализаторов в активации и окислении органического субстрата. Это обуславливает необходимость аккумуляции золота клетками / 23 /. Таким образом, методы защиты окружающей среды сорбционными способами, развиваются по следующим основным направлениям исследований в этой области: а) технологии производства сорбентов для очистки сточных вод от вредных в экологическом отношении примесей, элементов (хрома, кадмия, ртути, цинка, меди и др.), радионуклидов (цезия, стронция, урана и др.) и различных химических веществ (нефти, нефтепродуктов, различных органических веществ); б) способы очистки пресной воды с помощью сорбентов от металлов (кадмия, ртути, цинка, меди, бериллия, свинца); в) технологии извлечения с помощью сорбентов редкоземельных элементов и цветных металлов;

г) технологии производства сорбентов из отходов микробиологической промышленности; с) методы биоиндикации и выделения из воды тяжелых металлов на основе микроводорослей. Применение биосорбентов имеет очень перспективную экологическую нишу. Возможно, эти сорбенты помогут сделать нашу 1/6 часть Земного шара чище и экологически безопаснее.

30

4 Биотехнологические способы очистки сточных вод 4.1 Окислительно-восстановительные процессы 4.1.1 Окисление железа и мышьяка Суспензии, содержащие минеральные компоненты и ионы металлов, осаждают солями трехвалентного сульфата железа , которые получают окислением двухвалентного железа культурой Thiobacillus ferrooxidans . Известен патент Венгрии на получение в ферментерах раствора трехвалентного железа с высоким окислительно-восстановительным потенциалом . Процесс окисления осуществляется в одном или нескольких аэрируемых сосудах, причем во втором случае количество бактерий возрастает в каждом последующем ферментере. Приведем пример реализации изобретения. Пять 20-литровых ферментеров располагались друг над другом так , чтобы раствор из верхнего ферментера через сливное устройство переливался в нижний. В верхний ферментер наливали 7 л раствора следующего состава, г/л: FeSO4 х 7H2O 150; (NH4)2SO4 - 0,8; К2НРО4 - 0,4; Н2SO2 -- 2. В раствор вносили 1л суточной культуры Thiobacillus ferrooxiidans . Концентрация исходного раствора Fe(II) может варьировать в широких пределах – от 0,1 до 30,0 г/л . Через перфорированную стеклянную трубку в раствор вводили воздух ( 1л / 1л раствора / час). Через 36 час Fe (II) в питательном растворе практически окислялось, и тогда начинали непрерывную подачу раствора FeSO4 (25г/л). Скорость подачи раствора двухвалентного железа – 1200 мг/час. pH раствора с помощью H2SO4 поддерживали на уровне 2,5. Каждые 24 часа в первый ферментер вводили 12 г (NH4)2SO4 и 8 г К2РО4 Примерно через неделю начался слив из последнего ферментера, после чего без ограничения времени могли непременно получать продукт со следующими характеристиками: количество – 600 мг/час, Fe (II) < 0,2 г/л; Fe (III) >24,5 г/л, pH ∼ 2,0, окислительновосстановительный потенциал - 700мВ. Описанный процесс прост и легко регулируется. После размножения бактерий нужно только поддерживать на определённом уровне подачу соли двухвалентного железа, источника азота и воздуха. Fe (II) окисляется очень быстро, при малых объёмах ферментеров окисление идёт с высокой производительностью. Скорость окисления на один – два порядка выше, чем для спонтанного процесса. Для ускорения процесса окисления сульфата закиси железа культурой Thiobacillus ferrooxidans М. И. Агафонова (1969) предлагают раствор сульфата железа с бактериями предварительно обрабатывать магнитным полем напряжённостью 150 – 350Э с направлением магнитных силовых линий перпендикулярно движению жидкости. Отработанный раствор подают в прудрегенератор, нагревают до 23оС и выдерживают в течение 4 суток при аэрировании в режиме 1 м3 воздуха / 1м3 раствора. Магнитное поле ускоряет регенерацию сульфата оксида железа на 30 – 40 %, что позволяет уменьшить

31

объём утеплённого пруда-регенератора в 1,6 раза, сохранив его пропускную способность. В целях повышения степени очистки и удешевления технологии предложено осаждать мышьяк трёхвалентным железом, образованным в результате окисления Fe (II) железобактериями, так как реагентные способы очистки от мышьяка имеют следствием вторичное загрязнение воды химическими веществами. В биопруд, загрязненный мышьяком, вводят металлическое железо, культуры Leptothrix ochraceae, Leptothrix crassa, Gallionella ferruginea, сульфатовосстанавливающие бактерии и органическое вещество углеродного происхождения, предпочтительно опилки или растительные остатки. Деятельность сульфатовосстанавливающих бактерий или введение сернистого натрия необходимы для снижения ОВП и продукции двухвалентного железа исходного вещества, обуславливающего начало окислительной работы железобактерий. В лабораторных условиях процесс очистки ведут в условиях непрерывного культивирования. Исходный раствор содержит 4 мг/л мышьяка, время пребывания воды в трехсекционной модели – 4 суток. На выходе в воде содержится 0,05 мг/г мышьяка, т. е. эффективность очистки – 95%. Для очистки сточных вод от мышьяка предлагается штамм Pseudomonas putida 18, способный окислять трехвалентный мышьяк в пятивалентный в присутствии малых количеств органического вещества в нейтральных или слабощелочных условиях при пониженной температуре. Последнее очень важно при использовании данной бактерии для очистки воды от мышьяка, так как перепады температуры не лимитирует процесс. 4.1.2 Очистка от соединений шестивалентного хрома Биологическая технология очистки сточных вод от ионов шестивалентного хрома впервые была описана как способ Коренькова / 26 /. Согласно этому способу, сточные воды обрабатываются активным илом, содержащим культуру Bacterium dechromaticans Romanenko. Пример использования способа: сточные воды, содержащие хромит калия в количестве 60 мг/л по хрому и БПК5 = 100 мг/л, подают в неаэрируемую ёмкость, куда вводят 7 г/л по сухому веществу активного ила с микроорганизмами штамма Bacterium dechromaticans Romanenko. Без доступа кислорода воздуха и при поддержании активного ила во взвешенном состоянии данная культура восстанавливает шестивалентный хром до трёхвалентного с образованием гидроксида хрома. Полное восстановление Cr (VI) в Cr (III) происходит за 7 час. Затем активный ил отделяют от жидкой фазы отстаиванием и используют для восстановления новых порций хроматов в сточных водах. Недостатком вышеописанного способа является то, что источником углеродного питания хромвосстанавливающих бактерий служит растворенное органическое вещество хозфекальных сточных вод. Содержание органического вещества в этих водах лимитирует концентрацию Cr (VI), подаваемого

32

на очистку. Количество легкоокисляющихся органических веществ БПК5 в жидкой фракции комунальных стоков обычно не превышает 200 – 250 мг/л, следовательно, максимальная концентрация Cr (VI) в смеси не должна превышать 150 – 200 мг/л. В целях обеспечения очистки высококонцентрированных по содержанию Cr (V) стоков предлагается вести восстановление шестивалентного хрома активным илом, смешанным с осадком городских сточных вод. Процесс идет в мезофильных условиях в метантенках при постоянном перемешивании с нагрузкой 0,2 – 10 г Cr (VI) на 1 л загружаемого сырого осадка не нарушается технология сбраживания, Cr (VI) полностью восстанавливается до Cr (III). Процессы сбраживания осадков и очистки стоков от хрома нарушались при увеличении дозы Cr (VI) более 10 г/л загружаемого осадка, выделившийся газ не горит, что указывает на отсутствие метана. Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества: возможность одновременно сбраживать осадок сточных вод и восстанавливать высокие концентрации токсичного Cr (VI) (до 10 г/л) до безвредного Cr (III). В тех случаях, когда нет возможности использовать для восстановления шестивалентного хрома городские сточные, в качестве органического субстрата используют производственные сточные воды, содержащие нефтепродукты парафинового ряда, - керосин, бензин, трансформаторное масло. При окисление нефтепродуктов микроорганизмами происходит более глубокая очистка от хрома, чем при использовании в качестве источника органического вещества хозяйственно-бытовых сточных вод, - соответственно 1 и 22 мг/л Cr (III) в очищенной воде. Кроме того, за счет потребления нефтепродуктов микроорганизмами ХПК производственных сточных вод снижается на 20 – 50 %. Разнообразие биохимических свойств хромовосстанавливающих бактерий, их способность окислять широкий набор углеводородсодержащих соединений позволяет использовать в качестве углеводородного субстрата природный или попутный газ при добыче нефти. По данному способу очистку вод от Cr (VI) проводят в герметичном ферментере-биовосстановителе объемом 1000 мл , содержащим накопительную культуру (500мл) хромовосстанавливающего ила. Накопительная культура проедставлена ассоциацией микроорганизмов, в которую входят Aeromonas dechromaticans, Rhodococcus, Micrococcus, Pseudomonas sp. В биовосстановитель вводят шестивалентный хром и природный газ. Перемешиванием содержимого биовосстановителя осуществляет аэрацией углеродсодержащими газами. Отвод очищенных вод из ферментера производят после восстановления шестивалентного хрома, концентрация Cr (VI) через 8 часов практически нулевая. Недостатками способа с использованием нефтепродуктов в качестве органического субстрата для хромвосстанавливающих бактерий, являются длительность процесса очистки (24 час) и наличие в очищенной от хрома воде остаточных количеств нефтепродуктов, которые надо выводить дополнительно. В целях сокращения продолжительности очистки и повышения каче-

33

ства очищенной воды Н. С. Серпокрылов с сотр. в качестве субстрата предлагает использовать гранулы перлитмагносульфоната диаметром 1,0 – 2,5 мм, объёмной массой 0,3 – 0,9 кг/л. Материал получают термообработкой перлита, смешанного с сульфатно-дрожжевой бражкой и являющийся отходом целлюлозно-бумажной промышленности. В порах перлитмагносульфоната закрепляются хромвосстанавливающие бактерии, не вымывающиеся потоком очищенной воды. Время биохимического восстановления Cr (VI) при использовании в качестве перлитмагносульфоната составляет 2,5 – 6,0 ч (исходная концентрация Cr (VI) – 16,60 – 52 – 50 мг/л). Время восстановления хром при внесении в среду нефтепродуктов (прототип) – 40 – 24 час при исходных концентрациях Cr (VI) 5,12 – 29,0 мг/л. Хромвосстанавливающие бактерии хорошо иммобилизируется на керамзите, пенополиуретане, ершах из стекловолокна. Максимальную способность к закреплению бактерии проявляли в логарифмической фазе роста. 4.1.3 Очистка в результате деятельности сульфатредуцирующих бактерий Имеется ряд технических решений по использованию сульфатредуцирующих бактерии для осаждения ионов металлов из промышленных сточных вод. В основу технологии положен принцип стимуляции развития сульфатредуцирующих бактерий в анаэробных условиях обогащением среды доступным для них органическим. В этих целях предпочтительно использование дешёвых, характерных для данного производства органических соединений. Для очистки воды от ионов вольфрама и молибдена готовят эмульсию из смеси олеиновой кислоты (40 – 200 мг/л), керосина (40 – 200 мг), терпениола (10 – 50 мг), затем смешивают её с водным раствором ксантогената натрия. Полученную эмульсию в качестве углеродного питания для сульфатредуцирующих бактерий вносят в ёмкость для культивирования микроорганизмов объёмом 10 л. Процесс ведут 10 дней непрерывно в анаэробных условиях при постоянной циркуляции активного ила. Скорость потока жидкости – 0,5 г/л, температура 18 – 20о С, скорость перемешивания не более 96 об/мин. Анаэробиоз поддерживается продуванием газообразного азота через систему. Эффективность очистки от ионов металлов – 94 – 98%, на 70 – 80% снижается концентрация сульфидов и на 50% - органического углерода. Очистку стоков горнообогатительного комбината от висмута производят следующим способом. В качестве органического питания для развития сульфатредуцирующих бактерий в воду вносят обработанную смесь флотореагентов – продукты производства диоксана в виде одноатомных спиртов пиранового и диоксанового ряда и гликолий. Эффективность очистки от ионов висмута заметно возрастает с введением в состав микробиоциноза активного ила метанообразующих железоокисляющих бактерий рода Leptothrix.

34

При переработке отходов фотодела, содержащих ионы серебра, для стимуляции деятельности сульфатредуцирующих бактерий в среду вносят желатин (250 мг/л). Бактерии активно продуцируют сероводород, осаждающие серебро в виде чёрного налёта на стенках биотенка. Эффективность очистки при концентрации As+ до 25 мг/л стопроцентная, с повышением концентрации в растворе она снижается. Для защиты сульфатредуцирующих бактерий от токсического действия металлов при залповых сбросах / 11 /. А.Н.Илялетдинов и др. ( 1986) рекомендуют разделить бактерии и ионы металлов полупроницаемой пленкой, чтобы осаждение металлов осуществлялось диффундирующим через пленку сероводородом. В одном случае бактерии культивирует в ёмкости из целлофана, опущенной в раствор, содержащий металл в другом сквозь целлофановую трубку протекает раствор с ионами металлов, а бактерии выращиваются с внешней стороны трубки в культиваторе. Устройство для осаждения ионов тяжёлых металлов сероводородом биогенного происхождения состоит из двух соединённых трубопроводами сосудов, один из них предназначен для культивирования сульфатредуцирующих бактерий, а другой - для контактирования культуральной жидкости со сточной водой, проходящей через трубопровод (рисунок 2). Во втором сосуде расположен трубопровод из полупроницаемой мембраны (целлофана). Установка состоит из герметичной реакционной ёмкости 1, соединённой с ёмкостью 2 для выращивания микроорганизмов трубопроводами 3 и 4. На трубопроводе 4 монтируют датчики температуры 5, pH 6 и окислительновосстановительного потенциала 7. Внутри ёмкости 1 помещён трубопровод 8 из целлофана для пропускания очищаемой воды. Очищенная вода поступает в лоток-отстойник 9. Устройство работает следующим образом. В ёмкость 2 заливают воду, вносят избыток источника сульфатов, например гипса, добавляют органическое вещество как источник углерода для сульфат - восстанавливающих бактерий, вводят культуру микроорганизмов и культивируют в течении 7 – 10 дней для образования достаточной концентрации сероводорода в среде (300 – 800 мг/л). За оптимумом условий в культуральной среде следят по показаниям датчиков 5, 6 и 7 и при необходимости корректируют условия в ёмкости 2. Воду, содержащую ионы тяжелых металлов (ИТМ), прокачивают по трубопроводу 8, культуральную среду направляют из ёмкости 2 через трубопровод 3 в ёмкость 1, а из неё по трубопроводу 4 – в ёмкость 2, т. е. культуральная жидкость циркулирует по замкнутому контуру. Сероводород, продуцируемый микроорганизмами в ёмкости 1, проникает в трубопровод 8 и осаждает ИТМ. Образовавшийся нерастворимый сульфид металла током воды выносится в лоток – отстойник 9. Используя зависимость образования сульфидов различных металлов от величины pH раствора, в потоке очищаемой воды создают нужное значение рН и селективно при более кислом значении рН осаждают металл в виде сульфида металла. С целью очистки воды, выходящей из лотка-отстойника 9, от другого иона ме-

35

талла, рН доводят щёлочью до требуемого для осаждения другого сульфида металла и вновь пропускают по трубопроводу 8 через ёмкость 1.

4.2 Очистка воды от металлов путём адсорбции на микробной биомассе Биомасса практически всех видов микроорганизмов, включая бактерии и грибы, способна адаптировать металл из раствора и тем самым снижать концентрацию или полностью удалять металл из водного раствора. В нашей стране разработана технология извлечения золота из оффинатных растворов ювелирного производства путём адсорбции на мицелии грибов . Drobot (1981) предложил способ извлечения металлов из водной среды обработкой её грибным мицелием, причём для этих целей может быть использована биомасса широкого набора грибов: пенициллов, триходерм, кладоспориумов и других. Мицелий с иммобилизованным на его поверхности металлом в последствии отделяется от водной фазы, сжигается, и металл концентрируется в золе. Мицелий отделяется от водной фазы фильтрованием или центрифугированием, последнее предпочтительно, так как фильтры легко забиваются грибными клетками. Срок контакта мицелия со сточной водой – 4 – 48 ч, в среднем 24, температура – от 5 до 50оС, чаще в пределах 20 – 40оС. Для предотвращения выпадения неблагородных металлов при осаждении на мицелий драгоценных металлов процесс осуществляется при рН раствора 1 – 3, в остальных случаях рН может колебаться в пределах 4 – 8. Грибы выращиваются отдельно от сточной воды, затем выращенный мицелий вносится в раствор, содержащий металл. Если грибы адаптированы к имеющимся в растворе концентрациям металлов, их можно выращивать в сточной воде с добавлением питательных веществ. В качестве источника углерода в среду добавляются муравьиная и лимонная кислоты, а также азот в аммонийной, реже нитратной, форме. Карбонат кальция вносится как источник кальция и кислорода. Гриб можно выращивать на твердом носителе, а также для контакта со сточной водой мицелий можно фиксировать на губчатой пластинке или каучуке, и тогда движущаяся лента или вращающийся диск с мицелием адсорбируют металл из водной фазы. По выходе из водной среды твердый носитель освобождается от мицелия. Схема практической реализации данного изобретения изложена на рисунке 3 . Сточные воды с ионами металлов по трубопроводу 5 поступают в ёмкость для извлечения металлов 4, которая имеет водяную рубашку 6 для поддержания температуры. Биомасса для иммобилизации или посевной материал для культивирования гриба подаются в ёмкость по трубопроводу 7 в количестве 5% от объёма жидкости в ёмкости. Обработка осуществляется в аэробных условиях перемешиванием или подачей воздуха и диоксида углерода при заданных рН и температуре. Исключение перемешивания может создать анаэробиоз, в этом случае внесение карбоната кальция частично компенсирует недостаток углерода. Питательные вещества и карбонат кальция

36

подаются в ёмкость через трубопровод 8, а воздух и диоксид углерода – трубопровод 9 и барботажное устройство 11. Содержимое ёмкости может приводиться в движение мешалкой 12. По истечении времени контакта мицелия со сточной водой сточные воды из ёмкости подаются по трубопроводу 13 в центрифугу 14, отдельная от биомассы жидкость удаляется через трубопровод 15. Из центрифуги биомасса гриба поступает в трубопровод 16, откуда часть по трубопроводам 7 и 17 может вернуться в ёмкость в качестве посевного материала или адсорбента металлов. Большая часть мицелия по трубопроводу 18 попадает в сушилку 19 и, далее, на сжигание 20. Зола, содержащая металл, идет на дальнейшую обработку и извлечение металлов известными методами. Очень близкий к описанному способу прием разработан Л.Р.Сидоренко с сотр. (1985). Он касается очистки водных растворов от хрома сорбцией на мицелии гриба Aspergillus flavus. Гриб выращивают на хромосодержащей среде с добавлением источников углерода (сахароза) и азота. Оптимальный срок культивирования гриба – 10 суток. Выращенный мицелий гриба с адсорбированным хромом отделяют от воды фильтрацией, сушат при 50 – 70°С до постоянной массы, при 500 - 700°С в течение 2 – 3 ч проводят озоление мицелия, минеральный остаток оплавляют с двууглекислым натрием, растворяют в минеральной кислоте и определяют концентрацию извлеченного хрома. Результаты лабораторного эксперимента по адсорбции ртути на микробной биомассе и активном иле были проверены нами в производственных условиях очистных сооружений ацетальдегидного производства. Очистка осуществлялась следующим образом ( рисунок 4). Сточные воды, пройдя узел отделения от песка, поступают в распределительный лоток первичных отстойников, куда из иловой насосной подается активный ил в количестве до 500 м3 / ч из расчета 0,02 – 2,0 г влажного ила на 1,0 мг металла и далее – в первичный отсек первичного отстойника. Для лучшего контакта активного ила и воды, а также экстракции из нее металла в камеры подается воздух в количестве 10 м3 / м3 воды. В двух первых камерах первичного отстойника сточная вода и ил перемешиваются в течение часа – это оптимальное время контакта биосорбента и воды. Из второй камеры первичного отстойника смесь воды и ила без подачи воздуха последовательно поступает в камеры для осаждения ила. За 1 – 1,5 часа происходит накопление ила в илоуплотнителях. Очищенная от металла вода поступает в аэротенки, где происходит очистка стоков от органических веществ. Из уплотнителей по мере уплотнения ил собирается в иловую галерею, где смыкается с трубопроводом, отводящим ил на иловые площадки для высушивания. Подсушенный ил ( с остаточной влажностью 50 – 60 %) затаривается в барабаны и отправляется на регенерацию металла. Технология очистки промышленных стоков от ионов ртути не должна допускать попадания ионов ртути в активный ил аэротенков. С этой целью контакт ила с ионами ртути осуществляется на стадии предшествующей био-

37

логической очистки в аэротенках, а именно в первичных отстойниках, с выводом биосорбента на иловые площадки и последующей его регенерацией. Технология удаления ртути из стоков на ранних этапах очистки путем ее адсорбции на активном иле, искусственно внесенном в первичный отстойник очистных сооружений, обеспечивает оптимальную работу микрофлоры активного ила. Биохимический метод очистки сточных вод с использованием активного ила в качестве главного технологического агента оправдал себя . С развитием промышленного производства в стоки вносится неконтролируемое количество различных ксенобиотиков, что ведет к нарушению экологического равновесия в биоценозах. Однако положения и подходы, сформулированные в микробиологии очистки сточных вод требуют рациональной стратегии при совершенствовании технологии обезвреживания промышленных сточных вод. Возникает необходимость сознательного формирования пространственной сукцессии микроорганизмов с включением в нее отобранных из производственных стоков или специально селекционированных штаммов микроорганизмов-деструкторов доминирующих загрязнителей, наиболее токсичных для микрофлоры активного ила. Отбор должен быть целенаправленным, с учетом химической природы

38

5 Рекомендуемые лабораторные работы 5.1 Исследование сточных вод Цель занятия: Знакомство с методами отбора и анализа сточных вод в лаборатории СЭС. Задания: 1 Отберите пробу сточной воды для исследования 2 Определите физические и химические свойства данного образца воды 3 Определите содержание сульфатов (ГОСТ 2874-82) 4 Определите содержание железа (ГОСТ 2874 – 82) 5.1.1 Отбор проб Результаты анализа сточных вод будут правильными только в том случае, если проба для анализа отобрана верно. Способ отбора сточной воды зависит от цели, которая ставится в каждом случае. Необходимо следить, чтобы проба не оказалась случайной. Однократного взятия проб сточной воды для исследования бывает недостаточно, поэтому проводят отбор средней смешанной пробы ( за час, сутки) или же серийных проб по отработанному плану. Определяют суточные максимум и минимум сточных вод и суточное, недельное или годовое изменение качества воды. По ходу процесса проводится взятие проб в различных местах течения сточной воды. Различают пробу простую и смешанную. Простая проба получается путем однократного отбора сточной воды. Смешанную пробу получают путем сливания простых проб, взятых в одном и том же месте через определенные промежутки времени или отобранные одновременно в различных местах. Если пробу, пропорциональную объему спусковых сточных вод. Пробу отбирают в месте отбора имеется непостоянный расход воды, то отбирают среднюю через равные промежутки времени. Для неполного анализа отбира ют 1 дм 3 воды, для полного- 2 дм 3. Обычно воду отбирают в стеклянные бутыли. Если доступ к воде затруднен, то бутыль прикрепляют к жесту или бутыль с грузом опускают в воду на веревке. Если в воде присутствует свободный сероводород, то каждую пробу отбирают в отдельный сосуд вместимостью 250 см3, в который предварительно наливают 6 – 10 см3 раствора ацетата кадмия или 1 – 2 см 3 50 % раствора гидроксида натрия. Воду следует наливать до пробки, чтобы в сосуде не оставалось пузырьков воздуха. При спуске сточных вод в водоем нельзя ограничиваться исследованием самих сточных вод, следует анализировать также воду в водоеме выше и ниже впадения в него стока. На месте отбора сточной воды составляют акт отбора, где указывают вид и происхождение воды, описывают место отбора, номер бутылей, данные наблюдения

39

( температура, цвет и т.д.), цель исследования, фамилию, должность лица, отобравшего пробу; ставится его подпись. 5.1.2 Определение физических свойств Температуру определяют одновременно с отбором проб ртутным термометром с ценой деления 0,1 – 0,5 0 С. Прозрачность определяют в цилиндре Снеллена высотой 30 см, диаметром 2,5 см, градуированном в сантиметрах. Перед исследованием под дно цилиндра кладут хорошо освещенный шрифт на расстоянии 4 см от дна, в цилиндр наливают взболтанную воду и сливают до тех пор, пока рассматриваемые сверху буквы станут хорошо различимы. Опыт повторяют три раза и вычисляют среднее значение прозрачности в сантиметрах. Цвет (окраска). Определяют визуально при рассматривании воды в цилиндре сверху на белом фоне при дневном освещении. Для определения цвета измеряют также оптическую плотность фильтрованной сточной воды на спектрофотометре или фотоколориметре. Для этого исследуемая вода предварительно фильтруется, отбрасываются первые порции фильтрата. Оптическую плотность измеряют при толщине слоя 10 см, вторую кювету прибора заполняют дистиллированной водой. Зависимость спектральной области поглощения света от цвета раствора представлена в таблице 4. Правила спуска сточных вод в водоем требуют, чтобы вода в водоеме после смешения ее со сточной водой не имела видимой окраски при высоте слоя: 20 см ( для централизованного или нецентрализованного хозяйственнопитьевого водоснабжения) и 10 см (для купания, спорта, отдыха). В связи с этим практическое значение имеет определение степени разбавления сточной воды, при которой цвет ее перестает отличаться от цвета дистиллированной воды. Таблица 4 - Зависимость спектральной области поглощения света от цвета раствора Спектральная область Цвет светофильтра Цвет раствора Поглощения света 400 – 435 Фиолетовый Желто-зеленый 435 – 480 Синий Желтый 480 – 490 Зеленовато-синий Оранжевый 490 – 500 Сине-зеленый Красный 500 – 560 Зеленый Пурпурный 560 – 580 Желто-зеленый Фиолетовый 580 – 595 Желтый Синий 595 – 625 Оранжевый Зеленовато-синий 625 – 700 Красный Сине-зеленый Ход определения

40

Помещают на лист белой бумаги 3 цилиндра диаметром 20-25 мм из бесцветного стекла. В первый цилиндр наливают исследуемую сточную воду (высота слоя 10 см), в третий такое же количество дистиллированной воды, во второй такое же количество разбавленной сточной воды, увеличивая каждый раз степень разбавления (1 : 1, 1 : 2, 1 : 3 и т.д.), пока при рассматривании сверху через воду во втором и третьем цилиндрах бумага не будет выглядеть одинаково белой. Результат выражается порогом разведения (количественно) и описательно (качественно). Запах. Определение запаха проводят при комнатной температуре. Вначале устанавливают характер запаха (хлорный, гнилостный и т.д.), затем определяют его интенсивность по порогу разведения. Количественное определение запаха производится разведением сточной жидкости водой, лишенной запаха, до интенсивности запаха 1-2 балла. Для этого в колбы помещают исследуемую сточную воду в количестве 5, 10, 25, 50 см 2 и доводят объем до 100 см 3 водой, лишенной запаха. Содержимое колб перемешивают и определяют разведение, при котором запах исчезает, и разведение с интенсивностью запаха 1 – 2 балла. Кислотность сточных вод обусловлена содержанием в воде веществ, вступающих в реакцию с едкими щелочами (гидроксид натрия, гидроксид калия), К этим веществам также относятся: сильные кислоты ( хлороводородная, азотная и т.д.), слабые кислоты ( уксусная, сернистая, угольная, сероводород), катионы слабых оснований (ионы аммония, железа, алюминия, органических оснований и т.д.). Некоторые промышленные сточные воды содержат большие количества сильных кислот или их кислых солей. Кислотность воды определяют титрованием ее раствором щелочи и выражают в миллимолях в 1 дм 2. При наличии сильных кислот лучше применять индикатор метиловый оранжевый(красный), при наличии слабых кислот можно применять фенолфталеин. Оборудование и реактивы: конические колбы вместимостью 250 см2, мерные цилиндры вместимостью 100-200 см 3 , бюретки вместимостью 50, 100 см3;гидроксид натрия-0,1 н. раствор, фенолфталеин – 1% спиртовой раствор, 0,1 % раствор метиловый оранжевый.

Ход определения 100 см 3 воды титруют 0,1 н. раствором щелочи в присутствии индикатора метилового оранжевого ( 2-3 капли) до исчезновения красной окраски. Если при использовании индикатора метилового оранжевого не появится красное окрашивание, то используют индикатор фенолфталеина. Для этого к 100 см 3 профильтрованной воды ( или меньшему количеству, доведенному до объема 100 см 3 дистиллированной водой) приливают 5 –6 капель 1% спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия до исчезновения розового окрашивания.

41

Кислотность определяют по формуле: X = n * k 0,1 * 1000/V , ммоль/л ,

(1)

где n – объем 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование, мл ; К – поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора гидроксида натрия; (0,1 – титр раствора гидроксида натрия); 1000 – коэффициент пересчета; V - объем пробы, взятой для определения, мл. Щелочность сточных вод обусловлена содержанием в воде веществ, вступающих в реакцию с сильными кислотами, т.е. ионами водорода. К этим веществам относятся: сильные основания (гидроксид натрия, гидрооксид калия и т.д.), слабые основания (аммиак, анилин и т.д.), анионы слабых кислот ( НСО3-,СО32-, Н2РО4-,HSO3-, SO32-), анионы гуминовых веществ (HS-, SO32-) и т.д Щелочность воды определяют титрованием пробы сильной кислотой в присутствии смешанного индикатора ( или метилового оранжевого при титровании слабых оснований сильными кислотами до появления красного окрашивания). Оборудование и реактивы: мерные цилиндры, пипетки, конические колбы, бюретки; хлороводородная кислота – 0,1 н. раствор, метиловый оранжевый – 0,1 % водный раствор, фенолфталеин – 1% спиртовой раствор.

Ход определения В колбу наливают 100 см 3 исследуемой воды, приливают 5 капель фенолфталеина, при появлении розовой окраски пробу воды титруют на белом фоне хлороводородистой кислотой до обесцвечивания, затем прибавляют 5-6 капель смешанного индикатора и продолжают титрование раствором хлороводородной кислоты до перехода окраски из зеленой в розово-фиолетовую. Щелочность определяют по формуле: Х = n * K* 1000/ V, ммоль/л.

( 2 )

где n – объем 0,1 н. раствора хлороводородной кислоты, пошедший на титрование, мл; К – поправочный коэффициент раствора кислоты; 1000 – коэффициент для пересчета в кубические дециметры; V – объем воды, взятый для титрования, мл.

5. 2 Качественное определение сульфатов с приближенной количественной оценкой

42

Сульфаты, в количествах, превышающих 500 мг/дм 3, придают воде горьковато-солоноватый вкус, при концентрации 1000-1500 мг/дм 3 неблагоприятно влияют на желудочную секрецию, могут вызвать диспепсические явления. Сульфаты могут быть показателем загрязнения поверхностных вод животными отбросами, т.к. составной частью белков является сера, которая при разложении и последующем окислении превращается в соли серной кислоты. В водопроводной воде содержание сульфатов не должно превышать 500 мг/дм 3 . Качественное определение с приближенной количественной оценкой основано на учете степени помутнения воды от сульфата бария, образовавшегося при взаимодействии сульфат-иона с хлоридом бария. Оборудование и реактивы: колориметрические пробирки; основной стандартный раствор сульфата калия (0,9071 г сульфата калия растворяют в 1 дм 3 дистиллированной воды. 1 см 3 раствора содержит 0,5 мг сульфат-иона SO42-); рабочий стандартный раствор сульфата калия ( 10 см 3 основного стандартного раствора доводят до 100 см 3 дистиллированной водой. 1 см 3 раствора содержит 0,05 мг сульфат-иона); хлорид бария BaCl2* 2 H2O – 5 % раствор; хлороводородная кислота (1 : 5 и 1:1). Ход определения В колориметрическую пробирку наливают 10 см 3 исследуемой воды, добавляют 0,5 см 3 хлороводородной кислоты ( 1: 5). Одновременно готовят стандартную шкалу. Для этого в такие же пробирки наливают 2, 4, 8 см 3 рабочего раствора сульфата калия и 1,6; 3,2; 6,4 см 3 основного раствора сульфата калия, доводят дистиллированной водой до объема 0 см 3 , получая стандартную шкалу с содержанием 10, 20, 40, 80, 160, 320 мг/дм 3 сульфатиона. Прибавляют в каждую пробирку шкалы по 0,5 см 3 хлороводородной кислоты (1:5), затем в исследуемую воду и пробирки шкалы вносят по 2 см 3 5% раствора хлорида бария, закрывают пробками и сравнивают со стандартной шкалой.

5.3 Качественное определение железа с приближенной количественной оценкой В подземных водах железо находится в форме гидрокарбоната железа (II). При попадании в открытые водоемы гидрокарбонат теряет СО2, а карбонат гидролизуется с образованием гидроксида железа (II), который реагируя с кислородом, растворенным в воде, образует гидроксид железа (III) и затем оксид железа(III): Таким образом, в воде могут находиться соединения железа (II) и железа (III). Большие количества растворенного в воде железа не оказывают вредного влияния на здоровье людей, но такая вода непригодна для использова-

43

ния в ряде отраслей промышленности. ГОСТ 2874 – 82 устанавливает для воды водопроводной ПДК железа, равную 0,3 мг/л. Для водопроводов, подающих воду без специальной обработки по согласованию с СЭС, допускается содержание железа до 1 мг/л (приложение А) Принцип метода: Определение основано на взаимодействии в сильнокислой среде оксида железа (II) и роданида калия (или аммония) с образованием в красный цвет комплексного соединения роданида железа. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации железа. Fe3+ + 3 CNS-

Fe (CNS)3 .

Оборудование: 1) Колбы мерные на 50,100,1000 см3; 2)пипетки мерные на 1,2,10,25,50 см3; 3) Пробирки диаметром 14-15 мм; 4) Стеклянные палочки; 5) ФЭК; Реактивы: а) Основной раствор железо-аммиачных квасцов. Для приготовления раствора 0,8836 г свежеперекристаллизованных железоаммиачных квасцов NH4Fe(SO4)2* 12 H2O растворяют в мерной колбе вместимостью 1 л в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 2 см3 концентрированной хлороводородной воды и доводят до метки дистиллированной водой. 1 см3 раствора содержит 0,1 мг железа. б) Рабочий стандартный раствор железоаммиачных квасцов. Готовят в день поведения анализа разбавлением основного раствора в 10 раз дистиллироанной водой, 1 см3 раствора содержит 0,01 мг железа. в) Роданид аммония NH4 CNS (роданид калия KCNS) 50% раствор. 50 г роданида растворяют в 50 см3 дистиллированной воды. г) Хлороводородная кислота (плотность 1,12). К 65 см3 дистиллированной воды приливают 100 см3 хлороводородной кислоты (плотность 1,19). д) Персульфат калия (кристаллический). Ход определения В пробирку наливают 10 см 3 исследуемой воды, вносят 2 капли концентрированной хлороводородной кислоты и несколько кристаллов персульфата аммония (калия) и 0,2 см 3 роданида аммония (калия). Приближенно массовую концентрацию железа по интенсивности полученного окрашивания определяют по таблице 5. Таблица 5 - Приближенное определение общего железа с роданидом Окрашивание при рассмотрении Содержание железа мг/л

44

Сбоку Нет Слабое желтоваторозовое ---“-------“--Светло желтоваторозовое Сильно желтоваторозовое Светло желтоватокрасное

Сверху Нет Слабое желтоваторозовое --“---Светло- желтоваторозовое Желтовато-розовое

Менее 0,05 0,1 0,25 0,5 1,0

Желтовато-красное

2,0

ярко красное

Более 2.0

5.5 Микробиологическое восстановление сульфатов Бактерии, осуществляющие диссимиляционную сульфатредукцию называют десульфатирующими, или сульфатвосстанавливающими. Сульфатвосстанавливающие бактерии нуждаются в готовых органических веществах, наряду с использованием которых могут фиксировать большие количества углекислоты, чем другие гетеротрофы. По типу энергетического обмена это окислители. Единственным конечным акцептором электронов у них служат окисленные соединения серы, а донором – органические соединения, например, лактат, ацетат или H 2 . Бактерии, проводящие процесс сульфатредукции, сходны по многим признакам. Это подвижные формы, облигатные анаэробы, гетеротрофы, окисляют различные органические соединения, преимущественно до углекислого газа и ацетата, некоторые из этих организмов могут в отсутствии сульфата сбраживать пируват, малат или фумарат. Цель работы – изучение анаэробного дыхания на примере сульфатного и знакомство с некоторыми представителями сульфатвосстанавливающих бактерий, осуществляющих этот процесс. На выполнение задачи необходимо 15-16 часов. Занятие 1. Подготовка сред и посуды для стерилизации. Построение калибровочной кривой определения сульфида. Занятие 2. Посев культур в опыт. Отбор проб. Изучение морфологии клеток, подсчет клеток по Виноградскому и определение белка в биуретовой реакции. Занятие 3-4. Отбор проб, определение образовавшегося сульфида, подсчет числа клеток. Оформление результатов. Материалы, оборудование, посуда, реактивы: Термостат, ФЭК-56 М, микроскоп с фазово-контрастным устройством, мерные колбы, пипетки, обычные пробирки с резиновыми пробками, пред-

45

метные и покровные стекла, фуксин основной, железоаммиачные квасцы, N,N-диметилпарафенилендиамин, ацетат цинка, дрожжевой автолизат, концентрированная серная кислота; KH2 PO4,NH4Cl, (NH4)SO, Na 2SO, CaCl 2 , MgSO4, лактат Na, NaCl, FeSO4 ,Na 2S, NaHCO3. Микроорганизмы и их культивирование: В работе используют несколько представителей сульфатредуцирующих бактерий: Desulfovibrio desulfuricans штамм 2198, D.desulfuricans штамм 2372, D.вaculatus и Desulfotomaculum nigrifcans. Бактерии культивируют в среде следующего состава (г/л): KH2PO4 – 0,5; NH4Cl –0,1; (NH4)2SO4 – 7,0; CaCl2 –0,06; MgSO4 – 0,06; лактат Na –6,0; лимоннокислый Na (трехзамещенный) – 0,3; FeSO4-0,01; NaCl –5,0; Na2S – 1 мл (0,22 г/л); дрожжевой экстракт – 1,0; микроэлементы по Пфеннингу и Липперту – 1 мл/л. Отдельно от основной среды стерилизуют 0,1% раствор FeSO4 * 7H2O в 1% HCl; 5%ный раствор Na2S в 1% растворе NaHCO3; 5% раствор NaHCO3; 5% раствор HCl; 10% раствор дрожжевого автолизата ( стерилизуют при 152 кПа, остальные компоненты стерилизуют при 202 кПа 30 минут). Раствор микроэлементов вводят в среду при посеве и стерилизуют также при 152 кПа. Раствор микроэлементов (по Пфеннингу и Липперту) содержит в 100 мл дистиллированной воды (мг); ЭДТА – 500; FeSO4* 7 H2O – 200;ZnSO4* 7 H2O – 10; MnCl2 *4H2O – 3;CoCl2* 6H2O – 20; H3BO3 – 30; NiCl2 * 6H2 O – 2; Na2 MoO*2H2 O – 3;CuCl2 * 2H2 O – 1. Для удаления из стерильной среды растворенного кислорода ее кипятят в течение 5 мин и затем быстро и осторожно охлаждают водой. После этого вносят добавки в следующем порядке: микроэлементы, дрожжевой экстракт, FeSO4 ; далее доводят рН до 7,0 – 7,5 по бромтимолблау с помощью стерильного раствора бикарбоната и вносят Na2S по каплям до образования сероватого оттенка в среде. В среды немедленно вводят посевной материал (10% от объема ), разливают доверху в стерильные пробирки и закрывают резиновыми пробками. Часть среды оставляют незасеянной для контроля. Из засеянной среды берут пробу на анализ и микроскопирование. Процесс культивирования ведут в стационарных условиях в термостате при 30о С и при 60о С для D.nigri-ficans). Анализы: Ежедневно снимают по одной пробирке каждой культуры проводят микроскопирование в фазовом контрасте, следя за изменением морфологии клеток. Каждый раз подсчитывают число клеток в культуре по Виноградскому и результат заносят в журнал. Количественный учет биомассы можно вести также по приросту белка в культуре, определяемого по биуретовой реакции. Определение сульфидов: В процессе развития и диссимиляционной сульфатредукции клетки выделяют сероводород, который связываясь с присутствующим в среде железом, вызывает почернение. Определение образовавшегося сульфида в опытах и контрольных пробирках проводят по методуТеппера. В мерные колбы

46

на 25 мл вносят 5 мл 2%-ного раствора ацетата цинка; 0,25 мл пробы и 8 мл воды, раствор перемешивают. Приливают 2,5 мл 0,2%-ного раствора N,Nдиметилпарафенилендиамина в 20%-ной серной кислоте, перемешивают. Приливают 0,125 мл 10%-ного раствора железо-аммиачных квасцов в 2 %ной серной кислоте, доводят объем раствора до 25 мл водой, перемешивают. Через 30 минут окраску измеряют на ФЭКе при λ 802 нм. В качестве контроля вместо пробы берут 0,25 мл воды. Измерение проводят в кюветах с длиной оптического пути 5 мм. Пересчет содержания сульфида ведут с использованием калибровочной кривой, построенной для растворов с содержанием 50-200 мкг/мл ( в пересчете на серу). Оформление результатов: Результаты оформляют в виде таблицы и графиков прироста биомассы и количества образованного культурами сульфида (мкг/мл) в зависимости от времени по каждой культуре. Рассчитывают интенсивность процесса по часам, делают вывод о различии скорости образования сульфида в зависимости от условий выращивания клеток и вида бактерий.

5.5 Бактериальное окисление соединений железа В некоторых водоемах с пресной водой, где в высоких концентрациях содержатся восстановленные формы железа, железобактерии образуют природные колонии, покрытые коркой окиси железа. Биологическое значение окисления железа различно для разных организмов. Thiobacillus ferrooxidans обладает литоавтотрофным обменом, окисляя двухвалентное железо в трезвалентное через цитохром с и цитохромоксидазу. Образующийся при этом АТФ служит для фиксации углекислого газа. Th. Ferrooxidans способен окислять пирит (FeS2 ) с образованием трехвалентнго железа и серной кислоты. Развиваясь в кислой среде организм не образует оформленных соединений железа, но при этом идет реакция 4 Fe2+ + 4 H+ + O 2

4 Fe 3++ 2 H 2O

К собственно железобактериям относят организмы, образующие оформленные осадки железа. Наиболее типичными представителями являются нитчатые, заключенные в чехол бактерии группы Sphaerotius, а также представители родов Leptothrix, Toxothrix, Siderococcus. Их легко выращивать в средах, содержащих органические вещества и железо. Такие организмы накапливают в чехлах окись железа, но их способность развиваться как хемоавтотрофы не доказана. Наиболее очевидна такая способность для железобактерии рода Gallionella. Это чрезвычайно мелкий организм, едва отличимый от частиц железистого осадка. Она растет на минеральной среде, содержащей в качестве минерального источника восстановленного железа осадок сульфида железа. Культура образует хлопьевидные колонии на стенках сосу-

47

да, которые состоят из окисла железа, а маленькие бобовидные клетки располагаются на разветвленных кончиках пропитанных гидроокисью железа стебельков. Цель работы – наблюдение за процессом микробиологического окисления двухвалентного железа в трехвалентное и количественная оценка этого процесса. На выполнение задачи требуется 16 – 18 часов. Занятие 1. Приготовление и стерилизация сред и посуды. Занятие 2. Посев культуры, микроскопирование,приготовление реактивов для построения стандартной кривой. Занятие 3. Определение содержания Fe (III), числа клеток в культуральной жидкости, оформление результатов. Посуда, реактивы: пипетки стерильные – 10,пробирки – 25 штук, серная кислота (концентрироанная), железо-аммиачные квасцы, аммиак,сульфосалициловая кислота. Микроорганизмы и их культивирование: Используют культуры Leptothrix sp. и Th. ferrooxidans (окисляющий как соединения железа, так и соединения серы). Leptothrix sp. Выращивают в среде следующего состава(г/л): пептон – 4,0; глюкоза – 3,0; MgSO4 – 0,1; CaCl2 – 0,05; MnSO4 –0,01; FeCl3 – 0,001; тиамин – 0,2 мг; биотин – 0,02 мг;( NH4 )2 Fe – лимоннокислый (закисная соль) – 0,25; вода водопроводная – до 1 литра. РН среды до стерилизации устанавливают с помощью 10% растворов NaOH N 2SO4. Th. ferrooxidans культивируют на среде следующего состава (г/л): Раствор 1- сернокислый аммоний –3,0; фосфорнокислый аммоний однозамещенный – 0,5; хлористый калий – 0,1; сернокислый магний – 0,5; азотнокислый кальций – 0,01; вода дистиллированная – до 700 мл. Раствор 2 – железо сернокислое – 44,2; 1 мл 10 н. серной кислоты; вода дистиллированная – до 300 мл. Растворы 1 и 2 стерилизуют отдельно при 152 кПа 30 мин. Перед засевом растворы сливают, стерильно доводят рН до 2,5 при помощи 10%-ной серной кислоты. Среду разливают по 100 мл в стерильные качалочные колбы. В качестве посевного служат культуры в конце экспоненциальной фазы роста (3 суточные). Их вносят в количестве 10% по объему). Выращивание культур ведут на качалках при температуре 30о С в течение недели. Ежедневно отбирают пробы для микроскопирования клеток и определения количества окисного железа. Анализы: 1 Микроскопирование. Для наблюдения за образованием железистых чехлов Leptothrix готовят фиксированный препарат клеток, погружают его на 3 – 5 мин. в 5%-ный раствор желтой кровяной соли, затем без промывания -–0,1М раствор HCl. Осадок трехвалентного железа синеет, что,видно при микроскопировании препарата.

48

2 Чтобы определить количество клеток Th.ferroxidansготовят фиксированные препараты и подсчет ведут по методу Виноградского. Определение количества железа (II) проводят спектрофотометрическим методом, основанным на взаимодействии железа (II) с сульфосалициловой кислотой, при котором в зависимости от рН раствора образуется ряд комплексных соединений, в частности при рН 1,8-2,5 – моносульфосалицилат железа красно-фиолетового цвета, имеющий спектр поглощения с максимумом при 510 нм. Ход определения 1 мл культуральной жидкости с клетками помещают в пробирку, прибавляют 2 мл 10%-ной сульфосалициловой кислоты; 0,1 мл 2 н. серной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора до 10 мл дистиллированной водой. Оптическую плотность смеси измеряют на ФЭКе при 510 нм в кювете шириной 10 мм. Определение ведут по значениям стандартной кривой, которую строят в тех же условиях, используя навеску железо-аммиачных квасцов с 0,1-1 мкг/мл железа (II) в растворе. Оформление результатов Результаты вносят в таблицу и строят график зависимости окисления железа и появления в культуральной жидкости железа (III) от времени выращивания культуры и количества образованной биомассы.

49

Список использованных источников 1. Авакян З.А. Сравнительная токсичность тяжелых металлов для некоторых микроорганизмов // Микробиология.-1967,- т. 36, № 6 – С. 446-450. 2. Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов, их ингибиторы и биокаталитические процессы в биотехнологии // Прикладная биохимия и микробиология – 1995,- т.31, № 1 – С. 21-26 3. Безбородов А.М. Биотехнология продуктов микробного синтеза. – М.: Агропромиздат,1991,- 190 с. 4. Глоба Л.И. и др. Очистка природной воды гидробионтами, закрепленными на волокнистых насадках // Химия и технология воды. – 1992, - т.14, № 1,С.63-67. 5. Горшков В.А. и др. Испытание биологической технологии очистки кислой шахтной воды шахты «Скальная» ПО «Кизельуголь» //Экология и генетика микроорганизмов. АН СССР УрО.-1991,- т. 1,- С.80-83. 6. Данилович Д.А. Анаэробная биологическая очистка прозводственных сточных вод // Жилищное и комунальное хозяйство. – 1992, - № 2- С. 31-32. 7. Дятлова Н.М. и др. Комплексоны и комплексонаты металлов. – 1988,М.:Химия, 350 с. 8. Дубова Н.А. Миграция металлов в пресных водах //Водные ресурсы. – 1988, - № 4 – С.185-186. 9. Жданова Н.И., Олиферчук В.П. Использование некоторых почвенных микромицетов для очистки промышленных сточных вод // Микробиологический журнал.- 1993, - т. 55, № 3, - С. 67-73. 10.Заварзин Т.А. Литотрофные микроорганизмы - М.: Наука,1972,- 200 с. 11.Зайнуллин Х.Н., Смирнова Г.Ф. и др. Применение сульфатвосстанавливающих бактерий для биохимической очистки сточных вод машиностороительных предприятий //Химия и технология воды,- 1980, т.2 ,№ 3, С. 272-275. 12.Илялетдинов А.Н. Микробиологическая очистка воды от тяжелых металлов //Водные ресурсы,- 1980,- №2,- С.158-169. 13.Илялетдинов А.Н. Микробиология превращения металлов. – А-Ата.: Наука, 1982,- 268 с. 14.Илялетдинов А.Н., Алиева Р.М. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод.- А-Ата: Гылым,- 1990, 250 с. 15.Карасевич Ю.Н. Экспериментальная адаптация микроорганизмов – М.: Наука, - 1975, 180 с. 16.Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. и др. Резистентные бактерии рода Pseudomonas к соединениям шестивалентного хрома и способность к его восстановлению // Микробиологич. журнал. – 1988, - т.50,№ 6,- С. 24-27. 17.Квасников Е.И. и др. Бактерии, восстанавливающие хром в природе и в стоках промышленных предприятий // Микробиология, - 1988, - т. 57, № 4, - С. 680-685.

50

18.Квасников Е.И.,Серпокрилов Н.С. Биологическая очистка хромсодержащих промышленных сточных вод. – Киев:Наукова Думка,- 1990, 109 с. 19.Квасников Е.М. и др. Использование иммобилизированных клеток бактерий при очистке сточных вод от шестивалентного хрома // Микробиологич. журнал, - 1986,- т. 48, № 6, - С. 39-44. 20.Клюшникова Т.М. и др. Сульфатвосстанавливающая способность бактерий рода Pseudomonas // Микробиологический журнал, - 1992, - т. 54, № 2,С. 49-54. 21.Кондратьева Е.Н. Хемолитотрофы и метилотрофы.-М.:МГУ,1983,167 с. 22.Маракушев С.А. Геомикробиология и биохимия золота. – М.: Наука, 1991, 70 с. 23.Маракушев С.А. и др. Роль редокс-процессов при взаимодействии гетеротрофных микроорганизмов золотоносных месторождений с коллоидным золотом.//Доклады АН СССР. – 1988, - т. 30, № 5,- С. 1211-1214. 24.Павленко Н.И. и др. Некоторые аспекты детоксикации ионов тяжелых металлов при очистке нефтесодержащих сточных вод //Химия и технология воды, -1991,- т.13, № 4,- С. 371-374.с. 25..Рода И.Г., Смирнова Г.Ф. Биохимия и очистка хромсодержащих сточных вод // Химия и технология воды,-1989,-т.11,№ 2,- С. 169-172. 26.Романенко В.И. и др. А.С. (СССР ) № 521234 МКИ СО2 С5/10 Опубл. 1994- 4с. 27.Роуз Э. Химическая микробиология. –М.: Мир,1971,291 с. 28.Рыльский А.Ф.Восстановление шестивалентноо хрома термофильными микроорганизмами: Авторефер. Дис. канд.биол.наук:03.00.07- Киев,1986, 39 с. 29.Сидоренко Х.П. и др. Способ биологической очистки водных ресурсов от хрома. А.с. (СССР) № 1171438 МКЛ 4 СО 2 F3/34. Опубл.: 1985 – 6 с. 30.Ховрычев М.П. Поглощение ионов меди клетками Candida utilis //Микробиология, -1973,- т.XLII,-вып. 5,-с. 839-843. 31.Эрлих Х.Жизнь микробов в экстремальных условиях.-М.: Мир, 1981, 469 с. 32.Tynecka et.al. energy-dependent effluxofcadmium coded by a plasmid resistance determinet in Staphylococcus aureus // J. Bacteriol.- 1981,- v.147, P.313319. 33.Roa G, Mutharasan F. Directed metabolic from with high butanol yield and selectivity in continuos cultures of Clostridium acetobutylium // Biotechnol. Lett.1988-, v. 10, P.313-321.

51

Приложение А Требования к качеству питьевой воды (ГОСТ 2874 – 82) Показатель Запахи и привкусы при температуре 20о С Цветность Мутность рН Сухой осадок Хлориды Сульфаты Железо Марганец Медь Цинк Общая жесткость Бериллий Свинец Селен Стронций Фтор Общее количество бактерий Коли-индекс Коли-титр Мышьяк Молибден

52

Единицы измерения Балл

Норма ‹=2

град мг/л мг/г мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг-экв/л мг/л Мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л шт/л

‹=20 ‹=1,5 ‹=6,5-8,5 ‹=1000 ‹=350 ‹=500 ‹=0,3 ‹=0,1 ‹=1,0 ‹=5,0 ‹=7,0 ‹=0,0002 ‹=0,03 ‹=0,001 ‹=7,0 ‹=1,5 ‹=100

шт/л шт/мл мг/л мг/л

‹=3 ‹=300 0,05 ‹= 0,25

Приложение Б Предельно допустимые концентрации вредных веществ в сточных водах и в осадке, поступающих на сооружения очистных станций Вещество ПДК по СниП,мг/л Вещество ПДК по СниП,мг/л

Медь Мышьяк

Биологич. Очистка 0,5 0,1

Сбрасыв. Осадка 25 -

Никель

0,5

500

Свинец Хром (Ш) (VI) Цинк Цианиды Сульфиды Анилин Бензол Глицерин Капролактам Кислоты Бензойная Стеариновая Масляная Спирты Амиловый Метиловый

0,1

50

2,5 2,5

25 3

1,5

-

1,0 6,0 90,0 25,0

200 -

15,0 45,0 45,0

-

3,0 30,0

100 500

Фенол Формальдегид Детергенты(ПАВ) ОП-7 и ОП-10 Сульфонол Некаль «Новость» порошок Красители Уксуснокислый аммоний Крезол Нефтепродукты

Биологич. очистка 15,0 25,0

Сбрас. осадка -

50,0 20,0 20,0 20,0 20,0

100

25,0 25,0

-

15,0 25,0

-

200 200 100

53