Современные методы исследований в биохимии: Методические указания к выполнению СРС

Федеральное агентство по образованию

Восточно-Сибирский государственный технологический университет

УДК 577.1:543.5(075.8) Битуева А.В. Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии». - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. – 72 с. Рецензент: д.б.н., профессор кафедры «Биоорганическая и пищевая химия» Жамсаранова С.Д.

Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии» для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», магистерская программа разработана на основе ГОСВПО по направлению 260100 регистр. №187 от 23 марта 2000 г

Составитель Битуева А.В.

Дисциплина «Современные методы исследований в биохимии» относится к циклу дисциплин по выбору для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», обучающихся по магистерской специализированной программе «Развитие новых технологий на основе рационального использования белков». Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии» содержат теоретическое обоснование хроматографических методов исследования, масс-спектрометрии, методы ДНКдиагностики, а также вопросы для самопроверки знаний, включающие вопросы текущего контроля знаний, теоретических коллоквиумов. Методические указания составлены в соответствии рабочей программой курса и рекомендуются магистрантам, начинающим аспирантам.

Табл. 7, рис. 6, библиогр.: 16

Издательство ВСГТУ Улан-Удэ, 2006

ВСГТУ, 2006 г.

СОДЕРЖАНИЕ 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4 2.5. 2.6. 2.7. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 4.1. 5. 6. 7.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ Современные методы анализа, применяемые в биохимии Хроматографические методы определения веществ Оптимизация условий фракционирования Тонкослойная и бумажная хроматография Колоночная хроматография Жидкостная хроматография низкого давления Высокоэффективная жидкостная хроматография Газовая хроматография Атомно-абсорбционная спектрометрия, атомноэмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой в биохимическом анализе Основные принципы атомной спектрометрии Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой Атомно-абсорбционная спектрометрия Масс-спектрометрия элементного анализа Разновидности масс-спектрального анализа Методы ДНК-диагностики ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ЗНАНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 6 6 11 19 24 27 29 33 36 37 38 41 43 47 50 65 71

ВЭТТ ТСХ ВЭЖХ ГХ ТЖХ ЖЖХ ГЖХ РГХ ААС АЭС-ИСП АЭС ОЭС ЖХ/МС ГХ/МС МС/МС ПЦР –

высота, эквивалентная теоретической тарелке тонкослойная хроматография высокоэффективная жидкостная хроматография газовая хроматография Твердожидкостная хроматография Жидкожидкостная хроматография Газожидкостная хроматография (распределительная) реакционной газовой хроматографии атомно-абсорбционная спектрометрия атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой атомно-эмиссионной спектрометрии (другое название метода — оптико-эмиссионная спектрометрия) жидкостная хроматография с массспектрометрией - метод газовая хроматография с масс-спектрометрией тандемная масс-спектрометрия Полимеразная цепная реакция

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ Биологическая химия как наука, занимающаяся выяснением химической природы веществ, входящих в состав живых организмов, их превращения, а также связь этих превращений с деятельностью клеток, органов и тканей организма в целом, использует для их изучения разнообразные методы исследований. Целью обучения по дисциплине «Современные методы исследований в биохимии» является • совершенствование навыков работы по выделению и экстрагированию биологически активных веществ из различных субстратов с использованием методов хроматографии; • определение количественного содержания биологически активных веществ, содержащихся в изучаемых объектах, флюорометрическими методами; • качественная оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, методом полимеразной цепной реакции; • обучение студентов технике современного биохимического анализа, методам оценки и выбора методов анализа, адекватных поставленной задаче; • освоение современных методик, позволяющих выполнить будущую магистерскую диссертацию на достаточно высоком уровне. Предметные цели обучения включают следующие уровни усвоения знаний: Студент должен иметь представления: • об элементах теории хроматографических методов; • о хроматографическом процессе; • о материалах матриц сорбентов и обменников; • о методах ДНК – диагностики в пищевой промышленности;

• новейшие научные и практические достижения в области биологической химии; Студент должен знать: • классификацию хроматографических методов; • о принципах действия метода полимеразной цепной реакции; Студент должен уметь: • выбирать параметры хроматографического процесса; • оптимизировать условия эксперимента; • проводить подготовку эксперимента на анализаторе жидкости «Флюоорат-02»; • проводить выделение ДНК, амплификацию и электрофоретический анализ продуктов амплификации.

2. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В БИОХИМИИ В настоящих методических указаниях рассматриваются современные физико-химические методы, используемые в биохимии: разные виды хроматографии, атомно-абсорбционная спектрометрия, атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, масс-спектрометрия, методы ДНК-диагностики. 2.1. Хроматографические методы определения веществ В современных химико-биологических исследованиях наиболее часто применяют различные типы хроматографических методов: тонкослойную хроматографию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию (ГХ).

Физико-химические основы хроматографии Хроматографией называется разделение веществ, основанное на распределении компонентов смеси между неподвижной (стационарной) и подвижной (мобильной) фазами. Молекулы разделяемых веществ диффундируют через поверхность раздела фаз и в зависимости от химической природы удерживаются той или иной фазой по-разному. При продвижении компонентов смеси в разделяющей среде диффузия между фазами осуществляется многократно, причем каждый раз достигается небольшое разделение. Чем выше эффект разделения, тем точнее конечный результат анализа. Хроматографию сравнивают с ректификацией и пользуются понятием «теоретическая тарелка». Однако если для оценки эффективности ректификационной колонки используют понятие «число теоретических тарелок», то в хроматографии для оценки эффективности системы применяют понятие «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ). ВЭТТ соответствует расстоянию между двумя соседними теоретическими тарелками. Лабораторные установки для ректификации имеют обычно 10—100 теоретических тарелок. В ТСХ — наиболее простом варианте хроматографии используют хроматографические пластинки эффективностью несколько тысяч теоретических тарелок. Современная хроматография (в частности ВЭЖХ) располагает высококачественными сорбентами, позволяющими готовить хроматографические колонки эффективностью несколько десятков тысяч теоретических тарелок. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают жидкостную и газовую хроматографию (табл. 1). В основе газовой хроматографии лежат процессы распределения и адсорбции. Свойства подвижной фазы (газа-

носителя) имеют второстепенное значение для процесса разделения. В ТЖХ и ЖЖХ процесс разделения в значительной степени определяется составом подвижной фазы. В качестве подвижной фазы используется множество веществ, поэтому для каждого специального случая можно подобрать подходящую систему разделения. ГЖХ применяют главным образом для аналитических целей, а жидкостную хроматографию чаще используют для препаративных целей. Таблица 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПО АГРЕГАТНОМУ СОСТОЯНИЮ ПОДВИЖНОЙ И НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗ Неподвижная фаза

Подвижная фаза жидкость

Твердая

Твердожидкостная хроматография (ТЖХ) (адсорбционная, ионообменная, аффинная)

Жидкая

Жидкожидкостная хроматография (ЖЖХ) (распределительная)

газ Газоадсорбционная хроматография (ГАХ)

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) (распределительная) Выбор принципа разделения зависит от информации о свойствах анализируемых веществ. Так, например, только данные о растворимости целевых веществ позволяют сделать выводы о возможной схеме исследования (табл. 2). Если имеется какая-либо предварительная информация о свойствах анализируемых веществ, то, руководствуясь

данными, приведенными в табл. 3, можно выбрать принцип разделения. Анализируемые вещества распределены по полярности функциональных групп (возрастает слева направо). Неполярные вещества разделяют при помощи нормально-фазовой хроматографии.

В дихлорметане и гептане

Таблица 2. ВЫБОР ПРИНЦИПА РАЗДЕЛЕНИЯ И ТИПА СОРБЕНТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАСТВОРИМОСТИ ЦЕЛЕВОГО ВЕЩЕСТВА

Таблица 3. ПРИНЦИП РАЗДЕЛЕНИЯ ДЛЯ КСЕНОБИОТИКОВ РАЗНЫХ ХИМИЧЕСКИХ КЛАССОВ

Растворимость целевого

Принцип

вещества

разделения

Только в воде

Ионообмен Гельхроматография

В воде и этаноле

В этаноле и дихлорметане (хлористом метилене)

Распределение

Гельхроматография Адсорбция или распределение Гельхроматография

Сорбент хроматография хроматография низкого давления высокого давления Дауэкс, сефадекс, Ионообменники ионообменная на основе целлюлоза силикагеля Сефадекс G, Пористое стекло биогель, гидрогель, (CPG),TSK-гель сефакрил, агароза Целлюлоза или Силикагель модифицированный декстран (сефадекс LH),элюент: малополярный + сильнополярный растворитель Сефадекс LH Порагель, пористое стекло Силикагель, Модифицирован сефадекс LH кизельгель -NO2, -CM) Сефадекс LH Полистирагель (например, стирагель)

Неполярные соединения Углеводороды и их производные RH RX RNO2

Нормальнофазовая хроматография

Адсорбция или гельхроматография

Силикагель, оксид алюминия Полистирагель (например, биобедс)

Силикагель Полистирагель (например, стирагель)

Полярные соединения Кислородсодержа щие соединения О О О О II II II II ROR RC-OR RCR RCH RCNHR

Обращеннофазовая хроматография

Доноры Ионогенные протонов (ОН- соединения и NH-кислоты) + RNH2 ROH NH3-R-CO2ArOH RCO2H Распредели- Ионообментельная ная хроматохроматография графия

Выбор системы элюентов определяется рядом факторов. В гель-хроматографии вещества должны хорошо растворяться в элюенте, а вязкость элюента и раствора пробы должна быть минимальной. Селективность ионообменной хроматографии зависит не только от ионной силы буфера, но и от природы противоионов буфера. В адсорбционной хроматографии в большинстве случаев подходят системы метанол—вода или ацетонитрил—вода. Вторая система предпочтительнее, так как вязкость элюента по мере возрастания концентрации ацетонитрила убывает. Сопротивление колонки для системы метанол—вода выше, чем для системы ацетонитрил—вода.

Влага существенно влияет на селективность неполярной системы растворителей. После того как определен принцип разделения, подобраны элюент и размеры частиц сорбента, необходимо определить, какое разрешение должно быть достигнуто, какое количество вещества необходимо разделить и насколько важен фактор времени. На практике все параметры взаимосвязаны и условия хроматографического разделения можно оптимизировать только по одному из трех параметров. 2.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В большинстве случаев перед хроматографическим процессом стоит задача надежного разделения двух или более заранее известных компонентов исходной смеси. Если хроматографическая система уже определена, то в распоряжении экспериментатора еще остается возможность выбора целого ряда физических параметров процесса с целью оптимизации условий разрешения зон (пиков) в этой системе. Последовательно рассмотрим следующий ряд параметров: геометрия колонки, размер гранул, набивка колонки, скорость элюции, загрузка колонки. Рассмотрение возможно с позиции улучшения разрешения и одновременно уменьшения продолжительности хроматографического процесса. Геометрия колонки Длина колонки учитывается для поддержания оптимальной скорости элюции. Для слишком длинной колонки поддержание оптимальной скорости элюции может потребовать очень большого перепада давлений. С этой

точки зрения необходимо оценить возможности имеющегося насоса и опасность деформации гранул используемого сорбента. Диаметр колонки теоретически не должен сказываться ни на одной из характеристик хроматографического процесса: ни на скорости миграции, ни на форме зон, ни на разрешении. Например, колонку, площадь сечения которой в 100 раз превышает площадь сечения другой колонки (при идентичности всех прочих параметров, включая длину), можно рассматривать как 100 колонок меньшего диаметра, собранных параллельно, в один «пучок». В реальных случаях выбор сечения колонки сказывается на характеристиках хроматографического процесса. С одной стороны, диаметр колонки должен не менее чем в 50 раз превышать диаметр гранул, иначе упомянутое ранее влияние стенок колонки может вызвать заметное расширение зоны. С другой стороны, колонки диаметром более 2 см отличаются худшими характеристиками за счет неоднородностей тока жидкости в них, так как при набивке их сорбентом трудно обеспечить равномерность его распределения по всему сечению. Эти трудности особенно сильно выражены при гель-фильтрации, где зоны движутся очень близко друг за другом. Тем не менее диаметр колонки нередко заметно увеличивают ради большей загрузки препаратом, с тем чтобы при этом сохранить малой ширину исходной зоны. Размер гранул С уменьшением диаметра гранул d условия хроматографии заметно улучшаются: уменьшается высота теоретической тарелки, дисперсия зон, увеличивается разрешение, повышается оптимальная скорость элюции. Однако при этом происходит сильный рост необходимого перепада давления (АР). Необходимый перепад давления растет пропорционально третьей степени уменьшения

диаметра гранул (например, при уменьшении диаметра втрое перепад давлений необходимо увеличить в 27 раз). Это предъявляет новые, повышенные требования к конструкции насосов, колонок, подводящих трубок и их сочленений, а также к жесткости самих гранул (сжатие гранул ведет к их деформации, заполнению свободной площади сечения и закупориванию колонки). Как только возникла необходимость убыстрения хроматографического анализа (например, для экспресс-анализа в заводских условиях), указанные повышенные требования были осуществлены при разработке новой техники хроматографии при высоком давлении, которую условились обозначать ЖХВД. Диаметр гранул для ЖХВД оказалось возможным снизить 5 —10 мкм, что позволило использовать колонки диаметром 2—5 мм и уменьшить продолжительность хроматографического разделения до десятков минут; при этом используют перепады давления порядка сотен атмосфер. Существенного снижения эффективного размера гранул неподвижной фазы и улучшения разрешения без необходимости очень сильного повышения давления можно добиться путем использования в качестве неподвижной фазы сплошных (не пористых) гранул с сорбированным или химически закрепленным на них тонким слоем жидкости. Но при этом происходит снижение емкости колонки. Набивка колонки Практические исследования показывают, что в случае ненабухающих (и несжимаемых) гранул на основе спликагеля или пористого стекла наилучшие результаты нередко дает заполнение колонки сухими гранулами. Колонку при этом следует потряхивать или постукивать по ней. Первое заполнение ее жидкостью следует вести снизу вверх, вытесняя воздух. Матрицы и сорбенты на основе

целлюлозы или сефадекса нельзя вносить в сухом виде — им следует предварительно дать набухнуть. Для заполнения предпочтительно использовать суспензию гранул в воде или буфере в виде густой кашицы. Во всех случаях следует избегать свободного осаждения гранул из суспензии во время заполнения колонки, так как это приведет к распределению частиц по размерам как в продольном направлении, так и по сечению колонки, что обусловливает неоднородность последующего тока подвижной фазы. После заполнения фазам в колонке надо дать уравновеситься при рабочей скорости элюции и соответствующем перепаде давления.

Скорость элюции С помощью теории миграции хроматографической зоны можно получить выражение для оптимальной скорости элюции uопт; в первом приближении оно сводится к очень простой зависимости uопт ≈ Dm/d, где Dm — коэффициент диффузии вещества в подвижной фазе, a d — средний диаметр гранул. Для низкомолекулярных веществ в водных растворителях можно принять, что Dm≈10-5cm2/c. Тогда для колонки, заполненной гранулами со средним диаметром 80 мкм, uопт составит 1,25·10-3 см/с или 4,5 мл/ч на 1 см2 сечения колонки. Рабочую скорость элюции можно брать в 5 — 6 раз выше, чем uопт , т. е. примерно 20—30 мл/ч·см3. Для колонок ЖХВД с гранулами диаметром 10 мкм рабочую линейную скорость можно увеличить до 5· 10 2 см/с, т. е. до 3 см/мин. При обычной высоте колонки (25 см) это позволяет проводить хроматографическое фракционирование за 8—10 мин.

Загрузка колонки В целях наилучшего использования разрешающей возможности колонки ширина исходной зоны должна быть минимальной. Это не обязательно означает, что объем раствора препарата, вносимого на колонку, должен быть мал. Такое заключение справедливо только для гельфильтрации, где сорбция препарата в неподвижной фазе отсутствует. Если же сродство хроматографируемого вещества к неподвижной фазе велико, как, например, при ионообменной хроматографии, то узкая исходная зона на верхнем конце колонки образуется сама в процессе нанесения препарата даже из большого объема разбавленного раствора. С другой стороны, следует проявлять осторожность при внесении на колонку препарата в виде концентрированного раствора. Помимо проблемы повышенной вязкости такого раствора, не исключено, что условия в исходной зоне будут неблагоприятно влиять на разрешении пиков. В результате зона разрешения деформируется (ее передний фронт будет становиться все более крутым, а задний — растянется) и приобретет профиль с образованием размытого «хвоста», что достаточно часто встречается в хроматографической практике. Эта деформация может быть следствием перегрузки зоны, а также в случае слишком большой скорости элюции, разрешение этой альтернативы возможно за счет уменьшения скорости элюции при той же загрузке колонки. ХРОМАТОГРАФИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ Макромолекулы отличаются от малых молекул не только размерами, но и лабильностью, которая в первую очередь связана с тем, что биологическая активность многих

из них (например, белков) обусловлена третичной структурой, в образовании которой решающую роль играют слабые силы взаимодействия между достаточно удаленными друг от друга участками полипептидной или полинуклеотидной цепи. Кроме того, биологические макромолекулы являются полиэлектролитами, что в случае ионных взаимодействий с сорбентом приводит к многоточечному контакту. Часто на их поверхности мозаично расположены гидрофобные и гидрофильные участки, а также центры сорбции. Биологическая активность многих ферментов связана с сохранением четвертичной структуры, когда белковая молекула состоит из нековалентно связанных между собой субъединиц. Термином «денатурация» обычно обозначают утрату макромолекулами четвертичной, третичной или вторичной структурных организаций. Такая утрата может происходить в ходе самого хроматографического процесса — как в результате воздействия элюента (экстремальные значения рН, высокие концентрации соли, возможность окисления), так и вследствие многоточечной сорбции, когда макромолекулы как бы «распластываются» на поверхности сорбента. При этом слабые связи между участками их цепей разрываются. Денатурация, как правило, приводит к увеличению молекулярного объема и к экспонированию гидрофобных участков, особенно у белков, где эти участки в большинстве своем укрыты от контакта с водно-солевой средой клетки, располагаясь внутри белковых глобул. Такие изменения при денатурации влияют на распределение макромолекул между подвижной и неподвижной фазами. Это влияние нередко бывает неблагоприятным, поскольку развернутые полипептидные или полинуклеотидные цепи склонны очень прочно, а иногда и необратимо

сорбироваться в неподвижной фазе. Даже при отсутствии какой-либо сорбции, например при гель-фильтрации, увеличение молекулярного объема при денатурации может приводить к задержанию молекул внутри гранул, откуда они в нативном состоянии могли свободно диффундировать. Экспонирование гидрофобных участков может приводить к нежелательному взаимодействию фракционируемых молекул с самим материалом матрицы (полимерной сетки), образующей каркас гранул неподвижной фазы. Для уменьшения опасности денатурации нередко приходится вести хроматографию белков при пониженной температуре или вводить в состав элюента глицерин в качестве консерванта, что приводит к увеличению вязкости жидкостей подвижной и неподвижной фаз, требует повышения рабочего давления и нередко ухудшает разрешение за счет затруднения диффузии. С уменьшением коэффициентов диффузии снижается и допустимая скорость элюции, увеличивается продолжительность хроматографического процесса, а вместе с ней — и вероятность денатурации. Следовательно, расширение зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул обусловлены главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения скорости элюции. В тех случаях, когда (при достаточно малых размерах гранул) скорость элюции за счет повышенного давления удается увеличить, не следует забывать о возможности денатурации макромолекул в результате их сжатия под высоким давлением. Важное для хроматографии различие между малыми молекулами и биологическими макромолекулами обусловлено полиэлектролитным характером последних. Наличие нескольких точек связывания макромолекулы с

сорбентом в случае обычной адсорбции или в ионообменной системе приводит к ряду специфических особенностей взаимодействия вещества с сорбентом. Во-первых, начинает сказываться стерическое соответствие между ними, например близость средних расстояний между взаимодействующими (сорбционными, ионогенными) группами на поверхности макромолекулы и на сорбенте, что диктует определенную конформационную избирательность процесса. Во-вторых, переход от прочной, почти полной сорбции вещества в неподвижной фазе к его преимущественному нахождению в подвижной может быть очень резким. Этот переход выражен тем резче, чем больше среднее число точек закрепления, связывающих макромолекулу с сорбентом. Постепенное увеличение силы элюента (например, концентрации вытесняющей соли) может длительное время оставаться без видимого эффекта, так как уменьшение среднего числа точек фиксации молекулы еще ее не освобождает. Затем, при достижении критического значения данного параметра элюции, происходит быстрое перераспределение вещества в пользу подвижной фазы. Это означает, в частности, что фракционирование макромолекул путем изократической элюции в большинстве случаев имеет мало шансов на успех. Подавляющее большинство макромолекул при данном выборе элюента либо уже будет находиться в подвижной фазе, либо окажется слишком прочно связанным с неподвижной фазой. Непрерывная линейная градиентная элюция здесь удобнее, так как она для одного белка за другим создает ситуацию, отвечающую быстрой десорбции. Сопоставляя непрерывную и ступенчатую градиентные элюции макромолекул, можно заключить, что первая из них, как правило, дает лучшее и более полное разрешение всех компонентов фракционируемой смеси — в результате

весьма заметного растягивания задних фронтов хроматографических пиков (из-за неравновесного распределения между фазами). Ступенчатая элюция, наоборот, позволяет получить острые пики с очень хорошим выходом, но нередко за счет качества разрешения близких по своим свойствам компонентов, особенно если «высота» ступеней велика и их расположение не слишком удачно. Еще одна особенность хроматографии макромолекул связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сетки гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гельфильтрации, однако в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом плане обычные микропористые обменники на основе силикагеля, стекла и полистирола существенно уступают крупнопористым матрицам из целлюлозы и даже декстрана.

2.3. Тонкослойная и бумажная хроматография Методы тонкослойной и бумажной хроматографии (ТСХ и БХ) основаны на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении растворителя (элюента). Растворитель перемещается под действием капиллярных или гравитационных сил. Разница между этими методами заключается лишь в способе формирования рабочего слоя. В ТСХ слой сорбента наносят на поддерживающую подложку (пластинку, пленку). В БХ роль рабочего слоя играет лист специальной бумаги для хроматографии. Преимущество ТСХ заключается в том, что

при небольших затратах можно быстро и эффективно разделять различные смеси.

Рис.1. Пластинка ТСХ. 1—фронт растворителя; 2 — пятно целевого вещества; 3 — стартовая точка; L — расстояние старт—фронту ' — расстояние старт—пятно целевого вещества.

Разделение в ТСХ осуществляется вследствие многократного пересечения молекулами веществ границы фаз твердая — жидкая или жидкая — жидкая, т.е. вследствие многократного распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами (рис. 1). Неподвижной фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хроматография), либо сорбент, покрытый жидкой фазой (распределительная хроматография). Систему растворителей подбирают в соответствии со свойствами разделяемых веществ. Полярные вещества следует разделять в полярных растворителях, малополярные — в менее полярных или неполярных растворителях. В различных системах растворителей вещества обладают различной подвижностью. Количественно подвижность выражается величиной Rf — фактором удерживания, равным отношению расстояний от

стартовой точки до середины пятна вещества (I) и от стартовой точки до линии фронта растворителя (L). Значение Rf практически не зависит от длительности проявления, но зависит от множества других факторов (в том числе и от влажности воздуха) и, следовательно, представляет собой лишь предварительную ориентировочную характеристику. Большинство химических соединений бесцветно, и для их обнаружения на пластинке используют различные физические и химические методы. Многие ароматические соединения имеют собственную флуоресценцию при 360 нм, при такой длине волны они обнаруживаются в виде желтых флуоресцирующих пятен на темном фоне. Большинство готовых ТСХ-пластинок содержит люминофоры; при облучении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 254 нм наблюдается равномерное желто-зеленое свечение. Вещества, поглощающие свет в ультрафиолетовой области, обнаруживаются в виде темных пятен на светлом фоне. Сорбенты, применяемые в тонкослойной хроматографии На ТСХ-пластинках сорбенты закрепляют при помощи неорганических или органических связующих материалов. Такой слой держится достаточно прочно, на нем можно даже делать пометки мягким карандашом. Результаты разделения хорошо воспроизводятся. Сорбционный слой поглощает летучие вещества из воздуха, поэтому пластинки нужно хранить соответствующим образом. Для большинства экспериментов вполне подходят стандартные пластинки. Пластинки высшего качества (высокоэффективные ТСХ-пластинки или ВЭТСХпластинки) используют лишь при количественном анализе. Свойства наиболее важных сорбентов для ТСХ приведены в таблице 4.

Таблица 4. СОРБЕНТЫ ДЛЯ ТСХ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКИ Сорбент Силикагель

Область Разделение неполярных веществ; выделение веществ, обладающих основными свойствами; рекомендуется использовать элюенты с основными свойствами Оксид алюминия Разделение слабополярных основных веществ Модифицирован Разделение полярных ный силикагель веществ в условиях обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ) Полиамид

Разделение веществ, образующих с амидными группами сорбента водородные связи

Примечания Неполярные вещества разделяют методом распределительной хроматографии

Поверхность сорбента сильнополярная Поверхность покрыта химически связанными углеводородными группами Элюирующие свойства растворителей возрастают в ряду: вода< метанол <ацетон<формамид <диметилформамид

нанолитров. Аналитическая тонкослойная хроматография. Основы метода Тонкослойная хроматография позволяет проводить определение веществ в пределах от 1 до 10 мкг, а на ВЭТСХпластинках — в пределах нескольких нанограммов. Стартовое пятно должно иметь минимальные размеры, так как при проявлении пластинки пятна размываются вследствие броуновского движения молекул вещества. Если пробу предполагается хроматографировать на силикагеле или оксиде алюминия (адсорбционная хроматография), то образец следует растворять в наименее полярном растворителе (например, гексане). В этом случае вещество сорбируется на носителе сразу после выхода из капилляра и формирует точечное стартовое пятно. Если анализируемый образец растворяется в неполярном растворителе неполностью, то плохо растворимые компоненты смеси зарегистрировать не удается и данные о составе смеси будут недостоверны. Прежде чем начать проявление, необходимо полностью удалить с пластинки растворитель, в котором была растворена проба. Для этого при определении термостабильных веществ используют фен или помещают пластинку на короткое время в сушильный шкаф, а при определении нестабильных веществ пластинку высушивают в вакуум-эксикаторе. При нанесении пробы рекомендуется: —при хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия растворять образец в наименее полярном растворителе; —наносить минимальный объем пробы ( ≈1 мкл); —пробу наносить узким капилляром (внутренний диаметр не более 0,5 мм) или при помощи шприца; —при разделении на ВЭТСХ-пластинках для точного дозирования пробы применять микродозаторыаппликаторы, рассчитанные на объем в несколько

2.4. Колоночная хроматография Методом колоночной хроматографии (впервые предложенной М.С. Цветом в 1906 г.) можно разделять смеси веществ как при определении их микроколичеств, так и с препаративной целью. Неподвижную фазу помещают в колонку, затем вносят в нее анализируемую смесь и элюируют подходящим растворителем. При продвижении по колонке компоненты смеси удерживаются сорбентом в соответствии с физико-химическими свойствами и поэтому мигрируют с разной скоростью. На выходе колонки разделяемые вещества появляются в определенной последовательности и могут быть собраны в виде отдельных фракций. В колоночной хроматографии конечный результат зависит не только от используемого принципа разделения (адсорбция, распределение, ионообмен или молекулярноситовое распределение, гель-хроматография), но и от множества других факторов: условий элюирования (скорость потока, температура, вязкость элюента); конструкции и размеров колонки; нагрузки на колонку (количество пробы); размера частиц сорбента; конструкции основных элементов хроматографической системы (блок ввода пробы, мертвый объем в соединительных шлангах и ячейке детектора); качества подготовки пробы к анализу. Качество разделения компонентов (эффективность колонки) зависит также от равномерности упаковки колонки и от скорости установления равновесия адсорбция—десорбция вещества. Мерой эффективности колонки служит число теоретических тарелок N. Эта величина удобна при сопоставлении колонок, заполненных сорбентом одного типа, но при помощи этой величины сопоставить разделяющую способность различных колонок невозможно. Качество колонки удобнее определять по высоте, эквивалентной

теоретической тарелке N. Чем меньше N, тем выше эффективность колонки. Качество разделения зависит также от селективности системы сорбент—элюент. На рис.2 указаны основные параметры, необходимые для описания процесса жидкостной хроматографии (параметры удерживания). Мерой оценки качества разделения служит разрешение R между двумя соседними пиками. В ВЭЖХ и газовой хроматографии используют понятие «время удерживания tуд», в жидкостной хроматографии низкого давления — понятие «объем элюции Vx», но между ними нет принципиальной разницы. Значения ω1 и ω2 — длины отрезков между точками пересечения двух касательных каждого пика с осью абсцисс; тогда разрешение R определяется по формуле: R = R2,1 = 2(tУД2 — t УД1)/( ω1 + ω2). Разрешение R — величина безразмерная. Взаимосвязь селективности и числа теоретических тарелок при заданном разрешении показана в табл.5. Разрешение R = 1, т.е. почти полное разделение двух соседних пиков, может быть достигнуто в зависимости от селективности системы при различном числе теоретических тарелок. При низкой селективности (α = 1,01) необходима колонка на 165 000 теоретических тарелок. Если селективность системы увеличивают путем оптимизации до α = 1,25, то для достижения аналогичной эффективности достаточно всего 400 теоретических тарелок. Следовательно, для эффективности разделения важнее не число теоретических тарелок, а селективность системы. Численное значение ВЭТТ зависит от условий элюирования и свойств разделяемых веществ. Колонки для ВЭЖХ имеют 10 000 —40 000 теоретических тарелок, а колонки для хроматографии низкого давления — несколько сотен теоретических тарелок.

Рис. 2. Разрешение пиков и параметры удерживания. t0 — время удерживания несорбируемого компонента; tуд —полное время удерживания; tУД2 и t УД1— время удерживания компонентов 1 и 2; а1 и а2 — высота пиков; b0,5 — ширина пика на половине высоты; ω1 и ω2— ширина пиков у основания. Таблица 5. ЧИСЛО ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ТАРЕЛОК, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ДОСТИЖЕНИЯ РАЗРЕШЕНИЯ R = 1 ПРИ РАЗЛИЧНОЙ СЕЛЕКТИВНОСТИ КОЛОНКИ α α 1,01 1,02 1,05 1,10

Nэфф. 163 216 41056 7056 1036

α 1,25 1,50 2,00

Nэфф. 400 144 64

Факторы, которые обеспечивают оптимальное разрешение в жидкостной хроматографии: • небольшие размеры частиц сорбента; • возможно более узкий фракционный состав; • небольшая скорость подачи элюента; • небольшая вязкость элюента (вследствие чего быстро устанавливается диффузионное равновесие); • возможно более высокая температура. 2.5. Жидкостная хроматография низкого давления В жидкостной хроматографии низкого давления компоненты смеси разделяют на хроматографической колонке при нормальном (гидростатическом) или несколько повышенном давлении. Хроматографию на мягких сорбентах, таких как сефадексы, биогели, агарозы и многие полистирольные гели, проводят при атмосферном давлении. Этот вид хроматографии применяют для переработки больших объемов жидкости, если не нужно высокое разрешение, свойственное ВЭЖХ. Во многих случаях удовлетворительное разрешение обеспечивается высокой селективностью системы сорбент—элюент. В лабораториях хроматографию проводят на сорбентах с частицами диаметром 40—60 мкм, на производстве — диаметром 100—200 мкм и более. При использовании частиц диаметром более 40 мкм достаточно высокая скорость подачи элюента обеспечивается гидростатическим давлением, определяемым высотой вертикального столба жидкости. Для хроматографии этого типа используют более простую аппаратуру, чем для ВЭЖХ, поэтому разрешение здесь несколько ниже, а продолжительность эксперимента несколько больше. Хроматографическая система для жидкостной хроматографии низкого давления включает резервуар или градиентный смеситель; насос; устройство ввода пробы;

колонку; детектор обнаружения веществ в элюате; самописец; автоматизированный коллектор для сбора фракций. В качестве соединительных шлангов между отдельными блоками хроматографической системы используют тефлоновые капилляры с внешним диаметром 1,6 мм и внутренним диаметром 0,3—0,5 мм. В хроматографии при заполнении колонки и подаче в колонку элюента (в том числе при регенерации) используют насосы. Перистальтические насосы широко применяются при биохимических исследованиях, так как в насосах этого типа исключается контакт элюента с металлом. В устаревших и дешевых моделях насосов жидкость подается путем прокатывания роликов по мягкому шлангу, вследствие чего шланг быстро изнашивается и его приходится заменять. Определенным достоинством обладают насосы с планетарным механизмом, где ролики воздействуют на шланг, прижатый к покрытому тефлоном желобу. Эластичный шланг прижимается роликом к желобу, жидкость в шланге перемещается в направлении движения ролика. Здесь исключаются принудительное растяжение и последующее сокращение шланга, в результате чего механический износ существенно меньше. Работа шланговых насосов ограничена давлением 200 кПа. Мембранные насосы обладают достаточной мощностью, они безинерционны, сравнительно дешевы. Корпус насоса выполнен из нержавеющей стали, поэтому в целом насос долговечен и пригоден для работы с разнообразными растворителями. Если присутствие ионов металлов в растворе нежелательно, корпус насоса изготавливают из инертных материалов (керамики или тефлона). В насосах этого типа ход поршня и частота перемещения регулируются раздельно. Следует отметить, что плавность потока (минимальная пульсация) достигается небольшим ходом поршня и высокой

частотой перемещения. В зависимости от особенностей конструкции насосы этого типа создают давление до 3,5 МПа. Пульсацию потока также компенсируют при помощи демпфирующего устройства. Колонки. Для эффективности разделения первостепенное значение имеет конструкция хроматографической колонки. Колонки, снабженные адаптером и краном для ввода пробы, более современны, чем стеклянные колонки, имеющие стеклянную пористую перегородку и тефлоновый шланг на выходе. Для изготовления деталей, контактирующих с органическими растворителями, используют инертные материалы, такие, как стекло, тефлон и нержавеющая сталь. 2.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ — метод разделения веществ на мелкозернистых сорбентах (с частицами размером менее 15 мкм) при повышенном давлении. Метод обеспечивает высокую эффективность и быстроту разделения определяемых веществ. Вследствие небольших размеров частиц сорбента и их однородности разделяющая способность ВЭЖХ-колонок существенно выше по сравнению с хроматографией низкого давления. Из-за высокого рабочего давления (десятки атмосфер) приборы для ВЭЖХ отличаются от приборов для классической колоночной хроматографии. Чем меньше частицы, тем меньше ВЭТТ и тем выше соответственно достигаемое разделение по всей колонке. Сорбент с частицами диаметром 5±1 мкм обладает более высокой разделяющей способностью, чем сорбент с более крупными и менее однородными частицами. Минимальный размер частиц равен приблизительно 3 мкм, поскольку более мелкие частицы образуют довольно стойкие конгломераты. Приготовление стабильных суспензий из частиц диаметром

менее 20 мкм удается только при обработке ультразвуком; работа с более мелкими частицами еще более сложная. Применение мелких и однородных фракций целесообразно во многих отношениях. Чем меньше размер частиц, тем меньше зависимость ВЭТТ от скорости потока элюента, поэтому в отличие от классической колоночной хроматографии скорость элюирования в ВЭЖХ существенно выше (рис. 3). Кривые на рис. 3 иллюстрируют зависимость ВЭТТ (Н) от скорости элюирования (U) при элюировании на сорбентах с частицами различного диаметра. При минимальном размере частиц (3 и 4 на рис.3) увеличение скорости потока несущественно влияет на изменение значения Н. Чем частицы крупнее, тем заметнее изменение значений ВЭТТ. Высокое разрешение и, следовательно, возможность использования коротких колонок позволяют ускорить процесс и уменьшить расход растворителей.

Рис. 3. Зависимость ВЭТТ (Н) от скорости элюирования (U) при элюировании на сорбентах с различными размерами частиц. 1 — зипак (37 мкм); 2 — силикагель (10 мкм); 3 — зорбакс (5 мкм); 4 — микросорб (5 мкм). Растворители для ВЭЖХ должны: - соответствовать стандарту «особо чистые растворители»,

2,0

50

40

1,5

30 1,0 20

Ацетонитрли (%)

Хроматографы для ВЭЖХ состоят из -насоса, обеспечивающего рабочее давление до 200 • 105 Па; -манометра, рассчитанного на 400 • 105 Па; -капилляров из нержавеющей стали (внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,3 мм); - устройства для ввода пробы (автосемплер); -колонок; - высокочувствительного детектора. Для всех вариантов ВЭЖХ, за исключением аффинной хроматографии, выпускаются специальные сорбенты. Нерегулярные и сферические сорбенты имеют размер частиц 5—10 мкм. Хроматографические детекторы представляют собой приборы, позволяющие выявлять целевые вещества в потоке элюента по характерным свойствам (цвету, флуоресценции, поглощении в ультрафиолетовой области спектра и др.). Для определения веществ многих классов применяют спектрофотометрические и рефрактометрический детекторы. Реже применяются детекторы других типов. Флюориметрический детектор регистрирует флуоресценцию веществ. Разнообразные электрохимические детекторы, например, проточные рН-детекторы; ион-селективные электроды для обнаружения некоторых видов ионов; проточные детекторы по электропроводности; вольтамперометрические детекторы, амперометрические детекторы, находят все более

широкое применение. Радиоактивационные детекторы регистрируют интенсивность β- и γ-излучения радионуклидов.

A 210 нм

- иметь минимальную вязкость, - обеспечивать максимальную селективность разделения; - не должны содержать взвешенных частиц (фильтрование на входе колонки на металлическом фильтре с порами диаметром менее 4 мкм) и комплексообразующих ионов (например, галогенид- или ацетат-ионы), способствующих коррозии металлических частей насоса.

0,5 10

0,0 0

15

30

45

60

0 мин

Рис. 4. Обращенно-фазовая ВЭЖХ фракции Л4-4

На рис.4 показано фракционирование препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ активной фракции Л4-4 пептидного биорегулятора, полученного из лимфатических узлов крупного рогатого скота, условно названного АФЛ. ВЭЖХ проводили, используя хроматографическую систему System Gold (Beckman, USA), на колонке Luna C18(2) (Phenomenex, USA) (2x250 мм), уравновешенную в 2%-ном растворе ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Элюцию веществ с колонки проводили линейным градиентом ацетонитрил-содержащего 0,08% ТФУ, от указанных начальных условий до 42% за 80 мин со скоростью 0,2 мл/мин. Детекцию осуществляли с помощью детектора на диодной матрице System Gold 168 (Beckman, USA) при длине волны 210 и 280 нм. Анализ второй производной спектра поглощения основного пика в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм

выявил в нем характерные для триптофана максимумы. Кроме того, спектр поглощения в указанном диапазоне длин волн позволяет идентифицировать в пиках такие аминокислоты, как фенилаланин и тирозин. 2.7. Газовая хроматография Газовая хроматография — метод разделения летучих веществ: газов (при нормальной температуре) или паров (при повышенной температуре). В качестве неподвижной фазы в газовой хроматографии применяют твердые материалы (насадочные или набивные колонки), твердые материалы, покрытые слоем жидкости, или капилляры с нанесенным на внутреннюю поверхность слоем жидкости (капиллярные колонки). В зависимости от состояния фаз различают газотвердофазную или газоадсорбционную хроматографию и газожидкостную или распределительную хроматографию. В качестве подвижной фазы используют газ-носитель, переносящий разделяемые вещества через колонку. Разделение анализируемой смеси происходит за счет различного времени удерживания веществ в неподвижной фазе. Газ и парообразные вещества в качестве подвижной фазы имеют ряд преимуществ по сравнению с жидкостью: —относительно малая вязкость газов и паров позволяет использовать колонки большей длины, чем в жидкостной хроматографии, что дает очень высокую эффективность разделения. Можно разделить достаточно сложные смеси, содержащие большое количество соединений одного класса (нефть, природный газ, природные жиры); —сильное различие свойств газов или паров (элюентов) и разделяемых соединений породило разнообразные методы детекции веществ, выходящих из колонки.

—ввиду специфичности и высокой чувствительности метода возможно определение компонентов в пробе с концентрацией порядка 1—10 пг (10 -12 — 10 -11 г). Газожидкостная хроматография дала возможность разделять смеси исключительно близких по свойствам веществ (изомеров, изотопно-замещенных соединений и др.). Современная газожидкостная хроматография применяется для анализа и разделения очень широкого круга веществ — от легких газов до высокомолекулярных компонентов нефти, топлива, триглицеридов жирных кислот, летучих производных многих металлов, а также с применением определенной пробоподготовки веществ, в обычных условиях нелетучих. В качестве элюента для газовых хроматографов используют сжатый газ из баллонов или генераторов газов (водорода, азота). Аналитическую колонку помещают в термостат с заданной температурной программой. Анализы проводят при температурах как ниже нуля при наличии соответствующего криогенного аппаратурного оформления, так и при температурах 350—400 "С и выше. Анализы наркотических и лекарственных веществ проводят при температуре от 100 до 250—300 "С. Газохроматографические колонки, применяемые в газожидкостной хроматографии, могут быть как набивными, так и капиллярными. -набивные колонки представляют собой металлические или стеклянные трубки длиной 0,2—5 м. Эти трубки заполнены инертными порошкообразными твердыми носителями с зернами 0,1—0,5 мм, на которые нанесены неподвижные жидкие фазы от 0,1 до 15—20% массы носителя. -капиллярные колонки представляют собой трубки длиной до 100 м и диаметром 0,1—0,5 мм, изготовленные из металлов, стекла, а в последние годы преимущественно из плавленого кварца. Внутренняя поверхность капилляров покрыта тонкой

пленкой неподвижной фазы строго заданной толщины. Большая толщина дает хроматографическую емкость, малая — низкий унос фазы, а следовательно, небольшой уровень шума. В качестве неподвижной фазы используют в основном силиконовые полимеры, причем часть метильных групп в этих полимерах может быть заменена фенильными, цианопропильными или трифтор-пропильными группами, это придает неподвижным фазам специфические селективные свойства, в частности, увеличивает их полярность. Во время нанесения неподвижной фазы в нее добавляют небольшое количество сшивающего агента (пероксид трет-бутила и т.п.), что приводит к сшиванию отдельных полимерных цепей и делает неподвижную фазу нерастворимой в органических растворителях, а также обеспечивает подшивку фазы к стенке капилляра. В нормальных условиях эти высокомолекулярные соединения представляют собой вязкие жидкости или студенистые массы. Их относительная молекулярная масса составляет от 100 000 до 500 000. Они хорошо растворимы в бензоле, хлороформе и метиленхлориде, термически устойчивы, что допускает рабочий температурный диапазон 300—350 °С. При изготовлении набивных колонок жидкие фазы наносят на твердый носитель в количестве от 2 до 10% массы носителя. При изготовлении же капиллярных колонок фазу наносят на стенки тонким слоем толщиной от 0,25 до 1,5 мкм. Газовый хроматограф состоит из: -газового баллона, содержащего подвижную инертную фазу (газ-носитель), чаще всего гелий, азот, аргон и др.; -редуктора, уменьшающего давление газа до необходимого; - манометров; -колонки, представляющей трубку, заполненную сорбентом или другим хроматографическим материалом;

-устройства для ввода пробы, термостата, детектора, самописца, расходомера. Для непрерывного измерения концентрации разделяемых веществ в газе-носителе в комплекс газового хроматографа входит несколько различных детекторов – детектор по теплопроводности, детектор электронного захвата, плазменноионизационный детектор, масс-спектрометры. Газовая хроматография — один из самых современных методов многокомпонентного анализа. Экспрессность, точность, необходимый предел обнаружения, достигаемый при использовании этого метода, позволяют решать многие аналитические задачи. Количественный ГХ-анализ можно рассматривать как самостоятельный аналитический метод, более эффективный при разделении веществ одного и того же химического класса (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.). Возможности газовой хроматографии существенно расширяются при использовании реакционной газовой хроматографии (РГХ) вследствие того, что многие нелетучие, термонеустойчивые или агрессивные вещества непосредственно перед введением в хроматографическую колонку можно перевести с помощью химических реакций в более летучие и устойчивые. Химические превращения осуществляют чаще на входе в хроматографическую колонку, иногда в самой колонке или на выходе из нее перед детектором. Значительно удобнее проводить химические превращения вне хроматографа. Недостатки РГХ связаны с появлением новых источников ошибок и увеличением времени анализа. 3. Атомно-абсорбционная спектрометрия, атомноэмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой в биохимическом анализе При определении металлических ядов в биоматериалах стоит сложная задача, связанная с необходимостью фиксации

малого сигнала из-за низких содержаний определяемого элемента одновременно с сильными фоновыми помехами, поступающими из внешней среды и от различных компонентов анализируемого образца. Для решения такой задачи необходимо применение высокочувствительных (с пределами обнаружения 1 — 100 мкг/л) и высокоточных (имеющих малую погрешность определения) методов элементного анализа, к которым в первую очередь относятся атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС) и атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП). ААС и АЭС-ИСП — мулыпиэлементные методы анализа, позволяющие определять несколько элементов одновременно. Кроме того, в ряде случаев этими методами можно проводить прямой анализ исследуемого объекта без предварительного выделения и концентрирования определяемого элемента. Атомно-спектральные методы анализа нашли широкое применение для контроля содержания тяжелых металлов и других элементов в объектах окружающей среды и биообъектах. 3.1. Основные принципы атомной спектрометрии Атомно-спектральные методы анализа основаны на измерении спектров электромагнитного излучения, обусловленных химической индивидуальностью определяемых компонентов. Возбуждение атомов пробы происходит при воздействии тепловой, электромагнитной, химической, электрической энергии и др. Все эти воздействия приводят к испусканию света частицами пробы. Рассмотрим этот процесс подробнее. Атом представляет собой ядро, окруженное электронами, которые находятся на атомных орбиталях с определенными уровнями энергии. Чем дальше от ядра расположена орбиталь, тем выше уровень ее энергии.

Когда электрон размещается на ближайших к ядру орбиталях с наименьшей энергией, атом находится в устойчивом, основном состоянии. При получении энергии в результате электромагнитного излучения или столкновения с другой частицей электрон перемещается с орбитали основного состояния на более удаленную орбиталь с более высоким уровнем энергии. При этом атом переходит в возбужденное состояние. Атом в возбужденном состоянии неустойчив, и электрон возвращается на орбиталь с меньшим уровнем энергии с испусканием электромагнитного излучения энергии hv. Световая (электромагнитная) энергия излучается атомами в виде линейчатого спектра с дискретными значениями длин волн. Для испускания квантов света определенной частоты, т.е. для появления в спектре определенной спектральной линии, необходима совершенно определенная энергия, которую называют потенциалом возбуждения. Величина потенциала возбуждения зависит от строения атома, массы и заряда ядра, числа электронов и других характеристик. Каждому виду атомов соответствуют характеристическое излучение, собственный ряд длин волн поглощения и эмиссии. Характеристическое излучение может наблюдаться в ультрафиолетовой и видимой частях электромагнитного спектра (160—800 нм).

3.2. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой В атомно-эмиссионной спектрометрии (АЭС, другое название метода — оптико-эмиссионная спектрометрия — ОЭС) анализируемая проба подвергается действию высоких температур, достаточных не только для диссоциации на атомы, но и для возбуждения и ионизации атомов.

Возвращаясь из возбужденного в состояние с меньшей энергией, атомы испускают электромагнитное излучение на определенных длинах волн, которое измеряется и используется для идентификации исследуемых элементов. Так как количество передаваемой от атома к атому энергии изменяется в широких пределах, разные атомы оказываются в различных возбужденных состояниях, т.е. их электроны находятся на разных энергетических уровнях. Эмиссионный атомный спектр крайне сложный, многолинейчатый, так как выделение энергии происходит со всех энергетических уровней, расположенных выше основного. В качестве источника возбуждения в АЭС используются: -пламя (2000-3000 °С); -печи (3000-4000°С); -электрические разряды, имеющие более высокую температуру, чем пламя и печи; -ИСП 10000 °С (в настоящее время применяется наиболее широко). Плазма — ионизированный газ с высокой энергией. Аргоновая плазма является идеальным источником возбуждения атомов вещества. Для получения аргоновой плазмы используют электрический разряд, который возникает в газе при наложении магнитного поля. Для этого к верхнему концу горелки подводится катушка индуктора, соединяемая с генератором радиочастоты. Электроны инертного газа захватываются магнитным полем и ускоряются. Такое увеличение энергии электронов называется индуктивным связыванием. Принцип работы атомно-эмиссионного спектрометра. Электромагнитное излучение, испускаемое возбужденными атомами пробы, фокусируется на входную щель диспергирующего устройства. Это устройство разлагает свет на составные части, превращая его в спектр. Такие устройства могут быть двух типов: призменные и дифракционные.

В призменных устройствах световой поток разлагается призмой вследствие разных показателей преломления для лучей разной длины волны. В дифракционных устройствах дисперсия происходит при попадании света на дифракционную решетку, которая представляет собой зеркало с близко расположенными линиями, нанесенными или вытравленными на его поверхности. Попадающий на дифракционную решетку свет отражается под углом, зависящим от длины волны и плотности линий решетки. У большинства приборов плотность составляет от 600 до 4200 линий на миллиметр. Дифракционные решетки имеют большую разрешающую способность, чем призмы. Излучение, разложенное диспергирующим устройством по длинам волн, фокусируется на плоскость или на круг (круг Роуланда) и затем регистрируется детектором. В монохроматоре используется только одна щель на входе и один детектор. При многоэлементном анализе на монохроматоре осуществляется последовательное сканирование от одной спектральной линии к другой. Это достигается либо изменением угла поворота дифракционной решетки при ее вращении, либо перемещением детектора в плоскости щели монохроматора при фиксированном положении решетки. Если на выходе спектрометра установлено множество щелей и детекторов, устройство называется полихроматором (квантометром). Каждая щель полихроматора настроена на одну эмиссионную линию определенного элемента, что позволяет одновременно анализировать более 30 элементов (в силу пространственных ограничений не более 60 щелей). Таким образом, основное преимущество полихроматора — экспрессность, недостаток — возможность анализа только на выставленных длинах волн. Преимущество монохроматора

— возможность анализa на любой длине волны (выбор свободной от помех линии) и более надежные результаты. Существует несколько способов наблюдения и регистрации спектров: визуальный, фотографический, фотоэлектрический, термоэлектрический и др. В современных спектральных приборах используется фотоэлектрический метод. Полученная с детектора информация обрабатывается компьютером, который также управляет прибором. Атомно-эмиссионная спектрометрия позволяет осуществлять качественный и количественный анализ пробы. 3.3. Атомно-абсорбционная спектрометрия Метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС), предложенный Уолшем в 1955 г., основан на явлении селективного поглощения свободными атомами ультрафиолетового и видимого излучения. Если на свободные атомы подействовать пучком света от специального источника излучения, то эти атомы будут поглощать световую энергию. Уолш, рассчитав соотношение числа атомов в возбужденном состоянии и числа атомов в основном состоянии, показал, что оно очень мало даже при 3000 К и составляет для разных элементов 10-3—10-5. При воздействии энергии на атомный пар, когда основная масса атомов находится в невозбужденном состоянии, наиболее вероятны абсорбционные переходы электронов с основного уровня на самый низкий возбужденный уровень. Линии, соответствующие этим переходам, называются резонансными. Поглощение энергии атомами, находящимися в возбужденном состоянии, происходит очень редко. Обычно атомно-абсорбционные спектры гораздо проще эмиссионных и состоят преимущественно из резонансных

линий. Благодаря этому уменьшается вероятность наложения линий других элементов и появления спектральных помех. Таким образом, если в АЭС концентрация вещества связывалась с интенсивностью излучения атомов, находящихся в возбужденном состоянии, то в ААС аналитический сигнал (уменьшение интенсивности излучения) связан с числом атомов, находящихся в основном (невозбужденном) состоянии. Бесспорным преимуществом ААС является меньшая температурная зависимость абсолютного количества невозбужденных частиц по сравнению с количеством возбужденных частиц. Этим объясняется более высокая чувствительность ААС по сравнению с АЭС. Атомно-абсорбционные спектрометры состоят из источника линейчатого спектра (в отличие от атомноэмиссионных спектрометров, в которых анализатор является одновременно источником возбуждения); атомизатора, который служит для перевода пробы в атомный пар; монохроматора, выделяющего область спектра с резонансной линией определяемого элемента; фотоэлектрического детектора, преобразующего электромагнитное излучение в электрический сигнал. В качестве атомизаторов наибольшее распространение получили пламенные и электротермические атомизаторы. Для определения содержания элементов в анализируемой пробе в ААС применяют методы градуировочного графика или метод добавок. Метод градуировочного графика. Для построения градуировочного графика готовят серию растворов сравнения (3—5 растворов), содержащих те же компоненты, что и анализируемый раствор. Измеряют оптические плотности растворов и строят график в координатах А — С. В тех же условиях измеряют сигнал абсорбции анализируемого раствора и по градуировочному графику находят его концентрацию.

Метод добавок применяется при анализе сложных по составу объектов, когда не удается устранить мешающее влияние матрицы. При этом от анализируемого раствора отбирают несколько аликвотных частей и добавляют к ним известное количество определяемого компонента. Добавка должна быть в 1,5 раза больше определяемого содержания. В одну из аликвот добавку не вводят. Затем проводят измерение приготовленных растворов и находят содержание определяемого компонента вычитанием заранее известного содержания добавки.

4. Масс-спектрометрия элементного анализа Масс-спектрометрия является одним из наиболее универсальных и информативных методов анализа веществ. Сегодня этот метод анализа используется во всех сферах человеческой деятельности (табл. 6). Основное отличие масс-спектрометрии от других физико-химических методов состоит в том, что оптические рентгеновские анализаторы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а массспектрометрия определяет сами частицы вещества (молекулы, атомы) и основана на разделении атомов различных элементов по отношению массы к заряду. Так как атомы различных элементов имеют неодинаковую массу, их можно отличить друг от друга. В процессе анализа измеряется отношение массы частицы к заряду, для чего используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном и электрическом полях. Следовательно, для проведения масс-спектрального анализа необходимо прежде всего перевести нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы — ионы. Этот

процесс называется ионизацией и по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ. Масс-спектрометр состоит из ионного источника, массанализатора, детектора и системы управления и обработки данных (рис. 5). Интерфейс ГХ - МС

масс-анализатор

Рис. 5. Схема устройства масс-спектрометра с ионным источником электронного удара, квадрупольным анализатором масс, электронным умножителем непрерывного типа. Ионный источник. Для получения ионов в массспектрометрах наиболее часто используется ионизация посредством электронного удара или химическая ионизация. До настоящего времени большинство масс-спектров получали в результате ионизации электронным ударом. Масс-анализатор: Для разделения ионов, образовавшихся в ионном источнике, используются магнитные, электростатические, времяпролетные, ионно-циклотронного резонанса и квадрупольные анализаторы (модификации на основе квадрупольных анализаторов масс). Наибольшее распространение получили квадрупольные анализаторы. В них осуществляется разделение ионов в результате их различного поведения в поле высокочастотного и постоянного тока.

Таблица 6. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МАСССПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА (по данным фирмы «Finnigan») Область применения Биохимия Клиничес кая химия

Объект анализа Дрожжи

жх/мс/мс

Моча

мс/мс

Биологические жидкости

Косметика

Медицина

Пищевые продукты

Метод анализа

Зерно

Биологические жидкости человека

исп-мс

жх/мс

мс/мс

Определяемые компоненты Протеом дрожжей Наркотики: мепередин, кокаин, нордиазепам, кодеин, морфин и др.

Комментарии Исследован 131 протеин

Исследование профессионального риска и функциональных нарушений

Микотоксин — фумонизин В1

Определение низких концентраций в сложной матрице Исследование баланса липопротеинов в крови, гормональная терапия.

Витамин D

Область применения

Корма для скота

жх/мс

Прямой анализ

Коньяк

жх/мс

Сиреневый Изучение возраста и альдегид, ванилин, места изготовления эфиры высших коньяков и бренди кислот

Мясные продукты

жх/мс

Кленобутерон

Контроль ароматических стероидов в животноводстве

Объект анализа Моча

Метод анализа гх/мс/мс

Криминалистика

Отсутствует влияние матрицы, пределы обнаружения 0,01 мг/л

Следовые количества элементов

Гормоны: эстром, эстрадиол

Продолжение табл. 6

Моча

гх/мс/мс

Кровь

гх/мс/мс

Фармацевтика

Биологические образцы

МС/МС

Токсикология

Коровье молоко, почва Осадочные породы

гх/мс/мс

Экология

Грунтовые и поверхностные воды Моча

ИСП-МС

жх/мс/мс

ИСП-МС

Определяемые Комментарии компоненты Допинговые Определяемый агенты: 19уровень 0,2 мг/мл норандростерон эпиметендион, 3-гидроксистомазол Анаболические Предел обнаружения стероиды 1 мг/мл Марихуана Однозначная идентификация, предел обнаружения Дексаметазон, Определяемый преднизолон диапазон 0,01— 0,5 мкг/мл 2,3,7,8-замещен- Определяемое ные диоксины и содержание 2 фураны пг/мкл Радионуклиды Исследование плутония источников ядерного загрязнения Пестициды: Определяемые фенилмочевина, содержания метилкарбаматы 0,08-3,6 мг/л ,триацины Уран Мониторинг заражения окружающей среды обедненным ураном, используемым в современном вооружении

Примечание. ЖХ/МС - масс-спектрометрия с жидкостной хроматографией, ИСП-МС - масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой, ГХ/МС - масс-спектрометрия с газовой хроматографией, МС/МС - тандемная масс-спектрометрия

В настоящее время все большую популярность приобретают времяпролетные масс-анализаторы, в которых заряженные частицы движутся в бесполевом пространстве. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточно большую кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство все ионы имеют одинаковую кинетическую энергию, в зависимости от массы будут двигаться с разными скоростями и в разное время достигнут детектора, который расположен в конце трубы их пролета. Измерив время пролета, можно посчитать массу зарегистрированных ионов. Все процессы происходят за миллионные доли секунды. Такой масс-спектрометр является экспресс-анализатором. Другое его преимущество — возможность определять широкий диапазон масс, в том числе очень больших органических молекул. В масс-спектрометрах используют детекторы различных типов, но наибольшее распространение получили электронные умножители дискретного диодного и непрерывного диодного типов. Оба этих устройства обеспечивают большое усиление (до 107), что позволяет детектировать чрезвычайно малые ионные токи. 4.1. Разновидности масс-спектрального анализа Очевидно, что масс-спектрометрия с различными источниками ионов и масс-анализаторами является универсальным методом исследования, позволяющим анализировать твердые, жидкие и газообразные вещества. Масс-спектры неорганических веществ малолинейчатые и простые по сравнению со спектрами органических веществ со сложной структурой. При развитии метода за последние 20 лет на первом этапе органическая масс-спектрометрия вытеснила неорганическую, а теперь им первое место выходят массспектральные исследования больших молекул. Особый интерес

вызывают природные соединения, пептиды и протеины, полисахариды и полинуклеотиды (рис.6). Для анализа жидкостей применяется высокоэффективная масс-спектрометрия с формированием ионного пучка в индуктивно-связанной плазме. Этот метод сочетает низкие пределы обнаружения с хорошей воспроизводимостью результатов. Для анализа газовых или парогазовых сред применяют масс-спектрометр если источником ионов служит электронная пушка. Из-за мешающего влияния высокого парциального давления основы прямой масс-спектральный анализ не дает хороших результатов. Для достижения пределов обнаружения примесей на уровне 10-6—10-7% предварительно концентрируют примеси. Для решения таких задач используют гибридные методы, сочетающие масс-спектрометрию с выделением и концентрированием: газовая хроматография с масс-спектрометрией - метод ГХ/МС, с помощью которого сложную трехсоткомпонентную смесь можно разделить и идентифицировать компоненты, если даже содержание компонентов в пробе составляет около 10-12 г. При хроматографии происходит предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые фракции. жидкостная хроматография с масс-спектрометрией метод ЖХ/МС используется когда некоторые органические соединения невозможно разделить с помощью газовой хроматографии.

Рис. 6. Масс-спектограммы биорегулятора в диапозоне молекулярных масс 1474 - 4211 Да (смыв 80% ацетонитрилом 0,1% ТФУ)

a.i.

18000

16000

Масс-спектры фракций (L1 и L2) пептидного биорегулятора АФЛ были получены на МАЛДИвремяпролетном масс-спектрометре Ultraflex BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (337 нм). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс – 0.02 % (внешняя калибровка).

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0 1000

1500

2000

2500

3000

3500

/H=/Marina/07_12_04/Bitueva_L_gf1/0_M1/1/1SRef/pdata/1

4000

4500

Administrator

5000

5500

6000

6500

m/z

Fri Dec 10 11:25:01 2004

L1 a.i.

25000

20000

15000

10000

тандемная масс-спектрометрия (МС/МС), когда массанализаторы выстраиваются друг за другом. При анализе сложной органической молекулы ее разрывают на фрагменты и выделяют в первом масс-анализаторе те, которые представляют интерес. Во втором масс-анализаторе эти фрагменты разбивают на более мелкие и сортируют по массам. Однако последовательных масс-анализаторов иногда недостаточно для того, чтобы расшифровать структуру молекул. В этом случае используют ионные ловушки, с помощью которых можно удерживать представляющие интерес ионы, а остальные выбросить из нее. Оставшиеся в ловушке ионы можно подвергнуть деструкции (управляемая фрагментация), зарегистрировать их, оставить в ловушке те, которые представляют интерес, остальные выбросить и т.д. 5. Методы ДНК-диагностики

5000

0 1000

1500

2000

2500

3000

3500

/H=/Marina/07 12 04/Bitueva L gf2/0 M2/1/1SRef/pdata/1

L2

4000

4500

Administrator

5000

5500

6000

Fri Dec 10 11:36:31 2004

6500

m/z

Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Сегмент ДНК, детерминирующий определенный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последова-

тельность и может служить диагностическим маркером. ДНКдиагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей и использует ряд быстрых и надежных диагностических методов: гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод ПЦР/ЛОЗ, ПЦР в реальном времени. 5.1.Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК Процедура гибридизации состоит из: 1. Фиксации одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре. 2. Нанесении меченой одноцепочечной ДНКзонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью. 3. Промывании фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда. 4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень. В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть очень специфичной и высокочувствительной. Гибридизационные зонды Для обеспечения адекватности диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичными, т.е. необходимо, чтобы зонд

гибридизовался только последовательностью.

с

искомой

нуклеотидной

Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последовательности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты. Наиболее удобно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. В настоящее время с успехом проводят гибридиз ДНКмишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). 5.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР - это метод, который позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его.

Принцип метода Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное дополнение обеих. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический только для данного вида (но не для других видов) участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок. Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в исследуемую пробу праймеры находят в растворе участок, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединиться, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента - Taq - полимеразы специфического фрагмента ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 106 копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Механизмы ПЦР ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). Пятью основными компонентами ПЦР являются следующие: а) фермент Taq-ДНК- полимераза; б) пара олигонуклеотидных праймеров; в) 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); г) копируемая ДНК; д) ионы Mg+2. Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло. Модельная система, используемая в ПЦР и отражающая реальные биологические процессы репликации ДНК, включает три стадии: • денатурацию духцепочечной молекулы ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК). • гибридизацию (отжиг) праймеров с матричной ДНК (образование двухцепочечных "комплексов" праймерматрица, необходимых для инициации синтеза ДНК); • достраивание (удлинение, элонгация) комплиментарных цепей в направлении от 5' -конца к 3' -концу цепи, начиная с участков присоединения праймеров, при помощи ДНК-полимеразы. Многократное (циклическое) повторение этих трех стадий приводит к экспоненциальному обогащению смеси молекулами ДНК-мишени, поскольку в каждом новом цикле в качестве матрицы выступает не только исходная ДНК, но и ДНК, синтезированная в предыдущих циклах. Необходимо примерно 30-35 циклов (это 108 молекул ампликонов) для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Праймеры - это короткие, длиной 20-30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплиментарные 3'-концам цепей копируемой ДНКматрицы, благодаря которым ограничивается фрагмент ДНК, который будет миллионы раз скопирован ферментом TaqДНК - полимеразой, присоединяющейся к 3'-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований. Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК- матрицы (ампликоны), то они в реакционной смеси ПЦР присутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5 - 1,0 мкМ. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплиментарными участками ДНКматрицы, образуя даухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием ГЦ-пар и рассчитывается по следующей формуле: Т=[(A+T) x 2] + [(Г+С) х 4] - 5Ц (К.Itakura et al).

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих заболеваний за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК. Тест-системы, основаны на принципе амплификации ДНК, позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно. Это преимущество достигается за счет: высокой чувствительности ПЦР - системы, которая составляет около 10- 1000 бактериальных клеток, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов колеблется в пределах 103-105 клеток; высокой специфичности ПЦР, обусловленной тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов; универсальности процедуры выявления различных возбудителей; высокой скорости получения результатов анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа.

Определение можно проводить непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы) и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва, пищевые продукты). 5.3. ПЦР в реальном времени. На сегодня существует метод, превосходящий по своим возможностям ПЦР - это метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество. Отличительными чертами данного метода являются - возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, - отсутствие стадии электрофореза, - менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории - автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно

проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции. Использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Оборудование Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации. На сегодня существует немного моделей приборов для ПЦР в реальном времени: это "iQ iCycler" ("Bio-Rad"), несколько типов "ABI Prism" ("Applied Biosystems"), "LightCycler" ("Roche"), "SmartCycler" ("Cepheid"). Каждый из этих приборов обладает рядом достоинств и недостатков.

флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'положении блокирует полимеразу. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение. 2. Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons).

Детекция продуктов амплификации. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы: 1. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay). Данная методика основана на использовании 5'экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель

Данная методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, поэтому при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют шпильки. Внутренняя область зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. При отжиге праймеров зонды, не присоединившиеся к ДНК матрице, остаются в "схлопнутом" состоянии, так что происходит тушение флуоресценции. Те же зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные

стороны. Таким свечения.

образом, увеличивается

интенсивность

3. Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 13 нуклеотида. При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа. 4. Использование интеркалирующих агентов. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации. Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).

5.4. Метод ПЦР/ЛОЗ Для обнаружения однонуклеотидных замен применяют подходы, объединяющие ПЦР и метод, основанный на дотировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ) - ПЦР/ЛОЗ. Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена — G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к данному сайту и комплементарных противоположным цепям. Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что 3'-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а 5'-концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примыкающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей нормальную последовательность ДНК-мищенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНК-лигазы зонды X и Y ковалентно сшиваются. Если же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го нуклеотида то некомплементарный ему 3'-концевой нуклеотид зонда X не может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды X и Y. Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью.

Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсутствие лигирования. Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец зонда X метят биотином, а 3'-конец зонда Y — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все его стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день. Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование при 65 "С. затем повышают температуру до 94 °С, чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд— ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для

гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклов накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых» зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза. Если комплементарность неполная, то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет.

ВОПРОСЫ ТЕОРЕТИЧЕСКОГО КОЛЛОКВИУМА ТЕМА 1. веществ

Хроматографические

методы

определения

1. Классификация хроматографических методов по принципу фракционирования 2. Физико-химические основы хроматографии. 3. Концепция теоретических тарелок 4. Выбор принципа разделения анализируемых веществ. 5. Факторы, обуславливающие выбор системы элюентов. 6. Материалы матриц сорбентов и обменников • Целлюлоза • Гели на основе декстрана (сефадексы) • Агароза • Полиакриламидный гель • Полистирольные смолы • Полиамидные смолы • Силикагель • Окись алюминия • Пористое стекло 7. Зависимость оптимизации условий фракционирования от параметров колонки и размера гранул. 8. Зависимость протекания хроматографического процесса от качества набивки и загрузки колонки. 9. Особенности хроматографии макромолекул. 10. Принцип метода ТСХ и его преимущества. 11. Сорбенты для ТСХ и их характеристики 12. Основы метода аналитической ТСХ. 13. Разделение смеси веществ методом колоночной хроматографии. 14. Основные параметры, необходимые для описания процесса жидкостной хроматографии. 15. Применение жидкостной хроматографии низкого давления.

16. Описать хроматографическую систему для жидкостной хроматографии низкого давления. 17. Особенности проведения ВЭЖХ. 18. Хроматографы для ВЭЖХ. Описание и принцип работы системы. 19. Эффективность разделения смеси методом газовой хроматографии. 20. Принцип метода газовой хроматографии ТЕМА 2. Атомно-абсорбционная спектрометрия, атомно-эмиссионная спектрометрия, масс-спектральный анализ 1. Основные принципы атомной спектрометрии. 2. Преимущества методов ААС и АЭС-ИСП. 3. Принцип действия атомно-эмиссионного спектрометра. 4. Виды диспергирующих устройств в АЭС-ИСП. 5. Детекторы, используемые в АЭС-ИСП. 6. Принцип метода атомно-абсорбционной спектрометрии. 7. Атомно-абсорбционные спектрометры, устройство, принцип работы. 8. Виды атомизаторов. 9. Методы определения содержания элементов в пробе в АСС. 10. Возможности метода АСС. 11. Области применения масс-спектрального анализа. 12. Характеристика процесса ионизации. 13. Устройство масс-спектрометра. Основные характеристики масс-спектрометров. 14. Характеристика времяпролетного масс-анализатора. 15. Разновидности масс-спектрального анализа. 16. Гибридные методы, сочетающие масс-спектрометрию с выделением и концентрированием.

17. Этапы проведения хромато-масс-спектрометрического анализа. 18. Преимущества метода ГХ/МС. 19. Тандемная масс-спектрометрия. Принцип метода. 20. Особенности масс-спектрального анализа. ТЕМА 3. Методы ДНК-диагностики 1. Основные методы ДНК-диагностики 2. Охарактеризуйте сущность метода гибридизации нуклеиновых кислот. 3. Характеристика гибридизационных зондов. 4. Общая характеристика метода ПЦР 5. Принцип метода ПЦР 6. Схема амплификации ДНК 7. Электрофорез как метод детекции продуктов амплификации. 8. Что означают чувствительность, специфичность и простота применительно к диагностическим тестам? 9. Изложите принцип метода ПЦР/ЛОЗ. 10. Преимущества метода ПЦР в реальном времени. 11. Подходы, используемые для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени. 12. Почему использование флуоресцентных красителей облегчает обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей?

ЗАДАНИЯ ТЕКУЩЕГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ ТЕМА 1. Хроматографические методы определения веществ Выберите параметры очистки и фракционирования белков методом: 1. Гель-фильтрационного разделения; 2. Распределительной хроматографии; 3. Тонкослойной хроматографии; 4. Ионообменной хроматографии; 5. Адсорбционной хроматографии; 6. Аффинной хроматографии. Выберите параметры очистки и фракционирования нуклеиновых кислот методом: 7. Гель-фильтрационного разделения; 8. Распределительной хроматографии; 9. Тонкослойной хроматографии; 10. Ионообменной хроматографии; 11. Адсорбционной хроматографии; 12. Аффинной хроматографии. Охарактеризуйте основные параметры хроматографического процесса: выбор матрицы, размеры колонки, выбор элюента, скорость элюции. ТЕМА 2. Масс-спектрометрические технологии исследования биомакромолекул. 1. Опишите возможности масс-спектрометрии в биологии 2. Основные задачи масс-спектрометрии в протеомике, как дисциплины включающей набор высокотехнологичных методов изучения белков. 3. Основные методы ионизации в масс-спектрометрии в зависимости от размера молекул

4. Возможности протеомике.

масс-спектрометрии

в

медицинской

ТЕМА 3. Методы ДНК-диагностики Разработать простой, чувствительный и воспроизводимый тест: 1. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях и продуктах их переработки при амплификации фрагмента 35S-промотора генетически модифицированных источников в семенах растений; 2. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях и продуктах их переработки при амплификации фрагмента NOS-терминатора; 3. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях и продуктах их переработки при амплификации фрагмента маркерного гена NPTII; 4. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях и продуктах их переработки при амплификации фрагмента гена устойчивости к гербициду Раундап (глифосат)CP4; 5. Для обнаружения фрагмента ДНК сои в растениях и продуктах их переработки при амплификации фрагмента гена лектина; 6. Для обнаружения путем амплификации фрагмента гена зеина в растениях кукурузы и продуктах ее переработки; 7. Для обнаружения путем амплификации фрагмента гена пататина в растениях картофеля и продуктах его переработки; 8. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях кукурузы и продуктах ее переработки при

амплификации фрагмента гена cryIa устойчивости к насекомым отряда чешуекрылых; 9. Для обнаружения трансгенной ДНК в растениях картофеля и продуктах его переработки при амплификации фрагмента гена cryIIIa устойчивости к насекомым отряда жесткокрылых; 10. Для количественного определения гена СР4 в трансгенной сое; 11. Для обнаружения и идентификации тканей крупного рогатого скота в кормовом и пищевом сырье и готовой продукции; 12. Для обнаружения и идентификации тканей свиней в кормовом и пищевом сырье и готовой продукции; 13. Для обнаружения и идентификации тканей кур в кормовом и пищевом сырье и готовой продукции. Необходимо использовать методы, позволяющие выявлять ДНК при его минимальном содержании в кормовом и пищевом сырье. Опишите и обоснуйте последовательность ваших действий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

12

Щербаков В.Г., Лобанов В.Г. и др. Биохимия растительного сырья.

1999

М., Колос

13

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопным методом Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.

1983

М., Мир

1985

Изд-во Наука, Москва

Рекомендуемая литература № n/n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Автор, название Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии: в 3-х томах. Ленинджер А. Основы биохимии. Т.1,2,3. Страйер Л. Биохимия: в 3-х томах. Николаев А.Я. Биологическая химия. Николаев А.Я. Биологическая химия. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Филиппович Ю.Б., Егорова А.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. Кретович В.Л. Биохимия растений.

Год издания 1998

Изд-во

Место хран. Чит.зал, абонем. Биб-ки ВСГТУ

1987

Москва, Медицина М., Мир

1985

М., Мир

1985

М., Мир

14.

2001 1989

М., Медицина М., ВШ

15.

1985

М., ВШ

Землянухин Практикум по биохимии.

1999

М., Агар»

16.

1998

М., ВШ

1982

М., Просвеще ние М., ВШ

Жамсаранова С.Д., Пластинина З.А. Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии

1999

А.А. 1985 общей 2003

Изд-во Ворон. унив-т Изд-во ВСГТУ, Улан-Удэ

высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография, атомно-абсорбционная спектрометрия, тандемная масс-спектрометрия, полимеразная цепная реакция

Подписано в печать 18.12.2006 г. Формат 60Χ84 1/16. Усл.п.л. 4,18. Тираж 50 экз.

Заказ №310 -----------

Издательство ВСГТУ. 670013. г.Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40,в. © ВСГТУ, 2006