Современные методы микробиологических исследований: Учебно-методическое пособие

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Учебно-методическое пособие для вузов

Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2007

Утверждено научно-методическим советом факультета 26 апреля 2007 г., протокол № 8

биолого-почвенного

Составители: А.В. Семенихина, Т.И. Рахманова, Г.И. Нехаева, Т.Н. Попова

Научный редактор доц. М.Ю. Грабович

Практическое пособие подготовлено на кафедре аналитической и медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов 3, 4 курсов дневного и 4, 5 курсов вечернего отделения биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Для специальности: 011600 (020201) – Биология

2

СОДЕРЖАНИЕ Введение .............................................................................................................3 Тема 1. Иммунологические методы в микробиологической диагностике ..5 Тема 2. Молекулярно-генетические методы в микробиологической диагностике .......................................................................................................34 Литература .......................................................................................................66 ВВЕДЕНИЕ Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удастся ли обнаружить специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов. Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. Следовательно, для выявления микроорганизмов требуется рутинная практика культивирования, причем таким образом возможна идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК. Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для практического применения.

3

Таблица 1 Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами Метод Преимущества Недостатки Трудоемкость, MикроскопиПростота. ческое Прямое выявление длительность. исследование паразитических Низкая микроорганизмов. чувствительность. Возможность разграничения Невозможность микроорганизмов по разграничения сходных морфологическим признакам микроорганизмов. Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов анализа, Культивирова- Обнаружение только Длительность высокая стоимость. ние in vitro и жизнеспособных Потеря иммунизация паразитических жизнеспособности в мышей микроорганизмов. Возможность определения организме животного. вирулентности и Невозможность инфекционности использования разных животных. Использование животных Не всегда специфичен. Определение Простота, Невозможность антител в непродолжительность разграничения острой и сыворотке анализа. форм Возможность автоматизации. латентной Возможность тестирования инфекции большого числа образцов стоимость Гибридизация Быстрота, высокие Высокая и ПЦР чувствительность и анализов, многоэтапность. специфичность. Прямое обнаружение Невозможность различить живые и паразитических мертвые микроорганизмов. Возможность разграничения микроорганизмы. разных видов. Возможность получения Независимость результатов от ложноположительных и ложноотрицательных предыдущих инфекций. Не требуют жизнеспособности результатов паразитов. Возможность автоматизации 4

ТЕМА 1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов. Применение данных систем возможно при условии, что анализируемый компонент должен обладать свойствами антигена, то есть способностью вызывать в организме человека или животных синтез особых белков – антител, с высокой специфичностью связывающих антиген. В качестве антигена могут быть клетки микроорганизмов, вирусы, белки и полисахариды. Это полноценные антигены. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности – антигенным детерминантам (эпитопам). Такие участки у белков включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные детерминанты разветвленных молекул полисахаридов представлены цепочками из четырех-шести остатков. Существуют также неполноценные антигены – гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их посадке на полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты. Таким способом можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам и т. д. Гаптены представлены не только низкомолекулярными соединениями. Так, нуклеиновые кислоты сами по себе неиммуногенны. Однако антитела к нуклеиновым кислотам синтезируются, если они находятся в комплексе с белками. Антигенные детерминанты нуклеиновых кислот – три- и тетрануклеотиды. Выделение и очистка антигена для создания диагностикума достаточно трудоемкий процесс. В настоящее время данные задачи решаются с помощью методов биотехнологии путем создания генноинженерных (трансгенных) бактерий или дрожжей, синтезирующих антиген в необходимых количествах. Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению. Это иммуноглобулины (Ig) классов G, D, E, A, M, из которых первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть двухвалентны, IgA – четырех- или восьмивалентны, IgM – десятивалентны. С учетом того, что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных 5

детерминант, можно представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одного антигена. Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его генетических особенностей и физиологического состояния. Антитела получают в лабораторных условиях путем иммунизации следующих животных соответствующим антигеном: мыши, морские свинки, кролики, овцы, козы, лошади. Пригодны куры: антитела после иммунизации выделяют из желтков яиц. Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется аффинная хроматография. Сыворотка крови от иммунизированного животного пропускается через колонку с полисахаридным носителем, к которому ковалентно пришит антиген. Специфические антитела связываются антигеном, все другие белки, в том числе антитела с низким сродством к антигену, проходят через колонку, вслед за этим специфически связанные антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором: связь антигена с антителом нековалентна. Один цикл аффинной хроматографии позволяет очистить белки в 1000 раз и более. Однако даже такой способ очистки не позволяет полностью избавиться от гетерогенности препарата антител. Антитела с одной специфичностью, реагирующие с единственной антигенной детерминантой (моноклональные), получают методами клеточной инженерии путем гибридизации иммунокомпетентных B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению, неограниченному числом делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физико-химических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с «чужими» антигенами. Это высокотехнологичный продукт. Его недостаток – зачастую сравнительно низкое сродство к субстрату, низкая аффинность. Все иммуномикробиологические методы (ИМ) можно разделить на 3 группы: – ИМ, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.); – ИМ, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

6

– ИМ с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы, спиниммунологический и другие методы). Реакция агглютинации (РА) Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы: специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза); неспецифическая (видимая) фаза – образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0,85 % растворе натрия хлорида. РА можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микробы. Ориентировочная РА для идентификации микроба Реакция служит для предварительного определения вида микроба. На предметное стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (т. е. сыворотку, содержащую только специфические антитела). Сыворотку разводят 1 : 10 и рядом наносят каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2–4 мин учитывают результат. При положительной реакции (соответствие исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть. Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают L-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеивание – наступает «кислотная» агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с изотоническим раствором хлорида натрия. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) РНГА является своеобразной модификацией РА. Сущность реакции состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат. В последнее время РНГА получила 7

широкое распространение благодаря высокой чувствительности, экспрессивности и простоте постановки. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных двукратных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю – 0,5 мл физиологического раствора (контроль). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном – оседают в виде пуговки или колечка (табл. 2). Таблица 2 Постановка реакции непрямой гемагглютинации Номера лунок панели Контроли Ингредиенты 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 1-й 2-й Изотонический 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 раствор натрия хлорида, мл Исследуемая 0,5→ 0,5→ 0,5→ 0,5→ 0,5↑ Иммунный диагноссыворотка в тикум 0,5 разведении 1 : 25, мл Полученное 1 : 5 1 : 10 1 : 20 1 : 400 1 : 800 разведение 0 0 0 сыворотки Эритроцитарны 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 й диагностикум, мл Инкубация при 37 °С в течение 2 ч в термостате Титр сыворотки 1 : 100. На эритроцитах можно адсорбировать не только антигены, но и антитела. В данном случае РНГА можно применять для индикации патогенных микробов во внешней среде. Для этого IgG сыворотки фиксируют на поверхности эритроцитов барана. Разрешающая способность экспресс-индикации антигенов составляет несколько тысяч микробных тел в 1 мл. Задания для выполнения лабораторной работы 1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации изучаемых чистых культур бактерий. Сделать заключение по результатам реакции. 2. Протоколировать и оценить результаты реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), поставленной с целью серодиагностики. Сделать заключение по результатам реакции. 8

Наряду с представленными выше методами в микробиологической диагностике используют следующие иммунологические методы: реакция преципитации в геле, лизиса, связывания комплемента, Кумбса, флоккуляции, антистрептолизиновая, торможения гемагглютинации, принципы которых представлены далее. Так, в основе реакции преципитации в геле лежит иммунодиффузия в агаровом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специфичности, что приводит к образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов. Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические – испытуемые сыворотки. Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента (РСК) используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна и полностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56 °С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген-антитело его действие проявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корпускулярный, или не сопровождается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены. Для учета результатов РСК вводят вспомогательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген-антитело. Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с системой эритроциты барана - гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний. Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов. В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Антистрептолизиновая реакция основана на феномене нейтрализации гемолитического действия микробного токсина (О-стрептолизина) 9

антитоксическими антителами иммунной сыворотки. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на том, что при взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами иммунной сыворотки происходит блокирование (нейтрализация) гемагглютинирующей способности вируса, т. е. торможение гемагглютинации. Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых пластин. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Иммуноферментный анализ Одним из наиболее чувствительных методов выявления антител считается иммуноферментный анализ (ИФА), который не уступает по чувствительности радиоиммунному анализу (РИА) и в то же время отличается от него большей доступностью для обычных диагностических лабораторий. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе. Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагносцировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусные заболевания растений, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммовпродуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусоввозбудителей СПИДа и гепатита B – это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА. Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами и могут быть приобретены по каталогам известных фирм. 10

Данное исследование проводят с использованием планшет из полистирола (поливинилхлорида) на поверхности лунок которых адсорбируют специфический антиген. Фиксированный на пластине антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизованными антигенами иммуноглобулины выявляют с помощью антивидовой (античеловеческой) антииммуноглобулиновой сыворотки, к антителам которой ковалентно прикреплен фермент – пероксидаза. После инкубации с субстратом (пероксидом водорода) и индикатором (диаминобензидином) оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. Интенсивность окраски, пропорциональную количеству сорбированных на антигене антител, можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выявлять антитела к разным антигенам. Использование фермента в качестве индикатора дает ряд преимуществ, однако имеет ряд ограничений. Необходимо подобрать такой фермент, который длительно сохраняет свою активность, не теряет ее при операции связывания с антигеном или антителом, обладает высокой специфичностью к субстрату. Широко используются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и β-галактозидаза Escherichia coli. Перспективны люциферазы светлячков и светящихся бактерий. Активность ферментов детектируют по изменению оптической плотности, флуориметрически и электрохимически. Люциферазные реакции сопровождаются высвечиванием фотонов, поэтому их регистрируют по биолюминесценции. Приведем несколько примеров. Пероксидаза катализирует реакцию AH2 + H2O2 A + 2H2O. В качестве AH2 могут быть разные соединения. Так, восстановленный бесцветный о-фенилендиамин в пероксидазной реакции превращается в окисленную окрашенную форму с максимумом оптического поглощения при 435 нм, регистрируемую фотометрически. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз фосфорных эфиров: 4-нитрофенилфосфат превращается в 4-нитрофенол, регистрируемый по оптической плотности при 405 нм; 4-метилумбеллиферилфосфат превращается в 4-метилумбеллиферон, флуоресцирующий с высоким квантовым выходом при 450 нм (флуоресценцию возбуждают при 365 нм). β-Галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид, при гидролизе образуются галактоза и 4-метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически. В люциферазных реакциях детектируют биолюминесценцию: АТФ + люциферин + O2, 11

АМФ + Фн + оксилюциферин + hn560 нм, ФМНН2 + О2 + R-CHO, ФМН + R-COOH + H2O + hn490 нм, где АТФ – аденозинтрифосфат, АМФ – аденозинмонофосфат, Фн – ортофосфат, ФМН и ФМНН2 – окисленный и восстановленный флавинмононуклеотид, R-CHO и R-COOH – жирный альдегид и соответствующая кислота. Для связывания ферментной метки с антителом или антигеном без потери активности фермента и нарушения свойств антитела и антигена существуют три группы методов: биохимические, иммунологические и генно-инженерные. В биохимических методах используется сшивка фермента (E) с антителом или антигеном при участии свободных реакционноспособных групп: -NH2 , -COOH, -SH, -OH. Например: E-NH2 + HOOC-Аг E-NH-CO-Аг + H2O. Если прямое взаимодействие реализовать не удается, в ход идут бифункциональные сшивающие агенты: глутаровый диальдегид, n-бензохинон. Функциональные группы реагентов могут быть активированы. Так, гидроксигруппы в углеводном компоненте пероксидазы хрена можно окислить с помощью периодата натрия до альдегидных, через которые затем пришиваются антиген или антитело при участии аминогрупп с образованием основания Шиффа: E-CHO + H2N-Аг E-CH = N-Аг. Витамин биотин исключительно прочно связывается с яичным белком авидином – ингибитором биотинсодержащих ферментов. Если приготовить комплексы Аг-биотин и авидин-E и затем смешать их, то образуется комплекс Аг-биотин-авидин-E. Иммунологические методы получения антигенов или антител, меченных ферментами, основаны на применении антител или их составляющих в качестве сшивающих звеньев. Антитела всех пяти классов построены по единому плану. Антитело построено из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (H от англ. heavy – тяжелый) и двух легких (L от англ. light – легкий) с молекулярными массами соответственно 50 и 25 кДа. Тяжелые цепи связаны друг с другом двумя дисульфидными связями через остатки цистеина. Легкие цепи образуют с тяжелыми по одной дисульфидной связи. Обе цепи состоят из доменов, по ~ 110 аминокислотных остатков в каждом: в тяжелой цепи – четыре, в легкой – два домена. N-концевые домены H- и L-цепей, обозначаемые VH и VL (V от англ. variable – вариабельный), определяют специфичность антител, их первичная структура вариабельна. Остальные домены характеризуются постоянством структуры и обозначаются CH1, CH2, CH3 и CL (C от constant – константный). По форме молекула антитела напоминает букву Y, ножка которой связана с отростками шарнирным 12

участком.

Рис 1. Антитело класса G: действие папаина и пепсина

В исследовании структуры антител применяются протеолитические ферменты. Папаин расщепляет молекулу на три фрагмента. Два из них идентичны, одновалентны в реакции связывания антигена и названы Fabфрагментами (Fab от Fragment antigen binding – фрагмент, связывающий антиген). Третий фрагмент не связывает антиген, легко кристаллизуется и поэтому назван Fc-фрагментом (Fc от Fragment crystallizable – кристаллизуемый фрагмент). Пепсин расщепляет молекулу антитела подругому. При этом образуются двухвалентный F(ab')2-фрагмент и несколько осколков Fc-фрагмента, из которых наиболее крупный назван pFc'-фрагментом (рис. 1). Метод гибридных антител для сшивки антигена с ферментом включает несколько этапов (рис. 2): получение F(ab')2фрагментов к антигену и ферменту путем обработки соответствующих антител пепсином, их разъединение путем восстановления дисульфидных связей меркаптоэтанолом, смешивание полученных Fab-фрагментов, удаление меркаптоэтанола диализом, ведущее к реассоциации с образованием гибридных F(ab')2фрагментов, связывающих антиген и фермент в единый комплекс. Рис 2. Получение комплекса антигена Ar и фермента Е методом гибридных антител

Fc-фрагменты антител образуют прочный комплекс с белком A стафилококка. При наличии антител к ферменту и конъюгата белок Аантиген можно получить комплекс E-Ат-белок А-Аг. Генно-инженерный метод получения меченого антигена основан на синтезе гибридных белков с помощью микроорганизмов. Таким методом, используя трансгенную E. coli, в лаборатории Е.С. Северина получены 13

гибридные белки, содержащие полную аминокислотную последовательность бактериальной b-галактозидазы и специфическую последовательность белка от вируса иммунодефицита человека или вируса гепатита B. Сохранение нативной структуры и функции сшиваемых реагентов зависит от их индивидуальных особенностей, поэтому здесь не может быть применен какой-либо стандартный прием. Конкретный метод сшивки подбирается в индивидуальном порядке. Таким образом, нами рассмотрено получение необходимых компонентов диагностикума для проведения иммуноферментного анализа. В основе данного анализа лежит иммунохимическая реакция взаимодействия АГ-АТ: aАг + bАт* →a(Аг-Ат*) + (b – a)Ат* (1) или аАг* + bАт + cАг → d(Аг*-Ат) + e(Аг-Ат) + (a – d)Аг* + (c – e)Aг. (2) В первом варианте (1) из антигена Аг, находящегося в тестируемом образце, и меченого антитела Ат*, добавленного в концентрации, превышающей концентрацию Аг, образуется комплекс Аг-Ат*. Количественный анализ реакции (1) может быть проведен по образованию комплекса Аг-Ат*, детектируемого с помощью ферментной метки, или по Ат*, оставшемуся в свободном состоянии. Это неконкурентный вариант ИФА. Во втором варианте (2) лимитирующим субстратом является антитело Ат. Меченый антиген Аг*, будучи добавленным в анализируемый образец в известной концентрации, связывается с антителом, образуя комплекс Аг*-Ат. В этой реакции Аг* будет конкурировать с немеченым антигеном Аг, содержащимся в образце. Концентрация Аг*-Ат будет обратно пропорциональна концентрации Аг. Таким способом по заранее известной концентрации Аг* можно определить неизвестную концентрацию Аг. Это конкурентный вариант ИФА. В обоих вариантах ИФА надо решить важную задачу – разделить связанную фракцию меченого реагента (Аг-Ат* или Аг*-Ат) от несвязавшегося, свободного реагента (Ат* или Аг*), чтобы определить долю специфического связывания. Количественный анализ иммунохимических реакций (см. уравнения (1) и (2)) может быть проведен по продуктам (Аг-Ат* и Аг*-Ат) или по субстратам реакций, оставшимся в свободном состоянии (Ат* и Аг*). Для этого используют два основных подхода. Первый подход – направленное воздействие на ферментативную активность комплекса Аг-E посредством связанного Ат, ведущее к торможению или, напротив, к возрастанию скорости ферментативной реакции. Такой ИФА может быть реализован в однофазной системе – в растворе – и поэтому называется гомогенным, или жидкофазным. Это ИФА без предварительного физического разделения меченых лигандов (Ат* или Аг*) от их иммунохимических комплексов – продуктов реакций (1) и (2). 14

Второй подход – физическое разделение с помощью твердой фазы, связывающей меченый реагент. Это гетерогенный или твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используются стенки сосудов, в которых проводится анализ. Эти сосуды изготавливаются в виде специальных планшетов из непористых прозрачных полимерных материалов: полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата. Белки (антигены или антитела) адсорбируются на поверхности пластика – и в этом основа твердофазного ИФА. Для увеличения прочности связывания белков пластик подвергается модификации (проводится обработка глутаровым альдегидом, поли-L-лизином, толуол-2,4-диизоцианатом; способ модификации – ноу-хау фирмы-производителя) таким образом, что активированная поверхность приобретает способность к ковалентному связыванию белков. К режиму модификации предъявляются жесткие требования: однородность связывающих свойств поверхности пластика, его оптическая прозрачность (результаты ИФА регистрируются фотометрически). По окончании процедуры связывания с поверхностью пластика несвязанный меченый реагент просто смывается с поверхности планшета. В англоязычной литературе твердофазный ИФА именуется ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – определение фермента, связанного с иммуносорбентом. Общие принципы метода гетеротенного ИФА Определение антител Рассмотрим принцип определения специфических Aт методом тИФА. На рис. 3а показана общая схема метода, состоящего из трех стадий, соединенных на рисунке знаком плюс. Во время каждой стадии в систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого переходят к следующей стадии реакции, которая обозначена следующим знаком плюс на схеме. Рассмотрим подробнее процесс образования иммунного комплекса, который представлен на рис. 3. На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован Аг любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т. п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся Aт к инфекционному агенту (на рисунке обведены), то они закрепляются на соответствующих Aг и остаются связанными при промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная – «специфическая» стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса. На второй стадии анализа в лунку вносят Aт с заранее прикрепленным к ним ферментом, способные связаться с Aт человека, 15

закрепившимися на инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то возникает «молекулярная цепочка», на конце которой находится фермент. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс (рис. 3б). Если на первой стадии анализа иммунных комплексов не образовалось (рис. 3в), то отсутствует и вся последующая часть «молекулярной цепочки», вследствие чего хромоген не окрашивает раствор. В нашем случае ключевым элементом является специфическое Aт из сыворотки крови больного к инфекционному агенту. По сути, мы анализируем способность некоторых из Aт в исследуемом материале связаться с интересующим нас Aг. Хотелось бы особо отметить, что положительный результат теста показывает только наличие в исследуемом образце (обычно сыворотке крови больного) Aт, способных связываться с поверхностными Aг, сорбированными на твердой фазе. Результат анализа может существенно зависеть от свойств самой тест-системы и от особенностей иммунного ответа больного. Тест-системы на основе моноклональных Aт позволяют достигать более высокой чувствительности и избирательности. Однако чрезмерно узкая избирательность может приводить к ложноотрицательным результатам при некоторых особенностях иммунного ответа организма больного. Многое зависит от того, какого рода Aг используется для сорбции на твердой фазе. Важна и степень очистки, и количество различных Aг, доступных для образования иммунных комплексов, и многое другое. Разумеется, все отмеченное относится к полностью пригодным для использования тест-системам и безошибочному проведению процесса анализа. Рис. 3а. Последовательность анализа

Рис. 3б. Положительный результат теста

16

Рис. 3в. Отрицательный результат теста

Рис.3. Определение антител методом твердофазного иммуноферментного анализа Определение антигенов Для обнаружения самих инфекционных агентов, а точнее их Aг, применяется другая модификация метода тИФА, которая представлена на рис. 4а. В этом случае на поверхности планшета (твердой фазе) сорбируются Aт к искомому агенту. Образующаяся в ходе анализа цепочка выглядит так: Aт, инфекционный агент, далее, как и в предыдущем случае, следует комплекс Aт-Аг. То есть, если в исследуемом образце присутствует искомый Aг, то образуется иммунный комплекс. В ячейке присутствует фермент, который способен расщеплять хромоген с образованием окрашенного продукта. Это возможно только при наличии полной цепочки. Если в исследуемом образце искомый Aг (обведен на рис. 4а) отсутствует, то цепочка не образуется и окрашивания не происходит (рис. 4в). Ключевым элементом, от которого зависит, сформируется цепочка или нет, является искомый агент, точнее, его Aг, способные связываться с соответствующими Aт диагностической тест-системы. Так же, как и в предыдущем случае, не следует забывать, что мы определяем только наличие Aг, которые могут быть связаны в такой системе. Например, целую (неразрушенную) бактерию, Aг которой мы ищем, нельзя обнаружить в подобном тесте. Она слишком велика для того, чтобы ее можно было бы удержать в подобной молекулярной системе. Все особенности, о которых говорилось применительно к предыдущему варианту анализа, сохраняют свою актуальность и в этом случае. Кроме того, имеются дополнительные особенности, обусловленные необходимостью связывания диагностических Aт c различными поверхностными Aг исследуемого объекта. Все эти особенности необходимо учитывать при анализе результатов, получаемых с помощью ИФА. Только понимание того, что именно на самом деле определяет тест, позволяет правильно трактовать результат. Кроме того, необходимо учитывать динамику изменений этих показателей. В общем, они адекватно отражают течение инфекционного процесса, но не всегда синхронны с ним и не во всех деталях совпадают.

17

Рис. 4а. Последовательность иммуноферментного анализа

Рис. 4б. Положительный результат теста

Рис. 4в. Отрицательный результат теста

Рис. 4. Определение Aг методом твердофазного иммуноферментного анализа Динамика изменений показателей ИФА-тестов при инфицировании В связи с тем, что различные тест-системы дают возможность получить информацию о различных сторонах взаимодействия инфекционного агента и организма человека, возникает вопрос: каким образом значения отдельных показателей связаны с развитием исследуемых процессов. В случае острого инфекционного процесса, характеризующегося быстрым развитием инфекции и полным уничтожением инфекционного агента, выявлено несоответствие по времени в изменении числа бактерий и уровне поверхностных Аг, определяемых методом ИФА (рис. 5). Рис. 5. Динамика изменения уровня антигена при развитии острого инфекционного процесса, определяемого методом ИФА: кривая 1 соответствует изменению числа бактерий; кривая 2 — уровню поверхностных Aг, определяемых методом ИФА 18

Увеличение уровня поверхностных Aг может существенно отставать от роста числа бактерий. Некоторое запаздывание этой кривой может объясняться и тем, что чувствительность методов не бесконечно высокая, и ограниченной доступностью инфекционного агента в исследуемом материале, и рядом других причин. Возможно, сказывается то, что тестсистемы, как правило, лучше реагируют на антигенно-активные фрагменты, в то время как Aг непосредственно на поверхности живой клетки могут оставаться недоступными для тест-системы. Даже при адекватном заборе материала для лабораторного исследования с соблюдением всех предосторожностей, как правило, отмечается подобного рода несовпадение. Таким образом, далеко не всегда результат лабораторного теста по определению поверхностного Aг инфекционного агента полностью соответствует содержанию биологически активного инфекционного материала. Результат теста зависит от многих составляющих инфекционного процесса и от конкретной реализации тестсистем. Имеют значение технология получения диагностических Aг и некоторые другие факторы, в том числе описанные выше. Еще более неоднозначной может быть трактовка результатов теста на наличие Aт к антигенам инфекционного патогена. Часто результаты такого теста могут, в общем, достаточно хорошо описываться известной кривой иммунного ответа на иммунизацию чужеродными Aг (рис. 6). Рис. 6. Динамика изменения уровня антител специфичных к инфекционному агенту: кривая 1 отражает содержание инфекционного агента; кривая 2 — иммунный ответ на иммунизацию чужеродными Aг, определенный методом ИФА Необходимо отметить, что кривая 2, которая, по сути, является кривой иммунного ответа, запаздывает по отношению к кривой, отражающей содержание инфекционного агента. Иногда это бывает очень существенно. Уровень специфичных иммуноглобулинов (Ig), который собственно и определяется в нашем тесте, может сохраняться высоким и после подавления инфекции, хотя это и не является абсолютным правилом. Кроме того, при анализе результатов такого теста необходимо помнить о том, какого класса Ig определялись в применявшемся тесте, поскольку при развитии иммунного ответа происходит закономерная смена классов Ig. В типичных случаях Ig класса М (первичный иммунный ответ) сменяются на Ig класса G (вторичный иммунный ответ). Вместе с тем, при реактивации 19

хронической инфекции, «серологический профиль» пациента может имитировать первичный иммунный ответ (рис. 7).

Рис. 7. Динамика образования антител Таким образом, тесты, определяющие непосредственно уровень Ag в исследуемом материале, более адекватно отражают уровень содержания инфекционного патогена или другого агента, однако результаты анализа сильно зависят от выбора материала для исследования, условий его забора и др. Причем невозможность забора необходимого материала может поставить под вопрос и применимость теста вообще. Особенно важно, что во многих случаях при исследовании наиболее доступного биологического материала, которым является сыворотка крови, такие тесты закономерно дают отрицательные результаты. Вторая группа тестов, достоинство которых заключено в возможности определения инфекции или опухоли вне зависимости от локализации патологического процесса, основана на выявлении Aт различного класса, а также их субпопуляций к антигенам инфекционного агента, раковой клетки, гормона и т. п. В клиническом понимании эта информация дает сведения о стадии иммунного ответа. Рассмотрим возможные варианты результатов определения Aг и Aт методом тИФА на примере успешного лечения бактериальной инфекции. Через некоторое время после начала лечения содержание поверхностных антигенов начинает увеличиваться, иногда значительно. Затем уровень медленно падает до низких значений. Показатели тестов, определяющих содержание Ig, вообще не имеют на начальном этапе лечения четких тенденций. Может наблюдаться как снижение, так и увеличение уровня. Причем это зависит не только от применявшегося препарата, но и от ряда других факторов. Хотя можно отметить, что при использовании некоторых препаратов имеется тенденция к снижению данного показателя, в то время как при назначении других эта тенденция отсутствует. Необходимо подчеркнуть, что в указанном случае речь идет только об изменении отдельных показателей, полученных определенным методом. Изменение содержания Ag инфекционного агента в исследуемом 20

материале не обязательно коррелирует, а часто вовсе не совпадает с содержанием патогена в организме пациента. Уровень специфических Aт к Aг инфекционного агента не отражает состояние общего иммунного статуса, и тем более динамику изменения концентрации специфических Ат нельзя рассматривать в качестве показателя эффективности терапии, т. е. элиминации или сохранения в организме инфекционного агента. Оценка результатов любых лабораторных исследований должна проводиться врачом с учетом особенностей метода диагностики, своеобразия патогенеза болезни и индивидуальных особенностей конкретного пациента. Таким образом, современные лабораторные технологии предъявили новые требования к квалификации врача и ещё более повысили значимость клинического мышления в понимании результатов лабораторных анализов. Возможности применения метода ИФА в диагностике инфекционных заболеваний Вирусные гепатиты В структуре инфекционных заболеваний различные виды вирусных гепатитов занимают одно из ведущих мест. Они заключают в себе значительную клиническую проблему: если вирусы гепатитов А и Е вызывают только острые заболевания, то вирусы В, С и D являются причиной как острых, так и хронических форм гепатитов, часто прогрессирующих с развитием циррозов печени и печеночно-клеточного рака. Необходимо отметить, что различные виды острых и хронических вирусных гепатитов не имеют патогномоничных характеристик клинического течения и гистологической картины поражения печени. Следовательно, полный диагноз вирусного гепатита может быть поставлен только на основании специфических лабораторных тестов. Используя маркерный анализ, учитывая клинические и эпидемиологические данные, можно установить этиологию вирусных гепатитов А, В, С, D, Е и их ассоциированных форм. При этом следует учитывать, что поскольку при диагностике вирусных гепатитов С и Е зачастую используются диагностические тест-системы для определения маркеров аbНСV и abHEV (антитела класса IgG), то вирусологический диагноз вирусных гепатитов С и Е может быть только предположительным. Для постановки клинического диагноза эти данные маркерной диагностики имеют значение в комплексе с данными клинического обследования, биохимических исследований и эпиданамнеза. Маркерный анализ позволяет также установить стадию болезни, контролировать ход заболевания и прогнозировать его исход, осуществлять эпидемиологический анализ и эпидемиологический прогноз. 21

Данный анализ может быть эффективен в установке показаний для вакцинации и иммунопрофилактики, контроле их эффективности, позволяет распознать острые и хронические формы вирусных гепатитов, определить критерии безопасности крови и ее препаратов, а также риск вертикальной передачи инфекции от инфицированной матери плоду. Таблица 3 Клинико-эпидемиологическое значение маркеров вирусов гепатитов A, B, C, D и Е Маркер Обознач. Клинико-эпидемиологическое значение Антиген вируса HAVAg Обнаружение в фекалиях у детей в очагах гепатита А инфекции является показателем опасности для окружающих в отношении заражения (но не критерием постановки диагноза) Суммарные abHAV Показатель перенесенного в прошлом или антитела к вирусу переносимого в настоящее время вирусного гепатита А гепатита А и критерий для вакцинации Антитела класса М abHAV- Маркер острого вирусного гепатита А к вирусу гепатита А IgM РНК вируса RNAМаркер наличия вируса в исследуемом гепатита А HAV материале Поверхностный HBsAg Маркер вирусного гепатита В (острого или антиген (s) вируса хронического), требует дополнительных гепатита В исследований на аbНВс-суммарные, abHBcIgM). Один из критериев безопасности переливаемой крови или её препаратов. Контроль в группах риска. Выяснение распространенности вируса гепатита В при эпидемиологических исследованиях Антитела к abHBs Определение стадии развития гепатита В и поверхностному прогноза течения заболевания, контроль за антигену вируса уровнем специфического иммунного ответа гепатита В при определении целесообразности и эффективности вакцинации. Определение распространения вируса гепатита В при эпидемиологических исследованиях. Маркер благоприятного исхода Сердцевинный НВсАg Маркер наличия вируса гепатита В в антиген (с) вируса гепатоците (при остром или хроническом гепатита В гепатите В) Антитела к а bНВс Маркер острого или хронического 22

сердцевинному антигену вируса гепатита В (суммарные или класса G)

Антитела класса М abHBcк сердцевинному IgM антигену вируса гепатита В е-антиген вируса НВеАg гепатита В (антиген инфекциозности)

Антитела к е-антигену вируса гепатита В

аbНВе

ДНК вируса гепатита В

DNAHBV

Антитела к вирусу гепатита С (cуммарные)

abHCV

вирусного гепатита В (в комбинации с другими маркерами), наличия вируса гепатита В (в комбинации с другими маркерами), маркер инфицированности вирусом гепатита В в прошлом или настоящем. Контроль донорской крови и её препаратов. Используется в дифференциальной диагностике, определении распространенности вируса гепатита В при эпидемиологических исследованиях Маркер острого вирусного гепатита В, а также обострения хронического гепатита В

Определение интенсивности репликации вируса гепатита В и степени инфекционной опасности больного. Используется в дифференциальной диагностике вирусных гепатитов, контроле за течением и прогнозировании исхода заболевания. Определение вероятности вертикальной передачи инфекции плоду беременными носительницами HBsAg. Маркер активной репликации вируса. Маркер инфекциозности крови больного. Маркер неблагоприятного исхода (хронизации) вирусного гепатита В, если он обнаруживается через 2 месяца после начала заболевания Определение стадии заболевания. Дифференциальная диагностика вирусных гепатитов. Маркер благоприятного исхода болезни Высокая инфекциозность крови больного. Активная репликация вируса. Дифференциальная диагностика носительства вируса или HBsAg Маркер инфицирования вирусом гепатита С. Не позволяет судить о стадии болезни 23

Антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита С класса М РНК вируса гепатита С Антитела к вирусу гепатита D (суммарные) Антитела к вирусу гепатита D класса М РНК вируса гепатита D Суммарные антитела к вирусу гепатита Е

abHCcIgM

Маркер острого вирусного гепатита С, но может определяться и при реактивации хронического гепатита С

RNAHCV abHD

Маркер наличия вируса в крови после 10 дня заболевания Маркер инфицирования вирусом гепатита D. Не позволяет судить о стадии болезни

abHDIgM RNAHDV abHEV

Маркер острого вирусного гепатита D Маркер наличия вируса в крови Маркер инфицирования вирусом гепатита Е в настоящем или в прошлом. Маркер заболевания

При постановке диагноза вирусного гепатита следует руководствоваться следующими принципами: – использовать современные представления о клиникоэпидемиологическом значении каждого маркера (табл. 3); – знать индивидуальные иммунологические профили каждого вида вирусного гепатита; – использовать данные биохимических исследований (АЛТ, билирубин); – признание возможности существования ассоциированных форм вирусных гепатитов; – при невозможности исследовать наличие какого-либо маркера следует учитывать возможность положительного или отрицательного результата в случае применения диагностического теста; – необходимо учитывать возможность получения ложноположительного или ложноотрицательного результата и анализировать их причины (особенно случаи, когда сочетание определяемых маркеров не имеет смыслового значения). Вирус герпеса Вирус простого герпеса 1 + 2 типов может вызывать не только поражения кожи и слизистых оболочек, но и тяжелое поражение ЦНС, глаз и внутренних органов. Внутриутробное инфицирование может привести к поражению ЦНС плода, зрения и слуха, к рождению ребенка с микроцефалией, пороками развития желудочно-кишечного тракта. В 80 % случаев внутриутробное заражение заканчивается гибелью плода. Риск пренатального заражения плода при первичном инфицировании матери 24

составляет около 75 %. Защитную роль в предотвращении заражения новорожденного, ограничении формирования латентных форм заболевания играют антитела к вирусу простого герпеса. Отсутствие признаков заболевания у новорожденного не исключает факта врожденного инфицирования и развития симптомов заболевания в последующие месяцы и годы жизни. Эти обстоятельства диктуют необходимость серологической диагностики этих инфекций у будущей матери во время беременности и у ребенка сразу после рождения. Реактивация инфекции HSV не может предотвращаться иммунологически, так как распространяется внутри нервных клеток и не вступает в контакт со специфическими антителами в серозной или тканевой жидкости или с иммунокомпетентными клетками. Вирус герпеса распространяется в клетках-мишенях, разрушая их. Это приводит к периодически появляющимся на коже и слизистых оболочках очагах поражения с различной степенью выраженности и активным его выделением. Существует определенная закономерность в динамике выработки специфических антител к возбудителям инфекции простого герпеса. Через несколько дней после инфицирования на первом этапе формирования иммунитета образуются IgM антитела, уровень которых повышается достаточно быстро и значительно опережает интенсивность образования IgG антител. На втором этапе формирования иммунитета, в более позднее время, начинают формироваться IgG антитела, концентрация которых повышается в течение нескольких недель (5–8) до максимального уровня. К этому времени продукция IgM антител снижается или прекращается совсем. После выздоровления или стабилизации процесса в крови в небольших количествах циркулируют только IgG антитела. Эту закономерность важно учитывать при подозрении на острую инфекцию у женщин с малыми сроками беременности (І–ІІ триместры). В этих случаях обязательно исследование специфических IgM антител, т. к. в начале заболевания, в самом опасном для плода периоде, IgG антитела могут не определяться или выявляться на низком уровне. Цитомегаловирус При первичном инфицировании наиболее важным звеном иммунного ответа является выработка специфических IgМ, уровень которых в это время значительно повышается. В это же время постепенно начинает повышаться и уровень специфических IgG. В период обострения хронической инфекции концентрация IgМ увеличивается незначительно, но отмечается выраженный подъем концентрации специфических антител класса IgG. В стадии ремиссии заболевания в крови выявляются незначительно повышенные показатели специфического IgG. Выявление IgМ к ЦМВ является показателем острой фазы цитомегаловирусной инфекции. Однако положительный результат рекомендуется подтвердить 25

дальнейшими лабораторными исследованиями. Отрицательный результат обычно отражает лишь отсутствие IgМ, не исключая цитомегаловирусную инфекцию или реинфекцию. Вирус Эпштейна–Барр Открытый в 60-х годах вирус герпеса человека 4 типа (ВГЧ-4), или вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), относится к подсемейству Gammaherpesviridae рода Gymphocryptovirus. ВЭБ поражает в основном два типа клеток: эпителий верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта, а также В-лимфоциты, которые в результате инфицирования иммортализуются. Соответственно, ВЭБ вызывает такие различные заболевания, как инфекционный мононуклеоз или злокачественная лимфома Беркитта, злокачественная носоглоточная карцинома. Заболевание малоконтагиозно за счет наличия большого числа иммунокомпетентных лиц (до 50 % детей и 85 % взрослых серопозитивны в отношении ВЭБ) и протекания болезни в стертых и атипичных формах. У людей без дефектов иммунной системы первичное инфицирование ВЭБ может протекать бессимптомно или вызывать субклинические проявления болезни с положительными серологическими реакциями. В дальнейшем вирус может длительное время персистировать в клетках. При массированном поступлении вируса или недостаточности иммунной системы развивается вирусемия, приводящая к острым формам заболевания. Показана возможность трансфузионной передачи ВЭБ от доноров с острой фазой первичной инфекции. В процессе репликации вируса экспрессируется свыше 70 различных вирусоспецифических белков, однако к настоящему времени выделены группы иммуногенных белков, определение антител к которым дает возможность дифференцировать стадию инфекции. Наиболее специфичными и чувствительными маркерами острой стадии инфекции являются IgM к капсидному комплексу (VGA) и IgG к раннему антигену (ЕА). Лица, переболевшие ВЭБ-инфекцией, завершившейся благоприятной сероконверсией, характеризуюся только наличием IgG к ядерному антигену (EBNA-1). Таким образом, определение серологического профиля дает необходимую и достаточную информацию для постановки диагноза и установления стадии инфекции. Комплекс этих трех маркеров позволяет с высокой эффективностью по данным серологических исследований диагностировать различные стадии ВЭБ-инфекции. В таблице 4 приведена возможная интерпретация результатов серологических исследований.

26

Таблица 4 Интерпретация серологических данных № Период инфекционного процесса VCAп/п IgM 1. Инкубационный период или отсутствие инфицирования 2. Очень ранняя первичная инфекция + 3. Ранняя первичная инфекция + 4. Поздняя первичная инфекция +/5. Атипичная первичная инфекция + 6. Хроническая инфекция -/+ 7. Ранняя паст- инфекция 8. Поздняя паст-инфекция 9. Реактивация + 10. Атипичная реактивация +

ЕАIgG -

EBNAIgG -

+ + + + + -

+/+ + + + +

ВИЧ-инфекция Антитела к ВИЧ-инфекции встречаются у большинства больных СПИДом или в состоянии предзаболевания, а также часто обнаруживаются у вирусинфицированных людей в известных группах риска. Лабораторные методы диагностики ВИЧ-инфекции основаны на идентификации вируса и/или антител к нему. В практической работе используют определение антител к ВИЧ в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Определение антител говорит о зараженности вирусом и эпидемической опасности его носителя. Вирус краснухи Наиболее часто краснуха встречается в детском и подростковом возрасте. Однако от 20 до 59 % женщин детородного возраста не имеют иммунитета к вирусу краснухи, так как не болели краснухой в детском возрасте и являются группой риска по заболеванию во время беременности и инфицированию плода (Torch-инфекция). Заболевание краснухой в течение беременности, особенно в течение первого триместра, может быть причиной серьезных осложнений у плода. Глухота, болезни сердца, микрои гидроцефалия являются одними из некоторых отличительных признаков синдрома врожденной краснухи.

27

Таблица 5 Риск внутриутробных заражений при краснухе у беременных Срок % риска Исходы беременности внутриутробного заражения 0–12 недель 80–90 % 20 % – самопроизвольное прерывание беременности, 90 % – уродство плода 12–16 недель 50 % 20% – глухота Более 16 30–35 % Функциональные нарушения различных недель органов Новорожденного ребенка с малым весом и имеющего любой из ряда перечисленных симптомов необходимо обследовать на врожденную краснуху путем определения специфических антител класса IgМ. Специфические антитела против вируса краснухи класса IgМ определяются с 1–3 дня с момента появления первых симптомов заболевания и, в большинстве случаев, с 6 по 9 неделю титр их снижается. Нередко в первые дни болезни IgМ отсутствуют, что связано с коротким инкубационным периодом. Для подтверждения положительного результата рекомендуется параллельно проанализировать образцы, взятые у тех же больных через 7–14 дней. Для интерпретации следует воспользоваться динамикой уровня антител. Количественное определение антител класса IgG используется для оценки специфического иммунного статуса женщин до и в начале беременности, а также доноров органов и реципиентов. Уровень антител класса IgG ниже 10 Е/мл говорит об отсутствии протективного иммунного ответа, от 10 до 15 Е/мл означает слабый защитный иммунитет, выше 15 Е/мл – сильный защитный иммунитет. Диагностика бактериальных инфекций Helicobacter pylori Helicobacter рylori – спиральная бактерия, адаптировавшаяся к условиям существования в слизистой желудка. Выявление специфических антител к H. pylori в сыворотке и слюне пациентов методом ИФА является простым, быстрым и обоснованным подходом при диагностике H. рyloriинфекции и заболеваний, ассоциированных с Helicobacter рylori: хронического гастрита типа В, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Определение сывороточных антител при помощи ИФА по специфичности и чувствительности почти не уступает эндоскопическому обследованию и дыхательной пробе с мочевиной, к тому же является наиболее щадящим для пациента. К недостаткам метода относится инерционность: результат остается положительным не менее месяца после ликвидации инфекции. 28

Туберкулез Обнаружение в периферической крови специфических антимикобактериальных антител, независимо от выраженности специфического клеточного ответа, является одним из характерных диагностически значимых признаков туберкулеза. Вместе с тем, необходимо иметь в виду, что отсутствие в крови специфических антимикобактериальных антител не является основанием для исключения диагноза туберкулеза, особенно в случаях специфического процесса внелегочной локализации или атипичных микобактерий. В патологических очагах в органах и тканях местный иммунный ответ наиболее выражен, поэтому целесообразным является поиск антимикобактериальных антител (иногда с применением провокационных туберкулиновых проб) в биологических жидкостях или экстрактах тканей из анатомических зон поражения или максимально приближенных к ним участков (табл. 6). Таблица 6 Объект поиска антимикобактериальных антител в зависимости от локализации туберкулезного процесса Локализация специфического Исследуемый биологический поражения материал Туберкулезно-аллергический синовит Синовиальная жидкость Лимфаденит Экстракт ткани периферических лимфоузлов Сальпингоофорит Перитонеальная жидкость Дугласова пространства Спинальный менингит, развившийся в Цереброспинальная жидкость качестве осложнения туберкулезного спондилита Очаговый туберкулез легких Жидкость бронхоальвеолярного лаважа, промывные воды бронхов Экссудативный плеврит Экссудат или транссудат (при неспецифических поражениях) Боррелиоз (Болезнь Лайма) Боррелиоз – это зоонозная инфекционная болезнь, передающаяся через укус клеща, зараженного спирохетой Borrelia burgdorferi. Естественная восприимчивость людей высока, возможна реинфекция. Сезонность заболевания связана с периодом проявления активности клещей, наибольшее число случаев заражения наблюдается в мае-июне и сентябре-октябре. В начальной стадии болезни наблюдается воспалительная реакция на месте укуса клеща, позднее приводящая к повреждению кожи, а также 29

хроническая мигрирующая эритема. Болезнь связана также с нарушениями сердечной деятельности, неврологическими симптомами и симптомами артрита. Различают три стадии болезни: 1) хроническая мигрирующая эритема; 2) неврологическая стадия; 3) артроидная стадия. На ранних стадиях инфекции – на протяжении 1–2 недель (эритема) – концентрация IgM низкая или вообще не выявляется. Со временем титр антител повышается. Наиболее высокие уровни антител обнаруживаются у больных с хроническим артритом. Отрицательный результат теста не исключает диагноза болезни Лайма. Прием антибиотиков на ранних стадиях заболевания может подавить выработку антител, а у некоторых лиц их концентрация может не достигнуть уровня чувствительности метода. Сифилис Антропонозная венерическая спирохитозная инфекция с контактным механизмом передачи возбудителя. Возбудитель – подвижный спиралевидный микроорганизм Treponema pallidum (бледная трепонема). Иммуноферментные методы способны дополнить, а порой и заменить существующие рутинные серологические методы диагностики сифилиса. Установлено, что ранние стадии инфицирования характеризуются появлением в крови трепонемоспецифических антител класса М (примерно через две недели после заражения), концентрация которых нарастает и через два месяца достигает своих пиковых значений с последующим снижением уровня до неопределяемых величин. Антитела класса G появляются в крови только через месяц после инфицирования, однако уже на 6 неделе после инфицирования их уровень преобладает над уровнем IgM и может сохраняться в таком состоянии годы. Большое диагностическое значение приобретает выявление антитрепонемных IgM в крови новорожденных. Так как IgM не проходит через плаценту, выявление антитрепонемных IgM-антител у новорожденного указывает на врожденный сифилис. Точно так же IgM-антитела не проникают через гематоэнцефалический барьер, и их появление в спиномозговой жидкости говорит о нейросифилисе. Диагностика заболеваний, вызванных простейшими и гельминтами Лямблиоз Кишечное заболевание, вызываемое протозойным паразитом Giardia lamblia. Острые симптомы лямблиоза могут включать в себя диарею, нарушение всасывания, спазмы кишечника, анорексию, тошноту, потерю веса, общую слабость, зачастую на фоне нормальной температуры тела, продолжающуюся от нескольких недель до нескольких месяцев. Хроническая инфекция может протекать и без острой фазы и часто 30

является следствием безуспешного лечения, приводящего к рецидивам заболевания. Для диагностики лямблиоза используют определение в кале методом ИФА специфического антигена GSA 65, продуцируемого в больших количествах во время размножения Giardia lamblia в кишечнике хозяина. GSA 65 является специфическим антигеном Giardia и не обладает перекрестной реактивностью по отношению к другим кишечным паразитам. В сыворотке крови инвазированных лямблиями людей выявляются антитела к антигенам лямблий, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. Показано, что попадание антигенов лямблий в периферическую кровь увеличивается при резорбции слизистой оболочки кишечника. В связи с этим выявление IgМ к специфическим антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии острого лямблиоза, диагностика которого возможна на 10–14 день от начала инвазии. Токсоплазмоз Паразитарное заболевание, характеризующееся полиморфизмом клинических проявлений и значительной вариабельностью течения процесса: встречаются как и здоровые носители, так и лица с тяжелой, летальной формой болезни. Поражается в основном нервная система, мышцы, миокард, глаза, увеличивается печень и селезенка. Для лабораторной диагностики токсоплазмоза используют комплексное определение специфических IgM и IgG . Наличие IgM-антител к токсоплазме является показателем острого токсоплазмоза. Однако для подтверждения положительного результата рекомендуются дальнейшие лабораторные исследования. Отрицательные результаты анализа не исключают возможности ранней стадии заболевания с низкими концентрациями специфических IgM. Для диагностики недавнего инфицирования рекомендуется проводить два взятия крови у пациента с интервалом три недели – важным признаком недавнего инфицирования является нарастание титра специфических IgG. Описторхоз Описторхозы – гельминтозоонозы, вызываемые различными трематодами, характеризующиеся хроническим течением с преимущественным поражением печени, желчного пузыря и поджелудочной железы. Механизм патологического влияния описторхозов на организм человека складывается, в основном, из трех моментов: сенсибилизация организма к антигенам паразита с последующим развитием аллергических реакций; воздействие продуктов жизнедеятельности паразита на организм человека; повреждение органов и тканей человека в месте обитания паразита. Описторхоз вызывает значительные изменения в гепатобиллиарной системе, что ведет, в свою очередь, к возникновению различных форм 31

панкреатита, раку печени и поджелудочной железы. В случае интенсивного распада гельминтов могут развиться тяжелые проявления аллергии по типу реакции немедленного типа. Обнаружение специфических антител подтверждает диагноз описторхоза. Восприимчивость человека высокая. Иммунитет после перенесенного заболевания нестойкий. Токсокароз Токсокароз – заболевание человека, вызываемое миграцией личинок гельминтов, поражающих главным образом представителей псовых (Toxocara canis) и семейства кошачих (Toxocara mystax). Человек для токсокар не является истинным хозяином, поэтому личинки паразита в его организме не достигают половой зрелости, однако они способны к длительной миграции, поражая различные органы и ткани. Прижизненный паразитологический диагноз токсокароза практически невозможен, поскольку обнаружить мигрирующие личинки трудно, а идентифицировать их по гистологическим срезам весьма непросто. Ограниченная возможность паразитологической диагностики приводит к тому, что ведущими в диагностике токсокароза являются иммунологические тесты. Диагностика аллергических и иммунопатологических состояний Ревматоидный фактор Определение РФ в периферической крови человека методом ИФА используется для обследования пациентов с подозрением на ревматоидный артрит для мониторинга и контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий. Установлено, что высокий уровень РФ коррелирует с более тяжелым течением ревматоидного артрита и наличием системных (внесуставных) проявлений. Учитывая воспалительный характер ревматоидного артрита, для мониторинга заболевания и эффективности терапии помимо определения РФ целесообразно количественное определение С-реактивного белка. Ревматоидный фактор может обнаруживаться в крови человека при хронических гепатитах В и С; различных вирусных инфекциях; некоторых видах лимфом; системной красной волчанке; склеродермите; саркоидозах. Иммуноглобулин Е IgE отличается от других иммуноглобулинов высокой цитофильностью, т. е. способностью присоединяться к клеткам, в частности к тучным клеткам и базофилам. Присоединение антигена к IgE, находящемуся на этих клетках, приводит к выделению гистамина и других активных субстанций, обеспечивающих развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа. Особенностью IgE является 32

неспособность преципитировать антигены in vitro и фиксировать комплемент при его активации по классическому пути. IgE не способен проникать через плаценту. Определение IgE в клинике является показательным при диагностике различных аллергических состояний. IgE весьма чувствителен к нагреванию и другим денатурирующим воздействиям. Таблица 7 Нормальные показатели IgE в крови Возраст Концентрация (МЕ/мл) до 1,5 Новорожденные до 15 До 1 года до 60 От 2 до до 5 лет до 90 От 6 до 9 лет до 200 От 10 до 15 лет до 250 Взрослые: мужчины до 175 женщины У больных с атоническими аллергиями (например, внешней астмой, сенной лихорадкой или атомической экземой) уровень IgE в крови значительно повышен. Количество IgE увеличено также при многих паразитических заболеваниях. Концентрация IgE зависит от длительности заболевания, поэтому короткие атопические приступы не вызывают ее повышения. Иммуноферментный метод определения IgE является прекрасным вспомогательным средством диагностики атопической аллергии, клинически проявляющейся в виде астмы, частых заболеваний дыхательных путей, хронического ринита или дерматита. Определение IgE является полезным для прогнозирования наследственных аллергических заболеваний у детей. Повышение уровня IgE происходит при некоторых прогрессирующих опухолях, некоторых случаях агаммаглобулинемии (врожденная сцепленная с полом и обычная форма). Методы ИФА также широко используются для оценки уровня других иммуноглобулинов крови в рамках определения иммунного статуса пациентов.

33

ТЕМА 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ Применение метода полимеразной цепной реакции в медицинской микробиологии Молекулярная клиническая диагностика – наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот. Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии. Этому способствовало, во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определёнными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии учёного, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, ещё одним «критическим» научным событием стало открытие в 1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики. В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту – уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии: насколько тождественны понятия «НК» и «возбудитель». С точки зрения общей микробиологии, это неравнозначные понятия, т. к. возбудитель – это сложная биологическая система, включающая в себя НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Но при этом НК не может обойтись вне этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Поэтому с позиции клинической медицины определение НК является эквивалентом обнаружения/необнаружения возбудителя в объекте исследования. Внедрение в практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток. Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя 34

для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии). Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как микобактерии и грибы, является еще одним естественным ограничением, связанным с использованием культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может представлять угрозу для здоровья персонала лаборатории. Среди возбудителей болезней человека известны также и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита C, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов. Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов, таких, как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации. В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦРамплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции 35

позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах [5]. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления C. trachomatis. Принцип метода ПЦР Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (рис. 8). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНКполимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Для начала синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности. В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов: 1) денатурации, или «плавления» ДНК, когда двухцепочечная ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние; 2) связывания (отжига) праймеров с матричной ДНК; 3) элонгации, или удлинения цепи. Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (рис. 8.1). Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, т. е. растет с числом циклов экспоненциально. 36

В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taqполимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике. Для осуществления ПЦР в основном используются приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещаются в металлический блок, температура которого изменяется с помощью элемента Пельтье. Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР. Современные термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции. Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1–3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР. Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера. Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все более распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке. 37

Плавление (денатурация) двухцепочечной ДНК

Отжиг праймеров

Синтез новых цепей ДНК

1-й цикл → 2-й цикл

→ N-й цикл Х*(2N-2N) копий Х- количество копий ДНКмишени перед началом реакции

Рис. 8. Механизм полимеразной цепной реакции: основные этапы цикла ПЦР и процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов 38

Рис. 8. Механизм полимеразной цепной реакции: основные этапы цикла ПЦР и процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов Преимущества ПЦР как метода диагностики Одним из критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель чувствительности. При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов – г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем – диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %. Второй универсальный критерий лабораторной эффективности – специфичность – определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %. Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые» или экспресс-тесты, имеют чувствительность 40–60 %, ИФА – 50–70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75 %, культуральное исследование – 60–80 %, а ПЦР – от 90 до 100 %. Как видно, ПЦР, по сравнению с другими способами, обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и 39

непродолжительностью по времени анализа, т. е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом. Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики. 1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов. 2. Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами. 3. Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце. 4. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа. 5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т. е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства. 6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т. п. 7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата. 8. Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами. 40

Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. В настоящее время выделяют следующие недостатки. Один из них– технологический. Метод ПЦР подразумевает под собой высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тестнаборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат. Второй недостаток – клинический, заключающийся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40 % – 60 % лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – «инфицированность» и «инфекционная болезнь». Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов. Возможности применения метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦРамплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых 41

образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления C. trachomatis. Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR). Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (C. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или даже четырех возбудителей (H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите). Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических микроорганизмов. Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат. Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов. Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые тем не менее позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами (метод ПДРФ (RFLP) – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), или на определении 42

электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP – одноцепочечный конформационный полиморфизм). ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует однако отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов. Использование ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний В данном разделе будут рассмотрены только некоторые виды патологии, при которых метод ПЦР является основой диагностики и критерием эффективности лечения. ВИЧ-инфекция Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae. Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с фенотипом CD-4, присущим Т-лифоцитам хелперам и некоторым другим клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трёх направлениях: 1. Серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга, заключающаяся в определении в сыворотки крови антигенов и антител против ВИЧ. 2. Определение вирусной НК (провирусной-ДНК или РНК) методом ПЦР как в крови, так и в клетках крови. 3. Исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4 лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии. Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧинфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери, обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить 43

у ребенка материнские и его собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системы к возрасту 6–9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока. Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного вскармливания ребёнка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, т. к. риск заражения довольно высок и составляет около 5 %. Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если в первые 48 часов имеет место отрицательный результат ПЦР, но он становится положительным в возрасте 7–14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum. В настоящее время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вируса иммунодефицита. Определение «вирусной нагрузки» в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности антиретровирусной терапии. Таким образом, в настоящее время метод ПЦР является основным лабораторным критерием диагностики, прогноза и оценки эффективности лечения ВИЧ-инфекции. Вирусные гепатиты Современная таксономия вирусов гепатита человека представлена (табл. 8) семью типами возбудителей: А, В, С, D, Е, G и TTV. Для каждого вида возбудителя разработаны амплификационные тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатита В, С, D, G и TTV. Это обусловлено тем, что именно указанные возбудители больше всего ответственны за летальные, хронические и неопластические исходы вирусных гепатитов у людей. В патогенезе ВГ решающую роль играют свойства вируса и генетически детерминированный характер иммунного ответа на этот возбудитель, поэтому не менее важна оценка иммунитета (определение CD-4, CD-8, CD-56 и других фенотипов уровня интерферонов). Как указывалось выше, наиболее точные оценки иммунного статуса получаются при использовании метода проточной цитофлюориметрии.

44

Таблица 8 Общие характеристики вирусных гепатитов Заболевание/ Способ Геном вируса Диагностические тесты возбудитель передачи АлАТ, HAV РНК, Гепатит Одноцепочечная HAVAg, антитела к Энтеральный A/HAV РНК, 7500 осн. вирусу АлАТ, HBV ДНК, Гепатит Двухцепочечная HbsAg, HBeAg, Парентеральный антитела к вирусным B/HBV ДНК, 3200 осн. антигенам Гепатит Одноцепочечная АлАТ, HCV РНК, Парентеральный C/HCV РНК, 9500 осн. антитела к вирусу Гепатит Одноцепочечная НDV Ag, HDV РНК, Парентеральный D/HDV РНК, 1700 осн. антитела к вирусу Гепатит Одноцепочечная AлАТ, HEV РНК, Энтеральный E/НEV РНК, 7500 осн. антитела к вирусу Гепатит Одноцепочечная Парентеральный НGV РНК G/HGV РНК, 9500 осн. Одноцепочечная Гепатит ТТV Парентеральный TTV ДНК ДНК Вирусный гепатит В Серологическая диагностика и прогноз HBV-инфекции (HBV – от англ. Hepatitis B Virus) основаны на выявлении антигенов вируса и антител к нему. Но, как оказалось, в популяции вируса гепатита В встречается достаточно много мутантных штаммов (НВеАg-негативных), которые не улавливаются обычными серологическими тестами. Поэтому метод ПЦР для диагностики HBV-инфекции является крайне важным. Выявление ДНК HBV в крови имеет важное значение для прогноза острого ВГВ (рис. 9). Установлено, что персистирование ДНК HBV более 8 недель после дебюта заболевания указывает на хронизацию процесса (рис. 10), тогда как элиминация ДНК вируса в течение первых 2 недель болезни коррелирует с полным выздоровлением.

45

Рис. 9. Примерный серологический профиль, характерный для острого вирусного гепатита В с благоприятным исходом Рис. 10. Примерный серологический профиль, характерный для хронического гепатита В, вызванного вирусом дикого типа

Особенностью HBV-инфекции является наличие феномена так называемого «здорового» носительства НВsAg. Считается, что «здоровое» носительство НвsAg есть интегративная форма хронической HBVинфекции. Механизм этого феномена заключен в способности вируса гепатита В встраиваться в геном гепатоцита человека. При этом интеграция ДНК вируса в хромосому гепатоцита происходит не в полном объеме (дискретно), что приводит к синтезу только отдельных антигенов, в частности, НВsAg. Интересно отметить, что интегрированная ДНК вируса выявлялась в биоптатах печени у широкого круга лиц от абсолютно здоровых людей до пациентов с первичной гепатомой. В данной ситуации метод ПЦР позволяет дифференцировать интегративную и репликативную формы HBV-инфекции (табл. 9). Это имеет крайне важное клиническое значение, т. к. при интегративной форме HBV-инфекции человек незаразен для окружающих (отсутствует риск вертикальной передачи вируса от матери к плоду, возможность заражения для полового партнёра; человек по-прежнему сохраняет профессиональную пригодность и т. п.). Кроме того, таким пациентам не показана противовирусная терапия, более того, она для них даже опасна. Вместе с тем, при интегративной форме инфекции резко возрастает вероятность развития гепатомы (в 200 раз выше, чем у лиц без маркеров HBV-инфекции). Таким людям необходимо не менее одного раза в год проходить комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включающее в себя осмотр врача, печеночный комплекс, определение альфа-фетопротеина, ДНК HBV, 46

сонографию печени. Метод ПЦР имеет еще одно немаловажное клиническое значение: он может выступать в качестве арбитра для определения необходимости старта лечения и контроля эффективности терапии. Быстрое и стойкое исчезновение из крови ДНК НВV является прямым и надёжным тестом успешного исхода противовирусного лечения. Таблица 9 Маркеры вируса В в репликативную и интегративную фазы развития HBV-инфекции Фаза развития НВV-инфекции Маркеры НВV репликации интеграции 1.Сывороточные: НВsАg + + НвеАg + НВV ДНК + Аnti-НВс IgМ + Аnti-НВс IgG + +/Аnti-НВе + 2. Тканевые: НВсАg + НВsАg + + НВV ДНК + Таким образом, определение ДНК НВV в плазме крови является важнейшим анализом, который в совокупности с другими лабораторными исследованиями позволяет объективно диагностировать инфекцию, определять характер инфекционного процесса, выступать в качестве критерия в проведении терапии и оценки её эффективности. Вирусный гепатит C Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae и был идентифицирован в 1989 году как главный этиологический фактор посттрансфузионных гепатитов у людей. С открытием НСV (от англ. Hepatitus C Virus) начался процесс кардинального пересмотра этиопатогенеза и лечения хронических аутоиммунных гепатитов и криптогенных циррозов печени. По данным ВОЗ, около 3 % мирового населения инфицированы НСV. При этом ежегодно в мире регистрируется более одного миллиона новых случаев НСV-инфекции, что соответствует уровню пандемии. Особенностями НСV-инфекции является высокая частота хронизации (от 30 % до 95 % в зависимости от генотипа вируса), длительное бессимптомное или мимикрирующее под другие болезни 47

течение, возможность инфекции (рис. 11).

трансплацентарной

Рис. 11. Фазы течения НСV-инфекции

и

сексуальной

передачи

Рис. 12. Алгоритм обследования пациента на НСV-инфекцию

На рисунке 12 представлен алгоритм обследования пациента на НСV-инфекцию. Необходимо помнить, что у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С, возможны несовпадения результатов определения антител и РНК вируса. Ложноотрицательные результаты в ИФА при положительной ПЦР имеют место в следующих ситуациях. 1. Исследование произведено в ранние сроки после заражения или в так называемую фазу «серологического окна», которая длится от 2 недель до 6 месяцев. Это является основной причиной того, что методами ИФА в сыворотке крови не всегда удается обнаружить антитела против вируса гепатита С. 2. У иммуносупрессивных пациентов, в частности у ВИЧинфицированных, онкологических и туберкулёзных больных. 3. При инфицировании редкими генотипами НСV-инфекции, например 4 и 5 субтипами вируса С. Негативная ПЦР при положительном ответе в ИФА чаще всего бывает вследствие низкой концентрации вируса в крови (порог аналитической чувствительности) или при действительной элиминации патогена из организма, но при этом антитела к вирусу гепатита С ещё могут циркулировать в крови до двух лет. В целом необходимо помнить, что серологическая диагностика НСV-инфекции, т. е. выявление специфических антител класса M и G, решает задачу этиологического диагноза ВГ, но не определяет характер и прогноз инфекционного процесса. Более того, тест-систем ИФА для практического

48

здравоохранения с целью определения антигенов вируса гепатита С вообще не существует. Таким образом, применение ПЦР позволяет выявлять вирус гепатита С на самом раннем этапе инфекционного процесса, поскольку РНК вируса гепатита С может обнаруживаться в сыворотке крови уже через неделю после инфицирования. Ещё одной уникальной возможностью метода ПЦР является определение генетической полиморфности вируса гепатита С. В настоящее время выделяют 6 основных генотипов вируса гепатита С, которые в свою очередь делятся на множество субтипов. В странах СНГ преобладающими являются 1, 2 и 3 генотипы ВГС, причем наличие субтипа 1b является наименее благоприятным признаком течения и успешной терапии НСV-инфекции. Метод ПЦР позволяет также определить перинатальное заражение ребёнка от НСV-инфицированной матери. Таким образом, в диагностике, оценке прогноза и успеха противовирусной терапии НСV-инфекции метод ПЦР не имеет себе равных. Вирусный гепатит D Вирус гепатита D является уникальным патогеном, занимающим промежуточное положение между вирусами и вириоидами, и классифицируется как рибозим. Вирус гепатита D был открыт в 1977 г. итальянским микробиологом Ризетто у больного хроническим вирусным гепатитом В. В начале его расценили как новый антиген НВV и обозначили согласно английскому алфавиту буквой «d» или HВdAg, т. е. вслед за HВcAg. Поcледующие исследования показали, что это самостоятельный вирус, а после открытия нового возбудителя гепатитов (НСV-инфекции) сложившуюся классификацию решили не менять. Вирус гепатита D является «дефектным», что обусловлено отсутствием собственной оболочки вокруг вирусной РНК. Для этой цели вирус гепатита D использует НВsAg, посредством которого и происходит адгезия к мембране гепатоцита. Рис. 13. Примерный серологический профиль, характерный для коинфекции вирусами DиВ

49

Рис. 14. Примерный серологический профиль, характерный для суперинфекции вирусом D у больного хроническим вирусным гепатитом В Таким образом, НDV – это всегда микст-инфекция с HBV, которая может быть в форме коинфекции (одновременное заражение вирусами гепатита В и D) (рис. 13) или суперинфекции (на фоне хронической моноHBV-инфекции происходит заражение НDV) (рис. 14). Поэтому эпидемиология, клиника, лечение, диагностика и профилактика HBV соответствует НDV. Лабораторное обследование на наличие вируса гепатита D обязательно для всех пациентов только после обнаружения маркеров HBV-инфекции. Необходимо помнить, что серологический спектр маркеров HBV-инфекции зачастую обеднён, что обусловлено феноменом вирусной интерференции (ингибиция репликации вируса гепатита В вирусом гепатита D). При всех вариантах течения НDV-инфекции (ко- или супер-) метод ПЦР позволяет определить вирусную РНК в сыворотке крови пациента. Поэтому данный метод исследования может использоваться для контроля эффективности терапии и прогноза течения и исхода болезни. Клинически важно определить имеющуюся микст-инфекцию гепатитов В и D, так как это определяет прогноз течения и исхода вирусного гепатита. НDV усиливает некротический эффект при HBV, а стало быть, повышает риск развития. Вирусный гепатит G Открытие вируса гепатита G (ВГG) в 1995 г. явилось следствием попыток ответить на вопрос, почему до 1/3 парентеральных ВГ оставались серологически недифференцированными. ВГG – это РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae. В настоящее время доказано генетическое разнообразие вируса, имеющего 5 генотипов. Этот факт необходимо учитывать для правильной клинической трактовки результатов исследований. ВГG протекает чаще всего в иннапарантных или субклинических формах, что приближает его к НСV-инфекции. Хотя данный вирус выделен из крови и биоптатов печени больных хроническим гепатитом, что практически доказывает патогенность вируса, имеющиеся в настоящее время факты заставляют некоторых гепатологов критически относиться к способности НGV-инфекции вызывать поражения печени. 50

Это обусловлено рядом обстоятельств: так, вирус гепатита G чаще всего встречается в форме микст-инфекции с НСV; у 2 % клинически здоровых доноров в сыворотке крови определяется РНК вируса гепатита G; до сих пор не уточнено место репликации вируса; не наблюдается корреляция между уровнем вирусемии и активностью АлАТ. Вместе с тем не вызывает сомнения, что выявление НGV-инфекции у пациента является важным фактором в клиническом понимании и оценке статуса больного с ВГ. Повидимому, НGV-инфекция является ко-инфекцией НСV и усугубляет течение последней. В настоящее время серологические методы исследования (ИФА) по отношению к НGV ещё не доступны широкой клинической практике и поэтому метод ПЦР остается единственным способом доказать наличие инфицирования этим вирусом. Мы считаем обязательным обследование на НGV-инфекцию методом ПЦР всех серонегативных больных острым или хроническим ВГ; пациентов с маркерами НСV-инфекции, особенно готовящихся к проведению противовирусной терапии; доноров крови; органы или ткани, предназначенные для трансплантации. Герпетическая инфекция Современная таксономия семейства Herpesviridae огромна и включает в себя 80 видов вирусов, которые паразитируют в организмах практически всех существ – от устриц до человека. Герпес-вирусы имеют стабильные родовые свойства, основными из которых являются структура ДНК и механизмы инфицирования клеток хозяина. В настоящее время известно 8 патогенных для человека герпес-вирусов (табл. 10). Герпесвирусная инфекция является наиболее распространённой и может проявляться в разных формах: от пожизненной латентной персистенции до лимфопролиферативных состояний. В связи с этим любая герпес-вирусная инфекция лучше всего характеризуется этим образным выражением: «Однажды инфицирован – инфицирован на всю жизнь». Появляющиеся в ответ на внедрение вирусов герпеса специфические антитела зачастую не обеспечивают санацию организма от вирусов герпеса и не предупреждают рецидива заболевания. В связи с этим перед практикующим врачом стоят задачи: составить наиболее адекватный план лабораторного обследования и правильно оценить полученные результаты. Необходимо помнить, что антитела к большинству герпес-вирусов выявляются более чем у 90 % людей старше 25 лет, не имевших на момент обследования клиники какихлибо герпетических заболеваний. Вместе с тем, как указывалось выше, обнаружение в сыворотке крови ДНК какого-либо из герпес-вирусов не всегда означает дальнейшее развитие клинически манифестной инфекции или является причиной имеющейся патологии. Поэтому врачу крайне важно провести дифференциальную диагностику между состоянием 51

«инфицированности» и «болезни», вызванной каким-либо герпетическим вирусом. Таблица 10 Классификация герпес-вирусных инфекций человека Альфа-герпесы Бета-герпесы Гамма-герпесы ЦМВ – цитомегаловирус ВЭБ – вирус ВПГ 1 – вирус ВГ-6 – герпес-вирус 6 Эпштейна–Барр; простого герпеса 1 типа ГВ-8 – герпесВПГ 2 – вирус ВГ-7 – герпес-вирус 7 вирус 8 типа простого герпеса 2 V-Z – вирус ветряной оспы/ типа опоясывающего герпеса С этой целью лабораторные исследования должны проводиться по следующему алгоритму: – 1 этап: тестирование на наличие противогерпетических антител класса М и G методом твердофазного ИФА, а также определение ДНК методом ПЦР (кровь, ликвор, секреты слизистой); – 2 этап: не ранее чем через две, а лучше через три недели повторить обследование методом ИФА на наличие вышеуказанных антител. Проведение ПЦР в этом периоде необходимо только в случае спорной клинической ситуации; – 3 этап: обязательное обследование методом ПЦР для определения ДНК в сыворотке крови, ликворе или другой биологической среде, сроки которого определяются клинически и обычно зависят от протокола лечения. Серологические исследования на данном этапе носят второстепенный характер. Смысл такой последовательности заключается в том, что первые два этапа позволяют установить этиологию и характер инфекционного процесса (острая, хроническая или латентная формы). На третьем этапе врач осуществляет прогноз инфекции, и если назначалось лечение, то оценивает его эффективность. В этой фазе лечебнодиагностического процесса метод ПЦР играет ключевую роль, т. к. уровень специфических антител не отражает степени виремии, а стало быть, прогноз болезни и качество проведенной терапии. Цитомегаловирус Цитомегаловирус (ЦМВ) может быть причиной многих серьёзных заболеваний с летальным исходом. Темпы роста заражения ЦМВ составляют 1 % в год, при этом к пятидесятилетнему возрасту инфицированность людей приближается к 100 % показателю. Эти факты не позволяют однозначно ответить на вопрос о степени патогенности вируса. С одной стороны, ЦМВ редко вызывает клинически манифестные заболевания у иммунокомпетентных людей. С другой стороны, у иммунодефицитных пациентов отмечено развитие таких ЦМВ52

обусловленных заболеваний, как мононуклеоз (гетерофильнонегативный вариант), хориоретинит, ретардация ментальных функций, глухота и т. п. Как и при любой другой герпетической инфекции при первичном инфицировании ЦМВ возникает пожизненная латенция. Реактивация ЦМВ-инфекции зависит от состояния иммунной системы организма, срыв которой приводит к возможности патологического влияния вируса на организм. Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает в себя несколько подходов: 1) выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов; 2) определение вирусной ДНК; 3) определение иммунного ответа организма; 4) выявление прямого цитопатического действия вируса, выделенного из биологических субстратов пациента, на перевиваемую культуру клеток. Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфицирования данным вирусом. Однако это отнюдь не является основанием для заключения о том, что болезнь действительно вызвана ЦМВ. Показано, что высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфических антител против ЦМВ класса М и G также не позволяет с полной уверенностью дифференцировать острую инфекцию от реактивации хронической. Поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится важным тестом для диагностики заболевания этим вирусом. Метод ПЦР широко используется для диагностики ЦМВ в любых биологических тканях и жидкостях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся аналоги. Для увеличения диагностической и прогностической значимости разрабатываются количественные методы исследования, создаются праймеры к сверхранним, ранним и поздним генам вируса. Кроме того, апробируются новые технологии ПЦР, основанные на определении РНК-зависимой ДНКполимеразы. Это позволит выявлять мРНК реплицирующегося ЦМВ. Во многих работах показано, что прямая детекция ДНК ЦМВ в плазме методом ПЦР, коррелирует с повышенным риском развития манифестной формы ЦМВ или связанными с ней осложнениями. Кроме того, определение вирусной нагрузки ЦМВ в крови позволяет оценить эффективность противовирусной терапии. Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) Инфекция, названная так в честь учёных Мишеля Эпштейна и Эвелины Барр, выделивших в 1964 г. патоген из опухоли (лимфомы) Беркитта. ВЭБ – широко распространённая инфекция, контаминация которой происходит обычно в молодом возрасте. При этом ВЭБ-инфекция, 53

как и любая герпетическая инфекция, может протекать в форме первичного заражения или реактивации латентного процесса (табл. 11). Как видно из представленной таблицы, ВЭБ – это потенциально онкогенная инфекция. Таблица 11 Клинические варианты ВЭБ-ассоциированных лимфопролиферативных заболеваний Тип инфекции Заболевание Инфекционный мононуклеоз Лимфома Беркитта Первичная инфекция Болезнь Ходжкина Хроническая инфекция Реактивация хронической Синдром Дункана Назофарингиальная карцинома инфекции Лимфомы у ВИЧ-инфицированных Лабораторная диагностика ВЭБ-инфекции базируется на цитологическом исследовании крови или костного мозга, серологических исследованиях (определение гетерофильных и противовирусных антител) и ПЦР. Вирус ЭБ может быть обнаружен методом ПЦР в сыворотке крови, слюне, ткани опухоли и костном мозге. При этом важно сопоставление результатов клинических, серологических и молекулярных обследований в определении ВЭБ-инфекции как причины имеющегося заболевания. Папиллома-вирусная инфекция человека HPV-инфекцию начали интенсивно изучать после установления доказательств роли данного вируса в возникновении опухолей аногенитальной области, в частности, рака шейки матки. HPV – мелкие ДНК-вирусы, особенностью которых является пролиферативное влияние на эпителиоциты кожи и наружных слизистых. В настоящее время известно около 100 типов HPV, различаемых онкогенными свойствами. К группе высокого онкопотенциала относят следующие типы вирусов папилломы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. К типам с низкими предиктами онкогенности относят варианты: 6, 11, 42, 43 и 44. В таблице 12 представлены основные типы НРV и характерные для них клинические проявления. В лабораторной диагностике НРV-инфекции применяются исключительно молекулярногенетические методы анализа. Использование метода ПЦР для выявления папилломатоза резко повышает уровень доклинической диагностики предраковых состояний, благодаря высочайшей чувствительности и предсказательной ценности типирования вируса. Проведенные эпидемиологические исследования в Европе и Северной Америке показали, что при всех формах инвазивного рака матки у 70 % женщин старше 35 лет с дисплазией клеток эпителия матки был выявлен вирус 54

папилломы, преимущественно 16 и 18 типов. При обследовании женщин с нормальной цитологией НРV обнаруживался только в 3,5 % случаях. Таблица 12 Типы HPV, обнаруженные при различных поражениях кожи и слизистых оболочек Клинические проявления типы HPV Кожные поражения Подошвенные бородавки 1, 2, 4 Обычные бородавки 2, 4, 26, 27, 29, 57 Плоские бородавки 3, 10, 28, 49 Бородавки Бютчера 7 Бородавчатая 5, 8, 9, 10, 12, 15, 19, 36 эпидермодисплазия Небородавчатые кожные 37, 38 поражения Поражения слизистых гениталий Condylomata accurninata 6, 11, 42–44, 54 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, Некондиломатозные поражения 43, 51, 52, 55, 56, 57–59, 61, 64, 67–70 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 66, Карцинома 68 Поражения прочих слизистых оболочек Папиллома гортани 6, 11, 30 Карцинома шеи, языка 2, 6, 11, 16, 18, 30 Таким образом, метод ПЦР в профилактике (доклинической диагностике) онкологических заболеваний аногенитальной области папилломатозной этиологии не имеет себе равных. Хламидиозная инфекция Хламидии относятся к классу Rickettsias и включают одно семейство Сhlamydiaceae с единственным родом Chlamydia. В настоящее время известны три видовых таксона: C. Trachomatis, C. Psittaci и C. Pneumoniae. Наибольший удельный вес имеют генитальные формы, которые вызываются C. Trachomatis. По данным специалистов ВОЗ, ежегодно у около 50 млн человек впервые диагностируется генитальный хламидиоз. Экологической нишей хламидийной инфекции является цилиндрический эпителий шейки матки, уретра и прямая кишка. Полагают, что около 10 % всех женщин и мужчин инфицированы C. Trachomatis, при этом у пациентов хламидиоз протекает бессимптомно. 55

Вместе с тем, хламидии могут вызывать тяжелые заболевания, характеризующиеся как хронические воспаления малого таза, приводящие к бесплодию (женскому и мужскому) и другим последствиям. Для диагностики хламидиозной инфекции используют прямые (культуральные и молекулярно-генетические) и косвенные (определение специфических антител) методы диагностики. Наиболее доступным и эффективным является метод ПЦР. Число микроорганизмов в пробе

1

101

102

103

104

105

106

Амплификация ДНК

Изоляция в культуре клеток Прямая иммунофлюоресценция

Рис.15. Относительный предел измерения (аналитическая чувствительность) прямых методов диагностики C. Trachomatis (Carolyn M. Black, 1997)

Выявление антигена методом ИФА

Гибридизация

Микоплазменная инфекция Микоплазмы представляют собой мельчайшие бактерии, лишённые жесткой клеточной стенки. Последнее обстоятельство позволяет относить их, наряду с хламидиями, риккетсиями, актиномицетами и спирохетами, к атипичным бактериям. Патогенными для человека являются М. pneumoniae, вызывающая микоплазменную пневмонию, а также M. Hominis и U. Urealyticum, вызывающие урогенитальные заболевания мужчин и женщин. Клинические проявления микоплазменной инфекции весьма разнообразны и зависят от вида возбудителя и состояния макроорганизма: от латентной инфекции до менингита новорожденных, артрита (синдром Рейтера) или бесплодия. Различают острый, подострый, вялотекущий и хронический микоплазмоз. Лабораторная диагностика микоплазмозов без использования метода ПЦР сложна. До внедрения молекулярно-диагностических способов диагностики лабораторная верификация любой формы микоплазменной инфекции строилась на малодоступном методе выделения чистой культуры и серологическом обследовании на наличие специфических антител. Это связано с тем, что до 80 % здоровых людей имеют антитела к микоплазме и только нарастание титра антител в 4 раза является диагностически значимым. Основными преимуществами метода ПЦР в лабораторной диагностике микоплазмоза являются: высокая чувствительность, что особенно важно при хронических и подвергшихся лечению формах инфекции; высокая 56

специфичность; менее строгие требования к забору и транспортировке материала; возможность быстрого получения результатов анализа. Хеликобактерная инфекция В 1983 г. совершенно случайно из архивного эндоскопического биоптата микробиологами Маршаллом и Уорреном была выделена чистая культура Helicobacter pylori. Данный возбудитель – типичный антропоноз, экологической средой обитания которого является слизистая желудка, на которой H. Pylori может длительно (возможно, пожизненно) персистировать, не вызывая болезнь. Основными доказательствами этиопатогенетической значимости H. Pylori в возникновении и развитии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки являются следующие факты: – у больных с язвой двенадцатиперстной кишки и желудка статистически достоверно на 85–90 % чаще выявляются маркеры хеликобактерной инфекции; – у лиц, заражённых H. Pylori, язвенная болезнь развивается достоверно чаще, чем у лиц без данного патогена; – эрадикация с помощью антибиотиков H. Pylori позволяет излечить язвенную болезнь. Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции строится на следующих критериях: 1. Получение чистой культуры H. Pylori из эндоскопического материала и определение ее токсичности. 2. Микроскопия отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. 3. Определение уреазной активности в биопсийном материале или в содержимом желудка (респираторный тест). 4. Серологический тест на обнаружение антител к хеликобактеру. 5. Метод ПЦР для выявления ДНК в эндоскопическом биоптате. ПЦР в этом ряду диагностических тестов имеет одно неоспоримое преимущество. Вследствие своей высокой чувствительности данный метод позволяет точно определить присутствие H. Pylori и ее способность к токсинообразованию (т. е. патогенность) и оценить эффективность проведенной терапии. Туберкулез Туберкулёз по-прежнему остается проблемой всеобщего масштаба. Это обусловлено целым рядом социально-экономических (бедность, недоступность медицинской помощи, предрассудки и т. п.) и медицинских (прежде всего эпидемией ВИЧ-инфекции) причин. По данным ВОЗ, от туберкулёза ежегодно умирает около 3 млн человек. Для лабораторной диагностики туберкулёза используется комплексный подход, который 57

включает в себя специфические и неспецифические методы. Специфические методы лабораторной верификации туберкулёза состоят из четырёх этапов: бактериологический; молекулярно-генетический; цитогистологический; иммунологический. Внедрение в практическую фтизиатрию молекулярно-генетических методов обследования стало решительным прорывом в диагностике различных форм туберкулёза. Применение ПЦР как главного молекулярно-генетического метода исследования позволяет в короткие сроки (до 48 часов) выявить микобактерии в любом биологическом материале. Это особенно важно, т. к. микобактерии отличаются замедленным ростом при культивировании на питательных средах. Так, аналитическая чувствительность коммерческих амплификационных тестсистем позволяет идентифицировать единичные колонии (до 10 клеток). Метод ПЦР позволяет избирательно проводить амплификацию фрагментов НК микобактерий, что позволяет добиться 100 % специфичности и 97 % чувствительности анализа. Кроме того, необходимо отметить ещё два достоинства метода ПЦР. Во-первых, возможность определения внелегочных форм. Во-вторых, идентификация химиорезистентности микобактерий, что резко повышает эффективность терапии. Таким образом, метод ПЦР позволяет на 30 % повысить выявляемость микобактерий туберкулёза при значительном (в 10 раз) сокращении времени исследования. Методы молекулярного типирования микроорганизмов на основе ПЦР ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, которые можно рассматривать как производные технологии ПЦР (табл. 13). На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпидемиологического исследования с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации, необходимости сравнения результатов с данными, полученными из других источников, а также от возможностей конкретной лаборатории. 58

Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов. Таблица 13 Наиболее распространенные методы генетического типирования микроорганизмов с использованием ПЦР Метод Основной принцип

Область применения

Точность, Трудо- Стоивоспро- емкость мость изводимость

RAP D (APPCR)

Амплификация произвольных участков генома в условиях нестрогого связывания праймеров

Локальные эпидемиологические исследования любых штаммов микроорганизмов, выделяемых на искусственных питательных средах

+

+

+

RepPCR (ERIC -PCR)

Амплификация участков генома, ограниченных консервативны ми повторяющимис я последовательн остями ДНК

Типирование многих грамотрицательных и грамположительных бактерий

++

+

+

ПЦРПДР Ф (PCRRFLP )

Амплификация специфических участков ДНК и их расщепление с помощью рестриктаз

Возможно типирование возбудителей, находящихся непосредственно в клинических образцах или в культуре клеток

++

++

++

Широкомасштабные эпидемиологические

+++

+++

+++

AFLP Расщепление геномной ДНК

59

рестриктазами, лигирование (сшивание) фрагментов с ДНКадаптерами и амплификация с помощью комплементарных им праймеров

исследования любых штаммов микроорганизмов, выделяемых на искусственных питательных средах

Использование ПЦР для выявления лекарственной устойчивости у микроорганизмов В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 недель. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности (табл. 14). Таблица 14 Примеры использования ПЦР для выявления резистентности к антимикробным препаратам у различных видов микроорганизмов Микроорганизм

Стафилококки (обычно S.aureus и S.epidermidis)

Антимикробные препараты Метициллин, (оксациллин) и другие βлактамы

Генетические механизмы резистентности Наличие гена mecA, кодирующего дополнительный пенициллинсвязыв 60

Методы обнаружения ПЦРэлектрофорез, ПЦРгибридизация

ающий белок (ПСБ-2a) Энтеробактери и (обычно E.coli и K.pneumoniae)

ЦС III*, другие β лактамы, кроме карбапенемов

Мутации в генах β-лактамаз, расширяющие спектр активности этих ферментов

ПЦР-ПДРФ, ПЦРSSCP

M.tuberculosis

Изониазид

Мутации в гене каталазыпероксидазы (katG), реже в генах inhA и ahpC

ПЦР-ПДРФ, ПЦРSSCP, ПЦРсиквенирование, другие методы.

Рифампицин

Мутации в гене субъединицы РНКполимеразы (rpoB)

Этамбутол

Мутации в гене embB, кодирующем синтез арабиногалактана

Стрептомицин Мутации в генах 16S рРНК (rrs) и рибосомного белка S12 (rpsL) Пиразинамид

Мутации в гене пиразинамидазы (pncA)

Фторхинолоны

Мутации в гене A субъединицы ДНК-гиразы (gyrA)

Вирус простого герпеса (ВПГ)

Ацикловир

Мутации в гене тимидинкиназы (tk), реже в гене ДНК-полимеразы

ПЦРсиквенирование

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

Ингибиторы Мутации в гене обратной полимеразы (pol) транскриптазы

ОТ-ПЦР**сиквенирование

61

– ЦС III – цефалоспорины III поколения (цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон и т. д.) – ** ОТ-ПЦР – обратнотранскриптазная ПЦР – метод обнаружения специфической РНК путем создания ее ДНК-копии и последующей амплификацией с помощью ПЦР. Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительно культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНКмишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину. Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов: – данные о конкретных генетических механизмах резистентности могут отсутствовать; – резистентность к определенным препаратам часто бывает связана с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип. Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом. Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антимикробным препаратам является дополнительным фактором, ограничивающим возможность широкого применения этого подхода в практической диагностике. Преимущества и недостатки метода ПЦР О многих преимуществах использования ПЦР по сравнению с традиционными микробиологическими методами уже изложено. Такие свойства ПЦР, как скорость и высокая производительность (то есть возможность параллельного анализа большого количества образцов), являются бесспорными преимуществами данного метода. Стандартные процедуры выделения микробной ДНК из клинического материала или 62

чистой культуры и последующей ПЦР-амплификации обычно требуют для своего завершения не более нескольких часов. Продукты ПЦР могут быть идентифицированы с помощью простых методов (гель-электрофорез, гибридизация) приблизительно за то же время. Таким образом, весь процесс ПЦР-анализа – от момента поступления образца в лабораторию до получения конечного результата – занимает обычно не более одного рабочего дня. Преимущество ПЦР в скорости по сравнению с культуральными методами особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинорезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3–5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки [22]. Важное свойство ПЦР – ее высокая специфичность, определяемая прежде всего уникальностью генетического материала каждого вида микроорганизмов. Поэтому при использовании праймеров, комплементарных определенной «видоспецифической» последовательности ДНК, и соблюдении оптимального температурного режима реакции многократному копированию подвергается только ДНК искомого вида даже в присутствии большого количества другой, «балластной», ДНК, например ДНК человека или других видов микроорганизмов. При использовании ПЦР для выявления определенного возбудителя специфичность является несомненным достоинством этого метода. С другой стороны, всегда следует помнить об «узкой направленности» ПЦР в отличие от культуральных методов, которые позволяют выявить рост различных видов микроорганизмов при посеве на первичные накопительные среды. Помимо высокой оперативности и специфичности ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК(РНК)-последовательности в исследуемом материале. Если в качестве мишени для ПЦР используется фрагмент ДНК, представленный большим количеством копий в геноме возбудителя (например, гены 16S рРНК у многих видов бактерий), то ПЦР позволяет обнаружить менее одного микроорганизма в образце (то есть фрагмент ДНК из лизированной микробной клетки). Следовательно, чувствительность порядка 0,5–1 микроорганизма на пробу вполне возможна для ПЦР, что позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного 63

титра (например, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций). В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей и гениталий). Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а следовательно, к ложноположительному результату. Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, является потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя. В случае высокой концентрации микробной ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления, используемые для механической гомогенизации тканей. При использовании ПЦР с универсальными праймерами (см. выше) источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР. 64

В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения. Одним из наиболее существенных требований, предъявляемых к диагностическим ПЦР-лабораториям, является необходимость разделения лаборатории на так называемые «пред-ПЦР-помещения», где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и «после-ПЦР-помещения», где анализируются продукты реакции. Обязательными являются также раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК. Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами. Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов. Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо 65

использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб. Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦРанализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов. Наконец, ПЦР является дорогостоящим исследованием. Для его реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами. ЛИТЕРАТУРА 1. Абелев Г.И. Моноклональные антитела / Г.И. Абелев // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – Т. 1. – С. 16–20. 2. Абелев Г.И. Основы иммунитета / Г.И. Абелев // Соросовский образовательный журнал. 1996. – . 5. – С. 4–10. 3. Березин И.В. Биотехнология / И.В. Березин ; под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. – М. : Высш. шк., 1987. – Кн. 8 : Инженерная энзимология. 4. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. – 2-е изд., доп и перераб. – М. : Мед. информ. агентство, 2001. – 734 с. 5. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Л.Б. Борисов, Б.Н. КозьминСоколов, И.С. Фрейдлин. – М. : Медицина, 1994. 6. Галактионов В.Г. Как работает иммунная система / В.Г. Галактионов // Соросовский образовательный журнал. – 1997. – Т. 12. – С. 2–9. 7. Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров [и др.]. – М. : Высш. шк., 1991. 8. Иммуноферментный анализ / под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. – М. : Мир, 1988. 66

9. Ллуэлин М.Б. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / М.Б Ллуэлин. – М. : Мир; 1999. – С. 428–447. 10. Лопухов Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике. Лабораторная диагностика / Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – Т. 2. – № 3. 11. Маккреди Б.Д. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Б.Д. Маккреди, Д.А. Чимера. – М. : Мир; 1999. – С. 496–506. 12. Медицинская микробиология / А.З. Байчурина, Г.Х. Гильманова, В.Е. Григорьев [и др.] ; гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев. – М. : ГЭОТАР Медицина, 1999. – 1183 с. 13. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии : учебник для студ. мед. училищ / под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М. : [Б.и.], 2001. 14. Bobo L.D. PCR Detection of Chlamydia trachomatis / L.D. Bobo //Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. – ASM Press : Washington ; 1993. – P. 235–241. 15. Cockerill III F.R. Genetic Methods for Assessing Antimicrobial Resistance / F.R. Cockerill // Antimicrob Agents Chemother. – 1999. – № 43. – Р. 199–212. 16. Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in Genitourinary Specimens from Men and Women by a Coamplification PCR Assay / K.A. Crotchfelt // J Clin Microbiol. – 1997. – № 35. – Р. 1536–1540. 17. Dragon A.D. Quality Control of Polymerase Chain Reaction. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications / A.D. Dragon. – Washington : ASM Press ; 1993. – P.160–168. 18. Fatima-Hannachi M. Detection of Mutations Conferring ExtendedSpectrum Activity of SHV (-Lactamases using Polymerase Chain Reaction Single Strand Conforma tional Polymorphism (PCR-SSCP) / M. FatimaHannachi // J. Antimicrob Chemother. – 1996. – № 37. – Р. 797–802. 19. Fredericks D.N. Application of Polymerase Chain Reaction to the Diagnosis of Infectious Diseases / D.N. Fredericks, D.A. Relman // Clin Infect Dis. – 1999. – № 29. – Р. 457–488. 20. Hendolin P.H. Use of Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Four Bacterial Species in Middle Ear Effusions / P.H. Hendolin // J Clin Microbiol. – 1997. – № 35. – Р. 2854–2858. 21. Homopolymer Mutational Hot Spots Mediate Herpes Simplex Virus Resistance to Acyclovir / J.J. Sasadeusz [etc] // J Virol. – 1997. – № 71. – Р. 3872–3877. 67

22. McDonough M. PCR Detection of Human Adenoviruses. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications / M. McDonough [etc]. – Washington : ASM Press ; 1993. – Р. 389–393. 23. Mickelsen P.A. The Use of Molecular Strain Typing Has Become a Standard of Practice / P.A. Mickelsen // Clin Microbiol Newsletter. – 1997. – № 19. – Р. 137–142. 24. Mulder J.G. Comparison of Disk Diffusion, the Etest, and Detection of mecA for Determination of Methicillin Resistance in Coagulase-Negative Staphylococci / J.G. Mulder // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 1996. – № 15. – Р. 567–573. 25. Mullis K.B. Specific Synthesis of DNA in vitro via a PolymeraseCatalysed Chain Reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. – 1987. – № 155. – Р. 335–350. 26. Newton C.R. PCR / C.R. Newton, A. Graham. – Oxford : Bios Scientific Publishers ; 1996. – Р.18–19. 27. Persing D.H. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications / D.H. Persing, G.D. Cimino. – Washington : ASM Press ; 1993. – Р.105–121. 28. Pfaller M.A. The Clinical Microbiology Laboratory and Infection Control: Emerging Pathogens, Antimicrobial Resistance, and New Technology / M.A. Pfaller, L.A. Herwaldt // Clin Infect Dis. – 1997. – № 25. – Р. 858–870. 29. Ralph D. Arbitrary Primed PCR Methods for Studying Bacterial Diseases. Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications / D. Ralph, M. McClelland. – Totowa : Humana Press ; 1998. – Р. 83–102. 30. Ridley A.M. Genomic Fingerprinting by Application of rep-PCR. Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications / A.M. Ridley. – Totowa : Humana Press ; 1998. – Р.103–117. 31. Savelkoul P.H. Amplified-Fragment Length Polymorphism Analysis: the State of an Art / P.H. Savelkoul // J Clin Microbiol. – 1999. – № 37. – Р. 3083–3091. 32. Swaminathan B. Molecular Typing Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications / B. Swaminathan, G.M. Matar.– Washington : ASM Press ; 1993. –Р. 26–50. 33. Use of Polymerase Chain Reaction Single-Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) Analysis to Detect a Point Mutation in the Catalase-Peroxidase Gene (katG) of Mycobacterium tuberculosis / Z. Temesgen // Mol Cell Probes. – 1997. – № 11. – Р. 59–63. 34. Widjojoatmojo M.N. Rapid Identification of Bacteria by PCR-SingleStrand Conformation Polymorphism / M.N. Widjojoatmojo, A.C. Fluit, J. Verhoef // J Clin Microbiol. – 1994. – № 32. – Р. 3002–3007.

68

Учебное издание

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Учебно-методическое пособие для вузов

Составители: Семенихина Анастасия Владимировна, Рахманова Татьяна Ивановна, Нехаева Галина Ивановна, Попова Татьяна Николаевна, Редактор О.А. Исаева

Подписано в печать 24.08.07. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 4. Тираж 50 экз. Заказ 1742. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс) http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: [email protected] Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133. 69