Термодинамический анализ доменной организации кальций-зависимых белков

Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

На правах рукописи

Цветков Филипп Олегович

Термодинамический анализ доменной организации кальций-зависимых белков

03.00.03- Молекулярная биология

диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук А.А.Макаров

Москва - 2001

1

Содержание 1.

ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Дифференциальная сканирующая калориметрия как метод изучения структуры белков 2.1.1. Техника сканирующей калориметрии 2.1.2. Калориметрические измерения 2.1.3. Анализ результатов

6 9

2.1.

9 9 11 13

2.2. Калмодулин 2.2.1. Структура и функции калмодулина (СаМ) 2.2.2. Связывание кальция калмодулином 2.2.3. Связывание калмодулина с белками-мишенями

19 19 24 25

2.3.

31

Кальций-векторный белок (CaVP) из Amphioxus

2.4. Hsp90 2.4.1. Молекулярные характеристики и структура hsp90 2.4.2. Структура hsp90: N-концевой домен 2.4.3. Структура hsp90: С-концевой домен

35 36 38 39

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

40

3.1. Объекты и материалы 3.1.1. Белок теплового шока hsp90 3.1.2. Калмодулин и пептид RS20 3.1.3.

Кальций-векторный белок (CaVP)

3.2. Методы исследований 3.2.1. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК) 3.2.2. Круговой Дихроизм (КД) 3.2.3. Изотермическая Калориметрия Титрования 3.2.4. Флюоресценция триптофана 3.2.5. Метод поперечных ковалентных сшивок (кросс-линкинг) 3.2.6. Ионизационная электро-спрей масс-спектрометрия (ESI-MS)

40 40 40 41 43 43 45 46 47 47 48

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАЛМОДУЛИНА С САМ-СВЯЗЫВАЮЩИМ ДОМЕНОМ КИНАЗЫ ЛЁГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА ГЛАДКИХ МЫШЦ (RS20) ПРИ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ НАСЫЩЕНИЯ КАЛЬЦИЕМ 48 4.1.

Пептид RS20 связывается с CaM в отсутствии ионов кальция

50

4.2.

Изменение термодинамических параметров тепловой денатурации апокалмодулина при образовании комплекса с RS20 доказывает, что пептид связывается лишь с С-концевым доменом белка

52 2

4.3. Данные сканирующей микрокалориметрии подтверждают, что в присутствии ионов кальция RS20 взаимодействует с обеими долями калмодулина 4.4.

55

Данные КД-спектроскопии комплекса апоCaM-RS20 указывают на то, что пептид принимает частично спиральную конформацию

56

Данные масс-спектрометрии подтверждают существо-вание комплекса апоCaM-RS20

57

Пептид RS20 сильно увеличивает кооперативность связывания калмодулином кальция, что приводит к отсутствию форм комплекса, частично насыщенных кальцием

61

4.7.

Компьютерное моделирование комплекса апоСаМ с пептидом RS20

63

4.8.

Заключение

63

4.5. 4.6.

5. ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА КАЛЬЦИЙ-ВЕКТОРНОГО БЕЛКА (CAVP) ИЗ AMPHIOXUS: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДОМЕНОВ И ИХ РОЛЬ В РАСПОЗНАВАНИИ БЕЛКА-МИШЕНИ CAVPT 66 5.1. 5.2. 5.3. 5.4.

5.5. 5.6.

Рекомбинантный и природный CaVP имеют одинаковые конформации и сходным образом связываются с мишенью

66

N-концевой домен CaVP не влияет на кальций-связывающие свойства С-концевого домена

68

Рекомбинантные N-CaVP и С-CaVP не взаимодействуют друг с другом

69

N- и C-концевые доли CaVP представляют собой отдельные кооперативные домены, а C-домен и степень насыщения его кальцием модулируют стабильность N-домена

71

Только С-домен CaVP образует эквимолярный комплекс с CaVPТ, а N-домен модулирует это взаимодействие

76

Заключение

79

6. ТЕПЛОВАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP90: ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И МАГНИЯ 6.1.

Анализ температурной зависимости процесса олигомери-зации hsp90 с помощью нативного ПАГ-электрофореза показал, что ионы кальция и магния понижают температуру, при которой происходит самоассоциация димеров белка

81

82

3

6.2.

6.3. 6.4. 6.5.

При плавлении hsp90 претерпевает два денатурационных перехода, первый из которых соответствует плавлению N-концевого домена белка

85

Ионы кальция и магния снижают термостабильность hsp90 и температуру начала самоассоциации

87

Спектры КД hsp90 указывают на то, что кальций и магний изменяют третичную структуру белка

89

Заключение

90

4

Список сокращений апоСаМ

- апокалмодулин (СаМ, не связанный с кальцием)

СаМ

- калмодулин

CaVP

- кальций-векторный белок из Amphioxus (calcium vector protein)

CaVPT

- белок-мишень CaVP (calcium vector protein target)

EGTA

- (этилендиокси) диэтилендинитрилотетрауксусная кислота

ESI-FTICR

- Electrospray Ionization-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry

hsp90

- белок теплового шока 90 (heat shock protein 90)

ITC

- изотермическая калориметрия титрования (Isothermal Titration Calorimetry)

RS20

- пептид, соответствующий СаМ-связывающему домену smMLCK

smMLCK

- киназа лёгких цепей миозина гладких мышц

ДСК

- дифференциальная сканирующая калориметрия

КД

- круговой дихроизм

5

1. Введение Ионы кальция являются ключевыми мессенджерами в эукариотических клетках, контролирующими многие биологические процессы путем взаимодействия с большим числом кальций-связывающих белков. Внутриклеточная концентрация свободного кальция, возможно, является наиболее распространенным сигнальным феноменом в клетке и её величина составляет около 10-7М, что примерно в 10′000 раз меньше, чем концентрация кальция вне клетки. Однако, и в самой клетке распределение кальция далеко не равномерно и может варьировать на один-два порядка. Так, концентрация кальция около клеточной мембраны примерно в десять раз превышает её нормальное значение в клетке, а в эндоплазматическом ретикулуме (служащим основным хранилищем и источником кальция в цитозоле) она вообще в сотни раз выше. Сигнал кальция участвует в клеточном цикле, клеточной дифференцировке, мышечном сокращении, ферментативной

активности, изменении архитектуры клетки

путем перестройки

элементов цитоскелета (микротрубочки, актин-миозиновые нити) и в таких процессах как апоптоз.

Модуляция

клеточных

функций

кальцием

включает

преобразование

количественного сигнала (изменение внутриклеточной концентрации кальция) в качественный

биологический

ответ.

Сигнальный

механизм,

используемый

модулируемыми кальцием белками, имеет четыре основные стадии: • связывание Са, • конформационное изменение, • взаимодействие с мишенью и • активация мишени. Активация мишени приводит в движение молекулярный каскад, приводящий к целому ряду событий в клетке, придавая, таким образом, биологическую форму сигналам кальция. Перенасыщение кальцием в результате апоплексического удара или ишемии активирует биохимические процессы, приводящие к энзиматической деградации белков и смерти клетки. Более того, в последние годы было показано, что большое число заболеваний,

включая

болезнь

Альцгеймера,

гиперхолестероланемию,

нейродегенеративные нарушения и неопластические заболевания, связаны с гомеостазом кальция. На сегодняшний день известно более 400 Са2+-связывающих белков, разделённых на несколько семейств. Данная работа посвящена изучению двух представителей семейства EF-hand*, калмодулина и кальций-векторного белка из Amphioxus (CaVP), а также белка теплового шока hsp90. Последний хотя и не связывает кальций специфично, однако играет важнейшую роль при расшифровке кальциевого сигнала во время теплового стресса. Из всех детекторов кальция калмодулин является наиболее распространённым. Найденный *

в этом семействе эволюционной, функциональной и структурной Са2+-связывающей единицей является мотив спираль-петля-спираль, называемый EF-hand по аналогии с E- и F-спиралями парвальбумина.

6

во всех эукариотических клетках, он активирует большое число мишеней, хотя сам и не проявляет ферментативной активности. CaVP, напротив, имеет очень узкую локализацию и взаимодействует лишь с одной известной на сегодняшний день мишенью – CaVPT (calcium vector protein target). В связи с вышесказанным, актуальной является проблема понимания механизмов, ответственных за преобразование кальциевого сигнала, осуществляемое этими белками. Некоторые кальций-связывающие белки, такие как калмодулин или тропонин С, хорошо известны и изучены, их структура определена с высоким разрешением, как в кальциевой, так и в апо-форме; структуру и функции других, таких как кальций-векторный белок из Amphioxus, ещё только предстоит изучить. Однако, понимание функционирования этих белков требует не только знания их пространственной структуры. Оно в существенной мере зависит от термодинамического исследования доменной организации и роли отдельных доменов при взаимодействии кальций-связывающих белков со своими мишенями, поскольку домены зачастую являются биологически функциональными единицами, а их взаимодействие обеспечивает внутримолекулярную коммуникацию и координирует их действия. Идеальным

инструментом

для

такого

рода

исследований

являются

калориметрические методы. Они позволяют получить не только исчерпывающую информацию о термодинамике исследуемых белков, но и пролить свет на их доменную структуру

и

междоменные

взаимодействия,

а

также

получить

прямую

термодинамическую информацию о процессе их взаимодействия с белками-мишенями. Функциональная зависимость между энтальпией и температурой, получаемая в ходе калориметрическиго эксперимента, включает всю термодинамическую информацию о макроскопических состояниях системы в данном интервале температур. Анализируя функцию теплоёмкости белков от температуры, мы получаем полное термодинамическое описание их нативного состояния и промежуточных состояний, которые возникают при разворачивании белка под действием температуры. Термин «стабильность белка» относится

к

его

способности

сохранять

уникальную

трёхмерную

структуру

полипептидной цепи при экстремальных воздействиях теплом, кислотой, щелочью, давлением и другими физическими и химическими агентами. При этом среди различных денатурантов температура обладает существенным преимуществом, так как это наиболее универсальный фактор воздействия, имеющий фундаментальное физическое значение. Данная работа посвящена исследованию доменной организации, междоменного взаимодействия и особенностей функционирования ряда кальций-зависимых белков (калмодулина, кальций-векторного белка и белка теплового шока hsp90) при различных 7

степенях насыщения кальцием с помощью методов сканирующей и изотермической микрокалориметрии, масс-спектрометрии и КД-спектроскопии. В задачи исследования входило: изучение взаимодействия апокалмодулина с двадцатичленным пептидом, соответствующим калмодулин-связывающему домену киназы лёгких цепей миозина гладких мышц (RS20); доменной организации кальций-векторного белка из Amphioxus и его рекомбинантных N- и C-концевых долей и их взаимодействия с мишенью; термостабильности белка теплового шока hsp90, а также влияния на его денатурацию и функционирование ионов кальция.

8

2.

Обзор литературы

2.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия как метод изучения структуры белков 2.1.1. Техника сканирующей калориметрии Первые дифференциальные калориметры, появившиеся в середине шестидесятых годов, обладали чувствительностью на три порядка выше, чем у абсолютных калориметров, существовавших к тому времени

[1,2]

. Такое существенной увеличение

чувствительности было достигнуто за счёт использования наряду с дифференциальной схемой измерений непрерывного нагрева и полной адиабатичности ячеек. Важным шагом стало применение неизвлекаемых ячеек, что позволило повысить точность получаемых результатов за счёт увеличения воспроизводимости их заполнения. Материалами для ячеек служат платина, золото, сплавы тантала и стекло.

Нагреватель оболочки

Термостат Адиабатическая оболочка Ячейка 1 Ячейка 2 ∆T2

∆T1

Нагреватель

Регулятор нагрева 1

Нагреватель

Регулятор нагрева 2

Термометр

Компьютер Рис.2.1. Принципиальная схема измерительного блока дифференциального сканирующего микрокалориметра.

9

Дальнейшее

усовершенствование

было

достигнуто путём использования капиллярных спиральных калориметрических ячеек, которые позволили снизить температурный градиент в ячейках, существенно упростить их заполнение и избежать тем самым появления в ячейке пузырьков,

которые

вносят

существенную

ошибку в измерение теплоёмкости. Кроме того, стало

возможным

увеличить

избыточное

давление, подводимое к ячейкам, и тем самым расширить температурный интервал измерений до 130°C. Представителями калориметров с капиллярными ячейками являются ДАСМ-4, MicroСal-2

и

Nano-DSC,

Российской

Академией

«Биоприбор»,

Пущино),

производимые Наук

фирмой

(НПО MicroCal

(США) и Calorimetry Sciences Corporation (США), соответственно. На рис.2.1 изображена схема современного Рис.2.2. ДСК последнего поколения VP-DSC фирмы MicroCal (США).

сканирующего идентичные

микрокалориметра. ячейки,

изолированные

Две от

окружающей среды с помощью адиабатической

оболочки, прогреваются с постоянной скоростью. При этом одна из ячеек заполнена растворителем, а другая раствором белка. Мощности электронагревателей обеих ячеек автоматически регулируются с помощью «Регулятора нагрева 1 и 2» (рис.2.1) так, чтобы выдержать заданную скорость нагрева, при этом основная энергия идёт на нагрев растворов в ячейках. Однако, часть этой энергии расходуется на нагрев и плавление в одной из ячеек исследуемого белка. Из-за этого, для поддержания одинаковой температуры в ячейках и сохранения одинаковой скорости их прогрева, мощности, подводимые к ячейкам различны. Эта разность мощностей регистрируется с помощью компьютера или самописца в виде функции от температуры. Таким образом, происходит сканирование по температурной шкале с непрерывной регистрацией теплового разбаланса ячеек, возникающего из-за дополнительных тепловых затрат требующихся для нагрева и плавления исследуемого белка.

10

На рис.2.2 изображен дифференциальный сканирующий калориметр последнего поколения VP-DSC фирмы MicroCalorimeter (США), являющийся абсолютным лидером по чувствительности и стабильности базовой линии. Требования к чистоте и гомогенности образцов в микрокалориметрических экспериментах

достаточно

высокие.

Необходимая

для

измерений

концентрация

изучаемого вещества зависит от

А

Образец

Инструментальная базовая линия ∆C

характерных

особенностей

его

структуры и, как правило, для

app (T ) p

белков составляет 0,1-1,0 мг/мл при скорости сканирования 1 К/мин. 2.1.2. Калориметрические

Теплоёмкость

Б

измерения ∆C

Калориметрические измерения

pr (T ) p

теплоёмкости белка начинаются с определения

В

инструментальной

базовой линии. Для этого первое

Избыточная теплоёмкость

сканирование проводится, когда обе ячейки

∆C exc (T ) p

калориметра

заполнены

растворителем (обычно буферным

0

раствором). После чего одна из 20

40

60

80

o

Температура ( C)

ячеек

заполняется

образцом

белка

повторное

исследуемым и

проводится

сканирование.

На

Рис.2.3. А: «сырые» результаты калориметри-

верхней

ческого

эксперимента

изображены типичная термограмма

базовая

линия

температурная

(инструментальная

показана

пунктиром).

зависимость

Б:

теплоёмкости

(сплошная линия), экстраполяция теплоёмкостей

нативного

состояний

и

(пунктирные

панели

белкового

2.3

раствора

и

инструментальная базовая линия. Затем

инструментальная

денатурированного

базовая

прямые),

термограммы

базовая

рисунка

линия

вычитается образца,

из

чтобы

линия, учитывающая вклад в теплоёмкость как

скорректировать

нативного так и денатурированного состояний

приборный

(точечная кривая).

(рис.2.3Б), в результате чего мы

теплоёмкости.

В:

кривая

избыточной

получаем

имеющийся

разбаланс

ячеек функцию 11

экспериментально наблюдаемой теплоёмкости ∆C papp (T ) (рис. 2.3А), из которой может быть рассчитана функция парциальной теплоёмкости белка. Поскольку ∆C papp (T ) может быть выражена как разность теплоёмкостей растворителя, вытесненного белком, и самого белка:

∆C papp (T ) = C psolv (T )∆m solv − C ppr (T )m pr , где ∆C ppr (T ) и ∆C psolv (T ) - парциальные теплоёмкости белка и растворителя, mpr –масса белка в ячейке, а ∆msolv – масса вытесненного им растворителя, то по формуле C ppr (T ) = C psolv (T )

app V pr (T ) ∆C p (T ) − , V solv (T ) m pr

где Vsolv(T) и Vpr(T) удельные парциальные объемы растворителя и белка, могут быть получены абсолютные значения парциальной теплоёмкости исследуемых белков. В случае плавления малых глобулярных белков на температурной зависимости теплоёмкости

обычно

наблюдается

один

пик

теплопоглощения,

связанный

с

кооперативным разворачиванием белка. Однако для многих сложных мультидоменных белков эта зависимость может иметь более сложную структуру, состоящую из нескольких перекрывающихся пиков. Наличие пика на кривой теплопоглощения является простым критерием присутствия у исследуемого белка жесткой третичной структуры

[3,4]

. Области

до и после пика соответствуют температурным зависимостям теплоёмкости нативного и денатурированного состояниям, соответственно. Теплоёмкость денатурированного белка выше, чем нативного, что не может быть объяснено лишь увеличением степеней свободы белковой молекулы при распаде её структуры

[5,6]

, но упорядочением молекул воды

неполярными группами белка, которые экспонируются в растворитель при разрушении гидрофобного ядра глобулы [7,8,9,10,5]. Следующим этапом является нахождение кривой избыточного теплопоглощения, которая

отражает только денатурационное поглощение тепла образцом, отбрасывая

информацию

о

температурных

зависимостях

теплоёмкости

нативного

и

денатурированного состояний. Для этого из термограммы вычитают её базовую линию (рис.2.3Б точечная линия). Как нативный, так и денатурированный белок имеют почти линейные зависимости теплоёмкости от температуры (участки до и после пика, рис.2.3). Очевидно, что в области пика теплопоглощения присутствуют одновременно обе формы белка,

причём

при

температуре,

соответствующей

максимуму

пика,

число

денатурированных и нативных молекул одинаково, поэтому на температурном интервале пика его базовая линия вычисляется, учитывая пропорциональный вклад каждого из состояний в теплоёмкость

[5]

. На панели Б рисунка 2.3 базовая линия изображена в виде 12

точечной сигмоидальной линии, соединяющей температурные зависимости теплоёмкости нативного и денатурированного состояний. После вычета базовой линии мы получаем кривую избыточной парциальной теплоёмкости, рис.2.3В. Анализ этой зависимости достаточно сложен и требует в различных

случаях

применения целого ряда

математических моделей. Описание наиболее общих моделей для анализа кривых избыточной парциальной теплоёмкости приведено ниже. 2.1.3. Анализ результатов 2.1.3.1.

Термодинамический анализ данных ДСК

Простейшую модель, которая может быть использована для описания обратимой денатурации, можно представить следующей схемой: K N ←→ D,

где N - нативная форма белка, D - денатурированная форма, а K – константа равновесия. Это схема простой реакции первого порядка, когда белок минуя какие-либо промежуточные стадии переходит из нативного в денатурированное состояние. То есть существуют только два состояния молекулы, которые находятся в равновесии, поэтому эту модель называют моделью двух состояний («two-state» model). Подобные процессы обычно рассматриваются на основе подхода, предложенного Вант-Гоффом. Однако существенным недостатком этого метода анализа является изначальное предположение существования лишь двух состояний, которое часто не выполняется. Проверить справедливость этого предположения можно лишь методом ДСК, который даёт истинную энтальпию процесса денатурации. При этом наиболее чётким критерием обоснованности подхода Вант-Гоффа в каждом конкретном случае является близость друг к другу калориметрической и эффективной энтальпий (см. ниже). Константа равновесия между нативным и денатурированным состояниями при данной температуре может быть записана как: K=

α [D] = , [N ] 1 − α

где α - степень превращения ( 0 ≤ α ≤ 1 ). Изменения энтропии ∆S, энтальпии ∆H и свободной энергии ∆G можно определить непосредственно из экспериментально определённого теплового эффекта процесса, поглощенного тепла Qd при температуре денатурации Td, и изменения теплоёмкости в процессе денатурации ∆C pd , равного разности парциальных теплоёмкостей денатурированного и нативного состояний [9,3]:

13

Td

∆H (T ) = Qd − ∫ ∆C pd dT = ∆H (Td ) − (Td − T )∆C pd , T

d

d ∆C p Qd ∆H (Td ) T −∫ dT = − ln d Td T Td Td T

T

∆S (T ) =

∆G (T ) = ∆H − T∆S = где

 d ∆C p , 

Td − T T  ∆H (Td ) − (Td − T )∆C pd + T ln d ∆C pd , Td T 

Td - температура полупревращения, при которой концентрации нативной и

денатурированной форм равны. Как известно: ∆G = − RT ln K ,

где R – универсальная газовая константа (8,3144 дж/моль град), а изменение энтальпии определяется так называемым уравнением Вант-Гоффа: ∆H vH  d ln K  ,   = RT 2  dT  p где, ∆HvH – энтальпия Вант-Гоффа. Уникальностью ДСК является возможность в результате единственного эксперимента определить одновременно как реальную (калориметрическую) энтальпию процесса, так и эффективную энтальпию ( ∆HvH ) из уравнения Вант-Гоффа. Калориметрическая энтальпия определяется как площадь под пиком

теплопоглощения.

Эффективную

энтальпию

для

одностадийного

денатурационного процесса, исходя из уравнения Вант-Гоффа, можно выразить через степень превращения следующим образом [3]: ∆H vH

RT 2 dα = . α (1 − α ) dT

С другой стороны, для калориметрической кривой справедливо уравнение: ∆C p dα 1 dH = = . dT ∆H cal dT ∆H cal Таким образом, скомбинировав два последние выражения, получим температурную зависимость, описывающую эффективную энтальпию: ∆H vH (T ) =

RT 2 ∆C p (T ) . α (1 − α ) ∆H cal

Подставив в это уравнение значения температуры и степени превращения для середины процесса, мы получим выражение эффективной энтальпии одностадийного равновесного процесса:

14

∆H vH = 4 RTd2

∆C pmax ∆H cal

,

где Td –температура денатурации в абсолютных единицах (соответствует температуре полупревращения), ∆C pmax - значение теплоёмкости при Td, ∆H cal - калориметрическая энтальпия перехода. Для одностадийных равновесных процессов пик теплопоглощения симметричен и не зависит от концентрации белка, и поэтому температура денатурации Td совпадает с температурой максимума пика Tm

[9,3]

. Для асимметричных же пиков Td и Tm могут не

совпадать, хотя и быть близкими. Полученные экспериментально значения калориметрической энтальпии ( ∆H cal ) и энтальпии Вант-Гоффа ( ∆H vH ) могут значительно отличаться друг от друга т.к. ∆H cal определяется площадью пика, а ∆H vH - его остротой (формой). Отношение ∆H cal / ∆H vH может быть использовано для проверки справедливости предположения о том, что изучаемый процесс является одностадийным. Для тепловой денатурации небольших компактных глобулярных белков это отношение обычно близко к единице и отклонение в большинстве случаев не должно превышать пяти процентов. Это означает, что популяция всех промежуточных состояний между нативным и денатурированным достаточно низка, и денатурация в первом приближении может быть описана моделью «всё или ничего». Тем не менее, для денатурации больших белков, а в ряде случаев даже не очень больших, отношение ∆H cal / ∆H vH значительно выше единицы, что означает, что процесс разрушения нативной структуры не может быть описан моделью «всё или ничего» даже в первом приближении и что в ходе денатурации белок проходит через несколько промежуточных состояний. Отношение ∆H cal / ∆H vH в большинстве случаев равно числу кооперативных единиц (доменов) в исследуемом белке, подвергающихся независимому разворачиванию в ходе тепловой денатурации. Следует отметить, что это отношение может быть также меньше единицы, однако это может возникать лишь в двух случаях: когда либо молекулярный вес кооперативной единицы определён неверно, либо процесс является необратимым. Первый случай часто возникает, когда белок находится в растворе в форме олигомеров, а не мономеров и денатурации подвергается именно олигомерная форма белка. При этом отношение ∆H vH / ∆H cal , как правило, близко к числу субединиц в олигомере, подвергающихся плавлению как одна кооперативная единица. Более подробно влияние степени олигомеризации на характер одностадийной тепловой денатурации 15

проанализировано в работах

[11,12]

, где показано, что с ростом степени олигомеризации

тепловой переход становится всё более асимметричным. Во втором случае, форма пика также значительно искажается, и описываемая здесь нами модель становится неприменимой. Исследование подобных необратимых денатурационных переходов требует других подходов, к описанию которых мы переходим в следующем параграфе. 2.1.3.2.

Кинетический анализ данных ДСК

Приведённый выше анализ термодинамических данных справедлив лишь в тех случаях, когда в течение эксперимента существует равновесие между нативной и денатурированной формами белка. Однако, часто такое равновесие не устанавливается изза необратимости или медленности процесса денатурации. В подобных случаях форма пика теплопоглощения сильно зависит от скорости нагрева ячеек и нуждается в анализе с помощью моделей, учитывающих его кинетическую природу. Несмотря на то, что в большинстве случаев денатурация белков необратима, часто процессы, ответственные за неё (необратимость), являются медленными и поэтому в каждый момент времени система находится в локальном равновесии. При этом форма пика практически не меняется. Такие процессы хорошо описываются моделями равновесной термодинамики, рассмотренными в предыдущем параграфе. В тех случаях, когда не существует и локального равновесия, форма пика становится заметно ассиметричной, и такие переходы необходимо анализировать на основе кинетической модели необратимой денатурации

[13,14,15,16,17]

, которая в простейшем виде описывает

необратимый переход между двумя состояниями – нативным и денатурированным: k → N D,

где k – константа скорости первого порядка. Эта необратимая мономолекулярная реакция описывается следующим дифференциальным уравнением: −

dx N dx D = = kx N , dt dt

где xN и xD - молярные фракции молекул белка в состояниях N и D. Учитывая, что температурная зависимость константы скорости обычно описывается уравнением E Аррениуса k = exp a  R

 1 1   −  , где Еа – аррениусовская энергия активации процесса, и   T0 T  

скорость прогрева постоянна, v = dT/dt, это уравнение может быть записано как: E vx N dx N = − exp a  R

 1 1   −  dT ,   T0 T  

16

из которого путём интегрирования может быть легко получена температурная зависимость молярной фракции белка в нативном состоянии. С другой стороны, избыточная теплоёмкость выражается как: ∆C p = ∆DN H

dx dx D = − ∆DN H N , dT dT

где ∆DN H - энтальпия денатурации белка (разница энтальпий конечного и начального состояний). Из приведённых выше формул можно получить аналитическое выражение формы пика теплопоглощения для необратимого процесса [18]:   E   E   max exp a 2 (T − Tm )  ∗ exp − exp a 2 (T − Tm )  . C exc p = eC p   RTm   RTm   Численные значения k (или Ea) получают путём приближения (фиттинга) теоретического профиля термограммы к экспериментальному. В качестве нулевого приближения значения k (или Ea) обычно получают из экспериментальных данных с помощью уравнения Вант-Гоффа, предположив, что процесс является обратимым. В настоящее время предложено несколько методов обработки данных сканирующей калориметрии, позволяющих оценить константу скорости и энергию активации процесса денатурации для процессов, описываемых рассматриваемой схемой

[19,17]

. Хотя описанная

здесь кинетическая модель тепловой денатурации белка является простейшей, тем не менее, она хорошо описывает денатурацию очень многих белков [13,16,20,17]. 2.1.3.3.

Анализ термограмм мультидоменных белков

Описанные выше методы анализа термодинамических данных, полученных с помощью ДСК, справедливы лишь для небольших глобулярных белков, денатурация которых проходит по схеме «всё или ничего». Однако, большинство известных белков представляют собой крупные мультидоменные комплексы и поэтому не могут быть представлены как одиночные кооперативные единицы и их денатурация не является простым одностадийным переходом. Домены в таких «молекулярных машинах» зачастую являются биологически функциональными единицами, а их взаимодействие обеспечивает внутримолекулярную коммуникацию и координирует их действия. Дискретизация структуры, полученная с помощью данных ЯМР или рентгеноструктурного анализа, может существенным образом отличаться от таковой, определённой методом ДСК. В самом деле, встречаются случаи, когда белок с чётко выраженным разделением на структурные домены представляет единую кооперативную единицу, и, наоборот, единая структура при определённых условиях может плавиться в несколько этапов. Это 17

происходит из-за того, что структурные данные дают нам информацию лишь о взаимном расположении элементов составляющих белок, не учитывая при этом энергетику их взаимодействий. Калориметрия же, напротив, даёт нам интегральные характеристики кооперативных единиц белка, основанные на различии в их термодинамических свойствах. Основное свойство кооперативной единицы заключается в том, что её элементы могут изменить своё состояние только коллективно, поэтому домен* сворачивается и разворачивается по принципу «всё или ничего», а различия в термодинамических свойствах доменов, о которых говорилось выше, приводят к тому, что при повышении температуры их нативная структура распадается независимо. Последнее означает то, что при денатурации белок проходит несколько промежуточных состояний. Это отражается на температурной зависимости суперпозиция

нескольких

(часто

парциальной

перекрывающихся)

пиков

теплоёмкости как теплопоглощения,

соответствующих разворачиванию отдельных доменов. Такие термограммы часто интерпретируются как сумма независимых одностадийных переходов. Справедливость такого допущения обычно проверяется сравнением термограмм нескольких фрагментов изучаемого белка, полученных тем или иным способом, с кривой плавления целого белка [21,22]

.

Долгое время из кривых теплопоглощения мультидоменных белков удавалось извлекать весьма ограниченную информацию. Однако, в 1978 году Фрейер и Билтонен [23] предложили рекурсивный пошаговый алгоритм определения числа и термодинамических характеристик промежуточных состояний, белков, домены которых денатурируют равновесно, обратимо и независимо, опирающийся на некоторые фундаментальные свойства калориметрических кривых. Тем не менее, для решения практических задач этот алгоритм требовал улучшений, которые были сделаны Филимоновым с соавторами в 1982 году [24]. При наличии сильных междоменных взаимодействий вид термограммы может существенно меняться в зависимости от характера этих взаимодействий, и стандартные алгоритмы анализа перестают работать. К сожалению, общего алгоритма анализа таких калориметрических кривых не разработано, и в этих случаях анализ термограмм необходимо проводить, исходя из той или иной теоретической модели, по возможности дополняя данные экспериментами с фрагментами молекулы изучаемого образца. Лишь для белков, состоящих из двух доменов, в 1989 году Брандсом была разработана модель, учитывающая их взаимодействие [25]. *

далее в этой работе мы будем употреблять термин «домен» только в значении «кооперативной единицы»

18

2.2. Калмодулин На сегодняшний день известно более 400 Са-связывающих белков. Все они могут быть разделены на несколько семейств в соответствии со структурой Са-связывающего сайта. Двумя наиболее большими семействами являются семейство аннексина и EF-hand Сасвязывающие белки. Белки из семейства аннексина взаимодействуют с фосфолипидами и клеточными мембранами кальций-зависимым образом. Они проявляют высокую степень гомологии и содержат повторяющуюся консервативную последовательность. Этот сегмент длиной приблизительно 70 аминокислотных остатков включает сайты связывания кальция и фосфолипидов. В настоящее время известно более десяти белков из этого семейства с разнообразными функциями. Эти белки ассоциированы с такими заболеваниям как хронический ревматизм, воспаления и множественный склероз. Белки другого крупного семейства - EF-hand, насчитывают более 200 представителей. Их эволюционной, функциональной и структурной Са-связывающей единицей является мотив спираль-петля-спираль, называемый EF-hand (названы по аналогии с E- и Fспиралями

парвальбумина)

сайт.

Этот

мотив

представляет

из

себя

линейную

последовательность из 36 остатков, состоящую из 12-членной Са-связывающей петли, окруженной двумя α-спиралями.

2.2.1. Структура и функции калмодулина (СаМ) Калмодулин, небольшой кислый (IP~4) высококонсервативный кальций-связывающий белок, член суперсемейства EF-hand обнаруживается в цитоплазме всех эукариотических клеток

[26]

в отличие от других СаBP. Он был впервые выделен из мозга быка и

секвинирован в 1980 году

[27]

. Белок состоит из 148 аминокислотных остатков и имеет

молекулярный вес около 16700 Да. Сам калмодулин не проявляет ферментативной активности,

но

является

интегральной

субъединицей

целого

ряда

ферментов

(протеинкиназы, протеинфосфатазы, фосфодиэстеразы, ферменты подвижности). Он связывает и активирует более 40 мишеней. Концентрация СаМ в клетке варьирует в пределах 5-10 мкМ и составляет около половины концентрации всех СаМ-связывающих белков.

19

2.2.1.1.

Структура

не

содержащего

кальций

калмодулина

(апокалмодулин) Апокалмодулин является исходным состоянием белка и играет важную роль в клетке. Известно, что он может взаимодействовать, хотя значительно слабее, чем СаМ, с некоторыми белками-мишенями, например, с нейромодулином и миозином I [28], поэтому изучение апо-формы калмодулина со структурной и термодинамической точек зрения имеет первостепенное значение для понимания механизмов функционирования белка. К сожалению, к настоящему времени получены кристаллы калмодулина только в связанном с кальцием состоянии, однако в 1995 году методом гетероядерного ЯМР была определена трехмерная структура апо-СаМ

[29]

(рис.2.4). Как и насыщенный кальцием калмодулин,

апо-СaM состоит из двух глобулярных долей, связанных между собой гибкой полипептидной цепью и содержащих по два EF-hand мотива, способных связывать кальций. В отсутствии кальция в каждой из глобулярных долей α-спирали образуют сильно свернутую в узел структуру, накрытую коротким антипараллельным β-слоем, при этом участок, соединяющий домены и полностью спирализованный в 4Ca2+-CaM, частично развёрнут по центру и переломлен, благодаря чему домены в апокалмодулине расположены значительно ближе, чем в насыщенной кальцием форме. Качественно такая структура напоминает кальций-свободный N-концевой домен в тропонине С

[29]

. Эта

работа также подтвердила, что N- концевая доля апокалмодулина обладает большей термостабильностью, чем С-концевая доля. Кроме того, было показано, что структура остова С-концевой доли апокалмодулина должна хотя бы часть времени находиться в неспирализованном состоянии. Кубонива с соавторами

[29]

пришли к выводу об

отсутствии спирали F в домене III С-концевой доли апо-CaM, что в качественном отношении согласуется с калориметрическими данными Цалковой и Привалова [30]. Авторы работы [29] показали, что при связывании кальция с калмодулином происходит экспонирование гидрофобных остатков на поверхности каждой из двух долей белка и образование, таким образом, гидрофобных “карманов”, тогда как в апокалмодулине они полностью отсутствуют. Кроме того, исследования структуры комплексов калмодулина с тремя

разными

синтетическими

пептидами-мишенями

с

помощью

ЯМР

и

рентгеноструктурного анализа выявили наличие этих “карманов”, в каждом из которых располагались длинные гидрофобные боковые цепи остатков пептида [31,32,33].

20

21

Рис.2.4. Стерео изображение структуры апо-формы калмодулина.

2.2.1.2.

Структура Са-насыщенного калмодулина

К настоящему времени получены пространственные структуры насыщенного [34,35,36]

с разрешением 2,2 Å,

1,7 Å и 1,0 Å. Кальциевая форма калмодулина представляет

собой вытянутую

кальцием калмодулина из нескольких различных организмов

гантелеобразную молекулу с размерами 45 Å×45 Å×65 Å (рис.2.5). Молекула состоит из двух глобулярных доменов, разделённых центральным спиральным шарниром, состоящим из 28 аминокислотных остатков (спирали D и Е). Обе глобулярные доли структурно подобны и расположены примерно на одной оси с центральной α-спиралью. Каждая глобулярная доля имеет по два Са2+-связывающих сайта, содержащих мотив спиральпетля-спираль (EF-hand)

[37]

. Молекула содержит семь спиралей, сформированных

остатками 7-19 (спираль А), 29-39 (спираль В), 36-55 (спираль С), 65-92 (спираль D), 102112 (спираль Е), 119-128 (спираль F) и 138-148 (спираль G). Спирали двух EF-hand мотивов в каждой доле образуют богатые остатками фенилаланина и метионина гидрофобные карманы, экспонированные в растворитель и участвующие в связывании мишеней. На рисунке 2.5 показано стереоскопическое изображение насыщенной кальцием молекулы калмодулина. Структура калмодулина в растворе является более компактной, чем это следует из данных рентгеноструктурного анализа

[38]

. Однако, вторичные структуры долей

калмодулина, определенные рентгенографически и методом ЯМР, совпадают

[39]

. В

отличие от кристалла, в растворе область между остатками 78 и 81 не спирализуется, что обуславливает её высокую степень гибкости [40]. Доменная модель колмодулина, выделенного из мозга телёнка, была предложена Цалковой и Приваловым

[30]

ещё до определения его структуры. В своём исследовании

авторы опирались на результаты изучения тепловой денатурации белка методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, который позволяет получать информацию о реальных термодинамических параметрах тепловых переходов в белках. Цалкова и Привалов [30] показали, что калмодулин состоит из четырех доменов, каждый из которых связывает по одному иону кальция. При этом ими было установлено, что низкотемпературный пик теплопоглощения калмодулина в отсутствие ионов кальция соответствует плавлению домена IV С-концевой доли, а высокотемпературный пик отражает денатурацию единой кооперативной системы N-концевой доли (домены I и II), что указывает на сильное взаимодействие доменов в этой доле. Также было показано, что наименее стабильным является домен III С-концевой доли, который в присутствии кальция при комнатной температуре находится в компактном упорядоченном состоянии, а 22

23

Рис.2.5. Стерео изображение структуры кальциевой формы калмодулина. Сферами изображены ионы кальция.

в отсутствие кальция переходит в некомпактное разупорядоченное состояние. Кроме взаимодействия внутри долей, в ряде работ было показано существование взаимодействия между доменами в разных долях. Так в работе Протасевич с соавторами электростатических

мутаций

с

применением

ДСК

было

[41]

, с помощью

установлено,

что

перераспределение зарядов в С-концевой доле и центральной α-спирали вызывает конформационные изменения в N-концевой части белка, несмотря на отсутствие непосредственного

контакта

этих

долей.

Годом

позже

Соренсен

и

Шеа

[42]

протеолитически разделив две доли калмодулина показали, что N-концевой домен в составе белка плавится на 10ºС выше, чем в свободном состоянии, подтвердив тем самым, что калмодулин не является просто суммой своих частей. 2.2.1.3.

Сопоставление структур апо- и кальциевой форм калмодулина

Между калмодулином и апокалмодулином существует много различий, однако все эти различия можно обобщить следующим образом: •

Калмодулин имеет открытую, а апокалмодулин - более компактную структуру

рис.2.4, 2.5 •

В апокалмодулине гидрофобные остатки преимущественно расположены вместе

между α-спиральными сегментами в конце каждой доли и образуют гидрофобное ядро внутри молекулы. В калмодулине, наоборот, эти остатки экспонируются наружу и образуют две гидрофобные поверхности. •

В апокалмодулине около полудюжины аминокислотных остатков с каждого из

концов молекулы (т.е. с 8 по 15 и с 140 по 146), расположенных в первой и последней αспиралях калмодулина, приблизительно параллельны центральной α-спирали и образуют, таким образом, вторую «перекладину гантели». Кроме того, центральная спираль прервана посередине (Ser-81) не спиральным участком и согнута. Напротив, концевые участки в Са-калмодулине отогнуты от центральной спирали, а центральная спираль в кристаллической структуре не имеет изгиба. Это делает доступными гидрофобные карманы в калмодулине, которые блокированы этими концевыми сегментами в апокалмодулине. Два глобулярных домена апокалмодулина также повернуты друг относительно друга почти на 180 градусов по сравнению с калмодулином.

2.2.2. Связывание кальция калмодулином Как уже упоминалось, калмодулин состоит из четырёх EF-hand сайтов. Каждая доля содержит два спаренных Са-связывающих сайта. Как уже упоминалось, связывание кальция необходимо для активации СаМ и вызывает существенную реорганизацию белка, 24

приводящую к образованию гидрофобных полостей, которые дают возможность СаМ взаимодействовать с белками-мишенями. Макроскопические константы связывания Са2+ с различными сайтами на СаМ приведены в табл.1. Механизм связывания Са2+ с СаМ имеет сложный характер и принятой моделью является последовательная модель, в которой связывание идет по пути III→IV→I→II [43], где I-IV являются Са-связывающими сайтами, а нумерация начинается с N-конца молекулы. То есть в апоформе только одно Са-связывающее место может связать кальций

с

высокой

афинностью.

Связывание

с

первым

местом

вызывает

конформационное изменение во втором сайте, в результате которого он также получает возможность связать Са и т.д. Эта модель предполагает, что существует сильная асимметрия молекулы в апо-состоянии - только сайт III обладает высокой афинностью к Са, и существует сильная “позитивная кооперативность” между сайтами одной доли, а также между двумя долями молекулы. Более точно выражаясь - существуют сильные факторы сопряжения между различными сайтами молекулы. Связывание Са, как таковое, в основном вызывает десольватацию катиона и его координирование в EF-hand сайте. В растворе ион кальция в среднем окружает семь молекул воды. В работе Жилли с соавторами было продемонстрировано, что связывание кальция энтропийно выгодно во всех четырёх сайтах

[44]

. Связывание первого и второго

ионов кальция является энтропийно и энтальпийно выгодным, в то время как связывание третьего и четвертого выгодно только энтропийно. Это указывает на асимметрию в структуре белка между С- и N-долями и соответствует асимметрии распределения электростатического потенциала [45] и асимметрии гибкости двух долей [44,41]. Кроме четырех основных мест связывания кальция на калмодулине существует ещё восемь дополнительных со значительно более низкими константами связывания

[46,47]

.

Физиологическое значение вспомогательных мест связывания Са еще до конца не ясно. Эти места могут связывать другие внутриклеточные катионы, такие как Mg, Zn или Mn, и, таким образом, тонко модулировать активность СаМ, необходимую для оптимального функционирования клетки.

2.2.3. Связывание калмодулина с белками-мишенями Калмодулин участвует в активации большого числа белков. В большинстве случаев калмодулин связывается с мишенями лишь в кальциевой форме, однако в ряде случаев связывание происходит и с апокалмодулином. В таблицах 2.1 и 2.2 представлены наиболее известные белки, взаимодействующие с калмодулином и апокалмодулином. Построение общей модели взаимодействия и активации СаМ фермента представляет 25

Табл.2.1.

Некоторые мишени Са2+-калмодулина.

Группа

Белок

Функция

Протеинкиназы

Киназа фосфорилазы Б

Регуляция метаболизма гликогена

Киназа лёгких цепей

Регуляция сокращения гладких мышц

миозина СаМ киназа I

Многофункциональный

СаМ киназа II

Многофункциональный

СаМ киназа III

Трансляция?

СаМ киназа IV

Многофункциональный

Кальцинейрин

Регуляция клеточного цикла

Вторичные

Аденилат циклаза типа I

Продуцирование сАМФ

мессенджеры

cAMP фосфодиэстераза

Деградация сАМФ

метаболизма

NO синтетаза

Продуцирование NО

Иноситол 3-киназа

Продуцирование IP4

АТФаза Ca2+-транспорта

Уменьшение концентрации

Фосфопротеин фосфатазы

кальция в цитозоле Белки мышц и

Дистрофин

Ингибирование связывания F-актина

цитоскелета

Спектрин 4.1

Ингибирование связывания F-актина

Фодрин

Ингибирование связывания F-актина

Калдесмон

Ингибирование связывания F-актина

MARCKS белок

Ингибирование связывания F-актина

Синтрофин

Ингибирование связывания дистрофина

Белки метаболизма

NAD киназа

Преобразование NAD в NADР

Другие

MAPS

Ингибирование полимеризации тубулина

большой интерес. Как известно, модельные пептиды в большинстве случаев связываются с СаМ с той же афинностью, что и белки-мишени. С другой стороны, применение пептидов позволяет упростить изучение формирования калмодулин-белковых комплексов и поэтому вызывает всё большее внимание. К настоящему времени синтезировано более десяти пептидов, соответствующих калмодулин-связывающим доменам различных ферментов (табл.2.3). 26

Табл.2.2.

Белки, которые активирует апокалмодулин.

Группа

Белок

Предполагаемая функция

Актин-

Myr4

АТФ-зависимое связывание с F-

связывающие белки Скелетные и

актином P190

Активируемые актином АТФ-азы

Нейромодулин

Обратимое хранение СаМ, регуляция

мембранные белки

Ферменты

метаболизма фосфатидилиноситола Нейрогранин

Неизвестна

РЕР-19

Неизвестна

IGloo

Неизвестна

Синтрофин

Кластеризация Na+ каналов

IQGAP

Неизвестна

Киназа b фосфорилазы

Регуляция метаболизма гликогена

Циклаза аденилила

Продуцирование сАМФ

Синтетаза

Синтез оксида азота

индуцированного оксида азота Декарбоксилаза

Декарбоксилирование глутамата

глутамата cGMP-зависимая

СГМФ- и сАМФ-зависимое

протеинкиназа

фосфорилирование

Рецепторы и

Иноситол 1,4,5-

Связывание Иноситол 1,4,5-

ионные каналы

трифосфатный

трифосфата

рецептор

Освобождение SR от Ca2+

SR белок Ca2+ канала

СаМ связывается с различными основными амфифильными спиралями независимо от их

специфических

последовательностей.

В

настоящее

время

получены

три

пространственные структуры высокого разрешения комплексов СаМ с пептидами, соответствующими сайту связывания СаМ на различных киназах

[31,32,48]

. В свободном (от

пептида) состоянии оба домена СаМ, ограниченные только центральной спиралью, способны двигаться независимо друг от друга (рис.2.6а). В связанном состоянии домены собираются вместе и «поглощают» пептид, образуя единую компактную глобулярную структуру (рис.2.7). В пространстве между двумя доменами образуется длинный 27

Табл.2.3. Некоторые пептиды, соответствующие СаМ-связывающим участкам мишени. Пептид

Белок

Последовательность

RS20

киназа лёгких цепей миозина

ARRKWQKTGHAVRAIGRLSS

гладких мышц M13

киназа лёгких цепей миозина

KRRWKKNFIAVSAANRFKKISS

скелетных мышц C20W

Кальциевый насос плазматической LRRGQILWFRGLNRIQTQIK мембраны

C24W

Кальциевый насос плазматической QILWFRGLNRIQTQIRVVNAFSSS мембраны

C28W

Кальциевый насос плазматической LRRGQILWFRGLNRIQTQIRVVNAFSSS мембраны

PDE

cAMP фосфодиэстераза

QTEKMWQRLKGILRCLVKQL

CaD

Калдесмон гладких мышц

GVRNIKSMWEKGNVFSS

неполярный центральный туннель, где и помещается пептид (рис.2.7). Боковые цепи неполярных

остатков

пептида

оккупируют

неполярные

карманы

каждого

Са-

связывающего домена. В образуемом комплексе доминируют ван дер Ваальсовы контакты,

также

присутствует

несколько

специфических

электростатических

взаимодействий. Данные пептиды не упорядочены в растворе и приобретают αспиральную конформацию при связывании с СаМ. В комплексе N-концевая часть калмодулина взаимодействует с C-концевой частью пептида и наоборот. Однако в 1999 году Элшорст и коллеги получили структуру комплекса калмодулина с пептидом C20W (рис.2.6б), которая значительно отличалась от известных ранее тем, что пептид связывался лишь с С-доменом СаМ, что не приводило к появлению более компактной структуры (рис.2.6в) [49]. Несмотря на то, что калмодулин способен взаимодействовать с некоторыми белкамимишенями и в апо-форме, на сегодняшний день известны лишь комплексы 4Са2+калмодулина с пептидами-мишенями и только для пептида WF10 (первые 10 остатков N – концевой последовательности пептида М13) Бейли с соавторами

[50]

показали

существование стабильного, полунасыщенного кальцием комплекса 2Са2+-СаМ-WF10 (два иона кальция связаны с С-доменом СаМ), который распадается при уменьшении 28

а) CaM

б) CaM/C20W

в) CaM/M13

Рис.2.6 Структуры калмодулина и его комплексов с пептидами C20W и M13, основанные на координатах из Брукхевенского белкового банка данных (3CLN, 1CFF

и

2BBM,

соответственно).

N-концевые

части

калмодулина

(1-78)

изображены оранжевым цветом, С-концевая – красным, а пептиды – синим Ориентация

С-домена

одинакова

во

всех

случаях.

(а)

[49]

.

Поверхностное

представление кристаллической структуры насыщенного кальцием калмодулина. Гантелеобразная молекула калмодулина состоит из двух глобулярных доменов, содержащих по два кальций-связывающих сайта и соединённых длинной жесткой центральной спиралью. Данные ЯМР показывают, что в растворе центральная спираль искажается посередине и служит гибким линкером между доменами. (б) Структура комплекса СаМ/C20W в растворе, показывающая, что пептид C20W, соответствующий N-концевой части СаМ-связывающего домена кальциевого насоса плазматической мембраны, связывается только с С-концевым доменом СаМ. Гибкий участок между доменами позволяет существовать большому числу ориентаций доменов друг относительно друга. (в) Структура СаМ/М13 в растворе, демонстрирующая компактный глобулярный комплекс, включающий обе С- и N-концевые части СаМ во взаимодействии с пептидом М13, соответствующим СаМ-связывающему домену киназы лёгких цепей миозина из скелетных мышц. концентрации кальция. В этом комплексе, как и в комплексе 4Са2+-СаМ-C20W, пептид взаимодействует только с С-доменом СаМ. В случае пептида C20W также возможно существование комплекса с 2Са2+-СаМ, т.к. пептид в комплексе 4Са2+-СаМ-C20W не

29

взаимодействует

с

N

–концевой

долей СаМ и значит не нуждается в её конформационных изменениях, индуцируемых кальцием. RS20

представляет

двадцатичленный

собой

гидрофобный

основной пептид из калмодулинсвязывающего домена киназы лёгких цепей

миозина

гладких

мышц

(smMLCK). В 1992 году структура 4Са2+-СаМ-RS20

комплекса определена

с

помощью

кристаллографического анализа ЯМР Рис.2.7.

Структура

построенная пакета

с

комплекса

помощью

PDBViewer,

СаМ/RS20,

программного

основанная

на

[31]

была [32]

и

, рис.2.7.

Во взаимодействии этого пептида с калмодулином заряженные,

важны так

и

как

гидрофобные

координатах из Брукхевенского белкового

остатки,

банка данных (1CLD). Сферами изображены

продемонстрировал в своей работе

ионы кальция.

Афшар

однако, с

как

соавторами

электростатическая

[51]

,

компонента

играет основную роль в ориентации и сильном связывании пептида при формировании комплекса 4Са2+-СаМ-RS20. Ядро поверхности связывания гидрофобно и содержит желоб с четырьмя глубокими карманами, в которых могут поместиться объемные остатки пептида в позициях 4 и 8 (карман А), 11 (карман В), 13 (карман С), 14 и 17 (карман D). Два гидрофобных кармана на СаМ занимаются остатками пептида Trp4, Leu17, остатки Arg2, Lys6, Arg16 взаимодействуют с кислотными партнерами на белке - Glu123,24, Glu14,114, Glu84, а Arg1 и Lys3 RS20 взаимодействуют с Glu14 и Glu7,11 калмодулина. Остатки RS20 1, 2, 3, 5 и 6 могут взаимодействовать с отрицательно заряженным входом в туннель СаМ. Lys6 солевыми мостиками связывается с обеими долями калмодулина (Glu14,114). Остатки пептида 15 и Arg16 также сильно взаимодействуют с отрицательным карбоксильным краем входа в образуемый в белке туннель. Таким образом, пептиды с положительными

зарядами,

разделенными

9-10

остатками,

могут

эффективно

взаимодействовать с поверхностью связывания. Несмотря на то, что электростатические взаимодействия играют ключевую роль, доминантой в образовании комплекса является 30

гидрофобность поверхности связывания. Пептид взаимодействует с гидрофобным желобком, находящимся на поверхности туннеля. Следовательно, как электростатические, так и ван дер Ваальсовы взаимодействия дают вклад в высокую афинность связывания [51]. В 1997 году Винтрод и Привалов при помощи изотермической калориметрии титрования показали, что связывание СаМ с RS20 происходит с отрицательным изменением энтальпии и энтропии, продемонстрировав тем самым, что связывание является энтропийно не выгодным и протекает за счёт изменения энтальпии. Из этого они сделали вывод, что гидрофобный эффект, заключающийся в изолировании неполярных групп от воды, не является основной движущей компонентой связывания. Кроме того, они обнаружили, что при увеличении кислотности среды происходит сильное падение свободной энергии связывания без изменения энтальпии, из чего можно заключить, что электростатические взаимодействия вносят только энтропийный эффект при связывании [52]

.

2.3. Кальций-векторный белок (CaVP) из Amphioxus Многие кальций-связывающие белки, участвующие в проведении кальциевого сигнала, мультифункциональны как калмодулин и присутствуют во всех эукариотических клетках. Однако, существует ряд кальций-связывающих белков, выполняющих сугубо специфические задачи, а следовательно, имеющих очень ограниченное число мишеней и локализацию. К ним относится кальций-векторный белок (CaVP) с молекулярной массой 18,3 кДа. Хотя CaVP был открыт в 1986 году как второй наиболее распространенный кальций-связывающий белок в мышцах Amphioxus (хордовый червь, живущий в морском прибрежном песке на глубине 1-2 метра при температуре 4-15ºC) [53], его физиологическая роль до сих пор неизвестна. CaVP был изолирован в комплексе со своей единственной известной на сегодняшний день мишенью CaVPT (calcium vector protein target; 26,2 кДа), с которой он образует эквимолярный комплекс, регулируемый ионами кальция и фосфорилированием. В отсутствие кальция комплекс CaVP-CaVPT стабилен при физиологических условиях, однако связывание с кальцием увеличивает афинность белков друг к другу в 70 раз

[54]

. Клеточные концентрации CaVP и CaVPT составляют примерно

100 и 50 мкМ, соответственно, что приблизительно в 10 раз больше чем концентрация калмодулина и сравнимо с концентрацией тропонина С в скелетных мышцах кролика [55]. При гель-фильтрации CaVP мигрирует со скоростью, соответствующей массе 28 кДа, что указывает на асимметричную форму молекулы. Несмотря на то, что CaVP имеет сходную доменную организацию

и существенную (около 35%) гомологию с тропонином С и

калмодулином, филогенетически CaVP не может быть отнесён ни к одному из 32 семейств 31

EF-hand Ca2+-связывающих белков. CaVP включает четыре EF-hand сайта связывания кальция, однако, из-за мутаций в области кальций-координирующих остатков в сайтах I и II только сайты III и IV, расположенные в С-концевой части, способны связывать кальций [56,54]

, рис.2.8. Белок ацетилирован с N-конца и содержит два ε-N-триметиллизиновых

(TML) остатка в α-спиралях, ограничивающих кальций-связывающую петлю III. Два цистеиновых остатка, расположенных в N-концевой части CaVP, могут образовывать дисульфидный мостик. Окисленная и восстановленная формы CaVP имеют разные электрофоретические подвижности и могут легко переходить из одной в другую. В свежевыделенном комплексе CaVP-CaVPT тиолы свободны, однако, в отличие от свободного CaVP, слабо реагируют с тиольными реагентами

[54]

. Все остатки триптофана

и тирозина расположены в N-концевой части CaVP и связывание CaVP с кальцием не оказывает на них влияния

[53]

. Два С-концевых EF-hand сайта связывают кальций с

константами К'1=4,9×106 М-1 и К'2=7,3×103 М-1. Низкая афинность к кальцию сайта IV может быть связана с отсутствием кислотного бокового остатка в координирующей позиции Z кальций-связывающей петли

[57]

и, возможно, с более низкой общей

гидрофобностью α-спиралей [58,59], особенно спирали G. Поскольку кальций-связывающие свойства CaVP не изменялись в присутствии магния, было заключено, что сайты кальцийспецифичны

[54]

. Поэтому можно предположить, что в условиях покоя (отсутствия

кальциевого сигнала) белок находится в основном в апо-состоянии и небольшое увеличение концентрации свободного кальция приводит к образованию 1Ca2+-формы, характеризующейся хорошо сформированным третьим EF-hand сайтом и обладающим значительной подвижностью четвёртым EF-hand сайтом. Комплекс CaVP/CaVPT также связывает кальций, однако со значительно большей X Y Z-Y-X -Z AAPKARALGPEEKD ECMKIFDIFDRNAENIAPVSDTMDMLTKLG EAIMKEARGPKGDKKNIGPEEWLTLCSKWV EILRAFKVFDANGDGVIDFDEFKFIMQKVG EVEEAMKEADEDGNGVIDIPEFMDLIKSKK

I

N 1

II

Ca2+ III

QTYTKRET RQDDEE EEPLTDA NALKES

Ca2+ IV

C 161

Рис.2.8. Аминокислотная последовательность и доменная организация CaVP. Цветом выделены EF-hand мотивы. X, Y и Z – аминокислотные остатки, координирующие ионы кальция. ε-N-триметилированные лизины подчёркнуты. 32

афинностью и сильной положительной кооперативностью: К'1=2,4×105 М-1 и К'2=1,0×108 М-1

[54]

. Произведение констант связывания кальция (К'1 × К'2) в 670 раз больше для

комплекса, чем для изолированного белка, что говорит также об индуцированном кальцием увеличении афинности CaVP к CaVPT. Такое значительное увеличение афинности кальция к комплексу по сравнению с изолированным белком может быть объяснено структурной стабилизацией четвёртого сайта, вызванной образованием комплекса. Биологические функции CaVP до сих пор не известны. По-видимому, он регулирует активность мультидоменного белка CaVPT [60], регулирующего, в свою очередь, динамику толстых филаментов в Amphioxus лизинами

(1-23),

и

[61]

. Кроме мотива, богатого пролинами, аланинами и

CaVP-связывающего

сайта

(36-50),

CaVPT

содержит

два

иммуноглобулин-подобных повтора типа IgC2 (63-243) (рис.2.9). CaVP-связывающий сайт имеет сильную гомологию с IQ-мотивами (IQ***RG***R, где * - любой а.о.), являющимися

кальций-независимыми

нейромодулине и нейрогранине

1

[62,63]

калмодулин-связывающими

сайтами

в

. В этих белках регуляция взаимодействия с

Pro-Ala-Lys-rich IQ-домен PKPPAEAKPA AKPAAPPAAA NPFEGVDVKD PIVISAATRI QASFRMHKNR Ig-fold MALKEKSIPK FSQVLKDMFV MEGSAVTFFA RVWGIPDPVI KWFKDGQEVK QGPKHEIKFD DKDGTFLIIR NADGDDVGTY TCQATNSFGE AFDSARLALE Ig-fold VPAKCTKQPD NITVKAGGNF EIKVEIAGEP EPDVIWTKGK KEIDEGGRFS 243

YEDSPDYSIL RVEKAQAGDA GKYEIEIVND LGKARAYCTV KVN Pro-Ala-Lys IQ

Ig-fold

N

Ig-fold

C 1

243

Рис.2.9. Аминокислотная последовательность и доменная организация мишени кальций-векторного белка (CaVPT).

33

N Рис.2.10.

Стереоизображение

C структуры

С-домена

(остатки

86-154)

CaVP,

построенное с помощью программы PDBViewer на основе координат из Брукхевенского белкового банка данных (1C7V) []. калмодулином происходит посредством фосфорилирования серина протеинкиназой С. Изолированный CaVPT может быть фосфорилирован протеинкиназой С в соотношении белок/фосфат 1:1, тогда как добавление CaVP предотвращает фосфорилирование, а фосфорилирование CaVPT препятствует взаимодействию с CaVP

[64]

. Это может являться

решающим моментом в регуляции взаимодействия CaVP и CaVPТ, позволяющим диссоциацию и взаимодействие CaVPТ с другими белками-мишенями в мышцах Amphioxus. Трёхмерная структура CaVP, к сожалению, пока не известна, однако, высокая степень гомологии CaVP с калмодулином и тропонином С, а также сравнительное компьютерное моделирование позволяют предположить наличие в белке двух доменов, каждый из которых содержит по два EF-hand мотива. Совсем недавно методом ЯМР была определена структура С-концевой части CaVP (С-CaVP; а.о. 81-161)

[65]

. И поскольку афинности

сайтов III и IV к кальцию сильно различаются, то оказалось возможным исследование трёх форм С-CaVP: апо-формы и белка, связанного с одним или двумя ионами кальция (1Са2+-С-CaVP и 2Са2+-С-CaVP, соответственно). Кальций-насыщенная форма С-CaVP представляет собой домен, состоящий из четырёх α-спиралей (E87-F97, F107-Q115, D124A134, I144-K152), которые образуют два EF-hand мотива, соединённых двумя короткими антипараллельными полосами β-слоя (V104-D106, V141-D143) (рис.2.10) и сильно схожих с EF-hand мотивом из суперсемейства калмодулина. Подобно другим Са2+-сенсорам, 34

2Са2+-С-CaVP имеет хорошо упакованное гидрофобное ядро, состоящее из четырёх остатков Phe, одного Leu, шести Ile, одного Val и трёх Met. Данные ЯМР для апо-С-CaVP свидетельствуют об отсутствии третичной структуры, однако, спектр кругового дихроизма в дальней УФ-области указывает на наличие вторичной структуры (17% αспиральности). Кроме того, тепловая денатурация, фиксируемая при помощи КД в дальней УФ-области, показала, что элементы вторичной структуры апо-С-CaVP кооперативно плавятся при температуре 55ºС, из чего авторы делают не вполне правомерный вывод (который тем более противоречит их данным ЯМР) о наличии элементов трёхмерной структуры. Тем не менее, авторы заключают, что апо-С-CaVP проявляет свойства расплавленной глобулы. Терет с соавторами

[65]

показали, что первый ион кальция занимает EF-hand III и

вызывает существенную реорганизацию только этого сайта, в то время как остальная часть С-CaVP остается сильно флуктуирующей, присоединение же второго иона кальция структурирует весь белок. 1Ca2+-C-CaVP имеет похожую вторичную структуру, но другие внутриспиральные углы и гидрофобную упаковку по сравнению с 2Ca2+-C-CaVP. Такое поведение С-CaVP при последовательном связывании ионов кальция значительно отличается от наблюдаемого у тропонина С, в котором посадка каждого иона вызывает изменения во всей молекуле. Это может быть связано с большой разницей в афинности к кальцию двух сайтов С-CaVP. Таким образом, авторы считают, что апо-С-CaVP представляет собой новый пример белка, который в неденатурирующих условиях находится в плохо свёрнутом, разупорядоченном состоянии, проявляя тем самым многие характеристики

расплавленной

глобулы.

Авторы

предлагают

считать,

что

структурированный третий EF-hand сайт является своеобразным физиологическим триггером, который в присутствии природной мишени CaVPТ индуцирует появление структуры у четвёртого EF-hand сайта. К сожалению, из-за сильной тенденции CaVP к образованию агрегатов в условиях ЯМР-эксперимента, авторам не удалось провести аналогичные структурные исследования влияния кальция на конформацию С-домена в целом CaVP.

2.4. Hsp90 Основной белок теплового шока с молекулярной массой около 90 кДа, hsp90, высоко консервативен от E. сoli до человека и имеет, таким образом, очень схожие физикохимические свойства у прокариот и эукариот

[66]

. Hsp90 составляет 1-2% общего

количества белка в не подверженной стрессу клетке и взаимодействует со многими внутриклеточными белками, защищая их от тепловой денатурации и агрегации

[67]

. В 35

условиях стресса экспрессия hsp90 резко возрастает. In vitro, hsp90, в основном, представляет собой димер [68]. В соответствии с [69], связывание hsp90 с кальцием, магнием и марганцем может вызывать его олигомеризацию. Фосфорилирование hsp90 требует присутствия Ca2+, в то время как Mg2+ полностью блокирует этот процесс. Также, как и другие белки теплового шока, hsp90 является молекулярным шапероном и, как полагают, защищает клетки от повреждения при нефизиологически высоких температурах. По этой причине большой интерес представляет определение [70]

точного предела его температурной стабильности. Как показано в температурой

шапероновая

активность

hsp90

связана

с

его

, вызванная

олигомеризацией.

Олигомеризованный hsp90 сохраняет белок-субстрат в свернутом состоянии. Некоторые интересные данные по температурной стабильности hsp90

[71]

и hsp85

[72]

были получены

при помощи флуоресцентной спектроскопии. К сожалению, наблюдались лишь небольшие изменения в интенсивности флуоресценции hsp90 с температурой, что не позволило точно охарактеризовать процесс его разворачивания. Более того, агрегация сильно ограничивала точность оценки влияния двухвалентных ионов на параметры тепловой денатурации hsp90, и мы не смогли найти в литературе каких-либо прямых данных, касающихся влияния кальция на стабильность и конформацию этого белка, хотя известно, что концентрация кальция в клетке возрастает при тепловом шоке.

2.4.1. Молекулярные характеристики и структура hsp90 Хотя первичная структура hsp90 была давно определена

[73]

, относительно немного

известно о функциональной роли различных сегментов белка. Биохимические и электронно-микроскопические исследования показывают, что белок состоит из трёх чётко различимых доменов

[74,75]

и является фосфорилированным димером (рис.2.11)

содержащим 2-3 ковалентно связанные молекулы фосфата на мономер необходима для функционирования hsp90

[78]

[77]

[68,76]

,

. Димеризация

. В присутствии не ионных детергентов и под

действием температуры он преимущественно образует олигомеры

[79,68]

. Тенденция к

олигомеризации имеется у hsp90 и в нативных условиях, особенно в присутствии дивалентных катионов, нуклеотидов и при повышении концентрации белка показали исследование седиментации

[76,82]

и электронная микроскопия

[83]

[80,71,69,81]

. Как

, димеры hsp90

имеют довольно вытянутую структуру. Как и многие другие шапероны, hsp90 является в значительной степени гидрофобным белком, и его гидрофобность возрастает под действием теплового шока

[84,85]

. С другой

стороны, hsp90 содержит также две сильно заряженные области: одна расположена в зоне шарнира между N- и С-концевыми доменами (эта структура имеется только у 36

Trp 605

Trp 296 Trp 319

Trp 161 1

400

542 621

732

-C

N-

-N 542

1

400 Trp 161

Trp 296 Trp 319

Trp 605

C732 621

N-концевой домен (1-400 а.о.) Центральный домен (401-615 а.о.) С-концевой домен (621-732 а.о.) Рис.2.11. Структура димера hsp90, состоящего из двух ориентированных в противоположных направлениях мономеров. Приведено положение остатков триптофана. эукариотических гомологов hsp90), а вторая - в С-домене. Эти структуры (вместе с экспонированными взаимодействие

гидрофобными

hsp90

с

участками),

мишенями

[86]

,

что

возможно,

также

подтверждается

определяют

тем,

что

hsp90

предпочтительнее связывается с положительно заряженными или гидрофобными белками [87]

. Нsp90, возможно, является одним из самых «липких» белков цитозоля, своего рода

«молекулярным клеем» в клетках. Кроме киназ и фосфатаз он связывает большое число других белков, включая различные гормональные рецепторы [90,91,92,93]

[88]

, актин

[89,83]

, тубулин

, фактор теплового шока 1 [94], калмодулин [69], калпаин и протеосомы [95,96]. Нsp90

формирует большие цитозольные комплексы с другими молекулярными шаперонами, такими как hsp70, иммунофилины, CDC37 и p23 [97,98]. Ранние исследования показали, что hsp90 обладает АТР-связывающим сайтом и способен фосфорилировать себя сам

[99]

. Кроме того, он претерпевает значительные

конформационные изменения при связывании с АТР

[100]

. Очищенный hsp90 проявляет

АТРазную активность [101,94] и даже в ещё большей степени GTPазную

[102]

. Недавно были

получены кристаллические структуры ATP- и ADP-комплексов N-домена hsp90 имеет достаточно низкую афинность (Kd около 200–400 µM) к hsp90

[103]

. ATP

[99,100,104,105,106]

по

сравнению с другими нуклеотидами, такими как ADP [104] и СTP [80].

37

Рис.2.12. Структура N-домена (9 - 236) hsp90, построенная с помощью программного пакета PDBViewer, на основании координат из Брукхевенского Белкового Банка Данных (1YER).

2.4.2. Структура hsp90: N-концевой домен Одним из наиболее важных последних достижений в области исследования hsp90 является кристаллизация и определение трёхмерной структуры N-концевого домена hsp90 (рис.2.12)

[103,107,75]

. Структуры N-концевых доменов hsp90 человека

[75]

и дрожжей

[107]

практически одинаковы: сильно закрученный антипаралельный β-слой, состоящий из восьми полос, закрытый с одной стороны девятью α-спиралями. В центре α-спиральной части расположен глубокий карман, который формирует ATP/ADP-связывающий сайт [104,103]

, являющийся также жельданомицин-связывающим сайтом

[104,75]

. Жельданомицин-

связывающий сайт, возможно, перекрывается сайтом другого hsp90-связывающего антибиотика, радисикола [108]. N-концевой домен участвует в связывании белков-мишеней 38

[107,109]

и

содержит

отрезок

из

60

аминокислот,

который

высокогомологичен

соответствующей области в интрамолекулярном шапероне цитользина из Vibrio cholerae [110]

.

2.4.3. Структура hsp90: С-концевой домен С-концевой домен hsp90 содержит калмодулин-связывающий сайт димеризацию

[111,78,112]

белка

.

Сайт

димеризации

моноклональных антител к hsp90 и АС-88

[113,114]

расположен

[69]

и отвечает за

около

эпитопа

. Связывание АС-88 с hsp90

интерферирует со связыванием нескольких белков, включая стероидные рецепторы и актиновые филаменты, что может указывать на участие С-концевой части hsp90 во взаимодействии с мишенями [115,105,113,116,114]. Ранние исследования Ксермили и Кана (1991) показали наличие АТР-связывающей консенсусной последовательности в С-концевой части hsp90. Дальнейшие исследования [117]

показали, что степень гомологии сохраняется плохо и открытие неклассического

ATP/ADP-связывающего сайта (отличного от ATP сайтов всех других шаперонов N-концевом домене

[103]

[118]

)в

также сделало ненужным в то время предположение о

существовании ATP-связывающего сайта в С-концевой части. Однако, фосфоафинное мечение hsp90 аналогами АТР демонстрирует довольно рассеянное мечение почти всех трипсиновых фрагментов. Точки Хилла АТР-зависимой активности hsp90, такие как автофосфориляция

или

ассоциированная

АТРазная

кооперативность двух сайтов связывания в димере

[119]

активность,

указывают

на

. Часть этих наблюдений может

быть объяснена взаимодействием N-концевых ATP-связывающих сайтов димера hsp90 или наличием в hsp90 двух нуклеотид-связывающих сайтов, как у членов семейства шаперонов hsp110

[120]

. Недавние эксперименты Маркю с соавторами по связыванию

рекомбинантных участков С-концевого домена hsp90 различной длины с АТР-сефарозой подтвердили возможность существования в С-концевой области hsp90 (а.о. 538-728) АТРсвязывающего сайта [121]. Заканчивая наш структурный анализ hsp90, мы должны указать, что некоторые экспериментальные данные могут быть взаимосогласованы, только если предположить тесное взаимодействие N- и С-концевого доменов друг с другом. Сопоставление достаточно сильных и разных конформационных изменений hsp90 при связывании с АТР [100]

и жельданомицином со схожими третичными структурами комплексов N-концевого

домена hsp90 с АТР

[103]

и жельданомицином

[75]

позволяет сделать вывод о том, что N-

концевой домен вызывает конформационные изменения в С-домене при взаимодействии с

39

различными лигандами. К такому же заключению пришли в своей последней работе и Маркю с соавторами [121,122].

3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Объекты и материалы 3.1.1. Белок теплового шока hsp90 Hsp90 был выделен из мозга свиньи и очищен как описано ранее

[123]

, со следующим

незначительным изменением: на первой стадии хроматографической процедуры мы использовали колонку с Butyl Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia Biotech) вместо Butyl ToyoPearl 650 C. Белок был идентифицирован как hsp90 при помощи Вестерн блотанализа с использованием SPA-830 антител к hsp90 производства фирмы StressGen и с применением прибора Pharmacia-LKB PhastTransfer. Чистота белка проверялась

с

помощью SDS ПАГ-электрофореза с помощью прибора Pharmacia-LKB PhastSystem. После очистки белок был отдиализован в течение ночи при 4°C против 20 мM фосфатного буфера, pH 7,0 и хранился при температуре -80°C. Концентрация hsp90 определялась на спектрофотометре V-550 (“Jasco”, Япония), с использованием молярного коэффициента экстинкции 124'000 М-1 cм-1 при 280 нм, рассчитанного согласно методу, описанному в работе

[124]

, в предположении, что hsp90 является димером с молекулярной массой 162

кДа. Для приготовления растворов белка при pH 7,0 использовали 20 мМ фосфатный буфер и 10 мМ Tris-HCl (при добавлении ионов кальция и магния). 3.1.2. Калмодулин и пептид RS20 Рекомбинантный калмодулин (СаМ), являющийся искусственным гибридом СаМ из млекопитающих и растений, способный активировать все СаМ-зависимые ферменты и называемый SynCaM (впоследствии просто СаМ или калмодулин), был экспрессирован и очищен нашими французскими коллегами из ферментативного центра Лаборатории Бактериальной Химии (CNRS UPR, Marseille, France) в соответствии с методикой, описанной ранее

[125]

. Чистота белка проверялась с помощью SDS ПАГ-электрофореза,

капиллярного электрофореза высокого разрешения и ионизационной масс-спектрометрии и составляла более 99%. Концентрация белка измерялась спектрофотометрически с использованием молярного коэффициента экстинкции 1560 М-1см-1 при 280 нм

[126]

.

Пептид из 20 остатков (RS20), соответствующий калмодулин-связывающему домену киназы легких цепей миозина гладких мышц, был синтезирован и очищен как описано ранее

[127,128]

. Концентрация пептида определялась спектрофотометрически, полагая

коэффициент молярной экстинкции равным 5600 М-1см-1 при 280 нм (это значение было 40

определено путём сравнения УФ-спектра и данных аминокислотного анализа). Во избежание загрязнения апокалмодулина кальцием все коммерчески доступные химикаты, используемые для работы, были наивысшей степени очистки. Растворы белков были приготовлены в 10 мМ натрий-какодилатном буфере (некоторые образцы также в 50 мМ Нepes для сравнения со стандартными условиями), рН 7,5, содержащем 10 мМ EGTA или 1 мМ CaCl2. Комплекс CaM-RS20, используемый в ДСК и КД экспериментах, был приготовлен смешиванием белка с приблизительно 2-кратным молярным избытком RS20. Для масс-спектрометрических экспериментов использовался 10 мМ аммоний ацетатный буфер, pH 5,9, концентрация калмодулина составляла при этом 25 мкМ, а отношение концентраций калмодулина к пептиду было 1:1,5. Удаление кальция. Как известно, калмодулин может ренатурировать после осаждения с помощью трихлоруксусной кислоты. При низком значении рН сродство калмодулина к Ca2+ уменьшается. Эти свойства были использованы в методе по освобождению калмодулина от кальция, предложенном в 1981 году Айашем

[129]

. Данный метод

позволяет получать образцы калмодулина, содержащие менее 4×10-2 М Ca2+. Кальций удаляли из калмодулина следующим образом: 2 мг (∼10-7 М) калмодулина растворяли в 1 мл воды. Затем добавляли 33 мкл трихлоруксусной кислоты с концентрацией 1 г/мл. Суспензию центрифугировали, осадок собирали и растворяли в 967 мкл воды и 33 мкл раствора Tris-HCl (рН 9,5) до концентрации 121 мг/мл. Далее добавляли 33 мкл трихлоруксусной кислоты и весь процесс повторяли снова. После третьего добавления трихлоруксусной кислоты осадок трижды промывали в холодной воде. Затем осадок растворяли в рабочем буфере. Для всех экспериментов использовались ультрачистая вода (milli-Q apparatus, Millipore Inc.) и пластиковая посуда, вымытая в 1N HCl, для сведения к минимуму содержания кальция. 3.1.3. Кальций-векторный белок (CaVP)

Клонирование и экспрессия. Клонирование и экспрессия в E. coli кальций-векторного белка (CaVP) и его рекомбинантных долей (N-CaVP и С-CaVP) были осуществлены в Отделе биохимии Женевского Университета (Швейцария) в группе под руководством проф. Джоса Какса согласно методике, описанной в [130]. Очистка. 25 мл культуры E. сoli, экспрессирующей CaVP, N-CaVP или С-CaVP, смешивали с 50 мл 20 мМ Tris-HCl буфера при pH 7,5, содержащего 1 мМ DTT, 40 мкM PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 10 мкM СаСl2 и 0,1 мМ диизопропил флуорофосфата. После клеточного лизиса с помощью ультразвука в течении двух минут и последующего 25минутного центрифугирования суспензии при 13'000 об./мин полученный осадок снова 41

был растворен в том же буфере. Супернатанты CaVP или С-CaVP, были нанесены на ионообменную DEAE-целлюлозную колонку (2,6×9,5 см) и вымыты линейным градиентом

0-350

мМ

NaCl,

что

контролировалось

с

использованием

кондуктометрического анализа. Фракции были проанализированы с помощью SDS ПАГэлектрофореза и методом атомарной абсорбции для определения количества связанного с белком кальция

[131]

. Фракции, содержащие CaVP или С-CaVP, были нанесены на DEAE-

целлюлозную колонку (2,6×5,5 см), уравновешенную 20 мМ Tris-HCl буфером при pH 7,5, содержащим 1 мМ DTT, 40 мкM PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl, и вымыты линейным градиентом 50-300 мМ NaCl. Белковые фракции были сконцентрированы и подвергнуты гель-фильтрации на колонке Sephadex G-75 (2×145 см), уравновешенной 20 мМ Нepes буфером с pH 7,5, содержащим 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 мг/л пепстатина и 0,1 мМ CaCl2. Буферы, используемые для очистки N-CaVP, не содержали ни Са2+, ни EDTA. Так как фракции N-CaVP после DEAE колонки обладали более низкой проводимостью (3-4 миллиома) чем фракции CaVP (7 миллиома) и С-CaVP (7-8 миллиома), ионообменный этап очистки был выполнен на QAE колонке (2,6×3,6 см) с линейным градиентом 0-250 мМ NaCl. Природные CaVP и CaVPТ были очищены как описывалось ранее [54]. Элюционные объемы рекомбинантных CaVP, N-CaVP и С-CaVP после колонки Sephadex G-75 соответствовали молекулярным весам 35, 10 и 15 кДа, соответственно, а максимальный выход составлял 6,3, 2,6 и 4,7 мг на литр бактериальной среды, соответственно. Все три белка проявляли электрофоретическую гомогенность как в нативном,

так

и

в

SDS

ПАГ-электрофорезе.

Чтобы

проверить

правильность

аминокислотной последовательности синтезированных белков, были определены их точные

массы

с

помощью

масс-спектрометрии.

Измеренные

и

теоретические

молекулярные массы составляли 18'223±1 и 18'224 Да для CaVP, 9'768±5 и 9'773 Да для NCaVP, 9'402±2 и 9'269 Да для С-CaVP, соответственно. Расхождение, наблюдаемое для СCaVP, возникало из-за не отщеплённого с N-конца метионина (133 Да), что подтверждалось также секвенированием N-конца С-CaVP при помощи метода Эдмана. Концентрацию белков определяли на спектрофотометре V-550 (“Jasco”, Япония), принимая молярный коэффициент экстинкции при 278 нм равным 26'600 М-1 cм-1 для CaVPТ, 13'700 М-1 cм-1 для CaVP

[54]

, 5'690 М-1 cм-1 для С-CaVP и 12'660 М-1 cм-1 для N-

CaVP. Коэффициенты экстинкции рекомбинантных долей CaVP (С-CaVP и N-CaVP) рассчитывали, исходя из содержания остатков триптофана, тирозина и цистеина. Образование комплекса с CaVPТ. Белки CaVP, С-CaVP или N-CaVP в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,5, содержащем 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl 42

и 5 мкМ CaCl2, смешивались в эквимолярном отношении с CaVPТ в том же буфере, содержащем 2 М мочевины, диализовались против 20 мМ Tris-HCl буфера, pH 7,5, содержащего 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2, после чего концентрировались с помощью Centriprep-10. Комплекс отделялся от свободных белков гель-фильтрацией на колонке Sephacryl S-200 (1,2×132 см), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl буфером, pH 7,5, содержащим 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl и 5 мкМ CaCl2. Аналогичные эксперименты были проведены в присутствии 1 мМ EDTA вместо CaCl2. Удаление и связывание кальция. Для удаления ионов кальция растворы CaVP и комплекса CaVP/CaVPТ диализовались против 20 мМ Tris-HCl буфера, pH 7,5, содержащего 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA, затем концентрировались с помощью Centriprep-10 и пропускались через колонку Sephadex G-25 (1×40 см), уравновешенную 50 мМ Tris-HCl буфером при pH 7,5, содержащим 150 мМ КCl, который перед этим был очищен от примесей ионов двухвалентных металлов с помощью колонки EDTA-Sepharose

[54]

. Эксперименты по

связыванию кальция проводились на свободных от металла белках с помощью метода проточного диализа при 25°С в 50 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,5, содержащем 150 мМ КCl, согласно работе

[132]

. Концентрации белков составляли 15-30 мкМ. Обработка

экспериментальных данных и определение констант связывания производились как было описано ранее [46].

3.2.

Методы исследований

3.2.1.

Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК)

Калориметрические измерения проводили на дифференциальных адиабатических сканирующих микрокалориметрах ДАСМ-4 (НПО “Биоприбор”, Пущино, Россия) и VPDSC (MicroСal, США) при скорости нагрева 1 К/мин, объём рабочих ячеек составлял 0,48 мл

и 0,51 мл, соответственно. Для предотвращения образования пузырьков и

закипания растворов при повышении температуры, во всех калориметрических экспериментах в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 1,5 aтм., и, кроме того, перед проведением экспериментов растворы дегазировались в вакуумной установке в течении 5-10 минут. Для определения чувствительности приборов ДАСМ-4 они калибровались путём подачи на одну ячейку фиксированной мощности (w = 25 мквт) и из площади под кривой тепловыделения (s1) за время t (сек) определяли коэффициент k1 (в Дж/см2), который рассчитывали по уравнению k1 = wt/s1, а коэффициент k2 (в Дж/град⋅мм) из уравнения: k2 = w/vh, где v - скорость прогрева ячеек в град/сек и h 43

величина отклонения от базовой линии в мм шкалы самописца при заданной мощности тепловыделения w. Калибровочные коэффициенты k1 и k2 использовали в дальнейшем для расчёта энтальпии денатурации ∆Нcal = МQd, где М - молекулярный вес белка, Qd теплопоглощение в процессе денатурации (Qd = k1⋅s, где s - площадь под кривой зависимости избыточной теплоемкости белка от температуры, см2) и для расчёта теплоемкости (∆Cp = k2h, где h - высота шкалы самописца, мм). Для определения инструментальной базовой линии в обе калориметрические ячейки (рабочую и контрольную) помещали исходный буфер и проводили прогрев при заданной скорости. Затем обе ячейки перезаправляли: в контрольную помещали тот же буферный раствор, а в рабочую - раствор белка. Концентрации белков варьировали от 0,4 до 3,5 мг/мл. Экспериментальные кривые корректировали путём вычитания инструментальной базовой линии. Обратимость процесса тепловой денатурации определяли как отношение теплоты денатурации белка при повторном нагреве после охлаждения к её значению при первом нагреве. Парциальную молярную теплоемкость белка, Сp, определяли как описано в работе [133]

[2]

, принимая парциальной удельной объем для hsp90 и CaVP равным 0,73 см3/г

, а для калмодулина - 0,72 см3/г

[30]

. Парциальный объём белков был рассчитан по их

аминокислотному составу в соответствии с работой тепловой

денатурации

белка

Td,

∆Нcal

и

[133]

. Термодинамические параметры

∆Нeff

(температура

денатурации,

калориметрическая и эффективная (Вант-Гоффа) энтальпии денатурации, соответственно) определяли как было описано ранее

[2]

. Калориметрическую энтальпию денатурации

рассчитывали из площади под кривой зависимости избыточной теплоемкости белка от температуры; эффективную энтальпию денатурации рассчитывали в соответствии с уравнением: ∆Нeff = 4R(Td)2∆Cpmax/Qd, где R - универсальная газовая постоянная, (8,314 Дж/К моль); Td - температура денатурации, К; ∆Cpmax - максимальное изменение теплоемкости белка в точке, соответствующей температуре денатурации (∆Cpmax = k2h, где k2 - калибровочный коэффициент, выраженный в Дж/град⋅мм шкалы самописца; h высота пика теплопоглощения в максимуме, мм). Отношение ∆Нcal/∆Нeff связано, как правило, с числом кооперативных единиц, разворачивание которых происходит в наблюдаемом пике (см. гл.2.1.3.3). Точность определения величин калориметрических и эффективных энтальпий составляла 6-8%, а величины Cp определяли с точностью ±1,5 кДж/К моль. Экспериментальная ошибка измерения Td не превышала ±0,2ΟС. Анализ калориметрических кривых. Для обработки и анализа кривых плавления использовали программный пакет Origin фирмы MicroCal. Для этой цели сначала из экспериментальной кривой плавления вычитали её «собственную» базовую линию (см. 44

гл.2.1.2), определённую с помощью того же программного пакета (получая при этом функцию избыточной теплоёмкости, отличную от нуля лишь в области, где происходит плавление образца), а затем проводили разделение (деконволюцию) полученной кривой на отдельные пики. Алгоритм разделения калориметрических кривых, использующийся в данной программе, основан на следующих фундаментальных соотношениях (без какоголибо предположения конкретной модели или механизма реакции): •

каждая кривая плавления представляет собой алгебраическую сумму пиков, соответствующих одностадийным (многостадийным) кооперативным переходам;

•

эти переходы независимы то есть термодинамические параметры данного перехода не зависят от состояния других переходов;

•

энтальпия каждого перехода не зависит от температуры,

а также на последовательном нахождении параметров элементарных переходов в процессе распада структуры [24,23]. В соответствии со сделанными выше предположениями, ∆H (T) = ∑∆hi = ∆H (Td) + ∆Cp (T − Td), где ∆hi - энтальпия каждого перехода, Td - температура денатурации, а ∆Cp - изменение теплоемкости.

Для

одностадийных,

равновесных

и

независимых

переходов,

калориметрическая и эффективная энтальпии равны: ∆hi = ∆hi,cal = ∆hi,eff, кроме того, ∆hi,eff = 4R(Ti,d)2∆Cpmax/ ∆hi,cal, где ∆Cpmax - амплитуда теплопоглощения в середине перехода при Т = Тd, из чего следует, что площадь каждого пика, его амплитуда и положение на температурной шкале однозначно связаны следующим соотношением: (∆hi,cal)2/(Тi,d)2∆Cpmax = 4R, поэтому требование его выполнения значительно ограничивает количество вариантов разложения интегральной кривой на элементарные составляющие, и тогда возможность однозначного решения задачи определяется, в основном, погрешностью опыта. Ошибки в определении параметров индивидуальных переходов, полученных путем деконволюции кривых плавления, не превышали 8-10% для энтальпии перехода и ±1,3ΟC для температуры перехода. 3.2.2. Круговой Дихроизм (КД) Спектры КД снимали на спектрополяриметре J-715 (“Jasco”, Япония) в дальней и ближней УФ-областях. Для температурных измерений использовали программируемый 45

водный циркулятор RTE-111 с программой температурного контроля Deltatemp (“Neslab Instruments”, США) и специальные кюветы 0,02 см и 1 см с водяными рубашками (“Hellma Cells”, США). Плавление растворов белков проводили с такой же, как и в микрокалориметрии, скоростью нагрева, 1 К/мин. Концентрации белков составляли 0,151,6 мг/мл. Результаты измерений выражали в единицах молярной эллиптичности, [Θ] (град⋅см2⋅дмоль-1), приходящейся на средний аминокислотный остаток, считая среднюю массу остатка равной 111 для hsp90, 112,4 для СаМ, 112,6 для комплекса СаМ с RS20 и 113,2, 113,6 и 114,7 для CaVP, N-CaVP и C-CaVP, соответственно. Молярную эллиптичность рассчитывали по формуле [Θ] = (θ×100×MRW) / (c×l), где θ - измеряемая эллиптичность в градусах, MRW - средняя масса остатка, с -концентрация белка в мг/мл и l - длина оптического пути в см. Результаты измерений также выражали в единицах молярного дихроизма, Δε, (М-1см-1), по формуле Δε=θ/3300×l×C, где С – молярная концентрация

белка.

Спектрополяриметр

калибровали

с

помощью

камфорсульфоновой кислоты, принимая [Θ]291 = 7820 град⋅см2⋅дмоль-1

[134]

(d)-10-

и с помощью

негигроскопического стандарта фирмы “Jasco” d-10-камфорсульфоната аммония, для которого [Θ]290,5 = 7910 град⋅см2⋅дмоль-1 [135]. Шумы в спектрах КД сглаживали с помощью специальной программы спектрополяриметра J-715, которая позволяет выделять сигнал на фоне шума без искажения формы полос КД. Для расчёта процента α-спиральности в белках использовали формулу ƒH = −([Θ]222+2340)/30300, выведенную в работе Чена и соавторов [136]. 3.2.3. Изотермическая Калориметрия Титрования Связывание пептида RS20 с CaM было проанализировано с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC), с использованием прибора MicroCal MCS ITC (США). Эксперименты проводились при 25°С. Концентрация CaM в 1,34-мл калориметрической ячейке изменялась от 0,02 до 0,06 мМ, тогда как концентрация RS20 в шприце варьировалась от 0,2 до 0,6 мМ. Титрование CaM проводилось до достижения соотношения между концентрациями пептида и белка близкого к двум. Теплота разбавления измерялась с помощью инжекций пептида в свободный от белка раствор буфера или с помощью дополнительной инжекции пептида после насыщения; полученная величина вычиталась из теплоты реакции для получения эффективной энтальпии связывания. Данные были проанализированы с помощью пакета программ MicroCal Origin с использованием модели с набором из n независимых идентичных мест связывания («one set of sites» model). Данная модель может быть представлена в виде следующей системы стехиометрических уравнений: 46

K

P + L ←→ PL ;

K

…;

PLn −1 + L ←→ PLn ,

где P – белок, L – лиганд, а K – константа их связывания, определяющаяся из уравнения: K=

[ PLn ] [ PL] ⇒ = = [ P][ L] [ PLn −1 ][ L]

[ PLi ] = K i [ L]i [ P] .

Учитывая приведённые выше соотношения, запишем уравнение сохранения вещества для белка с начальной концентрацией [Р]0 через константу связывания: n

n

i =1

i =0

[ P]0 = [ P] + ∑ [ PLi ] = [ P]∑ K i [ L]i ; выражая отсюда концентрацию белка и подставляя в уравнение сохранения для лиганда с начальной концентрацией [L]0, получим: n

∑ iK [ L] i

n

n

i =1

i =1

[ L]0 = [ L] + ∑ i[ PLi ] = [ L] + [ P]∑ iK i [ L]i = [ L] + [ P]0

i

i =1 n

∑ K [ L] i

.

i

i =0

Пренебрегая младшими порядками, запишем уравнение, связывающее начальные концентрации белка и лиганда с его текущей концентрацией через константу связывания и стехиометрию процесса: [ L]0 = [ L] + [ P ]0

nK [ L] . 1 + K [ L]

Зная разбавление и выделившееся тепло в ходе каждой инъекции лиганда в раствор белка, мы проводим подгонку теоретической кривой к экспериментальной и определяем таким образом стехиометрию связывания (n), энтальпию связывания (∆Н), константу ассоциации (Ка) и, следовательно, изменение свободной энергии (∆G) и изменение энтропии (∆S). 3.2.4. Флюоресценция триптофана Эксперименты по эмиссионной флюоресценции проводились на флюориметре PerkinElmer LS-5B со щелями возбуждения и эмиссии 5 нм. Растворы, содержащие 10 мкМ белка в 50 мМ Tris при pH 7,5, в присутствии 150 мМ KCl и 1 мМ β-меркаптоэтанола, облучали светом с длиной волны 295 нм при 25°С. Апо-, кальциевая и денатурированная формы CaVP получались добавлением 20 мкM EDTA, 2,5 мМ CaCl2 и 4 М гуанидинхлорида, соответственно. 3.2.5. Метод поперечных ковалентных сшивок (кросс-линкинг) Эксперименты по ковалентному сшиванию белков проводились при комнатной температуре в соответствии с работой

[137]

. Эквимолярная смесь CaVPT с CaVP, С-CaVP 47

или N-CaVP (концентрация белков около 40 мкМ) инкубировалась в течении трех часов в 20 мМ Нepes буфере, pH 7,5, содержащим 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 мг/л пепстатина и 50 мкМ DSS в присутствии 1 мМ CaCl2 или EDTA. Затем реакция была остановлена добавлением этаноламина до конечной концентрации 1 мМ, после чего реакционная смесь была подвергнута электрофорезу в 15% SDS-полиакриламидном геле и окрашена с помощью Coomassie Brilliant Blue. 3.2.6. Ионизационная электро-спрей масс-спектрометрия (ESI-MS) Масс-спектрометрический анализ связывания пептида RS20 с СаМ проводился совместно с сотрудниками лаборатории проф. P.J.Derrick из Института МассСпектрометрии Университета Варвика (Великобритания) на FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) масс-спектрометре (Bruker Daltonics, США), оснащённом пассивно экранированным 9,4 Т сверхпроводящим магнитом (Magnex Scientific Ltd.,

UK),

цилиндрической ICR (Ion Cyclotron Resonance) ячейкой диаметром 0,06 м и внешним источником ESI (Analytica of Branford, США). Описание этого масс-спектрометра содержится в работах

[138,139]

. Источник ESI был оснащён капилляром Pyrex, покрытым с

обоих концов платиной. В качестве осушающего газа в источнике ESI использовался диоксид углерода и его температура тщательно контролировалась. Фоновое давление в анализаторе было, как правило, ниже 2×10-10 мбар. Ионизационная

электро-спрей

масс-спектрометрия

основана

на

ионизации

исследуемых молекул с последующим их разделением и анализом. Исследуемый раствор подаётся с постоянной скоростью по гибкому силиконовому капилляру к источнику, где происходит ионизация молекул и перевод их в газовую фазу. Это достигается за счёт того, что небольшие капельки раствора, на которые подведено напряжение порядка 3 кВ, обдуваемые азотом, взрываются при достижении ими критического размера в процессе испарения (рис.3.1). Затем макромолекулы, находящиеся в газообразном состоянии и имеющие разные массы и заряды, ускоряются, и направляются в магнитное поле. Частота вращения ионов в магнитном поле обратно пропорциональна их массе. Каждая частота вращения определяется и с помощью Фурье преобразования расчитываются массы ионов.

4.

Взаимодействие

калмодулина

с

СаМ-связывающим

доменом киназы лёгких цепей миозина гладких мышц (RS20) при различной степени насыщения кальцием Из всех детекторов кальция калмодулин (СаМ) является наиболее повсеместным, присутствующим во всех эукариотических клетках, где он активирует множество белков, 48

часть из которых даже являются антагонистами. Такое разнообразие и, одновременно, специфичность действия СаМ, пока не находят объяснения. Для анализа взаимодействия СаМ и его мишеней используются пептиды, соответствующие СаМ-связывающим доменам специфических ферментов. Несмотря на то, что для некоторых белков-мишеней была показана возможность существования комплекса с апокалмодулином, и, более того, в 1996 году Бейли с соавторами

[50]

доказали существование комплекса 2Са2+-СаМ с

десятичленным пептидом WF10 (первые 10 остатков N-концевой последовательности пептида М13) из СаМ-связывающего домена MLCK скелетных мышц, все существующие до

настоящего

времени

исследования

комплекса

20-тичленного

пептида

RS20,

соответствующего СаМ-связывающему домену MLCK гладких мышц, с калмодулином, как уже упоминалось в главе 2, проводились в присутствии насыщающей концентрации кальция. Поскольку в клетке СаМ осциллирует между кальций-насыщенной и апоформами, мы предположили, что могут существовать различные комплексы пептида RS20 с СаМ в зависимости от степени насыщения СаМ ионами кальция и изучили возможность и условия существования комплекса апоСаМ с пептидом RS20. Существующие в литературе данные структурных исследований предоставляют нам атомарную картину интенсивных контактов, образующихся между СаМ и его белкамимишенями. Однако, если мы хотим определить первопричины высокой афинности, наблюдаемой между СаМ и его мишенями, необходимо понимать связанную с этими контактами

энергетику.

Такое

понимание

требует

детальной

информации

о

термодинамике процесса связывания пептида с СаМ. Наиболее адекватными методами решения поставленной задачи являются сканирующая и изотермическая калориметрия. Эти методы могут не только предоставить нам самую полную термодинамическую информацию об узнавании калмодулином пептида-мишени, но и пролить свет на детали этого взаимодействия и роль в нём отдельных доменов белка.

49

4.1.

Пептид RS20 связывается с калмодулином в отсутствие

ионов кальция Для определения взаимодействия пептида RS20 с апоCaM при pH 7,5 и в присутствии 10 мМ EGTA была использована изотермическая калориметрия титрования (ITC). При титровании апокалмодулина буфером, содержащим EGTA, никакого сигнала ITC обнаружено не было. Мы использовали 10 мМ какодилатный буфер в связи с тем, что, как было показано ранее в нашей группе, эта концентрация буфера не вызывает значительных

Время, мин

0

10

20

30

40

50

60

ккал/моль RS20

мккал/сек

0 -0,5

А

-1,0 0 -5 -10

Б

-15 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Молярное отношение [CaM]/[RS20] Рис.4.1 Типичные кривые взаимодействия апо-СаМ с RS20, полученные методом ITC при 25°C в 10 мМ какодилатном буфере, pH 7,5, в присутствии 10 мМ EGTA. А, кривая титрования апокалмодулина пептидом RS20. Б, изотерма связывания, рассчитанная из кривой титрования (красная линия).

50

Табл.4.1. Термодинамические параметры связывания пептида RS20 с апокалмодулином в 10 мМ какодилатном буфере, в присутствии 10 мМ EGTA, при pH 7,5. Ka

∆Η

∆G

∆S

Соли

(M-1)

(кДж/моль)

(кДж/моль)

(Дж/К моль)

-

1,0×106

-38,9

-34,2

-16

100 мM NaCl

4,2×103

-106,6

-20,7

-288

150 мM KCl

1,2×103

-142,1

-17,6

-418

150 мM KCl

3,6×103

-154,7

-20,3

-451

5 мM MgCl2 изменений в структуре белка [41]. Кроме того, некоторые эксперименты были проведены в 50 мМ Hepes и, несмотря на разные величины теплот ионизации используемых буферов (-2 кДж/моль для какодилатного и 20,5 кДж/моль для Hepes), измеренное значение энтальпии связывания пептида апокалмодулином не зависело от типа буфера, как и для Са2+-СаМ

[52]

. Таким образом, эффект протонирования (депротонирования) в процессе

формирования комплекса отсутствует, и мы получаем истинное значение энтальпии связывания. Термодинамические данные демонстрируют образование эквимолярного комплекса

между

RS20

и

апокалмодулином

(рис.4.1),

которое

протекает

с

отрицательными изменениями энтропии и энтальпии, т.е. процесс является энтальпийно выгодным и энтропийно невыгодным (табл.4.1). Это не удивительно, так как и пептид, и белок значительно более неупорядочны в свободном состоянии: пептид в растворе существует как неупорядоченный клубок и становится, как будет показано далее, частично спирализованным при связывании, а один из доменов СаМ в комплексе, в отличие от свободного состояния, занимает фиксированную относительно пептида позицию (см. ниже). С другой стороны, связывание включает формирование большого числа энтальпийно выгодных ван дер Ваальсовых контактов. Присутствие соли приводит к тому, что связанное состояние становится более упорядоченным (табл. 1). В отсутствие соли константа образования комплекса составляет

106 М-1, а энтальпия и энтропия

связывания - –38,9 кДж/моль и –16 Дж/К моль, соответственно. Отметим, что это первая прямая демонстрация значительного связывания между апокалмодулином и пептидом RS20. Для приближения к внутриклеточным условиям мы использовали 150 мМ KCl и 5 мМ MgCl2 и обнаружили, что при этом константа ассоциации падает на три порядка, а также 51

происходит значительное увеличение энтальпии и энтропии связывания (табл. 4.1). Именно поэтому, возможно, в предшествующих работах, проводимых в присутствии соли, не было обнаружено взаимодействия между апоCaM и RS20 демонстрируют

важность

электростатических

взаимодействий

[52]

. Эти результаты

для

формирования

комплекса апокалмодулина с пептидом RS20. Добавление ионов магния в присутствии 150 мМ KCl, как видно из таблицы 4.1, оказывает лишь незначительное влияние на термодинамические параметры связывания пептида. Для насыщенного кальцием калмодулина и при отсутствии соли энтальпия взаимодействия равнялась –84 кДж/моль, что вдвое больше, чем в отсутствие ионов кальция.

4.2.

Изменение

термодинамических

параметров

тепловой

денатурации апокалмодулина при образовании комплекса с RS20 доказывает, что пептид связывается лишь с С-концевым доменом белка Зависимость парциальной молярной теплоёмкости комплекса апоCaM-RS20 от температуры существенно отличается от таковой для свободного апокалмодулина (рис.4.2А): хотя асимметрия кривой плавления сохраняется, выраженное плечо в области низких температур пропадает. Повторный нагрев образцов после их охлаждения от 90 до 5ºC демонстрирует высокую (до 95%) обратимость процесса денатурации. Как хорошо видно из рисунка 4.2А, парциальные молярные теплоёмкости при 20ºC свободного апокалмодулина и его комплекса с RS20 практически одинаковы, то есть подвижность (гибкость) молекулы апокалмодулина не изменяется при связывании с пептидом. Калориметрические энтальпии денатурации свободного и связанного апоCaM также не изменяются (табл.4.2), однако существенные различия проявляются при деконволюции обеих термограмм на «two-state» переходы: хотя число деконволюционных пиков (два) и температура второго перехода не изменяются, температура первого перехода в комплексе на 15ºC выше, чем у свободного белка (рис.4.2 Б и В; табл.4.2). Этот же эффект наблюдался и в буфере Hepes, хотя в этом случае увеличение температуры первого пика было не столь большим и составляло 5,7ºC (табл.4.2). Мы показали, что сам пептид не дает никакого вклада в кривую плавления, поскольку не обнаружили с помощью КД кооперативного перехода при прогреве пептида в трифторэтаноле, в котором он принимает α-спиральную конформацию. Как было показано в работах

[41,30]

, первый

деконволюционный пик соответствует плавлению С-концевой доли калмодулина, а второй отражает разворачивание N-концевой доли. Следовательно, связывание пептида оказывает влияние только на стабильность С-концевого домена апокалмодулина. 52

(кДж/К моль)

апоСаМ/RS20

C

(кДж/К моль)

C

апоСаМ

Температура (°С) Рис.4.2. А, температурные зависимости парциальной молярной теплоёмкости апокалмодулина и его комплекса с пептидом RS20 в присутствии 10 мМ EGTA, при pH 7,5. Б и В, компьютерная деконволюция избыточной теплоёмкости комплекса

(Б)

и

свободного

калмодулина

(В).

Сплошные

линии

–

экспериментальные кривые, пунктирные линии – деконволюционные пики и их сумма.

53

Табл.4.2. Термодинамические параметры тепловой денатурации калмодулина (в присутствии 1 мМ CaCl2) и апокалмодулина (в присутствии 10 мМ EGTA), а также их комплексов с пептидом RS20 в 10 мМ какодилатном буфере, при pH 7,5 Первый переход Образец

Соли

∆H acal

T

1 t

∆H

b

1 t

Второй переход

T

2 t

∆H

b

2 t

(кДж/моль)

(°C)

(кДж/моль)

(°C)

(кДж/моль)

АпоСаМ

-

348

38,9

124

59,6

224

АпоСаМ/RS20

-

335

53,9

118

58,7

217

АпоСаМ

100 мМ NaCl

358

50,1

134

65,4

224

АпоСаМ/RS20

100 мМ NaCl

405

49,7

173

64,4

232

АпоСаМ

150 мМ KCl

361

47,4

147

65,0

214

АпоСаМ/RS20

150 мМ KCl

353

47,8

138

64,8

215

АпоСаМ

150 мМ KCl

348

65,6

131

80,7

217

369

64,5

143

79,7

226

5 мМ MgCl2 АпоСаМ/RS20

150 мМ KCl 5 мМ MgCl2

АпоСаМ/RS20c

-

341

47,1

126

60,9

222

АпоСаМ c

-

297

41,4

110

60,8

210

150 мМ KCl

336

80,2

129

103,4

250

150 мМ KCl

557

100,4

170

105,2

486

-

332

45,3

145

64,0

193

-

352

78,5

127

105,5

251

CaM CaM/RS20 АпоСаМ

d

CaMd

a

Полная калориметрическая энтальпия денатурации.

b

Калориметрические переходы были определены с помощью разделения кривых избыточной теплоёмкости на переходы «всё или ничего».

c

50 мМ Hepes.

d

10 мМ аммоний-ацетатный буфер, pH 5,9.

54

Соответственно, RS20 и связывается лишь с С-концевым доменом. Вдвое большая энтальпия связывания RS20 с калмодулином в присутствии насыщающей концентрации кальция, когда обе доли белка взаимодействуют с пептидом, также подтверждает наш вывод. Температуры денатурационных переходов апоCaM повышаются в присутствии солей, при этом наибольший стабилизационный эффект наблюдается при совместном использовании KCl и MgCl2 (табл.4.2). Аналогично данным ITC, демонстрирующим значительное падение афинности RS20 к апоCaM при добавлении солей, результаты ДСК демонстрируют, что соли элиминируют селективный эффект RS20 на температуру первого калориметрического пика (табл.4.2), хотя данные ITC всё же предполагают наличие слабого комплекса. Возможное объяснение этого феномена заключается в том, что данный комплекс существует лишь при достаточно низких температурах и диссоциирует ещё до начала плавления.

4.3. Данные сканирующей микрокалориметрии подтверждают, что в присутствии ионов кальция RS20 взаимодействует с обеими долями калмодулина Из пространственной структуры комплекса CaM-RS20, определённой Меадором с соавторами в присутствии ионов кальция, следует, что калмодулин взаимодействует своими обеими долями с противоположными концами пептида

[33]

. На рис.4.3

2+

представлено плавление этого комплекса и свободного 4Са -СаМ в какодилатном буфере, содержащем 150 мМ KCl. Присутствие соли улучшает регистрацию термограмм Са2+-СаМ и его комплекса с RS20 (без соли плавление происходит при существенно более высоких температурах, граничащих с предельной чувствительностью современных микрокалориметров), которые легко разделяются на два «two-state» перехода (табл.4.2). Связывание пептида сильно понижает парциальную молярную теплоёмкость калмодулина при 20ºC, а следовательно, Са2+-СаМ принимает более компактную форму при образовании комплекса, что согласуется с данными рентгеноструктурных исследований. В отличие от комплекса с апо-белком, RS20 в присутствии ионов кальция воздействует на термодинамические параметры обоих переходов. Температура первого перехода увеличивается на 20,2ºC, а его энтальпия возрастает на 30%, и, хотя температура второго пика изменяется не столь значительно (на 1,8ºC), его энтальпия почти удваивается, что говорит о сильном взаимодействии пептида с N-концевой долей калмодулина.

55

С p (кДж/К моль)

80 60 CaM

40

CaM/RS20

20

0

20

40

60

80

100

120

140

Температура (°С) Рис.4.3. Температурная зависимость парциальной молярной теплоёмкости Са2+СаМ и комплекса Са2+-СаМ-RS20 в присутствии 1 мМ CaCl2 и 150 мМ KCl, при pH 7,5.

4.4.

Данные КД-спектроскопии комплекса апоCaM-RS20 указывают

на то, что пептид принимает частично спиральную конформацию На рис. 4.4 представлены спектры КД в дальнем ультрафиолете для апоCaM, RS20 и их комплекса. Спектр КД свободного

пептида типичен

для неупорядоченной

полипептидной цепи. Спектры калмодулина и его комплекса с RS20 подобны друг другу и представляют собой характерные для α-спиральных белков кривые с минимумами около 208 и 222 нм. Хотя добавление пептида не оказывает никакого влияния на спектр насыщенного кальцием калмодулина (данные не приведены), он заметно увеличивает амплитуду минимумов спектра КД апоCaM, что равносильно возрастанию αспиральности от 36% (для апоCaM) до 42% (для комплекса апоCaM-RS20). Содержание αспиралей рассчитывалось из элиптичности образцов при 222 нм в соответствии с работой [136]

(см. стр. ). Как известно, оба домена Са2+-СаМ не претерпевают значительных

изменений при образовании комплекса с RS20, в то время как центральная спираль частично расплетается и изламывается, а пептид RS20 в комплексе принимает α56

[Θ] x 10-4 (град см2/дмоль)

2

0 АпоСаМ

-2

RS20

190

АпоСаМ/RS20

230 210 Длина волны (нм)

250

Рис.4.4. Спектры КД пептида RS20, апокалмодулина и их комплекса при pH 7,5, в присутствии 10 мМ EGTA. Ширина линий определяет точность значений эллиптичности. спиральную конформацию с 4-го по 18-ый аминокислотный остаток

[32]

. Идентичность

спектров КД Са2+-СаМ и его комплекса с RS20 указывает на то, что увеличение эффекта КД из-за формирования вторичной структуры у пептида компенсируется его снижением вследствие частичного разрушения центральной α-спирали калмодулина. Как было показано выше, в комплексе апоCaM-RS20 пептид взаимодействует только с С-концевым доменом белка. Такой тип связывания не требует от апокалмодулина значительных конформационных изменений и деформации центральной α-спирали, чтобы подвести N-концевой домен к пептиду (как в случае с 4Са2+-СаМ). Следовательно, 6% увеличение α-спиральности комплекса апоCaM-RS20 по сравнению с апоCaM вызвано спирализацией примерно половины пептида из неупорядоченной конформации при связывании с апоCaM.

4.5.

Данные масс-спектрометрии подтверждают существование

комплекса апоCaM-RS20 Чтобы получить дополнительное подтверждение существования комплекса апоCaMRS20, мы решили применить масс-спектрометрию высокого разрешения (ESI-FTICR

[140]

),

57

Рис.4.5. Деконволюция функций избыточной теплоёмкости апокалмодулина (синяя кривая) и кальций-насыщенного калмодулина (красная кривая) в 10 мМ аммоний ацетатном буфере при pH 5,9. Сплошные линии – экспериментальные кривые, пунктирные линии – деконволюционные пики и их сумма.

являющуюся

наиболее

прямым

и

точным

методом,

позволяющим

определять

молекулярные нековалентные взаимодействия в растворе. Мы изучили на молекулярном уровне

последовательность

событий,

происходящих

при

взаимодействии

между

калмодулином и пептидом RS20 в отсутствие и в присутствии ионов кальция. На рис.4.6 представлен масс-спектр апокалмодулина в 5 мМ аммоний-ацетатном буфере при pH 5,9. Все пики спектра соотносятся с протонированными в различной степени молекулами апокалмодулина, так, например, [С]8+ соответствует [СаМ+8Н]8+, где СаМ является нейтральным белком. Экспериментально определённая молекулярная масса СаМ равнялась 16 616,84±0,02 Да, что хорошо согласуется с теоретическим значением 16 616,82 Да. Для того, чтобы проконтролировать влияние аммоний-ацетатного буфера на структуру калмодулина в отсутствие соли, была изучена тепловая денатурация белка с помощью ДСК. Температурные зависимости парциальных молярных теплоёмкостей как апокалмодулина, так и кальций-насыщенной формы калмодулина в 10 мМ аммоний58

Рис.4.6. Масс-спектр апокалмодулина в 5 мМ аммоний ацетатном буфере при pH 5,9. Вставка показывает изотопный состав в состоянии [С]8+.

ацетатном буфере были очень близки к таковым в 10 мМ какодилатном буфере в присутствии 150 мМ KCl, полученным нами выше. Деконволюция кривых плавления на два «two-state» перехода (рис.4.5), как видно из таблицы 4.2, даёт практически те же термодинамические

параметры

тепловой

денатурации

как

калмодулина,

так

и

апокалмодулина в аммоний ацетатном буфере при pH 5,9, что и в какодилатном буфере при pH 7,5, в присутствии 150 мМ KCl. Кроме того, парциальные молярные теплоёмкости калмодулина при 20ºC в аммоний ацетатном и какодилатном буферах также очень близки (31,9 кДж/К моль и 31,4 кДж/К моль, соответственно). Таким образом, можно заключить, что в экспериментальных условиях, используемых для проведения масс-спектрометрии, калмодулин не претерпевал никаких значительных конформационных изменений. Из масс-спектра RS20 в 5 мМ аммоний ацетатном буфере при pH 5,9 (данные не приведены) видно, что большинство молекул пептида находятся в состоянии [RS20+3Н]3+, т.е. связаны с тремя протонами. Экспериментально определённая молекулярная масса RS20 равнялась 2′293,293±0,01 Да, что хорошо согласуется с теоретическим значением 2′293,299 Да, полученным из аминокислотной последовательности. 59

Рис.4.7. Масс-спектр смеси калмодулина с пептидом RS20 (соотношение концентраций 1:1,5) в 5 мМ аммоний ацетатном буфере при pH 5,9, в отсутствие кальция. Вставка показывает масс-спектр калмодулина в состоянии [С]8+ с бóльшим разрешением. «Р» обозначает пептид RS20.

На рис.4.7 представлен масс-спектр, полученный после добавления пептида RS20 к раствору апокалмодулина в соотношении 1,5:1 RS20/апоCaM. Присутствие в спектре нескольких новых пиков по сравнению со спектром свободного апокалмодулина говорит о наличии эквимолярного комплекса апоCaM-RS20. Например, пик при m/z = 2′103,46, представляющий молекулы, протонированные девятью атомами водорода и имеющие соответственно заряд 9+, даёт нам массу в 18′922,14±0,02 Да, что в точности соответствует суммарной

массе

апокалмодулина

и

пептида.

Наличие

пиков

в

масс-спектре,

соответствующих комплексу апоCaM-RS20, является прямым и неопровержимым доказательством связывания калмодулина и СаМ-связывающего домена киназы лёгких цепей миозина гладких мышц в отсутствие ионов кальция.

60

4.6.

Пептид

RS20

сильно

увеличивает

кооперативность

связывания калмодулином кальция, что приводит к отсутствию форм комплекса, частично насыщенных кальцием На панелях А и Б рис.4.8 приведены масс-спектры калмодулина в аммоний-ацетатном буфере, содержащем 10 мкΜ CaCl2, в отсутствие и в присутствии пептида RS20, соответственно. Молярные отношения калмодулина, пептида и кальция в комплексе составляли 1:1,5:0,4. Присутствие кальция в таких концентрациях (в отсутствие пептида) не вызывало значительных изменений масс-спектра (рис.4.8А и 4.6) и, хотя наблюдались небольшие изменения интенсивности пиков [CaM]9+ и [CaM]7+, доминирующим оставался пик, соответствующий калмодулину с зарядом 8+. В каждом из этих состояний наблюдались молекулы калмодулина, насыщенные одним, двумя, тремя или четырьмя ионами кальция. Относительные интенсивности этих состояний слабо варьировали с изменением заряда калмодулина. Связывание кальция образцом всегда вызывало потерю двух протонов, так, например, [CaM+2Са]8+ соответствует калмодулину, связанному с двумя ионами кальция и протонированному четырьмя водородами (рис.4.8). В присутствии пептида RS20 наиболее интенсивный пик соответствовал полностью насыщенному кальцием комплексу с зарядом 8+ ([CaM+RS20+4Са]8+). Кроме того, наблюдались сильные пики, соответствующие свободному апокалмодулину и комплексу его апо-формы с RS20. Однако, несмотря на то, что в растворе присутствовали как апо-, так и полностью насыщенная кальцием формы комплекса калмодулина с пептидом, промежуточные состояния (то есть насыщенные одним, двумя или тремя ионами кальция) комплекса практически полностью отсутствовали и лишь в состоянии комплекса с зарядом 9+ наблюдались незначительные следы частично насыщенного комплекса (рис.4.8). Кроме того, при таких относительных концентрациях не было обнаружено калмодулина, связанного только с кальцием (без пептида). Почти

полное

отсутствие

частично

насыщенного

кальцием

комплекса

и

доминирование комплекса CaM-RS20-4Са2+ говорит о том, что пептид сильно увеличивает кооперативность связывания калмодулином Са2+ и посадка иона кальция на один из четырёх Са2+-связывающих сайтов значительно увеличивает константы связывания других, что тут же вызывает их заполнение и обеспечивает тем самым быстрый переход комплекса из апо-состояния и в его активированную (насыщенную кальцием) форму даже при незначительном возрастании концентрации ионов Са2+. Этот факт находится в хорошем согласии с кооперативным функционированием двух глобулярных доменов калмодулина [141,48,41]. 61

Рис.4.8. Масс-спектры СаМ в 5 мМ аммоний ацетатном буфере, pH 5,9, в присутствии 0,01 мМ CaCl2, в отсутствие (А) и в присутствии (Б) RS20. «Р» обозначает пептид RS20. 62

А

Б

Рис.4.9. А, структуры 4Са2+-СаМ (зелёный) и комплекса 4Са2+-СаМ/RS20 (голубой/синий). Б, модельная структура комплекса апоСаМ/RS20 (оранжевый/ фиолетовый). Ионы кальция изображены сферами.

4.7.

Компьютерное моделирование комплекса апоСаМ с пептидом

RS20 На основании полученных данных мы предлагаем модель комплекса апоCaM с пептидом RS20 (рис.4.9Б). Она была сконструирована с помощью координат структуры апоCaM, полученной методом ЯМР

[29]

, в предположении, что пептид связывается с

апоCaM своим N-концом и в той же конформации, что и в комплексе с 4Са2+-СаМ. Согласно нашим спектральным данным, С-конец пептида неупорядочен. С-домен апоCaM (правая часть панели Б) находится в той же ориентации, что и на левой панели. На левой панели приведены структуры 4Са2+-СаМ (зелёный), 4Са2+-СаМ-пептид (голубой/синий); ионы кальция показаны как сферы, С-домены (правая часть панели) в обеих структурах перекрываются. Все структуры били построены с помощью программного пакета FRODO с использованием координат из Брукхевенского белкового банка данных 1CLL [32]

[35]

, 1CDL

и 1CFC [29].

4.8.

Заключение Изучение взаимодействия и активации калмодулином ряда мишеней подняло вопрос

о селективности этих процессов. До недавнего времени предполагалось, что MLCK гладких мышц и пептиды, соответствующие её СаМ-связывающему домену, способны связываться с калмодулином только в присутствии кальция. В работе Бейли с соавторами 63

C

RS20

C

N

N

[Ca2+]=0

[Ca2+]

C

C

WF10

N

N

N

C

Рис.4.10. Схема, иллюстрирующая возможные механизмы взаимодействия калмодулина с пептидом WF10 согласно данным Бейли с соавторами пептидом

RS20

согласно

нашим

данным.

Фермент-мишень

[50]

и с

содержит

каталитический домен (большой) и регуляторный (синий), включающий СаМсвязывающий участок. Калмодулин схематически представлен как два домена (C и N), соединённые гибким участком. Свободные кальций-связывающие сайты показаны полыми кружками, а занятые кальцием – красными. Пояснения даны в тексте. было продемонстрировано существование комплекса СаМ с smMLCK-пептидом, когда только два иона кальция связаны с СаМ [50]. Наши результаты показывают существование комплекса RS20 с СаМ в отсутствие ионов

кальция,

который

стабилизируется,

в

основном,

электростатическими

взаимодействиями. Таким образом, кроме комплекса СаМ с пептидом, когда два или четыре иона кальция связаны с белком, существует и третий физиологически важный комплекс, образованный апо-формой калмодулина и его мишенью. Чувствительность этих комплексов к ионной силе и ионам магния может быть различной, что позволяет реализовать тонкую настройку во взаимодействии калмодулина с мишенями при различных

ионных

условиях.

Эта

настройка

обусловлена

балансом

между

электростатическими и гидрофобными взаимодействиями в комплексе СаМ с пептидом. Этот баланс модулируется связыванием с кальцием, разнообразием последовательностей мишеней и ионных условий среды. Как мы показали, в образовании комплекса калмодулина с пептидом в отсутствии ионов кальция основную роль играют 64

электростатические взаимодействия, в то время как в образовании комплекса 4Са2+-СаМпептид – гидрофобные

[52]

. В отличие от комплекса СаМ с пептидом WF10,

исследованным в работе Бейли, нам не удалось обнаружить в наших экспериментальных условиях комплекс RS20 с калмодулином, насыщенный двумя ионами кальция, и добавление кальция даже в ненасыщающей концентрации вызывало образование только комплекса 4Са2+-СаМ-RS20. На рисунке.4.10 представлена схема, иллюстрирующая различные механизмы взаимодействия калмодулина с белками-мишенями, основанная на наших исследованиях комплекса калмодулина с пептидом RS20

[142]

и на исследованиях Бейли с соавторами

комплекса с пептидом WF10 [50]. При низких концентрациях кальция регуляторный домен закрывает активный центр фермента. Однако, в случае RS20 регуляторный домен уже связан с апокалмодулином и образует, таким образом, готовый комплекс, способный к немедленной активации при незначительных увеличениях концентрации кальция, а в случае WF10 такой промежуточный комплекс образуется только если С-домен уже насыщен кальцием, активация же мишени происходит когда и N-домен связывается с кальцием, а затем с регуляторным доменом. Данный механизм связывания СаМ с RS20 позволяет обеспечить наиболее быстрый ответ на мгновенные увеличения концентрации кальция (цитоплазматические кальциевые волны), которые регулируют такие процессы как мышечное сокращение, передача нервных импульсов и т.д. Таким образом, для разных мишеней калмодулина реализуются различные механизмы активации кальцием самого калмодулина, что позволяет ему осуществлять тонкую и специфическую регуляцию своих многочисленных белков-мишеней в зависимости от локальной внутриклеточной концентрации кальция, превращая тем самым количественные сигналы кальция в качественный биологический ответ. Обнаруженная нами возможность существования апо-комплекса, в котором пептид взаимодействует лишь с С-концевой долей калмодулина и тот факт, что для активации мишени необходимо связывание калмодулина с кальцием, которое приводит к конформационным изменениям, подтягивающим N-концевую долю к мишени, позволяют нам определить роли каждого из доменов калмодулина в процессе расшифровки кальциевого сигнала. Так, С-концевая доля калмодулина играет основную роль в первом акте передачи кальциевого сигнала, т.е. в распознавании мишени, а N -концевая доля вступает в действие уже после увеличения концентрации кальция и основная роль в активации мишени принадлежит ей (рис.4.10). Предложенный нами механизм взаимодействия калмодулина с RS20 существенно дополняет существовавший до недавнего времени и предложенный Винтродом и 65

Приваловым

[52]

, заключающийся сначала в активации калмодулина кальцием и затем в

связывании его с мишенью. Мы показали, что последовательность событий при активации может быть и обратной, то есть на первом этапе апокалмодулин взаимодействует со своей мишенью, только после чего происходит активация кальцием уже готового комплекса.

5.

Доменная структура кальций-векторного белка (CaVP) из

Amphioxus: взаимодействие доменов и их роль в распознавании белка-мишени CaVPT Несмотря на недавние исследования методом ЯМР структуры С-концевой части CaVP при различной степени насыщения кальцием

[65]

, доменная организация целого белка и

влияние на неё ионов кальция до сих пор не изучены. Хотя Терет с соавторами и пытались перенести результаты, полученные на рекомбинантном С-концевом фрагменте CaVP, на С-концевую долю целого CaVP, её свойства могут сильно измениться из-за взаимодействия с N-концевой частью белка. Поэтому мы решили провести детальный анализ доменной организации CaVP, то есть определить число кооперативных единиц, исследовать их взаимодействие, изучить влияние кальция на конформацию и стабильность отдельных доменов, а также определить их роли при связывании CaVP со своей мишенью CaVPТ. Основываясь на высокой степени гомологии с СаМ и тропонином С и на сравнительном молекулярном моделировании

[56]

, мы предположили, что CaVP

состоит из двух кооперативных доменов (N- и С-), каждый из которых содержит по два EF-hand мотива. Исходя из этого, нами был экспрессирован и очищен рекомбинантный CaVP и его N- и С-концевые доли (N-CaVP и С-CaVP). N-концевая доля была сконструирована таким образом, чтобы содержать два первых EF-hand мотива и заканчиваться на 86-м аминокислотном остатке, а С-концевая доля начиналась с позиции 81, чтобы включать в себя остаток триптофана, необходимый для спектральной идентификации этого фрагмента.

5.1.

Рекомбинантный

и

природный

CaVP

имеют

одинаковые

конформации и сходным образом связываются с мишенью Поскольку природный CaVP имеет два остатка триметиллизина (TML), которых нет в рекомбинантном белке, мы исследовали влияние TML групп на связывание CaVP с кальцием, на его конформацию и взаимодействие с CaVPТ. Метод проточного диализа показал, что рекомбинантный CaVP связывает два иона кальция с теми же константами, что и природный белок (рис.5.1). Оба белка имеют сходные спектры триптофановой флюоресценции в присутствии CaCl2 , EDTA или 66

Связанный Ca2+

2,0

C-CaVP Рекомбинантный CaVP CaVP дикого типа

1,5

1,0

0,5

0,0

-7

-6

-5

-4

-3

2+

Log [Ca ] Рис.5.1. Связывание кальция CaVP дикого типа (z), рекомбинантного () и С-CaVP (▲). Эксперименты проводились методом проточного диализа при 25°С в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, содержащем 150 мМ KCl. Красная кривая – теоретическая изотерма, построенная на основе микроскопических констант связывания 4,6×106 и 7,4×103 М-1. гуанидинхлорида с «красным» смещением от 333 до 349 нм при денатурации. Кривые денатурации апо-форм белков также схожи и для обеих кривых полувысота изменения сигнала соответствует 1,4 М гуанидинхлорида. Как и в нативном CaVP

[54]

, два тиола

рекомбинантного CaVP быстро (t½<2 сек.) реагируют с 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислотой). Чтобы сравнить константы связывания рекомбинантного и природного CaVP с CaVPT, их эквимолярные смеси были обработаны, как описано в Методике (глава.3.2) и результаты гель-фильтрации представлены на рис.5.2. SDS ПАГ электрофорез выявил, что эквимолярный комплекс содержится во фракциях 45-51, а избыточный CaVP - во фракциях 53-59 (рис.5.2А). Нативный ПАГ электрофорез в присутствии глицерола

[137]

позволяет разделить рекомбинантный CaVP и CaVP дикого типа, так как последний более кислый и мигрирует медленнее. На рис.5.2Б хорошо видна одинаковость распределения двух форм CaVP во фракциях, содержащих либо комплекс, либо свободный CaVP. Все вместе эти данные указывают на то, что рекомбинантный и природный CaVP имеют одинаковые конформации и сходным образом связываются с белком-мишенью.

67

Фракции 45

47

49

51

53

55

57

59

CaVPT A

31

CaVP

21

WT CaVP Б Rec CaVP Рис.5.2. Взаимодействие рекомбинантного CaVP (Rec) и CaVP дикого типа (WT) с CaVPТ. Эквимолярные смеси рекомбинантного CaVP, CaVP дикого типа и CaVPT были диализованы в 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5, содержащем 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0.2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2. Образцы были

нанесены

на

Sephacryl

S-200

колонку

и

фракции

были

проанализированы с помощью SDS ПАГ электрофореза (А) и щелочного ПАГ электрофореза (Б) в присутствии 1мМ EDTA. Справа показаны молекулярные веса маркеров в кДа.

5.2.

N-концевой домен CaVP не влияет на кальций-связывающие

свойства С-концевого домена Эксперименты по равновесной гель-фильтрации в 50 мМ Tris-HCl буфере, содержащем до 200 мM Са2+, при pH 7,5 показали, что N-CaVP не связывает кальций. Изотерма адсорбции кальция, полученная методом проточного диализа (рис.5.1), демонстрирует, что С-CaVP связывает два иона кальция с микроскопическими константами 4,6×106 М-1 и 7,4×103 М-1. Эти значения очень близки к тем, которые были получены для целого белка, что говорит о том, что N-концевая часть CaVP не влияет на кальций-связывающие свойства С-концевой части. Большая разница в афинностях

к

2+

кальцию двух сайтов CaVP указывает на существование 1Са -формы CaVP в клетке в значительных количествах и на её важную физиологическую роль (при концентрации свободного кальция от 2 до 25 мкМ степень насыщения им белка составляет 1,0±0,1, рис.5.1).

68

5.3.

Рекомбинантные N-CaVP и С-CaVP не взаимодействуют друг с

другом Для исследования вторичной и третичной структуры CaVP, N- и С-CaVP были использованы методы КД и триптофановой флюоресценции. В табл.5.1 представлены процентные содержания различных типов вторичной структуры изучаемых белков, рассчитанные из спектров КД в дальнем ультрафиолете. Спектр КД N-CaVP не изменялся при добавлении кальция и соответствовал 42% содержанию α-спиралей. Напротив, спектр КД С-CaVP претерпевал значительные изменения при добавлении кальция, что соответствовало увеличению α-спиральности от 17 до 36%. Для сравнения α-спиральность целого CaVP при связывании с кальцием возрастала от 23 до 34%. На рис. 5.3 представлены спектры КД в ближнем ультрафиолете для CaVP, N-CaVP и С-CaVP в присутствии 5 мМ Са2+. Отрицательные пики при 262 и 269 нм обусловлены остатками фенилаланинов. Положительные пики при 284 и 291 нм, наблюдаемые на спектрах CaVP и N-CaVP, были соотнесены с Tyr47, Trp74 и Trp81, расположенными в Nконцевой доле CaVP (рис.2.10). Спектр КД С-CaVP характерен для белков, содержащих только остатки фенилаланинов. Отсутствие в спектре С-CaVP триптофановой полосы говорит о высокой подвижности единственного концевого остатка Trp81. Нагрев С-CaVP до 90°C вызывал весьма незначительное уменьшение интенсивности полос спектра КД, что говорит о высокой термостабильности этой доли CaVP. Спектр КД N-CaVP показал только два положительных Trp/Tyr пика, которые исчезали при нагревании и вновь появлялись при охлаждении образца. Все вышеприведённые спектры КД не менялись при удалении ионов кальция. Спектр триптофановой флюоресценции N-CaVP имел максимум при 335 нм и не Табл.5.1. Вторичная структура кальциевой и апо-форм CaVP, N-CaVP и CCaVP, оцененная по спектрам КД. H[%]

G[%]

Apo-CaVP

23

6

13

Ca2+-CaVP

34

5

N-CaVP

42

Apo-C-CaVP Ca2+-C-CaVP

Белки

E[%]

T[%]

P[%]

O[%]

15

7

36

8

14

6

33

6

3

13

6

30

17

4

13

15

10

40

36

5

8

14

7

31

H – α-спираль, G – спираль 310, Е – β-структура, Т - β-поворот, Р – спираль типа поли-L-пролин II, О- другие структуры. 69

0 -1 -2

C-CaVP А

0

(М-1см-1)

-5

N-CaVP Б

0 -5 CaVP В -10

0 -5

CaVP N-CaVP C-CaVP C-CaVP+N-CaVP Г

-10 260 300 280 Длина волны (нм) Рис.5.3. Спектры КД C-CaVP (А), N-CaVP (Б) и CaVP (В) в ближней УФобласти при pH 7,5 в присутствии 5 мМ Са2+ при различных температурах: 10°C (чёрная линия), 90°C (красная линия), 10°C, после охлаждения от 90°C (синяя линия). (Г): Спектры КД в ближнем УФ C-CaVP (красная линия), NCaVP (синия линия), CaVP (чёрная линия) и сумма спектров C-CaVP и NCaVP (зелёная линия). 70

менялся при добавлении Са2+, однако добавление гуанидинхлорида вызывало увеличение сигнала в 1,4 раза и красное смещение максимума к 354 нм, указывая тем самым на высокую структурированность N-CaVP. Как в присутствии, так и в отсутствии Са2+, СCaVP демонстрирует спектр флюоресценции свободного триптофана в полярной среде, что подтверждает данные, полученные при помощи метода КД. Так как во многих EF-hand белках, таких как парвальбумин или NSCP (саркоплазматический

белок

из

Nereis

diversicolor),

наблюдается

значительное

взаимодействие между N- и C-доменами даже после протеолитического разделения [137,143]

, мы исследовали аддитивность спектров КД и флюоресценции. Спектры

флюоресценции и КД в дальней УФ-области для эквимолярной смеси N- и C-CaVP, также как и спектр КД CaVP в ближней УФ-области (рис.3.5Г), совпадали с суммами спектров отдельных компонент, что указывает на то, что изолированные доли CaVP не влияют на вторичную и третичную структуры друг друга. Кроме того, нативный ПАГ электрофорез показал, что при смешивании N- и C-CaVP в присутствии 1мМ CaCl2 или EDTA, позиции полос не изменялись и новые полосы не возникали. Таким образом, мы не нашли указаний на взаимодействие изолированных N- и C-CaVP, хотя, как будет показано ниже, в целом CaVP существует взаимодействие между доменами.

5.4.

N- и C-концевые доли CaVP представляют собой отдельные

кооперативные домены, а C-домен и степень насыщения его кальцием модулируют стабильность N-домена Растворы CaVP, N- и C-CaVP, нагретые до 90°C, сохраняли прозрачность и спектры КД после прогрева до 90°C были почти полностью обратимы (рис.5.3). Кривые плавления, зарегистрированные при 222 нм, отражают стабильность вторичной структуры белка, в то время как плавление на длине волны 291 нм, характеризующее стабильность окружения триптофанов, обычно ассоциируется со стабильностью третичной структуры. При 222 нм CaVP претерпевает один широкий переход с температурой денатурации, Td, 47°C как для апо-, так и для Са2+-насыщенной форм (рис.5.4). При 291 нм CaVP обнаруживает более острый переход со значениями Td 37,2°C и 33,4°C для апо- и Са2+-форм, соответственно. Кривые плавления изолированного N-CaVP также показывают широкий переход в области дальнего ультрафиолета и узкий в области ближнего с температурами плавления около 44°C (рис.5.4Б). Из этих данных следует, что N-домен достаточно стабилен, и что С-домен в целом CaVP дестабилизирует гидрофобное ядро N-домена (Td падает на 7°C), а посадка кальция на С-домен усиливает этот эффект (Td падает на 11°C). Кривая плавления С-CaVP на 222 нм при насыщающей концентрации кальция не обнаруживает никаких 71

291 нм 10

А Апо-CaVP 2+ Ca -CaVP

0

(миллидегри)

-10

222 нм

291 нм

15

Б

10

N-CaVP

5 0

222 нм Первая производная

-5

В C-CaVP 222 нм

Температура (oC)

Рис.5.4. Температурная зависимость интенсивности КД для CaVP (А), NCaVP (Б) и C-CaVP (В) при pH 7,5 в присутствии 1 мМ EGTA (чёрные линии) и 2 мМ CaCl2 (красные линии) при 291 нм (тонкие линии) и 222 нм (толстые линии). Вставка демонстрирует первую производную кривой плавления КД. 72

exc

14

Cp (ккал/K моль)

16

12

А

2 1 0 0

20

40

60 o

Температура ( C)

Cp (ккал/K моль)

10 8

CaVP

7

Б

6 5 4 3 10

N-CaVP В

8 6 4

C-CaVP 20 40 60 80 100 120 o Температура ( C)

Рис.5.5. Температурные зависимости парциальной молярной теплоёмкости CaVP, NCaVP и C-CaVP при pH 7,5. А: апо-форма CaVP в присутствии 0,1 мМ EGTA (точечная линия), 1Са2+-форма в присутствии 0,1 мМ CaCl2 (сплошная линия) и 2Са2+-форма в присутствии 2 мМ CaCl2 (пунктирная линия). Вставка показывает температурную зависимость избыточной теплоёмкости CaVP для низкотемпературного пика. Б: N-CaVP в присутствии 5 мМ CaCl2. В: C-CaVP в присутствии 0,1 мМ EGTA (точечная линия), 0,1 мМ CaCl2 (сплошная линия) и 2 мМ CaCl2 (пунктирная линия).

73

Табл.5.2. Параметры тепловой денатурации CaVP, C-CaVP и N-CaVP при pH 7,5.

Белки

ДСК

КД N-домен

С-домен

Тd °C

∆Hcal ккал/моль

Тd °C

∆Hcal ккал/моль

Td222 °C

Td291 °C

37,5

45

-

-

47

37,2

1Ca2+-CaVP

28/37+

26

111,7

×

=

=

2Ca2+-CaVP

31,5

18

117,9

×

47

33,4

-

-

38,4/68

×

1Ca2+-C-CaVP

111,2

53

=

×

2Ca2+-C-CaVP

123,0

72*

-

×

43,9

44,6

Apo-CaVP

Apo-C-CaVP

N-CaVP

44,3

53

-: нет перехода; =: эксперимент не проведён; ×: невозможно определить; +: температуры получены с помощью компьютерной деконволюции пика избыточной теплоёмкости на два перехода «non-two-state»; *: значение энтальпии получено учитывая, что асимметричность пика необратимого «two-state» перехода равна 1,7 [154]. денатурационных пиков, однако плавление апоС-CaVP выявило два равнозначных перехода при температурах 38,4°C и 68°C (рис.5.4В). Наиболее прямым и очень чувствительным методом для исследования стабильности доменов белка является ДСК. Так как пространственные структуры апо-, 1Са2+- и 2Са2+-СCaVP сильно отличаются

[65]

, то мы сопоставили стабильности этих трёх состояний для

CaVP и С-CaVP. Из рис.5.5 видно, что кривая плавления апо-CaVP имеет лишь один пик теплопоглощения с температурой перехода 37,5°C, равной полученной методом КД (табл.5.2). Если нагрев был остановлен непосредственно после пика теплопоглощения, то обратимость плавления была полной. Отношение калориметрической и эффективной энтальпий для этого пика близко к единице, что говорит о том, что это простой «two-state» переход. 2Са2+-CaVP плавится в две очень удалённые друг от друга стадии с температурами 31,5°C и 117,9°C. 1Са2+-CaVP также плавится в две стадии, при этом низкотемпературный пик состоит из двух компонент с Td 28°C и 37°C, а высокотемпературный, по-прежнему, из одной с Td 111,7°C. N-CaVP при плавлении демонстрирует один «two-state» переход с Td, равной 44,3°C (рис.5.5Б), что совпадает с 74

температурой плавления, определённой с помощью метода КД. Термограмма апо-С-CaVP имела плоский профиль без каких либо четко выраженных кооперативных переходов (рис.5.5В). Напротив, 2Са2+-С-CaVP и 1Са2+-С-CaVP проявляли по одному переходу с Td при 123°C и 111,2°C, соответственно. Денатурационный пик 1Са2+-С-CaVP может быть хорошо описан с помощью модели необратимого «two-state» перехода, предложенной Санчес-Риц

[17]

. Эти данные показывают, что низкотемпературный переход в CaVP

соответствует плавлению N-домена, а высокотемпературный - плавлению С-домена. Влияние С-домена делает N-домен более чувствительным

к плавлению, и эта

чувствительность постепенно увеличивается при последовательном насыщении CaVP кальцием. В области высоких температур, где плавится С-концевой домен CaVP, Td для CaVP и С-CaVP близки: 111°C для 1Са2+-форм, 118°C и 123°C для 2Са2+-CaVP и 2Са2+-СCaVP, соответственно. Из этих данных следует, что N- и С-домены в целом CaVP взаимодействуют друг с другом, т.к. С-домен и степень его насыщения кальцием влияют на термостабильность Nконцевой части. Интересно, что междоменные взаимодействия возникают на уровне третичной, а не вторичной структуры. В самом деле, температуры плавления N-домена в апо-CaVP и 2Са2+-CaVP, определённые методом КД в дальнем ультрафиолете, совпадают, тогда как температуры плавления этого домена, определённые с помощью КД в ближнем ультрафиолете и ДСК, в этих двух состояниях различны (табл.5.2). Изолированный NCaVP имеет Td=44°C. Первый переход в целом CaVP, который соответствует плавлению N-концевого домена, происходит при 37,5°C в апо-белке и при 31,5°C в его Са2+насыщенной форме. В 1Са2+-CaVP N-концевой домен плавится бифазным образом, так, что его первая компонента имеет температуру 28°C, что близко к значению для 2Са2+состояния, а вторая - 37°C, что совпадает со значением в апо-состоянии. Эти данные демонстрируют, что С-домен и степень его насыщения модулируют стабильность Nдомена. Так как наши данные показывают, что С-концевой домен в апо-CaVP находится в состоянии близком к расплавленной глобуле (см. раздел 5.6), то можно заключить, что эта флуктуирующая структура оказывает меньшее дестабилизационное влияние на N-домен, чем хорошо упорядоченная пара EF-hands с двумя связанными ионами кальция. Существует также и влияние N-домена на С-домен, что следует из более раннего плавления

(на

5°C)

С-домена

в

2Са2+-CaVP

по

с

2Са2+-С-CaVP.

[42,41]

, причём в апо-

сравнению

Взаимодействие доменов также было описано для калмодулина

состоянии это взаимодействие значительно сильнее, чем для кальций-насыщенной формы.

75

5.5.

Только С-домен CaVP образует эквимолярный комплекс с

CaVPТ, а N-домен модулирует это взаимодействие Образование комплексов между изолированными долями CaVP и CaVPТ было изучено при помощи трёх методов: нативного полиакриламидного гель-электрофореза,

CaVPT

-

-

CaVP

CaVP

-

C-CaVP

C-CaVP

-

N-CaVP

N-CaVP

ковалентных поперечных сшивок и гель-фильтрации. Нативный ПАГ электрофорез

+CaCl2

+EDTA

CaVPT

+ + +

Рис.5.6. Изучение взаимодействия CaVP и его рекомбинантных долей с CaVPТ с помощью 12,5% нативного ПАГ электрофореза. N-CaVP, C-CaVP, рекомбинантный CaVP и их эквимолярные смеси с CaVPT в присутствии 2 М мочевины были отдиализованы перед экспериментом в 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5, содержащем 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl, плюс 1 мМ CaCl2 или 1 мМ EGTA. Стрелки указывают на комплекс, образованный в присутствии кальция. 76

C-CaVP

N-CaVP

CaVP

C-CaVP

N-CaVP

CaVP A

*

45 31

CaVPT

21 14

Б

*

45 31

CaVPT

21 14

DSS

-

-

-

+

+

+

Рис.5.7. Изучение образования комплекса между CaVP, С-CaVP, N-CaVP и CaVPT методом поперечных ковалентных сшивок. Белки инкубировались с CaVPT в присутствии 1 мМ CaCl2 (А) или 1 мМ EDTA (Б), а затем подвергались электрофорезу в присутствии SDS. Стрелка и звёздочка указывают на образовавшиеся комплексы C-CaVP/CaVPT и CaVP/CaVPT, соответственно. Справа показаны молекулярные веса маркеров в кДа.

77

Фракции

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

44 кДа 17 кДа А 38

39

В 39

41 43

40

41 42

43

44

45

46

45

47

48

49

50

Б 40 41 42

43

44

45

46

47

48

46

48

50

52

31 21 14 46

Г 35

37

39

41 43

31 21 14

Рис.5.8. Изучение образования комплекса между С-CaVP и CaVPT методом хроматографии на колонке S-200 при тех же условиях, что и для стандартов известных молекулярных весов (верхняя панель). Эквимолярные смеси C-CaVP и CaVPT (А) или C-CaVP, CaVP и CaVPT (Г) были диализованы в 20 мМ TrisHCl, pH 7,5, содержащем 1 мМ DTT, 40 мкМ PMSF, 0,2 г/мл пепстатина, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2. Образцы были нанесены на Sephacryl S-200 колонку и фракции были проанализированы с помощью SDS ПАГ электрофореза (15%акриламид). Добавление 2 мМ EDTA вызывает диссоциацию комплекса CCaVP/CaVPT (Б). C-CaVP имеет тенденцию к димеризации в присутствии 1 мM CaCl2 (В). Слева показаны молекулярные веса маркеров в кДа.

78

эквимолярных смесей CaVPТ с CaVP, С-CaVP или N-CaVP в присутствии ионов кальция обнаруживает появление новых полос (рис.5.6, верхняя панель), соответствующих эквимолярным комплексам CaVP/CaVPТ и С-CaVP/CaVPТ. Как и следовало ожидать, комплекс С-CaVP/CaVPТ, являющийся более кислым и меньшим по размеру чем CaVP/CaVPТ, мигрирует быстрее. Образование комплекса между С-CaVP и CaVPТ было также подтверждено с помощью метода ковалентных поперечных сшивок (рис.5.7). Как в присутствии, так и в отсутствии ионов кальция образовывался комплекс между С-CaVP и CaVPТ с молекулярным весом 40 кДа. Интенсивность полосы в присутствии Са2+ была значительно выше. CaVP также образовывал комплекс с CaVPТ с молекулярным весом 50 кДа (рис.5.7, звёздочка). Никакого ковалентного связывания N-CaVP с CaVPТ обнаружено не было. В соответствии с молекулярными весами компонент стехиометрия комплексов всегда составляла 1:1. Профиль гель-фильтрации эквимолярной смеси С-CaVP и CaVPТ давал только один пик, при этом SDS-ПАГ электрофорез показал образование 1:1 комплекса (рис.5.8А). Добавление 2 мМ EDTA вызывало полную диссоциацию комплекса на свободные С-CaVP и CaVPТ (рис.5.8Б). Эксперименты с эквимолярной смесью CaVP, С-CaVP и CaVPТ показывают, что афинность С-CaVP к CaVPТ слабее, чем афинность целого белка (рис.5.8Г). Следует отметить, что свободный С-CaVP в присутствии ионов кальция имеет склонность

к

образованию

димеров,

что

проявляется

в

появлении

полос,

соответствующих молекулярным весам 15 и 30 кДа (рис.5.8В). Тем не менее, сравнение профилей на рис. 5.8А и 5.8В демонстрирует образование комплекса между С-CaVP и CaVPТ. При тех же условиях N-CaVP сходит с колонки с молекулярным весом 10 кДа, что указывает на то, что он не взаимодействует с CaVPТ.

5.6.

Заключение Мы провели анализ доменной структуры CaVP и показали, что молекула белка

состоит из двух взаимодействующих доменов, причём С-домен и степень его насыщения кальцием влияют на термостабильность третичной структуры N-домена, не затрагивая его вторичную структуру. Только С-концевой домен связывает кальций и взаимодействует с внутриклеточной мишенью CaVPТ, а N-домен модулирует это взаимодействие. Обнаружено, что присутствующие в природном белке TML группы не влияют ни на связывание кальция, ни на конформацию, ни на взаимодействие с CaVPТ. Подобные выводы были сделаны прежде для калмодулина, обладающего одним остатком TML который может защищать его от протеолиза

[144]

[28]

,

. В отличие от калмодулина, который 79

включает четыре функциональных EF-hand мотива, расположенных по два в каждой из глобулярных долей

[145]

, CaVP связывает лишь два иона кальция своим функциональным

С-доменом с высокой (4,6×106 М-1) и низкой (7,4×103 М-1) афинностями, а N-домен не модифицирует связывание катиона. Данные микрокалориметрии демонстрируют, что влияние, оказываемое кальцием на С-домен в целой молекуле белка и на С-CaVP, одинаково. Анализ структуры 1Са2+-С-CaVP методом ЯМР показал, что сайт III первым связывает Са2+ и принимает упорядоченную конформацию, в то время как сайт IV остается сильно флуктуирующим; в 2Са2+-С-CaVP состоянии оба сайта хорошо структурированы

[65]

. Таким образом, последовательное связывание кальция индуцирует

прогрессивные пошаговые переходы от сильно разупорядоченного состояния к наполовину упорядоченному, а затем к стандартной структурированной паре EF-hand. Из наших данных следует, что изолированные N- и С-концевые половины CaVP представляют собой независимые кооперативные единицы с характерной вторичной и третичной структурами, и что только С-концевой домен претерпевает значительные конформационные изменения при связывании с кальцием. N-CaVP, как и любая функциональная пара EF-hand мотивов, богат α-спиралями (∼40%) и обладает хорошо сформированным гидрофобным ядром. Разница в термостабильности N- и С-CaVP (44 и 123ºC, соответственно) также справедлива и для целого CaVP, что позволило нам идентифицировать разворачивание каждого домена. В то время как насыщенные кальцием формы CaVP и С-CaVP хорошо структурированы, С-домен в апо-CaVP и апо-С-CaVP проявляют свойства расплавленной глобулы

[146]

: 1) отсутствие третичной структуры, т.к. методом ДСК не было

зарегистрировано никакого кооперативного перехода в области температур от 10°C до 120°C; 2) наличие вторичной структуры (однако, её содержание намного меньше, чем у насыщенных кальцием форм), которая, вероятно, сильно флуктуирует, т.к. она не наблюдалась методом ЯМР для С-CaVP

[65]

. Плавление апо-С-CaVP при 222 нм даёт

бифазную кривую с температурами переходов 38°C и 68°C, указывая на существование в белке двух групп α-спиралей различной стабильности. Так как данные ЯМР дают прямые доказательства отсутствия устойчивых водородных связей и стабильных контактов с участием ароматических остатков в апо-С-CaVP

[65]

, мы предполагаем высокую

подвижность боковых групп, что и вызывает усреднение сигналов NOE, как и должно быть в состоянии близком к расплавленной глобуле

[146]

. Примеры всё возрастающего

числа структурно неупорядоченных в нативных условиях белков и биологические преимущества их сворачивания при распознавании мишеней описаны в недавнем обзоре Райта и Дюсона

[147]

. Функциональное значение такого рода белков ещё до конца не 80

осознано, однако, в ряде случаев наличие неупорядоченной структуры объясняется необходимостью транспорта белка через узкие каналы [148] или обеспечением достаточной конформационной гибкости для молекулярного узнавания

[149,150]

. Кальций-зависимые

структурные изменения, наблюдаемые у С-CaVP и С-домена CaVP, не наблюдались до сих пор ни у одного белка, имеющего EF-hand мотивы. Обычно белки этого семействе хорошо свёрнуты,

имеют стабильную структуру и в отсутствие кальция, а при

связывании кальция в них происходит перегруппировка спиралей. Из наших данных следует, что С-CaVP связывает CaVPТ, а N-CaVP не образует с комплекса с мишенью. Как и для CaVP, в присутствии Са2+ комплекс С-CaVP/CaVPТ значительно более стабилен. Интересное сравнение может быть проведено со способом образования комплекса между калмодулином и пептидом RS20. Как мы показали выше, в отсутствии

ионов

кальция

в

этом

комплексе

С-концевая

доля

калмодулина

взаимодействует с N-концевой частью пептида. В присутствии ионов кальция этот комплекс значительно усиливается дополнительным взаимодействием N-концевой доли калмодулина с С-концом пептида. Точно также и С-концевой домен CaVP связывает CaVPТ даже в присутствии EDTA и, как показывают наши данные, афинность С-CaVP к CaVPТ ниже чем у целого CaVP. Таким образом, можно предложить модель (аналогичную взаимодействию калмодулина с его мишенью), в которой CaVP связывает CaVPТ в несколько шагов. Сначала происходит связывание С-концевой доли с CaVPТ, что подводит N-концевой домен CaVP достаточно близко к CaVPТ

для реализации

связывания. Этот последний шаг, который, возможно, как и в случае комплекса калмодулина с пептидом RS20 индуцируется кальцием, приводит к дальнейшему увеличению константы связывания CaVP со своей мишенью.

6.

Тепловая денатурация белка теплового шока hsp90: влияние

ионов кальция и магния Как видно уже из названия основного белка теплового шока hsp90, температура выступает

в

роли

определяющего

фактора,

регулирующего

его

активацию

и

функционирование как молекулярной машины, предохраняющей от необратимой тепловой денатурации другие белки. Во время теплового шока hsp90 экспрессируется в клетке в значительных количествах. Наряду с этим наблюдается сильное увеличение концентрации кальция. Как показал ряд исследований, олигомеризация hsp90 необходима для его функционирования как молекулярного шаперона. Несмотря на все перечисленные факты, до сих пор не было удачных попыток исследования термостабильности hsp90 и её роли в функционировании белка. Поэтому мы решили изучить тепловую денатурацию 81

hsp90 при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии, наиболее адекватного метода для решения такого рода задач, в комбинации с методом кругового дихроизма и нативным ПАГ-электрофорезом. Мы охарактеризовали тепловое разворачивание hsp90 и влияние температуры на его олигомеризацию, а также влияние ионов кальция и магния на эти процессы.

6.1.

Анализ температурной зависимости процесса олигомери-

зации hsp90 с помощью нативного ПАГ-электрофореза показал, что ионы кальция и магния понижают температуру, при которой происходит самоассоциация димеров белка Нативный полиакриламидный гель-электрофорез показал, что при pH 7,0 hsp90 находится в виде димеров, что подтверждается нашими экспериментами по седиментации

кДа

А

Фосфатный буфер

Б

[GDM] = 13 мкМ

кДа

665 470 327

669 440 232

163

140 50 53 56 59 62 65 68 53 56 59 62 65 68 Температура (°C)

кДа

В

[Mg] = 5 мМ

Г

[Ca] = 5 мМ

кДа

470

669 440 232

163

140 48 51 54 57 60 63 66

35 40 43 46 49 52

Температура (°C) Рис.6.1. Температурная зависимость процесса олигомеризации hsp90 (А), hsp90 в комплексе с жельданомицином (Б), hsp90 в присутствии 5 мМ магния (2,9 мМ ионов магния были связаны фосфатным буфером) (В) и hsp90 в присутствии 5 мМ кальция (Г) при pH 7,0. 82

Процентное содержание димеров hsp90

100 80 60 40 20 0 20

40

50

60 60°C

46°C 52°C 56°C Температура (°C)

70

Фосфатный буфер

[Ca ] = 5 мМ

[GDM] = 13 мкМ

[Mg ] = 5 мМ*

2+

2+

Рис.6.2. Температурная зависимость процентного содержания димеров hsp90 при pH 7,0: влияние жельданомицина, ионов кальция и магния. * 2,9 мМ ионов магния были связаны буфером. Табл.6.1. Влияние жельданомицина,

Ca2+,

Mg2+

на

температуру,

соответствующую исчезновению 50% димеров hsp90 (T50%), температуры первого (Т1) и второго (Т2) калориметрических переходов, а также на энтальпию денатурации. Добавленные

Т50%a

Т1

Т2

∆Hcal

соединения

(°C)

(°C)

(°C)

ккал/ моль

-

56

53,8 (53,3)b

63,1

490

53,6c

64,6c

460c

GDM

60

57,4

63,1

590

5 мМ MgCl2d

52

49,9 (50,1)b

60,9

400

5 мМ CaCl2

46/47

45,7 (45,1)b

56,3

360

a

данные ПАГ-электрофореза. в скобках даны значения, полученные с помощью метода КД. c скорость прогрева 2 К/мин. d 2,9 мМ ионов магния были связаны 20 мМ фосфатным буфером (Ка=80 М-1). b

83

(данные не приведены). Никаких изменений этого состояния в диапазоне температур 2050ºС не наблюдалось (рис.6.1А). Дальнейшее увеличение температуры вызывает уменьшение количества димеров hsp90 (рис.6.1А) и появление высокомолекулярных полос,

соответствующих

олигомерам

более

высокого

порядка:

50%

белка

олигомеризуется при 56ºС (табл.6.1). Оценка молекулярной массы олигомеров с очевидностью показала, что при нагревании происходит самоассоциация димеров hsp90, заключающаяся в формировании тетрамеров, гексамеров, октамеров и полимеров более высоких молекулярных весов, т.е. димеры hsp90 не диссоциируют при нагревании. Более того, сформированные олигомеры существуют до 68ºС (рис.6.1А). Не было никаких изменений наблюдаемой картины при изменении концентрации белка от 1 до 2 мг/мл. Влияние антибиотика жельданомицина (GDM), который, как известно, связывается с hsp90, на олигомеризацию hsp90 под действием температуры показано на рис.6.1Б. Жельданомицин сдвигает процесс олигомеризации в сторону более высоких температур: 50% димеров hsp90 олигомеризованы при температуре 60ºС вместо 56ºС, как для свободного hsp90 (рис.6.2., табл.6.1). Таким образом, жельданомицин защищает hsp90 от происходящей при нагреве олигомеризации. В присутствии магния и кальция мы наблюдали значительное уменьшение температуры, при которой начинают исчезать димеры hsp90 (рис.6.1В, Г; рис.6.2). В присутствии магния и кальция температуры, соответствующие исчезновению 50% димеров hsp90, были равны 52ºС и 46/47ºС, соответственно, что на 4ºС и на 10ºС ниже, чем в отсутствии ионов. Более того, в присутствии двухвалентных катионов, когда исчезает соответствующая димерам hsp90 полоса, мы не наблюдали появления олигомеров, как в случае свободного hsp90 и его комплекса с жельданомицином. При добавлении магния наблюдалось только несколько высокомолекулярных олигомеров, которые быстро исчезали при увеличении температуры (рис.6.1В); в присутствии кальция после исчезновения димеров вообще не появлялось никаких олигомеров и димеры hsp90 сразу агрегировали (рис.6.1Г). Образовавшийся агрегат не проникал в гель и оставался в начальном положении. В то же время, снижение концентрации кальция до 1-2 мМ позволило наблюдать олигомеризацию hsp90. Таким образом, Mg2+ и значительно сильнее Ca2+ способствуют самоассоциации hsp90.

84

6.2.

При плавлении hsp90 претерпевает два денатурационных

перехода, первый

из которых соответствует

плавлению N-

концевого домена белка Предполагается, что hsp90 функционирует при температурах, при которых другие белки разворачиваются, защищая их от тепловой денатурации и агрегации. Поэтому большой интерес представляет точное определение собственной термостабильности этого шаперона. На рис.6.3А приведена зависимость парциальной молярной теплоёмкости hsp90 от температуры при pH 7,0. Значение парциальной теплоёмкости при 20ºС (0,35 кал К-1 г-1) близко к средней величине для небольших глобулярных белков, что свидетельствует о плотной упаковке полипептидных цепей в димере. Калориметрическая кривая состоит из двух четко различимых пиков при 53,8ºС и 63,1ºС. Присутствие двух пиков указывает на то, что процесс денатурации не проходит по механизму перехода между двумя состояниями, а предполагает наличие существенно населённого частично развернутого состояния. Плавление hsp90 было необратимым. Однако, термограмма не показывает процесса агрегации, также не было обнаружено зависимости параметров денатурации от концентрации белка в диапазоне 0,8-2,1 мг/мл. Кроме того, температура первого пика и общая энтальпия денатурации не изменились при увеличении скорости нагрева от 1 до 2 К/мин, а температура второго пика возросла лишь незначительно (табл.6.1). Из этого следует, что процесс, ответственный за необратимость плавления, медленнее чем процесс денатурации и не может, таким образом, влиять на его параметры. Кривая плавления hsp90 может быть разделена на два перекрывающихся перехода (модель для независимых non-two-state переходов программы MicroCal Origin), рис.6.3Б. Как было показано в

[74,75]

, hsp90 состоит из трех структурных доменов: N-концевого

(остатки 1-400), центрального (401-615) и C-концевого (621-732) (рис.2.8). Имея это в виду, мы предположили, что два перехода на кривой денатурации hsp90 отражают плавление двух различных участков белка. Действительно, нагрев белка до температуры максимума первого пика не влияет на второй пик при повторном нагреве, в то время как первый пик значительно уменьшается. Для того, чтобы соотнести денатурационные переходы с определенными доменами белка, мы изучили плавление комплекса hsp90 с антибиотиком жельданомицином (рис.6.3А). Жельданомицин связывается только с Nконцевым доменом hsp90 и ингибирует его шапероновую активность

[104,75]

. Кривая

плавления в присутствии жельданомицина также может быть разделена на два перехода (Рис.6.3В), но низкотемпературный пик сдвигается в сторону более высоких температур 85

Cp (ккал/К моль)

140 A

100

60

Cp

exc

(ккал/К моль)

40

Б

20

В 40

20

40 60 80 Температура (°C) Рис.6.3. Температурная зависимость парциальной молярной теплоёмкости hsp90 и его комплекса с жельданомицином (А) при pH 7,0. Компьютерная деконволюция функций избыточной теплоёмкости hsp90 (Б) и его комплекса с жельданомицином (В): экспериментальные кривые – сплошные линии, деконволюционные пики и их сумма – пунктирные линии.

86

на 3,6ºС, в то время как высокотемпературный пик остаётся неизменным

(табл.6.1).

Следовательно, первый переход соответствует плавлению N-концевого домена, а второй остальной части белка. Меньшая температурная стабильность N-концевого домена была найдена также и у hsp70

[151,75]

. Температура исчезновения 50% димеров hsp90 сдвинута в

сторону более высоких температур по сравнению с температурой плавления N-концевого домена (рис.6.2, табл.6.1). Значит, разворачивание N-концевого домена предшествует олигомеризации белка. Отношение между калориметрической и эффективной энтальпиями, которое соответствует числу кооперативных единиц в молекуле, равно двум для первого денатурационного перехода свободного hsp90 и его комплекса с жельданомицином. Следует заметить, что калориметрическая энтальпия рассчитывалась на молекулярный вес димера. Таким образом, N-концевые части двух мономеров в димере hsp90 плавятся относительно независимо и не взаимодействуют друг с другом. Это хорошо соответствует данным о том, что N-концевые домены не участвуют в димеризации [112]. Механизм образования димеров hsp90 заключается во взаимодействии участков 542615 центрального домена одного мономера и 629-732 С-концевого домена другого мономера,

при

этом

направлении (рис.2.1)

молекулы

[112]

мономеров

ориентированы

в

противоположном

. Наши данные показывают, что олигомеры состоят из димеров

hsp90 во всем интервале температур. Из этого следует, что сегменты двух мономеров, участвующие в димеризации, остаются связанными и не диссоциируют при денатурации. Отношение между калориметрической и эффективной энтальпиями для второго калориметрического пика равно приблизительно трем как для свободного hsp90, так и для его комплекса с жельданомицином. Вследствие этого, три кооперативные единицы димера могут плавится в этом пике: две невзаимодействующие части центрального домена (401541) и область димеризации.

6.3.

Ионы кальция и магния снижают термостабильность hsp90 и

температуру начала самоассоциации Кривые тепловой денатурации hsp90 в присутствии магния и кальция приведены на рис.6.4А. Регистрация кривой 2 была затруднена из-за сильной агрегации белка при высоких температурах. Парциальная молярная теплоемкость при 20ºС и наклон зависимости теплоемкости от температуры до денатурации в присутствии двухвалентных катионов такие же, как и для свободного hsp90. Эти данные доказывают, что Mg2+ и Ca2+ не изменяют компактность и димерную форму hsp90 до денатурации. Это находится в согласии с приведённым выше ПАГЭ анализом олигомеризации hsp90 (рис.6.1В, Г). В 87

A 2+

Нормализованное изменение эффекта КД при 296 nm

p

Ca

2+

Mg

1

Б

Ca2+

2+

Mg

0,5

0 Температура (°C) Рис.6.4. Температурная зависимость парциальной молярной теплоёмкости hsp90 (А) и нормализованных изменений интенсивности амплитуды КД при 296 нм (Б) при pH 7,0: в присутствии 5 мМ MgCl2 (зелёные кривые; 2,9 мМ ионов магния были связаны фосфатным буфером), 5 мМ CaCl2 (красные кривые) и без дивалентных катионов (синяя кривая). противоположность свободному hsp90, нагрев белка в комплексе с катионами до максимума первого пика вызывает исчезновение обоих пиков при повторном нагреве. Тепловой эффект плавления уменьшается на 18% и 26% при добавлении Mg2+ и Ca2+, соответственно (табл.6.1). Температуры первого и второго пиков были ниже на 3,9ºС и 2,2ºС в присутствии ионов магния и на 8,1ºС и 6,8ºС - в присутствии ионов кальция (табл.6.1). Таким образом, двухвалентные катионы снижают термостабильность hsp90 и температуру начала самоассоциации. Влияние кальция на плавление hsp90 было значительно сильнее, чем влияние магния. Кальций-связывающие белки с EF-hand мотивами, как известно, стабилизируются, связываясь с ионами Ca2+

[41]

. Дестабилизация hsp90 в присутствии Ca2+ показывает, что 88

вряд ли он является Ca2+-связывающим белком с EF-hand мотивами, как это предполагалось ранее

[102]

. Более того, PROSITE (Ex-PASy-SWISS-PROT tools) анализ не

выявил EF-hand или других известных Ca-связывающих мотивов в первичной структуре последовательностей hsp90, доступных в базе данных SWISS-PROT.

6.4.

Спектры КД hsp90 указывают на то, что кальций и магний

изменяют третичную структуру белка КД белков в ближнем ультрафиолете является чрезвычайно чувствительным критерием нативного состояния белка и поэтому может служить "дактилоскопическим отпечатком" его третичной структуры. Молекула hsp90 содержит четыре триптофана, 25 тирозинов и 25 фенилаланинов. Добавление ионов кальция или магния приводит к существенным изменениям спектра КД белка и к изменению его знака в области 280 нм (где вносят вклад Tyr и Trp) с отрицательного на положительный (рис.6.5). Таким образом, кальций и магний влияют на локальную структуру и окружение групп остатков

-1

[Θ] (град. см дмоль )

Tyr и Trp, т.е. на третичную структуру белка. Тот факт, что эффект КД меняет знак в

20

2

20°C

0 -20 90°C

260 260 280 280

300 300 320 320

Длина волны (нм) Рис.6.5. Спектры КД hsp90 в области ближнего УФ в Tris-HCl буфере при pH 7,0: при 20°C (зелёная линия), при 90°C (синяя линия), в присутствии 5 мМ CaCl2 или MgCl2 (красная кривая) при 20°C. 89

области 280 нм не удивителен, т.к. даже небольшое изменение ориентации боковых групп может изменить знак эффекта Коттона

[152]

. В спектре КД hsp90 в ближней УФ-области

присутствует положительный пик при 296 нм, относящийся к остаткам триптофана, на положение которого не влияет присутствие катионов (рис.6.5). Мы изучили денатурацию белка по изменению амплитуды этого пика от температуры. Hsp90 претерпевает резкий денатурационный переход с температурой середины перехода равной 53,3ºС (рис.6.4Б). Присутствие двухвалентных катионов понижает эту температуру до 50,1ºС (Mg2+) и 45,1ºС (Ca2+). Эти значения совпадают с соответствующими величинами, полученными методом сканирующей калориметрии для первого перехода (табл.6.1), т.е. КД отражает разворачивание N-концевого домена белка. Это согласуется с локализацией триптофанов в молекуле hsp90, три из которых принадлежат N-концевому домену: Trp161, Trp296 и Trp319 (hsр90a_human, SWISS-PROT database). Четвертый остаток (Trp605) находится в Сконцевой области димеризации

[112]

, плавящейся, как мы показали, во втором

калориметрическом пике. Отсутствие второго перехода на кривой плавления hsp90, полученной методом КД, указывает на неизменность микроокружения остатка Trp605, подтверждая то, что димер белка не диссоциирует при денатурации. Как мы обнаружили выше, hsp90 при возрастании температуры проявляет тенденцию к олигомеризации, а присутствие катионов сильно понижает температурный порог начала их формирования. Эта тенденция подтверждается возрастающим поглощением раствора hsp90 при нагреве в присутствии катионов, вызванным образованием коллоидо-подобной структуры, и последующей преципитацией белка при 62ºС (Mg2+) и 47ºС (Ca2+) (рис.6.4Б).

6.5.

Заключение

С использованием методов сканирующей микрокалориметрии, нативного ПАГэлектрофореза и КД была охарактеризована тепловая денатурация и олигомеризация белка теплового шока hsp90, а также изучено влияние на эти процессы ионов кальция и магния. Тепловая денатурация hsp90 выявляет два четких перехода при 53,8°C и 63,1°C. С помощью специфического ингибитора белка жельданомицина мы установили, что Nконцевые домены двух мономеров в димере hsp90 плавятся в низкотемпературном пике, в то время как высокотемпературный пик соответствует плавлению центральных и Сконцевых доменов. Показано, что разворачивание N-концевого домена даёт начало процессу олигомеризации, а олигомеры состоят из недиссоциирующих при денатурации димеров. Как известно, олигомеризация hsp90 ответственна за его способность связывать белки и предотвращать их необратимую агрегацию [70]. Следовательно, разворачивание Nконцевых доменов в димере является важным шагом в инициации функциональной 90

активности белка. Наши данные демонстрируют, что магний, и в ещё большей степени кальций, уменьшают термостабильность hsp90, вызывая тем самым его олигомеризацию (а значит и активацию) при более низких температурах. Кальций сдвигает температуру разворачивания N-концевого домена hsp90 вплотную к температурному диапазону теплового шока (42-45ºС)

[72]

. Регуляция процесса олигомеризации hsp90 кальцием

находится в хорошем согласии с явлениями, происходящими при тепловом шоке. В самом деле, наблюдаемое во время теплового шока увеличение внутриклеточной концентрации кальция необходимо, чтобы hsp90 олигомеризовался и стал полностью активным как молекулярный шаперон. Наши данные по влиянию специфических лигандов на зависящую от температуры олигомеризацию hsp90

[153]

и об участии этого процесса в

механизмах, защищающих клетку от теплового шока, были впоследствии подтверждены в работе Маркю с соавторами [121].

91

Выводы 1. Методами микрокалориметрии, масс-спектрометрии и КД-спектроскопии изучена доменная организация калмодулина, кальций-векторного белка из Amphioxus (CaVP), его рекомбинантных N- и С-концевых долей, а также белка теплового шока hsp90. Установлена роль отдельных доменов в проведении сигнала кальция и узнавании внутриклеточных мишеней. 2. Впервые обнаружено существование комплекса между калмодулином и калмодулинсвязывающим доменом киназы лёгких цепей миозина гладких мышц (пептид RS20) в отсутствии ионов кальция. Определены константа ассоциации и термодинамические параметры образования этого комплекса. 3. Установлено, что пептид RS20 связывается только с С-концевым доменом апокалмодулина,

принимая

при

этом

частично

α-спиральную

конформацию.

Предложен механизм активации калмодулином белка-мишени, в котором на первом этапе с мишенью взаимодействует апокалмодулин, после чего происходит активация кальцием данного комплекса. 4. Показано, что молекула CaVP состоит из двух взаимодействующих доменов, причём С-домен и степень его насыщения кальцием влияют на термостабильность третичной структуры N-домена, не затрагивая его вторичную структуру. Только С-концевой домен связывает кальций и взаимодействует с внутриклеточной мишенью CaVPT. 5. Определены изменения доменной структуры CaVP в зависимости от степени насыщения кальцием и продемонстрировано, что С-концевой домен CaVP в апо-форме находится в состоянии расплавленной глобулы. 6. Показано, что плавление белка теплового шока hsp90 состоит из двух переходов: низкотемпературный переход соответствует плавлению N-концевого домена, а высокотемпературный - разворачиванию центрального и С-концевого доменов. Обнаружена регуляция процесса инициации функциональной активности hsp90 ионами кальция, заключающаяся в сдвиге температуры разворачивания N-домена белка в область температур теплового шока.

92

Список литературы 1. Privalov P.L. [Energy characteristics of the structure of protein molecules] // Biofizika, 1985, V.30, №4, p.722-733 2. Privalov P.L. and Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperatureinduced changes in proteins // Methods Enzymol., 1986, V.131, p.4-51 3. Privalov P.L. Stability of proteins: small globular proteins // Adv. Protein Chem., 1979, V.33, p.167-241 4. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding // Adv. Protein Chem., 1995, V.47, p.83229 5. Sturtevant J.M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1977, V.74, №6 , p.2236-2240 6. Velicelebi G. and Sturtevant J.M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol--water mixtures // Biochemistry, 1979, V.18, №7, p.1180-1186 7. Brandts J.F. and Hunt L. The thermodynamics of protein denaturation. 3. The denaturation of ribonuclease in water and in aqueous urea and aqueous ethanol mixtures // J. Am. Chem. Soc., 1967, V.89, №19, p.4826-4838 8. Murphy K.P. and Gill S.J. Solid model compounds and the thermodynamics of protein unfolding // J. Mol. Biol., 1991, V.222, №3, p.699-709 9. Privalov P.L. and Khechinashvili N.N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study // J. Mol. Biol., 1974, V.86, №3, p.665-684 10. Sanchez-Ruiz J.M. Differential scanning calorimetry of proteins // Subcell. Biochem., 1995, V.24, p.133-176 11. Sturtevant J.M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry // Annu Rev Biophys Bioeng, 1986, V.38, p.463-488

93

12. Takahashi K. and Sturtevant J.M. Thermal denaturation of streptomyces subtilisin inhibitor, subtilisin BPN', and the inhibitor-subtilisin complex // Biochemistry, 1981, V.20, №21, p.6185-6190 13. Conejero-Lara F., Sanchez-Ruiz J.M., Mateo P.L., Burgos F.J., Vendrell J., and Aviles F.X. Differential scanning calorimetric study of carboxypeptidase B, procarboxypeptidase B and its globular activation domain // Eur. J. Biochem., 1991, V.200, №3, p.663-670 14. Conejero-Lara F., Mateo P.L., Aviles F.X., and Sanchez-Ruiz J.M. Effect of Zn2+ on the thermal denaturation of carboxypeptidase B // Biochemistry, 1991, V.30, №8, p.2067-2072 15. Galisteo M.L., Mateo P.L., and Sanchez-Ruiz J.M. Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of yeast phosphoglycerate kinase // Biochemistry, 1991, V.30, №8, p.2061-2066 16. Guzman-Casado M., Parody-Morreale A., Mateo P.L., and Sanchez-Ruiz J.M. Differential scanning calorimetry of lobster haemocyanin // Eur. J. Biochem., 1990, V.188, №1, p.181185 17. Sanchez-Ruiz J.M., Lopez-Lacomba J.L., Cortijo M., and Mateo P.L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin // Biochemistry, 1988, V.27, №5, p.1648-1652 18. Sanchez-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry // Biophys. J., V.61, p.921-935 19. Freire E., Osdol W.W., Mayorga O.L., and Sanchez-Ruiz J.M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1990, V.19, p.159-188 20. Lepock J.R., Rodahl A.M., Zhang C., Heynen M.L., Waters B., and Cheng K.H. Thermal denaturation

of

the

Ca2(+)-ATPase

of

sarcoplasmic

reticulum

reveals

two

thermodynamically independent domains // Biochemistry, 1990, V.29, №3, p.681-689 21. Novokhatny V.V. and Medved L.V. [Domainal organization of the molecules of Lysplasminogen] // Mol Biol (Mosk) , 1983, V.17, №5, p.976-982 22. Novokhatny V.V. and Kudinov S.A. Domains in human plasminogen // J. Mol. Biol., 1984, V.179, №2, p.215-232 94

23. Freire E. and Biltonen R.L. Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I Theory and application to homogeneous systems. // Biopolymers, 1978, V.17, p.463-479 24. Filimonov V.V., Potekhin S.A., Matveev S.V., and Privalov P.L. [Thermodynamic analysis of scanning microcalorimetry data. 1. Algorithms for deconvolution of heat absorption curves] // Mol. Biol. (Mosk), 1982, V.16, №3, p.551-562 25. Brandts J.F., Hu C.Q., Lin L.N., and

Mos M.T. A simple model for proteins with

interacting domains. Applications to scanning calorimetry data // Biochemistry, 1989, V.28, №21, p.8588- 8596 26. Kilhoffer M.C., Lukas T.J., Watterson D.M., and Haiech J. The heterodimer calmodulin: myosin light-chain kinase as a prototype vertebrate calcium signal transduction complex // Biochim. Biophys. Acta, 1992, V.1160, №1, p.8-15 27. Watterson D.M., Sharief F., and Vanaman T.C. The complete amino acid sequence of the Ca2+-dependent modulator protein (calmodulin) of bovine brain // J. Biol. Chem., 1980, V.255, №3, p.962-975 28. Zhang M., Tanaka T., and Ikura M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin // Nat. Struct. Biol., 1995, V.2, №9, p.758-767 29. Kuboniwa H., Tjandra N., Grzesiek S., Ren H., Klee C.B., and Bax A. Solution structure of calcium-free calmodulin // Nat. Struct. Biol., 1995, V.2, №9, p.768-776 30. Tsalkova T.N. and Privalov P.L. Thermodynamic study of domain organization in troponin C and calmodulin // J. Mol. Biol., 1985, V.181, №4, p.533-544 31. Ikura M., Clore G.M., Gronenborn A.M., Zhu G., Klee C.B., and Bax A. Solution structure of a calmodulin-target peptide complex by multidimensional NMR // Science, 1992, V.256, №5057, p.632-638 32. Meador W.E., Means A.R., and Quiocho F.A. Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex // Science, 1992, V.257, №5074, p.12511255

95

33. Meador W.E., Means A.R., and Quiocho F.A. Modulation of calmodulin plasticity in molecular recognition on the basis of x-ray structures // Science, 1993, V.262, №5140, p.1718-1721 34. Babu Y.S., Sack J.S., Greenhough T.J., Bugg C.E., Means A.R., and Cook W.J. Threedimensional structure of calmodulin // Nature, 1985, V.315, №6014, p.37-40 35. Chattopadhyaya R., Meador W.E., Means A.R., and Quiocho F.A. Calmodulin structure refined at 1.7 A resolution // J. Mol. Biol., 1992, V.228, №4, p.1177-1192 36. Wilson M.A. and Brunger A.T. The 1.0 A crystal structure of Ca(2+)-bound calmodulin: an analysis of disorder and implications for functionally relevant plasticity // J. Mol. Biol., 2000, V.301, №5, p.1237-1256 37. Falke J.J., Drake S.K., Hazard A.L., and Peersen O.B. Molecular tuning of ion binding to calcium signaling proteins // Q. Rev. Biophys., 1994, V.27, №3, p.219-290 38. Heidorn D.B. and Trewhella J. Comparison of the crystal and solution structures of calmodulin and troponin C // Biochemistry, 1988, V.27, №3, p.909-915 39. Ikura M., Spera S., Barbato G., Kay L.E., Krinks M., and Bax A. Secondary structure and side-chain 1H and 13C resonance assignments of calmodulin in solution by heteronuclear multidimensional NMR spectroscopy // Biochemistry, 1991, V.30, №38, p.9216-9228 40. Barbato G., Ikura M., Kay L.E., Pastor R.W., and Bax A. Backbone dynamics of calmodulin studied by 15N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the central helix is flexible // Biochemistry, 1992, V.31, №23, p.5269- 5278 41. Protasevich I., Ranjbar B., Lobachov V., Makarov A., Gilli R., Briand C., Lafitte D., and Haiech J. Conformation and thermal denaturation of apocalmodulin: role of electrostatic mutations // Biochemistry, 1997, V.36, №8, p.2017-2024 42. Sorensen B.R. and Shea M.A. Interactions between domains of apo calmodulin alter calcium binding and stability // Biochemistry, 1998, V.37, №12, p.4244- 4253 43. Kilhoffer M.C., Kubina M., Travers F., and Haiech J. Use of engineered proteins with internal tryptophan reporter groups and pertubation techniques to probe the mechanism of ligand-protein interactions: investigation of the mechanism of calcium binding to calmodulin // Biochemistry, 1992, V.31, №34, p.8098-8106 96

44. Gilli R., Lafitte D., Lopez C., Kilhoffer M., Makarov A., Briand C., and Haiech J. Thermodynamic analysis of calcium and magnesium binding to calmodulin // Biochemistry, 1998, V.37, №16, p.5450-5456 45. Weber P.C., Lukas T.J., Craig T.A., Wilson E., King M.M., Kwiatkowski A.P., and Watterson D.M. Computational and site-specific mutagenesis analyses of the asymmetric charge distribution on calmodulin // Proteins, 1989, V.6, №1, p.70-85 46. Cox J.A. Interactive properties of calmodulin // Biochem. J., 1988, V.249, №3, p.621-629 47. Lafitte D., Capony J.P., Grassy G., Haiech J., and Calas B. Analysis of the ion binding sites of calmodulin by electrospray ionization mass spectrometry // Biochemistry, 1995, V.34, №42, p.13825-13832 48. Mirzoeva S., Weigand S., Lukas T.J., Shuvalova L., Anderson W.F., and Watterson D.M. Analysis of the functional coupling between calmodulin's calcium binding and peptide recognition properties // Biochemistry, 1999, V.38, №13, p.3936-3947 49. Elshorst B. and others NMR solution structure of a complex of calmodulin with a binding peptide of the Ca2+ pump // Biochemistry, 1999, V.38, №38, p.12320-12332 50. Bayley P.M., Findlay W.A., and Martin S.R. Target recognition by calmodulin: dissecting the kinetics and affinity of interaction using short peptide sequences // Protein Sci., 1996, V.5, №7, p.1215-1228 51. Afshar M., Caves L.S., Guimard L., Hubbard R.E., Calas B., Grassy G., and Haiech J. Investigating the high affinity and low sequence specificity of calmodulin binding to its targets // J. Mol. Biol., 1994, V.244, №5, p.554-571 52. Wintrode P.L. and Privalov P.L. Energetics of target peptide recognition by calmodulin: a calorimetric study // J. Mol. Biol., 1997, V.266, №5, p.1050-1062 53. Cox J.A. Isolation and characterization of a new Mr 18,000 protein with calcium vector properties in amphioxus muscle and identification of its endogenous target protein // J. Biol. Chem., 1986, V.261, №28, p.13173-13178 54. Petrova T.V., Comte M., Takagi T., and Cox J.A. Thermodynamic and molecular properties of the interaction between amphioxus calcium vector protein and its 26 kDa target // Biochemistry, 1995, V.34, №1, p. 312-318 97

55. Cox J.A., Comte M., and Stein E.A. Calmodulin-free skeletal-muscle troponin C prepared in the absence of urea // Biochem. J., 1981, V.195, №1, p.205-211 56. Kobayashi T., Takagi T., Konishi K., and Cox J.A. The primary structure of a new Mr 18,000 calcium vector protein from amphioxus // J. Biol. Chem., 1987, V.262, №6, p.2613-2623 57. Reid R.E. Synthetic fragments of calmodulin calcium-binding site III. A test of the acid pair hypothesis. // J. Biol. Chem., 1990, V.265, p.5971-5976 58. Wang S., George S.E., Davis J.P., and Johnson J.D. Structural determinants of Ca2+ exchange and affinity in the C terminal of cardiac troponin C // Biochemistry, 1998, V.37, №41, p.14539-14544 59. Sekharudu Y.C. and Sundaralingam M. A structure-function relationship for the calcium affinities of regulatory proteins containing 'EF-hand' pairs // Protein Eng, 1988, V.2, №2, p.139-146 60. Takagi T. and Cox J.A. Primary structure of CaVPT, the target fo calcium vector protein of amphioxus. // J. Biol. Chem., 1991, V.265, p.652-656 61. Petrova T.V., Comte M., Takagi T., and Cox J.A. Ninth International Symposium on Calcium-binding Proteins and Calcium functions in Health and Disease // 1995 62. Apel E.D., Byford M.F., Au D., Walsh K.A., and Storm D.R. Identification of the protein kinase C phosphorylation site in neuromodulin // Biochemistry, 1990, V.29, №9, p.23302335 63. Baudier J., Deloulme J.C., Van Dorsselaer A., Black D., and Matthes H.W. Purification and characterization of a brain-specific protein kinase C substrate, neurogranin (p17). Identification of a consensus amino acid sequence between neurogranin and neuromodulin (GAP43) that corresponds to the protein kinase C phosphorylation site and the calmodulinbinding domain // J. Biol. Chem., 1991, V.266, №1, p.229-237 64. Petrova T.V., Takagi T., and Cox J.A. Phosphorylation of the IQ domain regulates the interaction between Ca2+- vector protein and its target in Amphioxus // J. Biol. Chem., 1996, V.271, №43, p.26646-26652

98

65. Theret I., Baladi S., Cox J.A., Sakamoto H., and Craescu C.T. Sequential calcium binding to the regulatory domain of calcium vector protein reveals functional asymmetry and a novel mode of structural rearrangement // Biochemistry, 2000, V.39, №27, p.7920-7926 66. Schlesinger M.J. Heat shock proteins // J. Biol. Chem., 1990, V.265, №21, p.12111-12114 67. Lai B.T., Chin N.W., Stanek A.E., Keh W., and Lanks K.W. Quantitation and intracellular localization of the 85K heat shock protein by using monoclonal and polyclonal antibodies // Mol. Cell Biol., 1984, V.4, №12, p.2802-2810 68. Minami Y., Kawasaki H., Miyata Y., Suzuki K., and Yahara I. Analysis of native forms and isoform compositions of the mouse 90-kDa heat shock protein, HSP90 // J. Biol. Chem., 1991, V.266, №16, p.10099-10103 69. Minami Y., Kawasaki H., Suzuki K., and Yahara I. The calmodulin-binding domain of the mouse 90-kDa heat shock protein // J. Biol. Chem., 1993, V.268, №13, p.9604-9610 70. Yonehara M., Minami Y., Kawata Y., Nagai J., and Yahara I. Heat-induced chaperone activity of HSP90 // J. Biol. Chem., 1996, V.271, №5, p.2641-2645 71. Jakob U., Lilie H., Meyer I., and Buchner J. Transient interaction of Hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo // J. Biol. Chem., 1995, V.270, №13, p.7288-7294 72. Lanks K.W., London E., and Dong D.L. Hsp85 conformational change within the heat shock temperature range // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, V.184, №1, p.394-399 73. Farrelly F.W. and Finkelstein D.B. Complete sequence of the heat shock-inducible HSP90 gene of Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem., 1984, V.259, №9, p.5745-5751 74. Nemoto T., Sato N., Iwanari H., Yamashita H., and Takagi T. Domain structures and immunogenic regions of the 90-kDa heat-shock protein (HSP90). Probing with a library of anti-HSP90 monoclonal antibodies and limited proteolysis // J. Biol. Chem., 1997, V.272, №42, p.26179-26187 75. Stebbins C.E., Russo A.A., Schneider C., Rosen N., Hartl F.U., and Pavletich N.P. Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent // Cell, 1997, V.89, №2, p.239-250

99

76. Rose D.W., Wettenhall R.E., Kudlicki W., Kramer G., and Hardesty B. The 90-kilodalton peptide of the heme-regulated eIF-2 alpha kinase has sequence similarity with the 90kilodalton heat shock protein // Biochemistry, 1987, V.26, №21, p.6583-6587 77. Garnier C., Lafitte D., Jorgensen T.J., Jensen O.N., Briand C., and Peyrot V. Phosphorylation and oligomerization states of native pig brain HSP90 studied by mass spectrometry // Eur. J. Biochem., 2001, V.268, №8, p.2402-2407 78. Minami Y., Kimura Y., Kawasaki H., Suzuki K., and Yahara I. The carboxy-terminal region of mammalian HSP90 is required for its dimerization and function in vivo // Mol. Cell Biol., 1994, V.14, №2, p.1459-1464 79. Lanks K.W. Temperature-dependent oligomerization of hsp85 in vitro // J. Cell Physiol, 1989, V.140, №3, p.601-607 80. Freitag D.G., Ouimet P.M., Girvitz T.L., and Kapoor M. Heat shock protein 80 of Neurospora crassa, a cytosolic molecular chaperone of the eukaryotic stress 90 family, interacts directly with heat shock protein 70 // Biochemistry, 1997, V.36, №33, p.1022110229 81. Nemoto T., Matsusaka T., Ota M., Takagi T., Collinge D.B., and Walther-Larsen H. Dimerization characteristics of the 94-kDa glucose-regulated protein // J. Biochem. (Tokyo), 1996, V.120, №2, p.249-256 82. Welch W.J. and Feramisco J.R. Purification of the major mammalian heat shock proteins // J. Biol. Chem., 1982, V.257, №24, p.14949-14959 83. Koyasu S., Nishida E., Kadowaki T., Matsuzaki F., Iida K., Harada F., Kasuga M., Sakai H., and Yahara I. Two mammalian heat shock proteins, HSP90 and HSP100, are actinbinding proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1986, V.83, №21, p.8054-8058 84. Iwasaki M., Saito H., Yamamoto M., Korach K.S., Hirogome T., and Sugano H. Purification of heat shock protein 90 from calf uterus and rat liver and characterization of the highly hydrophobic region // Biochim. Biophys. Acta, 1989, V.992, №1, p.1-8 85. Yamamoto M., Takahashi Y., Inano K., Horigome T., and Sugano H. Characterization of the hydrophobic region of heat shock protein 90 // J. Biochem. (Tokyo), 1991, V.110, №1, p.141-145

100

86. Binart N., Chambraud B., Dumas B., Rowlands D.A., Bigogne C., Levin J.M., Garnier J., Baulieu E.E., and Catelli M.G. The cDNA-derived amino acid sequence of chick heat shock protein Mr 90,000 (HSP 90) reveals a "DNA like" structure: potential site of interaction with steroid receptors // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, V.159, №1, p.140-147 87. Csermely P. Proteins, RNAs and chaperones in enzyme evolution: a folding perspective // Trends Biochem. Sci., 1997, V.22, №5, p.147-149 88. Pratt W.B. The role of the hsp90-based chaperone system in signal transduction by nuclear receptors and receptors signaling via MAP kinase // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1997, V.37 , p.297-326 89. Czar M.J., Welsh M.J., and Pratt W.B. Immunofluorescence localization of the 90-kDa heat-shock protein to cytoskeleton // Eur. J. Cell Biol., 1996, V.70, №4, p.322-330 90. Fostinis Y., Theodoropoulos P.A., Gravanis A., and Stournaras C. Heat shock protein HSP90 and its association with the cytoskeleton: a morphological study // Biochem. Cell Biol., 1992, V.70, №9, p.779-786 91. Garnier C., Barbier P., Gilli R., Lopez C., Peyrot V., and Briand C. Heat-shock protein 90 (hsp90) binds in vitro to tubulin dimer and inhibits microtubule formation // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, V.250, №2, p.414-419 92. Redmond T., Sanchez E.R., Bresnick E.H., Schlesinger M.J., Toft D.O., Pratt W.B., and Welsh M.J. Immunofluorescence colocalization of the 90-kDa heat-shock protein and microtubules in interphase and mitotic mammalian cells // Eur. J. Cell Biol., 1989, V.50, №1, p.66-75 93. Williams N.E. and Nelsen E.M. HSP70 and HSP90 homologs are associated with tubulin in hetero- oligomeric complexes, cilia and the cortex of Tetrahymena // J. Cell Sci., 1997, V.110 ( Pt 14), p.1665-1672 94. Nadeau K., Das A., and Walsh C.T. Hsp90 chaperonins possess ATPase activity and bind heat shock transcription factors and peptidyl prolyl isomerases // J. Biol. Chem., 1993, V.268, №2, p.1479-1487 95. Tsubuki S., Saito Y., and Kawashima S.

Purification and characterization of an

endogenous inhibitor specific to the Z-Leu-Leu-Leu-MCA degrading activity in 101

proteasome and its identification as heat-shock protein 90 // FEBS Lett., 1994, V.344, №23, p.229-233 96. Wagner B.J. and Margolis J.W. Age-dependent association of isolated bovine lens multicatalytic proteinase complex (proteasome) with heat-shock protein 90, an endogenous inhibitor // Arch. Biochem. Biophys., 1995, V.323, №2, p.455-462 97. Hutchison K.A., Dittmar K.D., and Pratt W.B. All of the factors required for assembly of the glucocorticoid receptor into a functional heterocomplex with heat shock protein 90 are preassociated in a self-sufficient protein folding structure, a "foldosome" // J. Biol. Chem., 1994, V.269, №45, p.27894-27899 98. Pratt W.B. The role of heat shock proteins in regulating the function, folding, and trafficking of the glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem., 1993, V.268, №29, p.2145521458 99. Csermely P. and Kahn C.R. The 90-kDa heat shock protein (hsp-90) possesses an ATP binding site and autophosphorylating activity // J. Biol. Chem., 1991, V.266, №8, p.49434950 100. Csermely P. and others ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein (hsp90) // J. Biol. Chem., 1993, V.268, №3 , p.1901-1907 101. Nadeau K., Sullivan M.A., Bradley M., Engman D.M., and Walsh C.T. 83-kilodalton heat shock proteins of trypanosomes are potent peptide- stimulated ATPases // Protein Sci., 1992, V. 1, №8, p.970-979 102. Nardai G., Schnaider T., Soti C., Ryan M.T., Hoj P.B., Somogyi J., and Csermely P. Characterization of the 90 kDa heat shock protein (hsp90)-associated ATP/GTP-ase. // J. Biosci., 1996, V.21, p.179-190 103. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., and Pearl L.H. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone // Cell, 1997, V.90, №1, p.65-75 104. Grenert J.P. and others The amino-terminal domain of heat shock protein 90 (hsp90) that binds geldanamycin is an ATP/ADP switch domain that regulates hsp90 conformation // J. Biol. Chem., 1997, V.272, №38, p.23843-23850

102

105. Kellermayer M.S. and Csermely P. ATP induces dissociation of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) from F-actin: interference with the binding of heavy meromyosin // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, V.211, №1, p.166-174 106. Scheibel T., Neuhofen S., Weikl T., Mayr C., Reinstein J., Vogel P.D., and Buchner J. ATP-binding properties of human Hsp90 // J. Biol. Chem., 1997, V.272, №30, p.1860818613 107. Prodromou C., Roe S.M., Piper P.W., and Pearl L.H. A molecular clamp in the crystal structure of the N-terminal domain of the yeast Hsp90 chaperone // Nat. Struct. Biol., 1997, V.4, №6, p.477-482 108. Soga S. and others Radicicol leads to selective depletion of Raf kinase and disrupts K-Rasactivated aberrant signaling pathway // J. Biol. Chem., 1998, V.273, №2, p.822-828 109. Young J.C., Schneider C., and Hartl F.U. In vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites // FEBS Lett., 1997, V.418, №1-2, p.139-143 110. Nagamune K., Yamamoto K., and Honda T. Intramolecular chaperone activity of the proregion of Vibrio cholerae El Tor cytolysin // J. Biol. Chem., 1997, V.272, №2 , p.13381343 111. Meng X., Devin J., Sullivan W.P., Toft D., Baulieu E.E., and Catelli M.G. Mutational analysis of Hsp90 alpha dimerization and subcellular localization: dimer disruption does not impede "in vivo' interaction with estrogen receptor // J. Cell Sci., 1996, V.109 ( Pt 7), p.1677-1687 112. Nemoto T., Ohara-Nemoto Y., Ota M., Takagi T., and Yokoyama K. Mechanism of dimer formation of the 90-kDa heat-shock protein // Eur. J. Biochem., 1995, V.233, №1, p.1-8 113. Schlatter L.K., Howard K.J., Parker M.G., and Distelhorst C.W. Comparison of the 90kilodalton heat shock protein interaction with in vitro translated glucocorticoid and estrogen receptors // Mol. Endocrinol., 1992, V.6, №1, p.132-140 114. Sullivan W.P. and Toft D.O. Mutational analysis of hsp90 binding to the progesterone receptor // J. Biol. Chem., 1993, V.268, №27, p.20373-20379 115. Cadepond F., Binart N., Chambraud B., Jibard N., Schweizer-Groyer G., Segard-Maurel I., and Baulieu E.E. Interaction of glucocorticosteroid receptor and wild-type or mutated 90103

kDa heat shock protein coexpressed in baculovirus-infected Sf9 cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1993, V.90, №22, p.10434-10438 116. Sullivan W.P., Vroman B.T., Bauer V.J., Puri R.K., Riehl R.M., Pearson G.R., and Toft D.O. Isolation of steroid receptor binding protein from chicken oviduct and production of monoclonal antibodies // Biochemistry, 1985, V.24, №15, p.4214-4222 117. Jakob U., Scheibel T., Bose S., Reinstein J., and Buchner J. Assessment of the ATP binding properties of Hsp90 // J. Biol. Chem., 1996, V.271, №17, p.10035-10041 118. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., and Gay N.J. Distantly related sequences in the aand b-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-binding enzymes and a common nucleotide binding fold // EMBO J., 1982, V.1, №8, p.945-951 119. Soti C. and Csermely P. Characterization of the nucleotide pinding properties of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) // J. Biosci., 1998, 120. Wawrzynow A., Banecki B., and Zylicz M. The Clp ATPases define a novel class of molecular chaperones // Mol. Microbiol., 1996, V.21, №5, p.895-899 121. Marcu M.G., Chadli A., Bouhouche I., Catelli M., and Neckers L.M. The heat shock protein 90 antagonist novobiocin interacts with a previously unrecognized ATP-binding domain in the carboxyl terminus of the chaperone // J. Biol. Chem., 2000, V.275, №47, p.37181-37186 122. Weikl T., Muschler P., Richter K., Veit T., Reinstein J., and Buchner J. C-terminal regions of Hsp90 are important for trapping the nucleotide during the ATPase cycle // J. Mol. Biol., 2000, V.303, №4, p.583-592 123. Yonezawa N., Nishida E., Sakai H., Koyasu S., Matsuzaki F., Iida K., and Yahara I. Purification and characterization of the 90-kDa heat-shock protein from mammalian tissues. // Eur. J. Biochem., 1988, V.177, p.1-7 124. Gill S.C. and von Hippel P.H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. // Anal. Biochem. , 1989, V.182, p.319-326 125. Craig T.A., Watterson D.M., Prendergast F.G., Haiech J., and Roberts D.M. Site-specific mutagenesis of the alpha-helices of calmodulin. Effects of altering a charge cluster in the helix that links the two halves of calmodulin. // J. Biol. Chem., 1987, V.262, p.3278-3284 104

126. Kilhoffer M.C., Roberts D.M., Adibi A., Watterson D.M., and Haiech J. Fluorescence characterization of VU-9 calmodulin, an engineered calmodulin with one tryptophan in calcium binding domain III // Biochemistry, 1989, V.28, №14, p.6086- 6092 127. Guimard L., Afshar M., Haiech J., and Calas B. A protein/peptide assay using peptide-resin adduct: application to the calmodulin/RS20 complex // Anal. Biochem., 1994, V.221, №1, p.118-126 128. Lukas T.J., Burgess W.H., Prendergast F.G., Lau W., and Watterson D.M. Calmodulin binding domains: characterization of a phosphorylation and calmodulin binding site from myosin light chain kinase // Biochemistry, 1986, V.25, №6, p.1458-1464 129. Haiech J., Klee C.B., and Demaille J.G. Effects of cations on affinity of calmodulin for calcium: ordered binding of calcium ions allows the specific activation of calmodulinstimulated enzymes // Biochemistry, 1981, V.20, №13, p.3890-3897 130. Baladi S., Tsvetkov P.O., Petrova T.V., Takagi T., Sakamoto H., Lobachov V.M., Makarov A.A., and Cox J.A. Folding units in calcium vector protein of amphioxus: Structural and functional properties of its a // Protein Sci., 2001, V.10, №4, p.771-778 131. Cox J.A., Smith V.L., and Dedman J.R.

Stimulus response coupling: the role of

intracellular calcium-binding proteins // CRC Press, 1990, p.83-107 132. Colowick S.P. and Womack F.C. Binding of diffusible molecules by macromolecules: rapid measurement by rate of dialysis. // J. Biol. Chem., 1969, V.244, №4, p.774-777 133. Makhatadze G.I., Medvedkin V.N., and Privalov P.L. Partial molar volumes of polypeptides and their constituent groups in aqueous solution over a broad temperature range // Biopolymers, 1990, V.30, №11-12, p.1001-1010 134. Schippers P.H. and Dekkers J.M. Direct determination of absolute circular dichroism data and calibration of commercial instruments. // Anal. Chem., 1981, V.53, p.778-788 135. Takakuwa T., Konno T., and Meguro H.A. A new standard substance for calibration of circular dichroism: Ammonium d-10-camphorsulfonate. // Anal. Sci., 1985, V.1, p.215-225 136. Chen Y.H., Yang J.T., and Martinez H.M. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion // Biochemistry, 1972, V.11, №22, p.4120-4131 105

137. Durussel I., Luan-Rilliet Y., Petrova T.V., Takagi T., and Cox J.A. Cation binding and conformation of tryptic fragments of Nereis sarcoplasmic calcium-binding protein: Calcium-induced homo- and heterodimerization. // Biochemistry, 1993, V.32, p.2394-2400 138. Lavanant H., Derrick P.J., Heck A.J., and Mellon F.A. Analysis of nisin A and some of its variants using Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry // Anal. Biochem., 1998, V.255, №1, p.74-89 139. Palmblad M., Wetterhall M., Markides K., Hakansson P., and Bergquist J. Analysis of enzymatically digested proteins and protein mixtures using a 9.4 Tesla Fourier transform ion cyclotron mass spectrometer // Rapid Commun. Mass Spectrom., 2000, V.14, №12, p.1029-1034 140. Lafitte D., Heck A.J., Hill T.J., Jumel K., Harding S.E., and Derrick P.J. Evidence of noncovalent dimerization of calmodulin // Eur. J. Biochem., 1999, V.261, №1, p.337-344 141. Mamar-Bachi A. and Cox J.A. Quantitative analysis of the free energy coupling in the system calmodulin, calcium, smooth muscle myosin light chain kinase // Cell Calcium, 1987, V.8, №6, p.473-482 142. Tsvetkov P.O., Protasevich I.I., Gilli R., Lafitte D., Lobachov V.M., Haiech J., Briand C., and Makarov A.A. Apocalmodulin binds to the myosin light chain kinase calmodulin target site // J. Biol. Chem., 1999, V.274, №26, p.18161-18164 143. Permyakov E.A., Medvedkin V.N., Mitin Y.V., and Kretsinger R.H. Noncovalent complex between domain AB and domains CD*EF of parvalbumin. // Biochim. Biophys. Acta, 1991, V.1076, p.67-70 144. Gregori L., Marriott D., West C.M., and Chau V. Specific recognition of calmodulin from Dictyostelium discoideum by the ATP, ubiquitin-dependent degradative pathway // J. Biol. Chem., 1985, V.260, №9, p. 5232-5235 145. Minowa O. and Yagi K. Calcium binding to tryptic fragments of calmodulin // J. Biochem. (Tokyo), 1984, V.96, №4, p.1175-1182 146. Ptitsyn O.B., Pain R.H., Semisotnov G.V., Zerovnik E., and Razgulyaev O.I. Evidence for a molten globule state as a general intermediate in protein folding // FEBS Lett., 1990, V.262, №1, p.20-24

106

147. Wright P.E. and Dyson H.J. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure- function paradigm // J. Mol. Biol., 1999, V.293, №2, p.321-331 148. Daughdrill G.W., Chadsey M.S., Karlinsey J.E., Hughes K.T., and Dahlquist F.W. The Cterminal half of the anti-sigma factor, FlgM, becomes structured when bound to its target, sigma 28 // Nat. Struct. Biol., 1997, V.4, №4, p.285-291 149. Kriwacki R.W., Hengst L., Tennant L., Reed S.I., and Wright P.E. Structural studies of p21Waf1/Cip1/Sdi1 in the free and Cdk2-bound state: conformational disorder mediates binding diversity // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1996, V.93, №21, p.11504-11509 150. Lydakis-Simantiris N., Hutchison R.S., Betts S.D., Barry B.A., and Yocum C.F. Manganese stabilizing protein of photosystem II is a thermostable, natively unfolded polypeptide // Biochemistry, 1999, V.38, №1, p.404-414 151. Montgomery D., Jordan R., McMacken R., and Freire E. Thermodynamic and structural analysis of the folding/unfolding transitions of the Escherichia coli molecular chaperone DnaK. // J. Mol. Biol., 1993, V.232, №3, p.680-692 152. Hooker T.M. and Schellman J.A. Optical activity of aromatic chromophores. // Biopolymers, 1970, V.9, №11, p.1319-1348 153. Garnier C., Protasevich I., Gilli R., Tsvetkov P., Lobachov V., Peyrot V., Briand C., and Makarov A. The two-state process of the heat shock protein 90 thermal denaturation: effect of calcium and magnesium // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, V.249, №1, p.197-201 154. Potekhin, S. A., Loseva, O. I., Tiktopulo, E. I., and Dobtitsa, A. P. Transition state of the rate-limiting step of heat denaturation of Cry3A delta-endotoxin. // Biochemistry, 1999, V.38, №13, p.4121-4127

107