Ф е де рал ь ное аге нс тво по образованию В О Р О Н Е Ж СКИ Й ГО СУД А Р СТВ Е Н Н Ы Й УН И В Е СИ ТЕ Т
А .К. Буторина...
2 downloads
164 Views
1016KB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
Ф е де рал ь ное аге нс тво по образованию В О Р О Н Е Ж СКИ Й ГО СУД А Р СТВ Е Н Н Ы Й УН И В Е СИ ТЕ Т
А .К. Буторина, О .С. М аш кина К А Р ТИ Р О В А Н И Е Г Е Н О М А И О Б РА ТН А Я Г Е Н Е ТИ К А И З Б РАН Н Ы Е Л Е К Ц И И п о курсу “ Г енетикас основами селекц ии” У Ч Е Б НО Е П О С О Б И Е 020201 ( 011600) – Б иология
В ороне ж 2005
2
Утве ржде но научно-ме тодичес ким с ове том биол ого-почве нного факул ь те та3 ию ня 2005 года, протокол № 4
А вторы : БуторинаА .К. М аш кинаО .С.
Учебное пос обие подготовл е но на кафе дре ге не тики, с е л е кц ии и те ории эвол ю ц ии биол ого-почве нного факул ь те та В ороне жс кого гос ударс тве нного униве рс ите та Р е коме ндуе тс я дл я с туде нтов биол ого-почве нного факул ь те та дне вной и ве черне й формы обучения
3
СО Д Е Р Ж А Н И Е В В Е Д Е Н ИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. КА Р ТИ Р О В А Н И Е ГЕ Н О М А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. Ц итол огичес кие карты хромос ом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1. Гибридизац ия in situ: ISH - и FISH-гибридизац ия . . . . . . . . . . 1.1.2. Х ромос омны й пе й нтинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.3. Гибридизац ия с оматичес ких кл е ток. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Ге не тичес кое картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. М ол е кул ярны е марке ры Д Н К и их ис пол ь зование дл я ге не тичес кого картирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1. П Д Р Ф -марке ры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2. М ол е кул ярны е марке ры , ос нованны е напол име разной ц е пной ре акц ии (П Ц Р -марке ры ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3. М икрос ате л л иты и минис ате л л иты какмол е кул ярны е марке ры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Ф изичес кое картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.1. Создание ре с трикц ионны х карт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.2. Создание упорядоченны х библ иоте ккл онов. Карты контиг. П роц е дура“П рогул капо хромос оме ” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.3. Страте гии пос троения физичес кой карты вы с окого разре ш е ния . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. О пре де л е ние нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти ге нома (с е кве нирование ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Базы данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й . Компь ю те рная ге не тика(биоинформатика). И с с л е дования in silico . 1.7. Кандидатное картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. ГЕ Н О М И КА , П Р О ТЕ О М И КА И “О БР А ТН А Я ГЕ Н Е ТИ КА ” . . . . . . . 2.1. Ге номика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. О ртол огичны е и парал огичны е ге ны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. “О братная ге не тика” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. П роте ом и проте омика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5. Д Н К-микрочипы (Д Н К-пол я) и приме ры их ис пол ь зования дл я изучения ге номов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6. Н е которы е итоги с равните л ь ного анал изаге номов разл ичны х организмов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. О БЛА СТИ П Р И М Е Н Е Н И Я Р Е ЗУЛЬТА ТО В КА Р ТИ Р О В А Н И Я ГЕ Н О М А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Ге номная ме диц ина. Д Н К-диагнос тика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. О бнаруже ние мутац ий при нас л е дс тве нны х забол е ваниях чел ове ка. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Ге не тичес кий пас порт и е го значение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . СЛО В А Р Ь ТЕ Р М И Н О В . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Р Е КО М Е Н Д УЕ М А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 5 6 8 9 11 11 14 15 16 25 27 28 30 30 34 37 39 40 40 42 43 44 45 48 51 51 55 59 60 59
4
ВВЕ ДЕ Н И Е Картирование ге номов разл ичны х видов, т.е . ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов относ ите л ь но других ге нов в хромос омах и изучение их нукл е отидного с ос тава явл яе тс я фундаме нтал ь ны м направл е ние м с овре ме нной ге не тики, пос кол ь ку о с те пе ни ге не тичес кой изученнос ти видов с удят по “нас ы щ е ннос ти” ге нами их хромос ом. Ус тановл е ние пол оже ния и природы ге нов откры вае т возможнос ти дл я манипул ирования ими. Э то ис кл ю чите л ь но важно дл я с е л е кц ии с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ний и животны х, так как обе с пе чивае т возможнос ть дл я направл е нного подбора пар при гибридизац ии с ц е л ь ю пол учения гибридов, обл адаю щ их же л ае мы ми признаками. Э то не обходимо и дл я ис с л е дований по ге нной инже не рии, в ходе которы х инте ре с ую щ ий нас ге н л ибо вы де л яю т из организма с помощ ь ю с пе ц иал ь ны х прие мов, л ибо с инте зирую т, зная е го нукл е отидны й с ос тав. Как отме чае т А .И . М ирош ников (2004), “П о мне нию ве дущ их мировы х экс пе ртов, ге нная инже не рия буде т ш ироко ис пол ь зовать с я чел ове чес твом дл я ре ш е ния с воих гл обал ь ны х пробл е м в XXI ве ке , и по мас ш табам приме не ния будут с равнима с информац ионны ми те хнол огиями, а также те хнол огиями, приме няе мы ми дл я производс твановы х мате риал ов и эне ргии… В с оотве тс твии с прогнозами аме риканс ких экономис тов тол ь ко ге не тичес кие подходы обе с пе чат экономике СШ А к 2025 г. 20% прирос т вал ового нац ионал ь ного продукта, что с ос тавит окол о 2 трил л ионов дол л аров чис той прибы л и” . В обл ас ти ме диц ины картирование ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове ка, позвол яе т разрабаты вать ме тоды их ранне й диагнос тики и ге ноте рапии наос нове ге нно-инже не рны х подходов. В ажнос ть и с л ожнос ть пробл е мы картирования ге нома и в то же вре мя не дос таточное ос ве щ е ние е е в име ю щ ихс я учебниках по ге не тике обус л овил о не обходимос ть напис ания данного учебного пос обия с привл е чение м мате риал ов нове й ш е й пе риодичес кой л ите ратуры . М ы с очл и также ц е л е с ообразны м познакомить с туде нтов с с амы ми с овре ме нны ми направл е ниями мол е кул ярной ге не тики – ге номикой и проте омикой , ме тодол огичес кими подходами “обратной ге не тики” дл я ус тановл е ния функц ии ге нов и с ис пол ь зование м Д Н К-микрочипов (биочипов) дл я изучения ге номов. В учебном пос обии рас с матриваю тс я также пробл е мы ге не тики in silico – компь ю те рной ге не тики ил и биоинформатики, которая позвол яе т ис пол ь зовать и инте рпре тировать обш ирную информац ию , пол учае мую в мол е кул ярно-ге не тичес ких ис с л е дованиях, ос обе нно при анал изе пе рвичной с труктуры ц е л ы х ге номов вы с ш их организмов, а также гл обал ь ны х профил е й экс пре с с ии ге нов с приме не ние м биочипов. О граниченнос ть вре ме ни, отве де нного на чте ние л е кц ий по курс у “Ге не тика с ос новами с е л е кц ии” , не позвол яе т, к с ожал е нию , ос ве тить в л е кц иях вс е вопрос ы , кас аю щ ие с я гл авны х направл е ний с овре ме нной ге не тики. П оэтому, нанаш взгл яд, данное учебное пос обие може т пре дс тавл ять инте ре с дл я с туде нтов вс ех форм обучения, бакал авров, магис тров,
5
ас пирантов и пре подавате л е й -биол огов, а также химиков, физиков, мате матиков и других с пе ц иал ис тов, инте ре с ую щ ихс я пробл е мами с овре ме нной ге не тики. 1. К А Р ТИ РО В А Н И Е Г Е Н О М А Г еном – это с овокупнос ть кодирую щ их и не кодирую щ их пос л е довате л ь нос те й (с уммарная ге не тичес кая информац ия) кл е тки и организма. Н априме р, ге ном вирус ов, ге ном бакте рий – это вс я их (тотал ь ная) Д Н К (ил и Р Н К у вирус ов), а говоря о геноме дипл оидны х организмов, наприме р, пш е ниц ы ил и чел ове ка, име ю т в виду с овокупнос ть ге нов их гапл оидного (гаме тичес кого) набора. Э то ус ре дне нное , общ е е с трое ние Д Н К – разме ры и ос обеннос ти организац ии, пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов и др. П оэтому ге ном - это характе рис тикавидав отл ичие от ге нотипа– характе рис тики каждого индивида. Соматичес кие кл е тки чел ове кас оде ржат 2n=46 хромос ом, из них 44 аутос омы - одинаковы е у обоих пол ов (22 пары гомол огичны х хромос ом) и две пол овы е хромос омы (гонос омы ). У л иц же нс кого пол ас оде ржитс я пара гомол огичны х пол овы х хромос ом (Х Х ), а у л иц мужс кого пол а – две ге те рол огичны е хромос омы (Х У). Ге ном чел ове кавкл ю чае т 23 хромос омы (22 аутос омы и одну из двух пол овую хромос ому – Х ил и У), 32 ты с . с труктурны х ге нов и пре дс тавл е н 3,2 мл рд нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й (пн). О с те пе ни ге не тичес кой изученнос ти вида с удят по пл относ ти (ил и нас ы щ е ннос ти) ге не тичес ких карт е го хромос ом. К артирование генома – это ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К) на опре де л е нны х хромос омах относ ите л ь но других ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К). О но базируе тс я на ис пол ь зовании тре х ос новны х ме тодов (ил и подходов): ге не тичес кого, ц итол огичес кого и физичес кого. Карты ге нома, как и ге ографичес кие карты , можно с троить в разном мас ш табе , т.е . с разны м уровне м разре ш е ния. П риме ром с амой ме л комас ш табной карты явл яе тс я идиограмма дифференц иально окрашенных хромосом, с амой крупномас ш табной картой ге нома явл яе тс я пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов в мол е кул е Д Н К, входящ е й в с ос тав каждой хромос омы . Сл е довате л ь но, один нукл е отид явл яе тс я пре де л ь но возможны м уровне м разре ш е ния накарте ге нома. Таким образом, информац ия о с труктуре ге номаможе т бы ть пол учена в ре зул ь тате пос трое ния ге не тичес ких, ц итол огичес ких, физичес ких и ре с трикц ионны х карт хромос ом. Р ас с мотрим картирование ге номанаприме ре чел ове ка. Задача изучения ге нома чел ове ка приобре л а ос обую значимос ть в с вязи с ос ознание м учены ми не пос ре дс тве нной с вязи бол ь ш инс твабол е зне й чел ове кас повре жде ние м е го ге нома. П оэтому в 1987 г. по иниц иативе проф. Гарвардс кого униве рс ите та л ауре ата Н обе л е вс кой пре мии Уол те ра
6
Гил бе рта бы л а разработана ме ждународная программа “Ге ном чел ове ка” , объе динивш ая ус ил ия учены х 50 разны х с тран, в том чис л е и Р ос с ии. Ц е л ь ю этой очень дорогос тоящ е й программы бы л о: 1) ус тановл е ние групп с ц е пл е ния и л окал изац ия ге нов нахромос омах; 2) прочте ние (ил и с е кве нирование ) вс е х 3,2 мл рд пн в с ос таве ге нома чел ове ка и с ос тавл е ние подробной ге не тичес кой карты е го хромос ом; 3) изучение функц ии ге нов; 4) разработка ме тодов ге ноте рапии, т.е . ис правл е ние де фе ктов ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е бол е зни чел ове ка. П ри ус пе ш ном вы пол не нии данной программы у чел ове чес твапоявятс я пе рс пе ктивы понять ме ханизмы функц ионирования каждого из е го ге нов, принц ипы развития организма, ге не тичес кие причины многих нас л е дс тве нны х бол е зней и ме ханизмы с таре ния. К конц у XX с тол е тия бы л и пол нос ть ю рас ш ифрованы нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти, входящ ие в ге ном чел ове ка. П ос л е того как бы л и опре де л е ны нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти двух с амы х ме л ких хромос ом – 21 и 22-ой (2000г.), проц е дура с е кве нирования бы л а нас тол ь ко отработана, что с тал а, по с ущ е с тву, рутинной . О с тал ис ь до конц ане ре ш е нны ми такие задачи программы , как пол ное ге не тичес кое картирование , изучение функц ий вс е х 32 ты с ячге нов, ус тановл е нны х в геноме чел ове ка, и ге ноте рапии многих нас л е дс твенны х забол е ваний . Таким образом, ос новны ми ме тодами изучения ге нома явл яю тс я картирование и с е кве нирование . 1.I. Ц и т ологи ческ и е к арт ы хромосом П одробны е ц итол огичес кие карты хромос ом с озданы по чел ове ку с ис пол ь зование м ме тода диффе ре нц иал ь ного окраш ивания, которы й в отл ичие от прос той (монохромной = с пл ош ной ) окрас ки хромос ом, позвол яе т иде нтифиц ировать каждую хромос ому, вы явл ять их с труктурную разнороднос ть по дл ине , что вы ражае тс я в виде чере дования с ве тл ы х и те мны х пол ос . Чис л о и протяже ннос ть вы явл яе мы х при диффе ре нц иал ь ном окраш ивании пол ос характе ризую тс я пос тоянс твом и с пе ц ифичнос ть ю дл я каждой хромос омы (рис унок 1). К этим пол ос ам каждой хромос омы привязы ваю т ме с топол оже ние конкре тного ге на. В пе рвы е ме тод диффе ре нц иал ь ного окраш ивания хромос ом с помощ ь ю фл уоре с ц е нтны х крас ите л е й (Q-окрас ка) бы л пре дл оже н в 1968 г. Кас пе рс с оном с с отрудниками. П озже появил ис ь другие ме тоды окрас ки – G -, R -, C – и Т- окрас ка. О с обе нно подробно у чел ове каизученаХ -хромос ома, в час тнос ти, те е е учас тки, которы е находятс я в ге мизиготном с ос тоянии (рис унок2). П л е чи вс е х хромос ом, в том чис л е и Х -хромос омы , p – короткие и q дл инны е подразде л е ны нарай оны (у Х -хромос омы их два), в пре де л ах которы х с ве тл ы е и те мны е пол ос ы (бэнды = с е гме нты , ил и учас тки) пронуме рованы . Р ай оны и бэнды нуме рую тс я арабс кими ц ифрами от ц е нтроме ры к те л оме ре , отде л ь но дл я каждого пл е ча. Запис ь пол оже ния ге на на карте вкл ю чае т номе р хромос омы , пл е чо, номе р рай она и бэнда. Н априме р, пол оже ние гена GGPD указы вае тс я как Х q28, что означае т, что ге н
7
рас пол оже н в вос ь мом бэнде второго рай она дл инного пл е ча Х хромос омы .
Р ис унок 1. Схе матичес кое изображе ние гапл оидного набора хромос ом чел ове капри диффе ре нц иал ь ной окрас ке (G-ме тод) [Захаров, 1982].
8
Запис ь 7p11 означае т, что ге н л окал изован в первом бэнде первого рай онакороткого пл е чахромос омы 7. П одобная запис ь позвол яе т л окал изовать ге н с точнос ть ю до одного бэндаи даже е го с убъе диниц ы .
Р ис унок 2. Д иффере нц иал ь но окраш енная Х -хромос ома чел ове ка [Захаров, 1982]. П ри ц итологическом картировании изучение диффе ре нц иал ь но окраш енны х хромос ом позвол яе т обнаружить крупны е хромос омны е пе ре с трой ки путе м с равне ния ис с л е дуе мого образц ас контрол ь ны м. П риме ните л ь но к чел ове ку дл я ц итол огичес кого картирования ис пол ь зую т кл е тки пац ие нтов с хромос омны ми бол е знями. Е с л и у бол ь ного обнаруже наде л е ц ия опре де л енного учас ткаконкре тной хромос омы и в то же вре мя ус тановл е но наруш е ние функц ии какого-л ибо ге на, то очевидно, что ге н находитс я в этом учас тке . П ри ш ироком изучении хромос омны х бол е зне й появил ас ь возможнос ть пол учения набора кл е ток с де л е ц иями разной дл ины , т.е . возможнос ть с оздания п анелей клеток дляразных хромосом. 1.1.1. Г ибр идизация in situ: ISH- и FISH- гибр идизация П рямы м ме тодом картирования ге нов нахромос оме явл яе тс я ме тод гибридизац ии нукл е иновы х кис л от. В ариац ии ме тода(гибридизац ия in situ – на ме с те ): ISH (in situ hybridization) и FISH (fluorescence in situ hybridization) ис пол ь зую тс я в те х с л учаях, когдаиме ю тс я пробы , ил и зонды с изве с тны ми (с е кве нированны ми) нукл е отидны ми пос л е довате л ь нос тями. З онды – это ис кус с тве нно с инте зированны е ме чены е : радиоактивны ми изотопами (при ISH – гибридизац ии) ил и фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями – химичес ки (при FISH- гибридизац ии) не бол ь ш ие (10-30 нукл е о-
9
тидов) с е гме нты одноц е почечной Д Н К (ил и Р Н К), компл е ме нтарны е ис комому ге ну. Э ти короткие ол игонукл е отиды с ое диняю тс я тол ь ко с те м учас тком Д Н К, которы й с оде ржит пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов, с трого с оотве тс твую щ ую (компл е ме нтарную ) пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов зонда. Сл е довате л ь но, нал ичие с вязавш е й с я с Д Н К ме тки с вы с окой точнос ть ю с виде те л ь с твуе т о прис утс твии в анал изируе мом образц е ис комы х пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов. Локус ы ге нов, компл е ме нтарны е зондам, могут бы ть картированы не пос ре дс тве нно на хромос оме путе м ре гис трац ии радиоактивной ме тки (при ISH-гибридизац ии) ил и рис унку окраш е нны х фл уоре с ц е нтны м крас ите л е м пол ос (при FISH-гибридизац ии). Таким образом, гибридизац ияin situ – это ме тод вы явл е ния (картирования) опреде л е нны х учас тков мол е кул ы Д Н К напре паратах хромос ом, где пос л е де натурац ии Д Н К (путе м нагре вания ил и обработки щ е л очью ) ос ущ е с твл яе тс я е е отжиг с одноц е почечны ми компл е ме нтарны ми зондами. О тж иг – это проц е с с вос с тановл е ния (ре натурац ии) двухц е почечной мол е кул ы Д Н К из однонитчаты х пол инукл е отидны х ц е пе й путе м пос те пе нного охл ажде ния. О бразование гибридны х дупл е кс ов проис ходит тол ь ко при ус л овии компл е ме нтарнос ти ос нований ис с л е дуе мой мол е кул ы Д Н К и мол е кул ы зонда, что можно ус тановить с помощ ь ю ме тодаавторадиографии (в с л учае ISH-гибридизац ии) ил и приме не ния фл уоре с ц е нтного микрос копа(при FISH-гибридизац ии). В ы ш е названны е ме тоды ис пол ь зую тс я не тол ь ко дл я картирования хромос ом чел ове ка, но и многих животны х, а также рас те ний (наприме р, пш е ниц ы ). Какова разре ш аю щ ая с пос обнос ть данного ме тода? П ри рутинной (обы чной ) окрас ке хромос ом с амы й мал е нь кий наруш е нны й учас ток хромос омы в виде де л е ц ий ил и дупл икац ий , которы й можно разл ичить под с ве товы м микрос копом, с оде ржит 30⋅106 нукл е отидов. П риме не ние ме тодов диффе ре нц иал ь ной окрас ки хромос ом уве л ичивае т такую возможнос ть до (7… 10)⋅106 нукл е отидов. Д л я вс е х хромос ом чел ове ка пос трое ны ме л комас ш табны е ге не тичес кие карты с рас с тояние м ме жду с ос е дними марке рами 7-10 мл н. пар нукл е отидов ил и 7-10 М б (ме габаз; 1 М б=1 мл н пн). Совре ме нны е ме тоды гибридизац ии in situ с ис пол ь зование м ме тафазны х хромос ом, гл авны м образом, ме тод FISH, л окал изую т ге не тичес кие марке ры в пре де л ах 2–5 мл н пн. Бол е е того, при гибридизац ии in situ с инте рфазны ми хромос омами, в которы х ге не тичес кий мате риал находитс я в ме не е компактной форме , разре ш аю щ ая с пос обнос ть хромос омны х карт прибл ижае тс я к 100 тпн. Совре ме нны е с ве де ния о ге не тичес ких картах чел ове кас оде ржат информац ию о бол е е чем 50000 марке ров. 1.1.2. Хр омосомный пейнтинг В ц итоге не тике конц а90-х годов 20 ве капоявил ис ь новы е мощ ны е ме тоды , в ос нове которы х л е жит фл уоре с ц е нтная гибридизац ия нукл е иновы х кис л от in situ (FISH-гибридизац ия). Э то с вязано с приме не ние м новы х, бол е е эффе ктивны х фл уорохромов и нового оборудования дл я анал иза
10
микрос копичес ких изображе ний – ц ифровы х фотоаппаратов, с ое дине нны х с микрос копом и компь ю те ром (CCD-каме р) вме с то фотокаме р. О дним из наибол е е разре ш аю щ их ме тодов явл яе тс я многоц ветнаяфлуоресц ентная гибридизац ия ил и хромосомный п ейнтинг (хромос омная живопис ь ). Д л я пол учения многоц ве тны х изображе ний ис пол ь зую т разл ичны е фл уорохромы , которы ми ме тят разны е зонды Д Н К. И нформац ия об инте нс ивнос ти с ве чения каждого фл уорохромазапис ы вае тс я накомпь ю те ре отде л ь но и каждому из таких изображе ний прис ваивае тс я с вой с обс тве нны й пс е вдоц ве т. О дновре ме нное ис пол ь зование не с кол ь ких фл уорохромов позвол яе т пол учить не с кол ь ко пс е вдоц ве тов. Н априме р, е с л и фрагме нт хромос омы , окраш е нны й фл уорохромом а, буде т давать один пс е вдоц ве т, фрагме нт, окраш е нны й фл уорохромом b - другой , то фрагме нт, окраш е нны й a и b одновре ме нно, буде т давать тре тий пс е вдоц ве т. И с пол ь зование n фл уорохромов позвол яе т одновре ме нно опре де л ить л окал изац ию 2n-1 фрагме нтов Д Н К. Н априме р, приме не ние пяти фл уорохромов дае т возможнос ть анал изировать ре зул ь таты одновре ме нной гибридизац ии in situ 31 фрагме нта Д Н К. Н овая приборная базапозвол яе т ре гис трировать с ве рхс л абы е с ве товы е с игнал ы , не дос тупны е гл азу чел ове ка и с ве товы е с игнал ы с дл иной вол ны , вы ходящ ими запре де л ы видимого с ве та. П ри ис пол ь зовании тре х фл уорохромов каждую хромос ому чел ове каможно окрас ить в с вой с обс тве нны й пс е вдоц ве т. О крас ка хромос омы бол е е чем одним ц ве том с виде те л ь с твуе т о нал ичии транс л окац ии. Е с л и с де л ать библ иоте ку фрагме нтов Д Н К не из ц е л ой хромос омы , а из отде л ь ны х учас тков индивидуал ь ны х хромос ом, то можно идентифиц ировать пол оже ние этих учас тков. В нас тоящ е е вре мя в ряде диагнос тичес ких ц е нтров не которы е варианты многоц ве тной FISH ис пол ь зую тс я в качес тве рутинны х ме тодов при анал изе хромос омны х пе ре с трое к у чел ове ка. В пос л е дние годы дл я с равните л ь ного изучения ге номов разны х видов ис пол ь зуе тс я е щ е ц е л ы й ряд новы х ме тодов по пе ре кре с тной гибридизац ии Д Н К одного видас кариотипом другого. К их чис л у относ итс я ме тод Zoo-FISH (пре дл оже нны й в 1990 году). Так, с ис пол ь зование м такого ме тода у нас в с тране бы л и вы явл е ны зоны гомол огии ме жду хромос омами чел ове каи бурундука. П о с ос тоянию на1998 год в мире проводил и подобны е с опос тавл е ния набол е е чем 200 видах мл е копитаю щ их. В ре зул ь тате такой работы бы л о ус тановл е но, наприме р, что 17 хромос омачел ове каявл яе тс я дос таточно конс е рвативной и име е т пол ную гомол огию с с оотве тс твую щ ими ц е л ы ми хромос омами с винь и, бы ка, л ош ади, кош ки ил и с ц е л ы ми пл е чами хромос ом норки и тю л е ня, с отде л ь ны ми с е гме нтами хромос ом ол е ня мунжака, овц ы , ш импанзе , макаки, кита-финвал а. Д л я оц е нки ге номного дис бал анс ав кл е тках разл ичны х организмов в нас тоящ е е вре мя ш ирокое рас прос тране ние пол учил мол е кул ярноц итоге не тичес кий ме тод – CGH (Comparative Gemomic Hybridization = с равните л ь ная ге номная гибридизац ия), впе рвы е опис анны й в 1992 Кал л ионие ми с с оавторами. Е го приме няю т дл я иде нтификац ии и характе ри-
11
с тики чис л овы х и с труктурны х хромос омны х наруш е ний в кл е тках разны х ткане й при разл ичны х патол огичес ких с ос тояниях у чел ове ка, ос обе нно при ис с л е довании раковы х забол е ваний . 1.1.3. Г ибр идизация соматических клеток П ри ц итол огичес ком картировании ис пол ь зуе тс я также гибридизац ия соматических клеток. В ус л овиях кул ь туры можно пол учить с оматичес кие гибриды кл е ток чел ове каи разл ичны х гры зунов: чел ове к – мы ш ь , чел ове к – кры с а, чел ове к – хомяк. Э ти животны е л учш е изучены в ге не тичес ком отнош е нии. Так, к 2002 году бы л пол нос ть ю изучен ге ном мы ш и. О казал ос ь , что многие ге ны в геноме мы ш и гомол огичны по с труктуре ге нам чел ове ка. Н аос новании этого удал ос ь ус тановить функц ию 1200 ге нов чел ове ка. У мы ш и и других упомянуты х животны х в нас тоящ е е вре мя дос тупно значите л ь ное чис л о марке ров по ге нам, контрол ирую щ им пути ме табол изма. Такие отдал е нны е гибриды характе ризую тс я не с табил ь нос ть ю их ге номаи при размноже нии гибридны х кл е ток те ряю тс я хромос омы чел ове ка(как име ю щ ие бол е е ме дл е нны й те мп размноже ния). П оте ря хромос ом нос ит с л учай ны й характе р, и образую щ ие с я кл оны кл е ток с оде ржат ос тавш ие с я хромос омы в разны х с очетаниях. Так пол учаю т пане л и гибридны х кл е точны х кл онов, с оде ржащ их вс е го одну-две хромос омы чел ове каи пол ны й набор хромос ом другого вида. П ричем, хромос омы чел ове ка л е гко иде нтифиц ирую тс я с помощ ь ю ц итоге не тичес ких ме тодов. Э то позвол яе т ве с ти парал л е л ь ны е ис с л е дования какого-л ибо биохимичес кого признакаи хромос омного набора. Е с л и ис чезнове ние какого-л ибо признака с овпадае т с ис чезнове ние м опре де л е нной хромос омы , можно с де л ать вы вод о том, что ге н, контрол ирую щ ий этот признак, л окал изован в ис чезнувш е й хромос оме чел ове ка. Так, впе рвы е удал ос ь л окал изовать ге н тимидинкиназы в 17 хромосоме человека. Д ругой приме р. Инс ул ин чел ове ка с инте зирую т тол ь ко те гибридны е кл е тки, которы е с оде ржат 11-ую хромос ому. Сл е довате л ь но, ге н, кодирую щ ий инс ул ин, находитс я име нно в этой хромос оме . Таким образом, данны й ме тод позвол яе т ус танавл ивать группы с ц е пл е ния у чел ове ка, ис пол ь зуя же не хватки и транс л окац ии, можно вы яс нять и пос л е довате л ь нос ть рас пол оже ния ге нов, т.е . с троить ге не тичес кие карты хромос ом чел ове ка. М е тод явл яе тс я разновиднос ть ю кл ас с ичес кого ге не тичес кого анал иза. Е го ограничение – можно картировать тол ь ко биохимичес кие признаки. 1.2. Генет и ческ ое к арт и ровани е Г енетические карты – это карты -с хе мы взаимного рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на индивидуал ь ны х хромос омах, т.е. находящ ихс я в одной группе с ц е пл е ния. Таким образом, пе рвоначал ь ны й этап картирования – это пос трое ние ге не тичес ких карт с ц е пл е ния. И х с троят наос нове данны х о час тоте с овме с тного нас л е дования двух ил и бол е е признаков организма, которы е и с л ужат генетическими маркерами.
12
П од ге не тичес ким маркером понимаю т л ю бой нас л е дуе мы й фе нотипичес кий признак, дос тупны й дл я иде нтификац ии те м ил и ины м с пос обом (ге н, мутац ия, учас ток Д Н К с не опре де л е нной функц ие й , точкарас щ епл е ния Д Н К фе рме нтами – ре с триктазами, не транс крибируе мы е повторяю щ ие с я пос л е довате л ь нос ти разл ичной дл ины , мобил ь ны е ге не тичес кие эл е ме нты и т.д.). Ус тановл е ние л окал изац ии какого-л ибо марке рапозвол яе т ис пол ь зовать е го дл я опре де л е ния пол оже ния другого марке ра. М арке ры , вы бранны е дл я картирования, дол жны бы ть п олиморфными, т.е . дол жны с ущ е с твовать ал ь те рнативны е формы признака, которы е можно бы л о бы л е гко отл ичить и опис ать у отде л ь ны х ос обе й . Д вамарке ра, рас пол оже нны е наодной хромос оме вбл изи друг друга, име ю т те нде нц ию пе ре давать с я от родите л е й потомкам с овме с тно. Соотве тс тве нно с овме с тно пе ре даю тс я и контрол ируе мы е такими марке рны ми ге нами признаки. Че м бл иже рас пол оже ны марке ры друг к другу, те м “те с не е ” они с ц е пл е ны , те м ме не е ве роятно, что проц е с с крос с ингове ра разде л ит их. О нал ичии групп с ц е пл е ния те х ил и ины х ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) у рас те ний и животны х с удят по ре зул ь татам гибридизац ии организмов: час тоте с овме с тного нас л е дования марке ров. Е с л и два марке ра нас л е дую тс я вме с те , то они относ ятс я к одной группе с ц е пл е ния. О рас с тоянии ме жду ге нами в той ил и иной группе с ц е пл е ния – по ве л ичине крос с ингове ра. Е диниц е й рас с тояния ме жду ге нами с л ужит 1% крос с ингове ра(ил и 1с М – с антиморган). Когдачас тотаре комбинац ии ме жду двумя ге нами (ил и марке рами) равна 1%, это значит, что они находятс я на рас с тоянии 1с М . Ге не тичес кое рас с тояние в 1с М приме рно равно физичес кой протяже ннос ти в 1 мл н. пн – 1 М б (ме габазе ). О бщ ая дл инаге номачел ове кав этих е диниц ах с ос тавл яе т окол о 3200 с М . П ринц ипы ге не тичес кого картирования бы л и впе рвы е разработаны Т. М органом. И м же бы л а с ос тавл е на пе рвая ге не тичес кая карта Х хромос омы дрозофил ы , ос нованная научете час тоты образования крос с ове рны х и не крос с ове рны х гаме т у с амок, ге те розиготны х по ре ц е с с ивны м мутац иям, л окал изованны м в Х -хромос оме . Так, в ме й озе ге те розиготны х с амок крос с ингове р ме жду ге нами y (же л тое те л о) и w (бе л ы е гл аза) проис ходил в 1,5% с л учае в, ме жду ге нами w и m (миниатю рны е кры л ь я) – 34,5%, аме жду ге нами y и m – 36% с л учае в. Э то показал о, что данны е ге ны относ ятс я к одной группе с ц е пл е ния и рас пол агаю тс я в порядке y - w – m (рис унок3). Ге не тичес кие карты с ц е пл е ния правил ь но отражаю т порядок рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на хромос омах, однако рас с тояния ме жду ними име ю т относ ите л ь ны е значения, т.е . не с оотве тс твую т ре ал ь ны м физичес ким рас с тояниям. Э то с вязано с те м, что час тота крос с ингове раможе т ме нять с я от ус л овий с ре ды : те мпе ратуры , радиац ии, возрас та, питания. Э ффе ктивнос ть ре комбинац ии подавл енав ге те рохроматиновы х учас тках хромос ом. С другой с тороны , в хромос омах час то вс тре чаю тс я "горячие точки" ре комбинац ии. И с пол ь зование час тот ре комбина-
13
ц ии дл я пос трое ния физичес ких ге не тичес ких карт бе з учетаэтих факторов буде т приводить к ис каже ниям (с оотве тс тве нно заниже нию ил и завы ш е нию ) ре ал ь ны х рас с тояний ме жду ге не тичес кими марке рами. Таким образом, ге не тичес кие карты с ц е пл е ния явл яю тс я наиме не е точны ми из вс е х име ю щ ихс я типов ге не тичес ких карт, и их можно рас с матривать тол ь ко в качес тве пе рвого прибл иже ния к ре ал ь ны м физичес ким картам. Те м не ме не е , напрактике име нно они и тол ь ко они позвол яю т л окал изовать с л ожны е ге не тичес кие марке ры (наприме р, ас с оц иированны е с с имптомами забол е вания) на пе рвы х этапах ис с л е дования и даю т возможнос ть их дал ь не й ш е го изучения. y 0,0
w
m
1,5 1,5%
36,0 34,5% 36%
Р ис унок 3. Лине й ное рас пол оже ние ге нов в Х -хромос оме дрозофил ы , ус тановл е нное Т. М органом с помощ ь ю крос с ингове ра [Д убинин, 1985]: y – же л тое те л о, w – бе л ы е гл аза, m – мал е нь кие кры л ь я Кл ас с ичес кие ме тоды изучения групп с ц епл е ния, разработанны е на дрозофил е , не приме нимы дл я чел ове ка из-за не возможнос ти прове де ния прямы х с кре щ иваний . П оэтому до начал а70-х гг. XX ве кау чел ове кабы л и изве с тны л иш ь три аутос омны е и Х -хромос омная группы с ц е пл е ния. П е рвы й ге н чел ове ка(ге н ц ве товой с л е поты ) бы л картирован наХ -хромос оме в 1911 году, апе рвы й аутос омны й ге н – тол ь ко в 1968 г. Ге не тичес кие карты хромос ом чел ове кас троят наос новании изучения родос л овны х. В ме с то гибридол огичес кого ме тода (ме тода с кре щ иваний ) в данном с л учае дл я изучения нас л е дования признаков у чел ове каис пол ь зую т ге не ал огичес кий ме тод (ме тод родос л овны х). К 1973 г. нахромос омах чел ове кабы л о картировано 64 ге на, к1994г. – 5000 с труктурны х ге нов и с вы ш е 60 000 марке рны х Д Н Кпос л е довате л ь нос те й . Стол ь с тре мите л ь ны й прогре с с с картирование м ге нов чел ове ка с вязан с появл е ние м новы х те хнол огий в ц итоге не тике , в кл е точны х кул ь турах и ос обе нно в мол е кул ярной ге нетике . П о данны м В .А . М аккь ю с ика, до конц а1990 г. дл я пос трое ния ге не тичес ких карт с ц е пл е ния чел ове канаибол е е час то ис пол ь зовал ис ь ме тоды : гибридизац ия с оматичес ких кл е ток (1148 картированны х л окус ов), гибридизац ия in situ (687 л окус ов) и с е ме й ны й ге не тичес кий анал из с ц е пл е ния (466 л окус ов). В пос л е дне м с л учае вы явл яе тс я с вязь (с ц е пл е ние ) ме жду с имптомами забол е вания, вы зы вае мого мутац ие й в не изве с тном ге не , и другими ге не тичес кими марке рами.
14
Традиц ионно с ос тавл е ние карт с ц е пл е ния ге нов завис е л о от иде нтификац ии мутац ий по их эффе ктам на признаки, такие как ц ве т гл аз, ц ве т вол ос , форманос а, уш е й , группы крови и др. Гл авное при этом – нал ичие л е гко вы явл яе мы х ме жиндивидуал ь ны х разл ичий рас с матривае мы х марке ров. О днако таких морфол огичес ких марке ров с равните л ь но не много, бол ь ш ая час ть из них опре де л яе мы х многими ге нны ми л окус ами и с вязь ме жду ними и важны ми дл я ме диц ины признаками, такими как нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове каил и хозяй с тве нно ц е нны е признаки у рас те ний и животны х прос л е живае тс я с л або. П оэтому пос л е дние де с ятил е тия значите л ь ное рас прос тране ние пол учил и так назы вае мы е молекулярные маркеры. Так, изве с тно окол о 50 бе л ковы х (изозимны х) марке ров, с помощ ь ю которы х у рядаобъе ктов удал ос ь с оздать карты с ц е пл е ния ге нов. Н о поис тине не ограниченны е возможнос ти дл я картирования ге номов появил ис ь с ис пол ь зование м молекулярных маркеров Д Н К , позвол яю щ ие изучать е с те с тве нны й пол иморфизм науровне пос л е довате л ь нос те й Д Н К. 1.3. М олек улярные марк еры ДНК и и х и спользовани е для генет и ческ ого к арт и ровани я В чем же ос новны е пре имущ е с тва ис пол ь зования мол е кул ярны х марке ров Д Н К? 1. В озможнос ть ис с л е дования вс е го ге нома (с уммарной ге не тичес кой информац ии), а не тол ь ко кодирую щ е й Д Н К (бе л окс инте зирую щ ие пос л е довате л ь нос ти), с ос тавл яю щ е й у рас те ний и мл е копитаю щ их не бол е е 5-10% от вс е го разме ра ге нома. Т.е . марке рами могут бы ть как экс пре с с ируе мы е учас тки Д Н К (ге ны ), так и не кодирую щ ие пос л е довате л ь нос ти, нас л е дование которы х можно прос л е дить . 2. П ол иморфизм Д Н К можно опре де л ить нал ю бой с тадии онтоге не за, в л ю бы х час тях рас те ния (пос кол ь ку проявл е ние мол е кул ярны х марке ров не явл яе тс я ткане с пе ц ифичны м). 3. П роявл е ние бол ь ш инс тва мол е кул ярны х марке ров не й трал ь но по отнош е нию к фе нотипу; многие из ис пол ь зуе мы х в нас тоящ е е вре мя марке ров име ю т кодоминантное нас л е дование (это позвол яе т разл ичать гомо[А А ] и ге те розиготы [А а], рас познавать родите л ь с кие формы ) и с табил ь но с охраняю тс я в потомс тве , что дае т возможнос ть отне с ти их к чис л у наде жны х ге не тичес ких марке ров. 4. О с новны м с вой с твом мол е кул ярны х марке ров Д Н К явл яе тс я их с трогая видо- и ге нос пе ц ифичнос ть , что позвол яе т проводить иде нтификац ию отде л ь ны х видов, с ортов, кл онов. П оявл е ние мол е кул ярны х марке ров Д Н К дал о мощ ны й с тимул дл я картирования ге не тичес ких л окус ов, отве тс тве нны х запрос ты е менде л е вс кие признаки, в час тнос ти, приме ните л ь но к ге не тике чел ове казаН ЗЧ. К нас тоящ е му вре ме ни уже картировано не с кол ь ко с от Н ЗЧ, нас л е дуе мы х по ме нде л е вс кой с хеме .
15
1.3.1. ПД РФ –мар кер ы ПД Р Ф (полимор физм длин р естр икционных фр агментов Д Н К , restriction fragments length polymorphism – RFLP). Бы л о ус тановл е но, что ге не тичес ким марке ром може т бы ть л ю бое ме с то в ге номе , где произош л о изме не ние в пос л е довате л ь нос ти Д Н К, которое обнаруживае тс я как внутре нне е разл ичие ме жду индивидами в попул яц ии, но никаких вне ш них (фе нотипичес ких) разл ичий ме жду ними при этом не набл ю дае тс я. У бакте рий ус тановл е н и вы де л е н ц е л ы й ряд фе рме нтов – рестриктаз, которы е узнаю т с пе ц ифичес кие пос л е довате л ь нос ти в мол е кул е Д Н К (обы чно с ос тавл яю щ ие 4-6 нукл е отидов) и разре заю т двой ную с пирал ь внутри ил и вбл изи с ай таузнавания, в ре зул ь тате чего образую тс я ре с трикц ионны е фрагме нты , ил и ре с трикты . О тс утс твие с ай таузнавания може т бы ть с вязано с де л е ц ие й , инс е рц ие й ил и заме ной нукл е отидов. Сл е довате л ь но, л ю бая мутац ия, изме няю щ ая пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов с ай та ре с трикц ии, уничтожае т этот с ай т (рис унок4). сайты р естр икции му тация в сайте р естр икции
обр азу ется 3 фр агмента
обр азу ется 2 фр агмента Р ис унок4. М утац ия в с ай те ре с трикц ии приводит кизме не нию чис л а и дл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К П ол ное рас щ е пл е ние анал изируе мой ге номной Д Н К отде л ь ны ми ре с триктазами приводит к образованию опре де л е нного набора фрагме нтов Д Н К, чис л о и разме ры которы х с оотве тс твую т рас пол оже нию с ай тов ре с трикц ии. Гибридизац ия по Саузе рну позвол яе т опре де л ять разме ры и взаимное рас пол оже ние ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К пос л е их эл е ктрофоре тичес кого разде л е ния. П ри нал ичии мутац ии в одном из с ай тов ре с трикц ии этот с ай т ос тае тс я не рас щ е пл е нны м пос л е заве рш е ния ре с трикц ии, что приводит к с л иянию с ос е дних ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, разде л яе мы х мутантны м с ай том, и образованию фрагме нта Д Н К бол ь ш е го разме ра (рис унок 4). В ре зул ь тате дл ина ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, с оде ржащ их мутантны е с ай ты , може т ме нять с я (с тановитс я пол иморфной ), что четко вы явл яе тс я при с равне нии Д Н К из разны х ис точников ме тодом П Д Р Ф .
16
Е с л и какой -л ибо нормал ь ны й ге н отл ичае тс я от повре жде нного тол ь ко по отс утс твию ил и нал ичию с ай та узнавания, то такие разл ичия можно обнаружить по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов. Т.е . л ю бы е изме не ния (и/ил и разл ичия) в нукл е отидном с ос таве в точках, которы е “узнаю тс я” ре с триктазами, приводящ ие к ис чезновению одних и образованию других с ай тов-ре с трикц ии, проявятс я в виде изме не ния дл ины ре с трикц ионного фрагме нта Д Н К. Э то с разу вы явл яе тс я при эл е ктрофоре зе по изме не нию пол оже ния фрагме нтаД Н К (по с равне нию с контрол е м ил и другим ге нотипом), е го ис чезнове нию ил и появл е нию нового. М е тод бы л де тал ь но опис ан Ботш те й ном с с оавт. в 1980 г. Р азл ичия по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К пол учил и название п олиморфизм длины рестрикц ионных фрагментов (П Д РФ ил и RLFP). Такие учас тки можно привязать к хромос оме , как ге ны , ос обе нно в те х с л учаях, когда изве с тны е гены с ц е пл е ны с ними, т.е . най ти ме с топол оже ние таких фрагме нтов нахромос оме . М е тод П Д Р Ф ш ироко ис пол ь зуе тс я в ге не тичес ких ис с л е дованиях попул яц ий , пос кол ь ку нал ичие в ге номе ис с л е дуе мого организмаре с трикц ионного фрагме нтаД Н К опре де л е нной дл ины явл яе тс я пре крас ны м ге не тичес ким марке ром и одновре ме нно фе нотипичес ким признаком, те с но с вязанны м с ге нотипом организма. Э то позвол яе т л е гко с л е дить зарас прос тране ние м такого марке рав попул яц иях, запе ре дачей е го от родите л е й к потомс тву при с кре щ иваниях и ис пол ь зовать дл я пос трое ния ге не тичес ких карт ис с л е дуе мы х организмов, в том чис л е чел ове ка. Д л я анал иза бе рут пробы крови у чл е нов не с кол ь ких с е ме й , пре дс тавл е нны х 2-3 покол е ниями, л ибо у чл е нов одной бол ь ш ой с е мь и, пре дс тавл е нной не с кол ь кими покол е ниями, с данны м ге не тичес ким забол е вание м. С помощ ь ю П Д Р Ф марке ров бы л и картированы ге ны таких забол е ваний , как миодис трофия Д ю ш е на, муковис ц идоз и др. М е тод П Д Р Ф ис пол ь зую т дл я пре натал ь ной диагнос тики и вы явл е ния ге не тичес ких де фе ктов у л ю де й . Н априме р, в с л учае с е рповиднокл е точной ане мии проис ходит заме на А Т на ТА в ш е с той паре нукл е отидов ге на, кодирую щ е го β-ц е пь ге могл обина чел ове ка. Заме на проис ходит в с ай те (CTNAG), чувс твите л ь ном к ре с триктазе DdeI (рис унок 5). Ф рагме нты Д Н К, возникаю щ ие под де й с твие м DdeI у здорового чел ове каи бол ь ного с ерповиднокл е точной ане мие й в этом учас тке ге на разл ичаю тс я. Их можно с равнивать с помощ ь ю ме тодагибридизац ии по Саузе рну, ис пол ь зуя в качес тве зонда радиоактивно меченую Д Н К ге на β-гл обина. Таким с пос обом можно опре де л ить прис утс твие мутантного ге на в ге номе эмбрионазане с кол ь ко ме с яц е в до рожде ния. 1.3.2. М олеку ляр ныемар кер ы, основанныена полимер азной цепной р еакции (ПЦ Р -мар кер ы) В пос л е дние годы , однако, дл я ге номны х анал изов с тал и ис пол ь зовать пре имущ е с тве нно мол е кул ярны е марке ры Д Н К, ос нованны е нап олимеразной ц еп ной реакц ии (П Ц Р = PCR – polymerase chain reaction). Д л я них
17
дос таточно мал ого кол ичес тваис ходного мате риал а, и в отл ичие от П Д Р Ф не тре буе тс я ни кл онирования, ни с е кве нирования. Т.е . те хникаанал изов, ос нованны х наП Ц Р , прощ е и пригоднадл я автоматизац ии, авы явл яе мы й пол иморфизм значите л ь не е . A. Н ормал ь ная и мутантная пос л е довате л ь нос ть аминокис л от (кодоны 5,6 и 7) и с оотве тс твую щ ие им пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в Д Н К Н ормал ь ная β-ц е пь
Pro – Glu – Glu CCT GAG GAG GGA CTC CTC
Се рповидноКл е точная β-ц е пь
Pro – Val – Glu CCT GTG GAG GGA CAC CTC
Сай т ре с трикц ии DdeI подчеркнут
Б. Локал изац ия DdeI – с ай тов наре с трикц ионной карте учас ткаге наβц е пи ге могл обиначел ове ка: нормал ь ного (β) и мутантного ( β ) 175 201 88 β
89
β
89
S
S
376
88
В . Р азме ры DdeI –ре с триктов Д Н К из нормал ь ны х кл е ток(ββ) и кл е ток, S S гомозиготны х по мутац ии с е рповиднокл е точной ане мии ( β β ), опре де л е нны е с помощ ь ю радиоактивного зонда S S ββ β β
376
201 175
Р ис унок5. И с с л е дование мутац ии с е рповиднокл е точной ане мии наос нове анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К (П Д Р Ф ) [А й ал а, 1987].
18
Пр инципы метода ПЦ Р . Те хникаампл ификац ии фрагме нтов Д Н К с помощ ь ю пол име разной ц епной ре акц ии, которая ре вол ю ц ионизировал а с ущ е с твую щ ие ме тоды мол е кул ярного анал изаге номов, бы л апре дл оже на в 1985 г. Кэри М ю л л ис ом, заразработку которой в 1993г. е му бы л априс ужде наН обе л е вс кая пре мия. П ол име разная ц е пная ре акц ия имитируе т природны й проц е с с вос произве де ния (удвое ния) Д Н К – ре пл икац ию , проис ходящ ую на матричной ос нове (по принц ипу компл е ме нтарнос ти) с учас тие м фе рме нтаД Н К-пол име разы . Н о е с л и во вре мя ре пл икац ии удваивае тс я вс я Д Н К, то при П Ц Р – проис ходит многократное копирование (вос произве де ние , ампл ификац ия) л иш ь инте ре с ую щ е го ис с л е довате л я с пе ц ифичес кого, не бол ь ш ого фрагме нта, рас пол оже нного ме жду двумя прай ме рами. Компл е ме нтарное дос траивание ните й начинае тс я в опре де л е нны х с тартовы х точках, пол оже ние которы х опре де л яе тс я затравками = прай ме рами. П раймеры – с инте тичес кие ол игонукл е отиды , вкл ю чаю щ ие окол о 20 нукл е отидов, кажды й из которы х компл е ме нтаре н и буде т гибридизировать с я с одной из двух ц е пе й на противопол ожны х конц ах подл е жащ е го ампл ификац ии фрагме нтаД Н К. П рай ме ры орие нтированы таким образом, что с инте з Д Н К проис ходит тол ь ко ме жду ними, т.к. затравки компл е ме нтарны пос л е довате л ь нос тям Д Н К на л е вой и правой границ е ампл ифиц ируе мого фрагме нта. 3’-конц ы прай ме ров направл е ны навс тре чу друг другу на ампл ифиц ируе мы й учас ток (Д Н К-миш е нь ). Т.е . прай ме ры как бы “запираю т” с двух с торон фрагме нт, которы й дол же н бы ть многократно удвое н (рис унок6). О ткры тие те рмос табил ь ной Д Н К-пол име разы (Taq - пол име разы ) у обитаю щ их в горячих ис точниках бакте рий Thermis aquaticus, позвол ил и с де л ать проц е с с ампл ификац ии Д Н К ц икл ичес ким и ис пол ь зовать е го дл я работы in vitro. Э тот проц е с с автоматизирован и ос ущ е с твл яе тс я с помощ ь ю с пе ц иал ь ного прибора (те рмоц икл е ра =ампл ификатора), которы й по заданной экс пе риме нтатором программе проводит с е рию многократно повторяю щ ихс я ц икл ов (20-30 ц икл ов) и ос ущ е с твл яе т бы с трую с ме ну те мпе ратур. Кажды й ц икл П Ц Р вкл ю чае т три кратковре ме нны х этапа, проте каю щ их в разл ичны х те мпе ратурны х ре жимах (рис унок6). 1 этап. Д е натурац ия Д Н К. Кратковре ме нное нагре вание нативной Д Н К приводит к изме не нию е е физико-химичес ких с вой с тв, в час тнос ти, вязкос ти, проис ходит разруш е ние водородны х с вязе й , с ое диняю щ их компл е ме нтарны е ц е пи, и разъе дине ние ц е пе й ис ходной мол е кул ы Д Н К. В таком с ос тоянии каждая ц е почка може т с л ужить матриц е й дл я ре пл икац ии. П роте кае т при 93-950С в те чение 30-40 с е к. 2 этап. П рис ое дине ние прай ме ров (отжиг) при охл ажде нии ре акц ионной с ме с и. П рис ое дине ние прай ме ров проис ходит компл е ме нтарно к с оотве тс твую щ им пос л е довате л ь нос тям на противопол ожны х ц е пях Д Н К награниц ах с пе ц ифичес кого учас тка. Д л я каждой пары прай ме ров с ущ е с т-
19
вуе т с воя те мпе ратураотжига, значения которой рас пол агаю тс я в инте рвал е 50 - 650С. В ре мя отжига20-60 с е к.
Р ис унок6. Схе мапол име разной ц е пной ре акц ии [М ю л л ис , 1990] 3 этап. Синте з Д Н К (эл онгац ия). С учас тие м термос табил ь ной Д Н Кпол име разы (Taq-пол име раза) проис ходит избирате л ь ны й с инте з (копирование ) учас тка Д Н К, рас пол оже нного ме жду двумя прай ме рами. А мпл ификац ия проис ходит в том с л учае , е с л и рас с тояние ме жду прай ме рами находитс я в пре де л ах 50-4000 ос нований . Синте з Д Н К иде т от 5’ к 3’-е му конц у в обоих направл е ниях, начиная с учас тков прис ое дине ния прай ме ров. Т.е . наращ ивание прай ме ров проис ходит навс тре чу друг другу. М ате риал ом дл я с инте за новы х ц е пе й Д Н К с л ужит добавл яе мая в буфе рны й рас твор с ме с ь четы ре х де зокс ирибонукл е отидтрифос фатов (дН ТФ ). П ро-
20
ц е с с проис ходит при те мпературе 70-720С. В ре мя проте кания с инте за– 2040 с е к. (рис унок6). Р ас твор с пол ученны ми копиями Д Н К с новаподогре ваю т дл я начал а нового ц икл а ампл ификац ии, при котором тол ь ко что с инте зированны е фрагме нты Д Н К (ампл иконы ) с л ужат матриц е й дл я с инте зановы х ц е пе й . Т.е . в каждом ц икл е чис л о ампл ифиц ируе мы х фрагме нтов Д Н К удваивае тс я. О бщ е е их кол ичес тво може т бы ть вы чис л е но по формул е 2n, где n – чис л о ц икл ов ампл ификац ии. П оэтому, даже е с л и в ис ходном рас творе пе рвоначал ь но находил ас ь тол ь ко однадвухц е почечная мол е кул аД Н К, то за 30-40 ц икл ов ампл ификац ии с инте зируе тс я окол о 1 мл рд. (108) копий фрагме нтов = ампл иконов, что по вре ме ни занимае т 3-4 час а. Т.е . ис пол ь зуя очень не бол ь ш ое , с л е довое кол ичес тво матричной Д Н К (не с кол ь ко нанограммов), можно пол учить мил л ионы копий не обходимой Д Н К, что де л ае т возможны м визуал ь ны й учет ре зул ь татов пос л е ге л ь -эл е ктрофоре за и не тре буе т гибридизац ии с радиоактивны м зондом. П Ц Р позвол яе т ампл ифиц ировать л ю бы е инте ре с ую щ ие учас тки ге нома (дл иной до 4 ты с . п.н.) с ис пол ь зование м с пе ц ифичны х ил и произвол ь ны х (с л учай ны х) прай ме ров. П Ц Р -марке ры разл ичаю тс я дл иной ампл ифиц ированной пос л е довате л ь нос ти. Д л я опре де л е ния разме ра пол ученны х П Ц Р -фрагме нтов (П Ц Р -продуктов) их разде л яю т с помощ ь ю ге л ь эл е ктрофоре за. О пол иморфизме Д Н К организмов с удят по прис утс твию ил и отс утс твию пол ос ы в каждом п аттерне (рис унке рас пол оже ния пол ос ) при эл е ктрофоре тичес ком разде л е нии фрагме нтов Д Н К, их окрас ке и фотографировании в УФ с ве те . Такие разл ичия в патте рне могут бы ть с вязаны с де л е ц иями ил и инс е рц иями в ампл ифиц ируе мом фрагме нте . Бл агодаря бол ь ш ой информативнос ти и экономичнос ти, возможнос ти дос таточно бы с трого изучения многочис л е нны х вы борок и л окус ов (100-1000 л окус ов против 10-20 л окус ов ал л озимов), ме тод П Ц Р -анал изас приме не ние м разл ичны х мол е кул ярны х Д Н К-марке ров в нас тоящ е е вре мя ш ироко ис пол ь зую тс я в ге не тичес ких ис с л е дованиях. М е тод П Ц Р л е жит в ос нове картирования разл ичны х ге номов, Д Н К-иде нтификац ии л ичнос ти, ус тановл е ния родс тва л ю де й , в с уде бной ме диц ине (пос кол ь ку позвол яе т проводить ге не тичес кую “дактил ос копию ” по одной е динс тве нной кл е тке , диагнос тики нас л е дс тве нны х (вы явл е ние мутантны х ге нов), а также инфе кц ионны х забол е ваний бакте риал ь ной и вирус ной природы (обнаруже ние ге не тичес кого мате риал апатоге нны х микроорганизмов в кл иничес ких образц ах). Н априме р, данны й ме тод ис пол ь зуе тс я дл я диагнос тики бе с с имптомного нос ите л ь с твавозбудите л е й инфе кц ионного забол е вания - вирус а иммуноде фиц ита чел ове ка (В И Ч), которы е в л ате нтной с тадии инфе кц ии могут прис утс твовать в организме чел ове ка л иш ь в не бол ь ш ом чис л е копий . Д ругой приме р. С.А . Бул атом (одним из пе рвы х приме нивш их в наш е й с тране ме тод П Ц Р дл я иде нтификац ии грибов и анал изаих ге не тичес кой изме нчивос ти) бы л и с конс труированы ге нос пе ц ифичны е прай ме ры
21
(обозначенны е как Cs5), ампл ифиц ирую щ ие тол ь ко фрагме нты Д Н К, с пе ц ифичны е дл я патоге нного гриба ячме ня и пш е ниц ы Cochliobolus sativus, что позвол яе т вы явл ять ус той чивы е кданному грибу рас те ния (рис унок7).
Р ис унок 7. И л л ю с трац ия приме не ния П Ц Р -анал иза с о с пе ц ифичны ми прай ме рами дл я диагнос тики патоге нного дл я ячме ня и пш е ниц ы гриба Cochliobolus sativus [Бул ат, 1996]: А мпл ифиц ированны й фрагме нт с трого с пе ц ифичен дл я C. sativus. Ш е с ть пе рвы х дороже к - в ис с л е дуе мы х образц ах прис утс твуе т Д Н К патоге на, четы ре пус ты х дорожки – ус той чивы е к данному патоге ну рас те ния. П о краям (М ) – марке р мол е кул ярны х мас с (эл е ктрофоре з марке рны х макромол е кул с изве с тны ми мол е кул ярны ми мас с ами: Д Н К фагал ямбда, рас щ е пл е нная Hind III, и Д Н К пл азмиды pBR322, рас щ е пл е нная Alu I).
Н арис унке 8 приве де н приме р ис пол ь зования ме тодаП Ц Р -анал изаи анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ) в криминал ис тике . О бл ас тями ис пол ь зования мол е кул ярны х марке ров Д Н К в прикл адной ге не тике , с е л е кц ии и с еме новодс тве с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ний явл яю тс я: оц е нка ге не тичес кого разнообразия кул ь турны х рас те ний и их дикорас тущ их с ородичей , пас портизац ия и комме рчес кая с е ртификац ия ц е нны х ге нотипов, ре конс трукц ия родос л овны х, ре ш е ние с порны х вопрос ов такс ономии, подбор родите л ь с ких пар и оц е нкапотомс тваи др. В завис имос ти от природы прай мера(с пе ц ифичны й , пол ус пе ц ифичны й , произвол ь ны й =с л учай ны й ) и с пос оба иде нтификац ии продуктов ампл ификац ии разл ичаю т не с кол ь ко ме тодов и марке ров П Ц Р - анал иза. О с тановимс я намол е кул ярны х марке рах, которы е наибол е е ш ироко ис пол ь зую тс я дл я вы явл е ния ге не тичес кого пол иморфизмаи картирования ге номаживотны х, чел ове ка, рас те ний и микроорганизмов.
22
Р ис унок 8. П риме не ние ме тодаП Ц Р -анал изаи анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ) в криминал ис тике [Кол ь ман, 2004]: Д л я пол учения “ге не тичес кого отпе чатка” : 1)Д Н К-фрагме нт, вы де л е нны й из кл е тки подозре вае мого и с оде ржащ ий ис с л е дуе мую пос л е довате л ь нос ть ампл ифиц ирую т с помощ ь ю П Ц Р , 2) разре заю т подходящ е й ре с триктазой , 3) фрагме нты разде л яю т ге л ь -эл е ктрофоре зом, 4) с пе ц ифичес кий фрагме нт вы явл яю т с помощ ь ю зонда. Р е с трикц ионная карта образц а Д Н К, вы де л е нной из ткани, най де нной на ме с те пре с тупл е ния, четко с овпадае т с пробой , взятой у подозре вае мого 2, ане у подозре вае мого 1.
К чис л у таких марке ров, ос нованны х на П Ц Р , относ ятс я RAPD марке ры и микрос ате л л иты . RAPD-мар кер ы – РА ПИ Д (random amplified polymorphic DNA= RAPD-PCR - с л учай но ампл ифиц ированная пол иморфная Д Н К). П ри не обходимос ти ампл ификац ии ге на, ил и фрагме нта Д Н К с изве с тной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю ис пол ь зую т два ге нос пе ц ифичны х прай ме ра, фл анкирую щ их (ограничиваю щ их) нужную пос л е довате л ь нос ть . В этом с л учае прямой прай ме р с оотве тс твуе т по нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти начал у нужного ге на, а обратны й компл е ме нтаре н второй ц е пи в конц е этого ге на. Таким образом можно ис с л е довать пол и-
23
морфизм конкре тны х л окус ов, дл я которы х хотя бы час тично изве с тная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . И с пол ь зование таких марке ров бы л о рас с мотре но вы ш е (рис . 6-8). М е тодикаП Ц Р позвол яе т ампл ифиц ировать Д Н К из л ю бого учас тка ге нома, в том чис л е фрагме нты Д Н К с не изве с тной (анонимной ) нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю (при ис пол ь зовании RAPD-марке ров). П ри RAPD-ме тоде ис пол ь зую т с тандартны е наборы прай ме ров – с л учай ны е (произвол ь ны е ) прай ме ры . И с пол ь зование ол игонукл е отидны х прай ме ров произвол ь ной с труктуры ос новано натом, что в бол ь ш их ге номах дл я них име ю тс я множе с тве нны е с ай ты пос адки, а с л е довате л ь но, и иниц иац ии П Ц Р . В этом с л учае ис пол ь зуе тс я, как правил о, тол ь ко один прай ме р и ампл ифиц ирую тс я учас тки ме жду этим прай ме ром и е го обратной (инве ртированной ) пос л е довате л ь нос ть ю . П рай ме р с вязы вае тс я с ге номной Д Н К в двух разл ичны х учас тках – инве ртированны х повторов (ип). И нвертированны е повторы – это учас тки мол е кул ы Д Н К, двас е гме нтакоторы х име ю т одинаковую нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть , но противопол ожную е е орие нтац ию . C A G G A C A G A ... A G A C T G T C C T G T C T ... T О бы чно ис пол ь зую тс я произвол ь ны е прай ме ры из 10 нукл е отидов, с оде ржащ ие не ме не е 50% GC. ТаккакпараG-C с оде ржит три водородны х с вязи, апараA-T – тол ь ко две , гибрид “Д Н К-прай ме р” , с оде ржащ ий ме не е 50% GC, пл авитс я до того, как пол име раза начинае т пол име ризац ию и продукты ампл ификац ии в этом с л учае не образую тс я. П родукты RAPDП Ц Р пре дс тавл яю т с обой анонимную пос л е довате л ь нос ть Д Н К, закл ю ченную ме жду двумя инве ртированны ми повторами, разной дл ины . Их вы явл яю т ге л ь -эл е ктрофоре зом (как прис утс твие ил и отс утс твие отде л ь ной RAPD-пол ос ы ). RAPD-марке ры явл яю тс я вы с окоинформативной характе рис тикой дл я оц е нки ге не тичес кого разнообразия и родс тва. Типичная с хе маме тодаRAPD-П Ц Р пре дс тавл е нанарис унке (рис унок9). Н а рис унке 10 пре дс тавл е н приме р эл е ктрофоре граммы продуктов П Ц Р с ис пол ь зование м униве рс ал ь ного (произвол ь ного) прай ме ра. Д л я не которы х RAPD-марке ров ус тановл е нас вязь с ге нами ус той чивос ти к забол е ваниям. Н а с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ниях показана возможнос ть ис пол ь зования RAPD-марке ров в с е л е кц ии наге те розис : дл я оц е нки ге не тичес кого разнообразия ис ходны х инбре дны х л иний и подбора родите л ь с ких пар дл я с оздания вы с окоге те розис ны х гибридов и др. О дним из не дос татков RAPD-марке ров явл яе тс я их доминантное (а не кодоминантное ) нас л е дование . Считаю т, что в F2 доминантны е маркеры даю т в 2 раза ме нь ш е информац ии, чем кодоминантны е . Э ти не дос татки RAPDмарке ров пре одол е ваю т с помощ ь ю ме тодов, занимаю щ их проме жуточное пол оже ние ме жду П Д Р Ф - П Ц Р - анал изом. Сре ди них ос обы й инте ре с пре дс тавл яю т AFLP-марке ры .
24
Р ис унок9. Схе маRAPD – П Ц Р [Weising, 1995].
25
П ри AFLP-ме тоде ампл ификац ии подве ргаю т заране е вы бранны е пос л е довате л ь нос ти ге нома, наприме р, ре с трикц ионны е фрагме нты ге номас опре де л е нной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю .
Р ис унок 10. И л л ю с трац ия приме не ния П Ц Р -анал иза с униве рс ал ь ны м (произвол ь ны м) прай ме ром А А 2 дл я идентификац ии микроорганизмов: П Ц Р -профил и разны х видов грибов родаCochliobolus [Бул ат, 1996]: П Ц Р - продукты , будучи разде л е нны ми ге л ь -эл е ктрофоре зом в виде с пе ктров-патте рнов ампл ифиц ированной Д Н К, с пе ц ифичны дл я каждого вида организма. Каждая дорожка пре дс тавл яе т отде л ь ны й вид гриба. Д орожки по краям ге л я (М ) – марке ры мол е кул ярны х мас с (Д Н К фагал ямбда, рас щ е пл е нная Pst1).
Н овы е возможнос ти дл я картирования ге номавозникл и с откры тие м пол иморфизмав с трое нии мол чащ их учас тков Д Н К, которы е в ге номе чел ове ка, наприме р, с ос тавл яю т бол е е 90%. Э то так назы вае мая с ате л л итная Д Н К. 1.3.3. М икр осателлиты и минисателлиты как молеку ляр ныемар кер ы Р азновиднос тями с атД Н К явл яю тс я микросателлиты (М К С , или п ростые п овторяю щ иеся п оследовательности - П П П ) и минисателлиты (М Н С ). М инимал ь ная повторяю щ аяс я е диниц а (КО Р ) микрос ате л л итов вкл ю чае т от 1 до 10 пар нукл е отидов, минис ате л л итов – 15 –70 пн. И х рас пол оже ние в ге номе и чис л о повторений коровы х е диниц с пе ц ифичны дл я каждого организма.
26
И з-за ш ирокой вариабе л ь нос ти М КС и М Н С с ай ты их л окал изац ии нахромос омах названы локусами варьирую щ его числа тандемных п овторов (VNTR-л окус ы ). О ни повс е ме с тно вс тре чаю тс я не тол ь ко в яде рном ге номе эукариот (с час тотой 104-105 наге ном), но и в ц итопл азматичес кой Д Н К (хпД Н К и мтД Н К). В ге номе чел ове ка76% М КС приходитс я надол ю 5 типов повторов дл иной бол е е 20 нукл е отидов (A)n, (AC)n, (AAAN)n, (AAN), где N- л ю бой из тре х ос тавш ихс я нукл е отидов и (AG)n. П ри эл е ктрофоре зе П Ц Р - ампл ифиц ированной микрос ате л л итной Д Н К вы явл яе тс я разл ичная картина по чис л у, л окал изац ии и инте нс ивнос ти пол ос . П ри этом ул авл иваю тс я разл ичия в один нукл е отидны й повтор. М арке ры проявл яю т кодоминантнос ть и с е л е ктивно не й трал ь ное пове де ние (т.е . отс утс твие пл е й отропного эффе кта). В ы с окий пол иморфизм М КС и М Н С (что с вязы ваю т с их бол ь ш е й эвол ю ц ионной подвижнос ть ю по с равне нию с ос тал ь ной Д Н К), их обил ие и повс е ме с тное рас прос тране ние в ге номе с де л ал о их пе рс пе ктивны ми дл я ис пол ь зования в качес тве мол е кул ярны х маркеров Д Н К. Э то четкие ге не тичес кие марке ры , набор которы х уникал е н дл я конкре тного индивидуума. П рис утс твие М КС и М Н С в мтД Н К обе с пе чивае т возможнос ть ис пол ь зовать их дл я ц е л е й иде нтификац ии л ичнос ти по кос тны м ос танкам, как это бы л о с де л ано при иде нтификац ии чл е нов с е мь и пос л е дне го рус с кого ц аря и как это де л ае тс я в пе чал ь но изве с тной Р ос товс кой л аборатории. Н априме р, дл я идентификац ии ос танков ц арс кой с е мь и бы л ис пол ь зован один из коротких танде мны х повторов (Short Tandem Repeat – STR) мтД Н К, аиме нно ТН 01, с оде ржащ ий многократно повторяю щ ую с я пос л е довате л ь нос ть CA (от 6 до 10 копий ). Р азл ичия по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов, обус л овл е нны е пол иморфизмом М Н С и М КС, также нас л е дую тс я по ме нде л е вс кой с хе ме , т.е . могут бы ть ис пол ь зованы дл я ге не тичес кого картирования И сторияоткрытияминисателлитов такова. В 1985 г. группаангл ий с ких учены х во гл аве с А . Д же ффрис ом ис с л е довал аге н мы ш е чного миогл обинаи вы явил ав е го с ос таве не обы чны й учас ток, названны й ими минис ате л л итная Д Н К. В ос нове е е с трое ния л е жит бл ок из 16 нуклеотидов, рас пол оже нны х в опре де л е нной пос л е довате л ь нос ти. В с я этапос л е довате л ь нос ть бы л ас инте зирована, поме ченарадиоизотопом и ис пол ь зованав качес тве зонда(ил и пробы ) дл я вы явл е ния пол иморфизмапо минис ате л л итной Д Н К в ге номе чел ове ка. Такие пос л е довате л ь нос ти в ге номе чел ове карас пол ожены в разны х хромос омах и их чис л о кол е бл е тс я от двух до не с кол ь ких де с ятков, т.е . нал иц о оказал с я очень варь ирую щ ий признак – набор минис ате л л итны х Д Н К, разл ичаю щ ихс я по дл ине . Э ти учас тки Д Н К с тал и име новать гипе рвариабе л ь ны ми, а так как дл я каждого чел ове ка такой набор с угубо индивидуал е н, то по анал огии с отпе чатками пал ь ц е в ме тод вы явл е ния “п робы Д ж еффриса” пол учил название “генной дактилоскоп ии” ил и “фингерп ринтинга” - генных отп ечатков п альц ев.
27
Суть ме тодав с л е дую щ е м. И з биол огичес кого мате риал а(капл и крови, с пе рмы , не с кол ь ких л уковиц вол ос ) вы де л яю т Д Н К, ампл ифиц ирую т и разре заю т ре с триктазами. Ф рагме нты Д Н К де натурирую т (де л аю т одноните вы ми) и подве ргаю т эл е ктрофоре зу в пол иакрил амидном (П А А Г) ил и агарозном ге л е , где они разде л яю тс я по дл ине . В эл е ктричес ком пол е фрагме нты Д Н К движутс я от отриц ате л ь ного к пол ожите л ь ному пол ю с у с о с корос ть ю , завис ящ е й от дл ины (мас с ы ) фрагме нта. Че м ме нь ш е разме р фрагме нтов, те м бы с тре е они движутс я и дал ь ш е продвигаю тс я вниз по ге л ю . В ре зул ь тате эл е ктрофоре зав ге л е образуе тс я ряд пол ос , рас пол оже нны х однапод другой . В е рхние пол ос ы с оотве тс твую т фрагме нтам, име ю щ им бол е е крупны е разме ры , а нижние – фрагме нтам с бол е е ме л кими разме рами. П о окончании эл е ктрофоре за на ге л ь накл ады ваю т нитроц е л л ю л озны й фил ь тр, накоторы й мол е кул ы Д Н К пе ре нос ятс я и там закрепл яю тс я (иммобил изирую тс я) в той же пос л е довате л ь нос ти, что они бы л и рас пол оже ны в ге л е . Н атаком фил ь тре проводитс я гибридизац ия Д Н К с поме ченны м радиоактивно зондом Д же ффрис а (гибридизац ия in situ). Н аре нтге новс кой пл е нке , нал оже нной нанитроц е л л ю л озны й фил ь тр, радиоактивно ме ченая Д Н К буде т зас ве чивать эмул ь с ию в ме с тах, где произош л а гибридизац ия Д Н К с зондом. В итоге на эл е ктрофоре грамме пол учитс я рис унок из нес кол ь ких де с ятков те мны х пол ос , наразном рас с тоянии от начал адвиже ния. Каждая из таких пол ос с оотве тс твуе т отде л ь ному учас тку мини-с атД Н К, аих чис л о, разме щ е ние и инте нс ивнос ть с ос тавл яю т рис унок сугубо индивидуальный длякаж дого человека. П одс читано, что ве роятнос ть е го повторе ния у двух не родс тве нны х индивидов 1 на1 мл рд., кроме однояй ц е вы х бл изне ц ов. Н е которое , но дал е ко не пол ное с овпаде ние набл ю дае тс я также у кровны х родс тве нников. Ге нная дактил ос копия по Д же ффрис у ис пол ь зуе тс я в криминал ис тике и с уде бной ме диц ине . 1.4. Ф и зи ческ ое к арт и ровани е В отл ичие от рас с мотре нны х вы ш е ге не тичес ких карт с ц е пл е ния фи зи ческ и е к арт ы ге номаотражаю т ре ал ь ное рас с тояние ме жду ге нами (ил и марке рами), вы ражае мое чис л ом пар нукл е отидов. Физическое кар тир ование ос новано на п рямом анализе молекул Д Н К , составляю щ их каж дую хромосому (бе з анал иза ре зул ь татов с кре щ ивания). Е го коне чная ц е л ь – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в каждой хромос оме . Ф изичес ки картировать какой -л ибо ге н ил и фрагме нт на хромос оме означае т опре де л ить е го пол оже ние наэтой хромос оме в физичес ких е диниц ах - парах нукл е отидов. В озможнос ть физичес кого картирования ге номов появил ас ь в с вязи с развитие м те хники мол е кул ярны х марке ров Д Н К. Ф изическое картирование вклю чает создание рестрикц ионных карт и уп орядоченных библиотек клонов геномной Д Н К . В ажную рол ь при этом с ы грал о откры тие ре с триктаз.
28
1.4.1. С озданиер естр икционных кар т Рестрикц ионное картирование основано на установлении точек действияразличных рестриктаз. Р асп ределение сайтов рестрикц ии п редставляет собой своеобразный п асп орт каж дого фрагмента Д Н К и мож ет исп ользоватьсядляего идентификац ии. О бработка образц а Д Н К опре де л е нной ре с триктазой вс е гда дае т один и тот же набор фрагментов. Д л я пос трое ния ре с трикц ионной карты опре де л е нного рай онахромос омы ис пол ь зую т не с кол ь ко фе рме нтов ре с трикц ии и с начал аобрабаты ваю т (рас щ е пл яю т) Д Н К каждой из ре с триктаз в отде л ь нос ти, а зате м их комбинац иями. О пре де л ив разме р пол ученны х фрагме нтов с помощ ь ю ге л ь -эл е ктрофоре за, можно ус тановить порядок с л е дования с ай тов ре с трикц ии вдол ь анал изируе мой мол екул ы Д Н К. Т.е . мол е кул у Д Н К пос те пе нно рас щ е пл яю т на вс е ме нь ш ие и ме нь ш ие фрагме нты , пол учая пе ре кры ваю щ ие с я фрагме нты (име ю щ ие общ ие конц ы ) и зате м ус тановл иваю т пос л е довате л ь нос ть с амих фрагме нтов относ ите л ь но друг другав ге номе. Н аре с трикц ионной карте будут показаны ме с таре с трикц ии каждой нукл е азы по отнош е нию к ме с там ре с трикц ии других нукл е аз (рис унок11). 5,0 0,5
4,5
Eco RI 3,0
Bam HI Eco RI
Eco RI + Bam HI 0
0,5
2,0 Bam HI
3,0
5,0
Р ис унок 11. П риме р пос трое ния ре с трикц ионной карты по с ай там ре с трикц ии Eco RI и Bam HI [Ж имул е в, 2002]: Чис л а– рас с тояние ме жду с ай тами узнавания с оотве тс твую щ их фе рме нтов (тпн)
Н априме р, кл онирован фрагме нт Д Н К дл иной 5 тпн. О дну партию (ал иквоту) Д Н К обрабаты ваю т ре с триктазой EcoRI, другую – Bam HI, тре ть ю – с ме с ь ю обе их ре с триктаз. П ос л е ге л ь -эл е ктрофоре за опреде л яю т разме ры фрагме нтов, с опос тавл яя их с разме рами марке рны х макромол е кул с изве с тны ми мол е кул ярны ми мас с ами. П ри гидрол изе Д Н К ре с триктазой EcoRI образую тс я двафрагме нтаразмером 4,5 и 0,5 тпн. Э то с виде те л ь с твуе т о нал ичии тол ь ко одного с ай таре с трикц ии и этот с ай т находитс я на рас с тоянии 0,5 тпн от одного из конц ов ис ходного фрагме нта. П о этой же л огике е с ть тол ь ко один с ай т узнавания при гидрол изе ре с триктазой Bam HI, удал е нны й на3 тпн от одного из конц ов (рис унок 11). П ри с о-
29
вме с тном гидрол изе двумя ре с триктазами пол учаю тс я 3 фрагме нта: 2,5; 2,0 и 0,5 тпн, наос новании чего с троитс я ре с трикц ионная карта. В ре ал ь ны х экс пе риме нтах пос трое ние ре с трикц ионны х карт - гораздо бол е е с л ожны й проц е с с . П ос трое ние ре с трикц ионны х карт хромос ом – обязате л ь ны й пре дварите л ь ны й этап с е кве нирования (опре де л е ния пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов). Зная взаимное рас пол оже ние пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов Д Н К, можно вос с тановить пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов в бол е е крупны х фрагме нтах, азате м во вс е й хромос оме и в ге номе в ц е л ом. П е рвая ре с трикц ионная картабы л апол ученадл я вирус аSV-40 (онкоге нны й обе зь яний вирус ), зате м – бакте риофагаλ. Б анк генов. Д л я ре с трикц ионного картирования фрагме нты Д Н К, пол ученны е с помощ ь ю опре де л е нны х ре с триктаз ил и при возде й с твии на не е ул ь тразвуком (так назы вае мы м ме тодом дробовикаил и ш от-ган ме тодом), ис пол ь зую т дл я с оздавая геномых библиотек разных видов, или банков генов. Д л я этого фрагме нты Д Н К организма прис ое диняю т к ве кторны м мол е кул ам, т.е . мол е кул ам-пе ре нос чикам чуже родны х ге нов. В качес тве ве кторов ис пол ь зую т пл азмиды бакте рий , фаги (вирус ы , инфиц ирую щ ие бакте рии), кос миды (гибридны е мол е кул ы , пол ученны е из Д Н К фага λ и бакте риал ь ной пл азмиды ; бл агодаря нал ичию cos-учас ткафагаλ, которы й обе с пе чивае т замы кание е го л ине й ной Д Н К в кол ь ц о, кос мидная Д Н К, вкл ю чивш ая чуже родны е ге ны , може т бы ть упакована в гол овку бакте риофага). В качес тве ве кторов ис пол ь зую т также ис кус с тве нны е хромос омы дрожже й YAK – (Я К) и бакте рий BAC – (БА К) хромос омы . В е кторны е мол е кул ы с вкл ю ченны ми в них фрагме нтами чуже родной Д Н К, т.е . ре комбинантны е Д Н К (ре кД Н К) вводят в ре ц ипие нтны е бакте рии, где они ре пл иц ирую тс я автономно ил и вме с те с Д Н К бакте риире ц ипие нтапос л е инте грац ии с е е ге номом (хромос омой ). Кл онирование (многократную ре пл икац ию ) фрагме нтов Д Н К проводят с ц е л ь ю пол учения бол ь ш ого чис л а копий фрагме нтов, иде нтичны х ис ходному. Д л я кл онирования не бол ь ш их фрагме нтов Д Н К ис пол ь зую т пл азмиды , фаговы е Д Н К, адл я крупны х - кос миды и ис кус с тве нны е хромос омы . И с кус с тве нны е хромос омы дрожже й (YAK-хромос омы ) позвол яю т кл онировать фрагме нты Д Н К чел ове каразме ром до 1М б. А нал огичны е кол л е кц ии, пол ученны е из индивидуал ь ны х хромос ом ил и их час те й , назы ваю т хромосомными библиотеками. Создаю т также библ иоте ки кД Н К , т.е . копий Д Н К, компл е ме нтарны х мР Н К. П ос кол ь ку компл е ме нтарную Д Н К пол учаю т из зре л ы х мол е кул мР Н К, пре те рпе вш их проц е с с инг, мол е кул ы кД Н К не с оде ржат интронов. Библ иоте какД Н К отражае т с пе ктр ге нной активнос ти в кл е тках, из которы х онабы л авы де л е на. Создание таких библ иоте к пол е зно при с равне нии ге нной активнос ти в кл е тках разны х ткане й . Е е также ис пол ь зую т дл я ре с трикц ионного картирования и опре де л е ния нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й фрагме нтов Д Н К.
30
1.4.2. С озданиеу пор ядоченных библиотек клонов. К ар ты контиг. Пр оцеду р а “ Пр огу лка по хр омосоме” Чтобы ус тановить порядок рас пол оже ния кл онов (т.е . кл онированны х фрагме нтов Д Н К) на хромос оме (по е е дл ине ), не обходимо вы явить учас тки их час тичного пе ре кры вания. Э то можно с де л ать путе м гибридизац ии нукл е иновы х кис л от, е с л и изве с тна нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть хотя бы одного фрагме нта. Е го ме тят радиоактивно ил и фл уорохромом и ис пол ь зую т в качес тве зонда дл я с оздания уп орядоченных библиотек клонов. К упорядоченны м библ иоте кам кл онов относ ят карты контиг. Д л я их с оздания не обходимо пол учить и кл онировать не бол ь ш ие учас тки Д Н К и опре де л ить их нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти. Э то так назы вае мы й STS (sequence tagget site) – Д Н К-маркирую щ ий с ай т – уникал ь ная дл я данного л окус апос л е довате л ь нос ть . Зате м STS упорядочиваю т, с оздавая протяже нны е учас тки Д Н К. Э то и е с ть контиги – груп п ы клонов, охватываю щ ие п ерекрываю щ иесяучастки генома. Упорядочение рас пол оже ния кл онов ос ущ е с твл яю т с помощ ь ю проц е дуры , изве с тной как “п рогулка п о хромосоме” , пре дл оже нной в 1979 г. Б. Бе нде ром, П . Спире ром и Д . Х огне с с ом. “П рогулк а по хромосоме” (ск ользящ ее зонди ровани е). Д л я упорядочивания кл онов ис пол ь зую т две разны е библ иоте ки ге номной Д Н К, пол ученны е из Д Н К одного и того же организма, но разде л е нны е двумя разны ми ре с триктазами. Е с л и один из ге нов (ил и кл онов) в пе рвой библ иоте ке удал ос ь картировать и кл онировать (т.е . пол учить из не го Д Н Кмаркирую щ ий с ай т – STS), он зате м може т бы ть ис пол ь зован в качес тве зонда дл я вы явл е ния пе ре кры ваю щ е гос я кл она во второй библ иоте ке . А изученны й кл он второй библ иоте ки може т ис пол ь зовать с я как зонд дл я другого пе ре кры ваю щ е гос я фрагме нтапе рвой библ иоте ки и т.д. Так, оты с кивая кл он закл оном, можно пе редвигать с я по хромос оме ш агами дл иной до 30000 пн (рис унок12). Т аким образом устанавливается п орядок расп олож ения клонов на хромосоме. 1.4.3. С тр атегии постр оения физической кар ты высокого р азр еш ения Ф изичес кие карты разл ичаю тс я по с те пе ни их разре ш е ния, т.е . по те м де тал ям с труктуры ге нома, которы е на них пре дс тавл е ны . И с черпы ваю щ ая физичес кая картаге номачел ове камакс имал ь ного разре ш е ния буде т с оде ржать пол ную нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть вс е х е го хромос ом. Н адругом пол ю с е физичес ких карт с минимал ь ны м разре ш е ние м находятс я хромосомные (ц итогенетические) карты ге нома. П ринц ип их пос трое ния бы л рас с мотре н в разде л е 1.1.
31
библиотека геномной Д Н К , полу ченная 1-ой р естр иктазой
F
M
L
N
P
O
R
библиотека геномной Д Н К , полу ченная 2-ой р естр иктазой К лоны библиотеки 1
A B
F
К лоны библиотеки 2
L
L
M
N
C
M
X
N
O
Y
P
R
Z
P
O
Ге н F картирован наге не тичес кой карте , кл онирован и ус тановл е на е го нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . Э то позвол яе т иде нтифиц ировать в библ иоте ке ге номной Д Н К кл оны , с оотве тс твую щ ие с ос е дним ге нам с помощ ь ю ме тодики “прогул капо хромос оме ” . Кл он А (из 1-ой библ иоте ки), ис пол ь зуе мы й как зонд при изучении 2ой библ иоте ки, в проц е с с е бл оттингапо Саузе рну, иде нтифиц ипуе т кл он Х за с чет нал ичия у них пе ре кре щ иваю щ е гос я учас тка L ; кл он Х (из 2-ой библ иоте ки), ис пол ь зуе мы й как зонд при изучении 1-ой библ иоте ки в проц е с с е бл оттингапо Саузе рну, иде нтифиц ируе т кл он В зас чет нал ичия у них пе ре кры ваю щ е гос я учас тка М ; кл он В как зонд иде нтифиц ируе т кл он Y (пе ре кры ваю щ ий с я учас ток N ) и т.д.
F
L
к л он А
L
M M
к л он Х N
к л он В
N
O
к л он Y
O
P
к л он С
к л он Z
P
R
И с пол ь зование пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов позвол яе т опре де л ить порядок рас пол оже ния ге нов на ис с л е дуе мом учас тке хромос омы , т.е . пос троить карту контиг.
Р ис унок12. Схе мапроц е дуры “прогул капо хромос оме ”
32
К физичес ким картам низкого разрешенияотнос ятс я карты кД Н К . К ар ты кД Н К . Карты кД Н К отражаю т пол оже ние экс пре с с ирую щ ихс я учас тков Д Н К (экзонов) относ ите л ь но изве с тны х ц итоге не тичес ких марке ров (бэндов) наме тафазны х хромос омах. П ос кол ь ку такие карты даю т пре дс тавл е ние о л окал изац ии транс крибирую щ ихс я учас тков ге нома, в том чис л е и генов с не изве с тны ми функц иями, они могут бы ть ис пол ь зованы дл я поис кановы х ге нов. Э тот подход ос обе нно пол е зе н при поис ке ге нов, повре жде ния которы х вы зы ваю т забол е вания чел ове ка, в том с л учае е с л и прибл изите л ь ная л окал изац ия таких учас тков хромос ом уже пре дварите л ь но прове де нанаге не тичес ких картах с ц е пл е ния. К ар ты высокого р азр еш ения. Д л я пос трое ния карт ге номачел ове ка вы с окого разре ш е ния экс пе риме нтал ь но ре ал изую тс я два ал ь те рнативны х подхода: картирование сверху вниз(top-down mapping) и картированиеснизу вверх (bottom-up mapping), рис унок13. П ри картировании сверху вниз(рис унок 13А ) ис ходны м в анал изе явл яе тс я пре парат Д Н К индивидуал ь ной хромос омы чел ове ка. Д Н К разре зае тс я крупнощ е пящ ими ре с триктазами (наприме р NotI) надл инны е фрагме нты , которы е пос л е разде л е ния эл е ктрофоре зом в пул ь с ирую щ е м пол е (пул ь с -эл е ктрофоре з), подве ргаю тс я дал ь не й ш е й обработке другими ре с триктазами. М е тодом эл е ктрофоре запод де й с твие м однонаправл е нного пос тоянного пол я в агарозном ил и пол иакрил амидном (П А А Г) ге л ях удае тс я разде л ить фрагме нты Д Н К разме ром не бол е е 30-50 тпн. Э тот ме тод ус пе ш но ис пол ь зуе тс я дл я картирования мал ы х ге номов. П родвиже ние бол ь ш их фрагме нтов Д Н К в ге л е при пул ь с ирую щ е м изме не нии направл е ния эл е ктричес кого пол я проис ходит за с чет конформац ионны х изме не ний , обус л овл е нны х с кручивание м и рас кручивание м мол е кул Д Н К в моме нт пе ре кл ю чения направл е ния пол я. В этом с л учае удае тс я разде л ить мол е кул ы Д Н К разме ром от 50 тпн до 10 мл н пн). В ре зул ь тате пол учаю т макрорестрикц ионную карту, на которой дос таточно пол но предс тавл е ны вс е пос л е довате л ь нос ти ис с л е дуе мой хромос омы ил и е е час ти, однако е е разре ш е ние не вы с око. Н атакой карте очень трудно л окал изовать индивидуал ь ны е ге ны . К тому же каждая индивидуал ь ная картаре дко охваты вае т протяже нны е с е гменты Д Н К (как правил о, не бол е е 1–10 мл н пн). Д л я картирования ге номачел ове каснизу вверх (рис унок 13А ) индивидуал ь ную хромос ому разре заю т на множе с тво не бол ь ш их с л учай ны х фрагме нтов (разме ром 10–1000 тпн), час ть из которы х пе ре кры вае тс я друг с другом. Зате м их кл онирую т и упорядочиваю т. В качес тве ве ктора дл я кл онирования в этом с л учае час то ис пол ь зую т ис кус с тве нны е минихромос омы бакте рий (BAC) ил и дрожже й (YAC). П орядокрас пол оже ния кл онов, с оде ржащ их час тично пе ре кры ваю щ ие с я учас тки, опре де л яю т с помощ ь ю проц е дуры “прогул ка по хромос оме ” . Кажды й раз отобранны й фрагме нт ис пол ь зуе тс я в качес тве Д Н К-зондадл я пос л е дую щ е го поис ка. В ре -
33
Р ис унок 13. Страте гия физичес кого картирования ге нома(А ) и типы карт ге нома[П атруш е в, 2000]: А . 1.Страте гия "с ве рху вниз": Д Н К ц е л ой хромос омы рас щ е пл яе тс я ре с триктазами, дл я каждого из индивидуал ь ны х фрагме нтов Д Н К с троитс я ре с трикц ионная карта; 2 – с трате гия "с низу вве рх", индивидуал ь ны е YAC-кл оны пос л е иде нтификац ии объе диняю тс я в контиги. Б . 1 – ге не тичес кая картас ц е пл е ния, 2 – физичес кая ре с трикц ионная карта, пробе л ы обозначаю т ме с та рас щ е пл е ния Д Н К ре с триктазами, 3 – упорядоченная библ иоте ка кл онов (физичес кая карта контигов), показаны пе ре кры ваю щ ие с я кл оны Д Н К, пол ученны е с помощ ь ю YAC-ве кторов, 4 – ис черпы ваю щ ая физичес кая картав виде пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. Н авс е х картах пре дс тавл е н один и тот же учас токхромос омы .
зул ь тате пол учаю т набор час тично пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов Д Н К, образую щ их не пре ры вную с ос ты кованную (contiguous) пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов Д Н К (пол учивш их название “контиг” = от англ . contig), пол нос ть ю пе ре кры ваю щ их ис с л е дуе мы й учас ток хромос омы . Э тас трате гия впе рвы е бы л аус пе ш но приме не надл я изучения 3-й хромос омы дрозофил ы . К ограничениям ме тода относ итс я труднос ть прохожде ния бол е е
34
200-300 тпн в одном направл е нии из-занал ичия в ге номе повторяю щ ихс я и трудно кл онируе мы х пос л е довате л ь нос те й Д Н К. Д л я их пре одол е ния и ус коре ния проц е с с апоис каге нны х пос л е довате л ь нос те й Ф . Кол л инз пре дл ожил ме тод “пры жков” по хромос оме , позвол яю щ ий изол ировать фрагме нты Д Н К, отс тоящ ие в ге номе друг от друганас отни ты с ячпар нукл е отидов (дл инапры жка), не вы де л яя при этом вс е проме жуточны е пос л е довате л ь нос ти Д Н К. П равил ь нос ть пол ученны х контигов подтве рждаю т обы чно гибридизац ие й in situ (FISH) с одновре ме нной их привязкой к опре де л е нны м учас ткам ис с л е дуе мы х хромос ом. Карты , ос нованны е на контигах, пре дс тавл яю т пол ную информац ию о с труктуре отде л ь ны х с е гме нтов хромос ом и позвол яю т л окал изовать отде л ь ны е ге ны . О днако такие карты трудно приме нять дл я ре конс трукц ии ц е л ы х хромос ом ил и протяже нны х их учас тков из-заотс утс твия с оотве тс твую щ их кл онов в име ю щ ихс я кл оноте ках ге нов. 1.5. О пределени е нук леот и дной последоват ельност и генома (сек вени ровани е) И с черпы ваю щ ая физичес кая картаге номачел ове ка(и л ю бого другого организма) дол жна пре дс тавл ять с обой пол ную пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов Д Н К вс е х е го хромос ом. В 2001 году бы л о объявл е но о заве рш е нии с е кве нирования ге нома чел ове ка – прочте нии вс е го ге не тичес кого те кс та. К ре ш е нию такой грандиозной по объе му задачи бы л и привл е чены многие хорош о финанс ируе мы е л аборатории в разны х с транах мира, ос нащ е нны е автоматичес кими вы с окопроизводите л ь ны ми с е кве наторами. О дна из причин труднос ти с е кве нирования – дл инны е мол е кул ы Д Н К. Так, ге ном E. coli с ос тавл яе т почти 5 мл н пн. Таковаже дл инаД Н К с амой мал е нь кой Y хромос омы чел ове ка. Д л ина же Д Н К с амой бол ь ш ой хромос омы 1 с ос тавл яе т 300 мл н пн (300М б). П одс читано, что е с л и бы с е кве нированную Д Н К тол ь ко одной пол овой кл е тки чел ове ка, образованную 3 мл рд. пн и име ю щ ую с овокупную дл ину мол е кул в 1,8м, с ос тавить в книги, то это бы л о бы эквивал е нтно 200 томам по 1000 с траниц кажды й (вме щ аю щ их по 2500 пе чатны х знаков – A, G, T ил и C). Н апрочте ние таких книг чел ове ку потре бовал ос ь бы не ме не е тре ти жизни. Д л я с равне ния: ге ном бакте рии E. coli може т бы ть запис ан вс е го в двух подобны х томах. В 1977 г. бы л и разработаны две ме тодики с е кве нирования: 1) ме тод А . М акс амаи У. Гил бе рта- химичес кой де градац ии Д Н К; 2) ме тод Ф . Се нге ра– фе рме нтативны й с пос об. В торой с пос об ис пол ь зуе тс я чащ е . П риме не ние этих ме тодов с де л ал о проц е с с с е кве нирования дос тупны м л ю бой биохимичес кой л аборатории и значите л ь но ус корил о опре де л е ние пе рвичной с труктуры ге нов.
35
П ос л е довате л ь нос ть нукл е отидов опре де л яю т в одноц е почечны х фрагме нтах Д Н К, с ос тоящ их из 100-300 нукл е отидов, которы е образую тс я при рас щ е пл е нии Д Н К ре с триктазами. Р е зул ь таты с е кве нирования объе диняю тс я зате м в дл инны е ц е почки нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й на хромос оме . О баме тодас е кве нирования с водятс я к тому, чтобы пол учить с е рию одноц е почечны х мол е кул Д Н К, разл ичаю щ ихс я по размеру на один нукл е отид. Д л я этого ис пол ь зую т дваподхода: в одном с л учае Д Н К химичес ки рас щ е пл яю т (разруш аю т и укорачиваю т по одному ос нованию – химичес кая де градац ия); в другом с л учае (фе рме нтативны й с пос об) ос ущ е с твл яю т удл ине ние ц е пи Д Н К наодно ос нование , ис пол ь зуя дл я этого те риминаторы с инте за. П ол ученны е мол е кул ы можно разде л ить с помощ ь ю эл е ктрофоре за, аре зул ь таты прочитать “с л ис та” . Р ас с мотрим бол е е подробно ферментативный сп особ с е кве нирования. Е го е щ е назы ваю т метод обрыва ц еп и (от англ . chain termination method), рис унок14. Се кве нирование начинае тс я с кл онирования не бол ь ш их ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, образуе мы х в ре зул ь тате ре с трикц ии пре дварите л ь но кл онированны х бол е е крупны х фрагме нтов. Ф рагме нт Д Н К, подл е жащ ий с е кве нированию , де натурирую т до однонитчатого с ос тояния щ е л очной обработкой ил и нагре вание м. Зате м с одной из нитей проводят гибридизац ию (отжиг) с коротким ол игонукл е отидны м прай ме ром, которы й с вязы вае тс я с 3′-конц ом одноните вой Д Н К. О л игонукл е отид (которы й с л ужит прай ме ром дл я дос траивания ц е пи Д Н Кпол име разой ) с инте зируе тс я таким образом, чтобы е го 3′-коне ц бы л пос л е дним пе ре д с е кве нируе мой пос л е довате л ь нос ть ю . Д л я каждого экс пе риме нта по с е кве нированию с тавят 4 ре акц ии с однонитчатой Д Н К и прикре пл е нны м к не й прай ме ром. Каждая ре акц ионная с ме с ь с оде ржит четы ре нормал ь ны х пре дш е с тве нника Д Н К – четы ре дезоксирибонуклеозидтрифосфата dNTP: dATP, dGTP, dTTP и dCTP, а также Д Н К-пол име разу. П ре дш е с тве нники ме тятс я радиоактивно изотопами 32Р , 33Р ил и 35S ил и не радиоактивно. Кроме этого, в ре акц ионную с ме с ь добавл яю т один из четы ре х модифиц ированны х пре дш е с тве нников Д Н К – дидезоксинуклеозидтрифосфаты ddNTP (в с оотнош е нии 100 dNTP : 1 ddNTP), которы е с л ужат те рминаторами с инте за: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP. У этих нукл е отидов в 3′ пол оже нии находитс я -Н , ане -О Н (как у де зокс инукл е отидов). Так как пре дш е с тве нники (нукл е отиды ) модифиц ированы , то можно прис ое динить тол ь ко одно ос нование и рос т ц е пи пре кращ ае тс я (фос фодиэфирная с вязь не образуе тс я, т.к. –О Н отс утс твуе т). Зате м с помощ ь ю Д Н К-пол име разы ве дут синтез второй комп лементарной ц еп и Д Н К. О с тановкас инте за(обры в ц е пи) буде т проис ходить вс який раз, когдавме с то dNTP в рас тущ ую ц е пь Д Н К буде т вс траивать с я с оотве тс твую щ ий е му ddNTP. П оэтому с ре ди продуктов ре акц ии буде т множе с тво фрагме нтов, разл ичаю щ ихс я по дл ине , так как с инте з их начинае тс я с фикс ированной точки (от прай ме ра), акончае тс я в пол оже нии од-
36
ного из нукл е отидов, с оотве тс твую щ их диде зокс инукл е отиду. Н арис унке 14 это проде монс трировано на приме ре ddGTP. В данном с л учае образую тс я фрагме нты , которы е вкл ю чаю т прай ме р пл ю с 3, 6, 8, 13 ил и 14 других нукл е отидов.
Р ис унок 14. Схе мас е кве нирования Д Н К (фе рме нтативны й с пос об = ме тод обры вац е пи) [Кол ь ман, 2004]. Зате м вс е четы ре пробы внос ят в с ос е дние л унки пл ас тины ге л я и проводят ге л ь -эл е ктрофоре з, где они разде л яю тс я. Н укл е отидную пос л е довате л ь нос ть можно прочес ть прямо в ге л е (чте ние “с л ис та” ) с низу по направл ению к с тарту в с оотве тс твие с очере днос ть ю , в которой фрагме нты рас пол агаю тс я наотде л ь ны х “дорожках” (рис унок14).
37
Сре дняя с корос ть с е кве нирования к конц у 1998 г. с ос тавл ял а90 М б. Се й час анал изу чащ е подве ргаю т продукты П Ц Р , а не кл онированны е фрагме нты Д Н К. Спе ц иал ь но с конс труированны е ге номотроны (с е кве наторы -роботы ) производят до 105 пол име разны х ц е пны х ре акц ий в час и с е кве нирую т не с кол ь ко мил л ионов нукл е отидов в не де л ю . А втоматизац ия проц е с с ас е кве нирования с ущ е с тве нно ус корил аэтот проц е с с и позвол ил аос ущ е с твить с е кве нирование кл е точны х ге номов, дл я которы х пре дварите л ь но с ос тавл яю т физичес кие карты . П ос л е разработки нове й ш их те хнол огий прочте ние ге не тичес кого те кс та с тал о рутинной проц е дурой . 1.6. Б азы данных нук леот и дных последоват ельност ей. Компью т ерная генет и к а (б и ои нформат и к а). И сследовани я in silico Б азы данных ну клеотидных последовательностей. Сущ е с тве нную рол ь в развитии ге номны х подходов с ы грал и базы (ил и банки) данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й . Д овол ь но бы с тро с тал о понятно, что не возможно с опос тавл ять пос л е довате л ь нос ти, с равнивая вручную дл инны е ряды букв, приводимы х нарис унках кс тать ям. Уже в 1979 г. бы л о начато обс ужде ние того, как хранить пос л е довате л ь нос ти Д Н К и Р Н К и как обе с пе чивать дос туп к ним. П е рвы е базы данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й GenBank (СШ А ) и EMBL (Е вропа) появил ис ь в 1982 г., и уже в с л е дую щ е м году одним из пе рвы х важны х ре зул ь татов, пол ученны х при помощ и анал изапос л е довате л ь нос те й , бы л о обнаруже ние с ходс твавирус ного онкоге на v-sis и нормал ь ного ге на фактора рос та тромбоц итов, что приве л о к значите л ь ному прогре с с у в понимании ме ханизма рака. С те х пор с равне ние новой пос л е довате л ь нос ти с пос л е довате л ь нос тями из банка данны х с тал о рутинны м эл е ме нтом работы с л ю бы м ге ном, а поме щ ение каждой новой пос л е довате л ь нос ти в банк - не обходимы м ус л овие м журнал ь ной публ икац ии. В 1996 г. бы л и с формул ированы "Бе рмудс кие принц ипы " (названы по ме с ту прове де ния конфе ре нц ии), с огл ас но которы м даже не бол ь ш ие фрагме нты ге номов, пол ученны е в рамках прое кта "Ге ном чел ове ка" и анал огичны х программ, с разу же поме щ ал ис ь в банки данны х и могл и бы ть ис пол ь зованы вс е ми же л аю щ ими. То е с ть важной ос обе ннос ть ю с бораи хране ния информац ии о с е кве нированны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос тях в базах данны х явл яе тс я е е дос тупнос ть дл я ис с л е довате л е й . В с е опе рац ии по с равне нию нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й разл ичны х ге номов вы пол няю тс я с помощ ь ю компь ю те ра(это компь ю те рная проц е дура). Р аботаос ущ е с твл яе тс я в с л е дую щ е м порядке : с е кве нирование → базаданны х → вы явл е ние ге нов (откры ты е рамки с читы вания) → опре де л е ние их функц ии. Крупне й ш е й базой данны х по с труктуре ге нома чел ове ка в нас тоящ е е вре мя явл яе тс я GDB (Genome Data Base), с озданная и подде рживае мая в униве рс ите те Д ж. Гопкинс а(Бал тимор, СШ А ). Кроме изве с тны х пос л е -
38
довате л ь нос те й нукл е отидов ге номачел ове кав не й хранитс я вс я пол ученная информац ия о ге не тичес ких марке рах, зондах и контигах, ас с оц иированны х с ге не тичес кими забол е ваниями. Че ты ре других базы данны х хранят вс е изве с тны е пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов, вкл ю чая пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов ге нома чел ове ка: GenBank и Genome Sequence Data Base (GSDB) в СШ А ; European Molecular Biology Laboratory (EMBL) в Е вропе , International Nucleotide Sequense Database (INSD) в В е л икообритании; DNA Data Bank of Japan (DDBJ) в Я понии. В Р ос с ии И нс титутом мол е кул ярной биол огии им. В .А . Э нге л ь гардтаподде рживае тс я анал огичная базаданны х по ге ному чел ове ка (Hugene). Банки пос тоянно обме ниваю тс я данны ми и в этом с мы с л е , практичес ки равноц е нны . В этих базах данны х в 1996 году хранил ос ь ∼200 мл н.пн, пре дос тавл е нны х как с амими авторами, так и вводимы х из с тате й , опубл икованны х в пе риодичес ких изданиях. О с новной ме ждународной базой данны х по пос л е довате л ь нос тям аминокис л от явл яе тс я Protein Identification Resource (Ш ве й ц ария). К омпью тер ная генетика (биоинфор матика). И сследования in silico. А втоматизац ия проц е с с а с е кве нирования, л авинообразное нарас тание объе маданны х ре зул ь татов с е кве нирования пос л ужил о тол чком рожде ния мол одой науки – биоинформатики (вычислительной биологии), она же комп ью тернаягенетика. Э танаукавозникл ав 1976-1978 годах, окончате л ь но оформил ас ь в 1980 году с о с пе ц иал ь ны м вы пус ком журнал а «Nucleic Acid Research» (NAR), пос вящ е нного биоинформатике . Зате м бы л и пре дл оже ны не которы е ал горитмы вы равнивания пос л е довате л ь нос те й (т.е . с пос обанапис ания не с кол ь ких пос л е довате л ь нос те й друг под другом дл я их дал ь не й ш е го с равне ния). В 1987 году появил с я GeneBank (кол л е кц ия нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й ) и т.д. Биоинформатикавозникл а на с ты ке мол е кул ярной биол огии и ге не тики, мате матики (с татис тики и те ории ве роятнос ти) и информатики. Каждая пол ученная пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов пре дс тавл яе т инте ре с дл я ц е л е й ге нной инже не рии и биоте хнол огии, с равне ния с нукл е отидны ми пос л е довате л ь нос тями других организмов. Компь ю терны й анал из с тановитс я ос новны м ме тодом с равне ния и изучения ге нов разл ичны х организмов, пре дс казания функц ии ге нов по нукл е отидной и аминокис л отной пос л е довате л ь нос ти и др. Биоинформатика с тал а чре звы чай но модной обл ас ть ю науки, с прос нас пе ц иал ис тов в которой очень ве л ик. Биоинформатикаре ш ае т с л е дую щ ие задачи: 1. Статис тичес кий анал из пос л е довате л ь нос те й Д Н К; 2. П ре дс казание функц ии по пос л е довате л ь нос ти (рас познавание ге нов в пос л е довате л ь нос ти Д Н К, поис к ре гул яторны х с игнал ов, пре дс казание функц ий бе л ков). 3. А нал из прос транс тве нной с труктуры бе л ков и нукл е иновы х кис л от, в том чис л е пре дс казание с труктуры бе л капо пос л е довате л ь нос ти; 4. Те ория мол е кул ярной эвол ю ц ии и с ис те матика.
39
А нал из in silico (в компь ю те ре ) – с равне ние име ю щ ихс я в базах данны х ге номны х и EST п оследовательностей (Expressed sequence tags = марке рны е экс пре с с ируе мы е пос л е довате л ь нос ти). EST, по с ути, явл яю тс я пос л е довате л ь нос тями разной дл ины (в с ре дне м окол о 500 пн), пол ученны ми путе м обратной транс крипц ии с 3’ конц амР Н К. Э то короткие марке рны е пос л е довате л ь нос ти, характе рны е дл я каждого экс пре с с ируе мого ге на чел ове ка. П озвол яю т изучать разме ры , разнообразие и транс крипц ионную активнос ть экс пре с с ирую щ ихс я ге нов чел ове ка. То е с ть ос новны м инс труме нтом биоинформатики, ос обе нно той е е час ти, которая занимае тс я пре дс казание м функц ий , явл яе тс я с равните л ь ны й анал из, которы й , наприме р, позвол яе т по изве с тны м функц иям ге нов мухи дрозофил ы , червя не матоды и других организмов пре дс казы вать функц ии ге нов чел ове ка. Э то задачапоис кас ходс твапос л е довате л ь нос те й у разны х организмов. 1.7. Канди дат ное к арт и ровани е Д о пос л е дне го вре ме ни при картировании ге нома доминировал функц иональный п одход. П ри этом ме с то ге нанакарте ус танавл иваю т по ре зул ь татам с ц е пл е ния признака, наприме р, нас л е дс тве нной бол е зни с уже картированны ми ге не тичес кими марке рами. О днако с пис ок забол е ваний , дл я которы х функц ионал ь ная информац ия о биол огичес ком де фе кте , л е жащ е м в ос нове того ил и иного забол е вания, явл яе тс я дос таточно пол ной (наприме р, не дос таточнос ть пе ченочного фе рме нта фе нил ал анингидрокс ил азы при фе нил ке тонурии), в нас тоящ е е время практичес ки ис черпан. Бол ь ш инс тво ге нов, функц ия которы х бы л аизве с тна, уже с е кве нированы , кл онированы и картированы . Бл изко к функц ионал ь ному и так назы вае мое кандидатное картирование. В пос л е дне м с л учае информац ия о функц ии ге нане дос таточно пол ная, чтобы точно указать ге н, но дос таточная дл я того, чтобы бол е е ил и ме не е обос нованно предпол ожить о возможны х кандидатах. В обоих с л учаях клонирование гена предш е с твуе т е го точной л окал изац ии в ге номе , т.е . картированию . В рамках этих подходов картировать ген означало п ройти п уть от его функц ии к локализац ии нахромосоме(п озиц ии). П оявл е ние в 80-х гг. XX ве камноже с тва вы с окопол иморфны х марке ров Д Н К позвол ил о пой ти в обратном направл е нии – от хромос омной карты кфункц ии. П ри рас ш ифровке пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов ге номов прос то ус трое нны х бакте рий и вирус ов ге не тикам с точнос ть ю до одного нукл е отида удал ос ь опре де л ить их пос л е довате л ь нос ть в Д Н К. П рочте ние же нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й в ге номе эукариот оказал ос ь затрудните л ь ны м в с вязи с прис утс твие м у них бол ь ш ого кол ичес тваповторяю щ ихс я пос л е довате л ь нос те й (с вы ш е 90%). П ри наработке копий этих уча-
40
с тков с помощ ь ю П Ц Р они образовы вал и ш пил ь ки ил и изл омы , не рас познавае мы е ил и не правил ь но читае мы е Д Н К- пол име разами – фе рме нтами, удваиваю щ ими (ампл ифиц ирую щ ими) эти учас тки. К тому же повторяю щ ие с я учас тки, оказал ос ь , не возможно размножить в бактериал ь ны х кл е тках. М ногие труднос ти, однако, при изучении ге номов разны х организмов удал ос ь пре одол е ть бл агодаря разработке в ходе ос ущ е с твл е ния ме ждународной программы ге нома чел ове ка принц ипиал ь но новы х физичес ких, химичес ких и мате матичес ких ме тодов, вне дре нии роботов в анал из пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов Д Н К, развитие с амы х мощ ны х из име ю щ ихс я в мире компь ю те рны х программ. Э тому в значите л ь ной с те пе ни с пос обс твовал о крупное финанс овое обе с пе чение намного пре вы с ивш е е в ме ждународны х мас ш табах с тартовую ц е ну программы 3,2 мл рд. дол л аров, привл е чение к работе крупне й ш их с пе ц иал ис тов из вс е х с тран: ге не тиков, физиков, химиков, ме диков, мате матиков, компь ю те рщ иков, с ил ь не й ш ая конкуре нц ия ме жду учены ми и в то же вре мя с отрудничес тво в пл ане публ икац ий , обс ужде ния ре зул ь татов проработки программы на ме ждународны х с ове щ аниях. И с с л е дования ге нома с тал и аре ной не тол ь ко научного, но также экономичес кого и даже пол итичес кого с оре внования на гос ударс тве нном уровне . Так, пре дпринимал ис ь попы тки запате нтовать ус тановл е нны е ге ны нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка, не пол учивш ие подде ржки мирового научного с ообщ е с тва, а гл авы СШ А и В е л икообритании – гос ударс тв, вне с ш их ос обо крупны й вкл ад в изучение ге номачел ове ка, в канун нас тупл е ния XXI ве капубл ично заявил и, что име нно учены е их с тран добил ис ь крупне й ш их дос тиже ний в науке . 2. Г Е Н О М И К А , ПР О ТЕ О М И К А И “ О Б Р А ТН А Я Г Е Н Е ТИ К А ” 2.1. Геноми к а В нас тоящ е е вре мя парал л е л ь но с изучение м ге нома чел ове ка рас ш ифрованы пос л е довате л ь нос ти Д Н К и изучены функц ии ге нов у многих видов бакте рий и вирус ов, однокл е точны х эукариотичес ких организмов: дрожже й и многокл е точны х: кругл ого червя не матоды , нас е комого - пл одовой муш ки дрозофил ы и рас те ния арабидопс ис а. В 2002 г. рас ш ифрован ге ном мы ш и, ус пе ш но развиваю тс я ис с л е дования ге номов пш е ниц ы , рис а и других однодол ь ны х. Э то с оздал о предпос ы л ки дл я с равне ния ге номов организмов разны х такс ономичес ких кате горий . То е с ть ре зул ь таты ис с л е дований ге номов разны х организмов зал ожил и ос новы новой науки – геномика. Э то наукао ге номах. Те рмин “ге номика” появил с я тол ь ко в 1985 году и относ итс я к науке , занимаю щ е й с я картирование м и с е кве нирование м ге номов. Какие ос новны е задачи ре ш ае т ге номика?
41
1. Се кве нирование ге номов разл ичны х организмов, вы явл е ние ране е не изве с тны х ге нов, изучение л окал изац ии и с трое ния ге нов и других учас тков ге нома. Н априме р, у чел ове ка с обс тве нно ге ны с ос тавл яю т ме не е 10% вс е го ге нома(≈3%). 2. В ы явл е ние функц ий каждого ге на, изучение ме ханизмов ре гул яц ии работы ге номов. 3. И зучение вопрос ов проис хожде ния видов, биоразнообразия, с охране ния и ис пол ь зования биол огичес ких ре с урс ов пл ане ты . Р азл ичаю т структурную и функц иональную геномику. Ц е л ь ю с труктурной ге номики явл яе тс я вы яс не ние пос л е довате л ь нос ти ос нований в мол е кул ах Д Н К у организмов разл ичны х видов. Ф ункц ионал ь ная ге номика– это учение о функц иях ге нов. О дним из ос новны х экс пе риме нтал ь ны х подходов при изучении с труктурно-функц ионал ь ной организац ии ге номаи ме ханизмов ге нной экс пре с с ии, атакже дл я дигнос тики нас л е дс твенны х и инфе кц ионны х забол е ваний в ме диц ине , ве те ринарии и рас те ние водс тве явл яе тс я ме тод мол е кул ярной гибридизац ии нукл е иновы х кис л от. П е рвы е ус пе хи ге номики с вязаны с рас ш ифровкой ге номов вирус ов, бакте рий (пре дс тавл яю щ их инте ре с дл я ме диц ины , промы ш л е ннос ти и фундаме нтал ь ной биол огичес кой науки) и кл е точны х органе л л . В 1955 году бы л а опре де л е на пол ная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть не бол ь ш их ге номов патоге нны х бакте рий – микопл азмы и ге мофил ь ной пал очки, ав 1996-98 гг. бы л и рас ш ифрованы ге номы е щ е 15 бакте рий , в том чис л е рикке тс ии (возбудите л я тифа), микобакте рии (причины тубе ркул е за), ге л иобакте ра– не давно откры той бакте рии, которая явл яе тс я ис точником гас тритов и язвы же л удка. И зучение ге номов этих бакте рий позвол ил о вы яс нить ге не тичес кую природу их патоге ннос ти, иде нтифиц ировать с оотве тс твую щ ие ге ны . Н априме р, у бол ь ного ге мофил ие й най де но 115 ге нов, которы х не т у не патоге нны х бакте рий , из них бол е е 80 отве чаю т завзаимоде й с твие бакте рии с кл е ткой хозяинаи с те пе нь бол е зне творнос ти. У кл ас с ичес кого моде л ь ного объе ктаге не тики – киш е чной пал очки (E.coli), ге ном которой с ос тавл яе т ≈4,6 мл н пн, обнаруже но ≈ 4 ты с . ге нов, из них у 40% функц ии е щ е не изве с тны . Ге ном прос те й ш их эукариотичес ких организмов – дрожже й с ос тоит из 12 мл н. пн и приме рно 6 ты с . ге нов, однако функц ии 2 ты с . ге нов до с их пор не изве с тны . П оэтому с е й час ос обое внимание учены х с конц е нтрировано навы яс не ние функц ий разны х ге нов. Кл ю чевой пробл емой , которую не обходимо ре ш ить в с вязи с пол учение м бол ь ш ого кол ичес тва новой информац ии, явл яе тс я с оотне с е ние пе рвичны х с труктур откры вае мы х новы х ге нов с функц иями кодируе мы х этими ге нами бе л ков и нукл е иновы х кис л от. Структурно-функц ионал ь ны й анал из ге нома чел ове ка ос обе нно важе н дл я кл иничес кой ме диц ины , с тавящ е й пе ред с обой задачи не тол ь ко диагнос тики нас л е дс тве нны х бол е зне й , но и л е чения – ге ноте рапии. Бл агодаря ге номике возникл о новое понимание мол е кул ярны х ме ханизмов забол е ваний , ис пол ь зую тс я новы е подходы в с оздании л е карс тв, новы е диагно-
42
с тичес кие те с ты . П оявил ас ь фармакоге номика– наука, явл яю щ аяс я одновре ме нно ос новой пре одол е ния л е карс тве нной ре зис те нтнос ти и ос новой индивидуал ь ной фармакоте рапии. Н аконе ц , ге номика пол ожил а начал о пол учению транс ге нны х животны х и рас те ний ме диц инс кого назначения. 2.2. О рт ологи чные и паралоги чные гены Сравне ние ге номов организмов разны х видов (про- и эукариот) показал о, что с ущ е с твуе т фундаме нтал ь ны й набор ге нов, общ ий дл я вс е х организмов, бе л ковы е продукты которы х л е гко рас познаю тс я у вс е х них. Э то подтве рждае т гипоте зу об общ е м пре дш е с тве ннике дл я вс е х организмов. Такие ге ны пол учил и название ортологичные гены (ил и ортологи). Ге ны – ортол оги произош л и от одного ге на в общ е м пре дковом организме и с охранил и одну и ту же функц ию в проц е с с е эвол ю ц ии. О ни кодирую т с трое ние кл ю чевы х макромол е кул кл е тки, учас твую щ их в проц е с с ах ре пл икац ии, транс крипц ии, транс л яц ии и ре парац ии ге не тичес кого мате риал а. О чевидно, что такие ос новопол агаю щ ие ме ханизмы биол огичес кой организац ии, с л оживш ие с я мил л ионы л е т назад, уже не могут бы ть изме не ны в нас тоящ е е время так же , как не могут бы ть изме не ны ге не тичес кий код, с трое ние рибос ом, нукл е ос ом и многие другие с ис те мы многоуровне вой биол огичес кой организац ии. П оэтому мутац ии ортол огов, как правил о, л е тал ь ны . Таким образом, ортологи – это гомологичныегены в геномах разных организмов, которые п роизошли от одного гена в общ ем п редковом организме и сохранили одну и ту ж е функц ию в п роц ессе эволю ц ии. Н е подве ргаю тс я изме не ниям в нас тоящ е е вре мя и ре гул яторны е эл е ме нты , контрол ирую щ ие кл ю чевы е этапы онтоге не завы с ш их рас те ний и животны х. Типичны й приме р ортол огичны х ге нов – гис тоновы е ге ны , кодирую щ ие бе л ки гис тоны (H1, H2A, H2B и H3), учас твую щ ие в образовании нукл е ос ом при пе рвом уровне компактизац ии Д Н К в с ос таве хромос ом. Сущ е с твование ортол огичны х ге нов позвол яе т припис ы вать базовы е биохимичес кие функц ии пос л е довате л ь нос тям одного организманаос новании их гомол огии с пос л е довате л ь нос тями другого (п озиц ионное клонирование). О с обе нно час то такой подход ис пол ь зую т дл я “припис ы вания” функц ий ге нам, вовл е ченны м в возникнове ние нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка. Так, с труктура кл онированны х и с е кве нированны х ге нов чел ове ка MSH2 и MLH1, отве тс тве нны х занас л е дс тве нную пре драс пол оже ннос ть к не пол ипозному раку тол с той киш ки, оказал ас ь гомол огичной дрожже вы м и бакте риал ь ны м ге нам, вовл е ченны м в ре парац ию . В отл ичие от ортол огов п аралогичныегены, ил и п аралоги, возникаю т путе м внутриге номны х дупл икац ий и могут эвол ю ц ионировать с приобре те ние м новы х функц ий . П арал огичны е ге ны обе с пе чиваю т видам адаптац ию кме няю щ имс я ус л овиям окружаю щ е й с ре ды . И де нтификац ия ортол огов и парал огов очень важна дл я функц ионал ь ны х вы водов набазе с равне ния ге номов.
43
И с с л е довать функц ии ге нов бол е е прос ты х организмов л е гче, чем бол е е с л ожны х, апо гомол огии пос л е довате л ь нос тей ге нов можно с удить и об анал огии их функц ий . 2.3. “О б рат ная генет и к а” Г еномика ис пол ь зуе т ме тоды так назы вае мой “обратной генетики” , которая в отл ичие от кл ас с ичес кой ге не тики, изучаю щ е й вначал е признаки, азате м контрол ирую щ ие их ге ны (признак→ге н), иде т в обратном направл е нии - от иде нтификац ии ге напри отс утс твии вс якой информац ии о не м к изучению е го функц ии (ге н→признак). О братнаягенетика пол учил аразвитие в проц е с с е разработки ме ждународной программы “Ге ном чел ове ка” . Традиц ионно работы по изучению функц ий ге нов проводил ис ь так. И с кус с тве нно пол учал и ил и в природны х попул яц иях находил и мутантны е организмы , в которы х какая-то функц ия (признак) бы л анаруш е на, наприме р, мух с наруш е ниями пигме нтац ии гл аз, микроорганизмов с с е рие й биохимичес ких мутац ий , и с помощ ь ю кл ас с ичес ких ге не тичес ких экс пе риме нтов пы тал ис ь опре де л ить , какой ге н “отве чае т” заданную функц ию . Такой подход назы ваю т п рямой генетикой. Как уже отме чал ос ь вы ш е , с е годня рас ш ифрована пол ная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть многих ге нов разл ичны х организмов, однако функц ия бол ь ш инс тва из них не изве с тна. “О братная ге не тика” пы тае тс я вы явить функц ии ге на, ис ходя из изве с тной нукл е отидной пос л едовате л ь нос ти. Н априме р, е с л и какой -то ге н с не извес тной функц ие й гомол огичен уже изве с тному ге ну другого организма, то можно с казать , что функц ии этих ге нов с ходны . Н о что же де л ать , е с л и с равне ние пос л е довате л ь нос ти изучае мого ге на не вы явл яе т гомол огии с уже изве с тны ми ге нами? О дин из возможны х с пос обов ре ш е ния этой пробл е мы – ис пол ь зование не давно откры того дл я рас те ний и не которы х животны х фе номе на – Р Н К -интерференц ии. Суть е го закл ю чае тс я в с л е дую щ е м. П ри вве де нии ис кус с тве нно с инте зированной двухц е почечной Р Н К, гомол огичной изучае мому ге ну, проис ходит “вы кл ю чение ” е го работы , организмы с тановятс я мутантны ми по данному ге ну, т.е . наруш ае тс я функц ия с оотве тс твую щ е го ге на. Н априме р, вве де ние в не матоду Caenorhabditis elegans двуц е почечной Р Н К, гомол огичной ге ну rol, зас тавл яе т червяков с ворачивать с я в кол ь ц а, так как у них наруш ае тс я с инте з с пе ц иал ь ны х мы ш е чны х бе л ков – актинов. О с обе нно много подобны х работ проводят на кл ас с ичес ких объе ктах ге не тики муш ке дрозофил е и не матоде . Страте гия “обратной генетики” приме ните л ь но к поис ку ге нов пол учил а вопл ощ е ние в п озиц ионном клонировании, которое подразуме вае т л окал изац ию ге напри отс утс твии вс якой информац ии о е го функц ии, т.е . о кодируе мом ге ном бе л ке . П ре дварите л ь но ме с то ге нанахромос омной карте ус танавл иваю т по е го с ц е пл е нию с изве с тны м ге не тичес ким марке ром,
44
наприме р, с ус тановл е нны м ге ном, отве тс тве нны м заопреде л е ние нас л е дс тве нного забол е вания. П ос л е этого ос ущ е с твл яю т позиц ионное кл онирование и с е кве нирование ге на, функц ия которого не изве с тна. П роц е дурас е кве нирования, как уже бы л о с казано вы ш е , с е й час пол нос ть ю автоматизирована, как и с равне ние ге номов, и они пре дс тавл яю т с обой “компь ю те рое мкие ” и “инте л л е ктуал ь ное мкие ” проц е дуры . 2.4. П рот еом и прот еоми к а О дним из не обходимы х ус л овий функц ионал ь ного анал иза ге нома явл яе тс я также познание е го п ротеома. Те рмин “п ротеом” появил с я уже в 1994 году дляоп исаниясовокуп ности белков, эксп рессируемых геномом на п ротяж ении ж изни клетки. П ол ное познание проте ома– одно из не обходимы х ус л овий функц ионал ь ного анал изаге нома. Н аукао наборах бе л ков в кл е тках при разны х физиол огичес ких с ос тояниях и функц иях этих бе л ков пол учил а название п ротеомика. Задачапроте омики нане с кол ь ко порядков с л ожне е , чем у ге номики – инве нтарзац ия бе л ков, т.е . ре ал ь но работаю щ их ге нов в кл е тке . С ущ ественнаяразниц а меж ду геномикой и п ротеомикой, обусловлена тем, что геном данного вида, как п равило, достаточно стабилен, в то времякак п ротеом индивидуален не только дляразных клеток одного индивида, но и дляодной клетки в зависимости от ее состояния(деление, п окой, дифференц ировка и т.д.). Т.е . проте ом – понятие динамичное (в отл ичие от ге нома). Э то с вязано с те м, что в кл е тках про- и эукариот никогда не проис ходит экс пре с с ия вс е х име ю щ ихс я в нал ичии ге нов, ал иш ь час ти из них. Бе л ки ил и проте ины (отс ю дапроте ом) – продукты ге нной активнос ти, вы пол няю т в кл е тке и многокл е точном организме с амы е разнообразны е биол огичес кие функц ии (ферме нты , рос товы е гормоны , ре ц е пторны е и ре гул яторны е бе л ки и т.д.). П ри этом общ ий с ос тав кл е точны х бе л ков пос тоянно ме няе тс я в завис имос ти от фазы ц икл акл е точного де л е ния, ткане вой принадл е жнос ти и с тадии диффе ре нц ировки у многокл е точны х организмов, вне ш них возде й с твий и т.д. Кроме того, помимо набора, ме няе тс я е щ е и кол ичес тво бе л ков: от не с кол ь ких мол е кул до не с кол ь ких ты с яч накл е тку. О с новной задачей проте омики явл яе тс я пре дс казание функц ионал ь ной рол и отде л ь ны х бе л ков путе м экс пе риментал ь ного с опос тавл е ния их качес тве нного и кол ичес тве нного с ос тава в кл е тке наразны х с тадиях и в разны х с ос тояниях е е развития. П омимо этого, в задачу проте омики входит ус тановл е ние взаимос вязи ме жду с труктурой бе л каи е го функц иями, что впл отную с бл ижае т это направл е ние с функц ионал ь ной ге номикой . В ажной задачей явл яе тс я понимание ме ханизмов фол динга бе л ков, т.е . с кл ады вания пол ипе птидной ц е пи в функц ионал ь но активную тре хме рную с труктуру. О т прос транс тве нного (тре хме рного) с трое ния бе л ков завис ит их биол огичес кая функц ия. П онимание ме ханизмов фол дингатакже важно дл я биоте хнол огии и развития бе л ковой инже не рии. Кроме того, возник-
45
нове ние многих не й роде ге не ративны х забол е ваний у чел ове каи животны х (наибол е е яркий приме р – коровь е бе ш е нс тво) с вязано с нал ичие м в их организме прионов – бе л ков с не нормал ь ны м фол дингом. В проте омике с разу бы л взят ме диц инс кий укл он: в пе рвую очере дь с тал и изучать те бел ки, которы е важны дл я понимания ме ханизмазабол е вания и диагнос тики. П роте ом чел ове ка с оде ржит ≈ 250 ты с . разл ичны х бе л ков, в то вре мя как чис л о бе л ок-кодирую щ их ге нов вс е го ≈ 32 ты с . Такое оказал ос ь возможны м бл агодаря ал ь те рнативному с пл ай с ингу и с виде те л ь с твуе т о том, что в ге номе ос ущ е с твл яе тс я принц ип экономии генетического материала (комп актная зап ись), а с другой с тороны , бл агодаря ре гул ируе мой комбинаторике экзонов дос тигае тс я бол ь ш ой вы бор ге нны х продуктов – бе л ков. 2.5. ДНК-ми к рочи пы (ДНК-поля) и при меры и х и спользовани я для и зучени я геномов Н овы м дос тиже ние м изучения ге номов явл яе тс я с оздание Д Н Кмикрочипов – Д Н К-анал изирую щ их матриц . М икрочип пре дс тавл яе т с обой с те кл янную подл ожку разме ром не с кол ь ко с антиме тров, накоторую робот нанос ит (иммобил изуе т = химичес ки приш ивае т с помощ ь ю ул ь трафиол е та) дл инны е фрагме нты ге нов (Д Н К-пробы дл иной до 1000 нукл е отидов) ил и кД Н К (чащ е ). П е ре д нане с е ние м на чип мол е кул ы Д Н К ампл ифиц ирую тс я (умножаю тс я) с помощ ь ю П Ц Р . Ул ь трафиол е т с тимул ируе т образование химичес ких с вязе й ме жду с те кл ом и Д Н К. М атриц ас ос тоит из с оте н и ты с ячячее к. П л относ ть ячее к-пол е й с ос тавл яе т 1 мл н. точекна1 с м2, где каждая точка– отде л ь ная проба. Н атакой биочип (разме ром вс е го не с кол ь ко с м) можно “пол ожить ” с разу ве с ь ге ном той ил и иной живой с ис те мы . В каждой из этих ячее к закре пл е н маркированны й фрагме нт, пол ученны й в ре зул ь тате разре зания ис ходной мол е кул ы Д Н К наогромное чис л о фрагме нтов. Д л инафрагме нтов во вс е х ячей ках одинаковая, отл ичаю тс я они л иш ь пос л е довате л ь нос ть ю нукл е отидов. Совре ме нны е Д Н К-пол я уже с е й час с оде ржат до 10 ты с . ге нов наодин чип. Э ффе ктивнос ть микрочипов обус л овл е навозможнос ть ю парал л е л ь ного прове де ния огромного кол ичес тва с пе ц ифичес ких ре акц ий и взаимодей с твий мол екул биопол име ров. Н а рис унке 15 показан принц ип де й с твия ячей ки Д Н К микрочипа, ос нованного накомпл е ме нтарны х взаимоде й с твиях A с T и G с C в двух нитях Д Н К. Ф рагме нт одноц е почечной Д Н К фикс ирован в одной из ячее к микрочипаи избирате л ь но с вязы вае т из многих добавл е нны х к микрочипу фл уоре с ц е нтно ме чены х фрагме нтов Д Н К (наприме р, ге нома чел ове ка) тол ь ко компл е ме нтарны й . Т.е . е с л и пос л е довате л ь нос ть ос нований в одной нити Д Н К (ил и ол игонукл е отида) пол нос ть ю компл е ме нтарна пос л е довате л ь нос ти другой нити, то образуе тс я с табил ь ная двухнитчатая с пирал ь – дупл е кс . В ре зул ь тате тол ь ко этот эл е ме нт микрочипаначинае т с ве тить с я. П рис утс твие не компл е ме нтарной пары , наприме р G-G, пре дотвращ ае т об-
46
разование дупл е кс аи ос тавл яе т эл е ме нт микрочипате мны м. Таким образом, один эл е ме нт микрочипапроизводит одну вы борку приме рно из трил л ионавозможны х вариантов.
Р ис унок 15. Схе маобразования двой ной с пирал и Д Н К намикрочипе [М ирзабе ков, 2003]. С помощ ь ю микрочипов можно пол учить данны е о с ос тоянии вс е х ге нов организма, т.е . оц е нить , какие ге ны ре ал ь но работаю т (экс пре с с ирую тс я) в кл е тке в данны й моме нт вре ме ни. Ге н функц ионируе т, когдас не го с читы вае тс я информац ия и с инте зируе тс я Р Н К. И з кл е тки вы де л яю т с ме с ь продуктов разл ичны х ге нов (т.е . мР Н К разл ичны х типов), производимы х в данны й моме нт индивидуал ь ного развития. Р Н К (вы с тупаю щ ую в качес тве зонда) ме тят фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями и нанос ят намикрочип, с оде ржащ ий Д Н К дл я гибридизац ии Д Н К-Р Н К. В с ю работу вы пол няю т роботы . М е с тагибридизац ии Д Н КР Н К вы явл яю тс я путе м с канирования микрочипал азе ром. Н ос ите л е м информац ии явл яю тс я инте нс ивнос ть и ц ве т изл учения. Ге ны нас те кл е даю т с игнал ы разл ичной инте нс ивнос ти, которы е обрабаты ваю тс я с помощ ь ю компь ю те ров (рис унок16). И зготовл е ние одного микрочипа занимае т от тре х до ш е с ти не де л ь (при ус л овии, что в рас поряже нии ис с л е довате л я е с ть ге не тичес кий мате риал дл я нане с е ния начип). Сам экс периме нт (гибридизац ия и с нятие данны х) занимае т 1-2 дня. П ри традиц ионной же те хнол огии потре бовал ис ь бы годы на пос л е довате л ь ное прове де ние вс е х экс пе риме нтов, вкл ю ченны х в один биочип. В пе рвы е работу по изучению экс пре с с ии бол ь ш ого чис л а ге нов на уровне ц е л ого ге номавы пол нил и М . Ш е н с с отрудниками в 1995 г., с оздав микрочип наос нове ампл ифиц ированны х в П Ц Р фрагме нтов кД Н К дл я 48 ге нов рас те ния Arabidopsis thaliana. И з л ис ть е в и корне й рас те ний вы де л ял и с уммарную мР Н К, фл уоре с ц е нтно ме тил и в ре акц ии обратной транс -
47
крипц ии и гибридизировал и с с озданны м микрочипом. Р е зул ь таты анал иза проде монс трировал и, что экс пре с с ия изученны х ге нов в л ис ть ях и корнях одного и того же рас те ния разл ичаю тс я.
Р ис унок 16. Схе ма, ил л ю с трирую щ ая принц ип работы микрочипа(Григорян, 2001).
Д Н К-
Час то с оздаю т с пе ц иал изированны е микроматриц ы дл я анал изаэкс пре с с ии опре де л е нны х типов ге нов: контрол ирую щ их кл е точны й ц икл , апоптоз, с пл ай с инг, транс л яц ию , с инте з ц икл инов, факторов с ве рты вания крови, факторов транс крипц ии и др. Н априме р, Т. Ш е нк с с отрудниками (1998 г.), ис пол ь зуя четы ре микрочипа, с оде ржащ их в с умме фрагме нты кД Н К дл я 6600 ге нов чел ове ка, изучил и напе рвичной кул ь туре фибробл ас тов кожи чел ове ка, как инфиц ирование ц итоме гал овирус ом чел ове ка вл ияе т наэкс пре с с ию этих ге нов. О казал ос ь , что данная вирус ная инфе кц ия дос тове рно изме няе т (уве л ичивае т ил и уме нь ш ае т) экс пре с с ию 258 ге нов. Д ругая группаучены х наос нове данны х с е кве нирования Д Н К ц итоме гал овирус а чел ове ка с оздал а в 1998 году микрочип нукл е отиды , с оотве тс твую щ ие вс е м те оре тичес ки пре дс казанны м откры ты м рамкам транс л яц ии (О Р Т). Д л я 151 О Р Т бы л адоказанапродукц ия с пе ц ифичес ких мР Н К и вы явл е но вре мя их биос инте зав проц е с с е инфе кц ии. А . В ант-В оут с с оавторами (2003) ис с л е довал и экс пре с с ию 271 ге на кл е ток чел ове кав ус л овиях инфиц ирования их вирус ом гриппатипаА , вирус ом иммунодефиц итачел ове ка, атакже под де й с твие м инте рфе ронаил и те пл ового ш ока. О казал ос ь , что каждое возде й с твие по-разному отражае тс я наэкс пре с с ию данны х ге нов. В то же вре мя обнаруже но с ходс тво в ре гул яц ии экс пре с с ии рядаге нов при инфе кц ии кл е токвирус ом гриппаи под
48
вл ияние м инте рфе рона, что указы вае т важнос ть инте рфе ронового отве та при зараже нии данны м вирус ом. И с пол ь зуя микрочипы , можно диагнос тировать не тол ь ко врожде нны е забол е вания, но и бол е зни, явл яю щ ие с я ре зул ь татом прижизненны х мутац ий в ге не тичес ком коде . Так, в ге номе чел ове кае с ть дваге на, которы е в норме рас пол оже ны дос таточно дал е ко друг от друга. В ре зул ь тате патол огичес ких пе ре с трое к в Д Н К они могут оказать с я по с ос е дс тву. Э тот факт с л ужит дос тове рны м с виде те л ь с твом начал а л е й коза (рака крови). Н априме р, таким с пос обом л е й коз вы явл яе тс я на не с кол ь ко л е т рань ш е , не же л и с тандартны м путе м. И многих л ю де й можно бы л о бы с пас ти, прой дя они вовре мя подобную прове рку. С помощ ь ю микрочипов можно диагнос тировать и разл ичны е подкл ас с ы ос трого л е й коза. Д л я этого ис пол ь зуе тс я микрочип, с оде ржащ ий 50 ге нов, с ил ь ное разл ичие экс пре с с ии которы х позвол яе т однозначно опре де л ить тип опухол и и вы брать нужны й курс те рапии. Сущ е с тве нную помощ ь микрочипы могут оказать и при пе ре с адке органов, ос новной пробл е мой которой явл яе тс я отторже ние импл антированны х ткане й иммунной с ис те мой чел ове ка. Чтобы избе жать отторже ния, не обходимо, чтобы бе л ки-марке ры гис тос овме с тимос ти на импл антированной ткани как можно ме нь ш е отл ичал ис ь от бе л ков-марке ров пац ие нта. П одходящ е го донора(в качес тве которого може т вы с тупать не тол ь ко чел ове к, но и кл онированное животное , например, с винь я), пе ре с адка органов от которого вы звал абы минимал ь ны й иммунны й отве т, можно подобрать с помощ ь ю микрочипов. О л игонукл е отидны е микрочипы ис пол ь зую т дл я с е квенирования (с е кве нирование гибридизац ие й ). Э то е щ е один (новы й ) подход, пре дл оже нны й в 1988 г. группой рос с ий с ких учены х И нс титута мол е кул ярной биол огии им. В .А . Э нге л ь гардтаР А Н под руководс твом А .Д . М ирзабе кова. Суть ме тодазакл ю чае тс я в с е кве нировании коротких фрагме нтов Д Н К путе м гибридизац ии с ол игонукл е отидами изве с тной пос л е довате л ь нос ти, которы е иммобил изованы намикрочипе в с трого опре де л е нном порядке . 2.6. Нек от орые и т оги сравни т ельного анали за геномов разли чных органи змов Кос не мс я л иш ь не которы х итогов с равните л ь ного анал иза пол ны х ге номов разл ичны х организмов. П о данны м с е кве нирования ге номачел ове кас уммарное чис л о ге нов, кодирую щ их бе л ки, с ос тавл яе т окол о 32 ты с яч. П ре жние оц е нки (80-100 ты с яч) бы л и завы ш е ны , так как характе ризовал и не чис л о с амих ге нов, а разнообразие транс крибируе мы х с них мол е кул Р Н К. Э кс пе риме нтал ь но (по функц ии продукта, нал ичию мутац ий , разме ру транс крипта, ткане с пе ц ифичнос ти и т.д.) охаракте ризовано покаокол о 6500 ге нов чел ове ка, то е с ть приме рно однаш е с тая час ть . Н аос нове гомол огии с изве с тны ми ге нами других организмов в ге номном с икве нс е чел о-
49
ве кавы явл е но е щ е окол о 11 ты с ячге нов. Кажды й из этих ге нов нане с е н на карту. Д л я 40% аннотированны х ге нов чел ове кафункц ия покане изве с тна. П о с равне нию с ге номами других эукариотичес ких организмов у чел ове ка бол ь ш е е рас прос тране ние пол учил и ге ны , учас твую щ ие в обе с пе чении иммунной защ иты , в развитии не рвной с ис те мы и др. У чел ове ка значите л ь но бол ь ш е е кол ичес тво ге нов учас твуе т в транс крипц ии и транс л яц ии. Сравне ние с труктур ге нов с е кве нированны х к нас тоящ е му вре ме ни ге номов чел ове ка, дрозофил ы , не матоды , дрожже й и бакте рий приводит к вы воду, что вс е живы е с ущ е с тва де й с твите л ь но произош л и от общ е го пре дш е с тве нника в ре зул ь тате дупл икац ий , модификац ий и разл ичного рода пе ре тас овок ге не тичес кого мате риал а. Р одс тве нны е ге ны -ортол оги л е гко иде нтифиц ирую тс я в ге номах вс е х вы ш е пе ре чис л е нны х организмов. О днако с ущ е с твую т также ге ны , кодирую щ ие продукты , с пе ц ифичны е дл я отде л ь ны х видов. В ге номе чел ове каучены е нас читал и 223 ге на, которы е с ходны с ге нами киш е чной пал очки. Киш е чная пал очка возникл а приме рно 3 мл рд. л е т назад. Зачем нам такие «дре вние » ге ны ? В идимо, с овре ме нны е организмы унас л е довал и от пре дков какие -то фундаме нтал ь ны е с труктурны е с вой с твакл е ток и биохимичес кие ре акц ии, дл я которы х не обходимы с оотве тс твую щ ие бе л ки. Н е т поэтому ничего удивите л ь ного и в том, что пол овинабе л ков мл е копитаю щ их име ю т с ходс тво аминокис л отны х пос л е довате л ь нос те й с бе л ками мухи дрозофил ы . Р е зул ь таты с равне ния ге номов показал и, что с мы ш ь ю мы име е м бол е е 80% общ их ге нов, ас ш импанзе – окол о 99%. В то же вре мя вы явл е но, что у 52% ге нов чел ове кае с ть такие экзоны , которы х не т у мы ш и. Как уже вы ш е отме чал ос ь , проте ом чел ове кас оде ржит почти в 8 раз бол ь ш е бе л ков (приме рно 250 ты с разл ичны х бе л ков) по с равне нию с чис л ом бе л ок-кодирую щ их ге нов (вс е го окол о 32 ты с . генов). Э то возможно бл агодаря ал ь те рнативному с пл ай с ингу, когда один ге н кодируе т в с вое й с трукте ре бол е е одного бе л ка(т.е . разны е бе л ки кодирую тс я разны ми с очетаниями экзонов одного и того же ге на). Д о 1998 г. с читал ос ь , что тол ь ко окол о 6% ге нов чел ове каиме ю т ал ь те рнативны й с пл ай с инг. Се й час изве с тно, что не ме не е 50% ге нов чел ове каал ь те рнативно с пл ай с ируе тс я. Самое явс тве нное разл ичие ме жду чел ове ком и мы ш ь ю и другими организмами с с е кве нированны ми ге номами с ос тоит в том, что бе л ки чел ове кас оде ржат бол ь ш е доме нов набе л ок и новы е комбинац ии доме нов. У чел ове ка име е тс я бол ь ш ое чис л о новы х бе л ков. Сущ е с твуе т пре дпол оже ние , что H. sapiens не “изобре л ” новы е ге ны , аис пол ь зовал с ущ е с твую щ ие с труктурны е доме ны , с обирая из них новы е бе л ки с новы ми функц иями. Ге ном чел ове какодируе т бол ь ш е парал огов и многодоме нны х бе л ков с бол ь ш им разнообразие м функц ий и архите ктуры доме нов по с равне нию с ге номами других эукариот. Е щ е один вы вод: число генов не коррелирует со слож ностью организма. В рас с читанном с уммарном разме ре ге нома – 3,2 мл рд пн – бол е е
50
пол овины Д Н К занимаю т разны е виды повторяю щ ихс я пос л е довате л ь нос те й , ав ос тавш е й с я пол овине 1,1% ге номас ос тавл яю т экзоны , 24% - интроны , 75% - ме жге нная Д Н К. П ричем, чис л о с труктурны х (бе л оккодирую щ их) ге нов у чел ове кас ос тавл яе т вс е го л иш ь 3-5%, а95% приходитс я надол ю так назы вае мой избы точной (час то повторяю щ е й с я) Д Н К. Такого ге номного “мус ора” не т ни у бакте рий , ни у прос те й ш их однокл е точны х эукариотичес ких микроорганизмов – дрожже й . Чис л о ге нов, кодирую щ их бе л ки, в ге номе чел ове кал иш ь в дваразабол ь ш е , чем у червя C. elegans (32 ты с ячи 19 ты с ячс оотве тс тве нно) и приме рно равно чис л у кодирую щ их ге нов в ге номе Arabidopsis taliana (26 ты с яч) и ры бы фугу. То е с ть по чис л у ге нов мы уш л и с овс е м не дал е ко от прос те й ш их многокл е точны х организмов, хотя с читае м с е бя “ц арями природы ” и “ве нц ом эвол ю ц ии” . Бол е е того, ге ном такого с л ожного с ущ е с тва, как пл одовой муш ки D. melanogaster, с оде ржит в с е бе даже ме нь ш е ге нов (окол о 13 ты с яч), чем ге ном довол ь но примитивного червя (19 ты с яч). Н е трудно увиде ть огромное разл ичие в с л ожнос ти C. elegans и H. sapiens. Каким образом с кромное разл ичие в чис л е ге нов дае т разры в в с л ожнос ти организмов? Д ире ктор Инс титутамол е кул ярной ге не тики Р А Н , акаде мик Е .Д . Све рдл ов с читае т, что наибол е е ве роятны ми факторами такого разл ичия явл яю тс я с л е дую щ ие : 1. Сил ь ное уве л ичение функц ионал ь ной нагрузки наодин ге н в проц е с с е эвол ю ц ии; в ре зул ь тате один ге н чел ове ка вы пол няе т с ущ е с тве нно бол ь ш е функц ий , чем один ге н чел ове ка. 2. Р е зкое возрас тание комбинаторны х с очетаний продуктов, вовл е ченны х в вы пол не ние одной функц ии, поэтому однафункц ия вы пол няе тс я множе с твом ге нов, кажды й из которы х вы пол няе т также и другие функц ии. В озникаю т с л ожны е с е ти ге нны х взаимоде й с твий ; в ре зул ь тате почти вс е многообразие признаков пре дс тавл яю т с обой с л ожны е признаки, чре звы чай но трудно поддаю щ ие с я традиц ионному ге не тичес кому анал изу. 3. В озрас тание комбинаторны х с очетаний с опровождае тс я ус л ожне ние м с ис те мы регул яц ии экс пре с с ии ге нов, которая позвол яе т одному и тому же ге ну экс пре с с ировать с я в разное вре мя развития организма и в разны х диффе ре нц ированны х кл е тках. 4. М ноже с тво ге нов не кодирую т никаких бе л ков и вы пол няю т с вои функц ии в виде Р Н К. Е щ е одним отл ичие м с труктуры ге нома, с вязанны м с ре гул яц ие й ге нной активнос ти, явл яе тс я то, что у чел ове каэкзоны намного короче по с равне нию с другими изученны ми организмами, аинтроны – дл инне е . Кроме ус тановл е ния пол ной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти ге номачел ове ка, ве дутс я ис с л е дования по с равне нию ге номов разны х л ю де й дл я вы явл е ния их индивидуал ь ны х ос обе ннос те й . Э ти ис с л е дования привл е каю т внимание в с вязи с те м, что наос нове данны х о разнообразии ге нома ре конс труируе тс я ис тория проис хожде ния чел ове ка как биол огичес кого вида и ис тория формирования народов. И с с л е дования важны и дл я ме диц ины , так как разл ичны е попул яц ии характе ризую тс я с воим с пе ктром
51
бол е зне творны х мутац ий , и знание этих ос обе ннос те й с ущ е с тве нно дл я разработки с трате гий мол е кул ярной диагнос тики забол е ваний . В ге номе чел ове канай де но бол е е двух мил л ионов позиц ий , в которы х у разны х л ю де й находятс я разл ичаю щ ие с я нукл е отиды (так назы вае мы е однонукл е отидны е пол иморфизмы , Single Nucleotide Polymorfisms, с окращ енно SNP). М е не е 1% этих SNP приводят к изме не нию пос л е довате л ь нос ти бе л ков. С кажды м годом обнаруживае тс я вс е бол ь ш е ге нов, мутац ии по которы м проводят к опре де л е нны м забол е ваниям чел ове ка. В нас тоящ е е вре мя их вы явл е но бол е е 1,4 ты с . Такие ис с л е дования могут ре вол ю ц ионизировать ме диц инс кую науку. Сравне ние ге номов дал о возможнос ть оц е нить минимал ь ное кол ичес тво ге нов (минимал ь ны й разме р ге нома) однокл е точны х организмов, не обходимое дл я подде ржания кл е точной жизни. Р е ш е ние данного вопрос а не обходимо дл я понимания проис хожде ния жизни наЗе мл е , атакже путе й и ме ханизмов с овме с тного эвол ю ц ионирования ге нов, объе дине нны х в конкре тны е ге номы , ас л е довате л ь но, и ме ханизмов возникнове ния ге номов как таковы х. В качес тве моде л и минимал ь ной живой кл е тки бы л и взяты два бл изкородс тве нны х вида микопл азмы , име ю щ их с амы е мал е нь кие ге номы из изве с тны х и явл яю щ ие с я паразитами. О ни пол учаю т многие не обходимы е продукты от хозяе в. Mycoplasma genitalium с оде ржит 517 ге нов. П уте м мутац ий с ис те матичес ки уничтожаю т ге н заге ном дл я того, чтобы вы явить тот минимум, которы й явл яе тс я дос таточны м дл я обе с пе чения жизне де яте л ь нос ти бакте рии. Ус тановл е но, что тол ь ко 265-350 ге нов из 480 ге нов бакте рии, кодирую щ их бе л ок, абс ол ю тно не обходимы дл я с ущ е с твования с вободноживущ их кл е ток (в л абораторны х ус л овиях). К ним относ ятс я: почти пол ны й набор ге нов с ис те мы транс л яц ии; почти пол ны й набор ге нов с ис те мы ре пл икац ии; ге ны рудиме нтарной с ис те мы ре парац ии и ре комбинац ии; ге ны аппарататранс крипц ии, в котором отс утс твую т почти пол нос ть ю ге ны ре гул яц ии транс крипц ии; бол ь ш ой набор ге нов, кодирую щ их бе л ки, гомол огичны е ш аперонам; ге ны , контрол ирую щ ие анаэробны й ме табол изм, вкл ю чая ге ны гл икол иза и фос форил ирования с убс тратов; ге ны биос инте за л ипидов; вос е мь ге нов, кодирую щ их фе рме нты , которы е ис пол ь зую т с л ожны е кофакторы ; ге ны с ис те мы транс порта бе л ков; ограниченны й набор ге нов, обе с пе чиваю щ ий транс порт ме табол итов; пол ны й набор ге нов утил изац ии нукл е отидов de novo и ге ны их биос инте за; ге ны биос инте зааминокис л от не вкл ю чены (пос кол ь ку пре дпол агае тс я паразитичес кий образ жизни). 3. О Б Л А С ТИ ПРИ М Е Н Е Н И Я Р Е З У Л Ь ТА ТО В К А РТИ Р О В А Н И Я ГЕ Н О М А 3.1. Геномная меди ц и на. ДНК-ди агност и к а Традиц ионная диагнос тика нас л е дс твенны х и инфе кц ионны х забол е ваний с троитс я наде тал ь ном изучении с имптомов и прове де нии много-
52
чис л е нны х биохимичес ких анал изов, вкл ю чая кул ь тивирование патоге нны х микроорганизмов нас л ожны х питате л ь ны х с ре дах. П ри этом вы явл е ние бе с с имптомного нос ите л ь с тва вре дны х ал л е л е й и микроорганизмоввозбудите л е й пре вращ ае тс я в чре звы чай но трудое мкую задачу. В час тнос ти, традиц ионны ми ц итоге не тичес кими ме тодами можно вы явить в ге номе чел ове ка л иш ь не которы е крупны е хромос омны е пе ре с трой ки: протяже нны е де л е ц ии и транс л окац ии ге не тичес кого мате риал а, поте рю ил и приобре те ние ц е л ы х хромос ом. П ри этом ме л кие де л е ц ии, транс л окац ии и вс тавки, а также точковы е мутац ии, которы е явл яю тс я наибол е е час то вс тре чаю щ имис я изме не ниями ге не тичес кого материал а, ос таю тс я не обнаруже нны ми. То же име е т ме с то и при диагнос тике бе с с имптомного нос ите л ь с твавозбудите л е й инфе кц ионны х забол е ваний бакте риал ь ной и вирус ной природы , наприме р вирус а иммуноде фиц ита чел ове ка, которы е в л ате нтной с тадии инфе кц ии могут прис утс твовать в организме чел ове ка л иш ь в не бол ь ш ом чис л е копий . Р ас ш ифровкас труктуры ге номачел ове ка, атакже разработкановы х ме тодов мол е кул ярной биол огии, и ос обе нно ме тод П Ц Р , откры л и не дос тупны е ране е возможнос ти дл я понимания мол е кул ярны х ос нов нас л е дс тве нны х бол е зне й и разработки новы х с трате гий диагнос тики и л е чения (нас л е дс тве нны х и инфе кц ионны х забол е ваний ). П ри этом мутац ии вы явл яю тс я в Д Н К кл иничес ких образц ов, а бе с с имптомное прис утс твие возбудите л е й обнаруживаю т по нал ичию ге номны х Д Н К ил и Р Н К с оотве тс твую щ их вирус ов ил и бакте рий . В с е го изве с тно 5 ты с . нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка(Н ЗЧ), из них 2 ты с . – тяже л ы х рас с трой с тв, приводящ их к инвал иднос ти. Н аибол е е пол но изучены моноге нны е забол е вания, возникаю щ ие в ре зул ь тате наруш е ния работы одного ге на. И х изве с тно уже бол е е ты с ячи. Э то, наприме р, фе нил ке тонурия, ге мофил ия, пигме нтная кс е роде рмаи др. О днако бол ь ш инс тво нас л е дс тве нны х бол е зне й с вязано с одновре ме нны м наруш е ние м работы не с кол ь ких ге нов нафоне возде й с твия опре де л е нны х факторов вне ш не й с ре ды . Э то так назы вае мы е мул ь тификториал ь ны е (многофакторны е ) бол е зни. В той ил и иной с те пе ни нас л е дс тве нны е ос обе ннос ти опре де л яю т вос приимчивос ть ил и ус той чивос ть к бол ь ш инс тву забол е ваний , в том чис л е и кинфе кц ионны м. Ге номны е ис с л е дования позвол яю т вы явить пре драс пол оже ннос ть к ряду патол огий нал ю бой с тадии развития организма. Э то рас ш иряе т возможнос ти пре с имптоматичес кой (проявл е ние бол е зни е щ е не набл ю дае тс я – “бол е зне нны й ” ге н проявит с е бя в бол е е поздне м возрас те ), дородовой и пре импл антац ионной (пре дш е с твую щ е й вне дре нию зароды ш а в матку) диагнос тики. В пос л е дне м с л учае ряд яй ц е кл е ток мате ри опл одотворяю тс я in vitro (в пробирке ), зате м не с кол ь ко зароды ш е й развиваю тс я до с тадии 8 кл е ток, и 1-2 кл е тки зароды ш аанал изирую тс я нанал ичие повре жде нного ге на. Зароды ш , не с оде ржащ ий повре жде нного ге на, импл антируе тс я в матку. В бол ь ш инс тве с л учае в проводитс я анал из Д Н К, пол ученной обы чно из крови ил и других биол огичес ких образц ов индивида. Гл авное пре -
53
имущ е с тво Д Н К-диагнос тики – это возможнос ть ус тановить пе рвопричину патол огии, т.е . наруш е ния с труктуры ге на. С помощ ь ю Д Н К-диагнос тики с е й час вы явл яю т уже бол е е 500 Н ЗЧ, в том чис л е 50 наибол е е рас прос тране нны х вы явл яю т в Р ос с ии. М ол е кул ярно-ге не тичес кие ме тоды , т.е . ме тоды Д Н К-диагнос тики прочно вош л и в медико-ге не тичес кую практику с 70-80х годов XX ве ка. В с е они ос нованы навы явл е нии и изучении мутац ий и могут бы ть подразде л е ны нап рямыеи косвенные. П рямые ме тоды Д Н К-диагнос тики возможны л иш ь при ус л овии, что ге н забол е вания кл онирован, изве с тнае го экзон - интронная организац ия ил и нукл е отидная пос л едовате л ь нос ть е го кД Н К. П ос кол ь ку пре дме том анал изапри этом явл яю тс я мутац ии гена, эффе ктивнос ть прямой диагнос тики с ос тавл яе т 100%. О днако ге ны бол ь ш инс тванас л е дс тве нны х забол е ваний е щ е не кл онированы ил и забол е вание може т бы ть обус л овл е но повре жде ние м не с кол ь ких ге нов. В таких с л учаях приме няю т косвенные ме тоды Д Н К-диагнос тики, ос нованны е на ис пол ь зовании с ц е пл е нны х с ге ном пол иморфны х марке ров. П оэтому не обходимы м ус л овие м ис пол ь зования кос ве нны х ме тодов Д Н К-диагнос тики явл яе тс я обязате л ь ное пре дварите л ь ное изучение ге нотипа (гапл отипа) хотя бы одного пораже нного родс тве нника. Сре ди ос новны х ме тодов Д Н К-диагнос тики вы де л яю т: - разл ичны е ме тоды мол е кул ярной гибридизац ии нукл е иновы х кис л от: гибридизац ия in situ (ISH- и FISH- гибридизац ия), дот-гибридизац ия, дозовы й бл от-гибридизац ионны й анал из и др., час ть из которы х бы л и рас с мотре ны вы ш е ; - анал из пол иморфизмадл ин ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ); - пол имеразная ц е пная ре акц ия (П Ц Р ); - анал из пол иморфизмамикрос ате л л итны х пос л е довате л ь нос те й . Д от-гибр идизация. П ри диагнос тике инфе кц ионны х забол е ваний час то ис пол ь зую т ме тод дот-гибридизац ии (от англ . dot – точка). Э тот ме тод явл яе тс я модификац ие й ме тодамол е кул ярной гибридизац ии и приме няе тс я, когдане обходимо ус тановить факт нал ичия опре де л е нной нукл е отидной пос л довате л ь нос ти в ис с л е дуе мы х образц ах и оц е нить е е кол ичес тво. И з подходящ е й ткани (крови, амниотичес кой жидкос ти, пл ац е нты , удал е нной опухол и ил и с пе рмы чел ове ка; пе чени ил и хвос та мы ш и; л ис ть е в рас те ния и т.д.) вы де л яю т с уммарную Д Н К. О бразц ы Д Н К нанос ят на микропорис ты й (нитроц е л л ю л озны й ил и капроновы й ) фил ь тр, де натурирую т и иммобил изую т обл учение м ул ь трафиол е том, пос л е чего инкубирую т с ме чены м зондом. П ри этом на один фил ь тр могут бы ть нане с е ны де с ятки образц ов нукл е иновы х кис л от, вы де л е нны х из биол огичес ких жидкос те й разны х пац ие нтов. М е чены е зонды , ис пол ь зуе мы е в диагнос тике , компл е ме нтарны какой -л ибо пос л е довате л ь нос ти Д Н К ил и Р Н К (в с л учае зараже ния Р Н К-с оде ржащ ими вирус ами), с пе ц ифичной дл я возбудите л я забол е вания. За не с кол ь ко час ов можно пол учить отве т, инфиц ирован л и пац ие нт опре де л е нны м вирус ом ил и микроорганизмом и как много чу-
54
же родной нукл е иновой кис л оты прис утс твуе т в образц е . О т ре зул ь татов такого анал изазавис ит тактикал е чения бол ь ного. Б лот-гибр идизация. В том с л учае , когдатре буе тс я бол е е де тал ь ная информац ия о рас пол оже нии вы явл яе мой с пе ц ифичес кой нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти в ге номе , приме няе тс я другая модификац ия ме тода мол е кул ярной гибридизац ии - блот-гибридизац ия(от англ . to blot – промакать фил ь тровал ь ной бумагой ), пре дл оже нной е щ е в 1975 г. Э таме тодикаявл яе тс я униве рс ал ь ной те хнол огичес кой ос новой . Сущ нос ть ме тодики закл ю чае тс я в с л е дую щ е м: Д Н К, вы де л е нная из ткани л ю бого органа, кл е ток крови ил и кл е ток, кул ь тивируе мы х вне организма, подве ргае тс я рас щ е пл е нию ре с трикц ионны ми нукл е азами (ре с триктазами), которы е “узнаю т” в не й с трого опре де л е нную пос л едовате л ь нос ть нукл е отидов. Р е с триктазы назы ваю т “биол огичес кими ножниц ами” (их изве с тно уже бол е е 500). Н абор фрагме нтов Д Н К, пол ученны й при разре зании опре де л е нной ре с триктазой , с пе ц ифичен дл я каждого организма. Чтобы из множе с тва наре занны х ре с триктазой фрагме нтов (от не с кол ь ких ты с ячдо де с ятков мил л ионов) най ти один ил и не с кол ь ко с опре де л е нной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю и охаракте ризовать эти фрагме нты , пол ученную с ме с ь Д Н К подве ргаю т эл е ктрофоре зу. П ри этом фрагме нты разде л яю тс я по разме ру (ме л кие в ге л е мигрирую т бы с тре е бол ь ш их). Р азде л е нны е фрагме нты “пе ре пе чаты ваю т” на фил ь тр (с пе ц иал ь ны м образом обработанную бумагу, нитроц е л л ю л озу ил и не й л он), фикс ирую т (иммобил изую т) на не м и подве ргаю т гибридизац ии с зондом (ол игонукл е отидом), ме ченны м радиоактивны м изотопом ил и фл ю оре с ц е нтной ме ткой . Зонд явл яе тс я кл ю чевы м эл е ме нтом диагнос тичес кой с хе мы . З онд – это ол игонукл е отид (короткий : 10-30 нукл е отидов, ме чены й те м ил и ины м с пос обом с е гме нт одноц е почечной Д Н К, ил и Р Н К, ил и е е Д Н К-копии), ис пол ь зую щ ий с я дл я вы явл е ния компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос те й с помощ ь ю гибридизац ии. З онд – это кл онированная ге нноинже не рны ми ме тодами нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть конкре тного ге на, подл е жащ е го ис с л е дованию , ил и пос л е довате л ь нос ть , с инте зированная ис кус с тве нно. Зонд вы явл яе т не обходимы й фрагме нт, е с л и он прис утс твуе т с ре ди ис с л е дуе мого множе с тва фрагме нтов. Э то проис ходит путе м с пе ц ифичес кого с вязы вания пос л е довате л ь нос те й зондас комл е ме нтарны ми е му пос л е довате л ь нос тями фрагме нта, зафикс ированны ми нафил ь тре . Узнать об этом можно по проявл яю щ е й с я в таком с л учае радиоактивной ил и фл уоре с ц е нтной ме тке . Е с л и в зонде с оде ржитс я радиоактивная ме тка, фил ь тр в те мноте накры ваю т ре нтге новс кой пл е нкой , а по прош е с твии опре де л е нного вре ме ни (от не с кол ь ких час ов до не с кол ь ких с уток) е е проявл яю т и по зас ве ченны м пол ос ам опре де л яю т, в фрагме нтах какой дл ины находитс я компл е ме нтарная зонду нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . Е с л и зонд не с е т фл уоре с ц е нтную ме тку, фил ь тр фотографирую т в ул ь трафиол е товом
55
с ве те . Зонды ис пол ь зую т и дл я поис ка мутантного ге на не пос ре дс тве нно на хромос оме . М утантны й ге н при этом можно также обнаружить л ибо при ис пол ь зовании радиоактивно ме ченого зонда(ISH- ме тод), л ибо зонда, ме ченого фл уоре с ц е нтны м крас ите л е м (FISH- ме тод). FISH- ме тод име е т опре де л е нны е пре имущ е с тва пе ре д ISH-ме тодом потому, что при этом проис ходит бол е е точная л окал изац ия гибридизац ионного с игнал анахромос оме . Кроме того, не радиоактивная ме тка бе зопас на дл я здоровь я обс л уживаю щ е го пе рс онал а. В озможно приме не ние не одного, ане с кол ь ких Д Н К-зондов с разл ичной ц ве товой окрас кой . Пр именение ПЦ Р . Д л я вы явл е ния точковы х мутац ий , не бол ь ш их де л е ц ий и инс е рц ий в ис с л е дуе мы х ге нах, атакже ис комой нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти (прис утс твую щ е й в не дос таточном дл я обнаруже ния кол ичес тве ) ис пол ь зую т разл ичны е подходы , ос нованны е наме тоде П Ц Р , бл агодаря которому можно многократно уве л ичить (ампл ифиц ировать ) уникал ь ную пос л е довате л ь нос ть Д Н К, а зате м проанал изировать дл я вы явл е ния мутац ий ил и с пе ц ифичес кой пос л е довате л ь нос ти. Н е дос таточны м може т бы ть и с амо кол ичес тво ткани, дос тупной дл я прове де ния анал иза. В о вс е х этих с л учаях пе ре д нане с е ние м образц а на фил ь тр к ампл ификац ии (умноже нии) нукл е отидного мате риал ас помощ ь ю П Ц Р . А мпл ификац ия ничтожны х кол ичес тв ис ходного биол огичес кого мате риал ав с очетании с мол е кул ярной гибридизац ие й позвол яе т обнаружить одну кл е тку, инфиц ированную В И Ч с ре ди 105 не инфиц ированны х кл е ток нос ите л я СП И Д а. П риме не ние П Ц Р де л ае т возможны м однозначное ус тановл е ние л ичнос ти пре с тупникапо одному вол ос у, зас охш е й капл е с пе рмы , с л ю ны ил и крови с ис пол ь зование м ме тода “ге номной дактил ос копии” , также ос нованного напринц ипах мол е кул ярной гибридизац ии. 3.2. О б наруж ени е мут ац и й при наследст венных заб олевани ях человек а С еквенир ование Д Н К как способ обнар у ж ения му таций. П рямое секвенирование п родуктов П Ц Р явл яе тс я очень эффе ктивны м и чувс твите л ь ны м ме тодом вы явл е ния мутац ий . П ринято с читать , что с помощ ь ю прямого с е кве нирования одноц е почечны х и двухц е почечны х продуктов П Ц Р с тандартны ми ме тодами можно обнаруживать до 99% мутац ий . М е тод позвол яе т не тол ь ко точно л окал изовать мутац ию в ис с л е дуе мой пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов, но и опре де л ить е е тип и возможны й ме ханизм возникнове ния с учетом конте кс таокружаю щ их е е нукл е отидов. Лю бы е типы мутац ий могут бы ть обнаруже ны ме тодом прямого с е кве нирования мутантной кД Н К ил и отде л ь ны х экзонов. Как ос новной , этот ме тод приме няе тс я дл я с канирования мутац ий в ге нах, име ю щ их мал ы е разме ры (наприме р, в ге не фактораIX с ве рты вания крови, отве тс тве нного заге мофил ию В ). О днако с е кве нирование пол норазме рной кД Н К (т.е . вс е х экзонов) у пац ие нтов дл я опре де л е ния мутац ий дос таточно трудое мко, дорого и тре буе т бол ь ш их затрат вре ме ни. П оэтому напрактике чащ е проводят пре дварите л ь ны й отбор дл я ампл ификац ии фрагме нтов Д Н К, пре дпо-
56
л ожите л ь но с оде ржащ их мутац ии, азате м с е кве нирую т тол ь ко эти учас тки Д Н К. М е тоды поис кафрагме нтов Д Н К, с оде ржащ их мутац ии, ос нованы на с равните л ь ном анал изе мутантны х и нормал ь ны х пос л е довате л ь нос те й по ц е л ому ряду физичес ких и химичес ких характе рис тик, которы е в значите л ь ной с те пе ни варь ирую т от типамутац ионного повре жде ния. Н о не завис имо от ме тода вы явл е ния мутац ий , точны е мол е кул ярны е характе рис тики мутац ий могут бы ть пол учены путе м прямого с е кве нирования. М утац ии, изме няю щ ие дл ину ампл ифиц ированны х фрагме нтов, вы явл яю тс я л е гко при эл е ктрофоре зе . Такое , в час тнос ти, буде т име ть ме с то при микроде л е ц иях ил и вс тавках. Н о при мутац иях ге нов, пре дс тавл яю щ их с обой заме ну одного ил и не с кол ь ких нукл е отидов, дл ины ампл ифиц ированны х фрагме нтов ос таю тс я пос тоянны ми. В ыявление генных му таций пу тем оценки конфор мационного полимор физма однонитевой Д Н К (SSCP). О днако не которы е физикохимичес кие с вой с тва мутантны х мол е кул ме няю тс я. С учетом этих ос обе ннос те й разработаны разл ичны е ме тоды поис камутантны х фрагме нтов. Н априме р, ме тодами анал изаконформац ионного пол иморфизмаодноните вой Д Н К (SSCP – Single Strand Conformational Polymorfism). О н ос нован на ре гис трац ии разл ичий в эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти одноните вы х Д Н К, одинаковы х по ве л ичине , но разл ичаю щ ихс я вс л едс твие нукл е отидны х заме н по прос транс тве нной организац ии мол е кул . Конформац ия не бол ь ш их одноните вы х Д Н К завис ит от нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти, поэтому заме на даже одного нукл е отида приводит к изме не нию их прос транс твенной с труктуры . М е тод вкл ю чае т ампл ификац ию фрагме нтов Д Н К (экзонов ис с л е дуе мого ге на), де натурац ию продуктов П Ц Р и эл е ктрофоре з в П А А Г. В качес тве матриц ы дл я П Ц Р ис пол ь зую т Д Н К бол ь ны х и здоровы х (контрол ь ) индивидов. Каждая пара прай ме ров вы бирае тс я из пос л е довате л ь нос те й , фл анкирую щ их экзон, ил и из е го конц е вы х учас тков. В с л е дс твие компл е ме нтарнос ти две ц е пи одной мол е кул ы Д Н К име ю т разную нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть , а поэтому принимаю т разную тре хме рную конфигурац ию и мигрирую т при ге л ь -эл е ктрофоре зе с разной с корос ть ю . В ре зул ь тате пос л е разде л е ния в ге л е набл ю даю тс я 2 пол ос ы , отве чаю щ ие разны м компл е ме нтарны м ц е пям. Е с л и две мол е кул ы , пре дс тавл яю щ ие один и тот же учас ток гена, но пол ученны е из разны х ис точников, разл ичаю тс я одной парой нукл е отидов, то конформац ия одиночны х ните й ткаих мол е кул Д Н К буде т разл ичать с я, т.е . каждая из четы ре х ц е пе й буде т пе ре ме щ ать с я при ге л ь -эл е ктрофоре зе с о с вое й с корос ть ю (рис унок 17). С помощ ь ю SSCP можно л окал изовать нукл е отидны е изме не ния в опре де л е нном экзоне ил и с пе ц ифичес кой обл ас ти ге на, аопре де л ить природу мутац ии може т л иш ь с е кве нирование . М е тод оц е нки конформац ионного пол иморфизмаодноц е почечны х фрагме нтов Д Н К прос т в пос тановке и позвол яе т вы явл ять до 80% мутац ий . Поиск му таций пу тем анализа гетер оду плексов (Heteroduplex analysis, HA). Е щ е одним прямы м новы м ме тодом Д Н К-диагнос тики явл я-
57
е тс я ге те родупл е кс ны й анал из (HA), которы й позвол яе т вы явл ять мутац ии, находящ ие с я в ге терозиготном с ос тоянии, а также инс е рц ии и де л е ц ии. П ринц ип этого ме тода закл ю чае тс я в с л е дую щ е м. П ри ампл ификац ии фрагме нтов ге нов ге те розигот, пос л е дую щ е й де натурац ии и ме дл е нной ре натурац ии пол ученны х продуктов П Ц Р в ампл ифиц ированной с ме с и наряду с двумя типами ге те родупл е с ов образую тс я ге те родупл е кс ы ме жду нормал ь ной и мутантной ц е пями Д Н К. Такие ге те родупл е кс ны е мол е кул ы отл ичаю тс я по эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти от гомодупл е кс ов за с чет конформац ионны х ос обе ннос те й в ме с тах не с овпаде ния нукл е отидов, пос кол ь ку эл е ктрофоре тичес кая подвижнос ть ге те родупл е кс ов значите л ь но ниже , чем гомодупл е с ов. Э ти разл ичия обнаруживаю тс я при эл е ктрофоре зе в П А А Г. Д анны й ме тод также позвол яе т находить до 80% мутац ий .
Р ис унок 17. А нал из конформац ионного пол иморфизма одноц е почечной Д Н К (SSCP) [Гл ик, 2002]: П ре параты Д Н К, разл ичаю щ ие с я одной парой нукл е отидов (A:T↔G:C), ампл ифиц ирую т П Ц Р -ме тодом с ис пол ь зование м одинаковы х прай ме ров (П 1, П 2). П Ц Р -продукты де натурирую т и разде л яю т с помощ ь ю ге л ь -эл е ктрофоре за на двух дорожках (1 и 2). Р ас с тояние , на которое пе ре ме щ аю тс я одноц е почечны е мол е кул ы Д Н К, завис ит от конформац ии, а пос дняя, в с вою очере дь , - от нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти. П Ц Р -продукты образую т в ге л е не две , ачеты ре пол ос ы .
58
В нас тоящ е е вре мя наибол е е рас прос тране нны м с пос обом с крининга мутац ий явл яе тс я комбинац ия анал изаге те родупл е кс ов и ме тодаодноните вого конформац ионного пол иморфизма, позвол яю щ ая вы явить точковы е мутац ии почти в 100% с л учае в и не тре бую щ их бол ь ш их затрат вре ме ни. М етод “ тр ансляции белкового пр оду кта”. П рямы м ме тодом Д Н Кдиагнос тики явл яе тс я также ме тод “транс л яц ии бе л кового продукта” . О н ис пол ь зуе тс я дл я диагнос тики мутац ий , пре ры ваю щ их с инте з бе л кового продукта, в ре зул ь тате чего образую тс я укороченны е пол ипе птидны е ц е пи, функц ионал ь но не значимы е . Э тот ме тод проводитс я в с ис те ме in vitro на ос нове пол ученной с пе ц ифичес кой мР Н К с добавл е ние м л изатаре тикул оц итов, в котором с оде ржатс я вс е не обходимы е компоне нты дл я с инте за бе л ка. В этой с ис те ме с инте зируе тс я бе л ковы й продукт с оотве тс твую щ е го ге на. П родукт транс крипц ии анал изируе тс я с помощ ь ю эл е ктрофоре за. И зме не ние эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти бе л ка с виде те л ь с твуе т о нал ичии мутац ии (нонс е нс -мутац ия, наруш е ние с пл ай с инга Р Н К, с двиг рамки с читы вания), пре ры ваю щ е й с инте з пол ипе птидной ц е пи. В с е ме тоды , опис анны е вы ш е , приобре л и ос обую значимос ть с развитие м ме тодаП Ц Р , которы й дос таточно прос то позвол яе т ампл ифиц ировать конкре тны е учас тки ге номной Д Н К, пол учать пре паративны е кол ичес твагомоге нной по разме рам двухц е почечной Д Н К и бы с тро с оздавать ге те родупл е кс ы . П ри косвенной Д Н К-диагнос тике ис пол ь зую тс я те же те хничес кие прие мы , что и при прямой (пол учение Д Н К, ре с трикц ия, эл е ктрофоре з), а также не обходим мате матичес кий анал из с ц е пл ения признаков. И с пол ь зование кос ве нны х ме тодов Д Н К-диагнос тики оказал ос ь возможны м бл агодаря прис утс твию в ге номе пол иморфны х учас тков (л окус ов) Д Н К. Н укл е отидны е заме ны не ре дко вс тре чаю тс я в не кодирую щ их учас тках Д Н К. Значите л ь ное чис л о нукл е отидны х заме н приводит к изме не нию ме с т ре с трикц ии. Э ти изме не ния можно вы явить с помощ ь ю бл отгибридизац ии по Саузе рну, пос кол ь ку изме няе тс я дл ина ре с трикц ионны х фрагме нтов. Э та разновиднос ть пол иморфизма Д Н К пол учил а название пол иморфизмапо дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ). Р ас пол оже нны й вбл изи изучае мого ге на ил и внутри е го пол иморфны й с ай т може т с л ужить марке ром ал л ел ь ны х вариантов этого ге на, в том чис л е марке ром патол огичес ких мутац ий . Таким образом, кос ве нная Д Н К-диагнос тикас водитс я к анал изу пол иморфны х ге не тичес ких марке ров у бол ь ны х и здоровы х чл е нов с е мь и. М арке ры дол жны бы ть рас пол оже ны в том же хромос омном рай оне , что и ге н бол е зни, т.е . они дол жны бы ть с ц е пл е ны . О днако пол иморфизм, обус л овл е нны й нукл е отидны ми заменами ил и де л е ц иями, как правил о, диал л е л е н, с л е довате л ь но, е го информац ионная ц е ннос ть ограничена. Бол е е информативны ми явл яю тс я кл ас те ры танде мны х повторов, которы е обус л овл иваю т пол иморфизм по кол ичес тву копий (VNTR-variable
59
number of tandem repeats), так назы вае мы й пол иморфизм мини- и микрос ате л л итны х пос л е довате л ь нос те й . Кос ве нны е ме тоды Д Н К-диагнос тики не тре бую т знаний ге наи мутац ии в не м. О ни информативны дл я бол ь ш инс твас е ме й , но тре бую т абс ол ю тной уве ре ннос ти в кл иничес ком диагнозе , приме нимы тол ь ко дл я монол окус ны х забол е ваний и при обязате л ь ном с е ме й ном анал изе . В озможнос ть пре с имптоматичес кой , пре натал ь ной и даже пре импл антац ионной диагнос тики в пе рвом триме с тре бе ре ме ннос ти обе с пе чивае тс я с табил ь нос ть ю Д Н К напротяже нии вс е й жизни индивида. Д Н К-диагнос тика помогае т вы явить , наприме р, такие бол е зни как ге мофил ия А и В , миодис трофия Д ю ш е нна и Бе ке ра, муковис ц идоз, с пинал ь ная амиотрофия, фе нил ке тонурия, с е рповиднокл е точная ане мия и др. В с л учае адре но-генитал ь ного с индрома можно проводить профил актичес кое дородовое л е чение , с ущ е с тве нно с нижаю щ е е тяже с ть бол е зне й пос л е рожде ния ре бе нка. Д ородовое л е чение возможно и при с вое вре ме нной пре с имптоматичес кой диагнос тике бол е зни В ил ь с она-Коновал ова. В с л учае хоре и Ге нтингтона пре с имптоматичес кая диагнос тика име е т ре ш аю щ е е значение дл я пл анирования с е мь и. 3.3. Генет и ческ и й паспорт и его значени е В с е го в нас тоящ е е вре мя, гл авны м образом за с чет ис пол ь зования мол е кул ярно-ге не тичес ких ме тодов, удал ос ь картировать бол е е 10 ты с яч ге нов в ге номе чел ове ка (из 32 ты с с труктурны х ге нов), но те хничес ки дос тупе н индивидуал ь ны й анал из л иш ь по не с кол ь ким де с яткам ге нов. О днако это ге ны , отве тс тве нны е за важне й ш ие нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове ка. П оэтому же л аю щ ие знать с вои ге не тичес кие характе рис тики могут пол учить ге не тичес кий пас порт, в котором буде т с оде ржать с я информац ия о нал ичии мутантны х ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е бол е зни (моноге нны е ил и мул ь тифакториал ь ны е ). В не которы х западны х с транах ге не тичес кое те с тирование проводят по ме диц инс ким показаниям ил и в качес тве пл атной ус л уги. Све де ния, запис анны е в ге не тичес ком пас порте , - такая же врачебная тай на, как и ре зул ь таты л ю бы х других ме диц инс ких ис с л е дований . Д л я мол одого чел ове катакой пас порт важе н, чтобы знать какие бол е зни могут ожидать е го в будущ е м и как пре дотвратить их развитие . П ре жде чем прис тупить к с ос тавл е нию пас порта, не обходимо с ос тавить родос л овную и пос мотре ть , чем бол е л и е го родс тве нники. Н ос ите л ь с тво мутац ий , с вязанны х с моноге нны ми бол е знями (фе нил ке тонурие й , муковис ц идозом) можно опре де л ять , е с л и в с е мь е име ю тс я подобны е бол ь ны е ил и же забол е вания вс тре чаю тс я с вы с окой час тотой в той ме с тнос ти, где проживае т обс л е дуе мы й . Е с л и с ре ди родс тве нников бол ь ного име е тс я бол е е одного чел ове ка с одинаковой мул ь тифакториал ь ной патол огие й , не обходимо анал изировать ге ны пре драс пол оже ннос ти к е е развитию . П ри нал ичии факторов рис ка, с вязанны х с профе с с ие й ил и ус л овиями
60
с ре ды , нужно те с тировать ге ны , име ю щ ие отнош е ние к бол е зням, провоц ируе мы м этими факторами. Знание информац ии о с обс тве нны х гене тичес ких ос обе ннос тях дл я каждого чел ове кадае т возможнос ть е щ е до рожде ния пре дс казать , к каким нас л е дс тве нны м забол е ваниям буде т пре драс пол оже н чел ове к, какие меры профил актики и л е чения могут бы ть приняты . Ге не тичес кий пас порт може т бы ть макс имал ь но пол е зе н, е с л и ре зул ь таты те с тирования анал изирую тс я вы с ококвал ифиц ированны ми с пе ц иал ис тами вме с те с с е ме й ны м врачом. Р аботы по ге не тичес кой пас портизац ии профодятс я в Ирл андии, Ф инл яндии, СШ А . П равите л ь с тво Э с тонии вы де л ил о бол ь ш ие с ре дс твана ге не тичес кое те с тирование де те й с 7-л е тне го возрас та. Такие работы проводятс я и в Р ос с ий с кой Ф е де рац ии: в М ос кве , Санкт-П е те рбурге , Томс ке , Н овос ибирс ке , Уфе . СЛО В А Р Ь ТЕ Р М И Н О В Б анк генов, ил и клонотека (геномнаябиблиотека) – это кол л е кц ия кл онов Д Н К, вкл ю чаю щ ая вс е фрагме нты , входящ ие в с ос тав ге номаданного вида; набор фрагме нтов Д Н К, вс трое нны х в ве ктор. Б иблиотека кД Н К – кол л е кц ия кл онов кД Н К, с инте зируе мы х in vitro на матриц е мР Н К, проис ходящ их из одной ткани ил и кл е точной попул яц ии. Б лоттинг – пе ре нос разде л е нны х фрагме нтов из одной с ре ды (наприме р, ге л я) натве рды й нос ите л ь (бумагу, нитроц е л л ю л озны й фил ь тр). В екторы – это мол е кул ы Д Н К, с пос обны е пе ре нос ить вкл ю ченны е в них чуже родны е ге ны в кл е тку, где эти мол е кул ы ре пл иц ирую тс я автономно ил и пос л е инте грац ии с ге номом (хромос омой ). В е кторы ис пол ь зую тс я в ге нной инже не рии дл я пе ре нос а транс ге на от организма-донора в организм-ре ц ипие нт, атакже дл я кл онирования ге нов. Г ен – транс крибируе мы й учас ток хромос омы , кодирую щ ий функц ионал ь ны й пол ипе птид, л ибо тР Н К ил и рР Н К. Ге н – функц ионал ь но не де л имая е диниц а нас л едс тве нной информац ии, пре дс тавл яю щ ая с обой учас ток мол е кул ы Д Н К (ре же Р Н К у вирус ов) с опре де л е нной пос л е довате л ь нос ть ю нукл е отидов, кодирую щ ий с инте з пол ипе птида, тР Н К, л ибо рР Н К. Г ен-мишень – ге н, подве ргае мы й с пе ц ифичес кому возде й с твию . Ге н, инте ре с ую щ ий ис с л е довате л я. Г еном – это с овокупнос ть кодирую щ их и не кодирую щ их пос л е довате л ь нос те й (с уммарная ге не тичес кая информац ия) кл е тки и организма. Ге ном – с овокупнос ть ге нов гапл оидного наборахромос ом данного вида. Г еномика – наукао ге номах (о с труктуре и функц иях). Структурная ге номика вы явл яе т пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в мол е кул ах Д Н К у организмов разл ичны х видов. Ф ункц ионал ь ная ге номика – это учение о функц иях генов.
61
Г енотип - с овокупнос ть ге нов отде л ь ного организма(индивидуума), находящ ихс я ме жду с обой в разл ичного рода взаимоде й с твиях. Т.е . генотип – это не прос тая с умма ге нов, а с ис те ма взаимоде й с твую щ их ге нов. Э то ге не тичес кая конс титуц ия организма(набор вс е х е го ал л е л е й ), име ю щ ая фенотипичес кое проявл е ние . Г ибридизац ияД Н К – с паривание двух однонитчаты х мол е кул Д Н К, час то из разны х ис точников, бл агодаря образованию водородны х с вязе й ме жду компл е ме нтарны ми нукл е отидами. И с пол ь зуе тс я дл я вы явл е ния с пе ц ифичес ких нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й в пре парате Д Н К. Д енатурац ия– рас хожде ние ц е пе й двухц е почечной мол е кул ы Д Н К ил и Р Н К. Э то наруш е ние нативной конформац ии биол огичес ких макромол е кул в ре зул ь тате разруш е ния водородны х с вязе й . Д Н К -маркирую щ ий сайт, STS (Sequence tagget site). Уникал ь ны й дл я данного л окус а ол игонукл е отид, которы й може т ис пол ь зовать с я дл я е го иде нтификац ии ме тодом П Ц Р . Д Н К -фингерп ринтинг (“отпе чаток пал ь ц е в” ) – набор ре с трикц ионны х фрагментов Д Н К, характе рны й дл я данного индивидуума. Д л я пол учения “отпе чатка” ис пол ь зую т л ибо ге л ь -эл е ктрофоре з как таковой , л ибо в с очетании с П Ц Р -ампл ификац ие й . Д Н К -п олимераза – фе рме нт, катал изирую щ ий с инте з пол инукл е отидной ц е пи из отде л ь ны х нукл е отидов с ис пол ь зование м другой ц е пи в качес тве матриц ы и Д Н К-затравки (прай ме ра) с о с вободной 3′-О Н группой . Д Н К -п олимераза Taq – те рмос табил ь ная Д Н К-пол име раза(с охраняе т активнос ть при 950С) бакте рии Thermus aquaficus. Час то приме няе тс я в ме тоде П Ц Р . Д омен – учас ток пол ипе птидной ц е пи, вы пол няю щ ий опре де л е нную функц ию (наприме р, ц итопл азматичес кий доме н, транс ме мбранны й доме н и т.д.). П о мне нию не которы х ге не тиков, кажды й доме н кодируе тс я учас тком гена, рас пол оже нны м ме жду с ос е дними интронами (т.е . одним экзоном). Д . - дис кре тны й учас ток хромос омы , с пирал изую щ ий с я не завис имо от с ос е дних учас тков (доме нов), ил и обл адаю щ ий повы ш е нной чувс твите л ь нос ть ю кД Н Казе . З онды – это ис кус с тве нно с инте зированны е ме чены е (изотопами ил и фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями – химичес ки) не бол ь ш ие (10-30 нукл е отидов) с е гме нты одноц е почечной Д Н К (ил и Р Н К, ил и е е Д Н К-копии), компл е ме нтарны е ис комому ге ну. Зонд – это с инте тичес кий ол игонукл е отид (короткий с е гме нт одноц е почечной Д Н К) с изве с тной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю , которы й ис пол ь зуе тс я дл я вы явл е ния компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос те й с помощ ь ю гибридизац ии. И скусственные хромосомы дрож ж ей - YAK (Yeast Artificial Chromosomes) – ве ктор, приме няе мы й дл я кл онирования очень бол ь ш их (до 400Кб) фрагме нтов Д Н К.
62
кД Н К – Д Н К, компл е ме нтарная мР Н К, пол ученная путе м обратной транс крипц ии; ис пол ь зуе тс я как мол е кул ярны й зонд вы с окой избирате л ь нос ти. К андидатное картирование – с трате гия иде нтификац ии ге на конкре тного забол е вания, ос нованная на данны х о возможном продукте данного ге на. К арта рестрикц ионная- диаграммарас пол оже ния намол е кул е Д Н К с ай тов узнавания ре с триктазами. К арта сц еп ления(мул ь тил окус ная ге не тичес кая карта) – с хе ма взаимного рас пол оже ния л окус ов нахромос омах данного организма. К артирование генома – это ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К) на опре де л е нны х хромос омах относ ите л ь но других ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К). О но базируе тс я на ис пол ь зовании тре х ос новны х ме тодов (ил и подходов): ге не тичес кого, ц итол огичес кого и физичес кого. К артирование рестрикц ионное – картирование , ос нованное наус тановл е нии точекде й с твия разл ичны х ре с триктаз. К артирование физическое – картирование , ос нованное на прямом анал изе мол е кул Д Н К, с ос тавл яю щ их каждую хромос ому (бе з анал изаре зул ь татов с кре щ ивания). Е го коне чная ц е л ь – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в каждой хромос оме . К арты генетические - это с хе мы взаимного рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на индивидуал ь ны х хромос омах, т.е . находящ ихс я в одной группе с ц е пл е ния. К арты физические – карты ге нома(в отл ичие от ге не тичес ких карт с ц е пл е ния) отражаю т ре ал ь ное рас с тояние ме жду ге нами (ил и марке рами), вы ражае мое чис л ом пар нукл е отидов. К лон – попул яц ия кл е ток ил и мол е кул , иде нтичны х одной родоначал ь ной кл е тке ил и мол е кул е . К лонирование – с овокупнос ть проц е дур, ис пол ь зую щ ихс я дл я пол учения кл онов. Кл онирование ге нов вкл ю чае т: вы де л е ние нужного ге наиз какого-л ибо организма, вс траивание е го в ве ктор, вве де ние в кл е тку организма-хозяина, многократная ре пл икац ия. К лонирую щ ий вектор – мол е кул а Д Н К (пл азмидная ил и вирус ная Д Н К), пре дназначенная дл я кл онирования Д Н К-миш е ни. К онтиги – не пре ры вны й набор кл онов, охваты ваю щ их данную обл ас ть хромос омы ил и вс ю хромос ому. К онформац ионный п олиморфизм одноц еп очечной Д Н К , SSCP (Single Strand Conformational Polymorfism) – разл ичие в конформац ии одноц е почечны х Д Н К, отл ичаю щ ихс я одна от другой вс е го одним нукл е отидом. А нал изируе мы е Д Н К подве ргаю т де натурац ии. Д е натурированны е ц е пи принимаю т разную конформац ию и при ге л ь -эл е ктрофоре зе мигрирую т с разной с корос ть ю .
63
К осмида – ве ктор, объе диняю щ ий с вой с тва пл азмидного ве ктора и ве кторанаос нове фага λ. Име е т cos-с ай ты . П озвол яе т кл онировать бол ь ш ие (до 45Кб) по с равне нию с пл азмидами фрагменты Д Н К. Л окус – ме с то нахромос оме , где находитс я с пе ц ифичес кий ге н. М аркерные эксп рессируемые п оследовательности, EST (Expressed sequence tag) – короткие марке рны е пос л е довате л ь нос ти, характе рны е дл я каждого экс пре с с ируе мого ге на чел ове ка. П озвол яю т изучать разме ры , разнообразие и транс крипц ионную активнос ть экс пре с с ирую щ ихс я ге нов чел ове ка. М аркерный ген – ге н с изве с тной хромос омной л окал изац ие й , име ю щ ий четкое фе нотипичес кое проявл е ние (мутантны й фе нотип, фе рме нтативная активнос ть и др.). Час то ис пол ь зуе тс я при прове де нии картирования других ге нов. “О братная” генетика – в отл ичие от кл ас с ичес кой ге не тики, изучаю щ е й вначал е признаки, а зате м контрол ирую щ ие их ге ны (признак→ге н), иде т в обратном направл е нии - от иде нтификац ии ге напри отс утс твии вс якой информац ии о не м к изучению е го функц ии (ге н→признак). О лигонуклеотид – короткий (6-10 нукл е отидов) с е гме нт одноц е почечной Д Н К. О бы чно пол учаю т химичес ким путе м. О ртологичные гены (ортологи) – это гомол огичны е ге ны в ге номах разны х организмов, которы е произош л и от одного ге на в общ е м пре дковом организме и с охранил и одну и ту же функц ию в проц е с с е эвол ю ц ии. О тж иг – проц е с с образования двухц е почечны х мол е кул (Д Н К-Д Н К ил и Д Н К-Р Н К) из одиночны х пол инукл е отидны х компл е ме нтарны х ц е пе й . Э то проц е с с вос с тановл е ния (ре натурац ии) двухц е почечны х мол е кул . П аралогичные гены (п аралоги) – в отл ичие от ортол огов п аралогичные гены возникаю т путе м внутриге номны х дупл икац ий и могут эвол ю ц ионировать с приобре те ние м новы х функц ий . П озиц ионное картирование – однаиз с трате гий иде нтификац ии ге на забол е вания в отс утс твие данны х о продукте этого ге на и каких-л ибо ге нов-кандидатов. Сначал а опре де л яю т хромос омную л окал изац ию (позиц ию ) ге на. Зате м пол учаю т ге номны е кл оны , охваты ваю щ ие картированны й с ай т (ис пол ь зуя с оотве тс твую щ ие марке ры ), иде нтифиц ирую т и анал изирую т прис утс твую щ ие в них экзоны . И с пол ь зуя ц е л ы й ряд ме тодов опре де л яю т, какой име нно ге н отве тс тве не н заданное забол е вание . П олимеразнаяц еп аяреакц ия(П Ц Р = PCR – polymerase chain reaction) - ме тод ампл ификац ии с пе ц ифичес кого фрагме нтаД Н К с помощ ь ю те рмос табил ь ной Д Н К-пол име разы , с ис пол ь зование м ол игонукл е отидны х Д Н Кзатравок, компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос тям противопол ожны х ц е пе й Д Н К на границ ах ампл ифиц ируе мого учас тка. П роц е с с с ос тоит из с е рии ц икл ичес ких повторяю щ ихс я ре акц ий : де натурац ии Д Н К, отжига зондов, с инте заД Н К. П олиморфизм длины рестрикц ионных фрагментов, П Д Р Ф (restriction fragment length polymorphism, RFLP) И зме нчивос ть дл ины фрагме нтов
64
Д Н К, образую щ ихс я при е е рас щ е пл е нии ре с триктазами. О бус л овл е намутац ионны м измене ние м с ай тов ре с трикц ии ил и появл е ние м новы х с ай тов. О бнаруживае тс я при разде л е нии фрагме нтов с помощ ь ю ге л ь эл е ктрофоре за. П раймеры – короткий ол игонукл е отид, которы й гибридизуе тс я с матриц е й и с л ужит затравкой при е е копировании (ампл ификац ии). “П рогулка п о хромосоме” (chromosome walking) - ме тод вы де л е ния и анал иза нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й (новы х ге нов), фл анкирую щ их изве с тны е ге ны , дл я которы х име ю тс я ол игонукл е отидны е зонды . Ф л анкирую щ ие пос л е довате л ь нос ти ис пол ь зую тс я зате м в качес тве зондов иде нтификац ии прил е гаю щ их кним пос л е довате л ь нос те й и т.д. П ротеом – пол ны й набор бе л ков в кл е тке в конкре тны й моме нт. П ротеомика - наукао наборах бе л ков в кл е тках при разны х физиол огичес ких с ос тояниях и функц иях этих бе л ков. Сущ е с тве нная разниц а ме жду ге номикой и проте омикой обус л овл е нате м, что ге ном данного вида, как правил о, дос таточно с табил е н, в то вре мя как проте ом индивидуал е н не тол ь ко дл я разны х кл е токодного индивида, но и дл я одной кл е тки в завис имос ти от е е с ос тояния (де л е ние , покой , диффе ренц ировка и т.д.). Т.е . проте ом – понятие динамичное . “П рыж ки п о хромосоме” (chromosome jumping) - один из вариантов ме тода“прогул ок по хромос оме ” , отл ичаю щ ий с я те м, что в ре зул ь тате какой -л ибо мутац ии марке рны й ге н, ис пол ь зуе мы й дл я с кринингабибл иоте ки, пе ре ме щ ае тс я по ге ному (пры гае т нату же ил и другую хромос ому), что позвол яе т вы де л ять новы е с ц е пл е нны е с ним ге ны . Расстояние на генетической карте – рас с тояние ме жду двумя ге нами, опре де л яе мое по час тоте ре комбинац ий наанал изируе мом учас тке . За е диниц у картирования принимаю т рас с тояние ме жду ге нами, ве роятнос ть ре комбинац ии ме жду которы ми равна1% (одной с антиморганиде ). Ренатурац ия – вос с ое дине ние ц епе й двухц е почечной Д Н К, разош е дш ихс я при де натурац ии. Рестриктаза – бакте риал ь ны й фе рме нт, рас щ е пл яю щ ий двухц е почечную Д Н К в с пе ц ифичес ких с ай тах. С еквенирование – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. С еквенатор – прибор дл я опре де л е ния пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. С ц еп ление генов – с овме с тное нас л е дование разл ичны х генов, л окал изованны х в одной и той же хромос оме . Э лектрофорез– ме тод разде л е ния заряже нны х мол е кул (Д Н К, Р Н К ил и бе л ков), ос нованны й наразной с корос ти их пе ре ме щ е ния в эл е ктричес ком пол е .
65
1. 2. 3. 4. 5.
О СН О В Н А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А Гл ик Б. М ол е кул ярная биоте хнол огия: П ринц ипы и приме не ние . / Б. Гл ик, Д ж. П ас те рнак. - М . : М ир, 2002. - 589с . Ж имул е в И .Ф . О бщ ая и мол е кул ярная ге не тика / И .Ф . Ж имул е в. Н овос ибирс к: И зд-во Н овос иб. ун-та, 2002. - 458 с . П атруш е в Л.И . Э кс пре с с ия ге нов / Л.И . П атруш е в. – М . : Н аука, 2000. – 466с . Синге р М . Ге ны и ге номы : в 2-х т. / М . Синге р, П . Берг. - М . : М ир, 1998. Щ е л кунов С.Н . Ге не тичес кая инже не рия / С.Н . Щ е л кунов. – Н овос ибирс к: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496с .
Д О П О ЛН И ТЕ ЛЬН А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А 1. А й ал аФ . Совре ме нная гене тика: в 3-х т. / Ф . А й ал а, Д ж. Кай ге р. – М .: М ир, 1987. 2. Бочков Н .П . Кл иничес кая ге не тика/ Н .П . Бочков.- М . : М е диц ина, 1997. - 288с . 3. Бул ат С.А . И де нтификац ия грибов и анал из их ге не тичес кой изме нчивос ти ме тодом пол име разной ц е пной ре акц ии (П Ц Р ) с ге нос пец ифичны ми и не с пе ц ифичны ми прай ме рами / С.А . Бул ат, Н .В . М ироне нко // Ге не тика. – 1996. – Т.32, № 2. – С. 165-183. 4. БуторинаА .К. М ол е кул ярны е ме ханизмы ге не тичес ких проц е с с ов.- И збранны е л е кц ии по курс у “Ге не тикас ос новами с е л е кц ии” . Учебное пос обие / А .К. Буторина, О .С. М аш кина. - В ороне ж : В ороне ж. гос . ун-т, 2004. - 75с . 5. Ге л ь фанд М . Биол огия in silico / М . Ге л ь фанд // Компь ю те рра. Биоинформатика. – 2001. - № 36 (413). – С.20-22. 6. Ге л ь фанд М .С. Биоинформатика: от экс пе риме нта к компь ю те рному анал изу и с нова к экс пе риме нту / М .С. Ге л ь фанд, В .А . Лю бе ц кий // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 11. – С.987-994. 7. Гос тимс кий С.А . И с пол ь зование мол е кул ярны х марке ров дл я анал иза ге номарас те ний / С.А . Гос тимс кий , З.Г. Кокае ва, В .К. Боброва// Ге не тика. - 1999. - Т.35, № 11. - С.1538-1549. 8. Григорян И . Биочипы как приме р индус триал ь ной биол огии / И . Григорян, В . М аке е в // Компь ю те рра. Биоинформатика. – 2001. - № 36 (413). – С. 30-32. 9. Д ы мш иц Г.М . Н е радиоактивно ме чены е ол иго- и пол инукл е отидны е зонды – инс труме нт изучения с труктуры ге нома и диагнос тики / Г.М . Д ы мш иц // Сорос овс кий образовате л ь ны й журнал . – 2001. – Т.7, № 9. – С. 30-36. 10.Кол ь ман Я . Н агл ядная биохимия / Я . Кол ь ман, К.-Г. Р е м. – М . : М ир, 2004. – 469с . 11.Коничев А .С. М ол е кул ярная биол огия / А .С. Коничев, Г.А . Се вас ть янова. - М . : И здате л ь с кий ц е нтр “А каде мия” . - 2003. - 400с .
66
12.М аш кинаО .С. Ге не тичес кая инже не рия и биобе зопас нос ть - И збранны е л е кц ии по курс у “Ге не тика с ос новами с е л е кц ии” . Учебное пос обие / О .С. М аш кина, А .К. Буторина. - В ороне ж : В ороне ж. гос . ун-т, 2005. 71с . 13.М аш кина О .С. К ис пол ь зованию мол е кул ярны х марке ров Д Н К в ге не тико-с е л е кц ионны х ис с л е дованиях л е с ны х дре ве с ны х рас те ний / О .С. М аш кина, Ю .Н . И с аков // Ге не тичес кая оц е нкаис ходного мате риал ав л е с ной с е л е кц ии. – В ороне ж : Н ИИ ЛГиС, 2000. - С. 4-18. 14.М ирзабе ков А .Д . Биочипы в биол огии и ме диц ине XXI ве ка/ А .Д . М ирзабе ков // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 5. – С. 412-424. 15.М ол е кул ярная биол огия кл е тки: в 3-х т. / Б. А л бе ртс [и др.]. - М . : М ир, 1994. 16.М утовин Г.Р . О с новы кл иничес кой ге не тики / Г.Р . М утовин. - М . : В ы с ш . ш к., 2001. - 234 с . 17.М ю л л ис К.Б. Н е обы чай ная ис тория о том, как родил ас ь пол име разная ц е пная ре акц ия / К.Б. М ю л л ис // Н аучная А ме рика. – 1990. - № 5. – С.2634. 18.О с трове рхова Н .В . Сравните л ь ная ге номная гибридизац ия как ме тод оц е нки ге номного дис бал анс а/ О с трове рховаН .В ., Н азаре нко С.А ., Че ре мны х А .Д . // Ге не тика. – 2002. - Т. 38, № 2. – С. 149-160. 19.П атруш е в Л.И . И с кус с тве нны е ге не тичес кие с ис те мы . Т.1: Ге нная и бе л ковая инже не рия / Л.И . П атруш е в. – М . : Н аука, 2004. – 526с . 20.П узы ре в В .П . Ге номны е ис с л е дования и бол е зни чел ове ка/ В .П . П узы ре в // Сорос овс кий образовате л ь ны й журнал . – 1996. - № 5. – С.19-27. 21.Р убц ов Н .Б. М ногоц ве тие с овре ме нной ц итоге не тики, ил и multicolor fish today / Н .Б. Р убц ов, Т.В . Карамы ш е ва // В е с тн. В О ГиС. – 2000. № 11. - С. 11-15. 22.Сивол ап Ю .М . И с с л е дования мол е кул ярно-ге не тичес кого разнообразия инбре дны х л иний и уровня ге те розис а у гибридов подс ол не чника / Ю .М . Сивол ап, А .Е . Сол оде нко, В .В . Бурл ов // Ц итол огия и ге не тика. 1998. - Т.32, N6. - С.5-10. 23.Све рдл ов Е .Д . В е л икое откры тие : ре вол ю ц ия, канонизац ия, догмы и е ре с ь / Е .Д . Све рдл ов // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 6. – С.496-513. 24.Х авкин Э .Е . М ол е кул ярны е марке ры в рас те ние водс тве / Э .Е . Х авкин // Се л ь с кохозяй с тве нная биол огия. – 1997. - № 5. - С. 3-21. 25.Х ромос омы чел ове ка. А тл ас / А .Ф . Захаров [и др.]. - М . : М е диц ина, 1982. - 205с . 26.Х ус нутдинова Э .К. Ге номная ме диц ина – ме диц ина XXI ве ка / Э .К. Х ус нутдинова, С.А . Боринс кая // П рирода. – 2002. - № 12. – С.3-8. 27.Я нковс кий Н .К. Ге ном чел ове ка: научны е и практичес кие дос тиже ния и пе рс пе ктивы / Н .К. Я нковс кий , С.А . Боринс кая // В е с тник Р Ф Ф И . – 2003. - № 2. – С.3-21. 28.Chowdhary B.P. Einerging patterns of comparative genome organization in some mammalian species as revealed by Zoo-FISH / B.P. Chowdhary, T. Raudsepp, L. Fronicke // Genome research. – 1998. – Vol.8. – P. 577-589.
67
29.DNA fingerprinting in plants and fungi / Weising K. [et all.]. - Boca Raton: CRC Press. - 1995. - P.3-35. 30.McKusick A. Mendelian Inheritance in Man / A. McKusick. – Baltimor and London: Jons Hopkins University. – 1992. – 199p.
А вторы : А нас тас ия Конс тантиновнаБуторина, О л ь гаСе рге е внаМ аш кина Р е дактор О .А . Тихомирова