В.Г. АРТЮХОВ, Т.А. КОВАЛЕВА, В,П. ШМЕЛЕВ
БИОФИЗИКА Учебное пособие Под редакцией доктора биологических >шук, профессора В.Г.Артюхова Рекомендовано Государствненным комитетом Российской Федерации по высшему образованию в качестве учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений, обучающихся по направлению "Биология"
Издательство Воронежского университета 1994
УДК 577.3(075.8)
Федеральная целевая программа книгоиздания России Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П.. Биофизика: Учеб. пособие. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. - 336 с. В учебном пособии излагаются основы современной биофизической науки: ее история, методология и методы исследования биосистем, кинетика и термодинамика биологических процессов; рассмотрены вопросы структуры, функционирования и методов изучения биологических мембран; проанализированы природа первичных и конечных стадий фотобиологических процессов, в том числе фотохимических реакций в биополимерах и биомембранах, а также закономерности и механизмы действия ионизирующей радиации на различные биосистемы. Учебное пособие подготовлено на основе общего курса "Биофизика", читаемого авторами на старших курсах биолого-почвенного факультета ВГУ; предназначено для студентов биологических факультетов университетов. Может быть использовано студентами медицинских и сельскохозяйственных вузов. Ил. 94. Табл. 17. Библиогр.: 77 назв. Рецензенты: кафедра биофизики биологического факультета Московского государственного университета (зав. кафедрой - д-р биол. наук, член-корр. РАН, проф. А.Б. Р у б и н), д-р физ.-мат. наук, проф. В.Л. З и м а (Киевский государственный университет)
1903010000 - 014 безобъявл. А/174(03)-94 ISBN 5-7455-0626-1
©
Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П., 1994 © Оформление. Издательство Воронежского университета, 1994
ВВЕДЕНИЕ Биофизика - наука об элементарных, фундаментальных взаимодействиях и превращениях ионов, молекул, надмолекулярных комплексов, лежащих в основе физиологических процессов и биологических явлений. Это наука о молекулярных превращениях, определяющих жизнедеятельность органелл, клеток, организмов- дыхание, движение, обмен веществ и энергии, наследование принципов структуры и функций организма и др. Биофизика исходит из основного положения, сформулированного еще на раннем этапе ее развития: принципиальной приложимости и достаточности фундаментальных законов физики и химии для анализа и объяснений биологических явлений на молекулярном, мембранном и клеточном уровнях организации живых систем и недостаточности этого для объяснения и предсказуемости поведения живых систем при рассмотрении их на организменном, популяционном, биоценотическом, биосферном уровнях, где действуют наряду с физическими, химическими также и биологические законы. Законы физики и химии в иерархии отступают на второй план. При анализе биологических явлений на молекулярном уровне нет нужды говорить о каких-то особых жизненных силах, биологическом поле, а необходимо оставаться на общефизических понятиях силы, энергии, типов межмолекулярных взаимодействий,в рамках физических законов движения материи. Биологическая форма движения материи связана с многоклеточным, организменным, популяционным уровнями организации. Прогресс и успехи биофизики обеспечиваются разработкой и использованием биофизических методов, и особенно метода моделирования как вещественного (реального), так и математического (идеального). Биофизика как наука отвечает трем основным требованиям: имеет свои собственные цели и задачи, собственные объекты, собственные методы исследования. Биофизика - это прежде всего система собственных знаний, представлений, методов для изучения фундаментальных элементарных процессов, лежащих в основе жизнедеятельности организмов, и закономерностей функционирования биологических объектов и систем. Целью биофизики является изучение фундаментальных процессов, обеспечивающих основу жизнедеятельности всех без исключения живых организмов, независимо от уровня развития, эволюционной ступени, возраста индивидуума, среды обитания.
В задачу биофизики входит: - изучение на молекулярном уровне структуры субклеточных образований и механизмов их функционирования; - выявление общих законов (закономерностей) обмена веществ и энергии на уровне клетки и организма; - исследование молекулярных механизмов транспорта ионов, молекул через многочисленные и разнообразные мембраны поверхности разделов и фаз; - изучение молекулярных механизмов дыхания, подвижности; - исследование поглощения, размена энергии на химические превращения, влияние их на жизнедеятельность при действии энергии электромагнитных полей (видимого и ультрафиолетового излучения) , проникающей радиации; - термодинамический анализ сложных систем с использованием законов классической термодинамики, а также термодинамики неравновесных процессов; - кинетический аналитический подход к изучению сложных систем и предсказание их поведения. На ранних этапах своего развития биофизика в основном питалась идеями физики и использовала физические подходы к анализу жизнедеятельности организмов, что позволяло биофизикам оставаться на материалистических позициях и привлекать для анализа сложных биологических явлений фундаментальные физические законы и представления. Специфические особенности биологических объектов, биологические закономерности проявляются начиная с уровня клеток или организма, т.е. на высших уровнях организации и развития биологических систем. Исследование специфических биологических особенностей (эмоций, страха, абстрактного мышления и др.) не входит в задачу биофизики. В настоящее время построение моделей в биофизике связано с глубокой модификацией, переработкой идей смежных наук, что порой может служить источником для стимулирования, развития областей физики, химии, математики. Достаточно вспомнить развитие таких методов анализа биологических объектов, как ядерный магнитный резонанс, электронный парамагнитный резонанс, различные оптические методы, лазерная спектроскопия, гамма-резонансная спектроскопия, микроэлектродная техника, разнообразные электрические методы, метод радиоактивных изотопов и др. Результаты биофизических исследований ложатся в основу анализа конкретных физических процессов и биологических явлений,
что можно наблюдать в таких науках, как биохимия, физиология, микробиология, мембранология и др. Таким образом, развитие биофизики стимулирует прогресс определенных направлений физики, химии, математики. Полученные биофизикой результаты служат основой количественных методов в физиологии, биохимии, микробиологии, экологии. Биофизика является комплексной наукой, которая требует знаний основ физики, математики, общей биологии, физиологии, биохимии, генетики, и вместе с тем, изучение биофизики помогает глубже понять конкретные разделы других наук, выделить то общее, что связывает многие биологические науки, подняться над их частностями. Необходимо подчеркнуть еще одну особенность биофизики. Так как эта наука занимается изучением общих фундаментальных межмолекулярных и субклеточных механизмов функционирования живых систем, то в ней, как правило, отсутствуют сравнительные исследования, проводимые с эволюционных позиций, - нет эволюционной биофизики. Хотя всякая классификация и деление на разделы весьма условны и отражают лишь то положение, которое существует в данный момент, тем не менее они позволяют составить общее представление о предмете. В биофизике можно условно выделить следующие разделы: квантовую биофизику, молекулярную биофизику, биофизику мембран (мембранологию), термодинамику биологических процессов, кинетику биологических процессов, фотобиологию, радиационную биофизику, биофизику сократительных процессов, прикладную биофизику. КВАНТОВАЯ БИОФИЗИКА изучает структуру электронных энергетических уровней атомов, ионов, молекул, их донорно-акцепторные свойства, электронные переходы при поглощении квантов света и пути дезактивации поглощенной энергии, химические превращения электронно-возбужденных молекул, образование фотопродуктов и молекулярные взаимодействия, лежащие в основе фотобиологических процессов и явлений. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА изучает пространственную структуру биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, их комплексов, надмолекулярных образований). Являясь стержневым разделом биофизики, она исследует механизмы функционирования макромолекул, в отношении которых (механизмов) в последние годы получило развитие несколько основных представлений. Так, представление об электронно-конформационных взаимодействиях (ЭКВ) учитывает прежде всего внутримолекулярные
взаимодействия отдельных частей макромолекул, лежащие в основе ряда физиологических процессов. Макромолекулу представляют как своеобразный объект, который сочетает в себе взаимодействия по статистическим и механическим степеням свободы (Л.А. Блюменфельд, Д.С. Чернавский). Для объяснения функционирования биомакромолекул введено понятие конформона (М.В. Волькенштейн). Макромолекулы рассматривают как своеобразные машины, преобразующие энергию из одного вида в другой в пределах одной молекулы, в чем можно убедиться при анализе механизмов фотосинтеза, ферментативного катализа, фотопревращения в бактериородопсине и др. БИОФИЗИКА МЕМБРАН является частью МЕМБРАНОЛОГИИ, которая изучает структуру и функции биологических мембран, этих универсальных элементов построения клеток и субклеточных образований - органелл. Жизнь без мембран невозможна. Биомембраны - пример надмолекулярных образований, хорошо иллюстрирующих принцип структурной и функциональной организации, характерной для живых систем. Разнообразие функций (разграничительная, транспортная, формирования градиентов, трансформации энергии, рецепторная и др.) делает биомембраны объектом пристального внимания не только биофизиков, но и биохимиков, физиологов, иммунологов и других специалистов. Однако межмолекулярные отношения и мембранные механизмы, лежащие в основе функций живых организмов, являются предметом изучения для биофизиков. Такие фундаментальные процессы, как биосинтез, фотосинтез, трансформация и передача энергии, выделение веществ из клеток, биоэлектрогенез, протекают с обязательным участием биомембран. В последние годы внимание биофизиков привлекли мембранные механизмы рецепции, триггерные свойства биологических мембран. Термодинамику и кинетиху биологических процессов обычно включает БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ. Термодинамика биологических процессов анализирует функционирование биологических систем с позиций первого и второго начал термодинамики и следствий из них, используя фундаментальные физические представления. Если приложимость первого начала термодинамики к анализу функционирования живых систем не вызывает особых возражений, то в отношении второго закона термодинамики в течение многих лет не прекращалась дискуссия, итогом которой было установление необходимости учета изменения энергии не только в сие-
теме, но и в окружающей среде. Уменьшение энтропии в организме возможно только при увеличении энтропии в окружающей среде и наличии соответствующей информации. КИНЕТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ рассматривает скорости и механизмы протекания биохимических реакций (последовательных, параллельных, циклических), их взаимосвязь, сетку биохимических реакций, лежащих в основе физиологических процессов и биологических явлений. Изучая биохимические реакции, протекающие одномоментно в клетке (а их сотни), можно легко прийти к заключению, что их анализ невозможен. Однако, используя метод редукции, выделяя ведущие лимитирующие реакции, нетрудно значительно упростить решение задач, сделать возможным анализ кинетики биологических процессов, изучение роли температуры, ингибиторов, ионного состава среды и других факторов. ФОТОБИОЛОГИЯ исследует влияние видимого и ультрафиолетового излучений на биообъекты, начиная от биополимеров и кончая растительными и животными организмами. В данном разделе изучаются механизмы поглощения квантов света атомами и молекулами, миграция энергии, фотохимические реакции, лежащие в основе фотобиологических процессов и явлений фотосинтеза - фундаментального процесса, без которого невозможна жизнь на Земле: в результате фотосинтеза хлорофиллсодержащие организмы аккумулируют энергию солнечных лучей; животные по механизму получения и усвоения энергии являются "паразитами", существующими за счет хлорофиллсодержащих растительных организмов. РАДИАЦИОННАЯ БИОФИЗИКА исследует процессы взаимодействия ионизирующего излучения с биовеществом, размен энергии ионизирующего излучения на радиационно-химические реакции, развитие и исходы лучевого поражения как на уровне молекул и субклеточных образований, так и на уровне организма, что тесно примыкает к радиобиологии. БИОФИЗИКА СОКРАТИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ рассматривает различные формы биологической подвижности (начиная с движения протоплазмы и кончая мышечным сокращением) с позиции единых межмолекулярных взаимодействий белковых нитей актина и миозина (сократительных белков вообще). Многократная повторяемость сокращения и расслабления становится возможной благодаря использованию энергии АТФ. ПРИКЛАДНАЯ БИОФИЗИКА в самостоятельный раздел отнесена весьма условно, так как в каждом разобранном ранее разделе можно выделить прикладные вопросы. Так, в главе "Термодинами-
ка биологических процессов" указывается на практическое приложение биокалориметрии, закона изодинамии Рубнера, прикладное значение закона Гесса и др. В разделе "Кинетика биологических процессов" практическое значение имеют учение о стационарном состоянии, теорема Пригожина, выделение принципа ведущей реакции для анализа сложных динамических систем, где имеются аналоги притока, оттока и превращений внутри системы (домна, железнодорожная станция, больница и т.п.). Не приходится доказывать, что такие разделы биофизики, как фотобиология, радиационная биофизика, электробиология, мембранология и др., имеют прямой выход в практику, способствуют глубокому пониманию процессов, протекающих в живом организме. Изучение сложных процессов, происходящих в популяциях, биогеоценозах, биосфере, с использованием биофизических методов и подходов делает знакомство с содержанием биофизики необходимым не только для биологов разного профиля, но и медиков, работников сельского и лесного хозяйств и других специальностей. Авторы выражают благодарность сотрудникам кафедры биофизики Воронежского университета Г.А. Вашанову, К.П. Пенскому, М.А. Наквасиной, Н.Т. Шейной, О.В. Башариной, Л.П. Рогозиной за помощь при подготовке рукописи к изданию, а ткже зав. кафедрой биофизики биологического факультета МГУ, член-корр. РАН А.Б.Рубину и профессору кафедры биофизики Киевского университета ВЛ.Зиме за труд по рецензированию учебного пособия и ценные критические замечания.
ГЛАВА I ИСТОРИЯ И МЕТОДОЛОГИЯ БИОФИЗИКИ §1. Биофизика как наука Для исключения терминологической путаницы необходимо в самом начале определить ряд понятий, являющихся в дальнейшем ключевыми, в частности конкретизировать определение биофизики как науки, ее содержание, стоящие перед ней задачи. Определение биофизики Учитывая, что биофизика является синтетической, интегративной наукой на стыке физики, химии, математики, биологии, физиологии и других наук, не приходится удивляться многочисленным ее определениям, которые порой существенно отличаются друг от друга по содержанию, целям и задачам. Рассмотрим ряд из них, расположив их в хронологической последовательности. В.В.Ефимов в монографии «Биофизика для врачей» (1952) писал: «Биофизика, подобно биохимии, является частью физиологии. Благодаря накоплению громадного фактического материала биофизика и биохимия оформились в отдельные научные дисциплины. Современные физиологи являются биофизиками и биохимиками, в зависимости от методов, которыми они пользуются для изучения биологических процессов. Так, например, ботаник К.А.Тимирязев ... конечно, был выдающимся биофизиком». Разумеется, такое определение сейчас не выдерживает критики. В.Байер в книге «Биофизика» (1962), имеющей подзаголовок «Введение в физический анализ свойств и функций живых систем», указывал: «Биофизика представляет собой пограничную область науки; поэтому читатель не найдет в этой книге сколько-нибудь резкого разграничения между материалом, относящимся к физике, и материалом, относящимся к химии или к физиологии. При нынешнем состоянии биофизики не удается также четко разделить ее на отдельные области, подобные, например, механике, акустике, теплоте, электричеству и оптике в физике». Как видим, данное определение биофизики как формирующейся науки весьма аморфно. Близок к такому ее пониманию и Ю.Аккерман (1964): «Биофизика охватывает определенный круг вопросов, относящихся как к биологии, так и к современной физике». С точки зрения природы используемого материала биофизика определенно стоит ближе к
обычной биологии, чем к физике. «В отношении методологии биофизика примыкает ближе к физике, чем к биологии...». Б.Н.Тарусов (1968) приводит следующее краткое определение: «Биофизика - это физическая химия и химическая физика биологических систем». Этим он подчеркнул характерную черту биологических явлений: они и реализуются через биохимические реакции, и не являются результатом чисто физических изменений. В книге «Лекции по биофизике» (1968) П.О.Макаров дал развернутое определение биофизики: «... биофизика - это биологическая наука о физико-химических явлениях в живых системах, находящихся в неразрывной связи с окружающей средой. Объектом биофизического исследования является живая система. Это может быть часть клетки, отдельная клетка, отдельный орган, целый организм. Каждая такая система обладает рядом свойств, делающих невозможным сведение биофизического изучения к изучению физики живого объекта. Такими свойствами являются: раздражимость живых систем, наличие обмена веществ в живой системе, способность к росту, способность к движению протоплазмы, способность живых систем к размножению. Современная биофизика выдвигает еще пять характеристик живого: авторегуляция и авторегистрация, дискретность, адаптация и адеквация, микро- и макроэволюция, биопотенциалы живых систем». Он же пишет: «Биофизика является частью физиологии, того ее раздела, который изучает физико-химические аспекты жизни... Биофизика включает в себя такие области, как радиобиология, кибернетика, бионика, квантовая и молекулярная биофизика, космическая биофизика и т.д.». Такая точка зрения не получила широкого признания. В «Медицинской биофизике» Н.И.Губанова и А.А.Утепбергенова (1978) дано следующее определение биофизики: «Биофизика - это наука, изучающая физические и физико-химические процессы, которые протекают в биологических системах на разных уровнях организации и являются основой физиологических актов. Жизнь как биологическая форма движения материи включает в себя низшие формы движения материи - физическую и химическую, через которые она и проявляется». В учебном пособии «Биофизика» (1981) М.В.Волькенштейн отождествляет биофизику с физикой живой природы:«... определим биологическую физику как физику явлений жизни, изучаемых на всех уровнях, начиная с молекул и клеток и кончая биосферой в целом. ... Биофизическое исследование начинается с физической постановки задачи, относящейся к живой природе. Это означает, что ю
такая задача формулируется, исходя из общих законов физики и атомно-молекулярного строения вещества. Тем самым конечная цель биофизики состоит в обосновании теоретической биологии». М.В.Волькенштейн делает акцент на принадлежности биофизики прежде всего к физике как по формулировке задач, так и по методам исследования и трактовке полученных результатов. Ю.А.Владимиров с соавторами (1983) в учебнике для студентов медицинских институтов приводит такое толкование: «Биофизика одна из фундаментальных биологических дисциплин ...биофизика это наука, изучающая физические свойства биологических объектов, физические и физико-химические процессы, протекающие в этих объектах и лежащие в основе их функционирования». И далее: биофизика «учит мыслить точными количественными категориями в тех областях науки, которые раньше поддавались только приблизительному качественному описанию». Наиболее полное определение биофизики дано А.Б.Рубиным в двухтомнике «Биофизика» (1987). Автор рассматривает биофизику как пограничную науку на стыке биологии, физики, химии, математики. «Биофизика - наука о наиболее простых и фундаментальных взаимодействиях, лежащих в основе биологических явлений. Теоретическое построение и модели биофизики основаны на физических понятиях энергии, силы, типов взаимодействия, на общих понятиях физической и формальной кинетики, термодинамики, теории информации». Исходя из этого определения, для построения понятийного аппарата биофизики наряду с основными физическими законами необходимо привлечь теорию информации. С таким понятием биофизики соотносимо определение, приводимое в учебнике «Биофизика» под редакцией акад. П.Г.Костюка (1988): «Биофизика - это наука, изучающая физические механизмы и физико-химические процессы, которые лежат в основе жизнедеятельности биологических объектов. Иными словами, это физика живых систем на различных уровнях их организации - молекулярном, мембранном, клеточном, органном, популяционном». Однако в более позднем издании - «Лекциях по биофизике» И.А.Рыбин (1990) дает несколько иное определение: «Биофизика синтетическая наука... Это молодая отрасль естествознания, возникшая на стыке двух мощных наук - физики и биологии». Он же считает: «Биофизика - некоторая ориентация мысли... Биофизика естественнонаучное направление, целью которого является рациональное объяснение диалектической связи физического и биологического аспектов живой материи... Такое определение подразумеu
вает, что собственно биофизика не заканчивается, а начинается там, где физический анализ жизнедеятельности оказывается недостаточным для объяснения какого-либо биологического феномена и требуется привлечение понятий, принципов, законов, установленных биологией... Говорят, что биология не готова к такому творческому симбиозу». Однако трудно согласиться с подобным пониманием биофизики, поскольку такие разделы, как квантовая биофизика, молекулярная биофизика, радиационная биофизика и др., вряд ли требуют включения в свой понятийный аппарат биологических законов и принципов. В «Биологическом энциклопедическом словаре» (1986) можно прочесть: «Биофизика - наука о физико-химических и физических процессах, протекающих в биологических системах, а также о влиянии на них различных физических факторов». Примерно такое же определение встречаем в «Советском энциклопедическом словаре» (1989): «Биофизика - наука, изучающая физические и физико-химические явления в живых организмах, структуру и свойства биополимеров, влияние различных физических факторов на живые системы». Столь подробно приводимые нами многочисленные определения иллюстрируют различные точки зрения на биофизику, содержание ее разделов, принципиальное понимание разными исследователями сущности изучаемых процессов, происходящих в живых системах. Так как авторы использовали термины «биологический объект», «живая система», то необходимо их пояснить. Под биологическим объектом следует понимать живой организм, орган, клетку, субклеточные образования, биополимеры, совокупность их, обладающие характерными свойствами и функциями. Живая система - это одноклеточный или многоклеточный организмы, их совокупности, обладающие характерными свойствами и признаками, свойственными для данного уровня организации. Таким образом, понятие «биологический объект» имеет более широкий смысл и включает в себя понятие «живая система». Мы считаем, что в определение биофизики должно входить как изучение структуры и организации биологических объектов, так и изучение их физико-химических свойств, параметров, а главное исследование взаимодействий молекул и надмолекулярных комплексов, лежащих в основе фундаментальных элементарных процессов, определяющих физиологические процессы и биологические явления. Обязательными разделами биофизики являются дисципли12
ны, изучающие действие ряда физических факторов, таких как свет, ионизирующее излучение, температура и др. Возможно полное определение биофизики, с нашей точки зрения, такое: биофизика - интегративная наука, изучающая структуру, физические свойства и характеристики биологических объектов, фундаментальные взаимодействия молекул и молекулярных комплексов, элементарные физико-химические и физические процессы, лежащие в основе физиологических реакций и биологических явлений, а также влияние на биологические объекты различных физических факторов (света, ионизирующего излучения, температуры и др.). Более краткое определение: биофизика - это химическая физика, физическая химия и физика биологических систем и объектов. Руководствуясь данным определением, можно считать, что в задачу биофизики входит изучение всех шести типов пространственной организации наиболее важных биологических молекул, их комплексов, сборки и самоорганизации надмолекулярных образований, в первую очередь биомембран, выявление механизмов их функционирования, изучение общих фундаментальных молекулярных механизмов, лежащих в основе общебиологических явлений и процессов, таких как фотосинтез, поступление, утилизация пищевых веществ и энергии, выведение деградированных продуктов обмена и тепла, движение протоплазмы и макрообьектов, обеспечение относительного постоянства структуры и функций, приспособление функций к меняющимся условиям окружающей среды. Одно из центральных мест в современной биофизике занимает исследование наиболее простых межмолекулярных и надмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих протекание основных физиологических реакций и. биологических процессов: изучение молекулярных механизмов движения, фотосинтеза, дыхания, энергетического обеспечения биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, механизмов биоэлектрогенеза, механизмов функционирования биомембран. Выявлению закономерностей влияния различных физических факторов на живые системы уделялось самое пристальное внимание в течение многих десятилетий. Биофизика зрения разрабатывалась еще в прошлом столетии, хотя молекулярные механизмы превращения молекулы родопсина, йодопсина, приводящие к возникновению электрического потенциала действия, стали детально известны во второй половине XX в. Ряд областей биофизики, изучающих роль физических факторов, претендует на выделение в самостоя13
тельные дисциплины и даже науки - это радиобиология, фотобиология и др. Содержание биофизики Согласно А.Б.Рубину (1987) «основное содержание биофизики составляют нахождение общих принципов биологически значимых взаимодействий на молекулярном уровне, раскрытие их природы в соответствии с законами современной физики, химии, математики и разработка на основе этого исходных обобщенных понятий, адекватных описываемым биологическим явлениям. Формулировка собственных исходных теоретических понятий характерна для самостоятельных развитых наук, имеющих свою концептуальную базу. Специфика биологических закономерностей, полностью раскрывающихся на высших уровнях организации развитой биологической системы, тем не менее проявляется уже на низших молекулярных уровнях живого». В основе любого физиологического процесса или биологического явления лежат высококоординационные последовательные взаимодействия специфических биополимеров и макромолекулярных комплексов. Однако необходимо помнить, что чем выше уровень организации биологического объекта, тем большую роль играют биологические закономерности, тем труднее связать последние с молекулярными изменениями, протекающими в клетках, и проследить непосредственный механизм молекулярных взаимодействий. Для каждого уровня организации биологической системы характерны свои собственные закономерности. Следовательно, можно утверждать, что биофизики работают в основном на молекулярном, мембранном, клеточном уровнях организации биологических объектов. В зависимости от поставленных задач они могут достигать атомного или биосферного уровней. § 2 . История биофизики Биофизические исследования в XVII и XVIII веках Биофизику считают относительно молодой наукой, окончательно сформировавшейся в середине XX столетия. Но это справедливо только отчасти, так как становление биофизики проходило длительное «ремя. Условно можно выделить три этапа ее развития: I этап - с начала XVII до середины XVIII в.; II этап - с середины XVIII до середины XX в.; III этап - с середины XX в. до наших дней. I этап - накопление отдельных фактов. Делались первые попытки количественных измерений характеристик и параметров биоло14
гических объектов и систем. Для объяснения установленных фактов и наблюдаемых явлений использовались законы физики, но довольно часто делались ссылки на «жизненную силу», своеобразие и специфичность изучаемых объектов и систем. Итак, первые идеи биофизики заключались в обосновании материального единства живых организмов и неорганической природы, универсальности механического движения в живой и неживой природе, первых попытках применить физические законы для объяснения ряда физиологических функции (кровообращения). Был создан ряд физических приборов (лупа, микроскоп и др.), позволивших установить клеточное строение живых организмов и изучать мир простейших. Наметился переход от фрагментарных представлений к системе знаний о функциях живого организма, к созданию физиологии. II этап - широкое проведение экспериментов и определение многих физико-химических параметров живых организмов. Для объяснения сложных биологических явлений привлекались законы физики и химии. III этап - формирование собственного понятийного аппарата, разработка сложных биофизических методов исследования, выделение ряда разделов в самостоятельные научные дисциплины (фотобиология, радиобиология, мембранология и др.). Для объяснения биологических процессов и явлений привлекают не только законы физики, химии, но и математики и биологии. Если считать биофизическими исследованиями попытки определения физических параметров и характеристик живых организмов и изучение жизненных процессов и явлений с физико-химических позиций, то оказывается, что первые биофизические работы были проведены физиологами. Это и неудивительно. Термин «физиология» складывается из двух частей: греч. physis - физика, природа, logos - понятие, учение, наука о природе, но не вообще о природе этим занимается физика, а о функционировании живых организмов в природе. В данной связи понятен приоритет физиологиов разных стран в выполнении биофизической работы. Зарождение и развитие биофизики на начальных этапах зависели от успехов различных направлений физики, а позднее и биологии, в частности физиологии. Исследование физических свойств живых организмов, их характеристик, параметров началось после заложения основ механики. В трудах основоположника учения о кровообращении, английского врача и анатома У.Гарвея (1578-
15
1657) были использованы прямые наблюдения на людях и применено учение о гидродинамике. Французский философ, математик, физик, физиолог Р.Декарт (1596-1650) стремился не только объяснить законами механики физические явления - от механического перемещения предметов до движения небесных тел, но и применить эти законы в физиологии. Вместе с тем создание материи и приведение ее в первоначальное движение, по мнению Декарта, принадлежит Богу. В XVII в. господствовала идея причинного единства движения в живых организмах и неорганическом мире. Р. Декарт использовал физику и математику для объяснения ряда функций живых организмов. Он дал описание устройства глаза как оптического прибора, высказал суждения о формировании зрительного восприятия, опубликовал рекомендации по устройствам, улучшающим зрение. Все это было изложено в трактате «Диоптрика» (1637). Принципы механики использовал Дж.Борелли (1608-1679) для объяснения физических основ ходьбы, бега, плавания, ныряния, полета животных. Большую роль в развитии биологии и медицины сыграло создание и усовершенствование ряда физических приборов. А.Ван Левенгук (1632-1723) создал линзы со 160-кратным увеличением, которые были использованы ботаниками и зоологами для изучения простейших организмов. М.Мальпиги (1628-1694) обнаружил и описал капилляры, соединяющие артерии и вены, что позволило говорить о замкнутой системе кровообращения, основываясь не на догадках, а на реальных наблюдениях. Усовершенствование микроскопа Р.Гуком (1635-1703), разносторонним ученым, экспериментатором, архитектором, создателем ряда физических приборов, позволило установить клеточное строение растительной ткани. Им же введен термин «клетка». Он также отстаивал волновую природу видимого света. Фундаментальные достижения физики конца XVII в. связаны с именем И.Ньютона, опубликовавшего в 1687 г. «Математические начала натуральной философии». Эмпирические знания приобретают ценность, индуктивный метод становится основным. Этому во многом способствовало заявление И.Ньютона: «Гипотез не изобретаю». В физике выделяется ряд областей: учение о газовых состояниях, динамика твердого тела и жидкости, физика света, развивается учение об электричестве. Совершенствуется математический аппарат физики (используются дифференциальное и интегральное ис16
числения); создается и применяется высокочувствительная измерительная техника; физические теории базируются на законах сохранения энергии и вещества. В работах Л.Эйлера (1707-1783) идеи механики были использованы для создания учения о гемодинамике - движении крови и других биологических жидкостей. Универсальным ученым был М.В.Ломоносов (1711-1765), его теоретические работы по термодинамике, цветному зрению, механике содержали элементы предвидения, хотя ни одно из них им самим не было экспериментально доказано. Значительный вклад в развитие физиологии и биофизики сделал французский физик и химик А.Л.Лавуазье (1743-1794). Он удивительно сочетал теоретические представления с их блестящей экспериментальной проверкой. Рабочая гипотеза у него предшествовала опыту, в котором ученый искал готовый ответ, используя количественные методы. За свою короткую жизнь Лавуазье успел сделать многое для науки: опроверг теорию флогистона, доказал, что дыхание животных равнозначно окислению и горению веществ. Он является одним из основоположников химии. В 1894 г. замечательный русский физиолог И.М.Сеченов, много сделавший для развития физико-химических исследований в физиологии, сказал: «В настоящее время все сделанное Лавуазье кажется донельзя простым, но не следует забывать, что он создавал звенья этого простого целого вновь, сталкиваясь по временам с ложными воззрениями своего времени, и потому вынужден был проверять опытом каждый новый шаг в произведенной стройной цепи умозаключений. Сделать это мог только человек с умом, глубоко проницательным, точным и прямолинейным. Ему больше, чем кому-либо, принадлежит великая заслуга систематического приложения физико-химических способов исследования в области биологии». Историческую оценку работам АЛЛавуазье дал К.А.Тимирязев: «С той поры, как дыхание - эта, казалось, сущность жизни, было сведено гением Лавуазье на химико-физический процесс, витализму был нанесен роковой удар... Можно сказать, что все блестящие успехи физиологии были тесно связаны с распространением на нее и нередко талантливым усовершенствованием (в применении к ее более сложным и тонким задачам) экспериментальных методов физики и химии». Применение же количественных методов, базирующихся на фи-
17
зической теории, для решения физиологических и биологических задач, по сути есть биофизика. Конец XVIII в. был ознаменован достижением значительных успехов в изучении электричества. В 1785 г. Ш.Кулон опубликовал закон о взаимодействии электрических зарядов. Были изобретены чувствительные электроскопы, изучено действие электрических зарядов на животных и человека. В моду у богатых людей вошло увлечение коллективным наблюдением действия электрического тока на человека и животных. До настоящего времени ведутся дискуссии о роли и заслугах Л.Гальвани (1737-1798) и А.Вольта (1745-1827) в установлении животного электричества и химического источника электрического тока. Подробно об этом споре можно прочесть у И.А.Рыбина в «Лекциях по биофизике» (1990). Считается, что так называемым вторым опытом (сокращение мышцы без использования металлических электродов) Л.Гальвани доказал наличие источника электрического тока в живом организме. Он использовал два икроножных препарата задних конечностей лягушки. При набрасывании нерва второго препарата на поврежденный и неповрежденный участки мышцы первого препарата он наблюдал сокращение мышцы второго препарата. Заслугой же А.Вольта явилось доказательство возникновения разности потенциалов между медной и железной пластинами, погруженными в водный раствор. Ученый предложил источник электрического тока, по иронии судьбы названный «гальваническим элементом». В результате научного спора Л.Гальвани и А.Вольта было установлено, что поврежденная мышца является источником электрического тока. Был создан первый химический источник электрического тока (вольтов столб, 1800), открыта разность электрических потенциалов между поврежденным и интактным участками мышцы. К началу XVIII в. изменился характер получения и осмысливания биологических знаний. Описательный и «инвентаризационный» подход в биологии к изучению флоры и фауны Европы, Азии и других частей света позволил накопить такое огромное количество фактов, что потребовалась их систематизация. К.Линней (1707-1778), первый президент Шведской академии наук, создал научную систематику флоры и фауны, которой мы пользуемся и в настоящее время. В многотомной «Естественной истории» Ж.ЛЛ.Бюффона (1707-1788) была развита идея об изменчивости видов. В то же время заложены основы эмбриологии и биологии индивидуального развития (К.Ф.Вольф, 1734-1794). Были 18
достигнуты значительные успехи в сравнительной анатомии, физиологии человека и животных, проведены основополагающие работы по физиологии растений. Таким образом, развитие многих областей биологии подготовило их к восприятию не только идей физики, но и ряда методических подходов этой более точной науки. Развитие биофизических исследований в XIX и XX веках Бурное развитие физики и биологии в XIX в. послужило основой для успешного формирования биофизики. Достижения физики были неоспоримыми: установлены законы классической механики, термодинамики; заложены основы теоретической физики. Физика стала многоотраслевой, с высокоразвитым понятийным аппаратом. Эмпиризм сочетался с разработкой теории, и индуктивный метод дополнился дедуктивным. Изменился характер биологии: от собирательства, описания, инвентаризации живых объектов она переходит к экспериментальным методам исследования, разработке классификаций и систематизации, выделению общего в частностях, созданию теорий. Существенным завоеванием биологии явилось обоснование клеточной теории (М.Шлейден, 1838; Т.Шван, 1839), теории эволюции Ч.Дарвина (1859), теории онтогенеза (Э.Геккель, 1866) и др. Самостоятельными биологическими науками становятся эмбриология и биология индивидуального развития, палеонтология, микробиология, биохимия и др. Особенно успешно развивается физиология человека и животных, что объясняется не только потребностями медицины и сельского хозяйства, но и вечным стремлением человека познать себя самого. Для решения физиологических задач все чаще стали привлекать количественные физико-химические методы с использованием достижений физики и химии. Широкое распространение получает экспериментальный метод, он становится преобладающим. Значительные успехи были достигнуты в разработке биологической термодинамики, которая базировалась на двух началах (законах), обоснованных в середине XIX в. Немецкий корабельный врач Р.Майер (1814-1878) обратил внимание на более алую кровь своих пациентов во время пребывания их в тропиках. Он объяснил это снижением интенсивности окислительных процессов в организме при высокой температуре окружающей среды, что приводило к уменьшению отдачи кислорода в тканях, меньшему поступлению в кровь углекислого газа. Р.Майер пришел к выводу, согласно которо19
му теплота и работа могут трансформироваться друг в друга. Он считал, что теплота, механическая работа, электричество, магнетизм, химические превращения есть связанные друг с другом различные формы энергии, способные переходить друг в друга в эквивалентных количествах. По Р.Майеру, первое начало термодинамики - это обобщенный закон сохранения и превращения энергии. Окончательную его формулировку Р.Майер дал в 1842 г. в статье «Замечания о силах неживой природы». Действие первого начала термодинамики Р.Майер перенес на живые организмы, считая, что в органической природе происходят различные превращения первоначально накопленной растениями энергии. Укреплению этой точки зрения способствовал петербургский профессор Г.И.Гесс, сформулировавший в 1840 г. закон, согласно которому теплосодержание химического процесса зависит только от теплосодержания начальных и конечных веществ и не зависит от промежуточных превращений, т.е. не зависит от путей перехода, количества стадий и этапов. Применимости первого начала термодинамики к анализу энергетических затрат организма во многом способствовали работы ЮЛибиха (1803-1873), М.Рубнера (1854-1932) и др. по установлению тепловых эквивалентов белков, жиров, углеводов и различных видов пищи (закон изодинамии М.Рубнера). Проведенные У.Этуотером и Ф.Бенедиктом в 1892-1897 гг. калориметрические исследования на животных и человеке утвердили справедливость приложения первого начала термодинамики для энергетических превращений в живых организмах. Разработку и формулировку второго начала термодинамики обычно связывают с трудами С.Карно (1796-1832), РЛ.Клаузиуса (1822-1888), У.Томпсона, Дж.Максвелла (1831-1879), М.Планка (1857-1947). Принцип необратимости, разработанный С.Карно, лежит в основе второго начала термодинамики. Для характеристики необратимости процесса Р.Клаузиус ввел понятие функции состояния системы - энтропии, которая самопроизвольно растет при протекании необратимых процессов. Дискуссия о применимости второго начала термодинамики к живым организмам велась и в XX в. Закончилась она в пользу положения, что «живая природа все-таки не научилась обжуливать энтропию» (Э.Шредингер), если учитывать изменения последней не только в организме, но и в окружающей среде. Многое было сделано для развития биофизики в XIX в. Т.Юнгом (1773-1829), английским ученым, разработавшим теорию цветного 20
зрения, объяснившим интерференцию света, аккомодацию глаза, рассматривавшим деятельность сердечно-сосудистой системы с позиций гидродинамики. Обоснование закона сохранения энергии в живых организмах связано с работами Ю.Р.Майера (1814-1878), немецкого естествоиспытателя, врача, который первым сформулировал закон сохранения энергии, теоретически рассчитал механический эквивалент теплоты (1842), а также с работами Г.Гельмгольца (1821-1894). В XIX в. значительные успехи были достигнуты в изучении электрических явлений в тканях живого организма. Более подробные сведения об этом можно получить из учебных пособий «Электрофизиология» А.Б.Когана (1969), А.ИЛакомкина и И.Ф.Мягкова (1977), монографии «Общая электрофизиология» Д.С.Воронцова (1961). Биофизический характер носили исследования К.Маттеуччи (1837), Э.Г.Дюбуа-Реймона (1818-1896), Г.Гельмгольца, Ю. Бернштейна (1912) и др. Итальянский физик К.Маттеуччи доказал возникновение ритмического электрического тока в сокращающейся икроножной мышце лягушки, способного вызвать сокращение другой мышцы, нерв-которой расположен на сокращающейся мышце (физиологический реоскоп). Он установил факт, что поврежденный участок мышцы несет отрицательный заряд по отношению к неповрежденному - так называемый «ток покоя», а правильнее - разность потенциалов повреждения. В это же время немецкий физиолог Э.Дюбуа-Реймон применил индукционную катушку для определения порогов раздражения и изучения количественной зависимости между силой раздражения и величиной сокращения икроножной мышцы лягушки. Данный метод с успехом применялся в физиологии до середины XX в. Ученик Э.Дюбуа-Реймона Л.Герман (1838-1914) высказал гипотезу об электрической природе возбуждения и распространения нервного импульса. Г.Гельмгольц был автором фундаментальных трудов по физике, биофизике, физиологии, психологии. В 1847 г. он впервые математически обосновал закон сохранения энергии, доказал всеобщий его характер. Гельмгольц предложил термодинамическую теорию химических процессов, ввел понятия свободной и связанной энергии. Он разработал метод измерения и впервые измерил скорость распространения нервного возбуждения в седалищном нерве лягушки: средний ее показатель составил 26,4 м/с, у человека - около 80 м/с, что значительно меньше по сравнению с данными многих авторов. 21
Он же обнаружил и измерил величину теплообразования в мышце во время ее сокращения. Конец XIX столетия отмечен интенсивной разработкой электроизмерительной техники. В 1886 г. немецкий исследователь Ю.Бернштейн зарегистрировал потенциал действия, который возникал и развивался по принципу «все или ничего». Ученый отстаивал идею наличия поверхностной мембраны клеток, ответственной за ряд основных их функций (отделение от окружающей среды, проницаемость в отношении воды, различных веществ, электрогенез и др.). К концу XIX в. было установлено наличие электрических потенциалов у растений и произведено их измерение при освещении и затемнении листа, воздействии света разного диапазона длин волн (работы немецкого ученого О.Хааке; О.Уолера, 1900). Определенные успехи в XIX в. были достигнуты в оптике. Г.Гельмгольц в 1856-1867 гг. выпустил трехтомник по физиологической оптике. Он разработал офтальмологическое зеркало, экспериментально обосновал трехкомпонентную гипотезу цветного зрения. В области физиологической акустики блестящие экспериментальные способности Г.Гельмгольца как физика сочетались с его глубокими знаниями физиологии и анатомии. Резонансная теория слуха Г.Гельмгольца была позднее дополнена и модернизирована в теорию акустической системы с динамически меняющимися характеристиками. Созданная в середине XIX в. М.Шлейденом и Т.Шваном клеточная теория содержала три главных положения, обосновывающих, во-первых, образование клеток; во-вторых, клеточное строение всех тканей, органов и всех макроструктур организма растительного и животного происхождения; в-третьих, приложимость этих двух положений к росту и развитию растений и животных. Предложенная впоследствии мембранная гипотеза исходила из положения, что на поверхности клеток имеется особый структурный и функциональный слой (мембрана), обладающий избирательной проницаемостью и регулирующий осмос и тургор клеток (В.Пфеффер, 1877; Х.де Фриз, 1884). В разработке проблемы клеточной проницаемости особого внимания заслуживают исследования Р.Овертона (1902) по изучению проницаемости более 500 различных веществ. Им сформулированы основные правила проникновения веществ в клетки. Р.Овертон предложил липидную гипотезу строения биомембран: последняя представляет собой, слой липидов, который образует поверхность, не растворимую в воде, легко про-
22
пускающую вещества, растворимые в органических растворителях (липофильные вещества). В конце XIX в. стали успешно изучаться электрические свойства клеточных мембран: электропроводность на постоянном и переменном токе, биоэлектрогенез растительных и животных клеток, их проницаемость для различных веществ, воды, газов. Но основные успехи в исследовании механизма биоэлектрогенеза были связаны с развитием микроэлектродной техники в середине XX в. Успехи физической и коллоидной химии в конце XIX столетия стимулировали развитие биофизических исследований. Большая заслуга в этом принадлежит американскому ученому ЖЛебу (1859-1924), которого считают одним из основоположников физико-химической биологии. Изучение роли различных ионов сделало возможным физико-химическое объяснение их сложных взаимодействий: аддитивности, антагонизма, независимости и др. В 1906 г. вышла в свет на русском языке книга Ж.Леба «Динамика живого вещества», где было дано объяснение партеногенеза и оплодотворения с физико-химической точки зрения. Позднее появляются работы Х.Шаде (1912) о роли физико-химических явлений при различных заболеваниях. В 1912 г. была опубликована его книга «Физическая химия во внутренней медицине», которая вскоре стала считаться классической. Особое место в истории биофизики занимает история мембранологии, отдельные этапы которой изложены в книге: А.Котык, К.Яначек Мембранный транспорт. Междисциплинарный подход. М., 1980. Трудно назвать еще один раздел биофизики, где было бы опубликовано такое количество монографий, статей, сборников, учебных пособий как отечественных, так и зарубежных авторов. Назовем некоторые из м о н о г р а ф и й : Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М., 1972; Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны. М., 1974; Биологические мембраны/ Под ред. Д.С.Парсона. М., 1978; Иванов В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. М„ 1982; Кагава Я. Биомембраны. М., 1985; Сим Э. Биохимия мембран. М., 1985; Биологические мембраны. Методы/ Под ред. Дж.Финдлея, У.Эванза. М., 1990; Волотовский И.Д., Хооратович В.И,, Баранова Л.А. Транспорт ионов в фоторецепторной клетке. Минск, 1990, и ряд других. С л е д у е т у к а зать на систематический выход монографий под редакцией
А.А.Болдырева в серии «Биохимия мембран» издательств «Высшая ш к о л а » И М Г У : Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. М., 1985; Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М., 1989; Введение в биомембранологию/ Под ред. А.А.Болдырева. М., 1990 и др.
Успешное развитие физико-химической биологии было связано с 23
созданием в конце XIX в. шведским ученым С.Аррениусом (18591927) теории электролитической диссоциации солей, кислот и оснований. Он же много занимался вопросами химической кинетики (уравнение Аррениуса). Лауреат Нобелевской премии (1920) В.Нернст (1864-1941) сформулировал закон распределения электролитов между фазами; опубликовал фундаментальные работы по электрохимии, катализу; создал ионную теорию биоэлектрических явлений (происхождение потенциалов действия, покоя). Следует отметить труды еще одного лауреата Нобелевской премии А.Хилла (1886-1977) по термодинамике мышечного сокращения, он сумел измерить теплопродукцию во время фазы сокращения и фазы расслабления мышцы. В области исследования электрических свойств, характеристик клеток и тканей, биоэлектрогенеза многое сделал К.Коул (1933): ему принадлежит определение электрического сопротивления и емкости клеток и мембран, измерение ионных потоков через мембрану клеток в покое и при возбуждении и др. Э.Эдриан (1889-1977) при помощи микроэлектродной техники изучал биопотенциалы покоя и действия отдельных нервных клеток (Нобелевская премия 1932 г. совместно с Ч.С.Шерринггоном). Современная мембранная теория биоэлектрогенеза была создана А. Ходжкиным (1914; Нобелевская премия 1963 г., совместно с Дж.Эклсом и А.Ф.Хаксли). Впервые были измерены ионные потоки через мембрану во время развития потенциала возбуждения отдельной нервной клетки. Середина XX в. характеризуется появлением системы знаний о физико-химических фундаментальных процессах, лежащих в основе жизнедеятельности живых организмов. Изучение таких процессов и явлений, как фотосинтез, внутриклеточное дыхание, мышечное сокращение, ионные механизмы биоэлектрогенеза, механизмы мембранной проницаемости и др., потребовало разработки новых биофизических подходов и методов. Анализ полученных результатов привел к созданию системы знаний, которая отличалась от ранее существовавшей в биологии, и в частности в физиологии, переходом на субклеточный, мембранный, молекулярный уровни организации и функционирования биологических объектов. Начали формироваться новый понятийный аппарат, оригинальная система взглядов. Стало очевидно, что биофизика - это не только физика живого, законов физики недостаточно для понимания процессов жизнедеятельности, необходимо привлечь биологические законы и закономерности - теорию эволюции, законы наследственности, тео24
рию информации, ввести понятие детерминизма процессов жизнедеятельности. Стала складываться методология биофизики. Внедрение в исследовательскую практику ряда сложных высокоинформативных методов, какими являются электронный парамагнитный резонанс, ядерный магнитный резонанс, спектрофотометрические методы, метод радиоактивных изотопов, микроэлектродной техники, метод регистрации сверхслабого свечения биологических объектов, флуоресцентные методы, пикосекундная спектрофотометрия, метод математического моделирования, позволило биофизике занять лидирующее положение среди экспериментальных биологических наук, приблизить биологию по точности получаемых результатов к химии и физике; открылись возможности для создания теоретической биологии. В этом немалая заслуга биофизики. В настоящее время биофизика решает ряд проблем: выявление молекулярной организации биополимеров и ее связи со свойствами и выполняемыми функциями; выявление структуры и функционирования молекулярных и мембранных машин; изучение молекулярных датчиков, рецепторов, путей и механизмов утилизации в биологических машинах энергии фосфорных соединений; исследование фотобиологических, радиобиологических первичных механизмов при поглощении внешней энергии биологическими системами; разработка новых методов исследования биологических систем на молекулярном, мембранном, клеточном уровнях организации и др. Поступательное развитие биофизики продолжается. Становление биофизики как самостоятельной науки произошло в середине текущего столетия, чему во многом способствовала деятельность таких ученых, как Д.Бронк, А.Качальский, Дж.Робертсон, П.Бейкер, Т.Шоу, А.Ходжкин, О.Хит, Д.Холл, К.Рао, И.Пригожин, Дж.Николе, Р.Клейтон, Б.Н.Тарусов, А.А.Красновский, П.Г.Косткж, Ю.А.Владимиров, М.В.Волькенштейн, С.В.Конев, И.Д.Волотовский, А.Б.Рубин, Л.А.Блюменфельд и др. На международной арене биофизика была узаконена в 1961 г. созданием Международного союза чистой (в СССР - теоретической) и прикладной биофизики. Постоянные научные контакты позволяли регулярно проводить международные биофизические конгрессы: Стокгольм (1961), Вена (1966), Мюнхен (1969), Москва (1972), Копенгаген (1975), Киотто (1978), Мехико (1981), Бристоль (1984). В 1982 г. в Москве состоялся первый Всесоюзный биофизический съезд, на котором были широко представлены работы по современ-
25
ным проблемам биофизики. Идет подготовка к открытию второго биофизического съезда. Становление и развитие биофизики в России Становление биофизики как науки в России связано с развитием физико-химических подходов в биологии и медицине. Ряд физиологов плодотворно использовал такие подходы для анализа и объяснения сложных физиологических процессов - прежде всего выдающиеся русские физиологи И.М.Сеченов и Н.Е.Введенский, Б.Ф.Вериго, В.Ю.Чаговец. Так, И.М.Сеченов (1829-1905) установил количественные законы растворимости газов в солевых растворах, в крови и ряде биологических жидкостей; предложил называть подобные исследования молекулярной физиологией. Н.Е.Введенский (1852-1922) изучал закономерности реагирования возбудимых тканей (нервов, мышц) на действие различных раздражителей разной силы и длительности, обосновал учение об оптимуме и пессимуме силы раздражителя, о единстве природы возбуждения и торможения. Б.Ф.Вериго (1860-1925), ученик Н.Е.Введенского, установил влияние кислорода на способность крови связывать диоксид углерода. Физиолог В.Ю.Чаговец (1873-1941) выдвинул первую ионную конденсаторную теорию биоэлектрических явлений, экспериментально обосновал теорию раздражающего действия электрического тока. Систематические биофизические исследования проводились в Институте экспериментальной медицины (основан в 1890 г. в Петербурге). В 1922 г. был открыт Институт биофизики при Минздраве РСФСР под руководством талантливого организатора и ученого П.ПЛазарсва. Здесь работали выдающиеся ученые С.И.Вавилов (предельная чувствительность к свету человеческого глаза), П.А.Ребиндер и В.В.Ефимов (поверхностное натяжение клеток, физико-химические механизмы клеточной проницаемости), СВ. Кравков (физико-химическая природа цветного зрения, механизмы действия лекарственных и токсических веществ). Особая роль принадлежит Н.К.Кольцову (1872-1940), организатору и первому директору (1917-1937) Института экспериментальной биологии (Москва). Он - автор гипотезы о молекулярном строении и матричной репродукции хромосом, принципиальные положения которой легли в основу современной молекулярной генетики и биологии. По инициативе Н.К.Кольцова в МГУ была открыта ка-
федра физико-химической биологии, ею заведовал его ученик С.Н.Скадовский. Биофизические исследования проводили ученые Института биохимии АН СССР (Москва). А.И.Опарин выдвинул физико-химическую теорию возникновения и эволюции жизни на Земле. Биофизической лабораторией руководил академик А.А.Красновский (1913-1993), который исследовал первичные механизмы и стадии фотосинтеза, открыл реакцию фотохимического восстановления хлорофилла, вел преподавание биофизики в МГУ. В Институте экспериментальной медицины им. А.М.Горького, который был организован в Москве (1932) при СНК СССР, в отделе биофизики работали выдающиеся ученые П.П.Лазарев, Г.М.Франк (в последующем первый директор Института биофизики АН СССР), Д.Л.Рубинштейн - автор ряда монографий и учебных руководств («Введение в физико-химическую биологию», «Физико-химические основы биологии», «Общая физиология» и др.). В 1950 г. в Москве создается Лаборатория биофизики АН СССР, а в 1952 г. она преобразуется в Институт биологической физики АН СССР (ИБФ). В 1967 г. ИБФ АН СССР переводят во вновь созданный Биологический центр АН СССР (г.Пущино). В ИБФ АН СССР проводилась работа по изучению ультраструктуры клеток животных и растений, механизмов взаимодействия ультраструктур (акад. Г.М..Франк),, по исследованию вопросов радиационной биофизики (член-корр. А.М.Кузин), общих механизмов взаимодействия и управления клеточными и межклеточными процессами. Академик АН СССР А.Н.Теренин (1896-1967) основал в Ленинграде научную школу по фотохимии и фотобиологии. В течение ряда лет спектральными и оптическими методами им изучались фотохимические реакции с красителями. Развитие биофизики в Сибири связано с Институтом физики и биофизики СО АН СССР в Красноярске и созданием кафедры биофизики в Красноярском университете. Серьезные работы по изучению влияния энергии электромагнитных колебаний на биосистемы проводили ученые Томского университета. Проблемы управления микробиологическим синтезом, создание установок для получения пищевого и кормового белка, исследование экологически замкнутых систем, использование биофизических методов для экологических изменений в биосфере - вот ряд проблем, интересовавших академика И.А.Терского, работавшего в Красноярске. Для подготовки молодых специалистов в области биофизики в 27
1953 г. профессором Б.Н.Тарусовым была организована кафедра биофизики на биолого-почвенном факультете МГУ. В 1958 г. такая кафедра создана в Ленинградском университете (зав.кафедрой проф. П.О.Макаров). В 1963 г. кафедры биофизики были созданы в Воронежском, Киевском университетах, позднее - в Горьковском, Красноярском, Саратовском университетах, в ряде столичных университетов бывших союзных республик (в Тбилиси, Ереване, Баку и др.). В 1955 г. на физическом факультете МГУ также была организована кафедра биофизики (зав.кафедрой - проф. Л.А.Блюменфельд). За годы своего существования она подготовила сотни высококвалифицированных биофизиков, работающих в ведущих научных учреждениях страны. Несколько лет спустя во II Московском медицинском институте была открыта кафедра биофизики (зав.кафедрой - акад. Ю.А.Владимиров) . Начата систематическая подготовка биофизиков для медицинских научно-исследовательских институтов, лабораторий, преподавателей биофизики для медицинских институтов. Академия наук СССР с 1956 г. стала регулярно издавать журнал «Биофизика». В старейшем Московском обществе естествоиспытателей работает секция биофизики. В настоящее время, несмотря на все объективные экономические и организационные трудности, биофизические исследования в России продолжаются. Имеются определенные успехи: разработан метод пико- и фемптосекундной спектрофотометрии для изучения фотофизических процессов при фотосинтезе; экспериментально проверена хемиосмотическая теория, созданы молекулярные селективные датчики и др. Некоторые разделы биофизики приобретают черты самостоятельных наук: радиобиология, фотобиология, электробиология. Это естественный процесс. Заключение Со времени возникновения в XVII в. развитие и становление биофизики шло поступательно, но не равномерно, под влиянием господствовавших в ту или иную эпоху научных идей. Если условно выделить три периода в развитии биофизики, то первый из них - с XVII до середины XVIII в. - характеризовался ее зависимостью от успехов физики и влиянием физических идей. Фундаментальные достижения физики в области механики, динамики твердого тела и жидкости, учение о свойствах света, электричестве, магнетизме с 28
совершенствованием математического аппарата физики привели к разработке ряда высокочувствительных приборов и измерительной аппаратуры, которые могли быть применены в биологических исследованиях. Биология проходила стадию накопления фактов, инвентаризации биологических объектов и систем, что предопределило необходимость в дальнейшей систематизации и классификации накопленного. Второй этап развития биофизики - с середины XVIII до середины XX в. - связан с переходом от простого наблюдения к широкому применению экспериментального метода, определением многих физико-химических параметров и показателей биологических объектов, модернизацией физических и химических методов для изучения биологических систем, привлечением законов физики и химии для объяснения биологических процессов и явлений. Третий период - с середины XX в. до наших дней - отличается широким внедрением в биофизику метода математического (идеального) и реального (вещественного) моделирования биологических процессов и поведения биологических систем, интенсивной разработкой и применением сложных методов исследования биополимеров, мембран, клеток (методы радиоспектроскопии - ЯМР, ЭПР, гамма-резонансной спектроскопии, радиоактивных индикаторов, аналитического центрифугирования, полярографии, динамические спектральные методы, методы лазерной спектроскопии, калориметрические методы исследования биополимеров и мембранных систем и многие другие). Главным отличием третьего периода от предыдущих является формирование собственного понятийного аппарата биофизики, поскольку для объяснения получаемых данных становится недостаточно законов физики и химии и приходится привлекать законы биологии. Очевидно, что к биологическим системам следует подходить и как к вероятностным, и как к детерминированным. Широко внедряется системный подход к анализу биологических процессов. Начала формироваться теоретическая биология. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Является ли биофизика относительно молодой наукой? 2. Какие этапы становления биофизики условно можно выделить? 3. Какую роль играла физика на раннем этапе становления биофизики? 4. Почему физиологи одними из первых среди биологов стали проводить исследования биофизического характера? 5. Какое место занимает биофизика в ряду биологических наук? 6. Почему биофизику считают интегративной комплексной наукой? 29
7. Когда стал формироваться понятийный аппарат биофизики? S. С какими биологическими науками биофизика тесно связана? 9. Какова роль биофизики в возникновении теоретической биологии?
§ 3 . Методология биофизики Терминология При ознакомлении с данным разделом следует уяснить смысл ряда терминов и ограниченность их толкования в рамках конкретной биофизической науки. Прежде всего, необходимо понять смысл следующих терминов: объект биофизического исследования, биологическая система, методика, метод, методология. В дальнейшем познакомимся и с другими понятиями. Биополимеры, субклеточные образования, биомембраны, клетки, органы, организмы, популяции, биоценозы, биосфера в целом служат объектом биофизического исследования. Широко анализируются модели биологических объектов. Биологическая система - совокупность взаимосвязанных определенным образом элементов, отграниченная от окружающей среды и обладающая рядом специфических особенностей, характерных для живого организма: мембранной организацией, наличием дыхания или анаэробного окисления, утилизацией энергии света, биосинтезом веществ, избирательной проницаемостью, активным противоградиентным транспортом веществ через мембрану, делением клеток, биоэлектрогенезом, возбуждением, проведением, сокращением и др. Для исследования биологического объекта достаточно сохранения им одного или нескольких признаков. Так, при исследовании эритроцитов необходимо сохранение их целостности и способности поглощать и отдавать кислород, при исследовании нервной клетки сохранение способности к возникновению потенциала действия, мышцы - способности к сокращению и т.д. Методика (греч. methodiki) - совокупность способов целесообразного проведения какой-либо работы с целью достижения конечного практического результата. Второе значение данного термина отрасль педагогической науки, но рассматривать его в этом понимании мы не будем. В основе методики чаще всего лежит обобщенный практический опыт целесообразной деятельности профессионалов, специализирующихся в определенной области человеческой деятельности. Для методики не обязательны теоретическая разработка и обоснование. В качестве примера можно привести методики подсчета эритроци-
зо
тов в камере Горяева, определение рН среды колориметрическим методом, методику работы на фотоколориметре, микрокалориметре, спектрофотометре, ионометре и других приборах. Метод (греч. methodos - путь исследования, теория, учение) планомерный путь научного познания и установления истины, способ исследования явлений природы, подход к изучаемым явлениям, трактовке, объяснению, толкованию полученных результатов. В основе метода обязательно лежит научная теория. Иногда сама теория является методом. Так, метод электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса основывается на теорий резонансного поглощения энергии переменного электромагнитного поля неспаренными электронами или ядрами атомов вещества. В основе метода полярографии лежит теория отклонения от закона Ома при прохождении электрического тока через проводники второго рода за счет электрохимических процессов на катоде и аноде; в основе хроматографических методов - учение о взаимодействии атомов и молекул подвижной фазы с молекуламии неподвижной фазы и т. д. Еще раз подчеркнем, что без теории не существует метода. Термин «методология» имеет тройное толкование. Поэтому необходимо уяснить, о какой именно методологии пойдет речь в дальнейшем. 1. Методология (греч. methodos - путь исследования, теория, учение и греч. logos - слово, предложение, понятие, суждение) - учение о структуре, логической организации, методах и средствах деятельности. Методология - учение о методе, об объекте исследования, его свойствах, характеристиках, особенностях, о способах и приемах деятельности при исследовании объекта, о путях трактовки и анализа полученных результатов, о методах обработки полученных данных и о выводах, сделанных на основании исследований. 2. Методология науки - учение о принципах построения, формах и способах научного познания. 3. Методология - совокупность методов конкретной науки, в частности и биофизики. Речь пойдет о методологии как учении о биофизическом методе и методологии как совокупности методов биофизики. Следует вспомнить, что методология подразделяется на философскую, общенаучную и методологию конкретных наук. От философской методологии биофизики берут только материальность окружающего мира и диалектику, т.е. учение о диалекти31
ческом материализме. Все биологические объекты, системы, структуры рассматриваются как материальные, находящиеся в развитии. А живые организмы имеют вполне определенный и предопределенный генетическими структурами и механизмами срок существования, после чего они самопроизвольно распадаются на молекулы, атомы, ионы: энтропия такой системы достигает максимума. От общенаучной методологии биофизика берет целый ряд положений. Так, если рассматривать организацию и структуру биологического объекта или системы на уровне атомов, молекул, мембран, надмолекулярных комплексов, то для исследования и анализа процессов, явлений не надо привлекать к существующим и познанным физическим и химическим законам еще дополнительные: процессы и явления на этих уровнях можно и должно объяснять с позиций современной физики, химии. Только на уровне организма (одноклеточного и многоклеточного) появляются интегративные специфические процессы и явления как результат совокупности многих биохимических реакций, протекающих одномоментно, что мы и называем физиологической реакцией (сокращение мышцы, проведение возбуждения по нервному волокну, синапсу и т.д.) или биологическим процессом (деление клетки, образование антител, биосинтез органических веществ и др.). На организменном, популяционном, биоценотическом уровнях организации биологические объекты рассматриваются как продукт предшествующих химической, предбиологической и биологической эволюции. Организация и функционирование их подчиняется не только законам физики и химии, которых недостаточно, но и биологическим законам. Общенаучная методология предусматривает трактовку результатов, выводов, полученных на основании конкретных результатов, не как абсолютных, а как относительных, справедливых только для данного момента в свете существующих представлений и законов. Полученная истина не абсолютна, а относительна. Иногда вызывает недоумение в общем вполне объяснимое утверждение, что при рассмотрении биологического объекта на атомном, молекулярном, надмолекулярном уровнях организации и функционирования приходится применять более сложные методики и оборудование, чем при исследовании целых организмов и популяций. Так, в биофизических исследованиях биополимеров (белков, нуклеиновых кислот), мембран, рибосом, хлоропластов широко используют такие методы, как электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рентгеноструктурный анализ, специальные методы спектрофотометрии, метод радиоак32
тивных изотопов и др. Вместе с тем для наблюдения за поведением одноклеточного и многоклеточного организмов можно использовать световой микроскоп, а иногда достаточно и визуального наблюдения. Но одновременно данные, полученные на атомном, молекулярном, надмолекулярном уровнях при помощи сложной и дорогостоящей аппаратуры, значительно проще интерпретировать с позиций физики и химии, а результаты, добытые при помощи более простых методов на уровне физиологических систем, органов, целого организма, могут быть объяснены с разных точек зрения. Последнее возможно постольку, поскольку организм дуалистичен: с одной стороны, он представляет собой продукт химической, предбиологической и биологической эволюции, детерминированный в силу генетических закономерностей по ряду показателей (весу, росту, сроку жизни, структуре и функиции органов и т.д.), а с другой стороны, поведение каждого конкретного биологического объекта является в данный момент вероятностным и зависит во многом от индивидуальности данного организма и реальных условий, в которых он находится. Так как в науке не существует универсального метода исследования, то каждое явление, каждый процесс, каждый объект требует для своего изучения различных методических подходов, с тем чтобы полученные результаты дополняли, уточняли друг друга, чтобы была возможность для устранения случайных колебаний параметров, артефактов, ошибок. Каждая самостоятельная наука должна отвечать трем обязательным требованиям: иметь собственные цели и задачи, собственный объект (объекты) исследования, собственные методы исследования. Биофизика имеет следующие собственные цели: - основываясь на законах и представлениях физики и химии, изучать фундаментальные элементарные процессы, протекающие в биополимерах и надмолекулярных комплексах, лежащие в основе жизнедеятельности клеток и организмов; - исследовать действие ряда физических и химических факторов на биообъекты. Объектами исследования в биофизике чаще всего служат биополимеры и другие биологически важные молекулы, субклеточные комплексы, ткани, органы. Однако ученые проводят исследования на организмах и биосферные исследования, начала оформляться экологическая биофизика. На ранних этапах становления биофизики для изучения фундаментальных процессов использовали не только идеи физики, физи33
ческие подходы, но и физические методы, которые приспосабливали, модернизировали для изучения биологических процессов и явлений. Так было с методами определения вязкости биологических жидкостей, поверхностного натяжения клеток, измерения электрических потенциалов в растительных и животных организмах для исследования биологических явлений и процессов. Позднее были использованы различные оптические и спектрометрические методы, начиная от фотоколориметрии и кончая методами ЭПР, ЯМР, гамма-резонансной спектрометрии и др. В биофизических исследованиях стали использовать приборы и оборудование с такими характеристиками и параметрами, которые были продиктованы требованиями биологических исследований. Так, чтобы определить разность электрических потенциалов головного мозга, потребовалось сконструировать усилители для регистрации изменений в несколько микровольт; чтобы зарегистрировать потенциал покоя клетки - усилители с внутренним входным сопротивлением 10 10 Ом; возникла необходимость в лазерных спектрофотометрах для регистрации фотофизических процессов длительностью несколько пикосекунд (10 ~ 1 2 с). Можно вспомнить, что метод электронной микроскопии биологических объектов потребовал соединения методики приготовления срезов клеток и тканей толщиной 10-15 нм и методики напыления металлов для биополимеров. Зачастую подготовка биологических объектов (проб, образцов, препаратов и др.) занимает больше времени, чем само определение, измерение характеристик, параметров объекта (при применении методов микроскопии, ЭПР, ЯМР, полярографии, амперометрического титрования и др.). Метод исследования базируется на теории, чем он принципиально отличается от методики, которая зачастую представляет собой совокупность правил практических рациональных приемов для достижения конкретного результата; методики широко применяют в исследовательской деятельности. В отличие от классических биологических наук (ботаники, зоологии, физиологии, микробиологии и др.), биофизические исследования стоят ближе к физическим, но имеют ряд особенностей. Они требуют: - построения рабочей гипотезы при проведении исследования; - выбора из нескольких методов и методик оптимальных и адекватных; - учета взаимодействия орудия исследования с объектом исследования; 34
- учета конечного срока функционирования биологического объекта (органа, клеток, митохондрий, мембран, молекул ДНК, белка в растворе и др.); - стремления проводить количественные измерения характеристик, состояния исследуемого объекта; - максимального использования графической регистрации с последующей математической обработкой результатов, применением ЭВМ; - стремления автоматизировать исследования и включить ЭВМ в управление ходом эксперимента; - широкого использования метода моделирования как реального (вещественного), так и идеального (математического). Современный биофизический метод характеризуется: теоретическим обоснованием принципа, информативностью, воспроизводимостью результатов от идентичного объекта при соблюдении тех же условий, достоверностью изучаемых результатов, достаточной точностью, быстродействием. Перед исследователем всегда возникает трудная задача: выбрать из ряда методов адекватный, в наибольшей степени соответствующий решению поставленных задач, наиболее рациональным путем ведущий к достижению цели, максимально облегчающий однозначную трактовку полученных результатов, основанную на законах физики, химии, биологии. Необходимо подчеркнуть, что получаемые при помощи любых биофизических методов данные не могут считаться абсолютно достоверными, истинными. Их следует признать справедливыми для конкретных объектов и конкретных условий существования биологического объекта и проведения эксперимента. Признание относительной истинности полученных результатов заставляет биофизиков перепроверять полученные данные, использовать различные методы для более полной оценки исследуемого объекта. Биофизик должен быть постоянно готов к восприятию новых положений и идей в свете получаемых новых результатов. Гипотеза становится рабочей только тогда, когда она может быть проверена экспериментально. Если гипотеза, как бы она ни была привлекательна, не может быть проверена в эксперименте в настоящее время или в ближайшем будущем и если ее обсуждение не приводит к выработке рабочей гипотезы, то она получает название спекулятивной. Особенности биологического объекта:
35
- высокая химическая структурная и функциональная гетерогенность; - высокая интеграция сотен биохимических реакций; - опосредованность физиологических реакций, биологических процессов, жизненных функций, влияния физических и химических воздействий через биохимические превращения; - необходимость поддержания постоянства ряда физико-химических показателей внутренней среды на определенном уровне (рН, температуры, солевого состава, ИОННОЙ СИЛЫ, газового состава и др.). Следует помнить, что одноклеточные и многоклеточные организмы и их отдельные структуры являются продуктом, результатом химической, предбиологической и биологической эволюции. Химическая эволюция продолжалась несколько десятков миллиардов лет и закончилась образованием из легких элементов тяжелых, включая и трансурановые, под влиянием реакции синтеза и высокой температуры. Предбиологическая эволюция продолжалась миллиарды лет в условиях мощного ультрафиолетового солнечного излучения, электрических разрядов, что явилось причиной абиогенного происхождения ряда аминокислот, нуклеотидов, углеводов, альдегидов, спиртов, а затем белков и нуклеиновых кислот. Предбиологическая эволюция закончилась образованием ферментов, биологических мембран, генетического кода, фотосинтетического аппарата клеток. Определяющим фактором химической и предбиологической эволюции служило изменение энергии, приводящее многократно к образованию нового, более устойчивого соединения, что было связано с уменьшением общей энергии системы. Энергия двух простых исходных молекул или частиц всегда была больше, чем энергия образованной молекулы или димера. Природа взимала энергетическую плату за усложнение молекул или образование полимеров. Появление биологических катализаторов (белков-ферментов) значительно ускорило процесс синтеза за счет снижения энергетического барьера (понижения энергии активации), появились альтернативные пути превращения исходного вещества. Скорость превращения по альтернативным путям в соответствии с принципом Хиншельвуда определяется соотношением констант, ведущих (лимитирующих) реакций для данных условий. Шло максимальное образование того продукта, который в данных условиях имел максимальную скорость химического превращения. Биологическая эволюция определялась естественным отбором 36
наиболее приспособленных к реальным условиям индивидуумов в борьбе за обладание свободной энергией в различных экологических нишах. Методология и борьба идей в биофизике Подробное рассмотрение борьбы идей в биофизике дано в книге Г.Р.Иваницкого (1985), с которой можно ознакомиться. Мы затронем лишь узловые моменты данной темы. Борьба идей в биофизике тесно связана с борьбой идей в физике и биологии. В средние века в науке господствовала идея витализма. Учение об особой жизненной силе, которая присуща только живым организмам, не позволяло стремиться к исследованию жизненных процессов с количественных физических и химических позиций, считая эти процессы сопутствующими, а не определяющими. Однако по мере накопления фактического количественного материала многие явления в биологических системах стали изучаться как результат физических процессов, которые проявляются в особых условиях функционирования организма (электрические потенциалы, электропроводность, вязкость, поверхностное натяжение клеток и др.). Успехи физики и химии, применение ряда физических методов для изучения физиологических и биологических процессов привели к уверенности, что эти процессы базируются на биохимических реакциях, их можно познать, основываясь только на законах физики и химии. Этому способствовали успехи молекулярной биологии, молекулярной генетики, биотехнологии, радиационной биофизики, фотобиологии. Вульгарный материализм рассматривал организм как обычную физическую систему, подчиняющуюся законам механики, электродинамики, химическим законам, что на определенном этапе стало тормозить развитие биофизики. Широкое распространение в биофизике получил метод редукционизма - метод упрощения биологических явлений и процессов. Его сущность сводилась к вычленению основного, ведущего механизма изучаемого явления. В условиях принципиальной невозможности получения полной информации о биологическом объекте в каждый текущий момент метод редукционизма позволял получать достоверную информацию об основных процессах в биообъектах без учета разнообразных дополнительных действующих в них факторов. Но метод редукционизма превращался в тормоз, если в сложной системе, какой является биологическая, происходило переключение
37
определяющих процессов при изменении внешних или внутренних условий. Значительным шагом вперед было введение в биофизику системного подхода и метода, которые позволяли рассматривать биологический объект как продукт химической, предбиологической и биологической эволюции, имеющий иерархию структурных и функциональных уровней: каждый последующий уровень приобретает свои собственные закономерности функционирования; закономерности и особенности более низкого уровня являются вспомогательными, подчиненными закономерностям более высокого порядка. Закономерности функционирования многоклеточного организма будут интегрировать и подчинять закономерности, характерные для органного, тканевого, клеточного, субклеточного и молекулярного уровней. Вот почему при системном подходе изучение молекулярных изменений на уровне популяций теряет смысл. Такие понятия, как «страх», «любовь», «ненависть» и др.,невозможно уяснить, оставаясь на уровне межклеточных и межорганных взаимодействий. При системном анализе не надо привлекать трудно трактуемый в биологии закон перехода количества в качество; не понятно, как экстенсивные (количественные) показатели переходят в интенсивные (качественные). При системном анализе допускается, что в определенных условиях появляются качественно новые структуры, возникает новый иерархический уровень организации, образуется новая система более высокого порядка, которая будет подчиняться новым закономерностям, характерным для более высокого уровня организации биологических структур. Таким образом, методология биофизики включает учение об объектах исследования, их существенных характеристиках, особенностях. Конкретная методология биофизики рассматривает учение о биофизических методах, начиная с принципов, лежащих в их основе, и кончая методами трактовки полученных результатов. Аналитический подход в биофизике сменился синтетическим (системным), позволяющим понять поведение системы в сложных условиях, при учете многих действующих факторов. $ 4. Единство принципов структуры и функционирования живых организмов Сущность революции, произошедшей в биологии к настоящему времени, заключается в переходе от наблюдения живого организма, его органов и клеток к проникновению в интимные механизмы ряда 38
биологических процессов на субклеточном и молекулярном уровнях, связанному здесь с рядом крупных успехов: расшифровкой биосинтеза белка, выяснением молекулярных механизмов мышечного сокращения, расшифровкой путей аэробного окисления и гликолиза и т.д. Самым удивительным результатом развития современной биологии явилось доказательство общности основных, фундаментальных процессов, протекающих на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях, для всего живого на Земле, независимо от места, занимаемого каждым организмом в эволюционном ряду. Определение понятия «жизнь» Что есть жизнь? Существует ли носитель жизни? Что такое живой организм? Можно ли назвать молекулы живыми?.. Эти и другие подобные вопросы неизбежно возникают при попытке определить понятие «жизнь». Всем известно определение жизни, данное Ф.Энгельсом в «Диалектике природы»: «Жизнь есть способ существования белковых тел, существенным моментом которого является постоянный обмен веществ с окружающей их внешней природой, причем с прекращением этого обмена веществ прекращается и жизнь...». Такое определение базировалось на данных науки прошлого столетия. Всякое определение отражает состояние науки на конкретном этапе ее развития и неминуемо должно измениться с получением новых данных, т.е. оно справедливо только для данного уровня развития науки. Среди многочисленных определений жизни, принадлежащих разным ученым, преобладали функциональные определения. Так, еще Лавуазье писал, что «жизнь - это химическая функция». А.Г.Пасынский утверждает: «Жизнь - это способная к самовоспроизведению (белковая) открытая система», - но он ничего не говорит об организации, свойствах этой системы. Вот еще одно широко известное определение жизни, данное К.Перре : «Жизнь есть способная к самовоспроизведению открытая система сопряженных органических реакций, катализируемых ступенчатым и изотермическим образом сложными специфическими органическими катализаторами, которые сами продуцируются системой». Данное определение страдает односторонностью. Оно достаточно полно характеризует жизнь с биохимической точки зрения, но не затрагивает структуры, признаков живого, его свойств. Один из ведущих отечественных генетиков, академик Н.П.Дуби-
нин,пишет: «Исходя из фактов, можно сказать, что жизнь на Земле - это интегральное существование ДНК, РНК и белков в форме индивидуализированных личных и видовых, целостных, структурнобиохимических, саморегулирующихся открытых систем со свойствами воспроизведения исторически развивающихся форм генетической информации». В определении жизни, данном Н.П.Дубининым, мы встречаемся уже с новыми понятиями, такими как ДНК, РНК, открытая система, генетическая информация. В этом определении учитываются достижения науки последних десятилетий, но снова ничего не говорится о структурной организации открытой системы, ее основных свойствах (указывается только на свойство воспроизведения). Прежде чем перейти к характеристике и анализу свойств жизни, мы хотели бы обратить внимание на следующее определение Дж.Бернала: «Жизнь есть частичная, непрерывная, прогрессирующая, многообразная и взаимодействующая со средой самореализация потенциальных возможностей электронных состояний атомов». Хотя на первый взгляд это определение учитывает характеристики состояний электронных оболочек атомов, но оно практически мало что дает, так как указанные превращения осуществляются такими сложными путями и в такой сложной среде, что проследить за реализацией потенциальных возможностей электронных состояний атомов не представляется возможным. Из чего состоит живая система? Какие вещества в ней преобладают количественно, а какие являются определяющими, от присутствия которых зависят основные свойства живого организма? Наше определение жизни относится ко всему земному существованию и не затрагивает сущности внеземной жизни. Прежде всего, живой системой может быть только такая, которая состоит из белков, нуклеиновых кислот (НК), включающих в себя дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), липиды, углеводы, их комплексы (белково-липидные, белково-нуклеиновые и др.), соли, воду. Хотя во всех без исключения организмах количественно преобладает вода, но определяющими являются белок, НК, их комплексы. (Вода может составлять 9698% массы тела, как, например, у медузы.) Упоминать в определении жизни наличие только белка было бы в настоящее время недостаточным и неточным. Без НК прекратился бы синтез белка, стала невозможной передача по наследству основных свойств. В скором времени такая система перестала бы существовать. Если мы хотим трактовать жизнь как способ существования определенных ве40
ществ, то необходимо указать на наличие белков, НК, липидов и других веществ. В настоящее жремя, несмотря на многочисленные попытки, еще никому не удалось создать жизнь простым способом, простой комбинацией различных соединений в пробирке. Вероятно, для того чтобы система была живой, необходимы ее определенная организация, определенная структура, определенная интеграция. Такой единицей, обладающей минимальными структурой и организацией, следует считать клетку. Только клетка в состоянии обеспечить необычайную интеграцию различных органических реакций. Длительное существование биополимерной системы немыслимо без постоянного притока энергии и веществ из окружающей среды и выведения из этой системы деградированных продуктов с обеспечиванием ее необходимой энергией. Постоянство параметров биополимерной системы оказывается возможным не за счет отсутствия обмена энергией и веществом, а благодаря постоянному обмену. Следовательно, такая биополимерная система будет представлять собой открытую систему, находящуюся в стационарном состоянии. В определение жизни должно входить понятие о специфическом биологическом обмене веществ. Этот существенный признак жизни нуждается в пояснении. Под специфическим биологическим обменом веществ следует понимать высокую интеграцию различных биохимических превращений под влиянием биокатализаторов (ферментов), которые сами образуются в данной системе. Смысл биохимических превращений сводится к постоянному самообновлению структуры системы (клетки) в процессе приспособления к меняющимся условиям среды. Суть специфического биологического обмена веществ сводится также к окислению поступивших или ненужных структурных компонентов для образования универсального клеточного горючего, необходимого для осуществления различного вида работ в клетке, органе, организме. Эта энергия аккумулируется в виде энергии фосфорных связей - аденозинтрифосфата (АТФ), аденозиндифосфата (АДФ), креатинфосфата (КФ) и др. Основная масса энергии расходуется в виде АТФ. Следует подчеркнуть, что все без исключения реакции, протекающие в организме, могут быть воспроизведены в пробирке. Но для их протекания требуются высокие температуры, высокие давления, добавление неорганических катализаторов. В то же время в клетке эти реакции идут в «мягких» условиях (при температуре не выше 41
40° С, атмосферном давлении), чему предшествовала длительная эволюция предбиологических систем. Говоря о специфическом биологическом обмене, не следует упускать из виду необычайно высокую сопряженность, последовательность в осуществлении сложных реакций благодаря пространственному расположению ферментов. По сложности химических реакций в клетке (их одномоментно протекает около тысячи) ни один современный химический завод не может сравниться с ней. Продукт первой реакции служит исходным для второй, а конечный продукт второй реакции - для третьей и т.д. В результате все биохимические процессы необратимы - реакции идут в одном направлении. Ферменты очень хорошо работают и в пробирке, не требуя сложных условий. Определение жизни, по нашему мнению, должно указывать еще на одно главное свойство живого - способность к воспроизведению себе подобных с передачей по наследству важнейших структур и функций. Без такого свойства жизнь на Земле не могла бы сохраняться в течение примерно 4- 10 лет. Есть основания утверждать, что далекие предки, вымершие сотни миллионов лет назад, в фундаментальных процессах на уровне клеток, субклеточных образований и молекул в принципе ничем не отличались от ныне существующих животных и растений. Природа черезвычайно консервативна в своих принципах, что немыслимо без указанного важнейшего свойства - наследования существенных признаков. Уже на уровне молекул можно обнаружить способность к удвоению. На одной молекуле ДНК могут достраиваться по дополнительному принципу молекулы мРНК, из одной клетки при делении получаются две одинаковые клетки, ничем не отличающиеся по своим свойствам от исходной, хотя в дальнейшем процессе дифференцировки их структура и функции могут сильно измениться. На основании сказанного можно дать следующее определение жизни. Жизнь есть способ существования открытой биополимерной системы, определенным образом построенной (в первую очередь из белков и НК) и организованной не менее чем в клетку, находящуюся в стационарном состоянии и обладающую рядом свойств, важнейшими из которых являются наличие биологического обмена веществ, воспроизведение себе подобных с передачей по наследству общих принципов структуры и функций. С такой позиции кажутся совершенно неправомочными разгово-
42
ры и споры о возможности существования внеклеточной жизни, «живых» комплексов молекул, отдельных живых молекул. Исходя из данного определения жизни, вирусы, бактериофаги, семена в состоянии покоя мы должны отнести к неживым образованиям, обладающим потенциальными возможностями жизни. Жизнь в ближайшее время не будет получена путем составления простой механической смеси из необходимых компонентов. Для возникновения жизни необходима высокая интеграция химических процессов, чего достигнуть пока не представляется возможным. Исходя из идеи о структурных уровнях биосистем жизнь возникает на определенном уровне, а на последующих уровнях идет только усложнение данных организмов и их систем относительно окружающей среды, относительно других живых существ. Но переход на новый структурный уровень выше клеточного не вносит принципиальных изменений в структуру и функции всех живых организмов, рассматриваемых на уровне клеток. По Ц.Кардашсву, «структурным уровнем является дискретное, относительно устойчивое, качественно своеобразное состояние материальных систем, которое охватывает объективную специфику форм и видов материи, но вместе с тем и взаимосвязь между различными формами движения материи, узловые линии развития». Вполне понятно, что наибольшие изменения в биосистеме наблюдаются при ее переходе с одного структурного уровня организации материи на другой. С такой точки зрения жизнь возникает при переходе с субклеточного структурного уровня на клеточный. З.В.Каганов пишет: «Законы строения и поведения объектов качественно специфичны для каждого уровня организации. Это объясняется тем, что свойства структуры и поведения каждого уровня определяются, во-первых, свойствами составных элементов, вовторых, способом взаимодействия элементарных единиц друг с другом и, в-третьих, особенностями взаимодействия частей и целых систем». Жизнь не существует на уровне атомов и молекул. На этом уровне, а также на уровне органелл и т.д. мы можем рассматривать только организацию жизни. При рассмотрении таких структурных уровней биосистем, как атомный, молекулярный, органоидный, клеточный, органный, организменный, популяционный и т.д., становится ясно, что переход, скачок к новому качеству - от неорганической природы к жизни совершается на уровне клетки. Исходя из других критериев, можно прийти к тому же выводу, 43
который делают М.Ф.Веденов, В.И.Кремянский, А.Т.Шаталов: «По совокупности ... признаков необходимо и достаточно выделить два основных структурных уровня в развитии живого: 1) одноклеточные организмы и 2) многоклеточные организмы». Все, что меньше клетки, не является живым, а представляет только ее составную органическую часть. Можно рассматривать строение и функции живого на различных уровнях, но всегда следует помнить, что жизнь начинается с клетки. Разнообразие живых организмов В природе поражает разнообразие видов живых организмов. Р.Флиндт в книге «Биология в цифрах» указывает, что описано 1,5 миллиона видов животных и более 400 тысяч видов растений. В пределах одного вида могут насчитываться миллиарды индивидуумов, каждый из которых генетически самостоятелен и отличается от остальных. Достаточно указать, что население Земли достигло 5 миллиардов человек. Казалось бы, что может быть общего между туберкулезной бациллой и гималайским медведем, между улиткой и леопардом, между белым грибом и ливанским кедром! Эти биологические объекты, на первый взгляд, имеют гораздо больше различий, чем сходства. Однако оказывается, при тщательном анализе можно обнаружить не только сходство, но и единство принципов структуры и функционирования всех живых организмов. Можно легко доказать, что фундаментальные элементарные процессы, протекающие в них, принципиально не различаются. Устройство и функционирование молекулярного, органоидного, клеточного звеньев принципиально одинаково у всех живых систем. Различия появляются на более высоких ступеньках иерархической лестницы. Принципы структуры живых организмов следующие: 1. Единство элементарного состава. 2. Единство типов химических связей. 3. Единство мембранного типа строения субклеточных образований. 4. Единство клеточного строения. 5. Единство строения многоклеточных организмов. Рассмотрим более подробно каждый из принципов. Принцип единства элементарного состава живых о р г а н и з м о в . Из 109 элементов Периодической системы химических элементов Д.И.Менделеева в организмах живо-
44
тных и растений обнаружено более 30. Основные из них (преобладающие) приведены в табл. 1.1. В среднем на долю четырех элементов - кислорода, углерода, водорода и азота - приходится 97 - 98%, а еще восемь жизненно необходимых элементов - сера, фосфор, хлор, калий, магний, кальций, натрий, железо в сумме не превышают 1,9 - 2%. Количество остальных элементов, входящих в состав микропримесей, составляет не более 0,01%. Таблица Содержание химических элементов в клетке (цитоплазме) Элементы Кислород Углерод Водород Азот Фосфор Калий Сера Хлор
Количество 65-75 15-18 8-10 1,5-3,0 0.2-1.0 0,15-0,40 0,15-0,20 0,05-0,10
Элементы Кальций Магний Натрий Железо Цинк Медь Йод Фтор
1.1.
(Ю.И.Полянский) Количество 0.04-2,00 0,02-0,03 0,02-0,03 0,01-0,015 0,0003 0,0002 0,0001 0,0001
Преобладающим (но не определяющим!) элементом является кислород. Жизнь на Земле построена на базе углерода, но он не является самым распространенным элементом в земной коре: например, он более чем в 320 раз уступает кремнию, который стоит с ним в одном ряду Периодической системы элементов Д.И.Менделеева. Соединения углерода составляют основу всех типов биологически важных соединений. Но почему углерод? На этот вопрос в настоящее время можно дать следующий ответ. Атомы кремния и углерода способны присоединять 1-4 электрона и приобретать стабильные электронные конфигурации. Они взаимодействуют друг с другом, образуя длинные цепи. Однако углерод имеет большие преимущества перед кремнием: образует прочные С-С связи, дает кратные связи; соединения углерода стойки в присутствии воды, кислорода и аммиака. Соединения кремния такими свойствами не обладают. Тот факт, что ткани живого организма построены из числа первых 30 элементов Периодической системы Д.И.Менделеева, вполне объясним: атомы наименьшего размера после присоединения 1-4 электронов другого атома дают устойчивые соединения. Кислород и сера обеспечивают стабильность соединений путем образования кислородных мостиков и дисульфидных связей. Атомы водорода обусловливают подвижность, лабильность, быст45
рую изменчивость соединений в зависимости от их взаимодействия с окружающими атомами. Водородная связь играет значительную роль в осуществлении ряда взаимодействий. Водородной связью объясняют особые свойства воды. Азот необходим для образования пептидных связей з белке. Пептидная связь обеспечивает образование из аминокислот полипептидов и белка. Атомы натрия, калия, кальция, магния во всех живых организмах играют роль регуляторов оводнения. Особую роль в организмах выполняют соединения фосфора. Почти во всех живых организмах они образуют макроэргическую связь, за счет которой обеспечивается энергетическая трата организмов: совершается работа биосинтеза, механическая, электрическая, осмотическая. Таким образом, анализ элементарного состава самых различных живых организмов приводит к одному выводу: элементарный состав у живых систем одинаков. Принцип единства типов химических связей. Нетрудно предположить, что примерно из одинакового набора атомов в качественном и количественном отношении могут образовываться примерно одинаковые соединения, примерно однотипные химические связи. Анализ живых организмов легко подтверждает такое предположение, и это наглядно иллюстрируют данные табл. 1.2. Таблица 1.2 Содержание в клетке химических соединений (А.Гизе) Вещество Вода Соли и др, неорганические вещества Белок
Содержание, % к сырой массе 70-85
Средняя молекулярная масса. Да
18
Относительное' число молекул 18000
Жировые вещества
1-5
Углеводы
0,2-2,0
700 250
100 1 10 20
Нуклеиновые кислоты
0,5-1,5
3000000
0.001
1.0-1,5 10-20
55 36000
Из анализа таблицы видно, что и в процентном отношении к сырой массе, и по абсолютному содержанию химических соединений молекулы воды далеко превосходят молекулы других веществ. Но жизнедеятельность каждого организма определяется нуклеиновыми кислотами и белками, причем необходимо четко различать преоб46
ладающий (вода) и определяющий (НК и белки) типы химических веществ. Следует подчеркнуть, что, несмотря на огромное разнообразие конкретных типов химических соединений (так, каждый человек, как и любой другой организм, наряду с общими белками имеет свои собственные, индивидуальные белки), поражает однотипность и одинаковость мономеров, из которых образуются биополимеры, свойственные каждому организму. Поражает также общий единый план построения указанных шести типов веществ у самых различных живых существ, стоящих на большом расстоянии друг от друга в эволюционном ряду. Нуклеиновые кислоты. С ними связаны важнейшие функции и свойства живых организмов: консерватизм биологических объектов, проявляющийся в сохранении их структур и функций не только в течение жизни одного индивидуума, но и при смене поколений в течение сотен миллионов лет. Генетическая информация зашифрована в виде молекул ДНК. С НК связаны процессы биосинтеза белка, реализации генетической информации в зависимости от конкретных условий жизни. Приходится только удивляться, что каждый организм имеет свою индивидуальную НК (ДНК и РНК). Существуют сотни миллиардов НК. Но все они построены из одних и тех же восьми мономеров нуклеотидов, состоящих из азотистого основания (пуринового или пиримидинового), углевода (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. Особенность каждой ДНК и РНК зависит только от чередования и количества нуклеотидов. В одну молекулу НК входят сотни тысяч нуклеотидов в различной последовательности. Сохранение типичных свойств живого, размножение клеток обусловлены замечательным свойством ДНК живых организмов удваиваться, самовоспроизводиться. Необходимо помнить, что консерватизм живых систем зависит в основном от молекул ДНК, которые сохраняются в течение всей жизни клетки. Только при делении клетки идет удвоение ДНК. На молекуле ДНК строится молекула мРНК, а на молекуле мРНК белки. Какова молекула ДНК, таковы и белки. Итак, индивидуальность каждого организма зависит от индивидуальности ДНК и РНК, а последние у всех живых организмов построены из различных нуклеотидов по общему единому плану. Вновь, следовательно, мы встречаемся с единством в многообразии.
47
Белки. Крупнейшим достижением последних лет явилось глубокое познание структуры и механизма синтеза белка. Если назначение НК можно сравнить с механизмом, осуществляющим реализацию стратегических целей, то белки являются тактическим механизмом, определяющим конкретные проявления жизни в данный момент. Недаром Ф.Энгельс определял жизнь как форму существования белковых тел и с белками связывал все разнообразие живого. Каждый организм имеет свои индивидуальные белки. Но если рассматривать первичную структуру белка, то окажется, что все белки состоят из мономеров - аминокислот, число типов которых равняется 20-21. Соединяясь друг с другом, аминокислоты дают длинные цепи белка, их индивидуальность зависит от порядка чередования и количества аминокислот. Аминокислоты самых различных организмов имеют одинаковую структуру и соединяются друг с другом при помощи однотипной полипептидной связи. Таким образом, можно говорить о единстве аминокислотного состава всех белков различных живых организмов, о единстве общего плана строения белка и о сходных его свойствах при одинаковой структуре. Липиды. В клетках организмов содержатся липиды. Этот класс веществ объединяет жиры, жирные кислоты, стерины и другие соединения. Основную массу липидов живых организмов составляют жиры, которые построены у всех существ из глицерина и жирных кислот. Можно уверенно говорить о едином плане строения и единстве функций липидов у всех живых существ. Углеводы. Они входят в состав всех без исключения живых систем. Их содержание может колебаться от 1,5 до 60 %. Углеводы при всем своем разнообразии состоят лишь из небольшого числа мономеров (гексоз и пентоз). Мономеры при взаимодействии друг с другом могут приводить к образованию больших молекул полимеров (образование гликогена и крахмала из глюкозы). Неорганические вещества. К неорганическим веществам относятся вода, различные соли, кислоты, основания. На долю неорганических веществ (за вычетом воды в животных и растительных организмах) приходится 1-1,5 % от общей массы живого. Человек массой 70 кг имеет 23,8 кг внутриклеточной воды (340 мл/кг массы). Он состоит из 10 клеток. Нетрудно определить, что в состав клетки будет входить 7,9 • 10 4 молекул воды. Все жизненные процессы протекают в водной среде с широким 48
участием молекул воды в различных биохимических реакциях. Вода очень быстро вступает во взаимодействие с окружающей средой в тех организмах и органах, где высок обмен веществ. Обмен всей воды у различных живых организмов идет с такой скоростью: у амебы - 1 неделя; у человека - 1 месяц: у черепахи - 1 год; у кактуса - 29 лет. Вновь поступившие молекулы воды ни в структурном, ни в энергетическом отношении ничем не отличаются от выведенных. Очевидно, вода является средой и пассивно увлекается и выводится с продуктами деградации. Вода - уникальное химическое соединение с аномальными свойствами. Но интересно другое. Вода во всех организмах едина по химическому составу и выполняет одинаковые функции. У всех живых организмов водный раствор является внешней и внутренней средой, обмен веществ идет между клеткой и водной средой. Все биохимические реакции проходят в клетке в водной среде и часто при непосредственном участии молекул воды. Жизнь без воды невозможна. На основании сказанного закономерен вывод о единстве мономеров и едином плане строения различных классов химических соединений у самых различных организмов. Принцип единства мембранного типа строен и я с у б к л е т о ч н ы х о б р а з о в а н и й . Одним из величайших достижений биологии последних десятилетий явилось детальное выяснение структуры и ряда функций субклеточных образований. Самым удивительным фактом оказалась однотипность строения субклеточных образований у самых различных видов растений и животных. Существует общий план строения и функционирования однотипных субклеточных структур. Все органеллы клеток построены по единому, мембранному типу. Поражает универсальность применения мембран в построении органелл. Мембраны отделяют клетку от межклеточной жидкости; ядро, лизосому, фагосому - от цитоплазмы. Аппарат Гольджи и эндоплазматическая сеть у всех живых организмов представляют собой каналы, отграниченные от цитоплазмы мембранами. В митохондриях необычно развиты мембраны, на которых пространственно разделены отдельные ферменты, что обеспечивает- последовательное протекание ряда реакций окисления при выработке АТФ. Удивляет на первых порах однотипность строения самих мембран. Все мембраны имеют толщину 75-100 ангстрем и состоят из 49
трех слоев: однорядный слой белка, двурядный слой липидов и еще один слой белка. Такой тип строения сохраняется в самых различных мембранах, за исключением митохондрий, где мембрана удваивается и получается структура из пяти слоев. Единый план строения субклеточных структур служит еще одним доказательством реализации единых принципов организации всех живых организмов. Принцип единого плана клеточного строен и я ж и в ы х о р г а н и з м о в . Все живое или представляет собой клетку (одноклеточный организм), или состоит из клеток (многоклеточный организм). Исключений из этого общего правила не обнаружено. Многоклеточный организм чаще имеет более сложную структуру, у него появляются новые функции. На многих многоклеточных организмах можно проследить диалектический переход на новый, более сложный уровень организации (органно-тканевой, организменный) с появлением новых законов, управляющих этими более сложными системами. Иногда высказывается мнение, что одноклеточный организм устроен проще, чем клетка многоклеточного организма. Однако это не так: ведь одноклеточный организм выполняет весь объем функций, а клетка многоклеточного организма утрачивает часть функций, так как они распределены между другими клетками, и у клетки гипертрофируется одна определенная функция, на выполнении которой клетка специализируется. Ранее указывалось, что жизнь менее чем в клетке невозможна. Клетка является и структурной, и функциональной единицей жизни. Многоклеточные организмы построены по блочному принципу из различного количества клеток, между которыми устанавливается высокая корреляция биохимических, биофизических, физиологических и других процессов. Клеточный принцип строения всех живых систем - доказательство их общности. Принцип единства строения многоклеточн ы х о р г а н и з м о в . Одноклеточные организмы, размножающиеся простым делением, или многоклеточные организмы, размножающиеся половым путем, вначале представляют собой одну исходную клетку. Идет деление и генетического материала, и цитоплазмы. Дочерние клетки идентичны исходным, материнским. Новые клетки имеют необычайно сходную структуру и функции. Новые качества в результате дифференцировки появляются на новом эта50
пе, когда количество образованных клеток достигнет какого-то критического уровня. Начинает действовать диалектический принцип Гегеля: сумма больше слагаемых. Количество приобретает новое качество. Часть клеток утрачивает ряд функций и приспосабливается для преимущественного выполнения какой-либо одной функции: проведения возбуждения, сокращения, образования ферментов и т.д. Каждый многоклеточный организм представляет собой результат деления одной исходной клетки. Как подсчитал Э.Шредингер, человеческий организм является результатом 50-60-кратного деления исходной клетки. Половые клетки сильно различаются по величине (сравните яйцеклетки мыши и страуса), но они необычайно схожи по внутренней структуре и функции. После роста и дифференцировки возникают специализированные клетки, с преимущественным выполнением какой-либо одной функции. Но принципы функционирования специализированных клеток не могут быть иными, чем неспециализированных. Следовательно, одноклеточные и многоклеточные организмы, имея принципиально единый план строения субклеточных единиц, имеют и единые принципы функционирования. Единые принципы функционирования живых организмов Единство биохимических реакций и циклов. При внимательном анализе функционирования различных растительных и животных организмов удается лодметить множество общих реакций, протекающих в сходных образованиях при одних и тех же условиях. Оказывается, процессы аэробного и анаэробного окисления веществ, процессы фосфорилирования, гидролиза, фотосинтеза и др. принципиально одинаковы у всех живых существ. Да и жизнь всех земных объектов возможна только благодаря улавливанию ими энергии ядерных реакций Солнца. Растения способны усваивать энергию солнечных лучей непосредственно и трансформировать ее в энергию клеточного горючего - АТФ, которая используется для нужд клеток, а животные способны усваивать уже аккумулированную энергию Солнца в виде различных химических связей. Сложнейшие биохимические реакции, такие как биосинтез белка, биосинтез липидов, углеводов, гормонов и других веществ, оказываются исключительно сходными почти у всех живых существ. Вот почему данные, полученные в опытах на бактериях, помогают
51
выяснить принципиальные стороны биосинтеза белка у млекопитающих, в том числе и у человека. Е д и н с т в о д ы х а н и я . Все без исключения живые организмы дышат. Дышит не только организм в целом, но и отдельные его клетки. Дыхание у сложных организмов можно разделить на внешнее и внутреннее (тканевое или клеточное). Функции внешнего дыхания сводятся к доставке кислорода к клеткам и тканям. Внешнее дыхание необычайно разнообразно: поглощение кислорода из окружающей среды через всю поверхность - у одноклеточных организмов, через поверхность листа - у растении, систему мелких трахейных трубочек - у ряда насекомых, легкие - у млекопитающих, жабры - у рыб, кожу и легкие - у земноводных и т.д. Клеточное, или внутреннее, дыхание у всех живых образований сводится к выработке универсального клеточного горючего (АТФ) за счет окисления различных веществ. Этот процесс наблюдается и при аэробном, и при анаэробном дыхании. При аэробном дыхании поглощаются молекулы кислорода и выделяются молекулы углекислого газа, но это чисто внешняя сторона дыхания, а сущность его заключается в выработке АТФ. При анаэробном дыхании идет окисление молекул углеводов до молочной кислоты с образованием молекул АТФ. Но процесс этот менее эффективен по сравнению с аэробным дыханием. Итак, сущность клеточного дыхания у всех живых существ едина и заключается в выработке молекул АТФ. Е д и н с т в о п и щ е в а р е н и я . Если рассматривать поступление веществ в организм и подготовку их в организме к биосинтезу или окислению после разложения до мономеров, то отмечается большое разнообразие «внешнего» пищеварения. Но если рассматривать «внутреннее», внутриклеточное пищеварение, то бросается в глаза его единообразие, единый принцип, который мы можем определить одним словом - ферментативный. Идет расщепление веществ до мономеров, которые поступают в цитоплазму, где расходуются для нужд клеток. Во всех живых организмах основную роль играют химические процессы, ферментативные превращения, для воспроизведения которых потребовались те же реакции в пробирке при температуре в сотни градусов и при давлении в десятки и сотни атмосфер. Сущность пищеварения у всех живых объектов сводится к ферментативному превращению попавших в организм веществ до мономеров, способных включаться через биосинтез в структуры клеток или служить источником энергии после окисления в митохондриях. 52
Е д и н с т в о д в и ж е н и я . Жизнь немыслима без движения. Движение - это не только «метаболический вихрь», по выражению Д.Хевеши, но и непрестанное перемещение отдельных органелл, протоплазмы клеток, потоков веществ, частей организма и всего организма. Казалось бы, что общего между стремительным движением форели и движением улитки, ползанием змеи и перемещением протоплазмы в клетках! Однако если рассматривать фундаментальные процессы, лежащие в основе акта движения, на молекулярном уровне, то невольно поражаешься единству в многообразии. Разнообразные движения базируются на одном и том же принципе взаимодействия двух белковых нитей - актина и миозина. Последний выполняет роль фермента для АТФ. Взаимодействие актина и миозина обеспечивает все многообразие движений. Даже в том случае, когда речь идет о перемещении цитоплазмы, считается, что в этом процессе принимают участие актомиозиноподобные белки. Следовательно, несмотря на огромное разнообразие различных видов движения у живых организмов, молекулярные механизмы, лежащие в основе движения, у всех живых существ одинаковы. Единство наследования основных принцип о в с т р у к т у р ы и ф у н к ц и й . У всех без исключения живых организмов наследование основных структур и функций осуществляется путем передачи генетического материала в виде генов, образующих хромосомы. В случаях бесполового и полового размножения идет разделение генетического материала. Каждый вид растений или животных имеет постоянное количество хромосом, в которых зашифрована вся генетическая информация. У бактерий, дрожжей, простейших, растений, животных сущность полового и бесполового размножения сводится к сохранению вида, несмотря на непрерывную гибель отдельных организмов. Постоянство числа хромосом сохраняется путем их удвоения при бесполовом размножении, что предшествует делению клетки. Половинный набор хромосом в половых клетках до оплодотворения обеспечивает сохранность полного набора хромосом после оплодотворения. Почти весь генетический материал содержится в хромосомах, которые располагаются в ядре. Материал хромосом в течение жизни клеток не расходуется и не обменивается, что обеспечивает устойчивость и постоянство вида и индивидуального организма. Единство элементарного состава, однотипность основных химических соединений живых организмов, единый план строения суб53
клеточных образований и клеток, единство плана клеточного строения сложных организмов определяют и единые принципы функционирования всех живых организмов на начальных структурных уровнях биологических систем - от атомного до клеточного включительно. Можно убедительно говорить об однотипных качественных скачках у всех живых организмов при переходе от одного структурного уровня к другому, вплоть до клеточного уровня. Основные различия сложных организмов зависят от органного, организменного и популяционного уровней организации биологических систем. Но эти качественные различия не могут изменить принципы функционирования всех живых организмов, которые имеют по существу одинаковые фундаментальные элементарные процессы, лежащие в основе различных функций. Живые организмы, имея единый план атомного, молекулярного, субклеточного и клеточного строения, будучи построены из одинаковых элементов, функционируют на основе одинаковых принципов, что позволяет говорить о единстве структуры и функционирования всего живого. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какое определение можно дать биофизике на современном этапе развития науки? 2. Почему биофизику относят к биологическим и физическим наукам? 3. Какие разделы включает современная биофизика? 4. Какие задачи стоят перед биофизикой на современном этапе? 5. Какие исторические периоды в развитии биофизики можно выделить? 6. Как можно охарактеризовать развитие биофизики как науки на современном этапе развития? 7. Какое определение можно дать понятиям «методика, метод, методология»? 8. Какие выделяют уровни организации биологических объектов и систем? 9. Какие принципы положены в основу единства структурной организации живых организмов? 10. Единство каких функций организмов проявляется на уровне клетки? 11. Какие имеются проявления случайного и детерминированного в структуре и функционировании живых систем? 12. Как следует понимать химическую и предбиологическую эволюцию биологических систем? СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ А к к е р м а н Ю. Биофизика/ Пер. с англ. М., 1964. 684 с. Б а й е р В. Биофизика. Введение в физический анализ свойств и функций живых систем/ Пер. с нем. М., 1962. 430 с. Б е л е н о в с к и й А.С. Основы биофизики в ветеринарии. М., 1989.- 271 с. Б и о ф и з и к а / Под ред. Б.Н.Тарусова и О.Р.Кольс. М., 1968. 4U7 с. Б и о ф и з и к а / Под ред. П.Г.Костюка. Киев, 1988. 504 с.
54
Б и о ф и з и к а : Учебник/ВладимировЮ.А., Рощупкн Д.И., ПотапенкоЛ.Я.,ДеевА. М , 1983.272 с В о л ь к е н ш т е й н М.В. Общая биофизика. М , 1978. 590с Вол ькен ш т е й н М.В. Биофизика. М , 1981. 575 с. Е ф и м о в В.В. Биофизика для вречей. М., 1952. 342 с И в а н и ц к и й Г.Р. Мир глазами биофизика. М , 1985. 128 с. Р у б и н А.Б. Биофизика: Учебник. М., 1987. Кк.1. 319с. Р ы б и н И.А. Лекции по биофизике: Учеб. пособие. Свердловск, 1990. 235 с.
ГЛАВА 2 ТЕРМОДИНАМИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Термодинамика биологических процессов - это раздел биофизики, изучающий общие закономерности превращения энергии. Термодинамика рассматривает также проблемы устойчивости и эволюции биологических систем. Методы термодинамики приложимы к макроскопическим системам, состоящим из большого числа молекул. Этот раздел входит в биофизику сложных систем. Законы классической термодинамики используются в биологии, во-первых, для расчета параметров энергетических превращений в организме и, во-вторых, для определения КПД биологических процессов. Термодинамический аспект необходимо учитывать при изучении физико-химических процессов. Термодинамика биологических процессов послужила основой для разработки представлений об источниках энергии процессов жизнедеятельности, оказалась плодотворной для понимания и количественного анализа таких биологических процессов, как генерация биопотенциалов, осмотические явления, мышечные сокращения. Прежде чем рассматривать основы термодинамики биологических процессов, необходимо вспомнить термины, нужные для изучения данного раздела. Термодинамическая система - часть пространства с материальным содержимым, ограниченная поверхностью раздела (стенка сосуда, где идет реакция, или мембрана клетки). Примеры: клетка, митохондрия. Область вне оболочки - окружающая среда. Размеры системы всегда больше, чем размеры составляющих ее частиц. Термодинамика рассматривает три типа систем, они отличаются по характеру взаимодействия с внешней средой. Изолированные системы не обмениваются с окружающей средой ни веществом, ни энергией, т.е. границы такой системы непроницаемы, - сосуд Дьюара, колба с двойными посеребренными стенками, из пространства между которыми выкачан воздух. Теплопроводность сосуда Дьюара минимальна, и стенки его непроницаемы для химических веществ. Таким образом, он с известной степенью приближения моделирует изолированную систему. Системы, обменивающиеся через свои границы энергией с окружающей средой, но непроницаемые для веществ, относятся к закрытым системам. Реальные системы в природе никогда не бывают абсолютно изолированными и закрытыми. В
56
открытых термодинамических системах осуществляется обмен как веществом, так и энергией. Живые организмы как открытые термодинамические системы отличаются от таковых в неживой природе тремя признаками: 1) состоят из биополимеров (белков и нуклеиновых кислот); 2) способны к самовоспроизведению; 3) способны к развитию и саморегуляции. Термодинамические системы характеризуются определенными свойствами или термодинамическими параметрами (температура, давление, объем, энергия), совокупность которых представляет собой термодинамическое состояние системы. Термодинамические параметры системы разделяются на экстенсивные и интенсивные. Параметры, которые не зависят от массы (температура, давление), называются интенсивными. Они используются в качестве независимых термодинамических переменных при моделировании и могут иметь определенное значение в каждой точке системы. Параметры, зависящие от общего количества вещества в системе и изменяющиеся пропорционально массе отдельных компонентов системы, называются экстенсивными (объем, число молей в системе). Совокупность изменяющихся состояний в системе называется термодинамическим процессом. Процессы, протекающие в системе, могут быть обратимыми (равновесными) и необратимыми (неравновесными). Обратимыми называются такие термодинамические процессы, при которых возвращение системы в первоначальное состояние не требует затрат энергии извне и связанных с этим изменений в окружающей среде. При обратимых процессах не происходит рассеивания энергии в виде теплоты. Необратимыми называются термодинамические процессы, при которых возвращение системы в исходное состояние возможно лишь при условии затрат внешней энергии, что влечет за собой определенные изменения в окружающей среде. Необратимые процессы характеризуются переходом части энергии в теплоту. Ни один из осуществляющихся в природе естественных процессов или процессов, связанных с деятельностью человека, не является в строго термодинамическом смысле обратимым. Можно лишь приблизить его к условиям протекания обратимого процесса (обратимая химическая реакция). При этом сводятся к минимуму потери энергии и процесс осуществляется вблизи состояния равновесия.
57
Термодинамика биологических процессов изучает именно необратимые (неравновесные) процессы. Энергия - количественная мера определенного вида движения материи при ее превращениях. Основной единицей для измерения количества энергии и работы в системе СИ является джоуль (Дж). На практике часто пользуются внесистемной единицей - калорией (кал). 1 кал-4,184 Дж, 1ккал-4,184 кДж. Под внутренней энергией системы понимают ее общий запас, обусловленный всеми видами движений и взаимодействий составляющих ее молекул, атомов, ионов, элементарных частиц. Это энергия поступательного, колебательного и вращательного движения атомов, ионов, электронов, протонов, нейтронов, а также энергия силового взаимодействия этих частиц (электромагнитного, гравитационного) . Нельзя вычислить абсолютное значение этой энергии для данной системы, так как она включает большое число трудно поддающихся учету слагаемых, некоторые из них при современном состоянии науки еще неизвестны. Поэтому в термодинамике вычисляют разность между запасом внутренней энергии системы для начального и конечного состояния. Работа - любая макрофизическая форма передачи энергии. Термодинамическое равновесие - это состояние системы, при котором ее параметры не изменяются и она не обменивается с окружающей средой ни веществом, ни энергией. Стационарное состояние системы характеризуется тем, что ее параметры также не изменяются во времени, но происходит обмен веществ и энергии с окружающей средой. § 1. Первый закон термодинамики Это закон сохранения энергии, сформулированный в 1842 1847 гг. Ю.Р.Майером, Г.А.Гельмгольцем: в изолированной термодинамической системе полный запас энергии есть величина постоянная и возможны только превращение одного вида энергии в другой в эквивалентных соотношениях.. U-const; Ди-С. (2.1) Формулировка первого начала термодинамики для закрытых систем следующая: теплота, подведенная к системе, расходуете* на изменение внутренней энергии системы и на совершение работы против внешних сил. <5Q-dU + 4A, 58
(2.2)
где Q - теплота, подведенная к системе; U - внутренняя энергия системы; А - работа; <$ обозначает, что теплота и работа не являются функциями состояния системы и не могут быть полными дифференциалами; U - функция системы U - f <m, P, V, Т), зависящая от термодинамических параметров ( т , Р, V, Т). В настоящее время не вызывает сомнения применение закона сохранения энергии к биологическим объектам. Однако так было не всегда. Первые экспериментальные попытки измерения энергетического баланса организма были предприняты в конце XVIII в. АЛавуазье и ПЛапласом. Для доказательства приложимости первого начала термодинамики к биологическим объектам был применен ледяной калориметр. По скорости таяния льда находили теплоту, выделенную морской свинкой в изолированной камере или ледяном калориметре. После этого определяли количество теплоты, выделяющейся при прямом сжигании до СОг и НгО продуктов питания морской свинки в калориметрической бомбе. А.Лавуазье и П.Лаплас получили величины близких порядков. Так была показана полная эквивалентность химической энергии, которая освобождается в ходе биохимической реакции, и теплоты, выделяемой организмом во внешнюю среду. Следующим этапом изучения применения первого начала термодинамики явились опыты М.Рубнера (1894) и У.Этуотера (1904). Эти исследователи сконструировали калориметр, позволявший изучать энергетический обмен крупных животных и человека. Прибор имел систему подачи кислорода, ловушки для выделяемого СОг, весы, причем измерительная часть калориметра позволяла устранять утечку теплоты и оценивать не только количество тепловой энергии, но и дыхательный коэффициент: д
V c O 2
/т
ъ
< 5 = ( 2 . 3 ) Эти данные сравнивали с теплосодержанием продуктов питания, потребленных животным за время эксперимента. На основании полученных результатов вычисляли баланс обмена белков, жиров и углеводов. Измерение теплопродукции в калориметре и использование данных в непрямой калориметрии позволили с высокой точностью оценить энергетический баланс человека за сутки (табл. 2.1.). Расхождение между приходом и расходом тепла было не более 1 % - за счет погрешностей эксперимента. Достаточную точность при вычислении энергетического баланса 59
Таблица 2.1 Энергетический баланс человека (за одни сутки) Питательные вещества, кг Энергия, потребля- Теплота, измеренная калориметемая с питательныром, Q, кДж ми веществами, О.кДж 5743 Белки - 0,0568 Выделенная теплота 965.8 Углеводы - 0,0799 949 1358,3 Испарение через кожу Жиры-0,140 5460,0 Испарение через дыхание -757 Выделенные газы Моча и кал Поправки И т о г о 7784,1
180 96 46 7771
можно получить только для основного обмена, когда организм не выполняет работу и не происходит накопления биомассы. Таким образом, метод прямой и непрямой калориметрии позволил установить, что количество энергии, поглощенной организмом за сутки вместе с питательными веществами, равно выделенной за это же время теплоте. Энергетический баланс организма находится в полном соответствии с законом сохранения энергии, и никаких специфических источников жизни не существует. Энтальпия. Закон Гесса Жизнедеятельность организмов, как и работа тепловой машины, сопровождается выделением в окружающую среду тепловой энергии за счет дыхания, пищеварения, работы мышц. У гомойотермных животных в покое 50% всей теплоты образуется в органах брюшной полости, 20% - в скелетных мышцах, 10% - при работе органов дыхания и кровообращения. При напряженной мышечной работе теплопродукция может возрастать в 10 раз по сравнению с состоянием покоя. При понижении температуры окружающей среды теплопродукция организма усиливается. Теплота, выделенная организмом, может быть условно разделена на первичную (основную) и вторичную (активную). Первичная теплота - это результат неизбежного рассеивания энергии в ходе реакций диссимиляции из-за необратимо протекающих биохимических реакций. Первичная теплота выделяется сразу же после поглощения организмом кислорода и продуктов питания независимо от того, совершает он работу или нет. Она идет на нагревание организма и рассеивается в окружающем пространстве. Выделение вторичной теплоты наблюдается лишь при реализации энергии макроэрги-
60
ческих соединений (АТФ, ГТФ) в ходе обменных реакций или процессов жизнедеятельности (мышечное сокращение). Для живых организмов в нормальных условиях характерно равновесие между первичной и вторичной теплотой, причем уменьшение первичной теплоты сопровождается возрастанием вторичной. Это наблюдается при переохлаждении теплокровных. При патологических процессах увеличивается доля выделяемой первичной теплоты, что сопровождается повышением температуры тела. Удельной теплопродукцией называют количество теплоты, выделяемое единицей массы животного в единицу времени: g-QT//
q-a + b/fo/.
(2.6)
На основании экспериментальных данных по этим формулам были вычислены коэффициенты а и b для гомойотермных и пойкилотермных животных. Удельная теплопродукция уменьшается с увеличением массы животного (рис. 2.1). Такую зависимость можно объяснить тем, что с увеличением размера и массы животного уменьшается отношение его поверхности к объему. Для компенсации большой потери теплоты мелкими животными требуется более высокая интенсивность метаболизма и, соответственно, потребление большего количества пищи. Этим можно объяснить необычайную прожорливость грызунов и мелких птиц. Теплопродукция теплокровных животных в 25-30 раз меньше, чем пойкилотермных, за счет уменьшения теплообмена между окружающей средой и организмом. Живые организмы - открытые термодинамические системы, су61
Рис. 2.1. Зависимость * удельной теплопродукции от , массы животного: 1 - землеройка; 2 - мышь-малютка; 3 , мышь; 4 - крыса; 5 - кошка; 6 - кролик; 7 - собака; 8 - овца; • 9 - человек; 10 - свинья; 11 корова; 12-слон •
шествующие в условиях постоянства давления и температуры. Поэтому для оценки их жизнедеятельности важен еще один термодинамический параметр (функция) - энтальпия. Энтальпия - (от греч. - нагреваю) - это сумма внутренней энергии системы и произведения объема и давления: H - U +P V , (2.7) где Н - теплосодержание системы. Энтальпия - термодинамическая функция, которая, подобно температуре, давлению, объему и внутренней энергии, характеризует систему. Абсолютное значение энтальпии для рассматриваемой системы определить невозможно и в термодинамических расчетах фигурирует лишь изменение энтальпии АН, происходящее при переходе системы из одного состояния в другое. Для эндотермических процессов изменение энтальпии имеет положительный знак, для экзотермических - отрицательный. АН (кДж/моль) имеет абсолютное значение от (±) сотен до нескольких тысяч. Введенная функция лежит в основе закона Гесса основного следствия первого закона термодинамики. Он формулируется следующим образом: тепловой эффект химической реакции, развивающейся через ряд промежуточных стадий, не зависит от пути перехода, а определяется лишь разностью энтальпий конечных и исходных продуктов реакции. Математическое выражение закона Гесса: Q - АН - I/ Hi.k - X/ Hj.u, (2.8) где Z; Hi.k - сумма энтальпий всех продуктов реакции; 1j Hj,u - сумма энтальпий всех исходных веществ; АН - изменение энтальпии химической реакции. Следует отметить, что изменение энтальпии соответствует вели62
чине поглощенной или выделенной теплоты, которую довольно точно можно определить с помощью калориметра. Применяя данный закон, можно рассчитать тепловые эффекты любых биохимических реакций. Известно, что биохимические превращения в организме проходят множество промежуточных стадий, которые не всегда выявлены и доказаны. На основании закона Гесса, не зная промежуточных звеньев биохимического процесса, имея данные лишь о начальных и конечных продуктах реакции, можно вычислить суммарный энергетический эффект. Пример. Рассмотрим окисление глюкозы при постоянном давлении: С6Н12О6 + 6О2 -+6CO2 + 6H2O + Q;
<2-(6"сог +нн2о)-(\н12о6
+ш
ог)-2Ш«*ж»оль~
•
Такое же количество теплоты выделяется при окислении глюкозы в организме животных, когда в процессе анаэробного и аэробного гликолиза образуется ряд промежуточных веществ.
Таким образом, потребление 1 л кислорода или выделение 1 л углекислого газа организмом сопровождается выделением 2870: : 134,4 - 21,35 кДж теплоты. Поэтому тепловыделение любого животного можно подсчитать путем умножения количества потребленного кислорода или выделенного углекислого газа на 21,35 кДж. Это метод непрямой калориметрии для определения теплопродукции. Закон Гесса используется для вычисления калорийности пищевых продуктов и составления пищевых рационов человека и животных. § 2. Второе начало термодинамики и живые организмы Первое начало термодинамики позволяет утверждать, что при любых процессах, в том числе и тех, которые протекают в живых организмах, энергия не возникает и не исчезает. Все виды энергии взаимно превращаются в строго эквивалентных количествах. Однако первое начало термодинамики не дает ответа на вопрос о том, почему процесс, связанный с трансформацией энергии, протекает именно в данном направлении; насколько полно осуществляется превращение энергии; каковы реальные пределы протекания того или иного биохимического процесса. Второе начало термодинамики позволяет судить о направлении протекания процесса и, таким образом, дополняет первое начало термодинамики. Формулировку второго начала термодинамики впервые дали независимо друг от друга Р.Клаузиус и У.Томпсон (1850-1851). Второе начало не имеет столь простой и общепринятой формулировки, как первое, и формулируется по-разному, в зависи63
мости от той группы явлений, к которой оно прилагается. С.Карно: "Коэффициент полезного действия всех обратимых тепловых машин одинаков и не зависит от рода работающего тела, а только от интервала предельных температур, в котором работает машина". Р.Клаузиус: "Теплота не может переходить сама собой от более холодного тела к более теплому". Важной физической величиной, используя которую можно сформулировать второе начало термодинамики в более общем виде, является еще один термодинамический параметр систем - энтропия. Энтропия - это мера неупорядоченности или вероятности состояния системы. Энтропия измеряется в тех же единицах, что и теплоемкость, - Дж/моль- К, где К - температура по Кельвину. Энтропия является таким же свойством термодинамической системы, как температура, давление и др. В любом теле (лист бумаги) содержится определенная энтропия; так же, как и внутренняя энергия, энтропия системы растет с ее массой и равна сумме энтропии подсистем, она увеличивается при повышении температуры за счет усиления теплового движения молекул. Аналогичное увеличение энтропии наблюдается при переходе вещества из твердого состояния в жидкое. Для вычисления изменения энтропии AS биохимической реакции поступают так же, как при вычислении АН, т.е. из суммы изменения энтропии продуктов реакции вычитают сумму изменения энтропии исходных веществ. Изменение энтропии dS системы равно отношению количества теплоты (<5Q), сообщенного системе, к термодинамической температуре (Т): dS -<5Q/T. (2.9) Если ввести понятие энтропии, то второе начало термодинамики можно сформулировать так: энтропия изолированной системы возрастает в необратимом процессе и остается неизменной в обратимых термодинамических процессах. Уравнение второго закона термодинамики: dS><5Q/T.
(2.10)
Сущность второго начала термодинамики для изолированных систем состоит в том, что все необратимые процессы протекают в таком направлении, в котором энтропия системы увеличивается, т.е. dS>0, dF * dU. (F - свободная энергия системы). Это означает, что далеко не вся внутренняя энергия системы переходит в работу, часть ее рассеивается в виде теплоты.
64
При обратимых процессах dS - 0 и dF - dU, т.е. рассеивания энергии в пространстве не происходит. Энтропия - это часть общей энергии клетки, которая не может быть использована в данной системе. С увеличением энтропии энергия, вовлеченная в обмен, уменьшается и процесс становится менее обратимым. Согласно второму началу термодинамики энтропия изолированной системы стремится к максимуму, при котором достигается равновесие и реакция прекращается. Если атомы в молекуле упорядочены, то энтропия системы низка. Второй закон термодинамики показывает, что не все виды энергии эквивалентны. По качеству их можно разделить на 3 класса (А, В, С) соответственно величине энтропии. Такие виды энергии, как гравитационная, световая и электрическая, наиболее эффективно, т.е. с наименьшей энтропией, могут быть превращены в другие ее виды, и они относятся к классу А. В класс В (среднего качества) попадает химическая энергия. Тепловая энергия относится к классу С (низкое качество) - это энергия с максимальной энтропией. Мы рассмотрели второй закон термодинамики в применении к изолированным системам. Живые организмы - системы открытые, и изменение энтропии для них складывается из продукции энтропии внутри организма за счет необратимых биохимических процессов (diS) и обмена (deS) энтропии с окружающей средой. dS-diS + deS. (2.11) Индексы ставятся после знака дифференциала, так как в отдельном случае полным дифференциалом является общее изменение энтропии, а не каждое из слагаемых в отдельности. Формулировка второго закона термодинамики для живых организмов: скорость изменения энтропии в организме равна алгебраической сумме производства энтропии внутри организма и скорости поступления энтропии из среды в организм. Уравнение второго начала термодинамики для открытых систем следующее: dS/dt - diS/dt + deS/dt, (2.12) где dS/dt - скорость изменения энтропии в организме; diS/dt - скорость производства энтропии внутри организма; deS/dt - скорость обмена энтропией между организмом и окружающей средой. В отличие от первого закона термодинамики, имеющего абсолютное значение, второй закон носит статистический характер. Увеличение энтропии в необратимых процессах отражает лишь наиболее вероятное их протекание. Этот закон соблюдается особенно точно 65
для макроскопических систем с большим количеством компонентов. Впервые статистический характер второго закона термодинамики показал австрийский физик Л.Больцман. Он установил следующую связь между энтропией и термодинамической вероятностью системы: S - к • lnW, (2.13) 23 где к - постоянная Больцмана, равна 1,38 • 10" Дж/К; W - термодинамическая вероятность, равняется числу всех перегруппировок компонентов в системе и выражается огромными числами. Клетка содержит 109 молекул, W колеблется от 1 до 10 1 5 более. Таким образом, стремление энтропии к росту связано с переходом системы в менее упорядоченное состояние с большими значениями термодинамической вероятности W. Проанализируем уравнение второго начала термодинамики для открытых систем. deS/dt > 0 показывает увеличение энтропии системы в результате того, что в организм постоянно поступает поток вещества и энергии. deS/dt < 0 означает, что отток энтропии из организма превышает приток. Величина diS/dt > 0 (всегда положительна), так как в организме постоянно протекают биофизические и биохимические процессы. При условии, что diS/dt > 0, возможны следующие три случая: 1) dS/dtX), если deS/dt > 0 или если deS/dt<0, но diS/dt > deS/dt, т.е. скорость производства энтропии внутри организма будет превышать скорость обмена энтропией с окружающей средой; 2) dS/dt < 0, если deS/dt < 0, скорость обмена энтропией организма с окружающей средой превышает скорость производства энтропии внутри организма deS/dt > diS/dt; 3) dS/dt - 0, если deS/dt < 0, скорость обмена энтропией с окружающей средой равна скорости производства энтропии за счет внутренних биофизических и биохимических процессов. Последний случай соответствует установлению в системе стационарного состояния. Такой анализ уравнения второго начала термодинамики в применении к живым организмам показывает, что биологические процессы могут сопровождаться самопроизвольным уменьшением энтропии, и позволяет объяснить кажущиеся противоречия между живыми организмами и вторым началом термодинамики. Действительно, рост и развитие организмов сопровождается усложнением их организации и с точки зрения классической термодинамики вы66
глядит как самопроизвольное уменьшение энтропии и увеличение (накопление) свободной энергии. Дело в том, что свободная энергия не может возрастать лишь в изолированной системе. Живые организмы, как системы открытые, в процессе автотрофного и гетеротрофного питания получают свободную энергию из окружающей среды. Поэтому второй закон термодинамики применительно к живым организмам надо рассматривать, учитывая их взаимодействие с окружающей средой. С этой точки зрения уменьшение энтропии и увеличение свободной энергии фотосинтезирующих организмов происходит благодаря уменьшению свободной энергии и увеличению энтропии в системе Солнце-Земля (ядерные реакции на Солнце) и общий баланс энтропии автотрофов соответствует второму началу термодинамики. Точно так же уменьшение энергии в частях клетки, где идет биохимический синтез, происходит за счет избыточного увеличения энтропии в реакциях диссимиляции, и общий баланс энтропии увеличивается. Поэтому живые организмы подчиняются второму началу термодинамики, когда речь идет о круговороте и превращениях свободной энергии в системе организм - окружающая среда. Надо сказать, что процессы обмена веществ в организме не только подчиняются первому и второму началам термодинамики, но и в значительной мере зависят от скорости биохимических превращений, определяемых деятельностью генов. § 3. Баланс энтропии при росте и развитии организмов Общая теория роста и развития организмов на основе представлений термодинамики была выдвинута И. Пригожиным в 1947 году. По данной теории в процессе роста и развития организмов происходит уменьшение скорости продуцирования энтропии, отнесенной к единице массы объекта. dS-diS + deS
f
20
40 Сутки
60
12
16 20
Сутки
Рис. 2.2. Кривые теплопродукции зародышей кур на разных стадиях развития: а - после оплодотворения; 6 - после начала инкубации
денцию в те же периоды эмбрионального развития. Сходную картину можно получить и для целых организмов, и на изолированных органах и тканях. В процессе регенерации конечностей у амфибий, заживления ран у млекопитающих происходит также уменьшение скорости теплопродукции или уменьшение dS/dt. Таким образом, согласно теории Пригожина-Виам в процессе развития и роста организмов скорость продуцирования энтропии непрерывно снижается и достигает минимальных значений в конечном стационарном состоянии. Благодаря более интенсивным процессам обмена веществ отток энтропии превышает ее продукцию: diS deS (2.15) dt df Уменьшение термогенеза в период развития может быть вызвано изменением степени сопряжения энергодающих и энергопотребляющих процессов, а также структурными перестройками макромолекул. Можно сделать вывод о том, что в течение жизненного цикла существуют определенные периоды, когда происходит уменьшение скорости продуцирования энтропии в результате отклонения системы от стационарного состояния. Это отклонение может быть вызвано изменением условий существования или изменением внутренних параметров (температура; влажность, гормональные факторы). Старение, напротив, сопровождается возрастанием энтропии, которое уже не компенсируется ее оттоком в окружающую среду. (2.16) 68
Идет накопление энтропии в системе. Как писал один стареющий физик, "меня съедает энтропия и целиком и по частям". Скорость накопления энтропии различна у разных видов. Энтропия достигает максимального значения при термодинамическом равновесии. Жизнь - это постоянная борьба против тенденции к возрастанию энтропии. Синтез биомакромолекул, образование клеток со сложной структурой, организация живых существ - мощные антиэнтропийные факторы. § 4. Стационарное состояние. Теорема Пригожина. Термодинамическое равновесие. Устойчивое и неустойчивое стационарное состояние. Принцип Ле-Шателье Состояние системы, при котором ее параметры не изменяются в течение длительного времени, но происходит обмен веществом и энергией с окружающей средой, называют стационарным. В стационарном состоянии открытой системы концентрация промежуточных продуктов не изменяется со временем, что достигается определенным соотношением различных физико-химических процессов, •ответственных за распад и образование промежуточных соединений. Стационарное состояние в живых организмах достигается путем взаимной компенсации всех процессов, связанных с поступлением, удалением и превращением веществ и энергии. Живой организм в каждый момент времени не отвечает приведенному определению стационарного состояния. Однако, если рассмотреть средние значения его параметров за сравнительно большой промежуток времени, можно отметить их постоянство и утверждать, что стационарное состояние характерно для организма. Так, с большим постоянством поддерживается температура определенных органов и тканей у теплокровных животных, сохраняется неизменный солевой состав и водородный показатель (рН) различных биологических жидкостей, не изменяются в ходе нормальной жизнедеятельности величины биопотенциалов покоя, осмотического давления. В открытых системах суммарное изменение энтропии в стационарном состоянии равно нулю: dS-deS + diS-O. (2.17) Это уравнение стационарного состояния. Члены diS и deS, определяющие внутренние необратимые процессы и процессы обмена системы с окружающей средой, отличны от нуля. Стационарное состояние биологической системы поддерживается 69
при условии diS - deS, т. е. когда увеличение энтропии системы за счет происходящих в ней необратимых процессов компенсируется оттоком энтропии при взаимодействии с окружающей средой. Особенности стационарного состояния и термодинамического равновесия показаны в табл. 2.2. Таблица 2.2 Различие между системами, находящимися в термодинамическом равновесии и стационарном состоянии Стационарное состояние Термодинамическое равновесие Отсутствие обмена с окружающей сре- Непрерывный обмен с окружающей средой веществом и энергией дой веществом и энергией Энтропия системы постоянна и соответ- Энтропия системы постоянна, но не равна максимально возможному в данных ствует максимально возможному в данусловиях значению.. ных условиях значению Полное отсутствие в системе каких-либо Наличие постоянных по величине градиентов градиентов Не требуется затраты свободной энергии Необходимы постоянные затраты энергии Система нереакционноспособна и не со- В системе совершаются необратимые реакции, ее работоспособность постоянна вершает работу против внешних сил и не равна нулю
Сходство термодинамического равновесия и стационарного состояния системы заключается в том, что стационарное состояние, так же как и термодинамическое равновесие, сохраняет все основные параметры неизменными. Энтропия системы, находящейся в стационарном состоянии, имеет некоторую постоянную величину, не равную максимальной. Поэтому наиболее характерными свойствами стационарного состояния являются стремление системы к минимуму ежесекундного прироста энтропии и определенная внутренняя стабильность и упорядоченность. Для наглядности рассмотрим свойства стационарного состояния системы на термодинамической модели, предложенной А. Бертоном в 1939 г. (рис. 2.3). Сосуд S, в котором уровень жидкости постоянен (за счет большого объема сосуда S по сравнению с объемом сосудов А и В или в результате работы насосного механизма), играет роль внешней среды, а сосуд Z - роль стока, он также относится к внешней среде. Сосуды А и В, связанные с внешней средой кранами К о и Kz, представляют собой рассматриваемую нами открытую систему. Краны Ко и Kz регулируют скорость поступления и оттока воды и имитируют процесс диффузии. Стационарное состояние возникает при определенных уровнях жидкости в сосудах А и В и определенных положениях 70
Рис. 2.3. Гидродинамическая модель стационарного состояния
кранов Ко, К, Kz. Эти уровни соответствуют стационарным концентрациям реагирующих веществ в случае биохимической реакции. Кран К регулирует скорость перетекания воды из сосуда А в сосуд В, играя роль, аналогичную константе скорости реакции. Уровень жидкости в сосуде В служит показателем стационарного состояния системы. Если же изменить положение крана К, то уровень в сосуде В изменится, т.е. система перейдет в новое стационарное состояние. В организме поддерживается гомеостаз в течение времени, протекающего от рождения до смерти. Уровни стационарных состояний в течение онтогенеза постоянно изменяются. У детей уровень Са** в костях с их ростом увеличивается, изменяется количество зубов, волос и т.д. Это примеры перехода на новые стационарные уровни, примеры необратимых изменений. Живой организм может изменить уровень стационарного состояния в результате воздействия окружающей среды и при патологических процессах. Необходимо четко представлять, что при активной мышечной работе возможны временные отклонения от стационарного состояния и переходы на новые стационарные уровни. Типичные кривые перехода от одного стационарного уровня к другому характеризуются экспоненциальностью (рис. 2.4). Значит, саморегулирующие71
Рис. 2.4. Кривые переходов между стационарными состояниями: а - экспоненциальное приближение; Ь - переход с избыточным отклонением; с - переход с "ложным стартом" Время
ся системы организма способны поддерживать стационарное состояние только в некоторых пределах внешних воздействий. Одной из важнейших характеристик биологических систем является устойчивость стационарных состояний. Устойчивое стационарное состояние характеризуется тем, что при отклонении системы от стационарного уровня в ней возникают силы, стремящиеся вернуть ее в первоначальное положение. Внешние воздействия вызывают в неустойчивой стационарной системе нарастающие изменения, в результате которых система переходит или в устойчивое стационарное состояние (при дополнительной затрате энергии), или в состояние термодинамического равновесия. Свойства стационарных состояний можно изучать на математических моделях. Рассмотрим модель на основе многокомпонентной биохимической реакции, в которой претерпевают превращение различные вещества. Скорость изменения концентрации каждого вещества зависит от концентраций других веществ и может быть представлена системой дифференциальных уравнений: dc\ (2.18) dcn где n - общее число компонентов; ci, сг - концентрации веществ в системе. Если в системе устанавливается стационарное состояние, то концентрации ее компонентов не изменяются во времени: dt
72
dt
dt
(2.19)
Таким образом, стационарное состояние описывается следующей системой уравнений: fl(Cl,C2...Cn)-0, f2(ci,C2...cn)-0, (2.20) fn(Cl,C2...Cn)-0. Решение этой системы уравнений позволяет найти концентрации веществ (ci, сг..., Сп), соответствующие стационарному уровню. Допустим, что в рассматриваемой системе происходит изменение концентрации какого-либо компонента С, причем значение скорости изменения концентрации (v) и химического сродства (А) равны: v-v; A-X. (2.21) Под химическим сродством мы будем понимать разность химических потенциалов начальных и конечных реагентов, движущую силу химической реакции. При небольшом возмущении в системе отклонение от стационарности v и А будут равны: v * - v + dv; Л - X + dA; (2.22) dv и dA - величины отклонений от первоначального уровня. Произведение dv- dA - это избыточная продукция энтропии (2.23) обозначается как/3 [dS ]. Если стационарное состояние устойчиво, то Р [ d S ] - d v dA>0. (2.24) Положительное значение этой величины означает, что рассматриваемая нами система самопроизвольно возвращается в первоначальное стационарное состояние. Таким образом, в случае устойчивого стационарного состояния возникшие флуктуации в системе со временем исчезают. Если Д [dS ]» dv dA < 0, то стационарное состояние неустойчиво и первоначальные отклонения в системе будут нарастать во времени, причем изменения будут "уводить" систему от стационарного состояния все дальше. Для устойчивого стационарного состояния характерна отрицательная обратная связь, для неустойчивого - наличие механизмов самоусиления, работающего по типу положительной обратной связи. Если построить график зависимости Т- dS/dt от h (где Т - температура, dS/dt - скорость производства энтропии, h - какой-либо показатель стационарного уровня системы), то для устойчивого стационарного состояния график будет представлен в виде параболы, ветви которой направлены вверх. При неустойчивом стационарном 73
состоянии ветви параболы направлены вниз. Точка А является наиболее устойчивой. Если же поместить шарик во внутрь параболы, то его положение наиболее устойчиво. Таким образом, устойчивое стационарное состояние характеризуется тем, что система не может самопроизвольно выйти из него за счет внутренних изменений (шарик из точки А не может скатиться в точку В самопроизвольно, для этого нужно совершить работу). Точка Ai - наиболее неустойчивое состояние системы, так как под влиянием любого внешнего толчка шарик, помещенный в эту точку, быстро удаляется от нее. Любое отклонение от уровня стационарности вызовет в системе
Рис. 2.5. Диаграммы устойчивого (а) и неустойчивого (Ь) стационарных состояний в открытой системе
увеличение скорости продуцирования энтропии. Для точки А (рис. 2.5) скорость производства энтропии будет меньше, чем для точки В. Потеря устойчивости приводит к тому, что избыток продукции энтропии становится отрицательным. /3[dS]<0. (2.25) Появление неустойчивости в биологических системах можно рассматривать как новое их состояние, которое стабилизируется во времени и пространстве. Такое состояние системы - это образование новой диссипативной структуры с определенным типом изменения концентрации реагентов, которое поддерживается за счет непрерывного обмена с окружающей средой веществом и энергией. При этом в биологической системе чаще всего наблюдается неоднородное распределение реагентов в пространстве с локальным изменением концентраций в ходе кинетических нелинейных процессов. В настоящее время в литературе обсуждается другой тип не74
устойчивости стационарных диссипативных структур, которые зависят не только от пространственных координат, но и от времени. Такая система характеризуется волнообразными локальными колебаниями в виде концентрационных волн, распространяющихся во времени и пространстве, причем исходной причиной этих эффектов служит появление неустойчивости, соответствующее уравнению Р [dS ] < 0. Это является основой для множественности стационарных состояний в живых организмах, возможности многочисленных переходов между стационарными уровнями. Система, которая функционирует в одном из двух устойчивых стационарных состояний, характеризуется триггерными свойствами, обеспечивающими направленные и скачкообразные переключения из одного стационарного состояния в другое. Например, при раздражении нервного волокна состояние возбуждения, возникающее по принципу "все или ничего", наступает скачкообразно после достижения порога возбуждения. Триггерные свойства биологических систем определяют и процесс клеточной дифференциации, когда при делении возникают дочерние клетки, качественно отличные от клеток-предшественников. Можно привести еще один пример системы, обладающей несколькими стационарными состояниями и обеспечивающей возможность регулирования клеточного метаболизма за счет триггерных свойств. Это процесс биосинтеза белка. Последовательность процессов биосинтеза белка представлена на рис. 2.6. S
Ген регулятор
v-У
О
с.г.
•R^
I
E
I
Рис. 2.6. Схема биосинтеза белка
Важными в процессе биосинтеза являются следующие этапы: 1) синтез мРНК; 2) синтез фермента Е; 3) образование продукта х. Процесс транскрипции определяется структурным геном (с.г.), который контролируется репрессором, синтезируемым при. помощи гена-регулятора. Репрессор может действовать на участок структурного гена, блокируя синтез мРНК. Если синтез мРНК осуществляется, то синтезируется фермент Е, который, взаимодействуя с субстратом, приводит к образованию белка х, причем репрессор у 75
может существовать в активной (а) и неактивной (б) формах. На соотношение между активной и неактивной формами влияет метаболит х. Таким образом, под влиянием х репрессор у переходит в неактивное состояние (б) и синтез мРНК становится невозможным. Молекула репрессора имеет несколько участков связывания. Наиболее медленной стадией синтеза мРНК является образование комплекса репрессор - метаболит, (yxi), где i - число молекул метаболита (х), находящихся в комплексе с одной молекулой репрессора. На рис. 2.7 изображен график зависимости образования мРНК, складывающейся из скорости притока и оттока, отнесенных к единице концентрации х. 1/х- d P / d t = l / x f ( x , a W n p - I 0 T ; 1 в р -i/**np< x ) ; (2.26) 1от=1/хЬт<х). (2.27) Как видно, кривая зависимости 1От от (х) представляет собой прямую, параллельную оси абсцисс и пересекающую кубическую кривую 1Пр(х) в точках с координатами xi, X2, хз. Все точки, расположенные на ветвях I (участок Ьа) и III (участок da), относятся к устойчивым точкам, а на ветви II (участок ас) располагаются неустойчивые стационарные точки. Точки xi и хг, в которых кривая 1пр(х) достигает экстремумов, являются границами ветвей I, II и III. В этих точках имеет место потеря устойчивости и переход в новое стационарное состояние, причем флуктуации локальной продукции энтропии изменяют знак ф [dS ] < 0), происходит смена режима работы системы, и поэтому они называются бифуркационными точками. J
a
b
Гкг
i: \x«
!\ 7 :
Рис. 2.7. Кинетика образования мРНК в реакциях биосинтеза белка d
с Xt
Х2
X
Таким образом, каждому положению прямой 1от(х) соответствуют три точки пересечения с кубической кривой 1пр(х) и система биосинтеза белка является триггерной. Система последовательно проходит через ряд стационарных состояний. В бифуркационной точке с происходит скачкообразный переход на ветвь III в точку d. В зави76
симости от концентрации субстрата S система биосинтеза белка может переключаться из одного состояния в другое. Все эти переходы осуществляются в результате изменения управляющего параметра а - концентрации субстрата S. Скорость его изменения должна быть намного меньше, чем скорость метаболических реакций. Можно предположить, что рассмотренные выше механизмы возникновения неустойчивых диссипативных структур играли важную роль при формировании макромолекулярных агрегатов на заре появления жизни на нашей планете. Эти же процессы могут иметь прямое отношение к пространственной организации биоструктур в процессах эмбриогенеза и клеточной дифференциации. Теорема Пригожина И.Пригожий (1946) на основе изучения открытых систем сформулировал основное свойство стационарного состояния: в стационарном состоянии при фиксированных внешних параметрах скорость продукции энтропии в открытой системе, обусловленная протеканием необратимых процессов, постоянна во времени и минимальна по величине: ^7 -niin <2.28) at Таким образом, согласно теореме Пригожина стационарное состояние характеризуется минимальным рассеянием энергии. Условия стационарного процесса оказываются эквивалентными условиям минимума прироста энтропии. Это утверждение справедливо только для тех открытых систем, в которых выполняются линейные соотношения между величинами скоростей и движущих сил процессов. Кроме того, открытые системы должны находиться в частично-равновесном состоянии, при котором процессы их обмена с окружающей средой протекают равновесным образом. Живые организмы поставлены природой в весьма выгодные с точки зрения энергообеспечения условия: поддержание гомеостаза требует минимального потребления энергии. По теореме Пригожина для поддержания стационарного состояния тратится некоторое количество энергии, причем в каждом случае самое минимальное. Организм стремится работать на самом выгодном энергетическом режиме. При этом энтропия возрастает с минимальной скоростью. Принцип минимума прироста энтропии представляет собой количественный критерий для определения общего направления самопроизвольных изменений в открытой системе, т.е. количественный критерий эволюции открытых систем. На 77
основе изменения величин прироста энтропии можно предсказать переход системы в конечное стационарное состояние, если эти процессы протекают вблизи равновесия. Однако теорема Пригожина не позволяет характеризовать стационарное состояние с точки зрения устойчивости к внешним воздействиям и самопроизвольным флуктуациям в самой открытой системе. Теорема Пригожина приложима к живым организмам лишь в качестве первого приближения, ибо она предполагает постоянство кинетических параметров, которое в организме в полной мере не выдерживается, особенно в начальный период его развития. Стационарное состояние живого организма характеризуется высокой динамичностью: в организме протекают такие процессы, которые нарушают стационарное состояние тех или иных систем (повышение концентрации сахара в крови при диабете, повышение температуры тела при воспалительных процессах). Если эти изменения не превышают определенных пределов, то стационарное состояние может восстановиться, т.е. небольшие отклонения от стационарного состояния не ведут к необратимым изменениям. Биологические системы обладают способностью к саморегуляции (установление наиболее экономичных, наиболее надежных уровней в работе живых организмов). Это положение впервые было сформулировано в работе Ле-Шателье. Всякая система, находящаяся в состоянии химического равновесия и отклонившаяся от этого состояния под воздействием внешнего возмущения, стремится самопроизвольно вернуться в равновесное состояние за счет изменения параметров в направлении, противоположном тому, которое вызвало возмущение. Принцип аутостабилизации биологических систем имеет прямое отношение к теореме Пригожина, так как стремление энтропии в стационарном состоянии к минимальной величине приводит к тому, что при отклонениях от стационарного уровня в системе наступают такие изменения, которые стремятся вернуть ее к минимуму производства энтропии. Принцип Ле-Шателье является следствием закона сохранения энергии, лежит в основе регулирования по типу обратных связей и поддержания гомеостаза в организме. Он может применяться для любых физических и химических процессов. Например, согласно правилу Ленца, возникает индукционный ток такого направления, при котором его магнитное поле препятствует изменению магнитного потока, вызывающего этот индукционный ток. Принцип аутостабилизадии в применении к биологическим сис78
темам состоит в том, что увеличение потока положительной энтропии при отклонении системы от стационарного уровня (заболевание) приводит к появлению таких внутренних изменений, которые ограничивают этот поток, т.е. в организме происходят процессы, способствующие ликвидации причин, вызывающих заболевание, и система настраивается на более термодинамически выгодный ритм функционирования. § 5. Работоспособность биологических, систем биофизические процессы, происходящие в живых организмах, с точки зрения термодинамики, являются необратимыми. При совершении работы в организме осуществляется превращение химической энергии, заключенной в макроэргичсских связях АТФ, в другие виды энергии: механическую (при мышечном сокращении), электрическую (при нервном возбуждении); часть энергии рассеивается в окружающей среде в виде теплоты. В одних случаях энергия гидролиза АТФ непосредственно используется для совершения работы (мышечное сокращение), в других - она расходуется для создания различных градиентов. Градиент (Г) - это отношение разности какой-либо величины Дф (концентрации, давления, температуры) в двух точках к расстоянию между ними (х): r
*i~T '
(2-29)
Градиент - векторная величина, имеет направления от большего значения к меньшему. Биологические системы характеризуются наличием разнообразных градиентов. Одним из них является концентрационный градиент: содержание ионов калия в цитоплазме выше (в 15 раз), чем в межклеточной жидкости, и концентрационный градиент калия направлен из клетки в окружающую среду; концентрационный градиент натрия имеет обратное направление. Осмотический градиент, обусловленный наличием разности осмотического давления в клетке и омывающей жидкости, играет особенно значительную роль в жизнедеятельности растительных клеток (тургор). С неравномерным распределением ионов между клеткой и средой связано возникновение электрического градиента. Величина свободной энергии F биологической системы определяется наличием и величиной градиента:
n-^,
(2.30)
где R - универсальная газовая постоянная; Т - температура по Кельвину; Ф\ и Фг - значения параметра, определяющего градиенты. Работа в биологических системах связана с реализацией энергии каких-либо градиентов. Так, проведение нервного возбуждения осуществляется за счет концентрационного и электрического градиентов. Возникновение потенциала действия определяется концентрационным градиентом натрия и калия. Такие процессы, как электрофорез, электроосмос, протекают в живых организмах за счет энергии электрических градиентов. При совершении работы происходит уменьшение градиента, за счет энергии которого осуществляется работа, при этом возникает градиент противоположного направления. При обратимых процессах возникающий градиент имеет такую же величину, как и вызывающий его; при необратимых процессах вновь появляющийся градиент имеет всегда меньшую величину. Поэтому биологические процессы (диффузия ионов, передача теплоты) протекают в направлении уменьшения градиентов. Таким образом, работоспособность биологических систем, обусловленная наличием свободной энергии, определяется градиентами, которые являются результатом неравновесного распределения вещества в биологической системе и непрерывного переноса из одной части системы в другую. При отмирании клеток их градиенты уменьшаются, выравнивание градиентов означает смерть организма. Для описания необратимых процессов следует ввести понятие термодинамических потоков. Для биологических систем наиболее важны диффузионные, тепловые и электрические потоки. Интенсивность теплового потока пропорциональна градиенту температуры. Согласно закону Фика интенсивность диффузионного потока Ig пропорциональна градиенту концентрации вещества h=-D^
(2.31)
где D - коэффициент диффузии; dc/dx - концентрационный градиент. По закону Ома Ь л - - у &.,
80
(2.32)
где у - удельная электропроводность, dp /dx - градиент потенциала. Процесс жизнедеятельности определяют и другие потоки: осмотический, электродиффузионный, которые также характеризуются градиентами соответствующих величин. Следовательно, в живых организмах градиенты определяют потоки веществ. Так, поток тепла вызывается и поддерживается градиентом температуры, диффузионный поток - градиентом концентрации, поток электронов - градиентом электрического потенциала, объемный поток обусловлен градиентом гидростатического давления. Градиенты, вызывающие в системе потоки веществ, теплоты, зарядов, называются термодинамическими силами и обозначаются символами х или у. Соответствующие потоки обозначаются буквой I (табл. 2.3). Таблица 2.3 Сопряженные потоки и силы в неравновесной термодинамике Процесс Диффузия
|
Поток Незаряженных частиц
|
Обобщенная сила Градиент концентрации (dc/dx)
Электродиффузия
Ионов
Градиент электрохимиче-
Электрический ток
Электронов
Градиент электрического
Течение жидкости
Объемный
Градиент
ского потенциала ( ф / d x ) потенциала (dy>/dx) гидростатиче-
ского давления (dP/dx)
В сложных многокомпонентных биологических системах многие потоки связаны друг с другом. Например, диффузионный поток определяется не только концентрационным градиентом, но и разностью температур, а также разностью потенциалов, если имеет место поток электродиффузии. Л.Онзагер предположил, что любой необратимый процесс можно в общем виде описать линейной зависимостью: I-Lx, (2.33) где I - термодинамический поток, х - обобщенная сила, L - феноменологический коэффициент. Это уравнение носит название феноменологического, так как по своему виду похоже на уравнение Фика и другие уравнения, описывающие рассмотренные выше процессы. 81
В наиболее общей феноменологической форме любой процесс можно характеризовать произведением обобщенной силы X на термодинамический поток. В зависимости от характера процесса обобщенная сила может иметь разную природу: в химических реакциях - химическое сродство А, в механических процессах - сила F, в электрических явлениях - разность потенциалов й<р , в процессах диффузии - концентрационный градиент (dc/dx), в процессах теплопроводности - градиент температуры (dT/dx). В сложной биологической системе протекает одновременно множество взаимосвязанных процессов, которые взаимодействуют друг с другом. Допустим, в системе имеется поток тепла Ii и поток массы 12, обусловленные термодинамическими силами Xi (градиент температуры) и Хг (концентрационный градиент). Если бы поток Ii не был сопряжен с потоком 12, он бы зависел только от обобщенной силы Хь Так как в системе происходит взаимодействие между потоками Ii и 12, поток Ii зависит также от силы Хг, и эта связь определяется линейным коэффициентом взаимности Li 2. Таким образом, для двух сопряженных потоков сил имеем систему уравнений I i - L i i X1+L12X2, 12 - L21 Xi + L22 Х 2 , (2.34) где Li2,2i - феноменологические коэффициенты, отражающие взаимодействие процессов, коэффициенты взаимности; Ln,22 - феноменологические коэффициенты, отражающие взаимодействие соответствующих потоков и термодинамических сил. Когда необратимые процессы не взаимодействуют, Li2, 21 равны нулю. Данную систему уравнений называют соотношением взаимности Онзагера. Если поток Ii, соответствующий необратимому процессу, испытывает влияние термодинамической силы Хг, то и поток \г испытывает влияние термодинамической силы Хь Таким образом, Онзагер показал, что существует зависимость потоков как от сопряженных, так и от несопряженных термодинамических сил. Коэффициенты взаимности Онзагера могут иметь любой знак, но между ними должно существовать следующее соотношение: L12-L21. (2.35) Смысл этого уравнения заключается в том, что каждый из потоков влияет на величину других потоков. Например, химическая реакция окисления в клетках снижает концентрацию Ог и создает диффузионный поток Ог вовнутрь клетки. Одновременно эта же реакция определяет диффузионный поток COl из клетки, поток тепла. 82
Коэффициенты взаимности Онзагера находят опытным путем. Применение соотношений взаимности Онзагера к явлениям обмена между клеткой и средой позволило раскрыть биологические механизмы активного транспорта и электрокинетических явлений в сложных гетерогенных коллоидных системах протоплазмы. Используя соотношение взаимности Онзагера, можно установить количественную связь между сопряженными необратимыми процессами в клетке путем определения значений коэффициентов взаимности. Рассмотрим применение соотношения взаимности Онзагера к одновременным процессам переноса воды и растворенных в ней веществ. Представим, что через мембрану идет поток воды Ii и растворенного в ней вещества 1г. Движущей силой потока Ii является разность величин гидростатического давления в цитоплазме и межклеточной среде Xi - АР; поток растворенного вещества определяется разностью осмотических давлений по обе стороны мембраны Х2 - Ая. Эти два потока сопряжены, и в соответствии с соотношением взаимности Онзагера можно описать процессы переноса системой следующих уравнений: 11 - Ln Xi + L12 • Х2 - Li i д Р + Li2 Ал , (2.36) 12 - L21 Xi + L22 X2 - L21 АР + L22 Ал. Каждый из потоков определяется как силой А Р, так и силой Ая. Если искусственно поддерживать в системе разность осмотических давлений, равной нулю: Ал - 0 (при этом А Р * 0), через мембрану будет осуществляться поток воды Ii = Ln A P (коэффициент Ln коэффициент фильтрации мембраны). В случае, если мембрана обладает избирательной проницаемостью, то, несмотря на отсутствие осмотического давления (Ал - 0), будет наблюдаться и перенос растворенного вещества, определяемый коэффициентом ультрафильтрации. Пусть гидростатическое давление по обе стороны мембраны АР =» 0, но в цитоплазме и межклеточной жидкости имеются растворы различных концентраций, т.е. АР* 0. В этом случае через мембрану будет осуществляться поток воды под действием разности осмотических давлений (Ii - L 12" Ая ). Транспорт вещества через мемш брану определяется уравнением 1г L22 • Ал. Из соотношения взаимности следует, что L21 ~ 1л 2, т.е. коэффициент ультрафильтрации равен коэффициенту осмотического потока. Это значит, что поток воды Ii не может рассматриваться как функция разности величин гидростатического давления и определяется также потоком растворенного вещества. Применение соот83
ношений взаимности Онзагера позволило выяснить взаимосвязь этих явлений в процессе функционирования мембран и ввести коэффициент избирательности мембраны CT-L21/L11, (2.37) который показывает степень проницаемости мембраны для различных соединений. Соотношения Онзагера играют важную роль в анализе взаимодействий различных необратимых процессов и особенно полезны в тех случаях, когда молекулярные механизмы сопряжения неизвестны. На основании этих представлений можно выводить формулы для степеней сопряжения различных биологических процессов с учетом превращения энергии при их взаимодействии при условии предварительного экспериментального определения коэффициентов взаимности. Сопряжение необратимых процессов Сопряжение потоков биохимических процессов означает, что потоки, сами по себе невозможные с термодинамической точки зрения, сопровождающиеся повышением свободной энергии, могут осуществляться за счет других обобщенных сил. Сопряжение необратимых процессов можно проиллюстрировать простым примером водопада, приводящего в движение гидротурбину. Комплекс водопад+гидротурбина представляет собой новую систему, поэтому процессы движения воды в водопаде и турбине можно рассматривать независимо лишь в первом приближении, пока их взаимодействие не слишком сильно влияет на скорость движения воды. Рассмотрим систему двух одновременно протекающих необратимых реакций. Скорость возникновения энтропии в химических процессах пропорциональна произведению значения движущей силы реакции (химическое сродство А) и скорости реакции v: diS/dt-Ai V1+A2V2... An v n >0. (2.38) Эти реакции могут протекать лишь при условии их положительного значения: Ai vi + А2 V2 > 0. (2.39) Такое положение возможно, когда Ai • vi > 0 и Аг "V2 > 0 или когда Ai • vi < 0, А2 • V2 > 0. Первая реакция в данном случае называется сопряженной, вторая - сопрягающей. На этом основании можно связать чисто термодинамическую величину химического сродства с важнейшей кинетической характеристикой - скоростью реакции: 84
vi
Общее изменение энтропии в системе сопряженных необратимых процессов является величиной положительной - это критерий возможного сопряжения потоков в системе. Наличие термодинамического сопряжения в реакциях клеточного метаболизма позволяет по-новому подойти к оценке энергетической целесообразности биологических процессов по сравнению с методами классической термодинамики. Сопряжение необратимых процессов, характеризующихся тепловой деградацией свободной энергии системы, частично предотвращает эти потери, обеспечивая запас в биологических структурах части энергии. Образование АТФ, сопряженное с процессами окисления, является в этом отношении наиболее показательным примером. Таким образом, термодинамическое сопряжение реакций метаболизма ведет к уменьшению продукции энтропии, и поэтому тепловой поток, обусловленный необратимыми реакциями окислительного фосфорилирования, может изменяться в зависимости от степени сопряжения процессов свободного окисления с реакциями фосфорилирования. Экспериментальное определение термодинамических параметров биологических систем Наиболее важными термодинамическими характеристиками биологических систем являются скорость продуцирования энтропии, изменение свободной энергии системы, изменение энтальпии. Имеются многочисленные исследования, в которых делаются попытки оценить скорость продуцирования энтропии системы путем экспериментального определения теплопродукции. Для химических реакций величина энтропии реагирующих веществ непосредственно связана с тепловым эффектом: U 4 1 ) dt Т dt где Т - температура по Кельвину, dQ/dt - скорость теплопродукции реакции. Определяя тепловые эффекты реакции в специальных микрокалориметрах, можно вычислить скорость продуцирования энтропии. Однако применение данного уравнения для биологических систем связано с рядом трудностей. В живых организмах значительная часть поступающих из окружающей среды соединений расходуется без совершения работы на теплопродукцию, эквивалентную разности внутренних энергий части пищевых веществ и продуктов выделения. Процессы жизнедеятельности сопровождаются превращением части энергии в тепловую, которая учитывается в формуле. Однако эта теплопродукция составляет лишь часть термогенеза. Поэтому определение скорости продуцирования энтропии в биологических системах на основе калориметрических измерений не всегда дает однозначные результаты.
85
Для определения скорости продуцирования энтропии биологических систем используют метод, в основе которого лежит измерение константы равновесия К, т.е. измерения равновесных концентраций субстратов и продуктов реакции, при разных температурах. Он применяется лишь в том случае, когда изменение энтропии системы и изменение энтальпии от температуры не зависят. В этом случае используют уравнение Вант-Гоффа:
.nK-f.f. где К - константа равновесия; АН - изменение энтальпии; AS - изменение энтропии; Т - абсолютная температура; R - универсальная газовая постоянная. График зависимости In К от 1/Т представляет собой прямую линию, пересекающую ось ординат в точке AS/R, а ось абсцисс - в точке AS/ЛН. Для построения прямой достаточно двух точек, поэтому константу равновесия определяют при двух температурах. Изменение свободной энергии вычисляют по следующему уравнению: AG-AH-TAS,
(2.43)
где AG - изменение свободной энергии системы. Существует еще несколько способов определения величины AG. Если известно значение константы равновесия (К), то AG находят по формуле AG--RTlnK.
(2.44)
Отрицательное значение AG показывает, что реакция протекает самопроизвольно, положительная величина AG характерна для реакций, которые осуществляются против термодинамического потенциала, т.е. не могут протекать спонтанно. Можно определить AG из величин стандартных окислительно-восстановительных потенциалов по уравнению AG - - n F ДЕО-
(2.45)
где п - число переносимых электронов; F - число Фарадея (23 063 кал/моль); ДЕО разность стандартных окислительно-восстановительных потенциалов реагирующих веществ. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ 1. Сформулируйте закон Гесса - следствие первого закона термодинамики. Напишите уравнение. 2. Как применяются калориметрические методы в термодинамике биологических процессов? 3. В чем физическая сущность понятия энтропии? Единицы измерения энтропии. 4. Сформулируйте второе начало термодинамики для изолированных и открытых систем. Запишите математические уравнения. 5. Какие виды энергии характеризуются наименьшим значением энтропии? 6. Как изменяется баланс энтропии при росте и старении организмов? 7. Открытая система обменивается с внешней средой потоком энергии I] и потоком вещества 12- Оба эти потока взаимосвязаны. Через определенное время открытая система переходит в стационарное состояние, в результате чего поток энергии 11 - 0. Определите, как изменяется продукция энтропии в стационарном состоянии. 86
8. Как изменяется диссипативная функция открытой системы в устойчивом и неустойчивом стационарных состояниях? 9. Образование сахарозы из глюкозы и фруктозы идет с участием ЛТФ: глюкоза + фруктоза + АТФ -» сахароза + АДФ + Ф. При 298 К изменение стандартной свободной энергии составляет AGO ~ 6285 Дж моль . Найдите константу равновесия этой реакции. 10. Как осуществляется переход закрытой системы в равновесное состояние? 11. Количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата при концентрации исходных веществ и продуктов 1 моль (стандартное состояние), составляет 7,3 ккал/моль. Поскольку истинные физиологические концентрации АТФ, АДФ и неорганического фосфата в клетках отличаются от 1 моль, количество свободной энергии, необходимой для синтеза АТФ при физиологических условиях, отличается от 7,3 ккал/моль. Вычислите количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТФ в клетке печени человека при физиологических концентрациях АТФ, АДФ и неорганического фосфата, равных соответственно 3,5; 1,5 и 5,0 ммоль. 12. Вычислите изменение стандартной свободной энергии следующей ферментативной реакции при 25° С, рН 7,0, исходя из приведенного значения константы равновесия ( К - 6 , 8 ) : аспартатаминотрансфераза глутамат + оксалоацетат • аспартат + кетоглутарат. 13. Сформулируйте соотношения Онзагера и покажите, как они применяются для анализа биологических систем. 14. Объясните связь скорости изменения энтропии биологических систем (dS/dl) с теплопродукцией. 15. Каковы термодинамические критерии достижения устойчивого стационарного состояния? СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Б е л а н о в с к и й А.С. Основы биофизики в ветеринарии. М., 1989. 271 с. Б и о ф и з и к а / Под ред. Б.Н.Тарусова и О.Р.Кольс. М„ 1968. 467 с. Б и о ф и з и к а / Ю.Л.Владимиров, Д.И. Рощупкн, А.ЯА Потапенко, А.И. Деев. М 1983. 272 с. Б л ю м е н ф е л ь д Л.А. Проблемы биологической физики. М., 1977. 336 с. В о л ь к е н ш т е й н М.В. Биофизика. М., 1988.590с. Г у б а н о в Н.И., У т е п б е р г е н о в А.А. Медицинская биофизика. М.. 1978. 334 с. Д а в и д Р. Введение в биофизику. М, 1982. 207 с. Б и о ф и з и к а / Под ред. П.Г.Костюка. Киев. 1988.504 с. Л е н с к и й А.С. Введение в бионеорганическую и биофизическую химию. М., 1989.255 с. Р у б и н А.Б. Термодинамика биологических процессов. М., 1976. 238 с. Р у б и н А.Б. Биофизика. М., 1987. Кн.1 319 с. Ф р а й ф е л ь д е р Д. Физическая биохимия. М., 1980.582 с. Ч а н г Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. М., 1980.662 с. Э д с о л л Дж., Г а т ф р е н д X. Биотермодинамика. М., 1986. 220с. 87
ГЛАВА 3 КИНЕТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Кинетика биологических процессов изучает количественные закономерности протекания жизненных явлений во времени. В задачи этого раздела биофизики входит выяснение механизмов, определяющих скорости биологических процессов, и выявление их лимитирующх стадий, количественное описание протекания процессов жизнедеятельности во времени с использованием молекулярных представлений и законов физической и химической кинетики. Для современной биологии характерна интерпретация биологических явлений в терминах молекулярных механизмов и понимание основных принципов биоэнергетики, обусловливающих проявление физиологических функций. Кинетико-термодинамические исследования приобрели особое значение, когда в результате рентгеновских исследований структуры кристаллических ферментов появилась возможность трактовки их на молекулярном уровне. Ферментативные реакции протекают в полном соответствии с общими закономерностями химических превращений. В настоящее время прогресс в исследовании кинетики биологических процессов связан с интенсивным изучением кинетических особенностей действия ферментов, так как именно ферменты являются основными элементами биологических систем, определяющих развитие жизненных процессов. Теория ферментативного катализа развивается по двум направлениям: 1) изучение структуры ферментов и их активных центров; 2) исследование последовательности превращений молекулы субстрата в активном центре фермента, приводящих к образованию продукта. Механизмы ферментативных реакций в рамках кинетики биологических процессов представляют собой последовательность молекулярных трансформаций исходных веществ в конечные продукты, включающие образование высокореакционных промежуточных соединений. Исследование механизмов биохимических процессов это изучение строения и свойств промежуточных соединений, обнаружение корреляции между строением и реакционной способностью. Исследование кинетических закономерностей ферментативного катализа сводится к изучению влияния концентраций фермента, субстрата, активаторов и физико-химических факторов (температура, ионная сила, давление) на скорость ферментативной реакции. Экспериментальные данные о влиянии температуры дают инфор88
мацию о биоэнергетике ферментативного катализа, исследования влияния рН субстрата помогают идентифицировать функциональные группы активного центра. Ферментативная кинетика уделяет особое внимание проблемам регулирования биохимических процессов, исследованию стерической структуры, ответственной за активность, процессам ассоциации-диссоциации субъединиц и их роли в ферментативном катализе, а также кинетике функционирования рецепторов и транспорта органических и неорганических соединений в биомембранах. Одной из самых важных особенностей ферментативного катализа является компартментализация: большинство биохимических процессов локализовано в определенных участках клетки, отделенных друг от друга мембранами, на которых ферменты объединяются в полиферментные системы, согласованно работающие ансамбли (фотосинтезирующие системы хлоропластов, дыхательная цепь митохондрий и др.). Поэтому в большинстве случаев кинетические исследования ферментативных реакций дают возможность получить не истинные, а кажущиеся значения кинетических и термодинамических параметров. Отсюда следует, что кинетические исследования ферментативных процессов должны сопровождаться независимым изучением структуры и физико-химических свойств белка, а в случае мембданосвязанных ферментов - исследованием иммобилизации на соответствующих носителях. Кинетический метод применительно к ферментативным реакциям имеет и практическое значение - определение оптимальных условий функционирования ферментных систем в промышленности и медицине. Кинетика биологических процессов характеризуется проникновением в нее математических методов, и проблема функционирования биологической системы рассматривается как результат взаимодействия составляющих ее элементов. Математические модели с данными эксперимента - это необходимое условие проверки исходных гипотез о механизмах ферментативного катализа. Математические модели позволяют раскрыть механизмы взаимодействий в биохимических циклах метаболизма. Они основаны на детальном знании последовательности превращения веществ и экспериментальном определении значений концентраций реагентов, а также констант скоростей ферментативных реакций. При построении модели сложных гетерогенных биологических систем, применяемых в кинетике, необходимы: 1) объект моделирования; 2) цель моделирования; 3) средство моделирования. 89
Модели биологических процессов чаще всего бывают двух категорий: регрессионные и имитационные. Регрессионные модели помогают установить связь между некоторыми переменными в системе, позволяют уточнить характер связи между взаимодействующими компонентами и значение параметров, которые, по существу, определяют протекание биологического процесса. Это первый этап моделирования, позволяющий установить основные свойства объекта. Используя системы дифференциальных уравнений, описывают зависимость скорости изменения переменных от их значений. В системах дифференциальных уравнений учитывается несколько переменных, причем для описания изменения каждой составляется свое дифференциальное уравнение. Например, взаимодействие популяций жертв и хищников можно описать следующей системой уравнений: x~a 1 x-yf(x); y-yyf(x)-a 2 y, (3.1) где х -численность популяции жертв; у - численность популяции хищников; х и f - скорости изменения численности этих популяций; f(x) - возрастающая функция, описывающая зависимость интенсивности питания хищника от численности жертв; ai, а2 и у постоянные величины (параметры модели). Произведение aix описывает размножение жертвы; yf(x) - ее "выедание"; у yf (х) - размножение хищника; аг у - смертность хищника. Если из экспериментальных данных определить значение переменных, то можно решить систему дифференциальных уравнений, т.е. найти зависимость значений переменных от времени. В большинстве случаев модели содержат большое число уравнений, включая и нелинейные, так как биологические процессы, как правило, нелинейны, что может создать математические трудности в их решении. На основании регрессионных моделей можно делать качественные заключения о характере динамики системы: определить, в каких случаях система будет стремиться к устойчивому стационарному состоянию, или имеют место колебания вокруг равновесия. Имитационные модели также представляют собой системы дифференциальных уравнений. Причем они дают не только качественный, но и количественный прогноз. Имитационные модели включают большое количество переменных и, соответственно, большое число дифференциальных уравнений, в том числе и нелинейных. Решение такой сложной системы уравнений осуществляется с помощью ЭВМ. Имитационное моделирование - это в первую очередь 90
исследования, причем на сложных моделях можно проследить взаимосвязь между отдельными компонентами в полиферментных системах, а также качественно проанализировать последствия нарушения режимов регулирования отдельных этапов ферментативного процесса. Имитационное моделирование позволяет объединить разнородные сведения о механизмах отдельных стадий ферментативной реакции. При этом сразу становятся ясными пробелы в знаниях и модель может быть использована для выработки разумного плана комплексного исследования механизмов ферментативных реакций. Теорией дифференциальных уравнении пользуются для формального описания развития биохимических реакций, определения последовательности молекулярных трансформаций исходных веществ в конечные продукты. Кинетическое исследование, как правило, начинается с эксперимента: изучается зависимость концентрации продуктов реакции Р, исходных реагентов S или каких-либо промежуточных соединений от времени, при этом используются самые разнообразные биохимические и биофизические методы определения концентраций веществ. Экспериментатор для облегчения интерпретации результатов должен поддерживать ряд параметров постоянными в системе (значения рН, температуры, концентрации ингибиторов). Для объяснения полученных экспериментальных данных создают кинетические схемы, которые учитывают элементарные стадии трансформации молекул как мономолекулярные: бимолекулярные:
, А +В — С. При построении модели нужно предусматривать наименьшее число стадий процесса с учетом дальнейшей детализации и отдельного моделирования промежуточных реакций. Кинетическая схема записывается либо в виде последовательности реакций, либо в виде графа реакций, характеризующих взаимный переход компонентов биохимического процесса. Кинетическая схема реакции записывается как система дифференциальных или алгебраических уравнений: ИА
^
(3.2)
В каждой модели число уравнений равно числу переменных. Желательно, чтобы система уравнений представляла собой систему 91
дифференциальных уравнений первого порядка с постоянными коэффициентами, которую при известных начальных и граничных условиях можно решить. Система дифференциальных уравнений, описывающая биохимический или биофизический процесс, должна быть линейной, что достигается большим избытком одного из компонентов реакции, входящего в уравнение в виде константы. Это существенно упрощает решение системы дифференциальных уравнений. В ряде случаев решение системы дифференциальных уравнений не может быть получено в аналитическом виде из-за сложности и гетерогенности биосистем. Поэтому в последние годы в кинетике биологических процессов широко применяют ЭВМ, позволяющие решать задачи, ранее не получившие решения из-за математических трудностей. При использовании ЭВМ решение получается не в виде уравнений, а в виде функций, заданных таблицами или графиками. Известно, что биохимические процессы включают не только реакции первого порядка, но и реакции второго и даже более высоких порядков. Это значит, что в правой части уравнений могут появиться нелинейные члены, которые усложняют анализ и одновременно дают ценную информацию о кинетико-термодинамических свойствах процесса. Нелинейный характер дифференциальных уравнений определяется также необходимостью учета активаторов или ингибиторов при математическом описании биохимических реакций. Важнейшим моментом кинетического исследования является сопоставление выводов, вытекающих из кинетической схемы, с экспериментальными результатами. Если выводы кинетической модели согласуются с экспериментальными данными, то это значит, что предложенная схема соответствует экспериментальным результатам. В этом случае необходимо решение обратной задачи, т.е. определение численных значений параметров, входящих в уравнение, описывающее изменение концентрации компонентов. На данном этапе можно проводить пробные расчеты на ЭВМ, изменяя различные кинетические параметры; при этом вместе с результатами собственных экспериментов можно привлекать данные других авторов. § 1. Основные понятия кинетики биологических процессов Основные законы и понятия кинетики биологических процессов базируются на общих теоретических положениях химической кинетики, изучающей скорости химических реакций. Однако вследствие специфических особенностей биологических объектов эти поло92
жения во многом изменяются. Фундаментальное понятие химической кинетики - химическая реакция, представляющая собой совокупность актов перегруппировки межатомных связей. Химические реакции можно разделить на две группы: гомогенные и гетерогенные. Гомогенные реакции протекают с одинаковой скоростью в любом элементарном объеме данной фазы; гетерогенные - на границе раздела фаз, и скорость их определяется скоростью подачи реагирующих веществ на поверхности раздела фаз. Ферменты, растворенные в реакционной смеси и осуществляющие биохимические реакции, считаются гомогенными катализаторами. Некоторые ферменты ведут себя как гетерогенные катализаторы, так как они имеют большую молекулярную массу и образуют коллоидные растворы или являются компонентами мембран. Скорость реакции определяется как количество вещества, превращенного (образовавшегося или распавшегося) в единицу времени. Она является функцией концентрации участвующих в реакции веществ. Скорость реакции не может быть измерена непосредственно. Зная концентрации продуктов реакции, измеренные через определенные интервалы (At), строят график зависимости концентрации продукта от времени. При этом соблюдаются определенные условия реакции (температура, рН, давление). Кривая скорости реакции показывает изменение количества образующегося продукта со временем (рис. 3.1). Угол наклона касательной к кривой скорости реакции в какой-либо точке показывает, насколько быстро протекает реакция в соответствующий момент времени. Чем больше угол наклона касательной к кривой скорости, тем быстрее протекает реакция. На рис 3.1 угол наклона касатель-
100
81 о/-40 ом*-41а/
во во 1оо
Рис. 3.1. Кривая скорости реакции между разбавленной соляной кислотой и мраморной крошкой: 1 - касательная в начальный момент реакции; 2 - касательная в момент реакции через 40 с после начала; 3 - затухание реакции
ВовМЯ. О 93
ной к кривой скорости соответствует начальной скорости реакции, причем угол наклона максимален, так как реакция быстрее всего протекает в первый момент. Постепенно по мере накопления продукта реакции (СОг) наклон касательной к кривой в каждой следующей ее точке становится меньше. Существует понятие средней скорости реакции за период времени t, которая определяется уравнением: Скорость реакции -AV/dt. (3.3) Мгновенную скорость реакции в какой-либо конкретный момент времени можно выразить так: Скорость реакции - dV/dt. (3.4) Мгновенная скорость реакции определяется тангенсом угла наклона касательной к кривой скорости в соответствующий момент времени. Если в гомогенной системе протекает ферментативная реакция фермент А+В •«' *" C+D, в которой А и В - исходные вещества (субстраты), а С и О - продукты реакции, то скорость этой реакции есть производная от концентрации любого из исходных или конечных компонентов реакции по времени: v
{Л Л) " dt ~ dt - dt - dt • Знак "минус" показывает убыль концентрации субстратов в процессе реакции. Таким образом, скорость реакции определяется по уменьшению концентрации исходных веществ или по увеличению концентрации продуктов реакции. Катализаторы повышают скорость спонтанно протекающих реакций, при этом сами могут оставаться неизменными к концу реакции. Если вещество инициирует реакцию, оно называется инициатором, если ускоряет каталитическую реакцию, то его относят к активаторам. Соединения, понижающие скорость каталитической реакции или полностью подавляющие ее, называются ингибиторами. Вещества, непосредственно не влияющие на катализатор, но приостанавливающие активационное или ингибирующее действие другой молекулы, называются либераторами. Под кинетикой реакции понимают зависимость скорости реакции от концентрации реагирующих веществ, температуры и других параметров. Голландский физико-химик Я.Вант-Гофф в 1884 г. сформулировал представления о кинетике химических реакций. Он предложил классификацию простых элементарных реакций по числу участвующих в них молекул.
94
Под молекулярностью реакции понимается число молекул, реагирующих друг с другом в данной реакции. Если в реакции участвует одна молекула (А •*• В), то говорят о мономолекулярной реакции. К таким реакциям относится декарбоксилирование аминокислот. В этих реакциях сложные молекулы претерпевают химические превращения (диссоциация и изомеризация молекул L-аланин -• Dаланин). Бимолекулярные реакции характеризуются тем, что в элементарном акте химических превращений участвуют две молекулы: A+D •• С. Примером может служить взаимодействие моноокиси углерода и хлора с образованием фосгена: СО + С12 2 СОС12, а также реакции гидролиза ацетилхолина и разложения пероксида водорода по уравнению: Н2О2 + H2O2 - 2НгО + 02. Реакции, элементарный акт которых сводится к взаимодействию трех молекул, называются тримолекулярными: ЗА •• В или 2А + В -• С. Статистически такие реакции мало вероятны, и примеры тримолекулярных реакций в химической практике крайне редки. Реакции с молекулярностью выше трех в химической кинетике неизвестны, так как вероятность взаимодействия большего числа молекул в реакционном акте крайне мала. Поэтому уравнения химических реакций типа 4НС1 + О2 £ 2С12 + 2НгО нельзя отнести к пятимолекулярным реакциям. Это запись суммарного процесса, который включает цепь последовательно протекающих моно- и бимолекулярных реакций. Особенно это относится к биохимическим реакциям, характеризующимся большей сложностью и состоящим из ряда промежуточных стадий. Кинетика мономолекулярных реакций подчиняется следующему уравнению: v-k[A], (3.6) где к - константа скорости реакции; [А ] - концентрация вещества А. Скорость бимолекулярной реакции выражается уравнением: v-k[A][B], (3.7) где [А ] и [В ] - исходные концентрации реагирующих веществ. Если реагируют две одинаковые молекулы (в случае разложения Н2О2), то константа скорости 2 2 v-k[A] -k[B] (3.8) 95
бимолекулярной реакции численно равна скорости реакции при условии, что концентрации всех реагентов равны 1, и будет определяться уравнением: k
.I._!
L_I._J
L_
(3 9)
t [АЪ [А\о t [B\t [BK Таким образом, величина константы скорости бимолекулярной реакции зависит от абсолютных концентраций вещества. В кинетике важную информацию дает порядок реакции, который определяется как сумма показателей степеней концентраций реагирующих веществ в уравнении скорости реакций. Простейшая реакция - реакция первого порядка; ее скорость пропорциональна концентрации только одного вещества (рис. 3.2). v/
Рис. 3.2. Зависимость скорости реакции первого порядка от концентрации веществ с, ммоль
Уравнение скорости реакции первого порядка имеет вид: v-k[A]. (3.10) Обобщенное уравнение для скорости реакции второго и более высоких порядков (при условии, что начальные концентрации всех реагентов одинаковы):
^
- к2 [А] [В] -к2(Ао-с)-
(Во - с); (3.11)
где х - концентрация вещества А, использованного к моменту времени t; n - порядок реакции. Реакции нулевого порядка характеризуются тем, что скорость в пределах времени наблюдения остается постоянной и не зависит от концентрации реагента (рис. 3.3). Такая ситуация может возникнуть для бимолекулярных реакций в случае избытка одного компонента по отношению к другому. Для мономолекулярной реакции нулевого порядка для вычисления константы скорости необходимо 96
Рис. 3.3. Зависимость скорости реакции нулевого порядка от концентрации исходного вещества С. мшмь
полученное значение скорости реакции разделить на начальную концентрацию превращающегося вещества. Для реакций А + В -• С, протекающих по нулевому порядку, v - к. Диффузия, определяющая скорость протекания биохимических и биофизических процессов, подчиняется кинетике реакций первого порядка. Примером реакции второго порядка служит бимолекулярная реакция, скорость которой зависит от концентрации двух реагирующих веществ. Порядок простой гомогенной реакции совпадает с молекулярностью. Для более сложных реакций и реакций, происходящих в гетерогенных системах, зависимость между скоростью суммарной реакции и концентрациями реагентов имеет более сложный характер и порядок реакции не является целым числом. Большое разнообразие наблюдается в случае гетерогенных каталитических процессов. Наряду с целыми порядками могут быть и дробные, и нулевые. Особенно это положение характеризует ферментативный катализ. В кинетике биологических процессов описываются различные типы сложных реакций: последовательные, параллельные, цепные, циклические и др. Реакции называются последовательными, если продукт одной из реакций является исходным веществом для другой. Простейшая цепь реакций состоит из двух последовательно происходящих и необратимых реакций первого порядка. Хотя такая система упрощена и редко встречается в жизненных циклах, мы воспользуемся ею для примера: к, к 2 А— В — С. Каждая ступень реакции характеризуется собственной константой скорости и суммарная скорость процесса определяется соотношением этих констант. Концентрация вещества В вначале растет, затем убывает; концентрация вещества С в начале реакция не обнаруживается, и появление его связано с накоплением в процессе реакции вещества В (рис. 3.4.). 97
t
Рис. 3.4. Изменение количества вещества в последовательной реакции: 1 для исходного вещества А; II - для промежуточного вещества В; III - для конечного продукта С. По оси ординат концентрация вещества (С), по оси абсцисс - время (О
Уравнения для скоростей реакции записываются в следующем виде: -d[A]/dt-ki [А]; (3.12) d[B]/dt-ki [A]-k2[B]; (3.13) d[C]/dt-k2[B]. (3.14) Если величины ki и кг значительно отличаются друг от друга, то скорость реакции определяется меньшей из двух констант. Реакция с наименьшей константой скорости называется лимитирующей. Примером последовательной реакции, состоящей из двух промежуточных процессов первого порядка, служит превращение анизола в организме кролика. В результате гидроксилирования анизола образуется п-оксианизол, который затем связывается сернокислотным или глукуроновым остатком и выводится из организма. Определяющей реакцией является гидроксилирование. Реакции свертывания крови (протромбин -» тромбин-» комплекс тромбин -» антитромбин) являются последовательными реакциями первого порядка. Системы последовательных реакций, происходящих в клетках, являются незамкнутыми, поэтому при анализе кинетики большинства клеточных процессов следует пользоваться кинетикой незамкнутых систем. Весьма своеобразной разновидностью сложных реакций являются сопряженные реакции. Их первым исследователем был Н.А.Шилов (1905). Сопряженной называют реакцию, которая происходит при одновременном протекании другой реакции. Явление возбуждения (индуцирования) одной реакции благодаря протеканию какой-либо другой получило название химической индукции. Если, 98
например, к раствору иодоводородной кислоты добавить пероксид водорода, то окисление HI с образованием h по термодинамически возможной реакции не произойдет: 2HI + H2O2-I2 + 2H2O. Если ввести в реакционную смесь сульфат железа, то одновременно с окислением двухвалентного железа в трехвалентное будет происходить и окисление иодид-иона до свободного иода: 6FeSO4 + ЗН2О2 + 6HI - 2Fe2(SO4)3 + 2Feh + 6Н2О. Многие биохимические реакции синтеза, при которых происходит усложнение структуры молекулы, уменьшение энтропии и увеличение свободной энергии, оказываются возможными благодаря сопряжению с одновременно протекающими другими реакциями, характеризующимися отрицательными изменениями свободной энергии. Такие реакции называют тандемными. Большое значение в жизнедеятельности организмов имеют цепные реакции. Создание современной теории цепных реакций связано с именами отечественных ученых Н.Н.Семенова, В.А.Каргина, А.Н.Теренина и Н.М.Эмануэля. Эти реакции могут осуществляться лишь при участии активных частиц, свободных атомов или радикалов с ненасыщенной валентностью, а также молекул или ионов, имеющих некоторый избыток энергии. Рассмотрим, например, механизм развития цепной реакции при облучении воды. Процесс начинается с получения кванта лучистой энергии молекулой воды, что приводит к распаду ее на активные частицы: Н2О ^ Н г О ' - Н 20Н - Н2О2 Н2О2 -• НгО + О и т.д. Цепная реакция - это самоподдерживающаяся химическая реакция, при которой первоначально появляющиеся продукты принимают участие в образовании новых. Эти реакции протекают с большой скоростью и нередко имеют характер взрыва. Цепные реакции проходят три главные стадии: зарождения, развития и обрыва цепи. На стадии зарождения происходит образование промежуточных продуктов (атомов, ионов, нейтральных молекул). Инициирование этого процесса может осуществляться светом, ионизирующей радиацией, тепловой энергией, катализаторами. Стадия развития характеризуется тем, что промежуточные про99
дукты реагируют с исходными веществами, образуя новые интермедиаты и конечные продукты. Стадия развития в цепных реакциях повторяется много раз и приводит к образованию большого числа начальных и конечных продуктов. На стадии обрыва происходит окончательное расходование промежуточных продуктов или их разрушение, поэтому реакция прекращается. Цепная реакция может оборваться самопроизвольно или под действием специальных веществ (ингибиторов). Цепные реакции разделяются на реакции с разветвленными и неразветвленными цепями. Цепные реакции с разветвленными цепями характеризуются тем, что количество участвующих в них свободных радикалов или других активных частиц возрастает в процессе реакции, например, реакция окисления водорода: Нг + Ог/* Н'+^НОг - зарождение цепи, Н*+ 0 * 0 Н + (5 - разветвление цепи. Характерной особенностью разветвленной реакции является то, что она не подчиняется закону Аррениуса. Ускорение реакции при повышении температуры происходит быстрее, чем это следует из закона Аррениуса. В разветвленных реакцях на одну начально активированную молекулу приходятся тысячи и сотни тысяч вступающих в реакцию молекул или их осколков. Многие реакции, протекающие в живых организмах при участии специфических биокатализаторов (ферментов, гормонов) носят цепной характер. Циклические системы реакций играют важную роль в обмене веществ: ., д -
С Простейшей формой циклической системы служит ферментативная реакция, в которой фермент многократно проходит через свободную и связанную формы:
100
где Е - фермент, S - субстрат, [ES ] - фермент-субстратный комплекс, Р - продукт реакции. Циклические реакции с участием более двух реагентов часто встречаются в процессах обмена, причем иногда они приводят к сохранению вещества. Вычисления показали, что in vitro для ферментов, участвующих в процессах окисления, число молекул субстрата, измененных одной молекулой фермента в I мин, достигает 1(г 1(г. Кинетика метаболических циклов во многих отношениях подобна кинетике последовательных реакций. Кинетические уравнения для более крупных циклов (цикл трикарбоновых кислот, цикл орнитина) оказываются черезвычайно сложными и превращаются в нелинейные уравнения. Цикл трикарбоновых кислот состоит из серии последовательных реакций, катализируемых десятью различными ферментами, в ходе которых остаток уксусной кислоты в форме ацетил-КоА окисляется до СОг и Н2О. До тех пор, пока система находится в равновесии, реакции в одну сторону идут быстрее, чем в другую, т.е. цикл вращается по "часовой стрелке" или наоборот. Скорость обращения цикла зависит от относительных концентраций исходных веществ и продуктов реакции, участвующих в промежуточных процессах цикла. В циклических реакциях влияние определяющих промежуточных стадий меньше, так как все вещества в системе взаимосвязаны, даже если некоторые ступени необратимы. Поэтому необратимая реакция не может так же влиять на суммарную скорость, как определяющая реакция в линейной цепи. Скорость циклической реакции определяется степенью отклонения величины отношений концентраций Si /Pi от величины отношений, соответствующих равновесию. Цикл трикарбоновых кислот - важнейшй метаболический процесс, занимающий центральное положение в общей системе обмена веществ и энергии в организме. Если в реакциях гликолиза, окисления жирных кислот и окислительного дезаминирования освобождается около 1/3 заключенной в них энергии, то в ходе цикла трикарбоновых кислот происходит полное освобождение всей остальной энергии. При достаточно большом числе оборотов действие циклов близко к действию ферментов (по эффективности). По существу, элементарный каталитический акт заключается в циклическом повторении заполнения активного центра фермента молекулой субстрата и освобождение его после окончания реакции. Циклы вращаются в одном направлении за счет необратимых 101
стадий. Скорость вращения циклов зависит от относительной концентрации веществ, составляющх отдельные стадии цикла. Кроме того, промежуточные вещества, входящие в цикл, могут не только образовываться в нем, но и поступать извне. Благодаря этому организм может тонко регулировать концентрации реагирующих веществ в цикле, скорость вращения цикла и интенсивность производимых циклом превращений. Важным частным случаем циклических реакций является наличие в них аутокаталитических стадий, когда продукт реакции ускоряет одну из реакций цикла. В биохимических процессах обмена веществ циклы не замкнуты и не изолированы. С другими реакциями циклы связывают не только вещества, проходящие через цикл и претерпевающие в нем необратимые химические превращения, но и промежуточные соединения, которые образуются в других нециклических реакциях. Так, фумаровая кислота в цикле Кребса может образовываться не только из янтарной кислоты, но и из аспарагиновой аминокислоты, поступающей в цикл. Благодаря этой взаимосвязи организм может тонка регулировать скорости вращения циклов и интенсивность биохимических превращений. Поэтому в целом процессы обмена веществ протекают в одном направлении и, несмотря на наличие циклов, имеют необратимый характер. Термодинамически это выражается в преобладающем значении затрат свободной энергии и подчинении обмена веществ термодинамике необратимых процессов. Преобладающее протекание реакций цикла в одном направлении согласуется со стационарным характером циклов, и при стационарном состоянии скорость реакций в одном направлении всегда больше скорости в противоположную сторону на определенную постоянную величину. Существуют такие химические процессы, в которых роль катализатора выполняют конечные продукты реакции. Это аутокаталитические процессы. Примером такой реакции является превращение пепсиногена в пепсин. Катализируется эта реакция вновь образующимися молекулами пепсина. Конечный продукт - пепсин, являясь катализатором, ускоряет биохимический процесс. Для аутокаталитических реакций характерен инкубационный период, затем скорость реакции стремительно нарастает. Аутокаталитические реакции в организме протекают не непрерывно, а периодически. Так, при поступлении пищи в пищеварительный тракт возникает потребность перехода проферментов в ферменты и наблюдаются реакции их превращения: пепсиногена в пепсин, трипсиногена в трип102
син. Превращение трипсиногена начинает другой, менее эффективный фермент-энтерокиназа, которая выделяется при раздражении стенок желудка частицами пищи. Скорость аутокаталитической реакции зависит от концентраций как исходных, так и конечных веществ: А -^*В; d[B]/dt-ki [A][B]. (3.15) Процесс идет при переменной возрастающей концентрации катализатора. С увеличением концентрации образующегося продукта (В) скорость реакции растет. Аутокаталитические реакции характеризуются тем, что начальная скорость увеличения количества вещества В формально равна нулю и поэтому реакция имеет лаг-фазу - период накопления катализатора (рис. 3.5). vA
^
Рис. 3.5. Зависимость скорости аутокаталитической реакции от времени
t
Чем длиннее и сложнее цепь аутокаталитических реакций, тем больше величина лаг-периода, причем за индукционным периодом следует логарифмическая фаза, которая показывает, что концентрация вещества В увеличивается экспоненциально. Аутокаталитические реакции могут быть отдельными звеньями биохимических циклов, когда продукт реакции является активатором одной из предыдущих стадий цикла. Например, вещество X ускоряет реакцию превращения В -» С As «--»А«--»В*--*С«- -»D*--»E«- -»EZ X При этом вращение цикла будет постепенно ускоряться, и режим работы цикла будет отклоняться от стационарного состояния, мак-
юз
симальная скорость реакции As -• А-* В будет осуществлена при минимальной концентрации вещества В. Параллельными называют совместно протекающие реакции, если, по крайней мере, одно исходное вещество этих реакций является общим:
V
Если параллельные процессы необратимы, то они характеризуются одинаковым порядком. Параллельное осуществление реакцй в нескольких направлениях возможно лишь в том случае, если для каждого из этих направлений изменение свободной энергии будет иметь отрицательное значение. В процессах метаболизма параллельные реакции служат путями разветвления процессов обмена веществ и поэтому возникает сетка реакций. Представим, что реакции превращения вещества А в вещества В и С первого порядка, a ki и К2 - соответственно константы скоростей. Расходование вещества А подчиняется уравнению (3.16): - d [ A ] / d t - ( k i + k 2 ) [A]; (3.16) d[B]/dt-ki [A]; d [ C ] / d t - k 2 [A]. (3.17) Следовательно, концентрации веществ, образующихся по каждому направлению, относятся как константы скоростей этих реакций: [B]/[C]-ki/k 2 . (3.18) Если одна из параллельных реакций подчиняется нулевому порядку, то преобладает реакция первого порядка. В этом случае можно выделить главную реакцию, протекающую с наибольшей скоростью и все остальные одновременно протекающие реакции, которые называют побочными. Примером параллельных реакций может быть превращение церамида, промежуточного продукта биосинтеза сфинголипидов: -церамид цереброзиды
I
сфингомиэлины
N-ацетилгалактозоамин.
Таким образом, параллельные реакции образуют разветвленные цепи биохимических превращений в организме и создают возможность сопряжения различных метаболических путей обмена веществ. 104
$ 2. Влияние температуры на скорость биохимической реакции. Энергия активации реакции Голландский ученый Я.Вант-Гофф на основании многочисленных наблюдений установил, что при повышении температуры на 10 °С скорость гомогенной химической реакции увеличивается в 24 раза. Это обобщение известно как правило Вант-Гоффа. Для характеристики зависимости скорости химической реакции от температуры был введен коэффициент Вант-Гоффа. Qio - отношение константы скорости реакции при температуре Т+10 к константе скорости при температуре Т. Qio-кт+ш/кт (3.19) Зависимость скорости реакции от температуры можно объяснить увеличением кинетической энергии молекул, способствующее химическому взаимодействию при соударениях. Коэффициент Q10 определяют из уравнения Вант-Гоффа. dlnk/dt-AH/RT , (3.20) где к - ki/k-i - константа равновесия реакции; ki и k-i - константы скоростей прямой и обратной реакций; ДН - изменение энтальпии реакции; R - универсальная газовая постоянная; Т - абсолютная температура. Правило Вант-Гоффа носит весьма приближенный характер и служит лишь для ориентировочной оценки влияния температуры на скорость реакции. Значение Qio варьирует от 1,5 до 3,0 и часто выходит за указанные пределы, причем для данной реакции Qio не остается одним и тем же в различных интервалах температур. Более детальную информацию о зависимости скорости реакции от температуры, учитывающую размеры и формы молекул, дает уравнение С.Аррениуса: EaKT/RT k-PZe(3.21) Величина Еакт, входящая в уравнение, называется энергией активации реакции; Z - число столкновений молекул; Р - стерический фактор; к - константа скорости реакции. Уравнение показывает, что константа скорости реакции определяется двумя постоянными для данной реакции величинами - числом столкновений молекул и энергией активации реакции Еакт. Энергию активации реакции можно рассматривать как избыток энергии по сравнению со средней энергией молекул при данной температуре, которым должны обладать молекулы для вступления в химическую реакцию. Кривая, определяющая распределение молекул по энергии в системе, описывается функцией Максвелла. 105
В системе при температуре 273 К определенное количество молекул обладает энергией Еа (рис. 3.6). При повышении температуры реакции кривая сдвигается вправо, и число молекул, обладающих уровнем Еа, значительно повышается. Скорость реакции увеличивается, так как возрастает число молекул, обладающих достаточной энергией для обобществления электронов. Таким образом, константа скорости реакции зависит от числа молекул, обладающих достаточной энергией активации, важнейшим кинетическим параметром, определяющим ход реакции.
Рис. 3.6. Распределение молекул по энергиям: Tl - при температуре 273К; Т2 - при температуре 310К. По оси абсцисс - кинетическая энергия молекул Ек; по оси ординат - количество молекул, обладающих данной энергией (п) Б.
Ек
Энергия активации - это энергетический барьер, который преодолевают молекулы для осуществления реакции. В уравнении Аррениуса множитель е" а определяет долю молекул,-имеющих энергию выше Еакт и эффективно участвующих в реакции. Чем выще энергия активации реакции, тем мендленнее она протекает при заданной температуре. Катализаторы уменьшают энергию активации реакции. Закону Аррениуса подчиняются такие процессы, как изменение биоэлектрических потенциалов, проницаемость, скорость деления клеток, интенсивность люминесценции бактерий, ферментативные реакции. Вычислив коэффициент ВантГоффа, можно определить и энергию активации той или иной реакции по следующей формуле: Еакт - 0,46 TiT2lgQl0, (3.22) где Ti,T2 - абсолютные температуры, при которых вычисляли коэффициент Вант-Гоффа. Для химических реакций Еакт = десятки ккал/моль; для ферментативных реакций Еакт = 4-12 ккал/моль. Однако такой способ определения ЕаКт реакции дает не совсем четкую информацию, так как коэффицинет Вант-Гоффа носит приблизительный характер. Для определения энергии активации реакции графическим спо106
собом из уравнения Аррениуса величину (PZ) представляют как предэкспоненциальный множитель (А), его логарифмируют: lnk-lnA-Eax-r/RT (3.23) и экспериментальные данные представляют графически (рис.3.7) в координатах (Ink, 1/T). |Q(A с) 1.4 tg о = - Е/19.15
Я 1.0 I 0.6
Рис. 3.7. Расчет энергии активации с помощью интегральной формы уравнения Аррениуса
0.2 3.3
3.5
3.7
По формуле (3.24) производят расчет энергии активации: t g a - - Еакт/R. (3.24) Из экспериментальных данных могут быть рассчитаны не только значение энергии активации, но и величина предэкспоненциального множителя А, частота соударения молекул Z и стерический фактор Р. Для биохимических реакций часто получают более сложную зависимость (In k, 1/T), и в этом случае на диаграмме Аррениуса наблюдаются изломы (рис.3.8). Это прежде всего обусловлено тем, что в биологической системе протекает не одноактный процесс, а многостадийная последовательная реакция. Наличие изломов на диаграмме Аррениуса показывет смену лимитирующих стадий реакции. Усложнение диаграммы Аррениуса может быть связано также с 1пК
Рис. 3.8. Расчет энергии активации с помощью интегральной формы уравнения Аррениуса для биохимических реакций
1/Т 107
изменением фазового состояния биологической системы, например с "плавлением" мембранных ферментов. Энергия активации сложных биологических процессов может быть определена из отдельных участков диаграммы Аррениуса и характеризует отдельные стадии реакции. Диаграмма Аррениуса для ферментативной реакции может иметь точку перегиба, и это объясняется следующими причинами: 1) изменение фазового состояния растворителя (НгО) при изменении температуры; 2) в реакционной смеси протекают две параллельные реакции с различными температурными коэффициентами, катализируемыми различными активными центрами фермента; 3) фермент, катализирующий реакцию, присутствует в двух формах, имеющих разные активности; 4) изменение температуры влияет на сродство субстрата к ферменту. Ферментативная реакция в простейшем случае состоит, как минимум, из трех стадий. Влияние температуры в целом является результатом влияния на каждую из этих стадий. Это означает, что имеется, по крайней мере, три константы скорости реакции; для диаграммы Аррениуса предпочтительно брать Ks (константу скорости распада фермент-субстратного комплекса), так как она является лимитирующей стадией ферментативной реакции. § 3. Влияние катализаторов на скорость реакции Катализ - изменение скорости химической реакции в присутствии веществ (катализаторов), которые, будучи введенными в реакционную систему, взаимодействуют с участниками реакций, оставаясь при этом в химически неизменном виде. Каталитические реакции были исследованы еще в начале XIX в. (1812-1825 гг.) К.Кирхгофом, Х.Деви и др. Катализатор в ходе реакции не расходуется и в суммарное уравнение реации не записывается. Воздействие катализатора осуществляется путем промежуточного взаимодействия с реагирующими веществами так, что цикл промежуточных реакций завершается регенерацией катализатора и освобождением его в реакционной смеси в прежнем физическом состоянии. Явление катализа применяется в технике и широко распространено в природе. Круг веществ, выполняющих роль катализаторов, весьма разнообразен. Катализаторы могут изменять скорость лишь термодинамически возможных реакций, когда AG < 0. Если промежуточное 108
взаимодействие с катализатором способствует ускорению химического превращения, то говорят о положительном катализе. На практике встречаются и случаи отрицательного катализа, когда в присутствии катализатора скорость реакции уменьшается. Вещества, вызывающие такие процессы, называют ингибиторами. Различают гомогенный и гетерогенный катализ. Если катализатор и реагирующее вещество образуют одну однородную систему, такой катализ называют гомогенным. При гетерогенном катализе катализатор и реагирующие вещества находятся в разных фазах. Следует выделить также и микрогетерогенный катализ, при котором катализатор находится в высококоллоидном или высокомолекулярном состоянии. Примером гомогенного катализа может быть подавляющая часть биохимических процессов, осуществляемых с помощью ферментов. При гетерогенном катализе катализатором является твердое тело, а реагирующие вещества находятся в жидкой или газовой средах. Примером может служить окисление аммиака в присутствии металлической платины или разложение растворенной перекиси водорода под влиянием не растворимой в воде двуокиси марганца. Большая скорость реакции в присутствии катализатора может быть обусловлена двумя причинами: 1) катализатор направляет реакцию по пути с более низкой энергией активации; 2) катализатор осуществляет реакцию по цепному механизму, при этом ускорение достигается благодаря образованию богатых энергией частиц в процессе самой реакции. Например, каталитическое действие воды на окисление окиси углерода связано с развитием цепных реакций с участием гидроксилов и атомов водорода. Действие ингибиторов может быть связано с прекращением цепной реакции вследствие обрыва цепей при взаимодействии отрицательного катализатора с активными частицами. Таким образом, при каталитическом ускорении реакции катализатор образует в результате промежуточного химического взаимодействия с реагирующими веществами активированный комплекс, непрочное соединение, которое превращается в конечный продукт. Причем данная реакция характеризуется меньшей энергией активации, чем в случае протекания той же реакции в отсутствие катализатора. Пусть, например, для гомогенной реакции веществ С и Д энергия активации равнаЕ'акт: С + Д - С Д <£'«,*,„). Катализатор К вступает во взаимодействие с одним из реагентов: 109
С + К •* СК (2?' 'акт <Е акт ) • Далее промежуточный активный комплекс реагирует со вторым реагентом: CK + D - СД + К(£'"<шп <Е'акт). Данная схема крайне упрощена, но она показывает, что при участии катализатора реакция осуществляется через ряд промежуточных стадий, что способствует уменьшению активационного барьера. При гетерогенном катализе реакционный процесс еще более усложняется. Для твердых катализаторов образование промежуточных соединений обусловлено прежде всего поверхностью катализатора, структурой его кристаллической решетки, степенью пористости. Основное требование, предъявляемое к катализаторам, - высокая каталитическая активность в расчете на единицу массы (1 мг для белков) или на единицу поверхности. Для кислотно-основных каталитических реакций типичными катализаторами при гомогенном катализе являются кислоты и основания, при гетерогенном катализе - твердые тела, обладающие кислотными свойствами (синтетические и природные алюмосиликаты). Для окислительно-восстановительных каталитических реакций наиболее часто применяют в качестве катализаторов переходные металлы (Pt, Ni, Fe, Co) или их соединения. Катализаторы играют ведущую роль в живой природе. Вся сложная система управления биологическими системами основана на катализаторах. Сложные комплексы биохимических превращений, обусловливающие брожение, дыхание, синтез различных соединений, осуществляются с помощью ферментов - катализаторов белковой природы. Ферменты были выделены впервые из живой клетки в 1879 г. Бухнером. Эти исследования имели большое значение, так как было показано, что работающие в живом организме катализаторы могут функционировать совершенно независимо от любого другого клеточного процесса, в связи с чем изолированные ферменты нашли широкое применение. В чистом виде ферменты были выделены в лаборатории Самнера (1926 г.). Число известных ферментов в настоящее время превысило 2000. Исходя из количества генетической информации, заложенной даже в таких простых организмах, как Е. coli, можно предполагать, что идентифицированы далеко не все ферменты. Каталитическое по
действие ферменты проявляют в водных растворах и поэтому являются гомогенными катализаторами. Но без применения теории гетерогенного катализа трудно представить механизмы ферментативных реакций, так как ферменты относятся к высокомолекулярным белкам, и необходимо учитывать существование в растворе ферментов микроповерхности раздела, характерной для гетерогенных катализаторов. К тому же каталитическая активность ферментов обусловлена специфической реакционной способностью групп активного центра и структурой укладки полипептидного каркаса. Многие ферменты функционируют лишь в связанном со структурными компонентами клетки состоянии (ферменты цикла трикарбоновых кислот, АТФ-азы). Таким образом, ферменты характеризуются признаками как гомогенных, так и гетерогенных катализаторов. Кроме того, они обладают рядом особых свойств, отличающихся от катализаторов небиологической природы. Главное отличие - исключительно высокая каталитическая активность и ярко выраженная специфичность действия. Ферменты, как и другие катализаторы, ускоряют только реакции, протекание которых термодинамически возможно, т.е. реакции с уменьшением свободной энергии AG < 0. Ферментативный катализ характеризуется выигрышем энергии активации в 16 - 18 ккал, в то время как катализаторы небиологической природы дают снижение энергии активации на 4 - 7 ккал (рис. 3.9, 3.10). Кинетические исследования показывают, что скорость ферментативных реакций определяется не только энергией активации, но и энтропийным фактором, причем их взаимодействие для ферментов более выражено, чем для небиологических катализаторов. Ферменты несоизмеримо продуктивнее катализаторов небиологического происхождения и обладают не только высокой каталитической активностью, но и способностью изменять ее под влиянием изменения микроокружения белковой молекулы или при изменении условий внешней среды. Ферменты ускоряют лишь те биохимические процессы, скорость которых в отсутствие катализатора (при данных условиях температуры, рН среды) весьма мала. § 4. Физико - химические механизмы ферментативного катализа Первая теория ферментативного катализа принадлежит Э. Фишеру. Она известна в науке как "ключ-замок", т.е. Фишер предложил статическую модель ферментативного катализа, предполагающую очень жесткую подгонку субстрата к активному центру фермента. ill
Энергия активации в отсутствие катализатора
Реагенты Энергия активации в присутствии катализатора Продукты
Координата реакции °Рис. 3.9. Уменьшение энергии активации реакции с помощью катализатора Минимальная энергия, необходимая для катализированной реакции Минимальная энергия, необходимая д л я некаталиэированной реакции
Энергия столкновения
• -
Рис 3.10. Увеличение частоты столкновений, приводящих к реакции, в присутствии катализатора
Важным этапом в изучении механизмов ферментативного катализа были работы американского биохимика Д. Кошланда, предложившего динамическую модель ферментативного катализа, или теорию индуцированного структурного соответствия фермента и субстрата. В соответствии с этой теорией субстрат при взаимодействии с активным центром фермента вызывает существенные изменения его конформации, поэтому и происходит точная переориентировка функциональных групп активного центра. Главная причина увеличения скорости реакции состоит в замене маловероятной реакции высокого порядка на высокоэффективную более низкого порядка. Согласно модели Кошланда специфичность и каталитическая активность фермента связаны друг с другом, но их механизмы различны, и ферментативная реакция осуществляется при взаимном расположении сорбирующих и каталитических центров фермента. Ряд фактов действительно свидетельствует об изменении конформации ферментов в присутствии субстрата. Например, субстра112
ты индуцируют диссоциацию глутаматдегидрогеназы на субъединицы. Спектр поглощения химотрипсина изменяется при его взаимодействии с субстратом за счет вызванных изменений конформации молекулы фермента. По современным представлениям, среди механизмов, которые играют главную роль в образовании фермент-субстратного комплекса, можно выделить следующие: 1) образование ковалентных связей; 2) гидрофобное взаимодействие между неполярными углеводородными радикалами молекул субстрата и дегидратированными участками белковой глобулы; 3) электростатическое взаимодействие между заряженной группой субстрата и ионизированными группами фермента; 4) образование водородных связей. Общим для большинства ферментных систем является то, что субстрат связывается с их активным центром двумя или большим числом точек. В качестве примера можно указать на сорбцию молекулы субстрата на активном центре папаина: молекула субстрата связывается с белком за счет гидрофобных взаимодействий, дополнительную ориентацию ей придают три водородные связи с аминокислотными остатками белка Gly-66, Asp-158. Образование многоточечных комплексов способствует тому, что полипептидные цепи белка, и особенно боковые группы аминокислотных остатков, не зафиксированы слишком жестко и подвижны. Рентгенография фермент-субстратного комплекса дает прямую информацию о конформационных превращениях белка. Так, активный центр лизоцима расположен в специальной полости, при вхождении субстрата полость сужается и более плотно "зажимает" субстрат (смещение на 0,075 нм). Не менее важную роль в образовании фермент-субстратного комплекса играет повышенная микровязкость активного центра. Многоточечный характер комплексообразования при взаимодействии фермента с субстратом в сочетании с повышенной микровязкостью активного центра приводит к практически полной диффузионной неподвижности молекул субстрата, что способствует уменьшению энтропии при образовании ферментсубстратного комплекса. При сорбции активным центром молекулы субстрата она переходит из водного окружения в окружение, созданное аминокислотными остатками. Молекула субстрата оказывается в поле сильных электрических взаимодействий между реагентами, которые вносят существенный вклад в энергетику ферментативного катализа, т.е. в процесс снижения энергии активации реакции. Фермент-субстратный комплекс может образовываться при уча113
стии различных связей: ковалентных, ионных, водородных и гидрофобных взаимодействий. Поэтому конформационное изменение пространственной структуры фермента происходит без разрыва пептидных связей, т.е. без изменения первичной структуры. Образование фермент-субстратного комплекса происходит, как правило, при участии функциональных групп белка, которые не принимают участия в последующей химической модификации молекул субстрата. В процессе образования фермент-субстратного комплекса с помощью рентгеноструктурного анализа выявлены два типа конформационных перестроек: 1. Локальные конформадионные перестройки (не более 1,5 нм). Они связаны с изменением небольшого участка полипептида и боковой группы аминокислотного остатка. Например, в молекуле карбоксипептидазы при связывании с липидом (субстратом) Туг248 смещается на 1,2 нм. 2. Крупномасштабные конформационные перестройки, сопровождающиеся смещением на расстояние более 1,5 нм. Это может быть обусловлено смещением структурных доменов. Например, в молекуле гексокиназы при связывании с лигандом происходит переориентация доменов. Таким образом, по теории Кошланда, комплементарная структура активного центра образуется в молекуле фермента не заранее, а в процессе ферментативной реакции. Есть точка зрения (В. Дженкс, 1972), что силы сорбции используются для создания напряжений (деформаций) в молекулах реагирующих компонентов, что уменьшает энергию активации ферментативной реакции. При этом предполагается, что активный центр устроен так, что в результате деформации молекула субстрата активируется. Ни субстрат, ни фермент не имеют жесткой конформации, поэтому при связывании наблюдаются конформационные перестройки всех участков ферментативного процесса. Термодинамическая сущность всех теорий одна и та же: потенциальная свободная энергия связывания субстрата на ферменте тратится на снижение энергии активации последующей химической реакции. Комплексообразование субстрата с ферментом концентрирует и взаимно ориентирует реагирующие частицы (молекулы субстратов, группировки активного центра), увеличивая число эффективных соударений. Это означает повышение предэкспоненциального множителя в уравнении Аррениуса. Образование фермент-субстратного комплекса снижает энергию активации реакции. Это происходит 114
за счет изменения распределения электронной плотности в молекуле субстрата путем ее насильственной деформации при образовании комплекса (молекула субстрата как бы становится на "дыбы"), связи растягиваются и разрываются при значительно меньшей затрате энергии. Энергия, выделяющаяся при образовании фермент-субстратного комплекса или при протекании одной из стадий сложной ферментативной реакции, не диссипируется, а используется для преодоления активационных барьеров следующих стадий ферментативной реакции. Для ферментативного катализа необходима вся белковая глобула. Нельзя "отрезать" часть белковой цепи без ущерба для активности фермента. Фермент представляет собой "дрожащую, пульсирующую" структуру, причем случайные броуновские движения доменов обеспечивают молекуле энергию, необходимую для того, чтобы произошли спонтанные перестройки между открытыми и закрытыми конформациями. Динамика белковой структуры играет решающую роль в ферментативном катализе. В одной из последних моделей ферментативного катализа, предложенной Д.С. Чернавским, источником энергии также является сорбция субстрата, которая вызывает статические напряжения в белковой части фермента. В молекуле белка как бы запасается энергия сорбции, и ее можно представить как пружину, при переходе энергии на атакуемую связь - как движение стержня. Отличие этой модели от известной под названием "дыбы" состоит в том, что запасаемая энергия расходуется не сразу и не на первой, а на любой стадии процесса. Д.С. Чернавским разработаны задачи для определения степени сжатия молекулы белка при образовании ферментсубстратного комплекса. Приток субстрата в ферментативной реакции не является постоянной величиной, эта функция носит сложный характер. Поэтому в поведении ферментативной системы возможно наличие двух или более стационарных состояний. Системы, обладающие двумя или несколькими стационарными состояниями, между которыми возможны переходы, называются триггерными. Причем переход из одного стационарного состояния в другое может совершаться различным путем в зависимости от направления изменения значения параметра. Такое свойство систем называют гистерезисом. Множественность стационарных состояний и связанные с этим триггерные и гистерезисные явления играют важную роль как средство регулирования биологических систем: внутриклеточные процессы метаболизма, транспорт веществ через мембраны. Наряду с триггерными ритмами возможны автоколебательные процессы. 115
Обнаружение биологических часов с эндогенным ритмом послужило убедительным доказательством, что источником биологических ритмов является автоколебательная система биохимической реакции внутри клетки. В ферментативном катализе важную роль могут играть кислотно-основный, ковалентный, электростатический и многофункциональный катализы. В процессе кислотно-основного катализа происходит захват или отдача протона молекулой катализатора - молекула субстрата подвергается химической атаке не одной каталитической группой, а сразу несколькими. Это связано с тем, что третичная структура белка позволяет сосредоточить в активном центре значительное число электрофильных и нуклеофильных групп, таких как имидазольная, карбоксильная SH-группы, аммонийная, фенольная. Причем взаимодействие с субстратом одной функциональной группы может быть усилено за счет других. В последние годы активный центр ферментов, действующих на полимерные субстраты (протеазы, карбогидразы), рассматривают как центр, состоящий из отдельных участков или "сайтов". Каждый "сайт" связывает мономерный остаток полимера. В состав связующего участка лизоцима входят 6 "сайтов" (Филлипс и сотр.). Проводятся работы по картированию активных центров карбогидраз. Таким образом, в настоящее время не существует единой теории, объясняющей уникальные каталитические свойства ферментов и высокую специфичность действия. Однако для небольшого числа ферментов, первичная структура и физико-химические свойства которых исследованы, был выдвинут целый ряд вполне вероятных гипотез, подтвержденных результатами экспериментов с помощью методов рентгеноструктурного анализа, электронного парамагнитного резонанса, спектроскопических методов. Общими положениями этих гипотез являются: 1) сорбция субстрата на активном центре фермента определяется соответствием между пространственной и электронно-химической структурой молекулы субстрата и химическими группировками активного центра и облегчает протекание последующей химической реакции; 2) полифункциональный характер химического взаимодействия между ферментом и сорбированным субстратом; 3) эффекты микросреды, характеристики которой в области активного центра могут существенно отличаться от физико-химических условий других участков белковой молекулы.
116
5? 5. Кинетика ферментативных реакций Кинетика ферментативного катализа - это учение о скоростях и механизмах ферментативных реакций. Кинетические исследования начинаются с изучения зависимости концентраций продуктов реакции или каких-либо промежуточных соединений от времени. При этом используются самые разнообразные биохимические и биофизические методы определения концентраций веществ. Экспериментатор для облегчения интерпретации результатов должен поддерживать в системе ряд параметров постоянными (рН, температуру, концентрацию ингибиторов). Для объяснения полученных экспериментальных данных создают кинетические схемы, которые учитывают элементарные стадии трансформации молекул в виде последовательных реакций. В идеальном случае данные кинетических исследований следует сопоставлять с данными изучения структуры фермента. Кинетика ферментативного катализа стала развиваться в начале XX в. Анри в 1902 г. впервые выдвинул гипотезу об образовании в ходе реакции фермент-субстратного комплекса. Затем это предположение было подтверждение экспериментально при работе с папаином. В 1913 г. Л.Михаэлис и сотр. опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций. Они ввели понятие максимальной скорости и показали, что зависимость скорости реакции от концентрации субстрата является равнобочной гиперболой и математически описывается уравнением Михаэлиса: v-VmaxSo/Km+So, (3.25) где v - скорость реакции; Vmax - максимальная скорость; К ш - константа Михаэлиса; So - концентрация субстрата. Особенностью кинетики ферментативных реакций является нелинейная зависимость скорости v от концентрации субстрата S. Фермент и субстрат реагируют обратимо с образованием комплекса ES, который распадается с образованием продукта и исходного фермента: ki k2 E + S ^ E S ^ E + P. k-i k-2 Если [So ] > [E ], то [ES ] - const и реакция переходит на нулевой порядок. При этом K,n+[So]'
( 3 2 6 ) (J>/0)
117
где Кщ выражается в моль/л. Для стационарной стадии реакции, когда концентрация ES становится постоянной и [So ] > [Ео ], можно определить концентрацию [ES]:
Km+lsQ]'
а скорость ферментативной реакции выразится уравнением ( 3 2 8 )
Кщ + [So ]
где кг - каталитическая константа, константа распада фермент-субстратного комплекса, и ее обозначают кКат. В случае простых механизмов ккат-Vmax/lEo]; (3.29) это будет молекулярная активность фермента. Классическое уравнение Михаэлиса стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов. Формально оно соответствует изотерме Ленгмюра и показывает, что фермент действует как гетерогенный катализатор. Решая исходное уравнение v"Vmax[So]/Km+[So] относительно Km, получаем K m « < ^ p - 1 ) • [SO]. (3.30) Значения К ш варьируют в пределах 10* - 10" моль/л. В первоначальной форме уравнение Михаэлиса неудобно для определения кинетических параметров Vmax и К ш . Так, по графику зависимости v от [S ] довольно сложно определить точное значение Vmax (рис. 3.11). Как правило, величины Vmax и К ш находят на основе линеаризации уравнения Михаэлиса. Наиболее часто приме-
1'ис. 3.11. Кривая насыщения для односубстратной ферментативной реакции (по Л. Михаэк.
118
[S]
ЛИС
У)
няется график двойных обратных координат. Для этого обе части уравнения получают в обратных величинах: ==
"77
г п 1 "*" Т7
(»5.jl)
V Vmaxl-S] Vmax и строят графики в координатах 1/v от 1/S, которые называют графиком Лайнуивера-Берка (рис. 3.12).
mH. Рис. 3.12. Линеаризация уравнения Михазлиса в координатах Лайнуивера-Бер. 1 Km
[S]
V(nax
. — - Km
Vmax/Km
Рис. 3.13. Линеаризация уравнения Михаэлиса в координатах Иди-Хофсти
v/[S] Существуют и другие методы определения кинетических констант, в частности метод Иди-Хофсти. В этом случае строят график зависимости v от v/ [S ] (рис. 3.13). Величину Кш получают путем деления длины отрезка, отсекаемого на оси ординат, на длину отрезка, отсекаемого на оси абсцисс. Известен также метод Хейнса для определения Km и Vmax (рис. 3.14). Статистический анализ показал, что методы Иди-Хофсти и Хейнса дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера-Берка. 119
[S] V
Km V m a X
\ Рис. 3.14. Линеаризация уравнения Михаэлиса в координатах Хейнса
- Km
[S]
Это связано с тем, что в графиках Иди-Хофсти и Хейнса и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат. Очень точный графический метод определения кинетических параметров - график Эйзенталя и Корниш-Боудена. На нем каждой концентрации субстрата кривой (Si) соответствует значение начальной скорости. Значение [Si ] с обратным знаком откладывают на оси абсцисс, на оси ординат - значения vi; через полученные пары точек проводят прямые, пересекающие ось ординат, и проекция общей точки пересечения на ось абсцисс равна Km, на вертикальную - Vmax (рис. 3.15). Vmax
-[S4] -[S3] -[S2] - [ S i ]
IS]
Рис. 3.15. Определение кинетических констант (Km и Vmax) по методу Корниш-Боудена
Для определения кинетических параметров ферментативных реакций применяют и метод Диксона. На оси абсцисс откладывают концентрации субстрата [S ], на оси ординат - v, точку начала коор120
динат соединяют прямыми линиями с точками на кинетической кривой, соответствующими значениям Vmax/2, Vmax/3, Vmax/4 ... Эти прямые отсекают на горизонтальной линии Vmax одинаковые отрезки, равные К ш (рис. 3.16). KJTI Km
K/n
rvn
Рис. 3.16. Определение кинетических констант (Кш и Vmax) по методу Диксона [S]
Отрезки, отсекаемые на горизонтальной линии, одинаковы по величине только в том случае, если рассчитанное значение Vmax равняется его истинному значению. Если значение Vmax меньше рассчитанного, то с увеличением [S ] получаемые значения Km монотонно убывают, если больше - возрастают. Кроме К ш методом Диксона можно определить и другие параметры ферментативной реакции. Отрезок, отсекаемый касательной при [S ] = 0 на уровне Vmax, равен концентрации фермента в системе (рис. 3.17). Если известна
Рис, 3.17. Определение концентрации фермента (Ет) и концентрации ферментсубстратного комплекса [ES] по методу Диксона 121
концентрация фермента в системе, можно проверить правильность проведения касательной. Расстояние между осью ординат и касательной дает значение [ES]. Отрезок между кривой и касательной равен концентрации свободного субстрата [S ]. Каким бы методом ни определяли или рассчитывали К ш и Vmax, существует систематическая ошибка определения, вытекающая из самого характера этих методов. Для численного определения величин Vmax и Кш целесообразно использовать методы статистической обработки результатов на ЭВМ, дающие помимо численных значений достоверные сведения о величинах статистических ошибок. Определение констант скоростей ферментативной реакции Мы рассмотрели различные графические методы определения К ш и Vmax, входящих в уравнение Михаэлиса. Но эти параметры определяются константами скорости элементарных стадий ферментативной реакции ki и k-i, кг: ki k2 E +S ^ T E S i l E + P . k-l k-2 Константу кг можно найти из уравнения кг = Vmax/[Eo]. Константы скорости ki, k-i, k-2 определить труднее. Однако они дают более фундаментальные представления о реальных процессах, происходящих в ходе ферментативной реакции. Можно узнать, например, насколько быстро субстрат взаимодействует с ферментом, и сравнить эту величину со скоростью распада фермент-субстратного комплекса. Поэтому целесообразно рассмотреть экспериментальные методы определения этих параметров. Метод Слэтера Строят график зависимости Km от v и получают прямую с наклоном 1/ki [Е] (рис. 3.18), где k-i - константа диссоциации ферментсубстратного комплекса. Данный метод применяют в особых случаях, когда можно в условиях эксперимента изменить кг (ингибитор, связывающийся с субстратом без влияния на ki). Метод Гутфройнда и Рафтона Этот метод можно применять, если имеется специальная аппаратура для изучения предстационарной кинетики. Для того чтобы понять сущность данного метода, надо провести анализ накопления продукта ферментативной реакции во времени (рис. 3.19). В мо122
Km
tga=i/k 1 [E] T Рис. 3.18. Определение константы скорости ферментативной реакции методом Слэтера
Рис. 3.19. Кривая накопления продукта в ходе реакции: 1 - предстационарное состояние; 2 - стационарное состояние; 3 - переходная фаза; 4 динамическое равновесие
мент смешения фермента с субстратом начинается предстационарная фаза продолжительностью несколько минут или миллисекунд, в течение которой и образуются фермент-субстратные комплексы. Предстационарная фаза далеко не всегда может быть выявлена без специальной регистрирующей аппаратуры. С этой целью применяют метод "остановленной струи" (Б.Чане и сотр.). В кювету спектрофотометра с автоматической регистрацией оптической плотности одномоментно добавляются растворы фермента и субстрата с помощью специальных приспособлений и далее осуществ123
ляется запись накопления продукта через микросекунды. Таким образом, с помощью спектрофотометров с автоматической регистрацией можно уловить предстационарную фазу, затем графически обработать результаты в координатах (Р-Ро) от времени t (рис. 3.20), где Р - концентрация продукта в момент времени t, Pn - исходная концентрация продукта.
о
\
t
Рис. 3.20. Определенис длительности нредстационарного участка
Во многих ферментативных реакциях в реакционную смесь добавляют некоторое количество продукта (измеренное) и в его присутствии измеряют начальную скорость реакции. Экстраполируя линейный участок (см. рис. 3.20) до пересечения с осью абсцисс, получают длительность предстационарного состояния г , причем т «1/ki [S ]. Из этого соотношения легко определить ki, a k-i можно найти расчетным методом из уравнения K m -k-i+k2/ki. (3.32) I» 6. Ингибиторный анализ Действие большинства ферментов можно подавить, или ингибировать, определенными химическими реагентами. Изучение ингибиторов ферментов позволяет получать ценную информацию о субстратной специфичности, природе функциональных групп активного центра, механизме каталитической активности ферментов. Ингибиторы ферментов служат также полезным инструментом при исследовании метаболических путей в клетке. Существуют ингибиторы двух основных типов: необратимые и обратимые. Необратимые ингибиторы химически модифицруют
124
важные для проявления активности функциональные группы молекулы фермента. Например, иодацетамид - необратмый ингибитор, взаимодействует с SH-группами цистеина (ингибитор папаина, глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы). Обратимое ингибирование бывает двух типов: конкурентное и неконкурентное. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром, по своей структуре напоминает субстрат данного фермента. Но в отличие от субстрата конкурентный ингбитор не подвергается ферментативному превращению ki
E+
I^EI. k-i
Классическим примером конкурентного ингибирования является ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. В этом случае химические структуры ингибитора и субстрата аналогичны. Ингибитор связывается с той же группой активного центра, что и субстрат, и занимает участок связывания субстрата, поэтому активность фермента уменьшается. Здесь субстрат и его аналог (ингибитор) конкурируют за участок связывания на ферменте. Конкурентное ингибирование может быть вызвано не только аналогами субстрата, но и другими реагентами, химическая структура которых отличается от субстрата, но они могут реагировать с функциональными группами активного центра. В активном центре фермента различают центр связывания и каталитический центр (способствующий превращению субстрата). При конкурентном ингибировании ингибитор может связываться с обоими участками, но влиять на группы центра связывания. Ингибитор может также взаимодействовать только со связующим участком, при этом образуется комплекс EI, который препятствует превращению субстрата. Конкурентные ингибиторы изменяют (увеличивают) К ш : Km'-Km (1+7^7).
(3.33)
где К ш - истинное значение константы Михаэлиса до влияния ингибитора; Ki - константа ингибирования. При конкурентном ингибировании Vmax не изменяется, К ш увеличивается; при линеаризации в координатах Лайнуивера-Берка можно получить серию веерно расположенных прямых (рис. 3.21): Ki
^-,
(3.34)
А./Ц
Кт-\ 125
Наклон графика, соответствующего ингибированной реакции
к,
В отсутствие ингибитора Наклон = — -
[S] Отсекаемый -1 отрезок = ; K m (1 + [I]/K,) Рис. 3.21. Графический анализ конкурентного ингибировання в координатах Лайнуивера-Берка
где величина К ш ' - константа Михаэлиса реакции в присутствии ингибитора. Конкурентное ингибирование может быть полным, неполным, а также кажущимся конкурентным. Рассмотрим полное конкурентное ингибирование. В этом случае все группы, связывающие субстрат, способны реагировать с ингибитором. Если ингибитор взят в достаточно высокой концентрации, он может полностью блокировать ферментативный процесс. При полном конкурентном ингибировании наблюдается линеаризация кинетической кривой в координатах Диксона (рис. 3.22). Кинетические кривые строят при различных концентрациях субстрата (Si и S2) и определяют константу ингибирования (отрезок, отсекаемый на оси абсцисс от нулевой точки). При обработке экспериментальных данных графически в координатах Диксона отличают полное конкурентное ингибирование от неполного конкурентного. При неполном конкурентном ингибировании ингибитор лишь частично блокирует субстратсвязывающие группы активного центра, поэтому он не способен полностью помешать присоединению субстрата. Полное и неполное конкурентное ингибирование дают одни и те же графики в обратных координатах Лайнуивера-Берка, но эти ти126
tga = Ks / V[S]K,
II]
Рис. 3.22. Графический анализ полного конкурентного ингибирования в координатах Диксона
K,[(KS + [S]) / K s ] пы ингибирования можно различить с помощью графиков в координатах Диксона. Неполное конкурентное ингибирование в координатах 1/v от [I] дает нелинейную зависимость (в виде гиперболы). Могут быть и другие варианты нелинейной зависимости в координатах Диксона. Если зависимость описывается параболой, то можно предположить, что с одной субъединицей фермента связываются две молекулы ингибитора (рис. 3.23). [S],
Рис. 3.23. Графический анализ неполного конкурентного ингибирования в координатах Диксона
[I]
Кажущееся конкурентное ингибирование имеет место в том случае, если ингибитор, связываясь с белком, изменяет его структуру (конформацию). При этом может наблюдаться ингибирование, по кинетике напоминающее конкурентное. 127
Таким образом, в некоторых случаях причиной ингибирующего эффекта является изменение нативной конформации белка, а не изменение модифицированной группы. При кажущемся конкурентном ингибировании возможно также, что ингибитор, будучи связанным с белком, препятствует активированному действию субстрата на каталитически активную конформацию. Ингибитор как бы возвращает молекулу фермента в неактивное состояние. Эти представления были подтверждены экспериментальными данными о том, что мочевина и гуанидинхлорид, которые влияют на конформацию белков, конкурентно ингибируют некоторые ферменты. При неконкурентном ингибировании ингибиторы, как правило, не имеют сходства с субстратом и могут обратимо связываться как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом (рис. 3.24). Значение К т при добавлении неконкурентного ингибитора в систему не изменяется, a Vmax - уменьшается. С теоретической точки зрения механизм неконкурентного ингибирования может быть интерпретирован различными способами:
К
Осекаемый 1 отрезок = — (1 + [IJ/K.)
I ]§]
Рис. 3.24. Графический анализ неполного неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуннсра-Берка
1. Центр связывания субстрата и каталитический центр фермента различны. Ингибитор связывается с каталитическим центром и затрудняет превращение субстрата. 2. Центр связывания и каталитический центр перекрываются, а ингибитор связывается с другими группами белка, изменяя конформацию фермента, чем затрудняется протекание ферментативной реакции. 3. Ингибитор не связывается ни с каталитическим центром, ни с центром связывания и не влияет на конформацию фермента, но он может локально изменять распределение заряда на участке поверхности белка, что затрудняет ионизацию групп, участвующих в ка128
талитическом акте реакции. Например, одновалентные ионы таким путем ингибируют фермент фумаразу (3.35)
v= или ' ~
'
I/'
[Л max
(3.36)
-1
где V'max - максимальная скорость реакции в присутствии ингибитора. Неконкурентное ингибирование, как и конкурентное, бывает трех видов: полное, неполное и кажущееся. Для полного неконкурентного ингибирования можно предположить следующую схему реакции: E + S -*ES-»E + P; E + I ^ EI; ES + I Z При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор конкурируют не за участок связывания, а за конформацию, необходимую для проявления активности фермента. При полном неконкурентном ингибировании.ингибитор и субстрат не влияют на связывание друг друга с ферментом, но комплексы фермента, содержащие ингибитор, совершенно не активны. Полное неконкурентное ингибирование в координатах Диксона линеаризуется (рис. 3.25):
Рис. 3.25. Графический анализ полного неконкурентного ингибировамия в координатах Диксона (I)
129
ES + I^TESI;
V'max =
J£±
(3.37)
При неполном неконкурентном ингибировании комплексы, содержащие ингибитор, частично сохраняют активность и могут превращать субстрат, хотя с меньшей скоростью. В этом случае неполное и полное неконкурентное ингибирование ничем не отличаются в координатах Лайнуивера-Бсрка и отличить эти два вида ингиби-
Рис. 3.26. Графический анализ неполного неконкурентного ингибирооания в координатах Диксона [I]
рования можно лишь в координатах Диксона (рис. 3.26). Получаются гиперболы, параболы в отличие от прямых линий, характерных для полного неконкурентного ингибирования. При кажущемся неконкурентном ингибировании ингибитор может связываться с субстратом (конкурирующий компонент) и с фермент-субстратным комплексом (неконкурирующий компонент). В некоторых случаях может наблюдаться ингибирование, формально аналогичное неконкурентному. Условием для этого является равенство константы диссоциации комплекса фермент-ингибитор и константы диссоциации тройного комплекса фермент-ингибитор-субстрат: Kie=KCSi. Выделяют еще один тип ингибирования - бесконкурентное. В литературе можно встретить термин антиконкурентное, или сопряженное (чаще - бесконкурентное). Ингибитор не способен присоединяться к ферменту, но он образует комплекс с фермент-субстратным комплексом. Известны три разновидности бесконкурентного ингибирования: полное, неполное и кажущееся (схемы одинаковы: При полном бесконкурентном ингибировании комплекс, содержащий ингибитор, полностью не активен. График для полного бес130
(1/VX1 + IQ/K,)
Рис. 3.27. Графический анализ полного бесконкурентного ингибирования в координатах ЛайнуивераБерка
tg a = 1/VK,
(WM1 +IVIS]) Рис. 3.28. Графический анализ полного бесконкурентного ингибирования в координатах Диксона +Ks/[S])
[I]
конкурентного ингибирования в обратных координатах Лайнуивера-Берка - серия параллельных прямых (рис. 3.27). Причем в координатах Диксона наблюдается полная линеаризация (рис. 3.28). При неполном бесконкурентном ингибировании ингибитор также может связываться с уже образовавшимся комплексом ферментсубстрат, а не со свободным ферментом. Но комплекс, содержащий ингибитор, частично активен. Скорость его разложения меньше, чем для фермент-субстратного комплекса в отсутствие ингибитора: E + I + P. Данный тип ингибирования графически в обратных координатах Лайнуивера-Берка представлен на рис. 3.29а. Графически данный тип ингибирования в координатах Диксона показан на рис. 3.296. 131
"I/Km
VIS]
-К
[I]
Рис. 3.29. Графическое представление неполного бесконкурентного типа ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка (а) и в координатах Диксона (б)
Константа ингибирования при этом определяется по уравнению (3.38): (3.38) [ESI] • Таким образом, неполное бесконкурентное ингибирование характеризуется линеаризацией в координатах Диксона, в отличие от неполного конкурентного и неконкурентного ингибирования. При кажущемся бесконкурентном ингибировании субстрат не реагирует со свободным ферментом, осуществляется реакция с уже образовавшимся комплексом фермент-ингибитор: EI+S^r[ESI J -*-Е1 + Р. Образовавшийся комплекс претерпевает внутримолекулярные перестройки или конформационныс изменения и получается неактивный комплекс, что схематично описывается следующим образом: ESI^TISE; Ki = [ESI 1/ [ISE ]. (3.39) Константа равновесия этой реакции является не константой диссоциации комплекса фермент-ингибитор, а так называемой "константой внутренней конверсии". Графически в координатах Лайнуивера-Берка данный тип ингибирования совпадает с полным бесконкурентным (см. рис. 3.27). Отличия касаются точек пересечения прямых с осями абсцисс и ординат и зависят только от Ki (от [I ] не зависят, так как свободный ингибитор не присутствует в смеси, со132
держится в виде комплекса с ферментом). Для выявления различий нужно сравнить экспериментальные данные с полным бесконкурентным ингибированием. Смешанный тип ингибирования характеризуется тем, что ингибитор действует ца участок связывания, и на каталитический центр фермента, независимо от того, перекрываются они или нет. При смешанном типе ингибирования увеличивается константа диссоциации и уменьшается Vmax. Ингибирование смешанного типа можно представить себе как совокупность конкурентного и неконкурентного ингибирования. В данном случае фактически образуется как двойной комплекс фермент-ингибитор, так и тройной комплекс ингибитор-фермент-субстрат и оба комплекса каталитически неактивны. График для ингибирования смешанного типа в координатах Лайнуивера-Берка представлен на рис. 3.30. Пересечение прямых наблюдается в левом квадранте. В координатах Диксона пересечение их наблюдается также в левом квадранте. Схематически можно представить себе процесс следующим образом: E +S ^ E S ^ E + P Е +1 ^ Г EI EI + S^T EIS ES +1 ^ ESI. Кроме рассмотренных выше, существуют и другие особые (специфические) типы ингибирования. При графическом представлении экспериментальных данных специфических типов ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка пересечение прямых может наблюдаться в правом квадранте.
В отсутствие ингибитора Рис. 3.30. Графическое представление смешанного типа ингибирования в координатах Лай1 нуивера-Берка -
*
•
*
.
133
Специфические ингибиторы способны взаимодействовать с той или иной боковой цепью белков, что приводит к снижению активности фермента. В принципе это явление позволяет изучать природу аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе. При этом после блокирования боковых цепей возможно нарушение конформации, которое может усиливаться по мере протекания реакции. Интерпретация результатов исследования при специфических типах ингибирования вызывает затруднение. Так, трудно решить однозначно, является ли наблюдаемое ингибирование кажущимся конкурентным или неполным конкурентным, т.е. достаточно сложно решить, за счет чего уменьшается скорость реакции: это прямое следствие конформационных изменений или других эффектов. Для доказательства необходима постановка дополнительных экспериментов по влиянию данного ингибитора на конформацию с привлечением новых физико-химических методов исследования. Графические представления для описанных типов ингибирования справедливы лишь в тех случаях, когда механизм реакции соответствует уравнению Михаэлиса. Особый случай ингибирования ферментативной реакции - это действие избытка субстрата или продукта. При ингибировании субстратом добавление его после оптимальной концентрации вызывает снижение каталитической активности (рис. 3.31). При этом может наблюдаться полное и неполное ингибирование. При полном субстратном ингибировании кривая симметрична; при неполном наблюдается несимметричная кривая и повышение вязкости среды, при этом имеет место диффузионное торможение. График Лайнуивера-Берка для ингибирования субстратом привс-
Рис. 3.31. Зависимость активности фермента от концентрации субстрата при ингибировании избытком субстрата 134
Рис. 3.32. График Лайнуивера-Берка для случая ингибирования избытком субстрата
ден на рис. 3.32. В этом случае нет четкой линеаризации и наблюдается кривизна, направленная вверх. При ингибировании избытком субстрата механизмы этого процесса можно представить следующим образом: а) при высокой концентрации субстрата он может связываться с другим участком, отличающимся от активного центра и может наблюдаться ингибирование; б) увеличение концентрации субстрата выше определенного предела изменяет ионную силу и ингибирует реакцию. Схематично эти процессы можно представить следующим образом: ki
ki
E + S ^ ^ E S ^ r E + P.
k-i ft ks SES В фармакологии часто используют величину [I ]50- Это концентрация ингибитора, необходимая для ингибирования реакции наполовину (табл. 3.1). Таблица 3.1 Соотношение между [1]50 и Ki для различных типов имибирования Тип ингибирования Конкурентное
[1150 (Km+[S])Ki/K m
Неконкурентное Бесконкурентное
К)
Для случаев неполного ингибирования простые соотношения отсутствуют. Для определения константы ингибирования используют график Диксона. Этот метод требует измерения скорости реакции при нескольких 135
заданных постоянных концентрациях субстрата при изменении концентрации ингибитора; в некоторых случаях он оказывается затруднительным. Поэтому используют метод Лайнуивера-Берка по координатам точек пересечения графиков с осями и тангенсами угла наклона. В табл. 3.2 приведены обозначения, которые будут использованы ниже. Таблица 3.2 Обозначения в уравнениях для расчета констант ингибирования График Лайнуивера-Берка Величина отрезка, отсекаемого на оси у на оси х е Реакция в отсутствие ингибитора а f Реакция в присутствии ингибитора Ь
Наклон
с d
Полное неконкурентное ингибирование:
к,- cm <} - с
Ж.
=
(3.40)
f -е
Полное бесконкурентное ингибирование: b-a Неполное бесконкурентное ингибирование:
(3.41) (3.42)
Смешанное ингибирование:
Ki- c j j j ...
(3.43)
С помощью приведенных уравнений можно рассчитать константу ингибирования ферментативных реакций. & 7. Влияние активаторов и других факторов микроокружения на скорость ферментативной реакции
Вещества, которые способны увеличивать скорость ферментативной реакции, называются активаторами. Если активатор обратимо связывается с ферментом, т.е. может диссоциировать, и фермент подчиняется кинетике Михаэлиса, то для исследования этого процесса можно прменить те же принципы, что и для определения типов ингибирования. Активаторы делят на конкурентные, неконкурентные, бесконкурентные, смешанные. Под воздействием активаторов может увеличиваться прочность связи фермент-субстрат (в противоположность влиянию ингибитора, который вызывает дестабилизацию связи). Активаторы ускоряют стадию распада ферментсубстратного комплекса, а также могут изменять его конформацию, 136
переводя ее в наиболее выгодную с энергетической точки зрения. Если активатор связывается со свободным ферментом, то реакция может быть представлена следующей схемой: Е I^TEA^TEAS I^IEAP,
т
P
1
где А - активатор, S и Р - субстрат и продукт реакции соответственно. Уравнение скорости реакции будет иметь вид: v-Vmax/l+Km/S(l+Ka/[A]), (3.44) где К« - константа диссоциации комплекса ЕА (константа активации). Этот тип активации относят к конкурентному типу и при обработке экспериментальных данных в обратных координатах Лайнуивера-Берка можно получить семейство прямых, которые пересекаются в точке, лежащей на оси ординат (как при конкурентном ингибировании). Если активатор связывается не со свободным ферментом, а с фермент-субстратным комплексом и активатор покидает фермент прежде, чем образуется продукт, то процесс можно представить следующей схемой: S А Е ^TESrTESA 1 П ЕРА^Г ЕР1ГЕ. А Р Иногда активатор проявляет свое действие в результате связывания не с ферментом, а с субстратом: A + S z ^ A S ; E + ASZTEAS 1ГГЕ + АР. Причем молекулы свободного субстрата могут образовывать с ферментом тупиковый комплекс. Иногда активаторы выполняют двойную функцию, они связываются как с ферментом, так и с субстратом. Поэтому истинным субстратом является активатор - субстрат, который может образовывать активный комплекс с ферментом-активатором. A AS Е ^ Г EA^TEAAS А+Р Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации свободного активатора не является гиперболической, поскольку активатор взаимодействует с ферментом дважды. Несущественные активаторы проявляют свое действие за счет 137
связи либо с ферментом, либо с субстратом (или с обоими) и отличаются от необходимых активаторов тем, что фермент обладает некоторой активностью и в их отсутствии. Существуют и такие активаторы, без которых ферментативная реакция не может протекать: Е +А : = Е А ; К А - [ Е ] [ А ] / [ Е А ] ; (3.45) ks EA + S ^ E A S — » Е А + Р; Ks - [EA][S]/[EAS]. (3.46) Ионы металлов (Mn + , Co + , Mg + ) выполняют роль активаторов многих ферментов. Так, Mg + является активатором креатинкиназы. Нередко активация ионами металлов достигает максимума только через несколько часов инкубации с ферментом. Некоторые ферменты, действующие на водонерастворимые нейтральные вещества,активируются отрицательно заряженными липофильными молекулами, например, лизофосфолипаза из Penicillum. Она эффективно действует на фосфоглицериды, но не действует на лецитин, если не добавлен фосфотидилинозит. Известен еще один тип веществ, взаимодействующих с ферментом. Это "либераторы". Их нельзя отнести ни к ингибиторам, ни к активаторам. Но они могут подавлять действие ингибиторов или активаторов путем освобождения фермента от ингибитора и активатора. Выявлены либераторы для изоцитратдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, ацетилглутаматкиназы. Эти вещества действуют так же, как ингибиторы, по конкурентному, неконкурентному и бесконкурентному механизмам. В двойных обратных координатах получают картину, соответствующую типу ингйбирования. При увеличении концентрации либератора ингибирующий эффект ингибитора уменьшается до полного снятия и фермент активируется. Можно рассматривать влияние рН на скорость ферментативной + реакции в качестве либератора. Так, ионы Н или ОН" могут и ингибировать, и активировать ферментативную реакцию. § 8. Влияние рН субстрата на скорость ферментативной реакции Большинство ферментов характеризуется определенным значением рН субстрата, при котором проявляется оптимальная активность. При других значениях рН (выше и ниже этого) способность к осуществлению реакции уменьшается (рис. 3.33). При изучении зависимости активности фермента от рН субстрата измерение скорости реакции проводят в условиях насыщения фер138
и
О
б
а РН
РН
ю
6
8
10
РН
рн
Рис. 3.33. Зависимость активности фермента от рН субстрата: а - трипсин; б - холинэстераза; в - пепсин; г - папаин
мента субстратом и при оптимальной температуре каталитической реакции. Кривая, характеризующая зависимость активности фермента от рН, может иметь колоколообразную форму (трипсин); иногда оптимальная активность фермента проявляется в диапазоне значений рН (холинютсраза). Кривая, характеризующая зависимость активности от рН, может быть представлена прямой линией, 139
если заряженные группы не играют существенной роли в катализе (папаин). Влияние рН на активность ферментов осуществляется за счет изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов ферментативной реакции. Такие изменения могут происходить в нативном ферменте, фермент-субстратном комплексе или субстрате. Показано, что рН субстрата влияет на скорость ферментативной реакции тремя способами: воздействием на величину максимальной скорости ферментативной реакции, (Vmax), на образование фермент-субстратного комплекса и на устойчивость молекулы фермента. Значение рН, соответствующее максимальной активности, не обязательно совпадает с величинами рН, характерными для нормального внутриклеточного окружения этого фермента. В клетке оно может быть выше или ниже оптимума in vitro. Это позволяет предположить, что влияние рН на активность является одним из факторов регуляции обмена веществ в клетке. Оптимальные значения Vmax наблюдаются при величинах рН от 6 до 9. Молекулы ферментов содержат большое количество ионизирующихся групп, и поэтому они могут находиться в виде целого ряда различных ионных форм. Но каталитическая активность проявляется, как правило, в узком интервале рН, в связи с чем можно предполагать, что только одна из ионных форм фермента (точнее его активного центра) каталитически активна. Причем распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и констант ионизации (рК) отдельных групп ферментсубстратного комплекса, активного центра и субстрата. Таким образом, зависимость активности фермента от рН определяется: 1) величинами рК ионизируемых групп активного центра фермента, участвующих в связывании субстрата; 2)величинами рК функциональных групп молекулы субстрата, участвующих в связывании субстрата с ферментом; 3)величинами рК функциональных групп молекулы фермента, ответственных за каталитический акт; 4)величинами рК других групп фермента, состояние ионизации которых может определять специфически активную конформацию молекул фермента. Из этих рассуждений следует, что активность фермента в значительной мере определяется ионизацией двух особых групп в активном центре (кислой и основной). Надо сказать, что в молекуле фермента много одинаковых групп, способных к ионизации, но присутствие в активном центре более одной такой группы маловероятно. Характер рН-зависимости ферментативной реакции был деталь140
но проанализирован М.Диксоном. Он предложил строить графики зависимости lg Vmax от рН и lg Km от рН (рис.3.34, 3.35). Исследуя влияние рН на максимальную скорость ферментативной реакции, можно получить информацию о тех группах фермента, ионизационное состояние которых влияет на активность каталитического центра. Величина рК, полученная из рН зависимости максимальной скорости (см. рис.3.34), характеризует рК того аминокислотного остатка, ионизация или деионизация которого необходима для превращения субстрата, причем рК' - -lgK, где К - константа диссоциации группы. По величине рК можно определить, какие аминокислотные ос19 vm
Рис. 3.34. Изучение рН-зависимостей кинетических параметров ферментативных реакций
РН Рис. 3.35. Изучение рН-зависмостей кинетических параметров ферментативных реакций 141
татки принимают непосредственное участие в катализе (существуют таблицы рК аминокислот). Не всегда можно иметь однозначные ответы на такие вопросы, так как рК для многих аминокислот совпадают и в этом случае необходимо применять дополнительные физико-химические методы исследования. По характеру зависимости константы Михаэлиса от рН можно судить о природе групп, участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса, ионизованное или деионизованное состояние которых необходимо для образования комплекса. Полученные таким образом величины рК характеризуют аминокислотную группу, которая находится в центре связывания и принимает участие в образовании комплекса. Из графика зависимости lg V/Km от рН получают величину рК для свободного фермента или субстрата. При этом применяется метод касательной к точке перегиба, анализируются в основном вогнутые участки (см. рис. 3.35). Таким образом, с помощью трех графических построений можно установить, какие величины рК отвечают группам свободного фермента, фермент-субстратного комплекса или субстрата. Примером фермента, детально изученного с точки зрения влияния рН на кинетические параметры, может служить фумараза (фермент, превращающий фумарат в малат). Были рассчитаны графическим путем рКа и рКв для свободного фермента, равные соответственно 6,2 и 6,8. Из этих величин рК следует, что в состав его активного центра входит имидазольная группа гистидина. Если зависимости lgVmax от рН субстрата и lgKm от рН совпадают, можно сделать вывод, что ионизация одних и тех же групп необходима для связывания и превращения субстрата. Часто Vmax сильно зависит от рН, a Km практически не зависит. В таких случаях следует проверить рН-зависимость не только параметров полной реакции, но и индивидуальных констант. Графический анализ зависимости активности фермента от рН субстрата имеет серьезные недостатки. В первую очередь рК свободных аминокислот может отличаться от рК аналогичных аминокислотных остатков в белке на 1-3 единицы рН. Поэтому идентификация природы группы только по величине рК весьма сомнительна, если нет других независимых данных, подтверждающих данные рН-зависимости. Данные методы обработки можно использовать и для изучения механизмов ингибирования. Так, анализируя зависимость константы диссоциации ингибитора от рН субстрата, можно сделать выводы 142
об аминокислотных группах, которые участвуют в связывании ингибитора. В некоторых случаях это может служить контролем того, является ли ингибирование истинно конкурентным или кажущимся конкурентным. В случае конкурентного ингибирования значения рК для субстрата и ингибитора должны совпадать. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ 1. Что понимают под термином "скорость химической реакции"? 2. В каких единицах выражается скорость биохимической реакции? 3. Каков физический смысл константы скорости реакции? 4. Что называется порядком реакции по веществу? 5. Может ли порядок реакции быть нулевым, дробным, отрицательным? 6. Почему молекулярность реакции не превышает трех? В чем различие понятий "порядок" и "молекулярность" реакции? 7. Какими уравнениями описываются зависимости концентраций реагирующих веществ от времени в случае необратимых реакций второго порядка? 8. Можно ли на основании определения порядка реакции судить о ее сложности? 9. Может ли молекулярность реакции быть дробной величиной? 10. Можно ли определить константу ki (см. схему реакции) параллельной необратимой реакции первого порядка, измеряя только текущие концентрации веществ АиВ? >\ В
V 11. Какова функциональная зависимость изменения концентрации реагирующих веществ со временем в последовательной реакции А - В - С? 12. Изобразите графически изменение концентрации со временем участников последовательной реакции А -» В -» С. 13. Как формулируется правило Вант-Гоффа о температурной зависимости скорости реакции? Что представляет собой температурный коэффициент скорости реакции? Каково его значение для ферментативных реакций? 14. Может ли температурный коэффициент скорости реакции быть меньше 1? Если да, то для каких реакций? Приведите примеры. 15. Каков физический смысл энергии активации? 16. Какую информацию можно получить при изучении зависимости константы скорости ферментативной реакции от температуры? 17. Можно ли энергию активации рассчитать теоретически или оценить какимлибо эмпирическим путем? 18. При изучении превращения некоторого исходного вещества в продукт, которое протекает по реакции первого порядка, были получены следующие данные: Т.К 293 298 308 313 318 323 к- Ю с ' 1,76 3,3813,524.749,8 75,8 Определите энергию активации с помощью диаграммы Арреииуса. 19. При определении каталитической актишюсти пептидазы из тонкого кишечника, гидролизующей дипептид глицилглицин по реакции: Глицилглицин + И2О—» 2 глицин, были получены следующие экспериментальные данные: 143
1.5
[S] .ммоль
2.0
3,0
4,0
8,0
16,0
Продукт 0.21 0,40 0,24 0,28 0,33 0.45 мг/мин По этим данным определите грае шческим путем величины Кщ и Ymax для этого препарата фермента. 20. Приведенные ниже данные были получены при изучении конкурентного ингибирования, вызываемого а- /?-оксиметиласпартатом в системе с /3-метиласпартазой. Ингибитор изучали в системе с наилучшим субстратом, концентрация ингибитора 5- 10 моль. у(без1) v (с добавл. I) 0,006 (166,6) 0,014(71,4) 5 1 0 (20000) 0,010 (100) 0.026 (38.4) 1 0 ' 4 (10000) 0,040 (25) 0,092 (10,8) 5 1 0 (2000) 0.086(11,6) 1,5 10" 3 (666,6) 0,136(7,3) 0,120(8,3) 2,5 1Q"3 (400) 0.150 (6.6) 5 1 0 ' 3 (200) 0,165(6) 0,142(7) В скобках - обратные значения величин v и S. Определите Кщ и Km ' (в присутствии ингибитора) Y'max и Ymax. а также К| (константу ингибирования данной ферментативной реакции). 21. Пестицид ингибирует активность данного фермента А. В лаборатории определена зависимость V or [S]. [S], моль/л
V, моль/мин 10 I, в 10 без ингибитора
моль 37 56 3,3 10" 4 4 71 5,0 • 1 0 ' 47 4 61 6,7 • 1 0 ' 88 1,65- 10" 3 129 103 3 2,21 • 10" 149 125 Определите, к какому типу ингибиторов можно отнести исследуемый пестицид. 22. В таблице (см. ниже) приведены начальные скорости катализируемой ферментом реакции при различных концентрациях субстрата: а) определите Ymax и Km методом Лайнуивера-Берка; б) определите те же величины методами Иди-Хофсти, Хейнса, Корниш-Боудена и Диксона. [S], моль 4,1 • 10~3 9.5- 1 0 ' 4 4 5,2- 10" 4 1,03-10' 5 4,9- 10" 5
1.06- 10" 5.1 • 10~ 5
144
,8
V, моль/ • мин • 10' 177 173 125 106 80 67 43
23. Какие виды конкурентного ингибирования Вам известны? 24. Каковы механизмы смешанного ингибирования? 25. Назовите методы определения константы ингибирования (Ki). 26. Определить Vmax и Кщ для ферментативной реакции по следующим данным, используя графические методы. [S], моль 2,5- 1 0 '
V, мкмоль/мин
5
4,0- 10" 1 • 10'5
28 6
40 70
2 • 10'5
95
4 - 10~ 5
112
1 • 10" 4
128
2 - 10" 3
139
1 • 10" 2
140
27. При нагревании раствора гексокиназы в течение 12 мин при 45°С фермент теряет 5 0 % активности. Но если гексокиназа инкубируется при 45 С в присутствии очень большой концентрации одного из ее субстратов (глюкозы), то она утрачивает лишь 3 % активности. Объясните, почему тепловая денатурация гексокиназы замедляется в присутствии большой концентрации субстрата. 28. Метанол очень токсичен, прием 30 мл внутрь приводит к смерти. Это обусловлено продуктом его метаболизма - формальдегидом. Метанол быстро окисляется до формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы. Одним из методов лечения при отравлении метанолом являются внутривенные вливания этанола или прием вовнутрь, причем в количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение является эффективным? СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Б е й л и Д ж . , О л л и с Д. Основы биохимической инженерии. М., 1989. Т.1 692 с. Б е р е з и н И.В., М а р т и н е к К. Основы физической химии ферментативного катализа. М., 1977. 279 с. В а р ф о л о м е е в С.Д., З а й ц е в СВ. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М., 1982. 343 с. К а н т о р Ч . , Ш и м м е л П. Биофизическая химия. М., 1984. Т.1-3. К е л е т и Т. Основы ферментативной кинетики. М., 1990. 348 с. К о р н и ш - Б о у д е н Э. Основы ферментативной кинетики. М., 1979. - 280 с. К о э н Ф. Регуляция ферментативной активности. М., 1986. 144 с. П о п о в Е.М. Структурная организация белков. М., 1989. 351 с. Р у б и н А.Б., П ы т ь е в а Н.Ф., Р и з н и ч е н к о Г.Ю. Кинетика биологических процессов. М., 1987. 299 с. Ф р и м а н т л М. Химия в действии. М., 1991. 528 с.
145
ГЛАВА 4 МЕМБРАНОЛОГИЯ Естественный ход развития современной физико-химической биологии привел к выводу о первостепенном значении биологических мембран почти во всех проявлениях жизнедеятельности клеток и организма. Рост и развитие, питание, обмен веществ и выделение, регуляция клеточной деятельности, взаимодействие клеток и организма с внешней средой, фотосинтез, зрительное восприятие, нервная деятельность, эндокринная регуляция функций, иммунные реакции и др. осуществляются при непосредственном участии разнообразных общих и специализированных мембран. Мембранные структуры лежат в основе пространственной организации бактериальной, растительной и животной клеток. Возникновение патологических состояний, заболевания, как правило, связано с изменением функционирования биологических мембран. Таким образом, знание основ мембранологии становится обязательной составной частью подготовки биолога, медика, специалиста в области растениеводства, ветеринарии, лесного хозяйства и других специалистов. § 1. Терминология Биологические мембраны (лат. membrana - оболочка, кожица, перепонка) - поверхностные структуры молекулярного размера (в среднем 8,0-12,0 им), отграничивающие клетку от внешней среды (поверхностная, наружная, плазматическая мембрана) или внутриклеточные органоиды, частицы от цитоплазмы (ядерная, митохондриальная, лизосомальная и другие мембраны), выполняющие ряд общих и специальных функций. Искусственные мембраны - мембраны, получаемые в эксперименте из смеси липидов. Модифицированные мембраны - мембраны с включением различных веществ, изменяющих их структуру и функции. Для этой цели чаще всего используют белки (антибиотики, ферменты и др.). Матрикс - цитоплазма, внутриклеточное содержимое, за исключением органоидов. Биоэлектрогенез мембран - способность мембран реализовывать процессы,приводящие к возникновению разности электрических 146
потенциалов по обе ее стороны, чаще всего между наружной средой и содержимым мембраны. Проницаемость мембран - способность мембран пропускать атомы, ионы, молекулы как в прямом, так и в обратном направлениях. Полупроницаемость мембран - способность мембран пропускать в прямом и обратном направлениях одни ионы, молекулы, частицы и не пропускать другие. Селективные мембраны - мембраны, избирательно переносящие одни ионы, молекулы и не пропускающие другие. Транспорт веществ через мембрану - перенос веществ через мембрану. Транспорт веществ активный - перенос веществ через мембрану против градиентов с затратой энергии АТФ при участии специальных молекулярных структур - приводит к возрастанию величины локальной свободной энергии за счет расходования энергии АТФ. Транспорт веществ пассивный - перенос через мембрану веществ по градиенту, главным образом за счет механизма диффузии и осмоса; идет за счет уменьшения свободной локальной энергии. Некоторые термины будут объяснены при последующем изложении. § 2. Краткая история мембранологии История учения о мембранах связана с историей цитологии и гистологии, развитием оптических и физико-химических методов исследования, так как мембраны являются не только составной частью клеток (наружная мембрана), но и практически всех ее важнейших органелл, компонентов: ядер, митохондрий, хлоропластов, эндоплазматической сети, лизосом и др. Термин "клетка" был предложен в 1665 г. изобретателем микроскопа англичанином Робертом Гуком при описании тонкого среза коркового дерева. При систематическом изучении клеток животных (эритроцитов, сперматозоидов) и. бактерий основатель научной микроскопии голландский исследователь Антони ван Левенгук описал в 1677 г. общие черты строения разнообразных клеток. Однако прошло более 150 лет, прежде чем в 1838 г. М.Шлейден, а затем немецкий анатом Т. Шван (1839) утвердили принцип клеточного строения всех живых организмов. В 1958 г. Р.Вирхов обосновал утверждение, что все живые одноклеточные и многоклеточ-
147
ные организмы (бактерии, растения, животные) возникают из клетки и имеют клеточное строение ("каждая клетка - из клетки"). Термин "мембрана" был введен более 100 лет назад для обозначения клеточной поверхности, отделяющей клетку от среды и друг от друга и для обозначения полупроницаемой оболочки, пропускающей воду и ряд растворенных в ней веществ. Первые исследования мембран были связаны с их осмотическими свойствами. Так, 1851 г. немецкий физиолог X. фон Моль исследовал плазмолиз и деплазмолиз растительных клеток и пришел к выводу, что клеточные стенки функционируют как полупроницаемые мембраны, а клетки ведут себя как осмометры. В 1855 г. ботаник К. фон Негели на интактных и поврежденных растительных клетках исследовал проницаемость пигментов в клетки через клеточную поверхность, которую назвал плазматической мембраной. Следует выделить работы немецкого ботаника и физико-химика В.Пфеффера, который работал с искусственными осадочными мембранами и провел аналогию их функционирования с клеточными мембранами. Осмотические свойства растительной клетки изучал шведский ботаник X. де Фриз. На физико-химический подход к исследованию биомембран оказали большое влияние создание теории осмотического давления Я.Вант-Гоффом и обоснование теории электролитической диссоциации С.Аррениусом. С именем немецкого физико-химика В.Оствальда связано изучение возможной роли мембран в происхождении биоэлектрических явлений. Значительный вклад в исследование механизмов проницаемости клеточных мембран внесли труды Э.Овертона и его сотрудников, которые с 1885 до 1902 г. изучили проницаемость поверхностой мембраны клеток для более чем 500 различных веществ. На основе результатов исследования ими сформулированы эмпирические законы клеточной проницаемости, ряд из которых не утратил своего значения и в настоящее время (зависимость проницаемости мембран от полярности и величины электрического заряда проникающего иона, способности проникающего вещества растворяться в липидах и проникать через мембрану, зависимость скорости проницаемости от степени диссоциации исследуемого вещества и др.). Э.Овертон считал, что мембрана состоит из липидов, образующих непрерывный слой. Для более конкретного представления о строении мембран много 148
дали количественные измерения величины поверхности эритроцитов и поверхности липидов, входящих в состав мембраны эритроцитов, проведенные Е.Гортером и Ф.Гренделем в 1925 г. Поверхность экстрагированных из эритроцита рной оболочки липидов оказалась в два раза больше, чем поверхность эритроцитов, что позволило утверждать о двухрядном расположении липидов в биомембране. Интересно, что при извлечении липидов ацетоном экстракция была неполной, но так как ими было допущено занижение площади эритроцитов, то эти две ошибки удачно скомпенсировались, что позволило сделать правильное заключение. Проведенные в 1928 г. С.Гелфаном и в 1930 г. Л.Блинксом при помощи микроэлектродов работы по измерению электрического сопротивления поверхностного слоя клеток показали их большую величину (десятки и даже сотни тысяч Ом на см ), что подтверждало липидную структуру биомембран. Однако измерения величин поверхностного натяжения показали значительно более низкие значения, чем для липидного слоя, что могло свидетельствовать о нахождении на липидном слое молекул другого слоя, снижающего поверхностное натяжение. Такими веществами могли быть белки. Это позволило Дж.Даниелли и Х.Давсону в 1935 г. предложить бутербродную модель (модель сандвича) строения биологической мембраны. Принципы этой модели в видоизмененном виде сохранены в многочисленных современных моделях строения биомембран. Согласно этой модели мембрана состоит из двух липидно-белковых слоев. Причем наружный ряд белка обращен к внешней среде или цитоплазме, а внутренние ряды липидов обращены друг к другу. При рассмотрении в поперечном направлении мембрана имела три слоя: однорядный белковый, двурядный липидный if однорядный белковый; или два слоя, состоящих из ряда липида и ряда белка каждый. Споры и работы по выяснению строения и функций мембран продолжались. Мембрану необходимо было увидеть, а для этого известные методы оптической микроскопии не годились: слишком мало было разрешение. Даже ультрафиолетовая микроскопия имела предел разрешения порядка 2000 А. Но уже в 1939 г. М.Кноль и Г.Руска предлагают электронный микроскоп, разрешающая способность которого имела десятки ангстрем. Однако не было методов подготовки клеток для электронной микроскопии, которая требовала контрастирования и обезвоживания ультратонких срезов. Но и эти трудности были преодолены. Появились серии работ Дж.Робертсо149
на, Ф.Шестранда. В 1974 г. они получили Нобелевскую премию за цикл работ по изучению биомембран при помощи электронной микроскопии. Первая Нобелевская премия в области мембранологии была получена в 1961 г. Дж. Бекеши за исследование роли слуховых базилярных мембран (область отоларингологии). Необходимо подчеркнуть, что, начиная с 1963 г., Нобелевские премии в области медицины стали присуждать работам, в определенной степени связанным с исследованиями биологических мембран. В 1963 г. А.Ходжкин, А.Хаксли и Дж.Эклс получили эту награду за серию блестящих исследований по выявлению роли биомембран в электрогенезе потенциалов покоя и потенциалов действия; в 1964 г. ФЛайнен - за изучение мембранных липидов, связанных с биоэнергетикой; в 1967 г. - Дж.Уолд - за исследование мембран зрительных клеток (область офтальмологии); в 1970 г. - Дж.Аксельрод и др. - за изучение роли лизосом в области клеточной патологии; в 1971 г. Е.Сазерленд - за работы по исследованию мембранных рецепторов гормонов и вторичных мессенджеров; в 1972 г. Дж. Эдельман и др. - за выяснение антигенных свойств клеток и клеточных мембран. Исследованиями биологических мембран занимаются не только представители таких наук, как цитология, гистология, биоорганическая химия, биохимия, биофизика, физиология, генетика, молекулярная биология. Структуру и функции биомембран и искусственных мембран широко изучают в таких областях науки, как эмбриология, онкология, технология создания искусственных медицинских материалов и искусственных органов, трансплантационная иммунология, фармакотерапия, психиатрия. Искусственные мембраны широко применяют в крупнотоннажных технологических процессах, таких как переработка нефти и получение нефтепродуктов, в лакокрасочной промышленности, при очистке сточных вод и улавливании различных примесей, при переработке сельскохозяйственной и животноводческой продукции, в медицине, ветеринарии и многих других областях. В последнее десятилетие мембранология стала претендовать на то, чтобы считаться самостоятельной наукой, возникла мембранная биология. Однако каждая наука имеет свои области исследования и применения, поэтому мы выясним роль биомембран в области биофизики, где такие разделы, как фотобиология, радиобиология, электробиология, кинетика биологических процессов и др., невозможно понять без знания структуры и функций биомембран. 150
§ 3. Виды биологических мембран Существуют различные классификации мембран в зависимости от главных признаков, положенных в их основу. По происхождению мембраны делят на естественные и искусственные; мембраны бактерий, растений, животных. Значительно чаще в биологии естественные мембраны делят по принадлежности к органоидам: наружная (цитоплазматическая), ядерная, митохондриальная, эндоплазматическая, мембрана аппарата Гольджи, лизосомальная и т.д. По выполняемой функции или участию в биологическом процессе существуют фотосинтетические, рецепторные, энергосопрягающие, возбудимые и невозбудимые биомембраны. Искусственные липидные мембраны в зависимости от включения различных белков-каналообразователей, переносчиков, ферментов подразделяются на модифицированные и ^модифицированные. Я.Кагава (1985) выделяет следующие виды биологических мембран: Поверхностные мембраны Цитоплазматические мембраны Внутриклеточные мембра- Мембраны, образующие сферические структуры ны Мембраны, образующие разветвленную сеть Мембраны внешней поверхности клетки Комплексы клеток
Опорные структуры Межклеточные структуры Клеточный пласт эпителия
Лизосомальные Митохондриальные Пероксисомальные Гладкий эндоплазматический ретикулум Шероховатый эндоплазматический ретикулум Клеточная стенка Клеточная оболочка Базальная мембрана
Таким образом, биологические мембраны отличаются большим разнообразием по своей структуре, принадлежности к различным субклеточным образованиям, выполняемым функциям. § 4. Методы выделения и изучения мембран Методы выделения мембран Для получения мембран из клеток органов и тканей используют разные методы дезинтеграции, гомогенизации и выделения различных фракций, характеризующих мембраны субклеточных органелл.
151
Для дезинтеграции, разрушения клеток и тканей используют различные методики: 1. Растирание ткани в фарфоровой ступке пестиком с добавлением мела, кварцевого песка, корунда. 2. Использование механических гомогенизаторов с вращающимися ножами, пестиком, цилиндром, в том числе и тефлоновым. 3. Ультразвуковые гомогенизаторы, где используют разную длину волны и разные интенсивности излучения для разрушения клеток в жидкой среде. 4. Метод замораживания-оттаивания, когда при замораживании кристаллики льда разрывают многочисленные мембраны и при оттаивании ткани мембраны и содержимое их поступает в жидкую среду, 5. Метод осмотического шока; применим к таким клеткам, как эритроциты. Помещение эритроцитов в дистиллированную воду или сильно гипотонические растворы приводит к поступлению воды в эритроциты, их растяжению, образованию дефектов в мембране, к ее разрыву, выходу гемоглобина из эритроцитов, образованию "теней" эритроцитов, которые представляют собой мембраны, так как все клетки животных не имеют оболочек, а покрыты только мембраной, поэтому их иногда называют голыми. Для выделения различных фракций мембран в основном используют метод ступенчатого, последовательного центрифугирования или центрифугирования в градиенте плотности раствора сахарозы, фикола или хлористого лития. Последовательность и этапы выделения некоторых видов биологических мембран представлены на рис. 4.1. Дифференциальное центрифугирование является, очевидно, самым распространенным методом выделения мембран субклеточных органелл из гомогенатов тканей. Частицы и фрагменты, первоначально равномерно распределенные по объему центрифужной пробирки, оседают со скоростью, зависящей от их размера, плотности и формы. Характеристика клеточных компонентов печени крыс представлена в табл. 4.1. Из данных табл. 4.1 следует, что центрифугирование при малых ускорениях приводит к оседанию только крупных частиц (неразрушенных клеток, ядер). При увеличении относительного центробежного ускорения до 10000 g оседают преимущественно митохондрии, а при 100000 g в осадок выпадают микросомальные фракции и везикулы, в супернатанте (надосадочной жидкости) остаются только во152
Клетки печени I
Гомогенизация в сахарозе
Гомогенат | Ядерная 1м моль NaHCO,
Центрифугирование 3900 g, 45 мин
Супернатант
ракция Обработка ультразвуком в растворе сахарозы, цитрата натрия
Ядерные мембраны (уд. плотность 1,21)
Центрифугирование 600 в, 10 мин
Центрифугирование 8500 д. 10 мин
Аппарат Гольджи, фагосомы и др.
Нуклеоплазма
Митохондриальная фракция
Супернатант
Цен трифуг ирование в градиенте плотности сахарозы, электрофорез
Центрифугирование 100000 д, X мин
П
-Фракция микросом
Супернатант
Центрифугирование е градиенте плотности сахарозы
Цен
Цитоллазматические мембраны (уд. плотность 1,17)
Центрифугирование в градиенте плотности (сахарозы 2000 д, 30 мин)
Рибосомы
Лизосомы
|рование д, 10 ч
Супернатант
П
Г
Пероксисомы Митохондрии Обработка ультразвуком, осмотическим шоком
п
Внутренняя мембрана
мембрана
• - выделяемые фракции мембраны Рис. 4 . 1 . Схема выделения из гомогената печени крысы субклеточных мембранных фракций
дорастворимые белки. Последовательное центрифугирование с увеличением ступенчатого относительного центробежного ускорения и времени центрифугирования получило название метода дифференциального центрифугирования субклеточных фракций (см. рис. 4.1). Таблица 4.1 Клеточные компоненты печени крыс Фракции
Целые клетки Ядра Аппарат Гольджи
Диаметр частиц,
ускорение,
Режим осаждения время,
ная
мкм
S
мин
15-20 3-12
600 600
15 15
плотность, г/смЭ 1,20 1,32
1-3
2000
0,05-0,5
145000 10000
1,06-1,23 1,15-1,19 1,07-1.19
Лизосомы Шероховатые микросомы
0,7-1.1 0,4-0,8 0,05-0.2
Гладкие микросомы
0.05-0,3
145000
20 15 25 25 25 25
3-20 0.05-0,3
1500 145000
15 30
крупные фрагменты везикулы Митохондрии
10000 145000
Равновес-
1,12-1,16 1,06-1,16 1,17-1.21 1,12-1,16 1,13-1,25
Плазматические мембраны крупные фрагменты везикулы
Анализ табл. 4.1 показывает, что даже при повторных центрифугированиях получаемые фракции будут содержать кроме основной фракции различные примеси мембран других частиц. Достижима только определенная степень чистоты фракций. Скорость осаждения частиц будет прямо пропорциональна величине центробежного ускорения, разности между их плотностью и плотностью среды. Фрагменты разрушенных клеточных мембран могут замыкаться в пузырьки (микросомы) разного диаметра - от 0,3 до 3 мкм. Фракция микросом обычно состоит из мембран, принадлежащих к различным субклеточным органеллам и образованиям. Основные методы изучения биологических мембран Поскольку биомембраны имеют разнообразное строение даже в пределах одной клетки, а отдельные участки одной и той же мембраны могут иметь различное строение (мозаичность структуры) и выполнять разнообразные функции, то и методы их изучения отличаются большим разнообразием. Условно можно выделить несколь154
ко групп методов исследования структуры и функций биомембран, базирующихся на конечных целях, которые ставят отдельные биологические науки и дисциплины: биохимические; физиологические; генетические; иммунологические; биофизические. Кратко остановимся на характеристике первых четырех групп и более подробно рассмотрим биофизические методы изучения биомембран. 1. Биохимические методы исследования биомембран позволяют выделять в максимально чистом виде отдельные компоненты различных мембран, изучать их физико-химические свойства, способность образовывать надмолекулярные лабильные комплексы, определять время "жизни" отдельных компонентов, путей биосинтеза и распада, влияние на метаболизм различных физико-химических факторов как внутренней, так и внешней среды: ионов, температуры и т.д. 2. Физиологические методы предусматривают исследование различных функций как на естественных, так>и на искусственных мембранах или в модельных опытах на пластинчатых тканях (коже, передней брюшной стенке лягушки, стенке мочевого пузыря мелких животных, стенке кишечника животных, пластинке зеленого листа и др.). Физиологическими методами изучают проницаемость мембран для атомов, ионов, различных молекул; процессы, протекающие в биомембранах при возбуждении, торможении, проведении нервного импульса; поступление, распределение и выведение ионов и молекул из клеток и тканей, влияние физико-химических факторов на состояние мембран и изменение физиологических функций клеток. 3. Генетические методы, основанные на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков, позволяют решать вопросы о роли данных молекул белка в надмолекулярной организации, изменении функций мембран, их самоорганизации. 4. Иммунологические методы предусматривают выделение определенных мембран, использование их как антигенов с целью последующего применения выработанных антигенов для идентификации специфических участков мембран, распределения антигенов на изучаемых участках мембраны, выделения комплексов антиген-антитело с последующим разделением на антиген и антитело. Рассмотрим биофизические методы исследования биологических мембран бактерий, клеток растений, животных, выполняющих различные функции. 155
§ 5. Биофизические методы исследования биологических мембран К биофизическим подходам для выяснения структуры и функций биологических мембран относят ряд высокоинформативных, хорошо зарекомендовавших себя методов, позволяющих получать достоверные сведения о состоянии молекул, молекулярных комплексов, целой мембраны и изменении их физико-химических параметров в зависимости от функционального состояния мембран. Эти методы используют также для решения биохимических, физиологических, цитологических вопросов. К биофизическим методам относят: - метод электронной микроскопии; - метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и использования спиновых меток; - метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР); - метод флуоресцентной спектроскопии (и использования флуоресцентных зондов); - метод определения дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма; - метод дифференциальной сканирующей калориметрии; - метод рентгеновского рассеяния нейтронов; - метод моделирования; - метод искусственных мембран; - метод радиоактивных изотопов; - метод обнаружения фазовых переходов в мембранах. § 5а. Метод электронной микроскопии Предел разрешения оптического микроскопа в видимой области света составляет 2000 А , а это не позволяет увидеть биологические о
мембраны, толщина которых составляет в среднем 80-120 А . Электронная микроскопия доводит разрешение до 5-10 А , на уровне размера диаметра атома урана. Электронный микроскоп в реальных условиях более чем в 500 раз превосходит разрешающую способность оптического микроскопа. Ограничения разрешающей способности светового микроскопа зависят согласно доказательствам Эрнста Аббе от волновой природы света: Д d : , п sin a где d - разрешающая способность микроскопа - то минимальное расстояние между двумя точками, когда глаз воспринимает ихъ как раздельные; Д - длина волны источника света; п - показатель пре156
ломления среды, в которой находится объект; а - апертурный угол, под которым виден радиус объектива из точки размещения объекта. Световой микроскоп с хорошим иммерсионным объективом обеспео
чивает разрешающую способность около 0,2 мкм (2000 А ). Для невооруженного глаза человека разрешающая способность равна на расстоянии 25 см от глаза 0,2 мм; таким образом, полезное увеличение составляет 1000 раз. В ультрафиолетовом микроскопе с кварцевой оптикой разрешающая способность увеличивалась примерно в два раза и составляла о
около 1000 А , что явно недостаточно для исследования биологических мембран. Необходимы были принципиально иные источники излучения с более короткой длиной волны. О величинах различных биологических объектов и возможных методах их выявления позволяет судить рис. 4.2. 1 ММ
Предел видимости невооруженного ~ глаза ._1
100 мк
Крупные клетки 10 мк Эритроциты
Область световой микроскопии 1 мк
Бактерии
— 1000 А Вирусы
Область электронной микроскопии Методы структурного анализа
100 А —=
10 А "I
Белки Аминокислоты Атомы
Рис. 4.2. Полулогарифмическая схема величин различных объектов и возможные методы их выявления
157
В 1924 г. Л. де Бройль теоретически предсказал периодичность движения электрона, которому можно приписать определенную длину волны: A =V150/K , где V - энергия электрона в электрон-вольтах, измеряемая разностью потенциалов между раскаленной нитью катода и сеткой анода в электронной пушке. В этом случае при подаче напряжения в 60 000В движущиеся электроны будут иметь А-V150/60000"- 0,05 А , что в 100 000 раз меньше длины волны видимого света. В 1927 г. справедливость теории Л. де Бройля подтвердили работы Г.П.Томсона и Девидсона и исследования Джермера. Была измерена длина волны потока электронов и выявлено ее соответствие вычислениям Л. де Бройля. Бушем разработана теория электронных линз. Было установлено, что пучок электронов в магнитном или электрическом поле может сходиться в другой точке оси симметрии или расходиться из другой точки оси. Для магитных линз можно определить фокусное расстояние, которое можно менять за счет изменений силы проходящего в линзах тока. Буш обосновал возможность создания электронной оптики. Работой ряда исследователей была показана полная аналогия между электронной и световой оптикой и возможность создания электронного микроскопа. Первый электронный микроскоп был сконструирован в 1932 г. М.Кноллем и Г.Руска. Электронные микроскопы с разрешающей способностью 20 А появились в продаже уже в 1945 г. Дж. Гильер довел разрешающую способность их до 10 А . Изображение в электронном микроскопе монохроматично и интенсивность освещенности отдельных участков зависит только от способности разных участков объекта рассеивать электроны. Для изучения биомембран используют различные виды электронной микроскопии: - электронная микроскопия светлого поля (наиболее распространенная). Светлыми выглядят участки, мало рассеивающие электроны; - электронная микроскопия темного поля. Светлыми выглядят участки,сильно рассеивающие электроны, так как в конечном изображении принимают участие рассеянные электроны; - панорамное электронное микроскопирование; - сканирующая электронная микроскопия. Для проведения электронной микроскопии в мембранологии при158
меняют ряд методов приготовления образцов и получения контрастного изображения: - электронная микроскопия срезов биологической ткани; - методика замораживания-скалывания; - методика травления; - методика приготовления реплик. Во всех случаях к препарату для электронной микроскопии предъявляют три основных требования: - препарат должен быть достаточно тонким; - разные участки препарата должны в разной степени рассеивать электроны; - исследуемые объекты должны быть устойчивыми по отношению к бомбардировке электронами и выдерживать вакуумное разрежение до 10~4 - 10 мм рт. ст. Из этих требований следует, что изучать живые организмы и клетки живых организмов в физиологических условиях невозможно. При проведении электронной микроскопии биологических объектов всегда имеют дело с обезвоженными клетками, обработанными солями или соединениями тяжелых металлов. Практически максимально допустимая толщина среза составляет около 0,1 мкм о
©
о
(1000 А ) для получения разрешения около 100 А и от 50 до 100 А при разрешении в 10 А . Так как толщина большинства клеток животных от 1 до 50 мкм, то кусочки ткани после обезвоживания заливают в эпоксидную смолу, желатин, метилметакрилат. После полимеризации блок режут при помощи ультрамикротома со стеклянными или алмазными ножами на слои толщиной от 500 до 1000 А . Эти срезы контрастируют ("окрашивают") растворами солей молибдена, марганца, вольфрама, свинца, урана, четырехокиси осмия. Атомы тяжелых металлов реагируют в основном с молекулами белка: создают в клетках участки с высокой электронной плотностью. Для получения истинной картины исследуют большое число срезов - методика получения серийных срезов с их анализом в порядке получения (на 1 мм ткани до 100000 срезов). Методика замораживания-скалывания состоит в быстром замораживании образца, затем при помощи ультрамикротома, нож которрого не срезает, а скалывает образец по липидному бислою, образованному слабыми взаимодействиями. На образованную поверхность напыляют слой золота, серебра, углерода и при помощи сканирующего электронного микроскопа производят анализ образованной поверхности. 159
При замораживании-травлении замороженный образец высушивают в вакууме. Методика приготовления реплик заключается в покрытии исследуемого образца путем напыления в вакууме золотом, платиной, углеродом и получении "слепка" с поверхности объекта. Для придания жесткости реплике ее укрепляют слоем углерода, наносимым напылением в вакууме. Контур реплики повторяет поверхность объекта. Метод реплик получил применение для исследования биомембран, поверхностей вирусов и кристаллов белков, которые мало устойчивы в вакууме при действии пучка электронов. В большинстве случаев биологические объекты (белки, нуклеиновые кислоты) помещают на пленку-подложку из углерода или пластика (формвара, парлодиона), прозрачную для электронного о
пучка. Пленка толщиной до 1000 А размещается на медном дискесетке с отверстиями приблизительно 75 мкм. Для проведения электронно-микроскопического исследования макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, их комплексов), вирусов, фагов, рибосом используют метод оттенения при малом угле напыления углеродом, золотом, платиной. Электронная микроскопия позволила установить молекулярную структуру разнообразных и многочисленных биологических мембран и положила конец спорам об их наличии, существовании. С ее помощью проведена реконструкция субклеточных структур, органелл, клеточных контактов, мембранных рецепторов. Электронная микроскопия помогла понять механизм выполнения ряда функций мембран. Метод электронной микроскопии используют для идентификации чистоты фракции ядерных, митохондриальных мембран, везикул шероховатого эндоплазматического ретикулума, содержащего на своей поверхности рибосомы. Сочетание метода электронной микроскопии с методами гистохимии позволяет изучить распределение биологически важных макромолекул в различных компартментах клетки. Метод электронной микроскопии позволяет ответить на многочисленные вопросы о распространении мембранных структур, их взаимоотношениях, особенностях структуры мембран различных органелл и субклеточных частиц и образований. Но это статика клетки при определенных подготовительных процессах, полностью исключающих возможность изучения динамики и механизмов функционирования мембранных машин. Подготовительные процессы 160
вносят значительные артефакты, которые необходимо учитывать при анализе электронно-микроскопической картины. Однако в одной клетке одномоментно могут протекать до 1000 разнообразных ферментативных реакций, различных внутримолекулярных переходов (спираль-клубок), межмолекулярных (ассоциация-диссоциация) взаимодействий. О временных характеристиках ряда физических и химических реакций и методов их исследования дает представление рис. 4.3. Переходы типа "спираль-клубок" Перераспределение электронов в молекулах Фермент-субстратный комплекс Образование Распад Диссоциация Кислотно-основной Ассоциация катализ | 1 гГидратация и гидролиз Поверхностная \диффузия
Перенос протонов, диссоциация Перенос электронов
Вращательная диффузия в растворе в мембране
Н
10" КГ" Спектроскопические методы
1 h
-с
10"
10*
1
Температурный • скачок | Рассеяние лазерного света Ядерный магнитный резонанс
Ручн|ые методы
Деполяризация флуоресценции
I
1
ЭПР-слектроскопия Ультразвуковое поглощение
I
1
Концентрационный скачок
I
•
(метод остановленного потока) Рис. 4.3. Временные характеристики некоторых физических и химических реакций (А) и методов их исследования (Б)
Не существует универсального метода в биофизике, как и в биологии. Каждый метод имеет свои достоинства, ограничения и недо161
статки. Поэтому, как правило, для решения поставленной задачи применяют несколько методов, дополняющих друг друга. Для исследования ряда характеристик и состояния биомембран широко используют метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). § 5б. Метод электронного парамагнитного резонанса Интерес в мембранологии к методу ЭПР значительно возрос после разработки метода спиновых меток, когда стабильный малореакционный свободный радикал присоединяют к молекуле биополимера известной структуры и функции. Синтез стабильных нитроксильных радикалов в нашей стране был осуществлен Э.Г.Розанцевым: на их основе были созданы ЭПР-зонды (спиновые зонды), которые были использованы для характеристики микровязкости мембран, для определения степени упорядоченности микроокружения зонда, его поступательной и вращательной подвижности, степени диффузии меченых молекул при изменении температуры, концентрации липидов, воздействии различными ионами металлов. Молекулярная подвижность зондов находилась в пределах 10" - 10" с. Спин-метку можно вводить в разнообразные соединения с определенной предсказуемой локализацией в биомембране, что разрешает количественно оценить подвижность и взаимодействие между собой различных компонентов мембраны. В жирных кислотах нитроксильную группировку можно вводить на разном расстоянии от полярной карбоксильной СООН-группы, что позволяет тестировать биомембраны на разной глубине в поперечном направлении. Метод ЭПР с применением спиновых зондов позволил измерить плотность упаковки молекул в липидном бислое, подвижность жирнокислотных цепей на разной глубине мембраны. Однако этот метод оказался малоинформативным при изучении функционирования мембранных ферментов из-за различия в скоростях между ферментативными реакциями и скоростями молекулярной подвижности. Кроме того, ряд экспериментальных результатов можно объяснить, исходя из разных точек зрения. Вот почему данные, полученные при помощи метода ЭПР, для однозначной трактовки нуждаются в дополнительной проверке другими методами. Принципы методов ЭПР, ЯМР и ряда других и области их применения в биофизике изложены в главе 6. § 5в. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) В мембранологии метод ЯМР позволил сопоставить подвижность 162
различных жирнокислотных цепей в липидном бислое. Увеличение подвижности звеньев в цепи растет по направлению от эфирной связи к метальному концу. При исследовании белков в мембране метод ЯМР рассматривают как не модифицирующий ее, позволяющий получать сведения об интактной мембране наряду с другими немодифицирующими методами, к которым относят метод сканирующей микрокалориметрии и метод кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения. § 5г. Метод флуоресцентной спектроскопии Методы флуоресцентной спектроскопии в мембранологии используют для получения информации о подвижности молекул, входящих в состав мембран (латеральной диффузии в пределах одного слоя; флип-флоп переходов - перемещения молекул из одного слоя в другой; для определения локализации молекулы в мембране от поверхности мембраны; для характеристики измерения микровязкости; для определения скорости проникновения ряда веществ через мембрану; для исследования трансформации энергии в энергосопрягающих мембранах; для исследования влияния ряда блокаторов электронно-транспортной цепи; для изучения ряда ферментативных реакций, в осуществлении которых принимает участие фермент-мембраносвязанный комплекс. Изучение интенсивности флуоресценции при введении флуоресцентных зондов в биомембраны и клетки позволяет выяснить изменение относительной микровязкости мембран в зависимости от температуры, действия многовалентных катионов, неполярных растворителей, концентрации ионов водорода и других факторов. Флуоресцентные зонды применяют для определения степени связывания хромофора с мембранными компонентами. Перемещение зонда из неполярной области мембраны в полярную будет сопровождаться снижением интенсивности флуоресценции со сдвигом максимума в более длинноволновую область. В последнее десятилетие стали применять флуоресцентные зонды, чувствительные к изменению рН-среды (производные акридина) , что позволило изучать изменение концентрации ионов водорода на разных участках клетки при протекании ряда физиологических процессов (дыхания, фотосинтеза и др.) и анализировать проникновение веществ через мембрану, метаболизм ряда веществ. ДЛоуренс в 1952 г. впервые применил флуоресцентный зонд 1-анилин-8-нафталин-сульфонат (АНС) для исследования связывания зонда с компонентами мембраны. Связывание заряженных мо163
лекул зонда с мембраной зависит от плотности электрических зарядов в ней и при правильно подобранной концентрации интенсивность флуоресценции будет целиком зависеть от флуоресценции связанного с мембраной зонда. Это позволяет определять количество заряженных групп в мембране и величину трансмембранного потенциала. Определяя степень поляризации флуоресценции и используя флуорофоры с высоким квантовым выходом, можно изучать характеристики белок-липидных взаимодействий. Для этих целей применяют дансилхлорид, взаимодействующий с ЫНг-группами веществ. В последнее время стали использовать метод флеш-фотолиза (см. главу 6), дающий возможность измерять при помощи лазерного излучения высокой интенсивности поляризацию флуоресценции. Это позволило рассчитать время вращательной корреляции белковых молекул (табл. 4.2). Таблица 4.2 Время вращательной корреляции некоторых белков (при температуре 2УС). Белок Апомиоглобин Лактоглобулин (мономер) Трипсин а-Лактоглобулин (димер) Сывороточный глобулин Макроглобулин Са-АТФаза (мембраносвязанная) То же в присутствии АТФ То же при повышении температуры до
Молекулярная масса, к Да 17 18 25 36
8,3 нс 8,5 нс 12,9 нс 20,3 не
66 900 100 100 100
41,7 нс 80 нс 62 нс 30 нс 20 нс
тер
§ 5д. Метод определения дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма Изучение спектров кругового дихроизма позволяет судить о характере вторичной структуры мембранных белков. Однако при объяснении порученных данных возникают осложнения, которые зависят от негомогенности мембранных суспензий, трудности выделения и очистки мембранных фракций белков. Определение дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма позволяет решить вопрос о действии ряда внешних факторов на степень спирализации участков белковх молекул и оценить 164
состояния конформации белковых молекул как результат взаимодействия молекул мембранных белков друг с другом. § 5е. Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии Изменение фазового состояния системы, в частности биомембраны, при постоянном давлении обычно сопровождается поглощением или выделением тепла, что рассматривают как молекулярную реорганизацию анализируемой системы. В биомембранах можно выявлять переход от жидкокристаллического состояния в твердокристаллическое и обратно, например, при понижении или повышении температуры образца. Современные микрокалориметры позволяют в образцах массой в несколько миллиграммов измерять энергетическую ценность фазовых переходов в водно-липидных дисперсиях, искусственных бислойных мембранах, мицеллах, везикулах из известных фосфолипидов. Это дало возможность колилественно характеризовать организацию бислоев липидов, искусственных мембран. Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии было установлено, что фазовые переходы в бислоях индивидуальных фосфолипидов происходят в интервале долей градуса. В то же время для смеси фосфолипидов критическая температура (ТКр) фазового перехода расширяется до 1-2 °С. Ряд фосфолипидов слабо взаимодействует и не смешивается друг с другом. Обнаружено это у фосфолипидов, у которых углеродные цепи по длине не совпадают на четыре и более атомов углерода. Не смешиваются глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды: на термограммах отмечают два раздельных пика, свидетельствующих о наличии двух фазовых переходов. Но если к такой пробе добавить холестерин, то образуется одна фаза со смешанными свойствами. Если фосфолипиды хорошо смешиваются, то температура фазового перехода служит характеристикой такой системы. Чем длиннее жирнокислотная цепь фосфолипида, чем меньше содержится в ней непредельных жирнокислотных остатков, тем выше температура фазового перехода. Липидные системы дают петлю гистерезиса при определении Ткр фазового перехода при их нагревании и охлаждении. При нагревании ТКр сдвигается в сторону более высокой температуры, что объясняется образованием ряда слабых связей, приводящих к кооперативности и возникновению "памяти липидов", причиной которых может быть и разная энергия гидратации и дегидратации линидного бислоя при нагревании и охлаждении. 165
Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии оказался наиболее информативным и ценным для искусственных мембран определенного липидного состава. Наличие холестерина в естественных мамбранах затрудняет обнаружение четких изменений теплопродукции, характерных для фазовых переходов. Внутриклеточные мембраны содержат значительное количество непредельных жирнокислотных радикалов. Они остаются "жидкими" в широком диапазоне температур (5 - 60 °С), что значительно снижает область применения этого метода для изучения нативных мембран клетки. § 5ж. Метод радиоактивных меток Применение метода радиоактивных меток в мембранологии диктуется рядом преимуществ перед известными другими. Это прежде всего: - высокая чувствительность метода, позволяющая определять ничтожно малые концентрации веществ (10~ 1 4 - 10" моль/л), хотя диапазон измерения довольно широк - от 10 " 1 4 до 10 " 6 моль/л, тогда как химические методы имеют предел 10 " 7 моль/л; - возможность работать с малыми количествами вещества, измеряемыми микрограммами; - возможность исследования динамики ряда процессов (проникновение молекул вещества, ионов, атомов) через мембрану, выход ионов через каналы мембраны и др.; - возможность следить за превращением меченных двойной меткой молекул в процессе метаболизма; - возможность количественных измерений процессов и реакций, протекающих в ограниченном числе клеток. Радиоактивный распад атомных ядер является самопроизвольным процессом, зависящим от нескомпенсиронности ядерных сил, протекает в естественных условиях с постоянной скоростью для данного вида изотопа. Из нескольких типов ядерных реакций наибольшее значение для биологических исследований имеют радиоизотопы, испускающие /?-частицы (электроны) и у-лучи (фотоны). В любой момент времени число атомов радиоактивного вещества, распадающихся за единицу времени, пропорционально общему числу имеющихся радиоактивных атомов: dN/df^No, где-dN - число атомов, распадающихся за отрезок времени dt; А -постоянная радиоактивного распада; No - число радиоактивных атомов при t - 0. 166
Легко определить число оставшихся радиоактивных атомов Nt через время t: Обычно постоянную распада X выражают через период полураспада *1/г - время, в течение которого скорость распада (радиоактивность) самопроизвольно уменьшится в два раза и составит половину от исходной: г-1п2/А=0,693Д. Через время, равное двум периодам полураспада, остается одна четверть исходной радиоактивности, трем периодам полураспада одна восьмая, т.д. Если учесть, что биологические объекты, будучи предметами химической эволюции, построены в основном из легких элементов, то набор радиоактивных изотопов, применяемых в биологических исследованиях, весьма ограничен, о чем дает представление табл. 4.3. Таблица 4.3 Характеристика используемых в биологии радиоактивных изотопов Изотоп 3
Н
Ы
С
Испускаемая
Емакс. МэВ 0.018
Период полураспада 12,3 года
0,155
5568 лет
1,39
14.974 ч
24
Na
fi P P
24
Na
У
1.7; 2.75
14,974 ч
P P P P
1,7
14,2 дня
35 40
s
K
45
Ca 131j
131
I
a
У
0,167
87 дней
1,33; 1,46
1,25- 109 лет
0,254
164 дня
0,335; 0,608
8,1 дня
0,284; 0,364; 0.637
Принцип метода радиоактивных меток состоит в подборе соответствующего иона, молекулы вещества, введении препарата в среду, клетку, организм и регистрации скорости его поступления, распределения в объеме, выведении радиоактивной метки. Трактовка полученных результатов базируется на положении, что радиоактивный ион, меченая молекула ведут себя идентично стабильному изотопу, входящему в природное соединение или органическое вещество, ион. Изотопные эффекты, связанные с наличием радиоактивности, отсутствуют или существенно не влияют на протекание биохимических реакций, биологических процессов. 167
Для количественной регистрации радиоактивного распада используют ряд методик: - методики, основанные на ионизации газов в детекторах (счетчики Гейгера-Мюллера), в том числе и торцевого счетчика для подсчета а-распадов; - методики, основанные на измерении радиоактивности жидкими сцинтилляционными счетчиками. Энергия ионизирующих частиц или гамма-квантов поглощается растворителем, с добавлением флуоресцирующего вещества (флуоресцента), которое высвечивает фотоны от возбужденных молекул. Фотоны, испускаемые флуоресцентом, регистрируются фотоумножителем. Иногда комбинируют два флуоресцента, второй флуоресцент улавливает фотоны от первого, испускает более длинноволновые фотоны, к которым чувствителен данный фотоумножитель. Основная часть энергии ионизирующего излучения поглощается молекулами растворителя, мигрирует на флуоресцент, который работает как преобразователь энергии. Энергия излучаемой частицы превращается в пучок фотонов за интервал времени 10~9 с. Эффективность регистрации радиоактивного распада атомного ядра сцинтилляционными счетчиками будеть зависеть от способности молекулы растворителя поглощать энергию и переходить в возбужденное состояние и передавать энергию на первичный флуоресцент; от числа фотонов, испускаемых первичным и вторичным флуоресцентами; от геометрии трубки умножителя; от цикла преобразования заряда на фотоумножителе в напряжение; от соотношения сигнал/шум фотоумножителя. В мембранологии метод радиоактивных меток в основном используют для решения проблем мембранной проницаемости для ионов, молекул, изучения кинетики проницаемости мембран в зависимости от меняющихся условий и действия ряда факторов (изменения концентрации ионов и веществ, разные значения рН среды, изменения степени диссоциации молекул и др.). При помощи метода радиоактивных изотопов было определено количество ионов и величины ионных потоков через мембрану при развитии потенциала возбуждения и в состоянии покоя нервного волокна. Исследована кинетика превращений, протекающих при участии мембранзависимых ферментов. Изучены локальные ферментативные реакции, протекающие в различных компартментах клеток, скорости распределения ряда веществ в компартментах и вовлечение их в процесс метаболизма, выведение продуктов распада из клеток. 168
§ 5з. Метод моделирования мембран Моделирование - это исследование каких-либо явлений, процессов, систем путем построения и изучения их моделей, это одна из категорий научного познания. На моделировании базируется любой научный метод, который можно разделить на построение теоретических (идеальных) моделей и вещественных предметных (экспериментальных). Модель в широком смысле понимания - любой аналог мысленный (идеальный) или предметный, вещественный (реальный) какого-либо объекта, процесса, явления, максимально упрощенный, с сохранением основных параметров, свойств, используемый в качестве заместителя оригинала. В мембранологии метод моделирования использовали еще на ранних этапах изучения, когда только постулировали наличие мембраны на поверхности клеток (наружная мембрана). Представление о клетках как осмометрах, использование кожи лягушки, стенки мочевого пузыря как полупроницаемой мембраны - это примеры моделирования в мембранологии. Мембрану рассматривали как монослой липидов на водной поверхности. В 1962 г. П.Мюллер и Д.Рудин разработали способ получения больших двуслойных мембран (диаметром до 1 мм), используя тефлоновую пластинку, разделяющую две водные фазы. На отверстие кисточкой или петлей наносили смесь фосфолипидов. Происходило самопроизвольное формирование бислойной мембраны, на которой можно было изучать ряд свойств и параметров (электрический пробой, модификацию мембраны белками, ионную проницаемость и др.). Примером моделирования биомембраны являются липосомы замкнутые мембранные пузырьки, содержащие водную фазу внутри и находящиеся в водной среде. Липосомы формируют из липида (например, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина) в водной среде путем обработки ультразвуком, быстрого смешения раствора липида в этаноле с водой или пропуская через тонкую иглу раствор липида. Липосомы имеют почти правильную сферическую форму диаметром около 50 нм. Метод моделирования, получения искусственных мембран много дал для количественных измерений, изучения электрических параметров и свойств, исследования мембранной проницаемости для ионов, атомов, молекул, изучения биоэлектрогенеза возбудимых мембран, исследования воздействия факторов внешней среды (температуры, ионной силы, концентрации различных катионов, в том числе иона водорода, и других факторов). 169
$ 5и. Метод рентгеновского рассеяния нейтронов В мембранологии метод рассеяния нейтронов под малыми углами позволяет определить толщину бислоя и расстояние между слоями. Изменение рассеивания нейтронов под большими углами характеризует упаковку молекул в кристаллографической ячейке. Этим методом можно определить переходы между гексагональной, кубической, ламеллярной, аморфной и т.д. структурами, фазовые переходы от жидкокристаллического к твердокристаллическому состоянию. Метод сложен, применяется для анализа относительно простых систем, имеющих кристаллографическую структуру. Этот метод имеет преимущество перед методом сканирующей микрокалориметрии, так как он не только характеризует фазовые переходы, но и позволяет определить упаковку бислоя до и после температурных переходов. § 5к. Методы обнаружения фазовых переходов в мембранах Липиды в экспериментальных условиях могут находиться в жидком, жидкокристаллическом и твердокристаллическом состояниях. Фазовое состояние липидов будеть зависеть от концентрации вещества, температуры системы и природы липида (наличия ненасыщенных связей, длины углеводородной цепи и др.). Фазовые диаграммы отражают различные фазовые состояния системы в зависимости от концентрации компонентов при изменении температуры. Для обнаружения и регистрации фазовых переходов липидных систем используют методы: - дифференциального термического анализа (ДТА); - дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК); - рентгеновского и нейтронного рассеяния; - ЯМР-спектроскопии; - ЭПР-спектроскопии; - флуоресцентной спектроскопии. Поясним области применения каждого метода. С помощью ДТА и ДСК регистрируют изменения скорости теплового потока при постепенном повышении или понижении температуры. В точках фазового перехода происходит резкое пикообразное увеличение поглощения или выделения потока тепла, что и регистрируется. Подобную информацию получают с помощью ЭПР, ЯМР или спектрофлуориметрии при условии введения в эти системы спиновых или флуоресцентных зондов. Метод дифракции рентгеновских лучей или нейтронов наряду с определением фазовых переходов в липидных системах позволяет 170
вычислять размеры бислоя липидов, углы наклона жирнокиелотных цепей относительно плоскости бислоя, площадь, занимаемую одной липидной молекулой, среднюю степень упорядоченности цепей, положение молекул воды. Для достижения этих целей прибегают к замене атома водорода Н на дейтерий О ( Н). Существуют разнообразные биофизические подходы и методы для определения поведения молекул липидов и белков биомембран в естественных условиях, в эксперименте и при действии различных физико-химических факторов (изменения ионной силы, концентрации отдельных ионов, соотношения ионов, сдвигов рН, температуры). Ряд биофизических методов позволяет определить вращательный и латеральный виды диффузии белков и липидов, трансбислойную диффузию липидов, концентрацию ионов водорода в клеточных компартментах, поверхностный потенциал мембран и клеток, величину трансмембранного потенциала, внутриклеточное содержание ионов и других веществ. Но это будет проанализировано при изложении отдельных функций мембран, а теперь необходимо остановиться на химическом составе биомембран. § 6. Химический состав биологических мембран Биомембраны обладают сложной гетерогенной структурной^организацией, зависящей как от разнообразия их компонентов, так и от образования надмолекулярных относительно стабильных комплексов. Но если рассматривать компоненты биомембран с биохимической точки зрения, то практически все биомембраны состоят в основном из полярных липидов и белков. § 6а. Классификация, принципы построения и характеристика мембранных липидов Липиды (от греч. lipos - жир) - низкомолекулярные органические вещества, активные компоненты биологических мембран, извлекаемые из клеток растений и животных органическими растворителями (хлороформом, ацетоном, эфиром, бензолом). Первый анализ липидов был проведен А Лавуазье (1743-1794). Он установил, что животные жиры и растительные масла состоят в основном из углерода и водорода. Шведский химик К.Шееле (17421786) открыл глицерин, обнаружив его в жирах и маслах. В 1811 г. французский химик-органик М.Шеврель выделил кристаллическую жирную кислоту при кислотной обработке мыла, описал свойства ряда жирных кислот, детально разработал метод разделения 171
жирных кислот по их растворимости в различных органических соединениях. Первый синтез жира из глицерина и жирной кислоты провел в 1854 г. французский химик П.Бертло (1827-1907). Получение фосфолипидов и гликолипидов из желтка куриных яиц и ткани мозга связано с именами М.Гобли (1847) и Ф.ХоппеЗайлера (1877). Они выделили лецитин (от греч. lekithos - яичный желток). Английский врач Дж.Тудикум выделил из мозга кефалин, содержащий азот и фосфор, а в продуктах его гидролиза он обнаружил этаноламин; впервые им были описаны сфинголипиды - сфингомиелин и цереброзид. Большие трудности с выделением и очисткой индивидуальных липидов из смеси природных жиров и масел способствовали медленному развитию химии липидов, которая получила название грязной химии (Schmierchemie). Однако после разработки новых, в первую очередь хроматографических, методов химия липидов стала успешно развиваться, и современный период развития биофизики и биохимии связан с многочисленными и плодотворными исследованиями липидов разнообразных биологических мембран. Липиды - обширная группа природных органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества. Молекулы простых липидов представляют собой соединения спирта, высокомолекулярных жирных кислот и других компонентов. Стерины не содержат жирных кислот. К простым липидам относятся триглицериды, диольные липиды, воски. Сложные липиды - это комплексы с белками (липопротеины), производные ортофосфорной кислоты (фосфатиды или фосфолипиды). Молекулы сложных липидов содержат также остатки трехатомного спирта глицерина (глицеринфосфатиды) или сфингозина (сфинголипиды). К липидам относят вещества, не являющиеся производными жирных кислот, - стерины, убихиноны, терпены. О важнейших классах липидов дает представление табл. 4.4. Из семи важнейших классов липидов биологические мембраны бактерий, клеток растений и животных содержат три основных класса: глицерофосфатиды (фосфолипиды), глицерогликолипиды (гликолипиды) и сфингофосфолипиды (стероиды). Фосфолипиды делят на глицерофосфолипиды (производные фосфатидной кислоты) - фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин,
172
фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и сфингофосфолипиды (производные церамида, сфингомиелины). Таблица
4.4
Важнейшие классы лшшдов 1. Воски 1. Глицерофосфатиды (фосфолипиды)
2. Глицерогликолипиды 3. Сфингогликолипиды Цереброзиды (х-моносахарид) Ганглиозиды (х-олигосахарид, содержащий остатки сиаловых кислот)
Простые липиды 2. Диольные липиды | 3. Триглицериды Сложные липиды Лецитины (холипфосфатиды) этаноламинфосфатиды Кефалипы сери 11фосфатиды Фосфатидиловые кислоты фосфатидилглицерин Полиглицерофосфатиды ^^кардиолипин (х-фосфатидил глицерин) Фосфатидилинозиты (х-инозитил)
I
4. Сфингофосфолипиды Сфингомиелины Фитосфинголипиды (х-инозитилгликозид)
х - углеводородная цепь.
Молекулы липидов хорошо стерически "соответствуют" друг другу, несмотря на большое разнообразие индивидуальных соединений фосфолипидов за счет присоединения к гидроксильным группам молекулы глицерина радикалов как насыщенных, так и ненасыщенных жирных кислот, а их в состав мембран входит довольно значительное количество. Принципы построения липидных молекул Содержание липидов в биомембранах колеблется от 30 до 70%, а в миелиновых мембранах может доходить до 83-85%. Липиды мембран отличаются структурным многообразием за счет вхождения в гидрофобные "хвосты" различных жирных кислот. Однако в структуре мембранных липидов можно выделить единый принцип: липиды построены на базе спиртов (глицерина, этиленгликоля). Молекула липида включает гидрофобные "хвосты" 173
("хвост"), из предельных или непредельных жирных кислот и полярной головки, состоящей из фосфорной кислоты и этиленамина, серина, холина, инозита и др. (рис. 4.4). Одна часть молекулы липида гидрофобна, другая - гидрофильна, т.е. обладает сродством как к полярным, так и к неполярным растворителям (амфифильна). Их молекулы склонны к агрегации». Гидрофобные участки молекул стремятся попасть в гидрофобную фазу, образуя неполярные области, а полярные группы располагаются на границе с водой. Амфифильность мембранных липидов определяет разнообразие липидных агрегатов и надмолекулярных структур в зависимости от природы компонентов, их количественных соотношений, концентрации, температуры образца. Связующими звеньями между полярной головкой липида и неполярным (гидрофобным) хвостом обычно служат многоатомные или алифатические спирты, содержащие три (глицерин) или две (этиленгликоль) гидроксильные группы (см. рис. 4.4). Глицеролипиды (глицериды) составляют более половины липидов, встречающихся в природе и занимают по распространенности первое место среди липидов. Это производные трехатомного спирта - глицерина (1, 2, 3 - пропантриола): О II СН 2 - 0 - C-Ri !
СН2 - ОН I
сн - он I
11 сн-о- C-R2 О 1 1 1
1
сн 2 -он
СН2-0- Р - О - Х
Глицерин
Глицеролипид
11
он
Обычно в полярных глицеролипидах биологических мембран две гидроксильные группы глицерина связаны сложноэфирными связями с двумя высшими жирными кислотами, а третья гидроксильная группа соединяется с гидроксильной головкой. Липиды, построенные на основе сфингозина На базе аминоспирта сфингозина или его аналогов построена группа сфинголипидов: 174
в 1
:н, >"* ;
-
о- •-а Полярная {гидрофильная) голова
сн,- сн - !н.
1, ) с=о 1
1
сн
Нелолярный {гидрофобный} хвост
1 сн
(
:=о н.
1 сн. сн,
сн. сн.
ь
сн, сн, Iм' сн, сн
1». снк
1 сн, СН:
сн. с»; 1
1 * 1
сн,
сн,
\\—цис-Двойная связь
ч\:н,
\ сн, \ сн, \ сн, \ сн, \
сн сн
Рис. 4.4. Молекула фосфолипида фосфатидилхолина, представленная схематически (Л), химической формулой (Б), в виде пространственной модели (В) и символом (.Г)
СН2 - ОН H-C-NH2
СН2
Н-С-ОН
ОН
H-C-NH2
нс
н-с-он
11 транс
I (СН2)14
С Н
(СН2)12
С Н з
СНз Сфингозин Сфинганин Сфинголипиды входят в состав мембран нервных клеток, особенно высоко их содержание в головном и спинном мозгу. Сфингозиновые основания связаны во всех сфинголипидах амидной связью с жирными кислотами: полученные при этом вещества носят название церамидов. Несмотря на единый план строения фосфолипидов, что обеспечивает их стерическое соответствие друг другу, существует большое разнообразие фосфолипидов благодаря включению различных жирных кислот в неполярные "хвосты" молекул. Так, выделено несколько десятков природных видов фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, отличающихся по своим физическим и химическим свойствам (по температуре плавления, по способности окисляться и т.д.). Гликолипиды мембран подразделяют на цереброзиды, сульфатиды и ганглиозиды. Их объединяет содержание углеводных компонентов. Цереброзиды (гликосфинголипиды) - углеводные производные церамида, поэтому они носят еще название гликозилцерамиды:
HO-CHAWWW
I
СН - ЫН\ЛМАЛЛЛ=АЛАЛ
СНгОН
I
fl
он он Галактоцереброзид (нервон) 176
Наиболее распространены галакто- и глюкозоцереброзиды. Цереброзиды содержатся в тканях животных, растений и микроорганизмах. Это нейтральные соединения. Сульфатиды или сульфоцереброзиды представляют собой сулкфоэфиры. Они образуются при участии группы -ОН углевода и имеют кислую реакцию. Ганглиозиды относятся к гликолипидам, у которых концевыми остатками углевода служит N-ацетилнейраминовая кислота. Стероиды мембран представлены в основном холестерином (у животных), ситостерином и стигмастерином (у растений), эргостерином (у грибов). Мембраны прокариот содержат плазмалогены и глицероацетали. Особенности липидного состава мембран бактерий иногда служат отличительным признаком для их классификации. Несмотря на большое разнообразие жирных кислот, в мембранах в значительных количествах обнаруживают только две или три (табл. 4.5). Так, у высших растений - это в основном пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты. Жирные кислоты с четным числом атомов углерода (20, 22, 24) обнаруживаются очень редко; почти не содержится стеариновой кислоты. В то же время в тканях животных эта кислота наряду с пальмитиновой и олеиновой является преобладающей. Таблица 4.5 Наиболее распространенные жирные кислоты в составе мембранных липидов Соединение
Тривиальное название кислоты
Молекулярная масса, Да
Температура плавления, С
1
2
3
4
С12:0 С 14:0
Лауриловая
200,3 228,4
44,2
256,4
С16:0 С 17:0 С18:0 С20:0 С22:0 С24:0 С16:Н9) С18:1(9с) С18:Н9) С18:1(7)
C24:lfe) С 18:2(9,12)
Миристи новая Пальмитиновая
53,9
Маргариновая
270,4
63,1 61,3
Стеариновая
284,5
69,6
Арахидоновая Бегеновая
312,5
76,5
340,6
Лигноцериновая
368,5 254,4 282,5 282,5 282,5 366,6 280.5
81,5 86,0 -0,5 13,5 44.5 44.0
Пальмитоолеиновая Олеиновая Элаидиновая Вакценовая Нервоновая Линолевая
42,5 -5,0
177
1 С'8:2(9.12.15) С20:4(5.8.11.14) С22:5(7.10.13.16.19) С22:6(4.7.10.13.16.19)
2 Линоленовая Арахидоновая Клупанодоновая Докозагексагеновая
О к о н ч а н и е т а б л . 4.5 3 4 278,4 -10,0 304,5 -49,5 330,5 -45.0 -44,1 328,5
П р и м е ч а н и е . В классификации жирных кислот указывают число углеродных атомов, через двоеточие - количество двойных связей; в скобках - номер первого углеродного атома при двойной связи, считая от СООН-группы.
О липидном составе рвда биологических мембран дает представление табл. 4.6. Таблица
4.6
Липиднып состав некоторых биологических мембран (% различных липидов от общего их количества) Название липида
Эритроциты человека
Миелин человека
Фосфатидиновая кислота Фосфатиднлхолин Фосфатидилэтаноламин Фосфатидилглицерин Фосфатидилинозит
1,5 19,0 18,0 0,0 1.0 8,5 0.0 17,5 10,0 25,0
0,5 10,0 20,0 0,0 1,0 8,5 0,0 8,5 26,0 26.0
Фосфатидилсерии Кардиолипин Сфингомиелин Гликолипиды Холестерин
Митохондрии сердца быка 0,0 39,0 27,0 0,0 7,0 0,5 22,3 0.0 0.0 3.0
Мембраны E.coli 0 0 65 18 0 0 12 0 0 0
Анализ данных табл. 4.6 показывает, что основными липидами мембран клеток животных служат фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, в то же время в митохондриях содержится мало холестерина и свыше 22 % кардиолипина. Основную структурную функцию в мембране выполняет двухрядный бислой липидов, состоящий главным образом из фосфолипидов. Минорные соединения мембран наряду с белками определяют ряд своеобразных функций. Так, ганглиозиды участвуют в дифференцировке нейрональной ткани, могут модифицировать иммунную реакцию, блокировать действие лимфоцитов (киллеров), а гликолипиды иммунокомпетентных клеток принимают участие в иммунной реакции. Жирнокислотный состав липидов мембран животных хотя и раз178
нообразен, но относительно постоянен, тогда как у бактерий и растительных организмов встречаются своеобразные соединения, характерные для данного семейства или класса. Липидные компоненты мембран довольно интенсивно обновляются, что вытекает из данных табл. 4.7. Таблица 4.7 Время жизни липидных компонентов мембраны Время жизни в составе
Компонент мембраны
миелина
митохондриальных мемб2 мес.
Фосфатидилсерин
13мес. Юмес. 2мес. 7 мес. 4мес.
Фосфатидилинозит
1 мес.
ран Цереброзиды Сфингомиелин Фосфатидилхолин Фосфатидилэтаноламин
1 мес. 2нед. 4нед. Змее. 2 дня
§ 66. Белки биологических мембран Выше было показано, что основные общие морфологические свойства биологических мембран зависят от структуры и функций липидного непрерывного бислоя. Однако многочисленные и разнообразные специфические функции биомембран осуществляются в основном мембранными белками. Типы и содержание белка в мембране зависят от выполняемой специализированной функции клетки. Так, в миелиновой мембране нервной клетки мембрана выполняет в основном функцию изолятора-. Содержание белка в ней менее 20% от массы мембраны. В то же время в мембранах органелл, в которых совершаются энергетические превращения (митохондрии, хлоропласта), на долю белков приходится более 75% ее массы. В среднем в обычной плазматической (наружной) мембране клеток соотношение белков и липидов составляет около 5 0 % от сухой массы. В этом случае на одну молекулу белка приходится 70-80 молекул липидов. Если средний размер большой оси липида равен 25-30 А , то для молекулы белка он превышает 80-100 А , что обеспечивает различ179
ное расположение белковой молекулы по отношению к бислою липидов (трансмембранное, тангенциальное, частичное погружение в бислой липидов). Мембранные белки классифицируют по их положению мембране - поверхностные и интегральные; по взаимодействию с липидами и степени погружения и пронизывания мембран - моно-, би- и политопические (рис. 4.5; 4.6). Наиболее распространено деление белков в зависимости от ос-
Рис. 4.5. Монотопическая (А), битопическая (Б) и политопическая (В) локализация белков в мембране; N и Сконцы политпептидной цепи
Рис. 4.6. Четыре способе ассоциации мембранных белков с липидным бислоем 1 интегральные белки пронизывают мембрану насквозь; 2 - поверхностные белки погружены в липидный бислой частично; 3 - белки, удерживающиеся иековалентными взаимодействиями с другими мембранными белками; 4 - белки, ковалентно соединенные с одной или двумя цепями жирных кислот
180
новной выполняемой функции: белки-ферменты, белки структурные, белки-рецепторы, белки транспортные и т.д. Мембранные белки являются амфипатическими соединениями, их выделение и фракционирование возможно лишь только при использовании детергентов, нарушающих гидрофобные взаимодействия и приводящих к разрушению бислоя липидов. Мембранные белки имеют гидрофобные и гидрофильные участки, т.е. они - амфифильные соединения. Низкомолекулярный детергент состоит из гидрофильной головки и гидрофобного хвоста. Так как взаимодействие гидрофобных участков молекулы детергента с гидрофобными участками мембранного белка сильнее, чем взаимодействие липида с белковой молекулой, то гидрофобные участки детергента вытесняют липиды и связываются с белками. Полярные группы детергента взаимодействуют с молекулами воды. Мембранные белки переходят в воду в виде комплекса молекулы белка с детергентами, а в ряде случаев с частью прочно связанных с молекулой белка молекул липидов. Полярные концы детергента могут нести заряд (додецилсульфат натрия ДСН), либо быть неионогенными (тритон Х-100): О 11 + W W W 0 - S - C T Net II О Додецилсульфат натрия
сн3 ендо,
^ (О-СН 2 )9-ю-ОН
Тритон Х-100 В благоприятных условиях при низких концентрациях детергента мембранные белки могут сохранять нативную конформацию и быть активными, сохранив часть связанных липидов. Для получения индивидуальных мембранных белков используют методику разделения их при помощи электрофореза в полиакриламидном геле после обработки ДСН (при 100 °С в 1 %-ном растворе). В этих условиях разрушаются все нековалентные связи (белок-липидные, белок-белковые). Так как количество связавшегося ДСН с белком прямо пропорционально его массе, то суммарный отрицательный заряд включен181
ного детергента значительно превышает собственный заряд белка, поэтому перемещение молекул последнего в электрическом поле определяется в основном его молекулярной массой. По количеству фракций судят о составе белков, их молекулярной массе, а по интенсивности окраски (например, кумасси синим) определяют количество белка данной фракции. С помощью метода двухмерного электрофореза было идентифицировано более 50 различных белков в типичной плазматической мембране позвоночных животных. В мембране эритроцитов человека удалось выявить более 15 основных белков с молекулярными массами от 15000 до 250000 Да. На долю трех из них (спектрина, гликофорина и белка полосы III) приходится более 60% массы всех мембранных белков. Спектрин непрочно связан в мембране с внутренней стороны. Он составляет около 30% массы мембранных белков (3 1(г копий на клетку) и образует при взаимодействии с другими белками (анкирином и др.) цитоскелет. Встраивание молекул белка в бислой фосфолипидов осуществляется поэтапно: сначала происходит адсорбция молекулы белка на поверхности бислоя фосфолипидов, что вызывает конформационную перестройку белковой молекулы и затем образование гидрофобного контакта с ацильными частями фосфолипида. Это приводит к внедрению молекулы белка в бислой. Для мембранных белков характерно неодинаковое соотношение гидрофильных и гидрофобных участков в молекуле, что определяет силу гидрофобных взаимодействий в области неполярных хвостов липидов и электрических взаимодействий в области головок фосфолипидов на наружной и внутренней поверхностях мембран (см. рис. 4.6). Интегральные белки имеют не менее двух гидрофильных участков, которые располагаются на наружной и внутренней поверхностях мембраны (рис. 4.7). Иногда белковая молекула несколько раз пересекает мембрану (рис. 4.8). Полярная область
Гидрофобная область 182
Полярная область
1'ис. 4.7. Схема амфипатического интегрального мембранного белка, удержииаемого в л ими дном бислое гидрофобными взаимодействиями с углеводородными цепями молекул липидов
Цитоплазма
соон Липидный бислой
а - спираль
Внеклеточное пространство
Рис. 4.8. Структура молекул бактериородопсина и ее политопическое расположение в липидном слое. Полипептидная цепь пересекает бислой в виде семи спиралей
Периферические белки являются монотопическими, а интегральные - би- и политопическими. Так, гликофорин является битопическим белком, а бактериородопсин, транспортные АТФазы, каналообразователи - политопическими. Разнообразные функции мембранных белков зависят от их высокой конформационной подвижности, способности переходить в напряженное (state tensed) и расслабленное (state relaxed) состояния. Эти состояния обратимы (R^T-переходы), что связано с изменением четвертичной и третичной структур белковых молекул. Монотопические белки вызывают эластическую деформацию одной стороны мембраны, что облегчает взаимодействие мембранных рецепторов с гормонами (например, с инсулином). За счет гидрофобности белка и его встраивания в область неполярных хвостов липидов (например, цитохрома Ъ$) может происходить резкое изменение кривизны и деформация бислоя. Интегральные белки, проникающие через мембрану, могут оказывать значительное давление на бислой, что приводит к сжатию одних и уширснию других его участков (например, гликофорин в мембране эритроцитов). Процесс синтеза мембранных белков протекает в рибосомах эндоплазматической сети. К месту функционирования он поступает за счет диффузии на короткое расстояние, путем контактов между различными органеллами, в результате чего происходит обмен молекулами белка. На значительные расстояния молекулы мембранного белка переносятся везикулами, формирующимися в аппарате Гольджи. 183
Углеводы мембран Углеводы в свободном состоянии в мембранах практически не обнаруживаются. Они входят в состав белков (гликопротеины и протеогликаны) и в состав липидов (гликолипиды), что составляет соответственно около 10% всех белков и от 5 до 26% липидов. В гликопротеинах наиболее часто встречаются такие моносахариды, как глюкоза, галактоза, манноза, глюкозамин, нейраминовая кислота; в протеогликанах - галактоза, ксилоза, глюкуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин. Гликолипиды включают глюкозу, галактозу, фруктозу, глюкозамин, нейраминовую кислоту и др. Углеводная часть белковой молекулы находится на внешней стороне мембраны, что связано с их функциональной ролью: осуществлением межклеточных взаимодействий, ограничением подвижности белковых молекул, обеспечением иммунных реакций. Включение углевода в состав белков защищает их от протеолиза во время транспорта к месту функционирования, обеспечивает молекулярное узнавание и закрепление белковой молекулы в определенном месте мембраны. § 6в. Принципы построения мембранных липидных структур В силу природной амфифильности липидов их молекулы будут ориентироваться на поверхности и внутри полярного (вода) и неполярных растворителей (ацетоне, эфире, хлороформе) вполне определенным способом, образуя на границе раздела монослои (липидные пленки), бислои (мембраны), и в объеме растворителя - мицеллы (рис. 4.9). Способность липидов образовывать различные структуры при изменении концентрации липидов или изменении температуры получила название концентрационного или температурного мезомор-
Фосфолипидная мицелла
Фосфолипидный бислой
184
Рис. 4.9. Фосфолидная мицелла и фосфолидный бислой вводе
физма. Структурные переходы можно наблюдать при исследовании зависимости размера площади, занимаемой молекулой липида, от величины поверхностного давления (рис. 4.10). Монослои При нанесении на поверхность воды раствора липида в летучем органическом растворителе (эфире, ацетоне и др.) пленка свободно растекается по поверхности при отсутствии ее ограничений. Полярные головки при этом обращены к воде, а углеводородные неполярные хвосты ориентированы в воздух. Молекулы липида практически не взаимодействуют друг с другом, что напоминает состояние молекул вещества в газообразном состоянии. По мере ограничения поверхности (сжатия пленки) происходит увеличение плотности упаковки провзаимодеиствовавших липидных молекул. Возникает сплошная пленка липида, что соответствует состоянию "двумерной жидкости". При дальнейшем сжатии пленки достигается максимальная упаковка молекул, при которой головки обращены к воде, углеводородные хвосты в виде частокола направлены в воздух. Это состояние упаковки молекул получило название конденсированного монослоя, в котором площадь, приходящаяся на одну молекулу липида, будет минимальной, поэтому ЛАоААо оооооо ооооо4*
40,0
Коллапс "Твердый монослой
30,0 Ь' и UIXJ о
20,0
О
О
\ "Жидки]»'МОНОСЛОЙ
10,0 0,01 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1 Площадь, занимаемая молекулой, нм 2 <С
д Сжатие монослоя '
2
'
Рис. 4.10. Общий вид диаграммы зависимости поверхностного давления от площади, приходящейся на молекулу липида 185
образуется твердый конденсированный, практически несжимаемый монослой (см. рис. 4.10). При достижении определенной величины давления происходит сдвиг слоев, наползание их друг на друга (давление коллапса). Измерение поверхностного давления проводится при помощи пленочных весов Лэнгмюра или методом Вильгельми, который основан на взвешивании тонкой пластинки из инертного материала при соприкосновении ее с поверхностью монослоя. По измеренной величине скачка электрического потенциала (AV) вычисляют значение дипольных моментов молекул и получают информацию об ориентации поверхностно-активных молекул на поверхности монослоя и характере их взаимодействия с липидами. Разработана установка с применением радиоактивных меток, позволяющая измерять поверхностное давление, поверхностный потенциал и поверхностную радиоактивность. Липидные монослои служили удобной простейшей моделью биологических мембран с начала XX в. Достаточно вспомнить работы Б.Франклина, лорда Релея (Дж.Стратта), ИЛэнгмюра. Липидные монослои и в настоящее время позволяют оценить поверхностную активность отдельных компонентов, характер взаимодействия между ними. Структура и свойства монослоя зависят от строения липидных молекул. Триглицерины образуют конденсированные монослои при поверхностном давлении 10~4 Н/см . При максимальной плотности упаковки молекул площадь, приходящаяся на одну молекулу, в монослое равняется 0,19-0,20 нм , а при введении ненасыщенной жирной кислоты предельная площадь увеличивается до 0,26 0,27 нм . В данном случае образуется менее упорядоченная жидкорастянутая пленка. Ионизация полярных групп липидов при сдвиге рН приводит к более разреженному состоянию молекул в монослое, тогда как добавление двухвалентных и многовалентных катионов значительно увеличивает плотность упаковки молекул и уменьшает площадь, приходящуюся на одну молекулу. Молекулы белка при адсорбировании и проникновении в монослой липидов уменьшают поверхностное давление, изменяют величину электрического потенциала и увеличивают площадь, приходящуюся на одну молекулу. Мицеллообразовапие Мицеллы - это простейшие надмолекулярные образования, агре186
Мицелла классического типа Распад
It Г It ||
Липид Распад
II
Ассоциация Полярная головка
п
Углеводородный хвост Ассоциация
Неполярный растворитель + следы воды
Обращенная мицелла Рис. 4.11. Липидные мицеллы в воде и нсполярпом растворителе
гаты липидов в объеме растворителя. Липиды в полярном растворителе (воде) образуют мицеллы обычного, классического типа, а в органических растворителях - обращенные мицеллы (рис. 4.11). В обычных мицеллах гидрофильные головки контактируют с мо187
лекулами воды, а гидрофобные хвосты (углеводородные цепи) формируют гидрофобное ядро. В неполярных растворителях (гексане, бензоле, декане и др.) ядро образуют полярные головки липидов, а углеводородные цепи будут взаимодействовать с молекулами неполярного растворителя, что приводит к образованию обращенной мицеллы (см. рис. 4.11). Соотношение размеров полярной и неполярной частей молекулы, степень амфифильности, концентрация липидов сказываются на форме мицелл, которая может переходить от шарообразной (сферической) к элипсоидальной и цилиндрической. Как правило, легко образуют мицеллы в воде липиды, обладающие объемистой или заряженной головкой и небольшой углеводородной цепью, фосфолипиды с одной углеводородной цепью или с двумя, но короткими цепями (динексаноил- и диоктаноилфосфатидилхолины). Названные вещества имеют высокие по сравнению с другими липидами критические концентрации мицеллообразования (10" -10" 5 моль/л). В каждую мицеллу входит от нескольких десятков до нескольких сотен молекул, которые образуют шар или эллипс диаметром от 6 до 16 нм. Стержни и цилиндры формируются при увеличении концентрации вещества или снижении температуры. Они включают до 1000 и более молекул (рис. 4.12).
Рис. 4.12. Различные типы мицелл, образуемых липидами в воде: а - сферические мицеллы; б - эллипсоидальные; в - цилиндрические; г - диски, образуемые фосфолипидами и амфифильными аполипопротсинами 188
В неполярных растворителях более легкому формированию мицелл способствует малый размер полярной головки, малая величина ее заряда и наличие длинных углеводородных цепей (яичный фосфатидилхолин в бензоле). Образование различных форм мицелл легко обнаруживается при добавлении к образцу детергентов или других липидов. Наряду со сферическими, эллипсоидальными, цилиндрическими мицеллами можно обнаружить диски (см. рис. 4.12). Последние легко формируются при смешении фосфолипидов с солями желчных кислот. Бислои Бимолекулярный липидный слой (бислой) - энергетически наиболее выгодная форма ассоциации тех липидов, которые не способны образовывать мицеллы в полярном растворителе. Бислой легко образуют липиды, у которых соизмеримы площадь полярной головки и поперечное сечение углеводородных цепей. Это присуще большинству фосфолипидов. В бислое монослои располагаются параллельно друг другу, взаимодействуя гидрофобными углеводородными хвостами, а гидрофильные поверхности их обращены к воде. Критическая концентрация мицеллообразования для липидов бислойных структур на несколько порядков ниже по сравнению со сферическими и цилиндрическими структурами и составляет около 10 моль/л. Практически весь фосфолипид ассоциирован. Процентное соотношение липид/вода, строение и свойства фосфолипида определяют характер и особенности ламеллярного строения ассоциатов. Это могут быть мультиламеллярные бирядные слои, моноламеллярные и многослойные липосомы (пузырьки). Толщина липидного бислоя зависит от длины углеводородных цепей (обычно 4-5 нм), от плотности упаковки молекул: уменьшается при наличии двойных связей, боковых заместителей в цепи, цис-конфигурации боковых метальных групп. Фазовые переходы Липидный бислой в зависимости от температуры может находиться в твердом (кристаллическом, гелевом) и жидкокристаллическом (жидком) состояниях. Физический смысл перехода между этими состояниями состоит в замораживании или плавлении углеводородных цепей липидов, что фиксируется для конкретного липида при строго определенной температуре (температуре фазового перехода^). Температура фазового перехода понижается при введении цис189
двойной связи, метальной группы в середину цепи. Возрастание t n на 15-20 °С отмечается при увеличении длины насыщенной цепи на два метиленовых звена. Строение полярных головок влияет на t n . Так, включение фосфатидилхолина вместо фосфатидилэтаноламина при одних и тех же углеводородных звеньях понижает температуру фазового перехода на 20 °С. Фазовый переход зависит от изменения концентрации ионов водорода, ионного состава среды, особенно ионов Са + , добавления мембранотропных веществ, изменения липидного состава бислоя. При температуре ниже t n подвижность углеводородных цепей резко ограничена: они находятся в максимально вытянутой трансконформации и наиболее плотно упакованы. Повышение температуры до значения фазового перехода приводит к плавлению липидного бислоя: резко усиливаются вращательная и колебательная подвижности молекул за счет возрастания скорости гош - транс-изомеризации, появления кинков в цепях, увеличения межлипидного расстояния, уменьшения толщины бислоя. Липидный бислой становится менее упорядоченным. В жидкокристаллическом состоянии бислоя скорость латеральной диффузии высока (коэффициент латеральной диффузии липидов имеет величины в пределах 10" - 10" см • с" ) В среднем молекула липида совершает от 1000 до 100000 переходов на среднее расстояние, равное ее поперечному размеру (около 1 нм). Переход из одного ряда в другой (флип-флоп переход) идет очень медленно из-за необходимости преодоления высокого энергетического барьера при переходе полярной головки через гидрофобную область, образуемую углеводородными цепями. Полупериод флипфлопа составляет несколько часов, а при латеральной диффузии то же расстояние (4-5 нм) липидная молекула проходит за 2,5 мс. Если происходит замыкание липидных мембран и идет образование везикул, реализуются условия, приводящие к различию параметров бислойной мембраны на внутренней и наружной поверхностях: по плотности упаковки (выпуклая и вогнутая поверхности), величинам рН, различии в содержании поверхностно-активных веществ, отдельных ионов. Формируется топологическая асимметричность искусственных и биологических мембран. Модельные мембраны Бимолекулярные липидные мембраны (БЛМ, бислойные, "чер-
190
ные") - воспроизводимые в экспериментальных условиях искусственные мембраны, создаваемые в водной среде. Метод получения БЛМ был предложен американским ученым П.Мюллером в 1962 г. Он состоял в нанесении при помощи кисточки капли раствора липида на отверстие диаметром 1-2 мм в гидрофобном материале - тефлоне, полиэтилене (рис. 4.13). Самопроизвольно идет формирование мембраны толщиной от 100-600 нм до 4-9 нм за счет сил поверхностного натяжения в течение нескольких минут. Вследствие малой толщины мембрана не отражает падающий свет и кажется черной. Органический растворитель выдавливается к краям отверстия и может содержаться в средней области бислоя в виде микролинз (рис. 4.14). Время жизни таких мембран колеблется в пределах от нескольких минут до 1-3 часов. Липидный бислой обладает высокой прочностью. Под действием механического или осмотического давления Раствор липида^ Водная фаза
Водная фаза
Отраженный сеет
Бимолекулярная (черная) липидная мембрана
Рис. 4.13. Схема экспериментальной установки для получения бислойной липидной мембраны
Перегородка
Рис. 4.14. Процесс формирования бислойной липидной мембраны Толстая пленка
Тонкая пленка
Бимолекулярная мембрана
191
можно получить полусферу. Липидный бислой можно проткнуть волосом, стеклянным микроэлектродом и извлечь их без нарушения мембраны, что свидетельствует об их способности к самовосстановлению, самосборке.Однако БЛМ легко разрушают следующие факторы: примеси в липидах, их окисление, колебания температуры, вибрация, загрязнение посуды и т.д. Для получения БЛМ используют широкий набор природных и синтетических липидов и различные органические растворители, но наиболее стабильные мембраны получают при применении н-декана и н-тетрадекана. Метод "сухих" бислойных липидных мембран был впервые предложен японским ученым М.Такаги с сотрудниками в 1965 г. и позднее в 1972-1974 гг. был усовершенствован М.Монталом. Сущность данного метода состоит в механическом соединении (соприкосновении) двух мономолекулярных слоев на границе раздела вода-воздух. Таким способом получают асимметричные мембраны из липидных слоев разного липидного состава. БЛМ оказалась удобной моделью, при помощи которой был исследован ряд электрических характеристик липидного бислоя: мембранный потенциал, потенциал пробоя, электрическая емкость, проводимость. Эта модель оказалась полезной и для изучения проницаемости различных веществ при различных модификациях путем включения белков (переносчиков, каналообразователей, антибиотиков) . В табл. 4.8 приводятся данные о ряде свойств БЛМ и биомембран. Таблица
4.8
Сравнение некоторых свойств искусственных бислойных и биологических мембран Мембраны
Свойства
бислойные Толщина, нм Электрическое сопротивление, Ом- см Электрическая емкость, мкФ • см
10*-105
0,33-1
0,5-1,3
10 5 -10 6 0,5-2
10 2 -10 5
вода мочевина глицерин
31,7 4,2
0,37-400 0,015-280
4,6
0,003-27
эритрит
0,75
0,007-5
Потенциал пробоя, В /см Поверхностное натяжение, мН - м Проницаемость, мкм с
192
А
биологические
^
С
0,03-1
-10
На базе БЛМ созданы первые биосенсорные устройства, что открывает новые перспективы их практического применения. Липосомы В 1965 г. А.Бэнгхем описал процесс самопроизвольного образования сферических частиц при набухании фосфолипидов в воде. Они представляли собой множество замкнутых бислоев фосфолипида, разделенных слоями воды. По числу липидных бислоев и размера частиц липосомы делятся на: - многослойные (мультиламеллярные диаметром 5-10 мкм) - от десятков до сотен слоев; - крупные монослойные (моноламеллярные) с диаметром от 50 до 200 нм; - малые монослойные с диаметром от 20 до 50 нм. Существует несколько способов получения липосом: - продавливание липидов через стальные фильтры с определенным размером пор; - обработка фосфолипида в воде ультразвуком; - механическое встряхивание смеси фосфолипидов в воде. Липосомы образуются при температурах выше фазового перехода для данного липида, при низкой ионной силе раствора. На примере многослойных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина, можно составить представление о структуре и количественных характеристиках многослойных липосом. Толщина липидного бислоя, по данным рентгеноструктурного анализа, составляет 4 нм; площадь, занимаемая одной липидной молекулой, около 0,72 нм , что соответствует давлению сжатия (2,0-2,5) 10 Н/см. Толщина водного промежутка колеблется от 2-3 нм в случае отсутствия заряда бислоев и до 20 нм при наличии его. Объем водной фазы составляет от 20 до 40% общего объема. Бислои липосом функционируют как осмометры, поэтому липосомы набухают в гипотонических и "сморщиваются" в гипертонических растворах. Малые липосомы осмотически неактивны. Удельный водный объем у них невелик - (0,2-1,5) л/моль, в то время как у многослойных липосом он составляет от 1 до 4 л/моль воды. В стенку липосомы легко включаются мембранные белки, образуя протеолипосомы, которые могут моделировать транспортные, ферментативные и структурные свойства и функции биологических мембран. При образовании липосом вещества, содержащиеся в воде, вклю193
чаются во внутреннее пространство липосом. Таким путем включают в липосомы пептиды, лекарственные вещества, витамины, гормоны, антибиотики, различные белки и т.д. & 6г. Модели биологических мембран Притягательная идея о сведении мембран различных клеток животных и растений к одной универсальной структуре (модели), способной объяснить и объединить многочисленные наблюдения, факты, экспериментальные данные, владела умами многих исследователей в течение столетия. Но сначала надо было доказать, что биологические мембраны существуют, а затем предлагать и обосновывать их структуру и механизмы выполнения ими функций. В мембранологии смелые гипотезы часто опережали экспериментальные результаты. Изучив проницаемость клеточной мембраны для более чем 500 веществ, Э.Овертон в 1899 г. высказал мысль о существовании поверхностного липидного слоя клеток, который определяет их проницаемость. Измерения, проведенные в 1925 г. голландскими исследователями Э.Гортером и Ф.Гренделем на мембранах эритроцитов, показали, что площадь липидов в два раза превосходит площадь эритроцитов. Они сделали вывод о том, что мембрана имеет двойной слой липидов. В пользу этого свидетельствовали результаты измерения электрической емкости клеток, проведенные в 1927 г. Фрике. Найденную величину 0,81 мкФ/м мог иметь бимолекулярный слой липида с углеводородными хвостами, имеющими 16-18 углеродных атомов. Однако измерения поверхностного натяжения клеток привели к явно заниженным величинам - около 0,1 дин/см, тогда как для поверхности раздела липид/вода должно быть около 10 дин/см, что позволило предположить нахождение белков на поверхности клеток. В 1935 г. Дж.Даниелли и Х.Давсон предложили первую модель мембраны (принципиально общую для всех клеток) как трехслойной структуры. Между двумя слоями белка лежит двухрядный слой липидов. Липидные ряды разделены жироподобным веществом липоидом (рис. 4.15). Эта модель строения мембраны вошла в биологию как бутербродная модель или модель сандвича. Связывание белков с липидами согласно модели происходит за счет полярных взаимодействий. В 1956 г. Дж.Даниелли и В.Стейн дополнили эту модель допущением возможности проникновения гидрофобной части белковой молекулы в липидный бислой или полным проникновением через тол194
оооооо оооооо
6
щу мембраны с образованием поры, заполненной водой и способной пропускать водорастворимые незаряженные молекулы и некоторые ионы (см. рис. 4.15, б). Модель Даниелли-Давсона получила многочисленные экспериментальные подтверждения и в модифицированном виде используется и в настоящее время. Она была обоснована результатами, полученными при помощи поляризационной микроскопии, определения электрических параметров клеток, их проницаемости, методом дифракции рентгеновских лучей и др. Однако убедительные до-
Рис. 4.15. Модель биологической м е м б р а н ы к а з а т е л ь с т в а в пользу ЭТОЙ Даниелли-Давсона (а) и модель Стена-ДаниеллиМОДели были получены
(б)
только методом электронной микроскопии с ее многочисленными разновидностями (метод темного и светлого поля, метод замораживания-скалывания, метод сканирующей электронной микроскопии и др.). Исследователи перешли к детальному выяснению структуры мембран субклеточных образований, клеток органов и тканей многоклеточных растительных и животных организмов. Были опубликованы многочисленные данные о мембранах микроорганизмов. Мембранология пережила настоящий бум и в настоящее время претендует на оформление в самостоятельную научную дисциплину. Накопленный обширный материал требовал систематизации, обобщения, гипотез и теорий, позволяющих в их многообразии найти единство; в результате был предложен ряд новых моделей биомембран, позволяющих объяснить новые факты, не укладывающиеся в прокрустово ложе старых представлений. Трехслойное строение биомембран наблюдали многие ученые при электронно-микроскопических исследованиях клеток. В 1959195
1960 гг. Д.Робертсон предложил унитарную (единообразную) модель строения биомембран. В классическую модель Даниелли-Давсона он внес дополнение о том, что на наружной поверхности мембран лежит слой фибриллярного гликопротеида в развернутой конформации. Мембрана обладает структурной асимметрией (рис.4.16,а). Но на ряде микрофотографий исследователи получали изображение мембраны в виде системы глобулярных частиц. При помощи детергентов выделяли глобулы и вновь собирали их них фрагменты мембран. Это привело к созданию Шёстрандом (1963) и Дж.А.Люси (1964) глобулярной модели (рис.4.16, б и 4.17, а).
Рис. 4.16. Модель биологической мембраны Робертсона (а) и Шестранда (б)
Модель С.Шестранда предусматривала образование липидных мицелл, с которыми молекулы белка взаимодействуют различными способами. По представлению Дж.А.Люси, мицеллы включают в свой состав липиды и белки, образуя белково-липидный комлекс, и поэтому мембрана состоит из белковых глобул и липидных мицелл (рис. 4.17, а). А.А.Бенсон (1966) предложил модель мембраны, получившую название модели "ковра". В его модели полярные головки липидов и полярые части белков находятся на наружной и внутренней поверхностях, а внутри мембраны располагаются неполярные хвосты липидов, которые переплетаются с неполярной частью белка за счет гидрофобных взаимодействий (рис.4.17, б). Примерно в это же время Д.Е.Грин предлагает модель внутрен196
ней мембраны митохондрий в виде повторяющихся элементов, напоминающих конторскую печать, имеющих основание, шейку и головку (рис. 4.17, в).
Рис. 4.17. Модель биологических мембран Люси (а), Бенсона (б) и Грина-Пердью
После обоснования идеи молекулярной подвижности липидов и белков в модельной мембране и биомембране (Л.Д.Фрай и М.Эдидин, 1970; Г.М.Мак-Коннел, 1971) С.Дж.Синджер и ГЛ.Николсон в 1972 г. предложили жидкомозаичную модель биомембраны, основу которой составляют фосфолипиды, находящиеся в жидкокристаллическом состоянии, в которые погружены в разной степени молекулы белков (рис.4.18 и 4.19). Динамическая жидкокристаллическая мозаичная модель биомембраны общепринята. Она предусматривает возможность свободного движения молекул липидов и белков, но многие белки (интегральные) и часть липидов (аннулярных) находятся в фиксированном состоянии с резко ограниченной подвижностью. Необходимо указать на структурную и функциональную асимметричность биомембран, их мозаичность, высокую лабильность мембранных компонентов, зависимость их состояния от физико-химических показателей микроокружения, отсутствие сильных связей (ковалентных и электростатических) между молекулами, входящими в состав мем197
Липидный бислой
Молекула' липида
Молекула белка
Рис. 4.18. Участок модели биологической мембраны Синджера-Николсона
Липополисахарид Бело». формирующий пору Растворимый белок е периплазматическом пространстве
2S мм
Транспортный белое
Рис. 4.19. Клеточная оболочка грамотрицателыюй бактерии
бран. Стабильность мембранных структур и функций обеспечивают многочисленные слабые гидрофобные и ван-дер-ваальсовые связи. Это объясняет как достаточную стабильность биомембран, так и их высокую подвижность, приспособляемость к выполнению многочисленных функций в меняющихся физико-химических условиях. Причем эти изменения могут затрагивать как отдельные участки (мозаичность), так и мембрану в целом. § 7. Мембранный транспорт Основные понятия Мембранным транспортом называют любой переход атомов, ионов, молекул веществ через мембрану из среды в клетку или в об198
ратном направлении независимо от путей, сил и механизмов переноса. Проницаемость мембраны - это способность мембраны пропускать через себя атомы, ионы, молекулы веществ. В зависимости от характера связи транспорта данного иона металла или молекулы конкретного вещества от переноса других ионов или молекул веществ выделяют: унипорт - транспорт ионов или молекул через мембрану независимо от транспорта других соединений, например молекул газов, воды; симпорт - одновременный и однонаправленный перенос ионов или молекул двух различных веществ, например перенос ионов натрия и глюкозы через мембрану клеток эпителия тонкой кишки; антипорт - одновременный транспорт ионов или молекул вещества через мембрану в противоположных направлениях (рис. 4.20). Транспортируемая молекула
УНИПОРТ
Котранспортируемый ион
СИМПОРТ АНТИПОРТ 1 I Котранспорт
Рис. 4.20. Классификация способов транспорта веществ через мембрану
Котранспорт - взаимозависимый транспорт ионов или молекул веществ через мембрану. К котранспорту относят симпорт и антипорт. Биомембраны являются высокоспециализированными транспортными системами, обеспечивающими избирательную проницаемость веществ преимущественно в одном направлении. Транспорт веществ осущестляют специальные мембранные структуры: каналы, переносчики, насосы (рис. 4.21). Каналы - образования белковой природы (чаще всего крупные молекулы белка), имеющие центральную полость для прохождения + + + преимущественно ионов одного вида (Na , K , Са , Н ) и механизмов, обеспечивающих их открытие и закрытие. 199
Транспортируема молекула
АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ
Рис. 4.21. Виды пассивного и активного транспорта веществ через мембрану
Переносчики - молекулы веществ, осуществляющие транспорт ионов или молекул в результате временного взаимодействия их с веществом. На роль переносчиков претендуют ионофоры, сиаловые кислоты, белки. Насосы - мембранные АТФазы, специализирующиеся на противоградиентном переносе ионов Na+, K+, Са+, Н + за счет энергии гидролиза АТФ. Активный транспорт требует специальных ферментов-АТФаз, утилизирующих энергию гидролиза АТФ для совершения работы по переносу атомов или молекул веществ чаще всего против электрохимического градиента (см. рис. 4.21). По способам использования энергии выделяют: пассивный транспорт - перенос вещества идет самопроизвольно по электрохимическому градиенту с уменьшением свободной энергии системы (клетки); активный транспорт подразумевает перенос веществ, как правило, против электрохимического градиента с участием АТФаз с затратой энергии гидролиза АТФ непосредственно в акте переноса (это первично-активный транспорт); вторично-активный транспорт - это перенос соединений за счет предварительно созданных градиентов, за счет первично-активного транспорта. Вторично-активный транспорт обеспечивает котранспорт глюкозы (Сахаров), аминокислот за счет создания градиента ионов натрия на мембране и его уменьшения во время транспорта веществ. У низших эукариот для этой цели используются градиенты протонов, ионов натрия. Для транспорта одной и той же аминокислоты могут использоваться три-четыре разных переносчика. 200
Мембраны подразделяются на проницаемые, полупроницаемые, избирательно-проницаемые. Проницаемые мембраны - это мембраны, одинаково хорошо пропускающие ионы, молекулы веществ в обоих направлениях. Полупроницаемые мембраны - это мембраны, через которые проходят только одни вещества в прямом и обратном направлении, а другие вещества вообще не проходят. Избирательно-проницаемые (селективные) мембраны - это мембраны, избирательно пропускающие одни соединения и не пропускающие близкие по структуре вещества. Селективность обычно бывает относительной и выражается коэффициентом селективности: отношением коэффициентов проницаемости для двух ионов, соединений. Чтобы избежать некорректных оценок, необходимо четко различать такие понятия, как проницаемость мембраны и накопление вещества в клетке. Проницаемость мембраны для ионов, веществ понятие динамическое, определяемое количеством их молей, проникающих через единицу поверхности в единицу времени, т.е. коэффициентом проницаемости. Понятие накопление вещества в клетке эквивалентно понятию "содержание, концентрация" вещества в клетке и определяется количеством химически связанного данного соединения с веществом цитоплазмы, количеством адсорбированного и количеством физически растворенного вещества. С целью изучения проницаемости мембран для ионов, молекул веществ применяют различные методы: биофизические, биохимические, физиологические. Одни из них позволяют с высокой точностью проводить количественные измерения, а другие пригодны только для сравнительного качественного анализа и отвечают на вопрос: больше или меньше проникает вещества при одних и тех же условиях. В тех случаях, когда проницаемость мембраны для вещества незначительна, а химическое сродство к веществам, входящим в цитоплазму, высоко, накопление вещества идет медленно, но итоговая внутриклеточная концентрация его может достигать высоких величин. Проницаемость мембран, в том числе и биологических, для различных соединений, ионов изучают разными методами, которые должны удовлетворять следующим требованиям: - они позволяют исследовать кинетику поступления анализируемого вещества в клетку; - дают возможность работать с таким минимальным количеством вещества, которое не изменяет проницаемость мембран; 201
- они позволяют трактовать однозначно полученные результаты. Наиболее полно этим требованиям удовлетворяет метод радиоактивных изотопов, при использовании которого были получены основные результаты по определению ионных потоков при развитии потенциала действия, измерены скорости поступления и вовлечения в обменные процессы клетки биологически важных веществ углеводов, в том числе глюкозы, аминокислот, белков, липидов, нуклеиновых кислот. Метод радиоактивных изотопов используют для контроля результатов, полученных другими методами: химическими, индикаторными, осмотическими, физиологическими и измерения электропроводности. Это наиболее информативный, надежный, высокочувствительный метод, но требующий специально оборудованной лаборатории и использования радиоактивно-меченых препаратов. Поэтому довольно часто применяют метод измерения электропроводности, который относительно прост, позволяет исследовать динамику поступления и выведения веществ из клетки, регистрировать суммарные ионные потоки через мембрану, однако он пригоден для изучения проницаемости мембран только для ионов. Химический метод сводится к определению убыли химического соединения из инкубируемой среды или поступления молекул вещества непосредственно в клетку. По существу это метод химического микроанализа. Однако для обнаружения факта поступления вещества в клетку необходимо иметь объект крупных размеров, что сразу же ограничивает выбор объектов исследования, позволяет работать с несколькими организмами, имеющими гигантские клетки. Метод определения проницаемости мембран по убыли химического соединения из среды всегда встречает возражение, поскольку убыль вещества может происходить за счет адсорбционных процессов без проникновения через мембрану. Индикаторный метод является разновидностью химического метода. Он основывается на использовании диссоциирующего вещества, ионы или молекулы которого имеют определенный цвет. Зона перехода (зона виража), в которой происходит изменение цвета, зависит от степени диссоциации молекул: КА ^ГГ К+ + А'. Индикаторами служат органические кислоты, основания, соли. Для растительных клеток используют природные индикаторы, находящиеся непосредственно в них (антоцианы). Когда клетки помещают в среду, содержащую кислоты или основания, по мере их
202
проникновения через мембраны будет меняться рН внутриклеточной среды, что приведет к изменению окраски. Для введения индикатора в клетку в значительных количествах клетки и ткани предварительно помещают на несколько часов в раствор красителя, приготовленного на физиологическом растворе. Как правило, сильные кислоты и щелочи проникают в клетку только после повреждения биомембран. Скорость изменения величины рН внутриклеточной среды сильно отстает от кинетики проницаемости из-за значительной буферной емкости внутриклеточного содержимого. Индикаторный метод является качественным методом, позволяющим ответить на вопрос, проникает ли данное вещество в клетку и с какой первоначальной скоростью. Его можно использовать для сравнительной оценки проницаемости веществ гомологического ряда, когда известно отличие в структуре вещества. Группа осмотических методов включает измерения объема клеток и тканей по мере проникновения молекул вещества в клетку за счет изменения осмотического давления в них и за счет разности в скоростях проникновения молекул веществ, в том числе и воды. Скорость проникновения воды через мембрану значительно выше скоростей проникновения молекул других веществ. Поэтому при изменении осмотического давления внутри клетки этот процесс будет сопровождаться входом или выходом воды из клетки, что приводит к изменению ее объема. Так, если поместить клетки в слабый гипертонический раствор, содержащий исследуемое вещество, то первоначально за счет выхода воды из клеток суммарный объем будет уменьшаться, но по мере проникновения исследуемого вещества в клетки суммарный объем их будет возвращаться к исходным величинам. По скорости нормализации объема клеток можно судить о скорости проникновения различных веществ через биомембрану. Из анализа данных, приведенных на рис. 4.22, можно сделать заключение о том, что вещество А не проникает в клетки (кривая 1), вещество Б (кривая 2) проникает через мембрану значительно медленнее, чем вещество В, которое для мембран клеток в данных условиях имеет максимальную проницаемость (кривая 3). Исторически осмотические методы были раньше других методов использованы для изучения проницаемости биологических мембран как на растительных (по скорости плазмолиза и деплазмолиза), так и на животных клетках. Удобной моделью для исследования проницаемости биомембран животной клетки оказались эритроциты. Определив их гематокрит (процентный объем, занимаемый эритроци203
V, 100
1
О
Рис. 4.22. Определение скорости (v) проникновения веществ А, Б, В по изменению объема эритроцитов после помещения их в слабые гипертонические растворы: 1,2,3 - соответст-
i i i i i . i • • i . i 10 20 30 40 GO 60 70 80 ВО 100 110 1 »
венно для веществ А,Б,В
t, мин
тами по отношению к общему объему в тонких калиброванных трубочках), можно было судить о скорости возврата эритроцитарных клеток к исходному объему после помещения их в слабогипертонический раствор. Измерения гематокрита проводят через каждые пять минут. Это по существу качественный метод анализа для проведения сравнительных исследований. А.И.Терсковым и И.И.Гительзоном (1957) был предложен метод эритрограмм, позволивший исследовать кинетику поступления эталонного вещества (соляной кислоты) через мембрану эритроцитов (метод кислотных эритрограмм). Сущность их метода состоит в том, что по мере проникновения соляной кислоты в эритроцит происходит распад молекулы гемоглобина: тетрамер распадается на димеры и мономеры, что увеличивает осмотическое давление внутри клетки. Вода входит в эритроцит, растягивает мембрану до критической величины, в результате чего происходит разрушение мембраны и выход гемоглобина в раствор. Исследуя светопропускание взвеси эритроцитов, можно записать кинетику изменений объема эритроцитов. Данный метод оказался весьма информативным для модифицированных естественным или искусственным путем мембран эритроцитов: стали регистрировать интегральные, дифференциальные и разностные эритрограммы. Анализ последних позволяет характеризовать составные части пула эритроцитов здоровых и больных людей по их гемолитической стойкости. В качестве гемолитиков используют, кроме кислот, щелочи, гипотонические растворы, другие вещества. Таким образом, для исследования проницаемости биологических мембран существует ряд информативных методов; в зависимости от цели экспериментов необходимо применять адекватные методы и объекты исследования. 204
§ 7а. Пути проникновения веществ через биологическую мембрану Из вышеизложенного следует, что биологическая мембрана имеет высокоорганизованную структуру, которая содержит специализированные образования как для прохождения ионов по градиенту (каналы), так и для транспорта их против электрохимического градиента ("насосы"), функционирующие с затратой энергии АТФ, рецепторы, энергопреобразующие механизмы и структуры, обеспечивающие биоэлектрогенез, а также другие образования и молекулярные машины. Через биомембрану проникают вещества, необходимые для обеспечения жизнедеятельности клетки, и выводятся продукты обмена - газы, водорастворимые и жирорастворимые вещества. Биомебрана в состоянии перенести соединения, имеющие молекулярную массу от нескольких дальтонов до нескольких сотен килодальтонов (за счет пиноцитоза и фагоцитоза). Для понимания механизма переноса веществ через мембрану проанализируем пути проникновения, движущие силы и механизмы их транспорта. Очевидно, что для переноса различных веществ через мембрану существуют многие пути и механизмы в одной и той же клетке. В то же время у разных клеток одного и того же организма и организмов, стоящих на различных эволюционных ступеньках, имеются сходные пути, движущие силы и механизмы транспорта. Пути переноса веществ через биомембраны разнообразны для различных транспортируемых молекул и ионов. Однако переносимые соединения и ионы можно объединить в родственные группы по определенным характеристикам: молекулярной массе, электрическому заряду, количеству полярных групп или наличию ярко выраженной гидрофобности и т.д. Ионы, молекулы веществ могут проникать через мембрану по всей ее поверхности, через кинки в структуре липидного бирядного слоя, через каналы, "насосы", с помощью переносчиков (пермеаз). Крупные молекулы белков, ДНК, РНК, их комплексы могут проникать путем структурной перестройки биомембраны в виде фагоцитозных пузырьков. Ясно, что преобладающие пути проникновения для нейтральных молекул газов будут одни, для воды - другие, для ионов - третьи. По всей поверхности мембраны проникают вещества, хорошо растворяющиеся в липидах. С уменьшением полярности молекул в гомологическом раду класса веществ проницаемость их возрастает. Было выявлено, что наркотическое действие некоторых веществ пропорционально их растворимости в липидах. Молекула воды про205
никает через водосодержащие участки мембраны: каналы, кинки, заполненные водой поры, дефекты в жидкокристаллической структуре мембраны, через каналы эндоплазматической сети, открывающиеся на поверхности клеток при пино- и фагоцитозе. Молекулы диссоциирующих веществ (кислот, солей, оснований) в нераспавшемся состоянии могут транспортироваться через вещество мембраны, а ионы - через каналы, водосодержащие участки по электрохимическому градиенту. Известно, что уменьшение степени диссоциации молекул приводит в большинстве случаев к увеличению их проницаемости через мембраны. Силы, определяющие величину пассивной проницаемости веществ через мембрану, выражаются величинами градиентов. Под градиентом понимают разность величин, приходящуюся на единицу длины (см. главу 2). В клетке обычно выделяют следующие градиенты: концентрационный, электрический, температурный, градиент концентрации ионов водорода: Ce-Ci/Al; <р\-<ре/&1; или dC/dl; a>/dl. Если учесть, что толщина биомембраны колеблется в пределах 812 нм, то градиенты достигают огромных величин. Так, электрический градиент при трансмембранной разности в 100 мВ составит 100000 В/см; при разности температур между клеткой и межклеточной жидкостью в 0,1 °С температурный градиент составит 100000 °С/см. Сопоставимы с этими величинами и концентрационные градиенты. Это большие движущие силы, обеспечивающие значительную проницаемость веществ. На мембране при проникновении ионов концентрационный и электрический градиенты могут действовать в одном и том же направлении или в противоположных направлениях. Поэтому в данном случае говорят о наложении, суперпозиции градиентов, или об электрохимическом градиенте, когда активной силой будет определяющая, результирующая составляющая. Переносчиками мембраны являются специальные молекулы, способные вступать в непрочные соединения с транспортируемым веществом и в виде комплекса проникать через мембрану, а на противоположной ее стороне распадаться вновь на молекулу переносчика и на ион или молекулу транспортируемого вещества. Транспорт веществ осуществляется за счет разности физико-химических условий внутри клетки и в межклеточной жидкости или во внешней среде. Энергия АТФ в самом акте переноса веществ не расходуется, она требуется для поддержания постоянства физико-химических показателей в цитоплазме и на наружной поверхности клеток. 206
Было высказано мнение о том, что многие вещества имеют свои специфические переносчики, на роль которых стали претендовать фолиевые кислоты, пермеазы - ферменты-переносчики; были предложены схемы, объясняющие транспорт веществ через мембрану с участием переносчиков. Подчеркнем, что за счет переносчиков может идти противоградиентный перенос без затраты энергии фосфорных связей. Одновременно с падением интереса к изучению транспорта веществ за счет переносчиков возрастало количество исследований по каналообразователям и механизмам активного транспорта веществ, в первую очередь ионов. Противоградиентный перенос ионов мог быть объяснен использованием энергии АТФ в элементарном трансмембранном ионном транспорте. На эту роль претендовали крупные молекулы биополимеров, способные гидролизовать молекулу АТФ и использовать освобождаемую энергию для конформационных собственных перестроек, приводящих к трансмембранному транспорту определенного вида ионов. Такими молекулами, "насосами" мембран клеток оказались АТФазы: Na+-, К + -, Са + - и Н+-насосы. Механизмы функционирования "насосов" клетки будут рассмотрены ниже, а сейчас отметим признаки активного транспорта: - возможность противоградиентного трансмембранного переноса ионов; - использование для переноса энергию гидролиза АТФ; - наличие специализированных крупных молекул-ферментов, осуществляющих гидролиз АТФ, соединение с переносимым ионом, использование энергии гидролиза для ряда конформационных перестроек молекулы. При вторично-активном, или сопряженном, транспорте энергия АТФ расходуется на создание различных градиентов (концентрационного, электрического), а уже за счет уменьшения величины ранее созданных градиентов идет противоградиентный транспорт данного иона или молекулы вещества. В ряде случаев перенос ионов и молекул одного вещества происходит в зависимости от ионов и молекул другого соединения с использованием энергии АТФ (рис. 4.23). % 7б. Движущие силы мембранного транспорта Движущими силами пассивного переноса веществ через мембрану служат градиенты: 1) концентрационный - для нейтральных молекул; 2) электрохимический - для ионов; 207
Na
Сопряжение на переносчике
Сопряжение через Л рН
Сопряжение через Л Ф
Рис. 4.23. Сопряженный транспорт ионов и веществ через мембраны: а - апикальная мембрана клеток эпителия; б - внутренняя мембрана митохондрий; е~ - поток электронов по дыхательной цепи
3) осмотический и градиент гидростатического давления - для воды; 4) градиент парциальных давлений - для газов. Часто наблюдается суперпозиция градиентов. В этом случае движение ионов зависит от результирующей силы, что было зарегистрировано при развитии потенциала действия нерва и мышцы. При изменении проницаемости мембраны для ионов их направленное движение по каналам идет по концентрационному градиенту. Разница в величинах гидростатического и осмотического давлений в артериальном и венозном концах капилляра направляет выход воды из капилляра в артериальной его части и обратный перенос из тканей в венозный участок капилляра. Для направленного движения молекул газов в биомембране определяющим является градиент парциальных давлений (напряженность), существующий на мембране. Во всех перечисленных случаях движение нейтральных молекул и ионов идет по градиенту, "под гору", в соответствии со вторым началом термодинамики с возрастанием величины энтропии, уменьшением локальной свободной энергии. При сопряженном транспорте движение ионов или молекул одного вещества происходит против концентрационного градиента этого соединения или за счет движения других ионов по градиенту концентрации. § 7в. Механизмы пассивного мембранного транспорта Пассивный транспорт через мембрану происходит за счет концентрационного градиента для молекул неэлектролитов и за счет электрохимического градиента для ионов. Этот вид переноса веществ осуществляется путем простой и облегченной диффузии. Для ряда ионов облегченная диффузия реализуется в водных каналах, образуемых крупными молекулами белка. Облегченная диффузия может осуществляться подвижными переносчиками, которые пере208
водят комплекс после взаимодействия с переносимыми молекулами или ионами в жирорастворимое состояние. Образовавшееся соединение проходит по градиенту концентрации на противоположную сторону мембраны, где происходит отщепление переносимой молекулы от переносчика и переход ее из липидной фазы в водную среду. Изменение свободной энергии AG системы равно:
AG = RTlny = 2,3RTl^-, где R - универсальная газовая постоянная; Т - абсолютная температура; ci и С2 - концентрации веществ по обе стороны мембраны. Если транспортируется заряженная частица, то изменение свободной энергии переноса вычисляют по формуле: AG-2,3RTlg—+ z¥A
dmA.
С уменьшением разницы электрохимических градиентов /гцл и f*iA скорость диффузии вещества А уменьшается и диффузия прекращается, если/iiiA- /НА . Количественно процесс диффузии описывается формулой Теорелла для потоков вещества:
т-йП I
dt ' S ' где J - количество молей переносимого вещества А через площадку, равную 1см за единицу времени (с) в перпендикулярном направ209
лении к поверхности мембраны (размерность потока - моль/ (см •с)); dm/dt - число молей вещества, переносимого за единицу времени; S - площадь, через которую идет диффузия. Для простой диффузии движение через мембрану идет за счет концентрационного градиента. Формулу Теорелла в этом случае можно записать dt\ S dl, где u - подвижность молекулы (см • с"1 • Дж" моль); с - концентрация вещества А в точке 1 в момент времени t. Учитывая уравнение ft -/*o + RTlgc, тд,е/л - концентрационный химический потенциал „мо - стандартный химический потенциал, можно получить выражение для первого закона Фика: dm 1 _ n dc
dt S~
dx'
В условиях стационарного устойчивого состояния вместо производной от концентрации dc/dx используют разность концентрации вещества вне и внутри клетки, деленную на толщину мембраны: где Се и Cj - соответственно концентрации вещества снаружи и внутри клетки; 1 - толщина мембраны. С учетом же коэффициента распределения вещества в воде и мембране)? получают где Р -коэффициент проницаемости вещества, определяемый по формуле:
--£
Величина проницаемости мембраны для веществ при простой диффузии зависит от коэффициента диффузии в мембране (D) и коэффициента распределения ф ) их между водным раствором и липидной фазой биомембраны. Зная разность концентраций Се и ci и измерив величину потока J, можно вычислить значение коэффициента проницаемости по формуле J-P(Ce-G). Проницаемость мембраны для воды определяется аналогичным 210
образом, только вместо разности концентраций используют разность осмотических давлений наружного раствора л е и внутреннего содержимого клетки л \: Иногда проницаемость воды определяется по скорости изменения объема клетки в гипотонических и гипертонических растворах. В данном случае под коэффициентом проницаемости понимают количество воды, проникающей в единицу времени через единицу поверхности при разности осмотических давлений в одну атмосферу. Для многих неэлектролитов проницаемость биологических мембран хорошо коррелировала с их способностью к растворению в оливковом масле (рис. 4.24 и 4.25). Анализ приведенных результатов свидетельствует о том, что моВысокая проницаемость / \ 2
Гидрофобные молекулы
»j Бензол
Небольшие полярные молекулы
i -v-'-'l
Н,0
10"'
и О Глицерол СО
Мочевина Глицерол Большие незаряженные полярные молекулы
г
i™^ сахароза
^^^Ч X) и JJ
Триптофан Глюкоза 10"
CI"
Ионы
10 ' Искусственный липидный бислой
10' Низкая проницаемость
Рис. 4.24. Относительная проницаемость искусственного липидного бислоя для различных классов молекул
Рис. 4.25. Коэффициенты проницаемости искусственного липидного бислоя для различных молекул и ионов 211
лекулы, имеющие примерно одинаковую массу и размер, поступают через мембрану тем легче, чем выше их растворимость в липидах. Так, молекулы пропиленгликоля диффундируют через мембрану примерно в 20 раз быстрее мочевины. Однако проницаемость ряда неэлектролитов не подчиняется этой закономерности. Высокой проницаемостью обладают метанол, формамид, вода. Р.Колландер объяснил этот факт наличием в мембране неспециализированных каналов (пор), которые заполнены водой и легко пропускают молекулы малых размеров. Для растворенных в воде крупных молекул неэлектролитов остается путь проникновения через предварительное растворение в липидной фазе мембран, а это возможно только после разрушения всех водородных связей, образованных полярными группами молекулы с молекулами воды. В ряде случаев скорость диффузии некоторых водорастворимых веществ во много раз выше, чем скорость диффузии этих веществ в липидной фазе. Такое явление получило название облегченной диффузии. Облегченную диффузию в биомембранах осуществляют специфические молекулы (чаще всего белки), образующие каналы или связывающие транспортируемую частицу на одной стороне мембраны, переносящие ее в виде комплекса и отдающие в водную среду на противоположной стороне, без потребления энергии непосредственно в этом процессе. После отщепления транспортируемого иона молекулы переносчика возвращаются в исходное положение (рис. 4.26). Обнаружены белки-каналообразователи и подвижные белки-пеТранслортируемое вещает
"Понг
Транспортный белок, осуществляющий облегченную диффузию
Пинг"
Ф
Рис. 4.26. Схема, показывающая как конформационные изменения в белке-переносчике могли обеспечить облегченную диффузию незаряженного расворенного вещества А. Белок может существовать в двух различных конформациях, что приводит к транспорту вещества А по градиенту концентрации
212
ренрсчики. Для изучения механизма облегченной диффузии в экспериментах с искусственными мембранами широко применяют антибиотики. Примером подвижного мембранного переносчика может служить валиномицин, транспортирующий ион калия, а каналообразователя - грамицидин, осуществляющий трансмембранный перенос ионов натрия по градиенту концентрации. Зависимость скорости транспорта переносимых частиц от концентрации ионов показана на рис. 4.27.
Диффузия с помощью белка-переносчика
Рис. 4.27. Кинетика облегченной диффузии через мембраны при участии белкапереносчика и каналообразующего белка Концентрация транспортируемых молекул
Валиномицин, выделенный в 1955 г. Г.Брокманом, в неполярных растворителях легко связывается в устойчивые комплексы с ионами калия, рубидия, цезия, но почти не образует комплексов с ионами натрия. Отношение селективности по калию по сравнению с ионами натрия составляет 104 - 105 раз. В неполярных средах конформация валиномицина сходна с браслетом с шестью внутримолекулярными связями, а в воде она переходит в открытую форму. Ион калия проникает во внутреннюю полость антибиотика, почти точно соответствующую негидратированному иону калия (г - 0,133 нм) и рубидия (г - 0,149 нм). Но эта полость велика для иона натрия (г - 0,098 нм) и мала для иона цезия (г-0,165нм). Молекулярное окружение иона калия в валиномицине заменяет гидратную оболочку за счет комплексообразования шести ион-дипольных взаимодействий иона с переносчиком. Внешняя сфера комплекса за счет молекулы валиномицина остается гидрофобной и легко проницаемой для бирядного слоя липидов мембраны. Валиномицин снижает энергетический барьер проница213
емости липидных слоев, он активен при концентрациях 10" - 10" моль/л, которые не изменяются в процессе переноса ионов. Четко выражен феномен насыщения при увеличении концентрации ионов калия ("субстрата"), что описывается уравнением Михаэлиса-Ментен для ферментов. Валиномицин во многих отношениях к транспорту ионов калия и рубидия подобен ферменту. К тому же валиномицин, проявляя биологическую активность, служит высокоэффективным антимикробным средством. Подобное действие проявляют антибиотики энниатиновой группы, но их меньший эффект переноса объясняют более открытой структурой комплекса и более выраженным контактом гидрофильной части иона с гидрофобным слоем мембраны. Особый интерес исследователей привлекли антибиотики с незамкнутой полиэфирной цепью - моненсин, нигерицин, кальцимицин и др. как переносчики ионов кальция. Ион Са 2 + удерживается за счет ион-дипольных взаимодействий между двумя молекулами антибиотика ("модель сандвича"). На основе принципов функционирования ионофоров в фармакологии, химической и медицинской технологии используют синтетические молекулярные "ловушки" для ионов и полярных соединений, например, полиэфиры или "краун-эфиры". Они избирательно взаимодействуют с ионами ряда металлов и аминокислотами. Необходимо подчеркнуть, что ионофоры до настоящего времени достоверно не обнаружены в биологических мембранах. Многочисленные исследования ионной проводимости биологических мембран неоспоримо доказали функционирование неподвижных переносчиков, осуществляющих облегченную диффузию путем образования ионных каналов. Впервые идею о функционировании мембранных каналов высказали в 40-50-х гг. XX в. А.Ходжкин и Э.Хаксли для объяснения возникновения и распространения нервного (электрического) импульса. Каналы должны обладать селективностью и обратимо менять ионную проницаемость биологических мембран в доли секунды. На роль ионных каналов были выдвинуты белки-каналообразователи, что хорошо согласовывалось с теорией и экспериментальными результатами по изучению кинетики мембранной проницаемости для ионов во время развития возбуждения в нервной и мышечной тканях и клетках. Сущность белков-каналообразователей была раскрыта благодаря усилиям ряда ученых, использовавших такие антибиотики, как грамицидин А, амфотерицин В, аламетицин и др. 214
Грамицидин был выделен Р.Дюбо (1939). Молекулярная структура его была исследована в 1965 г. Р.Сарджером и Б.Виткопом. Ими было установлено, что грамицидин - линейный пентадекапептид с чередующимися L- и D-конфигурациями аминокислотных остатков. К -1976 г. С.Хладки и Д.Хейдон окончательно обосновали положение о том, что грамицидин формирует мембранный канал. Согласно модели Д.Урри (США) и Г.Рамачандра (Индия), предложенной в 1971-1972 гг., две молекулы грамицидина образуют полый цилиндр, в котором полярные группы находятся внутри. По модели Э.Блоутера и Б.Витчема (1974), две молекулы грамицидина образуют двойную спираль с осевой полостью около 0,3 нм. За одну секунду по каналу может проходить до 10 ионов, что примерно в 1(граз превышает производительность действия белков-переносчиков. Такой антибиотик, как амфотерицин В, образует агрегаты из 816 молекул, обращенных к водной среде и составляющих полупору; две полупоры формируют канал. Особый интерес как модель потенциалзависимого ионного канала представляет пора, состоящая из 6-10 молекул амфотерицина с внутренним диаметром до 1,5 нм. Такие каналы увеличивают проницаемость липидных мембран для одновалентных ионов при приложении электрического поля. В отсутствие электрического поля ион-проводящие каналы не формируются. При приложении разности потенциалов к мембране происходит ее конформационная перестройка, заканчивающаяся появлением ион-проводящих форм. По гипотезе Р.Мюллера, молекулы аламетицина, сконцентрированные на поверхности мембраны, под действием электрического поля ориентируются перпендикулярно к поверхности мембраны за счет взаимодействия поля с полярной С-концевой частью молекулы, тогда как гидрофобная а-спиральная часть остается погруженной в липидную фазу. Карбонильная группа а—спирали с высоким дипольным моментом смещается в противоположную сторону, формирует ионный канал. Эту модель можно использовать как простейшую электровозбудимую структуру. Белки-каналообразователи были обнаружены в биомембранах. Ионные каналы биомембран - это специализированные, селективные поры, образованные белковыми молекулами, предназначенные для облегченной диффузии определенных ионов (Na+, K+, + Са ,СГ). Ионные каналы расположены в наружной клеточной мембране и мембранах ряда органелл (митохондрии, эндоплазма215
тическая сеть, саркоплазматический ретикулум и др.). Выделяют три самостоятельные транспортные системы в возбудимых мембранах - Na+-, K+-, Са2+-каналы, сходные по своим функциям, но отличающиеся избирательностью (селективностью), что позволяет говорить об общности происхождения этих образований в процессе эволюции. Для исследования структуры и функций ионных мембранных каналов используют ряд методов. Высокоинформативным оказалось использование селективных блокаторов ионных каналов. Тетродотоксин, сакситоксин, батрахотоксин избирательно блокируют натриеые и тетраэтиламмоний-калиевые каналы, изоптин, лантан кальциевые каналы. Метод измерения воротных токов (флуктуации ионных токов) позволил изучить функционирование одиночных каналов. В возбудимых мембранах число ионных каналов на 1 мкм поверхности мембраны достигает нескольких сотен. Пропускная способность одиночного натриевого канала составляет 10 ионов/с, проводимость составляет от 1-2 до 10 пСм. Модель ионного канала включает ряд функциональных образований. С внешней стороны мембраны у входа в канал расположен селективный центр (центр узнавания), в основе функционирования которого лежит принцип стерического соответствия. Его назначение - не пропускать в канал или из канала ионы большего и меньшего размеров, а со стороны цитоплазмы располагаются так называемые "ворота", которые управляются трансмембранным электрическим полем при помощи конформационно-лабильного электрического сенсора. По каналу ионы проходят по эстафетному принципу, друг за другом. Ворота могут находиться в двух состояниях: "открыто 3ft: закрыто". Решающую роль в функционировании канала играет электростатический заряд его внутренней поверхности, что делает ее гидрофильной, проницаемой для ионов. Определенную роль при этом выполняет подвижность липидного окружения. Модель ионного канала объясняет многие экспериментальные данные и обладает предсказуемостью. Б.Хилле считает, что механизм проведения ионов связан со способностью отрицательно заряженного атома кислорода селективного центра взаимодействовать с молекулой воды катиона или ионами, имеющими - ОН-и - NHj-группы, путем образования водородных связей, что обеспечивает скольжение иона по каналу. Гидрофобные группы молекул (-СНз) не в состоянии этого сделать. Вот 216
+
почему, по его мнению, гидроксиламин НзМ -ОН и гидразин H3N NH2 проходят по натриевому каналу, а метиламин Ы+Нз-СНз не проходит. Селективность ионного канала не абсолютна. Натриевый канал пропускает ионы Na + , Ii + , К+, Rb+, Cs + в разной степени. Приняв проницаемость ионов натрия за единицу, получают ряд проницаемости этих ионов: 1:1,1:0,083:0,025:0,016. Ряд малых органических катионов проходит по натриевому каналу. Б.Хилле (1984) указывает на такую последовательность: натрий>гидроксиламин>гидразин>аммоний « формамидин » гуанидин гидроксигуанидин >аминогуанидин»метиламмоний. Метальная группа в отличие от гидроксильной и аминогруппы не образует водородных связей. Замена в органическом ионе -ОН" и -NHJ групп на метальную затрудняет его прохождение по каналу. Размеры входа в натриевый канал по модели Б.Хилле 0,3 х хО,5 нм. И он имеет прямоугольную форму. Селективный фильтр канала включает 8 атомов кислорода, которые взаимодействуют путем образования водородных связей с молекулой воды проникающего иона натрия, который был частично дегидратирован при входжении в канал. Для установления структуры и выяснения механизма функционирования ионных каналов много информации дал метод ингибиторного анализа. Одна молекула тетродотоксина и сакситоксина блокирует один натриевый канал, что позволило определить их количество на единицу поверхности мембраны и изучить воротные токи. Деполяризация мембраны смещает ионы кальция, находящиеся в ионном канале, что приводит к изменению положения частиц канала и переводит канал в состояние "открыто-закрыто". Теоретические расчеты хорошо согласуются с полученными экспериментальными данными. Установлена экспоненциальная зависимость между начальным изменением мембранного потенциала и пиковым значением ионной проводимости для натрия: деполяризация мембраны на 4-6 мВ приводит к е-кратному повышению проводимости gNa++ + 8Ыа тах о и 8Na ~ 1+bexpi-zaF/RT)1 где b - множитель, не зависящий от <р\ г - валентность гипотетического иона; а - число, выражающее долю напряжения, действующего на ион. Если каждый ионный канал может находиться только в одном состоянии "открыто-закрыто", то количество активированных кана217
лов обеспечивает разную степень деполяризации при действии различных факторов на возбудимую мембрану, что может привести к возникновению потенциала действия. Механизмы активного мембранного транспорта Выше было показано, что активный транспорт - это трансмембранный перенос ионов против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ специальными транспортными АТФазами. Принцип работы АТФаз-насосов основан на конформационных перестройках белковой макромолекулы при взаимодействии с транспортируемым ионом. Кальциевый насос представлен АТФазой - полипептидной цепью с молекулярной массой около 100 000 Да. В.Б.Ритов и Ю.А.Владимиров выделяют четыре этапа процесса переноса кальция (рис. 4.28). мембрана
Ф-(
( Са" Са"
—•*•
Рис. 4.28. Основные этапы сопряженного с гидролизом АТФ переноса ионов кальция через биологическую мембрану. Конформационные изменения фермента обеспечивают активный транспорт ионов (пояснения в тексте)
П е р в ы й этап работы Са -АТФазы - связывание компонен+ 2+ тов: иона Са с комплексом Mg-АТФ. Присоединение ионов Mg и -2+ Са идет на наружной поверхности саркоплазматичсской мембра218
•J 1
ны к разным участкам переносчика. При связывании иона Са освобождается энергия в 37,4 кДж/моль: Са 2 + + АТФаза + (Mg2+-ATO) - Ca2+-ATOa3a-Mg2+-ATO. Константа связывания иона Са + составляет 10 л/моль. В т о р о й этап работы насоса - гидролиз АТФ с образованием фермент-фосфатного комплекса (Е ^ Ф ) . Константа связывания около 5- 105 л/моль. Переход комплекса Е-АТФ в Е-АДФ происходит с малым перепадом энергии. Свободная энергия гидролиза АТФ израсходовалась на синтез Е 'уф. Т р е т и й этап работы фермента - транслокация: переход центра связывания кальция на противоположную (внутреннюю) сторону мембраны. Для отрыва прочно связанных ионов кальция необходима энергия, которая доставляется за счет гидролиза макроэрга АТФ. Транслокация идет с затратой энергии около 19,6 кДж/моль или около 17,8 кДж/моль расходуется на переход связанного в комплексе иона кальция в растворимое состояние. Суммарная затрата энергии на перенос через мембрану и освобождение иона Са + на внутренней поверхности мембраны требует затрат 19,6 + 17,8 - 37,4 (кДж/моль). При гидролизе одного моля АТФ освобождается около 40 кДж, что достаточно для переноса двух молей ионов Са 2 + через мембрану из цитоплазмы, где концентрация их (1+ 4)- 10 моль/л, внутрь саркоплазматического ретикулума, где концентрация Са равна (1 + 10) • 10' 3 моль/л. Ч е т в е р т ы й этап функционирования кальциевого насоса состоит в конформационных перестройках, приводящих к транслокации кальцийсвязывающих центров на наружную сторону мембраны (в исходное положение). Таким путем завершается цикл переноса иона кальция против концентрационного градиента за счет использования энергии гидролиза АТФ. Более сложную структуру и механизм функционирования имеет Na -К -насос, осуществляющий в обычных условиях противоградиентный перенос через мембрану трех ионов натрия из клетки и накачивающий два иона калия внутрь клетки. Условно в работе Na+К -насоса выделяют шесть этапов (рис. 4.29): + 1. Связывание трех ионов Na и фосфорилирование АТФазы на внутренней поверхности мембраны: 3Na+ + М§2+-АТФ + Е -• 1^2+-АДФ + (ЗЫа+)-Е~Ф. 2. Транслокация комплекса со связанными ионами натрия на наружную поверхность мембраны. 3. Перевод ионов натрия в межклеточную жидкость и присоединение из нее двух ионов калия: 219
Внеклеточное пространство
1
Цитоплазма
Рис. 4.29. Схема функционирования Na+, K+АТФазы
Е * O(3Na+) + 2К+ -• Е ~ ф(2К + ) + 3Na+. 4. Гидролиз АТФ с отщеплением молекулы фосфорной кислоты: + + Е~Ф(2К ) - Е ( 2 К ) + Ф . + 5. Вторая транслокация: перенос связанных ионов К через мембрану с наружной поверхности на внутреннюю: Е(2К+) - (2К+) Е . 6. Завершение цикла: отсоединение двух ионов калия, присоединение трех ионов натрия и фосфорилирование молекулы АТФазы: 3Na+ + Mg2+-ATФ + (2К+) - Е - 2К+ + Mg^-АДФ + Ша + )-Е~Ф. При обычном режиме функционирования Na+-K+-Hacoca внутрь + + клетки переносится 2К и выводится 3Na , что приводит к нарушению электронейтральности и появлению разности потенциалов между внешней средой и цитоплазмой. Внутренняя сторона мембраны заряжается отрицательно по отношению к наружной. Следовательно, Na -К -насос функционирует как электрогенный механизм. При изменении соотношений концентраций ионов натрия и калия, величины потенциала покоя и других условий перенос ионов натрия и калия может происходить в соотношениях 1:1, 2:1, 3:1. 220
Кинетика активного транспорта ионов зависит от соотношения констант ке и к|, т.е. диссоциации комплекса иона - фермента на наружной и внутренней стороне мембраны клетки. Поток ионов направлен туда, где диссоциация комплекса выше и ниже константы связывания. Электрический градиент замедляет работу насоса, если движение ионов идет против градиента, и ускоряет, если положительный ион движется в отрицательно заряженную область. В оптимальных условиях максимальная проводимость помпы ограничена коэффициентом проницаемости мембраны для комплекса ион - фермент. Поток ионов будет прямо пропорционален концентрации молекул-переносчиков в мембране (транспортной АТФазы). Транслокация комплекса и транспортной АТФазы зависит от липидного состава мембраны, который регулируется изменением соотношения ненасыщенных жирных кислот к насыщенным и содержанием холестерина. Механизмы сопряженного мембранного транспорта Перенос через мембрану ионов и молекул может определяться предварительным или одновременным переносом ионов, создающих градиент концентрации ионов или электрический градиент, под влиянием которых и осуществляется транспорт агентов. Для переноса ионов Са + и фосфорной кислоты внутрь митохондрий достаточно создания электрического градиента за счет активного транспорта протонов из митохондрии в цитоплазму. Проницаемость фосфорной кислоты внутрь митохондрий в конечном счете определяется транспортом протонов наружу, созданием градиента концентрации ионов водорода, который сопрягает перенос протонов из митохондрии с переносом фосфорной кислоты внутрь ее. Сопряженный перенос Сахаров и аминокислот с транспортом ионов детально изучен в клетках эпителия кишечника теплокровных животных. В кишечнике, почках, легких, в капиллярах транспортируемые вещества проходят через слой клеток, систему мембран, поэтому такой транспорт называют трансцеллюлярным или трансэпителиальным. С учетом того, что транспорт через ряд мембран принципиально не отличается от транспорта веществ через единичную мембрану, рассмотрим трансмембраиный перенос молекул Сахаров и аминокислот через одну из них. Всасывание Сахаров и аминокислот из просвета тонкого кишечника в серозную часть, а в конечном счете в просвет венозной части капилляра имеет ряд особенностей, позволяющих говорить об облегченной диффузии с участием подвижного переносчика и о сопряжении транспорта органи221
ческого соединения с одновременным переносом иона натрия, а именно: 1. Эффект насыщения: при определенной концентрации субстрата скорость переноса остается постоянной, несмотря на увеличение концентрации переносимых веществ. 2. Эффект взаимного конкурирования: ряд Сахаров тормозит транспорт друг друга. 3. Стереоспецифичность: различная скорость транспорта при одних и тех же условиях через мембрану для лево- (L) и правовраща-
шшж т
Рис. 4.30. Схема процессов эндоцитоза (Л), экзоцитоза <Б) и отпочковывания ( В) 222
ющих (D) форм. Скорость переноса L-аминокислот выше, чем их D-формы, а L-сахаров ниже, чем D-сахаров. 4. Эффект специфического ингибирования транспорта ряда соединений. Перенос Сахаров подавляет флоридзин, а транспорт аминокислот остается при этом без изменений. Сопряжение транспорта Сахаров и аминокислот с переносом ионов натрия происходит на молекуле-переносчике. Об этом свидетельствуют следующие факты: транспорт этих органических соединений идет только в присутствии ионов натрия. При достаточно высоком значении электрохимического градиента ионов натрия транспорт Сахаров и аминокислот может происходить против их концентрационного градиента. Внутрь клеток эпителия ионы натрия поступают по концентрационному и электрическому градиентам, а выход в межклеточную жидкость, в плазму крови капилляра идет против концентрационного градиента и против электрического поля за счет активного транспорта (Na+, К+-АТФазы). Движущей силой переноса Сахаров и аминокислот является электрохимический градиент ионов натрия. Такой вид трансмембранного переноса называется вторичным активным транспортом. Из цитоплазмы эпителия кишечника в серозную часть, в межклеточную жидкость, в плазму крови сахара и аминокислоты проникают пассивно по градиенту концентрации без сопряжения с переносом неорганических ионов. Ряд высокомолекулярных веществ может транспортироваться через мембраны за счет их структурных перестроек, получивших название эндоцитоза, экзоцитоза и отпочковывания (рис. 4.30). § 8. Электропроводность биологических систем Электропроводность биологических систем - это количественная характеристика способности биомембран, клеток, тканей проводить электрический ток. Электропроводность обратно пропорциональна величине электрического сопротивления системы. Величины электропроводности несут информацию о функциональном состоянии тканей и органов, об изменениях в них, наступающих под действием физических, химических и ряда других факторов. В медицине величины электропроводности могут характеризовать воспалительные процессы, изменения проницаемости мембран клеток, тканей, изменения кровенаполнения органов (методы реографии). Если на объект подать разность потенциалов (U), то, согласно за223
кону Ома, через объект потечет электрический ток силой (I), пропорциональный электропроводности (G): I = UG. Так как. живой организм, его клетки, ткани являются проводником второго рода, то перенос электрического тока зависит от величины направленного движения ионов в электрическом поле. Чем больше свободных подвижных ионов, тем выше электропроводность объекта. В клетках животных основные катионы - это ионы калия и основные анионы, в первую очередь - ионы органических кислот (угольной, лимонной, уксусной, молочной и др.). В межклеточной, межтканевой жидкостях животных основными ионами являются натрий и хлор. Ионы биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, их комплексов) не оказывает заметного влияния на величины электропроводности. Измерение электропроводности биологических объектов проводят на постоянном и переменном токах прямоугольной или синусоидальной формы с частотами от долей герца до 10 1 0 Гц. При пропускании постоянного тока через биологический объект наблюдается падение величины тока за счет развития поляризационных явлений на границах раздела в объекте. Различные виды поляризации обусловлены наличием в биологических объектах свободных и связанных зарядов, гетерогенностью строения клеток, наличием мембран и поверхностей раздела. Свободные заряды (ионы, электроны) перемещаются под действием электрического поля, создают ток проводимости. В клетках подвижность ионов офаничена наличием многочисленных мембран компартментов, на которых создается ЭДС обратного направления по отношению к приложенному. Связанные заряды крупных органических ионов, мембран, органелл перемещаются в узких пределах, формируя токи смещения. Выделяют несколько видов поляризации. Электронная поляризация - смещение электронных орбит атомов относительно положительно заряженных ядер под действием приложенного электрического поля. Возникающий дипольный момент молекул имеет небольшую величину. Время образования и устранения электронной поляризации (время релаксации) находится в пределах 10' 1 б -10" 1 4 с. Ионная поляризация - смещение иона в кристаллической решетке с возникновением ЭДС обратного приложенному направления. Время релаксации ионной поляризации 1 0 - 1 0 " с. Электронная и ионная поляризации не играют существенной роли в биологических объектах. 224
Дипольная (ориентационная) поляризация свойственна полярным молекулам. Вода, спирты, белки обладают значительными дипольными моментами. Время релаксации (т) дипольнсй поляризации колеблется от 10 до 10" си определяется по формуле: г -4^j/r3/kT, где п - вязкость среды; г - радиус молекулы; Т - абсолютная температура. Макроструктурная поляризация зависит от неоднородности электрических свойств проводящей среды и связана с чередованием слоев высокой и низкой проводимости и накоплением свободных зарядов на границе слоев с низкой проводимостью, что свойственно биологическим объектам с их гетерогенностью и развитой сетью мембран и мембранных структур, имеющих сопротивление порядка 1000 Ом/см . Время релаксации макроструктурной поляризации 10" 8 -10" 3 с. Поверхностная поляризация свойственна поверхности с двойным электрическим слоем. В электрическом поле происходит смещение ионов диффузной части в одну, а частиц - в противоположную стороны. Время релаксации - 10 - 1 с. Электролитическая поляризация означает изменение концентрации зарядов в приэлектродном слое. Время релаксации этой поляризации-10" - Ю с . Для устранения различных видов поляризации измерение электропроводности проводят на переменном токе различной частоты. 10 На высоких частотах (10 - 10 Гц) поляризация практически исключается. Свойства границ раздела можно описать, вводя понятия реактивного (емкостного) Хс и активного (омического) сопротивлений. Реактивное сопротивление Хс зависит от частоты, на которой проводится его определение: Хс ~ 1/ сое, где с - емкость системы, со - круговая частота, которую рассчитывают по формуле: со - In f, где f частота в герцах. Общее сопротивление Z (импеданс) при последовательном соединении Z - R + Хс, где R - омическое сопротивление. При параллельном соединении реактивного и активного сопротивлений импеданс равен: Z - R / V I + C ^ R V . Для измерения импеданса биологических объектов используют мосты постоянного и переменного токов; применяют металлические и угольные электроды. Для измерения импеданса цитоплазматических мембран используют неполяризующиеся электроды (хлорсе225
ребряные). Микроэлектрод вводят в клетку, а второй (макроэлектрод) находится снаружи. Величина поляризации зависит от многих факторов: приложенной к системе разности потенциалов, площади электродов, сопротивления системы, частоты измерения. Для уменьшения плотности тока используют платиновые электроды, покрытые губчатым слоем платиновой черни, что увеличивает эффективную поверхность электродов в 1000 раз. Из-за высокой степени поляризации на постоянном токе электродов и мембран биообъектов измерение электропроводности проводят на переменном токе низкой и высокой частот. Для однозначной интерпретации результатов по измерению электропроводности биологических систем используют эквивалентные схемы, состоящие из комбинации емкостей и активных сопротивлений, которые служат эквивалентами структур клеток и тканей. Поляризационные явления уменьшаются с увеличением частот, на которых проводят измерения. Следовательно, емкостное (реактивное) сопротивление при этом падает. Зависимость импеданса или емкостного сопротивления от частоты называют дисперсией электропроводност и. На частотах 10 Гц и выше импеданс зависит только от величины активного сопротивления (R) цитоплазмы и межклеточной жидкости. Выделяют a—,fi— и у-виды дисперсии, а- дисперсию наблюдают в диапазоне частот 10 - 10 Гц. Она зависит от устранения поляризации границ раздела (в первую очередь мембранной поляризации) и неоднородностей структуры. При гибели, медленном отмирании тканей происходит возрастание электропроводности на низких частотах, что объясняют повышением проницаемости биомембран для ионов. Б.Н.Тарусов предложил определять коэффициент дисперсии К - RH/RB, где RH и RB соответственно сопротивления, измеренные на низкой и высокой частотах. Выбор частот определяется диапазоном а-дисперсии. Для мышечной ткани RH - 10 Гц, RB - 10 Гц, для клеток крови и жиро4 вой ткани RH = 10 Гц, RB - ю ' Г ц , для кожи RH - 10 , RB - 10* и т.д. Можно вычислить ионную проводимость и объем межклеточных промежутков и цитоплазмы, проницаемость мембран для ионов, величины емкости биомембран. Физические (ионизирующее и ультрафиолетовое излучения, по226
вышение температуры) и химические факторы (кислоты, щелочи, спирты, органические растворители) обычно увеличивают проницаемость мембран для ионов, что приводит к уменьшению импеданса и емкостного сопротивления. Измерение активного сопротивления, емкости и дисперсии электрического сопротивления позволили вычислить статическую емкость мембраны клетки. Ее величина оказалась около 1 мкФ/см , а это, в свою очередь, обосновало предположение о том, что толщина липидного биослоя составляет 5,0-6,0 нм. Сопротивление миоплазмы, аксоплазмы и цитоплазмы всего в 2 3 раза выше сопротивления межклеточной жидкости и сыворотки крови, а сопротивление цитоплазматической мембраны оказалось выше в десятки тысяч раз. Эти характеристики нервного волокна легли в основу формирования "кабельной" теории проведения нервного импульса. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Дать определение биологическим мембранам. 2. Какие виды мембран описаны? 3. Выделите основные функции биологических мембран. 4. Какие существуют группы методов изучения биологических мембран, относящиеся к биологическим наукам и дисциплинам? 5. Какие выделяют биофизические методы исследования структуры, параметров, свойств, функций биомембран? Что их объединяет, каковы их особенности и отличия от методов других биологических наук? 6. Какими методами изучают динамику изменений параметров и функций мембран? 7. Какую информацию можно получить о биологических мембранах, их свойствах при применении методов ЭПР, ЯМР и флуоресцентной спектроскопии? 8. Какими методами изучают фазовое состояние липидов в мембране и фазовые переходы? 9. Охарактеризуйте наиболее информативный метод, позволяющий изучать динамику изменения параметров мембраны при протекании различных биологических процессов и реакций. 10. Охарактеризуйте подвижность липидов и белков в мембране. 11. Что представляют собой силы, стабилизирующие структуру мембран? 12. Что такое фазовое состояние и фазовые переходы в мембранах? 13. Почему нормально функционировать могут только асимметричные мембраны? 14. Как создается и поддерживается асимметрия мембран? 15. Какие надмолекулярные липидные структуры образуются в воде и неполярных растворителях? 16. Как получают искусственные мембраны? 17. Назовите основные модели биомембран. 18. Какие вещества транспортируются через биологические мембраны? 227
19. По каким признакам транспорт веществ подразделяют на пассивный и активный? 20. Назовите основные пути проникновения молекул и ионов через мембрану. 21. Какие силы обеспечивают траисмембранный транспорт веществ? 22. Каковы основные механизмы пассивного транспорта? 23. Как осуществляется облегченная диффузия? 24. Как функционируют подвижные переносчики и каналообразователи? 25. Выделите принципы и основные этапы работы Са - насоса и Na - К - насоса. 26. Как клетки и ткани проводят постоянный и переменный электрический ток? 27. Назовите виды поляризации в веществе и биологической ткани. 28. Что такое импеданс биологической ткани и клеток? 29. Охарзктеризуйтеа-,/?- и у-дисперсии электропроводности.. СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Б е р г е л ь с о н Л.Д. Мембраны, молекулы, клетки. М., 1982. 183с. Б и о л о г и ч е с к и е мембраны. Методы /Пер. с англ./ Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза.М., 1990. 424 с. Б и о ф и з и к а : Учебник/ Под ред. П.Г.Косткжа. Киев, 1988.504 с. Б и о ф и з и к а : Учебник/ Под ред. 1О.А. Владимирова. М., 1983. 272 с. В о л ь к е н ш т е й н М. В. Биофизика. М., 1981. 575 с. В в е д е н и е в мембранологию: Учебное пособие/ Под ред. А.А.Болдырева. М., 1990.208 с. В о л о т о в с к и й И.Д., X о в р а т о в и ч В.И., Б а р а н о в а Л.А. Транспорт ионов в фоторецепторной клетке. Минск, 1990. 222 с. Г у б а н о в Н И . , У т е п б е р ге п о в А.А. Медицинская биофизика. М., 1978. 336 с. К а га в а Я. Биомембраны. М., 1985. 303 с. К о н е в СВ., А к с е н ц е в С.Л., В о л о т о в с к и й И.Д. Откровения двухмерного мира. Минск, 1981. 175 с. К о т ы к А., Я н а ч е к К. Мембранный транспорт. Междисциплинарный подход/ Пер. с англ. М., 1980. 341 с. М о л е к у л я р н а я биология/ Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Льюис и др. - М., 1986. Т.2. 312 с. О в ч и н н и к о в Ю.А. Биоорганичсская химия. М., 1987. 815 с. Р у б и н А.Б. Биофизика: Учебник. М., 1987. Кн.2. 303 с. Р ы б и н И.А. Лекции по биофизике: Учебное пособие. Свердловск, 1990. 235 с. Х о д ж к и н А. Нервный импульс/ Пер. с англ. М., 1965. 125 с. Ф р а й ф е л ь д е р Д. Физическая биохимии. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии/ Пер. с англ. М., 1980. 582 с.
228
ГЛАВА 5 КВАНТОВАЯ БИОФИЗИКА §> 1. Физико-химические основы фотобиологических процессов Квантовая биофизика изучает электронную структуру биологически важных молекул (преимущественно макромолекул), электронные переходы в этих молекулах и пути превращения энергии возбужденного состояния молекул в энергию их продуктов. Биофизика фотобиологических процессов изучает закономерности и механизмы действия оптического излучения на биологические системы различной сложности организации. Под оптическим понимают ультрафиолетовое, видимое и инфракрасное излучения. Квантовая биофизика рассматривает: структуру электронных энергетических уровней биомолекул; их донорно-акцепторные свойства; электронные переходы при поглощении и испускании света веществом; свойства свободных радикалов и механизмы свободнорадикальных процессов; механизм хемилюминесценции, обусловленной процессами превращения энергии, выделяющейся в ходе биохимических реакций, в энергию электронно-возбужденных состояний. В принципе многими из этих вопросов занимается и биофизика фотобиологических процессов, однако основной задачей ее является выяснение химических превращений электронно-возбужденных молекул, определение природы первичных лабильных и последующих стабильных фотопродуктов и их реакционной способности. Другими словами, биофизика фотобиологических процессов рассматривает вопросы, связанные с изучением физико-химических основ действия света (в широком смысле этого слова) на биосистемы. Решение обсуждаемых вопросов представляет значительный теоретический и практический интерес, в частности для медицины. Например, знание отдельных стадий, особенно первичных, воздействия ультрафиолетовой радиации и видимого света на живые организмы - теоретическая и практическая основа фото- и фотохемотерапии. Эти же знания необходимы при использовании оптического излучения для регуляции нормальной жизнедеятельности организмов, а также для регулирования свободнорадикальных реакций при лечении многих патологических процессов. Фотобиологические исследования способствовали раскрытию механизмов электронноконформационных взаимодействий в биосистемах. 229
Фотобиологические процессы весьма разнообразны: фотосинтез, зрение, фоторецепторные реакции, деструктивно-модифицирующее действие оптического излучения и др. Во всех фотобиологических процессах свет индуцирует фотохимические реакции: энергия света необходима для преодоления активационных барьеров химических превращений биомолекул. Отдельный фотобиологический процесс представляет собой сложную последовательность различных стадий: поглощение энергии фотона хромофорной группой биомолекулы и образование электронно-возбужденных состояний системы-* миграция энергии электронного возбуждения -» первичный фотофизический акт и появление первичных фотопродуктов •* промежуточные стадии, включающие перенос заряда -* образование стабильных химических продуктов -• физиолого-биохимические процессы -* конечный фотобиологический эффект. Следовательно, фотобиологическая реакция имеет в начале чисто физический, а в конце - чисто биологический характер. Последние стадии фотобиологического процесса относятся к области физиологии и биохимии, поэтому мы сосредоточим свое внимание на анализе первичных и начальных стадий фотобиологических процессов ввиду их принципиальной общности для всех фотобиологических реакций. § 2. Взаимодействие квантов света с биологически важными соединениями Для того чтобы данный раствор или вещество поглощали энергию падающего пучка света, необходимо выполнение ряда условий. 1. Соблюдение энергетических условий. Частота поглощаемого излучения (v) должна соответствовать выражению Бора: v - (Е2 -Ei)/h, где h - постоянная Планка, равная 6,6256- 10' 2 7 Эрг • с; Eiэнергия основного состояния молекулы; Ег - энергия возбужденного ее состояния. Смысл этого уравнения заключается в том, что энергия кванта (фотона) поглощается веществом целиком, а не по частям. Следовательно, Ег-Ei - hv - hc/Д , так как v - с/Д (с - скорость распространения света в вакууме, А - длина волны света). Величина hc/A представляет собой энергию света с длиной волны А , поглощаемую одной молекулой. Умножив ее на число Авогадро (6,02210 ), получают количество поглощенной энергии на 1 моль вещества, получившей название Эйнштейн. 2. Содержание в падающем пучке света таких фотонов, которые имели бы возможность взаимодействовать с осциллятором или ротатором молекулы. Ротатор - компонент молекулы, связанный с 230
вращением, а осциллятор связанный с колебанием групп или молекул вещества. Наиболее важным типом взаимодействия является взаимодействие электрического поля световых колебаний Е и дипольного момента молекулы Р. Чтобы осциллятор (хромофорная группа: >С=С<, > О 0 , >OS, -ОН, -SO3H, -NH2, -СООН, -NH) поглощал энергию, электрическое поле падающего света должно иметь составляющую, параллельную его дипольному моменту. Аналогичное условие ротатора состоит в том, чтобы падающий свет имел составляющую, перпендикулярную оси вращения молекулы. Ниже показаны возможные случаи взаимодействия составляющих электрического поля падающей световой волны (Е х и Еу) с дипольным моментом ротатора и осциллятора. X
Su
,Ех
J 'Е
Т
р
^Z
А
р н. P "*
Б
ttt Е Р Р
Пусть свет распространяется в направлении Z. Компоненты, взаимодействующие с вращением: А Б Ех и Е у Е у с колебанием: Ех > А - диполи ориентированы по направлению распространения света, Б - диполи ориентированы перпендикулярно к направлению распространения света. 3. Необходимость учета правил отбора. Вероятность поглощения кванта зависит, кроме рассмотренных условий, и от разрешенное™ перехода: правилами отбора разрешены не все переходы. Наиболее вероятны (интенсивны) только те, которые происходят между состояниями одинаковой мультиплетности, т.е. синглет-синглетные или триплет-триплетные переходы. Поглощение атомами энергии фотона характеризуется отдельными линиями в спектре, отражающими чисто электронные переходы. Каждый электрон в молекуле находится на определенной орбитали (а, п% п-орбитали) и обладает определенной энергией, поэтому в молекуле существует система электронных энергетических уровней. Электронные уровни в молекулах представлены семейством колебательных подуровней, а каждый колебательный подуровень - семейством вращательных (рис. 5.1). 231
I,
w - Э1
Рис. 5.1. Схема энергетических уровней молекул. Линии обозначают энергетические уровни молекулы; расстояния между линиями соответствуют дискретным значениям изменения энергии молекулы. Э1 - совокупность линий, обозначающих один электронный уровень, распадающийся на колебательные и вращательные подуровни; Э2 - другой электронный уровень; Kl, К2, КЗ - колебательные подуровни, распадающиеся на вращательные подуровни, Bl, B2, ВЗ - вращательные подуровни
Полная (общая) энергия молекулы равна: Еобщ " Еэл + Екол + + Ецращ. Для упрощения вклад вращательных переходов в Еобщ обычно не рассматривается. Частота изменения каждого из видов энергии молекулы Еэл, Екол и Евращ имеет значения порядка 1 0 , 1 0 и 10 с" соответственно. При поглощении кванта света молекулой электрон переходит с нижнего электронно-колебательного основного уровня на электронно-колебательный возбужденный уровень. Так как при возбуждении (светопоглощении) электрон переходит с нулевого колебательного подуровня основного состояния (связывающая орбиталь) на различные колебательные подуровни возбужденного состояния (разрыхляющая орбиталь), то спектр поглощения молекулы описывается не линией, как в атомах, а полосой (слепком колебательных подуровней возбужденного состояния). Из сопоставления частот изменения Еэл, Екол и Евращ следует, что за время электронного перехода положение колеблющихся ядер не изменится. Из принципа (правила) Франка-Кондона вытекает, что наиболее вероятными (интенсивными) будут переходы между теми колебательными подуровнями электронных состояний молекул, у которых ядерные конфигурации одинаковы (точнее - практически совпадают). Возбуждение молекулы вещества М (поглощение ею энергии фотона) описывается выражением: М + hv -» М*, где М* - возбужденное состояние молекулы. Поглощение света внешне проявляется в ослаблении светового потока после прохождения через исследуемый объект. С помощью приемника излучения (фотоумножитель, фотоэлемент) можно определить, во сколько раз интенсивность света перед образцом 1о (например, кюветой с раствором белка, нукле232
иновой кислоты и т.д.) окажется больше интенсивности света, прошедшего через раствор (I). Измеренная спектрофотометром величина светопропускания T-1/Io не зависит от интенсивности света, но зависит от длины волны и может служить характеристикой данного образца. Величина 1-Т носит название светопоглощения. Однако ни величина светопропускания, ни величина светопоглощения не пропорциональны концентрации раствора, а связаны с концентрацией (с) и толщиной кюветы (1) более сложной (экспоненциальной) зависимостью. Поэтому для характеристики поглощения вещества и определения его концентрации используют другую величину - оптическую плотность образца (D). Поглощение света в бесконечно тонком слое dl пропорционально толщине слоя и концентрации вещества: dl = к- с • dl. При интегрировании этого выражения с учетом конечной толщины кюветы 1 (образца) получается уравнение Бугера-Ламберта-Бера: lg I o / I ш D - -lg Т - е cl или lg I/Io " -е cl, где е - молярный коэффициент экстинкции (поглощения). Раствор с концентрацией 1 моль/л в кювете толщиной 1 см имеет оптическую плотность D, равную е. (В английской литературе вместо D чаще используют обозначение А от слова absorbance - поглощаемость.) Молярный коэффициент поглощения не зависит от условий измерения (с, 1 и др.) и характеризует способность молекул данного вещества поглощать свет той или иной длины волны. Размерность е - л • моль" см" . е -1/с1 • lg (Io/I) или D/cl. Измерив оптическую плотность раствора в кювете толщиной 1 см, по значению молярного коэффициента экстинкции можно определить концентрацию раствора (моль/л): c-D/e. Если толщина кюветы 1 (точнее - длина оптического пути) не равна 1 см, то c-D/el. Значения с многих веществ определены и внесены в соответствующие справочные издания. Величины е и D зависят от длины волны измеряемого света. Кривую зависимости величин оптической плотности раствора (образца) от длины волны измерения (Я ) называют спектром поглощения, а кривую зависимости светопропускания (Т) от длины волны измерения - спектром пропускания. 233
Спектр поглощения является индивидуальной характеристикой вещества, поэтому структурные особенности его находят отражение на спектрах поглощения. На основании изучения и интерпретации спектров поглощения можно проводить качественный и количественный анализ веществ. В дальнейшем нами будут обсуждены спектры поглощения функционально важных биологических соединений и некоторых биообъектов. Ниже приводятся типы электронных переходов, обусловливающих спектр поглощения в видимой и ультрафиолетовой (УФ) областях, причем учитывается, что молекулярные орбитали а и л могут быть связывающими и разрыхляющими (антисвязывающими). Из схемы электронных переходов (рис. 5.2) следует, что наибольшей энергии требует а -» ст*-переход. Такие переходы характерны для молекул насыщенных углеводородов (метана и этана) и соответствуют поглощению в области длин волн меньше 200 нм. Переходы л-*л* происходят в молекулах ненасыщенных соединений и связаны с поглощением энергии света в видимой или близкой УФ-области (Я >200 нм). Хромофорные группы таких соединений всегда содержат ненасыщенные связи (ароматические соединения). Переходы п-*о*, п-»?г» совершают несвязывающие электроны, например, электроны неподеленных пар. Такие электроны удерживаются в молекуле наименее прочно. Переходы этого типа происходят в молекулах, содержащих такие гетероатомы, как азот, кислород, сера,галогены.
о' (разрыхляющаяо)
t
п -*а' " п -> я' к-» я'
х' (раэрыхлякхцаял) п (носаязыоающая, непо деленная) JC (связывающая л)
о-» о'
Вис. 5.2. Схема электронных пео (связывающая о) Реходов, обусловливающих спектр поглощения в видимой и УФ-обла-
§ 3. Спектральные свойства некоторых биомолекул Рассмотрим спектры поглощения важных в функциональном отношении биологических соединений: белков, нуклеиновых кислот, липидов, хлорофилла, родопсина, ароматических аминокислот. 234
Для проведения глубокого анализа биомолекул (биосистем) необходимо располагать надежным отнесением их полос поглощения. Однако вопрос об отнесении некоторых полос поглощения биологических веществ, в частности гема, не решен окончательно. Все порфиринсодержащие соединения имеют систему сопряженных двойных связей, играющую роль хромофора и обусловливающую интенсивные полосы поглощения в видимой и близкой ультрафиолетовой областях спектра. л-Электроны двойных связей включены в общую сопряженную систему порфиринового кольца. В сопряженную систему не входят двойные связи двух пиррольных колец, которые названы "полуизолированными". Волновые функции лг-электронов последних только перекрываются волновыми функциями лг-электронов кольца. Характерными для оксигенированной формы гемоглобина - двухкомпонентного транспортного белка - полосами поглощения в видимой области спектра являются полосы с Дшах при 412, 542 и 576 нм (рис. 5.3). Первая полоса называется полосой Соре в честь исследователя спектральных характеристик порфиринсодержащих соединений. Указанные полосы поглощения принадлежат гему. Считают, что полоса Соре соответствует отдельному электронному переходу, остальные полосы обусловлены колебательными переходами другого электронного уровня. Спектр поглощения оксигемоглобина характеризуется также полосой сДшах ~ 342 нм, обусловленной особенностями железопорфирина (неидентифицированная полоса поглощения гема). Полоса поглощения с Дтах ~ 275 нм обусловлена поглощением энергии квантов л-электронами ароматических ами-
200
250
300
350
400
450
500
550
600
нм
Рис. 5.3. Спектр поглощения водного раствора (рН5,8)оксигемоглобина мышей в ультрафиолетовой и видимой областях 235
нокислот (триптофан, тирозин, фенилаланин) белковой части молекулы гемоглобина. Однокомпонентные неокрашенные белки (сывороточный и яичный альбумины, гамма-глобулин, пепсин, трипсин, рибонуклеаза, лизоцим, альдолаза и др.) в отличие от двухкомпонентных окрашенных белков (гемоглобин, миоглобин, катал аза, пероксидаза, цитохром с) не поглощают в видимой области спектра. Их спектры поглощения располагаются в интервале длин волн от 180 до 290 нм. Особый интерес представляют две полосы поглощения: с Яшах V28O нм и с Яшах ~ 190 нм. Полоса при 280 нм объясняется светопоглощением сопряженными ядрами триптофана, тирозина и фенилаланина (рис. 5.4). Интенсивность полосы поглощения каждого данного белка вблизи 275-280 нм зависит от количества в нем хромофорных групп, содержащих л>электроны. Эта полоса поглощения белковых молекул объясняется возбуждением л>электрона, т.е. переходом -л -*л*. Кроме остатков ароматических аминокислот в общий спектр поглощения белка определенный вклад (иногда весьма малый) вносят и другие хромофорные группы. В области 240-300 нм главный вклад в спектр дают триптофан, тирозин и фенилаланин. При этом триптофан даже при относительно невысоком содержании в белке в зна-
Рис. 5.4. Спектр поглощения водного раствора сывороточного альбумина человека 240
236
260
280
300
320 нм
чительной степени определяет характер его спектра, так как молярный коэффициент экстинкции (е) его индольного ядра в 4 раза превышает е тирозина и почти в 30 раз - е фенилаланина. В области спектра 220-255 нм поглощают серосодержащие аминокислоты - цистин, цистеин, метионин. В самой коротковолновой области спектра (190 нм) имеет место светопоглощение хромофора пептидной группы белковой молекулы. Пептидная группа -C-NII I ОН это важнейший элемент первичной структуры белка. Полоса поглощения полипептидов и белков за счет пептидной связи с Дшах при 190 нм возникает вследствие электронного перехода л\ -*л»(рис. 5.5). Уровень лг отвечает связывающей, уровень л* - несвязывающей орбите СО-группы, уровень л\ - нссвязывающей орбите азота, а уровень п -состоянию неподеленнои пары электронов кислорода. Переход п -*а* - ридберговский атомный переход в кислороде. Цифры на рис. 5.5 указывают длину волны света (нм), инициирующего тот или иной электронный переход. Интенсивность полосы поглощения вблизи 190 нм зависит от структурного состояния белковой молекулы (спирализованная молекула или она - в состоянии статистического клубка). Если нагреть раствор белка и таким способом разрушить спирали Полинга-Кори, то интенсивность максимума при 190 нм заметно возрастет, а местоположение полосы поглощения существенно не изменится. Обратный процесс - создание регулярной пространственной структуры - сопровождается уменьшением интенсивности светопоглощения в полосе пептидной группы белковой молекулы. Это явление называется гипохромным эффектом, который используется для оценки степени спиральности (упорядоченности) белков. Измерение гипохромного эффекта пептидных связей имеет то преимущество, что О 150 нм К К,
190
165
t
220 Рис. 5.5. Электронные переходы в пептидной (амндиой) группе
237
белок исследуется в растворе, т.е. изучается вторичная структура изолированных макромолекул. Напомним, что при рентгеноструктурном анализе требуется перевод белковых молекул в кристаллическое состояние, что определенным образом их модифицирует. Полосы поглощения белков, и особенно полоса при 280 нм, чувствительны к разнообразным влияниям, которые действуют на лэлектроны ароматических аминокислот. Это - различные типы комплексообразования, ионные и дипольные взаимодействия, образование водородных и иных связей функциональными группами, присоединенными к ароматическим (бензольным, индольным) ядрам. Анализ спектральных характеристик- белковых образцов дает возможность получить надежную информацию о состоянии белковых молекул в норме, в условиях различного их микроокружения, при действии физико-химических агентов, при развитии в организме патологических процессов и др. Спектры поглощения нуклеиновых кислот, формирующиеся из спектров поглощения входящих в их состав азотистых оснований, характеризуются полосой поглощения с максимумом в диапазоне 255-270 нм, что зависит от нуклеотидного состава молекулы биополимера (рис. 5.6). Основными хромофорами нуклеиновых кислот являются пуриновые и пиримидиновые основания нуклеотидов. В состав ДНК входят адснин, гуанин (пуриновые), цитозин и тимин (пиримидиновые азотистые основания); в РНК вместо тимина присутствует урацил. За светопоглощение ответственна главным обраD зом л-электронная система 0,5пуриновых и пиримидиновых колец (л -» л -переходы). Полосы поглощения азотистых 0,4 оснований с максимумами около 260 нм отличаются вы2\ \ сокой интенсивностью. Некоторый вклад в общее поглоще0,3 ние, особенно в длинноволновой части спектра, вносят 0,2
Рис. 5.6. Спектры поглощения натнипон диухцепочечной ДНК (1), денатурированной теплом ДНК (2) и моиомериых нуклеотидои (3)
0,1
220
238
240
260
280
300 нм
л-*л*-переходы с участием неподеленной пары электронов гетероатомов азота и кислорода. Участие л-»л -переходов проявляется в спектрах поглощения в виде "плеч" в интервале 280-320 нм. Положение спектров поглощения оснований сильно зависит от величины рН раствора из-за образования различных ионных форм. Изменение полярности растворителя также оказывает влияние на спектры поглощения оснований вследствие межмолекулярных взаимодействий. При денатурации ДНК наблюдается сдвиг полосы поглощения ее образцов в более длинноволновую часть спектра с одновременным увеличением экстинкции. Регистрация и анализ спектров поглощения нуклеиновых кислот, а также нуклеотидов позволили получить весьма полезную информацию о радиационно- и фотохимических превращениях их молекул, о термостабильности, об устойчивости ДНК и РНК по отношению к различным денатурирующим (модифицирующим) факторам. Фотосинтез начинается с поглощения кванта света специализированными хромофорами, которые подразделяются на три основные группы: хлорофиллы, каротиноиды и фикобилины. Наибольшее значение в фотосинтезе имеют хлорофиллы, и в первую очередь хлорофилл а. Вес хлорофиллы (а, Ь, с, d, бактериовидин, бактериохлорофилл а, бактсриохлорофилл Ь) интенсивно поглощают видимый свет. В спектрах поглощения хлорофиллов обнаруживаются четыре полосы: три в красно-желтой и одна в синей области (рис. 5.7). Положения максимумов в спектрах поглощения хлорофиллов в клетке и органических растворителях не совпадают. Так, например, для хлорофилла а в органических растворителях характерны наиболее интенсивные полосы поглощения при 430 (полоса Соре) и 660 нм, а в клетке зеленых растений - полосы поглощения при 435 (полоса Соре) и 661-710 нм (несколько форм пигмента). В органических растворителях в спектре поглощения хлорофилла b наблюдаются полосы при 453 и 643 нм, а в клетке - полосы поглощения при 480 и 650 нм. Для бактериохлорофилла а в органических растворителях характерны полосы поглощения при 365, 605 и 770 нм, а в клетке - красные полосы (800, 870, 890 нм). Максимумы поглощения в красно-желтой области спектра формируются сложной комбинацией двух электронно-колебательных л -»л*-переходов. Два электронных л -» л»-перехода ответственны также за появление полосы Соре. Тот факт, что спектры поглощения фотосинтетических пигментов в клетках зеленых растений сдвинуты в длинно239
D/c
Рис. 5.7. Спектры поглощения хлорофиллов в (1) и в (2) в эфире.We - удельный коэффициент поглощения (с - концентрация, г/л)
0,20,0 380 420 460 500
540 580
620
660
700
НМ
волновую область по сравнению с таковыми для растворов в органических растворителях, указывает на интенсивный характер взаимодействия пигмент-микроокружение. Особо важную роль при этом, вероятно, играют пигмент-белковые, пигмент-липидные и пигментпигментные слабые физико-химические взаимодействия. Следует отметить, что благодаря глубокому изучению и интерпретации спектров поглощения фотосинтетических пигментов были выявлены фотофизические стадии такого уникального фотобиологического процесса, как фотосинтез. Зрительный пигмент родопсин - сложный белок, молекулы которого пронизывают липидный бислой мембран зрительных дисков. Родопсин состоит из гликопротеидной части - опсина и хромофорной группы - ретинальдегида (ретиналя). Последний может иметь несколько пространственных изомеров, например, 9-цис-ретиналь, 11-цис-ретиналь, полностью-транс-ретиналь и др. Только 11-цисретиналь структурно соответствует центру связывания ретиналя на белке (опсине) и образует с ним прочный комплекс. Спектральные свойства родопсина обусловлены взаимодействием хромофора с опсином. Максимум спектра поглощения изолированного ретиналя лежит около 370-380 нм, а максимум поглощения опсина - при 278 нм. Взаимодействие 11-цис-ретиналя с опсином со240
провождается батохромным (длинноволновым) сдвигом его полосы поглощения в зеленую область с образованием основного максимума около 500 нм. Таким образом, спектр поглощения родопсина характеризуется четырьмя максимумами: а-полоса (~500 нм), /3-полоса (350 нм), у-полоса (278 нм) и <5-полоса (231 нм). а- и/3-полосы в спектре родопсина обусловлены поглощением ретиналя, а у- и 5полосы - поглощением опсина (рис. 5.8). Молярные коэффициенты экстинкции имеют следующие значения: при 500 нм - 43250, при 350 нм - 10600 и при 278 нм - 71300. D
1.0
0.6
0.2
Рис. 5.8. Спектр поглощения родопсина 300
400
500
600
НМ
В результате поглощения энергии видимого света происходит обесцвечивание родопсина и сдвиг максимума в спектре поглощения хромофора с 500 нм в коротковолновую область, что связано с процессом фотоизомеризации 11-цис-ретиналя в полностью-трансконформацию и депротонированием шиффова основания. Образование транс-формы ретиналя вызывает нарушение стерического соответствия хромофора и опсина, а это, в свою очередь, приводит к целой серии конформационных перестроек в молекуле белка, которые сопровождаются изменениями в спектре поглощения зрительного пигмента. Такие перестройки молекулы родопсина были впервые изучены Г.Уолдом, получившим за эти исследования Нобелевскую премию в 1966 г. На конечной стадии фотолиза родопсина разрывается альдиминная ковалентная связь и высвобождается свободный ретиналь в транс-конформации. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и его восстановленная форма (НАДН) играют важную роль в процессах переноса электро241
на в биологических системах. НАД в УФ-области спектра характеризуется полосой поглощения с Дшах " 260 нм, а НАДН - с Атах при 260 и 340 нм (рис. 5.9). На основании спектральных исследований водных растворов НАДН были получены кривые зависимости оптической плотности его образцов от температуры и с помощью уравнения Вант-Гоффа оценена энтальпия конформационного перехода динуклеотида от "открытой" к "свернутой" форме. Величина АН этого перехода имела значение 33-69 кДж/моль. Максимум поглощения никотинамидной части Д-НАДН сдвигался с 340 до 338,5 нм при повышении температуры его растворов от 0 до 38 °С.
D 1,0г
0,5
0,0 200
Рис. 5.9. Спектры поглощения НАД и НАДН: 1 - окисленная форма; 2 - восстановленная форма динуклеотида
250
300
350
400 НМ
Спектры поглощения НАД(Н) регистрировались и для анализа действия других физико-химических факторов на структурно-функциональное состояние молекул динуклеотида (рН, ионная сила, УФ- и ионизирующая радиация, химические агенты). § 4. Пути дезактивации электронно-возбужденного состояния молекулы Мы рассмотрели первую стадию фотобиологического процесса поглощение биологически активного света хромофором и образование электронно-возбужденных состояний молекул биосистемы. 242
Энергия возбуждения, приобретенная молекулой при поглощениии кванта света, реализуется различными путями. На рис. 5.10 схематически изображены все возможные процессы фотофизической дезактивации электронно-возбужденной молекулы. Прямые стрелки между уровнями - излучательные переходы, волнистые - безызлучательные. При поглощении молекулой кванта света происходит переход одного электрона с заполненного уровня (So) на один из незаполненных уровней. Молекула при этом оказывается в синглетном (Si, S2) электронно-возбужденном состоянии. При переходе
Рис. 5.10. Электронные переходы в биомолекулах: So - основное (невозбужденное) состояние; S f , S 2 H T, , Т 2 - возбужденные соответственно синглетные и триплетные состояния; около каждого уровня показано направление спина возбужденного электрона по отношению к спину оставшегося электрона; жирные горизонтальные линии - чисто электронные уровни энергии, топкие (0, 1,2 ... или 0, 1,2...^колебательные уровни; прямые стрелки - поглощатсльные и излучательные переходы, волнистые - безызлучательные переходы; ВК - внутренняя конверсия (переходы электрона без обращения спина); ИК - интеркомбинационная конверсия (переходы электрона с обращением спина) 243
между уровнями So, Si, S2 спины электронов не изменяются (антипараллельны). Время жизни молекул в состоянии Si составляет Ю"8 - 10' 9 с. За время порядка 10" 1 ' - 10~12 с возбужденная молекула безызлучательным путем отдает избыток электронной и колебательной энергии окружающей среде. Этот процесс в спектроскопии получил название внутренней конверсии. В результате внутренней конверсии все молекулы вещества, независимо от того, в какое электронно-колебательное состояние они были переведены поглощенным фотоном, переходят на низший колебательный подуровень первого синглетного возбужденного состояния (Si). От этого состояния берут начало все последующие, конкурирующие между собой фотофизические процессы, в конечном счете приводящие к дезактивации возбужденной молекулы. С определенной вероятностью могут реализоваться следующие пути превращения энергии возбужденного состояния Si: 1) в тепло (тепловая диссипация вследствие безызлучательного перехода Si АЛЛ/—• So; 2) испускание кванта флуоресценции: Si-* S o + hv фл5 3) фотохимическая реакция: Si •* фотопродукт; 4) передача (миграция) энергии возбуждения другой молекуле; 5) переход молекулы в триплетное электронно-возбужденное состояние Ti с обращением спина электрона: Si-vW—»Ti. Переход из триплетного состояния в основное запрещен, так как спины электронов одинаковы (параллельны). Поэтому в состоянии Ti молекула находится значительно дольше (10" - 10 с), чем в состоянии S i. Известны несколько путей дезактивации триплетного возбужденного состояния молекулы: 1) безызлучательный переход в основное синглетное состояние с обращением спина электрона: So; 2) испускание кванта фосфоресценции в соответствии с переходом Ti -• So + hv фос; 3) фотохимическая реакция с образованием соответствующего фотопродукта; 4) передача энергии возбуждения другой молекуле. Излучательные переходы в молекуле (флуоресценция и фосфоресценция) имеют общее название - люминесценция. Понятие люминесценции относится как к излучению видимого света, так и к излучению в ближнем ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах. По виду возбуждения различают фотолюминесценцию (возбуждение светом), радиолюминесценцию (возбуждение ионизирующей радиацией), электролюминесценцию (возбуждение электрическим полем), триболюминесценцию (возбуждение механическими колебаниями - деформациями), хемилюминесценцию (возбуждение в результате химических реакций). Способность к люминесценции обнаруживают различные вещества. 244
Твердые и жидкие вещества, которые люминесцируют под действием различного рода возбуждений, называются люминофорами (например, ZnS • Си). Необходимым условием люминесценции является превышение вероятности излучательных переходов над вероятностью безызлучательных. Повышение вероятности безызлучательных переходов приводит к тушению люминесценции, и эта вероятность увеличивается при повышении температуры (температурное тушение), концентрации люминесцирующих молекул (концентрационное тушение) или примесей (примесное тушение). Люминесценция ряда биологических объектов (некоторые виды бактерий, грибов, некоторые беспозвоночные животные, рыбы) позволила получить информацию о процессах, происходящих в клетках на молекулярном уровне. Спектры люминесценции (испускания) - это зависимость интенсивности люминесценции образца от длины волны (частоты) измеряемого света. Интенсивность люминесценции выражается обычно в единицах энергии или в числе высвечиваемых квантов. Интенсивность люминесценции (1Л) возрастает с увеличением интенсивности возбуждающего света do), способности вещества поглощать энергию света и его способности испускать кванты люминесценции: где I - интенсивность вышедшего из образца света; <р - квантовый выход люминесценции, представляющий собой отношение числа излученных квантов к числу поглощенных квантов и рассчитываемый по формуле <р " 1л / do - I); с - молярный коэффициент поглощения; с - концентрация вещества; 1 - толщина образца (длина оптического пути). Измерение спектров люминесценции проводят с помощью приборов, называемых спектрофлуориметрами. Высокая чувствительность, точность и быстродействие обусловили широкое распространение люминесцентных методов исследования в биологии, медицине, сельском хозяйстве, химии и других областях знаний. Регистрацию люминесценции используют для качественного и количественного анализа, а также для изучения структуры и функции биосистем различной сложности организации: от макромолекул и мембран до целых органов и организмов. Наряду со спектрами люминесценции часто для решения специальной задачи приходится регистрировать спектры возбуждения люминесценции, под которыми понимают зависимость интенсивно245
сти люминесценции (1Л) объекта от длины волны возбуждающего света (Авозб):
W i o - f Ывозб) или ijio~
и нейтральных значениях рН практически не флуоресцируют. Аденин, гуанин, цитозин, тимин и ДНК при физиологических условиях среды имеют очень низкие квантовые выходы флуоресценции (около 10" ). Интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот и азотистых оснований значительно возрастает при экстремальных значениях рН, а также при низких температурах. Спектры флуоресценции сдвинуты в длинноволновую область по сравнению с длинноволновой полосой поглощения (закон Стокса) и зеркально-симметричны данной полосе поглощения (правило Левшина) . Закон Стокса означает, что энергия кванта флуоресценции меньше энергии кванта возбуждающего света, так как часть поглощенной энергии за время порядка 10 с растрачивается в тепло, и испускание флуоресценции происходит всегда с нижнего возбужденного энергетического уровня Si. Форма спектра люминесценции (правило Каши) и квантовый выход (закон Вавилова) не зависят от длины волны возбуждающего света. Измерение флуоресценции также проводят с помощью спектрофлуориметров. Флуоресцентный метод анализа - один из безынерционных, высокочувствительных методов исследования, с успехом применяемых для качественного и количественного анализа смесей веществ, изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов в биосистемах и конформационных свойств биомакромолекул. Флуоресценция - наиболее распространенный экспериментальный метод обнаружения процесса миграции энергии в системах: хлорофилл b -» хлорофилл а; ароматические аминокислоты белка -» фикобилины; белок -» краситель; тирозин -» триптофан; триптофан-» триптофан; глобин -» гем в составе гемоглобина и др. При освещении раствора поляризованным светом флуоресценция его будет также поляризована, если за время жизни возбужденного состояния молекулы не успевают переориентироваться. В этом случае измеряют так называемые поляризационные спектры флуоресценции - зависимость степени поляризации флуоресценции объекта от длины волны возбуждающего света (поляризационные спектры по поглощению) или длины волны регистрации при фиксированной длине волны возбуждения (поляризационные спектры по испусканию). Степень поляризации флуоресценции (Рдо) - доля поляризованного света флуоресценции в общей суммарной интенсивности флуоресценции. Степень поляризации флуоресценции определяют по формуле 247
ще II и i - интенсивности световых потоков флуоресценции, поляризованных взаимно перпендикулярно ( поляризована аналогично возбуждающему свету). Теоретически Рфл может достигать значения 0,5. Практически в случае сильно вязких растворов ее величина не превышает 3033 %; в случае симметричных молекул предельные значения Рфл составляют 0,14. Реальные значения Рфл зависят от степени релаксации молекулы (вязкости ее ближайшего окружения - микровязкости) за время жизни возбужденного состояния (т). Связь между степенью поляризации флуоресценции и вязкостью среды (ф установлена Перреном и Яблонским: l / P - l / 3 - O / P o - 1/3)
7 + 1), где Ро - предельные значения поляризации при T/rj-*-O; R - газовая постоянная; Т - абсолютная температура; V - объем моля флуоресцирующих молекул. Этой формулой пользуются для расчета значения т. Варьируя угол направления поляризации флуоресценции, можно установить направление и степень ориентации молекул в анализируемом образце. Исследование поляризации флуоресценции позволяет изучать миграцию энергии в биосистемах, определять размеры биомакромолекул и время жизни их возбужденного состояния. Поляризацию флуоресценции определяют также, чтобы судить о микровязкости структур клетки. Измерив Рфл для флуоресцентного зонда (например, 1-анилинонафталин-8-сульфоната), введенного в мембранную систему, можно определить микровязкость мембраны. Другим излучательным путем дезактивации электронно-возбужденного состояния молекулы, помимо флуоресценции, является фосфоресценция - высвечивание кванта света молекулами, находящимися в триплетном возбужденном состоянии. Зависимость интенсивности фосфоресценции от длины волны света называется спектром фосфоресценции, отношение числа высвеченных (пфос) квантов к числу поглощенных (пп) - квантовым выходом фосфоресценции (А): Очевидно, что квантовый выход фосфоресценции отражает вероятность дезактивации триплетного возбужденного состояния по излучательному пути. Так, триптофан и триптофанилы белков при низких температурах интенсивно фосфоресцируют с квантовым выходом около 0,1. Спектры фосфоресценции веществ сдвинуты в длинноволновую 248
область по сравнению с их спектрами флуоресценции, так как они формируются при излучательных переходах фотоэлектрона с нижнего колебательного подуровня триплетного возбужденного состояния на различные колебательные подуровни основного синглетного состояния. Например, тирозин характеризуется спектром поглощения с максимумами при 217 и 275 нм, спектром флуоресценции с максимумом при 304 нм и спектром фосфоресценции с максимумом при 387 нм. Регистрацию фосфоресценции используют для решения многих проблем биологии, химии, медицины, сельского хозяйства и других отраслей народного хозяйства (см. спектры люминесценции). Особенно полезным оказался этот метод для изучения механизма первичных фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в биосистемах (ароматические аминокислоты, белки, хлорофилл и родственные соединения, флавины, НАДН, витамины А, Вб, Е, многие лекарственные вещества). К разновидности люминесценции, сопровождающей химические реакции, относится и хемилюминесценция. В этом случае кванты света испускают продукты реакции или другие компоненты, возбуждаемые вследствие переноса энергии к ним от продуктов реакции. Хемилюминесценцию можно разделить на две стадии: 1) образование возбужденного продукта (Р*) из исходных реагентов и 2) переход возбужденной молекулы Р* в основное состояние (Р) с испусканием фотона с энергией (Р*-* Р + h v ) , т.е. хемилюминесценция - пример прямого преобразования химической энергии в световую. Хемилюминесценция обнаруживается при протекании газофазных, жидкофазных и гетерофазных реакций: ее спектр может располагаться в ИК-, видимой или УФ-областях. Хемилюминесценция сопровождает реакции, идущие самопроизвольно при смешивании реагентов, или реакции, происходящие под влиянием различных агентов - источников дополнительной энергии (электрический разряд, свет, ионизирующее излучение и т.д.). Интенсивность хемилюминесценции пропорциональна скорости реакции и эффективности хемилюминесценции, под которой понимают число квантов хемилюминесценции на один акт реакции. К реакциям, сопровождающимся хемилюминесценцией, относятся различные процессы окисления (окисление кислородом лк>минола, люцигенина, силоксена, белого фосфора). Частным случаем хемилюминесценции является биолюминесценция - холодное свечение ряда живых организмов, начиная с бак249
терий и кончая рыбами; всем хорошо известны также жуки-светляки северных широт (Lampyris noctiluca) и летающие светляки черноморского побережья Кавказа (L. mingrelica). Механизм биолюминесценции еще полностью не раскрыт, хотя и представляет очень большой интерес. Общепризнано, что биолюминесценция - это химическая реакция, сопровождающаяся испусканием видимого света в области 550-595 нм у различных летающих светляков. В основе данной реакции лежит окисление субстрата люциферина (ЬЩ) кислородом воздуха в присутствии фермента люциферазы (Е). Система люциферин-люцифераза локализована в мембранах подобно родопсину. Специальные органы для биолюминесценции называются фотофорами. Реакцию высвечивания квантов биолюминесценции записывают в таком виде: Е ЬНг + АТФ + Ог »Ь=О + АМФ + ФФ + СО2 + свет, где ФФ - пирофосфат. Люциферин летающего светляка с химической точки зрения карбоновая кислота со структурной формулой Н
,ъ
s
s
сн2
A
Структуры люциферинов других организмов отличаются от таковой летающего светляка. Указанная карбоновая кислота активируется в ходе вышеописанной реакции, протекающей с участием АТФ с превращением в люцифериладенилат:
Н i
250
~
Н
О г
Р Л „
Последний окисляется кислородом в присутствии фермента люциферазы: разрывается ацил-аденилатная связь и карбоксильная группа отщепляется в виде СОг (см. химическую реакцию). Люцифераза представляет собой белок с молекулярной массой около 50 кД, не содержащий какого-либо кофактора. Энергия квантов света, испускаемых при биолюминесценции, значительно превосходит энергию, выделяемую при расщеплении АТФ. Сказанное подтверждается тем, что свет, испускаемый светляками, имеет при 560 нм энергию 214 кДж на моль квантов, а это на порядок больше энергии, выделяемой при расщеплении молекулы АТФ. Систему люциферин-люцифераза используют в качестве весьма чувствительного индикатора АТФ: по интенсивности люминесценции можно судить о количестве АТФ, так как она необходима для свечения. Реакция окисления люциферина идет, вероятно, через образование свободных радикалов, рекомбинация которых сопровождается выделением квантов видимого света. В то же время синяя биолюминесценция медузы Aeguorea aeguorea происходит без участия молекулярного кислорода. Этот вид медузы содержит фотобелок экворин, который испускает Свет при добавлении ионов кальция. Роль Са состоит, по-видимому, в модификации конформации экворина. Биолюминесценция бактерий происходит с участием восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН • Ш). Эффективность хемилюминесценции в случае биолюминесценции некоторых светляков приближается к 100%, в то время как при реакциях окисления пероксидом водорода эфиров щавелевой кислоты - к 25%, а в остальных случаях - к 1% или гораздо ниже. Это диктует необходимость использования для обнаружения хемилюминесценции высокочувствительной фотоэлектронной аппаратуры. Исследование хемилюминесценции позволяет решать вопросы перераспределения энергии в продуктах реакции, строения молекул, определять скорости реакций или концентрацию реагирующих веществ. Исследование хемилюминесценции биологических систем дает возможность изучать механизм запасания и утилизации энергии кванта света при фотобиологических реакциях, выяснить роль возбужденных состояний молекул в темновых (нефотобиологических) процессах, а также механизм ферментативных реакций, сопровождающихся высвечиванием квантов. Одним из путей дезактивации электронно-возбужденного состояния молекулы является миграция энергии. Это самопроизвольная 251
безызлучательная передача энергии от одной частицы (атома, молекулы) к другой на расстояния, значительно превышающие межатомные, происходящая без растраты на тепловые колебания и без кинетических соударений донора и акцептора энергии: M*l+M2-Ml+M*2, где M*i - донор энергии - электронно-возбужденная частица (молекула) ; Мг - акцептор энергии - молекула в основном состоянии. Миграция энергии - чисто физический процесс, не сопровождающийся химическими изменениями вещества. Она происходит в газах, жидкостях и твердых телах как между одинаковыми (М* -* -* М), так и между разными (M*i -» M2) частицами в направлении от более высокого к более низкому или одинаковому энергетическому уровню. Известно несколько механизмов миграции энергии: индуктивно-резонансный, обменно-резонансный, экситонный и полупроводниковый (зонная проводимость). Мы рассмотрим только три первые вида миграции энергии, так как зонная проводимость подробно излагается в курсе физики. Индуктивно-резонансная миграция энергии изучалась на красителях. Передача энергии по этому механизму осуществляется за счет диполь-дипольных взаимодействий между молекулами Mi и Мг без переноса каких-либо частиц вещества или световых квантов. В этом случае энергия взаимодействия обратно пропорциональна третьей степени межмолекулярных расстояний R, а вероятность миграции энергии обратно пропорциональна R . Для осуществления индуктивно-резонансной миграции энергии необходимо, чтобы молекулы Mi и Мг имели одинаковые ДЕ между определенными энергетическими уровнями (условие резонанса) и чтобы взаимодействия между ними были достаточно интенсивны (условие индукции). Миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму может происходить в случае выполнения трех правил Ферстера: 1. Донор энергии (M*i) должен обладать способностью к флуоресценции. 2. Спектр флуоресценции донора (M*i) должен перекрываться со спектром поглощения акцептора (Мг). Эффективность миграции энергии прямо пропорциональна площади перекрытия указанных спектров. 3. Донор (M*i) и акцептор энергии (Мг) должны быть сближены на определенные расстояния (R). Расстояния, при которых осуществляется миграция энергии между донором и акцептором, принято характеризовать так называемым критическим радиусом Ro. Значение его колеблется для раз252
личных пар молекул от 1 до 10 нм и определяется временем жизни возбужденного состояния донора (10" - 10 с), площадью (интегралом) перекрытия вышеназванных спектров и величиной мигрирующих порций энергии. Константа скорости переноса энергии (кп) от донора (D) к акцептору (А) по индуктивно-резонансному пути описывается уравнением Ферстера: .
90001nlQyflfr,
L ,
ч
, ,dv
где% - ориентационный фактор: донор и акцептор энергии должны быть удачно ориентированы относительно друг друга; Вфл - квантовый выход флуоресценции; п - показатель преломления растворителя; N - число Авогадро; TD - время жизни возбужденного состояния молекул донора в отсутствие переноса энергии; RDA межмолекулярное расстояние между донором и акцептором; FD( V) - интенсивность флуоресценции донора в относительных единицах; ел (У) - молярный коэффициент поглощения акцептора как функция частоты v. Если дипольные моменты излучения донора и поглощения акцептора перпендикулярны друг другу, то перенос энергии осуществляться не будет (% =Qt). Если направление моментов совпадает с направлением радиуса-вектора, соединяющего молекулы D и А, то вероятность переноса энергии максимальна (х - 4). В растворах при хаотической ориентации молекул и их быстром вращении % -2/3. Индуктивно-резонансная миграция энергии может протекать как в рамках одной молекулы, от одних групп ее к другим (внутримолекулярная миграция), так и между отдельными молекулами (межмолекулярная миграция энергии). Для обнаружения этого вида передачи энергии применяют следующие экспериментальные методы: 1) спектры действия (возбуждения) или измерения квантовых выходов процесса при различных длинах волн возбуждающего света (будут рассмотрены ниже); 2) поляризационные спектры люминесценции (флуоресценции) системы из двух молекул (Mi + Мг); 3) измерения кинетики затухания флуоресценции Мг при возбуждении ее в полосах поглощения молекул Мг и Mi. Для большого числа донорно-акцепторных пар зарегистрирована внутримолекулярная миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму: ароматические аминокислоты белка-» фикобилины (фикоэритрин и фикоцианин); тирозин-* триптофан; триптофан-» 253
триптофан; ароматические аминокислоты -» краситель в ковалентных или абсорбционных комплексах белок-краситель; адениновое-» никотинамидное кольцо в НАД*; тиазоловое-» пиримидиновое кольцо в молекуле витамина Bi и др. Примеры межмолекулярной миграции энергии: фикоэритрин -» фикоцианин -• хлорофилл а (водоросли); хлорофилл b -» хлорофилл а (высшие растения). Индуктивно-резонансная миграция энергии возможна как между синглетными уровнями донора и акцептора, так и между синглетным уровнем донора и триплетным уровнем энергии акцептора. Обменно-резонансная, или триплет-триплетная миграция энергии была впервые обнаружена А.Н.Терениным и В.Л.Ермолаевым в 1952 г. В данном случае энергия переносится с триплетного возбужденного уровня донора ( О ) на триплетный уровень акцептора (3А) в соответствии со схемой 3 D + А -» *D +3A из-за прямого перекрывания "триплетных" электронных облаков за счет электростатических взаимодействий электронов донора и акцептора. Чем больше объем перекрывания электронных орбит (облаков), тем вероятнее перенос, при котором донор и акцептор взаимно обмениваются своими электронами. Отсюда возник и сам термин "обменнорезонансный перенос", для которого необходимо большее сближение молекул (Ro < 2 нм), чем для индуктивно-резонансного переноса энергии между донором и акцептором. Эффективность обменно-резонансной миграции энергии обратно пропорциональна шестой степени межмолекулярного расстояния (1 /R ). Скорость переноса энергии по этому механизму значительно превышает таковую для индуктивно-резонансной миграции энергии и достигает значения ™ 10' с. Для обнаружения обменно-резонансной миграции энергии используют явление сенсибилизированной фосфоресценции. Подбирают такую донорно-акцепторную пару молекул, у которой синглетныи уровень донора располагается ниже синглетного уровня акцептора (это исключает синглет-синглетный перенос), а триплетный уровень донора, наоборот, лежит выше триплетного уровня акцептора. Если при данных условиях свет, поглощаемый донором, возбуждает фосфоресценцию акцептора и одновременно наблюдается тушение собственной фосфоресценции донора при незначительных сокращениях его длительности, то это является доказательством триплет-триплетного переноса энергии в изучаемой системе. Теория экситонной миграции энергии была впервые разработана Я.М.Френкелем, им же в 1931 г. введено представление об экситоне. Экситонный перенос энергии возникает вследствие электриче254
ских, диполь-дипольных взаимодействий между молекулами или ионами. Э к с и т о н - квазичастица, представляющая собой электронное возбуждение в диэлектрике или полупроводнике, мигрирующее по кристаллу и не связанное с переносом электрического заряда и массы. Описано несколько типов экситона. В молекулярных кристаллах образуется экситон Френкеля - элементарное возбуждение электронной системы отдельной молекулы, распространяющееся (благодаря межмолекулярным взаимодействиям) по кристаллу в виде волны. В полупроводниках образуются экситоны Ваннье-Мотта, представляющие собой связанную пару: электрон проводимости-"дырка". Экситоны Френкеля проявляются в спектрах поглощения и люминесценции молекулярных кристаллов. Экситон ВанньеМотта можно рассматривать как квазиатом, движущийся в вакууме. Искажения структуры кристалла, вносимые экситоном или даже большим числом экситонов, пренебрежимо малы. Экситоны Ваннье-Мотта отчетливо проявляются в спектрах поглощения полупроводников в виде узких линий. Время жизни экситона невелико: электрон и "дырка" ("вакансия"), составляющие экситон, могут рекомбинировать с испусканием фотона. Экситон может распадаться при столкновении с дефектами кристаллической решетки. В кристаллических структурах наблюдается экситонная миграция энергии электронного возбуждения. Вследствие делокализации возбужденных электронных уровней в кристалле возникает возбуждение коллективных состояний, одновременно охватывающее тысячи молекул. Это коллективное возбуждение ансамбля молекул возможно за счет быстрого движения экситона. Время "скачка" его ( ~10~ с) от одной молекулы к другой примерно в 10 раз меньше времени жизни возбужденного состояния молекулы ( у<> 10 с), поэтому энергия возбуждения переносится на расстояние, значительно превышающее расстояние между молекулами. В биологических системах, как показано выше, наиболее частой является миграция энергии электронно-возбужденного состояния по индуктивно-резонансному механизму. Как и при индуктивном резонансе, при экситонной миграции энергии не отмечается эффекта фотопроводимости или уменьшения электрического сопротивления образца при освещении. Это означает, что молекулы обмениваются не электронами, а только электронным возбуждением. Эк ситонная миграция энергии возможна как между синглетными воз-
255
бужденными, так и между триплетными уровнями энергии молекул. В настоящее время отсутствуют убедительные доказательства осуществления в биосистемах миграции энергии по экситонному механизму. Для обнаружения индуктивно-резонансной миграции энергии измеряют спектры действия (возбуждения) этого процесса. Под спектрами действия понимают зависимость относительной эффективности излучения (света) различных длин волн от длины волны: Биологический эффект/Число падающих квантов - f (А). Это же отношение принято выражать и в такой форме: где - <р квантовый выход фотобиологического процесса; Т - светопропускание образца. В данной форме спектр действия аналогичен спектру возбуждения люминесценции, но в противоположность интенсивности люминесценции величина фотобиологического эффекта не пропорциональна интенсивности света (зависит от нее по более сложному закону). Спектры действия фотохимической реакции - зависимость поперечного сечения (вероятности) фотохимической реакции ( а) от длины волны облучения: о = S
где n - число молекул на 1 см образца; 1 - длина оптического пути; 1о и I - соответственно интенсивность падающего на образец и выходящего из него света. Поперечное сечение поглощения (S) связано с молярным коэффициентом поглощения (с): S - 3,8 • 10" 2 1 е(см 2 ).
Физический смысл S - эффективное сечение молекулы, при попадании в которое происходит поглощение фотона данной длины волны. Поперечное сечение (вероятность) фотохимической реакции (а) численно равно I/D37» где D37 - доза облучения (см. ниже), при которой 63% молекул претерпевают химические изменения, а 37% молекул сохраняют исходную биологическую активность. Спектры действия широко применяют для выяснения механизма биологического действия оптического излучения. Анализ их дает 256
основную информацию о природе акцепторов биологически активного света. Так, измерение спектров действия инактивации большого числа белков позволило установить, что акцепторами фотонов, поглощение которых вызывает инактивацию белка, являются ароматические аминокислоты (главным образом, триптофан) и цистин. С помощью спектров действия было продемонстрировано, что нуклеиновые кислоты под влиянием ультрафиолетового излучения повреждаются в основном через фотохимические превращения пиримидиновых азотистых оснований их молекул. Роль пигментов (хлорофиллов, каротиноидов и фикобилинов) как акцепторов света доказана многочисленными измерениями спектров действия фотосинтеза. Спектры действия были использованы для выявления механизма протекания и других фотобиологических процессов и реакций (фототаксиса, фототропизмов, фотокинеза, фотоморфогенеза, фотопериодизмов и др.). Рассмотрим физический смысл квантового выхода фотохимической реакции (<р), входящего в уравнение для определения поперечного сечения фотохимической реакции (о) . ^-отношение числа прореагировавших (химически измененных) молекул (щ) к числу молекул, поглотивших фотоны (пг): = ni/пг. Величина квантового выхода фотохимической реакции определяется отношением констант скорости фотохимической дезактивации электронно-возбужденного состояния к сумме констант скорости других процессов дезактивации: тепловая диссипация, испускание кванта люминесценции, фотохимическая реакция и образование фотопродукта, миграция энергии, переход молекулы в триплетное возбужденное состояние. Квантовый выход малоэффективных процессов в макромолекулярных системах может составлять всего 10" , а в случае фотохимически инициированных цепных реакций (например, фотохлорирование в газовой фазе) достигает величины 10 . Квантовый выход фотохимической реакции - важнейшая количественная характеристика фотохимической реакции. Расчет величины <р необходимо проводить с целью определения фоточувствительности биообъектов, выражаемой через значения поперечного сечения фотохимической реакции. Квантовые выходы фотоинактивации белков характеризуются достаточно низкими значениями, находящимися для некоторых из них в пределах 10" - 10" . Величины квантовых выходов фотодимеризации тиминов колеблются от 1 (кристаллы моногидратов тимина) до 0,003 (тимидилтимидин). Квантовый выход реакции образо257
вания диеновых и триеновых гидроперекисей при ультрафиолетовом облучении жирных кислот значительно превышает 1 (например, 90 для этиллинолеата). Определенную информацию о физико-химическом и физиологическом состояниях биосистем (биообъектов) можно получить путем анализа их спектров отражения, под которыми понимают кривые зависимости отражательной способности тел от длины волны измерения. Отражательная способность или спектральный коэффициент отражения (р) - это отношение интенсивности отраженного от тел света (I) к падающему на них (10) :р — 1/Ь. Величина/) тем больше, чем менее шероховата поверхность тела. Для хорошо отполированных металлических зеркал р достигает значений 0,89-0,90. На основании анализа спектров отражения, как и спектров поглощения, можно проводить количественную оценку содержания поглощающего свет вещества в образце. Так, например, определяют количество гемоглобина в коже. Падающий монохроматический свет do), проникая в кожу, ослабляется из-за поглощения. Некоторая часть света (р) после многократного рассеяния клетками кожи отражается, т.е. выходит обратно. При эритеме (сложном комплексе индуцированных ультрафиолетовым излучением биохимических и морфологических изменений в коже), как известно, резко усиливается микроциркуляция и возрастает уровень гемоглобина в коже, поэтому уменьшение отражательной способности в области светопоглощения этого гембелка (около 542 и 576 нм) служит количественным критерием эритемы. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Что изучают квантовая биофизика и биофизика фотобиологических процессов? 2. Назовите области практического использования идей и методов квантовой биофизики. 3. Проанализируйте отдельные стадии фотобиологического процесса. 4. Назовите условия, необходимые для того, чтобы произошло светопоглощение в биосистеме. 5. Охарактеризуйте спектры светопропускания и светопоглощения: их применение для количественного и качественного анализов биосистем. 6. Назовите типы электронных переходов, обусловливающих спектр поглощения вещества в видимой и УФ-областях. 7. Сравните спектры поглощения гемоглобина и сывороточного альбумина. 8. Назовите хромофорные группы молекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, хлорофилла, родопсина, ароматических аминокислот. 9. Вследствие какого типа электронного перехода иозникает полоса поглощения полипептидов и белков при 190 нм? 10. Объясните происхождение спектров поглощения НАД и НАДИ. 258
11. Проанализируйте пути дезактивации электронно-возбужденного состояния биомолекул. 12. Как измеряют спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции биообъектов? Какую информацию можно получить при их анализе? 13. Каковы квантовые выходы флуоресценции и фосфоресценции? 14. По какой формуле определяют степень поляризации флуоресценции? 15. Что понимают под эффективностью хемилюминесценции? 16. Биолюминесценция как частный случай хемилюминесценции: система люциферин-люцифераза, механизм взаимодействия между ними. 17. Миграция энергии - это чисто физический процесс или она сопровождается химическими изменениями вещества? 18. Назовите особенности индуктивно-резонансного, акситонного, обменно-резонансного путей миграции энергии. Приведите примеры. 19. Какой механизм (путь) миграции энергии описывается с помощью уравнения Ферстера? 20. Что понимают под спектром действия фотобиологического процесса? 21. Каков физический смысл квантового выхода фотохимической реакции? Назовите квантовые выходы фотоинактивации белков, фотодимернзации тиминов и образования гидропероксидов при УФ-облучении жирных кислот.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Арт ю х о в В.Г., Б у ту р л а к и м М.С., Ш м е л е в В.П. Оптические методы исследования биологических систем и объектов. Воронеж, 1980. 116 с. Б у р ш т е й н Э.А. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования)// Итоги науки и техники. Биофизика. М., 1976, Т.6. 213 с. В л а д и м и р о в Ю.А., Р о щ у и к и н Д.И., П о т а п е н ко А.Я., Д ее в А.И. Биофизика. М., 1983. 272 с. К о н е в СВ., В о л о т о в с к и й И.Д. Фотобиология. Минск, 1979. 378 с. Р у б и н А.Б. Биофизика. М., 1987. Кн.2. 303 с,
259
ГЛАВА 6 НЕКОТОРЫЕ БИОФИЗИЧЕСКИЕ (КОНФОРМАЦИОННО-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ) МЕТОДЫ АНАЛИЗА БИОСИСТЕМ § 1. Свободные радикалы в биосистемах При протекании в клетке и ее компонентах (например, в биомембранах) некоторых окислительно-восстановительных реакций и после воздействия на органические молекулы (биомакромолекулы) ионизирующей и УФ-радиации образуются свободные радикалы. Свободные радикалы - кинетически независимые частицы, характеризующиеся наличием неспаренных электронов. Широко распространено представление о том, что свободный радикал - это молекула или ее часть, имеющая неспаренный электрон (свободную валентность). Свободный радикал обозначают точкой над соответствующей группой химического соединения или над условным обозначением этого вещества. Благодаря наличию неспаренного электрона, свободные радикалы легко вступают в химические реакции: для них характерна высокая реакционная способность. Свободные радикалы обладают парамагнитными свойствами, так как они имеют нескомпенсированные магнитные моменты неспаренных электронов. Еще одна особенность свободных радикалов - это способность вести цепные реакции. К неорганическим свободным радикалам, которые имеют на внешнем уровне один^элсктрон; относят атомы водорода Н , щелочных металлов (Na*, К и др.) и галогенов (СГ, Вг*, F", I*), молекулы окиси'ЫО и двуокиси'гЮг азота. Свободные радикалы органических соединений подразделяют на короткоживущиеи долгоживущие (стабильные). Короткоживущие алкильные (R*) и арильные (Аг*) свободные радикалы,характеризующиеся временем жизни менее 0,1 с, образуются при гемолитическом расщеплении различных химических связей. К этому типу свободных радикалов относятся метил (СНз) и этил (СН3СН2). Короткоживущие свободные радикалы принимают участие главным образом в реакциях рекомбинации (а), присоединения (б) и диспропорционирования (в), протекающих сочень высокими скоростями: СН3СН2СН2 + CH3CH2CH2 = СНз(СН2)4СНз, (а) СНзСН2СН2 + Я = СНзСН2СН2й, (б) 260
СН3СН2СН2 + CH3CH2CH2 - CH3CH2CH3 + CH 3 CH=CH 2 . (в) С.Хиншелвуд и Н.Н.Семенов показали, что механизм цепных реакций включает и эти типы реакций. Продолжительность (время) жизни долгоживущих свободных радикалов зависит от условий (наличие или отсутствие влаги и кислорода воздуха) и составляет от нескольких минут до нескольких месяцев и даже лет. Более высокая устойчивость этих свободных радикалов связана с : 1) частичной потерей активности неспаренного электрона в результате взаимодействия его со многими атомами молекулы (делокализация неспаренного электрона); 2) малой доступностью атома, несущего неспаренный электрон, вследствие экранирования его соседними атомами. Примерами долгоживущих свободных радикалов являются трифенилметил (СбН5)зС, тетраметилпипсридиноксил (I), бис-трифторметилнитроксил (II) и др.:
I
И
Свободные радикалы I и II называются и м и н о к с и л ь н ы м и . Последние широко применяют в биофизических и биохимических исследованиях для выяснения конформации белковых молекул и функциональных свойств биологических мембран. При окислении или восстановлении нейтральных молекул образуются з а р я ж е н н ы е свободные радикалы - катион-радикалы или анион-радикалы; например, катион-радикал тирозина:
"но- <J5^— сиг - сн - соо*, +
NH3 а нейтральный радикал тирозина имеет такую структуру:
6-
/pSN - CH2 - СН - СОО"
К анион-радикалам относят супероксид-анион-радикал кислорода (ниже будет подробно рассмотрен), семихиноны, в частности бензосемихинон:
-о-<0>- 6 Семихиноны являются продуктами одноэлсктронного восстанов261
ления хинонов. Свободные радикалы, которые содержат два не взаимодействующих друг с другом неспаренных электрона, называются бирадикалами (молекула кислорода О-О). П о л и р а д и к а л ы содержат более двух неспаренных электронов. Изучение катион-радикалов и анион-радикалов дает ценную информацию о характере взаимодействия ионов в растворе. Свободные радикалы играют большую роль в окислительно-восстановительных, фотохимических и каталитических процессах, а также в важнейших промышленных процессах (полимеризация, пиролиз, крекинг, горение, взрыв и т.д.). Многие биохимические реакции протекают с участием свободных радикалов в качестве активных промежуточных продуктов. С помощью метода электронного парамагнитного резонанса (см. ниже) показано, что все активно метаболизирующие клетки растений и животных содержат свободные радикалы в концентрации 10" -10 моль на 1 г ткани. В реакциях биологического окисления свободные радикалы участвуют в образовании переносчиков электронов типа хинонов и флавинов, входящих в мембранные структуры. Свободные радикалы образуются также при перекисном окислении липидов в биологических мембранах. В организме свободные радикалы, как выше отмечалось, могут генерироваться и при действии на него различных физических и химических агентов. Так, влияние ионизирующей радиации на живые организмы связывают с возникновением свободных радикалов как при радиолизе воды, так и при воздействии излучений на биомолекулы (аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, азотистые основания, полисахариды и др.) клетки (см. гл. 7, 8). § 2. Методы изучения свободных радикалов Для изучения свободных радикалов применяют различные физико-химические методы: электронную спектроскопию, масс-спектроскопию, метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), метод хемилюминесценции и др. Из названных методов наибольшее распространение получил метод ЭПР, который дает возможность идентифицировать свободные радикалы и определять их концентрацию, а также получать информацию о физической природе неспаренного электрона и характере его поведения в молекуле. Однако по чувствительности метод ЭПР уступает другому физическому методу - хемилюминесценции, основанному на регистрации свечения, сопровождающего химические реакции, и обсужденного нами в предыдущих 262
главах. В последующем мы более подробно рассмотрим такие методы обнаружения свободных радикалов, как ЭПР, ЯМР, импульсный фотолиз, лазерная спектроскопия. Сейчас остановимся на характеристике супероксид-радикала кислорода, одной из активных форм кислорода, обозначаемой Of- Понимание роли супероксид-анионного радикала кислорода в биологии сильно продвинулось с открытием фермента супероксиддисмутазы. Функция этого широко распространенного фермента заключается в катализе дисмутации потенциально токсичных супероксид-анион-радикалов, возникающих как в процессе функционирования живых систем, так и в результате воздействия на их компоненты различных агентов, в том числе ионизирующего и ультрафиолетового излучений. Например, Of можно легко получить при импульсном радиолизе, в частности, при гамма-облучении окисленного водного формиата: ОН + НСОО' -*СО2~ + Н 2 О; СОг + 02 -• СОг + Of. Гидроксид-радикал ОН - первичный продукт радиолиза воды довольно сильный окислитель. Кислород, играющий важнейшую роль в биологических системах, является эффективным акцептором первичных восстановительных радикалов реакций радиолиза воды: eaq + Ог -О2*; Н*+02 - Н 0 2 , где eaq - гидратированный электрон (стабилизированная форма электрона); Н - радикал водорода; НОг - гидроперекисный радикал, выступает и к^ак окислитель, и как восстановитель. Радикал 02 имеет максимум поглощения при 245 нм, а радикал Н0'2 - при 225 нм. Супероксид-радикал кислорода, как и радикал Н05, может наносить очень серьезные повреждения биологически важным молекулам. С помощью метода импульсного радиолиза в присутствии формиата натрия и кислорода показано, что анион-радикалы Of восстанавливают феррицитохром с до ферроцитохрома со 100%-ным выходом, но значительно медленнее, чем eaq или Н* причем скорость восстановления молекул гембелка сильно зависит от величины рН среды. Супероксид-радикалы кислорода принимают участие в свободнорадикальных процессах перекисного окисления липидов. Ненасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая, арахидоновая) 263
взаимодействуют с активными формами кислорода с образованием нейтрального радикала липида в соответствии с реакцией RH + (Of, O 2 ) - R + НОГ, i - молекула углеводорода (жирнокислотный остаток ее); О_2 синглетный кислород; R - алкильный свободный радикал; HOi" протонированный супероксидный радикал кислорода. Метод ЭПР Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) - резонансное поглощение энергии электромагнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Явление ЭПР было открыто Е.К.Завойским в 1944 г. На основе этого явления был разработан один из методов радиоспектроскопии - метод ЭПР. Условие резонанса записывают в виде уравнения: hv -ДЕ - g/3H, где h - постоянная Планка; v - частота переменного электромагнитного поля; ДЕ - разность энергий между магнитными (зеемановскими) подуровнями, которые образуются в результате расщепления уровней энергии парамагнитной частицы в постоянном магнитном поле Н; g - фактор расщепления: отношение магнитного момента парамагнитной частицы к ее механическому моменту (спину); /J - магнетон Бора. При соблюдении условия резонанса образец поглощает электромагнитную энергию. Для измерения поглощения используют радиоспектрометры (спектрометры ЭПР), в которых при постоянной частоте электромагнитного поля порядка 9000 МГц и медленном изменении напряженности магнитного поля регистрируют изменение поглощаемой в образце мощности СВЧ-поля. Записываемый с помощью регистрирующего устройства (осциллограф или самописец) сигнал имеет форму производной от кривой поглощения. Спектры ЭПР дают важнейшую информацию об электронном строении изучаемой системы. Метод ЭПР эффективно применяется для решения ряда проблем биологии, химии, физики, медицины, в частности для определения наличия и концентрации свободных радикалов в веществах, их трансформации и взаимодействий между ними. Выделяют следующие главные н а п р а в л е н и я применения ЭПР-спсктроскопии в исследованиях биологически важных структур и процессов: 264
1. Изучение механизмов окислительно-восстановительных ферментативных реакций (появление свободных радикалов различной природы в ходе биохимических процессов как в изолированных ферментных системах, так и в целых клетках и тканях); исследование процессов транспорта электронов в митохондриях, строения и механизмов окисления и восстановления хинонов, флавинов, дину клеотидов, порфиринов, хлорофиллов, гемопротсидов и др. 2. Радиобиологические исследования: идентифицированы свободные радикалы и ион-радикалы, возникающие в целых клетках и тканях и в многочисленных образцах аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов под влиянием ионизирующего излучения в условиях различного микроокружения. 3. Фотобиология и фотосинтез. Фотохимические процессы в биосистемах сопровождаются образованием свободных радикалов в качестве промежуточных продуктов. Свободные радикалы появляются и при реализации первичных актов фотосинтеза. Метод ЯМР Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориентацией системы магнитных моментов атомных ядер в постоянном магнитном поле. ЯМР, как и ЭПР, - один из методов радиоспектроскопии, был открыт и объяснен Ф.Блохом и Э.Псрселлом в 1946 г. Этот процесс избирательного поглощения электромагнитной энергии наблюдается в сильном постоянном магнитном поле, на которое накладывается слабое радиочастотное магнитное поле (с частотой порядка 40 МГц), перпендикулярное постоянному. Частота радиоволн в методе ЯМР зависит как от типа изотопа, так и от напряженности магнитного поля. Условие резонанса записывают аналогично электронно-парамагнитному резонансу. Так как протоны обладают спином и зарядом, то они имеют магнитный момент, который у атомных ядер примерно в 2000 раз меньше, чем у электронов. Для создания постоянного магнитного поля напряженностью 110 Т используют электромагниты массой 10 - 104 кг со стабильностью, превышающей 0,1%. Для изменения магнитного поля в пределах 10" Т применяют дополнительные электромагниты (свипэлектромагниты). Для расшифровки сложных спектров регистрируют 10-1000 спектров одного и того же образца и вводят экспериментальные данные 265
в ЭВМ для получения среднего спектра или спектра, получаемого путем накопления. ЭВМ-приставки используют при исследовании слабопоглощающих биологических образцов. Положение спектральной линии ЯМР относительно некоторой эталонной линии называется химическим сдвигом. В качестве эталона для протонного резонанса органических соединений используют тетраметилсилан (CH3>4Si, а для водных растворов биополимеров - ДСС (2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновая кислота). Химический сдвиг (<5) представляет собой отношение сдвига частоты поля (Дси) к эталонному значению (а>о). умноженное на 10 : 6 - (Дш/wo) • 1О б =ДН/Но- Ю6, где Но - напряженность постоянного магнитного поля. Величина д для алифатических протонов биополимеров варьирует от -0,5 до -2,0, ароматических протонов - от -6,0 до -8,5. При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мультиплетная) структура линий ЯМР, возникающая вследствие магнитного взаимодействия между ядрами, передаваемого через электроны связи (непрямое спин-спиновое взаимодействие). Изучение химических сдвигов и сверхтонкой структуры проводится с целью получения количественной информации о расположении и взаимодействии атомных ядер жидкостей и твердых тел. ЯМР высокого разрешения представляет собой стандартный метод определения строения органических молекул, используемый также для исследования механизма и кинетики химических и биохимических реакций. Спектроскопия ЯМР находит все более широкое применение в биологии (биофизике) и в медицине. Так, методы ЯМР были эффективно использованы при анализе конформационных свойств биополимеров, взаимодействий белков с фармакологическими веществами, взаимодействий фермент - лиганд (гемопротеиды), биополимеры - вода, антиген - антитело. Очень часто методы ЯМР используют для определения природы химических групп, участвующих в образовании специфических комплексов (сывороточный альбумин - пенициллин, сывороточный альбумин - стрептомицин, алкогольдегидрогеназа - НАД), а также природы вновь образующихся связей (например, водородной). ЯМР на Р и С успешно применяется и для изучения живых клеток и тканей (изменение концентрации АТФ и креатин-фосфата при сокращении мышцы). Метод импульсного фотолиза Импульсный фотолиз (флеш-фотолиз) - один из спектральных 266
методов исследования биосистем, который наряду с методами электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса дает непосредственную информацию о сущности первичных быстропротекающих фотопроцессов. Этот метод был предложен Р.Норришем и Г.Портером в 1949 г. В разработке его приняли участие Н.Дэвидсон и сотр. (1951), Г.Герцберг и Д.Рамсей (1952). Сущность метода импульсного фотолиза заключается в том, что при освещении объекта кратковременной мощной вспышкой света поглощающие энергию света молекулы, переходя в возбужденное состояние, могут накапливаться в избыточной концентрации. При этом образуются и промежуточные короткоживущие фотопродукты, для идентификации которых используют спектральную аппаратуру. Таким образом изучают реакции, в которых принимают участие первичные фотопродукты. С помощью метода импульсного фотолиза впервые были получены спектры поглощения некоторых свободных радикалов (NH2, НСО и др.), а также триплетных возбужденных молекул (в частности, ароматических аминокислот). Очень высокие интенсивности света (одно из главных достоинств импульсного фотолиза) можно получить только в том случае, если использовать все полихроматическое излучение импульсной лампы, но тогда практически невозможно точно оценивать квантовые выходы фотохимической реакции. Поэтому в дальнейшем были разработаны способы получения импульса света большой интенсивности и после фильтрации фотолизирующсго света. Это дало возможность определять величины квантовых выходов фотопродуктов с достаточной степенью точности. Рассмотрим блок-схему установки для флеш-фотолиза. На рис. 6.1 представлена схема импульсного спектрофотометра, сконструированного на кафедре биофизики биологического факультета МГУ для биологических исследований. Измеряющий свет от источника 1 фокусируется линзой 2 на входную щель монохроматора 3. Монохроматический луч света с помощью линзы 4 фокусируется на кювету с образцом. Проходя кювету, луч света падает на стеклянную пластинку 19, расположенную под углом 45 °, которая отражает около 12% падающего на нее света. Таким образом, часть света через стеклянную пластинку и светофильтр 20 попадает на фотокатод первого фотоумножителя 21, а часть, отражаясь и поворачиваясь зеркалом 14, через светофильтр 15 - на фотокатод второго фотоумножителя 16. Импульсное возбуждение производится двумя лампами 10, 13, расположенными параллельно оптической оси, от кото267
to 00
10
1
14
15
16
17
21
22
18
2
8
23
/ / И* Ьз 24
Рис. 6.1. Схема импульсного дифференциального спектрометра
О
рых свет через светофильтры 11,12 попадает на кювету с образцом. Энергия вспышки для большинства измерений 30-40 Дж, длительность 5- 10" 5 с. Для возбуждения молекул вещества постоянным светом используют лампу накаливания 5, от которой луч через систему линз 6, 8, тепловой 7 и стеклянный 9 светофильтры попадает на образец. Интенсивность измерительного света составляет около 10~5 Вт/см , а постоянного возбуждающего света - около 10" . Импульсное возбуждение производится однократными или последовательными двумя вспышками через регулируемые интервалы времени от 5 • 10 с до нескольких минут. Электрический сигнал от первого фотоумножителя поступает на эмиттерный повторитель 22, затем на широкополосный усилитель 23 и регистрирующий прибор (осциллограф) 24. Со второго фотоумножителя сигнал усиливается электрометрическим усилителем постоянного тока 17 и поступает на самопишущий потенциометр 18. Схема регистрации обеспечивает чувствительность порядка 0,2% AD (изменение оптической плотности образца). Сигнал с экрана осциоллографа можно сфотографировать. Длительность вспышки ("фотоимпульса") может варьировать от нескольких миллисекунд до пикосекунд в зависимости от индуктивности цепи импульсная лампа - конденсатор (батарея конденсаторов), приложенного напряжения, размеров импульсной лампы, природы и давления газа в импульсной лампе. Для непосредственного определения времени жизни флуоресценции биообъектов (от 10 до 10 с) по зависимости интенсивности флуоресценции от времени необходимо иметь импульсные лампы с длительностью вспышки наносекундного диапазона. Дж.Малмберг (1957) описал лампу с очень короткой вспышкой, пригодной для таких измерений. Методике импульсного фотолиза присущи следующие экспериментальные трудности: 1. Очень высокие напряжения (30 кВ) и большие количества энергии, накапливаемой в конденсаторах, являются опасными для жизни. В связи с этим необходимо, чтобы зарядкой и разрядкой конденсаторов управляли на некотором расстоянии от источника высокого напряжения. В ряде лабораторий конденсаторы расположены в соседней комнате, причем сделано специальное устройство, которое автоматически выключает высокое напряжение, когда открывают дверь в комнату с источниками высокого напряжения. 2. Зависимость интенсивности вспышки от времени не одинакова 269
для различных длин волн. При количественных исследованиях требуется точное знание зависимости интенсивности от времени. Поэтому необходимо определить эту зависимость для той области длин волн, где наиболее сильно поглощает исследуемое вещество. 3. В процессе эксплуатации импульсная лампа часто начинает "газить", в результате чего ухудщаются ее рабочие характеристики. Импульсную лампу в этом случае следует заменить. 4. Температуру фотохимической реакции часто невозможно определить, так как поглощается большое количество энергии за очень короткий промежуток времени. Это может повышать температуру поглощающей системы до 1000 °С и, следовательно, вызывать термическое разложение исходного вещества и продуктов фотохимической реакции, если не принять необходимых мер предосторожности. Чтобы избежать теплового нагрева, в изучаемую систему вводят большое количество газа, не поглощающего свет вспышки, или используют жидкий растворитель. Самый распространенный и удобный способ предотвращения термического разложения биообъекта - проведение экспериментов при низких температурах (жидкий азот). Метод импульсного фотолиза применяется для анализа фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в биосистемах: тетрапиррольные пигменты (хлорофиллы, порфирины, связанные с биосинтезом гема, пигменты желчи, гемоглобин и миоглобин), полиены (С40 - каротиноиды и их аналоги, С20 - полиены), белки и их компоненты, нуклеиновые кислоты и их компоненты, компоненты цепи переноса электрона (НАД, флавины, убихинон, пластохинон, цитохром с). Исследование сложных белков - гемопротеидов методом флешфотолиза дает ценную информацию об электронно-конформационных взаимодействиях в этих белках. Применение указанного метода для изучения гембелков основано на том, что комплекс гемопротеид - лиганд фоточувствителен и под действием света обратимо распадается на свободный белок и лиганд. Наблюдая затем рекомбинацию, можно исследовать кинетические характеристики этого процесса и судить по ним о конформации молекул белка, участвующих в рекомбинации. Лазерная спектроскопия Лазерная спектроскопия - раздел оптической спектроскопии, методы которой основаны на использовании лазерного излучения. Применение монохроматического излучения оптических кванто270
вых генераторов (лазеров) позволяет стимулировать квантовые переходы между вполне определенными уровнями энергии атомов и молекул. В отличие от лазерной спектроскопии, в спектроскопии, использующей нелазерные источники света, получают спектры, возникающие в результате переходов между громадным числом квантовых состояний атомов и молекул. Создание достаточно мощных лазеров видимого диапазона, излучение которых имеет фиксированную частоту, позволило приступить к проведению серьезных экспериментов в области лазерной спектроскопии. Принципиально новые возможности лазерной спектроскопии открылись с появлением лазеров с перестраиваемой частотой; это дало возможность решать важные задачи, перед которыми спектроскопия обычных источников света практически бессильна. Так, благодаря высокой монохроматичности излучения лазеров с перестраиваемой частотой удается измерять истинную форму спектральных линий вещества, не искаженную аппаратной функцией спектрального прибора. Из-за высокой монохроматичности и когерентности излучение лазера переводит значительное число частиц из основного состояния в возбужденное, что повышает чувствительность регистрации атомов и молекул. В 1см вещества удается регистрировать включения, состоящие из 102 атомов или 10 10 молекул. Успешно разрабатываются методы регистрации отдельных атомов и молекул. Лазерная спектроскопия дает возможность изучать быстропротекающие (<**10 - 10" с) процессы возбуждения, девозбуждения и передачи возбуждения в веществе, а также исследовать спектры рассеяния и флуоресценции атомов и молекул в атмосфере на расстоянииЧОО км и получать информацию о ее составе, осуществлять контроль загрязнения окружающей среды. Лазерная спектроскопия позволяет анализировать состав малых количеств веществ, имеющих размеры порядка длины волны. Приборы, применяемые в лазерной спектроскопии, принципиально отличаются от обычных спектральных приборов. В них используются лазеры с перестраиваемой частотой, поэтому отпадает необходимость в разложении оптического излучения в спектр с помощью диспергирующих элементов (призм, дифракционных решеток - основных частей обычных спектральных приборов). Лазерная спектроскопия широко внедряется в биологию, химию и медицину, особенно для исследования короткоживущих продуктов, химических и биологических реакций.
271
Инфракрасная спектроскопия Инфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия) - раздел спектроскопии, в задачу которого входит получение, исследование и применение спектров люминесценции, поглощения и отражения в инфракрасной области спектра. Инфракрасная спектроскопия занимается преимущественно анализом молекулярных спектров, так как в ИК-области расположено большинство колебательных и вращательных спектров молекул. В ИК-диапазоне поглощается свет именно тех частот, которые равны частотам колебаний атомов в молекуле. В инфракрасной спектроскопии наиболее широкое распространение получило изучение ИК-спектров поглощения, возникающих в результате поглощения ИК-излучения при прохождении его через вещество. Происхождение ИК- спектров обусловлено главным образом колебаниями атомов в молекуле. ИК-спектр состоит из большого числа полос, причем для молекулярного анализа важно то, что часть полос поглощения может быть приписана колебаниям отдельных атомов группировок, более или менее сохраняющих свойства в разных молекулах. Исследования в области инфракрасной спектроскопии обычно проводятся в интервале длин волн от 1 до 25 мк (10000 - 400 см" 1 ). Основные характеристики спектра ИК-поглощения: число полос поглощения в спектре, их положение, которое определяется частотой v (или длиной волны Д), ширина и форма полос, величина поглощения. Эти характеристики ИК-спектра определяются структурой и химическим составом поглощающего вещества и зависят от его агрегатного состояния, а также от температуры, давления и других факторов. Следовательно, методы инфракрасной спектроскопии позволяют определять структуру молекул, их химический состав, моменты инерции молекул, величины сил, действующих между атомами в молекуле, проводить качественный и количественный анализ смесей различных веществ (полимеров, полупроводниковых материалов, биологических соединений). С помощью быстродействующих спектрофотометров регистрируют ИК-спектры поглощения за доли секунды, что необходимо при изучении быстропротекающих химических и биохимических реакций. Инфракрасная спектроскопия играет большую роль в создании и изучении молекулярных оптических квантовых генераторов, излучение которых лежит в ИК-области спектра. Широкое распространение инфракрасная спектроскопия получила для выяснения структурного состояния биополимеров, в частно272
сти белков и полипептидов. При изучении полимеров обычно исследуют пленки, полученные осаждением из раствора или расплава. В случае необходимости макромолекулы белка в исследуемом препарате подвергают ориентации разными способами (растяжением, прокатыванием, волочением, размазыванием высыхающего раствора). Для получения более богатой (глубокой) информации измеряют не просто поглощение ИК-излучения, а так называемый инфракрасный дихроизм. Сущность метода ИК-дихроизма заключается в измерении разности поглощения света, поляризованного вдоль оси ориентации и перпендикулярно этой оси ориентации молекулы. Так, с помощью измерения ИК-дихроизма можно установить, как направлены важнейшие группы белка ( > О 0 и -NH) по отношению к оси его макромолекулы. Необходимыми для определения частотами пептидной связи белков являются следующие: 3330 см" для валентного колебания -NH-группы, 1660 см"1 для валентного колебания >СО-группы и 1550 см" для деформационного колебания -NHгруппы. Анализ смещения этих полос поглощения, изменения их ширины, формы, величины поглощения позволяет судить о состоянии вторичной структуры белков и полипептидов. Гамма-резонансная спектроскопия Гамма-резонансная (мсссбауэровская) спектроскопия основана на эффекте Мессбауэра, состоящем в резонансном поглощении атомным ядром монохроматического у-излучения, испускаемого радиоактивным атомом. В 1958 г. немецкий физик Р.Л.Мсссбауэр обнаружил, что для ядер, входящих в состав твердых тел, при малых энергиях у-переходов может происходить испускание и поглощение у-квантов без потери энергии на отдачу, т.е. не сопровождающееся изменением внутренней энергии тела; В спектрах испускания и поглощения наблюдаются несмещенные линии с энергией, равной энергии у-перехода, причем ширины этих линий равны (или весьма близки) естественной ширине линий. В этом случае линии испускания и поглощения перекрываются, что позволяет наблюдать резонансное поглощение у-квантов. В соответствующих условиях эксперимента флуоресцентное у-излученис характеризуется предельной резкостью линий. Так, например, резонансное у-излучение Zn имеет полуширину всего лишь 4,8-10" эВ, что составляет примерно 2- 10" % энергии у-кванта,равной 93 кэВ. Для сравнения необходимо подчеркнуть, что для рентгеновского излучения К-линии Zn 273
ее полуширина составляет 4,7 • 10" эВ при энергии фотона 8,6 кэВ, т.е. линия в 10000 раз шире.чем для /-излучения. Наиболее часто с помощью гамма-резонансной спектроскопии изучают соединения железа в силу благоприятного расположения ядерных энергетических уровней в изотопе Fe. Этот изотоп имеет метастабильный уровень, лежащий на 14,4 кэВ выше основного, и переход между этими уровнями даст у-излучение, которое легко поглощается ядрами Fe, находящимися в основном состоянии. Во всех природных соединениях железа содержится 2,2% изотопа 57 Fe, что позволяет изучать Fe-содержащие белки (гемоглобин, миоглобин, цитохромы и др.) методом гамма-резонансной спектроскопии. Исследуемый образец подвергают действию у-лучей, испускаемых радиоактивным 5 7 Fe. Если сообщить радиоактивному источнику небольшую скорость движения относительно образца (поглотителя) вдоль оси, соединяющей источник и образец, то частота укванта немного изменится вследствие эффекта Доплера. При некотором значении собственной частоты ядра Fe образца будут поглощать у-кванты резонансно. Резонансная частота ядра Fe в геме и в других Fe-содержащих группах весьма чувствительна к воздействию соседних атомов и групп. Это дает возможность получать информацию об электронной структуре Fe-содержащих атомных групп в различных их состояниях в белках. Эффект может быть усилен обогащением биополимера изотопом Fe. Наряду с гемопротеидами методом гамма-резонансной спектроскопии эффективно изучаются железосерные белки (ферредоксин, рубредоксин и т.д.), а также механизмы химических реакций с участием железосодержащих биополимеров. Кроме абсорбционных гамма-резонансных спектров изучаются и эмиссионные гамма-резонансные спектры. Эмиссионным методом изучено строение ряда порфириновых соединений кобальта (например, витамин В12). Так как чувствительность эмиссионного метода очень большая, то с его помощью удается следить за быстропротекающими биологическими процессами. Были зарегистрированы мсссбауэровские спектры нескольких образцов лунных пород. Путем сравнения со спектрами известных пород идентифицированы два минерала железа. Гамма-резонансная спектроскопия применяется в геологической разведке для экспрессанализа руд, проведения химического анализа веществ, получения сведений об особенностях взаимодействия атомов в твердых телах и о колебаниях атомов в кристаллической решетке; успешно исполь274
зуется для исследования электронных состояний примесных атомов в металлах и полупроводниках и для решения других задач. Дисперсия оптического вращения (ДОВ) Дисперсия оптического вращения (оптической активности) - зависимость угла вращения (поворота) плоскости поляризации света (<р) или удельной оптической активности (удельного вращения [а]) от длины волны X оптического излучения, проходящего через среду: <р= [а] 1-е, где 1 - толщина слоя активного вещества (или его раствора); с - концентрация этого вещества. Поворот плоскости поляризации в данной среде происходит либо по часовой стрелке (<р > 0), либо против часовой стрелки dp < 0), если смотреть навстречу ходу лучей света. В связи с этим оптически активные вещества, проявляющие естественную оптическую активность, т.е. оптическую активность, не вызываемую наличием внешних полей, разделяют на правовращающие (положительно вращающие, (d), <р > 0) и левовращающие (отрицательно вращающие, (1), <р < 0). Это условное деление теряет смысл лишь вблизи полос собственного (резонансного) поглощения среды. Еще Ж.Био (1815) установил, что в случае чистых жидкостей (скипидара), растворов и паров многих (органических) веществ угол вращения плоскости поляризации <р тем меньше, чем больше X (<р~Х~ ). Такая ДОВ характерна для нормальной оптической активности - вдали от длин волн Хо, на которых в оптически активном веществе происходит резонансное поглощение. Эме Коттон, изучавший оптическую активность для излучений сД , близкими кД 0 (212 нм), обнаружил аномальную оптическую активность - увеличение <р с ростом X. При анализе оптической активности веществ наиболее удобной величиной является молярное вращение [М Ji , связанное с удельным вращением [а Ц следующим уравнением: [М]Я=[аЦ -М/100. В химии белков и полипептидов в качестве молекулярной массы М применяют среднюю массу М аминокислотного остатка из числа остатков, составляющих полипептидную цепь. Для учета показателя преломления растворителя пХ используют скорректированное вращение среднего аминокислотного остатка [m'u: _ 2 2 1 [т']И = 3[а]А • М/100 (пА + 2) град- см -дмоль" . 275
В зарубежной литературе вместо [т*Ц чаще применяют обозначение [R ]х в честь Рэлея. Кривые ДОВ и кругового дихроизма (см. Дихроизм) в области эффекта Коттона, где поглощение обусловлено основной полипептидной цепью, тонко отражают вторичную структуру белковых молекул. Изучение и анализ кривых ДОВ и кругового дихроизма для таких конформации, как а-спираль, /3-структура, неупорядоченная клубкообразная конформация, проводятся на основании результатов по синтетическим полипептидам (например, для полиглутаминовой кислоты и полилизина), а также по экспериментальным данным для белков, структура которых установлена методом рентгеноструктурного анализа. Кривая ДОВ поли-Ь-лизина в а-спиральной конформации обнаруживает минимум при 233 нм, пересекает ось абсцисс около 220 нм, имеет плечо при 215 нм и острый пик при 198 нм (рис. 6.2). Кривая ДОВ полипептида поли-Ь-лизина с /9-структурой характеризуется минимумом при <» 230 нм, имеет точку пересечения при 220 нм и положительный пик при 205 нм. При сравнении с кривой
70 «0
: /
\
50
1 *°
I
30
Ь 20
2,0 0 -1О -20
Л : Vг
ISO
\ 2
V s ^ 1
200 210 220 230 240
250
Рис. 6.2. Кривые дисперсии оптического вращения поли-Ь-лизина в трех конформациях: 1 - а-спираль; 2 -^-структура; 3 - неупорядоченный клубок 276
ДОВ для а-спирали выявляется, что в данном случае глубина минимума почти в 2 раза меньше, пик сдвинут на 6-7 нм в область более длинных волн, а плечо отсутствует. Кривые ДОВ полипептидов в неупорядоченной конформации существенно отличаются от аналогичных кривых для а-спирали, fiструктуры. В качестве стандартных образцов полипептидов с полностью неупорядоченной структурой используются щелочные и нейтральные растворы полиглутаминовой кислоты и нейтральный раствор полилизина. В интервале длинных волн в отсутствие эффекта Коттона (см. Дихроизм) для изучения вторичных структур применяют ДОВ. Кривая ДОВ описывается уравнением Моффита-Янга: [m'h - ( а 0 До2/ А2- До2) + bo До4/ (А2 -А^)2, где коффициенты Моффита а 0 и b 0 являются параметрами, связанными с вторичной структурой биополимера. (В большинстве случаев До - величина постоянная, равная 212 нм.) Коэффициент bo в случае а-спирали (правой) принимает значение -630, а в случае конформации неупорядоченного клубка Ьо£ 0. В водных растворах абсолютная величина bo значительно меньше, чем в органических средах. Коэффициенты Ь о для /5-структуры и конформации неупорядоченного клубка близки к нулю. Значение коэффициента ао зависит от условий среды и аминокислотного состава полипептида и не может быть ( в противовес коэффициенту Ьо) использовано для идентификации конформации макромолекул. Таким образом, с помощью аномальной ДОВ удается получать ценные сведения о конформациях биополимеров и их изменениях (например, переход спираль-клубок) под действием различных физико-химических факторов. Дихроизм Дихроизм - различная окраска одноосных кристаллов, обладающих двойным лучепреломлением, в проходящем свете при взаимноперпендикулярных направлениях наблюдения: вдоль оптической оси и перпендикулярной к ней. Так, например, кристалл апатита при освещении белым светом кажется на просвет светло-желтым, если смотреть по направлению оптической оси, и зеленым - в перпендикулярном направлении. При других направлениях наблюдения кристалл также виден окрашенным в какой-либо из промежуточных цветов. Очевидно, что дихроизм представляет собой частный случай многоцветности (плеохроизма) - изменения окраски ве277
ществ в проходящем через них свете в зависимости от направления распространения этого света и его поляризации. Дихроизм линейный - неодинаковость поглощения обыкновенного и необыкновенного лучей в кристаллах. Дихроизм круговой (эффект Коттона) - различие поглощения для света правой и левой круговых поляризаций. Эффект Коттона один из лучших современных методов характеристики природы спиральных конформаций и оценки степени спиральности белковых молекул - был предложен в 1961 г. для белков, которые заведомо содержат а-спиральные участки. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью: его применяют даже в тех случаях, когда степень спиральности белков довольно мала. С помощью эффекта Коттона была определена степень беспорядочности, создаваемой в метгемоглобине и миоглобине в окисленной форме при обработке этих белков различными способами, приводящими к денатурации биополимеров. Выявлено, что такие процессы приводят к уменьшению содержания спиральной фракции указанных гембелков от первоначальных 75-80 до 10-30 % • Микрокалориметрия Микрокалориметрия - один из современных информативных методов исследования суммарных свойств вещества, в частности, температурного хода теплоемкости. Термодинамические исследования позволяют получать важную информацию о структуре и конформационных переходах спираль-клубок в макромолекулах белков и нуклеиновых кислот. Для этого применяются высокочувствительные дифференциальные сканирующие микрокалориметры, разработанные отечественными (ЭЛ.Андроникашвили, П.Л.Привалов) и зарубежными (Ю.Итимура, Е.Тэрамото) учеными. Принцип метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии состоит в том, что измеряется тепло, необходимое для повышения температуры объекта на очень малую величину, при непрерывном увеличении температуры исследуемого образца. Изменение энтальпии ДН при разворачивании макромолекулы под влиянием физико-химических агентов определяется путем измерения количества тепла, необходимого для поддержания одной и той же температуры биообъекта и образца сравнения (например, буфера) при медленном повышении температуры обоих образцов. Присутствие, образца сравнения дает возможность вносить поправку на вклад теплоемкости (С р ). Чувствительность микрокалориметра составляет не ниже значения 16- 10 Дж • моль*1- град"1. 278
Кривые плавления (процесса денатурации) молекул биополимера представляются в виде зависимости теплоемкости Ср от температуры образца. Если в белковой макромолекуле имеются структурные домеиы с различной термоустойчивостью, то на калориметрической кривой выявляется несколько пиков Ср. Например, для фибриногена крови существует два пика: низкотемпературный с температурой плавления Т п -328 К и высокотемпературный с Т п • 368 К, принадлежащие соответственно Д и Е - структурно-функциональным доменам белковой макромолекулы. Доменное представление фибриногена имеет большое значение для понимания тонких механизмов образования фибриновых волокон при свертывании крови. Несколько структурных доменов имеется и в молекулах иммуноглобулина G, плазминогена, тропомиозина, миозина и др. Методами микрокалориметрии были изучены и термодинамические характеристики плавления ДНК. Теплота и температура плавления этой макромолекулы сильно зависят от значения рН среды. При возрастании величины рН от 7,0 до 9,7 Т п уменьшается от 84,8 до 66,3 °С, АН - от 40,4 до 29,9 кДж/моль, AS - от 113 до 88 Дж/(моль- К). При убывании рН от 5,4 до 3,2 Т п снижается от 84 до 55 °С, АН - от 39,5 до 10,4 кДж/моль, AS - от 107 до 52 Дж/(моль • К). Значение Т п зависит и от ионной силы образца. С помощью метода микрокалориметрии изучают также фазовые переходы (кооперативные процессы) при плавлении фосфолипидных бислоев: измеряют теплоемкость С р суспензии фосфолипидов при разных температурах в области фазового перехода. Показано, что в этой области происходит резкое возрастание значения Ср. Максимум теплопоглощения на кривой зависимости Ср от температуры соответствует Т п . Площадь под пиком на указанной кривой соответствует общему количеству тепла, поглощаемому при переходе из твердого состояния липидного слоя в жидкое (фазовый переход). Метод рентгеноструктурного анализа Рентгеноструктурный анализ объединяет методы исследованияструктуры вещества по распределению в пространстве и интенсивностям рассеянного на анализируемом объекте рентгеновского излучения. Рентгеноструктурный анализ даст прямую информацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах. В его основе лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны <*< 0,1 нм. Последние рассеиваются на элект279
ронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины (регистрируется рентгенограмма). При рассеянии на кристалле можно рассматривать дифракцию как отражение рентгеновских лучей плоскостями кристаллической решетки. Дифракция наблюдается, если рассеянные волны находятся в фазе, т.е. разность хода лучей равна целому числу п волн. Условие дифракции (отражения) дается формулой Брэгга - Вульфа: пД - 2 d s i n 6 , где X - длина волны; d - расстояние между кристаллическими плоскостями; в - угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью. Главная идея рентгеноструктурного анализа состоит в определении расстояний d на основании дифракционной картины, получаемой для рентгеновских лучей с известной X . Дифракционная картина зависит от длины волны рентгеновских лучей и строения объекта. Подробные сведения о строении вещества можно получить только при изучении кристаллов, так как их атомы расположены периодически. Дифракционные максимумы характеризуются различными интенсивностями: их анализ позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле. Эта плотность выражается через так называемые структурные амплитуды, которые зависят от числа электронов в атоме и от направления рассеяния. Методами рентгеноструктурного анализа изучают металлы, сплавы, минералы, неорганические и органические соединения, полимеры, аморфные материалы, жидкости и газы, молекулы белков, нуклеиновых кислот, пенициллина, витаминов (Bi 2) и т.д. Рентгеноструктурный анализ широко используется в медицине для получения рентгеновского изображения объекта, в промышленности для обнаружения различных дефектов в материалах и конструкциях, для выяснения неоднородностей состава неорганических материалов. Бурному развитию молекулярной биофизики способствовало применение рентгеноструктурного анализа для исследований пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот (ДНК). Крупнейшие достижения в изучении биополимеров принадлежат кембриджской научной школе (У. Брэгг, Дж. Кендрью, М.Перутц), исследовавшей структуру миоглобина и гемоглобина. В настоящее время рентгенография высокого разрешения (для миоглобина до 0,14 нм) осуществлена примерно для 200 глобулярных белков (пепсин, леггемоглобин, аспартатаминотрансфераза, коллаген, фиброин 280
и др.). Расшифровка сложных рентгенограмм белков и нуклеиновых кислот - трудная и длительная работа, которую проводят с использованием ЭВМ. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какие биофизические методы анализа биосистем можно отнести к конформационно-чувствительным? 2. Дайте определение понятию "свободный радикал". Приведите примеры неорганических свободных радикалов и свободных радикалов органических соединений. 3. Напишите структурные формулы катион-радикалов и анион-радикалов ароматических аминокислот. 4. Дайте подробную характеристику супероксид-радикалу кислорода. 5. Назовите методы изучения свободных радикалов. 6. Напишите уравнение, определяющее условие резонанса в методе ЭПР. 7. Охарактеризуйте главные направления применения ЭПР-спектроскопии в исследовании биологически важных структур и процессов. 8. Что понимают под химическим сдвигом? С помощью какого уравнения и с какой целью он определяется? 9. В чем заключается сущность метода импульсного (флеш) фотолиза? Нарисуйте блок-схему установки для импульсного фотолиза. 10. Каковы особенности лазерной спектроскопии по сравнению с обычной? 11. Происхождение ИК-спектров: основные характеристики спектра ИК-поглощения. 12. В чем сущность эффекта Мсссбауэра? Назовите области применения гаммарезонансной спектроскопии. 13. Что такое дисперсия оптического вращения? Напишите уравнение МоффитаЯнга. 14. Какие сведения (информацию) можно получить с помощью аномальной дисперсии оптического вращения? 15. Эффект Коттона: определение степени спиральное™ белков и полипептидов. 16. Принцип метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Какие биологические процессы изучаются с помощью этого метода? 17. Рентгеноструктурный анализ как одни из самых точны» методов исследования структуры вещества. 18. В чем заключается главная идея рентгеноструктурного анализа? Основные направления применения этого метода анализа в биохимии и медицине. СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ В о л ь к е н ш т е й н М.В. Биофизика. М., 1988.592 с. Б и о ф и з и к а / Под ред. П.Г.Костюка. Киев, 1988.504 с. С о в р е м е н н ы е методы биофизических исследований/ А.Л.Булычев, В.Н.Верхотуров, Б.А.Гуляев и др.; под ред. А.Б.Рубина. М., 1988. 359 с.
281
ГЛАВА 7 ОСНОВНЫЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ И ФОТОХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ БИОСИСТЕМ Фотохимические и фотофизические процессы имеют огромное значение для жизни на Земле. Как известно, природные фотохимические явления влияли на эволюцию жизни и продолжают оказывать влияние на ее нынешнее существование на Земле. Энергия Солнца утилизируется в процессе фотосинтеза, при этом из атмосферного углекислого газа и воды образуются углеводы и выделяется кислород. Образование из простейших элементов сложных биоорганических соединений, а затем и возникновение самой жизни тесно связаны с фотохимическими процессами. Важнейший для жизнедеятельности человека и многих других существ процесс - зрение - также имеет фотохимическое происхождение. Многогранны и разнообразны пути воздействия фотохимических процессов на нашу жизнь: применения фотохимии простираются от фотографии до фототерапии. В этой главе мы приведем ограниченное число примеров из области прикладной фотохимии и более подробно проанализируем фундаментальные процессы фотохимии биосистем. § 1. Классификация фотобиологических реакций Фотобиологические процессы можно систематизировать как с энергетической, так и с биологической стороны. В первом случае говорят об эндергонических и экзергонических фотобиологических реакциях. С биологической, функциональной стороны фотобиологические реакции можно подразделить на собственно физиологические и деструктивно-модифицирующие. Эндергонические фотобиологические реакции - это такие реакции, при протекании которых образуются фотопродукты, обладающие большими запасами свободной энергии, чем исходные вещества (например: фотосинтез у растений). Основной биологический смысл эндергонических фотобиологических реакций - превращение световой энергии в химическую. Экзергоничсские фотобиологические реакции - это реакции, идущие с уменьшением (или без существенного изменения) свободной энергии системы. Большинство фотобиологических реакций относится к экзергоническим реакци-
ях 2
ям, поэтому роль света, как отмечалось выше, по существу сводится к преодолению активационного барьера этих химических реакций. Теперь проанализируем собственно физиологические, или функционально-физиологические, фотобиологические реакции, в которых только световым путем образуются фотопродукты, необходимые для выполнения некоторых естественных функций клетки (организма). Это означает, что определенные стадии сложной сетки процессов обмена веществ и энергии осуществляются под действием света. Функционально-физиологические фотобиологические реакции могут быть разделены на энергетические, информационные и фотобиосинтетические. В ходе энергетических фотобиологических реакций в АТФ запасается световая энергия (фотосинтез). При протекании информационных фотобиологических реакций кванты света посредством образования фотопродуктов триггируют (запускают) специализированные усилительные механизмы, в результате чего организм получает нужную ему информацию о ситуации в окружающей среде. Примеры информационных реакций: таксисы, зрение у животных; тропизмы у растений; периодизмы у растений, животных, человека. К фотобиосинтетическим реакциям относятся отдельные (промежуточные) фотохимические стадии последовательных реакций биосинтеза некоторых органических соединений (витамина О, хлорофилла). Свет может активировать также ферментативную систему синтеза пигментов (индукция биосинтеза). В случае деструктивно-модифицирующих фотобиологических реакций свет повреждает молекулы биообъекта, индуцирует различные химические превращения их. Основным результатом данных фотобиологических реакций является повреждение или гибель клетки (организма), но наряду с этими эффектами наблюдаются и эффекты противоположного рода, т.е. стимуляция и (или) модификация жизненных процессов. Большинство реакций, вызываемых УФ-излучением, относится к деструктивно-модифицирующим. Однако в ряде случаев и видимый свет способен индуцировать протекание указанных типов реакций: речь идет о фотохимическом действии больших (лазерных) интенсивностей света и о фотодинамическом эффекте. Фотодинамическое действие - поражение клеток видимым светом в присутствии сенсибилизатора (кислорода или красителя). Таким образом, деструктивно-модифицирующие фотобиологические реакции можно подразделить на летальные, мутационные, патофизиологические. В дальнейшем мы сконцентрируем свое вни283
мание на анализе биологических эффектов УФ-света. Почему из оптического излучения мы выбрали только биологическое действие УФ-лучей? Во-первых, действие видимого света на животные и растительные объекты изучается соответственно в курсе физиологии человека и животных и курсе физиологии растений. Во-вторых, механизм биологического действия УФ-излучения привлекает к себе большое внимание широкого круга исследователей. Это связано: а) с все возрастающим использованием УФ-света в биологии, медицине, сельском хозяйстве, промышленной микробиологии и других областях народного хозяйства; б) с интересом к УФ-лучам в связи с началом освоения космического пространства, где интенсивность естественной УФ-радиации Солнца несоизмеримо выше, чем на поверхности Земли; в) в связи с возможными и ожидаемыми последствиями научно-технического прогресса в развитии общества. Рассмотрим более подробно причины, обусловившие необходимость глубокого исследования закономерностей и особенностей биологического действия УФ-лучей различных длин волн. УФ-лучи обладают мощным бактерицидным, антимитотическим, мутагенным, канцерогенным, терапевтическим (лечебным) и профилактическим действием. УФ-излучение широко привлекают для разработки ряда актуальных проблем биологии: структура, функции и метаболизм нуклеиновых кислот и белков, физиология митоза, роль цитоплазматических и ядерных структур в жизнедеятельности клетки, молекулярный и клеточный механизм лучевого поражения и пострадиационного восстановления. Следовательно, УФ-излучение может использоваться в качестве тонкого и специфического инструмента для решения проблем самой клетки, ее строения и функции. Так, были изучены строение и функции отдельных компонентов клеток млекопитающих в культуре (ядерных, ядрышковых и цитоплазматических структур) путем их локального облучения УФ-микролучом. Фотохимия широко применяется в медицине. УФ-облучение используется для дезинфекции, стерилизации и очистки воды, флуоресценция -для диагностики в дерматологической и стоматологической практике, УФ-свет - для отверждения полимерных материалов в стоматологии. С помощью фотополимеризации получают легкие ортопедические фиксирующие повязки. Задачей фототерапии, как области медицины, является лечение заболевания. Незначительные кожные заболевания часто быстро проходят под действием УФ-света, а такая серьезная кожная болезнь, как псориаз, поддается фотохимиотерапии, т.е. УФ-облучение дополняется применением фото284
сенсибилизирующего лекарства типа 8-метоксипсоралена. Последнее принимается больным за несколько часов до облучения. В обычных условиях пребывания на солнечном свету хватает для синтеза достаточного количества антирахитического витамина D3, который необходим для образования здоровых костей. Специальное облучение искусственным УФ-светом может защитить больных, вынужденных находиться в помещении, от развития хрупкости костей и рахита. В настоящее время в хирургических, акушерско-гинекологических и терапевтических клиниках для лечения ряда заболеваний широко используется метод аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК). Эффективность этого метода была убедительно продемонстрирована на больных с островоспалительными процессами, хронической артериальной недостаточностью конечностей, с некоторыми сердечными заболеваниями, при сепсисе и др. Лечебный эффект метода АУФОК связывают с усилением оксигенации крови, купированием гипоксических состояний, повышением бактерицидных и нормализацией реологических свойств УФ-облученной крови, а также стимуляцией факторов клеточного и гуморального иммунитета. Далее представляется целесообразным проанализировать последствия загрязнения атмосферного воздуха, явившегося результатом научно-технического прогресса, на условия жизни на Земле. Высвобождая каталитически активные материалы в ходе своей деятельности, человек может неумышленно изменить концентрации озона, который интенсивно поглощает коротковолновую часть спектра УФ-излучения Солнца, защищая живые системы от летального (смертоносного) действия УФ-лучей. Из-за высокой вертикальной стабильности в результате температурной инверсии внесенные в стратосферу загрязнители могут существовать там несколько лет, прежде чем будут физически удалены путем переноса. Поэтому они могут накапливаться до уровней глобального разрушения, уменьшая концентрацию озона (Оз) в стратосфере с биологическими последствиями на поверхности Земли. Из-за быстрого развития сверхзвукового воздушного транспорта, летающего на высоте 18-30 км, началось разрушение озонового пояса атмосферы. Так, перелеты через Атлантический океан 500 самолетов типа "Конкорд" только за летний сезон приводят к снижению концентрации озона на 2-5%. Главной причиной разрушения озонового защитного пояса Земли может явиться попадание в стра285
тосферу фторхлоруглеводородов типа дихлордифторметана CF2CI2 (CFC-12) и трихлорфторметана GFCI3 (CFC-11). Фторхлоруглеводороды имеют важное значение как аэрозольное ракетное топливо, хладагенты (фреоны), наполнители в производстве пенопластиков и растворители. Все применения фторхлоруглеводородов в конце концов приводят к их выделению в атмосферу. Установлено, что в течение года содержание фреонов в воздушной среде ноосферы возрастает почти на 10%. Основные негативные последствия загрязнения атмосферного воздуха фреонами связаны с их диссоциацией в пределах стратосферы с выделением атомов хлора, вызывающих каталитическое разложение озона. В Антарктике было обнаружено новое явление - "озоновая дыра": ежегодное резкое падение уровня озона в октябре. Высказана гипотеза, что "дыра" связана с возрастанием количества фторхлоруглеводородов в атмосфере. Уменьшение содержания озона обусловлено также увеличением количества N2O в биосфере вследствие интенсивного применения удобрений. Удвоение концентрации N2O должно привести (согласно проведенным оценкам) к снижению концентрации озона на 916%, хотя столь большое увеличение концентрации N2O мало вероятно в ближайшем будущем. Из вышеизложенного следует, что возникает опасность резкого повышения на Земле интенсивности биологически наиболее активной компоненты солнечного излучения, к которой живые организмы эволюционно не приспособлены. Если общая концентрация озона атмосферы уменьшится на 10%, то интенсивность коротковолнового УФ-света на поверхности Земли возрастет на 2-4 порядка. В результате этого УФ-излучение будет оказывать вредное влияние на живой мир: возрастет частота появления рака кожи у светлокожих людей, будет проявляться разрушительное воздействие УФ-радиации на растения, в том числе и на сельскохозяйственные культуры, ряд сухопутных и морских организмов. Все сказанное диктует необходимость систематического и разностороннего исследования биологических эффектов УФ-излучения, и в первую очередь его коротковолнового диапазона с использованием биообъектов различной сложности организации. Первые данные о действии УФ-излучсния на живые системы относятся к 1877 г., когда А.Даунси Т.Блант обнаружили, что оно вызывает инактивацию бактерий. Однако интенсивная экспериментальная работа развернулась только в 50-е гг. после открытия в 1949 г. явления фоторсактивации (снятия или ослабления видимым 286
светом последствий УФ-облучения клеток). Установление факта фотореактивации вызвало быстрое исследование эффектов УФ-света на клеточном уровне. Расшифровка же молекулярных механизмов фотопроцессов в основном началась в 60-е гг. За последние 30 лет исследователям удалось выявить и изучить как ключевые стадии сложного фотобиологического процесса в отдельности, так и их взаимоотношения в биосистемах. § 2. Особенности УФ-излучения как биологического фактора УФ-излучение относится к группе излучений электромагнитной природы. В спектре электромагнитных колебаний УФ-область располагается между рентгеновскими лучами и видимым светом, занимая диапазон длин волн ^2-400 нм с энергией кванта 125-ь 3 эВ О э В - 1,6 • 10" 12 Эрг = 23ккал/моль). Поверхности Земли УФ-свет достигает в диапазоне 287-400 нм с энергией квантов ^"3-4 эВ. Коротковолновая часть спектра УФ-излучения Солнца, как отмечалось выше, полностью поглощается озоновым слоем атмосферы. В биологических исследованиях в настоящее время изучается преимущественно УФ-излучение в диапазоне 120+ 400 нм. Весь спектр УФ-излучения принято делить на четыре участка: 1. 315-400 нм - длинноволновое УФ-излучение (ДУФ); 2. 280-315 нм - средневолновое УФ-излучение (СУФ); 3. 200-280 нм - коротковолновое УФ-излучение (КУФ); 4. < 200 нм - вакуумный ультрафиолет. Выявление биологических эффектов вакуумного УФ-излучения затруднено тем, что его кванты поглощаются кислородом воздуха, а также кварцем и стеклом (последнее пропускает только ДУФ). Работ, выполненных с применением вакуумного УФ-излучения, явно недостаточно, чтобы судить о механизме его биологического действия. Эксперименты проведены главным образом на бактериальных спорах. Вместе с тем интерес к изучению биологических эффектов вакуумного УФ-излучения постоянно возрастает л в настоящее время в этих исследованиях происходит переход на молекулярный уровень, т.е. изучаются фотохимические изменения нуклеиновых кислот, белков, нуклеотидов, нуклеозидов, азотистых оснований, аминокислот и др. Важнейшая особенность УФ-излучения состоит в том, что УФлучи разной длины волны поглощаются различными по химическому составу и строению (конформации) биологическими молекулами (см. гл. 5). УФ-лучи отличаются небольшой проникающей спо287
собностью, что объясняется малой энергией квантов и интенсивным поглощением УФ-света биомолекулами. При облучении многоклеточных организмов или их тканей область первичных фотохимических эффектов ограничивается только поверхностными слоями клеток: ДУФ проходит в ткани примерно на 1 мм, а СУФ - примерно на 0,5 мм. Напомним, что в спектре УФ-излучения Солнца, достигающего поверхности Земли, на долю ДУФ приходится 96%, а на долю СУФ-лишь 4%. Совокупность вышеприведенных особенностей УФ-излучения как биологического фактора и является причиной его высокой активности и того многостороннего действия, которое оно оказывает на живые организмы и биообъекты. Установлено, что, с одной стороны, УФ-лучи стимулируют рост и размножение клеток, способствуют синтезу высокоактивных биологических веществ типа витаминов и антибиотиков, вызывают в коже человека загар и эритему, увеличивают устойчивость клеток к различным повреждающим агентам и повышают сопротивляемость организма к ряду заболеваний. С другой стороны, наиболее сильное повреждающее (модифицирующее) действие на клетки (микроорганизмы) оказывает УФ-свет, поглощаемый нуклеиновыми кислотами. Уже в середине 30-х гг. стало ясно, что каждый биологический эффект инициируется строго определенной областью длинволн УФ-лучей, т.е. имеет свою спектральную характеристику (табл. 7.1). Таблица 7.1 Спектральная характеристика основных биологических эффектов УФ-излучения Биологический эффект Загар Эритема Антирахитическое действие Канцерогенное действие Летальное, антимитотическое действие на клетки Мутагенное действие на клетки и вирусы
Диапазон длин волн, нм 280-400 250-320 260-310 260-320 200-320 200-320
Эритема (покраснение кожи) вызывается главным образом СУФ. Канцерогенным действием обладает КУФ. В результате неумелого применения этой части спектра УФ-излучения из-за недостаточного знания механизма его действия УФ-лучи могут вызывать рак кожи. Как следует из данных таблицы, загар индуцируется преимущественно СУФ. Летальное, антимитотическое и мутагенное действие на клетки и живые организмы оказывает КУФ в диапазоне 250288
280 нм (максимум светопоглощения ДНК и других нуклеиновых кислот и ДНП в клетке). Значительный вклад в разработку проблемы выяснения закономерностей воздействия УФ-излучения различных областей спектра на клетки внесли отечественные исследователи акад. Г.М.Франк, К.А.Самойлова, В.Н.Сахаров и др. § 3. Фотохимические превращения биополимеров и биомембран Действие УФ-излучения на белковые системы Фотохимические реакции белков - совокупность типов фотохимических реакций, приводящих к различным повреждениям белковых молекул и их возможной инактивации (активации). Доказано, что основными хромофорами белков являются остатки ароматических аминокислот, главным образом триптофана и в значительно меньшей степени тирозина и фенилаланина. Эти аминокислоты, а также цистин ответственны за функционально активное поглощение квантов света макромолекулами белков. Об этом свидетельствует совпадение спектров действия фотоинактивации белков с их спектрами поглощения. В табл. 7.2 приведены сведения о степени фотохимической чувствительности ряда аминокислот при 254 нм. Таблица 7.2 Фоточувствительность аминокислот при 254 нм Соединение
Фотохимические свойства с, л/моль- см
Цистин (S-S-связь) Триптофан Тирозин Фенил аланин Ацетилаланин (пептидные связи) Гистидин
Ч>
270 2870 140 320
0,13 0.004 0,013 0.002
,„20 2 а-10 ,см 13,4 4,4 0,69 0,23
0,2 0,24
0,05 <0,03
0,004 < 0,0027
Из данных табл. 7.2 вытекает, что наибольшую роль в УФ-инактивации белков играют остатки серосодержащих и ароматических аминокислот. Причем при действии УФ-света с X > 285 нм поглощение осуществляется в основном триптофаном и тирозином. В более коротковолновой области спектра (240-260 нм) резко возрастает роль фотолиза цистина. Образованию конечных стабильных фотопродуктов ароматических аминокислот предшествует возникновение ряда первичных 289
(промежуточных) лабильных (неустойчивых) фотопродуктов свободнорадикальной природы. Появление в белковых образцах при УФ-облучении (260-280 нм) свободных радикалов ароматических аминокислот зарегистрировано с помощью методов электронного парамагнитного резонанса, фотохемилюминесценции и фототермолюминесценции. Благодаря использованию низких температур (77 К), способствующих накоплению и стабилизации лабильных фотопродуктов, удалось выяснить природу свободных радикалов триптофана, тирозина, фенилаланина, цистина и др. Установлено, что основной первичной фоторсакцией ароматических аминокислот в белке является фотоионизация - отрыв электрона от молекулы аминокислоты (АН) с образованием катион-радикала (АН ) и сольватированного (захваченного средой, т.е. окруженного молекулами растворителя) электрона (es) по следующей схеме: AH + hv -.-АН*-» AH+ + c s . При распаде (диссоциации) катион-радикала (сильной кислоты) возникает нейтральный радикал: •АН+-» -А + Н . Ниже приведены структурные формулы свободных радикалов ароматических аминокислот:
СНч/ COQ"
Радикал триптофана
Радикал фенилаланина
Поглощение квантов УФ-свста (254 нм) цистином сопровождается образованием свободных радикалов с локализацией нсспаренного электрона на атоме серы. При фотолизе цистина разрываются -S-S-связи и возникают радикалы типа S-СНг-СН-СООН:
•уупчг Ы,
SH
*
сн
СН 290
H 2 N COOH
Квантовый выход фотолиза цистнна в растворе в 100-1000 раз выше, чем триптофана, и составляет~0,13 (см. табл. 7.2). В белках квантовый выход фотолиза цистина еще больше и колеблется от 0,18 в инсулине до 0,75 в химотрипсиногене. Фотолиз -S-S-связи может происходить при поглощении квантов УФ-излучения как самим цистином, так и ароматическими аминокислотами. Разрывы дисульфидной связи цистина, входящего в активный центр белка, приводят к его фотоинактивации, под которой понимают потерю ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной, иммунологической и других видов активностей белковых макромолекул. На рис. 7.1 приведена схема процессов фотопревращения аминокислотных остатков белков при УФ-облучснии. Выявлено, что существенное влияние на фоточувствительность белков оказывает конформация их молекул. Показано, что самые различные физические и физико-химические воздействия (повышение температуры, сдвиги значений рН, присутствие в растворах Нативный белок Ароматические аминокислоты
-S-S- + hv,,
АО, <-= А + Н* «- АН* + о
Рекомбинация и хемилюминесценция
Радикалы цистина
Димеры ры
ДОФА, формилкинуренин, тирозин
Реакции без участия О,
Фотолиз S-Sи C-S -связей
Нарушения конформации или повреждения активного центра
Инактивация Рис. 7.1. Схема процессов фотонпактпници" белкоиых молекул 291
мочевины, гуанидина, детергентов), вызывающие структурные перестройки белковых макромолекул, приводят к значительным изменениям квантовых выходов фотоинактивации белков. УФ-облучение индуцирует повышение функциональной активности некоторых белков (карбоксипептидазы А, цитохрома с). Так, например, мы исследовали влияние УФ-свста (240-390 нм) в интервале доз (1,51-30,2) -10 Дж/м на каталитические свойства супероксиддисмутазы при различных значениях рН. При этом был выявлен эффект фотоактивации молекул фермента, наиболее выраженный при экстремальных для проявления активности СОД значениях рН. УФ-облучение в дозе 151 Дж/м растворов оксигемоглобина человека приводило к сдвигу кривых диссоциации гембелка в область меньших значений парциального давления кислорода, что свидетельствует о повышении сродства гемоглобина к кислороду. Нами изучены закономерности и особенности фотохимических превращений гемопротеидов (гемоглобина, цитохрома с, каталазы) в условиях различного микроокружения их молекул. Выявлено, что главная особенность действия УФ-свста в области 250-400 нм на гемопротеиды состоит в том, что ароматические аминокислоты апобелков фотосенсибилизируют простетические группы, а 'фотомодификация простетических групп (гемов) индуцирует локальные конформационные перестройки апобелков. Причем первичные фотохимические реакции, приводящие к фотоокислению, фотовосстановлению и фотодиссоциации лигандов (Ог, СО, CN"), протекают только в ароматических аминокислотах белковых компонентов гемопротеидов: названных фотореакций не наблюдается при УФ-облучении растворов гембелков в области евстопоглощения их железопорфириновых частей. Действие УФ-излучения на нуклеиновые кислоты Фотохимические реакции нуклеиновых кислот - совокупность типов фотохимических реакций, приводящих к различным повреждениям нуклеиновых кислот и прежде всего ДНК. Это - образование фотодимеров тимина, урацила, цптозинл, смешанных димеров; гидратация цитозина и урацила; внутримолекулярные и межмолекулярные сшивки ДНК; сшивки ДНК-белок; разрывы сахарофосфатного остова нуклеиновых кислот. Пуриновые азотистые основания более фоторезистентны, чем пиримидиновые, поэтому нуклеиновые кислоты повреждаются пре-
292
имущественно в результате протекания фотохимических реакций с участием пиримидиновых оснований. Димеризация тимина обнаружена Р.Бейкерсом, В.Берендсом и др. (1958) в экспериментах по УФ-облучению его замороженных водных растворов. Вскоре было установлено, что фотодимеризация тимина играет существенную роль в инактивации бактерий и вирусов. Сущность реакции фотодимеризации состоит в разрыве 5,6-двойной связи у обеих вступающих во взаимодействие молекул тимина и образовании циклобутанового кольца:
о r/NN и
I
н
... о .. П
I
н
~
.,
о I
н
J П II
|
н
Как прямая, так и обратная реакции имеют фотохимическую природу и не требуют термической активации. Установлено, что в замороженных растворах тимина в интервале температур от 0 до -196 °С скорость реакций не изменяется, т.е. коэффициент 0 ю ~ 1, следовательно, энергия активации равна нулю. Фотодимеры тимина характеризуются максимумом свстопоглощения около 240 нм. Под влиянием коротковолнового УФ-излучения (235-239 нм) димеры тимина мономеризуются: расщепляются на исходные мономеры (рис. 7.2). Квантовый выход реакции фотодимеризации тимина сильно зависит от концентрации и степени взаимоориентации мономеров тимина в момент возбуждения одного из них. При идеальном стереометрическом соответствии мономеров (кристаллы моногидратов тимина) квантовый выход образования димеров составляет е*> 1. По мере нарушения этого соответствия квантовый выход реакции фотодимеризации снижается для политимидиловой кислоты до 0,02, а для тимидил-тимидина - до 0,003. Фотодимеры тимина циклобутанового типа образуются в однонитевых полинуклеотидах и в ДНК. Квантовый выход фотодимеризации тимина изменяется при любых воздействиях, оказывающих влияние на пространственную структуру ДНК (изменение влажности, температуры, значения рН, ионной силы, присутствие химических агентов). 293
100
Рис. 7.2. Спектры действия димеризации тимина (1) и фотомономеризации димеров (2) в политимидиловой кислоте
220 240 260 280 300 н м Известны убедительные экспериментальные доказательства триплетного механизма образования тиминовых фотодимеров. Другими словами, предшественником фотодимеров тимина в свободном состоянии и в составе ДНК является триплетное возбужденное состояние его молекул. Тем не менее в научной литературе обсуждается вопрос о возможности протекания реакции фотодимеризации тимина и через синглетное возбужденное состояние азотистого основания. Вероятность осуществления этой реакции через синглетное состояние тимина, особенно при благоприятных физических и физико-химических условиях, остается достаточно высокой. Вызвать мономеризацию димеров нагреванием или химическими реагентами не удается: есть только фотохимическая реакция мономеризации димеров. Фотодимеризация урацила происходит при УФ-облучении урацила или его производных в замороженных и водных растворах урацилсодержащих динуклеотидов, РНК вируса табачной мозаики, транспортной и рибосомной РНК. При этом также возникают фотодимеры урацила с циклобутановым кольцом:
О н
294
,н
О
О
Квантовые выходы прямой и обратной реакций зависят от длины волны действующего света. Фотодимеры цитозина обнаружены после УФ-облучения цитозина, цитидил-цитидина, ДНК. Фотодимеры цитозина неустойчивы и в темноте могут мономеризоваться или дезаминироваться с превращением в димеры урацила через стадию образования смешанного димера Ц - У. NH2 I Н
Н
о
NH,
+ШГ
н
д
НН
о II
н
Квантовый выход фотодимеризации цитозина резко (примерно в 9 раз) возрастает при повышении значения рН от 3,0 до 6,5. Реакция гидратации урацила и цитозина протекает под действием УФ-света в области 260-270 нм. Фотогндраты образуются в растворах урацила и цитозина, их ди- и полпнуклеотидах (нуклеозидах), РНК и ДНК. Сущность реакции фотогидратации заключается в присоединении молекулы воды к пиримидиновому кольцу у 5,6двойной связи с ее разрывом:
Видно, что эта реакция фотонсобратима: гидраты разрушаются в темноте при повышении температуры образцов, при сдвигах рН как в щелочную, так и в кислую области, при возрастании ионной силы 295
раствора. Квантовый выход фотогидратации урацила в растворе достигает значения 0,002, а в полиуридиловой кислоте - 0,01. Разрывы полинуклеотидной цепи ДНК выявляются при воздействии больших доз УФ-излучения с квантовым выходом порядка 10 -10 . Разрывы сахарофосфатного остова ДНК в результате УФоблучения можно наблюдать под электронным микроскопом. В ряде работ получены данные, указывающие на образование внутримолекулярных ковалентных сшивок между двумя комплементарными цепями ДНК в растворе. Так, показано, что УФ-облученная ДНК неспособна "расплетаться" на отдельные полинуклеотидные цепи при денатурационных воздействиях - разрыве водородных и других нековалентных связей. Квантовый выход образования межмолекулярных ДНК-ДНК сшивок (связей) составляет ~10~ . Предполагают, что за появление этих сшивок, как и внутримолекулярных, ответственны тиминовые димеры. Макромолекулы нуклеиновых кислот под влиянием УФ-света претерпевают денатурационные изменения. Фотоденатурация ДНК является следствием разрушения кооперативной системы слабых нековалентных связей (водородных, гидрофобных) и частичным (локальным) или полным нарушением ее двуспиральной структуры. После УФ-облучения растворов ДНК наблюдается уменьшение вязкости, снижение сродства к метиловому зеленому, повышение чувствительности ее макромолекулы к тепловой денатурации, что связывают с разрывом водородных связей и нарушением нативнои конформации ДНК. Разрыв водородных связей в двойной спирали молекулы ДНК был показан В.Зауэрбиром (1960) и другими исследователями в опытах с использованием формальдегида. Известно, что последний реагирует со свободными аминогруппами азотистых оснований. Поэтому разрыв водородных связей можно определить, измеряя кинетику связывания формальдегида сразу после прекращения облучения образцов ДНК. При увеличении доз УФ-излучения количество связываемого формальдегида возрастает, что указывает на разрыв- водородных связей с освобождением свободных аминогрупп азотистых оснований в составе макромолекулы ДНК. Разрыв водородных связей зарегистрирован также по понижению точки "плавления" ДНК, т.е. перехода спираль-клубок. С помощью методов вискозиметрии, электронной микроскопии, седиментации, светорассеяния В.М.Жильцовой (1967) было показано, что вязкость растворов ДНК тимуса теленка падает с увеличением времени УФ-облучения по экспоненциальному закону. Кон296
станта скорости уменьшения вязкости растворов биополимера оказалась равной 5,4- 10" мин" . Оптическая плотность растворов ДНК возрастала по мере увеличения времени УФ-облучения. Константа скорости увеличения гиперхромного эффекта составляла 5,8- 10" мин" . Совпадение величин названных констант свидетельствует о том, что снижение вязкости обусловлено разрывом водородных связей. Молекулярная масса УФ-облученных образцов ДНК заметных изменений не претерпевала, что является аргументом в пользу представления о конформационных превращениях молекулы ДНК вследствие УФ-облучения. К.Е.Кругляковой и сотр. (1979) с помощью методов спиновой метки и спиновых зондов были получены сведения о конформационных изменениях ДНК при УФоблучении ее образцов. УФ-облучение клеток (например, E.coli) индуцирует сшивки нуклеиновая кислота - белок в составе РНП и ДНП. Изучение механизма фотохимического образования ковалентных сшивок между ДНК и белком позволило К.Смиту (1962) предположить, что аминокислоты белков (гистонов) через SH- и ОН-группы присоединяются к пятому (или шестому) углеродному атому азотистого основания ДНК (прежде всего тимина). Помимо фотоповреждения нуклеиновых кислот в клетках протекает другой важнейший фотобиологический процесс - фотореактивация, осуществляющаяся с участием фотореактивирующего фермента. Этот фермент выделен как из бактериальных клеток, так и из клеток человека. Фотореактивирующий фермент вступает во взаимодействие с циклобутановыми димерами пиримидиновых азотистых оснований с образованием соответствующего комплекса. В таком комплексе видимый свет вызывает распад димеров с регенерацией исходных оснований. В лимфоцитах или фибробластах человека спектр действия фотореактивации располагается в области 300-600 нм с максимумом при 400 нм. Таким образом, фотореакцивация ответственна за мономеризацию пиримидиновых димеров, индуцированных УФ-излучением в нуклеиновых кислотах. Действие УФ-излучения на липиды и биологические мембраны Биологические мембраны (см. гл. 4) выполняют в клетке барьерную функцию, основанную на их низкой проницаемости для полярных молекул и ионов. УФ-облучение биомембран приводит к протеканию в них одновременно нескольких фотохимических реакций: фотоинактивация белков в результате фотолиза ароматических 297
аминокислот и серосодержащих групп, пероксидное окисление липидов, фотодеструкция различных коферментов, таких как пиридиннуклеотиды, флавины, кофермент Q, геминовые соединения, которые связаны с ферментными системами, встроенными в биомембраны. Фотохимические реакции с участием любого из этих хромофоров должны отразиться на функционировании мембраны. Пероксидное фотоокисление липидов - основная реакция превращения молекул липидов под влиянием УФ-излучения. Оно имеет важнейшее значение в процессах фотоповреждения биологических мембран, которые сформированы из фосфолипидов и белков. УФ-свет индуцирует фотоокисление липидов: отмечается прямая корреляция между степенью их окисляемости и степенью ненасыщенности жирных кислот (RH), в частности олеиновой, линолевой, линоленовой и арахидоновой. В результате УФ-окисления молекул липидов образуются гидропероксиды жирных кислот (ROOH), которые относятся к первичным относительно стабильным продуктам реакции фотоокисления липидов. Диеновые гидропероксиды жирных кислот имеют максимум светопоглощения п р и ^ З З нм, а триеновые гидропероксиды - при ~270 нм (рис. 7.3). D 1.0
Рис. 7.3. Спектры поглощения продуктов фотолиза (X > 239 нм) липидов из мозга крыс: 1 — необлученные липиды в гептане; 2 — УФ-облучение на воздухе; 3 УФ -облучение в отсутствие кислорода;
0,5
0,0
i
i
250
i
300 »л
Квантовый выход реакции образования пероксидов значительно превышает 1 (например, 90 для окисления этиллинолеата). Это означает, что УФ-окиеление липидов происходит по цепному, свобод298
норадикальному механизму в соответствии с такой последовательностью реакций: RH + hv - R' +O2 -ДО*2 + RH -• R + 02 -• ROOH ->R02 + RH,-> R*+02 - R O 2 + RH -R", ROOH ROOH где R - первичный свободный радикал; R02 - пероксидный радикал. Первичной фотохимической реакцией, приводящей к образованию радикала R, является отрыв электрона или атома водорода от одного из атомов углерода жирной кислоты (RH). Гидропероксиды, возникающие при пероксидном фотоокислении липидов, претерпевают дальнейшие превращения с образованием ряда стабильных продуктов окисления, в том числе альдегидов, например, малонового диальдегида, способного давать окрашенный хромофор (Д - 533 нм) с тиобарбитуровой кислотой:
с-снг-сС! от ^^о
Есть также и другие продукты разрушения пероксидных соединений, сообщающие окисленным липидам желтоватую окраску и характеризующиеся светопоглощением в видимой области спектра. Используя различные условия УФ-облучения, удается избирательно накапливать те или иные продукты фотоокисления липидов. Процесс образования конечных (стабильных) продуктов фотоокисления липидов осуществляется в две стадии: Ненасыщенная жирная кислота (поглощение при X < 220 нм) сенсибилизатор, I УФ-облучение, (Стадия 1) кислород * Гидропероксиды (поглощение при X « 233 нм) УФ-облучение в вакууме
(Стадия 2) I
Альдегиды и кетоны (поглощение при 260-280 нм) Пероксидное фотоокисление липидов является двухквантовым процессом. Видно, что реакция распада гидропероксидов может протекать и в отсутствие кислорода. УФ-свет в области 233 нм, интенсивно поглощаемый гидропероксидами, индуцирует образование конечных продуктов (альдегидов и к стонов). 299
Фотолиз фосфолипидов может приводить к серьезным нарушениям структуры биомембран. Известно также, что продукты пероксидного фотоокисления липидов обладают достаточно выраженными токсическими свойствами. Пероксиды липидов и продукты их дальнейших превращений (альдегиды и кетоны) могут индуцировать повреждение белковых молекул, в частности, сульфгидрильных групп белков. Повреждение белков может быть обусловлено как их окислением, так и образованием стабильных ковалентных связей между молекулами белков и продуктами пероксидного фотоокисления липидов. Последние способны инактивировать многие ферменты, в том числе и ацетилхолинэстеразу эритроцитарных мембран. Указанные продукты окисляют также такие биологически важные соединения, как цистеин, глютатион, нуклеотиды, витамины А и D, липоевую кислоту и др. Воздействие УФ-света приводит к повышению проницаемости биомембран для различных веществ и прежде всего для ионов. Изменение ионной проницаемости клеточных мембран было обнаружено у дрожжей, яиц морского ежа, водорослей, простейших и т.д. Изменение проницаемости мембран для ионов натрия и калия было установлено после УФ-облучения безъядерных клеток (эритМЕМБРАНА
липиды
БЕЛКИ
нжк*
-SH- группы -S-S- мостики
Перекисное . фотоокисление Окисление
Разрыв
Увеличение проницаемости для Н\ К', Na'
Разобщение окислительного фосфорилирования
300
Набухание и лизис клеюк и их органелл
Рис. 7.4. Схема молекулярного механизма повреждения мембранных структур животной клетки под действием У Ф света ( Н Ж 1 ^ - ненасыщенные жирные кислоты)
роцитов человека). При этом происходил выход калия из клетки, вход в нее натрия и как следствие нарушения осмотического баланса - набухание и лизис эритроцитов. Увеличение проницаемости наблюдалось также и в случае мембран субклеточных структур, например, митохондрий и лизосом. Пероксиды липидов могут вызывать повышение проницаемости мембран для ионов Н+, К и Na в результате повреждения как белкового, так и липидного компонентов биологической мембраны. Д.И.Рощупкин (1980) предложил схему процессов, приводящих к повреждению мембранных структур животной клетки под действием УФ-излучения (рис. 7.4). В нормальной (интактной) биомембране пероксидное фотоокисление липидов, по-видимому, заторможено из-за структурных ограничений и наличия разнообразных антиоксидантов, включая природный антиоксидант — а—токоферол (витамин Е). КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какова роль фотохимических процессов для поддержания жизни на Земле? 2. Дайте классификацию фотобиологических реакций. 3. Применение фотохимии в медицине. 4. Проанализируйте главные причины разрушения озонового защитного пояса Земли, существование "озоновой дыры". 5. В чем особенности УФ-излучения как физического агента и биологического фактора? 6. Дайте спектральную характеристику основные биологических эффектов УФизлучения. 7. Докажите, что наибольшую роль в фотоинактивации белков играют остатки серосодержащих и ароматических аминокислот. 8. Напишите структурную формулу свободного радикала, образующегося при фотолизе молекул цистина. 9. Влияет ли конформация белковых молекул на их УФ-чувствителыюсть? 10. Проанализируйте закономерности и особенности фотохимических превращений гемопротеидов. 11. Перечислите основные типы фотохимических реакций, приводящих к различным повреждениям нуклеиновых кислот. 12. Напишите уравнения реакции фотодимеризации молекул тимина. Какова эффективность протекания данной реакции (квантовый выход димеризации тимина)? 13. Является ли реакция фотодимеризации урацила фотохимически обратимой? 14. Напишите уравнения реакции фотогидратации урацила и цитозииа. 15. С помощью каких методов получены доказательства разрыва полинуклеотидной цепи ДНК под влиянием УФ-света? 16. Дайте определение понятию "фотореактивация": роль фотореактивирующего фермента в осуществлении этой реакции.
301
17. Является ли пероксидное фотоокисление липидов свободнорадикальным процессом? Каков его квантовый выход? 18. Опишите отдельные стадии процесса образования стабильных продуктов фотоокисления липидов. 19. В чем заключаются особенности фотохимических превращений белков в составе биомембран по сравнению со свободными белками? 20. Какова роль липидов в процессах УФ-модификации биомембран? 21. Опишите схему процессов, приводящих к повреждению мембранных структур животной клетки под действием УФ-излучения (по Д.И.Рощупкину). СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ А р т ю х о в В.Г. Фотохимия и фотофизика сложных белков// Вестн. Вороне же к. ун-та Серия 2. 1993. Вып.1. С.20-35. В л а д и м и р о в Ю.А., П о т а п е н к о А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М., 1989. 199 с. К о н е в СВ., В о л о т о в с к и й И.Д. Введение в молекулярную фотобиологию. Минск, 1971.232 с. К о н е в СВ., В о л о т о в с к и й И.Д. Фотобиология. Минск, 1979. 378 с. К р у г л я к о в а К.Е., Ж и л ь ц о в а В.М., Г р и б о в а З.П. Физико-химические механизмы повреждения ДНК УФ-излучением// Фотобиология животной клетки. Л., 1979. С.64-73. С а м о й л о в а К.А. Действие ультрафиолетовой радиации на клетку. Л., 1967. 145 с. С а м о й л о в а К.А. Сравнительный анализ действия на клетки нефотосинтезирующих организмов ультрафиолетового излучения различных областей спектра: Автореф. дис.... докт. биол. наук. Л., 1979. 52 с. С а х а р о в В.11. Действие коротковолнового ультрафиолетового излучения на клеточные структуры и их функции: экспериментальный анализ методом микрооблучения: Автореф. дис.... докт. биол. наук. М., 1988. 39 с. Р о щ у п к и н Д.И. Молекулярные механизмы повреждения мембран, липидов и белков под действием ультрафиолетового излучения: Дис. ... докт. биол. наук. М., 1980.524 с. У э й н Р. Основы и применения фотохимии. М., 1991. 304 с.
302
ГЛАВА 8 ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА РАЗЛИЧНЫЕ БИОСИСТЕМЫ § 1. Предмет и проблемы радиобиологии Радиобиология - наука, изучающая закономерности и механизмы действия ионизирующих излучений на биологические системы различной сложности организации (макромолекулы, фаги, вирусы, простейшие, клеточные, тканевые и органные структуры, многоклеточные растительные и животные организмы, человек, популяции, биоценозы). Поэтому она отражает в той или иной степени все области биологии. Специфика этой науки обусловлена большой энергией квантов излучения и частиц ( а-частиц, электронов, позитронов, протонов, нейтронов, л-мезонов и др.), значительно превосходящих энергию ионизации атомов, и способностью частиц проникать в глубь облучаемого объекта. Ионизирующее излучение (радиация) воздействует на все структуры облучаемого объекта, составляющие их молекулы и атомы. Современная радиобиология - самостоятельная комплексная дисциплина, имеющая собственные методы исследования и четко выделенные отдельные направления: общая радиобиология, радиационная биохимия, радиационная цитология, радиационная генетика, радиационная экология, противолучевая защита и терапия радиационных поражений, космическая радиобиология, радиационная иммунология, радиационная гигиена и радиобиология опухолей. Каждое из этих направлений имеет свои конкретные задачи, вытекающие из их названий, для решения которых используются специальные радиобиологические методы анализа, что и объединяет их в одну общую дисциплину - радиобиологию. Фундаментальной проблемой радиобиологии является вскрытие общих закономерностей биологического ответа на воздействие ионизирующего излучения. Для решения этой задачи необходимо, по выражению Н.В.Тимофеева-Рессовского, понять и объяснить основной радиобиологический парадокс. Под последним подразумевается большое несоответствие между ничтожной величиной поглощенной энергии и крайней степенью выраженности реакций биообъекта, вплоть до летального эффекта. Известно, что облучение в дозе 10 Гр вызывает гибель всех млекопитающих (см. Доза ионизирующего излучения). Что же представляет собой такая доза по сум-
303
марной энергии, поглощенной в теле животного при облучении? Если условно перевести эту энергию без потерь в тепловую энергию, то окажется, что организм человека нагревается лишь на 0,001 °С. Отсюда становится понятной необходимость выяснения сущности основного радиобиологического парадокса. Радиобиология - дисциплина экспериментальная: ни Одно утверждение в ней не воспринимается серьезно, если оно лишено путей экспериментальной проверки. Другая ее особенность - стремление овладеть способами искусственного управления лучевыми реакциями биологических объектов и человека с помощью различных модифицирующих средств (см. Радиопротекторы и радиосенсибилизаторы). Радиобиология прочно служит человеку в самых разнообразных областях народного хозяйства. Исследования в области радиобиологии лежат в основе практического применения ионизирующих излучений в лучевой терапии злокачественных новообразований; на их базе разработаны эффективные методы лечения лучевой болезни. В сельском хозяйстве используется предпосевное облучение семян с целью повышения всхожести и урожайности многих культур. Достижения радиобиологии послужили теоретическим фундаментом для применения ионизирующих излучений в борьбе с сельскохозяйственными вредителями. Методы радиационной генетики широко используются для выведения новых сортов сельскохозяйственных растений, для получения интересных и полезных изменений у животных. На основе радиобиологических предпосылок организована лучевая стерилизация овощей, пищевых консервов, а также многих медицинских препаратов. Данные космической радиобиологии необходимы для прогнозирования и обеспечения безопасности полетов человека в космос. Многие открытия в области радиобиологии способствовали существенному развитию знаний об общих законах жизни. § 2. Доза ионизирующего излучения Биологический эффект действия радиации при прочих равных обстоятельствах прежде всего определяется дозой облучения, в связи с этим рассмотрим системные и внесистемные единицы дозы излучения, а также предельно допустимую дозу облучения населения за год. Доза ионизирующего излучения - энергия ионизирующего излучения, поглощенная в единице массы облучаемого вещества или организма. В этом смысле доза излучения называется также погло304
щенной дозой. Поглощенная энергия расходуется на нагрев вещества, на его химические и физические превращения. Величина дозы зависит от вида излучения (рентгеновское и гамма-излучение, поток а-частиц, протонов, нейтронов и т.п.), энергии его частиц, плотности их потока и состава облучаемого вещества. При прочих равных условиях доза тем больше, чем больше время облучения (О: D-Pt, где Р - мощность дозы, т.е. доза, отнесенная к единице времени. Мощность дозы измеряется в рад/с, рад/мин, рад/ч, а в системе СИ - в Гр/с, Гр/мин, Гр/ч. Поглощенная доза в системе единиц СИ измеряется в Дж/кг. Широко распространена внесистемная единица поглощенной дозы - рад: 1рад = 10~2 Дж/кг - 100 Эрг/г. Для любого вида ионизирующих излучений поглощенная доза в 1 Дж/кг- 100 рад соответствует 1 Гр (Грей). Экспозиционная доза - мера ионизации воздуха под действием рентгеновского и у-излучений. Эта доза измеряется количеством образованных зарядов. Единицей экспозиционной дозы в системе СИ является 1 Кл/кг, где Кл - кулон. Экспозиционная доза в 1 Кл/кг означает, что суммарный заряд всех ионов одного знака, образованных в 1 кг воздуха, равен 1 Кл. Широкое распространение имела внесистемная единица экспозиционной дозы - рентген: IP 2,57976- 10" Кл/кг, что соответствует образованию 2,08 • 10 пар ионов в 1 см воздуха при 0 °С и 760 мм рт.ст. На создание такого количества ионов необходимо затратить энергию, равную 88 Эрг/г; другими словами, эта энергия и есть энергетический эквивалент рентгена. По величине экспозиционной дозы можно рассчитать поглощенную дозу ренгеновского и у-излучений в любом веществе: для достижения этой цели необходимо знать состав вещества и энергию фотонов излучения. В радиобиологии различают следующие дозы, приводящие к гибели животных в ранние и поздние сроки после воздействия ионизирующего излучения (радиации): летальная доза ЛД50/30 - доза, вызывающая, гибель 50% животных за 30 дней. Выбор 30 дней для наблюдения за состоянием животных основывается на том факте, что острый период заболевания у млекопитающих обычно заканчивается к концу первого месяца после облучения. При анализе радиочувствительности биообъектов (клетки, вирусные частицы, макромолекулы и т.д.) пользуются 37%-ной (инактивирующей) дозой - Д37. При этой дозе радиации 37% от исходного количества биообъектов оказываются непораженными (сохранившими свои исходные свойства). Значения Дз7 применяют 305
для определения радиочувствительности (S) биосистем: S * 1/Д37, т.е. под радиочувствительностью биообъектов понимают меру чувствительности их к действию ионизирующего излучения. Дозы излучения, приводящие разные биообъекты к гибели, различаются в очень широких пределах. Для одних (например, лимфоцитов) достаточно нескольких десятков, тогда как для других (некоторые одноклеточные) необходимы тысячи Гр. Приведем величины доз гамма-излучения в Гр, вызывающих 50%-ную смертность некоторых объектов: овца - 1,5-2,5; человек - 2,5-3,5; собака - 2,53,0; обезьяны (разные) - 2,5-6,0; крысы разных линий - 7,0-9,0; кролик - 9,0-10,0; птицы - 8,0-20,0; змеи - 80,0-200,0; насекомые 10,0-100,0; растения - 10,0-1500,0; простейшие - 1000,0-3000,0. Крайне низкой радиочувствительностью (высокой радиорезистентностью) отличались бактерии Micrococcus radiodurens (микрококк радиоустойчивый), обнаруженные в канале американского ядерного реактора, где мощность дозы (Р) была 12 Гр/с, а поглощенная доза за сутки составляла <~ 10 Гр. В этих условиях бактерии не только не погибали, но и продолжали размножаться. Измерение дозы излучения с целью предсказания радиационного эффекта осуществляют с помощью дозиметрических приборов - дозиметров. В целях регламентации (гигиенического нормирования) радиационного воздействия на человека пользуются понятием предельно допустимой дозы за год (ПДД). Это - наибольшая величина индивидуальной эквивалентной дозы за год, которая при равномерном воздействии в течение 50 лет не вызовет в состоянии здоровья персонала (профессиональных работников) неблагоприятных изменений, обнаруживаемых современными радиобиологическими методами. Предельную эквивалентную дозу за год для ограниченной части населения называют пределом дозы за год (ПД). Необходимо уточнить, что ПДД устанавливается "Нормами радиационной безопасности" (НРБ) для категории А облучаемых лиц, а ПД - для категории Б. К категории А относят персонал (профессиональные работники) , непосредственно работающий с источниками ионизирующих излучений, и лиц, которые по роду своей производственной деятельности могут подвергнуться облучению. Категория Б - ограниченная часть населения, проживающая на территории наблюдаемой зоны, где дозы облучения могут превысить пределы, допустимые для населения. Категория В - население области, края, республики, страны в целом. НРБ устанавливаются также три группы критических органов. 306
Под последними понимают жизненно важные органы или системы, первыми выходящие из строя в исследуемом диапазоне доз излучения, что обусловливает гибель организма в определенные сроки после облучения. К I группе критических органов относят все тело, гонады и красный костный мозг; ко II группе - мышцы, щитовидную железу, жировую ткань, печень, почки, селезенку, желудочно-кишечный тракт, легкие, хрусталики глаз и другие органы, исключая относящиеся к I и III группам; к III группе - кожный покров, костную ткань, кисти, предплечья, лодыжки и стопы. Наиболее радиочувствительными являются критические органы I группы. ПДД для I, II и III групп критических органов составляют соответственно 5, 15 и 30 бэр/год, а ПД - 0,5; 1,5; 3,0. Видно, что основные дозовые пределы для лиц категории Б в десять раз меньше, чем для персонала категории А. Это вытекает из необходимости предотвращения необоснованного облучения гетерогенного контингента, включая детей, беременных и лиц пожилого возраста. § 3. Относительная биологическая эффективность ионизирующих излучений (ОБЭ) ОБЭ - показатель (коэффициент), с помощью которого определяют, во сколько раз биологическое действие ионизирующих излучений данного типа (например, а-, /9-частицы, нейтроны, протоны и т.д.) больше (или меньше) действия на тот же биологический объект стандартного излучения. Величину этого коэффициента находят сравнением дозы излучения, вызывающей определенный биологический эффект, с дозой стандартного излучения, обусловливающей тот же эффект. Обычно в качестве стандартного излучения используют рентгеновское излучение с энергией 180-250 кэВ. Для определения значения ОБЭ используют формулу: ОБЭ-DR/DX,
где DR - доза рентгеновского излучения; D x - доза изучаемого излучения; биологический эффект сравнивают по общему критерию. ОБЭ возрастает с увеличением линейной передачи энергии (ЛПЭ), под которой понимают энергию, переданную заряженной частицей на единице длины ее пробега в веществе. Понятие ЛПЭ было введено в 1954 г. Р.Цирклем. За единицу ЛПЭ принимают 1 кэВ/мкм ткани (1 кэВ/мкм - 62 Дж/м). В зависимости от значения ЛПЭ все ионизирующие излучения подразделяются на редко- и плотноионизирующие. а-излучение Со и рентгеновское излучение с длиной волны 307
приблизительно 20 нм (250 кэВ) имеют соответственно ЛПЭ около 0,3 и 2 кэВ/мкм, нейтроны с энергией 14 МэВ - 12, а тяжелые заряженные ядерные частицы - от 100 до 2000 кэВ/мкм. Однако такое деление достаточно условно, так как ЛПЭ не только связана с физической природой излучения, но и зависит от скорости полета частицы. При очень большой скорости движения быстрые протоны и электроны характеризуются одинаковым уровнем ЛПЭ, так как обладают равным по величине зарядом. К редкоионизирующим излучениям относят все виды излучений (независимо от их физической природы), имеющие величины ЛПЭ меньше 10 кэВ/мкм, а к плотноионизирующим - те излучения, для которых ЛПЭ превышает это значение. Рассмотрим общую картину связи ОБЭ с ЛПЭ. На рис. 8.1 представлены кривые выживания культуры клеток человека после их облучения тремя разными видами ионизирующей радиации, резко различающимися по величинам ЛПЭ: рентгеновским излучением 250 кэВ, нейтронами 15 МэВ и а-частицами. Их ЛПЭ возрастает от 1,3 кэВ/мкм у рентгеновского излучения до 100 кэВ/мкм у а-частиц. Видно, что с ростом значения ЛПЭ увеличивается наклон кривых и уменьшается экстраполяционное число (сокращается "плечо" на начальном отрезке кривых), достигая единицы при а-облучении (см. Принцип попадания и принцип мишени). Следовательно, по мере роста ЛПЭ повышается поражаемость
!\ПЭ
4 6 8 Доза излучения Гр
308
10
Рис. 8.1. Кривые выживаемости культуры клеток чело*"века, подвергнутых действию ионизирующей радиации: 1 рентгеновские лучи; 2 - нейтроны; 3 - а-частицы
клеток и снижается их способность к восстановлению. Кривая, выражающая зависимость между величинами ОБЭ и ЛПЭ, имеет максимум (рис. 8.2). Заметный рост ОБЗ наблюдается со значения ЛПЭ, равного 10 кэВ/мкм, достигает максимальной величины при ЛПЭ 100 кэВ/мкм, а с последующим увеличением ЛПЭ круто падает. Это явление объясняется тем, что гибель клетки происходит после поглощения достаточного количества энергии в некотором критическом объеме: с ростом ЛПЭ такая вероятность возрастает. Однако после некоторых величин ЛПЭ наступает насыщение, и каждая последующая частица теряет энергию уже в убитой клетке. Другими словами, биологическая эффективность ионизирующих излучений с такой достаточно высокой ЛПЭ снижается, иак как энергия расходуется вхолостую. Значение ОБЭ зависит не только от вида излучения и его ЛПЭ,
ММ
mil. 10
1СС
ЛПЭ, кэВ/мкм ткани
1
10 ЛПЭ, кэв/ н«ы
10 *
10'
Рис. 8.2. Зависимость ОБЭ от ЛПЭ и величины дозы излучения: А - выживаемость культуры клеток человека (по Дж.Барсндсену, 1968); Б - выживаемость клеток хлореллы (по Л.К.Векшиной, 1975)
но и от исследуемого эффекта, а также от множества других факторов, главные из которых - величина и мощность дозы, до- и пострадиационные условия, режим фракционирования, наличие, дефицит или отсутствие кислорода. Весьма важна и практически значима зависимость ОБЭ от дозы облучения и ее распределения во времени (см. рис. 8.2). Кривые 1, 2 и 3 отражают соответственно 80, 10 и 1 % выживаемости клеток человека. Из анализа этих кривых вытекает, что абсолютная величина ОБЭ не является постоянной, а зависит от степени поражения, снижаясь с ее увеличением. Так, при 80-90%309
ных уровнях выживаемости клеток почки человека ОБЭ составляет около 8, а при 1-10%-ной выживаемости - около 3. Один и тот же биологический эффект может быть достигнут при фракционированном облучении нейтронами в относительно меньших суммарных дозах (по сравнению с суммарной дозой рентгеновского излучения), чем при однократном облучении. Это явление используют при терапии опухолей нейтронами и другими тяжелыми ядерными частицами, характеризующимися большими величинами ЛПЭ. Использование плотноионизирующих излучений (например, нейтронов) в лучевой терапии базируется на повышении их ОБЭ в условиях дефицита кислорода, выявляемого в опухолях, а тем более в условиях аноксии, из-за устранения защитного действия гипоксического фактора с возрастанием ЛПЭ. Этот феномен продемонстрировали в своих цитогенетических экспериментах А.Конжер и Г.Ивенс; они показали на разных объектах, что ОБЭ быстрых нейтронов, оцененная по аберрациям хромосом в клетках асцитной карциномы Эрлиха и по образованию микроядер в клетках конских бобов, составляет в аэробных условиях соответственно 2,5 и 10,5, а в анаэробных - 6 и 18. Каковы же границы применения концепции ОБЭ? Суммируя вышеизложенный материал, можно констатировать, что ОБЭ зависит от многих факторов и ее абсолютная величина для того или иного вида излучения может быть различной в разных условиях облучения, а также от характера оцениваемого эффекта. Значение ОБЭ очень сильно зависит от ЛПЭ. Поскольку последняя тесно связана с проникающей способностью ионизирующих излучений, точная оценка ОБЭ может быть сделана лишь с учетом особенностей распределения дозы в облучаемом биообъекте. При невыполнении этого обязательного требования неизбежна неправильная интерпретация полученных результатов исследования. Корректная оценка ОБЭ и ее зависимость от ЛПЭ могут быть получены лишь в случае, когда в качестве системы изучения используют изолированные клетки или другие мелкие объекты, в которых энергия излучения распределяется равномерно по всему объему. Вычисление коэффициентов ОБЭ в экспериментах, проведенных на более крупных животных, в большинстве случаев вообще теряет смысл, так как при этом не может быть обеспечена адекватность условий опытов и прежде всего равномерность распределения поглощенных доз в тканях для разных видов излучений. В рассматриваемых случаях отношение доз, индуцирующих одинаковый био-
310
логический эффект, предлагается именовать не ОБЭ, а отношением равных эффектов (независимо от механизма их возникновения). § 4. Лучевая болезнь В результате действия ионизирующих излучений на живые клетки (биологические объекты) возникают повреждения важных биологических молекул и разнообразных структур клеток, что влечет за собой развитие лучевой болезни (лучевого поражения). Лучевая болезнь - заболевание, возникающее при воздействии различных видов ионизирующих излучений на организм (человек, животные, растения). Многообразие проявлений поражающего действия радиации на живой организм зависит прежде всего от следующих факторов: вид облучения - общее или местное, внешнее или от инкорпорированных радиоактивных веществ; временной фактор однократное, повторное, пролонгированное, хроническое облучение; пространственный фактор - равномерное или неравномерное облучение, облучаемый объем и локализация облученного участка. Человек, животные, микроорганизмы и растения постоянно подвергаются извне действию гамма-излучений земной коры, космических лучей и изнутри облучаются находящимися в организме человека в ничтожных количествах радиоактивными веществами ( К , ж а , 2 2 2 Rn, I 4 C и др.). Лучевая болезнь развивается лишь тогда, когда суммарная доза облучения превышает естественный радиоактивный фон. Чем больше поглощенная доза излучения, тем сильнее проявляется поражающее действие радиации. Различают острую лучевую болезнь, возникающую от однократного общего облучения в сравнительно больших дозах, и хроническую лучевую болезнь, которая может быть результатом перенесенной острой лучевой болезни или хронического воздействия малыми дозами. Характерной чертой острой лучевой болезни человека является волнообразность ее клинического течения. А.К.Гуськова и Г.Д.Байсоголов (1970) предложили выделять три периода в течении острой лучевой болезни: период формирования, период восстановления и период исходов и последствий. Рассмотрим более подробно первый период острой лучевой болезни - период формирования. Этот период течения острой лучевой болезни в свою очередь можно разделить на четыре фазы: 1) фаза первичной острой реакции; 2) фаза кажущегося клинического благополучия (скрытая или латентная фаза); 3) фаза выраженных
311
клинических проявлений (фаза разгара болезни); 4) фаза раннего восстановления. Острую лучевую болезнь различают и по степени тяжести радиационного поражения, определяемой величиной поглощенной дозы излучения. Лучевая болезнь человека возникает при облучении в дозах 1-10 Гр и более (имеется в виду воздействие у-излучения). После облучения человека в меньших дозах наблюдают реакции различной степени выраженности со стороны отдельных его систем. В интервале доз 1-10 Гр выделяют три степени тяжести острой лучевой болезни: острая лучевая болезнь I (легкой) степени (1-2 Гр); острая лучевая болезнь II (средней) степени (2-4 Гр); острая лучевая болезнь III (тяжелой) степени (4-6 Гр); острая лучевая болезнь IV (крайне тяжелой) степени (выше 6 Гр). Вероятность развития острой лучевой болезни той или иной степени тяжести при данной поглощенной дозе излучения определяется индивидуальной радиочувствительностью организма. Так, например, при дозах 6-10 Гр выявляется переходная форма лучевой болезни, которая протекает как III степень, но с поражением кишечника. Специальное лечение человека может обеспечить его выживание. При дозах 10-20 Гр развивается типичная форма кишечного поражения, заканчивающаяся смертельным исходом через 816 суток. При дозах 20-80 Гр отмечается токсемическое поражение (сосудистая форма поражения). Смерть наступает на 4-7-е сутки при мозговой и менингиальной симптоматике. При дозах облучения выше 80 Гр развивается церебральная форма поражения с колапсом и судорогами, завершающаяся смертью на 1-3-и сутки после воздействия радиации. Критической системой, степень поражения которой определяет тяжесть и исход острой лучевой болезни при дозах 1-10 Гр, является система кроветворения и в первую очередь костный мозг. Хроническая лучевая болезнь - нозологическая форма лучевого поражения, развивающаяся при продолжительном облучении организма в малых дозах. Эта форма, как и острая лучевая болезнь, характеризуется фазностью течения, особенностями проявления, связанными с неравномерностью облучения, и также имеет отдаленные последствия. Большая заслуга в выделении, классификации и принципах диагностики хронической лучевой болезни принадлежит А.К.Гуськовой. Хроническая лучевая болезнь развивается по достижении некоторой критической дозы облучения. Она представляет собой сложный четко очерченный клинический синдром с вовлечением большинства органов и систем организма. Хроническая 312
лучевая болезнь у животных сопровождается постепенным ослаблением сердечной деятельности, нарушением функций желез внутренней секреции, истощением, ослаблением сопротивляемости инфекционным болезням. Выраженный синдром хронической лучевой болезни развивается при суммарных дозах 0,7-1 Гр (70-100 рад) и интенсивности излучения 0,001-0,005 Гр/сут. После прекращения облучения человека и животных наступает период восстановления, который характеризуется преобладанием репаративных процессов в наиболее радиопоражаемых тканях (кроветворная система, эпителий слизистой тонкого кишечника), а также нормализацией функциональных нарушений в других системах. У растений лучевая болезнь возникает под влиянием различных видов ионизирующих излучений. Наибольшую опасность представляют а-частицы и нейтроны, нарушающие нуклеиновый, углеводный и жировой обмен в растениях. Очень чувствительны к действию радиации корни и молодые ткани. Общий симптом лучевой болезни растений - задержка их роста. Выявлены видовые, сортовые и индивидуальные внутрисортовые различия в радиочувствительности растений. При лучевой болезни повышается восприимчивость растений к инфекционным болезням. & 5. Модификация радиочувствительности Проявление радиобиологического эффекта может изменяться под влиянием факторов физической и химической природы, называемых модификаторами лучевого поражения. Конечная цель исследований по вопросам модификации радиочувствительности - это нахождение путей активного и избирательного воздействия на радиочувствительность, т.е. ослабления ее или усиления в зависимости от необходимости. Наиболее активно проблема модификаци радиочувствительности, точнее - овладения способами управления радиочувствительностью, начала развиваться после 1945г. и в последующий период интенсивного испытания атомного оружия, когда возникла реальная угроза возникновения массовых лучевых поражений человека. Во всех развитых странах мира внимание ученых в данный период было привлечено к поиску средств противолучевой защиты. Радиочувствительность биообъектов (биосистем) можно модифицировать разными путями: изменением выходов первичных радиационно-химических реакций, дезактивацией свободных радикалов и других активных продуктов радиолиза, активацией или ингибированием рапарационных, восстановительных процессов и т.п. 313
Процесс модификации радиобиологичсскх эффектов осуществляется на разных уровнях организации клетки, охватывая разные этапы формирования лучевого поражения. Кислородный эффект в радиобиологических явлениях Сильное влияние на исход лучевого поражения организмов и величины радиационно-химического выхода превращений многих типов биосоединений оказывает свободный кислород в биосистеме. Речь идет о так называемом кислородном эффекте - универсальном явлении радиобиологии. Кислородный эффект - это явление усиления лучевого поражения организмов в присутствии кислорода (при повышении его концентрации) по сравнению с поражением при облучении в условиях гипоксии или аноксии. Под кислородным эффектом в радиобиологии понимают также защитное действие пониженного содержания кислорода (гипоксии) при облучении живых организмов ионизирующей радиацией. Кислородный эффект впервые был описан еще в 1909 г. Г.Шварцем. Используя предельно переносимое снижение концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе (для мышей - 7%, для крыс - 5%), А.Дауди и сотр. (1950) отметили высокий процент защиты этих животных, облученных рентгеновскими лучами в абсолютно смертельной дозе. Кислородный эффект обнаружен по различным показателям лучевого поражения как в модельных системах, так и в экспериментах на всех уровнях биологической организации (субклеточном, клеточном, тканевом, органном и организменном). При снижении содержания кислорода в биообъекте значительно ослабляются все радиобиологические реакции (биохимические нарушения, мутации, угнетение роста и развития) и повышается выживаемость облученных организмов. В настоящее время еще полностью не ясно, какие свойства кислорода ответственны за его радиомодифицирующес действие. Механизм защитного действия гипоксии объясняется тем, что при облучении в присутствии молекулы кислорода, являющейся бирадикалом, образуются пероксидные радикалы, которые усиливают действие ионизирующих излучений на жизненно важные макромолекулы и структуры клеток и (или) ослабляют эффективность внутриклеточных защитных веществ. Количественным выражением изменения эффекта облучения под влиянием кислорода служит ФИД (фактор изменения дозы), который в данном случае называют коэффициентом кислородного усиления (ККУ). Величина кислородного эффекта зависит главным 314
образом от вида ионизирующего излучения и условий облучения. Наибольший кислородный эффект наблюдается при действии рентгеновских и у-лучей. С ростом плотности ионизации кислородный эффект уменьшается, а при действии наиболее плотно ионизирующих излучений, например а-частиц, исчезает. Практически сенсибилизирующее действие кислорода при облучении животных клеток может проявиться только в том случае, когда он присутствует непосредственно в момент облучения. Так, при подведении кислорода к клеткам китайского хомячка всего через 0,3 мс после облучения значение ККУ падало с 2,6 (в случае присутствия кислорода в момент облучения) до 1,5. Если же кислород подводили спустя 5 мс после облучения, то величина ККУ уменьшалась до 1,1. Для получения.же максимальной сенсибилизации в этих опытах кислород надо было подавать в камеру за 1-2 мс до начала облучения. Классическая зависимость кислородного эффекта от концентрации кислорода впервые была экспериментально установлена Л.Г.Греем и сотр. в 50-х гг. На оси ординат рис. 8.3 отложена величина ККУ в виде относительной радиочувствительности, за единицу которой принято ее значение в аноксии. Выявлено, что при давлении кислорода, равном 159 мм рт.ст. (20,92% Ог), радиочувствительность клеток максимальна, она близка к 3 и не возрастает при повышении концентрации кислорода до 100% .
3,0
2.5
2,0 Рис. 8.3. Зависимость радиочувствительности клеток от парциального давления кислорода при 5Т°С
1.» 1,0 I
I
10
20
30
40
50
60
70 155
760
Напряжение кислорода, мм. рт ст.
315
Кислородный эффект находит применение в лучевой терапии: повышение содержания кислорода в опухоли и создание гипоксических условий в окружающих тканях позволяют усиливать лучевое поражение опухолевых клетках с одновременным уменьшением повреждения здоровых тканей. Таким образом, кислород - универсальный радиомодифицирующий агент. Радиопротекторы и радиосенсибилизаторы Область применения ионизирующих излучений в различных направлениях науки и техники быстрыми темпами расширяется, что выдвигает в качестве фундаментальной задачи современной радиобиологии поиск путей повышения радиоустойчивости организма. Одна из реальных возможностей решения этой задачи состоит в использовании средств фармако-химической защиты - протекторов, существенно снижающих поражающее действие ионизирующей радиации. Проблема химической противолучевой защиты интенсивно разрабатывается в лабораториях всего мира, большие успехи в этой области достигнуты и в нашей стране (Ю.Б.Кудряшов, Е.Ф.Романцев, П.Г.Жеребченко, Е.Н.Гончаренко, А.С.Мозжухин, С.П.Ярмоненко и др.). Не менее активно разрабатывается и проблема, связанная с поиском средств, усиливающих лучевое поражение организмов (А.М.Кузин, Л.Х.Эйдус и др.). Радиопротекторы и радиосенсибилизаторы - вещества, введение которых животному, а также добавление в культуральную среду или к биологическому объекту перед действием ионизирующего излучения вызывает соответственно значительное снижение или усиление радиационного эффекта. Введение радиопротектора после облучения организма неэффективно. Добавление радиозащитных препаратов к биообъекту после его облучения может не дать должного эффекта. Показано, что введение цистеина после облучения крыс (не позже чем через 5 мин) оказывается неэффективным. Защита организма животных и биологических систем от поражающего действия радиации с помощью химических веществ является одним из наиболее значимых итогов развития радиационной биофизики. Радиопротекторы очень широко используются в целях повышения радиорезистентности организма и различных биологических объектов. В век использования атомной энергии потребность в химических протекторах никогда не отпадет, несмотря на огромные возможности физической защиты.
316
Эффект профилактической химической защиты организмов от лучевого поражения был открыт в 1949 г. 3.Баком. К настоящему времени из многих тысяч изученных соединений отобраны наиболее эффективные, способные предотвратить гибель животных, облученных в смертельных дозах. Некоторые радиопротекторы уже стали фармокопейными препаратами: их используют при лучевой терапии злокачественных новообразований. Зная механизм первичных физико-химических и биохимических процессов, развивающихся в организме после воздействия ионизирующей радиации, можно нормализовать их при помощи определенных радиопротекторов. С другой стороны, уменьшая эффект радиационного поражения путем введения ряда соединений, можно понять сущность процессов, происходящих в ткани в результате облучения. Защитные вещества весьма разнообразны по своему химическому строению и биологическому действию. Цианистый натрий был одним из первых веществ, введение которого мышам в дозе 5 мг/кг непосредственно перед облучением в летальных дозах повышало их выживаемость по сравнению с контрольными животными (З.Бак и сотр., 1949). Были изучены радиозащитные свойства и цистеина, который в дозе 1000 мг/кг значительно повышал выживаемость мышей (Г.Патт и сотр., 1949). Серосодержащие вещества - наиболее многочисленная и хорошо изученная группа защитных соединений. Радиозащитным действием обладают азиды, аминокислоты, спирты, сахара, фенолы, органические кислоты и т.д. Однако экспериментальное изучение многих тысяч химических соединений выявило, что наиболее перспективные и высокоэффективные из них относятся к двум классам веществ: индолилалкиламинам и меркаптоалкиламинам. Радиопротекторы, относящиеся к индолилалкиламинам, являются производными триптамина. Последний при внутрибрюшинном введении мышам в дозах 79-95 мг/кг за 5-20 мин перед облучением на 25-30% повышал их выживаемость по сравнению с контрольными животными. Одним из эффективных химических протекторов считается 5-окситриптамин (серотонин): С Н г — CH2NH2
317
Сейчас изучено более двухсот соединений, относящихся к классу индолилалкиламинов, причем у некоторых из них выявлена противолучевая активность, сравнимая с защитным эффектом серотонина. Цистеинамин, или 2-меркаптоэтиламин (МЭА) обладает способностью защищать животных от действия ионизирующей радиации в летальной дозе. Обнаружение радиозащитной активности МЭА послужило толчком к интенсивному синтезу и других тиолсодержащих соединений, в результате чего были выявлены другие не менее эффективные радиопротекторы: меркаптопропиламин и его дисульфид, аминоэтилизотиуроний, меркаптоэтилгуанидин, меркаптопропилгуанидин, аминоэтилтиофосфаты и многие другие вещества класса меркаптоал кил аминов. Различные гипотезы о механизмах противолучевой защиты так или иначе связывают их с самыми начальными процессами, индуцируемыми в клетке при поглощении энергии ионизирующего излучения. Показана значительная радиосенсибилизирующая эффективность (в отношении большого числа первичных опухолей мышей и крыс) метронидазола, мизонидазола и других электроноакцепторных соединений. При этом для достижения одного и того же эффекта требуются дозы ионизирующего излучения почти в 2 раза меньшие, чем при облучении без радиосенсибилизатора. В качестве радиосенсибилизаторов применяют такие соединения, как синкавит, иодацетамид, метилгидразин, иоддезоксиуридин и др. К эффективным радиосенсибилизаторам относится и кислород. Общие трудности использования радиопротекторов и радиосенсибилизаторов в радиоонкологической клинике состоят в значительной токсичности большинства препаратов, а также в необходимости избирательности их действия на нормальные или опухолевые ткани. Поэтому актуальной задачей клинической радиобиологии является поиск условий, при которых поражение здоровых тканей будет минимальным, а опухоли - максимальным, а также выбор средств и способов увеличения этой разницы. § 6. Теоретические представления о механизме биологического действия ионизирующих излучений В последние два десятилетия четко выделились два направления в развитии теоретических представлений о биологическом действии радиации. Исследователи одного из них стремятся установить общие, в основном феноменологические, но обязательно количествен318
ные закономерности, характеризующие начальные звенья лучевого поражения клетки ("принципы попадания и мишени", "стохастическая теория", "вероятностная модель радиационного поражения клетки"). Другое направление объединяет ученых, которые ставят перед собой задачу объяснить все многообразие конкретных лучевых реакций биологических объектов; отсюда преимущественно качественный, описательный характер гипотез данного направления ("гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций", "структурно-метаболическая теория"). Принцип попадания и теория мишени Теория мишени - одна из количественных наиболее обоснованных теорий биологического действия ионизирующих излучений, летальный эффект которых имеет вероятностный характер вследствие случайного распределения элементарных актов первичного взаимодействия частиц с высокочувствительными объемами (мишенями) облученных объектов. Каждый акт одиночного переноса энергии в теории мишени рассматривается как событие попадания, приводящее к поражению определенной биологической структуры. Акты попадания статистически распределяются по всей облучаемой системе. При рассмотрении радиобиологических эффектов на молекулярном и (или) клеточном уровне термин "мишень" удобно использовать для формального обозначения того микрообъема, в котором должны произойти одна или несколько ионизации, приводящих к наблюдаемой (изучаемой) реакции. В зависимости от числа попаданий, необходимых для поражения, различают одно-, дву- и многоударные объекты или реакции. Принцип попадания и принцип мишени (чувствительной области) и основанная на них теория мишени получили развитие в трудах Д.Кроузера, Н.В.Тимофеева-Рсссовского, К.Циммера, Д.Ли, исходящих в своих теоретических представлениях о механизме биологического действия ионизирующих излучений из статистики (уравнения) Пуассона. Представим, что облучаемая биосистема состоит из No объектов, каждый из которых имеет мишень сечением S. Пусть для инактивации объекта достаточно, чтобы трек плотноионизирующей частицы прошел через сечение мишени S, т.е. произошло попадание. Если траектории частиц распределяются по поперечному сечению объекта случайным образом и не зависят друг от друга, то вероятность (Рп) одного, двух, ..., п попаданий в мишень, находящуюся в пределах объекта, описывается уравнением: 319
P ( n ) - a n • e~a / n ! , (8.1) где a - среднее число попаданий в мишень; п! - n-факториал. Обозначим через D среднее число частиц, пролетающих через единичную площадку сечением S, тогда a - SD. (8.2) При какой угодно малой дозе облучения D существует вероятность прохождения частицы через одну из мишеней. С ростом дозы облучения увеличится число мишеней, претерпевающих попадание. Ясно, что при возрастании размера мишени повысится и вероятность попадания. Если принять за No общее число объектов в облучаемой системе, а за N - число объектдв, сохранивших после облучения исходные свойства (т.е. "выживших"), то величина N/No соответствует вероятности непопадания (п=0). Из уравнения (8.1) для случая п=0 получим N/No - (SD)° • e~SD/0! = e" SD ,
(8.3)
так какО!=1. При некоторой дозе облучения выполняется условие SD-1; это соответствует случаю, когда в среднем число попаданий равно числу мишеней. В действительности же часть попаданий испытали уже однажды пораженные мишени, а некоторые не претерпели ни одного попадания. Согласно статистике Пуассона при SD=1 реально поражается только 63% мишеней, 37% их оказываются непораженными. Подтверждение этому можно получить, если подставить в уравнение (б.3)значение SD=1, тогда N / N o - е ^ - е " 1 =0,37. Отношение N/No, определяемое экспериментально, представляет собой долю "выживших" объектов по отношению к их общему числу до облучения. Найдя дозу облучения, при которой выживает 37% объектов (D37). можно рассчитать сечение мишени: SD37-I или5=1/Оз7. На рис. 8.4, А-В представлена схема, иллюстрирующая зависимость числа пораженных мишеней от дозы облучения. Видно, что даже при малой дозе облучения некоторое число частиц проходит через мишени и вызывает их инактивацию; увеличение дозы облучения приводит к резкому (почти по линейной зависимости) возрастанию числа.пораженных объектов, а затем вес более вероятно повторное прохождение частиц через однажды пораженные мишени. При дозе D37 общее число частиц соответствует числу мишеней (SD=1), однако 37% объектов остаются непораженными, так как 320
некоторые из 63% мишеней испытали по два и более попаданий (рис. 8.4, Б). Примечательно, что при очень большой дозе облучения все же какоето число объектов оказалось не пораженным облучением (рис. 8.4, В). Графически зависимость доли "выживших" объектов от величины дозы облучения выражается экспонентой (рис. 8.4, Г): 3 7 % непораженных мишеней
Величина D37, как отмечалось выше, служит мерой радиочувствительности клеток и определяется по кривой выживания (см. рис. 8.4, Г) как доза, при которой выживает 37% Непораженная мишень клеток от исходного количества. N/N. Аналогичные рассуждения можно использовать для рассмотрения вопроса об "одноударных процессах", возника0,37 ющих при действии рентгеновского или гамма-излучений, вызывающих редкорасполоДоза облучения женные акты ионизации по Рис. 8.4. Зависимость между числом всему объему облучаемого объпораженных мишеней и поглощенной дозой: 1 - объект с мишенью сечением S; екта. 2 - треки частиц (пояснения в тексте) Теоретические положения теории мишени, основанные на предположении об "одноударности" процесса попадания, предсказывают экспоненциальную зависимость "доза - эффект" (см. рис. 8.4, Г). В реальных условиях эксперимента экспоненциальную зависимость наблюдали при облучении макромолекул, вирусов, бактериальных спор, некоторых одноклеточных организмов. В природе чаще встречается другой тип 321
2 3 4 5 6 7 8 9 Доза, усл. ад.
Рис. 8.5. Теоретические кривые выживаемости для объектов, инактивируемых в результате нескольких попаданий (по Дессауэру, 1954): А - в полулогарифмическом масштабе; Б - в обычном масштабе. Цифры на кривых означают "ударность" процесса инактивации объекта 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Доза, усл. ед.
кривых "доза - эффект", характерных для большинства клеток растительного и животного происхождения. В линейных координатах они имеют S-образную форму (рис. 8.5, Б). В этих случаях говорят о многоударном процессе, подразумевая, что для инактивации биообъекта необходимо не одно, а два и более попаданий в единственную мишень или поражение двух мишеней и более, каждая из которых должна быть поражена. При изображении кривых "доза - эффект" в полулогарифмическом масштабе (рис. 8.5, А) они приобретают "плечо" (начальный, более горизонтальный участок кривой), переходящее в прямолинейный участок, наклон которого совпадает с наклоном соответствующей одноударной кривой. Чем больше "ударность" мишени, тем заметнее эти "плечо". Если экстраполировать прямолинейный участок кривой к нулевой дозе, то на оси ординат отсекаются отрезки, соответствующие "ударности" мишеней (их числу). На основании принципа попадания и концепции мишени можно 322
анализировать кривые "доза - эффект", полученные в эксперименте. В зависимости от вида биообъекта и характера излучения получают различные дозные кривые - от простых экспоненциальных до сигмоидалъных с различной величиной "плеча". Для интерпретации последних используют сложные математические построения, основанные на различных гипотетических моделях. Применение принципа попадания и теории мишени позволило впервые определить размеры некоторых макромолекул (например, РНК-азы), вирусов, генов, получить сведения о внутренней структуре бактериальных спор. Достоинством указанных теоретических представлений о механизме летального действия ионизирующих излучений является простота объяснения основных экспериментальных данных, в первую очередь это относится к количественному описанию кривых выживания. Принцип попадания и теория мишени позволяют получить важные сведения о характере первичных физических процессов, происходящих в биообъекте под влиянием радиации и оценить параметры (сечение, объем, молекулярную массу) структур, ответственных за наблюдаемый биологический эффект. К главным недостаткам теории мишени относится то, что она носит формальный характер, а формальный анализ экспериментальных кривых "доза - эффект" не может раскрыть последовательность физико-химических процессов, приводящих к поражению мишени в результате попадания. Теория мишени не может удовлетворительно объяснить явление модификации радиочувствительности биосистем под действием различных физико-химических агентов, в том числе радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Она не позволяет учесть влияние фактора времени, концентрации кислорода, рапарационных процессов, роль ЛПЭ и т.д. при действии ионизирующего излучения на биообъекты. Теория мишени рассматривает эффекты, индуцированные радиацией, как строго детерминированные первичными актами поглощения энергии; ее основное свойство - строго количественный подход к вопросу о механизме биологического действия ионизирующих излучений. Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций Гипотеза липидных радиотоксинов - одна из широко распространенных гипотез биологического действия ионизирующих излучений, объясняющая преимущественно одно важное звено (так называемый "лучевой токсический эффект") в сложном патогенетическом комплексе лучевых реакций организма. Гипотеза липидных радиотоксинов, успешно развиваемая Ю.Б.Кудряшовым, базирует323
ся на выдвинутой Б.Н.Тарусовым и Н.М.Эмануэлем концепции о решающей роли в начальных процессах лучевого поражения цепных окислительных реакций свободнорадикального типа, наиболее подходящим субстратом для которых являются липиды. Большим стимулом формирования данной гипотезы послужил (обнаруженный в начале 50-х гг. А.С.Мочалиной и Ю.Б.Кудряшовым) тот факт, что водно-солевые вытяжки из облученной печени при инъекции интактным животным вызывают гемолиз эритроцитов крови. Было высказано предположение, что под влиянием радиации в печени животных образуется так называемый "гемолитический фактор". Идентификация указанного цитотоксического агента выявила его липидную природу: агент получил название липидного радиотоксина (ЛРТ). Последние обнаруживаются уже в первые часы после облучения не только в печени, но и в крови, тонком кишечнике, семенниках, почках, желудке и других органах животных; этот эффект был продемонстрирован на растениях и микроорганизмах. Установлено, что ЛРТ представляет собой лабильный комплекс продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот, гидропероксидов, эпоксидов, альдегидов и кетонов, способных вызывать не только гемолиз, но и другие реакции, характерные для лучевого поражения. Так, при действии ЛРТ отмечаются торможение клеточного деления, нарушение кроветворения, повреждение хромосомного аппарата некоторых объектов. Изучение содержания различных токсических продуктов в печени облученных в дозе 7 Гр крыс (рис. 8.6) позволило выявить, что в разные сроки после воздействия радиации наблюдается чаще увеличение, но иногда и уменьшение количества холина, хинонов, гистамина и ЛРТ. Введение ЛРТ интактным животным, по данным Ю.Б.Кудряшова, вызывало у них фазные изменения других "радиотоксинов", в том числе хинонов. Однако инъекция хинонов или других "радиотоксинов" не приводила к образованию ЛРТ. На этом основании ЛРТ были отнесены к первичным радиотоксинам (в настоящее время первичными радиотоксинами считают и хиноны). Липиды - составные компоненты клеточных мембран, поэтому их поражение вызывает нарушение регуляции химических процессов в живой клетке вплоть до уровня, приводящего ее к гибели. Согласно гипотезе липидных радиотоксинов ионизирующее излучение вызывает разрушение или ингибирование природных антиокислительных (антиоксидантных) систем организма, что и способствует возникновению цепных окислительных реакций свободнорадикального типа. В рамках этой гипотезы именно первичное 324
Рис. 8.6. Содержание различных веществ, которым приписывают роль "радиотоксинов" в печени крыс, в разные сроки после общего облучения в дозе 7Гр: 1 - холин; 2 - хиноны; 3- гистамин; 4 - ЛРТ
вч
2
4 8 8 Время после облучения, сут
10
поражение определенных фракций липидов индуцирует развитие всех последующих событий в клетках, включая и поражение генетического аппарата. Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций, как и теория мишени, не может быть признана универсальной теорией летального действия ионизирующих излучений на клетку (С.П.Ярмоненко, 1988). Во-первых, аналогия в действии ЛРТ и ионизирующих излучений ограничена лишь определенным кругом явлений, но установлены и принципиальные различия, например, отличаются по своей природе структурные повреждения хромосомного аппарата, не выявлено мутагенное действие ЛРТ. Во-вторых, кинетика накопления ЛРТ количественно не связана с ЛПЭ, а последняя в основном определяет относительную биологическую эффективность ионизирующих излучений. В-третьих, отсутствуют четкие количественные временные характеристики зависимости эффекта поражения биосистем от скорости образования ЛРТ при различных дозах облучения. Структурно-метаболическая теория Структурно-метаболическая теория - преимущественно качест325
венная теория биологического действия ионизирующих излучений в радиационной биофизике, активно разрабатываемая с 1965 г. А.М.Кузиным. В ее основе лежит идея о том, что под влиянием радиации в клетке возникают не только чисто радиационно-химические повреждения, но благодаря биохимическим механизмам усиления в организме синтезируются и высокореакционные продукты; их образование приводит к дополнительному повреждению биологически важных макромолекул и возникновению низкомолекулярных токсических метаболитов. В структурно-метаболической теории решающее значение отводится не только радиационному поражению молекул ДНК и РНК, но и нарушениям цитоплазматических структур и их нормального функционирования. Повреждение строго скоординированной биосистемы (или клетки) в одном или нескольких звеньях вызывает нарушения мембран и сопряжения важных метаболических процессов: инактивацию ферментов, расстройство управляющих систем и другие тяжелые последствия. В рамках структурно-метаболической теории особая роль из токсических метаболитов в лучевом поражении организма придается, как и в гипотезе липидных радиотоксинов, первичным радиотоксинам (ПРТ). Под последними понимаются вещества, которые образуются в клетках облученных организмов тотчас или в ближайшие часы после облучения и обладающие свойством вызывать основные радиобиологические эффекты при действии на клетки или организмы (А.М.Кузин, 1970, 1986). ПРТ - комплекс веществ, обладающих близкими свойствами, но относящихся к различным классам химических соединений (например, к хинонам). Одни из этих веществ всегда присутствуют и в нормальной клетке, однако в меньшем количестве, чем после воздействия радиации. Возрастание концентрации хинонов в клетках после облучения носит экспоненциальный характер (рис. 8.7). А.М.Кузин и сотрудники показали, что введение экстрактов из облученных растительных объектов (картофеля), содержащих хиноны (ортохиноны), приводит к уменьшению массы животных, угнетению клеточного деления и возникновению хромосомных аберраций в клетках корешков растений, подавлению роста клеточных структур, увеличению числа уродств личинок вьюна и частоты мутаций у кишечной палочки. Структурно-метаболческая теория, также как и теория мишени, гипотеза липидных радиотоксинов, не может быть признана универсальной теорией биологического действия ионизирующего излучения по ряду причин. Так, ею не установлены количественные со326
100
20
0
40 60 Время, ч
80
Рис. 8.7. Содержание хинонов в проростках кукурузы в зависимости от дозы (А) и времени (Б) после воздействия ионизирующего излучения. Время и дозы облучения указаны на кривых
отношения между накоплением ПРТ в клетке и степенью ее поражения. Факт экспоненциального повышения содержания ПРТ с возрастанием дозы облучения и во времени, который А.М.Кузин приводит как веское доказательство справедливости своей теории, не может претендовать на какую-либо однозначную интерпретацию. Трудно также принять без сомнения точку зрения автора о ведущей роли ПРТ в первичных процессах радиационного поражения клетки, если время образования радиотоксинов в соответствии с его определением смещается от момента облучения к ближайшим часам и даже нескольким суткам после облучения организмов. Структурно-метаболическая теория базируется на анализе многочисленных фактов, накопленных радиобиологией за текущие десятилетия. Она связывает с действием первичных и вторичных радиотоксинов возникновение практически всех нарушений, происходящих в облученном организме, вплоть до отдаленных радиационных последствий.
327
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что изучает радиобиология (радиационная биофизика)? Основные проблемы радиобиологии. 2. Доза ионизирующего излучения, ее мощность. Единицы поглощенной и экспозиционной доз ионизирующего излучения. 3. Понятие предельно допустимой дозы за год (ПДД). 4. Относительная биологическая эффективность ионизирующих излучений (ОБЭ). Какова связь ОБЭ с линейной передачей энергии (ЛПЭ)? 5. Лучевая болезнь человека и животных: стадии ее развития. 6. Критические системы организма. Конкретные их примеры. 7. Что следует понимать под термином "модификация радиочувствительности"? 8. Кислородный эффект в радиобиологических явлениях: коэффициент кислородного усиления (ККУ), зависимость кислородного эффекта от концентрации кислорода по Л.Г.Грею. 9. Понятия "радиопротекторы и радиосенсибилизаторы". Приведите примеры радиопротекторов из двух классов веществ: индолилалкиламинов и меркаптоалкиламинов. 10. Охарактеризуйте два направления в развитии теоретических представлений о биологическом действии радиации. 11. Сущность теории мишени. Ее научная обоснованность. Авторы. Достоинства. 12. Критика теории мишени: соответствие ее положений современным экспериментальным результатам воздействия ионизирующего излучения на биосистемы (белки, ферменты, нуклеиновые кислоты, биомембраны, хромосомы и т.д.). 13. Кем разработана гипотеза липидных радиогоксинов? Что такое липидные радиотоксины? Кинетика процессов их образования в различных системах облученного организма. 14. Достоинства и слабые стороны гипотезы липидных радиотоксинов. 15. Является ли структурно-метаболическая теория количественной теорией биологического действия радиации? Кто ее разработал? 16. Какая идея лежит в основе структурно-метаболической теории? Ее достоинства и слабые стороны. 17. Согласны ли Вы с утверждением о том, что ни структурно-метаболическая теория, ни теория мишени, ни гипотеза липидных радиотоксинов не могут быть признаны универсальными теориями биологического действия ионизирующего
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Б а к 3. Химическая защита от ионизирующей радиации. М., 1968. 263 с. К у з и н A.M. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. М., 1986. 284 с.
328
К у д р я ш о в Ю.Б., Б е р е н ф е л ь д Б.С. Основы радиационной биофизики. М., 1982.304 с. Г о й ч а р е н к о Е.Н., К у д р я ш о в Ю.Б. Гипотеза эндогенного фона радиорезистентности. М., 1980.176 с. Э й д у с Л.Х. Физико-химические основы радиобиологических процессов и защиты от излучений. М., 1979. 216 с. Я р м о н е н к о С П . Радиобиология человека и животных. М., 1988. 424с.
329
О ГЛАВЛЕНИЕ
Введение Глава I. История и методология биофизики
3 9
§ 1. Биофизика как наука 9 §2. История биофизики 14 § 3. Методология биофизики 30 § 4. Единство принципов структуры и функционирования живых организмов 38 Г л а в а 2 . Термодинамика биологических процессов.... 56 § 1. Первый закон термодинамики § 2. Второе начало термодинамики и живые организмы § 3. Баланс энтропии при росте и развитии организмов % 4. Стационарное состояние. Теорема Пригожина. Термодинамическое равновесие. Устойчивое и неустойчивое стационарное состояние. Принцип Ле-Шателье § 5. Работоспособность биологических систем
58 63 67 69 79
Г л а в а 3 . Кинетика биологических процессов 88 % 1. Основные понятия кинетики биологических процессов... 92 § 2. Влияние температуры на скорость биохомичсской реакции. Энергия активации реакции 105 § 3. Влияние катализаторов на скорость реакции 108 % 4. Физико-химические механизмы ферментативного катализа 111 § 5. Кинетика ферментативных реакций 117 § 6. Ингибиторный анализ 124 330
§ 7. Влияние активаторов и других факторов микроокружения на скорость ферментативной реакции 136 § 8. Влияние рН субстрата на скорость ферментативной реакции 138 Глава 4. Мембранология 146 % 1. Терминология 146 % 2. Краткая история мембранологии 147 § 3. Виды биологических мембран 151 § 4. Методы выделения и изучения мембран 151 § 5. Биофизические методы исследования биологических мембран 156 § 5а. Метод электронной микроскопии 156 § 56. Метод электронного парамагнитного резонанса 162 § 5в. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 162 § 5г. Метод флуоресцентной спектроскопии 163 § 5д. Метод определения дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма 164 § 5е. Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 165 % 5ж. Метод радиоактивных меток 166 § 5з. Метод моделирования мембран 169 § 5и. Метод рентгеновского рассеяния нейтронов 170 §г 5к. Методы обнаружения фазовых переходов в мембранах 170 4 6. Химический состав биологических мембран 171 § 6а. Классификация, принципы построения и характеристика мембранных липидов 171 § 66. Белки биологических мембран 179 § 6в. Принципы построения мембранных липидных структур 184 § 6г. Модели биологических мембран 194 § 7. Мембранный транспорт 198 § 7а. Пути проникновения веществ через биологическую мембрану 205 § 76. Движущие силы мембранного транспорта 207 § 7в. Механизмы пассивного мембранного транспорта 208 § 8. Электропроводность биологических систем 223 Глава 5. Квантовая биофизика 229 § 1. Физико-химические основы фотобиологических процессов 229 331
% 2. Взаимодействие квантов света с биологически важными соединениями 230 § 3. Спектральные свойства некоторых биомолекул 234 I 4. Пути дезактивации электронно-возбужденного состояния молекулы 242 Г л а в а 6. Некоторые биофизические (конформационночувствительные) методы анализа биосистем 260 § 1. Свободные радикалы в биосистемах 260 % 2. Методы изучения свободных радикалов 262 Г л а в а 7. Основные фотофизические и фотохимические превращения биосистем 282 § 1. Классификация фотобиологических реакций 282 § 2. Особенности УФ-излучения как биологического фактора 287 § 3. Фотохимические превращения биополимеров и биомембран 289 Г л а в а 8. Действие ионизирующей радиации на различные биосистемы 303 § 1. Предмет и проблемы радиобиологии 303 & 2. Доза ионизирующего излучения 304 % 3. Относительная биологическая эффективность ионизирующих излучений (ОБЭ) 307 % 4. Лучевая болезнь 311 § 5 . Модификация радиочувствительности 313 % 6. Теоретические представления о механизме биологического действия ионизирующих излучений 318
332
Учебное издание Артюхов Валерий Григорьевич Ковалева Тамара Андреевна Шмелев Владимир Павлович БИОФИЗИКА Редакторы О. П. Ш и ш о в а, 3. С. Ф о м е н к о, В. В. П у ш к а р е н к о Художественный редактор Л.А. К л о ч к о в Технический редактор О. В. Н а г а е в а Компьютерная графика Т.к. В а ш а н о в а , К.П. П е н с к о г о Компьютерная верстка С.Н. К у з н е ц о в о й Корректор Г. И. С т а р у х и н а
ИБ2140 ЛР 040088 от 17.09.91. Под. в печ. 03.06.94. Форм. бум. 60x84/16. Бумага офсетная. Офсетная печать. Усл. п.л., 19,5. Уч.-изд. л. 20,7. Тираж 3000. Заказ 49 38 Издательство Воронежского университета 394000. Воронеж, ул. Ф.Энгельса, 8 Издательско-полиграфическая фирма "Воронеж" 394000. Воронеж, пр. Революции, 39
№ стр.
Строка
Напечатано
5 снизу Таблица 1.1, графа 2,4 61 Уравнение 2.4 4 снизу 3 снизу
ионаруженные опечатки № Строка Следует читать стр.
8 45
62 80 82 85 96
меньше уменьшения
Количество, % q=Q I /M T больше увеличения
Ь
12,21
V 118 уравнение 3.30 К ^ - * " - l)[S0) 124 уравнение 3.32 K^k., + V k , 125 уравнение 3.34
1С=
130 уравнение 3.37
m
4l,22
"
к
.
[I]
1С
1 сверху 5 сверху
3,4 сверху 8 сверху 2 сверху
104 105
7 сверху 11 сверху 12 сверху
116
Количество
4 снизу 19 снизу 18 снизу
97 99 103
108 111 112
Следует читать
117 уравнение 3.25 v=V m | H S ( ) /K m +S 0
5 снизу
9 снизу
107
Напечатано
величина константы скорости Кп:
'"Ч величина скорости
137 уравнение 3.44=VaB/l+Kn/S(l+ICJ/[A)) 144
JA0-x)'-°-[A0]' (n-l)t
(n-l)-t
v=k v=const 2FeI2 2FeI3 выделяется при выделяется в кишечнике раздражении при раздражении реакций реакцй ,o Qio = k T+io/ k T Q,o=kT+loAT Зависимость скорости Зависимость константы скорости
рис. 3.7 обозначение Ln(kC) In k оси ординат 10 снизу реации реакции 6 снизу условиях температуры условиях-температуры рис. 3.10, столкновение столкновение ось ординат с определенной частиц с определенной 13 сверху карбоксильная карбоксильная, SH-группы SH-группы
147 155 156 167 168 188 199 200 217 225
245 330
Задача 21 графа 3 Задача 22, 8 снизу 9 снизу 3 снизу 2 снизу 18 сверху 7 снизу 2 снизу Табл. 4.3. 2 графа 18 снизу 10 сверху 2 снизу 6 сверху 10 сверху
V = 1+
|JJ
v max
[S]
|А1
I, в 10' 5 моль
I, 10-5 моль
V, моль/'мин-108 коркового Шван 1958 мембраны, так как антигенов ихъ
V, моль/мин -10"8 пробкового Шванн 1858 мембраны. Так как антител их
Испускаемая умножителя элипсоидальной Са + Са + гуанидин гидроксигуанидин температура
Излучение счетчика эллипсоидальной
Са*+ гуанидин, гидроксигуанидин температура; 8 сверху к-константа Больцмана а заряженных частиц а частиц 19 сверху (омического, R) 13 снизу (омического) уравнение 1л=<р(10-1)=10р(1-10-« » i.-rfi.-D-i.rti-io-*) биохомической биохимической 7 снизу
