Методическое пособие для проведения большого практикума. Часть 2. Генетический анализ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Е.В. Машкина МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ БОЛЬШОГО ПРАКТИКУМА Часть 2 Генетический анализ

Ростов-на-Дону 2000 г.

2

Печатается по решению редакционно-издательского совета Ростовского-на-Дону государственного университета Методическое пособие: для самостоятельной работы студентов дневного и вечернего отделений. Ростов-на-Дону: Изд-во Рост. ун-та, 2000. - с. 18 Ответственный за выпуск: профессор Е.П. Гуськов

3

Введение Целью основных

большого

генетических

практикума

является

методов

подходов, принципов

и

освоение

студентами решения

генетических задач. В ходе выполнения генетических экспериментов студенты должны научиться планировать эксперимент. Планирование включает прежде всего четкую постановку цели, выбор адекватных путей ее достижения, оценку разрешающей способности метода исследования, учет деталей методики. Заранее должен быть определен и выбор соответствующих статистических методов анализа результатов. Данный

раздел

большого

практикума

включает

выполнение

студентами экспериментов на дрозофиле, арабидопсисе, микроорганизмах. Генетический анализ у дрозофилы Drosophila melanogaster - один из наиболее удобных и хорошо изученных модельных объектов для генетического анализа. Дрозофила насекомое с полным превращением. При оптимальной температуре (2425оС) цикл ее развития проходит за 9-10 дней. Продолжительность стадий следующая: яйцо - 1 день, личинка - 4,5-5 дней, куколка - 3,5-4,5 дня, имаго. Вылупившиеся самки в течение 6-12 часов не способны к спариванию и оплодотворению. Самцы и самки становятся половозрелыми на вторые сутки после вылупления, максимальная половая активность и плодовитость

проявляется

у

4-5-дневных

мух.

Для

скрещивания

используют только неоплодотворенных (виргинных) самок. Молодые самки и самцы в течение первых 3-4 часов после вылета имеют более длинное светлое тело, еще не расправившиеся крылья, сложенные на спинке. В последующие часы виргинные самки не отличаются от оплодотворенных. Самки начинают откладывать яйца на 2-3 день после

4

вылупления. Плодовитость мух зависит от плотности популяции и температуры содержания имаго. К несомненным достоинствам дрозофилы следует отнести наличие огромного числа разнообразных мутаций, большинство из которых хорошо проявляется фенотипически; малое число хромосом; простоту разведения. Целью

задания

является

проведение

генетического

анализа

конкретного признака Drosophila melanogaster для выявления гена, ответственного за данный признак, и определения его местоположения в хромосоме. Получив

анализируемую

мутантную

линию,

студент

должен

выявить, какой признак затрагивает мутация, определить степень ее пенетрантности и экспрессивности, дать фенотипическое описание в сравнении с мухами дикого типа. Задача состоит из двух последовательных этапов: 1. определение группы сцепления; 2. определение местонахождения гена в хромосоме.

В ходе выполнения задачи необходимо выяснить: „ является ли признак моно- или полигенным; „ доминантен или рецессивен ген, определяющий данный признак; „ сцеплен ли ген с полом; „ если не сцеплен, то в какой аутосоме локализован; „ в каком локусе хромосомы расположен анализируемый ген.

Для определения группы сцепления рекомендуется проведение реципрокных скрещиваний анализируемого мутанта с мухами дикого типа. Это позволит установить сцеплен ли ген с полом; доминантен или рецессивен; является признак моногенным или полигенным. Если анализируемый ген сцеплен с полом и является рецессивным, то в случае скрещивания мутантной самки с самцом дикого типа в F1

5

наблюдается крисс-кросс наследование; при скрещивании мутантного самца - в F1 и самцы и самки имеют дикий фенотип. Если ген доминантен и сцеплен с полом, то при скрещивании мутантной самки с диким самцом все потомство будет иметь мутантный фенотип; в потомстве дикой самки и мутантного самца

- крисс-кросс

наследование. В случае локализации гена в аутосоме результаты прямого и обратного скрещивания будут идентичны как в F1, так и в F2, а расщепление

по

фенотипу

в

отношении

3:1

может

подтвердить

моногенный характер анализируемого признака. Единообразие

гибридов

F1

по

мутантному

признаку

будет

свидетельствовать о доминантном проявлении гена, а наличие дикого фенотипа - о рецессивности анализируемого гена. Одновременно необходимо поставить скрещивание анализируемого мутанта с линией, маркированной доминантными генами в хромосомах 2 и 3, например, с мухами линии Cy/L2, D/Sb. Хромосомы 2 и 3 данной линии маркированы доминантными генами, кроме того хромосомы, содержащие гены

Cy,

D,

содержат

инверсии,

препятствующие

прохождению

кроссинговера у самок. Все четыре доминантных гена находятся в гетерозиготном состоянии, поскольку в гомозиготе они летальны. Характеристика генов линии Cy/L2, D/Sb. Мутация Сy - крылья загнуты вверх. Гомозиготы летальны. Локализация - во 2 хромосоме. Мутация L2 - глаза сильно уменьшены, с вырезкой на переднем крае. Гомозиготы летальны. Локализация - во 2 хромосоме. Мутация D - крылья растопырены на 45 градусов от оси тела и слегка приподняты, часто отсутствуют некоторые дорзовентральные щетинки. Гомозиготы летальны. Локализация - в 3 хромосоме. Мутация Sb - щетинки заметно короче и

6

толще, чем у мух дикого типа. Гомозиготы летальны. Локализация - в 3 хромосоме. Наличие маркированых 2 и 3 хромосом и немаркированной 4 хромосомы в данной линии позволяет определить группу сцепления анализируемого мутанта А. Рассмотрим схему скрещивания, предположив, что анализируемый мутантный ген локализован во 2 хромосоме. В F1 получим 4 фенотипических класса мух: 1Cy-D : 1Cy-Sb : 1L-D : 1L-Sb. В генотипе каждого из классов мух в гетерозиготе имеется мутантный ген А. Далее следует произвести анализирующее скрещивание мух одного из фенотипических классов, например, L-D, с гомозиготными особями мутантной линии А. Из F1 целесообразно брать самцов, так как у них полностью исключен кроссинговер между хромосомами. Если ген А локализован в хромосоме 2, то в потомстве после анализирующего скрещивания анализируемый признак А не проявляется у мух с признаком L, но будет обнаружен в сочетании с признаком D. Если ген А был бы локализован в хромосоме 3, то признак А не проявился бы ни у одной мухи с признаком D, а был бы обнаружен в сочетании с признаком L. Если же признак А проявился у 50% мух L-D, у 50% мух L и у 50% мух D, то тогда можно сделать вывод о локализации гена А в хромосоме 4. Определив группу сцепления анализируемого гена, необходимо выяснить его месторасположение на хромосоме. Локализация гена в Х-хромосоме Местоположение анализируемого гена определяется с помощью скрещивания мутанта с мухами другой линии, маркированной двумя генами. В F1 получают гетерозиготных по трем генам самок. Скрещивая таких самок с самцами из этой же пробирки (или любых других), можно проанализировать гаметы самок F1 на фоне гамет самца с Y-хромосомой.

7

Подсчет мух в фенотипических классах второго поколения ведется только по самцам (если гены линии-анализатора являются рецессивными) или и по самцам, и по самкам (если гены анализаторной линии доминантные). Локализация гена в аутосомах Локализацию неизвестного гена в аутосоме проще всего производить с помощью анализаторной линии с доминантными маркерами. Однако, анализаторы с доминантными маркерами используются очень редко из-за ограниченного числа таких линий и наличия у многих из них инверсий, что препятствует прохождению кроссинговера. Поэтому чаще для локализации гена в аутосомах проводится скрещивание исследуемого мутанта с двойным рецессивным анализатором для перевода всех трех генов в гетерозиготное состояние. Например, скрещивание, где в качестве материнской формы является исследуемая гомозиготная мутантная линия, а отцовской формой служит линия мух с рецессивными генами b - black, cn - cinnabar в гомозиготном состоянии. По фенотипу все потомство F1 будет дикого типа. Так как кроссинговер у самцов дрозофилы не происходит, для анализирующего скрещивания необходимо отобрать виргинных самок из первого поколения и скрестить их с самцами из линии анализатора, гомозиготными по всем трем генам. В потомстве после анализирующего скрещивания следует ожидать 8 фенотипических классов, два из которых будут соответствовать родительским, а 6 окажутся кроссоверными. Наибольшее число особей следует ожидать в некроссоверных классах, наименьшее - это число двойных кроссоверов. Следует иметь ввиду, что частота кроссоверов зависит от ряда факторов: от размера выборки; от неодинаковой жизнеспособности разных фенотипических классов; от температуры, питания и т.д. Определив порядок расположения генов, необходимо рассчитать относительное расстояние между генами.

8

Зная

местоположение

генетической

карте

генов

дрозофилы

black, и

cinnabar

на

стандартной

относительное

расстояние

анализируемого мутантного гена от них, можно сделать вывод о месте локализации данного гена. На основе проведенного генетического анализа необходимо сделать вывод

о

характере

наследования

и

локализации

анализируемого

мутантного признака. Выявление и количественный учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы. Большинство мутаций являются рецессивными и могут проявиться только в гомозиготном (или гемизиготном) состоянии. Для обнаружения мутаций используют специально созданные линии-анализаторы. В их генотипе содержатся инверсии, блокирующие кроссинговер. В результате вновь возникающая мутация всегда наследуется с хромосомой, полученной от особи, которая была подвергнута действию мутагенного фактора. Метод Меллер-5 Данный

метод

позволяет

проводить

количественный

учет

рецессивных летальных мутаций, возникающих в Х-хромосоме зрелых сперматозоидов самцов дрозофилы. Линия-анализатор Меллер-5 содержит в генотипе 2 инверсии, не влияющие на жизнеспособность мух. Инверсия sc8 захватывает большую часть Х-хромосомы, инверсия δ49 подавляет кроссинговер в средней части Х-хромосомы. Кроме того, линия Меллер-5 маркируется видимой мутацией, например, wa- apricot - абрикосовые глаза и B-Bar полосковидные глаза. Самцов, подвергнутых мутагенной обработке в возрасте 3-5 дней, скрещивают с самками из линии Меллер-5 того же возраста. Через двое суток мух удаляют из пробирки так как на третий день в оплодотворении

9

участвуют половые клетки, находившиеся на стадии сперматид в момент обработки самцов. Через 9-10 дней начинается анализ мух F1 только двухдневных яйцекладок. Самцы первого поколения имеют фенотип линии Меллер-5. Каждая самка в первом поколении имеет одну Х-хромосому, пришедшую от отца. В этой Х-хромосоме может быть локализована вновь возникшая рецессивная летальная мутация. Для того, чтобы определить какие самки несут эти мутации, в первые 2-3 дня лета мух проводят индивидуальные скрещивания самок первого поколения с самцами из линии Меллер-5. Через 9-10 дней в течение 9 дней проводится анализ второго поколения, культуры просматривают ежедневно. Если в Х-хромосоме самки из первого поколения летальная мутация отсутствует, то в потомстве F2 проявляется расщепление: половина самцов и самок имеют дикий фенотип, половина - фенотип линии Меллер-5. Если в Х-хромосоме самки F1 содержалась леталь, то в F2 не появятся нормальные самцы. Частота леталей определяется как доля (%) Ххромосом,

несущих

летальную

мутацию,

от

общего

числа

проанализированных Х-хромосом. Например, если в опыте изучено потомство 800 самок первого поколения, т.е. 800 Х-хромосом, полученных от обработанных мутагеном самцов, и летальные мутации обнаружены в потомстве 26 самок, то частота возникновения рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме в данном опыте составляет 3,25%. Метод CLB В линии CLB кроме одной большой инверсии и маркера В, содержится рецессивная леталь в гетерозиготном состоянии, поэтому в F1 не образуется самцов CLB и в F2 появляются только нормальные самцы, если в Х-хромосоме нет летали. Если Х-хромосома, полученная самками F1 с гаметой обработанного мутагеном самца, несет леталь, то в F2 вообще не

10

появляются самцы. Метод CLB в настоящее время используется редко, так как одна инверсия не полностью "запирает" кроссинговер. Генетический анализ Arabidopsis thaliana (L.). Целью

данной

работы

является

ознакомление

студентов

с

основными принципами проведения эксперимента по химическому мутагенезу у высших растений на примере изучения генетического действия нитрозометилмочевины (НММ) при обработке семян Arabidopsis thaliana (L.). В качестве основного критерия генетического эффекта мутагена выбрана частота возникающих рецессивных мутаций. Схема эксперимента предусматривает анализ двух поколений растений из обработанных семян: М1 - растений из обработанных мутагеном семян и М2 - растений следующего

поколения,

где

возможно

фенотипическое

проявление

большинства рецессивных мутаций. Помимо этого, проводят анализ повреждающего

действия

мутагена

по

ряду

морфологических

физиологических

признаков.

Наиболее

значимыми

являются

показатели,

выживание

растений

на

фазах

как

разных

и

такие

развития

(определяется по числу нормально вегетирующих растений в каждой фазе онтогенеза) и плодовитость растений, дошедших до фазы созревания ("нормально плодовитые" - растения, давшие более 25 семян, и "малоплодовитые" - менее 25 семян). Выбор

Arabidopsis

thaliana

(резушка)

в

качестве

объекта

исследования обусловлен рядом преимуществ данного растения, в частности,

малой

продолжительностью

вегетационного

периода

и

возможностью провести опыт в лабораторных условиях независимо от времени года. Общая продолжительность экспериментальной части задачи составляет 2-3,5 месяца.

11

Критериями генетического действия НММ у арабидопсис могут служить частоты возникающих в М2 хлорофильных и эмбриональных летальных

мутаций.

Определение

частоты

хлорофильных

мутаций

заключается в объективной идентификации многочисленного класса мутаций, возникающих в М2. Тест на эмбриональные летальные мутации позволяет проводить учет летальных мутаций, вызывающих гибель зародышей

семян

на

разных

этапах

индивидуального

развития.

Преимуществом данного теста является то, что он позволяет анализировать эмбрионы, формирующиеся уже на растениях М1. Это освобождает от необходимости посева растений М2. Выращивание растений второго поколения проводится лишь для проверки наследования обнаруженной летальности. Анализ эмбрионов в стручках растений М1 позволяет также определить выщепление трех основных типов хлорофильных мутаций albina, xantha, chlorina. Исходный материал, предназначенный для опыта, должен отвечать следующим основным требованиям: отличаться возможно более коротким вегетационным периодом и периодом послеуборочного дозревания; быть генетически однородным по изучаемым признакам. Техника проведения анализа: зеленые, слегка светлеющие стручки незадолго до начала созревания срезают с растения и препарируют на влажной фильтровальной бумаге под бинокулярным микроскопом. На вскрытом стручке легко определить число завязавшихся семян и число мутантных фенотипов: эмбриональных леталей: а) меньших размеров семена, содержащие сильно недоразвитый зародыш под коричневой семенной оболочкой - мутации sicca, vana, brevis, diffusa;

12

б) нормальных размеров семена, содержащие дифференцированный на семядоли и гипокотиль эмбрион, не достигающий, однако, нормальной величины; коричневая, реже прозрачная семенная оболочка - мутации murca, parva; в)

нормальных размеров семена с хорошо развитым зародышем,

имеющим локальную красно-фиолетовую окраску, семенная оболочка прозрачная - мутации fusca; хлорофильных мутаций хорошо развитые семена с нормальным по величине, но измененным цветом всего зародыша под прозрачной семенной оболочкой г) белый цвет зародыша - мутация albina; д) кремовый, желтый цвет зародыша - мутация xantha; е) желто-зеленый цвет зародыша - мутация chlorina. Нормальные семена имеют максимальные размеры и содержат хорошо развитый дифференцированный зародыш интенсивно зеленого цвета под прозрачной семенной оболочкой. При обработке семян мутагеном мутации возникают лишь в некоторых из многочисленных меристематических клеток. Дальнейшее деление этих клеток приводит к развитию у растения "мутантного" сектора, клетки которого несут возникшую рецессивную мутацию в гетерозиготном состоянии, т.е. к химерному строению растения М1. Только в результате мейоза в спорогенных тканях и последующего самооплодотворения возможно возникновение зиготы, в которой появившаяся рецессивная мутация будет находится в гомозиготном состоянии. Разработана схема определения частоты рецессивных мутаций при посемейном анализе потомств растений из обработанных семян. По этой схеме для определения частоты мутаций в М2 высевается случайная выборка (не менее 25) семян каждого растения М1. Семьи, давшие меньше 25 проростков, из анализа

13

исключаются, независимо от того, выщепились ли в них мутантные фенотипы или нет. Результаты подсчета эмбриональных и хлорофильных мутаций в М2 заносятся в таблицы 1,2. Таблица 1 Результаты подсчета эмбриональных летальных и хлорофильных мутаций в М2 (эмбрион-тест) 1-й стручок

2-й стручок

...5-й стручок

Примечания

всего эмбрионов эмбриональных леталей хлорофильных мутантов

Всего проанализировано растений..., стручков..., эмбрионов.... Всего химерных по мутации растений М1...., в том числе по эмбриональным леталям...., в том числе по хлорофильным мутациям...... Всего мутантных фенотипов в М2....., в том числе эмбриональных леталей...., в том числе хлорофильных мутаций..... Общая частота мутаций (в %) Частота эмбриональных леталей (в%) Частота хлорофильных мутаций (в%). Таблица 2 Результаты подсчета хлорофильных мутаций в М2 №№ семей

Дата посева

Кол-во посеянных семян

Кол-во проростков

В том числе мутантных

Всего проанализировано в М2 семей...., растений....; из них несут мутацию семей....., растений...... Частота хлорофильных мутаций (в%). По результатам эксперимента делается вывод о генетической активности различных концентраций мутагена; о наличии или отсутствии

14

зависимости между частотой эмбриональных и хлорофильных мутаций у арабидопсис и концентрацией мутагена. Генетический анализ на микроорганизмах. Тест Эймса Тест Эймса - один из основных методов, применяющихся в просеивающих

программах,

когда

нужно

сравнительно

быстро

проанализировать большое количество химических соединений и отобрать среди них те, которые обладают мутагенной активностью. Данный тест позволяет выявить не только прямые мутагены, но и промутагены (вещества,

приобретающие

мутагенную

активность

в

результате

метаболических превращений). В работе используют специальные тестерные штаммы бактерии Salmonella typhimurium. В генотип бактерий тестерных штаммов внесены изменения, повысившие их чувствительность к внешним воздействия и лишившие их патогенности. Кроме того, внесены мутации в гены, отвечающие за синтез гистидина (бактерии погибают на среде без гистидина). Тест объекты Для скрининга мутагенов используют следующие штаммы Salmonella typhimurium: TA98 hisD3052 rfa

uvrB/pKM101; TA100 hisG46 rfa

uvrB/pKM101; TA97a hisD6610 hisO1242 rfa uvrB/pKM101; TA102 his(G)8476 rfa/pKM101/pAQ1 (hisG6428). Мутации rfa - нарушение синтеза липополисахаридов, в результате чего возрастает проницаемость клеточной стенки; uvrB - нарушение эксцизионной репарации (делеция участки gal-biouvrB). Штаммы с этой мутацией нуждаются в биотине.

15

В клетки внесены плазмиды pKM101 (увеличивает вклад ошибочной репарации ДНК в общий процесс восстановления после мутагенного воздействия); pAQ1 (содержит мутантный ген hisG6428). Мутации ауксотрофности по гистидину: hisG46 - миссенс-мутация (пролин вместо лейцина) в диком типе. Мутация в гене hisG, кодирующем первый белок биосинтеза гистидина, АТФ-фосфорибозилфосфотрансферазу; hisD3052 - фреймшифт-мутация, реверсия происходит за счет делеции -CG- в последовательности -CGCGCGCG-, находящейся недалеко от сайта мутации. Ген hisD кодирует гистидинолдегидрогеназу; hisD6610 - фреймшифт-мутация, как результат трех независимых мутаций; hisO1242 - конститутивная экспрессия оператора - увеличивает частоту реверсии hisD6610; hisG428 - охра-мутация. Батарея штаммов с различными мутациями по гистидину позволяет выявить широкий спектр мутагенов с разнообразными принципами действия. ТА100 ревертирует под действием многих мутагенов, индуцирующих замены пар оснований или сдвиг рамки считывания. ТА98 чувствителен к мутагенам, индуцирующим сдвиг рамки считывания, особенно к различным циклическим соединениям. ТА97 имеет две чувствительные к мутагенам "горячие точки" в гене hisD6610 - группу из 6 -С- и последовательность чередующихся пар -GCвблизи от нее. Штамм чувствителен к довольно широкому спектру мутагенов. ТА102 штамм - ген, в котором происходит реверсия, расположен не в хромосоме бактерии, а в многокопийной плазмиде pAQ1; в сайте мутации

16

содержит не CG пары , а АТ-пары. Данный штамм выявляет мутагены, ревертирующие штаммы с ненарушенной системой репарации. Тестерные штаммы сальмонеллы культивируют на специальной среде

без

гистидина,

на

которой

могут

развиваться

лишь

те

микроорганизмы, у которых произошла обратная мутация (реверсия) от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие реверсии происходят с очень низкой частотой. Если в среду внести мутаген,

то

частота

мутаций

значительно

увеличивается,

что

регистрируется по числу колоний ревертантов. Каждый ревертант образует отдельную колонию. Для учета возможной активации мутагенов в среду вносят активирующую

смесь,

основным

компонентом

которой

являются

микросомальная фракция S9, полученная из клеток печени крыс или других животных. Эксперимент включает варианты с участием активирующей смеси и без активирующей смеси. Для контроля работоспособности штаммов в опыты включается позитивный контроль - обработка бактерий веществами с известными мутагенными свойствами, например, азид натрия, митомицин С и другие. Проведение эксперимента. В пробирку с 3 мл расплавленного полужидкого агара вносится 100мкл исследуемого раствора, 500мкл активирующей смеси (в варианте без активации добавляется 500мкл 0,1М калий-фосфатного буфера, рН 7,4) и 100мкл суспензии клеток. Все интенсивно перемешивается и наслаивается на чашку Петри с плотным нижним агаром. Чашки культивируются 48 часов при 37 градусах, после чего проводится подсчет колоний ревертантов. Обработка результатов. Если в опыте ревертантов значительно больше, чем в контроле (увеличение более чем в 100 раз), мутагенность пробы доказана. Если увеличение незначительно, для проверки его

17

достоверности производится расчет по методу множественных сравнений Даннетта: 1. Из количества ревертантов на каждой чашке выводится его натуральный логарифм (y). 2. Вычисляется среднее значение натурального логарифма для каждого варианта опыта (Y). 3. Определяют случайные отклонения (Y-y) в каждом варианте и возводят их в квадрат (с2). 4. Квадраты случайных отклонений суммируют по всему опыту (SS). 5. Вычисляют выборочную оценку случайной дисперсии s =

SS /v, где v - число степеней свободы, равное количеству

повторов в каждом варианте опыта минус 1, v = Σ(n - 1), n - число повторов в варианте. 6. Вычисляют доверительный интервал D = d √s 1/ni + 1/no ), где d - табличная константа, зависящая от числа степеней свободы (V) и количества вариантов опыта без контроля (k). О мутагенности пробы говорят, если Yi - Yo > D (i - в опыте, o - в контроле). Параллельно вычисляется кратность превышения числа ревертантов в данном опытном варианте над контролем. При отсутствии статистически значимых различий степень мутагенного эффекта оценивается баллом "0". Баллы "1", "2", "3" проставляются в тех случаях, когда число колоний на опытных чашках превышает число колоний на контрольных чашках соответственно до 10 раз (если превышение статистически значимо), более чем в 10 раз до 100, и более чем в 100 раз (слабый, средний, сильный эффект). Мутагенность пробы считается доказанной, если проявляется хотя бы в одном варианте на одном штамме. Литература:

18

Большой практикум по генетике животных и растений. -М., 1977.136с. Худолей В.В. Характеристика современных мутагенных тестов для выявления канцерогенов окружающей среды // Успехи современной биологии, 1984.-Т.98.-№ 2.-С.177-192. Орлова Н.Н. Генетический анализ. М. :"Высшая школа" Тихомирова М.М. Генетический анализ. Л., 1990, 280с.