Современные методы ЯМР для химических исследований

172

Глава 5

Рис. 5.16. При вычитании двух лоренцевых линий, даже совсем немного отличающихся по частоте, остается значительный сигнал (в левой части рисунка различие частот едва заметно). Остаточные пики могут появляться и при вычитании сигналов с одинаковой амплитудой и фазой, но различными частотами (рис. 5.16). Похожая ситуация встречается и в фазочувствительной двумерной спектроскопии (гл. 8) при перекрывании двух линий с противоположными фазами. В гл. 3 мы уже записывали уравнение лоренцевой линии с амплитудой А и шириной на полувысоте И^(рис. 3.3): AW2 ( 5 Л 9 )

Рассмотрим две линии с v 0 = ( + \/2)р Wn (— l/2)p W(T.e. разделенные нар ширин линий; нас интересуют случаи, когда р меньше 1). Пусть х = 2 v/W, тогда их разность можно записать как

Это выражение не соответствует точно дисперсионной лоренцевой форме, но задаваемая им линия также проходит_в центре через нуль: в точке х = О или посредине между двумя лоренцевыми линиями (рис. 5.16). Нам нужно узнать амплитуду этой линии, и мы найдем х-координаты ее максимума и минимума. Продифференцировав (5.20), приравняв полученное уравнение нулю и решив его относительно х, получим л-= +

(р2

(5.21)

Это очень интересное уравнение. Из него следует, что даже для сравнительно больших величин р измеряемая разность частот двух противофазных пиков значительно отличается от их действительной разности. Например, для р = 4 ошибка составляет 17%. Об этом важно помнить при измерении в двумерном фазочувствительном спектре константы спин-спинового взаимодействия протонов порядка нескольких герц по двум линиям с противоположными фазами примерно той же ширины.

Ядерный эффект Оверхаузера

173

2ОО|180

i § 440 s

120

I 100

I во •*- 60

Рис. 5.17. Зависимость амплитуды остаточных сигналов разностного спектqo qi q? qa Q4 qs qe q7 qs q9 1,0 у у ц з у ^ р а от расстояния между лоренцевыми Разделение линий р (чаешь ширины линии)

ЛИНИЯМИ.

Техника таких измерений рассматривается в гл. 8, где приведено графическое решение уравнения (5.21). Амплитуда остаточных пиков задается довольно сложным выражением (эта зависимость изображена графически на рис. 5.17), но нас с точки зрения разностной спектроскопии интересуют только малые величины р. Выражение (5.21) имеет предел х = ± 1/,/з при р -> 0, т. е. расстояние между максимумами близко к W/y/З при любых достаточно малых р. При этом условии амплитуда линии, т.е. разность интенсивностей самой положительной и самой отрицательной точек, отнесенная к амплитуде исходных линий, будет иметь вид (5.22) Таким образом, для того чтобы интенсивность остаточных сигналов не превышала 2%, частота линий не должна изменяться от прохождения к прохождению более чем на 1% их ширины! Это значит, что для типичных протонных линий шириной 1 Гц флуктуации поля не должны превышать 10 мГц, т.е. 5 - К Г 1 0 на 500 МГц. Это близко к пределу стабильности частоты термостатированных кварцевых генераторов. Такая стабильность может быть достигнута, но это требует использования оптимальных конструкций приборов и тщательного контроля условий эксперимента. Использование при обработке данных экспоненциального умножения ССИ уменьшает амплитуду остаточных сигналов этого типа, поэтому желательно использовать экспоненциальную функцию с большим уширением линии, чем в оптимальном фильтре. Оптимальные условия разностной спектроскопии ЯЭО. Н а м стало ясно, что измерение небольших ЯЭО требует от спектрометра предельной реализации всех его возможностей. Поэтому нужно выяснить, что

174

Глава 5

можно сделать для увеличения ЯЭО и улучшения подавления остаточных сигналов. Сначала рассмотрим последний вопрос. Стабильность спектрометра может зависеть от таких аспектов эксперимента, как дейтериевый лок и параметры окружающей среды образца. В гл. 3 мы уже рассматривали систему лока, в разд. 5.3.4 дан более подробный ее разбор. Здесь мы постараемся выяснить, какие факторы, связанные с условиями, в которых находится образец, могут дестабилизировать эксперимент. Наиболее вероятный фактор - нестабильная температура. Химические сдвиги во многих случаях обладают значительной зависимостью от температуры, которая может проявляться на интересующих нас сигналах как непосредственно, так и через изменение химического сдвига опорного сигнала лока. Особенно сильно это проявляется в водных растворах. Таким образом, при измерении ЯЭО очень хорошо использовать температурную стабилизацию, которая легко достигается нагреванием образца чуть выше комнатной температуры. Нагревание полезно еще и потому, что оно приближает образец к области предельного сужения. При работе с большими молекулами может оказаться необходимым использовать максимально допустимую для раствора температуру. Следует иметь в виду, что обычный температурный блок спектрометра Я М Р - довольно грубое устройство с точки зрения поддержания температуры, близкой к комнатной. По возможности, лучше купить или сделать самому более качественный блок [8]. В любом случае следует экспериментально проверить, дает использование температурного контроля улучшение или нет. Другой фактор, влияющий на качество разностных экспериментов, это, по рассказам ЯМР-спектроскопистов, перемещение людей и больших предметов возле лаборатории. Поэтому эксперименты по ЯЭО рекомендуется делать ранним утром или в воскресенье, хотя, по опыту автора, увеличение времени выборки позволяет полностью исключить влияние этих факторов. Но все-таки во время проведения разностных экспериментов лучше стараться избегать всяких движений в комнате, где стоит спектрометр, особенно если это прибор с высокой напряженностью поля. Другое направление, в котором мы можем частично контролировать эксперимент по ЯЭО,-это сама величина ЯЭО. Минимизируя р* и обеспечивая условия предельного сужения, мы тем самым увеличиваем шанс измерения чистой кросс-релаксации. Это означает, что мы должны работать с разбавленными, тщательно обезгаженными образцами в дейтерированных растворителях высокой изотопной чистоты. Желательно выбирать наименее вязкий из подходящих растворителей. Надо проверить, достаточен ли период насыщения для установления новой равновесной заселенности, т. е. длительность облучения должна быть как минимум в 3 раза больше максимального Ти а лучше-еще больше. Особенно медленно возникает непрямой трехспиновый ЯЭО, поскольку установление промежуточного прямого ЯЭО, который должен появить-

Ядерный эффект Оверхаузера

175

ся первым, само требует времени порядка Tt. Очень полезно предварительно оценить Ti по быстрой методике (гл. 7, разд. 7.5.3), особенно это важно в случае протонов, где в одной и той же молекуле Тх может меняться от долей секунды до 5 с и более. Величины Тх могут помочь и в интерпретации данных ЯЭО, поскольку необычно большие Ti свидетельствуют об относительной изоляции протона от источников диполь-дипольной релаксации. Выводы из величин ЯЭО на таком протоне следует делать очень осторожно (вспомните протон Н А четырехспиновой системы, обсуждавшейся в конце разд. 5.2.4). Селективность и проблема селективного переноса заселенности. До сих

пор мы предполагали, что можем произвольно насыщать все линии любого мультиплета. Однако на практике насыщение одного сигнала в сложном спектре без возмущения остальных может представлять собой столь сложную проблему, что именно она часто определяет возможность применения разностного метода измерения ЯЭО. Решить ее можно только методом проб и ошибок, используя различные напряженности радиочастотного поля и оценивая насыщение желательных и нежелательных сигналов (общее обсуждение проблемы селективного облучения полями малой напряженности см. в гл. 7, разд. 7.7.2). Обычно, чтобы избежать насыщения находящихся поблизости сигналов, мы вынуждены использовать неполное насыщение интересующего нас мультиплета, что приводит к понижению величин ЯЭО. В связанных спиновых системах эта проблема может усложняться еще и эффектом, известным под названием селективного переноса заселенности (SPT, от англ. Selective Population Transfer). SPT может возникать в связанных спиновых системах, когда различные переходы одного и того же ядра испытывают неравное возмущение. В идеальном случае, когда все переходы насыщаются полностью, SPT не возникает вообще. Однако, пытаясь повысить селективность облучения, мы стремимся снизить напряженность радиочастотного поля и тем самым создаем возможность для появления SPT. Мы не будем здесь рассматривать механизм переноса заселенности, поскольку он подробно обсуждается в гл. 6; укажем только природу этого явления и способы его подавления. В отличие от ЯЭО, повышающего общую интенсивность мультиплета, SPT создает только разностную поляризацию, т. е. приводит к появлению линий с противоположными фазами, суммарный интеграл которых равен нулю (рис. 5.18). При интегрировании сигналов для определения ЯЭО линии SPT не изменяют величину интеграла, но интенсивные линии с противоположными фазами искажают спектр, поэтому имеет смысл попробовать их подавить. К счастью, это легко достигается при использовании тг/2-импульсов для регистрации спектра [9]. При этом задержки между прохождениями обязательно должны быть в несколько раз больше Ту. Это необходимо также из соображений повышения чувствительности. Для действительно полного подавления SPT-сигналов рекомендуется использовать состав-

176

Глава 5

ill

JUL

4,4

4,3

1,2

I

I

4,1

4,0

I

3,9

3,8

3,7

3,6

м. 3. Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное насыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование составных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и выявить ЯЭО. ные я/2-импульсы (гл. 7, разд. 7.3). Все спектры в этой главе, кроме приведенного на рис. 5.18, были получены именно таким путем. Количественные измерения. После того как получен удовлетворительный разностный спектр, нам остается провести интегрирование его сигналов и получить численные величины различных ЯЭО. Существуют два подхода к решению этой задачи. Прямой подход следует из определения ц. Он состоит в получении величин / 0 интегрированием мультиплетов в невозбужденном спектре (т.е. отдельно преобразованной части Б на рис. 5.14), которым приписывается интенсивность 100%. Интегрирование соответствующих мультиплетов в разностном спектре даст непосредственно величины ц. Спектр должен иметь тот же масштабирующий фактор. Для этого, возможно, потребуется установить некоторый флажок в программном обеспечении спектрометра.

Ядерный эффект Оверхаузера

177

Хотя такая процедура и позволяет получить величину реального увеличения интенсивности каждого мультиплета, пользоваться ей можно не всегда. При снижении напряженности насыщающего поля для повышения селективности мы, вероятно, получим неполное насыщение. В этом случае имеет смысл как-то масштабировать полученные значения ЯЭО с учетом степени насыщения, чтобы определить те значения, которые были бы получены при полном насыщении. Это можно сделать при использовании в качестве эталона интенсивности насыщавшегося сигнала в разностном спектре. Ему нужно приписать интенсивность -100%, если это мультиплет одного протона. Интегралы остальных пиков вычисляются в этой шкале. Численные величины ЯЭО, приводимые в разд. 5.4, получены именно таким способом. Какой бы способ измерения ни был выбран, не стоит рассчитывать на высокую точность результатов. Отношение сигнал/шум для разностного пика интенсивностью в несколько процентов обычно достаточно мало, и нет смысла приводить его величину с несколькими десятичными знаками. Но, к счастью, в большинстве случаев нас интересует отличие, скажем, 5% ЯЭО от 20%, которое можно заметить вполне отчетливо. Большая точность не нужна даже при выполнении вычислений по уравнению (5.17), поскольку обратная зависимость расстояний от шестой степени ЯЭО делает их нечувствительными к ошибкам отдельных величин т|.

5.3.4. Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации Использование системы долговременной стабилизации поля с помощью системы дейтериевой стабилизации-необходимое условие осуществления разностной спектроскопии. Однако в масштабе времени отдельного прохождения такая система не в состоянии обеспечить достаточную стабилизацию. Причины этого станут нам вскоре ясны, но это не приведет к улучшению стабильности поля. Нам необходимо обеспечить оптимальные условия стабилизации. Мы уже обсуждали их в гл. 3, но теперь, когда объем наших знаний вырос, пора снова вернуться к этому вопросу. Сказанное здесь полностью относится и к двумерной спектроскопии, где эффекты кратковременной нестабильности отношения поле/частота проявляются как «/х-шум» (см. гл. 8). Задача системы стабилизации-поддержание постоянного отношения напряженности поля к рабочей частоте. Для этого постоянно наблюдают сигнал некоторой линии ЯМР, обычно дейтериевого резонанса от молекулы растворителя, и подстраивают постоянное поле так, чтобы эта линия оставалась на одном и том же месте. Для этой цели очень удобна дисперсионная форма линии, имеющая нулевую амплитуду в точке резонанса, которая становится положительной и отрицательной по разные от него стороны (рис. 5.19). Выделяемый таким образом сигнал можно непосредственно использовать для коррекции поля в петле обратной связи. Нам сразу, становится понятна необходимость правиль12-75

178

Глава 5

коррекция ПОЛЯ

РИС. 5.19. Петля обратной связи системы стабилизации, обеспечивающая постоянное положение опорной линии, использованной в форме сигнала дисперсии.

ной настройки фазы канала стабилизации (гл. 3). Полностью неправильная установка фазы, например, соответствующая линии поглощения, нарушает стабилизирующую способность петли обратной связи, поскольку амплитуда сигнала в точке резонанса не будет нулевой. Даже небольшие ошибки фазы в канале стабилизации приводят к уменьшению градиента линии в ее центре, снижая тем самым эффективность его работы. При отсутствии шума в опорном сигнале система будет способна устранять изменения отношения поле/частота с достаточно большой скоростью, ограничиваемой быстротой коррекции поля и необходимостью подавления возможных осцилляции или устранения сбоя резонансных условий. Однако сигналы ЯМР неизбежно содержат шум, и мы вынуждены увеличивать время регистрации опорной линии, чтобы этот шум не вызвал флуктуации постоянного поля (это была бы просто аварийная ситуация!). Регистрируемый опорный сигнал стабилизации усредняется электронным интегратором в течение довольно длительного промежутка времени от десятков до сотен секунд. Обычно постоянная времени усреднения-это внутренняя характеристика спектрометра, которую не может менять оператор. Нет оснований ожидать выполнения коррекции поля в промежутки времени, меньшие указанного. Это очень плохо, поскольку именно такие времена и интересны с точки зрения разностной спектроскопии. Таким образом, стабилизация вряд ли будет эффективно работать во временных интервалах порядка одного прохождения. Но тем не менее долговременная стабилизация остается важной, и мы можем обсудить способы оптимизации ее работы. Сигнал коррекции, получаемый из дисперсионной формы опорной линии, будет наиболее чувствителен

Ядерный эффект Оверхаузера

179

к изменениям отношения поле/частота при условии, что сигнал узкий, при правильно настроенной фазе и большом отношении сигнал/шум. Мы можем воздействовать на эти факторы как с помощью выбора режима работы спектрометра (тщательная настройка разрешения, правильная настройка мощности и фазы опорного сигнала стабилизации), так и подбором растворителя, поскольку ширины резонансных линий дейтерия в спектрах различных растворителей изменяются в широких пределах. Один из лучших ЯМР-растворителей- ацетон, дающий в спектре дейтерия очень узкую линию, так как его вязкость мала. Более вязкие растворители (например, диметилсульфоксид, пиридин), вероятно, создают худшие условия для стабилизации. Один из самых плохих в этом плане растворителей-неизбежная во многих экспериментах вода. Ее протоны (или ионы дейтерия) участвуют в обменных процессах. При определенных рН, температуре и типе растворенного вещества они могут давать чрезвычайно широкую линию. Эти факторы необходимо учитывать при планировании эксперимента, поскольку небольшие изменения характеристик водных растворов могут вызвать значительное уширение линии опорного сигнала в канале стабилизации.

5.4. Использование ЯЭО 5.4.1. Очень простой случай Рассмотрим самую обычную проблему, надо различить цитраконовую (1) и мезаконовую (2) кислоты. В этом случае мы можем использовать подход Белла и Сондерса, поскольку обе молекулы НО 2 С

СО 2 Н

очень близки по структуре и нет опасности наложения посторонних диполь-дипольных взаимодействий. При выполнении эксперимента в растворе D 2 O в молекуле останутся только интересующие нас протоны: олефиновые и метальные. При исследовании изомерных олефинов полезно помнить об одном правиле: отношение межъядерных расстояний в цис- и транс-изомерах составляет около 1,3:1. В этом очень простом случае использование стандартных длин связей позволяет рассчитать (в предположении усреднения положений метильных протонов) отношение расстояний между олефиновым и метальными протонами в цис- и транс-изомерах, которое оказывается равным 1,32:1. Удобнее всего измерить ЯЭО на олефиновом протоне при насыщении метильных. Возможен и обратный эксперимент, но он менее

Глава 5

180

разностный спектр ЯЭО

мезаконоВпя

кислота нормальный спектр

цитраконобая кислота

6,6

6,4

6,2 м.Э.

6,0

5,8

2,6

2,2 2,0 м.б.

1,6

1,6

Рис. 5.20. Разностные спектры, обсуждающиеся в тексте.

интересен, поскольку метальные протоны релаксируют в основном за счет диполь-дипольного взаимодействия друг с другом и измеряемый на них ЯЭО будет намного меньше. На рис. 5.20 показаны протонные спектры обеих кислот и соответствующие разностные ЯЭО-спектры с облучением метальных протонов. Много усилий было затрачено на получение действительно равновесного ЯЭО. Это оказалось не самым простым делом для таких малых молекул: Тх олефинового протона в транс-изомере составляет около 18 с. Как и ожидалось, ЯЭО, полученный для цитраконовой кислоты, значительно превышает ЯЭО для мезаконовой кислоты. Для двух соединений интегрирование сигналов дает значения т), равные 0,29 и 0,06 соответственно. Предполагая 6 зависимость ц от расстояния типа 1/г , мы получаем отношение межъядерных расстояний 1,30:1, и если точность определения ц составляет ± 0,01 (оптимистичная оценка!), то ошибка в величине отношения расстояний составляет + 0,04. Таким образом, найденная величина совпадает с известными расстояниями в пределах ошибки эксперимента. Итак, мы получили вполне удовлетворительный результат. Но всетаки рассмотрим, с какими проблемами мы столкнулись бы в случае доступности только одного из изомеров. Мы бы получили некоторый результат, допустим, 6%. Но какой вывод мы должны отсюда сделать? Не имея данных по второму веществу, мы не можем сказать, «большой» это или «малый» ЯЭО. Действительно, при плохом приготовлении образца и неоптимальном выборе параметров регистрации спектра мы легко можем получить такую величину и на z/uc-изомере. Например, если вы предварительно не проверили Ti и выбрали длительность периода насыщения только несколько секунд, то ЯЭО не успеет полностью установиться. Сущность использования ЯЭО для определения структуры состоит в сравнительном характере этого метода. В самом деле, надежные результаты можно получить только при сравнении двух

Ядерный эффект Оверхаузера

181

стереоизомеров. Чем дальше вы отходите от такой ситуации, тем осторожнее надо интерпретировать полученные данные. Еще один интересный аспект эксперимента состоит в ширине диапазона возможных величин ЯЭО. Максимально возможный ЯЭО составляет, разумеется, 50%. Величины, меньшие 1%, трудно измерить достоверно. Таким образом, максимально возможное соотношение составляет 50:1, что соответствует отношению межъядерных расстояний чуть менее 2 : 1 . Это задает «динамический диапазон» эксперимента; расстояния, имеющие большее отношение, оказываются несравнимыми.

5.4.2. Проверка трехспинового уравнения Если в нашем образце можно выделить изолированную трехспиновую систему, то очень полезно попробовать использовать уравнение (5.17). В качестве примера рассмотрим акриловую кислоту. Протон карбоксильной группы снова можно заменить на дейтерий и оставить чисто трехспиновую систему, дающую на частоте 500 МГц спектр первого порядка. Измерение ЯЭО в этой системе представляет собой интересную техническую проблему, поскольку резонансы разделены всего на 120 Гц, что затрудняет селективное облучение. При облучении мультиплетов первого порядка хорошо работает процедура последовательного насыщения линий [10]. Частота декаплера настраивается на одну из линий, и на короткое время включается слабое поле (несколько герц). Затем частота облучения переводится на следующую линию и т.д.; этот цикл выполняется в течение всего периода насыщения. Максимальное Tj акриловой кислоты в обезгаженном метаноле составляет около 10 с (протон Н х в формуле 3). При проведении эксперимента каждая линия мультиплета подвергается краткому облучению в течение 0,5 с, полный цикл для четырех линий составляет 2 с. Цикл повторяется 45 раз, и общая длительность периода насыщения получается равной 9 7^. Как видно из разностного спектра на рис. 5.21 (приведен только один из трех экспериментов), применение очень слабого радиочастотного поля позволяет добиться чрезвычайно высокой селективности. Полученные величины г| приведены в табл. 5.1 (обозначение протонов соответствует формуле 3). Таблица 5.1. Величины ЯЭО для акриловой кислоты (индексы протонов даны в соответствии с формулой 3) Облучается

А

М

X

ПА Лм г| х

0,360 0,140

0,340 -0,035

0,068 -0,015

Глава 5

182

Л

II

AMJ

\

I

6,4

I

6 , 3

Г

6 , 2

I

6 , 1

м. 8.

I

6 , 0

I

5 , 9

I

5 , 8

I

I

5 , 75 , 6

Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.

При использовании уравнения (5.17) для данных такого типа необходимо выбрать наиболее удобное для расчетов отношение межъядерных расстояний. В нашем примере каждый изомер характеризуется только одним геометрическим соотношением, но выразить его можно разными способами. Например, мы можем выбрать отношение межъядерных расстояний в цис- и транс-изомерах, а можем выбрать и отношение одного из них к геминальному расстоянию (г АМ в формуле 3). Такие варианты соответствуют перестановке индексов А, М, X в уравнении (5.17). Анализируя уравнение и типичные данные для таких систем, легко догадаться, что наиболее точный результат может быть получен при такой расстановке индексов, когда взаимодействия AM и АХ велики по сравнению с MX. Другая расстановка индексов (формула 4) поставит отношение межъядерных расстояний в зависимость от очень малой разности неточных величин, что внесет большую ошибку. НО2С

но2с

Итак, самым удобным для вычислений будет отношение расстояний между цис- и гем-протонами; исходя из длин связей, оно должно быть

Ядерный эффект Оверхаузера

183

1,30:1. Подставив нужные значения из табл. 5.1 в уравнение (5.17), мы получим 1,32:1. Это вполне удовлетворительный результат. Чтобы проиллюстрировать важность правильного выбора расстояний, попробуйте повторить расчеты с индексированием протонов по формуле 4. Вы будете сравнивать цис- и транс-расстояния; оценка их отношения с учетом длин связей составляет 0,79:1. Вычисленный по (5.17) результат должен значительно отличаться от этой величины. Объясняется это тем, что в системе преобладает взаимодействие MX, в то время как требующаяся информация содержится именно в разности взаимодействий AM и АХ. 5.4.3. Реальная задача При попытке использовать измерения ЯЭО для более интересных молекул, чем приведенные в предыдущем разделе, мы столкнемся с некоторыми трудностями. Вероятно, большое число взаимодействующих протонов сделает невозможным расчет межъядерных расстояний. Предположение о равных корреляционных временах для всех межъядерных векторов, на котором основаны такие расчеты, скорее всего вообще не выполняется для больших молекул, и мы не должны забывать об этом. Для того чтобы добиться успеха в определении структур сложных молекул, мы должны частично забыть о «двух основных принципах» из разд. 5.2.4. Мы будем считать, что наблюдаемая величина ЯЭО отражает относительную близость ядер, но при этом надо помнить, что в некоторых случаях наши выводы могут быть неверны. Попробуем решить реальную задачу. При длительном нагревании трипептида 5 с ферментом изопенициллин-1Ч-синтетазой (IPNS, схема 1) [11] из реакционной смеси выделяется соединение 6. Общая структура легко устанавливается при простом

анализе протонного спектра и подтверждается протонным двумерным корреляционным спектром (гл. 8). Задача состоит в выяснении стереохимии этого соединения и особенно в определении ориентации гидроксильной группы в семичленном цикле, которая частично определяется механизмом действия фермента. В более изученных циклических системах задачи такого типа легко решаются с помощью протон-протонных констант спин-спинового взаимодействия, но для подобных систем этих данных нет, и, кроме того, будет не так просто

184

Глава 5

^ ^ g j ^ < Vw,*-^vv*>«*-^^

I / WiV^-nPVv

t

. I ,J

-

llJ. AiiAA H

2b

H

2o

H

4b

Рис. 5.22. Эксперимент по измерению ЯЭО для соединения 6.

определить конформацию большого цикла. Однако на основании протонных констант мы можем утверждать, что два протона в четырехчленном цикле находятся в i/иоположении (как показано в формуле 6); это дает начальную информацию для построения эксперимента по ЯЭО. Прежде чем представить полученные величины ЯЭО, делающие отнесение структуры почти очевидным, мы коснемся некоторых практических трудностей, встретившихся при решении этой задачи. Изучаемое соединение малоустойчиво, а в ферментативной реакции в каждом опыте можно получить его в очень небольших количествах (не более 1 мг). Как хорошо видно из некоторых разностных спектров на рис. 5.22, такое количество вещества соответствует пределу чувствительности даже спектрометра на 500 МГц. Это значит, что регистрация ЯЭО требует большого количества времени работы спектрометра-порядка 15 ч на каждый эксперимент, а достаточную информацию о структуре можно получить только за несколько дней. Трудно описать в книге эту сторону спектральной работы. Простой перечень результатов и сделанных из них выводов придают эксперименту излишне сухой и аналитический вид. На самом же деле это настоящая борьба и настоящий подвиг. Еще одним следствием трудной доступности вещества оказывается низкая точность полученных величин ЯЭО. Величины, отличающиеся друг от друга менее чем в 2 раза, приходится считать неразличимыми. Результаты измерения ЯЭО на соединении 6 приведены на схеме 2.

Ядерный эффект Оверхаузера

185

RNH

Схема 2

Сначала рассмотрим эксперимент на протонах Н 2 а и Н 2 Ь (на схеме слева). Нашей точкой отсчета будет протон Н 7 , которому мы приписываем изображенную стереохимию и который, как известно, находится в i/мс-положении по отношению к другому протону (3-лактама. Заметный ЯЭО (5%) на Н 7 при облучении Н 2 а и нулевой эффект при облучении Н 2 Ь свидетельствуют о том, что Н 2 а также находится за плоскостью рисунка (см. формулу 6). (У авторов уже был большой опыт работы с Р-лактамными системами, поэтому такое отнесение не вызывало сомнений.) Как очевидно, Н 2 Ь находится по ту же сторону плоскости рисунка, что и Н 5 (3% ЯЭО). Это позволяет зафиксировать относительные конфигурации С 7 и С 5 . К сожалению, вопрос о конфигурации С 3 не так ясен. Похоже, что Н 2 а создает на Н 3 больший ЯЭО, чем Н 2 Ь , но низкая точность измерений и сложность спиновой системы делают рискованным отнесение конфигурации по этим данным. Только что описанные эксперименты были выполнены в первой серии измерений, и задача, таким образом, осталась нерешенной. Спустя некоторое время была проделана вторая серия измерений с облучением протонов Н 4 а и Н 4 Ь (на схеме 2 справа), которые полностью прояснили структуру. Прежде всего большие величины ЯЭО на Н 5 и Н 3 при облучении Н 4 Ъ свидетельствуют об их сходном положении, а поскольку Н 5 уже связан с Н 2 Ь , можно утверждать, что гидроксильная группа находится за плоскостью рисунка. Конфигурация С 4 была подтверждена взаимодействием Н 4 а и Н 7 , также свидетельствующим о предложенной конфигурации цикла. Таким образом, установленная стереохимия соответствует формуле 7. Позже она была подтверждена обратной картиной взаимодействия протонов при С 2 с протоном Н 3 в изомерном веществе 8.

СО 2 Н

СО 2 Н

Из этого примера можно сделать важный вывод: почти всегда имеет смысл измерять все возможные ЯЭО. Даже если вам кажется, что еще

186

Глава 5

один эксперимент будет пустой тратой времени, все-таки проделайте его - ведь он не потребует больших дополнительных усилий. Не думайте, что вы сможете заранее предсказать его результаты. Например, взаимодействие Н 4 а и Н 7 в веществе 6 оказалось неожиданным и принесло полезную информацию. Чем- больше можно получить информации, подтверждающей гипотетическую структуру, тем лучше, поскольку ошибки в интерпретации данных по ЯЭО встречаются гораздо чаще, чем в других областях ЯМР.

5.4.4. Гетероядерный ЯЭО До сих пор мы занимались только гомоядерным ЯЭО и упомянули гетероядерный эффект только как источник повышения чувствительности на ядрах со спином 1/2 и малым у. ЯЭО между протоном и гетероядром может быть информативен и в селективных экспериментах, позволяя 13 преодолеть некоторые технические трудности. Возьмем, к примеру, С . Релаксация протонированного углерода происходит в основном за счет непосредственно связанных с ним протонов, и в этом случае ЯЭО не будет интересен - информацию легче получить с помощью развязки или двумерной гетероядерной корреляции химических сдвигов. Очень интересный момент состоит в том, что часто можно избежать создания прямого ЯЭО, поскольку он получается при насыщении не основного протонного сигнала, а его 13С-сателлитов. На практике обычно удается облучать центральную 12 С-линию, не задевая сателлитов, поскольку прямые константы протон-углеродного взаимодействия довольно велики. В этом случае мы должны увидеть ЯЭО только на четвертичных углеродах, связанных с тем атомом углерода, протоны которого облучались. Этот эксперимент может дать совершенно необычную стереохимическую информацию. Важнейшая проблема таких экспериментов-чувствительность. Она осложняется еще и тем, что спектры необходимо регистрировать с широкополосной развязкой от протонов, поэтому между прохождениями приходится делать значительные задержки, чтобы все ненужные ЯЭО успели исчезнуть, а нужные-появиться. Задержки должны быть в несколько раз больше Tt четвертичных углеродов, которые часто превышают 10 с. Тем не менее, используя концентрированные образцы и не жалея времени спектрометра, можно получить очень полезные результаты. На рис. 5.23 этот принцип проиллюстрирован на примере третбутильной группы. Внизу приведен спектр, полученный без ЯЭО с большой задержкой между прохождениями. Более сильнопольный метальный сигнал, как и ожидалось, в 3 раза интенсивнее сигнала четвертичного углерода. В разностном спектре (вверху), полученном при облучении протонов метальных групп (только 12С-линии), мы видим 80% ЯЭО на четвертичном углероде и отсутствие ЯЭО на метильном сигнале. Такая большая величина вполне нормальна, поскольку максимальный ЯЭО на углероде при насыщении протонов составляет 200%.

Ядерный эффект Оверхаузера

3*

38

34

32

30

2*

187

2t

Рис. 5.23. Селективный гетероядерный ЯЭО для соединения с го/>е/я-бутильной группой. Мультиплет в слабом поле принадлежит растворителю. По причине недостаточной чувствительности такие эксперименты пока не нашли широкого применения. Тем не менее в литературе появляются отдельные примеры (см. [12-15]). В будущем они станут, видимо, более обычными, поскольку получаемая с их помощью информация труднодоступна другими путями. Литература 1. Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ.-М.: ИЛ, 1963. 2. Noggle J.H., Schirmer R.E., The Nuclear Overhauser Effect - Chemical Applications, Academic Press, 1972. 3. Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd edn., Elsevier, 1984. 4. Bothner-By A. A., Stephens R. L., Lee J., Warren С D., Jeanloz R. W., J. Amer. Chem. Soc, 106, 811-813 (1984); Bax A., Davis D.G., J. Mag. Res., 63, 207-213 (1985). 5. Bell R. A., Sounders J.K.M., Can. J. Chem., 48, 1114-1122 (1970). 6. MershJ.D., Sounders J.K.M., Prog. NMR Spec, 15, 353-400 (1982). 7. Примеры использования нестационарного ЯЭО для решения структурных задач: Heatley F., Akhter L., Brown R. Т., J. Chem. Soc. Perkin II, 919-924 (1980). 8. VoldR.L., VoldR.R., J. Mag. Res., 55, 78-87 (1983). 9. Shaka A.J., Bauer C.J., Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984). 10. Kinns M., Sounders J.K.M., J. Mag. Res., 56, 518-520 (1984). 11. Baldwin J. E., Adlington R. M., Derome A. E., Ting H.-H., Turner N. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1211-1214 (1984). 12. Kover K.E., Batta G., i. Chem. Soc. Chem. Commun., 647-648 (1986). 13. Kover K. E., Batta G., J. Amer. Chem. Soc, 107, 5829-5830 (1985) и ссылки в этой работе. 14. Aldersley M.F., Dean F.M., Mann B.E., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 107-108 (1983). 15. Leeper F.J., Staunton J., J. Chem. Soc Chem. Commun., 911-912 (1982).

Глава 6

Перенос поляризации и редактирование спектров 6.1. Введение По общему мнению, спектроскопия ЯМР-идеальный аналитический метод для решения химических задач: ЯМР имеет высокое разрешение, и его параметры (химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия) связаны с химическими представителями об электронной структуре и топологии молекул вполне прямым и понятным путем. Но основной ее недостаток-это невысокая чувствительность. Слишком часто от ЯМР-спектроскопистов можно услышать слова: «Вот если бы у вас было еще 50 мг вещества...» Низкая чувствительность объясняется тем, что в существующих магнитных полях энергия ядерных переходов настолько мала, что они оказываются не так далеки от насыщения даже при комнатной температуре. При проведении ЯМР-эксперимента прибор должен регистрировать очень тонкое различие заселенностеи энергетических уровней. Вообще эти переходы заметны только благодаря наличию резонансных условий. Недостаток чувствительности существенно снижает достоинства ЯМР, поскольку уже сейчас можно без больших преувеличений утверждать, что при наличии неограниченного количества любого вещества с молекулярной массой не более, скажем, 3000 единиц, можно подобрать такую последовательность ЯМР-экспериментов, которая с очевидностью установит его структуру. Но, к сожалению, интересующие нас вещества редко доступны в неограниченных количествах. Любой метод повышения чувствительности чрезвычайно важен для ЯМР. Именно поэтому химики сегодня с радостью покупают магниты, которые в 10 раз дороже, чем двадцать лет назад. Повышение напряженности поля постоянных магнитов - прямой способ увеличения интенсивности сигналов ЯМР. Однако прогресс в этом направлении неизбежно имеет определенный предел. Современная технология производства стационарных постоянных сверхпроводящих магнитов (в отличие от магнитов, создающих мощные поля на короткие промежутки времени) позволяет получать напряженности полей, соответствующие протонным переходам на частотах 500-600 МГц. Прогресс в этом направлении пока еще не остановился, технология продолжает совершенствоваться, но трудно предположить возможность увеличения напряженности поля на несколько порядков. Даже если бы это и было достижимо, дальнейшее увеличение напряженности поля оказалось бы бессмысленным по ряду

Перенос поляризации и редактирование спектров

189

других причин. Например, с ростом поля мы быстро приближаемся к такой ситуации, когда обычное молекулярное движение становится медленным в шкале времени ЯМР. Повышения чувствительности можно добиваться и с помощью других технических новшеств, как, например, использование криогенных датчиков [1], однако здесь также обязательно существует предел. Практическим критерием эффективности спектроскопии ЯМР с точки зрения чувствительности служит ее способность анализировать такие количества вещества, с которыми обычно имеют дело химики. В настоящее время это количество составляет примерно 1 мг при использовании обычной хроматографической техники или несколько микрограммов при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это количество вещества химики уже «чувствуют». Вещество становится невидимым при уменьшении его количества, и с ним трудно обращаться. Биологи же, напротив, часто могут определить присутствие вещества по его биологической активности, поэтому микрограммовые количества считаются достаточными для работы. Мы будем использовать компромиссную величину 100 мкг в качестве наименьшего доступного количества вещества. Какие ЯМР-эксперименты можно провести с таким образцом на современных спектрометрах с не самой высокой напряженностью поля? К сожалению, их не так много. Мы можем зарегистрировать протонный спектр (а также спектр на фторе и экзотическом тритии). Сможем, вероятно, провести некоторые эксперименты по ЯЭО и зарегистрировать протонный спектр COSY (гл. 8), хотя это и потребует много времени. С другими ядрами дело обстоит сложнее. На очень сильнопольных спектрометрах, возможно, удастся зарегистрировать спектр ядра 3 1 Р и, поставив накопление в микроячейке на субботу и воскресенье, спектр 13 С с широкополосной развязкой от протонов. Если же мы-химикинеорганики и хотим получить спектры низкочастотных металлов, то без увеличения количества вещества в сотни раз у нас не будет никакой надежды на успех. Вообще, протон-это единственное ядро, позволяющее проводить ЯМР-эксперименты с такими количествами вещества, которые обычно имеются в распоряжении химика. Для наблюдения других ядер необходимо получать его в больших количествах. Возможность переноса этого замечательного свойства протонов на другие ядра была бы очень важна. В этой главе мы сначала рассмотрим очень старый эксперимент SPI и на его примере установим необходимые для такого переноса законы. В двух других разделах мы обсудим два наиболее общих эксперимента по переносу поляризации: INEPT и DEPT. Первый из них интересен по двум причинам. Во-первых, он был разработан первым и способствовал быстрому прогрессу в этой экспериментальной области, и, во-вторых, он более удобен для изложения с помощью нашего иллюстративного метода. DEPT же в большей степени подходит для практических применений и излагается в основном с этой точки зрения: понять его механизм в деталях невозможно без

190

Глава 6

привлечения концепции многоквантовой когерентности, которую мы рассмотрим в гл. 8.

6.2. Селективный перенос заселенности Как это ни странно, метод, позволяющий перенести интересующие нас свойства протонов на другие ядра, известен уже много лет под названием селективного переноса заселенности SPT (Selective Population Transfer) или, что более точно соответствует нашему эксперименту, селективной инверсии заселенности SPI (Selective Population Inversion). Для того чтобы понять происходящие в нем процессы, мы должны подробнее рассмотреть уровни энергии спиновой системы и их заселенности. Мы проанализируем систему АХ, которую можно представлять себе состоящей из протона и ядра 1 3 С , но это может быть и любая другая пара ядер со спином 1/2. На рис. 6.1 изображена диаграмма энергетических уровней этой системы и спектры каждого из ядер. Мы остановимся на нескольких существенных деталях рисунка. Энергии протонных и углеродных переходов переданы в масштабе. Ларморова частота протонов в 4 раза выше частоты углерода, поэтому протонные переходы имеют в 4 раза большую энергию. Различия энергий двух переходов (Hj и Н 2 , С х и С 2 ), обусловленные спин-спиновым взаимодействием, настолько малы в сравнении с общей энергией, что в масштабе диаграммы не видны. Нас больше интересует разность заселенностей по каждому из переходов. В условиях теплового равновесия, которое наблюдается в начале эксперимента, разность заселенностей по протонным переходам должна в соответствии с законом Больцмана в 4 раза превышать разность по углеродным переходам. Будем обозначать эти разности 2АН и 2ДС, тогда АН = 4АС. Реальная заселенность каждого уровня и, следовательно, численные величины разностей зависят от

Рис. 6.1. Энергетические уровни гетероядерной системы АХ и их заселенности.

Перенос поляризации и редактирование спектров

191

общего числа присутствующих ядер N. Но нам удобнее пользоваться не собственно заселенностями уровней, а их отличием от JV/4 (этот прием мы уже использовали для двухуровневой системы в разд. 4.2.6 гл. 4 и для гомоядерной двухспиновой системы в разд. 5.2.2 гл. 5); именно эти значения и приведены на диаграмме. Теперь мы уже можем кое-что сказать об относительных интенсив13 ностях сигналов С и ' Н в нашей системе. Избыток заселенности по протонным переходам в 4 раза больше углеродного, кроме того, протонный магнитный момент в 4 раза превышает углеродный (поскольку он пропорционален у); следовательно, воздействие я/2-импульса на протоны создает в 16 раз большую поперечную намагниченность, 13 чем в случае С . Сигнал, наводимый в катушках приемника прецессией этой намагниченности, пропорционален скорости самой прецессии (в 4 раза большей у протонов). Таким образом, регистрируемый сигнал протонов будет в 64 раза интенсивнее сигнала углерода (т. е. в общем случае интенсивность сигнала ЯМР ядер с гиромагнитным отношением 3 у пропорциональна у ). Помимо этого, низкое природное содержание 13 изотопа С уменьшает сигнал еще примерно в 100 раз, но это уже несущественно для нашего обсуждения. Мы можем считать, что рабо13 таем с веществом, обогащенным изотопом С . Именно по причине пропорциональности сигнала ЯМР величине у 3 наблюдение протонов оказывается наиболее удобным. Следующее за ними ядро, представляющее широкий интерес (в отличие от ядер 1 9 F , 3 Н, 3 Не и двух изотопов таллия, не представляющих интереса),-это 3 1 Р , имеющее у, в 2,5 раза меньшее, чем у протонов, что приводит к 16-кратному понижению чувствительности, т. е. к увеличению в 256 раз времени накопления спектра для получения того же отношения сигнал/шум в предположении равных скоростей релаксации. Если же взять, например, родий ( 1 0 3 Rh) с у, составляющим только 3% от Х Н, то мы получим снижение чувствительности в 32 тысячи раз, несмотря на 100%-ное природное содержание этого ядра. Эксперимент по SPI позволяет очень простым способом сделать зависимость от у только квадратичной. Наша система дает спектр первого порядка, поэтому каждая наблюдаемая в нем линия соответствует переходу отдельного ядра. Теперь представим себе, что одна из протонных линий подверглась воздействию селективного тс-импульса, в результате чего заселенности по соответствующему переходу инвертировались. На практике это достигается при использовании достаточно низкой мощности радиочастотного поля протонного декаплера, например импульса длительностью 20 мс при амплитуде поля 25 Гц. На рис. 6.2 изображено состояние системы после селективной инверсии заселенности. Оно отличается от равновесного только тем, что заселенности по переходу Н1 поменялись местами. Но посмотрите, что произошло с разностями заселенностей. Их величины по протонным переходам не изменились, не считая того, что одна из разностей поменяла знак. По углеродному же переходу С1, где разность раньше

192

Глава 6

Рис. 6.2. Новые заселенности после инверсии одного из протонных переходов.

составляла 2 АС, теперь мы получаем (АН + АС) — ( — АН — АС) или 2АН + 2АС. По переходу С 2 , наоборот, получаем ( — АН + АС) — (АН — — АС) или —2АН + АС. Таким образом, мы перенесли протонные разности заселенностей на углеродные переходы и прибавили их к существующим разностям! Если сразу после этого подействовать на углеродную намагниченность тс/2-импульсом и зарегистрировать сигнал, то мы получим дублет с интенсивностями компонент + 5 и —3 (относительно интенсивности сигналов при прямом наблюдении без селективной инверсии), поскольку АН = 4АС. Так как один из переходов получает отрицательный вклад от протонов, а другой-положительный, то говорят, что суммарный перенос намагниченности отсутствует, но наблюдается разностный перенос поляризации. Заметим, наконец, что полная инверсия заселенностей не обязательна, достаточно будет любого неравного их возмущения. Именно в такой ситуации возникает SPT-эффект, обсуждавшийся в разд. 5.3.3 гл. 5. На рис. 6.3 представлен результат эксперимента SPI. Существует несколько проблем, связанных с экспериментом SPI. Первая-это его селективность; при выполнении эксперимента нам придется инвертировать не сами протонные линии, а их 13 С-сателлиты. Кроме того, SPI не может использоваться для получения спектров с развязкой от протонов, поскольку включение декаплера приведет к частичной компенсации противофазных линий, т.е. восстановлению нормальных интенсивностей. Таким образом, эксперимент SPI интересен не сам по себе. Он важен тем, что открывает путь к целому классу

Перенос поляризации и редактирование спектров

100

°

гц

193

Рис. 6.3. Эксперимент SPI, выполненный для хлороформа: а-инвертирование сателлита в слабом иоле; б-инвертирование сателлита в сильном поле; в-нормальныйй спектр.

f6

-°

более общих методов переноса поляризации, разработанных после 1980 г. Обсуждаемые в этой главе эксперименты обычно осуществляют перенос поляризации от одного ядра к другому, сопровождающийся аз увеличением интенсивности регистрируемого сигнала в 4jy2 Р -

6.3. INEPT 6.3.1. Введение Основная идея. Основное ограничение эксперимента SPI-это недостаточная общность. Если мы найдем какой-либо способ поляризации всех протонных переходов независимо от частоты, то мы, очевидно, получим многообещающий эксперимент. Мы должны предложить такую последовательность импульсов, которая, как и SPI, придает парам протонных переходов противоположные фазы, но делает это с помощью неселективных импульсов и независимо от химических сдвигов. Такая последовательность может использовать спиновое эхо для ориентации компонент дублетов вдоль различных осей: S: I:

(к/2)х - т - кх - т - (я/2), пх (я/2),

Выборка...

В этой записи, которая была приведена в первом сообщении об эксперименте INEPT [2] (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer низкочувствительные ядра, усиленные с помощью переноса поляризации), буква S (sensitive) обозначает чувствительные ядра, т. е. дающие мощный сигнал, a I (insensitive)-низкочувствительные со слабым сигналом (в нашем случае ' Н и 1 3 С соответственно). К сожалению, не все авторы придерживаются этого обозначения, и во многих публикациях можно встретить использование буквы I для ядра, с которого переносится поляризация, и буквы S для ядра, на которое она переносится. Конечно, это совершенно произвольное обозначение, но от авторов 13-75

194

Глава 6

US, -

h

-

«г

к Рис. 6.4. Последовательность INEPT для системы АХ.

можно было бы ожидать большей последовательности. Везде в этой главе буквой S будут обозначаться ядра, с которых переносится поляризация, и буквой I-ядра, на которые она переносится (независимо от того, какое из них чувствительнее). Мы легко можем проанализировать воздействие приведенной выше последовательности на систему АХ с константой J (рис. 6.4). Задержка т выбирается равной 1/4/, и компоненты дублета (прецессирующие во вращающейся системе координат с частотой +J/2 Гц) успевают за это время пройти 1/8 полного цикла. я-Импульс на частоте ядра S переносит эти компоненты во вторую половину плоскости х-у, а импульс на частоте ядра I предохраняет его от рефокусировки с помощью изменения направления прецессии. Во время второй задержки т химические сдвиги и неоднородность поля рефокусируются, и в дальнейшем их можно не учитывать. В конце второй задержки компоненты дублета ядра S находятся на осях ±х. Два заключительных я/2-импульса на ядрах S и I обычно производятся одновременно, но для облегчения понимания мы будем считать, что сначала производится S-импульс. Будучи (я/2)у-импульсом, он помещает находящиеся на осях +х компоненты на ось z: одна из них оказывается направленной вверх, а другаявниз. В результате мы получили требующуюся противофазную ориентацию компонент дублета и после я/2-импульса на ядре I можем регистрировать более интенсивный сигнал, как и в случае SPI (рис. 6.5). Исходная намагниченность ядра I. При воздействии на систему последовательностей SPI и INEPT перенесенная разность заселенностей накладывается на уже существующую разность по переходам ядра I. По этой причине интенсивности регистрируемых положительных и отрицательных сигналов не равны и в случае дублета 1 3 С составляют + 5 и —3. Во многих применениях переноса поляризации такое влияние исходной намагниченности переходов ядра I оказывается нежелательным, поэтому требуется принимать какие-то меры для его исключения. Существует несколько способов, позволяющих устранить влияние

Перенос поляризации и редактирование спектров

195

I i 95

90

85

80

I

75

70

Рис. 6.5. INEPT позволяет получить на всех дублетах эффект, который SP1 позволяет только на одном.

исходной намагниченности. Поскольку поляризация ядра I не требуется на протяжении всей последовательности, его можно, например, насытить до начала эксперимента. Для этого подойдут широкополосное облучение (но оно обычно недоступно на отличных от протонов ядрах), один или несколько я/2-импульсов на частоте I или создание градиента поля Во вслед за тг/2-импульсом (т.е. нарушающий однородность импульс - homospoil pulse). В разд. 6.4.6 мы обсудим эксперимент по переносу поляризации, использующий предварительное насыщение, но в обычных случаях при переносе поляризации с протонов на низкочастотные ядра предварительное насыщение не требуется. Исходную намагниченность ядра I можно нейтрализовать с помощью фазового цикла, поскольку она не так велика по сравнению с переносимой поляризацией. В таком цикле должна изменяться фаза заключительного я/2-импульса на частоте ядра S (обычно протонов). Замена (я/2)у на (я/2)_у поменяет знак протонной поляризации; это значит, что те компоненты дублета, которые раньше были направлены по оси +z, теперь окажутся на оси — z и наоборот (рис. 6.6). В результате компонента намагниченности ядра I, обусловленная перенесенной поляризацией, будет противоположной, и для правильной ее регистрации необходимо изменить фазу приемника. Исходная же поляризация спина I создает сигнал с постоянной фазой (просто сигнал ядра I после я/2-импульса), поэтому

Глава 6

196 (~

состоят*'Н перед последним им

4f), РИС. 6.6. Подавление исходной намагниченности ядра I при чередовании фазы заключительного импульса ядра S.

1

1

1 100

1

1

а

гц

1

I -100

'

1

'

1 100

1

1 0 Гц

'

1 -МО

'

13

Рис. 6.7. Спектры INEPT ядра С без использования (левый) и с использованием (правый) подавления исходной намагниченности. перемена фазы приемника полностью его нейтрализует. Обычно такое вычитание позволяет уменьшить интенсивность нежелательных сигналов в несколько сот раз, чего вполне достаточно при переносе поляризации с протонов на гетероядра (рис. 6.7). INEPT с рефокусировкой. Спектры последовательности INEPT не могут быть получены с применением развязки от протонов, поскольку компоненты мультиплетов имеют противоположные фазы. Однако этот недостаток легко преодолеть с помощью небольшой задержки А перед выборкой данных. Правильный выбор длительности А позволяет компонентам спиновых мультиплетов снова стать синфазными, например

197

Перенос поляризации и редактирование спектров

°с

~

47

Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки широкополосную развязку. для дублетов требуется Д = 1/2J (рис. 6.8). Чтобы предотвратить влияние различия химических сдвигов, понадобится дополнительное спиновое эхо в виде я-импульса посредине задержки: 1

1

/*\

A

A к

&

Выборка (±х).

Эта последовательность известна под названием INEPT с рефокусировкой. Она обладает очень интересными свойствами с точки зрения изменения длительности А (разд. 6.3.3), но пока при получении спектров с развязкой от протонов (рис. 6.9) мы будем считать А постоянной. В отличие от дублетов, для которых оптимальная задержка составляет 1/2J, другим мультиплётам нужны другие величины А (см. табл. 6.2 в разд. 6.3.3), поэтому при наличии в спектре различных мультиплетов необходимо выбрать некоторое компромиссное значение. Для случая

ей1

' А ' 4 "-Jo'

' 'кЬ' J '-«'

ЮО

О -KB

г« Рис. 6.9. Различные спектры хлороформа. В спектре INEPT с рефокусировкой можно заметить некоторое уменьшение интенсивности в сравнении с простым INEPT; это частично объясняется поперечной релаксацией во время периода рефокусировки и частично-неидеальностью импульсов. ГЦ

ГЦ

198

Глава 6

углеродных спектров, которые могут состоять только из дублетов, триплетов и квартетов, подойдет величина 0,3/JCH- НО поскольку сама константа J C H может изменяться, такая задержка, конечно, не идеальна.

6.3.2. Характеристики спектров INEPT Влияние на чувствительность. Повышение чувствительности для ядер I в ys/y, раз, т.е. замена зависимости интенсивности наблюдаемого 2 сигнала вида у на у -фундаментальное свойство последовательности INEPT. Однако это не такое уж и большое повышение, поскольку получаемую интенсивность правильнее будет сравнивать не с равновесной для сигналов ядер I, а с сигналом, полученным в условиях развязки от протонов. Широкополосная развязка от протонов будет повышать интенсивность сигнала за счет ЯЭО, который также зависит от отношения гиромагнитных постоянных. Правильное сравнение будет выглядеть так: INEPT*: ЯЭО:

I = I0 / =J

7s Yi

2Y,

Здесь буквой / обозначается интенсивность усиленного сигнала, а / 0 - интенсивность сигнала без усиления (обычно величина ЯЭО оценивается через коэффициент усиления ц, а не через конечную интенсивность сигнала; в этой главе буквой / будет обозначаться именно конечная интенсивность, за исключением тех случаев, где это специально оговаривается). Важно отметить, что интенсивность сигнала последовательности INEPT зависит от модуля отношения гиромагнитных постоянных, в то время как ЯЭО зависит и от его знака. Таким образом, ЯЭО между протонами и ядром с отрицательным у может вызывать не увеличение интенсивности, а, наоборот, ее понижение; если величина г| окажется близкой к — 1, то сигнал может исчезнуть вообще (разд. 5.2.4 гл. 5). Вскоре мы вернемся к этой проблеме. Проводя сравнение спектров, полученных с помощью INEPT, и спектров с полным ЯЭО, мы должны также учитывать релаксационные свойства ядер. Для эксперимента по ЯЭО важна величина Тх наблюдаемых ядер, в то время как в эксперименте INEPT на интенсивность конечного сигнала оказывает влияние только разность заселенностей ядра S, обычно протонов, и именно их Ti определяет частоту повторения прохождений. В результате частота прохождений в эксперименте INEPT не зависит от Tj ядра I, что на практике часто оказывается важнее, чем сам перенос поляризации. * Такое соотношение достигается при наличии одного ядра S. При другом количестве ядер S коэффициент усиления слегка изменится (см. табл. 6.2).

Перенос поляризации и редактирование спектров

199

Таблица 6.1. Сравнение интенсивностей сигналов при прямом наблюдении гетероядра в условиях полного ЯЭО со стороны протонов с результатом переноса поляризации с протонов на гетероядро. Приведенные значения вычислены относительно интенсивности сигнала при прямом наблюдении ядра без ЯЭО Ядро

Максимальный ЯЭО

Перенос поляризации

31р

2,24 2,99 -1,52 -3,94 16,48 - 14,89

2,47 3,98 5,03 9,87 30,95 31,78

"С 29

Si

15

N

"Fe

103

Rh

Теперь мы можем рассмотреть реальные случаи. В табл. 6.1 сравниваются теоретические интенсивности сигналов некоторых ядер в спектрах INEPT (по отношению к равновесным величинам без ЯЭО) с интенсивностями при максимальном ЯЭО. Как мы видим, результаты довольно близки, хотя нельзя забывать о том, что условия эксперимента иногда не позволяют использовать INEPT и реализовать максимальный ЯЭО. Величина ЯЭО зависит от величины вклада ядер S в релаксацию ядра I по механизму диполь-дипольного взаимодействия, поэтому в зависимости от обстоятельств ЯЭО может быть небольшим или вообще отсутствовать, а в случае ядер с отрицательным у он может оказаться близким к — 1 , что приведет к нулевой интенсивности сигнала. В таких случаях INEPT будет намного эффективнее даже без учета увеличения частоты повторения прохождений. Однако для атомов 1 3 С , связанных с протонами, чаще бывает характерен полный ЯЭО, а их времена релаксации ненамного превышают времена релаксации связанных протонов, поэтому использование INEPT с рефокусировкой, вероятно, не даст существенных преимуществ при регистрации спектров с развязкой от протонов. Для получения неразвязанных спектров, где ЯЭО отсутствует, использование переноса поляризации может оказаться очень полезным; к этому вопросу мы вернемся в дальнейшем. В полной мере преимущества INEPT реализуются на ядрах с очень большим ^ я в особенности на ядрах с отрицательным у. Распространенные ядра, обладающие такими свойствами,-это 2 9 Si и 1 5 N . Рассмотрим гипотетическое вещество, содержащее ядро 1 5 N и связанные с атомом азота протоны. Даже при наличии полного ЯЭО (относительная интенсивность —4) эксперимент INEPT будет в 2 раза эффективнее (относительная интенсивность 10). Помимо этого, величина 7\ азота может составлять 32 с, в то время как 7\ протонов-порядка 2 с. В результате за один и тот же промежуток времени мы сможем получить

200

Глава 6

в эксперименте ШЕРТ в 16 раз больше прохождений, чем при непосредственном наблюдении азота, что приведет к дополнительному четырехкратному повышению отношения сигнал/шум. Таким образом, в реальной ситуации с помощью INEPT мы легко можем добиться 10-кратного повышения чувствительности на ядре 1 S N (рис. 6.10; см. также рис. 6.14 с примерами спектров 2 9 Si). Сочетание этих двух достоинств эксперимента INEPT создает широкие возможности для наблюдения низкочастотных, медленно релаксирующих ядер. Другая область, где повышение чувствительности позволяет получать новые результаты,-это спектроскопия ЯМР на ядрах переходных металлов. Для многих комплексных соединений из спектров металлов можно извлечь очень ценную информацию, но чрезвычайно низкая чувствительность и малое природное содержание ядер со спином 1/2, таких, как 1 0 3 R h или 1 0 9 Ag, создают серьезные трудности при измерениях их спектров ЯМР. Для переноса поляризации требуется наличие значительной константы взаимодействия протон-металл, которая не всегда присутствует в реальных комплексах. Однако почти всегда есть константа взаимодействия с ядром 3 1 Р , обусловленная широкой распространенностью фосфиновых лигандов. Обычно отношение yfhmclai довольно велико, и перенос поляризации в этих условиях оказывается очень эффективным. На рис. 6.11 сравниваются спектры прямого наблюдения родия со спектрами переноса поляризации с фосфора на родий

Рис. 6.10. Различные способы регистрации спектров " N . В нижней части рисунка приведены спектры с полной релаксацией (одинаковое число прохождений), а1 5в верхней-с частотой повторения, оптимизированной по соответствующему ( N или 1 Н) времени Г, (одинаковое время регистрации). В использованном соединении (фталимиде) имеется протон, непосредственно связанный с азотом, поэтому время релаксации 1 5 N сравнительно невелико (примерно в 2 раза больше, чем протона). Для азота, не связанного непосредственно с протонами, но все же имеющего с «ими заметную константу спин-спинового взаимодействия, можно ожидать еще большего увеличения интенсивности.

Перенос поляризации и редактирование спектров

201

INEPT

нормальный спектр

^480,0

I

-5dO,O

-S20.0

-540,0

-560,0

-5*1,0

и. а.

Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 1 0 3 Rh при переносе поляризации с 3 1 Р . (С любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Broker Spectrospin, и д-ра Тевиссена с сотрудниками, фирма ITC-TNO, Утрехт, Нидерланды.) с помощью последовательности INEPT. Мы видим, что спектры, казавшиеся ранее недоступными, теперь можно получить достаточно просто. К сожалению, выпускаемые промышленностью спектрометры очень редко оборудуются для таких экспериментов (необходимы датчик, настраивающийся одновременно на две Х-частоты, и двухканальный широкополосный передатчик), но в будущем ситуация несомненно изменится. Влияние иа спектры без развязки. В спектрах INEPT, полученных без рефокусировки и развязки, мультиплетная структура сохраняется, но их вид становится совсем необычным. Дублеты, как мы уже видели, представляются парами линий в противофазе. Можно показать, что триплеты теряют свою центральную линию и дают сигналы с интенсивностями — 1 : 0 : 1 , а квартеты имеют структуру — 1: — 1:1:1 (в гл. 8 вы увидите, что эти интенсивности, так же как и кросс-пики эквивалентных ядер в спектрах COSY, соответствуют правилу «противофазного треугольника»). Такую мультиплетную структуру можно считать как полезной (рис. 6.12), так и вредной, отвлекающей внимание. Описанная в разд. 6.4 последовательность DEPT позволяет получать спектры без развязки с нормальной мультиплетной структурой.

Глава 6

202

Т

so

I

«5

to

I 55

I

30

I 25

20

Рис. 6.12. Структура мультиплетов в спектрах INEPT без развязки.

6.3.3. Задержка Получение оптимальной чувствительности. Исследуем более тщательно роль задержки А в последовательности INEPT с рефокусировкой. Сначала рассмотрим условия получения оптимальной интенсивности сигналов в спектре с развязкой. Как мы уже видели в разд. 6.3.1, величина 1/2J, подходящая для дублетов, совершенно не подойдет для триплетов (рис. 6.13). В конце периода задержки компоненты триплета окажутся в противофазе, что приведет к исчезновению сигнала при включении декаплера. Та же картина будет наблюдаться и для всех остальных мультиплетов, поэтому спектры, полученные с задержкой А = 1/2J, будут содержать только дублеты спиновых систем IS. С помощью несложных вычислений [3] мы получаем, что для произвольной спиновой системы IS,, оптимальное значение А последовательности INEPT с рефокусировкой и развязкой равно (6.1) В табл. 6.2 приведены некоторые величины А и соответствующие им коэффициенты усиления сигнала, зависящие от числа ядер п. Во многих 13 случаях переноса поляризации на ядра, отличные от С , в спектрах

Перенос поляризации и редактирование спектров

203

максимальный

Эубпащ

' 4J '

•

*

-

-

Рис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефокусировки последовательности INEPT-основа для редактирования спектров.

Таблица 6.2. Оптимальные значения Д (в единицах 1/J) и соответствующее им усиление (в единицах Ys/y,) для последовательности INEPT с рефокусировкой при переносе поляризации с и ядер со спином 1/2

Д(х 1/J) £ ( х Ys/r,)

0,5 1,0

0,25 1,0

0,196 1,15

0,167 1,30

0,148 1,43

0,134 1,55

встречается только один тип мультиплетов, что позволяет выбрать оптимальную величину А. Например, спектр 2 9 Si широко распространенной триметилсилильной группы лучше всего получать с помощью INEPT с задержкой Д, соответствующей и = 9 (рис. 6.14). Редактирование спектров. Изменение величины А позволяет определить число ядер S, связанных с ядром 1, т. е. провести редактирование спектра в соответствии с мультиплетностью его сигналов. Например, в спектроскопии 13С можно получить отдельные спектры для групп СН, СН 2 и С Н 3 . Информацию, получаемую из неразвязанных спектров таким образом, мы можем получить в условиях широкополосной развязки, повышающей как чувствительность, так и разрешение. Вскоре мы рассмотрим практические способы регистрации таких спектров с помощью последовательности DEPT (разд. 6.4.3), но основные принципы легче изучить на примере INEPT. Пусть 9 - угол, определяемый условием 8 = к JA. Проанализировав прецессию компонент мультиплетов групп СН, СН 2 и СН 3 во время

Глава 6

204

INEPT

-JL» SO

О

-SO

разАяшм иЯЭО

SO

50

-so

о

-50

Гц г» 29 Рис. 6.14. Спектр INEPT ядра Si с переносом поляризации с ' Н демонстрирует отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с оптимальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).

задержки Л, мы можем выразить интенсивность сигнала каждой группы (в условиях развязки) как функцию угла 6: СН: /ос sin 9 СН 2 : /ос sin20 (6.2) СН 3 :

/ ос - (sin 0 +sin 30) 4 Легко видеть, что рассмотренный ранее случай (Л = 1/2J, т. е. 0 = л/2) согласуется с этими формулами. Чтобы выделить сигналы углеродов трех различных типов, необходимо зарегистрировать три спектра с такими задержками Л, чтобы соответствующие им углы 0 были равны л/4, л/2 и Зл/4. В табл. 6.3 приведены относительные интенсивности каждой группы в таких спектрах. Таблица 6.3. Относительные интенсивности сигналов при редактировании спектров СН ж/4 к/2 Зя/4

Чу/г 1

Чу/г

СН, 1 0 -1

СН,

3/2^2 О 3/2^2

Важность этих величин станет понятнее после анализа некоторых спектров (рис. 6.15). Спектр 0 = л/4 содержит сигналы всех групп, спектр 0 = л/2-только групп СН, а спектр 0 = Зя/4 опять содержит все резонансы, но сигналы групп С Н 2 инвертированы. Как мы вскоре увидим, складывая и вычитая эти спектры определенным образом, можно получить подспектры групп СН, С Н 2 и С Н 3 .

Перенос поляризации и редактирование спектров

SO

45

40

55

30 25 м.З.

20

И

205

10

Рис. 6.15. Вид сигналов групп СН, С Н 2 и С Н 3 при редактировании спектров.

Как раз из таких манипуляций с фазами и интенсивностями сигналов и состоит редактирование спектров. В нем вообще нет ничего необычного. Механизм изменения фазы в последовательности DEPT будет менее понятен (поскольку в нем используется концепция гетероядерной многоквантовой когерентности), однако основные принципы останутся неизменными. Но эксперимент INEPT также требует весьма глубокого анализа. Мы избежали ситуаций, в которых векторная модель оказывается несостоятельной только потому, что ограничились случаем дублета и выбрали определенный порядок следования заключительных я/2-импульсов. Для лучшего понимания редактирования спектров попробуйте сравнить процессы, происходящие во время задержки Л последовательности INEPT и во время периода эволюции эксперимента по гетероядерному J-модулированному спиновому эху (разд. 10.2 гл. 10). Начальные состояния спиновых систем в этих экспериментах различны, но в остальном они очень похожи.

6.4. DEPT 6.4.1. Введение Буква D в названии эксперимента происходит от слова „Distortionless"-«без искажений» (расшифровать остальные буквы вы сможете сами). Эта последовательность осуществляет аналогичный эксперименту INEPT перенос поляризации, но с той существенной разницей, что все сигналы нечувствительных ядер перед началом выборки оказываются синфазными. Таким образом, спектры с развязкой от протонов можно получать, не прибегая к дополнительной рефокусировке с задержкой А, а спектры без развязки сохраняют обычную мультиплетную структуру,

206

Глава 6

именно это и подразумевается под словами «без искажений». Это и многие другие достоинства делают DEPT наиболее удобной последовательностью для практического редактирования спектров с помощью переноса поляризации.

6.4.2. Последовательность DEPT как многоквантовый фильтр В разд. 6.4 в качестве наиболее часто встречающегося объекта для применения последовательности DEPT мы будем рассматривать перенос поляризации с протонов на углерод, но при этом не будем забывать о том, что их можно заменить любой другой парой ядер со спином 1/2. Последовательность DEPT выглядит так:

п

е±

Развязка

(^)

п

Выборка (±х)...

-h- ~h- '~h13

С:

-

\2/х

где 6 +у~протонный импульс переменной длительности, который, как мы вскоре увидим, выполняет те же функции, что и задержка А в INEPT. Переключение фазы этого импульса (вместе с переключением режима сложение/вычитание приемника) служит для устранения исходной намагниченности 1 3 С . Фазы обоих я-импульсов также можно переключать для уменьшения интенсивности ложных сигналов. Во время выборки в зависимости от требований к спектру можно использовать, а можно и не использовать широкополосную развязку от протонов. Если вы попытаетесь с помощью векторной модели во вращающейся системе координат проанализировать воздействие этой последовательности на спиновую систему, то обнаружите, что ситуация после углеродного тс/2-импульса окажется не очень простой. Поперечная намагниченность будет одновременно присутствовать на углеродной и протонной частях связанной спиновой системы, и имеющихся у нас знаний оказывается недостаточно для предсказания ее поведения. Действительно, очень трудно описать это состояние системы (известное под названием гетероядерной многоквантовой когерентности) в терминах классической векторной модели [4]. Мы столкнемся с некоторыми проблемами и при попытках предсказать эффект G-импульса без привлечения квантовой механики. В результате механизм эксперимента DEPT остается для нас не совсем понятным. Однако предварительно ознакомившись с гл. 8 (где в разд. 8.3.5 излагается, хотя и несколько метафизически, многоквантовая когерентность), вы вполне сможете понять дальнейшие комментарии к последовательности DEPT. В противном случае вам не стоит их читать. Если вы не хотите нарушать порядок чтения книги и переходить к гл. 8, то пропустите оставшуюся часть до разд. 6.4.3.

Перенос поляризации и редактирование спектров

207

Рассмотрим сначала другую последовательность [5]:

!) -±-±-(1) (*) 2/ 23 к 23 \2U\2j-x Ф

13

С:

(£)х

к

-~Выборка (±х)...

Ее существенное отличие от DEPT состоит в том, что 9-импульс заменен парой

где ф-произвольная фаза (не обязательно х или у), определяющаяся через угол с осью у. Вы, наверное, сможете самостоятельно убедиться (хотя бы начиная с z-намагниченности) в том, что эта пара импульсов эквивалентна одному импульсу Qy, где ср = 0, поэтому DEPT и описанная последовательность оказываются одинаковыми. Группа импульсов до (я/2)ф включительно может рассматриваться как эквивалент критерия многоквантовой когерентности (разд. 8.4.3 гл. 8), расширенный для случая гетероядер. Таким образом, непосредственно перед (тс/2)_х-импульсом существует двухквантовая когерентность для группы СН, трехквантовая для группы СН 2 и четырехквантовая для группы С Н 3 . Заключительный протонный импульс-это импульс «чтения», он восстанавливает одноквантовую когерентность углерода, пригодную для регистрации. В соответствии с рецептом, данным в гл. 8, изменение фазы последовательности возбуждения по отношению к фазе импульса «чтения» должно сделать возможным разделение сигналов по кратности квантовой когерентности, т.е. многоквантовую фильтрацию. Это и создает возможность редактирования спектров. Такой способ редактирования был реализован в эксперименте с названием POMMIE [6] (это и есть приведенная выше последовательность с небольшими фазовыми поправками). Но мы не будем обсуждать этот метод, поскольку большинство доступных в настоящий момент спектрометров не способно создавать фазовый сдвиг, необходимый для разделения сигналов с квантовой когерентностью различного порядка. Если ваш спектрометр обладает таким свойством, то вам имеет смысл сравнить эту последовательность с DEPT, чтобы выбрать наиболее подходящую. Поскольку фазовый сдвиг в POMMIE эквивалентен 0-импульсу в DEPT, различие методик будет определяться не их принципиальными свойствами, а характеристиками спектрометра.

6.4.3. Редактирование спектров с помощью DEPT Введение. Если вы пропустили разд. 6.4.2 и решили продолжить чтение с этого места, то принцип редактирования спектров при использовании 0-импульса в последовательности DEPT будет вам не

208

Глава 6

совсем понятен. Однако для практических нужд вполне достаточно понимать, что эксперимент DEPT с заключительным в^-импульсом будет давать такой же результат, как и INEPT с задержкой Л = 9/jrJ. Следовательно, весь материал разд. 6.3.3 может быть без изменений перенесен на случай последовательности DEPT, только вместо nJA следует читать 0. В последовательности INEPT величина А зависит от J; например, оптимальная чувствительность на системе IS n достигается l при Д = (l/nJ)sin~ (l/y/n) [уравнение (6.1)]. Тогда в соответствующем эксперименте DEPT величина в оказывается независящей от J. В этом состоит его принципиальное преимущество. Конечно, в последовательности еще есть зависящие от J величины, но процесс редактирования спектров к ним менее чувствителен. Редактирование. Для разделения подспектров групп СН, СН 2 и С Н 3 мы регистрируем спектры с 0-импульсом, равным я/4, я/2 и Зя/4, таким же образом, как мы это делали с помощью изменения задержки Л в INEPT [7]. В эксперименте 0 = я/2 требуется зарегистрировать в 2 раза больше прохождений для получения одинакового с остальными спектрами отношения сигнал/шум. Как и в разностной спектроскопии ЯЭО, для уменьшения влияния медленных дрейфов экспериментальных условий очень хорошо через равные промежутки времени чередовать накопление разных спектров (разд. 5.3.3 гл. 5). Общее число прохождений определяется обычными требованиями чувствительности. По табл. 6.3 мы можем легко определить операции, необходимые для получения подспектров. СН-подспектр мы получаем в эксперименте с в = я/2. Но он наверняка содержит ложные пики (в основном принадлежащие метальным группам), которые можно устранить после получения остальных подспектров (см. далее). Спектры 8 = я/4 и 0 = Зя/4 отличаются друг от друга только фазами сигналов групп С Н 2 . Их разность даст нам СН2-подспектр. Сложив результаты этих двух экспериментов, мы получим спектр, содержащий сигналы групп СН и С Н 3 . Вычитание из него данных эксперимента 0 = я/2 (умноженных на 1Л/2) приведет к СНъ-подспектру. В заключение можно из спектра 0 = я/2 вычесть небольшую часть суммы (в = я/4) + (0 = Зя/4) (которую мы уже получали при работе над СН3-подспектром) с целью уменьшения в нем интенсивности метальных сигналов. Однако, по личному опыту автора, это требуется довольно редко. На рис. 6.16 изображен полный процесс получения подспектров. Как наилучшим образом проделать все эти сложения и вычитания? Мы могли бы, например, поступить так же, как и в случае разностной спектроскопии ЯЭО, складывая и вычитая ССИ с необходимыми масштабирующими множителями. Однако на практике гораздо удобнее работать в частотной области, что позволяет анализировать комбинации спектров по мере их получения. Для этого программное обеспечение спектрометра должно позволять работать с двумя спектрами

Перенос поляризации и редактирование спектров 1-я ступень

209

2-я ступень

Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см. текст).

в интерактивном режиме; особенно удобно складывать и вычитать спектры с подбором масштабирующего множителя в реальном времени. В этом случае вам не нужно помнить о том, что 1Д/2 = 0,707; вы просто складываете спектры и подбираете их соотношение таким образом, чтобы исчезли нежелательные пики. При этом практически всегда легко отличить СН-пики от С Н 2 и т.д., поэтому не стоит беспокоиться о возможной потере информации. Такой способ позволяет автоматически скомпенсировать отклонения амплитуд сигналов различных групп от их теоретических величин. Если все сигналы группы имеют одинаковые ошибки, то редактирование сохраняет свою эффективность. Какова точность редактирования? Нетрудно догадаться о причинах, по которым процесс редактирования может оказаться несовершенным. Например, амплитуды сигналов зависят от угла поворота О-импульса, и неправильная его калибровка или неоднородность поля В 2 вызовут появление ошибок. Далее, три входящие в последовательность задержки должны соответствовать величине прямой константы спин-спинового взаимодействия протон-углерод, которая может изменяться от 125 до 14 75

210

Глава 6

210 Гц. Обычно выбирается компромиссное значение 150 Гц, если в соединении есть олефиновые углероды или углероды, связанные с электроотрицательными заместителями, и 130 Гц во всех остальных случаях. Если соответствующая константа какого-либо углерода значительно отличается от этой величины, то в подспектрах могут появляться принадлежащие ему ложные сигналы [7]. В литературе по ЯМР этим проблемам уделялось много внимания, и в результате обе они были решены: DEPT GL [8] допускает большее различие констант спинспинового взаимодействия, а модифицированный DEPT с составными импульсами [9] менее чувствителен к точности калибровки углов поворота импульсов. В этих более совершенных экспериментах используются весьма сложные импульсные последовательности и фазовые циклы, и химику, поставившему своей задачей отнесение мультиплетов, не обязательно в них разбираться. Важно то, что даже при наличии ложных пиков анализ отдельных спектров DEPT позволяет отнести сигналы совершенно однозначно. Спектр 9 = тс/4 содержит сигналы всех протонированных углеродов значительной интенсивности. При 0, близком к л/2, амплитуды сигналов групп СН 2 и С Н 3 должны значительно уменьшиться. Пусть они и не станут точно нулевыми; одни останутся положительными, другие исчезнут, третьи станут отрицательными, но все они обязательно уменьшатся. При дальнейшем увеличении 9 в спектре могут происходить самые разные изменения, но сигналы групп СН 3 в отличие от С Н 2 никогда не станут отрицательными (есть одно редкое исключение, когда частота повторения прохождений слишком велика для изолированных, свободно вращающихся метальных групп в молекулах с заторможенными конформационными переходами; см. работу [7], с. 283, и работу [10]). Сравнение исходных спектров позволяет полностью разобраться во всех непонятных пиках. А затем можно получить подспектры, которые можно считать наиболее подходящим способом представления результатов для большинства сигналов.

6.4.4. DEPT для спектров без развязки Как мы выяснили в разд. 6.3, повышение чувствительности ядра 1 3 С с помощью переноса поляризации с протонов-очень эффективный метод регистрации углеродных спектров без развязки. В этом случае DEPT позволяет получать спектры с точно такой же мультиплетной структурой, как и при прямом наблюдении без развязки от протонов. Однако из-за различия констант спин-спинового взаимодействия протон-углерод могут появляться некоторые искажения формы линии. Для подавления этих эффектов были предложены два эксперимента [11]: DEPT + и D E P T + + . Первый из них, видимо, представляет собой самый лучший компромисс между сложностью реализации и качеством получаемых результатов. Последовательность DEPT + такова:

211

Перенос поляризации и редактирование спектров

DEPT + (неправильная мвержка)

41-

, DEPT (неправильная задержка)

11 so

ts

.DEPT

40

3S

I

M M.8.

2S

I

20

15

10

РИС. 6.17. Устранение фазовых ошибок в спектрах DEPT без развязки с помощью последовательности DEPT + . Два верхних спектра получены с задержкой, в 2 раза превышающей правильную.

13,

С:

п

Выборка (±х)..

Она в точности повторяет DEPT с дополнительным протонным л-импульсом на каждом втором прохождении. Так же как и DEPT, она требует точного подбора длительности задержек, но при наличии некоторого диапазона констант этот эксперимент дает меньшие фазовые искажения сигналов (рис. 6.17). Влияние неправильно установленных задержек сводится в DEPT + к изменению интенсивности компонент мультиплетов. Возникающие при этом ошибки интенсивностей можно попробовать удалить с помощью DEPT + + , который описан в работе [11].

Этот гс-импульс должен создаваться при каждом втором прохождении.

212

Глава 6

6.4.5. Квадрупольные ядра Сфера применения переноса поляризации не ограничивается ядрами со спином 1/2. Любое из ядер спиновой системы или оба могут быть квадрупольными [12]. Единственное ограничение состоит в том, что суммарная длительность импульсной последовательности должна быть намного меньше времени релаксации. Эта длительность, очевидно, зависит как от величины константы спин-спинового взаимодействия (чем она больше, тем лучше), так и от релаксационных характеристик соединения. При выполнении этого условия можно попробовать провести все описанные выше типы экспериментов (повышение чувствительности в спектрах без развязки, редактирование и т.д.). Однако для наиболее общего случая редактирования неразвязанных спектров спиновой системы из произвольных ядер выбор параметров становится очень сложным [13], и мы не будем его рассматривать в нашей книге. Такой эксперимент может понадобиться только в весьма экзотических ситуациях. Мы сосредоточим свое внимание на повышении чувствительности в обычных спектрах с развязкой. Одним из наиболее интересных для химиков случаем может быть наблюдение дейтерия с развязкой от протонов. Для работы с квадрупольными ядрами последовательность DEPT следует несколько изменить:

I:

<рх

гс

Выборка (±х) ...

Эта последовательность получила название UPT (Universal Polarisation Transfer-универсальный перенос поляризации), хотя введение нового названия при изменении длительности всего лишь одного импульса может показаться излишним. Для оптимальной чувствительности необходимо подобрать 0, исходя из спина и числа ядер S, и ср, исходя из спина и числа ядер I. И в том и в другом случае это делается следующим образом. Пусть мы имеем N ядер со спином s. Каждое конкретное ядро / может находиться в состоянии, определяющемся спиновым квантовым числом т{, которое может принимать 2s + 1 значение в диапазоне от —sppsc шагом 1. Если мы определим число М как

то оно будет принимать значения от — Ns до Ns (2Ns + 1 значение). Оптимальный угол поворота а для последовательности UPT (т. е. 0, если рассматриваются ядра, с которых переносится поляризация, и ф в случае ядер, на которые она переносится) можно найти из уравнения

Перенос поляризации и редактирование спектров

213

2

M cos2Ma = 0 (6.3) м где DM-вырождение состояния М. Общую формулу для DM вывести не так просто, но в реальных случаях ее можно рассчитать прямым способом. Например, для двух ядер со спином 1 состояние М = О имеет вырождение DM = 3, поскольку оно реализуется в трех случаях: (0, 0), (1, — 1) и (— 1, 1). В общем случае можно выписать все члены суммы (6.3) и получить из нее некий полином относительно cos a, который можно решить численно [13]. Таким образом, в общем случае рассчитать 0 и ф не так просто, но обычно хотя бы одно из ядер имеет спин 1/2, что позволяет при вычислении оптимального угла поворота пользоваться довольно простой формулой (6.1).

6.4.6. «Обращенные» эксперименты Введение. Все применения переноса поляризации, с которыми мы до сих пор встречались, заключаются в переносе поляризации с ядра с большим у на ядро с меньшим у. В принципе нет никаких причин считать это «прямое» направление единственно возможным, вполне возможно провести перенос, например, с 1 3 С на ХН или с 2 Н на 1 3 С . Однако такие эксперименты могут показаться бессмысленными, поскольку они неизбежно должны приводить к потере чувствительности в сравнения с прямым наблюдением. Но, с другой точки зрения, подобные эксперименты могут оказаться полезными. Сравним спектроскопию *Н и 1 3 С . Первая из них обладает той особенностью, что протоны присутствуют практически во всех объектах. Интересующие нас сигналы в протонных спектрах многих распространенных систем, таких, как среды с химическими реакциями или живые клетки, полностью закрываются интенсивными сигналами воды или других растворителей или таких распространенных в биохимии веществ, как липиды. Ядро 13 С , напротив, имеет низкое природное содержание, что позволяет пометить им интересующие нас объекты или их части, которые далее можно контролировать с помощью 1 3 С-ЯМР, не встречая помех со стороны интенсивных протонных сигналов. Таким образом, протонам присуща высокая чувствительность, а углероду (и другим ядрам с низким природным содержанием) - высокая селективность. Теперь мы можем представить себе эксперимент, где «обратное» направление переноса поляризации могло бы оказаться полезным. В идеальном случае эксперимент (с помощью фазового цикла или другими путями) полностью подавляет исходную намагниченность чувствительных ядер. Если при этом мы будем переносить на протоны намагниченность с редких ядер, использованных в качестве меток, то в результате протонные спектры будут обладать селективностью редких ядер. Этот процесс, конечно, будет сопровождаться некоторой потерей чувствительности по сравнению с непосредственным наблюдением. На-

214

Глава 6 13

пример, при переносе поляризации с С на протоны разность заселенностей в самом худшем случае будет в 4 раза меньше наблюдаемой в обычном эксперименте, в результате в 4 раза понизится чувствительность. Но полученный спектр будет обладать достоинствами углеродных спектров в том смысле, что мы увидим сигналы только тех 13 объектов, которые содержат ядра С . Поэтому правильнее проводить 13 его сравнение с наблюдением углерода, а не протонов. Сигнал С при 1 прочих равных условиях в 64 раза слабее сигнала Н , поэтому обратный перенос поляризации позволит в сравнении с непосредственным наблюдением углерода получить 16-кратное усиление. Далее, если мы будем облучать протоны в перерывах между прохождениями, то ЯЭО на углероде увеличит его разность заселенностей еще примерно в 3 раза. В результате чувствительность составит 3/4 прямого наблюдения про13 тонов, что в 50 раз выше, чем при прямом наблюдении С . Но с практической точки зрения такие оценки могут оказаться 13 слишком оптимистичными. Например, сигналы С всегда синглетны, тогда как протоны часто входят в состав сложных спиновых систем. При каждом расщеплении линии на две части отношение сигнал/шум уменьшается в 2 раза. В то же время константы спин-спинового взаимодействия дают дополнительную информацию о структуре. Другая проблема состоит в том, что частота повторения прохождений ограничивается релаксацией редких ядер, которая может быть достаточно медленной. Поэтому вопрос об эффективности такого эксперимента надо решать в каждом конкретном случае. Например, времена релаксации углеродов пептида, спектры которого мы увидим ниже, очень небольшие, но для других соединений может наблюдаться обратная картина. Это необходимо учитывать при планировании эксперимента. Наконец, в реальном эксперименте мы можем и не получить теоретических интенсивностей. У большинства датчиков, настраивающихся на какоелибо гетероядро, катушка для наблюдения протонов (катушка декаплера) редко оптимизируется по чувствительности. Однако очень хорошее подавление исходных сигналов протонов можно получить с помощью описываемой далее процедуры. Все эти моменты обязательно нужно учитывать при сравнении обратного DEPT с другими альтернативными методами, например с методом разностного спинового эха из гл. 10. Обратный DEPT. Импульсную последовательность для реализации обратного переноса поляризации легко построить на основании принципов эксперимента UPT, описанного в предыдущем разделе [14]. Наибольший интерес представляет перенос поляризации с одного ядра со спином 1/2 (например, метка 1 3 С) на несколько ядер со спином 1/2 (например, на два протона в группе СН 2 ). Из уравнения (6.3) мы получаем величину 0-импульса я/2, а величина ср будет зависеть от числа ядер, на которые переносится поляризация. Если мы его заранее не знаем, то можно использовать компромиссное значение, позволяющее получить заметные интенсивности всех групп ХН„; для случая 13С такой

Перенос поляризации и редактирование спектров

'Н

-

I на

i

215

- бШкцжо t x

РИС. 6.18. Схема обратного эксперимента DEPT. величиной будет ф = л/4. Таким образом, для осуществления обратного DEPT нам потребуется последовательность, изображенная на рис. 6.18. Фазовый цикл последовательности должен быть похожим на обычный DEPT, его основная функция - чередование фаз заключительного 13 импульса С и фазы приемника с целью подавления исходной намагниченности протонов. Поскольку исходная намагниченность протонов гораздо больше переносимой поляризации, одного фазового цикла будет, по-видимому, недостаточно для полного ее подавления, и чередование фаз следует сочетать с предварительным насыщением протонов с помощью широкополосного облучения. Насыщение, помимо этого, будет создавать на гетероядрах ЯЭО, соответствующим образом повышающий их чувствительность, поэтому предварительное облучение следует считать существенным элементом последовательности. Широкополосная же развязка от гетероядер во время выборки-это необязательный элемент. Она, с одной стороны, увеличивает интенсивность сигналов, но с другой-лишает спектр дополнительной информации, поэтому ее использование оказывается желательным далеко не всегда.

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

5,5

5fl

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

tfi

tf

\fi

м.д.

Рис. 6.19. В верхней части представлен нормальный протонный спектр трипептида, помеченного ядром С. На нижнем спектре сигналы протонов у помеченного углерода получены отдельно от остальных с помощью обратного DEPT с широкополосной развязкой от 1 3 С во время выборки (эксперимент GARP-1, гл. 7). Другие небольшие сигналы, чуть видимые в спектре, возникают за счет природного содержания ядер 1 3 С в положениях, связанных спин-спиновым взаимодействием с другими протонами.

216

Глава 6

Кроме того, широкополосная гетероразвязка от ядер типа 1 3 С с их широким диапазоном химических сдвигов-далеко не простая задача (см. разд. 7.4 гл. 7). На рис. 6.19 представлен спектр, полученный с помощью такой последовательности. Очень хорошее подавление протонных сигналов было достигнуто с помощью сочетания фазового цикла с насыщением протонов в течение 1 с перед каждым прохождением. С точки зрения отношения сигнал/шум полученный спектр сравним с прямым наблюдением протонов, но, как мы уже упоминали ранее, это соединение имеет очень благоприятные релаксационные свойства. Возможности эксперимента и его аналогов, которые обсуждаются в гл. 10, выглядят весьма внушительными, однако на сегодняшний день мы знаем лишь несколько примеров их применения [15]. Литература 1. Styles P., Saffe N., J. Mag. Res., 50, 397-404 (1984). 2. Morris G.A., Freeman R., J. Amer. Chem. Soc, 101, 760-762 (1979). 3. Pegg D. Т., Doddrell D. M., Brooks W. M., Bendall M. R., J. Mag. Res., 44, 32-40 (1981). 4. Такие попытки делались; см.: Lynden-Bell R. M., Bulsing J. M., Doddrell D. M., 3. Mag. Res., 55, 128-144 (1983). 5. Levitt M.H., Ernst R.R., Mol. Phys., 50, 1109-1124 (1983). Основная тема этой работы не включает DEPT, но он упоминается как многоквантовый фильтр в связи с поиском источников ошибок в импульсных последовательностях. 6. Bulsing J.M., Brooks W.M., Field J., Doddrell D.M., J. Mag. Res., 56, 167-173 (1984). 7. Bendall M.R., Pegg D. Т., J. Mag. Res., 53, 272-296 (1983). 8. Sjrensen O.W., Bildsje S., Bilds^e #., Jakobsen H.J., J. Mag. Res., 55, 347-354 (1983). 9. Pegg D. Т., Bendall M.R., J. Mag. Res., 60, 347-351 (1984). 10. Bendall M.R., Pegg D. Т., J. Mag. Res., 53, 40-48 (1983). 11. Sfrensen 0. W., Ernst R.R., J. Mag. Res., 51, 477-489 (1983). 12. Pegg D. Т., Bendall M.R., J. Mag. Res., 55, 51-63 (1983). 13. Pegg D.T., Bendall M.R., J. Mag. Res., 58, 14-26 (1984). 14. Bendall M.R., Pegg D. Т., Doddrell D.M., Field J., J. Mag. Ress., 51, 520 526 (1983). 15. См.: Brooks W.M., Irving M.G., Simpson S.J., Doddrell D.M., i. Mag. Res., 56, 521-526 (1984); Doddrell DM., Staunton J., Laue E.D., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 602-605 (1983).

Глава 7

Дополнительные сведения об экспериментальных методах 7.1. Введение В этой главе мы рассмотрим экспериментальные проблемы, с которыми часто приходится сталкиваться в практической многоимпульсной спектроскопии ЯМР. Эта книга, как мы уже говорили в гл. 1, не претендует на роль исчерпывающего учебника по практическому ЯМР. В первую очередь мне хотелось бы сосредоточить внимание на процедурах, связанных с выбором параметров эксперимента, которые приходится выполнять каждый день, и описать, как их следует правильно выполнять. Описываемые далее некоторые современные приемы работы-это не «методы экспериментального ЯМР» в полном смысле слова. Они в сочетании с другими методиками позволяют повысить производительность спектрометра или ослабить влияние ошибок экспериментатора и недостатков спектрометра на качество получаемых результатов. Многие современные эксперименты чрезвычайно чувствительны к тщательному выбору длительностей импульсов, задержек и фазовых сдвигов и к тому, насколько точно заданные параметры воспринимаются спектрометром. К сожалению, к большинству спектрометров следует относиться с известным скептицизмом, поскольку очень часто реальные сигналы на выходе передатчика могут быть слабо связаны с тем, что мы от него требовали. Это в особенности относится к таким экспериментам, как, например, упоминающиеся в разд. 7.3 составные импульсы, где последовательность некоторых действий производится в микросекундном масштабе времени. При любых многоимпульсных экспериментах нужно тщательно калибровать длительности импульсов, это особенно необходимо при первом выполнении нового эксперимента. Чтобы уменьшить вероятность ошибок и путаницы, важно изучить сущность вашего эксперимента и знать характеристики вашего спектрометра, наиболее для него критичные. Перед проведением нового эксперимента его следует оттестировать на таком объекте, для которого результат уже известен, а выполнение эксперимента не требует много времени. Это значит, что нужно использовать концентрированные растворы простых соединений, сложность которых, однако, еще достаточна для демонстрации возможностей эксперимента. Для увеличения частоты повторения полезно сократить величины Т2 с помощью добавления ацетилацетоната

218

Глава 7

хрома(Ш) (в органические растворы) или хлорида марганца(Н) (в водные растворы). Для работы с протонными спектрами полезно иметь образцы, дающие спектр с единственным сигналом (например, хлороформ в дейтерохлороформе с небольшой добавкой релаксационного реагента для сокращения 7^ до 1 или 2 с), и с двух- и трехспиновой системами первого порядка (вполне подойдут р-хлоракиловая кислота и 1,2-дибромпропионовая кислота в дейтерохлороформе). Количество тестовых образцов для работы с гетероядерными системами может быть бесконечным. Тестирование большинства протон-углеродных экспериментов удобно проводить с помощью обогащенного по 1 3 С метилиодида. Часто бывает нужно дополнительно сократить Тх.

7.2. Длительность импульса и напряженность поля 7.2.1. Введение: шкала мощности в децибелах При настройке спектрометра перед проведением многоимпульсного эксперимента часто приходится измерять мощности нескольких радиочастотных полей. Различные названия этой операции-калибровка длительности импульсов или измерение напряженности поля - отражают только разные стороны определения одного и того же параметра. Для измерения амплитуды радиочастотного поля можно использовать единицы типа гаусс (Гс) или тесла (Т): IT = 10000 Гс, но с точки зрения ЯМР ее наиболее удобно выражать, как мы это уже делали в гл. 4, через скорость прецессии ядерной намагниченности. В этом случае связь между амплитудой поля В в герцах, т. е. в числе поворотов намагниченности в секунду, и длительностью л-импульса tn, вызывающего поворот намагниченности на 1/2 цикла, выглядит особенно просто (tK = 1/25). Например, обычный жесткий я-импульс длительностью 10 мкс соответствует амплитуде поля 50 кГц, а обычная для гомоядерной развязки амплитуда поля 50 Гц эквивалентна мягкому я-импульсу длительностью 10 мс. Термины «жесткий» и «мягкий» довольно часто неправильно применяются для обозначения неселективных и селективных импульсов. Поэтому точное значение этих терминов зависит от контекста. Для измерения амплитуды радиочастотного поля нам потребуется некоторое чувствительное к этой величине явление ЯМР. Мы рассмотрим целый набор таких явлений, а выбор конкретного из них будет зависеть от обстоятельств. Обычно передатчик и декаплер, если последний используется в импульсном режиме, работают на максимально возможной мощности. Однако во многих экспериментах, например при получении мягких импульсов заданной длительности или для селективной развязки, нужно использовать некоторую конкретную мощность. Более низкая мощность обычно получается делением максимальной мощности с помощью аттенюатора. Нам будет полезно иметь представление о том, как параметр, отражающий отношение мощностей (децибел или дБ), связан

Допопнительные сведения об экспериментальных методах

219

с амплитудой радиочастотного поля в ЯМР-эксперименте. Децибел (дБ) дает нам логарифмическую шкалу отношения мощностей и определяется как

(£)

(7.1)

где Р1 и Р2-жае сравниваемые мощности. Очень часто удобнее сравнивать не мощности, а напряжения сигналов, которые связаны с мощностью соотношением 2

V

При выполнении расчетов, исходя из величин напряжений, нужно пользоваться соотношением (7.3) Как мы видим, децибелы характеризуют отношение величин. Поэтому их обычное использование в качестве некоторой абсолютной величины в выражениях типа «громкость звука взлетающего самолета превышает 150 дБ» или в более важном для ЯМР (если, конечно, ваша лаборатория находится не возле аэропорта) «выходная мощность синтезатора составляет + 10дБм» может несколько озадачить. Фокус состоит в том, что в этих выражениях говорится об отношении интересующей нас величины к некоторой стандартной; последняя, как предполагается, всем известна. Для обычных единиц измерения радиочастотной мощности (дБм и дБВт) эта величина составляет 1 мВт и 1 Вт соответственно. Обычные генераторы прямоугольных сигналов имеют на выходе мощность в несколько дБм, а обычные импульсные передатчики спектрометров ЯМР могут давать + 20 дБВт. Двукратное снижение мощности соответствует ее изменению на — 3,01 дБ (101g0,5), или, можно считать, просто на — 3 дБ. Однако мощность радиочастотного поля пропорциональна напряжению сигнала, прикладываемого к катушке, поэтому для понижения напряженности поля в 2 раза нужно снизить напряжение сигнала на 6 дБ. Запомнив это простое соотношение, вы легко сможете подобрать величину соответствующего параметра для получения нужной амплитуды радиочастотного поля.

7.2.2. Импульсы на частоте наблюдаемых ядер В случае высокой чувствительности. Длительность импульса передатчика измеряется легче всего, когда чувствительность ядер и концентрация образца достаточны для получения хорошего отношения сигнал/шум за одно прохождение. В этом случае мы можем искать

Глава 7

220

JL.

"Г

1

Рис. 7.1. Калибровка длительности импульса. Интенсивность сигналов проходит через нуль при углах поворота импульса п, 2я...

длительность я-импульса, исходя из того, что ему должен соответствовать сигнал нулевой интенсивности. Сначала следует получить спектр с помощью короткого импульса, угол поворота которого заведомо меньше те/2. На обычных передатчиках спектрометров высокого разрешения таким требованиям должна удовлетворять длительность 1 -2 мкс. По этому спектру следует подобрать условия коррекции фазы для получения положительного сигнала поглощения. Повторение этого эксперимента с увеличивающейся длительностью импульса позволяет найти точку нулевого сигнала, соответствующую я-импульсу. Предварительное определение условий коррекции фазы облегчает поиск нулевой точки, поскольку после прохождения через нее сигналы инвертируются (рис. 7.1). Имейте в виду, что некоторые спектрометры автоматически масштабируют каждый новый спектр. Поэтому для получения таких спектров, как на рис. 7.1, автоматическое масштабирование необходимо отключить. На практике такая процедура сопряжена с рядом сложностей. Если вы еще не очень освоились со спектрометром и не имеете представления о возможной длительности я-импульса, то убедитесь, что найденная вами нулевая интенсивность действительно первая. Аналогичные точки нулевой интенсивности соответствуют импульсам с углами поворота 2я, Зя и т.д., поэтому начинающему пользователю очень полезно иметь представление о приблизительных величинах длительностей импульсов на различных ядрах. Еще одно препятствие состоит в том, что оператору надо решить, какой спектр принять за «нулевой». я-Импульс не может

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

^^^^^^^^^^^^_^^^^^_^^^ I,. .1 , и и i^. •,.,,.. ,^,,, ,|,, . ^ w . M . , . , Гц

221

Рис. 7.2. Остаточный сигнал, полученный с помощью я-импульса. На конкретном приборе его вид определяется конструкцией датчика.

быть идеальным, и во всех спектрах обязательно будут наблюдаться какие-либо остаточные сигналы. Одна из причин этого состоит в чувствительности я-импульсов к расстройке резонансных условий (гл. 4). Ее легко исключить, просто поместив несущую частоту точно на измеряемую линию. Но из-за неоднородности поля В1 специфические остаточные сигналы все равно сохранятся (рис. 7.2), и вам самостоятельно придется принимать решение о том, какая длительность импульса наиболее близка к искомой. При этом лучше всего учитывать среднюю часть линии сигнала, которая отражает поведение основного объема образца, и не обращать внимания на ее боковые части. В случае низкой чувствительности. Если с одного прохождения становится трудно зарегистрировать сигнал образца, то при измерении длительности импульса приходится проявлять больше изобретательности и терпения. В зависимости от того, насколько плоха чувствительность, можно использовать различные пути. Если сигналы, видимые в некоторых спектрах, исчезают в шуме при приближении к я-импульсу, то может быть достаточно определить последний видимый положительный сигнал и первый видимый отрицательный и взять среднюю между ними величину. Кроме того, если оператору хватит терпения, можно использовать накопление. При калибровке длительности импульса большинства ядер делать задержку в несколько Т х , достаточную для полного восстановления z-намагниченности между прохождениями, не так просто. Можно повторять импульсы и не дожидаясь полной релаксации, но при этом выборка данных должна проводиться только после установления стационарного режима. В этом случае более эффективным будет поиск второго «нуля», соответствующего 2я-импульсу, поскольку длительность этого импульса и «нуль» я-импульса связаны довольно просто [1]. Если за разумные промежутки времени не удается увидеть вообще

222

Глава 7

никаких сигналов, то необходимо использовать предварительную калибровку. Можно, например, описанными ранее способами определить длительность импульса на концентрированном образце. При тщательной настройке датчика (гл. 3) эта величина должна воспроизвестись и на разбавленном образце. Исключение составляют случаи, когда интересующий нас образец сильно отличается по электрическим свойствам от раствора, на котором производилась калибровка. Это может быть при попытке работать с водными растворами электролитов, когда используются длительности импульсов, полученные на органических растворах. Значительно лучше приготовить образец, похожий по свойствам на исследуемый, но с достаточной для калибровки я-импульса концентрацией. Полученная таким образом величина может применяться без дополнительной настройки спектрометра. Некоторые ядра, например многие металлы, не позволяют получить видимые сигналы ни при каких концентрациях растворов. Если вам приходится заниматься экспериментами на таких ядрах, то единственный способ калибровки импульсов - это использование описываемого далее метода, когда импульс для интересующего вас ядра калибруется с применением гетероядерного спин-спинового взаимодействия с другими ядрами.

7.2.3. Импульсы на других ядрах Во многих экспериментах импульсы должны производиться на частоте других ядер, связанных с наблюдаемыми. Это прежде всего эксперименты по переносу поляризации, такие, как DEPT, и соответствующие двумерные эксперименты. Чаще всего другим ядром ока13 зывается *Н, а наблюдаемым- С или еще какое-либо гетероядро. Протонный импульс создается протонным декаплером, поэтому определение длительности я-импульса часто называют «калибровкой длительности импульса декаплера». По мы сохраним этот термин для случая, когда нас будет интересовать именно развязка. Во множестве экспериментов протоны не используются в качестве «других» ядер. Это, 31 например, DEPT с переносом поляризации с Р на металл или обратный перенос поляризации с 1 3 С на протоны. Во всех этих случаях задача остается той же: найти длительность я-импульса ядер, не наблюдающихся непосредственно. Все методы калибровки можно разделить на группы по типу зависимости интенсивности сигналов наблюдаемых ядер от угла поворота импульса, воздействующего на связанные с ними другие ядра. Например, вот простая последовательность [2]: X:

I —I — х-Выборка ...

Y:

а

где Х-наблюдаемое ядро, Y-«другое» ядро, оба со спином 1/2. Для калибровки требуется спиновая система XY (т. е. дублет сигнала X). При

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

223

импульс 'Н 21 мкс

23 мкс

25 мкс

мкА^Л'о-НмЧл

Г

Ч

••"I 0

Гц

I -100

100

о -too Гц

Рис. 7.3. Калибровка импульсов на системе связанных ядер (первый метод).

т, равном 1/2JXY> импульс на ядре Y с углом поворота а = я/2 (заметьте, я/2, а не я) приведет к регистрации сигнала нулевой интенсивности. Компоненты дублета всегда оказываются в противофазе. При переходе длительности а-импульса через точку я/2 фазы компонент инвертируются (рис. 7.3). Основной недостаток этого эксперимента состоит в невозможности развязки от ядра Y при выборке сигнала X, что приводит к потере чувствительности. Кроме того, оптимальная частота повторения прохождений определяется величиной 7\ ядра X, что может вызвать затруднения в наиболее распространенном случае, когда Y-протон, а Х-малочувствительное и, возможно, медленно релаксирующее ядро. Лучше использовать последовательность DEPT (гл. 6), где допускается развязка от Y, а частота повторения прохождений определяется величиной Ti ядер Y. Начиная с небольшого импульса 8 для настройки фазовой коррекции, нужно найти такую длительность 9-импульса, при которой сигналы групп XY2 и/или XY3 становятся нулевыми; эта величина будет соответствовать 9 = я/2 (рис. 7.4). При переносе поляризации с протонов на углерод можно вполне точно откалибровать длительность импульса на сильно разбавленных образцах, суммируя 8-16 прохождений, повторяющихся через 1 или 2 с. Но предварительно необходимо измерить длительность импульса на углероде и подобрать длительность входящей в последовательность задержки в соответствии с ожидающейся величиной константы спин-спинового взаимодействия протон - углерод. Два этих метода пригодны для калибровки только достаточно сильных радиочастотных полей (соответствующих неселективным импульсам). Калибровка мягких импульсов на системе связанных ядер, которая требуется для проведения эксперимента SPI, может оказаться

224

Глава 7

21 мне

(2 мкс

Рис. 7.4. Калибровка импульсов на системе связанных ядер с помощью последовательности DEPT.

гораздо сложнее. Вероятно, для этого лучше использовать первый из описанных методов с резонансным импульсом на ядре Y при достаточно большой напряженности поля (например, около 1 кГц), чтобы его можно было считать неселективным. Когда найдена длительность импульса для этой напряженности поля, ее можно снизить до нужной величины с помощью точного аттенюатора.

7.2.4. Мощность радиочастотного поля при гомоядернои развязке Если нам необходимо осуществить непрерывное облучение ядер сигналом малой мощности, например при гомоядернои развязке, то удобнее использовать амплитуду поля, а не длительность импульса. Для выбора параметров эксперимента с целью получения эффективной развязки или оптимальной селективности удобно иметь таблицу, отражающую связь амплитуды поля и мощности декаплера. Расчет эффективной амплитуды поля декаплера по длительности его тг-импульса может оказаться очень сложным, поскольку на фурье-спектрометрах гомоядерная развязка реализуется при помощи облучения короткими импульсами (развязка с разделением времени), которая снижает эффективную амплитуду поля на неизвестную в общем случае величину. Значительно лучший способ измерения амплитуды слабого поля для гомоядернои развязки состоит в использовании так называемых сдвигов Блоха-Зигерта. Они представляют собой изменение частоты сигналов относительно их обычного положения при облучении системы на близкой частоте (рис. 7.5). Это изменение связано с амплитудой поля декаплера (В2) и разностью частот сигнала и облучения следующим образом: 2 (v - v,)

(7.4)

Дополнительные сведений об экспериментальных методах

225

Рис. 7.5. Сдвиг Блоха-Зигерта. Внизу изображен нормальный спектр, вверхуспектр, полученный при облучении системы на нулевой частоте; остальные параметры регистрации те же. Вычисленная из величины сдвига напряженность поля составляет около 20 Гц. где В j выражается в герцах, v - исходная частота наблюдаемого сигнала, V,-- частота облучения и В2 « v — v,. Это измерение удобно проводить с помощью разностного метода: нормальный спектр, содержащий одну линию, вычитается из спектра, облучаемого на близкой частоте, что позволяет непосредственно измерить сдвиг частоты. Частота облучения должна быть удалена от сигнала на расстояние, значительно большее ожидающегося сдвига Блоха-Зигерта. Серия таких экспериментов с различными аттенюаторами должна показать линейную зависимость напряженности поля от коэффициента деления в дБ.

7.2.5. Мощность радиочастотного поля при гетероядерной развязке Измерение мощности поля при гетероядерной развязке (т. е. развязке от ненаблюдаемых ядер) обычно требуется в двух случаях-в качестве предварительного эксперимента при определении длительности импульса по методу, описанному в разд. 7.2.3, и для настройки развязки от гетероядер. Конечно, длительность импульса можно определить и без измерения мощности поля. Но если вы определяете импульс на какомлибо экзотическом ядре или на незнакомом датчике, то предварительная калибровка поля альтернативным способом поможет ускорить эксперимент и снизит вероятность ошибок. Более важная сторона такого подхода состоит в том, что современные методики широкополосной развязки требуют использования фазовых сдвигов декаплера в соответствии с заданной последовательностью, скорость которых определяется мощностью поля (разд. 7.4). Если гетероядерный передатчик допускает работу в непрерывном режиме, то определение мощности поля позволяет обойтись вообще без процедуры, упомянутой в разд. 7.2.3. Простой и не очень точный метод состоит в наблюдении эффектов развязки в нерезонансных условиях. Рассмотрим в качестве примера 15-75

Глава 7

226

группу СН. Сигнал углерода без развязки от протонов представляет собой дублет с константой J. Если мы будем с достаточной интенсивностью облучать систему точно на частоте протонов, то дублет углерода превратится в синглет. Смещение частоты облучения в сторону от протонного сигнала приведет к восстановлению дублета, но с меньшим расстоянием между линиями. В приближении значительно большей напряженности поля по сравнению с разностью частот протонного сигнала и облучения его можно выразить через величину остаточного расщепления: J5v

(7.5)

где J r - остаточное расщепление, 8v-разность частот протонного сигнала и облучения. Существует и более точная формула: (7.6) но при В2 » 5v приближение (7.5) вполне приемлемо. Общая процедура будет состоять из измерения константы спин-спинового взаимодействия, измерения точной частоты протонного сигнала и последующего нерезонансного облучения с 5v, выбранным таким образом, чтобы получить небольшое, но надежно измеряемое остаточное расщепление (рис. 7.6). Такие измерения не очень точны, поэтому их можно использовать только в качестве предварительной оценки перед проведением калибровки более точными методами. Описанный метод больше подходит для измерения средних и высоких напряженностей поля декаплера в отличие от метода сдвигов Блоха-Зигерта, который лучше работает на слабых полях.

расстройка декаплера

Рис. 7.6. Использование эффекта расстройки резонансных условий для измерения напряженности поля гетероядерной развязки.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

227

7.3. Уменьшение неидеальности импульсов 7.3.1. Введение Сколько бы сил вы ни затратили на точное измерение длительности импульсов с помощью описанных выше процедур, вам все же не удастся достичь эффекта идеального 71/2-или я-импульса. Объясняется это двумя причинами — неоднородностью поля В1 по объему образца, обусловленной несовершенством конструкции катушки передатчика, и отклонением эффективного угла поворота намагниченности, обусловленным конечной величиной напряженности поля В1 (гл. 4, разд. 4.3.2). В рутинной одномерной спектроскопии, где используются только я/2-импульсы или более короткие, ни один из этих эффектов не заметен. Отклонение угла поворота намагниченности вызывает появление в спектре фазовых ошибок, которые суммируются с ошибками из других источников и корректируются при обработке данных, поскольку они приблизительно линейно зависят от величины расстройки резонансов. Небольшие изменения в эффективной длительности импульса, обусловленные неоднородностью поля B t по объему образца, не оказывают заметного влияния на результаты. Однако все виды многоимпульсных экспериментов могут быть в значительной степени подвержены влиянию этих факторов. Простым примером этого может служить упомянутый в гл. 4 метод инверсии-восстановления для измерения величин Tt. В этом методе измеряется скорость, с которой намагниченность, помещенная я-импульсом на ось — z, возвращается к состоянию равновесия. Легко догадаться, что некорректная отработка импульса приведет к получению неверных результатов. Другой пример, более важный для химических приложений,-это многие современные эксперименты по переносу поляризации, использующие прием размещения векторов намагниченности вдоль определенных осей. В эту категорию попадают рассмотренные ранее эксперименты INEPT и DEPT, их двумерные аналоги (гл. 9), а также другие одномерные и двумерные эксперименты, такие, как INADEQUATE (гл. 8). Отклонение векторов намагниченности от их идеального положения, которое может быть обусловлено их вращением вокруг наклонной оси или неправильным углом поворота, снижает чувствительность этих экспериментов, а в некоторых случаях может вызывать появление ложных сигналов. Потеря чувствительности может быть особенно нежелательна, поскольку многие из этих экспериментов разработаны специально для ее повышения. К дефектам импульсов очень чувствительны также все эксперименты, использующие спиновое эхо. В двумерных экспериментах, известных под названием J-спектроскопии, некорректность импульсов создает целые наборы ложных сигналов (гл. 10).

228

Глава 7

7.3.2. Составные импульсы Одно из направлений борьбы с дефектами импульсов-это чисто аппаратурное совершенствование конструкции датчиков. Оно решает обе проблемы, поскольку позволяет повысить как однородность, так и амплитуду поля Вх. Последний параметр, казалось бы, должен в большей степени зависеть не от датчика, а от передатчика, поскольку амплитуду поля fix можно повысить, просто увеличивая напряжение радиочастотного сигнала. Действительно, на практике нет реальных препятствий (кроме стоимости прибора), мешающих повысить выходное напряжение, передатчика на несколько порядков. Препятствия создают именно компоненты датчика, которые должны работать при высоких напряжениях без деформаций и пробоя изоляторов. В настоящее время на датчиках небольших диаметров можно создать поля В^ с амплитудой в 20-50 кГц (длительность я/2-импульса 12,5-5 мкс) и выше. Однако параллельно с совершенствованием конструкций датчиков происходит и рост напряженности постоянных магнитных полей, что требует дальнейшего расширения спектральных диапазонов. При амплитуде радиочастотного поля 20 кГц отклонение частоты импульса от резонанса на 3,5 кГц приводит к существенному (10°) наклону оси поворота намагниченности. При наблюдении ядра 1 3 С на спектрометре с рабочей частотой 500 МГц для протонов диапазон 3,5 кГц составляет только 28 м. д., а полный спектральный диапазон может быть около +120 м. д. Таким образом, неидеальность импульсов необходимо компенсировать каким-либо способом. Одним из самых впечатляющих достижений последних лет стали попытки разработки комплексных (составных) импульсов, эквивалентных в сумме одному п- или тг/2-импульсу, но менее чувствительных к отклонению от резонанса и/или неоднородности поля Вг. Исследования в этой области еще продолжаются, и проблема пока не решена, но достигнутые к настоящему времени успехи позволяют надеяться на ее решение. Для большинства последовательностей, реализующих составные импульсы, вполне очевидно, что желаемый эффект будет достигнут только в случае идеальности каждого из входящих в них импульсов. Иногда влияние на последовательность отклонения от резонанса или неоднородности поля можно изобразить графически в терминах векторной модели, как это сделано на рис. 7.7. Но в общем случае для правильного понимания этих эффектов вам нужно ознакомиться с оригинальными работами. В первых попытках построения составных импульсов проблемы отклонения от резонанса и неоднородности поля BY решались отдельно [3]. Дальнейшие последовательности разрабатывались для одновременного решения обеих проблем. Особое внимание уделялось я-импульсам, поскольку они в большей степени чувствительны к отклонению

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

229

Рис. 7.7. Диаграмма движения намагниченности системы после составного я-импульса. Движение начинается на оси + z и представлено в виде серии линий на поверхности сферы. Каждая линия соответствует уменьшению длительности тс/2-импульса с шагом 5° от номинальной величины. Для различных величин В1 строится несколько серий. Траектории заканчиваются гораздо ближе к оси — z, чем можно было бы ожидать в случае обычного тс-импульса с той же ошибкой в напряженности поля. от резонанса [4, 5]. Два первых составных импульса, эквивалентных пи 71/2-импульсам, выглядят так: л 2'

Ы

Входящие в них импульсы должны создаваться без промежуточных задержек, но на практике это недостижимо, и между импульсами иногда нужно вставлять задержки в несколько микросекунд. Наибольший интерес для нас представляет тс-импульс, который применяется как для инверсии z-намагниченности, так и для создания спинового эха. Мы еще вернемся к нему в гл. 10. Для того чтобы понять его работу, нужно рассмотреть траектории компонент намагниченности, первоначально находящихся на оси z, с увеличивающейся ошибкой компонент импульса (см., например, рис. 7.7). Составной импульс вставляется в нужную последовательность на место своего эквивалента. Для изменения его фазы следует на равные величины изменить фазы его компонент, так чтобы относительные фазы остались прежними. Трехэлементный составной я-импульс обеспечивает хорошую компенсацию неоднородности поля В1 (отклонения длительности импульсов от идеальной величины порядка + 2 0 % изменяют эффективность инверсии не более чем на 1%), но только при отсутствии отклонений от резонанса. Для компенсации обоих эффектов требуется более сложная

230

Глава 7

последовательность, наилучшая из доступных в настоящее время имеет весьма подозрительное название GROPE-16 («поиск-ощупью-16») [5]. Для описания более длинных последовательностей составных импульсов удобно пользоваться специальными правилами сокращения. Пусть гс/2-импульс, поворачивающий намагниченность вокруг оси х, обозначается X. Такой же импульс вокруг оси у будет обозначаться Y, а 180°-фазовый сдвиг-при помощи верхней черточки, т.е. X и Y. Импульсы другой длительности будут записываться как кратные я/2-импульсу, например я_ х -импульс-это 2Х. В качестве примера использования правил сокращения мы можем записать упоминавшийся ранее составной я-импульс как X2YX. Последовательность GROPE-16 будет выглядеть так: 3X4XY3Y4YX Эта последовательность допускает ошибки в длительности импульсов до + 2 0 % и отклонения от резонанса до +0,5В х при снижении эффективности инверсии намагниченности не более 1%. На примере поля Bt в 50 кГц 99%-ная эффективность инверсии будет достигаться при задании длительности я/2-импульса от 3 до 6 мкс в диапазоне +25 кГц вокруг резонанса. Это дает огромное преимущество при тестировании новых экспериментов и не только за счет большой допустимой погрешности в длительности импульсов. Составные я/2-импульсы с двойной компенсацией особенно удобны для подавления SPT-сигналов _в экспериментах по ЯЭО [6] (разд. 5.3.3 гл. 5). Последовательность Y3X4X, используемая в качестве составного я/2-импульса, создает поперечную намагниченность с 99%-ной эффективностью при тех же допусках по однородности поля Bt и отклонению от резонанса, что и GROPE-16. Почти все разностные спектры ЯЭО в гл. 5 были получены с помощью этого импульса. Однако дело обстоит не так благополучно, как это может показаться на первый взгляд. Описанные здесь последовательности разрабатывались для воздействия только на z-компоненту намагниченности-для ее устранения (я/2-импульс) или инверсии (я-импульс). Только к этой компоненте и относятся компенсационные свойства последовательностей. Наличие поперечной намагниченности значительно изменяет их влияние на спиновую систему. Рассмотрим простой пример: последовательность (я/2)^ (я/2),, помещает z-намагниченность в поперечную плоскость с компенсацией неоднородности поля В х . Однако если мы подействуем этой парой импульсов на вектор, находящийся на оси +у, то он окажется на оси +х, чего мы вовсе не хотели. В то же время упоминавшийся составной я-импульс все же будет осуществлять вращение поперечной намагниченности на 180°, но при этом компенсационные свойства последовательности уменьшатся [7]. Было найдено, что составной импульс, такой, как X2YX, снижающий чувствительность амплитуды спинового эха к неоднородности поля б 1 ; вносит ошибку в его фазу (в отличие от обычного я-импульса, создающего эхо с фазой,

231

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

не зависящей от угла поворота). Это значит, что составные импульсы нельзя просто так вставлять в импульсные последовательности на место их аналогов без тщательного анализа задачи. Эффективный пример этого можно найти в работе [8]. На результаты таких последовательностей оказывает влияние и ряд экспериментальных факторов. Использование составных импульсов снижает зависимость эксперимента от параметров датчика, но повышает зависимость от качества других блоков спектрометра. Для корректного их применения необходимо тщательно контролировать синхронность и величину фазовых сдвигов. Большинство спектрометров можно легко запрограммировать на генерацию составных импульсов, но соответствующие им реальные процессы останутся окутанными дымкой не/1

J расстройка

0,258,

р

/"ч

0,55,

0,75В,

в,

0,25S,

0,5S,

0,253,

0,5в,

fl,

г

. расстройка

0,258,

0,7SS,

0,5В,

0,753,

- расстройка

РИС. 7.8. Сравнение составного л-импульса GROPE-16 (вверху) с обычным я-импульсом (внизу). Для того чтобы смоделировать влияние неоднородности поля Вх, зависимость амплитуды сигнала от расстройки изображена в обоих случаях при оптимальном угле поворота (слева) и при угле, превышающем оптимальный на 20% (справа).

232

Глава 7

известности. Более длинные последовательности помимо проблемы синхронности фазовых сдвигов будут страдать и от «затухания импульса», поскольку передатчик, предназначенный для создания импульсов длительностью порядка 20 мкс, при попытках генерации длинных импульсов начинает выдавать ложные сигналы (например, продолжительность GROPE-16 составляет 160 мкс при длительности обычного я/2-импульса 10 мкс). Именно по этой причине эффективность использования составных импульсов нужно проверять на каждом конкретном спектрометре. Во многих экспериментах при попытках использования составных импульсов можно получить совершенно неожиданные результаты. Например, может возрасти точность измерений. Поэтому перед их использованием требуется независимая проверка, результат которой должен ясно свидетельствовать об их корректности. Подходящий тест для составного я-импульса таков: П — —Выборка ... где П - составной импульс. Эффективность инверсии намагниченности можно проверить, определив ее зависимость от величины отклонения от резонанса или длительности импульса на образце, дающем спектр с единственным сигналом. Для предотвращения дополнительных эффектов отклонения от резонанса при определении зависимости эффективности инверсии от частоты П-импульса частота тг/2-импульса должна быть строго резонансной. На рис. 7.8 показаны результаты сравнения обычного л-импульса с GROPE-16 на спектрометре с частотой 500 МГц при амплитуде радиочастотного поля В1, равной 30 кГц.

7.4. Широкополосная развязка Во многих экспериментах необходимо полностью освободиться от спин-спинового взаимодействия между двумя ядрами с помощью широкополосного облучения второго ядра (т. е. не находящегося под наблюдением). Чаще всего это протоны, но иногда бывает удобно развязаться и от других активных с точки зрения ЯМР ядер с высоким природным содержанием, таких, как 3 1 Р или 1 9 F . Широкополосная развязка традиционно состоит из облучения большой мощности и фазовой модуляции радиочастоты для создания «боковых полос», распределенных по всему интересующему нас диапазону. Различные схемы модуляции, в том числе и самая первая случайная или шумовая модуляция, разрабатывались эмпирическим путем. Схема шумовой модуляции послужила причиной широкого распространения термина «шумовая протонная развязка» или PND (proton-noise-decoupling) для обозначения широкополосной развязки вообще. Этот термин не совсем корректен, поскольку современные спектрометры почти не используют такой метод.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

233

Ни один из эмпирически найденных методов нельзя считать полностью удовлетворительным. Две основные проблемы таковы: 1) необходимость использования достаточно высоких напряженностей поля В2 и, следовательно, высоких мощностей радиочастотных сигналов, нагревающих образец; 2) недостаточная эффективность развязки, приводящая к потере разрешения. Обе проблемы еще более осложняются на сильнопольных спектрометрах, где требуется более широкая полоса облучения. Уширение линий, обусловленное недостаточно эффективной развязкой и приводящее к снижению чувствительности, не рефокусируется с помощью спинового эха и поэтому особенно вредно для использующих его экспериментов (см. гл. 10). За последние годы в области широкополосной развязки были сделаны очень важные разработки, позволившие решить многие из этих проблем. Для начала попробуем разобраться, почему непрерывная развязка высокой мощности работает недостаточно хорошо. Очень интересный способ решения вопроса-это вообразить себе цепь л-импульсов на частоте ядра, от которого нужно развязаться (пусть это 13 будут протоны при наблюдении С): ^Н:

п — х — я — х — п — х — 7Г — х — п — х — л — х — ...

13

- Выборка

С:

...

Каждый раз, воздействуя импульсом на протоны, мы изменяем направление прецессии компонент мультиплета 1 3 С (рис. 7.9). Следовательно, в середине каждого интервала т они будут оказываться на одной оси, и, производя выборку в эти моменты, мы получим спектр, не содержащий информации о спин-спиновом взаимодействии, т.е. развязанный от протонов. Мы уже знаем, почему цепь 71-импульсов будет очень чувствительна как к ошибкам в длительности импульсов, так и к наклону оси поворота намагниченности - ведь с каждым импульсом эти ошибки будут накапливаться (см. эксперимент Карра - Парселла в гл. 4). Поэтому в том, что это не самый лучший метод широкополосной развязки, нет ничего удивительного. Если представить себе такую цепь с задержками т, сжатыми до нуля, то она будет эквивалентна непрерывному облучению, и ее несостоятельность можно будет показать с помощью тех же аргументов.

п

SL

Рис. 7.9. Широкополосная развязка с помощью серии тс-импульсов.

234

Глава 7

Предложенная модель развязки как цепи я-импульсов позволяет нам провести ее дальнейшее улучшение. Возможно, замена неидеального я-импульса на его составной аналог позволит настолько снизить влияние неоднородности поля В2 и отклонения от резонансов, что развязка окажется эффективной. В этом направлении было проведено много исследований, идея которых состояла в использовании исходного составного я-импульса с систематической перестановкой его компонент и фаз [9]. В качестве основы для такой последовательности можно использовать упоминавшиеся ранее составные я-импульсы, однако особенно удобным оказался составной импульс

достоинство которого состоит в том, что он не использует 90°-фазовые сдвиги и поэтому может быть реализован на существующих фазовых модуляторах канала развязки. Для удобства описания последовательностей развязки, использующих только 18(Г-фазовые сдвиги, мы несколько модифицируем принятые ранее правила записи. Продолжительность импульса будет по-прежнему обозначаться кратной я/2-импульсу, а фазовому сдвигу будет соответствовать черточка над символом. Так как 90°-сдвиги уже не нужны, то отпадает необходимость в использовании X и Y, достаточно будет только цифры, обозначающей длительность. Таким образом, указанный составной импульс запишется как 123 (соответствующая ему последовательность носит сокращенное имя WALTZ, см. гл. 4). В качестве основы последовательностей развязки можно использовать и другие составные импульсы, которые, возможно, дадут еще лучший результат, но модификация 123, названная WALTZ-16 [10], полностью решает все проблемы, связанные с неточностью калибровки поля В2, и представляется самой предпочтительной для практического использования. WALTZ-16 можно записать в виде ...QQQQ... Перестановки фаз импульсов должны производиться без задержек, а Q = 3423Т2423 Эта последовательность легко реализуется при помощи современных аппаратурных средств и, вероятно, станет стандартной методикой развязки на спектрометрах, которые будут выпускаться после 1984 г. На рис. 7.10 приводится сравнение эффективности развязки WALTZ-16 с более старой схемой модуляции (прямоугольная волна с разверткой по частоте). Использование для развязки составных импульсов в значительной степени решает проблему нагревания образца даже на спектрометрах с частотой 500 МГц. В спектрах, полученных в условиях широкополосной развязки, становятся возможными измерения с высоким разрешением, поскольку ширина линии может достигать 0,25 Гц и менее;

Дополнительные сведения об экспериментальных методах WALTZ-16

-3

- 2 - 1 0 1 расстройка,

прямоугольная

-3

235

волна

- 2 - 1 0 1 2 расстройка, кГц

РИС. 7.10. Сравнение результатов широкополосной развязки с применением методики WALTZ-16 и с помощью обычно используемой в продающихся приборах схемы модуляции (прямоугольная волна с разверткой по частоте). Наблюдается углеродный сигнал бензола при различном отклонении частоты развязки от частоты сигнала протонов. Напряженность поля в обоих случаях одинакова. Ширина линии в спектрах WALTZ-16 не превышает 0,3 Гц. соответствующее ей увеличение Т2 во временной области может быть очень полезно в экспериментах по спиновому эху. Наконец, становится значительно более реальной широкополосная развязка и от других ядер, 31 например от Р при наблюдении *Н. Ширина полосы эффективной развязки для WALTZ-16 при использовании поля с амплитудой В2 составляет около 2В2. Мощности порядка 5 кГц легко получаются без привлечения очень высоких мощностей радиочастотного сигнала, но это, конечно, зависит от датчика и частоты ядер. На спектрометрах со средней напряженностью поля (250 МГц) это позволяет, например, получать спектры 1 3 С в диапазоне 160 м. д. или спектры 1 9 F в диапазоне 40 м. д. с вполне эффективной развязкой и узкими линиями. Если допускается большее остаточное уширение линий, то можно использовать другие последовательности, дающие еще более широкую полосу развязки (например, GARP-1 [11] имеет полосу эффективной развязки шириной около 5Д 2 ).

7.5. Релаксация и повторение прохождений 7.5.1. Введение В экспериментах, где требуется усреднение многих прохождений, связь между двумя параметрами релаксации Ti и Т2, идеальной длительностью импульса а и частотой повторения прохождений Тг довольно сложна. Однако часто можно сделать некоторые упрощающие предположения, позволяющие подобрать оптимальные параметры эксперимента, при условии, что мы уже знаем величины Tt и Т 2 . Измерить на практике величину Т2 довольно трудно, но на концентрированных образцах по методике, описанной в разд. 7.5.2, можно приближенно измерить величину ^ . к о т о р а я даст верхнюю границу Т 2 . В этом разделе мы рассмотрим те факторы, которые необходимо учитывать при выборе

236

Глава 7

параметров эксперимента. Заметьте, что нашей основной целью будет получение максимальной чувствительности при минимальных ложных сигналах, а не количественное измерение интенсивностей, для которого требуется установление равновесных, а не стационарных условий (разд. 7.6).

7.5.2. Длительность импульса и частота повторения прохождений Во многих экспериментах длительность импульса определяется не соображениями релаксации, а, например, необходимостью выполнения определенных типов переноса поляризации (см. гл. 8). В этом случае частота повторения прохождений-единственный произвольный параметр. Однако в обычных одномерных спектрах мы можем произвольным образом выбирать и длительности импульса и частоту повторения прохождений, причем оба этих параметра будут оказывать значительное влияние на результаты эксперимента. Чтобы разобраться в этом, мы должны рассмотреть два взаимосвязанных явления-поведение z-намагниченности и поведение намагниченности в плоскости х — у. Относительная скорость восстановления z-намагниченности (по сравнению с частотой повторения прохождений) будет определять амплитуду регистрируемого сигнала. Если же мы повторяем импульсы настолько часто, что поперечная намагниченность к следующему импульсу полностью не исчезает, то картина значительно усложняется. Для начала легче вообще исключить из рассмотрения поперечную намагниченность, т. е. предположить, что Т2 « 7"i, и заниматься только z-компонентой. Но, к сожалению, такое предположение слишком далеко от реальности, и позже мы будем вынуждены рассмотреть ситуацию, когда оно не работает. Воздействие Ti/2-импульса на образец, находящийся в состоянии теплового равновесия, даст нам максимальный сигнал ЯМР, поскольку при этом вся намагниченность переводится в поперечную плоскость. Однако при усреднении многих прохождений такая длительность импульса-не самый лучший вариант, поскольку г-намагниченность не будет каждый раз успевать восстанавливаться в достаточной степени, если, конечно, промежуток между импульсами Тг не будет во много раз превышать 1\. Низкая частота повторения прохождений не эффективна, и поэтому такая ситуация редко встречается на практике, за исключением экспериментов по измерению Ту, где необходимо регистрировать именно равновесную намагниченность. Гораздо лучше сделать задержку между прохождениями равной времени выборки, которое определяется требованиями к разрешению, и подобрать такую длительность импульса а, чтобы максимизировать создающуюся в стационарном состоянии z-намагниченность. Точная величина а зависит от отклонения частоты сигнала от резонансной [12], но можно взять некую среднюю оптимальную величину а Е (угол Эрнста), определяющуюся выражением

Дополнительные сведения об экспериментальных методах = e~r'-/:ri

237 (7.7)

В условиях Т$ х Т2 х Tj и Тг(= А,) > Т2 эта длительность импульса будет наилучшей. Именно в таких условиях и регистрируется на практике большинство протонных спектров (хотя при количественных измерениях мы можем склоняться к выбору более коротких импульсов). Но при наблюдении гетероядер, где требования к разрешению могут быть ниже, А, короче, и Т2 уменьшено за счет неполной развязки, или в двумерных экспериментах, где время выборки всегда имеет величину порядка Tf, такие условия используются редко. Если наш эксперимент подразумевает обязательное использование 7г/2-импульсов (или в какой-либо последовательности нам необходимо полностью устранить z-намагниченность), то, очевидно, приведенная выше формула не может быть использована для определения оптимальной длительности импульса. В этом случае мы должны найти компромисс между повышением чувствительности за счет увеличения числа прохождений в заданный промежуток времени и ее понижением за счет уменьшения z-намагниченности в стационарном состоянии. В предположении полного затухания поперечной намагниченности в промежутках между прохождениями можно показать, что оптимальная частота повторения прохождений задается формулой Т г = 1,27Т\ [13]. В этом случае мы получим отношение сигнал/шум, составляющее. 80% от аналогичного эксперимента с большей частотой повторения прохождений и углом Эрнста для импульса, если бы он был возможен. Для многих экспериментов, включающих устранение z-намагниченности с помощью последовательности импульсов, где поперечная намагниченность действительно затухает между прохождениями или где описанные выше эффекты не влияют на результат, лучшим выбором частоты повторения прохождений будет 1,3 Т1. Но предполагавшиеся выше условия выполняются далеко не всегда. Гораздо вероятнее, что наше Т* будет значительно меньше Т2, в свою очередь Т2 может быть меньше 1\, и, будучи ограничены во времени, мы заинтересованы в таком времени выборки, чтобы получить спектр с плохим разрешением, но без потери сигналов (т. е. А, = Т*). Почти все двумерные эксперименты и многие одномерные эксперименты по наблюдению гетероядер производятся в этих условиях. Повторение прохождений с Тг< Т2 приводит к появлению стационарного эха [14], поскольку существующая к моменту следующего импульса поперечная намагниченность рефокусируется во время прохождения. Анализ такой ситуации слишком сложен, чтобы приводить его здесь (см. работы [14, 15]). На практике можно получить следующие результаты. В одномерных спектрах, полученных в таком режиме, фазы и интенсивности сигналов оказываются зависящими от отклонения их частоты от резонансной, если, конечно, а не равен углу Эрнста. Однако такой угол не будет оптимальным с точки зрения чувствительности; предпочтительнее импульсы большей длительности. В экстремальном

238

Глава 7

случае, когда Тг = Г | и Т* « Т2, Tt (например, при плохой однородности постоянного поля), оптимальная длительность импульса становится независимой от 7j [15] и составляет около 0,4л. На практике использование фазовых циклов типа процедуры CYCLOPS для подавления ложных сигналов при квадратурном детектировании позволяет в значительной степени снизить эффекты стационарного эха в одномерных спектрах. Их можно снизить еще больше с помощью периодических случайных изменений Тг [14]. В двумерных экспериментах по переносу когерентности (см. гл. 8 и 9) наличие к началу следующего прохождения остаточной поперечной намагниченности или других видов когерентности может привести к появлению ложных сигналов, поскольку импульсы этого прохождения произведут дополнительный перенос остаточной намагниченности. В этих случаях задержки между прохождениями должны быть больше, чем это требуется из соображений чувствительности. Величина 7^ порядка ЗТ, обеспечит достаточное затухание всех видов когерентности.

7.5.3. Методы быстрого определения 7^ Все приведенные выше рассуждения подразумевают, что у нас уже есть какие-то предположения о величинах 7\ в нашем образце. Если он достаточно концентрированный и дает заметный сигнал с одного прохождения, то для приближенной оценки 7\ можно использовать метод инверсии - восстановления: тс — г

Выборка ...

z-Намагниченность в конце задержки х определяется формулой М2 = М 0 ( 1 - 2 е ~ т / Т ' )

(7.8)

Интенсивность регистрируемого сигнала проходит через нуль при (7.9) Если вы выполняете серию экспериментов с различными т, начиная с очень небольшого значения для подбора параметров коррекции фазы (заметьте, что на этом этапе сигналы будут отрицательными) и заканчивая на спектре с нулевой интенсивностью интересующего сигнала (рис. 7.11), то 7\ можно получить из формулы

7; = ^ |

(7.10)

Такая оценка будет довольно грубой, но ее вполне достаточно для выбора частоты повторения прохождений и для других подобных задач. Наиболее вероятный источник ошибок состоит в слишком частом повто-

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

239

Т =0,70с

J-

—рктлрг-*

J

VT-

T = 0,23c

т =0

Рис. 7.11. Определение приближенных величин 7| методом инверсии - восстановления. Величины т соответствуют нулевой интенсивности помеченных стрелками сигналов; отвечающие им величины Г, составляют 0,3 с (средний спектр) и 1,0 с (верхний спектр). рении эксперимента, в результате чего не все ядра будут успевать полностью отрелаксировать, и мы получим заниженные величины для больших 7~i. Реальные образцы обязательно имеют различные величины Т1У ИЗ которых следует выбрать некоторую компромиссную, поэтому ошибки в их измерениях скорее всего не будут иметь серьезного значения. Однако сложность состоит в том, что оптимизация параметров регистрации спектра наиболее важна именно для разбавленных образцов, где Ti определить совсем не просто. Если проводить описанные выше эксперименты с усреднением, то между прохождениями необходимо делать задержки порядка 5Ti, что сразу делает эксперимент недопустимо долгим. В такой ситуации нужно уметь интуитивно оценивать возможные величины 7\ для соединений и ядер, с которыми вы работаете. Необходимый для этого опыт легко приобрести, измеряя все возможные Ti в каждом удобном случае. Конечно, в литературе есть большие таблицы Ту, но они не очень полезны для практических целей, поскольку содержат данные, полученные в необычных условиях (необычных с точки зрения повседневной спектроскопии; например, в обезгаженных образцах). Величины протонных Tt в молекулах среднего размера составляют обычно 1 или 2 с, хотя есть множество отклонений как в ту, так и в другую сторону. Другие ядра со спином 1/2 могут иметь чрезвычайно малые скорости релаксации, особенно этим отличаются четвертичные углероды, а также ядра 2 9 Si и 1 5 N в самом различном окружении. Для ядер : 5 N, не связанных с протонами, обычные величины Тх составляют несколько минут даже в необезгаженных образцах. Квадрупольные ядра (спин > 1/2) эффективно релаксируют за счет взаимодействия с градиентами локального электрического поля, их величины Ту почти всегда попадают в диапазон от микросекунды до, сотен миллисекунд.

240

Глава 7

7.6. Количественное измерение интенсивностей 7.6.1. Введение Интегрирование спектров с целью получения информации о площадях пиков-одна из самых обычных процедур протонной спектроскопии ЯМР. Ее точность вполне достаточна для определения числа протонов, дающих вклад в какой-либо пик. Было бы очень заманчиво использовать эту процедуру для других задач, требующих определения относительных количеств каких-либо соединений в растворе, например для экспериментов по кинетике или для количественного анализа смесей. Но если точность в 10-15%, вполне достаточная для определения числа протонов, достигается довольно легко, то точность, требующаяся для других количественных применений (допустим, лучше 1-2%), может оказаться недостижимой. В этом разделе мы коротко рассмотрим те причины, которые затрудняют использование спектроскопии ЯМР и особенно фурье-спектроскопии ЯМР для строгого количественного анализа. Эта тема подробно излагается в других руководствах по практическому ЯМР, но она настолько важна, а ожидания химиков настолько преувеличены, что, пожалуй, имеет смысл изложить здесь некоторые наиболее существенные моменты.

7.6.2. Как сделать интенсивность сигналов пропорциональной числу ядер В предыдущем разделе, где мы оптимизировали эксперимент по чувствительности, для повышения скорости регистрации спектра мы использовали режим, в котором z-намагниченность возвращалась в некоторое стационарное состояние, отличное от равновесного. Однако такой режим совершенно не подходит для количественных измерений, поскольку интенсивность сигнала зависит от величины Тх, и, если только все Ti не окажутся одинаковыми, измеренные интенсивности будут содержать ошибки. В принципе, знание величин Tt измеряемых пиков позволяет скорректировать интенсивности, но достаточно точное измерение Ti сложнее, чем простая регистрация спектра без насыщения, поэтому такой способ нельзя считать практичным. Однако полезно приближенно оценить величины Тг по методу, описанному в разд. 7.5.3, для того чтобы выбрать правильную частоту повторения прохождений и избежать насыщения. Чтобы получить представление о том, насколько трудно добиться возвращения z-намагниченности всех ядер в состояние теплового равновесия, рассмотрим несколько особых случаев. Как уже упоминалось ранее, протонные Tt составляют 1 или 2 с, но при выборе Тг мы должны учесть самое большое Гх во всей молекуле. Пусть оно оказалось равным 3 с. Если мы используем импульс длительностью а и повторяем его через каждые Тг с, то в системе установится стационарная z-намаг-

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

241

ниченность Мг, определяющаяся формулой (7.11) где М о -равновесная намагниченность. Здесь предполагается, что поперечная намагниченность успевает полностью исчезнуть между прохождениями; в количественных экспериментах это обычно реализуется. Для случая а = я/2 выражение упрощается до вида Mz = M0(l-e-Tr'Ti)

(7.12)

Будем считать, что наша стационарная намагниченность не должна отличаться от равновесной более чем на 1% (т.е. должна составлять 0,99Мо). Это значит, что для Tj = 3 с и я/2-импульса Тг должно составлять 14 с! Для более коротких импульсов ситуация слегка упрощается: при использовании я/4-импульса тем же требованиям удовлетворяет задержка в 10 с, однако дополнительные прохождения в сэкономленное время не компенсируют потери чувствительности из-за уменьшения длительности импульса, поэтому при недостаточной чувствительности такой режим не подойдет. Разумнее использовать я/2-импульс и задержку как минимум в 5Г 15 чтобы ошибки из-за насыщения не превышали 1%. Регистрация спектра в таком режиме может потребовать довольно большого времени. Например, обычное Тх ядер 1 3 С составляет 10-30 с, что требует задержки между прохождениями в несколько минут. В этом случае очень полезно для сокращения TY использовать релаксационные реагенты, такие, как ацетилацетонат хрома(Ш). Дополнительные проблемы возникают при использовании широкополосной развязки от протонов при наблюдении гетероядер. Так как развязка насыщает протонные переходы, то она может сопровождаться появлением ЯЭО (гл. 5), который значительно изменяет интенсивности сигналов независимо от эффектов насыщения. Например, максимальный ЯЭО на ядре 1 3 С составляет 200% (эта величина выражает усиление сигнала, т. е. интенсивность сигнала с ЯЭО может быть в 3 раза больше, чем без него). Эффект такой величины довольно часто реализуется на протонированных углеродах, в то время как интенсивность сигналов четвертичных углеродов может увеличиваться лишь слегка или вовсе не увеличиваться. В результате, сколько бы усилий мы ни тратили на предотвращение насыщения, все количественные измерения теряют смысл. К счастью, ЯЭО не возникает моментально при включении декаплера, для его создания требуется время, сравнимое с Тг ядра1 3 С , поэтому мы можем подавить ЯЭО, выключая декаплер между прохождениями на достаточно большое время (эксперимент с обратной прерываемой развязкой, рис. 7.12). Под словами «достаточно большое время» подразумевается промежуток, большой по сравнению с 7\ ядра 13 С . В любом случае мы не должны повторять импульсы чаще, чем через 57\, а продолжительность времени выборки едва ли составит такую 16 75

242

Глава 7 Вкпючен

Л

Н-Эвкаплер

выключен

«С

•••-—11 i

репарация

иI

ТС

/ \ у Л ^ ^ ч _ ^ ^ — Выборка

РИС. 7.12. Схема эксперимента с обратной прерываемой развязкой.

величину, поэтому использование обратной прерываемой развязки не вызывает никаких затруднений. Релаксационные реагенты помимо сокращения Ту способствуют и подавлению ЯЭО, поэтому при использовании широкополосной развязки их применение еще более желательно. Важно помнить, что при отсутствии ЯЭО и низкой частоте повторения прохождений, неизбежных в количественных гетероядерных экспериментах, реальное отношение сигнал/шум может оказаться значительно ниже величины, ожидавшейся для данной концентрации образца. Это очень осложняет эксперимент, поскольку высокое отношение сигнал/шум, как мы вскоре увидим,-необходимое условие для точных количественных измерений.

7.6.3. Регистрация спектра Обеспечив пропорциональность сигналов относительному количеству создающих их ядер, мы тем самым проделали только одну часть количественного анализа. Некорректные выполнение оцифровки данных, производящееся в фурье-спектрометрах, и выбор областей оцифрованного спектра вносят дополнительные ошибки в величины интенсивностей. Точность интегрирования зависит также и от отношения сигнал/шум, что кажется вполне очевидным, но на практике мы часто об этом забываем. И наконец, сами величины интегралов часто выглядят случайными. Этот вопрос подробно обсуждался в связи с измерением ЯЭО [16], и здесь мы только подытожим основные выводы. Мы не должны забывать, что обычный сигнал спектра ЯМР довольно узок и может быть представленным всего лишь парой точек. Величины интегралов обычно вычисляются по правилу трапеции, поэтому при недостаточной оцифровке мы получим неточные величины. Более точный способ оценки площади под сигналом состоит в итерационной подгонке теоретической линии к точкам экспериментального спектра, но мы остановимся только на простом численном интегрировании как на самом распространенном методе. Однако требования к оцифровке не так высоки. Если на ширину линии на полу высоте приходится более трех точек, то возникающие из-за этого ошибки составят не более 1%. Реальная ширина линии в протонном ЯМР может изначально составлять 0,5 Гц и увеличиваться при оптимальной фильтрации до 1,0 Гц, поэтому цифрового разрешения 0,2 Гц на точку должно

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

243

вполне хватать. Эта величина чуть меньше цифрового разрешения в спектрах с полным диапазоном (обычно 0,3-0,4 Гц), но все же она легко достижима. Недостаточная оцифровка гораздо чаще используется при наблюдении гетероядер, поэтому при выполнении количественного эксперимента необходимо или увеличить число точек в спектре, или уширить линии с помощью подходящей взвешивающей функции. Следующий фактор, который мы должны рассмотреть,— это ширина диапазона интегрирования. С точки зрения идеальной лоренцевой линии ответ очень прост: для получения 99% точности следует брать интеграл в диапазоне 20 ширин линий в обе стороны от сигнала, т. е. как минимум 20 Гц по обе стороны линии для предыдущего примера. Однако на практике при этом возникает ряд проблем. Каждая линия будет иметь 13 боковые полосы от вращения и, возможно, С-сателлиты, для того чтобы сравнение различных интегралов имело смысл, они должны или всегда включаться в диапазон интегрирования, или всегда исключаться из него. Боковые полосы первого порядка, вероятнее всего, будут попадать внутрь 20-Гц диапазона, поэтому их имеет смысл включать. К боковым полосам более высоких порядков и сателлитам следует подходить более осторожно. Лучше их, конечно, включить, но если рядом находятся другие сигналы, крылья или сателлиты которых попадают в диапазон интегрирования, то их лучше исключить. Важно быть в курсе таких проблем и в каждом конкретном случае находить способ для их решения. Процесс оцифровки спектра и способ вычисления интегралов находятся полностью под нашим контролем, поэтому систематические ошибки, производимые этими операциями, можно уменьшить до приемлемого уровня. Но остаются еще случайные ошибки, обусловленные шумом в спектре, которые можно уменьшить только тремя способами-сделать образец более концентрированным, купить спектрометр с более сильным магнитом или провести более длительное накопление. Первые два способа обычно оказываются неприемлемыми, и мы можем только увеличивать время накопления до получения подходящего отношения сигнал/шум. Однако в этом случае отношение сигнал/шум растет пропорционально квадратному корню из числа прохождений, поэтому на этот процесс не имеет смысла тратить более нескольких часов. Шумовая ошибка в величинах интегралов зависит не только от отношения сигнал/шум, но и от способа оцифровки спектра. Выше мы показали, что правильный выбор некоторых параметров снижает систематические ошибки до 1%. Аналогично можно показать, что измеряемая величина интеграла совпадает с его истинным значением с точностью + 1 % и вероятностью 99% при отношении сигнал/шум для интегрируемого пика около 250:1 (определение величины см. в гл. 3). Такая чувствительность получается без особых усилий лри наблюдении протонов, но для других ядер она может оказаться очень трудно достижимой. В качестве примера на рис. 7.13 приведен пик с отношением сигнал/шум около 250:1.

Глава 7

244

х 4

100

о

г*

-100

-200

Рис. 7.13. Вид резонансной линии при отношении сигнал/шум, равном 250:1.

7.6.4. Другие аппаратурные трудности Систематические ошибки в измерении интегралов могут возникать по целому ряду других аппаратурных причин. Одна из важнейших-это невозможность точной настройки фазы на сигнал поглощения в полном диапазоне спектра, полученного преобразованием Фурье. Пики, включающие дисперсионную составляющую, будут, очевидно, иметь меньшую интенсивность, поскольку интеграл дисперсионного сигнала равен нулю. Само по себе это явление не вносит большой ошибки, поскольку снижение интенсивности не настолько велико, чтобы заметно повлиять на отношение сигнал/шум. Ошибки возникают из-за различия фазовых сдвигов сигналов, поэтому наиболее важна именно частотно-зависимая часть коррекции фазы. В спектре с хорошим отношением сигнал/шум при помощи обычной двухпараметровой коррекции (гл. 4) можно визуально настроить фазу с точностью до нескольких градусов, но только при выполнении предположения о линейной зависимости фазы от частоты. Если же это предположение не выполняется, то перед интегрированием фазу каждого сигнала нужно настраивать отдельно. Измее нение фазы сигнала на 5 приводит к изменению интеграла на 1%. При очень прецизионных измерениях можно пользоваться специальными процедурами, позволяющими настроить фазу с высокой точностью [17], однако они нужны только на том уровне точности, когда обычное числовое интегрирование уже не подходит, и требуются итерационные процедуры обработки полной формы линии. Еще один источник обычных ошибок интегрирования-это состояние базовой линии спектра. По целому ряду аппаратурных причин даже при полном отсутствии шума базовая линия спектра (т. е. интенсивность точек в тех местах, где нет сигналов) не будет не только нулевой, но даже

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

245

Рис. 7.14. Искажение базовой линии довольно часто наблюдается тогда, когда в спектрах присутствует относительно широкий и интенсивный пик. Левый спектр был получен при включении приемника в середине задержки между импульсом и выборкой, правый-при использовании схемы, описанной в тексте. Масштаб обоих спектров по вертикали одинаковый. постоянной во всем спектре. Основная причина искривления базовой линии заключается в том, что полосовой фильтр, включенный между приемником и АЦП, способен возбуждаться проходящими через него сигналами ЯМР. Правильный подбор задержек между импульсом, включением приемника и началом оцифровки позволяет в значительной степени снизить влияние фильтра. Обычно независимо от требований базовой линии (с целью минимизации фазовой коррекции первого порядка) задержка между импульсом и регистрацией первой точки должна быть равна обратной величине скорости выборки (1/2Ж в обозначениях, принятых в гл. 2). При этом тип искажений базовой линии зависит от момента включения приемника. Как было показано [18], включение приемника после завершения 0,6 задержки придает искажениям базовой линии вид постоянного смещения от нуля (рис. 7.14). Установка момента включения приемника не всегда производится автоматически, поэтому имеет смысл проверить ее правильность. Но, как бы мы ни исправляли базовую линию, она все же оказывает влияние на величину интегралов, поэтому процедуры интегрирования всегда сопряжены с какой-либо ее коррекцией, которая может быть как автоматической, так и управляемой оператором [в форме установки параметров «отклонение» („offset" или „drift") и «наклон» („bias" или „slope")]. В пакеты программного обеспечения многих спектрометров включаются также более сложные процедуры исправления базовой линии, которые позволяют оператору вычитать различные функции из спектра с целью его сглаживания. По мнению автора, наилучшие результаты удается получить с помощью простого четырехчленного полинома с ручной, а не автоматической настройкой коэффициентов. Такая процедура предпочтительнее использования коррекции, автоматически производящейся при интегрировании. И наконец, сравнивая интегралы пиков в различных частях спектра, мы делаем предположение о линейности всей цепи событий от импульса до оцифровки данных. Мы считаем, что импульс в одинаковой степени возбуждает сигналы всего спектрального диапазона (это вполне справедливо для я/2-импульса при ширине диапазона, значительно меньшей

246

Глава 7

напряженности поля Вх) и что все каскады приемника одинаково усиливают разные частоты. Последнее предположение кажется довольно сомнительным, если учесть, что приемник обычно состоит из предусилителя, смесителя, усилителя промежуточной частоты, еще одного смесителя, усилителя звуковой частоты, настраивающегося фильтра звуковых частот и АЦП. Фильтр звуковых частот, использование которого необходимо для повышения чувствительности,-самый первый кандидат на роль создателя нелинейности в спектральном диапазоне. Вместо теоретического разбора этого вопроса для конкретного спектрометра лучше проделать экспериментальный тест, состоящий в регистрации спектров образца с единственной линией, помещая ее в разные места спектрального окна. Такой эксперимент не эквивалентен регистрации спектра с фиксированной несущей частотой и набором линий в разных местах спектрального окна, но он все же позволяет оценить величину возникающих при этом ошибок. Мораль этого раздела состоит в том, что в фурье-спектроскопии ЯМР существует множество факторов, влияющих на точность количественных измерений, и, несмотря на то что ошибки каждого из них можно снизить до 1% или около того, суммарная ошибка все же остается значительной. Вообще, ко всем измерениям, точность которых якобы превышает несколько процентов, лучше подходить скептически, если, конечно, вам не станет ясно, что все описанные выше факторы были учтены.

7.7. Селективное возбуждение и подавление 7.7.1. Введение В некоторых обстоятельствах бывает полезно возбудить сигналы только части спектрального диапазона, оставив остальные невозбужденными. В зависимости от соотношения частей диапазона, подвергшихся и неподвергшихся воздействию, мы можем говорить о селективном или «скроенном» („tailored") возбуждении или, наоборот, подавлении пиков. При подавлении пиков наиболее частая задача состоит в устранении одного интенсивного сигнала с целью обойти трудности, связанные с большим динамическим диапазоном (см. гл. 3). В качестве примеров использования селективного возбуждения можно назвать эксперименты по нестационарному ЯЭО и SPI и процедуры по выделению небольших частей сложного спектра. Это очень большая тема, и, чтобы избежать излишнего затягивания, мы рассмотрим несколько методов, использующихся для решения часто встречающихся задач.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

247

7.7.2. Подавление пиков Подавление пиков предварительным насыщением. Обзор литературы по подавлению пиков содержал бы огромный список методов, поскольку эта область очень популярна среди экспериментаторов. Но, к счастью, это тот самый редкий случай, когда мы можем однозначно утверждать, что один из методов - предварительное насыщение-самый лучший. Однако нужно сразу добавить, что это верно только тогда, когда подавляемый пик не участвует в химическом обмене с другими интересующими нас сигналами. Предварительное насыщение в отсутствие химического обмена - лучший метод понижения интенсивности сигналов в том смысле, что оно сочетает в себе возможность значительного подавления сигнала с минимальным возмущением оставшейся части спектра. Нас интересуют два критерия: насколько мы можем ослабить мешающий сигнал и что при этом произойдет с остальными пиками. Предварительное насыщение представляет собой облучение подавляемого сигнала слабым радиочастотным полем, достаточно долгое для устранения разности заселенностей по соответствующему переходу. Чтобы близкие к подавляемому сигналы не испытывали сдвигов Блоха Зигерта, непосредственно перед импульсами и выборкой данных облучение выключается (рис. 7.15). Обычно проблемы динамического диапазона возникают в протонных спектрах, и облучение удобно осуществлять с помощью декаплера. Оптимизация эксперимента состоит из подбора напряженности поля и длительности облучения. Напряженность поля В2 должна быть такой, чтобы «фактор насыщения» В\ТХТ2 {В2 в герцах) оказался сравнительно большим (например, > 100), а облучение должно быть достаточно длительным, чтобы насыщение успело установиться (например, в несколько раз больше Т2). Подавление пиков необходимо чаще всего в водных растворах, поскольку остаточные сигналы воды велики, а многие вещества биологического происхождения растворимы только в воде, имеют высокую молекулярную массу и доступны в небольших количествах, так что подавляемый пик-это обычно HDO. Его времена Тг и Т2 (сильно зависящие, однако, от растворенного вещества) могут составлять 5 и 1 с, поэтому включения поля В2 напряженностью 20 Гц на 2-3 с должно быть достаточно. Эти параметры легко подобрать экспериментальным

Эекаплер

передатчик

селективное насыщение

«.

, \ у

х

^

^

в ы б о р к а

РИС. 7.15. Схема эксперимента по подавлению пиков с помощью предварительного насыщения.

248

Глава 7

путем и без знания характеристик релаксации, поскольку образецочевидно, довольно концентрированный, и предварительные эксперименты не потребуют много времени. Задача подбора параметров заключается в снижении напряженности поля для повышения селективности и сокращении времени облучения для увеличения частоты повторения прохождений при сохранении приемлемого подавления. Хотя основная цель подавления сигналов-это уменьшение динамического диапазона, оно требуется только при отношении интенсивностей, большем чем несколько тысяч к одному (для АЦП с длиной слова 12 бит). Подавление для улучшения общего вида спектра полезно и при меньших отношениях интенсивностей (рис. 7.16). Подавление интенсивного пика может облегчить наблюдение его слабых соседей и снизить искажения базовой линии. При проведении двумерных экспериментов, как, например, COSY (гл. 8), насыщающее поле желательно выключать перед выполнением последовательности (я/2 — /t — л/2 — Выборка). Однако это может привести к недостаточному восстановлению намагниченности растворителя за время tt. В этом случае насыщающее поле следует оставлять до начала интервала t2, т. е. до выборки данных. Наличие поля В2 во время

5,4

5 , 25 , 04 , 84 , 6 4 , 4 4 , 2 4 , 03 , 83 , 63 , 4 м.Э.

3 , 2

Рис. 7.16. Подавление сигнала HDO с помощью предварительного насыщения. Часть нижнего спектра в середине усилена в 8 раз. Пик HDO подавлен на верхнем спектре.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

249

промежутка tx может вызвать в преобразованном спектре сдвиги Блоха -Зигерта только по оси v x , что нарушит его симметрию. Например, упоминавшееся выше поле с амплитудой 20 Гц вызовет заметные сдвиги сигналов в диапазоне в несколько сотен герц. Таким образом, этот эффект может создавать серьезные осложнения. Схема предварительного насыщения перестает работать, когда облучаемый сигнал участвует в химическом обмене с другими интересующими нас ядрами, на которые таким образом будет переноситься насыщение. Эта проблема часто возникает при подавлении сигналов воды в водных растворах. Протоны воды неизбежно будут обмениваться с такими функциональными группами, как ОН и NH. Кроме того, если нам нужны именно их сигналы, то мы не можем использовать в качестве растворителя дейтерированную воду. В результате предварительное насыщение неприменимо именно там, где оно больше всего нужно. В такой ситуации, очень часто встречающейся в биологических экспериментах, необходимо применять другие методы, не использующие облучение сигнала воды. Подавление пиков «скроенным» возбуждением. Существует множество схем «скроенного» возбуждения, которые «раскрывают» частотное распределение возбуждающего импульса таким образом, чтобы исключить воздействие на некоторую спектральную область. В общем случае они состоят из замены жесткого неселективного импульса группой слабых импульсов или последовательностью жестких импульсов, производящих аналогичный эффект (один из видов составных импульсов). Наиболее распространенный метод «мягкого импульса»-это редфилдовский 2-1-4-«скроенный» импульс [19]. Но при всей эффективности его можно применять только на спектрометрах, позволяющих производить длительные слабые импульсы, что часто оказывается недоступным. Кроме того, при необходимости значительного подавления пиков он очень чувствителен к выбору параметров. В последние годы был предложен целый ряд жестких составных импульсов для достижения того же эффекта. Эти методы имеют более широкую область применения, поэтому мы ограничимся их кратким описанием. Последовательность

А

(А

- I —т —I- I ^/ х

Выборка

...

\£/ —х

известна под названием «прыжок-возврат» („jump and return", J R) [20]. Она вполне понятна и послужила прародителем целого семейства экспериментов. Если частоту передатчика настроить точно на подавляемый пик, то во время задержки т он будет оставаться постоянным во вращающейся системе координат, и второй импульс вернет его на ось z. Остальные же пики во время задержки т будут прецессировать, и их намагниченность частично, а может быть, и полностью, не подвергнется воздействию второго импульса (рис. 7.17). Очевидно, что любой сигнал, успевший за время т совершить прецессию точно на я, 2л... (т. е. линии на

Глава 7

250

-выборка

В

А

Рис. 7.17. Воздействие двух импульсов «прыжок-возврат» на систему из двух линий, одна из которых находится точно в резонансе, другая смещена по частоте на 1/4 т.

частотах 1/2т, 1/т Гц... от опорной), также будет подавлен, а сигналы в диапазоне от 0 до 1/2т будут возбуждаться в неодинаковой степени с максимумом на частоте 1/4т. Поэтому т подбирается таким образом, чтобы поместить интересующий нас спектральный диапазон в область максимального возбуждения. Недостатки этого эксперимента, общие для всех экспериментов такого типа, сразу понятны. Неравное возбуждение частей спектра делает невозможным количественное сравнение интенсивностей сигналов. Вероятно, это неизбежная плата за возможность не возмущать сигнал растворителя. Кроме того, ширина полосы «нулевого возмущения» передатчика сравнительно невелика. Если сигнал растворителя широк, или имеет боковые полосы, или частота передатчика неправильно настроена, то подавление растворителя будет неполным. Мы можем построить последовательность с лучшими характеристиками. Например, можно расширить нулевую полосу передатчика, добавив в последовательность новые импульсы с длительностями, определенными из коэффициентов биномиального разложения [21]. Используя введенное ранее сокращенное обозначение, мы можем записать последовательность «прыжок-возврат» как IT. Тогда_другие представители этой серии будут выглядеть как 121, 133Т, 14641 и т.д. (подразумевается, что все импульсы разделены задержками т). При этом импульс «1» не обязательно имеет длительность тг/2; важно, чтобы сохранялось правильное соотношение длительностей импульсов в последовательности. Имеет смысл только суммарный угол поворота всех импульсов, который определяет эффективный угол поворота намагниченности сигналов, находящихся на расстоянии 1/2т от резонанса. Обычно он выбирается я/2 или меньше. Таким образом, обычный «прыжок - возврат» оказывается нетипичным представителем серии,

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

251

поскольку его эффективный угол на указанных частотах составляет я (т.е. нулевое возбуждение). Наилучший компромисс между сложностью последовательности и ее эффективностью-это, наверное, последовательность 1ЗЗТ. При ее выполнении экспериментатор может выбрать суммарный угол тг/4 и подобрать т исходя из величины спектрального диапазона. Например, для наблюдения большинства нормальных протонных спектров области максимального возбуждения следует поместить на расстоянии + 4 м. д. от сигнала воды. Тогда на спектрометре с частотой 500 МГц задержка т будет составлять около 250 мкс. Поскольку длительность импульса «1» должна составлять 1/8 от я/4, он может оказаться слишком коротким для его практического выполнения. Выход состоит в ослаблении поля Вх с помощью аттенюатора до такой величины, чтобы получить разумную длительность. Если длительность я/4-импульса составляет 4 мкс без аттенюатора, то длительность «1»-импульса будет 0,5 мкс. Для большинства спектрометров лучше всего увеличить ее как минимум до 2-3 мкс с помощью аттенюатора в 12-15 дБ, что позволит избежать нежелательных эффектов от его плохой формы. Некоторые спектрометры позволяют автоматически подключать аттенюатор, в остальных же необходимо использовать внешнее устройство, подключаемое к выходу передатчика. При использовании последнего способа имейте в виду, что аттенюатор следует включать между передатчиком и предусилителем, а не между предусилителем и датчиком, поскольку это приведет к ослаблению наблюдаемых сигналов ЯМР. Импульс 133Т позволяет получать спектры с понижением интенсивности сигнала растворителя в несколько тысяч раз, сравнимым

5,4

5 , 2 5 , 0 4 , 8 4,6 4 , 4 4 , 2 4 , 0 3 , 8 3 , 6 3 , 4 м.8.

3 , 2

Рис. 7.18. Подавление сигнала растворителя с помощью импульса 1331 (спектр с неподавленным сигналом приведен на рис. 7.16). Обратите внимание на то, что единственный сигнал слева от растворителя имеет обратную фазу.

252

Глава 7

с результатами эксперимента с предварительным насыщением. Фаза спектра сильно зависит от частоты сигналов, но зависимость носит приблизительно линейный характер, и ее можно скомпенсировать обычным путем. Кроме того, сигналы, находящиеся по разные стороны от опорной частоты, имеют противоположные фазы, поэтому, если у вас нет специальной процедуры фазовой коррекции, одна половина спектра окажется перевернутой (рис. 7.18).

7.7.3. Селективное возбуждение Селективное возбуждение мягкими импульсами. Наиболее прямой способ возбуждения ограниченной спектральной области-это снижение амплитуды поля Bt. Каким же образом амплитуда поля связана с шириной полосы эффективного возбуждения импульса? Заметьте, мы хотим перейти от зависимости амплитуды радиочастотного поля от времени к ее зависимости от частоты, т.е. перейти от временного представления к частотному. При условии линейности спиновой системы (т.е. при условии равенства отклика на комбинацию возбуждений сумме откликов на отдельные возбуждения) это можно сделать, подействовав преобразованием Фурье на функцию во временной области. Фурье-образ прямоугольного импульса (прямоугольник - хорошее приближение огибающей импульса, получающегося при включении и последующем выключении передатчика) - это бесконечная функция (sinx)/* или sincx (см. гл. 2, рис. 2.16). Кривая sincx, соответствующая импульсу длительностью т, проходит через нуль каждые 2/т Гц; область равного возбуждения находится внутри первой пары нулей, допустим, в области ±0,2/т от центральной частоты. Однако с точки зрения селективности (т.е. отсутствия возбуждения прочих сигналов) активную область следует распространить на большие расстояния, возможно, на + 10/т от центральной частоты, поскольку заметное возбуждение наблюдается не только внутри первой пары нулей. Таким образом, чтобы избежать воздействия на сигналы, не входящие в область 200 Гц, мы должны использовать импульс длительностью как минимум 50 мс; при этом следует выбрать такую напряженность поля, чтобы получить нужный угол поворота (например, 5 Гц для я/2-импульса). Учтите, что селективность такого эксперимента будет намного ниже величины, ожидавшейся на основании измерений только напряженности поля; объясняется это формой импульса. Но при своей недостаточной селективности импульс длительностью 50 мс пригоден для создания равномерного возбуждения лишь в узком диапазоне порядка + 4 Гц вокруг резонансной частоты. Такие мягкие прямоугольные импульсы, несмотря на их очевидные недостатки, находят широкое применение. Если они нужны на протонной частоте, например для описанного в гл. 6 эксперимента SP1 или для инверсии сигналов при измерении нестационарного ЯЭО (гл. 5),

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

253

Рис. 7.19. Зависимость возбуждения, создаваемого одинаковыми прямоугольным (внизу) и гауссовым (вверху) импульсами, от расстройки. Длительность импульсов 80 мс, расстройка увеличивается с шагом 2,5 Гц. то в качестве источника облучения можно использовать декаплер: настройка его на нужные длительности импульса и напряженности поля обычно не вызывает затруднений. Если прибор позволяет управлять амплитудой радиочастотного сигнала во время самого импульса, то можно получить результаты с большей селективностью за счет выбора подходящей формы импульса. Придав огибающей импульса гауссову форму, мы устраняем боковые лепестки, присущие частотной характеристике прямоугольного импульса, и обеспечиваем быстрый и плавный спад возбуждения при удалении частоты от резонанса [22]. Это очень похоже на устранение «виглей» с помощью аподизации усеченных данных (гл. 2). На рис. 7.19 сравниваются зависимости эффективности возбуждения от отклонения от резонанса для прямоугольного и гауссова импульсов эквивалентной длительности. Селективное возбуждение с помощью DANTE. Почти все спектрометры имеют стандартный источник облучения с настраиваемой мощностью, который может работать на частоте протонов в течение большого промежутка времени (декаплер). Однако такой же источник, работающий на частоте других ядер, встречается гораздо реже. Конечно, мы можем попытаться использовать для этого широкополосный передатчик, понизив его выходную мощность, но конструкция импульсных усилителей часто не позволяет им работать дольше нескольких сотен микросекунд, и включение на более длительное время приводит к выходу из строя. Поэтому при необходимости создания селективного импульса на частоте гетероядра (например, при выполнении переноса поляризации с 3 1 Р) необходимо пользоваться другими методами. Это, например, последовательность DANTE (Delays Alternating with Nutations for Tailored Excitation-чередование задержек и нутаций для «скроенного» возбуждения) [23], состоящая из т жестких импульсов, имеющих

Глава 7

254

очень малый угол поворота, постоянную фазу и одинаковые интервалы между собой: а — т — а — т — а — х — а — т — а — т — ... Действие этой последовательности на спиновую систему можно проанализировать аналогично прямоугольному импульсу, выполнив преобразование Фурье всей цепи или рассмотрев ее с точки зрения векторной модели. В последнем случае сигнал, находящийся точно на частоте передатчика, будет постоянным во вращающейся системе координат в интервале т. Малые импульсы будут суммироваться, и общий угол поворота всей последовательности составит та. Остальные резонансы в промежутках между импульсами будут прецессировать и, таким образом, окажутся менее возбужденными, если, конечно, не будут успевать сделать целое число поворотов. Следовательно, частотная характеристика возбуждения будет иметь лепестки через каждые 1/т. Гц;

—I— 32

—I— 30

—I— 28

26

22

—1— 18

16

Рис. 7.20. Спектр 1 3 С холестерилацетата без развязки от протонов очень сложен даже на частоте 125 МГц (средний спектр); использование описанной в тексте последовательности DANTE позволяет извлекать из него отдельные мультиплеты (два верхних спектра).

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

255

более детальный анализ показывает, что каждый лепесток имеет форму функции sine*. Селективность облучения внутри каждого лепестка определяется полной длительностью последовательности тг; расстояние между нулями на кривой sincjc составляет приблизительно 2/тх. Следовательно, нужно выбирать такую величину а, чтобы она составляла незначительную часть от требуемой длительности импульса, а тх оставался малым в сравнении с временем релаксации. Короткие импульсы не очень удобны, избежать их использования можно с помощью деления выходной мощности передатчика. Величина т подбирается так, чтобы лепестки частотной характеристики не попали на те пики, которые не следует возбуждать. Частота передатчика настраивается на интересующий нас диапазон. Последовательность DANTE можно использовать во всех экспериментах, где требуется селективное возбуждение. На рис. 7.20 приведен 13 пример разделения с ее помощью сложных спектров С на отдельные сигналы. Во время генерирования DANTE включается широкополосная развязка от протонов, т и т выбраны таким образом, чтобы последовательность в сумме была эквивалентна тг/2-импульсу. Во время выборки декаплер выключается, что позволяет регистрировать мультиплетную структуру сигналов.

7.8. Несколько тестов для спектрометра Описанные в гл. 3 тесты на чувствительность, форму линии и разрешение служат основными критериями качества спектрометра, и именно на них тратится значительная часть времени при покупке нового прибора. Однако круг различных производителей спектрометров не так широк. Даже если вам покажется, что тот или иной прибор имеет самые хорошие характеристики, то в болЪе реальных условиях окажется, что между ним и остальными приборами нет существенных различий. Но затраты на покупку современного спектрометра ЯМР довольно велики даже для крупных промышленных концернов, поэтому имеет смысл упомянуть несколько менее очевидных тестов, позволяющих более детально оценить качество прибора. Эти тесты нельзя назвать стандартными, поэтому при сравнении спектрометров вы должны точно определить свои намерения и убедиться, что тесты на разных приборах производятся в строго одинаковых условиях. Не все из этих тестов предназначены для количественного определения характеристик спектрометра. Оценить количественно такие важные показатели, как, например, кратковременную стабильность отношения поле/частота или однородность поля Ви может быть очень непросто, в то время как качественное сравнение сделать довольно легко. Оценка других качеств прибора, таких, как стиль программного обеспечения,-дело чисто субъективное, но не менее важное. При покупке прибора труднее всего решить, какие же задачи вы собираетесь решать

256

Глава 7

с его помощью. В университетах обычный ответ на этот вопрос-«все», но этот ответ не самый лучший. В промышленности круг задач может быть гораздо более определенным. Относительная важность различных качеств спектрометра определяется предполагаемыми задачами. Например, если вы собираетесь регистрировать только рутинные протонные спектры, то все обычные тесты и все тесты из этой главы можно не проводить. Приборы всех четырех основных производителей (фирмы JEOL, Bruker, Ge NMR Instruments и Varian) имеют вполне пригодные для этой цели характеристики. Лучше обратите внимание на пакеты программного обеспечения: насколько быстро, легко и удобно с ними работать? Сможет ли неспециалист овладеть ими за час или два? В какой степени возможна автоматизация операций? Отвечает ли требованиям документация? (часто основной недостаток состоит именно в этом). Это наиболее важные вопросы, на которые вы должны получить ответ. Однако их очень трудно или даже невозможно выяснить во время короткой демонстрации спектрометра. Лучше всего обсудить их со сторонними пользователями приборов. Конечно, все они будут жаловаться и критиковать производителей; но, возможно, пользователи одних приборов будут настроены заметно критичнее, чем пользователи других. Если ваш прибор будет использоваться в нерутинном режиме, где потребуется предельная чувствительность, разрешение или еще чтонибудь, то вам необходим совершенно иной подход к его оценке. Программное обеспечение сохраняет всю свою значимость, но некоторое неудобство работы с ним вполне можно будет допустить. Ключевым его достоинством становится гибкость. Для многих экспериментов из оставшейся части этой книги необходимо надежно контролировать импульсную последовательность в микросекундном масштабе времени. Для двумерных экспериментов важно наличие мощных вычислительных средств, позволяющих максимально свободно проводить обработку данных. К сожалению, большинство современных спектрометров не обладает этими свойствами в достаточной мере, и фирмы продолжают совершенствовать программное обеспечение своих приборов; поэтому такие свойства необходимо тщательно анализировать при покупке. Даже если программные средства прибора обеспечивают превосходное управление экспериментом, то проверьте, дают ли конкретные эксперименты требующиеся результаты. Такие характеристики прибора, как стабильность, постоянство отношения поле/частота, диапазон и точность фазовых сдвигов, диапазон и воспроизводимость длительности импульсов, форма импульса, однородность поля Ву, не так легко оттестировать, однако они могут полностью испортить результаты многоимпульсных экспериментов. Приводящиеся далее тесты позволяют получить хотя бы качественную информацию о некоторых из них.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

257

Измерьте длительность я-импульса и затем повторите измерения с другими фазами импульса (их должно быть как минимум 4, а можно и больше): полученные величины не должны различаться. Проанализируйте форму остаточного сигнала я-импульса, она характеризует однородность поля Bt. Проверьте, точно ли кратным длительностям я-импульса (т.е. 2я-, Зя-импульсам и т.д.) соответствуют точки нулевой интенсивности сигналов. Если это не так, значит, передатчик плохой и не может генерировать длительные импульсы. Если последний тест прошел, то сравните длительность я-импульса с его длительностью при понижении выходной мощности передатчика на 12 дБ. Она должна увеличиться ровно в 4 раза; другие соотношения могут свидетельствовать о плохой форме импульса (но убедитесь, что делитель точно откалиброван). Чувствительный тест сразу на все характеристики спектрометра-это разностная спектроскопия. Попробуйте зарегистрировать два прохождения одного и того же спектра, содержащего единственную линию, и вычтите их друг из друга (убедитесь, что задержка между прохождениями обеспечивает полную релаксацию). Амплитуда остаточного пика будет определяться кратковременной стабильностью (см. гл. 5). Проделайте это несколько раз, чтобы получить диапазон возможных величин. Выполните этот эксперимент, поменяв фазу передатчика и заменив вычитание сложением. Должен получиться тот же результат; изменившийся результат свидетельствует о плохой отработке фазовых сдвигов. Отличные от 180° фазовые сдвиги проверить сложнее; на спектрометрах недавнего выпуска, позволяющих создавать небольшие фазовые сдвиги, попробуйте провести с различными ср эксперимент: Выборка ... Амплитуда сигнала должна быть пропорциональна sin ср. Фазовые сдвиги в канале декаплера можно проверить с помощью модифицированного варианта калибровки длительности импульса на «других ядрах» (разд. 7.2.3): 13

С:

Выборка ... 'п 2. ..

При точной калибровке длительности протонного я/2-импульса интенсивность компонент дублета 1 3 С должна быть пропорциональна cos (р. Дальнейшую проверку фазовых сдвигов и общей стабильности спектрометра можно проделать с помощью эксперимента по многоквантовой фильтрации максимально возможного порядка (не обяза17-75

258

Глава 7

тельно двумерного, см. гл. 8, разд. 8.4.3 и последнюю часть разд. 8.5.1). Проанализируйте степень подавления нежелательных пиков и степень возбуждения желательных. Двумерная спектроскопия (гл. 8-10) в общем случае очень чувствительна к дефектам спектрометра. Выполните эксперимент COSY (гл. 8) на концентрированном образце, где обычный шум пренебрежимо мал. Проанализируйте величины «шума по /t» (гл. 8, разд. 8.3.6), которые очень чувствительны к качеству спектрометра, но убедитесь, что все условия проведения эксперимента (ширины спектров, углы импульсов, задержки, режимы обработки данных и функции окна) одинаковы на сравниваемых спектрометрах и спектры не «симметризованы» (разд. 8.3.6). Особенно чувствительна к прибору J-спектроскопия (гл. 10); зарегистрируйте ./-спектр без использования EXORCYCLE и посмотрите, на что похожи ложные пики [24, 25]. Попробуйте, наконец, провести эксперименты того типа, которые вы собираетесь выполнить на этом приборе. Сначала испытайте простые образцы, свойства которых вам уже известны, а затем сложные, которые вы еще никогда не исследовали. Попробуйте очень разбавленные и очень концентрированные образцы (не удивляйтесь, дефекты электроники приемника могут проявиться как раз на интенсивных сигналах). Посмотрите, нет ли в спектре выбросов на частоте передатчика, других выбросов, квадратурных пиков и т.д. Получите спектр без использования фазового цикла CYCLOPS и посмотрите, насколько он ухудшился. Попробуйте зарегистрировать спектр одновременно с выполнением серьезной вычислительной задачи (например, двумерного преобразования Фурье); часто компьютер или система его дисков могут наводить помехи в радиочастотном канале спектрометра. Литература 1. Giinther Я„ Wesener J.R., J. Mag. Res., 62, 158 (1985). 2. Thomas D.M., Bendall M.R., Pegg D. Т., Doddrell D.M., Field J., J. Mag. Res., 42, 298 (1981). 3. Freeman R., Kempsell S. P., Levitt M.H., J. Mag. Res., 38, 453-479 (1980). 4. Levitt M.H., Ernst R.R., J. Mag. Res., 55, 247-254 (1983). 5. Shaka A.J., Freeman R., J. Mag. Res., 55, 487-493 (1983). 6. Shaka A.J., Bauer C.J., Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984). 7. Levitt M.H., Freeman R., J. Mag. Res., 43, 65 (1981). 8. Levitt M.H., Ernst R.R., Mol. Phys., 50, 1109-1124 (1983). 9. Waugh J.S., J. Mag. Res, 50, 30-49 (1982). 10. Shaka A.J., Keeler J., Freeman R., J. Mag. Res, 53, 313-340 (1983). 11. Shaka A.J., Barker P. В., Freeman R., J. Mag. Res, 64, 547-552 (1985). 12. Ernst R.R., Anderson W.A., Rev. Sci. fast, 37, 93-102 (1966). Это первая работа, предлагающая использовать метод Фурье в спектроскопии ЯМР. 13. Waugh J.S., J. Mol. Spec, 35, 298-305 (1970). 14. Freeman R., Hill H.D.W., J. Mag. Res, 4, 366-383 (1971). 15. Waldstein P., Wallace W.E., Rev. Sci. fast, 42, 437-440 (1971). 16. Weiss G.H., FerrettiJ.A., J. Mag. Res, 55, 397-407 (1983). 17. Herring F.G., Phillips P.S., J. Mag. Res, 59, 489-496 (1984) и ссылки в этой работе.

Дополнительные сведения об экспериментальных методах

259

18. Hoult D.I., Chen C.-N., Eden H., Eden M., J. Mag. Res., 51, 110-117 (1983). 19. Redfield A.G., in: NMR-Basic Principles and Progress (Diehl P., Fluck E., Kosfeld R., eds.), 13, 137-152, Springer-Verlag, 1976. 20. Plateau P., Gueron M., J. Amer. Chem. Soc., 104, 7310-7311 (1982). 21. Hore P.J., J. Mag. Res., 55, 283-300 (1983). 22. Bauer С J., Freeman R., Frenkiel T, Keeler J., Shaka A. J., J. Mag. Res., 58, 442-457 (1984). 23. Morris G.A., Freeman R., J. Mag. Res., 29, 433-462 (1978). 24. Bodenhausen G., Freeman R., Niedermayer R., Turner D. L., J. Mag. Res., 26, 133-164 (1977). 25. Bodenhausen G., Freeman R., Turner D.L., J. Mag. Res., 27, 511 (1977).

Глава 8

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМ Р. Корреляция за счет гомоядерного взаимодействия 8.1. Введение С помощью какого из двух основных типов экспериментов рассматривать предмет двумерной спектроскопии? Мне было трудно выбра гь между ./-разрешенной спектроскопией и корреляционной. J-Спектры, описанные в гл. 10, могут быть поняты до конца (для систем первого порядка) при использовании нашей графической векторной модели, и с этой точки зрения начать можно было бы с них. Однако эти эксперименты достаточно ограниченны по числу приложений, и у неискушенного читателя может возникнуть ощущение того, что достижение даже не очень значительных результатов с использованием этой техники потребует больших усилий. В то же время гомоядерные корреляционные спектры различных типов настолько полезны, что, очевидно, не придется разочароваться, если начать именно с них. С этой точки зрения они, по-видимому, будут полезны в качестве вводных примеров. К сожалению, нам, возможно, не удастся до конца постичь всей глубины этих экспериментов без анализа поведения макроскопической намагниченности. При этом возникает опасность напустить туману и окончательно запутать вопрос о том, что же все-таки происходит в двумерных экспериментах. Как видно из названия этой главы, я в конце концов сделал выбор в пользу корреляционной спектроскопии, надеясь на то, что возникающая при этом нестрогость описания экспериментов в достаточной мере компенсируется тем, что уже в самое ближайшее время нам удастся познакомиться с реальными химическими приложениями. Имея это в виду, я начинаю с объяснения меченых частот, которые являются основой двумерных ЯМР-экспериментов. До конца это можно осознать с привлечением понятия макроскопической намагниченности. В дальнейшем я попрошу вас принять как факт, без перепроверки, интересный результат, проявляющийся при действии второго радиочастотного импульса на систему, которая к этому моменту уже имеет определенную величину поперечной намагниченности. Это даст нам возможность непосредственно приступить к рассмотрению прикладных аспектов. В гл. 6 мы уже сталкивались с частными проявлениями этого явления, поэтому нам не составит большого труда сделать здесь некоторое обобщение. Несколько позже мы опять вернемся к вопросу

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

261

о том, что происходит во время второго импульса и постараемся прочувствовать концепцию когерентности и переноса когерентности. Однако до этого нам предстоит обсудить множество технических вопросов, связанных с концепцией двумерного эксперимента. Части этого раздела будут иметь аналогии с заключительными частями разд. 4.3 гл. 4. Ознакомление с некоторыми разделами настоящей главы можно перенести на более позднее время, когда понимание этого материала окажется необходимым. В этой главе технические детали обсуждаются подробнее, чем в остальных главах, потому что большая часть из них имеет общий характер для всех двумерных экспериментов. Основной эксперимент, на котором построено содержание этой главы, имеет множество разновидностей. В следующем разделе приводится обсуждение тех из них, которые, на мой взгляд, наиболее полезны. В заключение рассматриваются еще два корреляционных эксперимента, которые дают несколько иную информацию.

8.2. Меченые частоты Хотелось бы, чтобы вы представили себе следующий эксперимент. На первый взгляд он может показаться не очень серьезным, но на самом деле иллюстрирует основу техники, имеющей чрезвычайно важное значение для спектроскопии ЯМР. Возьмем образец, спектр ЯМР которого характеризуется только одной резонансной линией, например раствор хлороформа в дейтерированном растворителе при наблюдении протонов. Линия имеет химический сдвиг v. Проследим за превращением этой линии во вращающейся системе координат после (я/2)х-импульса, так же как мы делали много раз раньше. Для простоты будем полностью пренебрегать эффектами продольной релаксации, но учитывать поперечную релаксацию, которая определяет форму линии сигнала ЯМР. На рис. 8.1 изображена линия, которая в течение определенного времени прецессировала на частоте v (в Гц). Это время обозначим через tx, исходя из соображений, которые станут понятными в дальнейшем (эту переменную не следует путать с 7\-временем продольной релаксации). В конце интервала tt прикладывается второй (я/2)х-импульс и производится регистрация сигнала ЯМР в форме сигнала ССИ. Что же при этом происходит? Лучший способ ответить на этот вопрос-проследить за проекциями

Рис. 8.1. Амплитудная модуляция сигнала ЯМР может быть следствием варьирования интервала между двумя импульсами.

262

Глава 8

компонент намагниченности на осчх х и у. В течение интервала времени ti вектор намагниченности совершил прецессию на угол 2nvty. Если длина вектора равна М, то из простых тригонометрических соотношений (см. рис. 8.1) следует, что его компонента вдоль оси у равна М cos2nvt1, а компонента вдоль оси х равна М sin 2nvtt. Величина М в свою очередь связана с начальной намагниченностью Мо соотношением /r

M = M 0 e-'i 2

(8.1)

которое следует из определения Т2 (правильнее было бы писать Tf, однако я опускаю индекс «*» из соображений удобства набора текста). Второй импульс, обозначенный (п/2)х, поворачивает ^-компоненту намагниченности дополнительно на угол 90°, переводя ее по направлению оси z, в то время как лг-компонента остается без изменения. Таким образом, величина намагниченности, определяющая амплитуду сигнала ЯМР, составит Msin2nvt1. При этом наблюдается совершенно нормальный спектр, за исключением того, что он имеет определенное отклонение по амплитуде. Теперь представим себе, что произойдет, если мы проведем серию экспериментов с различными значениями tlt например начинающимися с нуля и монотонно возрастающими до нескольких секунд, т. е. проведем дискретную выборку интервалов tt. Если мы возьмем данные из каждого эксперимента и преобразуем их в спектр, то для каждого эксперимента получим пик, причем амплитуда пиков будет изменяться как функция 11. Действительно, она будет синусоидально осциллировать с частотой v, и величина поперечной намагниченности в конце интервала tt составит Msin2nvtl. Рис. 8.2 точно иллюстрирует этот эксперимент или по крайней мере несколько начальных значений tl (на нем изображены протонные спектры хлороформа на частоте 500 МГц!). В этом эксперименте v составляет 80 Гц и интервал между значениями tx принят равным 1 мс. Помня о том, что данные спектра ЯМР состоят из дискретного набора чисел, представим себе, что будем выбирать по одной точке из каждого спектра, причем выбранная точка должна соответствовать максимуму сигнала хлороформа. Если предположить, что система ЯМР-стабилизации нашего спектрометра работает нормально, это всегда будет одна и та же точка. Что же мы получим, записав эти точки как функцию ft? Просто график амплитуды сигнала, которая осциллирует с частотой v и затухает экспоненциально с постоянной времени Т2, как это изображено на рис. 8.3. Я надеюсь, вы сразу увидите, что этот график выглядит как некий ССИ. Конечно же, так оно и есть -это синусоидальная осцилляция, экспоненциально затухающая, и мы оцифровали ее, выбирая значения tx с некоторым шагом. Действительно, это ССИ, но не существующий в «реальном времени» как сигнал, который мы регистрируем в обычном ЯМР-эксперименте. Он генерируется точка за точкой как функция переменной ti. Чтобы подчеркнуть это, мы назовем такой график интерферограммой.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

263

Рис. 8.2. Результат использования последовательности, изображенной на рис. 8.1, с различными г,.

Рис. 8.3. Изменение амплитуды сигнала в спектре, представленном на рис. 8.2. Приведено сечение параллельно оси tt; секущая плоскость проходит через вершины пиков.

264

Глава 8

Сейчас мы отчетливо представляем себе, что если провести фурьепреобразование такого набора данных, то получится частотный спектр, содержащий лоренцеву линию с шириной 1/пТ2 и частотой v. Другими словами, то же самое мы уже получили из «обычного» ССИ, составляющего основу этого эксперимента. Большей общности, чем при преобразовании только точек, соответствующих максимумам сигнала хлороформа, мы добьемся при фурье-преобразовании каждого столбца точек, взятого из полного набора ССИ. Это равнозначно двумерной обработке нашего набора данных, т. е. вместо функции одной временной переменной, как в случае простого ССИ, это будет функция двух переменных f(tu t2)- Первый временной параметр t1 соответствует интервалу между двумя импульсами (это первое время в эксперименте, следовательно, t-L), а второй параметр является «реальным временем», в течение которого производится выборка данных. Двумерное преобразование Фурье переводит наши данные в двумерный спектр частот /( v i> уг)> и сейчас нам следует проработать вопрос о том, какую смысловую нагрузку несут переменные vx и v 2 . Очевидно, что v 2 является мерой химического сдвига v сигнала и, как мне кажется, легко видеть, что переменная vl также определяет химический сдвиг сигнала v, поскольку полученная нами интерферограмма имеет осцилляции с частотой v. Итак, мы получили квадратный спектр с двумя ортогональными осями и с сигналом, имеющим в частотном представлении максимум в точке с координатами (v, v), т. е. на диагонали (рис. 8.4). Сечением этого спектра через его центр в направлении осей vi или v 2 является лоренцева линия с шириной 1/яТ2. Это наш первый двумерный ЯМР-эксперимент. Я могу согласиться, что он не слишком впечатляющий, поскольку не содержит никакой дополнительной информации по сравнению с обычным спектром. Однако он имеет все необходимые элементы прототипа двумерного эксперимента (рис. 8.5), в котором сигнал модулируется как функция переменной t1 и затем регистрируется как функция t2. Все двумерные эксперименты

Рис. 8.4. Результат преобразования по второй координате-двумерный сигнал поглощения. Альтернативное контурное представление (справа) обсуждается ниже в тексте.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

265

Рис. 8.5. «Прототип» двумерного эксперимента.

осуществляются таким образом. Я хочу особо выделить эту мысль, чтобы обратить внимание на то, что идея, лежащая в основе двумерной спектроскопии, на самом деле исключительно проста. Композиция некоторого «нечто» и некоторого «нечто другое» на рис. 8.5 может быть сложным делом, но концепция модуляции намагниченности перед ее регистрацией проста. Причина, по которой выбранный нами эксперимент выглядит недостаточно впечатляюще, заключается в том, что намагниченность претерпевает одинаковую модуляцию как в течение времени tt, так и в течение времени t2 (прецессия на собственной ларморовой частоте). Более интересны такие эксперименты, в которых в обоих временных интервалах происходят различные процессы. В общем мы стараемся проводить двумерные эксперименты таким образом, чтобы намагниченность, которая совершала эволюцию с какой-то частотой за время /х (т.е. была «помечена» этой частотой), прецессировала с другой (отличной от первой) частотой в течение времени t2. Последняя частота в экспериментах всех типов будет описывать и химические сдвиги, и константы спин-спинового взаимодействия. Это приводит к сигналам при (v x , v 2 ) с различающимися Vj и v 2 , т.е. к недиагональным или >фосс-пикам. Для того чтобы понять, как интерпретировать эксперимент, нам нужно знать, что представляют собой частотные оси (в нашем примере они обе являются протонными химическими сдвигами, но могут быть и сдвигами разных ядер или константами спин-спинового взаимодействия и химическими сдвигами и т. д.). Важно также знать, как связаны намагниченности в период t1 и t2, или, другими словами, что приводит к появлению кросс-пиков. Когда мы проводим двумерный эксперимент, нам необходимо задать диапазон изменения 11 и величину приращения между отдельными значениями (инкремент) tl. Более подробно этот вопрос мы обсудим ниже, но сейчас я хотел бы отметить, что оцифровка интервалов tt полностью аналогична оцифровке обычных ССИ. Таким образом мы используем понятие ширины спектральной полосы (которая определяется диапазоном ожидаемых частотных модуляций в течение времени 1Х) для того, чтобы определить инкремент /х в соответствии с критерием Найквиста. Мы также используем понятие цифрового разрешения для определения общего объема выборки данных по этой временной координате. При этом мы сразу сталкиваемся с серьезными практическими проблемами. Вспомним пример из гл. 2, в котором мы оцифровывали протонный спектр с рабочей частотой 500 МГц, занимающий область химических сдвигов Юм.д. Для того чтобы получить цифровое разрешение 0,2 Гц на точку, необходимо использовать время выборки

266

Глава 8

данных 5 с и объем памяти, достаточный для хранения 50000 действительных чисел (или 25 000 комплексных чисел при использовании квадратурного детектирования). Все эти параметры являются практически достижимыми для спектрометров, оснащенных современными системами обработки данных. Если мы попытаемся провести описанный выше двумерный эксперимент с использованием такой же полосы частот и такого же цифрового разрешения в обоих измерениях, то для этого потребуется 50000 слов для представления переменной t2 и дважды по 25000 слов для tt, что в целом составит 2500000000 слов! Общее время такого эксперимента можно оценить следующим образом: это 7,5 с (средняя величина tx плюс время выборки данных по t2), повторенное 25 000 раз, и все это помножено на 8 (из-за технических ограничений это, по-видимому, минимальное число прохождений для каждого значения tx, как мы увидим в дальнейшем). Это составит 17 суток! Очевидно, нам необходимо уточнить наши представления об оцифровке спектров, когда мы приступаем к двумерным ЯМР-экспериментам. Чтобы не показалось, что двумерная спектроскопия несет с собой только одни бесконечные технические проблемы, мы сейчас перейдем к рассмотрению таких ситуаций, когда эти эксперименты оказываются в высшей степени информативными. Действительно, определенные трудности возникают при обработке двумерных массивов данных. Накопив определенный запас энергии и энтузиазма, мы вернемся к рассмотрению этих проблем.

8.3. Эксперимент Джинера 8.3.1. Введение Та последовательность, которую мы сейчас изучали, фактически являющаяся первым двумерным ЯМР-экспериментом, предложена Джинером в 1971 г. Ее полезность станет очевидной, когда мы рассмотрим, что произойдет при действии второго импульса на систему, которая имеет гомоядерную спин-спиновую связь. Однако перед тем, как перейти к этому вопросу, я хочу обратиться к эксперименту, который, хотя и является в высшей степени непрактичным, очевидно, мог бы оказаться полезным, если бы его можно было бы реализовать. В дальнейшем станет ясно, что основные недостатки этого вымышленного эксперимента не характерны для эксперимента Джинера, в то время как информационная емкость каждого из них сравнима.

8.3.2. Двумерный эксперимент. Непрерывная развертка-преобразование Фурье Гомоядерная развязка является старым и очень информативным экспериментом. Как известно, она позволяет определить, какие группы ядер в молекуле связаны спин-спиновым взаимодействием, что в свою

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

267

очередь часто подтверждает или опровергает гипотезы о ее строении. Подтверждение спин-спинового взаимодействия с помощью этого эксперимента принято считать более «солидным» доказательством типа структуры, чем простое рассмотрение данных по химическим сдвигам и константам спин-спинового взаимодействия, причем мнение это достаточно распространено. Оно основано на нашей уверенности в том, что, например, в протонных спектрах большие константы будут редко наблюдаться между ядрами, разделенными более чем тремя связями. В сравнении с этим информация, полученная из величин химических сдвигов, может оказаться в существенной степени неоднозначной, поскольку сдвиги подвержены влиянию большого числа факторов, и мы не знаем точно их действие. Поэтому опасно опираться только на данные по химическим сдвигам при определении структуры. Назначение этой книги состоит в том, чтобы в ряде случаев нам избавиться от необходимости так поступать. При определении характера спин-спиновой связи с помощью гомоядерной развязки возникают некоторые проблемы. Если мы имеем дело со сложным спектром, то может оказаться неочевидным, облучение каких сигналов будет наиболее информативным. При этом мы можем потратить массу времени на проведение тех экспериментов, которые окажутся совершенно неинформативными. Даже если мы знаем, какие сигналы следует облучить, не всегда в спектре, имеющем сильное перекрывание сигналов, можно провести облучение с необходимой селективностью. Из-за сложного характера мультиплетности результат развязки может быть замаскированным и не замеченным. Для решения последней проблемы предложен метод разностной развязки, но сам этот метод имеет ряд недостатков, в особенности из-за эффектов, возникающих при сдвигах Блоха-Зигерта. Тот эксперимент со спиновой развязкой, который мы хотели бы провести, выглядит следующим образом. Пусть спектрометр в автоматическом режиме делает дискретную развертку частоты развязки при прохождении через интересующую нас область частот. Пусть для каждого значения частоты развязка осуществляется абсолютно селективно, а результат ее однозначно проявляется в какой-то области спектра. 4$се эти эксперименты соберем в одном месте, для того чтобы могла быть непосредственно отображена полная структура спиновой связи. Пусть эксперимент проходит быстро и с высокой чувствительностью. На практике к этому эксперименту наиболее близко можно было бы подойти, по-видимому, реализовав серию экспериментов с разностной развязкой (это был бы эксперимент INDOR с фурье-преобразованием) при очень низком уровне мощности декаплера, что и обеспечит высокую селективность. Не вдаваясь в детали, положим, что отклики проявляются для связанных спин-спиновым взаимодействием протонов, причем в тех случаях, когда облучению подвергаются их партнеры по спиновой связи. Было бы непросто изобразить такую серию спектров достаточно информативным путем, но, не заостряя на этом внимания, перейдем

268

Глава 8

к более фундаментальной проблеме. Этот эксперимент привел бы к двумерному спектру, но реально он является спектром непрерывной развертки по одной координате. Частота развязки варьируется в спектре тем же самым способом, что и частота передатчика в спектрометрах старого типа. Ценой этого будет низкая скорость сбора информации. Время, которое потребуется для перевода частоты развязки из одного края спектра в другой, будет зависеть от того, насколько грубо или тонко нам нужно делать приращения к частоте, другими словами, от разрешения по этой координате. Это аналогично требованию малой скорости прохождения для получения высокого разрешения на спектрометре с непрерывной разверткой. Даже без учета других его практических недостатков это был бы по сути малоэффективный эксперимент, поскольку измерения проводятся в частотной области. Вот если бы использовать преимущества метода фурье-преобразования по второй координате!

8.3.3. Перенос намагниченности Несомненно, вы не удивитесь, когда узнаете, что последовательность Джинера обладает именно этими преимуществами перед вымышленным двумерным спектром, полученным с помощью сочетания непрерывной развертки и преобразования Фурье. Причина этого заключается в том, что в системе, содержащей связанные спин-спиновым взаимодействием ядра, второй импульс такого эксперимента приводит к перераспределению намагниченности, причем намагниченность, соответствующая какому-то одному переходу в течение времени t u перераспределяется между всеми другими, с которыми этот переход связан. Как сказано во введении, я хотел бы обсудить механизм этого явления позднее, и надеюсь, что вы пока примете на веру то, что это действительно так. В гл. 6 мы уже рассматривали эксперименты по переносу намагниченности (SPI, DEPT, INEPT), которые, однако, значительно проще для понимания, потому что эти системы являются гетероядерными (что позволяет независимо рассматривать действие импульсов на ядра разноро типа), а также из-за того, что мы выбрали специальное расположение компонент мультиплета, для которых осуществляется перенос намагниченности. В общем виде гомоядерный эксперимент, к рассмотрению которого мы сейчас приступаем, несколько труднее визуализировать. Тем не менее нам необходимо выяснить, что стоит за словами «всеми другими, с которыми этот переход связан». Итак, я напомню вам диаграмму энергетических уровней системы АХ, к которой мы уже не раз обращались в других главах (рис. 8.6). Эта система описывает четыре перехода, и соответственно в спектре ЯМР проявляются четыре линии. Каждый из переходов, например А 1 ; соответствует определенной линии в спектре, например линии на частоте vA + (1/2) J A X , что следует из основных свойств систем первого порядка. Если второй импульс в эксперименте Джинера соответствует я/2, то та

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

269

Рис. 8.6. Энергетические уровни для системы АХ. часть намагниченности, которая соответствует переходу A t , преобразуется в намагниченность всех других переходов, т.е. А 2 , Х1 и Х 2 . Некоторая доля намагниченности сохранится также и за переходом А1. Таким же образом перераспределятся компоненты для всех других переходов. Это означает, что линия, регистрируемая в течение времени t2, может содержать компоненты своей амплитудной модуляции с частотами, соответствующими положению всех остальных линий по координате t1. Это приведет к появлению кросс-пиков с этими линиями в двумерном спектре. Не очень просто понять, как все одновременно смешивается со всем, однако легко себе представить получающийся спектр (рис. 8.7).

6,8

6,7

6,6

м.а.

6,5

6,4

6,3

Рис. 8.7. Эксперимент Джинера, проведенный на системе АХ (Р-хлоракриловая . кислота).

270

Глава 8

Сигналы, находящиеся на диагонали спектра, соответствуют тем компонентам намагниченности, которые имеют ту же частоту как в течение tl, так и в течение t2. Это та часть намагниченности, которая совсем не перенесена действием второго импульса. Итак, глядя на сигналы, находящиеся на диагонали, мы обнаружим, что это нормальный спектр системы. В нашем случае-только два дублета. Вне диагонали мы видим сигналы кросс-пиков между всеми линиями, которые могут принадлежать как одному и тому же мультиплету (сигналы, расположенные по квадрату около диагонали), так и разным мультиплетам, связанным спин-спиновым взаимодействием (группы из четырех линий вдали от диагонали). Следует отметить, что, поскольку намагниченность переносится между переходами в обоих направлениях, кросс-пик при (v 1 ; v 2 ) имеет симметрично расположенного партнера при (v 2 , v t ). Корреляции между переходами, принадлежащими одному мультиплету, могут вызвать определенные неудобства, и ниже мы увидим, что их можно устранить. Важными корреляциями являются те, которые принадлежат переходам из разных мультиплетов. Они необходимы для выявления характера спин-спиновых связей. В нашем простом примере имеется только одна спиновая система, поэтому «все коррелирует со всем». В более сложных системах мы можем непосредственно проследить путь передачи спин-спинового взаимодействия через недиагональные пики. Это происходит благодаря тому, что спин-спиновое взаимодействие между протонами открывает тот путь, по которому может переноситься намагниченность при действии второго импульса.

8.3.4. Два реальных примера Сейчас мы приступим к рассмотрению содержащего массу интересных деталей вопроса о том, как мы проводим этот эксперимент и в чем собственно состоят его достоинства и недостатки. Однако, для того чтобы возбудить ваш аппетит, перед тем, как, перейти к разделам, содержащим больше технических вопросов (они будут следовать ниже), мне представляется целесообразным обратиться к двум реальным задачам для того, чтобы вы могли убедиться, насколько легко можно сделать спектральное отнесение на основе эксперимента Джинера. Первая из них относительно проста и могла бы быть решена более традиционными средствами, в то время как вторая лет десять назад представляла бы серьезную проблему. Сейчас она может быть решена за вечер. Перед тем как обращаться к спектрам, следует прояснить еще два вопроса. Первый касается названия метода, который я до сих пор называл экспериментом Джинера. В литературе иногда используют это обозначение, но значительно чаще встречается термин COSY (от англ. Correlation Spectroscop Y-корреляционная спектроскопия). Практически все методы используют какого-либо типа корреляцию, поэтому термин COSY (часто в сочетании с модифицирующими дополнительными терминами), к сожалению, используют также и для обозначения разно-

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

271

образных родственных методов, что может приводить к недоразумениям. Итак, термином COSY я буду пользоваться для обозначения гомоядерной корреляции через спин-спиновое взаимодействие, осуществляемой с помощью эксперимента Джинера. Второй важный вопрос заключается в том, как правильно представлять результаты эксперимента COSY. Двумерный спектр можно представить как совокупность одномерных спектров (строк), смещенных относительно друг друга. Такое представление используется до сих пор для того, чтобы подчеркнуть природу данных. Но по мере того как растет сложность спектра, оно оказывается излишне громоздким, и интерпретация спектра может приводить к недоразумениям. Значительно более ясное представление о соотношении между диагональными и недиагональными сигналами мы получим, если будем использовать контурную форму записи, точно таким же образом, как изображается на картах форма горного массива. В качестве иллюстрации на рис. 8.8 показаны в форме контурного представления те же самые данные, что и на рис. 8.7. Достаточно реальное представление о спектре можно получить, прописав только один нижний контур (что, кстати, и быстрее), а не несколько уровней, как изображено на рисунке. При этом представление об относительной высоте пика в той или иной степени можно составить по его величине (площади контура). Для работы со спектром COSY полезно иметь под рукой график обычного спектра, что позволит легче идентифицировать сигналы на диагонали. Для того

-6,3

6,6

6.7

6,4

Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.

272

Глава 8

чтобы связать контуры диагональной части двумерного спектра с сигналами в обычном спектре, требуется некий навык, который, однако, легко приобретается в практической работе. Теперь о примерах. В обоих случаях у нас были предварительные соображения о структуре соединений, и цель детального отнесения сигналов в спектре состояла в проверке того, насколько спектр согласуется с этой структурой. Это, действительно, достаточно распространенный случай, потому что, даже если проводить полный структурный анализ «с нуля», т.е. не располагая предварительной информацией, многие заключения о структуре фрагментов молекулы могут быть получены на основании простых спектров ЯМР (или, конечно, с помощью других спектральных методов). Гипотезы о взаимном расположении фрагментов молекулы могут быть затем проверены с помощью более детальной интерпретации спектров. Возможности отнесения с помощью двумерных ЯМР-экспериментов делают стадию такой проверки значительно более строгой. Первое вещество (1) является природным соединением. Оно выделено из бобов [1] и представляет интерес, поскольку его структура

похожа на структуру других соединений-ингибиторов гликозидазы. Обычный протонный спектр приведен на рис. 8.9, а контурное представление спектра COSY-на рис. 8.10. Сначала следует уделить некоторое

н 6 'н 6

Hi' 4,4

4,2

4,0

3,8

2,4

м. о.

3,4

3,2

А

н 5 н1а 2,6

3,6

Н

2,2

2,0

3,0

Н

2е 1,8

1,6

1,4

2а 1,2

Рис. 8.9. Протонный спектр соединения 1 (500 МГц, D 2 O).

2,8

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

е

я

>•

В

273

ft

}

li

H

S

0

•

К

Н

В

Z

В

»н,

В •

•

1

."i

л• яв з

а

6

н6,н6' # • а »

н6

...

я

«

0

»

a

>

я

«I

2«

S

II

Hie

2Q

••-

•>.

4,2

4,0

3,8

3,6

3,<

3,2

3,0

2,В

2,8

2,1

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

Рис. 8.10. Полный спектр COSY соединения 1.

время сопоставлению групп сигналов в одномерном спектре с диагональной частью спектра COSY для того, чтобы сориентироваться в последнем. Отметим, что двумерные эксперименты обычно проводятся со значительно худшим, чем в одномерных спектрах, цифровым разрешением, и поэтому не все элементы тонкой структуры, проявляющейся в обычных спектрах, могут быть идентифицированы в контурном представлении COSY. Однако, изучив вопрос более детально, мы увидим, что лишь в редких случаях это может вызвать неудобства. При интерпретации спектров наиболее важный вопрос состоит в том, чтобы идентифицировать сигналы, отнесение которых однозначно. Примером этого может быть аномерный протон Щ в кольце глюкозы, 18-75

Глава 8

274

4,«

4,2

«,0

),•

5,6

2,»

2,6

2,4

Рис. 8.11. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Показана схема отнесения взаимодействующих протонов в кольце глюкозы. которому, несомненно, принадлежит дублет в слабом поле. Таким образом, мы имеем опорную точку для определения партнеров по спин-спиновому взаимодействию, что в данном примере позволит нам полностью отнести сигналы этого кольца. Рис. 8.11 иллюстрирует схему отслеживания спин-спиновых взаимодействий, стартующую от аномерного протона к его единственному кросс-пику, а затем снова на диагональ для определения сигнала, соответствующего протону Н' 2 , после чего к другому кросс-пику и т. д. Необходимо отметить, что кросс-пики хорошо разрешены, несмотря на то что в обычном спектре даже на частоте 500 МГц наблюдается сильное перекрывание сигналов в области

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

а

1

11 t;

3

275

* H

£3

5

HI

в

II

2o

-

"H2e

И

OB

&

s

в #«

8, 3,1

5,«

5,2

&

8 5,0

2,8

1,6

2,4

2,2

2,0

1,1

1,1

1,«

М.В.

Рис. 8.12. Сильнопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Попытайтесь сделать отнесение сигналов другого кольца, не обращаясь к рис. 8.9-8.11. Стартовой точкой может быть любой из помеченных на рисунке протонов Н 2 . резонанса протонов глюкозного кольца. Это происходит из-за того, что положение кросс-пика определяется двумя химическими сдвигами, и вероятность их полного совпадения соответственно падает. Случайно оказалось так, что в данном спектре мы можем идентифицировать мультиплеты, соответствующие каждому протону, путем тщательного изучения растяжек одномерного спектра. Если бы спектр был настолько сложен, что этого уже нельзя было сделать, то вместо идентификации сигналов по одномерному спектру нам часто приходилось бы ставить перед собой лишь задачу идентификации кросс-пиков. Для этого потребуется совершенно новый взгляд на расшифровку спектра, но этот 18»

276

Глава 8

подход к установлению структуры является абсолютно правильным. Хорошей стартовой точкой для отнесения сигналов другого кольца может служить любой из двух сильнопольных мультиплетов, которые должны принадлежать протонам Н 2 а или Н 2 е (а-аксиальный, е-экваториальный). Только эти два протона не находятся по соседству с гетероатомами. Отметим, что, хотя мы по-прежнему используем химические сдвиги для облегчения отнесения, реально мы пользуемся только большими эффектами, как в данном случае, а не какими-то малозначащими несущественными деталями. Например, нам не потребуется использовать предположение о том, находится ли слабопольный протон вблизи азота или кислорода. Отнесение сигналов этого кольца я оставляю

«,»

«,3

«,2

4,1

4,0

5,9

S,8

5,7

3,6

3,5

3,4

3,3

3,2

м.а.

РИС. 8.13. Спектр COSY соединения 1, оптимизированный для регистрации дальних констант.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

277

в качестве упражнения; растяжка соответствующей части спектра приведена на рис. 8.12. Убедившись в том, что оба кольца предполагаемой структуры согласуются со спектром, нам остается определить лишь место сочленения колец. Одномерный спектр не содержит каких-либо конкретных указаний на это, но замечательное свойство эксперимента COSY состоит в том, что он позволяет нам непосредственно определить место сочленения. Это связано с возможностью регистрировать кросс-пики, вызываемые малыми константами, которые меньше наблюдаемой ширины линии и вследствие этого не проявляются в одномерном спектре. В протонном спектре константы через четыре и пять связей часто попадают в диапазон от 0,1 до 0,5 Гц. Хорошо известно, что геометрические факторы могут сделать эти константы значительно большими по величине, как, например, при расположении протонов по правилу W. Для того чтобы зарегистрировать кросс-пики, сопряженные с малыми константами, необходимо выполнить некоторые условия. Это будет обсуждаться ниже в разд. 8.4.2, однако существенным является то, что времена регистрации данных в обоих измерениях должны быть достаточно большими (обычный фактор контроля разрешения). На рис. 8.13 для того же диапазона, что и на рис. 8.11, приведен спектр COSY, оптимизированный для регистрации дальних констант. Теперь аномерный протон H'i имеет большое число кросс-пиков с другими протонами глюкозного кольца. Но весьма важно то, что он также имеет кросс-пик с протоном Н 4 другого кольца (отмечен стрелкой на рис. 8.13). Он появляется благодаря существованию неразрешенной в спектре константы через четыре связи между этими протонами и однозначно указывает на место сочленения колец. Во втором примере уровень сложности на порядок выше. Соединение 2 имеет молекулярную массу около 1000. Но для современных возможностей двумерной спектроскопии даже такая задача остается доста-

CONH2

точно простой. Использование спектра COSY (рис. 8.14а и 8.146) в деталях подобно тому, как это делалось в предыдущем примере, и я предоставляю читателю возможность убедиться самому в сог-

278

Глава 8

. / сн :

•

*\

•о-

о

1

' '

'

I '

5,S

' '

' I '

5,0

• '

• I '

4,5

• • ' I ' • ' • I

4,0

3,5 М.Э. V

3,0

) I

2,5

I f I I I I I

2,0

1,5

2

Рис. 8.14a. Полный спектр COSY соединения 2.

ласованности отнесения, приведенного в подписи к рисунку (рис. 8.15). В связи с этим примером я хотел бы обратить внимание на то, что важно не забывать традиционные методы, которые по-прежнему могут оказаться весьма эффективными. Настолько легко поддаться очарованию открывающимися возможностями двумерной спектроскопии ЯМР, что о простых путях решения проблемы можно забыть. Изучение всего протонного спектра соединения 2 (рис. 8.15) хорошо иллюстрирует это положение. В этом примере сигналы занимают более обширную область, чем в предыдущем случае, и некоторые из стоящих в стороне сигналов выглядят весьма привлекательно в качестве возможной опорной точки для отнесения. Например, таковы дублеты А,

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

279

-в

о

0

О • S

э

# О

о- в

S N

к•*•

'J.K в .11, i Ов iff о 1

•о-

ООН

•®~

5,8

9

в »*•

S

@h

a

6,0

«

(Ш

я

5,6

5,4

SS

5,2

5,0

4,8 4,6 М.8.

4,4

4,2

4,0

3,8

3,6

3,4

Рис. 8.146. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.14а. В и С в слабом поле, которые могут быть отнесены к амидным NH-протонам. В принципе, можно было бы провести эксперимент COSY так, чтобы включить все сигналы спектра, но при этом возникнут определенные проблемы. При этом либо придется выполнять эксперимент с очень низким цифровым разрешением, что в этом случае никак нельзя считать приемлемым, либо он займет много времени и в ходе него возникнет громоздкий массив данных. От мощности имеющегося в распоряжении компьютера зависит, составит или не составит проблему размер массива данных; однако большое время регистрации спектра-это фундаментальное препятствие. Эксперимент COSY может быть быстрее и проще проведен, если предварительно выполнить несколько

Глава 8

280

простых экспериментов двойного резонанса для того, чтобы идентифицировать ближайшее окружение слабопольных протонов (рис. 8.16). Имея в виду эту возможность, я мог бы проделать то же самое с двумя дублетами метильных групп в сильном поле, сделав диапазон частот для двумерного эксперимента еще уже. Однако в определенный момент у меня были некоторые соображения для того, чтобы оставить эти сигналы в двумерном спектре, а исключение области NH-протонов уже уменьшило размер эксперимента до такого уровня, который, по моему

1.

А 9,*

9,2

.

.i

В 9,0

8,8

-*-л_А_ с В, Б

л

роспЛ.

pocmO.

8,4

I

D

и»

Е 8,2

8,0

7,8

м.8. PhCH,—

F

G

>,6

7,4

растб-

h •

7,2

7,0

PhCH 2

H 1 J,K

LM

NО P

Q R.S T

—i—i—i—•—i—i—i—'—i—i—r~~>—i—'—i—'—i—•—i—'—i—•—i—•—i 6,6

6,4

6,2

6,0

5,8

1 3,2

1 3,0

5,6

5,4

6,8

5,2

м.е.

5,0

4,8

4,6

4,4

4,2

'

U i

4,0

Л —i— —I— — I — 3,4 3,6 з,е

—r~ 2,2

—I 1,9

1 1,6

Рис. 8.15. Протонный спектр соединения 2 (500 МГц, пиридин-^)- Отнесение сигналов (обозначения атомов и групп см. на схеме соединения 2): А, кольцо A NH; В, кольцо В NH; С, Ala (фрагмент D) NH; F, A3; G, А4; Н, В^ /, В 4 ; J, Glu (фрагмент Е) а-протон; К, A,; L, Ala (фрагмент D) а-протон; М, В 2 ; N, А2; О, Ae; P, Ala (фрагмент С) а-протон; Q, А6; R, В 5 ; S, В 6 ; Т, В 3 ; U, А5; V, В 6 ; W и X Glu (фрагмент Е) СН 2 ; CHj 1 , Ala (фрагмент С) Me; CHf, Ala (фрагмент D) Me.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

281

£Йпучение С

облучение В

облучение А PhCHj

PhCH 2 S.30 '

5,20

5,10

5,00

4,90

4,80

4,70

4,60

4,50

М.8.

РИС. 8.16. Спектры двойного резонанса соединения 2.

опыту, мог бы быть проведен достаточно легко. Поэтому я не провел этих развязок.

8.3.5. Детали эксперимента COSY Введение. Сейчас у нас есть некоторое представление о том, насколько полезным инструментом при отнесении сигналов может служить эксперимент COSY, и я намерен приступить к более углубленному изучению вопросов о том, как проводится эксперимент COSY, как возникают разнообразные артефакты и как они могут быть устранены, какие есть методы представления данных и как на практике подобрать подходящие экспериментальные параметры. Этот раздел посвящен в основном техническим вопросам и будет более интересен тем, кто самостоятельно выполняет на спектрометре эксперимент COSY или аналогичные эксперименты. Если у вас нет технических наклонностей или вас вовсе не интересуют вопросы о том, как работать на спектрометре, я рекомендую опустить большую часть этого раздела, за исключением параграфов «Фазовые соотношения в фазочувствительном COSY» и «Цифровое разрешение и времена выборки данных». Многие из обсуждаемых здесь вопросов полностью или частично касаются не только COSY, но и всех двумерных экспериментов, и в оставшихся

322

Глава 8 Me-, Р, Me Me

РМе-i

].^Меь Рб L и 71ез

которой вы можете, по-видимому, столкнуться при использовании этой техники для произвольных ядер со спином 1/2, представляют широкие спектральные диапазоны, которые могут потребоваться. Как следствие этого, в некоторых случаях возникают большие массивы данных. Для квадрупольных ядер времена релаксации не должны быть настолько короткими, чтобы совсем исчезло спин-спиновое взаимодействие. Однако константы, хотя бы частично разрешенные в одномерном спектре, могут все-таки приводить к появлению кросс-пиков. Этот эксперимент нашел свои наиболее интересные приложения при исследовании спектров ядер таких элементов, которые образуют многоядерные кластерные соединения. COSY зарекомендовал себя идеальным методом для установления сложных структур в этой области. Например, COSY использован в спектроскопии П В [26] и 1 8 3 W [27]. Некоторые другие методы корреляционной спектроскопии (см. разд. 8.5) также использовались для 1 8 3 W [28].

8.4. Эксперименты, родственные COSY 8.4.1. COSY-45 Варьирование длительности второго импульса эксперимента COSY, т. е. использование последовательности

с переменной а, приводит к изменению относительных интенсивностей кросс-пиков и близких к диагонали пиков. В частности, можно показать с использованием подхода, основанного на каскадах импульсов, или с помощью формального квантовомеханического описания, что соотношение интенсивностей при переносе когерентности между прямо и косвенно связанными переходами определяется как ctg2(a/2). Прямо связанные переходы в системе АХ-это пара переходов, таких, как А1 и Xj, имеющих общий уровень энергии. Косвенно связанные переходы могут возникать в более сложных спиновых системах и являются непараллельными переходами, не имеющими общего энергетического

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

323

уровня. Задавая а равной я/4, мы получим соотношение порядка 6. Интенсивности пиков, соответствующих переносу между параллельными переходами, также понижаются на определенную величину. Это и есть популярный эксперимент COSY-45, который имеет два преимущества перед основным COSY. Понижение интенсивности переноса между параллельными переходами упрощает вид спектра вблизи диагонали из-за уменьшения кросс-пиков внутри мультиплетов. В сложном спектре это может сделать возможной идентификацию корреляций, которые в противном случае были бы скрыты в нагромождении пиков вблизи диагонали. Благодаря тому, что межмультиплетный перенос ограничивается в основном непосредственно связанными переходами, возникает возможность определения относительных знаков констант спин-спинового взаимодействия в системах из трех и более спинов по некоторой аналогии с одномерным экспериментом спин-тиклинг. Этот последний тип информации используется при определении структуры лишь в особых случаях. По этой причине, а также учитывая то, что данный вопрос подробно обсуждается в книге [5] (разд. 2.3.4), я не буду в дальнейшем развивать эту тему. На рис. 8.34 показаны спектры COSY и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислоты (оба в форме магнитуды). Видно, что в нижнем спектре исчезли некоторые компоненты кросс-пиков и корреляции внутри мультиплетов. Однако эта иллюстрация, по-видимому, несколько обманчива. Важно помнить, что эти корреляции не устраняются полностью, а лишь уменьшаются в некоторое число раз. В более сложных случаях может оказаться невозможным так определить нижний контурный уровень, чтобы исключить все ослабленные корреляции, поэтому не получается столь хорошее упрощение диагональной части спектра. Сопоставление рис. 8.35 (COSY-45) и рис. 8.10 (COSY-90 того же соединения) отчетливо указывает на то, что при этом следует ожидать. Для рутинных спектров COSY-45 запись с фильтром типа эха при магнитудном представлении тем не менее в целом является предпочтительной. Однако при этом происходит некоторая потеря чувствительности по сравнению с COSY-90. Этот метод нельзя использовать в фазочувствительном варианте из-за того, что сигналы возникают не только за счет амплитудной модуляции. Из новых экспериментов, в которых могут быть получены фазочувствительные данные, стоит посмотреть Е. COSY [9].

8.4.2. Определение малых констант Небольшие константы, значительно меньшие ширины линии, также дают кросс-пики в эксперименте COSY, хотя и с низкой интенсивностью. Для протонных спектров это означает, что часто возможно идентифицировать константы через 4 и 5 связей, лежащие обычно в диапазоне 0,1-0,5 Гц и, следовательно, неразрешимые в рядовых одномерных экспериментах. Спектроскописты считают эту возможность весьма при-

Щ

: t:

BIT

COSY-46

LJL 4,5

<И 4,3

4,2

4,1 4,0 м.Э.

3,9

3,8

57

3,6

4. Спектры COSY-90 и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислот ние спектра COSY-45.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

ч

ft

• ш

&

*

ч»

*

325

т 0

9

ш а

9

•0 •g-

т

\£

ш.

а

а•

*

-т

0

4,4

а

4,2

4,0

3,8

3,6

3,4

3,2

3,0

2,8 2,6 М.О.

2,4

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

Рис. 8.35. Спектр COSY-45 соединения 1.

влекательной, так как кажется, что это позволяет расширить границы измерения. Но как химики мы должны быть более осторожны в суждениях. Несомненно, бывают случаи, когда полезно определить очень небольшие константы, как, например, для соединения 1 из разд. 8.3.4. Тем не менее встречаются и такие ситуации, когда проявление в спектрах всех дальних корреляций становится очень нежелательным. В частности, в спектрах молекул с жестким или напряженным углеродным скелетом, а также в спектрах полиненасыщенных соединений иногда может показаться, что все коррелируют со всем, и информация о структуре из подобных спектров извлекается с трудом. В настоящее время един-

326

Глава 8

ственным способом ослабить возникающие за счет малых констант корреляции является работа с низким цифровым разрешением и короткими временами регистрации. Однако эти корреляции могут быть особо выделены в описанном ниже случае. Мы уже обсуждали главные факторы, определяющие интенсивность кросс-пиков, обусловленных малыми константами. Кратко напомню, что эти факторы определяются как степень ослабления противофазных пиков, и соотношение между переносом когерентности и поперечной релаксацией представляется выражением (8.3). Это выражение действительно описывает спад огибающей ССИ для сигнала, соответствующего переносу когерентности по обеим координатам. Он достигает максимума для значения времени / т а х , определяемого соотношением 'max = — arctg(7uJT2) (8.4) nJ Для очень небольших значений J (JT2 « 1) оно хорошо аппроксимируется как r max = T2. Таким образом, чтобы предотвратить потерю сигнала, вызванного малыми константами, нам необходимо иметь времена выборки по каждой из координат, значительно превышающие Т2; это условие не выполняется для рутинных экспериментов COSY. В экспериментах с фильтром типа эха при магнитудном представлении данных для получения формы линии, похожей на сигнал поглощения, нам требуется так подобрать функцию окна, чтобы она напоминала сигнал эха, т.е. была симметрична относительно центральной точки времени выборки. Для того чтобы максимум этой функции соответствовал максимуму сигнала переноса когерентности, нам потребуется время регистрации порядка 2Т2 по обеим координатам. Это временное ограничение неизбежно, однако можно избежать необходимости хранения и обработки очень больших массивов данных, которые могут при этом возникнуть. Это достигается введением двух дополнительных задержек фиксированной длины в интервалы tt и t2, в таком случае последовательность приобретает вид

При этом смягчается требование к временам выборки до Atvi2 ~ ~ 2Г2 — 2А, т. е., если для регистрации данных потребуется одно и то же общее время, для оцифровки нужно будет меньше точек. Как и в COSY-45, при необходимости а может принимать значение, меньшее чем л/2. Однако это может оказаться нецелесообразным, поскольку так или иначе могут возникать проблемы, связанные с чувствительностью. Мы уже видели пример спектра, полученного таким образом (рис. 8.13). В этом случае А было выбрано равным 0,25 с. Для типичного диапазона протонных Т2 от 0,2 до 0,6 с подходящие значения А лежат в интервале 0,05-0,45 с в предположении, что для времени регистрации использовано значение 0,3 с. В экспериментах этого типа может уменьшаться

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

327

интенсивность корреляций, обусловленных большими по величине константами, если выражение J(T2 — А) принимает значение, близкое к целочисленному (т. е. J ш 7 или 14 Гц для приведенных выше параметров); таким образом, для того чтобы избежать недоразумений, хорошо было бы иметь обычный спектр COSY.

8.4.3. Многоквантовая фильтрация Если мы добавим дополнительный rt/2-импульс непосредственно в конце последовательности COSY следующим образом:

то в таком случае многоквантовая когерентность, которая, как оказывается, возникает перед третьим импульсом, может быть опять переведена в наблюдаемую намагниченность (см. параграф «Еще раз о переносе намагниченности» в разд. 8.3.5). При этом в идеале третий импульс должен следовать сразу за вторым, однако на практике может быть использована задержка до нескольких микросекунд для фазового сдвига. Как обсуждалось выше, задание подходящего фазового цикла может затем разделить сигналы, возникающие от многоквантовой когерентности различных порядков. Так, например, двухквантовая когерентность в 2 раза более чувствительна к изменению фазы в возбуждающей ее последовательности, чем одноквантовая. Поэтому, если мы смещаем фазу ср первых двух импульсов (в общем случае всех импульсов до того момента, как возникла когерентность) на 90°, фаза того регистрируемого сигнала, который прошел через состояние двухквантовой когерентности, инвертируется. Тогда инвертирование фазы приемника (т.е. вычитание 90°-эксперимента из О°-эксперимента) выделяет компоненту, прошедшую через состояние двухквантовой когерентности. Правило для выделения ^-квантовой когерентности заключается в том, чтобы шагами изменять фазу возбуждающих импульсов в следующей последовательности: 0, ISO/p, 2 х 1$0/р...(2р — 1) х 180/р, альтернируя фазу приемника по мере движения [10]. Эта процедура также позволяет детектировать когерентности порядка р (2т + 1), т = 0, 1, 2 ... Однако в общем когерентности более высокого порядка возбуждаются с низкой интенсивностью. Многоквантовые когерентности модулируются как функция tt обычным образом, поэтому результирующий спектр оказывается похожим на нормальный COSY, но испытавшим воздействие многоквантовой фильтрации. Квадратурное детектирование по координате v t в этих экспериментах может осуществляться с помощью любого из обсуждавшихся выше методов, если вы не забыли, что для получения необходимого сдвига фазы на 90° в /^-квантовой когерентности вам нужно сместить фазу возбуждающей последовательности на 90/р градусов. Отметим, что многоквантовая фильтрация может по-

328

Глава 8

требовать фазовых сдвигов, не кратных 90°; спектрометры, созданные примерно после 1983-1984 гг., как правило,'обеспечивают это. Существуют две совершенно ясные причины, побуждающие к проведению многоквантовой фильтрации: упрощение спектра й усовершенствование фазочувствительного эксперимента COSY. Упрощение спектра, возникающее за счет многоквантовой когерентности, может достигаться только в связанных многоспиновых системах; /^-квантовая когерентность может возникать только между по крайней мере /ьядрами со спином 1/2. Следовательно, в двухквантовом эксперименте устраняются синглеты (например, сигналы растворителя), в то время как обычные корреляции сохраняются. Трехквантовый эксперимент устраняет дополнительно системы АХ и АВ и так далее для более высоких порядков (однако чувствительность быстро падает при переходе к более высоким порядкам). Устранение пиков осуществляется только за счет вычитания сигналов, поэтому на практике в лучшем случае, вероятно, можно ожидать ослабления их интенсивностей в несколько сот раз. При этом также не возникает облегчения по отношению к динамическому диапазону-АЦП по-прежнему должен быть в состоянии оцифровать весь диапазон амплитуд имеющихся сигналов. На рис. 8.36 сопоставлены спектры трипептида Gly-Tyr-Gly с двух- и трехквантовой фильтрацией. Трехквантовые эксперименты и эксперименты более высокого порядка, очевидно, не имеют столь общего характера, как основной COSY. Необходимо заранее знать типы имеющихся спиновых систем и в соответствии с этим выбирать тип эксперимента. Второе важное свойство эксперимента с двухквантовой фильтрацией в его фазочувствительном варианте заключается в том, что в отличие от фазочувствительного COSY фаза как диагональных, так и кросс-пиков

Рис. 8.36. Спектры COSY с двух- и трехквантовой фильтрацией для трипептида Gly-Tyr-Gly.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

3,6

ИГ""

"5"

т [ 2,4 3,8

329

2,4

Рис. 8.37. Сравнение нормального фазочувствительного COSY (слева, те же самые данные, что и на рис. 8.27) с DQF-COSY (справа). Сильное упрощение вида диагональной части последнего с лихвой компенсирует потерю чувствительности в этом эксперименте (см. текст). может быть настроена на чистое поглощение. Фактически для систем, содержащих более двух спинов, диагональные пики все же будут иметь вклад дисперсионной компоненты; тем не менее на практике улучшение весьма значительно. Это устраняет единственный недостаток фазочувствительного COSY. За это приходится расплачиваться двукратным понижением чувствительности, которая определяется как отношение сигнала к тепловому шуму. В разд. 8.3.5 мы уже видели, что, по крайней мере при наблюдении протонов, помехи при детектировании чаще определяются уровнем шума по t1, а не теплового шума. Поскольку синглеты, вызывающие самый значительный шум по * 1 5 устраняются в эксперименте с двухквантовой фильтрацией, можно добиться эффективного улучшения по сравнению с таким же нефильтрованным спектром. В настоящее время фазочувствительный COSY с двухквантовым фильтром (DQF-COSY), по-видимому, является лучшим методом для отнесения констант. Сравните два спектра на рис. 8.37 и вы увидите, насколько понятнее становится диагональная часть в спектре DQF-COSY.

8.4.4. Эстафетный перенос когерентности Достаточно общая проблема при отнесении протонных спектров состоит в идентификации линейных цепей спинов, т. е. таких последовательностей С Н — С Н — С Н — С И ..., которые могут возникать в полизамещенных соединениях или олефинах. Отнесение с использованием COSY должно быть простым, однако иногда может возникнуть неопре-

330

Глава 8

деленность. Рассмотрим, например, только три спина, расположенные в ряд. Они образовали бы систему АМХ, в которой J A M и J M X были бы вицинальными константами, a J A X -нулевой (для насыщенных соединений). Соответствующий спектр COSY имел бы кросс-пики между А и М и между М и X, но не между А и X. Такая картина не содержит прямых указаний на то, что А и X являются составными частями одной и той же спиновой системы, поскольку тот же результат был бы получен для двух двухспиновых систем AM и М'А, если бы М и М' имели одинаковый сдвиг. В сложном случае (особенно в спектрах белков, где эта проблема возникает часто) из исследования одномерного спектра иногда нельзя определить, имеется ли перекрывание сигналов в некоторой заданной области спектра. В эксперименте по эстафетному переносу когерентности (RCT, от англ. Relayed Coherence Transfer) эта проблема решается путем передачи намагниченности, перенесенной от А к М в нормальном эксперименте COSY, к следующим ядрам, связанным с М. Это достигается простым добавлением третьего тс/2-импульса для того, чтобы вызвать другое распределение когерентности, поэтому основная последовательность будет иметь вид

При этом возникает проблема, что делать с интервалом ь. В идеале можно было бы представить проведение трехмерного эксперимента, в котором этот интервал изменялся бы с определенным шагом независимо от tl. После трехмерного преобразования мы получили бы массив данных, в котором амплитуда представляется как функция трех частот. Эта идея не имеет практической ценности, потому что выполнение такого эксперимента потребовало бы много времени. Кроме того, трудно найти достаточно информативный способ представления данных такого типа. Обычно применяется другой способ. Значение Ь принимается равным такому вычисленному значению, которое обеспечивает максимальный перенос когерентности от А к X через М. Существует и третий метод, получивший название «аккордеон-спектроскопия», в котором, по существу, трехмерный эксперимент сводится к двум измерениям за счет того, что ь представляется как функция / : (см. работу [11]), но мы не будем его здесь рассматривать. Для того чтобы сделать результат эстафетного переноса не зависящим от разностей химических сдвигов, необходимо поместить тс-импульс в середине интервала /?. Тогда последовательность будет выглядеть следующим образом: ^

т

т

с

т

,

,

Для системы АМХ, в которой JAX = 0, количество намагниченности,

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

331

перенесенное от А к X при использовании этой последовательности, пропорционально sin (27с/АМт) sin (27гУмхх)

(8.5)

поэтому оптимальное значение т можно выбрать, если удается оценить величину константы спин-спинового взаимодействия. В системах со свободным вращением вицинальные константы обычно близки к 7 Гц. Тогда оптимальное значение х составляет примерно 35 мс. Для других систем т сложным образом зависит от типа констант и их значений; обширные таблицы оптимальных значений т для разнообразных фрагментов приводятся в работе [29]. Очевидно, дто этот эксперимент не имеет общего характера, поскольку требует некоторых предварительных знаний о спиновой системе и возможных значениях констант спин-спинового взаимодействия. Однако в сочетании с COSY он может часто использоваться для устранения неоднозначностей. На рис. 8.38а и 8.386 сравниваются спектры COSY и RCT для соединения 6. Одномерный протонный спектр и спектр COSY

"

i

j

i

4,0

|

Zfi

i

|

3,6

i

|

i

ЗД

|

i

$2

|

i

3£

|

LL i

2,8 г

|

i

2,6

•

j

2,4

У,"

рисн,п

?

1

я" *

I

в

м н.

"ч

"

к

::

a

н*

• н, I

н, ' I

I

'

I

'

I

'

I

' I

5,5

5,0

45 ^ в 4,0

33

Рис. 8.38а. Протонный и COSY-спектры соединения 6.

3/3

2,5

332

Глава 8

•

1 1

> 1

•

« .

•

отраженные >/ • Hg < * II •• * •

-

:.0

•

л«

•

а;

•

О

н«

е

Н3-Н5'

••н4-н7

Нб

"н?..

% ц ^-н« •

Ан "

О

2

0

•Hi

5,5

5,0

•

4,5

• »г нз

S,0

2,5

Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополнительные эстафетные пики. представлены на рис. 8.38а, а спектр RCT, на котором помечены дополнительные корреляции,-на рис. 8.386. Хотя т подобрано для регистрации небольших констант углеводного цикла, эстафетный перенос когерентности можно все-таки видеть и для других резонансных сигналов. Этот подход широко используется в спектроскопии ЯМР белков. Составляющие их спектры спиновые системы аминокислотных остатков известны, но часто сложность спектра такова, что даже кросс-пики могут недостаточно разрешаться. Использование эксперимента RCT позволяет определить связи между сигналами Р-протонов аминокислотных остатков и соответствующих протонов NH-групп даже тогда, когда не разрешаются сигналы а-протонов [12]. При работе с малыми молекулами более полезным, по-видимому, является гетероядерный вариант эксперимента RCT (см. гл. 9).

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

333

8.5. Другие эксперименты по гомоядерной корреляции 8.5.1. INADEQUATE Введение. Это, пожалуй, одна из наиболее ужасных аббревиатур (от англ. Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment-эксперимент с невероятным двухквантовым переносом намагниченности на природном содержании) в этой книге. Один из видов этого эксперимента до сих пор служит наиболее совершенным средством для установления строения скелета органических молекул. К сожалению, он также одновременно является и одним из наименее чувствительных из имеющихся экспериментов. По этой причине мы рассмотрим его лишь очень кратко. Исторически данный метод возник из идеи, связанной с измерением углерод-углеродных констант спин-спиновогоувзаимодействия на природном содержании, однако сформировавшие его концепции имеют значительно более общий смысл. Я намерен подойти к эксперименту INADEQUATE с другой стороны, на базе того, что мы уже знаем о COSY, а затем вернуться к первоначальному эксперименту. При этом станет ясно, что мы уже изучили его принципы. Самое большее, для чего мы до сих пор использовали двухквантовую когерентность, которая может быть получена в конце основной последовательности COSY,-так это преобразование ее опять в одноквантовую когерентность. Это приводит к эксперименту DQF-COSY, в котором единственная роль, отводимая двухквантовой когерентности, состоит в том, чтобы отличать ядра, не имеющие констант, от тех, которые их имеют. Все интересное, что происходит в DQF-COSY в период эволюции tt, совершается с одноквантовой намагниченностью; следовательно, в этом смысле можно лишь подразумевать, что это двухквантовый эксперимент. Используя ту же последовательность импульсов, мы могли бы провести реальный двухквантовый эксперимент, фиксируя интервалы между первыми двумя импульсами и помещая интервал tx между двумя следующими импульсами таким образом: К

К

К

--2x---tl---t2 С использованием подходящего фазового цикла, выделяющего сигналы, которые возникли благодаря двухквантовой когерентности, мы получим, что именно частоты двухквантовых переходов будут совершать эволюцию в течение периода t v Для оптимального эксперимента нам нужно выбрать такое значение т, чтобы создать максимальную двухквантовую когерентность. Мы также поместим я-импульс в центре интервала 2т для того, чтобы возбуждение не зависело от химических сдвигов:

334

Глава 8

Это основная двумерная последовательность INADEQUATE. Как и в случае COSY, я сначала собираюсь обсудить получаемые при этом результаты и лишь затем сравнительно кратко обратиться к техническим деталям проведения эксперимента. Двумерные спектры INADEQUATE. Частоты двухквантовых переходов, совершающие эволюцию в течение периода tt этого эксперимента, являются просто суммой химических сдвигов (относительно частоты передатчика) для тех пар ядер, которые участвуют в формировании двухквантовой когерентности. Пики в двумерном спектре, соответствующие двум ядрам со сдвигами vA и vB, имеют координаты ((vA + vB),. X), где Х-частота одноквантовой когерентности, в которую переводится намагниченность действием последнего импульса. Как мы вскоре увидЬм, для сильных ядер, например 1 Н , это может приводить к некоторому усложнению; данный эксперимент изобретен и продемонстрирован для ядер 1 3 С [3]. Преимущество рассеянных ядер, таких, как углерод, состоит в том, что в конечном спектре заметную интенсивность имеют только сигналы от двухспиновых систем АВ или АХ. Они возникают благодаря тому, что 0,01% молекул вещества содержит два атома 1 3 С . Значительно более интенсивные сигналы от одиночных атомов 1 3 С устраняются за счет двухквантовой фильтрации, а сигналы от молекул с тремя атомами 1 3 С (трехспиновые системы) имеют пренебрежимо малую интенсивность. Можно так подобрать значение т,

Рис. 8.39. Схематический двумерный спектр INADEQUATE для последовательности систем АХ. Те части спектра, которые расположены снаружи от заштрихованных линий, не могут содержать сигналов.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

335

что будут наблюдаться только сигналы от атомов, связанных большими по величине прямыми константами. Таким образом, для каждой частоты по v t , по которой наблюдается сигнал, можно выделить прямую, параллельную v 2 , на которой будут находиться компоненты систем АВ 13 или АХ для пары связанных атомов С , т.е. в двумерном спектре возникнут дублеты при ((vA + v B ), v A ) и ((vA + vB), v B ). Центр между каждой парой сигналов попадает в точку ((vA + vB), (vA + vB)/2), поэтому эти точки лежат на линии, имеющей коэффициент наклона, равный 2 (рис. 8.39). Этот факт можно использовать для того, чтобы отличить истинные сигналы от артефактов. Поясним это на примере соединения 7 (рис. 8.40). Поскольку каждый

С

—I—'—I—'—I—'—I—'—г~ 150

МО

130

120

110

100

с, ее, С..С,

—I—'—I—'—r~ 40 30 го

Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 1 3 C лимонена (7). Время регистрации по tl составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128 прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии у1 = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.

336

Глава 8

неконцевой атом углерода связан с двумя или более партнерами, в принципе может быть восстановлен весь скелет молекулы (если только нет разрывов в углеродной цепи, как во фрагментах С—X—С). Начиная, как обычно, с наиболее легко относимого сигнала, мы проходим по линии, соответствующей его химическому сдвигу на оси v 2 и параллельной v 1 ; до тех пор, пока не обнаружим сигнал. Двигаясь далее параллельно v 2 , мы определим одного из его партнеров по спин-спиновому взаимодействию. Стартуя опять с этого сигнала и повторяя то же самое, мы, очевидно, определим очередного партнера по спин-спиновому взаимодействию. Этот метод открывает феноменальные возможности, но одновременно имеет исключительно низкую чувствительность. Его недостаток состоит в том, что мы пытаемся наблюдать сигналы, интен13 13 сивность которых равна интенсивности С-сателлитов от сигналов С , т.е. возникающих лишь от одной из 10000 молекул. Это исключает возможность использования эксперимента для большинства реальных задач, однако он может найти применение в биохимических исследова13 ниях с соединениями, меченными по С . Если мы проделаем то же самое для такого сильного ядра, как *Н, то проблема чувствительности исчезает, но вместо нее возникают другие 13 сложности [14]. Выбор задержки х в случае С прост: для систем АХ ее оптимальное значение составляет 1/4J (для сильносвязанных систем нужны несколько различающиеся значения, см. книгу [5]). Диапазон значений J для прямых углерод-углеродных констант относительно невелик (примерно 35-55 Гц). Для протонов, напротив, зависимость т от J оказывается более сложной из-за того, что часто приходится иметь дело со сложными спиновыми системами, да и диапазон изменения констант спин-спинового взаимодействия оказывается шире (для сравнения, скажем, от 2 до 20 Гц). Другая проблема для систем, содержащих более двух спинов, состоит в том, что двухквантовая когерентность при действии последнего импульса может перераспределяться по всем переходам в спиновой системе; это усложняет интерпретацию каждой строки по v t , соответствующей сигналам от пары связанных ядер. К счастью, этот недостаток может быть частично устранен в результате того, что последний импульс задается равным Зя/4, а не я/2, что по аналогии с COSY-45 ограничивает большую часть перераспределения теми переходами, в которых участвующие ядра непосредственно формируют двухквантовую когерентность [14] (здесь термин «непосредственно» используется в прямом смысле, безотносительно связи между переходами). На рис. 8.41 представлен протонный двумерный спектр INADEQUATE 2,3-дибромпропионовой кислоты с завершающими импульсами я/2 и Зя/4. Преимущество этого эксперимента по сравнению с COSY заключается в том, что в нем отсутствуют диагональные пики. Поэтому для очень сложных задач можно с помощью двумерного спектра INADEQUATE определить те корреляции, которые трудно найти в спектре COSY, когда соответствующий кросс-пик расположен близко

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР считывающий

импульс--|-

:::

337

считывающий импульс -

MB

•н

-МО

\ -200

--I00

...

-0

-

,„

•I

т

-100

\ Гц

•ч

О ГЦ

I

-ТОО

I •"

-200

Гц

РИС. 8.41. Двумерные спектры INADEQUATE 'Н 2,3-дибромпропионовой кислоты с варьированием угла последнего (или «считывающего») импульса. Пики, возникающие в результате нежелательного переноса намагниченности к «пассивным» спинам, помечены стрелками на левом спектре.

к диагонали. Неудобство заключается в меньшей общности. Для этого метода невозможно задать оптимальное значение т, подходящее для всех возможных величин констант и типов расположения ядер. В настоящее время уже есть ряд примеров, демонстрирующих полезность этого метода для анализа спектров ЯМР белков [15], но пока еще рано делать вывод о том, что окажется важнее-преимущества или недостатки. Для спектроскопии ЯМР малых молекул этот эксперимент определенно не является экспериментом первой необходимости, однако его можно рассматривать как альтернативу в тех случаях, когда COSY или его модификации не дают ответа на поставленный вопрос. Детали двумерной последовательности INADEQUATE. При задании параметров для этого эксперимента мы сталкиваемся с обычными проблемами двумерной спектроскопии: выбором ширины спектральной полосы, параметров оцифровки и фазового цикла. В литературе имеется целый ряд подходов к их решению. Метод активно использовался в нескольких исследовательских группах, а детали его выполнения сильно меняются в зависимости от возможностей и конструкции спектрометра, которые существенно изменялись. Я собираюсь рассматривать его так же, как это было сделано для DQF-COSY и COSY, но для полноты упомяну некоторые другие возможности, с которыми вы можете столкнуться. Создавая фазовый цикл, мы должны иметь в виду двухквантовую фильтрацию, подавление артефактов и квадратурное детектирование по 22-75

338

Глава 8

v r Двухквантовая фильтрация может достигаться точно так же, как и для DQF-COSY. Мы используем тот факт, что сдвиг на 90° фазы возбуждающей части последовательности (первые три импульса) инвертирует сигналы, возникающие за счет двухквантовой когерентности. Однако в литературе чаще используется циклирование фазы последнего импульса, по-видимому, с целью достижения удобства при программировании. Сдвиг по фазе этого импульса на 90° смещает фазу сигнала, который прошел через двухквантовую когерентность, на 270°. Это можно понять, если представить себе, что мы имеем сдвиг на 90° относительно возбуждающей последовательности (что приводит к фазовому смещению на 180°) плюс прямой 90°-сдвиг возникшей одноквантовой когерентности. Если мы будем менять фазу последнего импульса по кругу в последовательности х, у, —х, —у, то фазу приемника следует менять в противоположном направлении (т.е. х, —у, —х, у) для того, чтобы следовать за двухквантовым сигналом. Для подавления артефактов к этому четырехшаговому циклу можно добавить процедуру CYCLOPS. Полезным может оказаться и смена фазы л-импульса. Имеются также дополнительные возможности, описанные в работе [16]. В общем, размер реально необходимого фазового цикла лучше определять экспериментально для данного спектрометра, потому что никто не хочет без реальной необходимости увеличивать число прохождений на каждом шаге по tt. Квадратурное детектирование по vx требует, как обычно, сдвига на 90° фазы регистрируемого сигнала. Для сигналов, возникающих за счет двухквантовой когерентности, это требует сдвига на 45° фазы возбуждающих импульсов. На современных спектрометрах это можно сделать непосредственно. Однако в то время, когда метод INADEQUATE только разрабатывался, спектрометры не были приспособлены для таких фазовых сдвигов, поэтому были разработаны два косвенных способа. Первый состоит в использовании так называемого составного z-импульса [17], т.е. последовательности

где нет задержки между импульсами, а <р обозначает угол импульса*, соответствующий желаемому фазовому сдвигу (т. е. я/4 в нашем случае). Для намагниченности в плоскости х — у эта последовательность будет совершать поворот намагниченности по оси z на угол ср (рис. 8.42). То, что произойдет в реальном эксперименте, будет сильно зависеть от качества спектрометра. Для выявления мнимой части эксперимента с квадратурным детектированием мы расположим эту группу импульсов непосредственно после третьего импульса последовательности * То есть вызываемый импульсом поворот вектора намагниченности. -

Прим. перев.

339

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

•

*

Г

У

Рис. 8.42. Составной z-импульс. INADEQUATE [18] и, опустив взаимно погашающую пару импульсов (/2) и (п/2)-х, получим -Т-Я-Т-1-.

ч4/_, Существует еще возможность использовать фильтр типа эха. Она основана на зависимости интенсивности сигналов типа эха и анти-эха от длительности последнего импульса. Здесь слишком сложно дать полное обоснование такого эксперимента. Упомянем только, что задание последнего импульса равным 2тс/3, по существу, устраняет компоненту анти-эха, не требуя дополнительных экспериментов со сдвигом фазы [19]. Выбор цифрового разрешения может быть сделан обычным путем. Для этого необходимо стремиться сохранить время регистрации данных по t2 по крайней мере равным Г | , чтобы избежать потери чувствительности. Время регистрации данных по tt может быть очень коротким. На первый взгляд может показаться, что полоса спектра по vx должна быть в 2 раза больше, чем по v 2 , из-за того, что двухквантовые частоты являются суммой химических сдвигов. Но в действительности, если мы будем считать обе спектральные полосы равными, то, хотя и произойдет отражение двухквантовых частот, это не приведет к неоднозначностям (рис. 8.43). Последовательность связей углеродных атомов скелета выявляется так же, как уже описано выше, а при определенных обстоятельствах чувствительность для одинакового времени эксперимента улучшается в ^fl раз [20]. Исходный эксперимент INADEQUATE. Наконец, мы подошли к тому, с чего началось измерение углерод-углеродных констант спинспинового взаимодействия. Строго говоря, этот предмет не совсем подходит для главы, посвященной гомоядерной корреляции. Но он столь тесно связан с описанными выше экспериментами, что было бы неразумно его от них отрывать. Углерод-углеродные взаимодействия проявляются в спектрах 1 3 С как 13 С-сателлиты линий. Сателлиты, обусловленные прямыми константами, находятся на расстоянии 15-25 Гц от линий и, конечно, имеют амплитуду, составляющую 0,55% 22*

340

Глава 8

Рис. 8.43. Схематическое представление двумерного спектра INADEQUATE, такое, как на рис. 8.39, но с заведомым отражением по v,. Это не вносит никакой неоднозначности.

от основного сигнала. Константы через две и три связи, имеющие значения 0-15 Гц, проявляются в виде сателлитов на расстоянии 0-7 Гц от основной линии. Для реальных форм линий, полученных на сверхпроводящих магнитах, это означает, что сателлиты от прямых констант должны непосредственно легко наблюдаться, а сателлиты от дальних констант могут потеряться на крыльях линии. Трудности могут возникать не только при плохой форме линии, но также из-за боковых полос от вращения, имеющих обычно интенсивность порядка 0,1-1%, и, конечно, из-за примесей. Чтобы надежно обнаруживать линии сателлитов, весьма полезно устранить из спектра основной сигнал вместе с боковыми полосами от вращения, а также вообще все сигналы, кроме сателлитов. Как мы уже знаем сейчас, этого можно достигнуть с помощью двухквантовой фильтрации. Если мы не будем проводить изменений t1 в двумерном INADEQUATE (т. е. фиксируем tx = 0), то получим последовательность

-GUI представляющую собой одномерный эксперимент с двухквантовой фильтрацией. Использование уже описанного циклирования фазы (конечно, без компоненты квадратурного детектирования по tx) приводит к спектру, в котором подавляются все сигналы, возникающие от несвязанных ядер. В то же время сигналы спиновых систем АВ или АХ останутся в спектре, хотя и без какого-либо улучшения чувствительности, поскольку мы по-прежнему наблюдаем сигналы от 0,01% ядер. Компоненты дублетов проявляются в виде характерных линий с противоположными фазами (рис. 8.44). Для достижения успеха в этом эксперименте требуются большое количество вещества и столь же высокая стабильность работы спектрометра, как в экспериментах с ЯЭО, а также правильный выбор частоты повторения и т. Последние два условия широко обсуждаются в книге Бакса [5] (гл. 5), поэтому я не буду здесь их рассматривать.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

Ц I I JI

1

»о(«ал».ып аю«пр \ i ' i ' I ' I ' I ' 40 20 20 40 А "

341

Рис. 8.44. Часть 1 3 одномерного спектра INADEQUATE C для атома углерода, связанного с двумя другими; можно различить две разные прямые константы. Хорошо виден небольшой остаточный сигн а л о т основной (нерасщепленной) линии; попадает точно на центр дублетов он не вследствие изотопного сдвига при замещении12Сна13С.

Вследствие ограничений по чувствительности и из-за специфичности информации, получаемой из спектра INADEQUATE, маловероятно, что этот эксперимент станет широко использоваться в его первоначальной форме. Однако идея использования двухквантового фильтра (или фильтра более высокого порядка) в одномерном спектре для разделения сигналов, представляющих интерес, от основных интенсивных сигналов имеет много возможных приложений, в частности в биохимии. Одним из очевидных примеров было бы прослеживание дважды меченных по 1 3 С метаболитов непосредственно в биологической системе. Такой эксперимент следовало бы сравнить с методом обратного переноса поляризации, уже рассмотренным в гл. 6, и с методиками разностного спинового эха в гл. 10.

8.5.2. NOESY или обменная спектроскопия Введение. Если вы вернетесь назад и снова посмотрите на рис. 8.1, то поймете, что существует еще одна получаемая при действии последовательности COSY компонента намагниченности, которую мы до сих пор полностью игнорировали. Это часть поперечной намагниченности, возвращенная к направлению оси z при действии второго импульса. Отметим, что та намагниченность также модулируется как функция tlt т.е. она представляет собой частоту, меченную точно так же, как и намагниченность в плоскости х — у. Конечно, в COSY эта компонента не генерирует сигналов, поэтому нам даже не следует беспокоиться о том, чтобы устранить ее при циклировании фазы. Однако, поскольку она была вовлечена в некий физический процесс, мы можем провести двумерный эксперимент, который позволит его зарегистрировать. Для этого нужно возвратить намагниченность в плоскость х — у и продетектировать возникающий сигнал. Можно представить себе по крайней мере два информативных взаимодействия, в которые может быть вовлечена z-компонента меченой частоты: химический обмен с другим ядром и ядерный эффект Оверхаузера.

342

Глава 8

Результат химического обмена, возможно, легче представить. Если мы выжидаем время после второго импульса, используя последовательность П

Я

Я

называемую NOESY, в таком случае при наличии обмена то ядро, z-намагниченность которого модулируется при одном химическом сдвиге в течение tx, может мигрировать к другому положению за период хт, называемый временем смешивания. Следовательно, оно имеет другой химический сдвиг в течение периода t2, и результирующий спектр будет похож на спектр COSY, а кросс-пики будут наблюдаться между обменивающимися положениями. Этот эксперимент, применяемый для обнаружения химического обмена, представляет собой двумерный аналог обычного эксперимента по переносу намагниченности и для сложных систем должен обладать обычными преимуществами двумерных спектров. Однако, как мы увидим дальше, он имеет целый ряд технических недостатков. Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) также приводит к тому, что изменения в z-намагниченности одного ядра приводят к изменению z-намагниченности другого. Поэтому пары ядер, которые показывали бы ЯЭО в одномерном спектре, могут иметь кросс-пики в данном двумерном эксперименте. В методе обычного равновесного ЯЭО, который рассмотрен в гл. 5, изменение z-намагниченности, используемое нами, представляет собой насыщение (т.е. устранение) ее, но при этом любое нарушение теплового равновесия также может воздействовать на заселенности соседних ядер. NOESY является двумерным аналогом неравновесного ЯЭО, рассмотренного в гл. 5 (разд. 5.2.4). Итак, эксперимент NOESY позволяет определять пути химического обмена и устанавливать пространственную структуру быстро и с хорошим разрешением, что характерно для двумерного метода. Таким, образом, он кажется весьма привлекательным. Я не хотел бы показаться слишком пессимистичным, но все же должен указать вам на ряд основных трудностей, связанных с его применением. Очевидно, что обменные и ЯЭО-взаимодействия здесь невозможно различить. Но тот же недостаток свойствен и обычным одномерным методам, поэтому нет причины на этом основании избегать использования NOESY. Обычно из химии известно, могут ли протекать обменные процессы в данном соединении, что позволяет правильно интерпретировать спектр NOESY. В стадии развития находятся различные эксперименты, в том числе так называемая zz-спектроскопия [21], которая позволит отличить обмен от ЯЭО. Но она пока не находит широкого применения. Две существенно более серьезные трудности возникают при выборе задержки т т и из-за возможного присутствия перекрывающихся кросс-пиков, обусловленных спин-спиновой связью.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

343

Выбор гт. Задержка хт должна выбираться таким образом, чтобы происходил максимальный обмен или сформировался максимальный ЯЭО перед тем, как конечный импульс прикладывается к z-намагниченности. Это потребовало бы знания значений времен 7\ вовлеченных во взаимодействие ядер, а также скорости обмена или формирования ЯЭО. Если мы знаем только один из этих двух параметров, то нам трудно начать эксперимент без предварительных допущений. Здесь существует четкая разница между возможным диапазоном хт для определения обмена и для ЯЭО (в последующем изложении я подразумеваю, что вам известны динамические эффекты в спектрах ЯМР; см., например, гл. 8 в книге Гюнтера [22]). Конечно, химический обмен может происходить фактически с любыми скоростями. Очевидно, что с помощью NOESY можно изучать область медленного обмена. Основываясь на разности химических сдвигов обменивающихся ядер, мы можем оценить верхнюю границу его скорости. Для двухпозиционного обмена с равными заселенностями и разностью их химических сдвигов Av при коалесценции сигналов константа скорости процесса кс равна яДу/^/2. Поэтому при медленном обмене в нашем случае скорость обмена к должна быть заведомо меньше, чем кс. В то же время к не должна быть намного меньше 1/Tj. В противном случае частотно-меченая z-намагниченность исчезнет до того, как произойдет миграция. Диапазон значений к, для которых имеет смысл эксперимент NOESY, лежит между этими двумя границами. Чаще всего полезно использовать одномерный вариант намагниченности или NOESY в области довольно медленного обмена, где к не слишком сильно отличается от 1/7^, поскольку именно в этой области не существует других методов получения сведений о химическом обмене. В этом случае оптимальное значение хт для обнаружения обмена, протекающего со скоростью к между равнозаселенными положениями, зависит от kTt и медленно изменяется от значения 0,5/к при к = 1/Ti до 1,5/к при к = 10/7^. Обычно к точно не известна, поэтому вполне разумно для грубой оценки т т принять его равным 1//с. На практике бывает необходимо выполнить несколько экспериментов, используя различные оценки для к. Даже такой требующий значительного времени эксперимент все же дает только качественную информацию о путях обмена, поскольку пока нет простого метода количественного расчета констант скоростей из получаемых данных. Обе эти проблемы (определение хт и количественный расчет констант) могут быть решены при использовании метода «аккордеон-спектроскопии» [11], в котором т т устанавливается пропорциональной времени t1. В нем трехмерный спектр можно эффективно представить в виде двумерного. При этом по координате Vj расположены линии, формы которых зависят от величины к. Расчет констант скорости из такого спектра требует количественного анализа формы линии этих сигналов. Программы такого анализа пока еще не очень широко доступны, поэтому я не буду дальше продолжать его обсуждение. Вполне возможно, что

344

Глава 8

в будущем такие эксперименты найдут более широкое применение. В противоположность химическому обмену формирование ЯЭО сдерживается скоростью продольной релаксации. Многие обстоятельства могут сделать формирование ЯЭО более медленным, чем 1/Ти но ничто не может заставить его возникать быстрее. Это означает, что, выбрав хт примерно равным 1/Т1? мы с большой вероятностью сможем наблюдать кросс-пики ЯЭО между соседними ядрами. Ядерные эффекты Оверхаузера между более удаленными ядрами формируются медленнее, поэтому для их регистрации нужны большие времена смешивания. Но конкурирующая продольная релаксация приводит к тому, что кросспики в этом случае будут очень слабыми. Конечно, в одномерных экспериментах такие ЯЭО тоже очень слабые, но в эксперименте NOESY используется стационарная, а не равновесная намагниченность, поэтому трудности дополнительно возрастают. Кроме того, при спин-спиновом взаимодействии могут возникнуть артефакты, очень запутывающие картину двумерного спектра и затрудняющие идентификацию истинных кросс-пиков ЯЭО. И наконец, еще раз отмечу, что не существует простого способа получения количественных результатов в данном эксперименте. Мы имеем только указание на присутствие ЯЭО, но не надежное измерение его величины. Существование этих неблагоприятных факторов объясняет, почему NOESY мало используется при изучении небольших молекул. Однако при исследованиях белков этот метод приобрел большое значение. Причина в том, что большие молекулы белков совершают беспорядочные движения в растворе относительно медленно. В связи с этим в таких системах вклад в быструю дипольдипольную релаксацию дает процесс Wo (см. гл. 5). В них ЯЭО оказываются большими и отрицательными, и они быстро устанавливаются. Примеры использования метода NOESY для отнесения сигналов в спектрах белков приведены в работах [23, 24]. Трудности, обусловленные спин-спиновым взаимодействием. Не уди-

вило ли вас то, что последовательность NOESY отличается от использованной для метода DQF-COSY только введением интервала хт. Это означает, что в эксперименте могут присутствовать различные сигналы переноса когерентности, и, как обычно, нужная компонента выделяется при помощи фазового цикла. Легко видеть, что фаза сигналов, возникающих от намагниченности, ориентированной вдоль оси z в течение времени хт, не зависит от фазы первых двух импульсов, но следует за фазой третьего. Поэтому большую часть нежелательных сигналов можно подавить либо совместным циклированием фазы первых двух импульсов в последовательности х, у, —х, —у при постоянной фазе приемника, либо совместным циклированием фаз последнего импульса и приемника. Квадратурное детектирование можно провести обычными способами -фазочувствительным или с фильтром типа эха. Однако, к сожалению, существует перенос когерентности, приводящей к сигналам с точно таким же фазовым поведением, как и желаемая z-компонента.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

345

Эта часть проходит через нуль-квантовую когерентность. Это значит, что в спектре NOESY для нашего соединения на кросс-пики, обусловленные ЯЭО или обменом, накладьшается спектр COSY с нуль-квантовой фильтрацией, причем циклирование фазы не может препятствовать этому. Очевидно, что для связанных систем эта проблема неразрешима. Она сродни эффектам SPT, возникающим в одномерных экспериментах по ЯЭО, но в двумерном эксперименте трудно или невозможно различать реальные и нуль-квантовые кросс-пики. Было предложено несколько решений этой проблемы, но ни одно из них нельзя считать полностью удовлетворительным. Простейший прием сводится к варьированию интервала т т случайным образом при переходе от одного прохождения к другому. Интенсивность кросс-пиков, обусловленных ЯЭО или обменом, медленно изменяется с изменением хт, тогда как пики переноса когерентности модулируются с нуль-квантовыми частотами, которые равны разностям химических сдвигов связанных ядер. Таким образом, по крайней мере некоторые из нуль-квантовых сигналов изменяются так же быстро, как и хт. Поэтому при благоприятном стечении обстоятельств они должны усредняться и исчезать после некоторого числа прохождений. Наилучший способ реализации этой идеи-введение я-импульса в хт: я

я

г

я

2 ~ h ~ 2 ~ Т ' ~ Ti ~ % ~ Т ' ~ 2 ~ ' 2 Теперь хт равняется т, + 2т' (использованное здесь обозначение взято из работы [25]). Т; и т; можно изменять, в то время как хт сохраняется постоянным. Тогда обменные или ЯЭО-пики не изменяются от прохождения к прохождению, а нуль-квантовые пики модулируются как функция только т,, поскольку все эффекты в оставшейся части хт рефокусируются. Можно менять т,- случайным образом, но все же при использовании этого способа приходится полагаться на удачу, и надежное подавление можно получить лишь при большом числе прохождений. Существует и другой метод, когда вычисляется оптимальный набор значений т,- для каждого числа прохождений, который также зависит от диапазона подавляемых нуль-квантовых частот, т.е. от разностей химических сдвигов между парами взаимодействующих ядер. Оказывается, что самый лучший результат дает комбинация вычисленных и случайных переменных при пошаговом изменении т, как функции / х . Тогда Т; выражается следующим образом: *.- = Т? + Xh + ^random

(8-6)

В работе [25] содержатся таблицы и формулы для определения наилучших значений т,? для разных сочетаний диапазонов химических сдвигов и числа прохождений на каждое значение tt. Даже при использовании этого тщательно разработанного метода подавление нуль-квантовых компонент при малом числе прохождений на каждое значение t, оказывается весьма слабым, особенно в том

Глава 8

346

случае, если велик диапазон разностей химических сдвигов. Но поскольку эксперимент NOESY всегда имеет низкую чувствительность, как правило, при накоплении сигнала используется большое число прохождений. Если на каждом шаге по tx используется больше 10 прохождений, то подавление нуль-квантовых пиков становится вполне достаточным для типичных диапазонов химических сдвигов. Ко всему этому нужно добавить, что хт должно быть порядка T t . Поэтому очевидно, что эксперимент NOESY требует больших затрат времени.

1,-арен

_л

Ньь

6,0

4,0

Рис. 8.45. Отслеживание пути химического обмена во флуктуирующем металлоорганическом соединении.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

347

1

2,5

2,0

1,5

Рис. 8.46. Спектр NOESY производного пенициллина (8). Метильная группа, обращенная под плоскость молекулы, показывает в спектре кросс-пик с одним из р-протонов (Н 5 ) лактамного цикла. При облучении этого метила на лактамном протоне проявляется равновесный ЯЭО, составляющий 15%. Напротив, метильная группа, расположенная над плоскостью молекулы, обнаруживает корреляцию с протоном Н 3 .

Примеры. Несмотря на все сказанное в двух предыдущих разделах, в действительности эксперименты NOESY все же можно проводить! Я склонен думать, что обнаружение химического обмена с практической точки зрения представляет собой наиболее важное применение этого метода для небольших молекул. В качестве примера на рис. 8.45 приведен спектр NOESY для стереохимически нежесткого металлоорганического соединения, на котором можно проследить механизм обмена. Пример обнаружения ЯЭО дан на рис. 8.46. Это спектр NOESY соединения 8, которое является производным пенициллина. Времена релаксации протонов Ту в его обезгаженном растворе в D 2 O изменяются

в широком диапазоне от 0,4 до 2 с, поэтому для параметра хт было выбрано промежуточное значение 1 с. Тем не менее кросс-пики проявляются в местах, ожидаемых для измерений равновесного ЯЭО. В этом случае не возникает трудностей, связанных со спин-спиновым взаимодействием, и мы вполне уверены, что кросс-пики возникают как следствие эффекта Оверхаузера.

348

Глава 8 Литература

1. Evans S. R., Hayman A. R., Fellows L. E., Shing T.K.M., Derome A. E., Fleet G. W. J., Tet. Lett., 26, 1465-1468 (1985). 2. States D.J., Habekom R.A., Ruben D.J., J. Mag. Res., 48, 286-292 (1982). 3. Keeter J., Neuhaus D., J. Mag. Res., 63, 454-472 (1985). 4. Marion D., Wuthrich K., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113, 967-974 (1983). 5. Бакс Э. Двумерный ядерный магнитный резонанс в жидкости. Пер. с англ.-Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1989. 6. Levitt M.H., Bodenhausen С, Ernst R.R., J. Mag. Res., 58, 462-474 (1984). 7. MehlkopfA.F., Korbee D., Tiggelman T.A., Freeman R., J. Mag. Res., 58, 315-323 (1984). 8. Nagayama K., Kumar A., Wuthrich K., Ernst R.R., J. Mag. Res., 40, 321 (1980). 9. Griesinger С W., S
Глава 9

Гетероядерная корреляционная спектроскопия 9.1. Введение При создании эксперимента INEPT на основе SPI в гл. 6 мы должны были тщательно исключить влияние химических сдвигов спинов S с помощью спинового эха. Если уберем эхо и сделаем варьируемым интервал между оставшимися импульсами, то получим &

I:

2

h

2 - Выборка (t2)—

Ясно, что этот эксперимент может также приводить к переносу поляризации, но степень переноса будет зависеть от специфического расположения векторов намагниченности, относящихся к компонентам мультиплета, во время второго импульса. Оно в свою очередь зависит от резонансных частот сигналов S и длительности tx. Таким образом, мы имеем основу для двумерного эксперимента: амплитуда сигнала I, детектируемая в течение времени t2, будет модулироваться как функция ty на резонансных частотах спинов S. Приведенная выше схема составляет фундамент гетероядерной корреляционной спектроскопии. Другой путь рассмотрения этой последовательности состоит в сравнении с COSY. Единственная разница заключается в том, что перенос когерентности после второго импульса распространен на другое ядро с помощью одновременного импульса на частоте этого ядра. Таким образом, видно, что все эксперименты в гл. 6, 8 (исключая NOESY) и 9 основаны на одном и том же явлении: переносе когерентности между взаимодействующими спинами, который проще всего можно понять в контексте SPI. Так как все основы для понимания двумерного ЯМР изложены в предыдущей главе, то здесь у нас остается относительно простая задача-изучить несколько технических деталей гетероядерного эксперимента и сделать обзор некоторых его вариантов. Простейший вид гетероядерной корреляции, описанный в следующем разделе, и COSY (предпочтительно в форме фазочувствительного DQF-COSY) представляют собой два главных метода двумерного ЯМР, к которым вы должны обращаться в первую очередь, берясь за решение проблемы. Все

Глава 9

350

другие эксперименты более специфичны и приспособлены к частным ситуациям, поэтому лучше всего держать их в резерве до тех пор, пока анализ сколько-нибудь не продвинется. Довольно странно, что, несмотря на популярность игры по изобретению сокращений, не возникло согласия по поводу того, как называть гетероядерную корреляционную спектроскопию. Полное название произносить очень неудобно, и авторы обычно прибегают к некоторой сокращенной версии. Часто ее называют H-X-COSY. Но тогда возникает путаница, если другое ядро не протон, так же как и в случае, когда говорят просто COSY. Для ясности и краткости в дальнейшем я буду называть этот эксперимент в его оригинальной форме HSC (от англ. Heteronuclear Shift Correlation). He сомневаюсь, что читатели с большими творческими способностями придумают свое собственное, более запоминающееся обозначение.

9.2. Детали HSC 9.2.1. Устранение различных КССВ Введение. На рис. 9.1 показано, что получается в результате применения основной последовательности HSC для системы АХ. Сигналы в каждом измерении связаны кросс-пиками. Точно так же как и в фазочувствительном COSY, компоненты оказываются в противофазе. Очень часто координата спектра v t как бы воспроизводит протонные химические сдвиги, a v 2 содержит сдвиги гетероядра, например углерода. Ясно, что поставленный таким образом эксперимент не удовлетворяет полностью тем требованиям, которые мы предъявляем к спектрам этих

•7,6 •7,7 •7,8 •7,9

M.S. 16*0

165,0

Рис. 9.1. Основной тип эксперимента по гетероядерной корреляции ' Н - 1 3 С для системы АХ (муравьиная кислота, квадратурное детектирование по V! с помощью метода TPPI).1 3 Обе координаты, как 'Н, так и С, содержат дублеты в противофазах (положительные и отрицательные контуры показаны красным и черным цветом). Сечение параллельно v 2 показано над контурным представлением.

Гетероя^ерная спектроскопия

351

ядер по одной из двух координат. Например, во время регистрации гетероядра применяется широкополосная протонная развязка; следовательно, мы не наблюдаем структуру мультиплетов, обусловленную взаимодействием с протонами. В то же время координата vx содержит частоты протонных линий, вызванных спин-спиновым взаимодействием 13 с гетероядром, например С-сателлиты протонных линий при наблюдении углерода. Поэтому для упрощения интерпретации и получения оптимальной чувствительности в эксперименте желательно устранить гетероядерное взаимодействие по обеим координатам. Однако мы должны соблюдать осторожность, чтобы не разрушить также и сам эксперимент, который непосредственно зависит от наличия взаимодействия. Устранение взаимодействия по v2. Для того чтобы иметь возможность включить широкополосную развязку в течение времени t2, мы должны получить компоненты детектируемого ядра в одной фазе. Возникает та же проблема, что и при развязке в INEPT, и, как обычно, она решается путем введения задержки после конечных импульсов последовательности. Эта задержка, обозначаемая А2 в терминах HSC, играет ту же роль, что и задержка А в INEPT. В действительности это и есть та же самая задержка, поэтому ее можно выбирать на основании критериев, рассмотренных в гл. 6. Единственная разница состоит в том, что если двумерный эксперимент предназначен для представления спектра в виде магнитуды, то нам не нужно заботиться о фазовых изменениях, обусловленных химическими сдвигами, в течение этого интервала. Таким образом, нет нужды помещать я-импульс в центр А2 с целью создания спинового эха для экспериментов в режиме магнитуды спектра. Фазовые изменения следует принимать во внимание, если используется фазочувствительное детектирование. Устранение взаимодействия по v t . Для получения по координате v t спектра, «развязанного» от гетероядра, требуется довольно тонкий подход. Чтобы понять почему, представьте сначала, что у нас есть истинная широкополосная развязка от ядра I. Если ее применять на всем протяжении t u то эксперимент не получится совсем, потому что компоненты мультиплета, обусловленные гетероядерным взаимодействием, никогда не будут иметь противофазу, необходимую для переноса поляризации. В действительности мы хотим сделать так, чтобы гетероядерное взаимодействие не модулировало сигнал в течение tt, но хотели бы все же получать с помощью этого взаимодействия линии в противофазе, что необходимо для переноса поляризации. Этого можно добиться подавлением спин-спинового взаимодействия в течение t1 и установкой другой задержки А1 между концом tt и стадией переноса поляризации, во время которой развязка выключается. В результате мы получим полную последовательность HSC для экспериментов в режиме магнитуды спектра (рис. 9.2, последовательность А). Дело выглядит так, как будто бы вы получили пирожное, но с условием, что откусывать от него можно только в течение времени tx.

352

Глава 9 А

1

13

п 2

Н=

С=

_J

*—— и —

А2 _ > J

>«-Д;

развязка

L

раавязка Ьыборка

2

£ 2

J

« ft

~*"*"2

развязка

L

tJ развязка

Ч

Ьыборка

ft

It

2

в 2 13 Г .

t—

2 Tt*

* =

Tt

и или 111)

%

_

2 ~*"г *~ 2 ~ V " Tt

Tt

^

*•_] развязка .

Ьыборка

1Ц\

РИС. 9.2. Улучшенные схемы последовательностей HSC: А - с гетероядерной развязкой по Vj и v 2 ; S'-TO же самое, но с рефокусировкой во время задержек Д для фазочувствительных экспериментов; В -устранение необходимости точ13 ной широкополосной углеродной развязки с помощью тс-импульса по С в середине tv Постоянные задержки, такие, как Д г , не влияют на амплитудную модуляцию сигнала, но обеспечивают появление частотно-зависимых сдвигов фаз в v1. Еще раз отмечу, что это не влияет на эксперимент в режиме магнитуды спектра. Но необходимо исключить такие сдвиги фаз, если применяется фазочувствительный вариант со спиновым эхом (рис. 9.2, последовательность Б). Практические трудности при реализации последней последовательности возникают в связи с необходимостью осуществлять широкополосную развязку от ядра X, что трудно или даже невозможно на современных спектрометрах. К счастью, поскольку tt изменяется дискретными шагами, вместо развязки можно просто воздействовать одиночным я-импульсом на ядро I в центре tt. Как и в гипотетической схеме широкополосной развязки, описанной в гл. 7 (разд. 7.4), при этом направление прецессии компонент мультиплета меняется на противоположное, а поэтому спин-спиновое взаимодействие исчезает к концу t1. Для достижения развязки достаточно только одного импульса, поэтому не происходит накопления ошибок, что препятствует применению тако-

Гетероядерная спектроскопия

353

7,6 7,7 7,8

Ч'п) 7,9

ьр •V

ма

167,0

-

Рис. 9.3. Эксперимент HSC с гетероядерной развязкой по обеим координатам (снова муравьиная кислота).

го подхода при обычной широкополосной развязке. Однако и здесь часто используют составной импульс. В таком случае оптимальной схемой для фазочувствительного HSC с развязкой по координатам vx и v 2 была бы последовательность В на рис. 9.2. Задержка (1/2)А1 в этой последовательности эквивалентна т в INEPT, и, следовательно, она должна иметь длительность 1/4J (т.е. Al = 1/2J). Весь диапазон прямых КССВ протонов и углерода составляет 125-210 Гц. Однако в большинстве случаев при записи С—Н-корреляционных спектров можно принять, что эта константа составляет около 130-150 Гц. Тогда At будет равно 3-4 мс. При необходимости значение Д, можно использовать для редактирования, но обычно оно устанавливается равным 0,3/J (2-2,5 мс для Н—С-корреляции) для того, чтобы правильно воспроизводить интенсивности для групп IS, IS 2 и IS 3 . В этом случае для системы АХ получается спектр, приведенный на рис. 9.3.

9.2.2. Другие экспериментальные аспекты Фазовый цикл. При создании фазового цикла для HSC самой важной проблемой является исключение аксиальных пиков и квадратурное детектирование по v t . Фазовое альтернирование конечного импульса по спину S и приемника позволяет исключить аксиальные пики. Такая же процедура используется для устранения собственной намагниченности ядра I в эксперименте INEPT. При этом необходимо, чтобы квадратурное детектирование проводилось в фазочувствительном режиме с помощью процедуры RuSH или TPPI, выбор которой зависит от особенностей конструкции вашего спектрометра. Однако в литературе часто встречаются примеры создания эксперимента по правилам эха в режиме магнитуды спектра. Для этого случая конечный я/2-«мпульс по спину S сдвигается на 90° одновременно со сдвигом приемника на —90°. Базовый фазовый цикл, таким образом, имеет четыре шага, или две пары из двух шагов, каждая в фазочувствительной форме. При необходимости этот четырехшаговый цикл может быть рас23-75

354

Глава 9

ширен с помощью последовательности CYCLOPS. В этом случае происходит циклирование фазы всех импульсов и приемника с шагом в 90°, а также фазовое альтернирование всех я-импульсов. Время регистрации и частота повторения. Поскольку данный эксперимент включает гетероядерное детектирование, потребуется тщательная оптимизация всех временных параметров для обеспечения приемлемой чувствительности. Изложенные здесь принципы уже обсуждались в гл. 7 (разд. 7.5.2) и 8 (разд. 8.3.5). Так как эта последовательность включает перенос поляризации, то частоту повторения определяют времена TY ядер S (обьгчно протонов). Для релаксации ядер S между прохождениями должен быть оставлен период около 1,3 Tj. Заметим, что это-время между прохождениями, а не общая скорость повторения, включающая время регистрации, потому что широкополосная развязка от S включается в течение времени t2. Время регистрации по t2 должно быть по крайней мере равно среднему Г | для ядер I. Данное условие легко выполнимо, так как это время не является критическим для общего времени эксперимента. При этом время регистрации по ty может быть очень коротким. В отличие от COSY, где нам следовало быть весьма аккуратными, чтобы избежать уменьшения сигнала при подавлении противофазных пиков, сигналы в HSC находятся в фазе. Таким образом, необходимо только, чтобы Atl было достаточно большим для получения нужного нам разрешения по этой координате. При рутинном использовании HSC мы просто хотим скоррелировать протонные сдвиги с их гетероядерными партнерами-ядрами X; следовательно, по координате vx допустимо цифровое разрешение в 10 Гц на точку или более, соответствующее А,^ = 100 мс или меньше. Если же по Vj необходимо получить высокое разрешение, то в таком случае следует увеличить время At . Однако при этом чувствительность эксперимента быстро понижается. В гл. 10 (разд. 10.4.3) для такого случая описан альтернативный подход. Идеальный, хотя и трудно выполнимый на практике, способ достижения высокого разрешения по координате протонов состоит в том, чтобы эту координату сделать v 2 , т.е. выполнить эксперимент «наоборот» [1]. Если эксперимент HSC содержит небольшое число инкрементов по tt и частота повторения оптимизирована для протонных времен Г15 то чувствительность этого эксперимента очень высока. Однако, поскольку чувствительность зависит от огромного числа факторов, ее довольно трудно точно предсказать. Я нашел следующее исключительно полезное правило. Определим возможное число прохождений на каждый инкремент fj, задавая общее время эксперимента и требуемое число инкрементов. Затем получим спектр INEPT с этим числом прохождений, т. е. выполним эксперимент с r t = 0. Тогда если в спектре проявляется большинство ожидаемых резонансных сигналов даже с плохим отношением сигнал/шум, то двумерный корреляционный эксперимент несомненно будет иметь подходящую чувствительность при условии, что

Гетероядерная спектроскопия

355

мы правильно подобрали Atl и взвешивающие функции. Гетероядерная корреляционная спектроскопия имеет шанс на успех даже тогда, когда в эксперименте с t1 = 0 сигналы не видны. Мы не должны забывать, что все прохождения дают вклад в конечные сигналы.

9.2.3. Использование HSC Необходимость применения HSC для решения химических проблем вполне очевидна. Метод HSC позволяет идентифицировать спин-спиновую связь в гетероядерных системах. Здесь мне бы хотелось это продемонстрировать, а также показать некоторые значительные преимущества двумерного варианта. Первое преимущество -скорость. На рис. 9.4 представлены протонный и углеродный спектры соединения 1, он

он

13 г

• i •

100

80

1

н5 4,0

3,5

н.э.

I

p

50

М.Э.

40

H,Q 2

'

5

"2а

2,0

1,5

Рис. 9.4. Протонный и углеродный спектры соединения 1. Углеродный спектр зарегистрирован с использованием DEPT (400 прохождений). На рис. 9.5 использован тот же образец для эксперимента HSC.

356

Глава 9

1 5

г-

-ад V,

-до

Чо м.э.

"i'do

90

й'

70^'j

"sb

'iti

Ж

Рис. 9.5. Спектр HSC соединения 1 (128 инкрементов по f, для времени регистрации по этой координате в 76 мс; 192 прохождения на инкремент). Приведено отнесение протонов, полученное с использованием COSY в предыдущей главе. В содержащей много сигналов центральной области непросто определить протонные сдвиги по контурному представлению. Однако их легко измерить при исследовании вертикальных сечений спектра. Отнесение Н 4 и H i может быть обратным. которое мы уже широко исследовали в гл. 8, а на рис. 9.5-спектр HSC. После того как отнесены сигналы в протонном спектре, упражнение по отнесению углеродных резонансных сигналов является тривиальным. Получение той же самой информации с помощью селективной гетероядерной развязки в этом случае, весьма вероятно, было бы невозможным из-за сильного перекрывания сигналов в протонном спектре. Но, даже если такие селективные развязки возможны, выполнение более чем двух или трех подобных экспериментов чрезвычайно утомительно по сравнению с регистрацией HSC. Эксперимент HSC может показаться очень простым, но при наличии сильной связи между протонами [7] возникают серьезные осложнения. В слабосвязанных системах наблюдаются только кросс-пики между протонами и непосредственно связанными с ними гетероядерными партнерами. Однако при наличии сильной связи намагниченность может переноситься через систему, приводя к непрямым корреляциям. Следовательно, в системе типа Н д — С А — С в — Н в протон Н А может давать кросс-пик с С в , если он сильно связан с Н в . На практике подобная ситуация распознается без труда. При этом необходимо учитывать 13 следующий нюанс: именно С-сателлиты должны проявлять сильную связь. Система, в которой наблюдается первый порядок для 12 С-изотопомеров, может иметь сильносвязанные 13С-сателлиты, потому что относительные химические сдвиги протонов в этих системах могут заметно различаться. Противоположное (т.е. слабая связь 13С-сателли-

357

Гетероядерная спектроскопия

тов при наличии сильной связи у соответствующих 12С-изотопомеров) также иногда бывает верным. Второе преимущество составляет тип распределения информации. Обычные гетероядра, такие, как " С и " Р , имеют диапазон химических сдвигов как в герцах, так и в миллионных долях, намного больший, чем протоны. Часто их спектры состоят из наборов одиночных линий, поскольку отсутствует гомоядерная связь, что обусловлено либо низким изотопным содержанием партнеров по гомоядерному взаимодействию, либо наличием в молекуле только одного гетероядра с высоким содержанием, а также благодаря широкополосной развязке от протонов. Совместное действие этих двух факторов приводит к тому, что эффективная протяженность гетероядерного спектра намного больше, чем протонного. Даже для сравнительно больших молекул в спектре редко возникает перекрывание резонансных сигналов. В спектре HSC информация о частотах протонов передается на резонансной частоте гетероядра, что делает возможным использование различия в свойствах гетероядер для анализа сложных протонных спектров. При отсутствии сильной связи протонов и при условии, что по v t достигается достаточное цифровое разрешение, эту идею можно реализовать весьма просто. Сечение спектра HSC параллельно Vj на частоте, соответствующей химическому сдвигу ядра X, дает в итоге положение протонов, связанных с этим ядром. Действительно, выводить на график только отдельные сечения часто бывает полезнее, чем расписывать полное контурное представление. Рис. 9.6 и 9.7 помогают проиллюстрировать эффективность этой методики. На рис. 9.6 представлена ароматическая область протонного спектра на рабочей частоте 500 МГц иридиевого комплекса, который является интермедиатом каталитического гидрирования. Наша цель состояла в отнесении всех резонансных сигналов. С помощью экспе-

7,9

7,7

7,5

7,3

7,1

60

ф

^5

Рис. 9.6. Протонный спектр иридиевого комплекса.

358

Глава 9

•До

м.Э.

Рис. 9.7. Сечения спектра 1 H- 3 l P-HSC иридиевого комплекса, показанного на рис. 9.6, параллельно v,. Отдельные сечения приведены в виде сигналов поглощения, хотя и не проводилось фазочувствительного эксперимента. риментов ЯЭО мы смогли определить расположение лигандов вокруг иридия [2]. Связи между протонами были легко определены с использованием COSY. Оставалось найти опорные точки для отнесения. На рис. 9.7 показаны сечения спектра Х Н — 3 1 P-HSC на частотах химических сдвигов каждого атома фосфора. Таким способом были однозначно отнесены о/имо-протоны фенильных колец. Особенно стоит отметить протон Hi, который был идентифицирован с помощью данной методики, хотя в одномерном протонном спектре область, где наблюдается резонанс этого протона, выглядит совершенно неподдающейся интерпретации. На рис. 9.7 также видны небольшие отклики на некоторых других протонах фенильных колец, связанных с фосфором. Они появляются благодаря переносу поляризации за счет дальних протон-фосфорных констант, даже несмотря на то, что задержки Aj и А2 выбраны в соответствии с величиной константы через три связи с орто-протонами. Этот пример также иллюстрирует третье преимущество -мощность метода. Ясно, что по стандартам двумерного ЯМР это было «простое» соединение. Как только эксперимент закончен, последующее отнесение является минутным делом. Нет больших трудностей в распространении методики на более сложные задачи, чем эта. Важная особенность заключается в преимуществе совместного использования COSY и HSC, поскольку это позволяет проследить всю структуру молекулы. Начиная с некоторого легко относимого резонансного сигнала, скажем в углеродном спектре, соответствующий протонный сдвиг может быть идеи-

Гетероядерная спектроскопия

359

тифицирован из HSC. Тогда COSY позволяет локализовать соседние протоны, с помощью которых в свою очередь можно провести дальнейшее отнесение углеродных сигналов. Для проведения анализа протонного спектра вовсе не нужно, чтобы он имел простую структуру, так как можно локализовать полученные кросс-пики. Пример такого подхода к отнесению безнадежно неразрешенного протонного спектра описан в работе [3]. Некоторые другие методики (например, INADEQUATE или RCT) также дают возможность определить углеродный скелет молекулы. Но совместное использование COSY и HSC наиболее практично. Для реальных задач, когда доступно только ограниченное количество вещества, такое сочетание является лучшим способом их решения.

9.3. Эксперименты, родственные HSC 9.3.1. Широкополосная гомоядерная развязка по v t в эксперименте HSC В типичном спектре HSC с довольно низким разрешением по v : наличие гомоядерного протон-протонного взаимодействия является неблагоприятным фактором. Зачастую отдельные линии не разрешаются из-за ограничений оцифровки, и тогда гомоядерное взаимодействие ведет к уширению резонансных сигналов и понижению чувствительности. Для задач с низким разрешением в работе [4] предложен такой вариант эксперимента, который с учетом определенных ограничений позволяет исключить большую часть гомоядерных взаимодействий по Способ, которым это достигается, состоит в следующем. Допустим, что на 13С-сателлиты линий протонного спектра можно воздействовать селективным я-импульсом, не затрагивая остальные резонансные сигналы. Пусть протон, присоединенный к 1 3 С , одновременно взаимодействует с другими протонами, связанными с соседними 12С-атомами. Поэтому, используя такой «полуселективный» импульс, можно инвертировать состояние протона при 1 3 С , не воздействуя на его партнеров по спинспиновому взаимодействию. В гл. 4 уже было показано, почему гомоядерное взаимодействие обычно не рефокусируется л-импульсами. Причина в том, что оба ядра, вовлеченные в спин-спиновое взаимодействие, инвертировали свои спиновые состояния в результате смены направлений прецессии компонент мультиплета после импульса. Однако этот гипотетический «полуселективный» импульс не инвертирует вектор намагниченности ядра, присоединенного к 1 2 С . Следовательно, поместив его в центре tу в эксперименте HSC, можно рефокусировать гомоядерное взаимодействие. Исключение, конечно, составят геминальные взаимодействия, поскольку в этом случае оба протона присоединены к 1 3 С . Остается найти способ инвертирования 13С-сателлитов без воздей-

360

Глава 9

ствия на другие сигналы. Таким свойством обладает приведенная ниже последовательность, называемая «билинейным оператором поворота» [5]:

13

С:

я

Действие его на протоны, связанные с 1 3 С , и другие («дальние») протоны показано на рис. 9.8. В гл. 10 (разд. 10.2.2) описана последовательность TANGO, которая аналогичным образом действует я/2-импульсом на прямо связанные ядра и я-нмпульсом на дальние ядра одного и того же типа. Помещая билинейный оператор поворота на место я-импульса по 13 С в центре tl последовательности HSC (рис. 9.9), мы получим спектр без гомоядерного взаимодействия по Vj (рис. 9.10). Отметим, что в этом спектре еще проявляются геминальные взаимодействия. При этом резонансные сигналы ядер, не вовлеченных в геминальные взаимодействия, стали синглетами по координате м1. Для успешного осуществления данного эксперимента необходимо, чтобы величины гомоядерных и гетероядерных КССВ существенно различались. В работе [4] выдвигается условие, определяющее успех эксперимента. Оно заключается в том, что общая ширина протонных г

У ••/ * 1

/

А

У

•А

1

•

2

а

i

ж .ж

I

У

У

у

у

У

У

у

У

/ у

1

1 г

*

/

I

У

ж

у

У

У

Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной инверсии для протоков, связанных с гетероядром. 1Н. /5)_*!_[!!\_1 _ п у — 1 - f ^ - t i - A i - п _ д 2 — развязка

13С.

выеорка

Рис. 9.9. Эксперимент HSC с широкополосной гомоядерной развязкой по координате Vi.

361

Гетероядерная спектроскопия *

6,5

SP

4.5

4,0 8, м.9.

0

5.0

80

ТО

«О

80 40 8, м.О.

30

20

Рис. 9.10. Спектр HSC (вверху справа), полученный с использованием последовательности, приведенной на рис. 9.9, вместе с протонным и COSY-спектрами того же соединения. мультиплетов должна быть по крайней мере в 5 раз меньше, чем величина гетероядерной константы. Для прямых констант Н — С это означает, что ширина протонных мультиплетов не должна превышать 25-30 Гц. В то же время диапазон гетероядерных констант должен быть небольшим, поскольку задержка между импульсами в билинейном операторе поворота не должна отклоняться слишком сильно от величины 1/2J. Ошибки в этой задержке, возникающие из-за таких отклонений, приводят к артефактам, которые можно уменьшить с помощью одновременного поворота фазы всех протонных импульсов е билинейной последовательности с шагом в 90 при постоянной фазе приемника [6]. Последнее ограничение заключается в том, что поперечные времена релаксации для протонов не должны быть слишком короткими во избежание потери сигнала в течение дополнительного интервала 1/У, помещенного в t1.

9.3.2. Дальние константы 1 3 С— 1 Н. Последовательность COLOC Поскольку последовательность HSC содержит фиксированные задержки, определяемые величиной гетероядерного взаимодействия, в случае малых КССВ чувствительность падает за счет поперечной релаксации. Потеря чувствительности возникает при попытке скоррелировать протоны и углероды, связанные спин-спиновым взаимодействием через две или три связи, например в тех случаях, когда нет взаимо-

362

Глава 9

'н.

И 2

<]

п

2

а

"

( л 1 -• 1 >— а

Л

2

развяака

2

Рис. 9.11. Последовательность COLOC. Интервал tx, содержащий в центре гс-импульс, помещается внутрь интервала А1. 1

31

действий через одну связь, как в примере Н - Р , описанном в разд. 9.2.3. И вот наступает момент, когда задержка At больше, чем (l/2)Atl; тогда стоит использовать модифицированную последовательность, известную как COLOC [8]. Для типичного значения Atl, равного 100 мс, этот момент будет достигнут, когда J H x упадет ниже 20 Гц. Задержки Д2 и Д 2 являются неизбежными, но последовательность COLOC экономит на общей длительности эксперимента за счет включения интервала t1 внутрь интервала At (рис. 9.11). Интересно отметить, что последовательность COLOC без дополнительных модификаций дает спектры с широкополосной гомоядерной развязкой по координате \1. Так как интервал между первым импульсом и шагом переноса поляризации фиксирован, то гомоядерные взаимодействия не подвергаются действию мобильного ти-импульса в этом интервале и не модулируют сигнал как функцию ti. В то же время на химические сдвиги влияет положение л-импульса, поскольку они рефоку сируются за время tt и затем совершают эволюцию в оставшейся части времени А х . Координата v1 спектра COLOC содержит, таким образом, только протонные химические сдвиги. При этом наблюдаются корреляции между взаимодействующими ядрами, как и для эксперимента HSC. Однако нужно помнить, что, хотя задержки At и А2 определяются в соответствии с величинами интересующих нас малых констант, в спектре могут присутствовать корреляции, обусловленные большими константами. Значения задержек А, определенные для дальних констант, могут оказаться кратными величинам, соответствующим большим константам, что позволяет наблюдать оба типа корреляций. Если это вам мешает, то в эксперимент может быть встроен низкочастотный ./-фильтр, упоминаемый в следующем разделе.

9.4. Эстафетный перенос когерентности 9.4.1. Введение Постоянная цель исследований в области спектроскопии ЯМР-найти метод, который позволит провести прямое определение скелета органической молекулы в единичном эксперименте. Двумерный вариант последовательности 1 3 C- 1 3 C-INADEQUATE, который мы рассмотрели

Гетероядерная спектроскопия

363

в гл. 8, довольно близко подходит к решению данной задачи, однако ценой крайне низкой чувствительности. На другом конце шкалы последовательностей, который ближе к реальной жизни, мы приходим к совместному использованию COSY и HSC. Но это, конечно, два эксперимента, а не один. Где-то между этими крайними точками лежат различные методы эстафетного переноса когерентности (RCT, от англ. Relayed Coherence Transfer). Они имеют существенно более низкую чувствительность, чем HSC, но все же гораздо большую, чем двумерный INADEQUATE, и несут похожую, хотя и не идентичную, информацию. Эстафетные методики, как правило, основаны на комбинации двух шагов переноса когерентности. Один из них используется для модулирования сигналов и генерации координаты tt. Другой остается фиксированным и служит для того, чтобы передавать сигнал в наиболее интересную точку. Например, самая обычная схема состоит в переносе намагниченности от одного протона к другому, а затем на гетероядро, связанное со вторым протоном. В результате исходный протон может быть скоррелирован не только с тем гетероядром, с которым он прямо связан, но и с соседним. Таким образом, возникает требуемая информация о скелете молекулы. Существенную проблему методик этого типа составляет отсутствие общности, потому что при наличии разнообразных спиновых систем и широкого диапазона возможных значений протон-протонных констант оказывается невозможным оптимизировать схему эксперимента. Поэтому к таким экспериментам не стоит обращаться вначале, когда вы беретесь за решение задачи; их можно использовать тогда, когда другие подходы оказались бесплодными.

9.4.2. Эстафета Н—Н—С Эстафетный Н—Н—С-эксперимент может быть построен на основе HSC [9], как показано на рис. 9.12. Первый шаг-удалить импульс по углероду в конце периода ? 1 ; ограничивая таким способом перенос намагниченности к протонам. Для того чтобы сделать возможной передачу к углероду намагниченности, перенесенной между протонами, необходимо выждать, чтобы приняли одинаковую фазу те компоненты мультиплета, которые обусловлены гомоядерным взаимодействием и в данный момент находятся в противофазе. Это происходит в течение периода хт, в котором создается спиновое эхо для исключения влияния химических сдвигов (рис. 9.12, последовательность Б). Теперь мы возвращаемся в состояние, подобное HSC, и, как обычно, должны выждать время Aj для того, чтобы компоненты мультиплета, обусловленные гетероядерным взаимодействием, стали противофазными перед тем, как завершить перенос намагниченности с помощью импульсов по протонам и углероду. Задержка А2 выполняет ту же функцию, что и в последовательности HSC. Последняя модификация состоит в том, чтобы поместить протонные и углеродные п-импульсы в центры задержек Ах и Д 2 . Это необходимо, как и раньше, для фазочувствительных спектров,

364

Глава 9

развязка Г

I

п

Ьыборка

2

^^п^^г^развязка i

°Г;

п

п«-Д1-»!Е«-Д2-»п«-й2-»Ьывор«а 2

2

2

2

Рис. 9.12. Построение эстафетного Н-Н-С-эксперимента на основе HSC: Анормальный HSC; ^-добавление второго шага протон-протонного переноса перед гетероядерным переносом; S-оптимальная последовательность (см. текст). поскольку такая процедура и в случае эстафетного эксперимента оптимизирует процесс переноса намагниченности [9]. На протоны действуют два последовательных я-импульса, которые оказывается возможным слить в один. Он помещается посередине между второй парой протонных я/2-импульсов (вообще-то я бы рекомендовал не беспокоиться по поводу этих деталей!). Последовательность В (см. рис. 9.12) оптимальна для эстафетного Н—Н—С-эксперимента. Камнем преткновения в этом эксперименте является интервал хт, который должен регулироваться в соответствии с типом протонной спиновой системы и величинами КССВ. В литературе проанализированы некоторые детали этой проблемы. Например, работа [10] включает графики зависимости эффективности переноса намагниченности от величины т для различных спиновых систем. Отметим, что в этой статье используется обозначение т, относящееся к общему времени смешивания, которое в наших обозначениях соответствовало бы Tm + Aj. В отсутствие точной оценки значения хт (ясно, что, строго говоря, этого нельзя сделать для неизвестной структуры) выбирается величина, равная примерно 1/5JHH- Типичные значения протон-протонных констант составляют около 7 Гц. Следовательно, значение \т надо устанавливать равным примерно 28 мс. Несогласованность величины хт с требованиями спиновой системы может приводить к очень сильному ослаблению сигналов переноса намагниченности в эстафетных экспериментах.

Гетероядерная спектроскопия

365

В самом лучшем эксперименте RCT чувствительность, вероятно, в 4 раза меньше, чем при использовании HSC.

9.4.3. Использование RCT На рис. 9.13 приведен пример использования эстафеты Н — Н — С . Здесь сравниваются схематические спектры HSC и RCT для фрагмента типа Н А — С А — С в — Н в . В спектре HSC кросс-пики появляются при химических сдвигах (Н А , С А ) и (Н в , С в ). В эстафетном спектре Н - Н - С эти пики еще присутствуют, однако они скомбинированы с другими при (Н А , С в ) и (Н в , С А ), возникающими в результате косвенного переноса намагниченности. Таким образом, углеродный скелет молекулы может быть прослежен через вицинальные протон-протонные взаимодействия. На рис. 9.14 приведен реальный эстафетный спектр Н - Н - С для соединения 2. То, что непосредственно связанные атомы все еще дают кросс-пики в спектрах переноса когерентности по типу эстафеты, весьма неудобно. Поэтому был предложен метод [ И ] , ослабляющий кросс-пики между «соседями». Он основан на использовании разницы между величинами прямых и дальних углерод-протонных КССВ. Этот «низкочастотный J-фильтр», в принципе хотя и привлекателен, однако содержит практически неудобный длинный фазовый цикл, увеличивающий минимальное число прохождений на каждый инкремент tt до уровня, который во многих случаях может оказаться неприемлемым. Было предложено множество разнообразных экспериментов по эстафетному переносу когерентности: Н - С - С [12], Н - Х - Н [13] (к сожалению, обозначенный термином HERPECS) и С - Н - Н [14]. Очевидно, что применение этих методов зависит от конкретных обстоятельств. Например, эстафета Н - С - С сходна с INADEQUATE и тре13 бует, чтобы в молекуле находились рядом два атома С . Следовательно, для необогащенных систем этот метод очень мало чувствителен. Однако в этом отношении он немного лучше, чем INADEQUATE,

Рис. 9.13. Схематическое представление спектра HSC (слева) и эстафетного спектра Н - Н - С (справа).

366

Глава 9 Н-Н-С -RCT

:R

ом« I

'N

-^"^u

i

I

IR

IN

'R

130 130

125 120 115

110

105

IR

120 110 100 М.Э.

100 95

-4,4

м.е.

-4,6 -4,8 -S.0 L

5,2

-5,4 -5,6 H,

He 5,4

5,3

52

5,1

М.Э.

HA

5,0 4,9 4,8 4,7 4,6 4J5 м.а.

130

120 t1O 100 M.8.

Рис. 9.14. Эстафетный спектр Н - Н - С для соединения 2. Прямые корреляции помечены N (для «соседей»), а эстафетные корреляции-R (для «дальних»). Отметим, как заметно изменяется интенсивность пиков вплоть до того, что в одном случае "N''-пик полностью отсутствует. Такие изменения амплитуды сигнала являются основным слабым местом в данном эксперименте.

и может быть оптимизирован для определения четвертичных углеродов. Эстафета Н - Х - Н основана на регистрации протонов и является потенциально чувствительным экспериментом, который может заполнить пустоты в сетке взаимодействий при корреляции протонов через общее гетероядро. Он имеет то преимущество, что вообще не требует измерений на гетероядрах, и должен быть весьма практичным для ядер с большим естественным содержанием, таких, как 3 1 Р . Литература 1. Neuhaus D., Keeler J., Freeman R., J. Mag. Res., 61, 553-558 (1985). 2. Alcock N. W., Brown J. M., Derome A. E., Lucy A. R., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 575-578 (1985). 3. Bhacca N. S., Balandrin M. F., Kinghorn A. D., Frenkiel T. A., Freeman R., Morris G.A., J. Amer. Chem. Soc, 105, 2538-2544 (1983). 4. Box A., J. Mag. Res., 53, 517-520 (1983). 5. Garbow J.R., Weitekamp D.P.. Pines A., Chem. Phys. Lett., 93, 504 (1982). 6. Bolton P.H., Wilde J.A., J. Mag. Res., 59, 343-346 (1984). 7. Morris G.A., Smith K.I., J. Mag. Res., 65, 506-509 (1985). 8. Kessler #., Griesinger C, Zarbock J., Loosli H. R., J. Mag. Res., 57, 331-336 (1984). 9. Kessler #., Bernd M., Kogler H.. Zarbock J., Sjrensen O. W., Bodenhausen G., Ernst R.R., J. Amer. Chem. Soc, 105, 6944-6952 (1983).

Гетероядерная спектроскопия

367

10. SarkarS.K., Вах A., J. Mag. Res., 63, 512-523 (1985). 11. Kogler H., Sjrensen О. W, Bodenhausen G., Ernst R.R., J. Mag. Res., 55, 157-163 (1983). 12. Kessler #., Bermel W., Griesinger C, J. Mag. Res., 62, 573-579 (1985). 13. DelsucM.A., Guittet E., Troitin N., Lallemand J. Y., J. Mag. Res., 56, 163-166 (1984); NeuhausD., Wider G., Wagner G., Wuthrich K., J. Mag. Res., 57, 164-168 (1984). 14. Field L.D., Messerle B.A., J. Mag. Res., 62, 453-460 (1985).

Глава 10

Спиновое эхо и «/-спектроскопия 10.1. Введение Теперь мы рассмотрим эксперименты, которые включают спиновое эхо, такие, как INEPT, INADEQUATE и RCT. Во всех этих примерах эхо используется не для того, чтобы добавить что-либо новое к эксперименту. Оно устраняет влияние химического сдвига. Есть еще один класс экспериментов, в которых эхо непосредственно определяет получаемый результат. Они объединены здесь под общим названием «J-спектроскопия», подчеркивающим тот факт, что влияние структуры мультиплета на вид окончательного спектра представляет главную особенность этих экспериментов. J-Спектроскопии было уделено большое внимание на раннем этапе развития двумерного ЯМР, и ее теоретические и практические аспекты были весьма подробно проанализированы. Однако вследствие различных обстоятельств большинство из этих экспериментов не имеет столь общего применения, как корреляции химических сдвигов, рассмотренные нами в двух предыдущих главах. По этой причине и из-за доступности обширной литературы я не буду излагать этот вопрос детально, а просто представлю короткий обзор основных экспериментов по спиновому эху и некоторых их приложений.

10.2. Гетероядерная J-модуляция и спиновое эхо 10.2.1. Введение Обсуждение вопроса удобно начинать с рассмотрения именно этого эксперимента, потому что его легко понять, используя векторную модель во вращающейся системе координат. В гл. 4 (разд. 4.4.4) я отметил, что если вы выполняете эксперимент по спиновому эху в гетероядерной системе, то у вас есть право выбора, рефокусировать ли гетероядерное взаимодействие или нет, поскольку вы можете действовать я-импульсом на второе ядро, а можете и не действовать. Если вы выбираете метод, основанный на использовании я-импульса в соответствии с последовательностью X: Y:

( - 1 — т — я , — т — Выборка... к

(Развязка...)

Спиновое эхо и ./-спектроскопия г

г

У

/

' ~У

z

, 2

z

х/

.

369 г

г

У

*ф

/

у

_

^

^7

/

У

Y:

Рис. 10.1. Последовательность спинового эха для гетероядерной системы АХ. 13

где Х-наблюдаемое ядро (например, С), a Y-другое ядро (например, 1 Н), то в таком случае эхо не рефокусирует константу спин-спинового взаимодействия. Широкополосная развязка от Y по желанию может быть включена или выключена во время регистрации, а подходящим образом подобрав т, можно получить интересные эффекты, зависящие от величины константы спин-спинового взаимодействия между X и Y. Это довольно легко понять на основе векторной модели во вращающейся системе координат. Рис. 10.1 показывает результаты действия этой последовательности для групп XY и XY2 в предположении, что X и Y имеют спины 1/2 13 (например, ядро С и протоны метановой и метиленовой групп) и т равно 1/2J. Для группы XY сигнал X является дублетом, и, следовательно, если мы совместим опорную частоту с его центром, то увидим две компоненты, сдвинутые на ±J/2 Гц во вращающейся системе координат. Через промежуток времени, равный 1/2J, они повернутся на угол ± 1/2J х J/2, т. е. на 1/4 оборота, и будут направлены вдоль осей +х. В течение второй половины последовательности они продолжают движение в том же самом направлении, так как я-импульс по ядру Y обменивает все а- и Р-состояния; в то же время импульс лу по ядру X меняет местами две компоненты, поэтому к началу периода регистрации они обе выстраиваются вдоль оси — у. Теперь мы можем спокойно включить широкополосную развязку по Y и регистрировать спектр на ядре X, который содержит синглет. В результате при обычной коррекции фазы сигналы, ориентированные в начальный момент вдоль положительного направления оси +у, дадут синглет с перевернутой фазой. Для группы XY2 сигнал X представляет собой триплет (рис. 10.2). Если мы совместим опорную частоту с центром триплета, то в таком случае одна линия остается в покое вдоль оси +у, тогда как крайние компоненты мультшшета поворачиваются в противоположных направлениях на угол ±J. Поскольку они двигаются вдвое быстрее, чем дублетные компоненты, в момент действия тс-импульса они совместятся друг с другом и направлением оси — у и возвратятся в исходное состояние вдоль оси +у к началу регистрации. Таким образом, полученный развязанный сигнал имеет фазу, противоположную той, которая была получена для группы XY. Следовательно, эксперимент позволяет различать число протонов, присоединенных к ядру X, и в этом смысле

370

Глава 10

(Н

— ЬыОорко (развязка)

Рис. 10.2. Та же последовательность, что и на рис. 10.1, но только для системы

Ьыборка

*•• ( - а Ьключвн декаллвр выключен

Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществления гетероядерной J-модуляции спинового эха. конкурирует с внерезонансной развязкой и методами редактирования спектров. Если мы повторим эту процедуру для групп X (т. е. четвертичного углерода) и XY3 (т. е. метила), то оказывается, что эксперимент для группы X приводит к той же самой фазе, что и в случае группы XY2, а для группы ХУ 3 -как в случае XY. В общем, все сигналы от ядер, прямо связанных с четным числом протонов, имеют фазу, противоположную по отношению ко всем сигналам ядер X, имеющих нечетное число непосредственно связанных протонов. Интересно, что тот же самый эксперимент можно провести без применения импульса по ядру Y. Достаточно только включить на некоторое время декаплер, как показано на рис. 10.3. Так как развязка, по существу, «замораживает» компоненты мультиплета, где бы они ни находились во вращающейся системе координат в момент ее включения, то, установив т = 1/J и включив декаплер одновременно с я-импульсом по X, мы получим желаемый результат. Тот же эффект достигается выключением декаплера в течение первой части эха, включением его во время второго интервала т и в период регистрации. Описанные два эксперимента одинаковы только тогда, когда нужны развязанные сигналы. Если развязка не используется во время регистрации, то первый эксперимент приводит к экзотическим результатам [1]. Все эти последовательности дают спектры, в которых сигналы групп с четным и нечетным числом протонов различаются по фазе (рис. 10.4). Поскольку в эксперименте по J-модулированному спиновому эху регистрация происходит с широкополосной развязкой, получаемые

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

40

38 36

34

32 30

28 26 М.9.

24

22

20

371

18 16

Рис. 10.4. Нормальный спектр ЯМР 1 3 С (внизу, часть спектра холестерилацетата) и спектр J-модулированного эха (вверху, метод переключаемого декаплера при т = 1/J). Фаза спектра приведена к такому виду, что сигналы групп СН 2 и четвертичных углеродов положительны, а групп СН 3 и СН отрицательны. в этом случае разрешение и чувствительность значительно выше, чем при использовании внерезонансной развязки. В то же время он менее информативен, поскольку группы X и XY2 неразличимы, так же как и группы XY и XY3. Надо иметь в виду, что доведенная до конца расшифровка спектра должна давать лучшие результаты, чем любой из этих двух методов; она позволяет различить все типы групп, но требует больше внимания к экспериментальным деталям. Эксперимент с J-MOдуляцией, выполненный с помощью переключения декаплера (такие эксперименты менее трудоемки из-за того, что не требуют проведения калибровки амплитуды импульса декаплера), иногда может быть полезным для быстрого отнесения. Прежде всего его следует использовать, когда спектр с внерезонансной развязкой оказывается слишком перегруженным сигналами или зашумленным и кажется, что постановка эксперимента DEPT требует слишком много хлопот. Большая проблема для эксперимента по /-модулированному спиновому эху заключается в том, что задержка т зависит от значения J. В реальных ситуациях мы встречаемся с широким диапазоном величин J, который, например, для прямых углерод-протонных констант составляет примерно 125-210 Гц. Любое отклонение от условия т = 1/J (или 1/2J) ведет к понижению амплитуды детектируемых сигналов. В крайней ситуации, когда т = 1/2J для эксперимента с переключением декаплера (или 1/4J для импульсного эксперимента), сигналы всех ядер, за исключением тех, которые не имеют связанных с ними протонов, оказываются 24»

372

Глава 10

Рис. 10.5. Нулевое условие (т = 1/4 J) для взаимодействующих ядер в эксперименте по гетероядерному J-модулированному спиновому эху.

7о

50

м.Э.

з'о

Рис. 10.6. Идентификация четвертичных углеродов с использованием нулевого условия (тот же пример, что и на рис. 10.4). Обнуление сигналов протонированных углеродов зависит от точности задания задержки т, поэтому, если есть разброс в значениях констант спин-спинового взаимодействия, некоторые сигналы устраняются не до конца. нулевыми (рис. 10.5 и 10.6). Эта зависимость амплитуды сигналов от длительности т дает нам ключ к тому, как обобщить эксперимент. К этому я еще вернусь.

10.2.2. Разностное спиновое эхо Фазовое поведение J-модулированного эха может быть использовано как основа для простой техники расшифровки спектров. Рассмотрим 13 специфический пример-вещество, содержащее единственную метку С . Мы выполним эксперимент по J-модулированному эху наоборот, используя развязку по углероду и наблюдение протонов. Использование широкополосной развязки по углероду является характерной чертой методов с составными импульсами, описанными в гл. 7. Если ваш

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

373

спектрометр не дает таких возможностей, то для эха можно использовать импульсный метод, и в получаемом протонном спектре будет 13 наблюдаться взаимодействие с С . В данном случае мы должны 12 рассмотреть только группы «X» (т.е. протоны, присоединенные к С) 13 и группы «XY» (т.е. протоны, присоединенные к метке С). Если мы принимаем, что протон-протонные константы настолько меньше, чем углерод-протонные, что их влияние пренебрежимо мало в течение интервала т, равного \/JCH, TO анализ проводится точно так же, как и раньше. Положим, что мы выполняем два эксперимента: Х

Н:

13

( - ) — т — пу — т — Выборка

С:

...

Развязка ...

и 1

Н:

13

С:

[ - ) - т - пу - х -

Выборка ...

Развязка ...

Первый из них ведет к нормальному спектру, поскольку взаимодействие углерод - протон рефокусируется вместе со всеми другими. Однако во втором эксперименте включение развязки в течение второй половины последовательности останавливает рефокусировку взаимодействия. Таким образом, сигналы от протонов, связанных с меткой 1 3 С (и только эти протоны), инвертируются во втором эксперименте. Вычитание двух спектров усиливает сигналы протонов, присоединенных к метке, и погашает сигналы всех других (рис. 10.7). Так же как и в случае разностных экспериментов, уровень погашения будет зависеть от многих аспектов конструкции спектрометра. Практически мы можем ожидать понижения амплитуды нежелательных пиков в несколько сот раз. Достоинство этого эксперимента заключается в том, что он соединяет в себе селективную природу метки 1 3 С с чувствительностью протонного детектирования. В противоположность обращенному DEPT (гл. 6) мы должны иметь полную чувствительность по протонам. Потеря сигнала происходит только через механизм поперечной релаксации в течение эха. Обращенный DEPT переносит углеродные заселенности к протонам, понижая таким образом чувствительность в 1,3-4 раза; частота повторения также определяется значениями Tt для углеродов. В то же время эксперимент по обратному переносу поляризации дает много лучшее подавление сигналов протонов, присоединенных к 1 2 С , так как они могут быть насыщены при широкополосном облучении между прохождениями. Поскольку технические требования этих двух конкурирующих экспериментов довольно различны, имеет смысл рассмотреть оба эксперимента при планировании действий по решению проблемы метки. Примеры использования разностного спинового эха даны в работе [2].

374

Глава 10

-SO

О

-50

-100

-100 -150

-ISO

ГЦ

Рис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной кислоты, обогащенной по 1 3 С на 60%; импульсный метод был использован таким образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два спектра: один с использованием тс-импульса по 1 3 С (вверху слева) и другой без этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обусловленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не имеющих констант, исчезают. Для многих случаев простое разностное спиновое эхо, возможно, будет давать недостаточное подавление сигналов протонов, не связанных с меткой. К счастью, эксперимент можно улучшить, если заменить я/2-импульс последовательностью, известной как TANGO [3]. Эта последовательность для селективного возбуждения действует по-разному на ядра разного типа в соответствии с тем, связаны они с гетероядром или нет, действуя как я/2-импульс на связанные ядра и как л-импульс в противном случае. Это достигается с помощью спинового эха:

13

С:

я

На рис. 10.8 показано действие этой последовательности при т, равном 1/2Л;н- Сравним эту последовательность с «билинейным оператором поворота», введенным в гл. 9 (разд. 9.3.1). Последовательность TANGO сама по себе обычно не дает адекватного подавления сигналов протонов, не связанных с меткой, но в сочетании с разностным спиновым эхом получаемые результаты сравнимы с достигаемыми при использовании обращенного DEPT, но при этом с лучшей чувствительностью. В этом

Спиновое эхо и ./-спектроскопия д а м и и е протоны ж

г

г

/

/

~У

У

V №\

1 2J

л

ж

/

УЧ '

У

/

Ч

I

У

If

У It

гз

•к

связанны! протон\ы ж

375

г

+

\

У

к

\ \

г

ж


-4

if

/

/ У

У

Рис. 10.8. Последовательность TANGO для селективного возбуждения ядер, имеющих гетероядерную константу.

5

4

3

2

1

м. а. Рис. 10.9. Селективное детектирование протонов, присоединенных к метке 1 3 С , с помощью разностного спинового эха; начальный ;с/2-импульс заменен последовательностью TANGO. Во время регистрации применяется широкополосная развязка по 1 Э С. Подавление сигналов от необогащенных молекул подобно тому, что получается при использовании обращенного DEPT, но чувствительность значительно выше. Это тот же самый образец, который использовался для рис. 6.19, однако эксперимент был проведен спустя некоторое время; в слабопольной области относительно основного сигнала видны некоторые сигналы от продуктов разложения вещества, содержащего изотопную метку.

Глава 10

376

можно убедиться, сравнив рис. 10.9, демонстрирующий спектр, полученный при сочетании TANGO и разностного спинового эха, с рис. 6.19 в гл. 6, на котором для того же самого соединения изображен эксперимент обращенного DEPT.

10.3. Гетероядерный J-спектр 10.3.1. Введение Рассмотрим последовательность ./-модулированного эха с применением импульсного метода, однако в то же время вместо тщательно определенного интервала х мы будем использовать произвольный интервал ?х/2. Ниже я буду повсюду говорить о наблюдении связанных спин-спиновым взаимодействием ядер ' Н и 1 3 С , но, конечно, это может быть любая пара ядер: (-) Х

--±-пу--±-

Н:

Выборка ...

71

Развязка ...

Исследуя рис. 10.10, мы можем проследить за поведением дублета. В течение данной последовательности каждая компонента отклоняется на угол izJt1. Поскольку мы собираемся включить развязку во время регистрации, главный интерес представляет результирующая этих компонент. Проецируя их на оси х и у, мы получим величину MCOS(JIJ?J) вдоль оси у, в то время как проекции компонент вдоль оси х направлены в противоположные стороны и взаимно погашаются. Таким образом, к началу регистрации детектируемый вектор намагниченности всегда направлен вдоль оси +у, т.е. он имеет постоянную фазу, не зависящую от ?!. Однако его амплитуда подвержена модуляции, характер которой определяется величиной константы спин-спинового взаимодействия.

В-

/Я\

2

i

1

2

Рис. 10.10. Амплитудная модуляция сигнала углерода группы СН-основа гетероядерной ./-спектроскопии.

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

377

Отметим, что эта чисто амплитудная модуляция возникает как результат симметричного расположения компонент дублета, которое в свою очередь обусловлено тем, что спиновая система имеет первый порядок. В более сложном случае, включающем взаимодействия как между протонами, так и между протонами и углеродом, в системе может встретиться порядок, отличный от первого. Тогда предположение, что мультиплеты должны быть симметричными относительно их центров, оказывается несостоятельным. Это может привести к заметному усложнению вида спектра. Я буду везде подразумевать взаимодействия исключительно первого порядка; более детальный анализ данного вопроса представлен в работе [4]. Если проследить за применением показанной выше последовательности к группам СН 2 и СН 3 , то можно убедиться, что в основном линии показывают амплитудную модуляцию в течение ty., степень которой зависит от их положения относительна центра мультиплета. Это означает, что если мы выполняем двумерный эксперимент с варьируемыми t1, то координата v t будет содержать только мультиплетную структуру, в то время как v 2 будет содержать только химические сдвиги, так как регистрация происходит с широкополосной развязкой. Это и есть J-спектр; он соответствует протонно-связанному углеродному спектру, в котором мультиплетные структуры разных сигналов разошлись в пространстве и стали направленными по второй координате. Тот же самый эксперимент может быть выполнен с использованием переключения декаплера вместо Tt-импульса на протонах, как описано выше для одномерного J-модулированного эха (эксперимент с «переключаемым декаплером»). В этом случае из-за того, что J-модуляция происходит только в течение половины / х , расстояния между линиями по этой координате уменьшаются вдвое. В зависимости от обстоятельств это можно рассматривать и как полезное, и как нежелательное свойство.

10.3.2. Примеры гетероядерных ./-спектров Существуют две до некоторой степени крайние ситуации, когда выгодно применять гетероядерный J-спектр: стремление либо к очень высокому, либо к очень низкому разрешению по координате v t . В первом случае эксперимент используется в качестве средства разделения мультиплетов, которые перекрывались бы в обычном спектре; он также имеет то преимущество, что устраняет неоднородность за счет спинового эха. Во втором случае это скорость и высокая чувствительность при определении мультиплетности интересующих нас сигналов. Для большинства структурных проблем применяется быстрый эксперимент с низким разрешением, но я буду обсуждать оба. Эксперимент с высоким разрешением по координате vi. Так же как и в эксперименте с высоким разрешением, в J-спектре можно наблюдать мультиплеты с естественными ширинами линий. Это происходит из-за

378

Глава 10

того, что огибающая сигнала в течение tt определяется истинным значением Т2, а не Т | , когда спиновое эхо устраняет неоднородность магнитного поля. (Как и обычно в случае спинового эха, ограничения возникают вследствие диффузии внутри образца.) Однако использованию этой особенности могут мешать другие практические трудности. Если наблюдаются истинные ширины линий, то потребуется тонкая оцифровка по координате v l 5 поскольку значения Т2 для углеродов могут быть большими, зачастую достигая 10 с и выше. Идеальными были бы времена регистрации, в несколько раз большие, чем величины Т2, однако при этом потребуется много инкрементов по t1 при небольшой ширине спектра по этой координате. Самыми широкими мультиплетами у протонно-связанных углеродов являются квартеты, возникающие для метальных групп. Имея в виду, что прямая КССВ не превышает 200 Гц, нам может потребоваться оцифровать диапазон спектра в 600 Гц (для эксперимента с импульсами по протонам). Это означает, что инкремент по ft должен быть около 0,8 мс. Чтобы получить время регистрации по гх хотя бы 10 с, мы должны, таким образом, сделать более тысячи прохождений. Это редко удается, так как 13 частота повторения эксперимента определяется временами Тх для С и поэтому оказывается достаточно малой. Чувствительность также будет низкой, поскольку многие эксперименты необходимо проводить с большими значениями А, ; следовательно, время регистрации по v 2 должно быть не меньше чем Tf, даже если меньшие значения давали бы приемлемое разрешение по этой координате. Одновременное выполнение двух этих условий приводит к очень большим массивам данных. Может показаться, что вариант эксперимента с переключаемым декаплером уменьшает проблему оцифровки по v, (фактически вдвое) из-за того, что в этом методе диапазон спектра вдвое уже. Однако при этом желаемое нами разрешение, а также расстояние между линиями также будут вдвое меньше, что, напротив, создает проблему для получения высокого разрешения. Для описанных ниже экспериментов с низким разрешением уменьшение диапазона спектра оказывается полезным. Кроме того, есть и другие преимущества использования метода переключаемого декаплера перед импульсным, которые мы обсудим в разд. 10.3.3. Приняв во внимание все эти соображения и имея известное терпение, при необходимости, если того потребует эксперимент, можно получить довольно высокое разрешение в J-спектре. Хотя массив данных может иметь большой объем, нужно всего лишь, чтобы было место для его хранения, так как его обработка, как правило, не вызывает серьезных проблем, поскольку можно не выполнять полное двумерное преобразование. Вместо этого достаточно преобразовать только по координате v 2 и затем для преобразования по v t выбирать единичные столбцы, соответствующие интересующим нас химическим сдвигам. Эти сечения могут быть дополнены нулями и преобразованы с большим числом точек как обычные одномерные спектры. На рис. 10.11 показаны выде-

Спиновое эхо и J-спектроскопия

т л а ч » . ы - V Гц |||||и&||о„„ь).1ДГц

-80

379

г iTh

-120

Рис. 10.11. Сечения через координату v1 гетероядерного J-спектра металлоорганического соединения с высоким разрешением по v t . В принципе таким образом могут быть получены естественные ширины линий. ленные таким образом сечения из J-спектра металлоорганического соединения. Отметим, что, хотя сам двумерный спектр следует представлять в виде магнитуды (ограничения, определяющие этот выбор, мы обсудим ниже в разд. 10.3.3), отдельные сечения могут быть настроены по фазе на сигнал чистого поглощения. Основным неблагоприятным фактором для получения высокоразрешенных гетероядерных констант с помощью J-спектра является относительно большая ширина спектра, которая определяется наличием больших по величине прямых констант. Если вас в этой ситуации в первую очередь интересует тонкая мультиплетная структура, обусловленная дальними константами (т.е. константами через две и три связи в спектре 1 3 С), то для этого случая предложен хороший альтернативный подход [15]. Замена я-импульса в центре периода ft «билинейным оператором поворота», уже рассмотренным в гл. 9 (разд. 9.3.1), устраняет J-модуляцию, вызванную большими прямыми константами за счет рефокусировки соответствующих компонент мультиплетов. Малые константы при этом не подвергаются воздействию и поэтому модулируют сигнал как функцию r t . Эта процедура понижает требуемый диапазон спектра до ширины мультиплета, обусловленной дальними константами, и делает возможной тонкую оцифровку по координате vl. Эксперимент с низким разрешением по координате v t . Традиционной проблемой в спектроскопии ЯМР 1 3 С является определение числа протонов, связанных с каждым атомом углерода. Мы рассмотрим сейчас два способа, альтернативных традиционному методу внерезонансной развязки: редактирование спектра посредством переноса поля-

Глава 10

380

ризации и применение J-модуллрованного спинового эха. Используя J-спектр, можно заполнить пробел между неполной информацией, предоставляемой одномерным экспериментом по спиновому эху, и полной, оцененной экспериментально с использованием процедуры редактирования на основе ./-спектра. Когда структуры 13С-мультиплетов присутствуют на координате v t , очевидно, что там содержится вся желаемая информация. Но если речь идет о сравнении данного эксперимента с конкурирующими методами, то сделать это нужно быстро и с высокой чувствительностью. Для этого требуется определить, каково минимально приемлемое число инкрементов по tlt при котором еще не происходит потери разрешения. Для данного эксперимента с низким разрешением мы, естественно, выбрали метод с переключением декаплера, который обеспечивает минимальную ширину спектра по v t и более удобен в работе. Обсуждая вопрос о цифровом разрешении в гл. 8 (разд. 3.3.5), мы убедились в том, что для получения эффективной ширины линии 8v нам нужно время регистрации l/5v. Теперь, если минимальное значение прямой углерод-протонной константы будет около 130 Гц, в эксперименте с переключением декаплера расстояние между линиями уменьшается до 65 Гц.

ill

II 11 I II il,

лЛА.Ш

1D0 :-60

'- о -50 100 Гц 28

27

26

25

24

23

22 М.Э.

21

20

Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по \1 обеспечивает быстрое определение мультиплетности (часть спектра 1 3 С холестерилацетата, экспериментальные условия описаны в тексте). Спектр 'Н с широкополосной развязкой (А) приведен над контурным представлением .7-спектра (Б), а спектр с внерезонансной развязкой (5) можно сравнить с вертикальными сечениями через Vj (Г). Сечения 1-4 позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчетливо обнаруживается недостаточное разрешение по v 2 . Вследствие перекрывания триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по v 2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.

Спиновое эхо и J-спектроскопия

381

Максимально приемлемая ширина линии, не приводящая к неразрешенным линиям, должна быть меньше этого расстояния, скажем 40 Гц. Из этого вытекает время регистрации ио v t , равное 25 мс. Диапазон спектра составляет 300 Гц, следовательно, нам нужно около 15 инкрементов. В этом случае во избежание искажений формы пиков сильно усеченный сигнал по этой координате должен быть умножен на тщательно подобранную взвешивающую функцию. На рис. 10.12 показан спектр, полученный в точно таких условиях. Общее время регистрации составило 30 мин, что сравнимо со временем, необходимым для получения спектра с внерезонансной развязкой с приемлемым отношением сигнал/шум. Существует возможность еще более понизить число инкрементов по tu используя иной подход к обработке данных. Как было показано выше, можно увеличить эффективную ширину линии 5У ЭФФ при действии взвешивающей функции таким образом, чтобы Atl было примерно 1/8Уэфф (ЗГ|). Если этого не сделать, то можно показать, что эффективная

i

1

1

г

сн

СН*СН,

сн,

и°

ДХХ1ХШЛААААААААААА 6

3

2

>

П

4

12

5

20

7

I

9 1 3 1 6 1 9 1 0 1 4

13

16

17

Рис. 10.13. J-Спектроскопия только с 5 инкрементами по f,-c использованием специальной обработки данных (см. текст). Для этого соединения при редактировании спектра был1 получен ошибочный результат (верхние спектры) из-за большой константы Jal для С 2 0 (помечена стрелкой). Однако J-спектр дает вполне однозначный ответ.

382

Глава 10

ширина линии составит примерно 0,6/А, г однако сигналы исказятся при усечении. Возникающие при этом «вигли» можно удалить другими средствами помимо аподизации. В частности, можно использовать тот факт, что нам известна форма искажения, определяемая малостью значения Aty. Перспективным методом обработки таких сильно усеченных данных является метод максимальной энтропии [5] (гл. 2); в нем делаются определенные предположения о форме спектра, который следует восстановить. Недавно предложен новый вариант этого метода [6], предъявляющий намного меньше требований по вычислительным затратам (метод впервые использован в радиоастрономии). В этом случае для определения истинного положения пиков применяется итерационная процедура. На рис. 10.13 показано определение мультиплетности этим методом с использованием только 5 инкрементов по tl в J-спектре.

10.3.3. Экспериментальные аспекты EXORCYCLE и составные я-импульсы. Оказывается, что больше всего ущерб качеству J-спектров наносит искажение каждого из импульсов по наблюдаемому ядру, но особенно это касается л-импульса. Детальный анализ этой проблемы приведен в работе [7]; я же просто покажу связь наиболее очевидных проблем и существующих стандартных решений. Представим, что я/2-импульс в начале последовательности немного короче своей номинальной длительности, что может возникнуть либо из-за его неправильной калибровки, либо вследствие неоднородности Ву, неизбежной в определенных частях образца. При этом небольшая часть намагниченности останется направленной вдоль оси z к началу tx. По-видимому, л-импульс будет тоже короче номинальной длительности, поэтому вместо безобидного инвертирования этой намагниченности он будет переводить некоторую ее часть в плоскость х — у. Здесь она будет совершать прецессию в течение второй половины tl с частотой, определяемой как химическими сдвигами 1 3 С , так и углерод-протонными константами в импульсном варианте эксперимента. После двумерного преобразования появляются дополнительные пики. Поскольку они совершали эволюцию на частоте, определяемой как химическими сдвигами, так и константами, почти наверняка они будут отражаться по координате v x . Более глубокий анализ обнаруживает другие нежелательные аспекты использования неидеальных я-импульсов. В гетероядерном эксперименте с импульсом по протонам несовершенство этого импульса также вызывает появление в спектре дополнительных пиков между истинными компонентами мультиплета [8]. В гомоядерном J-спектре (см. следующий раздел) существует даже больше оснований для беспокойства. Предположим, что тг-импульс был слишком длинным. Тогда мы можем мысленно выделить в эксперименте ту его часть, которая соответствует

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

383

действию номинального по длительности я-импульса, а остальная часть в этом случае будет состоять из последовательности я/2 — t1/2 — a — — tJ2-Выборка, где а-избыточная часть «длинного» я-импульса. С точностью до несущественных деталей задания временных интервалов это представляет собой последовательность переноса когерентности, точно такую же, как в COSY. Мы ожидаем, что протонная намагниченность, совершающая эволюцию в течение первой половины tx с протонными химическими сдвигами и константами, будет переноситься и детектироваться как модуляция намагниченности других взаимодействующих протонов в течение t2. В узком диапазоне координаты v t химические сдвиги будут отражаться много раз, приводя к дополнительным пикам в непредсказуемых местах. Весьма вероятно, что действие я-импульсов будет сопровождаться инверсией намагниченности (гл. 4), и возникнут связанные с этим проблемы. В гетероядерном эксперименте проблем с протонными я-импульсами избежать просто, выбрав вариант эксперимента с переключаемым декаплером. В гомоядерной J-спектроскопии (разд. 10.4) такой возможности пет. Чтобы избежать появления дополнительных пиков в ./-спектрах, совершенно необходимо использовать подходящее циклирование фазы. Циклирование я-импульса по 1 3 С в последовательности х, у, —х, —у с инверсией фазы приемника с шагом в 90е по фазе импульса устраняет много проблем. Эта процедура известна как EXORCYCLE [9] (из-за того, что некоторые из дополнительных пиков в J-спектрах называются по-разному: и как «фантомы», и как «призраки»). Она может быть скомбинирована обычным образом с CYCLOPS при одновременных шагах поворота всех фаз в 1 3 С и фазы приемника. Проблемы протонного я-импульса лучше всего решать в гетероядерном случае, используя метод переключаемого декаплера, как упомянуто выше. Для гомоядерной J-спектроскопии рекомендуется использовать составной я-импульс (п/2)хку (я/2)х (гл. 7). Распознавание знака и форма линии. Распознавание знаков частот по v x в J-спектре часто не является столь проблематичным, как в экспериментах с переносом когерентности. Для случаев чисто первого порядка, которые мы обсудили, или всегда для экспериментов с низким разрешением мультиплетность сигналов симметрична относительно Vj = 0, так что можно использовать отражение относительно этой линии. Результирующий спектр может быть скорректирован по фазе в спектр чистого поглощения, поэтому нет нужды использовать необычные взвешивающие функции. Однако спектр поглощения возникает из-за наложения симметрично расположенных пар линий с нежелательной фазоскрученной формой, и любое отклонение от точной симметрии относительно линии vx = 0 будет искажать его. В этом случае (т. е. для систем, не имеющих чисто первого порядка) или просто для того, чтобы восстановить определенные области мультиплетов по v l 5 комбинирование подходящих квадрантов преобразо-

384

Глава 10

ванных данных позволяет провести распознавание знаков частот по vx [10]. Поскольку индивидуальная компонента мультиплета (а не результирующая пары компонент) претерпевает фазовую модуляцию в течение
10.4. Гомоядерный ./-спектр 10.4.1. Введение Если последовательность спинового эха используется при наличии гомоядерной связи, то автоматически возникает J-модуляция детекти* В 1982 г. предложен весьма перспективный метод измерения дальних констант 1 3 С - ' Н , основанный на использовании селективного инвертирующего я-импульса для получения гетероядерного J-спектра; см.: Вах A., Freeman R., J. Amer. Chem. Soc., 104, 1099 (1982).- Прим. перев.

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

385

-0

-50 -100 Гц 40

20

-й

Рис. 10.14. Сравнение гомоядерного (а) и гетероядерного (б) J-спектров систем А 3 Х. В случае гомоядерного спектра константа проявляется по обеим координатам, поэтому мультиплет имеет наклон 45°. руемого сигнала как функция tv, поскольку гомоядерные константы не рефокусируются. Двумерный эксперимент, выполненный при варьировании tl, таким образом, ведет к разделению мультиплетных структур по v x , как и в гетероядерном случае. Существует, однако, важная разница: взаимодействия присутствуют еще и в течение t2. В гетероядерном эксперименте мы устраняем их за счет широкополосной развязки, но ясно, что это невозможно для гомоядерных констант. В результате мультиплеты лежат не на линии, параллельной координате^!, а на наклоненной к ней под углом 45°. Для иллюстрации этого случая на рис. 10.14 сравнивается гетероядерный /-спектр метильной группы с гомоядерным спектром Х-части протонной системы А3Х в одном масштабе как по v l 5 так и но v 2 . На практике обычно масштаб изображения по координате v 2 бывает намного мельче, чем для v,, потому что спектр должен включать весь диапазон химических сдвигов, а не только ширину одного мультиплета; поэтому наклон будет менее явно выражен (рис. 10.15). Как мы увидим позднее, поворот мультиплетных структур в некоторых случаях может быть сопряжен с определенными проблемами. Однако сначала рассмотрим вопрос о том, с какой целью мы хотим получить гомоядерный J-спектр. Сугубо умозрительно преимущества этого метода таковы: разделение перекрывающихся мультиплетов при их развороте на вторую координату, возможное улучшение ширины линии по v1 из-за устранения неоднородности поля и возможность отличить гомоядерные константы, которые проявляются по координате Vj, от гетероядерных, которые в рамках этого эксперимента выступают подобно химическим сдвигам и проявляются только по координате v 2 . Имея в виду первые два связанных друг с другом аспекта, необходимо помнить, что эксперимент работает нормально только для систем чисто первого порядка. При наличии сильной связи появляются дополнительные линии. Это означает, что эффективное дополнительное разре-

Глава 10

386

1

1 1

1

1

• 1

--5 1

1 11

4,4

- 0

1

1

4,0

3,8

1

11•

3,6 3,4 М.В.

3,2

-10

ДО

2,8

i

-a

1

- 5

1

4,2

I " ' и 1 И

1

in 4,2

4,0

3,8

3,6 3.4 М.Э.

-5

i

n1

-10 Гц

.0 I 3,2

3,0

2,8

Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представлениями). Время регистрации по ./-координате было около 2,5 с. Контурное представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его интерпретация становится неоднозначной (справа). шение мультиплетной структуры может быть получено только для довольно ограниченного случая перекрывания большого числа сигналов, которые тем не менее должны быть мультиплетами первого порядка. В тех случаях, когда эти условия выполняются, полученный У-спектр может оказаться достаточно информативным, но необходимо учитывать при этом некоторые осложнения, обсуждаемые дальше.

10.4.2. Наклон J-спектров Наиболее интересная информация заключена в J-спектре по координате v t . Хорошо бы иметь возможность, как и в гетероядерном эксперименте, в сечениях параллельно v t обнаружить все компоненты мультиплета. К сожалению, из-за поворота на 45° мы в действительности находим, что они содержат только одиночные линии. Каждый столбец, несущий сигнал по v l 5 содержит одну компоненту мультиплета. Другой недостаток гомоядерного ./-спектра обнаруживается, если представить себе его проекцию на координату v 2 параллельно v x , т.е. просуммировав столбцы массива данных. В гетероядерном экспери-

Спиновое эхо и J-спектроскопия

387

менте такие столбцы либо содержат все компоненты мультиплета в тех случаях, когда они находятся при соответствующей сигналу частоте по координате v 2 , либо они не содержат ничего (кроме шума). Следовательно, проецирование на v 2 восстанавливает одномерный спектр детектируемого ядра без каких-либо констант. Напротив, проекция гомоядерного эксперимента на v 2 параллельно v t просто дает вам нормальный спектр со всеми константами. Тем не менее открывается захватывающая перспектива получения спектра с широкополосной гомоядерной развязкой. Это достигается при проецировании вдоль линии, наклоненной к оси v 2 под углом 45°, что заставляет все компоненты мультиплета выстраиваться вдоль одного направления (это действительно так) и, таким образом, приводит к спектру, содержащему просто одиночную линию на месте каждого химического сдвига. К сожалению, если двумерный массив данных сохраняет свою фазовую информацию, то свойство соотношения Фурье {теорема о сечениях и проекциях) показывает, что фактически сигналы не будут наблюдаться при проецировании J-спектра под углом 45°. Это происходит из-за того, что положительные и отрицательные части фазоскрученных линий при точной ориентации вдоль направления, наклоненного под углом 45°, взаимно погашаются при суммировании. Проецирование спектра в виде магнитуды обходит эту проблему, но мы будем иметь все обычные неудобства магнитудных спектров, связанные с широкими линиями и необходимостью сильного улучшения разрешения. Даже для магнитудных спектров проекция под углом 45° может оказаться полезной. Получение проекций и сечений, которые также могут оказаться полезными для выделения сложных мультиплетов, значительно упрощается с помощью специального приема: повороту подвергается весь массив данных. Это влечет за собой перемещение каждой заполненной строки в большей или меньшей степени в зависимости от ее частоты по v, и ведет к представлению, похожему на гетероядерный J-спектр. Вычисляется магнитудный спектр, тогда сечения параллельно v t содержат мультиплеты, а проекция на координату v 2 выглядит как спектр с широкополосной гомоядерной развязкой; это показано на рис. 10.16. Во всем этом деле разочаровывает следующее: прилагая значительные усилия при проведении эксперимента, который должен увеличить разрешение, мы затем ухудшаем его снова, проводя вычисление магнитуды. В настоящее время не существует способа полностью избежать этого. Если главный интерес представляет разрешение единичных мультиплетов, то отдельные столбцы из повернутого массива данных могут быть изучены без вычисления магнитуды. Однако даже тогда в отличие от гетероядерного случая они не имеют вида истинного поглощения: линии обнаруживают сильное искажение у основания, возникающее при повороте, который смешивает дисперсионные компоненты (рис. 10.17). Поскольку рефокусирующее влияние на ширину линии на практике часто невелико, основное преимущество состоит просто в разделении пере-

388

Глава 10

ЛЛ

нормальный спектр

проекция

t

сильное спин-спинобое взаимодействие

наклоненный 3- спектр

артефакты

I

1

t

1

I

0

J

1

t 8

'

4,2

4,0

3,8

3,6

3,4 М. Э.

3,2

3,0

2,8

РИС. 10.16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекцией на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополосной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные пики, которые отмечены стрелками на этом спектре. крывающихся мультиплетов. Если же вас интересует проекция, то в этом случае требуется особое внимание уделить подбору взвешивающей функции по каждой координате. Но как ни старайся, очень узких линий получить все-таки не удается. Представление гомоядерного J-спектра с фазой, соответствующей сигналу чистого поглощения, было бы весьма привлекательным для каждой из двух поставленных задач, но пока еще не существует полностью удовлетворительного решения. Известна последовательность, позволяющая получить фазу чистого поглощения для двухспиновой системы [12], но для систем, состоящих из большего числа спинов, снова возникает вклад дисперсии. Также предложен вычислительный метод [13], родственный используемому для обработки сильно усеченных данных, который упомянут в разд. 10.3.2, но он, кажется, требует большого объема вычислений и, по моим сведениям, в настоящее время не может быть реализован в подходящей форме в системах обработки данных, которыми оснащены компьютеры спектрометров.

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

389

Рис. 10.17. Вертикальные сечения из наклоненного гомоядерного У-спектра можно представить в виде сигналов, близких по форме к сигналам поглощения (Л), но форма линии в таких спектрах сильно искажается. На рисунке для сравнения представлены два сечения из массива данных рис. 10.16: с вычислед нием и без вычисления магнитуды (Б) вместе с тем же мультиплетом из нормального одномерного спектра (В), обработанного эквивалентной взвешивающей функцией.

fi

Гц

В заключение можно сказать, что гомоядерный J-спектр полезен только с учетом ряда ограничений. Мы должны иметь взаимодействие чисто первого порядка и удовлетвориться либо тем разрешением, которого можно достичь в режиме магнитуды, либо пойти на сильное искажение формы линий. В таком случае мы получаем возможность применить данный эксперимент для разделения перекрывающихся мультиплетов, а при использовании проекций получить положения центров мультиплетов. Если присутствует гетероядерное взаимодействие, то оно также проявится на проекции, поэтому эксперимент может быть использован для идентификации гетероядерных констант.

10.4.3. Непрямой J-спектр В последний раз вернувшись к идее разделения перекрывающихся мультиплетов, мы рассмотрим эксперимент, который находится на стыке гетеро- и гомоядерной J-спектроскопии, причем в экспериментальном аспекте он очень близок к гетероядерной корреляционной спектроскопии (гл. 9). Этот метод решает проблему полностью перекрывающихся мультиплетов, перекрывание которых, очевидно, сохранится и в гомоядерном J-спектре. Он позволяет перенести гомоядерную мультиплетную структуру на химические сдвиги соседних гетероядер. В действительности идея довольно проста. Гетероядерный корреляционный эксперимент в принципе уже содержит тонкую структуру по v : вследствие гомоядерных взаимодействий между ядрами, от которых переносится намагниченность. Эту структуру не просто разглядеть

Глава 10

390 tl

>=-*,-

2

«г.

выборка

Рис. 10.18. Последовательность для непрямого J-спектра. Сравним с последовательностью HSC: для устранения различий химических сдвигов по координате v, в середину интервала tl помещается тс-импульс по 'Н. При этом рефокусируется и гетероядерное взаимодействие, в связи с чем отпадает необходимость импульса по 1 3 С . В интервал А, необходимо встроить я-импульсы по обоим ядрам, но в интервале Д 2 они необязательны. в экспериментальном спектре, поскольку сложно оцифровать v t достаточно тонко из-за того, что эта координата включает весь диапазон химических сдвигов для протонов-до 10 м. д. Если химические сдвиги убрать с этой координаты, что в принципе можно сделать с помощью спинового эха, то только ширина самого широкого мультиплета из тех, которые нужно охарактеризовать, будет определять диапазон частот по v 1 ? что уже делает возможным достижение высокого разрешения. Таким образом, последовательность нормальной корреляции химических сдвигов модифицируется просто добавлением протонного тт-импульса в центре периода эволюции (рис. 10.18), при этом убираются химические сдвиги с координаты v t . Эксперимент подробно описан в работе [14]. Этот эксперимент имеет те же ограничения, что и гомоядерная J-спектроскопия, но характеризуется более низкой чувствительностью из-за того, что детектируется гетероядро, поэтому пользоваться им следует только в самых крайних случаях-при полном перекрывании сигналов в нормальном J-спектре. На рис. 10.19 показаны результаты,

--Ю.0

г.

--5,0

0 Г? 0 и

0

л

-0,0

V

-5,0

t

0 0

-Ю,0

•• о О

U о

0

f)

/X

V

о0

77,0

Tbfi

7ЗД 74,0 7JD 72,0 Д О 70,0

3,6

3,5

3,4

г-5,0

8 о

о

Гц

м!в.

з.г

--10,0

0,0 -5,0

ко Гц

3,1

Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б) J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов неодинаков.

Спиновое эхо и ./-спектроскопия

391

полученные для образца глюкозы в D 2 O. Нормальный протонный спектр (вверху справа) плохо разрешен из-за довольно большой ширины линии и в силу того, что вещество существует в виде смеси аномеров. Протонный J-спектр немного лучше, но мультиплеты все еще трудно идентифицировать. Но уже в непрямом J-спектре мультиплетная структура хорошо просматривается.

Литература 1. Levitt M.H., Bodenhausen G., Ernst R.R., J. Mag. Res., 53, 443-461 (1983). 2. Freeman R., MareciT.H., Morris G. A., J. Mag. Res., 42, 341-345 (1981); DoddrellD.M., ReidD.G., Williams D.H., J. Mag. Res., 56, 279-287 (1984); DoddrellD.M., Williams D.H., ReidD.G., Fox K., Waring M.J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 218-220 (1983). 3. Wimperis S.C., Freeman R., J. Mag. Res., 58, 348-353 (1984). 4. Bodenhausen G., Freeman R., Morris G. A., Turner D.L., J. Mag. Res., 28, 17-28 (1977). 5. Hore P.J., J. Mag. Res., 62, 561-567 (1985). 6. Keeler J., J. Mag. Res., 56, 463-470 (1984). 7. Bodenhausen G., Freeman R., Niedermayer R., Turner D. L., J. Mag. Res., 26, 133-164 (1977). 8. Freeman R., Keeler J., J. Mag. Res., 43, 483-486 (1982). 9. Bodenhausen G., Freeman R., Turner D.L., J. Mag. Res., 27, 511 (1977). 10. Freeman R., Kempsell S. P., Levitt M.H., J. Mag. Res., 34, 663-667 (1979). 11. Bachmann P., Aue W.P., Muller L., Ernst R.R., J. Mag. Res., 28, 29-39 (1977). 12. Williamson M.P., J. Mag. Res., 55, 471-474 (1983). 13. Shaka A.J., Keeler J., Freeman R., i. Mag. Res., 56, 294-313 (1984). 14. Morris G.A., J. Mag. Res., 44, 277-284 (1981). 15. Box A., J. Mag. Res., 52, 330-334 (1983).

Предметный указатель Акриловая кислота 181, 182 Аксиальные пики 282, 283 Алгоритм быстрого фурье-преобразования Кули и Тьюки 31 Аморфные стеклообразные растворы 153 Амплитуда сигнала 287 - спинового эха 230 - шума 93 Амплитудная модуляция 376 Ампула для регистрации спектров ЯМР 60 Аналого-цифровой преобразователь (АЦП) 22, 32, 92 -разрешение 32, 92 Аподизация 44 Аттенюатор 251 Ацетилацетонат хрома (III) 133, 241 Билинейный оператор поворота 360 Боковые полосы 66, 67, 71, 78, 232 mpem-Бутильная группа 186 Взвешивающие функции 46, 49, 243 «Вигли» 41, 44, 50, 253 Возбуждение образца 28 Вращательный момент 103 Вращающаяся система координат 101 Времена выборки данных 298

-ожидания 154 Временное представление 29 Время регистрации 34, 41, 354 - смешивания 342, 364 Выборка 197, 206, 212, 368, 373 -данных 33, 136 Выбор растворителя 55 Гауссово псевдо-эхо 291 Гауссовы линии 48 Геминальные взаимодействия 359 Гетероядерная корреляционная спектроскопия 18, 349 - многоквантовая когерентность 205 -./-модуляция 368 Гетероядерный J-спектр 376 - ЯЭО 186, 187 Гиромагнитное отношение 99 Гомоядерная развязка 16 Гомоядерный J-спектр 384 Гравитационное поле 99 Z-Градиенты 77 Датчики ЯМР 23, 86 - настройка 88 - селективно-настроенные 87 - широкополосные 87 — с помощью моста 90 направленного ответвителя 91 Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР 260

Предметный указатель - спектроскопия ЯМР 302 Двумерные спектры INADEQUATE 334-337 - эксперименты 18 Двумерный эксперимент NOESY 165 - ЯМР-эксперимент 264-266 Двухквантовая когерентность 306 Дейтериевая стабилизация (лок) 72 Дейтерированная вода 249 Дейтерированные ЯМР-растворители 56 - протонные спектры 59 Декаплер 64 Детектирование сигнала 33 Дефекты формы линии 76 2,3-Дибромпропионовая кислота 308 Динамический диапазон 92, 93 Диполь-дипольное взаимодействие 132, 152 - сила 154 Дискретная выборка интервалов 262 орто-Дихлорбензол (ODCB) 64, 65 Длительность импульса 218, 236 Дополнение нулями 43 Естественная ширина линий 139, 377 Задержка 202, 353 - выборки данных 128 Избыточная намагниченность 100 Измерение ЯЭО 167 Изохроматы 134 Импульс 103 Импульсная фурье-спектроскопия ЯМР 31 Импульсный фурье-спектрометр ЯМР 22 - ЯМР 27, 142 Импульсы на частоте наблюдае26-75

393

мых ядер 219 Инверсия заселенностей 166 INEPT с рефокусировкой 196 Интенсивность сигнала 83, 199 Интерферограмма 262 Использование ЯЭО 179 Исходная намагниченность ядра 194 Исходный эксперимент INADEQUATE 339 Калибровка длительности импульса декаплера 222 Квадратурное детектирование 117, 119, 121 - - по Vj 284

Квадрупольные ядра 212 Когерентность 305 Комплексный спектр 119 Константа активная 309 - пассивная 309 Константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) 16, 111, 129, 223, 313 Контроль ширины полосы 36 Коррекция фазы 126 Коэффициент усиления 198 Критерии разрешения 63 - чувствительности 81 Критерий Найквиста 36, 118, 302 Кросс-пики 265, 275, 277, 296, 310, 342 - идентификация 275 - интенсивность 300 - исчезновение 314 Кросс-релаксация 151, 174 Лабораторная система координат 112 р-Лактам 185 Ложные сигналы 36 Локальное поле на ядре 153 - электрическое поле 239 Лоренцева форма линии 31

394

Предметный указатель

Магнитные диполи 152 Магнитуда спектра 289, 353 Магнитудные спектры 320, 387 Максимальный ЯЭО 158, 199 Матрица плотности 143 Межъядерные расстояния 158, 162, 182 Мезаконовая кислота 179 Метод «аккордеон-спектроскопия» 330, 343 - CAT 25 - DANTE 138 - WALTZ 138 - инверсии-восстановления 132, 238 - максимальной энтропии (MEM) 51, 53 - непрерывной развертки 24, 27 - переключаемого декаплера 370, 377 - разностных спектров 168 - Редфилда 125 - RuSH 285, 292, 294 - TPPI 125, 287, 292, 294 - Эрнста-Бэйна 307 - ЯМР с непрерывной разверткой 34 Методы Фурье 18 Меченые частоты 261 Многоимпульсные эксперименты 227 Многоквантовая когерентность 97, 105, 306 - фильтрация 21, 207, 327 Мост Уинстона 90 Мощность радиочастотного поля при гетероядерной развязке 225 при гомоядерной развязке 224 сигнала 73 Наклон J-спектров 386 z-Намагниченность 230, 238, 240, 342 Намагниченность образца 103

- объемная 102 Напряженность поля 77, 218 Настройка колоколов 26 - разрешения 63, 74 без лока 80 - шиммов по ССИ 79 Насыщение 73 - перехода 146 Непрерывная развертка 266 Непрямой и гомоядерный J-спектры глюкозы 390 - J-спектр 389 Непрямые корреляции 356 Низкочастотный Лфильтр 362 Обменная спектроскопия 341 «Обращенные» эксперименты 213 Обращенный DEPT 214, 373, 374 Обрезание 34, 44 Объемная намагниченность 143 Объем образца 60 Одноквантовая когерентность 305 Опорная частота 112, 114 Определение траектории когерентности 144 Осцилляции (биения) 31 Отношение поле/частота 63, 68, 178 - сигнал/шум 25, 26, 38, 46, 65, 81, 120, 244, 300 Отражение в двух измерениях 317 Отраженные пики 122 Перенос когерентности 97, 105, 306 - намагниченности 268, 305 - поляризации 18, 199 Переходы - параллельные 296 - прогрессивно связанные 296 - регрессивно связанные 296 - связанные 296 Петля обратной связи 178 Пиковая интенсивность шума 82, 83 Повторение прохождений 235

Предметный указатель - частота 236 Подавление пиков 247 - предварительным насыщением 247 - «скроенным» возбуждением 249 Подспектры групп СН, СН 2 и С Н 3 208 Подход Белла-Сондерса 179 Поликристаллические порошки 153 Полное сопротивление цепи 90 Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT 209 Полосовой фильтр 38, 245 Последовательное насыщение линий 181 Последовательности WALTZ и WALTZ-16 234 Последовательность COLOC 361 - CYCLOPS 289 - DANTE 253 - DEPT 205, 206 - GROPE-16 230 - HSC 350 - MLEV 138 - «прыжок-возврат» 249, 250 - SPI 140, 223 - TANGO 374, 375 - UPT 212 Преимущество Фелгетта 28 Преобразование лоренцевой формы линии в гауссову 48 - Фурье 29, 51 Прерываемая развязка 168 Приготовление образца 54, 62, 167 Протонные спектры хлороформа 262 Протонный декаплер 222 - спектр 312 муравьиной кислоты 374 иридиевого комплекса 357 холестерилацетата 14 Процедура CYCLOPS 283, 303 - EXORCYCLE 382 Пути релаксации 147 26*

395

Равновесная намагниченность 241 Радиочастотное поле 100 Развязка 197, 206, 212, 368, 373 - с разделением времени 224 Разностная спектроскопия ЯЭО 168 - оптимальные условия 173 Разностное спиновое эхо 372 Разностный перенос поляризации 192 Разрешение 48 Распознавание знака 383 - отраженных пиков 50 Регистрация спектра 242 Редактирование спектров 203, 207, 208 - точность 209 Резонансная частота контура 90 Релаксационные процессы 73 Релаксация 128, 235 - поперечная 129, 134 - продольная 130, 131, 261, 282 - через диполь-дипольное взаимодействие 154 Сдвиги Блоха -Зигерта 169, 224, 225, 267 Селективная инверсия заселенности (SPI) 190 Селективное возбуждение 246, 252 - мягкими импульсами 252 - с помощью DANTE 253 Селективность 175 Селективный перенос заселенности (SPT) 175, 190 Сигнал дисперсии 39 - поглощения 39 - ЯМР 142 Сигналы ССИ 303 Сильнопольная часть спектра 275 Симметризация 318 Синусоидальная осцилляция 262 Систематические ошибки 243 Скорость развертки 26 - релаксации 156

396

Предметный указатель

Слабопольная часть спектра 274 Смешение (конволюция) фурье-образов 44 Согласованный фильтр 46, 47 Составной z-импульс 338, 339 Составные импульсы 228, 232 - я-импульсы 382 Спад свободной индукции (ССИ) 29, 104 Спектральная плотность 155 - ширина 142 Спектр COSY 273, 276, 278, 294, 314, 319 13 - С холестерилацетата 254 - INEPT 354 - HSC 356-358, 361 - J-модулированного эха 371 - непрерывной развертки по одной координате 268 - NOESY производного пенициллина 347 ./-Спектроскопия 18 Спектр RCT 332 Спектры двойного резонанса 281 - COSY-45 и COSY-90 323-325 - INEPT 196, 198 характеристики 198 - хлороформа 197 Спиновое эхо 130, 135, 136, 368 Спин-спиновое взаимодействие 270, 274 Среднеквадратичная амплитуда шума 82 Стационарная система координат 107 Стационарное эхо 237 Суммарный перенос намагниченности 192 Схема обратного эксперимента DEPT 215 - резонансного контура датчика ЯМР89 - эксперимента разностной спектроскопии ЯЭО 169

Теорема о сечениях и проекциях 387 - о максимальной мощности 88 - о центральном пределе 120 Теория поглощения Блоха 98 - фазовых циклов 117 Тест ASTM 81 Тесты для спектрометра 255 Треугольник Паскаля 313 Трехсшгаовый эффект 164 Триплет 369 Угол Эрнста 236 Уровни энергии 105 - заселенность 105, 150 Усиление в канале лока 73 Условие Бакса 301 - предельного сужения 156 Усреднение сигналов 25 Устранение артефактов по v 2 283 - взаимодействия по vt 351 по v 2 351 Уширение несимметричное 77 - симметричное 77 Фаза 40, 50, 113 - в двух измерениях 292 - канала стабилизации 178 - относительная 116 - приемника лока 73 Фазовая информация 308 - когерентность 143, 305 Фазовые квадранты 292 - ошибки ПО, 126,127, 295 - циклы 122, 353 Фазовый цикл CYCLOPS 122 - четырехшаговый 124 Фазочувствительный COSY с двухквантовым фильтром (DQF-COSY) 329 - детектор 114 - спектр COSY 296, 309 Фильтр типа синусоидально-колоколообразного окна 290 Фильтры типа эха и анти-эха 288

Предметный указатель Форма импульса 252 - линии 48, 383 - с перекрученной фазой 289 Формализм мультипликативных операторов 144 Фурье-спектроскопия ЯМР 41 Цитраконовая кислота 179 Цифровое разрешение 41, 42, 298

Частота декаплера 181 - ларморовой прецессии 100, 147, 190 - Найквиста 34, 35, 51 - повторения 354 Частотное представление 29 Частотные метки 97 Чувствительность 46, 186 - высокая 219 - максимальная 80 - низкая 221 - оптимальная 202

Шиммирование 69 Шиммы 69 - теплые 70 Ширина импульса 29 - линии 47 - развертки 34 Широкополосная развязка 203, 232, 354 гомоядерная 359, 387 Шкала мощности в децибелах 218 Шум 24 - белый 37 - в двух измерениях 316 - оцифровки 93 - по tt 316 Шумовая модуляция 232, 233 - протонная развязка (PND) 232

397

Эксперимент COSY 97, 270, 271, 277, 279, 281, 287, 294, 300 - COSY-45 322 - для квадратурного детектирования 119 - Джинера 266, 268, 269 - FOCSY 318 - HSC 353, 354 - INADEQUATE 333 - INDOR с фурье-преобразованием 267 - INEPT 193 - Kappa-Парселла 137 - Kappa- Парселла- МейбумаДжилла fCPMG) 138 - NOESY 342, 346 - POMMIE 207 - с обратной прерываемой развязкой 241 - SPI для хлороформа 193 Эксперименты D E P T + H DEPT + + 210 Электрический диполь 152 Эстафета Н - Н - С 363 Эстафетный перенос когерентности (RCT) 329, 330, 362 - спектр Н - Н - С 365, 366 - Н-Н-С-эксперимент 364 Эффективное поле 108 Эхо переноса намагниченности 289 Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) 17, 63, 133, 145, 160, 342 - в двухспиновых системах 160 - в реальных системах 160 - в системе из нескольких ядер 162 - неравновесный 165 - отрицательный 163 - положительный 163 Ядра 98 - отличные от протонов 62, 320 ЯМР с непрерывной разверткой 114

Оглавление Предисловие редактора перевода

:

Предисловие автора

5 7

Предисловие

11

Введение

12

Глава 1. О чем эта книга 1.1. Введение 1.2. Что вам нужно знать 1.3. Что вы найдете в этой книге У/1.4. Что можно сделать с помощью ЯМР 1.5. Маленькая прогулка вокруг спектрометра ЯМР Литература

14 14 16 17 19 21 23

Глава 2. Некоторые вопросы импульсного ЯМР 2.1. Введение 2.2. Настройка колоколов 2.3. Импульсный ЯМР 2.3.1. Введение 2.3.2. Возбуждение образца 2.3.3. Время и частота 2.4. Практическое выполнение импульсного ЯМР 2.4.1. Введение . . 2.4.2. Детектирование и регистрация 2.4.3. Преобразование 2.5. Практические аспекты фурье-спектроскопии ЯМР v/2.5.I. Введение 2.5.2. Цифровое разрешение и время регистрации 2.5.3. Обрезание и аподизация 2.5.4. Взвешивающие функции 2.5.5. Распознавание отраженных пиков 2.6. Преобразование Фурье-не единственный способ Литература

24 24 26 27 27 28 29 31 31 32 38 41 41 41 44 46 50 51 53

Глава 3. Основные экспериментальные методы 3.1. Введение 3.2. Приготовление образцов 3.2.1. Введение

54 54 54 54

Оглавление 3.2.2. Выбор растворителя 3.2.3. Ампула для регистрации спектров ЯМР 3.2.4. Объем образца 3.2.5. Приготовление образца 3.2.6. Ядра, отличные от протонов 3.3. Настройка разрешения 3.3.1. Введение 3.3.2. Критерии разрешения 3.3.3. Факторы, влияющие на разрешение 3.3.4. Шиммирование 3.4. Достижение максимальной чувствительности 3.4.1. Введение 3.4.2. Критерии чувствительности 3.4.3. Факторы, влияющие на чувствительность •Литература Глава 4. Импульсная спектроскопия ЯМР 4.1. Введение 4.2. Составные части эксперимента 4.2.1. Введение 4.2.2. Ядра 4.2.3. Радиочастотное поле 4.2.4. Вращающаяся система координат 4.2.5. Импульс! 4.2.6. Векторы и уровни энергии 4.3. Реальный эксперимент 4.3.1. Введение 4.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс 4.3.3. Когда детектируется несколько частот одновременно . . . . 4.3.4. Оси и фазы 4.3.5. Квадратурное детектирование 4.3.6. Фазовые ошибки и коррекция фазы •%4.4. Релаксация v 4.4.1. Введение , j 4.4.2. Двигаясь к равновесию v 4.4.3. Релаксация в плоскости х — у v 4.4.4. Спиновое эхо 4.5. Импульсный ЯМР Литература Глава 5. Ядерный эффект Оверхаузера 5.1. Введение 5.2. Происхождение ядерного эффекта Оверхаузера 5.2.1. Введение 5.2.2. Пути релаксации 5.2.3. Причины релаксации 5.2.4. ЯЭО и межъядерные расстояния 5.2.5. Неравновесный ЯЭО 5.3. Измерение ЯЭО 5.3.1. Введение 5.3.2. Приготовление образца 5.3.3. Метод разностных спектров 5.3.4. Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации \/5А. Использование ЯЭО 5.4.1. Очень простой случай

399 55 60 60 62 62 63 63 63 67 69 80 80 81 86 96 97 97 98 98 98 100 101 103 105 106 106 106 110 112 117 126 128 128 130 133 135 142 144 145 145 146 146 147 152 158 165 167 167 167 168 177 179 179

400

Оглавление 5.4.2. Проверка трехспинового уравнения 5.4.3. Реальная задача 5.4.4. Гетероядерный ЯЭО Литература

181 183 186 187

Глава 6. Перенос поляризации и редактирование спектров 6.1. Введение 6.2. Селективный перенос заселенности 6.3. INEPT xj 6.3.1. Введение 6.3.2. Характеристики спектров INEPT .' 6.3.3. Задержка 6.4. DEPT 6.4.1. Введение 6.4.2. Последовательность DEPT как многоквантовый фильтр . . 6.4.3. Редактирование спектров с помощью DEPT 6.4.4. DEPT для спектров без развязки .' . 6.4.5. Квадрупольные ядра 6.4.6. «Обращенные» эксперименты Литература

188 188 190 193 193 198 202 205 205 206 207 210 212 213 216

Глава 7. Дополнительные сведения об экспериментальных методах . . . 7.1. Введение 7.2. Длительность импульса и напряженность поля 7.2.1. Введение: шкала мощности в децибелах 7.2.2. Импульсы на частоте наблюдаемых ядер 7.2.3. Импульсы на других ядрах 7.2.4. Мощность радиочастотного поля при гомоядерной развязке 7.2.5. Мощность радиочастотного поля при гетероядерной развязке 7.3. Уменьшение неидеальности импульсов 7.3.1. Введение 7.3.2. Составные импульсы 7.4. Широкополосная развязка 7.5. Релаксация и повторение прохождений 7.5.1. Введение 7.5.2. Длительность импульса и частота повторения прохождений 7.5.3. Методы быстрого определения Г, ^ 7.6. Количественное измерение интенсивностей \, 7.6.1. Введение х, 7.6.2. Как сделать интенсивность сигналов пропорциональной числу ядер ^У 7.6.3. Регистрация спектра У 7.6.4. Другие аппаратурные трудности 7.7. Селективное возбуждение и подавление 7.7.1. Введение 7.7.2. Подавление пиков 7.7.3. Селективной возбуждение 7.8. Несколько тестов для спектрометра Литература

217 217 218 218 219 222 224

240 242 244 246 246 247 252 255 258

Глава 8. Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР. Корреляция за счет гомоядерного взаимодействия /8.2. Меченые частоты (/8.3. Эксперимент Джинера 8.3.1. Введение

260 260 261 266 266

225 227 227 228 232 235 235 236 238 240 240

Оглавление 8.3.2. Двумерный эксперимент. Непрерывная развертка-преобразование Фурье 8.3.3. Перенос намагниченности 8.3.4. Два реальных примера 8.3.5. Детали эксперимента COSY 8.3.6. Работа с COSY 8.4. Эксперименты, родственные COSY 8.4.1. COSY-45 8.4.2. Определение малых констант 8.4.3. Многоквантовая фильтрация 8.4.4. Эстафетный перенос когерентности 8.5. Другие эксперименты по гомоядерной корреляции 8.5.1. INADEQUATE 8.5.2. NOESY или обменная спектроскопия Литература

401

266 268 270 281 307 322 322 323 327 329 333 333 341 348

Глава 9. Гетероядерная корреляционная спектроскопия 9.1. Введение 9.2. Детали HSC 9.2.1. Устранение различных КССВ 9.2.2. Другие экспериментальные аспекты 9.2.3. Использование HSC 9.3. Эксперименты, родственные HSC 9.3.1. Широкополосная гомоядерная развязка по Vj в эксперименте HSC 9.3.2. Дальние константы 1 3 С - ' Н . Последовательность COLOC 9.4. Эстафетный перенос когерентности 9.4.1. Введение 9.4.2. Эстафета Н - Н - С 9.4.3. Использование RCT Литература

359 361 362 362 363 365 366

Г л а в а 10. Спиновое эхо и/-спектроскопия 10.1. Введение 10.2. Гетероядерная /-модуляция и спиновое эхо 10.2.1. Введение 10.2.2. Разностное спиновое эхо 10.3. Гетероядерный /-спектр 10.3.1. Введение 10.3.2. Примеры гетероядерных J-спектров 10.3.3. Экспериментальные аспекты 10.4. Гомоядерный /-спектр 10.4.1. Введение 10.4.2. Наклон /-спектров 10.4.3. Непрямой /-спектр Литература Предметный указатель

368 368 368 368 372 376 376 377 382 384 384 386 389 391 392

349 349 350 350 353 355 359