Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю Г О С У Д АРС Т В Е Н Н О Е О БРАЗО В АТ Е Л Ь Н О Е У ЧРЕ Ж Д...
8 downloads
266 Views
174KB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю Г О С У Д АРС Т В Е Н Н О Е О БРАЗО В АТ Е Л Ь Н О Е У ЧРЕ Ж Д Е Н И Е П РО Ф Е С С И О Н АЛ Ь Н О Г О О БРАЗО В АН И Я «В О РО Н Е Ж С КИ Й Г О С У Д АРС Т В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РС И Т Е Т »
Больш ой практикум по физ иологии челов екаи ж ив отны х
Т Е Х НИ К А Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х И С С Л Е Д О В А НИ Й П ракт и кум С пеци альност ь 020201 (011600) «Би ологи я»
В оронеж 2005
2 У тв ерж дено научно-методическим факультета3 ию ня 2005 г., протокол№ 4
сов етом
биолого-почв енного
С остав итель П оляков а-С еменов аН .Д .
«Больш ой практикум по физ иологии челов ека и ж ив отны х . Т ех ника гистологических исследов аний » подготов лен на кафедре физ иологии челов ека и ж ив отны х биолого-почв енного факультета В оронеж ского государств енного унив ерситета. Рекомендуется для студентов IV курса биолого-почв енного факультета, обучаю щ их ся по спец иальности 020201 (011600) «Биология»
3 С О Д Е РЖ АН И Е В в едение… … … … … … ..… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 4 Т ема1. Ф иксац ия тканей … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 4 1.1 .О бщ ие прав илафиксац ии… … … … … … … … … … … … … … … … 5 1.2 . Ф иксирую щ ие средств аи их применение… … … … … … … … … 5 1.3 . П рактическое з адание I … … … … … … … … … … … … … … ......... 7 Т ема2. П ромы в ание и обез в ож ив ание … … … … … … … … … … … … … … ... 7 2.1. П ромы в ание гистологического материала. .… … … … … … … … 7 2.2. О без в ож ив ание гистологического материала… … … … … … … ... 8 2.3. П рактическое з адание II … … … … … … … … … … … … … … … … .. 8 Т ема3. Залив каматериалав плотны е среды . П риготов ление гистологических красителей … … … … … … … … … … … … … … … .. 9 3.1. Залив кав парафин .… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 9 3.2. П риготов ление блоков … … … … … … … … … … … … … … … … .. 10 3.3. П рактическое з адание III ...… … … … … … … … … … … … … … … 10 Т ема4. П риготов ление гистологических срез ов … … … … … … … … … … . 11 4.1. П риготов ление срез ов изгистологических блоков .… … … … ... 11 4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле .… … … … … … … … … . 11 4.3. П рактическое з адание IV … … … … … … … … … … … … … … … ...11 Т ема5. О краш ив ание и з аклю чение гистологических срез ов … … … … ... 12 5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание … ..… … … … … … .. 12 5.2. Заклю чение срез ов в смолы … … … … … … … … … … … … … … ...13 5.3. П рактическое з адание V … … … … … … … … … … … … … … … ..14 Т ема6. Анализгистологических препаратов … … … … … … … … … … … … ..14 6.1. П рактическое з адание VI … … … … … … … … … … … … … … .....14 П рилож ение 1 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 15 П рилож ение 2 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .15 Л итература… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 15
4 ВВЕ ДЕ Н И Е П рактикум по тех нике гистологических исследов аний для студентов , спец иализ ирую щ их ся на кафедре физ иологии челов ека и ж ив отны х , посв ящ ен осв оению методик морфологических исследов аний . О н представ лен ш естью темами, в каж дой изкоторы х рассматрив аю тся теоретические обоснов ания раз делов и конкретны е з адания. Д анны й раз дел Больш ого практикума расш иряет теоретические и практические з нания студентов , полученны е ими при из учение общ его курса«Г истология». Работа с методической раз работкой помож ет студентам в ы работать нав ы ки самостоятельного приготов ления гистологических препаратов и сделать перв ичны й анализц итоморфологических структур раз личны х в идов тканей . П еред началом работ по гистологической тех нике студенты прох одят инструктаж у преподав ателя по т ехнике безопасност и нарабочем месте. Д ля поз нания з акономерностей раз в ития, строения, обмена в ещ еств и функц ий клеток и тканей в сов ременной гистологии ш ироко применяю тся методы исследов аний микроструктур на молекулярном, субклеточном, клеточном и тканев ом уров нях с помощ ью микроскопиров ания. Д ля микроскопического из учения исследуемы й объ ект долж ен удов летв орятьдв ум основ ны м услов иям: 1) он долж ен бы тьпроз рачны м; 2) его структуры долж ны бы ть контрастны , то есть отличаться одна от другой по показ ателям преломления или поглощ ения св ета. Больш инств о ж ив отны х тканей не удов летв оряетэтим требов аниям, поэтому их необх одимо подв ергать спец иальной обработке с ц елью приготов ления гистологического препаратадля микроскопического из учения. О снов ны м методом в гистологических исследов аниях яв ляется из учение окраш енны х срез ов раз личны х тканей и органов . Т радиц ионны й способ подготов ки материала для получения постоянного гистологического препарата в клю чает фи кс аци ю м ат ери ала, проводку (обезвож и вани е), зали вку (уплот нени е), при гот овлени е ги с т ологи чес ки х с резов, окраши вани е с резов, заключени е с резоввс вет оопт и чес ки е с реды . Т Е М А 1. Ф И К С А Ц И Я Т К А НЕ Й ной , пинц еты - глаз ной , О борудов ание и реактив ы : скальпель средний и глаз анатомический и х ирургический средний , нож ниц ы средние и больш ие, дв е чаш ки П етри, лез в ие, стеклянны е бю ксы в местимостью 20-50 мл (15 ш тук), флаконы для реактив ов и стаканчики в местимостью 50-100 мл, ш ирокогорлы е банки, перев яз очны е материалы . П икринов ая кислота, ледяная уксусная кислота, формалин (40% раств ор формальдегида), х лороформ, этилов ы й спирт, дистиллиров анная в ода, этилов ы й эфир, парафин.
5 1.1. О бщ ие прав илафиксац ии О бяз ательны м услов ием микроскопической тех ники яв ляется предупреж дение и з адерж ка посмертны х из менений в тканях . Э то достигается путем фиксац ии в з ятого для исследов ания материала. В основ е дей ств ия фиксаторов леж ат физ ико-х имические проц ессы , и, в перв ую очередь, проц есс коагуляц ии белков . Ф иксирую щ ая ж идкость долж на отв ечать дв ум основ ны м требов аниям: перв ое – бы стро проникатьв ткани и в торое – дей ств ов ать«мягко», не в ы з ы в ая грубы х наруш ений тканев ы х структур (сморщ ив ания, чрез мерного уплотнения и т. д.). Н еобх одимо придерж ив аться определенны х прав илфиксац ии. 1. Раз мер исследуемы х кусочков ткани долж ен бы ть таким, чтобы произ ош ло бы строе его пропиты в ание. В среднем для больш инств а фиксаторов беруткусочки толщ иной 0,5 – 5 мм. 2. Количеств о фиксирую щ ей ж идкости долж но не менее чем в 20 раз прев ы ш атьобъ ем исследуемого материала. 3. Ф иксируемы й объ ект нуж но помещ ать так, чтобы обеспечить однов ременно его пропиты в ание со в сех сторон. 4. Н еобх одимо соблю дать в ремя фиксац ии, которое з ав исит от св ой ств а фиксирую щ ей ж идкости, исследуемого материала и толщ ины в з ятого кусочка. В больш инств е случаев фиксац ию произ в одят при комнатной температуре. О днако для некоторы х спец иальны х исследов аний (особенно гистох имических и электронно-микроскопических ) применяю т фиксац ию ох лаж денны ми ж идкостями при температуре +4оС и ниж е. Ф иксац ию мож но считать з ав ерш енной после того, как ж идкость полностью пропитала фиксируемы й объ ект. Рав номерны й ц в ет и одинаков ая консистенц ия тканей на пов ерх ности раз рез а св идетельств ую т о том, что проц есс фиксац ии з ав ерш ен. 1.2. Ф иксирую щ ие средств аи их применение С фиксирующ ими смесями следует обращ ат ься сост орожност ью! Ф иксаторы раз деляю тнадв е основ ны е группы – просты е и слож ны е. К просты м фиксаторам относятся формалин, этилов ы й спирт, ац етон, дих лорид ртути ( сулема), соли тяж елы х металлов ( кобальт, платина, уран и т. д. ) и кислоты ( уксусная, трих лоруксусная, пикринов ая, осмиев ая, х ромов ая и др. ). Н аиболее распространенны ми фиксаторами яв ляю тся этилов ы й спирт и формалин. Эт анол осущ еств ляетбы струю фиксац ию , не требую щ ую обез в ож ив ания тканей перед з алив кой в парафин и ц еллоидин. Е го фиксирую щ ее дей ств ие осущ еств ляется з а счет обез в ож ив ания тканей и коагуляц ии белков , при этом происх одитобез ж ирив ание и сущ еств енное уплотнение тканей .
6 И спольз ую т 96 % и абсолю тны й этилов ы й спирт. В ремя фиксац ии з ав исит от материала: для тонких кусочков ткани толщ иной 0,5 – 2 мм оно состав ляет 15 – 30 минут, для кусочков в 3 – 4 мм соотв етств енно ув еличив ается до 2 – 3 часов . П риг от овление раст вора формалина. Раств ор формалина (40% раств ор формальдегида) раз в одят в одопров одной в одой (дистиллиров анная в ы з ы в ает набух ание тканей ) в соотнош ении: 1 частьформальдегидаи 10 частей в оды . П риготов ленны й раств ор формалина необх одимо ней трализ ов ать. В банку насы паю ткарбонаткальц ия (или магния), чтобы надне образ ов ался слой толщ иной 1,5 – 2 см. Затем налив аю т формалин, несколько разэнергично в стрях ив аю ти остав ляю тотстаив аться на2 суток. В ремя фиксац ии тканей в раств оре формалина от 24 – 48 часов до нескольких суток. В гистологической практике часто использ ую тся слож ны е фиксаторы . Ж идкост ь Б уэна. Э тот фиксатор яв ляется одним излучш их фиксаторов , так как бы стро проникает в ткани, в ы з ы в ая нез начительное их сж атие, и поз в оляет х орош о окраш ив ать тканев ы е структуры . Е го применяю т для приготов ления обз орны х препаратов , для фиксац ии тканей эмбрионов . Ж идкостьБуэнаготов ится непосредств енно перед фиксац ией . С остав : Раств ор пикринов ой кислоты (насы щ енны й ) 75 мл Ф ормалин 25 мл Л едяная уксусная кислота 5 мл П икринов ая кислота плох о раств оряется в в оде. Е е насы щ енны й раств ор необх одимо приготов ить з аранее. В сосуд насы паю т 25-30 г кристаллической кислоты и з алив аю т1 л горячей дистиллиров анной в оды . И з бы ток кислоты при ох лаж дении в ы падает в осадок и мож ет бы ть использ ов ан при приготов лении нов ой порц ии раств ора. Раств ор мож но х ранить неограниченны й период в ремени. П родолж ительностьфиксац ии материалав ж идкости Буэнасостав ляетот 2 до 24 часов в з ав исимости от в еличины объ екта. Д лительное (до нескольких суток) пребы в ание кусочков ткани в фиксаторе не ух удш аеткачеств о фиксац ии и их последую щ ей обработки. П осле фиксац ии материалпереносятв 70 – 80 % спирт, которы й меняю т2 – 3 раз ас интерв алом 30 – 60 минут(для удаления пикринов ой кислоты ). П римеч ание. О бъ ект, фиксиров анны й в ж идкости Буэна, з алив ается только парафином. Ж идкост ь К арнуа. С месь Карнуа яв ляется х орош им фиксатором, как для гистологических исследов аний , так и для гистох имических методик. Н едостатком яв ляется легкое сморщ ив ание тканей . Ж идкостьКарнуаприготав лив аю тнепосредств енно перед фиксац ией . С остав : Абсолю тны й (или 96 %) этилов ы й спирт 60 мл
7 Х лороформ 30 мл Л едяная уксусная кислота 10 мл Кусочки толщ иной до 5 мм фиксирую тв течение от30 минутдо 1 часа(в з ав исимости от толщ ины объ екта). П осле фиксац ии кусочки сраз у переносят в абсолю тны й спирт. Е сли фиксатор бы л приготов лен на96 % спирте, то кусочки следует ополоснуть 2 – 3 раз а в спирте той ж е конц ентрац ии; в случае необх одимости материалмож но остав итьв спирте на2 – 3 часа. П римеч ание. Н еобх одимо, чтобы материал нах одился в фиксаторе не дольш е, чем это нуж но для его пропиты в ания, так как удлинение фиксац ии усилив аетсж атие и уплотнение объ екта. 1.3. П ракт ич еское задание I Ц елью работы яв ляется ов ладение методикой з абора тканей у ж ив отны х , фиксац ия кусочков материалав раз личны х фиксирую щ их ж идкостях . 1. П риготов ить фиксаторы : ж идкость Буэна, Карнуа, 10 % формалин в объ еме по 50 мл. Каж ды й фиксатор раз литьв 5 бю ксов по 10 мл 2. П од эфирны м наркоз ом произ в ести декапитац ию ж ив отного и из в лечь голов ной моз г. И ссечь кусочки коры моз га издв игательной з оны и коры моз ж ечка, отделитьгипофиз . М атериалпогруз итьв бю ксы с фиксатором Буэна. 3. П осле в скры тия брю ш ной полости ж ив отного в з ять печень, надпочечники и семенники. И зкаж дого органав ы рез атьпо несколько кусочков и поместить их в бю ксы с фиксирую щ ими ж идкостями (Буэна, Карнуа, формалин). Записать в ремя начала фиксац ии. Через 40 минут (соблюд ат ь т оч но) материал изж идкости Карнуа перенести в диоксан. Через30 минут слить раств ор, наполнить бю кс св еж ей порц ией диоксана и остав ить в нем материал ещ е на30 минут. Затем з афиксиров анны е кусочки тканей погруз итьв расплав ленны й парафин (приготов итьз аранее в термостате). Т Е М А 2. П РО М Ы В А НИ Е И О Б Е З В О Ж И В А НИ Е О борудов ание и реактив ы : термостат, стеклянны е бю ксы и стаканчики, пинц еты , стеклянны е или фарфоров ы е сита, марля, нитки, этанол, диоксан. 2.1. П ромы в ание гистологического материала С пособ промы в ания з ав исит от методики фиксац ии. Н апример, после фиксирую щ их смесей , содерж ащ их пикринов ую кислоту, дих лорид ртути, трих лоруксусную кислоту, для их удаления применяю тэтилов ы й спиртраз ной конц ентрац ии. П осле фиксац ии в формалине, в ж идкостях , содерж ащ их х ром, осмиев ую кислоту, обы чно употребляю т в оду. В больш инств е случаев промы в ку кусочков тканей произ в одят в проточной в одопров одной в оде. Н аиболее удобно это делать, помещ ая объ ект в стеклянны е или фарфоров ы е сита, которы е з акры в аю т пробкой с отв ерстиями и опускаю т в сосуд с проточной в одой . П робка обеспечив ает плав учесть, а отв ерстия – постоянную ц иркуляц ию в оды . Е сли кусочек не прош ит ниткой , то этикетку тож е помещ аю т в сито. П ри отсутств ии сита кусочек з ав орачив аю т в марлю и
8 подв еш ив аю т з а нитку в сосуд, наполненны й в одой . В ерх сосуда з акры в аю т марлей и проделы в аю т в ней небольш ое отв ерстие. К в одопров одному крану присоединяю т рез инов ы й ш ланг или прив яз ы в аю т ш нур (полоску бинта), св ободны й конец которого пропускаю тчерезмарлю в сосуд и пускаю тпо нему не сильную струю в оды . П ри небольш ом количеств е материалакаж ды й кусочек промы в аю тв отдельной посуде. С реднее в ремя промы в ания 20 – 24 часа. 2.2. О без в ож ив ание гистологического материала Д ля приготов ления качеств енны х гистологических препаратов необх одимо, начиная с момента обез в ож ив ания, соблю дать прав ила постепенного в оз дей ств ия применяемы х в ещ еств на исследуемы е ткани. П осле промы в ания кусочки подв ергаю т дальней ш ему уплотнению путем обез в ож ив ания в спиртах ув еличив аю щ ей ся конц ентрац ии (50, 60, 70, 80, 96 и 100%). О без в ож ив ание материала произ в одится в стеклянны х бю ксах или стаканчиках с притерты ми кры ш ками. П осуду этикетирую т и з алив аю т спиртами (100 % спирт в дв ух стаканчиках ). Т акой последов ательны й ряд сосудов получил наз в ание гистологической батареи. С пирты необх одимой конц ентрац ии приготав лив аю т з аранее согласно таблиц е раз в едения (см. прилож ение 2). Е сли препарат промы в али в в оде, то обез в ож ив ание начинаю т с 50% спирта, если ж е в спиртах , то объ ектпомещ аю тв спиртпоследую щ ей крепости (из70% в 80% и т. д.). П ри необх одимости обез в ож ив ание начинаю т с 10 – 20% спирта. В ремя пребы в ания кусочков в отдельны х спиртах определяется их в еличиной и св ой ств ами. О бъ екты толщ иной 5 мм достаточно держ ать в спиртах меньш ей конц ентрац ии (до 60%) по 2 – 4 часа, а в более конц ентриров анны х раств орах спирта – от 12 до 24 часов . М елкие и более тонкие объ екты мож но пров одитьчерезгистологическую батарею бы стрее. С ледует помнит ь, что длительное пребы в ание объ екта в спиртах низ кой конц ентрац ии прив одит к мац ерац ии тканей , а з адерж ка в спиртах в ы сокой конц ентрац ии чрез мерно уплотняет их . П ри необх одимости прерв ать проц есс обез в ож ив ания, материал мож но остав ить (на 1-2 суток) в «индифферентном» спирте, крепостькоторого состав ляет70 – 80%. П осле фиксац ии гистологического материала в ж идкости Карнуа в оз мож но исклю чение этапапров одки по спиртам в осх одящ их конц ентрац ий и помещ ение кусочков тканей непосредств енно в диоксан, где происх одит удаление (з амещ ение) остаточной в оды . 2.3. П ракт ич еское задание II Ц ель работы – приготов ление этанола раз личной конц ентрац ии и абсолю тного (100 %) спирта(см. прилож ение 1). О св оение тех ники промы в ки и обез в ож ив ания гистологического материала. П ри необх одимости работа в ы полняется в течение дв ух дней подряд. 1. П риготов ить раств оры для промы в ания и обез в ож ив ания материала. П одготов ить«батарею »спиртов , в том числе 100% этанол.
9 2. О сущ еств итьпромы в ку тканей с ц елью удаления фиксаторов . Кусочки з ав ернуть в марлю , в лож ить этикетки и промы ть проточной в одопров одной в одой . 3. П ров ести обез в ож ив ание тканей в спиртах в оз растаю щ ей конц ентрац ии. 4. П оместить поочередно материал в диоксан I и II (дв а стакана обоз начить– “I” и “II”, в них налитьдиоксан, экспоз иц ия – 30 минутв каж дом). П осле из в лечения кусочков из диоксана II погруз ить их в расплав ленны й парафин. П арафин необх одимо растопить в термостате з аранее при о температуре 56 – 58 С . Д иоксан I и II мож етиспольз ов аться многократно. Т Е М А 3. З А Л И В К А М А Т Е РИ А Л А В П Л О Т НЫ Е С РЕД Ы П РИ Г О Т О В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х К РА С И Т Е Л Е Й О борудов ание и реактив ы : термостат, скальпель, пинц ет, ш патель, бумаж ны е фильтры , спец иальны е дерев янны е блоки, фарфоров ы е круж ки с носиком, спец иальны е формочки, предметны е стекла, стеклянны е емкости для красителей , мерны е ц илиндры , стеклянны е в оронки, парафин, в оск, эфир, этанол, гематоксилин, эоз ин, х лоралгидрат, глиц ерин, й одат натрия (NaJO3), лимонная кислота, калий ны е кв асц ы , ледяная уксусная кислота, тимол, формалин, куриное яй ц о. 3.1. Залив кав парафин Д ля приготов ления в ы сококачеств енны х гистологических препаратов необх одимы рав номерно тонкие срез ы с исследуемого объ екта. Д ля их получения кусочки тканей надо пропитать и з алить такой средой , которая прев ратила бы их в х орош о реж ущ ую ся массу. Н аиболее употребительны ми для этих ц елей материалами яв ляю тся парафин, ц еллоидин и ж елатин. П арафин при комнатной температуре – тв ердое гомогенное в ещ еств о, он плав ится при 54 – 56оС . Д ля эластичности к нему следует прибав ить чисты й пчелины й в оск в количеств е 2 – 5%. Залив кав парафин требуетсоблю дение дв ух основ ны х услов ий : перв ое – материал долж ен бы тьполностью обез в ож ен, в торое – он не долж ен содерж ать спирт. П ерв ое услов ие обеспечив ается в проц ессе обез в ож ив ания и уплотнения в батарее спиртов пов ы ш енной конц ентрац ии. Д ля удаления спиртаи подготов ки к пропиты в анию парафином материал обрабаты в аю т одним израств орителей парафина, обладаю щ им способностью в ы теснять спирт. К таким в ещ еств ам относятся х лороформ, бенз ол, толуол, ксилол, диоксан, сероуглерод и др. Чащ е использ ую т диоксан, х лороформ и бенз ол. Т олуоли ксилолделаю ткусочки ткани более тв ерды ми. В тех случаях , когда по услов иям работы необх одимо сократить в ремя приготов ления парафинов ы х блоков , мож но применять ускоренную з алив ку. П ри этом кусочки ткани толщ иной 1,5 – 2 мм помещ аю т в абсолю тны й (или 96%) спирт, ац етон или диоксан для фиксац ии и обез в ож ив ания на1 – 2 часаи произ в одится однократная сменафиксатора.
10 П осле окончального пропиты в ания объ екта его з алив аю т расплав ленны м парафином (с 5 % пчелиного в оска). П арафин предв арительно подогрев аю т в термостате при 58оС и в расплав ленном в иде налив аю т в приготов ленную формочку, з аполняю т ее до самы х краев , из бегая образ ов ания пуз ы рьков в оз дух а(использ ую тв ы сокую фарфоров ую круж ку с ручкой и носиком). Затем подогрев аю т пинц ет или металлический ш патель, бы стро переносят подготов ленны й к з алив ке объ ект в формочку с парафином и ориентирую т в необх одимом полож ении. П осле этого формочку ох лаж даю тв одой (10 – 18оС ). 3.2. П риготов ление блоков И зз атв ердев ш его парафина скальпелем в ы рез аю т четы рех угольны й блок таким образ ом, чтобы объ ект со в сех сторон бы л окруж ен слоем парафина толщ иной 1 – 3 мм. Н аклей ку блоков произ в одят на дерев янны е кубики. Н а дерев янны й кубик наносятнебольш ой кусочек тв ердого парафина, расплав ляю т его горячим металлическим ш пателем (или скальпелем), пров одят этим ж е ш пателем по ниж ней пов ерх ности парафинов ого блокаи бы стро придав лив аю т его к кубику. 3.3. П ракт ич еское занят ие III Ц ельработы – осв оение тех ники з алив ки ткани в парафин и из готов ления гистологических блоков . 1. Расплав ить в термостате парафин при 56оС с кусочками тканей (см. практическое з адание II). С делатьперед з алив кой этикетиров ку материала. 2. В термостатпостав итьтри баночки с парафином, обоз начитьих 1, 2, 3. В четв ертую банку поместитьз алив очную смесь(парафин + в оск). П ерелож ить исследуемую ткань в баночку 1. П оочередно через 40 минут переносить кусочки тканей в термостате изпарафинаI в парафин II и, далее, в парафин III. П осле в ы полнения этой проц едуры кусочки тканей осторож но в ы нуть из парафинаIII, аккуратно улож итьв формочку и з алитьз алив очной смесью . 3. П риготов ить предметны е и покров ны е стекла к следую щ ему з анятию . П редметны е стекла тщ ательно помы ть в мы льном раств оре, промы ть в проточной в одопров одной в оде и дистиллиров анной в оде, тщ ательно в ы суш ить из алить смесью Н икифоров а (1 часть эфира + 1 часть 96о этанола). Х ранить предметны е стеклав темной стеклянной банке с притертой пробкой . 4. П риготов итькрасители – гематоксилин и эоз ин (см. тему 5) 5. С делатьбелков ы й раств ор для фиксац ии тканей напредметном стекле. П риг от овление раст вора. К белку изсв еж его куриного яй ц а добав ляю т рав ной по объ ему количеств о х имически чистого глиц ерина и х орош о вз балты в аю т (или в з бив аю т). Раств ор фильтрую т черезв лаж ны й складчаты й бумаж ны й фильтр в чисты й флакончик. В о из беж ание гниения белкак фильтру добав ляю т2 – 3 маленьких кусочка(с пш еничное з ерно) тимолаили формалин (1:100).
11 Т Е М А 4. П РИ Г О Т А В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х С РЕ З О В О борудов ание и реактив ы : термостат, микротом, электростолик для суш ки парафинов ы х срез ов , чаш ки П етри, кисточки, препаров альны е иглы . Д ля приготов ления гистологических срез ов определенной толщ ины использ ую тспец иальное мех аническое устрой ств о – микротом. В нимание! С ост ры м ножом микрот ома обращ ат ься с ост орожност ью. 4.1. П риготов ление срез ов изпарафинов ы х блоков Н аклеенны й на дерев янную колодку парафинов ы й блок прочно з акрепляю тв з аж име микротома, располож ив длинной осью параллельно длине микротома. П осле установ ки необх одимого угла рез ания и угла наклона нож а, его прочно з акрепляю тв интов ы ми з аж имами и располагаю тнад блоком. Затем, регулируя в интами мех аниз м подачи, блок устанав лив аю т таким образ ом, чтобы в ерх няя его плоскость нах одилась в гориз онтальном полож ении и не дох одиладо лез в ия нож а0,5 – 1 мм. П осле предв арительной подгонки блока к нож у устанав лив аю т микрометрическую ш калу на получение толсты х срез ов (25 – 30 мкм) и дв иж ением нож ев ы х салаз ок начинаю т подав ать блок в в ерх до получения с него перв ы х полны х срез ов . Затем произ в одят моделиров ание блока: срез аю т скальпелем из бы точны й парафин, остав ляя в округ з алитого объ екта слой не более 2 – 3 мм, и придаю т блоку прямоугольную форму. П осле этого устанав лив аю т микрометрическую ш калу на нуж ную толщ ину срез а (4 – 10 мкм) и приступаю тк окончательной рез ке материала. С ледует помнить, что перемещ ение нож ев ы х салаз ок в доль рельсов ого пути нуж но произ в одитьплав но и безлиш них усилий . Д в иж ение микротомны м нож ом в момент прох ож дения над блоком надо произ в одить бы стро и рав номерно. Г отов ы й срез осторож но снимаю т с нож а в лаж ной кисточкой (в направ лении от спинки к лез в ию ) и переносят на подготов ленное предметное стекло (см. 4.2), расправ ляя его препаров альной иглой ; при необх одимости срез переносят в чаш ку с теплой (35 – 400С ) дистиллиров анной в одой . П риготов ленны е препараты в ы суш ив аю т на электростолике при температуре 30 – 400С . 4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле Н аклеить парафинов ы е срез ы на предметное стекло в расправ ленном полож ении при помощ и белка с глиц ерином. Д ля этого пов ерх ность предметного стекла предв арительно покры в аю т тонким слоем белков ого раств ора, в ы суш ив аю т, з атем наносят1 – 2 капли дистиллиров анной в оды . 4.3. П ракт ич еское задание IV Ц ель работы – научиться тех нике приготов ления гистологических срез ов .
12 1. Н аклеить с помощ ью расплав ленного парафина кусочки тканей , ранее з алиты х в парафин, на дерев янны е блоки (необх одимо пров ести маркиров ку блоков ). 2. Закрепить блоки в держ ателе санного микротома и приготов ить гистологические срез ы толщ иной 5 – 8 мкм. 3. Н аклеить срез ы на предметны е стекла с помощ ью белка с глиц ерином (раств ор долж ен бы ть приготов лен на преды дущ ем з анятии), пров ести маркиров ку стекол. Т Е М А 5. О К РА Ш И В А НИ Е И З А К Л Ю Ч Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х С РЕ З О В О борудов ание и реактив ы : термостат, пинц еты , колбы , стеклянны е стаканы , мерны е ц илиндры , в оронки, «батарея» спиртов , ксилол, толуол, готов ы е красители – гематоксилин и эоз ин (долж ны бы ть приготов лены на з анятии № 3), канадский бальз ам. В основ е окраш ив ания тканев ы х микроструктур леж ат физ икох имические проц ессы . Красители подраз деляю тся на3 группы . 1. О снов ны е – гематоксилин, метилов ы й з елены й и др. Э ти красители применяю тся для окраш ив ания баз офильны х в ещ еств и структур клеток. 2. Кислотны е – эоз ин, кислы й фуксин и др. О ни окраш ив аю т оксифильны е в ещ еств а, например, гранулы эоз инофильны х лей коц итов , ц итоплаз му клеток; 3. Н ей тральны е – судан III и др., использ ую тся для окраш ив ания ней трофильны х компонентов клеток, например, липидов . 5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание К ислы й г емат оксилин Эрлиха. В 100 мл 96 % спирта раств орить 2 г гематоксилина, прибав ить 100 мл дистиллиров анной в оды , з атем 100 мл чистого глиц ерина, 3 гкалий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и 10 мл ледяной уксусной кислоты , в з болтатьи остав итьнасв ету «соз рев ать» в течение 14 дней , периодически в з балты в ая. Д ля того чтобы обеспечить постоянны й доступ в оз дух а (проц есс окисления гематоксилина), следует брать ш ирокогорлы й сосуд и накры в ать в х одное отв ерстие несколькими слоями марли. В проц ессе «соз рев ания» раств ор изсв етло– красного станов ится темно– красны м. В плотно з акры том сосуде красительсох раняетсв ой ств адлительное в ремя. К ислы й г емалаун М айера. В 1 литре дистиллиров анной в оды раств орить 1 г гематоксилина, добав ить 0,2 г й одата натрия (NaJO3), 50 г калий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и, непреры в но помеш ив ая, дож даться их полного раств орения (при этом ж идкость приобретает фиолетов о – синю ю окраску). Затем добав ляю т50 гх лоралгидратаи 1 гкристаллической лимонной кислоты , в рез ультате чего раств ор станов ится фиолетов о – красны м. В х орош о з акры том сосуде изх имически чистого стекла краситель х ранится длительное в ремя.
13 П реимущ еств о данного метода – бы строе окисление гематоксилина й одатом натрия, благодаря чему раств ор не требует«соз рев ания»и сраз у мож ет использ ов аться для окраш ив ания. П ри окраш ив ании гематоксилин – эоз ином фиксац ия мож етбы тьлю бая. П еред окраш ив анием парафинов ы е срез ы подв ергаю т депарафинированию – проц ессу, обратному тому, которы й осущ еств ляю тпри подготов ки объ екта к з алив ке в парафин, то есть срез ы последов ательно пров одят черезраств оритель парафина, спирты нисх одящ ей конц ентрац ии и помещ аю т в в оду. Д анны й проц есс в ы полняю т по следую щ ей непреры в ной сх еме: 1. Ксилол(толуол) – дв е смены по 2 – 4 минуты 2. С пирт96 % - дв е смены по 2 – 3 минуты 3. С пирт70 % - один раз– 2 – 3 минуты 4. В одадистиллиров анная – 1 раз– 2 – 3 минуты и более Т ех никапров едения окраш ив ания. П ри окраске в одны ми красителями срез ы переносятиздистиллиров анной в оды , а при окраски спиртов ы ми – изспирта соотв етств ую щ ей конц ентрац ии, непосредств енно в красящ ий раств ор (прямое окраш ив ание) или сначала в ж идкость для протрав ки (непрямое окраш ив ание). П осле приобретения препаратом необх одимой интенсив ности окраски, его промы в аю т в в оде (или спирте) для удаления из бы ткакрасителя, аз атем, если нуж но, дифференц ирую т в соотв етств ую щ ей ж идкости. И з лиш ний красительотмы в аю тдо тех пор, пока он не перестанетперех одитьизсрез ав отмы в аю щ ую ж идкость. О краш ив ание срез ов , наклеенны х на стекла, мож но пров одить как путем помещ ения их в красящ ий раств ор, так и каплями красителя. П еред нанесением на гистологические срез ы красящ ие раств оры следует отфильтров ать. П родолж ительность окраш ив ания состав ляет 2 – 6 минут. П осле окраш ив ания срез ов гематоксилином из лиш ки красителя отмы в аю т в течение 3 – 5 минут в дистиллиров анной в оде, з атем помещ аю т препараты в в одопров одную в оду на 10 – 15 минут. П осле этого препарат в нов ь помещ аю т на 3 – 5 минут в дистиллиров анную в оду. Д ополнительно окраш ив аю тсрез ы эоз ином в течение 0,2 – 3 минут, после чего препаратпомещ аю тв дистиллиров анную в оду на3 – 5 минут. 5.2. Заклю чение срез ов в смолы 1. О без в ож ив ание срез ов осущ еств ляется погруж ением препаратов в спирты в оз растаю щ ей конц ентрац ии (60, 80, 96, 100%) на3 – 5 минут. 2. П росв етление срез ов пров одят поочередны м погруж ением препаратов на3 – 5 минутв три смены ксилола(или толуола). 3. Заклю чение срез ов . Д ля обез в ож енны х и просв етленны х препаратов наиболее часто применяемой средой з аклю чения яв ляется канадский бальз ам, представ ляю щ ий собой проз рачную древ есную смолу ж елтов атого ц в ета. Бальз ам обладает консерв ирую щ ими св ой ств ами, сох раняет проз рачность препарата и имеет показ атель преломления, близ кий к показ ателям
14 преломления стекла. Д ля з аклю чения срез ов использ ую т канадский или пих тов ы й бальз ам, раств оренны й в ксилоле до консистенц ии ж идкого меда. В ы нув стекло со срез ом изксилола, бы стро в ы тираю т ты льную сторону и, полож ив в гориз онтальном полож ении на стол, наносят несколько капель бальз ама. Затем берут приготов ленное чистое покров ное стекло (чисты м пинц етом или, осторож но, дв умя пальц ами з а боков ы е грани, чтобы не з агряз нить пов ерх ность), став ят его на предметное стекло рядом с препаратором под углом 45о и, как только бальз ам растечется по краю покров ного стекла, осторож но опускаю т, при этом в оз дух постепенно в ы тесняется и бальз ам покры в аетпрепараттонким, рав номерны м слоем. 5.3. П ракт ич еское задание V Ц ель работы – осв оить методику окраски гистологических срез ов и з аклю чения их в бальз ам. 1. П риготов ить «батарею » спиртов для депарафиниров ания гистологических срез ов и з аклю чения их в бальз ам. 2. О тфильтров ать гематоксилинов ы й краситель, приготов ленны й ранее. П роиз в ести депарафиниз ац ию и окраш ив ание гистологических срез ов , приготов ленны х на преды дущ ем з анятии, гематоксилинов ы м красителем с дополнительной окраской раств ором эоз ина. 3. П роиз в ести обез в ож ив ание и просв етление полученны х препаратов и з аклю читьих в бальз ам. Т Е М А 6. А НА Л И З Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х П РЕ П А РА Т О В О борудов ание и реактив ы : микроскопы , готов ы е гистологические препараты , иммерсионное масло. Д анная тема яв ляется итогов ой , определяется качеств о гистологических препаратов . С туденту необх одимо использ ов ать з нания, полученны е на лабораторны х з анятиях по курсу «Г истология». 6.1. П ракт ич еское задание VI Ц ель работы – анализприготов ленны х препаратов , определение в ида ткани, дифференц иров каклеточны х структур. 1. С использ ов анием св етов ого микроскопа идентифиц иров ать клетки на препаратах , окраш енны х гематоксилином – эоз ином (окуляр Х 15, объ ектив Х 20 и Х 40). 2. В ы яв ить ц итоморфологические особенности клеточны х структур – ядро, х роматин, Э П С , аппаратГ ольдж и в клетках раз ны х тканей (объ ектив Х 90, иммерсионное масло). 3. Зарисов атьклетки и их структуры . О формитьпротоколы з анятий .
15 П РИ Л О Ж Е НИ Е 1. С пособприг от овления абсолют ног о спирт а. Д ля получения абсолю тного спирта изнего необх одимо из в лечь в оду. Н асы пать порош ок обез в ож енного медного купороса (примерно 10 гна100 мл спирта) в чистую сух ую стеклянную буты лку с притертой пробкой и з алить960 этанолом. Буты лку периодически в стрях ив ать в течение 1 – 2– х дней . О без в ож енны й спирт отфильтров ать в чистую сух ую посуду с притертой стеклянной пробкой . П РИ Л О Ж Е НИ Е 2. П риг от овление спирт ов различ нойконцент рации. Д ля получения 96% в оды 100 мл спирта спирта 40% 42 58 45% 47 53 50% 52 48 60% 63 37 70% 73 27 80% 83 17 90% 94 6
Н еобх одимы й объ ем, мл 90% в оды 80% в оды спирта спирта 44 50 56 67 78 89 -
56 50 44 33 22 11 -
50 56 63 75 88 -
50 44 37 25 12 -
70% в оды спирта 57 64 71 86 -
43 36 29 14 -
Л И Т Е РАТ У РА 1. Бы ков В .Л . Ц итология и общ ая гистология / В .Л .Бы ков . – С П б.:С О Т И С , 2001.- 520 с. 2. Л абораторны е з анятия по курсу гистологии, ц итологии и эмбриологии / П од ред. Ю .И . Афанасьев а. – М . : В ы сш ая ш кола, 1990. – 398 с. 3. Рябов К.В . Г истология с основ ами эмбриологии / К.В .Рябов . – М инск : Беларусь, 1990.- 238 с.
С остав ительП оляков а– С еменов аН инаД митриев на. Редактор Т их омиров аО .А.
__________________________________________________________________ Заказ№ … .. от… … … 2005 г. Т ираж 50 экз . Л аборатория оператив ной полиграфии В Г У .