Пространственная структура цитоксинов и их взвимодействие с мицеллами и биомембранами

МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

На правах рукописи

ДУБИННЫЙ Максим Анатольевич ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ЦИТОТОКСИНОВ NAJA OXIANA И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МИЦЕЛЛАМИ И БИОМЕМБРАНАМИ

Специальность 03.00.02 — БИОФИЗИКА

Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико–математических наук

Научный руководитель доктор химических наук Арсеньев А.С.

Москва 2006

2

Работа выполнена в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.х.н. проф. А.С. Арсеньеву за проявленную настойчивость, без которой данная работа вряд ли была бы написана. Автор так же благодарен всему коллективу лаборатории структурной биологии за активную помощь и обсуждение различных частей данной работы. В частности, автор благодарен своему первому научному руководителю к.х.н. П.В. Дубовскому за руководство в части работы, связанной с ЭПР спектроскопией, а так же за помощь в проведении экспериментов по измерению трансляционной диффузии, Ю.Е. Пустоваловой за помощь в отнесении сигналов цитотоксина I в водном растворе, А.Г. Коншиной и к.ф-м.н. П.Е. Волынскому за проведение и анализ молекулярной динамики цитотоксинов I и II, Н.П. Сырцеву за проведение молекулярной динамики мицеллы ДФХ, Д.М. Лесовому за ЯМР-эксперименты на ядрах 31 P, И.А. Куделиной и д.б.н. А.В. Феофанову за эксперименты по КД спектроскопии цитотоксинов и Ю.И. Ростовцевой за тщательную вычитку рукописи. Отдельно автор выражает благодарность д.х.н. Ю.Н. Уткину за предоставление образцов цитотоксина I и II из яда кобры Naja oxiana, а так же за синтез, очистку и предоставление для экспериментов их спин-меченых аналогов.

3

Оглавление

Введение

5

Глава 1. Обзор литературы 11 § 1. Семейство трехпетлевых (трехпальцевых) белков из яда змей 11 § 2. Структурные исследования цитотоксинов . . . . . . . . . . 15 Глава 2. Результаты и обсуждение § 1. Исследование структуры ЦТ I методом ЯМР . . . . . . . . 1.1. Приготовление образцов и сбор ЯМР данных . . . 1.2. Отнесение сигналов и расчет структуры . . . . . . 1.3. Поиск прочно связанных молекул воды в ЦТ I . . . § 2. Исследование ионогенных групп ЦТ I и ЦТ II . . . . . . . 2.1. Анализ данных по pH-зависимости химических сдвигов цитотоксинов . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I . § 3. Исследование динамического равновесия в системе цитотоксин/мицелла ДФХ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Модель для анализа химического сдвига в системе белок/мицелла . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Модель для анализа коэффициента трансляционной диффузии белка в комплексе с мицеллой . . . . . . 3.3. Модели для kn и Mn . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ 3.5. Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . § 4. Связывание спин-меченого ЦТ II с модельной липидной мембраной . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23 23 23 25 36 41 41 41 45 45 50 55

63

65 73

4

4.1. 4.2. 4.3.

Материалы и методы . . . . . . . . . . . . . . . . . Модель Гуи-Чапмена . . . . . . . . . . . . . . . . . Связывание СМЦТ II с липидной мембраной. . . .

73 75 77

Заключение

81

Выводы

83

Список иллюстраций

84

Список таблиц

85

Список сокращений

86

Литература

87

5

Введение

Актуальность темы. Яды змей семейства Elapidae – сложная смесь биологически активных полипептидов, которая включает нейротоксины, цитотоксины, фосфолипазы и другие биологически активные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотоксины гомологичны нейротоксинам по аминокислотной последовательности и пространственной структуре, но отличаются широким спектром биологической активности. Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины), вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипидных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липидного бислоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитотоксина III Naja atra, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека K562, клеткам рака кишечника Colo205, а так же CD8+ лимфоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов. Цитотоксины представляют собой β-структурные амфифильные одноцепочечные белки длиной 59–62 аминокислотных остатка и массой 6–7 кДа. В настоящий момент известны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из яда змей рода Naja, из них только для 11 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотоксины имеют высокую степень гомологии по амино-

6

кислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два β-слоя по два и три βтяжа в каждом, а так же три функционально важных «петли» цитотоксина. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфидными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности. В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл, как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы детергентные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка. Несмотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотоксина II из яда Naja oxiana, все остальные структуры получены в водном растворе (методом ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктурного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цитотоксина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мембранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.

7

Цель исследования. Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja oxiana: цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Данная цель подразумевает: 1. Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда Naja oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения. 2. Измерение pKa боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I. 3. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина II. Методы исследования. В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной 1 Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфатидилхолина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амидных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спин-спинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помощи NOESY и ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе CYANA. Константы pKa депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР. Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффи-

8

циента трансляционной диффузии белка методом градиентного спинэха. Для анализа полученных данных разрабатывается оригинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изменения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицеллярного комплекса. Взаимодействие цитотоксина II с модельной липидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина. Кривая связывания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена. Основные задачи исследования. 1. Получить гомоядерные 1 H-ЯМР спектры высокого разрешения, произвести полное отнесение сигналов и рассчитать пространственную структуру цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение; 2. Провести титрование цитотоксинов I и II в диапазоне pH 2.0–7.0 и определить pKa отрицательно заряженных ионогенных групп цитотоксинов и изменения химических сдвигов ∆δ близлежащих атомов для обоих цитотоксинов в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ; 3. Проанализировать связывание цитотоксинов с мицеллой ДФХ по данным об изменении химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов для различного соотношения белок/детергент. Выявить наличие/отсутствие кооперативности связывания молекул цитотоксина, определить количество молекул цитотоксина, способных связаться с мицеллой и оценить константу связывания. 4. Изучить связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной методом ЭПР. Получить кривую связывания, проанализировать в рамках модели Гуи-Чапмена и определить константу связывания и эффективный заряд цитотоксина. Сравнить данные, полученные для взаимодействия с мембраной с данными по взаимодействию с мицеллой ДФХ.

9

Научная новизна и практическая ценность работы. изложенные в настоящей работе, получены впервые.

Все результаты,

1. Получена структура высокого разрешения для цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Обнаружена связанная молекула воды в составе второй петли цитотоксина I в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ происходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитотоксинов впервые. 2. Анализ pH—зависимостей химических сдвигов цитотоксина I показал высокую консервативность свойств заряженных остатков Asp40 и Asp57 и выявил особую роль остатка Asp29 в конформации второй петли молекулы. 3. По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Согласно данной модели цитотоксины связываются с мицеллой ДФХ антикооперативно, что говорит против формирования комплекса из нескольких молекул токсина. Константа связывания первой молекулы с мицеллой согласуется с константой связывания спин-меченого цитотоксина с липидным бислоем. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина. 4. Изучено связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной. Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный интерес и могут быть применены к исследованию других мембраносвязывающихся белков. Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с мицеллой, выявления кооперативности/антикооперативности связывания бел-

10

ков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вытеснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение химических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок/белковых и белок/лигандных комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом. Основные результаты работы опубликованы в реферируемых журналах [1, 2, 3, 4, 5, 6] и тезисах конференций [7, 8, 9, 10]. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав включая литературный обзор, заключения, выводов и списка литературы. Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из двух частей. В первой части проводится обзор семейства «трехпальцевых» («трехпетлевых») белков из ядов змей, обсуждается широкое разнообразие функций белков со сходной структурной организацией. В качестве обобщения сделан вывод о том, что наиболее значимые аминокислотные остатки для каждого из видов токсинов находятся в трех функционально важных петлях молекулы. Во второй части приведен обзор структурных и функциональных исследований цитотоксинов. Отмечается надостаточная изученность структуры цитотоксинов в липидном окружении. Во второй главе изложены основные результаты диссертации. Первый раздел посвящен определению структуры цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Во втором разделе подробно анализируются pH-зависимости химических сдвигов цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, обсуждается структурная и функциональная роль заряженных остатков цитотоксинов. В третьем разделе изложена математическая модель взаимодействия белка с мицеллой детергента и показана ее применимость к взаимодействию цитотоксинов с мицеллой ДФХ. Последний раздел посвящен взаимодействию спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной. Описание использованных экспериментальных методик приведено в начале каждого раздела. Заключение и выводы приведены в конце диссертации.

11

Глава 1. Обзор литературы

§ 1.

Семейство трехпетлевых (трехпальцевых) белков из яда змей

В семейство трехпетлевых (трехпальцевых) белков из ядов змей входят полипептиды длиной 58-74 аминокислотных остатка, с характерной пространственной структурой, похожей на «руку» с тремя «пальцами» (рис. 1). Среди всех ядовитых змей трехпетлевые белки встречаются в ядах змей семейства элапидов, или аспидов (Elapidae), которое включают рода: кобра (Naja), крайт (Bungarus) и мамба (Dendroaspis), а так же в семействе морских змей (Hydrophiidae), но не встречаются в ядах змей семейства гадюк (Viperidae) и гремучих змей (Crotalidae) [11]. Кроме ядов змей структурно гомологичные трехпетлевые домены встречаются в составе других белков, например, субъединицы рецептора плазминогенактиватора уракиназного типа человека состоят из трех доменов, структура каждого из которых представляет трехпетлевой белок (рис. 1(и)). Все трехпетлевые белки содержат от четырех до пяти дисульфидных связей, четыре из которых консервативны и расположены в гидрофобном ядре молекулы (в верхней части каждой молекулы, показанной на рисунке 1). Пятая дисульфидная связь может быть расположена во второй (κ-Бунгаротоксин, рис. 1(в)) или первой (кандоксин, рис. 1(г)) петле молекулы. Вторичная структура представлена исключительно двумя антипараллельными β-слоями. Малый β-слой состоит из двух β-тяжей, остатки между которыми образуют так называемую первую петлю (в дальнейшем «петля I») молекулы. Большой β-слой состоит из трех βтяжей, разделенных второй и третьей петлей, соответственно. Номера петель обозначаются римскими цифрами I, II, III, на рисунке 1 петли расположены в нижней части каждой молекулы, петля I — справа, петля III — слева. Несмотря на большую гомологию по пространственной структуре, трехпетлевые белки сильно различаются по своей функции и спектру биологической активности. Данное семейство белков включает в

12

(а) Эрабутоксин-a

(б) Цитотоксин II

(в) κ-Бунгаротоксин

(г) Кандоксин

(д) Фасцикулин I

(е) Мускариновый т.

(ж) Токсин FS2

(з) Дендроаспин

(и) uPAR

Рис. 1. Структуры семейства трехпетлевых белков. (а) Эрабутоксинa Laticauda semifasciata (1QKD); (б) Цитотоксин II Naja oxiana (1CB9); (в) κ-Бунгаротоксин Bungarus multicinctus (1KBA); (г) Кандоксин B. candidus (1JGK); (д) Фасцикулин I Dendroaspis angusticeps (1FAS); (е) Мускариновый токсин D. angusticeps (1FF4); (ж) Токсин FS2 D. polylepis polylepis (1TFS); (з) Дендроаспин D. jamesoni kaimosae (1DRS); (и) Nконцевой домен рецептора плазминоген-активатора уракиназного типа (uPAR) Homo sapiens (1YWH).

13

себя нейротоксины [12, 13, 14], фасцикулины [15, 16], кальцисептины [17, 18], кардиотоксины (цитотоксины) [19, 20, 21], дендроаспины [22] а так же некоторые малоизученные белки неизвестного функционального назначения. Нейротоксины, наиболее изученная часть семейства трехпетлевых белков, воздействуют на холинергическую передачу нервного импульса в периферийной и центральной нервной системе. Основываясь на их селективности к определенным рецепторам, нейротоксины могут быть классифицированы на курароподобные, или α-нейротоксины (рис. 1(а)), κ-токсины (рис. 1(в)) и мускариновые токсины (рис. 1(е)), которые взаимодействуют с мускульными, нейрональными и различными подтипами мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, соответственно. Курароподобные токсины (α-нейротоксины) связываются с мускульными (α1) nAChR препятствуя связыванию ацетилхолина с рецептором и таким образом делают невозможной передачу нервного импульса [12]. Они в дальнейшем делятся на короткие нейротоксины (60–62 аминокислотных остатка и 4 дисульфидных связи) и длинные нейротоксины (66– 74 аминокислотных остатки и 5 дисульфидных связей). Дополнительная не консервативная дисульфидная связь располагается во второй петле молекулы. Длинные и короткие α-нейротоксины связываются с одним и тем же сайтом на поверхности мускульного nAChR, различие между ними заключается в том, что короткие нейротоксины с высокой эффективностью связываются с нейрональным (α7) nAChR. Для связывания с nAChR и проявления специфичности к (α1)/(α7) субъединицам наиболее существенны остатки второй петли длинных [23,24] и коротких [25,?,26] нейротоксинов, при этом дисульфидная связь на конце третьей петли играет существенную роль для распознавания (α7) рецептора [23]. κ-токсины связываются специфически с нейрональным (α3β4) nAChR. Подобно длинным α-нейротоксинам, они имеют пятую дисульфидную связь во второй петле (рис. 1(в)). В растворе существуют в виде димера [14]. Длинные и короткие нейротоксины имеют слабую афинность к (α3β4) nAChR, аналогично κ-токсины слабо связываются с (α1) nAChR. Мускариновые токсины селективно связываются с определенными подтипами мускариновых ацетилхолиновых рецепторов [27]. Эти токси-

14

ны структурно гомологичны коротким нейротоксинам (рис. 1(е)), однако в отличие от α-нейротоксинов мускариновые токсины могут быть как агонистами, так и антагонистами AChR. Фасцикулины влияют на нервно-мышечную передачу, ингибируя фермент ацетилхолинэстеразу (AChE), которая присутствует в нервномышечном синапсе. Данный вид токсинов вызывает фасцикуляцию (дрожание) мышцы в следствие накопления ацетилхолина в синапсе. Фасцикулины были выделены из яда мамбы (Dendroaspis), они структурно аналогичны коротким нейротоксинам (рис. 1(д)). Фасцикулины связываются с периферическим центром AChE и препятствуют связыванию ацетилхолина с активным сайтом фермента, таким образом блокируя расщепление ацетилхолина [15, 28, 16]. Способность к ингибированию ацетилхолинэстеразы показана так же для некоторых цитотоксинов [29], при этом в отличие от фасцикулинов, стабилизирующих не функциональную форму AChE, цитотоксины стабилизируют функциональную форму AChE. Исследование мутантов фасцикулина показало, что функционально важными для связывания с AChE являются остатки первой и второй петель фасцикулина [30]. Блокаторы кальциевых каналов (кальцисептин [17], токсин FS2 [31]) специфически блокируют кальциевые каналы L-типа [32]. Данные полипептиды структурно гомологичны коротким нейротоксинам, состоят из 60 аминокислотных остатков и стабилизируются четырьмя дисульфидными связями [18] (Токсин FS2, рис. 1(ж)). Они связываются с сайтом связывания 1,4-дигидроксипиридина кальциевого канала L-типа и блокируют кальциевый ток [33]. Показано, что для связывания с кальциевым каналом существенны четыре аминокислотных остатка третьей петли молекулы: Met45-Trp46-cis-Pro46-Tyr47 [34]. Эти четыре остатка имитируют гидрофобные свойства и водородные связи нифидина, производной 1,4-дигидроксипиридина. Дендроаспин, или мамбин, антагонист процессов клеточной адгезии, выделенный из яда Dendroaspis jamesoni, препятствует агрегации тромбоцитов [22]. Данный белок структурно гомологичен коротким нейротоксинам, состоит из 60 аминокислотных остатков и стабилизируется четырьмя дисульфидными связями [35] (рис. 1(з)). Антиадгезивная функция дендроаспина обусловлена наличием Arg-Gly-Asp (а.а. 43–45)

15

фрагмента в аминокислотной последовательности белка в составе его третьей петли (так называемый RGD-мотив). На примере рецептора адгезии αVβ3 интегрина показано, что трипептид Arg-Gly-Asp связывается с интегринным белком на границе между αV и β3 субъединицами [36], вызывает конформационные переход в рецепторе и препятствует нормальному процессу клеточной адгезии. На основе гомологии по аминокислотной последовательности и присутствия RGD фрагмента к этому же классу трехпетлевых белков могут быть отнесены два токсина S5 C1 и S5 C10 [37]. Способность связываться с αVβ3 интегрином и ингибировать клеточную адгезию обнаружена у другого трехпетлевого белка, цитотоксина А5 [38]. Цитотоксин А5 не содержит RGD фрагмента и структурные детали его взаимодействия с интегрином пока не установлены. Цитотоксины, или кардиотоксины, обладают наиболее широким спектром биологической активности во всем семействе трехпетлевых белков. Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях, вызывать деполяризацию и сокращение мышечных клеток, лизис эритроцитов, некоторых типов эпителиальных и раковых клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипидных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липидного бислоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Более подробно структура и функция цитотоксинов будет обсуждаться в следующем разделе. § 2.

Структурные исследования цитотоксинов

На рисунке 2 показаны аминокислотные последовательности цитотоксинов, структура которых была исследована методом ЯМР и/или рентгеноструктурного анализа. Структура некоторых цитотоксинов была определена несколько раз разными методами, что будет указано ниже при рассмотрении структурных исследований каждого цитотоксина. Первые пространственные структуры цитотоксинов были получены

16 10

20

30

40

50

60

LKCHNTQLPFIYKTCPEGKNLCFKATLKKFPLKFPVKRGCADNCPKNSALLKYVCCSTDKCN LKC NKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVATP KVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN LKC NQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAP KVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN LKC KKLVPLFSKTCPAGKNLCYKMFMVAAP HVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDKCN LKC NQLIPPFWKTCPKGKNLCYKMTMRAAP MVPVKRGCIDVCPKSSLLIKYMCCNTDKCN LKC NQLIPPFWKTCPKGKNLCYKMTMRAAP MVPVKRGCIDVCPKSSLLIKYMCCNTNKCN LKC NKLIPIAYKTCPEGKNLCYKMMLASKK MVPVKRGCINVCPKNSALVKYVCCSTDRCN LKC NKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVSNK MVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN LKC NKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVSNL TVPVKRGCIDVCPKNSALVKYVCCNTDRCN RKC NKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVSNL TVPVKRGCIDVCPKNSALVKYVCCNTDRCN LKC NKLIPIASKTCPAGKNLCYKMFMMSDL TIPVKRGCIDVCPKNSLLVKYVCCNTDRCN LKC NKLVPIAYKTCPEGKNLCYKMFMMSDL TIPVKRGCIDVCPKNSLLVKYVCCNTDRCN

S-S b1 петля I

b2

S-S b3

S-S петля II

b4

петля III

N. atra ЦТ V N. atra ЦТ III N. atra ЦТ VI N. oxiana ЦТ II N. nigricollis ЦТ g N. mossambica ЦТ IIb N. mossambica ЦТ V4II N. atra ЦТ A5 N. atra ЦТ II N. atra ЦТ IV N. atra ЦТ I N. oxiana ЦТ I

S-S b5

Рис. 2. Аминокислотные последовательности цитотоксинов, структура которых определена методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. (внизу) Схема вторичной структуры цитотоксинов. Показаны элементы β-структуры, функциональные петли и S–S мостики. в начале 1990-х годов методом рентгеноструктурного анализа для кардиотоксина VII4 из яда Naja mossambica [39] (PDB код 1CDT) и методом ЯМР для кардиотоксина IIb из яда той же кобры [40] (PDB код 2CCX). Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.5  A установлена трехпетлевая структура цитотоксина VII4 , гомологичная структурам постсинаптических нейротоксинов, выделена непрерывная гидрофобная область, охватывающая вторую и третью петлю цитотоксина, установлен необычный характер первой петли, окончание которой содержит фрагмент 310 спирали. Методом ЯМР было произведено полное отнесение сигналов основной цепи цитотоксина IIb, произведено стереоспецифическое отнесение большинства резонансов, измерены константы 3JHN -Hα и 3JHα -Hβ , идентифицированы водородные связи. Полученный в результате набор структур характеризуется СКО по атомам основной цепи элементов β-структуры 0.51  A, общее СКО по всем тяжелым атомам 1.16 A. Охарактеризованы элементы вторичной структуры цитотоксина: малый и большой β-слои, близость N- и C- концевого фрагмента, β-поворот типа II соединяющий двух- и трех-тяжевый β-слои. Показано, что наибольшее различие

17

с рентгеновской структурой кардиотоксина VII4 локализовано в области первой и второй петель токсина. Структура цитотоксина γ из яда Naja nigricollis получена методом ЯМР [41] (PDB коды 1CXO, 1CXN). По сравнению со структурой IIb N. mossambica в данном цитотоксине наблюдались дополнительные NOE контакты между остатками первой (Leu6) и второй (Val34, Lys35) петель, что говорит о б´ольшей сближенности петель в токсине γ. После анализа структуры боковых цепей молекулы была высказана гипотеза о наличии в цитотоксине сайта связывания фосфолипида, который образован боковыми цепями трех остатков лизина Lys12, Lys18 и Lys35. Структура этого же цитотоксина была получена годом позже методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1.5  A [42] (1TGX). Три молекулы цитотоксина в кристаллической ячейке представляют из себя тример, который был предложен авторами как модель поры, образуемой токсином на поверхности мембраны. Сходство ЯМР и трех рентгеновских структур наблюдалось везде за исключением конформации петель I и II, плохо определенных методом ЯМР и слабо структурированных в рентгеновских структурах. В центре второй петли обнаружена молекула воды, которая удерживается тремя водородными связями с атомами HN Met26, CO Ala29 и CO Val32. Последнее исследование цитотоксина γ N. nigricollis было проведено методом ЯМР в присутствии мицелл ДФХ [43]. Было произведено отнесение сигналов и анализ вторичной структуры белка, но расчет пространственной структуры выполнен не был. По изменению химических сдвигов белка в водном растворе и в комплексе с мицеллой сделан вывод о том, что с мицеллой взаимодействуют три петли цитотоксина, которые образуют непрерывную гидрофобную область на его поверхности. Структура цитотоксина I из яда Naja atra была определена в водном растворе методом ЯМР спектроскопии [44] (2CDX). Набор структур характеризуется СКО 0.53  A по тяжелым атомам основной цепи и 1.69  A по всем тяжелым атомам. Данный цитотоксин отличается всего тремя аминокислотными заменами от цитотоксина I Naja oxiana, структура которого исследуется во второй главе настоящей работы. Цитотоксин II из яда Naja atra был исследован методом ЯМР [45] (1CRF, 1CRE), полученная структура характеризуется СКО 0.44  A по ато-

18

мам основной цепи элементов вторичной структуры и 1.37  A по всем тяжелым атомам. Отмечена б´ольшая длинна сегмента второй петли (остатки 26–34 вместо 25–34 в других токсинах), так же авторы подтверждают возможность образования сайта связывания фосфолипида боковыми цепями остатков лизинов 12, 18 и 35. Отмечен меньший угол закручивания β-слоев по сравнению с кристаллической структурой цитотоксина VII4 Naja mossambica. В работе [46] показано, что цитотоксин II N. atra связывает нуклеотидтри- и монофосфаты с константой связывания от 14 мкм (гуанидинтрифосфат) до 87 мкм (аденозинмонофосфат). Методами ЯМР и молекулярной динамики установлен сайт связывания нуклеотидтрифосфатов: остатки Leu1, Lys2, Asn4, Lys23, Thr56, Arg58 и Asn60. Данный сайт отличен от предложенного ранее сайта связывания фосфолипидов и находится на противоположной поверхности молекулы. В последствии динамика данного цитотоксина II N. atra была исследована методом 13 C ЯМР-релаксации Cα атомов с использованием естественного содержания магнитного изотопа углерода [47]. Показано, что значения параметра порядка S 2 для петель цитотоксина (0.78, 0.77 и 0.79 для петель I, II и III, соответственно) достоверно меньше, чем для остатков в составе β-слоев (в среднем 0.84), что говорит о повышенной подвижности петель цитотоксина. Данное обстоятельство может играть роль при связывании цитотоксина с гипотетическим рецептором на поверхности мембраны эритроцитов или с плазматической мембраной клетки. Вполне вероятно, что подвижность остатков окончаний трех петель облегчает формирование комплекса, понижает энергетический барьер и увеличивает связывания токсина. Данные по ЯМР релаксации были независимо сопоставлены с подвижностью молекулы, наблюдаемой методом молекулярного моделирования, и обнаружено качественное, а для некоторых остатков и количественное согласие значений параметров порядка S 2 [48]. Представляет интерес сравнение структуры данного цитотоксина со структурой цитотоксина IV Naja atra [49] (1KBT, 1KBS), который отличается только N-концевым остатком аргинина (вместо лейцина в цитотоксине II). Данная замена приводит к вдвое большей гемолитической активности цитотоксина, основные структурные различия токсинов лока-

19

лизованы в области пространственно сближенных N – и C–концов. Так, в цитотоксине IV существенно замедлен обмен HN протонов на N – и C– концах, наблюдается солевой мостик между гуанидиновой группой Arg1 и карбоксильной группой Asp57, в целом стабильность цитотоксина IV выше, чем у цитотоксина II. Структура цитотоксин V из яда Naja atra получена методом ЯМР A. Сравни[50] (1CHV) со значением СКО по атомам основной цепи 0.68  вая полученную структуру со структурами других цитотоксинов из яда Naja atra (цитотоксины I, II, III и IV), авторы выделили «пальцеобразную проекцию» второй и третьей петель токсинов, которая предположительно коррелирует с высокой цитотоксичностью. Отсутствие водородной связи Val27–Leu48 приводит к появлению «зазора» между петлями II и III и б´ольшей экспонированности боковой цепи Met26 в растворитель на «выпуклой» стороне цитотоксина, что предположительно обеспечивает б´ольшую токсичность цитотоксина V. Цитотоксин A5 из яда Naja atra (так же известен как кардиотоксин-подобный осн´овный белок) единственный из цитотоксинов с известной пространственной структурой содержит 62 аминокислотных остатка. Цитотоксин A5 изучен методом ЯМР при pH 3.7 [51] (1CVO) и методом рентгеноструктурного анализа при pH 8.7 [52] (1KXI). Данный цитотоксин обладает существенно меньшей мембранолитической активностью, но способен вызывать слияние фосфолипидных везикул. По данным [51] у данного цитотоксина сильно отличается расположение βповорота Lys19–Pro16. Уникальный для Цитотоксина A5 остаток Asp42 образует солевой мостик с Lys19. Группа остатков Glu17, Lys19 и Asp42 предположительно определяет специфичность к цвиттерионным липидам по сравнению c заряженными для данного цитотоксина. Структура петли II цитотоксина A5 так же существенно отличается от структур других цитотоксинов, в частности, вторая петля содержит дополнительный остаток Lys33. Цитотоксины, гомологичные цитотоксину A5 по аминокислотной последовательности второй петли (остатки 30–34), способны вызывать слияние сфингомиелиновых везикул. Дополнительный остаток His4 препятствует образованию структуры водородных связей, стабилизирующих первый β-слой цитотоксинов, что, вероятно, приводит к уменьшению мембранолитической активности.

20

В работе [53] показано, что протонирование остатка His4 (pKa = 6.0) при низких pH приводит к ослаблению связывания цитотоксина с мембраной, полностью инактивирует способность цитотоксина вызывать агрегацию/ слияние фосфолипидных везикул и вызывает значительные изменения химических сдвигов протонов первой петли (остатки Cys3–Thr14), Cконца (Lys60–Asn62) и трехтяжевого β-слоя (остатки Cys22, Lys24, Ala25, Arg38 и Ala41). Данная инактивация предположительно обеспечивает инертность молекулы цитотоксина внутри ядовитой железы и ее активацию в физиологических условиях. Методом рентгеноструктурного анализа получена структура цитотоксина A5 при pH 8.7 с разрешением 2.13  A [52]. Кристаллическая ячейка содержит димер цитотоксина, в котором две молекулы связаны 9 водородными связями, замыкая два трехтяжевых β–слоя в один шеститяжевый. Локальные конформационные изменения по сравнению со структурой при pH 3.7 обнаружены в функционально важных петлях I и II. Изменения в петле I вызваны протонированием и переориентацией ароматического кольца His4, что объясняет значительное изменение химических сдвигов влиянием π-кольцевого тока. Структура II петли в рентгеновской структуре стабилизирована одной и двумя молекулами воды (для первой и второй молекулы в составе димера), что придает ей Ω–образную форму и обеспечивает формирование непрерывной гидрофобной поверхности размером 34  A, охватывающей все три петли цитотоксина. Методами молекулярной динамики и Монте-Карло показано [54], что наиболее стабильной для данного цитотоксина является Ω–образная форма второй петли и предложена модель связывания цитотоксина A5 с мембраной, в которой петли I и II погружаются в липидное окружение. В работе [38] обнаружено, что цитотоксин A5 способен связываться с αVβ3 интегрином и ингибировать восстановление костей. При этом цитотоксин A5 не содержит RGD (ArgGly-Asp) последовательности, которая до сих пор присутствовала во всех интегрин-связывающих белках. В цитотоксине II из яда Naja oxiana впервые методом ЯМР была обнаружена молекула прочно связанной воды в составе второй петли цитотоксина [55]. Молекула связанной воды стабилизировала водородными связями с атомами HN Met26, CO Ala29 и CO Val32. Получена структура основной (1CB9) и минорной (1CCQ) формы цитотоксина, на-

21

личие минорной формы связано и изомеризацией пептидной связи val7– Pro8. Так же для этого цитотоксина впервые рассчитана пространственная структура в комплексе с мицеллой ДФХ [56] и показано, что связанная молекула воды сохраняется в составе второй петли после встраивания токсина в мицеллу. Установлено, что цитотоксин взаимодействует с мицеллой всеми тремя петлями. Структура цитотоксина III из яда Naja atra, в настоящий момент самого изученного в структурном плане цитотоксина, была впервые определена методом ЯМР [57] (2CRS, 2CRT). СКО по атомам основной цепи элементов вторичной структуры составило 0.55  A, по всем тяжелым атомам 1.52  A. Как и во всех структурах цитотоксинов, первая и вторая петли являются наиболее неопределенными элементами структуры цитотоксина III. Наблюдались контакты между первой и второй петлями цитотоксина, однако для второй петли было обнаружено всего несколько кросс-пиков ЯЭО, чего было явно недостаточно для определения структуры. Структура данного белка была рассчитана повторно методом ЯМР [58] (1I02) с учетом прочно связанной молекулы воды во второй петле цитотоксина. Методом 17 O–ЯМР было определено время жизни связанной воды: от 5 нс до 15 мкс. Показано, что структура второй петли высоко гомологична в 5 цитотоксинах P-типа (содержащих остаток Pro30), у всех цитотоксинов P-типа вторая петля содержит молекулу связанной воды, стабилизированную водородными связями с атомами HN Met26, CO Ala/Thr29 и CO Val32. Структура цитотоксина III N. atra так же была изучена методом рентгеноструктурного анализа [59, 60]. В работе [59] получена структура цитотоксина вместе с анионным детергентом додецилсульфатом натрия (PDB код 1H0J), который распределен неравномерно по кристаллической решетке имитируя анионную мицеллу детергента. Два димера цитотоксина в кристаллической решетке могут быть сгруппированы в олигомерную структуру, напоминающую пору в липидной мембране, что позволяет предположить образование аналогичной поры при связывании цитотоксина с мембраной. Другая структура цитотоксина III N. atra получена методом рентгеноструктурного анализа в комплексе с шестичленным сахаром гепаринсульфатом и анионами цитрата, присутствующими в природном яде

22

кобры [60] (PDB код 1XT3). Две молекулы цитотоксина образуют комплекс с молекулами аниона цитрата, взаимодействуя с ним положительными зарядами боковых цепей остатков Lys23 и Lys31, расположенных во второй петле цитотоксина. Взаимодействие с сахаром гепаринсульфатом так же происходит посредством положительных боковых цепей лизинов: консервативные для цитотоксинов остатки Lys2, Lys5, Lys18, Lys35 и Lys44 образуют связи с карбоксильными и сульфоксидными группами сахаров гепаринсульфата. Предложен механизм удержания цитотоксина на поверхности клеточной мембраны при помощи гепаринсульфата и ионов цитрата. Предложена классификация цитотоксинов на две группы по признаку наличия во второй петле остатков Lys31 или Met31/Thr31 (рис. 2). Структура цитотоксина VI из яда N. atra получена методом рентгеноструктурного анализа [61] (1UG4) и характеризуется существенно измененной конформацией петли I. На основе полученной структуры пересмотрена классификация цитотоксинов на тип I и тип II. Данная классификация основана на спектра кругового дихроизма (КД) цитотоксинов: в спектрах КД цитотоксинов группы I присутствует более интенсивный положительный сигнал на длине волны 192,5 нм и отсутствует положительный сигнал на длине волны 225 нм; в цитотоксинах группы II присутствует интенсивный положительный сигнал на длине волны 220 нм. В работе [61] продемонстрировано, что структура первой петли цитотоксинов типа I содержит разворот типа VIа и цис-пептидную связь между двумя остатками пролина в фрагменте PPxY.

23

Глава 2. Результаты и обсуждение

§ 1.

Исследование структуры ЦТ I методом ЯМР

1.1.

Приготовление образцов и сбор ЯМР данных

Цитотоксин I был выделен из яда кобры Naja oxiana согласно методике [62]. В экспериментах использовали дейтерированный ДФХ-д38 от Cambridge Isotope Laboratories (США), тяжелую воду 2 H2 O (99.9% 2 H) от Isotope (Россия), и Stohler Isotope Chemicals (США), 100.0% 2 H. В работе использовались липидные спиновые метки 5-доксилстеариновая кислота (5-ДС) и 16-доксилстеариновая кислота (16-ДС) от Sigma. Образец для определения структуры ЦТ I в водном растворе содержал 20 мг ЦТ I в 600 мл H2 O/2 H2 O (9:1) при pH 6.0. Образец ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ содержал 10 мг ЦТ I и 35 мг ДФХ-д38 (1:60 моль/моль) в 600 мл H2 O/2 H2 O (9:1) при pH 6.0. Для измерения pKa ионогенных групп цитотоксина pH раствора меняли титрованием HCl (NaOH), все значения pH приведены по показаниям pH-метра. Для измерения скоростей дейтерообмена HN -протонов образец ЦТ I (ЦТ I/ДФХ) был лиофилизован и растворен в 99.9% 2 H2 O, после чего серия одномерных и двумерных ЯМР спектров снималась в течение двух суток при температуре 10 ◦ C и 30 ◦ C для ЦТ I и ЦТ I/ ДФХ, соответственно. После обмена большинства HN -протонов образец цитотоксина был дважды лиофилизован и растворен в 100% 2 H2 O. Для выявления областей ЦТ I, погруженных в мицеллу ДФХ, были приготовлены образцы, содержащие ЦТ I:ДФХ:5-ДС в соотношении 2:120:1 (моль/моль), ЦТ I:ДФХ:16-ДС в соотношении 2:120:1 и 1:60:1 (моль/моль) в растворе H2 O/2 H2 O (9:1), pH 6.0, концентрация ЦТ I 5 мг в объеме 600 мл. Все спектры ЯМР (TOCSY, DQF-COSY, NOESY, ROESY [63]) снимались на спектрометре DRX-500 (Bruker), оборудованном градиентным датчиком TXI 1 H-13 C/15 N-D Z-GRD. Спектры TOCSY снимались

24

с использованием импульсной последовательности MLEV-17 [64] с компенсацией релаксационных эффектов по методике «clean TOCSY» [65]. Спектры NOESY в 2 H2 O для времени смешивания 6 60 были сняты с подавлением нуль-квантовых эффектов, искажающих структуру кросспиков, по методике [66]. Все спектры для расчета структуры были сняты при pH 6.0. В спектрах, снятых в H2 O, подавление сигнала растворителя производили при помощи биномиальной импульсной последовательности 3-9-19 с применением градиентов [67, 68], в спектрах в 2 H2 O растворитель подавляли преднасыщением. Для проведения отнесения сигналов и расчета структуры ЦТ I в водном окружении были сняты следующие двумерные спектры: TOCSY 80 мс (H2 O, 2 H2 O, 30 ◦ C); DQF-COSY (H2 O, 2 H2 O, 30 ◦ C); NOESY 50, 100, 150, 200 мс (H2 O, 2 H2 O, 30 ◦ C); серия спектров для детекции связанных молекул воды — NOESY 75 мс + ROESY 75 мс (H2 O, 10, 30, 50 ◦ C); серия спектров для измерения дейтерообмена HN протонов — TOCSY 80 мс (2 H2 O, 10 ◦ C); серия спектров для определения pH-зависимостей химических сдвигов с шагом 0.5–0.3 единицы pH в диапазоне pH 2.0–6.0 — NOESY 100 мс (H2 O, 30 ◦ C). Для проведения отнесения сигналов и расчета структуры ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ-д38 были сняты следующие спектры: TOCSY 60, 80 мс (H2 O, 2 H2 O, 50 ◦ C); DQF-COSY (H2 O, 2 H2 O, 50 ◦ C); NOESY 30, 60, 90 мс (H2 O, 2 H2 O, 50 ◦ C); серия спектров NOESY 90 мс (H2 O) при температурах 30–50 ◦ C с шагом 5 ◦ C для верификации отнесения HN -X кросс-пиков в NOESY спектре ЦТ I/ДФХ-д38 ; серия спектров для детекции связанных молекул воды — NOESY 75 мс + ROESY 20 мс (H2 O, 30, 40, 50 ◦ C); серия спектров для определения скоростей дейтерообмена HN -протонов — NOESY 80 мс (2 H2 O, 30 ◦ C); серия спектров NOESY 90 мс (H2 O, 50 ◦ C) для определения pH-зависимостей химических сдвигов с шагом 0.5–0.3 единицы pH в диапазоне pH 2.0– 6.0; спектры для определения областей ЦТ I, погруженных в мицеллу ДФХ — TOCSY 80 мс (50 ◦ C) для образцов ЦТ I:ДФХ-д38 :5-ДС = 2:120: 1, ЦТ I:ДФХ-д38 :16-ДС = 2:120:1 и 1:60:1 (моль/моль). Двумерные спектры снимали с разрешением 4096×512 точек, кроме спектров DQF-COSY, которые были сняты с разрешением 4096 × 1536 точек. Преобразование спектров проводили в программе XWINNMR, по-

25

ставляемой вместе со спектрометром (Bruker). В процессе преобразования проводили цифровое подавление растворителя, взвешивание спада свободной индукции функцией Лоренца-Гаусса для улучшения разрешения спектра, линейное предсказание по непрямому направлению до 1024 точек, заполнение нулями по непрямому направлению до 2048 точек, после чего спектры с разрешением 4096 × 2048 точек конвертировали в формат программы XEASY [69] или NMRPipe [70]. Для определения констант спин-спинового взаимодействия 3JHα -Hβ спектры DQF-COSY (ЦТ I, ЦТ I/ДФХ) в 2 H2 O в формате NMRPipe [70] анализировали при помощи программы ACME [71]. Калибровку интенсивности сигналов проводили на основе кросс-пиков между Hδ -Hε протонами остатков Tyr и Phe 3JHδ -Hε = 8.0 Гц. Константы 3JHN -Hα измеряли по форме линии интенсивных HN –X кросс-пиков в NOESY-спектре ЦТ I, преобразованном с использованием Лоренцевой взвешивающей функции. Значение констант определяли нелинейной регрессией формы линии при помощи программы в среде Mathematica версии 4.1. 1.2.

Отнесение сигналов и расчет структуры

В процессе отнесения сигналов цитотоксина в водном растворе были обнаружены два набора спиновых систем для аминокислотных остатков 4–13 (первая петля цитотоксина) и остатка Gly37 (рис. 3(а)). Две формы белка представлены в растворе в соотношении 5:1. Аналогичное явление ранее наблюдалось для ЦТ II N. oxiana в водном растворе. Конформационная гетерогенность обусловлена изомеризацией пептидной связи Val7–Pro8: для основной формы белка данная пептидная связь имеет транс-, а для минорной — цис- конформацию (рис. 4(а)). Из предыдущих исследований ЦТ II известно, что минорная форма цитотоксина не взаимодействует с мицеллой ДФХ, аналогично не взаимодействует с мицеллой ДФХ и минорная форма ЦТ I. Расчет структуры производился только с использованием сигналов основной формы цитотоксина. Последовательное отнесение сигналов, идентификацию спиновых систем и выявление элементов вторичной структуры проводили по методике [73,74] с использованием программы XEASY [69]. Данные последо-

26

м.д.

(а)

6 37

37

9

4.00

7 9

37

10

37

5 6 7 5 13 12 13

10

12 4 4

5.00

11

11

10.00

м.д.

9.00

8.00

HN Met26

7.00

HN Met26

(б)

м.д.

HN Met26

(в)

(г)

4.50 Ha Phe25

5.00

Ha Met26

9.4

9.2

9.0

9.4

9.2

9.0

9.4

9.2

м.д.

Рис. 3. Спектры ЯМР ЦТ I в водном растворе. (а) Область HN –Hα сигналов в TOCSY спектре ЦТ I в H2 O, pH 6.0. Указаны номера остатков, дающих два набора кросс-пиков вследствие изомеризации пептидной связи Val7-Pro8 (остатки 4–13 и 37). Жирным шрифтом выделены сигналы основной формы белка (транс- конфигурация пептидной связи), курсивом — сигналы минорной формы белка (цис- конфигурация пептидной связи). (б)–(г) Фрагменты спектров ROESY-75 мс ЦТ I: (б) 10 ◦ C, (в) 30 ◦ C, (г) 50 ◦ C. Овалом отмечен отрицательный кросс-пик между сигналами HN Met26 и H2 O.

27 5

Dd(осн., мин.)

м.д.

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(а) Dd(HN )

1.0

Dd(H a )

|Dd(HN ) |+|Dd(Ha ) |

0.5

0.0

м.д.

Dd(осн., ДФХ)

10

(б)

0.5

0.0

- 0.5

(в)

5-ДС : ДФХ = 120:1

16-ДС : ДФХ = 120:1 16-ДС : ДФХ = 60:1

Аттеньюация

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 LK CNKLVPIAYKTCPEGKNLCYKMFMMSDLTIPVKRGCIDVCPKNSLLVKYVCCNTDRCN

Рис. 4. Разница химических сдвигов и аттеньюация сигналов ЦТ I. (а) Разница химических сдвигов сигналов протонов основной и минорной формы ЦТ I в водном растворе (30 ◦ C, pH 6.0). Конформационная гетерогенность является следствием цис-транс изомеризации пептидной связи Val7–Pro8, соответствующие остатки выделены на рисунке штриховкой. (б) Изменение химических сдвигов основной формы ЦТ I при переходе из водного раствора в мицеллу ДФХ (30 ◦ C, pH 6.0). Данные для остатков Ser28 и Asp29 не приведены по причине сильного уширения HN сигналов в случае комплекса ЦТ I с мицеллой ДФХ. (в) Аттеньюация HN –Hα сигналов в TOCSY спектре цитотоксина доксилстеариновыми спиновыми метками.

28

вательного отнесения приведены в таблице 3 для основной формы цитотоксина в водном растворе и в таблице 4 для цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ. Анализ разницы химических сдвигов основной формы цитотоксина (таблица 3 на стр. 33) и комплекса ЦТ I/ДФХ (таблица 4 на стр. 35) выявляет наибольшие различия в области трех функциональных петель цитотоксина (рис. 4(б)), что позволяет предположить, что цитотоксин погружается в мицеллу окончаниями всех трех петель. Этот вывод подтверждается данными по уширению сигналов цитотоксина встроенными в мицеллу липидными спиновыми метками: как видно из рисунка 4(в), при встраивании 5-ДС/16-ДС в мицеллу наиболее сильно подавляются сигналы окончаний трех петель цитотоксина. При расчете структуры цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ возникла дополнительная трудность, связанная с сильным ослаблением сигналов в области окончания второй петли цитотоксина, поэтому однозначного отнесения сигналов основной цепи остатков Ser28 и Asp29 получить не удалось. Такое ослабление сигналов по-видимому объясняется наличием конформационного перехода, скорость которого удовлетворяет условию «промежуточного обмена» в шкале времени ЯМР, при котором скорость обмена между двумя конформациями молекулы близка к разнице резонансных частот протонов. Для корректного определения конформации второй петли цитотоксина сигналы NOESY спектра второй петли (аминокислотные остатки с Met26 по Ile32) калибровались отдельно от остальных NOE кросс-пиков. Такой подход позволил извлечь достаточно информации из ЯМР спектра для определения конформации второй петли молекулы. Ближние и дальние ограничения на расстояния, полученные из NOESY спектров, ограничения на торсионные углы из констант спинспинового взаимодействия, ограничения на водородные связи, определенные по скоростям 2 H-обмена (рис. 5(а)) и выявленным элементам вторичной структуры вместе с данными по стереоспецифическому отнесению сигналов протонов использовались для расчета структуры цитотоксина в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, таблица 1. Полученные в результате расчета структуры цитотоксина I в водном раствор и в комплексе с мицеллой ДФХ обладают низким значением СКО, низким значением штрафной функции CYANA и практически

29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(а) 2 H2 O-обмен (б) dNN (i, i + 1)

(в) dαN (i, i + 1)

(г) dβN (i, i + 1) LKCNKLVPIAYKTCPEGKNLCYKMFMMSDLTIPVKRGCIDVCPKNSLLVKYVCCNTDRCN

Рис. 5. Данные по дейтерообмену и последовательным NOE-контактам ЦТ I (основная форма). (а) Скорость дейтерообмена HN протонов ЦТ I в водном окружении (верхний ряд, 10 ◦ C) и в комплексе с мицеллой ДФХ (нижний ряд, 30 ◦ C). Светлые окружности соответствуют HN -протонам, сигналы которых отсутствовали в первом спектре, снятом через 20 минут после растворения образца в 2 H2 O, черные окружности соответствуют амидным протонам, сигналы которых наблюдались через 24 часа после растворения, полузакрашенные окружности соответствуют промежуточной ситуации. (б),(в),(г) Карта последовательных d-связей ЦТ I (верхний ряд для каждого типа контактов) и комплекса ЦТ I/ДФХ (нижний ряд). Для ЦТ I в водном окружении (основная форма) использовался спектр NOESY-50 мс (30 ◦ C), для ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ спектр NOESY-30 мс (50 ◦ C). Эллипсами обозначены перекрытые в NOESY-спектре кросс-пики. Для остатков Pro роль HN -протонов играют Hδ -протоны пролина.

30

Таблица 1. Входные данные для расчета структуры ЦТ I в растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ Входные данные КССВ 3 JHN -Hα 3 JHα -Hβ 1 Угловые ограничения: 2 Основная цепь Боковые цепи Водородные связи: Основная цепь Боковые цепи Связанная вода SS-связи: Верхние NOE-ограничения: Внутренние Последовательные Ближние 1 < |i − j| 6 5 Дальние |i − j| > 5 Стереоспецифическое отнесение: Метиленовые Hα протоны Метиленовые Hβ протоны Метиленовые Hγ протоны Метиленовые Hδ протоны Метильные Hγ группы Метильные Hδ группы Амидные протоны боковых цепей 1

2

ЦТ I 107 47 60 270 141 129 34 25 5 4 4 517 173 151 36 157 59 2 39 8 2 1 2 5

ЦТ I/ДФХ 121 45 76 260 143 117 24 18 6 0 4 523 151 171 42 159 53 2 34 4 3 3 3 4

Для отсутствующих в DQF-COSY 2 H2 O Hα /Hβ кросс-пиков были дополнительно введены константы 3JHα -Hβ = 3.0 ± 1.5 Hz. На некоторые торсионные углы наложено несколько ограничений.

31

Таблица 2. Характеристика 20 лучших структур ЦТ I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ Характеристика ЦТ I Целевая функция программы CYANA: 1.19 ± 0.10 Максимальное нарушение ограничений: 1 Верхние ( A) 0.18 Нижние ( A) 0.09 CYANA ван дер Ваальс ( A) 0.14 Угловые (◦ ) 1.8 СКО по всей структуре ( A): Атомы основной цепи 0.31 Все тяжелые атомы 0.87 2  СКО по элементам вторичной структуры (A): Атомы основной цепи 0.20 Все тяжелые атомы 0.86 Конформации пролиновых колец: Pro8 Up Pro15 Down Pro33 Down Pro43 Up Конформации SS-связей: 3 Cys3 – Cys21 M Cys14 – Cys38 M Cys42 – Cys53 P Cys54 – Cys59 P 1

2 3

ЦТ I/ДФХ 0.78 ± 0.04 0.20 0.00 0.18 2.0 0.31 0.94 0.18 0.93 Up Down Down Up M M P P

Среднее по набору структур нарушение для наиболее сильно нарушающегося ограничения. Остатки 2–4, 11–13, 20–26, 35–39 и 49–54. Определяется величиной двугранного угла χ3 : Cβ –Sγ –Sγ –Cβ дисульфидного мостика. В конформации М χ3 < 0, в конформации P χ3 > 0.

32

(а) Структура ЦТ I в водном растворе

(б) Структура ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ Рис. 6. Стереоизображение пространственной структуры ЦТ I (20 структур) в водном растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (б). Основная цепь показана синим цветом, HN атомы основной цепи — красным, CO атомы — желтым, боковые цепи — розовым, водородные связи — зеленым, прочно связанная молекула воды на рис. (а) — серым цветом. Римскими цифрами I, II и III обозначены номера петель цитотоксина.

33 Таблица 3: Таблица химических сдвигов основной формы ЦТ I в водном окружении Остаток Leu1

HN

Hα 4.18

Hβ 1.57

Hγ 1.51

Lys2

8.59

5.39

1.32, 1.17

1.12

Cys3 Asn4 Lys5

8.82 9.70 7.92

5.15 4.95 4.25

2.49, 2.84 2.30, 2.71 1.55, 2.09

1.38

Leu6

8.17

3.67

1.65, 1.79

1.55

Val7

7.55

4.47

2.12

Pro8 Ile9

7.06

4.54 4.19

2.25, 1.86 2.07

Ala10 Tyr11

7.87 7.84

4.62 5.32

1.38 2.70, 2.84

Lys12

9.03

4.77

1.73, 1.43

1.28, 1.41

Thr13 Cys14 Pro15 Glu16 Gly17 Lys18

8.73 9.14

4.07 2.84, 3.53 2.41, 1.97 1.96, 2.31

1.27

8.57 8.89 7.61

4.67 4.99 4.62 4.03 3.68, 4.30 4.30

Asn19 Leu20

7.93 8.22

Cys21 Tyr22

δ1 δ2 δ 

Другие 0.77 0.85 1.20 2.82

δ δ  δ1 δ2

7.57, 6.64 1.25 2.89 0.70 0.88

δ δ

3.83, 3.98 1.33

δ  δ 

6.73 6.79 1.71 3.01

1.93, 2.18 2.01

δ

3.45, 4.00

1.94

1.10

4.95 4.86

3.02, 2.66 1.68, 1.39

1.52

δ  ζ δ δ1 δ2

1.36, 1.41 2.96 7.70 7.49, 7.02 0.75 0.89

9.02 8.97

6.11 6.09

2.97, 3.04 3.12, 2.98

Lys23

9.06

4.86

1.50, 1.66

1.42

δ  δ  ζ

6.61 6.84 1.76 3.07 7.86

Met24 Phe25

8.30 9.51

5.15 4.86

1.79, 1.69 2.49, 3.40

1.55, 1.32

Met26 Met27 Ser28 Asp29 Leu30

9.30 8.37 7.66 7.94 8.79

5.11 4.16 4.21 4.67 4.04

2.03, 2.35 1.92, 2.03 3.81, 4.07 2.71, 2.90 1.48, 1.32

2.87, 2.63 2.12, 2.64

δ  ζ  

7.08 6.94 7.19 1.86 2.08

δ1 δ2

0.83 0.68

Thr31 Ile32

8.69 7.12

4.42 4.87

4.32 1.88

δ

1.63

4.05

1.22, 1.50

δ

3.95, 3.86

Pro33

γ1 γ2 γ1 γ2

0.97 1.00 1.92, 1.99 1.09, 1.00 0.91

1.63

γ1 γ2

1.20 1.17, 1.21 0.90 1.91, 1.66

34 Таблица 3: (Продолжение) Остаток Val34

HN 8.75

Hα 4.42

Hβ 2.29

Lys35

7.36

4.56

1.73, 1.98

Hγ 0.83 1.03 1.55, 1.63

Arg36

8.22

4.40

1.03, 1.50

1.39, 1.55

Gly37 Cys38 Ile39

6.51 8.67 9.83

3.87, 4.15 5.97 4.42

3.46, 2.93 1.73

Asp40 Val41 Cys42 Pro43 Lys44

8.72 7.74 8.88 7.92

4.88 4.02 4.46 4.08 4.21

2.80 1.73 2.76, 3.11 1.87, 0.74 1.71, 1.86

Asn45 Ser46 Leu47

8.43 9.00 8.37

4.96 5.03 4.30

2.87, 3.26 4.46, 3.98 1.94, 1.63

Leu48

8.24

4.50

1.75, 1.67

Val49

7.55

5.08

1.88

Lys50

8.79

4.81

1.80, 1.64

Tyr51

9.29

5.33

2.98, 2.75

Val52

8.98

4.58

2.09

Cys53 Cys54 Asn55 Thr56 Asp57 Arg58 Cys59 Asn60

9.54 9.19 8.58 7.59 8.23 9.66 7.60 9.02

5.89 5.11 5.15 4.72 4.82 3.40 4.46 4.37

3.10, 3.80 3.44, 3.65 3.38, 2.65 4.30 2.49, 2.27 1.80, 2.19 3.36, 3.65 2.72, 2.33

γ1 γ2

δ  ζ δ 

1.79, 1.86 3.05 7.53 3.04 7.86

δ

0.41

0.55, 1.23 1.56

δ  ζ δ

2.33, 3.88 3.06 7.51 7.69, 7.37

1.76

δ1 δ2 δ1 δ2

0.94 0.96 0.89 0.96

δ  ζ δ 

1.50 2.88 7.63 6.84 6.47

δ

7.54, 6.73



7.85

δ

7.40, 7.52

γ1 γ2

1.65, 1.43 0.57

γ1,2

0.76

γ1 γ2

γ1 γ2

Другие

0.83 0.90 1.22

1.08 1.16

1.21 1.32, 1.37

35 Таблица 4: Таблица химических сдвигов ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ Остаток Leu1

HN

Hα 4.21

Hβ 1.59

Lys2

Hγ 1.54

8.59

5.43

1.40

Cys3 Asn4 Lys5 Leu6

8.76 9.87 7.80 8.12

5.16 5.03 4.24 3.61

2.48, 2.88 2.47, 2.68 1.50, 2.16 1.83, 1.71

Val7 Pro8 Ile9

7.12 6.83

4.51 4.61 4.31

2.16 1.84, 2.15 2.05

Ala10 Tyr11

7.96 7.82

4.72 5.37

1.40 2.67, 2.90

Lys12

9.04

4.83

1.43, 1.73

1.26

Thr13 Cys14 Pro15 Glu16 Gly17 Lys18

8.69 9.09

4.10 2.86, 3.52 2.44, 1.97 2.00

1.30

8.47 8.75 7.61

4.68 5.02 4.63 4.05 3.70, 4.32 4.31

Asn19 Leu20

7.80 8.22

Cys21 Tyr22

δ1 δ2 δ 

Другие 0.79 0.90 1.25 2.87

1.23 1.55

δ δ δ1 δ2

7.42, 6.58 1.40 0.84 0.99

1.00 1.96, 2.39 1.04 0.95

δ δ

3.60, 4.01 1.39

δ  δ 

6.71 6.81 1.84 3.00

2.19 2.32

δ

3.47, 4.02

1.96

1.15, 1.38

4.93 4.88

2.68, 3.04 1.69, 1.42

1.56

δ  δ δ1 δ2

1.43 2.98 7.39, 6.93 0.77 0.88

9.01 8.92

6.13 6.14

2.97, 3.08 2.97, 3.15

Lys23

9.07

4.82

1.52, 1.62

1.43

δ  δ 

6.64 6.87 1.44 2.98

Met24 Phe25

8.42 9.46

5.09 4.93

1.96, 1.77 2.45, 3.19

1.32, 1.60 δ  ζ

7.07 7.14 7.24

Met26 Met27 Ser28 Asp29 Leu30

9.56 8.75 —1 8.432 7.92

5.14 4.00 4.572 5.032 4.32

2.05, 2.13 2.13, 2.34 3.54, 3.98 2.18, 2.44 1.53

2.48, 2.61 2.51, 2.60

δ1 δ2

0.90 0.78

Thr31 Ile32

8.43 7.44

4.52 4.83

4.41 1.88

δ

1.67

1.32, 1.56 2.38

δ

3.63, 4.08

8.25

4.12 4.39

Pro33 Val34

1 2

γ1,2 γ1 γ2

1.61 1.30 γ1 0.93, 1.23 γ2 1.03 1.71, 1.84 γ1 0.81 γ2 1.04

Сигнал не был обнаружен в NOESY, TOCSY и COSY спектрах ЦТ I/ДФХ Сигнал отнесен не однозначно по причине сильного уширения сигналов второй петли ЦТ I

36 Таблица 4: (Продолжение) Остаток Lys35

HN 7.22

Hα 4.45

Hβ 1.85, 1.92

Hγ 1.68

Arg36 Gly37 Cys38 Ile39

8.12 6.42 8.66 9.85

4.45 3.86, 4.16 5.97 4.45

1.11, 1.52

1.29

2.98, 3.49 1.78

Asp40 Val41 Cys42 Pro43 Lys44 Asn45 Ser46 Leu47

8.76 7.71 8.75 7.78 8.34 9.05 8.45

4.89 4.06 4.51 4.12 4.24 5.03 4.95 4.19

2.81 1.76 2.78, 3.12 0.77, 1.86 1.74, 1.86 2.94, 3.08 3.99, 4.45 1.81, 1.70

Leu48

8.12

4.49

1.69, 1.80

Val49

7.40

4.97

1.94

Lys50 Tyr51

8.59 9.12

4.90 5.49

1.61, 1.81 2.79, 2.96

Val52

8.89

4.59

2.10

Cys53 Cys54 Asn55 Thr56 Asp57 Arg58 Cys59 Asn60

9.33 9.16 8.54 7.57 8.12 9.60 7.63 8.94

5.91 5.13 5.18 4.72 4.82 3.40 4.47 4.37

3.09, 3.81 3.45, 3.67 3.41, 2.67 4.30 2.51, 2.27 1.79, 2.18 3.40, 3.69 2.28, 2.68

γ1 γ2

1.48, 1.69 0.62

γ1,2

0.79 0.54, 1.23 1.57

δ 

Другие 1.83 3.11

δ

0.46

δ  δ

2.42, 3.87 3.04 7.57, 7.39

δ1 δ2 δ1 δ2

0.94 1.02 0.93 1.01

δ 

6.87 6.49

δ

7.46, 6.70

δ

7.33

4.58

γ1 γ2

γ1 γ2

0.81 0.91 1.19

1.11 1.22

1.23 1.37

не нарушают введенных ограничений (таблица 2). Как структура ЦТ I (рис. 6(а)), так и структура ЦТ I/ДФХ (рис. 6(б)) соответствуют классической трехпальцевой структуре цитотоксинов с хорошо определенными элементами вторичной структуры. Наиболее существенное различие структур наблюдается в области второй петли цитотоксина. Данное различие подробно обсуждается в следующем разделе. 1.3.

Поиск прочно связанных молекул воды в ЦТ I

Анализ ROESY спектров ЦТ I в водном окружении при трех температурах (10, 30 и 50 ◦ C) выявил интенсивный отрицательный ROE

37

кросс-пик с сигнала HN Met26 на сигнал воды (рис. 3(б)–(г)). Согласно [75], данный сигнал может быть интерпретирован либо как признак существования долгоживущей связанной с белком молекулы воды, либо как присутствие лабильной гидроксильной группы боковой цепи белка в непосредственной окрестности от HN Met26. Предварительные расчеты пространственной структуры ЦТ I показали, что ближайший к HN Met26 лабильный протон (OH Ser28) удален на расстояние более 5  A. Медленная скорость дейтерообмена HN Met26 (рис. 5(а)) говорит о наличии водородной связи с его участием, однако в ходе предварительных расчетов структуры ЦТ I подходящий акцептор водородной связи обнаружен не был. Все приведенные данные однозначно свидетельствуют о наличии связанной воды в петле II ЦТ I. Связанная вода в аналогичном положении наблюдалась в структурах цитотоксинов, полученных как методом рентгеноструктурного анализа [42, 52, 59], так и методом ЯМР-спектроскопии [56, 55, 58]. Водородные связи вида CO · · · HOH не могут быть установлены экспериментально ни методом рентгеноструктурного анализа (поскольку невозможно восстановить положение протонов в молекуле воды), ни методом гомоядерной 1 H-ЯМР спектроскопии. Однако моделирование структуры цитотоксина A3 Naja atra методом молекулярной динамики с явно заданным водным окружением [58] показало, что связанная молекула воды во второй петле цитотоксина A3 образует водородные связи не только с HN группой Met26, но и с CO группами остатков Thr29 и Val32. Выравнивание структуры второй петли пяти цитотоксинов P-типа, для которых экспериментально доказано существование связанной воды во второй петле [58], показало высокую консервативность в пространственном расположении групп атомов HN 26, CO 29 и CO 32. Данные по структуре цитотоксина A3 Naja atra в комплексе с мицеллой SDS, полученной методом рентгеноструктурного анализа [59], так же подтверждают выводы работы [58]. С целью поиска акцепторов водородных связей белок – вода были проведены два расчета молекулярной динамики ЦТ I в явно заданном водном окружении длительностью 17 и 23 нс. В качестве стартовой структуры использовали структуру ЦТ I, рассчитанную методом ЯМР без предположения наличия в структуре белка связанной воды. Полученная

38

Молекулы воды

30

20

10

0

5

10

15

20 Время, нс

Рис. 7. Последовательная смена связанных молекул воды во второй петле ЦТ I в водном растворе в процессе молекулярной динамики, показаны результаты двух независимых стартов длительностью 16 нс (черным цветом) и 23 нс (серым цветом). Каждая из показанных молекул воды образует водородные связи с двумя из трех остатков Met26, Asp29 и/или Ile32. Молекулы отсортированы в том порядке, в котором они впервые появляются в составе второй петли ЦТ I. в результате молекулярно-динамическая траектория была проанализирована с целью выявить во второй петле белка долгоживущую молекулу связанной воды и обнаружить стабилизирующие ее водородные связи. В результате расчета было показано, что во второй петле цитотоксина практически все время присутствует связанная молекула воды, которая удерживается следующими водородными связями: HN Met26 · · · HOH, CO Asp29 · · · HOH, Oδ Asp29 · · · HOH и CO Ile32 · · · HOH. На рисунке 7 показано, как в процессе молекулярной динамики различные молекулы воды из ближайшего окружения встраиваются во вторую петлю ЦТ I на время от 100 пс до 5 нс. Все приведенные выше данные позволили ввести в расчет структуры ЦТ I связанную молекулу воды и добавить ограничения для четырех перечисленных выше водородных связей. Для этого при расчете структуры ЦТ I по данным ЯМР в конец молекулы при помощи гибких лин-

39

керов была добавлена молекула воды тетраэдрической геометрии [55]. Для учета ее влияния на структуру второй петли цитотоксина, были введены ограничения для четырех водородных связей типа связанная вода · · · белок: с атомами HN Met26, Oδ Asp29, CO Asp29 и CO Ile32. (таблица 1). Добавленные ограничения не противоречат экспериментальным ЯМР ограничениям, и позволяют получить структуру белка вместе с прочно связанной молекулой воды (рис. 8(а)). Из рисунка хорошо видно, как 4 водородные связи белок – вода стабилизируют структуру второй петли цитотоксина. Для комплекса ЦТ I/ДФХ интенсивность ROESY кросс-пика HN Met26/вода уменьшилась более чем на порядок по сравнению с ЦТ I в водном растворе. Учитывая общее ослабление сигналов в области второй петли ЦТ I (см. выше стр. 28), был сделан вывод об участии второй петли в конформационном обмене, который сопровождается уменьшением времени жизни связанной воды в комплексе ЦТ I/ДФХ по сравнению с ЦТ I в водном растворе. В дальнейшем при расчете структуры ЦТ I/ДФХ связанная вода не учитывалась. После расчета структуры цитотоксина без учета связанной воды, была получена конформация второй петли ЦТ I, существенно отличная от структуры в водном растворе (рис. 8(а) и рис. 8(б)). Особенно сильно отличается положение боковой цепи аспарагиновой кислоты Asp29, которая, по-видимому и служит причиной наблюдаемых изменений. Конформация аспарагиновой кислоты изменяется таким образом, чтобы избежать контакта отрицательного заряда карбоксильной группы с гидрофобным окружением мицеллы, в которое погружается вторая петля токсина. Вслед за боковой цепью Asp29 изменяется конформация всей второй петли ЦТ I, что делает невозможным образование тех водородных связей, которые удерживали связанную воду во второй петле молекулы в водном окружении. Следует заметить, что в ЦТ II Naja oxiana связанная вода во второй петле наблюдалась как в водном растворе [55], так и в комплексе с мицеллой ДФХ [56]. При связывании с мицеллой не изменилась интенсивность ROE кросс-пика с HN Met26 на сигнал воды, не изменилась общая интенсивность NOE кросс-пиков в области второй петли ЦТ II, так же мало изменилась и конформация второй петли в целом [56].

40

(а) ЦТ I в водном растворе

(б) ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ Рис. 8. Стереоизображение структуры петли II (остатки 24–34) ЦТ I в водном растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (б). На рис. (а) показана прочно связанная молекула воды, которая образует водородные связи с остатками Met26, Asp29 и Ile32. Очевидно изменение ориентации боковой цепи Asp29 при связывании с мицеллой ДФХ. Пунктиром обозначены водородные связи белок – белок и белок – связанная вода.

41

§ 2.

Исследование ионогенных групп ЦТ I и ЦТ II

2.1.

Анализ данных по pH-зависимости химических сдвигов цитотоксинов

Анализ pH-зависимостей химических сдвигов протонов ЦТ I проводили в соответствии со следующим уравнением, справедливым для случая титрования одной ионогенной группы: δh + δl × 10pKa −pH δ= 1 + 10pKa −pH

(2.1)

здесь δ – химический сдвиг сигнала ядра при данном pH; pKa – значение pKa титрующейся группировки; δh , δl – химический сдвиг атома при высоких и низких значениях pH, соответственно. Если титрование одной ионогенной группы вызывало изменение химических сдвигов нескольких атомов, то pH-зависимости химических сдвигов этих атомов анализировались совместно с общим значением pKa и различными δh и δl для каждого атома (см. табл. 5). pH-зависимостей, в которых участвуют две ионогенные группы, в цитотоксине ЦТ I обнаружено не было. Для согласования экспериментальных данных с уравнением (2.1) была написана программа в среде Mathematica. 2.2.

Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I

Цитотоксин ЦТ I содержит четыре аминокислотных остатка, боковые цепи которых изменяют ионогенное состояние в диапазоне pH 2.0 – 8.0, это остатки Glu16, Asp29, Asp40 и Asp57. Значения pKa этих аминокислот были определены по изменению химических сдвигов близлежащих протонов в серии двумерных ЯМР-спектров, как описано в разделе 2.1. Полученные значения pKa и изменения химических сдвигов приведены в таблице 5. Все перечисленные титрующиеся группы пространственно удалены друг от друга, поэтому каждая кривая титрования хорошо описывается одним значением pKa , уравнение (2.1). Изменение pKa титрующихся группировок вместе с данными об изменении химических сдвигов (рис. 4) при связывании с мицеллой ДФХ дают информацию о том, какие участки цитотоксина взаимодействуют с мицеллой. Сравнение рисунка 4 и таблицы 5 показывает, что остат-

42

Таблица 5. Значения pKa боковых цепей аминокислотных остатков ЦТ I, титрующихся в диапазоне pH 2.0 – 8.0 и изменения химических сдвигов ∆δ = δh −δl атомов, чувствительных к титрованию приведенных остатков. ЦТ I/ДФХ (50 ◦ C) pKa ∆δ, м.д.

Изменение

Остаток Атомы

ЦТ I (30 ◦ C) pKa ∆δ, м.д.

Glu16 Glu16 HN Glu16 Hα Glu16 Hβ1,2 Glu16 Hγ1,2 Asn19 HN Asp29 Met27 HN Met27 Hα Ser28 HN Asp29 HN Asp29 Hα Leu30 HN Asp40 Asp40 HN Asp40 Hα Val41 HN Asp57 Lys2 HN Lys2 Hα Asp57 HN

3.75 ± 0.06 0.04 ± 0.006 −0.07 −0.09 −0.11 −0.09 3.47 ± 0.03 −0.08 ± 0.004 −0.04 −0.11 −0.15 −0.17 −0.12 2.64 ± 0.03 0.57 ± 0.01 −0.19 0.31 2.30 ± 0.04 0.78 ± 0.04 −0.12 ± 0.02 −0.40 ± 0.02

3.87 ± 0.04 0.09 ± 0.005 −0.05 −0.09 −0.23 −0.06 4.63 ± 0.07 −0.04 ± 0.01 −0.04 Не изм.1 Не изм.1 Не изм.1 −0.32 2.25 ± 0.05 0.90 ± 0.05 −0.22 ± 0.02 0.44 ± 0.03 2.14 ± 0.03 0.84 ± 0.03 −0.11 ± 0.01 −0.36 ± 0.01

+0.12

1

+1.16

−0.39

−0.16

Не были измерены по причине полного уширения сигналов Ser28 и Asp29 в спектрах ЦТ I/ДФХ

43

ки Glu16, Asp40 и Asp57 локализованы в области ЦТ I, удаленной от мицеллы, так как ни химические сдвиги, ни значения pKa не изменяются существенно при встраивании цитотоксина в мицеллу. В то же время значительное изменение pKa Asp29 (более единицы pH) в совокупности с сильным изменением химических сдвигов в данной области белка позволяет сделать вывод о том, что боковая цепь Asp29 находится в области белка, взаимодействующей с мицеллой ДФХ. Как было показано выше методом молекулярной динамики, в водном растворе боковая цепь Asp29 участвует в формировании водородной связи с прочно связанной молекулой воды. Значение pKa Asp29 в водном растворе мало отличается от значения свободной аминокислоты (3.70), что говорит об экспонировании боковой цепи в водное окружение. Данный вывод согласуется с полученной пространственной структурой второй петли цитотоксина, рис. 8(а). После связывания с мицеллой ДФХ цитотоксин теряет связанную молекулу воды, а вместе с ней исчезает и водородная связь с карбоксильной группой Asp29. Значение pKa Asp29 в комплексе ЦТ I/ ДФХ значительно превышает значение pKa боковой цепи свободной аспарагиновой кислоты, что свидетельствует о стабилизации незаряженной формы карбоксильной группы в гидрофобном окружении мицеллы. Обращает на себя внимание большое изменение химического сдвига HN Lys2 при титровании боковой цепи Asp57, таблица 5. Следует заметить, что Cγ атом карбоксильной группы аспарагиновой кислоты находится на продолжении N–H вектора Lys2 на расстоянии 3.3  A, что в N совокупности с медленным дейтерообменом H Lys2 говорит в пользу существования водородной связи Lys2 HN · · · Oδ Asp57. В работах [76, 77] показано, что положительное изменение химического сдвига HN протона при титровании карбоксильной группы определяется относительным времени существования водородной связи. Стабильная водородная связь, которая существует 70–90% времени, должна приводить к изменению химического сдвига на +1.5 .. [77] при переходе от кислых значений pH к нейтральным. Если изменение химического сдвига меньше данной величины, то можно сделать вывод о временном характере водородной связи. Следовательно, водородная связь Lys2 HN · · · Oδ Asp57 должна существовать приблизительно 50% времени. Анализ депонированных структур в банке данных PDB показывает, что гомологичная

44

водородная связь присутствует в рентгеновских структурах других цитотоксинов [42, 39, 52, 59]. Данная водородная связь была введена в расчет структуры ЦТ I и ЦТ I/ДФХ (таблица 1). Аналогично можно показать, что боковая цепь аспарагиновой кислоты Asp40 образует водородные связи с атомами HN Asp40 и HN Val41. Большое положительное изменение химического сдвига ∆δ этих атомов при переходе через pKa (таблицa 5) соответствует водородным связям, которые существуют 40/60% (HN Asp40) и 20/30% (HN Val41, раствор/ мицелла ДФХ). Гомологичные водородные связи наблюдаются в рентгеновских структурах других цитотоксинов [42, 39, 52, 59]. Низкое значение pKa аспарагиновых кислот Asp40 и Asp57 по сравнению со значением pKa свободной аспарагиновой кислоты (3.70) связано с присутствием вблизи каждой из них положительно заряженных групп белка. Положительный заряд боковой цепи остатка Lys18 пространственно сближен с отрицательным зарядом Asp40, а положительные заряды боковых цепей Lys2 и Arg58 пространственно сближены с отрицательным зарядом Asp57. Глутаминовая кислота Glu16 экспонирована в водное окружение, не образует никаких водородных связей и пространственно удалена от других заряженных групп белка, значение pKa Glu16 близко к значению для свободной аминокислоты в водном растворе (4.28).

45

§ 3.

Исследование динамического равновесия в системе цитотоксин/мицелла ДФХ

Взаимодействие белка с мицеллой является сложным динамическим процессом. Мицелла представляет собой сравнительно небольшой агрегат из нескольких десятков молекул детергента и обычно имеет форму близкую к сферической. Мембраноактивные и мембраносвязывающиеся белки обычно способны связываться с мицеллами подходящего состава. Считается, что при связывании с мицеллой белок располагается относительно поверхности мицеллы примерно так же, как он располагается относительно поверхности липидного бислоя. Обычно мицелла способна связывать несколько молекул белка, при этом нельзя исключать изменения размера мицеллы при связывании каждой последующей молекулы белка. Метод ЯМР позволяет наблюдать изменение химических сдвигов белка и коэффициента трансляционной диффузии комплекса белок/ мицелла в зависимости от соотношения белок/детергент. Ниже предлагается аналитическая модель для анализа химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии в системе белок/мицелла. 3.1.

Модель для анализа химического сдвига в системе белок/ мицелла

Изменение химических сдвигов белка при связывании с мицеллой будем анализировать в рамках модели, основанной на следующих допущениях: 1. Одна мицелла способна связывать не более N молекул белка. Величину N будем условно называть «валентностью мицеллы» по отношению к данному белку; 2. Обмен между различными олигомерными состояниями белка является быстрым в масштабах ЯМР эксперимента; 3. Все молекулы белка, связанные с мицеллой, имеют одинаковые химические сдвиги. Так же совпадают химические сдвиги у комплексов, содержащих различное количество молекул белка;

46

∆M M0

2∆M M2

M1 k0

k1

Рис. 9. Схематическое представление связывания двух (n = 2) молекул белка с мицеллой. Свободная мицелла состоит из M0 молекул детергента (слева внизу, показаны черным цветом). Первая молекула белка связывается с мицеллой с константой k0 и вытесняет ∆M молекул детергента, новая мицелла состоит из M1 = M0 −∆M молекул детергента. Вытесненный детергент распределяются между остальными мицеллами (показаны вверху серым цветом). Аналогично вторая молекула белка связывается с константой k1 и вытесняет еще ∆M молекул детергента. 4. Связывание n-й молекулы белка с мицеллой, содержащей n − 1 молекул белка, описывается константой бимолекулярного равновесия kn ; 5. Размер мицеллы может зависеть от количества связанных молекул белка. Мицелла, содержащая n молекул белка (m = 0, N ), состоит из Mn молекул детергента. Описанная модель связывания белка с мицеллой проиллюстрирована на рисунке 9 на примере n = 2 молекул белка. В рамках сделанных j предположений наблюдаемый химических сдвиг δobs сигнала ядра j белка описывается уравнением:   P P j j j (3.1) δ = δвода + δмиц. 1 − набл. Pt Pt j j здесь δвода и δмиц. – химический сдвиг j-го атома белка в водном растворе и в комплексе с мицеллой, соответственно; P и Pt – концентрация

47

белка, не связанного с мицеллой и общая концентрация белка в растворе, соответственно. Для анализа экспериментальных данных удобно ввести суммарное изменение химического сдвига δ all , которое определяется формулой: X j − δвода ) (3.2) δ all = sj (δ j набл. j

j j sj = sign(δмиц. − δвода )

(3.3)

Подставив уравнение (3.1) в уравнение (3.2), после очевидных преобразований получим:   P all all δ = ∆δ 1− (3.4) Pt где введено обозначение ∆δ

all

=

X

j j |δмиц. − δвода |

(3.5)

j

Для сопоставления уравнения (3.4) с экспериментом необходимо знать концентрацию белка P , не связанного с мицеллой. Рассмотрим систему бимолекулярных равновесий, описывающую последовательное связывание молекул белка с мицеллой (рис. 9). Обозначим C0 концентрацию свободных мицелл в растворе, C0 = M0 L0 , где L0 – концентрация молекул детергента в составе свободных мицелл. Аналогично обозначим через C1 , C2 , . . . концентрацию белок/мицеллярных комплексов содержащих 1, 2, . . . молекул связанного белка. В этом случае система бимолекулярных равновесий, описывающих связывание, выглядит следующим образом: C0 + P  C1

с константой k1

C1 + P  C2 .. .

с константой k2 .. .

CN −1 + P  CN

с константой kN

(3.6)

48

Последовательно извлекая концентрации C1 , C2 , . . . из бимолекулярных равновесий (3.6) получим: C1 =

P k1 P2 C0 k1 k 2 .. . Pn C0 k1 k 2 . . . kn .. . C0

C2 = C1 .. .

P = k2

P Cn = Cn−1 = kn .. . CN = CN −1

(3.7)

PN P = C0 kN k1 k 2 . . . kN

Для дальнейшего удобства введем обозначение  k k . . . k n ≥ 1 1 2 n Kn = 1 n=0

(3.8)

С учетом (3.7) и (3.8) имеем в общем случае: Pn Cn = C0 , Kn

n = 0, N

(3.9)

Чтобы получить систему уравнений для P , используем законы сохранения вещества для белка и детергента. Пусть Pt и Lt – общая концентрация белка и детергента в растворе, соответственно. С учетом того, что комплекс Cn содержит ровно n молекул белка, закон сохранения вещества для белка выглядит следующим образом: Pt = P +

N X

nCn = P + C0 Sn (P )

(3.10а)

n=0

Аналогично используя факт, что комплекс Cn содержит Mn молекул детергента (см. положение 5 модели на странице 46) получим закон сохранения для детергента: Lt =

N X n=0

Mn Cn = C0 SM (P )

(3.10б)

49

В уравнениях (3.10) введены обозначения для сумм: N X Pn n Sn (P ) = Kn

SM (P ) =

n=0 N X n=0

Pn Mn Kn

(3.11) (3.12)

Система уравнений (3.10) может быть использована для того, чтобы найти неизвестные величины P и C0 по известным константам равновесия и концентрациям веществ. Преобразуем эту систему уравнений к более удобному для анализа виду. Для этого введем степень связывания r белка с детергентом, которая определяется как отношение концентрации связанного белка к общей концентрации детергента в растворе: r=

Pt − P Lt

(3.13)

Данную величину легко извлечь из системы уравнений (3.10). Вычитая P из обоих частей уравнения (3.10а) и деля полученный результат на (3.10б), получим выражение для r: r=

Sn (P ) SM (P )

(3.14а)

Добавим сюда определение r (3.13) записанное в другой форме: Pt = P + rLt

(3.14б)

и получим систему уравнений (3.14), равносильную системе (3.10) с учетом определения (3.13). Новая система уравнений позволяет ввести важное понятие кривой связывания белка c детергентом. Глядя на первое уравнение в системе (3.14а) мы можем видеть, что степень связывания белка r зависит от концентрации свободного белка в растворе P , а так же от внутренних свойств системы белок/детергент (констант связывания Kn и размеров мицелл Mn ), но не зависит от общей концентрации белка Pt и детергента Lt в растворе. Зависимость степени связывания от концентрации детергента r(P ) называется кривой связывания белка с детергентом. По своему физическому смыслу кривая связывания всегда проходит через начало координат (r = 0 при P = 0) и монотонно возрастает с ростом P . Кривой связывания белка с детергентом достаточно

50

чтобы полностью рассчитать состояние системы при любых концентрациях белка и детергента. Для этого достаточно дополнить кривую связывания уравнением (3.14б), содержащим Pt и Lt , и решить получившуюся систему. Заметим, что прямая, задаваемая уравнением (3.14б), всегда убывает от значения Pt /Lt при P = 0 до нуля при P = Pt , поэтому данная прямая всегда пересекает кривую связывания (3.14а) в единственной точке, что доказывает существование и единственность решения системы (3.14). В общем случае система уравнений (3.14) не имеет аналитического решения. Однако используя описанные выше свойства уравнений (3.14), можно построить эффективный численный метод ее решения. Поскольку неизвестная концентрация P находится в диапазоне 0 ≤ P ≤ Pt , то для поиска численного значения P можно использовать метод половинного деления. После того, как величина P будет локализована с достаточной точностью, целесообразно перейти к итерациям по методу Ньютона, который сходится гораздо быстрее метода половинного деления, но требует хорошего выбора начального приближения. 3.2.

Модель для анализа коэффициента трансляционной диффузии белка в комплексе с мицеллой

В системе белок/мицелла молекулы белка обмениваются между свободным состоянием и состоянием, в котором белок связан с мицеллой. Скорость трансляционной диффузии комплекса белок/мицелла зависит от размеров комплекса: чем больше молекул белка связала мицелла, тем медленнее диффундирует комплекс. Наблюдаемый в эксперименте коэффициент трансляционной диффузии белка равен средневзвешенному коэффициенту диффузии по всем возможным состояниям белка. Обозначим коэффициент трансляционной диффузии свободного белка через Df , а коэффициент диффузии белок/мицеллярных комплексов, содержащих ровно n молекул белка, через Dn . Учитывая, что концентрация свободного белка равна P , а концентрация соответствующих мицеллярных комплексов Cn (3.9), получим, что наблюдаемый коэффи-

51

циент трансляционной диффузии равен:   N X 1 nCn Dn Dt = P Df + Pt

(3.15)

n=0

Здесь коэффициент диффузии мицеллы, содержащей n молекул белка, учитывается n раз. Подставив Cn из уравнения (3.9) и затем выразив C0 из (3.10б), получим выражение для Dt через концентрацию свободного белка P : PN Pn P Lt n=0 n Kn Dn Dt = Df + (3.16) Pt Pt SM (P ) Величина P , входящая в это уравнение, должна находиться решением системы уравнений (3.14). Для практических расчетов по формуле (3.16) необходимо оценить коэффициенты трансляционной диффузии Dn . Для этого воспользуемся моделью сферического комплекса: будем оценивать коэффициент трансляционной диффузии комплекса в предположении, что комплекс является сферическим с объемом равным сумме объемов молекул белка и детергента. В рамках такого предположения коэффициент трансляционной диффузии комплекса Dn и свободного белка Df,0 будет определяться уравнением Стокса-Эйнштейна: kb T 6πηρn kb T = 6πηρP

Dn = Df,0

(3.17а) (3.17б)

Здесь T – температура, kb – постоянная Больцмана, η – вязкость воды, η = 0.7973 × 10−3 пуаз, ρn и ρP – радиус комплекса и свободного белка, соответственно. Предполагая суммирование объемов при образовании комплекса, находим радиус комплекса ρn , содержащего n молекул белка, из следующего уравнения: 4 3 4 πρn = Mn V0 + πnρ3P 3 3

(3.18)

Здесь V0 – объем, занимаемый одной молекулой детергента в мицелле. Объем, приходящийся на одну молекулу детергента в мицелле ДФХ можно найти, зная радиус мицеллы ДФХ (23  A) и количество молекул

52

в мицелле (60). Поделив объем сферы на количество молекул получим V0 = 850  A3. Перепишем уравнение (3.18) следующим образом: p ρn = ρP 3 µMn + n (3.19) Здесь введен коэффициент µ, который равен отношению объема одной молекулы детергента к объему молекулы белка: 3V0 µ= (3.20) 4πρ3P Теперь подставив (3.19) и (3.17) в (3.16) перепишем последнее уравнение в виде:   P Lt SD (P ) Dt = Df,0 + (3.21) Pt Pt SM (P ) Здесь введено обозначение для суммы, определяющей относительное изменение коэффициента трансляционной диффузии белка: N X

n Pn √ SD (P ) = 3 µMn + n Kn n=0

(3.22)

Заметим, что две последовательности коэффициентов kn и Mn достаточны, чтобы описать как химический сдвиг, так и диффузию в системе белок/мицелла. Эти коэффициенты входят в выражения для трех сумм по олигомерным состояниям Sn (P ) (3.11), SM (P ) (3.12) и SD (P ) (3.22). Указанные суммы в свою очередь определяют степень связывания белка с мицеллой через уравнения (3.14), а затем и химический сдвиг белка через уравнение (3.4), а так же изменение коэффициента трансляционной диффузии через уравнение (3.21). Конкретные модели для коэффициентов и соответствующих сумм будут обсуждаться ниже в разделе 3.3. Перед тем как применять уравнение (3.21) для анализа экспериментальных данных, необходимо рассмотреть еще два обстоятельства, которые оказывают влияние на величину наблюдаемого коэффициента трансляционной диффузии. Первое обстоятельство это несферичность комплекса белок/мицелла. В следствие несферичности комплекса перестает быть применимым уравнение Стокса-Эйнштейна в форме (3.17). Для учета несферичности частицы в уравнение добавляется форм-фактор F [78]: kb T Dt = (3.23) 6πηρэфф F

53

В данном уравнении ρэфф обозначает радиус сферы с тем же объемом, что и рассматриваемая частица. Явное выражение для форм-фактора эллипсоида вращения с соотношением главных осей p = a/b было получено Перрином в 1934 году [78, 79, 80]: p  p2 − 1   p p ≥ 1 (сплющенный эллипсоид)     p2/3 arctan p2 − 1 p F = (3.24) 2  1 − p   √ p < 1 (вытянутый эллипсоид)    2/3 1+ 1−p2 p log p Подставив в (3.24) значения p = 2 и p = 0.5 получим, что для сплющенного эллипсоида с соотношением осей 2:1 форм-фактор равен F = 1.04195, а для вытянутого эллипсоида с таким же соотношением осей F = 1.04387. Таким образом, даже для довольно сильно вытянутой частицы коэффициент трансляционной диффузии отличается от коэффициента для сферы того же объема не более чем на 5 %. Поскольку вытянутость белок/мицеллярного комплекса вряд ли превышает 2:1, то эффектом несферичности комплексов можно с хорошей точностью пренебречь. Второе обстоятельство связано с тем, что мицеллы занимают некоторую долю объема раствора, ограничивая тем самым собственную трансляционную диффузию, а так же диффузию других частиц в растворе [81]. Точное аналитическое решение задачи о диффузии невзаимодействующих твердых сфер в вязкой жидкости было получено М. Токуямой и И. Оппенгеймом в 1994 году [82, 83]. Согласно результатам Токуямы и Оппенгейма коэффициент трансляционной диффузии Dt твердых сферических частиц радиуса a зависит от объемной доли φ частиц (φ = 43 πa3 n0 , n0 – концентрация частиц) и коэффициента диффузии Dt,0 одиночной частицы. Точная зависимость Dt (φ) имеет вид [82]: 9 1 − 32 φ Dt (φ) = Dt,0 1 + H(φ) + K(φ)

(3.25а)

где 2b2 c bc(2 + c) H(φ) = − − 1 − b 1 + 2c (1 + c)(1 − b + c)

(3.25б)

54

здесь обозначено b =

q

9φ 18 ,

φ K(φ) = φ0

c=



11φ 16 ,

φ 1− φ0

2 (3.25в)

а величина φ0 есть критическая объемная доля частиц: φ0 = ( 43 )3 /(7 log 3 − 8 log 2 + 2) ≈ 0.57185

(3.25г)

Уравнения (3.25) описывают Dt (φ) для произвольных, в том числе больших, значений φ. Для наших целей представляет интерес упростить выражение (3.25) в предположении малости φ: φ  φ0 . Разложив выражение в ряд Тейлора по φ в окрестности φ = 0 получим:     59 1 φ + O(φ3/2 ) (3.26) Dt (φ) = Dt,0 1 − + 32 φ0 Отбросив слагаемые высших порядков, получим приближенное выражение для коэффициента диффузии сферических частиц в вязкой жидкости: Dt (φ) ≈ Dt,0 (1 − 3.59247φ) (3.27) Оценим вклад поправки в уравнении (3.27) в трансляционную диффузию мицелл. При расчете пространственной структуры ЦТ I в комплексе с мицеллой ДФХ использовался 90 миллимолярный раствор ДФХ-д38 . Считая объем приходящийся на одну молекулу ДФХ равным · 850 × V0 = 850  A3, рассчитаем объемную долю мицелл: φ = 90 мМоль л 3 м шт · 6.0221 × 1023 Моль = 0.0460, то есть мицеллы занимают 4.6 % 10−30 шт объема раствора. Согласно уравнению (3.27) коэффициент диффузии мицелл уменьшается на 4.6 · 3.6 = 16.56 % по сравнению с коэффициентом трансляционной диффузии свободной мицеллы. Этот вклад почти в 4 раза превышает вклад, который даст двукратная вытянутость диффундирующей частицы. Кроме того, величина поправки в уравнении (3.27) растет линейно с ростом концентрации липида, что особенно важно при анализе зависимости коэффициента диффузии от концентрации добавленного липида [81]. Вообще, для раствора ДФХ концентрации Lt объемная доля мицелл составляет φ(Lt ) =

Lt , L0t

где L0t = 1.95

Моль л

(3.28)

55

В силу вышесказанного, в дальнейшем при расчетах коэффициента трансляционной диффузии пренебрегали несферичностью белок/ мицеллярных комплексов, но учитывали объемную долю, занимаемую мицеллами. Диффузию свободного белка в растворе мицелл можно рассматривать как ограниченную диффузию в свободном от мицелл объеме. В случае, когда ограничивающие диффузию частицы имеют сферическую форму, уменьшение коэффициента трансляционной диффузии Df описывается следующим уравнением [84, 85, 86]: Df,0 Df = (3.29) 1 + φ2 где Df,0 обозначает коэффициент диффузии в отсутствие ограничивающих диффузию частиц, а φ то же самое, что и в уравнениях (3.25–3.27). Подставляя в (3.21) поправку на исключенный из диффузии объем φ из уравнения (3.27) для мицелл и из уравнения (3.29) для свободного белка, окончательно получаем:   Lt P 1 SD (P ) + (1 − 3.59247φ) Dt = Df,0 (3.30) Pt 1 + φ2 Pt SM (P ) 3.3.

Модели для kn и Mn

Для анализа экспериментальных данных по химическому сдвигу и коэффициенту трансляционной диффузии белка при помощи изложенных выше моделей необходимо задаться определенными зависимостями для констант связывания kn и размера мицелл Mn , n = 1, N . Данные коэффициенты входят в суммы (3.11,3.12) и (3.22) и фактически определяют конкретный вид зависимости химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка через уравнения (3.4,3.14) и (3.30). Если предположить все константы и размеры мицелл полностью произвольными и подлежащими определению из экспериментальных данных, то уже для N = 3 получится 6 параметров, подлежащих определению из эксперимента. Большое количество свободных параметров приводит к сильной избыточности модели уже при весьма умеренных N . Кроме того, количество параметров, подлежащих определению сильно зависит от «валентности мицеллы» N , что затрудняет сравнение моделей с разными N между собой. Для разрешения

56

этой трудности предположим, что величины kn и Mn являются простыми функциями от n и рассмотрим несколько конкретных видов таких функций. Модель А: Постоянные kn и Mn Простейшей из возможных функций является константа, поэтому сначала рассмотрим наиболее очевидный случай: kn = k0 и

(3.31а)

Mn = M0 при любых n

(3.31б)

Из (3.8) видно, что Kn = k0n и суммы (3.11,3.12) могут быть легко вычислены явно. Обозначив q = kP0 получим для SM (P ) сумму геометрической прогрессии: N X 1 − q N +1 n SM,A (P ) = M0 q = M0 (3.32) 1−q n=0

Сумма Sn (P ) может быть получена дифференцированием суммы геометрической прогрессии по параметру q: Sn,A (P ) =

N X n=0

N

∂ 1 − q N +1 ∂ X n q =q = nq = q ∂q ∂q 1 − q n

n=0

N +1

q

1−q (N + 1)q − 2 (1 − q) 1−q

(3.33)

N +1

После подстановки (3.32) и (3.33) в уравнение (3.14а) и очевидных упрощений получим следующее выражение для кривой связывания: Sn,A (P ) rA = = SM,A (P )   1 1 N +1 N+ − , M0 1 − q 1 − q N +1

P где q = k0

(3.34)

Совместно с уравнением (3.14б) данное уравнение образует систему, которая может быть решена относительно r и P . Заметим, что выражение (3.34) имеет смысл в том числе и при дробных (не целых) значениях N , что позволяет определять параметр N методом нелинейной регрессии наравне с другими параметрами модели.

57

Аналогично на случай дробных N может быть обобщено уравнение для коэффициента трансляционной диффузии (3.21,3.30). Для этого заметим, что сумма в числителе уравнений (3.21,3.30) выражается через трансцендентную функцию Лерча: N X

nq n √ SD,A (P ) = = SΦ (µM0 , N, q) 3 µM + n 0 n=0

(3.35)

где введено обозначение SΦ (a, N, q) для комбинации функций Лерча: SΦ (a, N, q) = Φ− 2 (q, a) − q N +1 Φ− 2 (q, a + N + 1)− 3 3
N +1 a Φ 1 (q, a) − q Φ 1 (q, a + N + 1) 3

(3.36)

3

Здесь трансцендентная функция Лерча [87,88] Φs (x, a) определяется как: Φs (q, a) =

X 0≤n<∞ a+n6=0

qn (a + n)s

(3.37)

Справедливость выражения (3.36) может быть проверена прямой подстановкой в него определения (3.37). Степенной ряд (3.37) сходится при |q| < 1, но может быть аналитически продолжен на всю комплексную плоскость с разрезом от 1 до +∞ [87]. Поскольку трансцендентная функция Лерча определена при любых (в том числе дробных) значениях a, правая часть уравнения (3.36) может быть вычислена при дробных N . Заметим, что хотя при q > 1 функция Лерча в правой части (3.36) принимает комплексные значения, после вычисления всего выражения мнимые части сокращаются и получается действительный результат. Подставляя (3.35,3.36) и (3.32) в уравнение (3.30) получим выражение для коэффициента трансляционной диффузии белка при произвольном N . Полученные уравнения позволяют моделировать совместное изменение химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка в процессе его связывания с мицеллой. Параметр N – «валентность мицеллы» в этом случае определяется естественным образом как один из параметров нелинейной регрессии. На рисунке 10 показаны графики кривой связывания r(P ) (3.34), доли свободного белка P (Lt ) и коэффициента трансляционной диффузии Dt (Lt ), рассчитанные по данной модели. Как видно из рисунка, кривая

58

rA M0

N=6

5

5

4

4

3

3

2

2

1

N =1

0

0

1

2

3

4

5

80

100

q= P

k0

(а) Кривая связывания

P Pt 0.8 0.6

N=

0.4

1

0.2

N=6

0 0

20

40

60

Lt Pt

(б) Доля свободного белка Рис. 10. Модель A для химического сдвига и трансляционной диффузии белка. (Начало. Окончание и объяснения к рисунку на странице 59)

59

Dt 1 Df,0 0.9

N=

0.8 0.7

N =1

1 N=6

0.6 0.5

µM0 =1 µM0 =3

N=6 0

20

40

60

80

100

Lt Pt

(в) Коэффициент трансляционной диффузии Рис. 10. Модель A для химического сдвига и трансляционной диффузии белка (Окончание. Начало на странице 58). (а) Кривая связывания белка с мицеллой (3.34) в зависимости от «валентности мицеллы» N . (б) Доля свободного белка в растворе P/Pt в зависимости от отношения детергент/белок Lt /Pt для различных значений N . При моделировании использовались следующие значения параметров: Pt = 1, K = 0.1 и M0 = 60. Концентрация свободного белка P находилась численным решением системы уравнений (3.34,3.14б). (в) Уменьшение коэффициента трансляционной диффузии белка Dt /Df,0 в присутствии мицелл детергента без учета эффекта вытесненного объема φ. Коэффициент Dt определялся из уравнения (3.21), где суммы SD (P ) и SM (P ) вычислялись согласно (3.35) и (3.32), соответственно. При моделировании использовались те же значения параметров, что и в пункте (б). Графики показаны для двух значений отношения объема мицеллы к объему белка: µM0 = 1 (сплошная линия) и µM0 = 3 (пунктир).

60

связывания (рис. 10(а)) и доля свободного белка (рис. 10(б)) являются монотонными зависимостями, в то время как коэффициент трансляционной диффузии Dt (рис. 10(в)) зависит от концентрации детергента Lt , вообще говоря, не монотонно. Данный факт имеет простое качественное объяснение. При малой концентрации детергента имеется большой избыток белка над детергентом, что приводит к образованию комплексов, содержащих более одной молекулы белка на мицеллу. Это приводит к уменьшению трансляционной диффузии белка. При дальнейшем увеличении концентрации детергента равновесие смещается в сторону комплексов, содержащих одну молекулу белка на мицеллу, и коэффициент трансляционной диффузии увеличивается. Заметим, что в иллюстративных целях зависимости на рис. 10(в) приведены без учета эффекта вытесненного объема φ. Учет вытесненного объема приведет к более крутому падению трансляционной диффузии белка с ростом Lt и сглаживанию минимума зависимости Dt от Lt . Модель B: Постоянные kn и линейно изменяющиеся Mn В следующей модели предположим, что размер мицеллы Mn меняется при связывании белка с мицеллой. Предположим, что каждая связавшаяся молекула белка «вытесняет» из мицеллы определенное количество молекул детергента. В этом случае выражения для kn и Mn принимают вид: kn = k0 Mn = M0 − n∆M

(3.38а) (3.38б)

Новый параметр ∆M задает количество молекул детергента, вытесняемых из мицеллы при связывании одной молекулы белка, рисунок 9. Для сумм Sn (P ) и SM (P ) получаем выражения: Sn,B (P ) = Sn,A (P )

(3.39)

SM,B (P ) = SM,A (P ) − ∆M Sn,A (P )

(3.40)

Откуда очевидно, что: rB =

Sn,B (P ) rA = SM,B (P ) 1 − ∆M rA

(3.41)

61

где rA задается уравнением (3.34). Для суммы SD (P ) очевидно получим:

SD,B (P ) =

N X n=0

√ 3

nq n = µMn + n

N X

nq n p = 3 µM + n(1 − µ∆M ) 0 n=0   1 µM0 √ SΦ , N, q 3 1 − µ∆M 1 − µ∆M

(3.42)

Здесь выражение SΦ (a, N, q) как и раньше определяется уравнением (3.36). Легко видеть, что модель B, так же как и модель А, позволяет вычислять значения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии при дробных значениях N . Последнее выражение (3.42) имеет смысл при µ∆M 6= 1. Особый случай µ∆M = 1 соответствует ситуации, когда каждая молекула белка при связывании с мицеллой вытесняет ровно такой объем детергента, какой занимает сам белок. В этом случае коэффициент трансляционной диффузии мицеллы не изменяется при связывании белка, и все Dn (3.17а) равны между собой, сумма SD вырождается в обычную сумму геометрической прогрессии. Модель C: Экспоненциально изменяющиеся kn и постоянные Mn Другая полезная модель связывания белка с мицеллой получается, если мы откажемся от предположения о тождественности констант связывания kn . Константа связывания kn экспоненциально зависит от изменения свободной энергии ∆Gn при связывании: kn = Ae−

∆Gn RT

(3.43)

Здесь A – некоторый предэкспоненциальный множитель. Тождественность констант связывания равносильна тождественности изменения свободной энергии при связывании. Предположим, что каждая последующая молекула белка связывается со все меньшим и меньшим изменением свободной энергии, при чем уменьшение свободной энергии связывания происходит в арифметической прогрессии: ∆Gn = ∆G0 − n∆2 G

(3.44)

62

Подставляя (3.44) в (3.43), получим, что константы связывания должны изменяться в геометрической прогрессии: kn = k0 p n ,

n = 1, N

(3.45а)

где k0 =

∆G0 Ae− RT

и

p=

∆2 G − RT e

Предположим, что значения Mn , как и в модели A, остаются неизменными: Mn = M0 ,

n = 0, N

(3.45б)

Как видно из уравнения (3.45а) параметр p задает показатель геометрической прогрессии констант связывания. Если p > 1 то каждая следующая константа связывания больше предыдущей в p раз, что соответствует в p раз более слабому связыванию. Таким образом параметр p можно назвать коэффициентом антикооперативности связывания белка с мицеллой. Подставив (3.45а) в (3.8) получим для Kn : Kn = k0n p

n(n+1) 2

(3.46)

Соответственно выражения для сумм Sn (3.11), SM (3.12) и SD (3.22) будут: Sn,C =

N X

nq n p−

n(n+1) 2

(3.47а)

n=0

SM,C = M0

N X

q n p−

n(n+1) 2

(3.47б)

n=0

SD,C

n(n+1) N X nq n p− 2 √ = 3 µM0 + n n=0

(3.47в)

Здесь по-прежнему q = kP0 . К сожалению, ни одна из сумм (3.47) не выражается в явном виде и не может быть очевидным образом обобщена на случай дробных N , как это было для моделей A и B. Тем не менее, анализ экспериментальных данных возможен непосредственно с использованием выражений (3.47), и, как будет показано ниже, использование модели C может существенно уменьшить значение χ2 по сравнению с моделями A и B при анализе экспериментальных данных.

63

Модель D: Экспоненциально изменяющиеся kn и линейно изменяющиеся Mn Последним очевидным обобщением предыдущего изложения являтеся модель, которая учитывает как изменение константы связывания белка с мицеллой kn , так и размер мицеллы Mn . По аналогии с моделями B и C, примем следующие выражения для kn и Mn : kn = k0n p

n(n+1) 2

(3.48а)

Mn = M0 − n∆M

(3.48б)

и после очевидной подстановки получим выражения для сумм Sn (3.11), SM (3.12) и SD (3.22): Sn,D = SM,D = SD,D =

N X n=0 N X

nq n p−

(3.49а)

(M0 − n∆M )q n p−

n=0 N X

nq n p− p 3

n=0

n(n+1) 2

n(n+1) 2

n(n+1) 2

µM0 + n(1 − ∆M )

(3.49б) (3.49в)

В данном случае, как и для модели C, приведенные суммы не выражаются в виде аналитически замкнутых выражений. Однако, как будет показано в слудующем разделе, численный анализ экспериментальных данных при помощи модели D (3.49) с учетом эффектов вытесненного объема (3.30) приводит к наиболее адекватным результатам. 3.4.

Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ

Зависимость химических сдвигов цитотоксина I от соотношения детергент/белок (L/P ) определяли по серии двумерных TOCSY и NOESY спектров при температуре 30 ◦ C. Титрование проводили добавлением к 1.5 мМ раствору ЦТ I раствора ДФХ-д38 . Для соотношений L/P = 0, 3, 6 и 9 были сняты спектры TOCSY-60 мс и NOESY-100 мс; для соотношений L/P = 12, 15 и 18 спектры TOCSY-50 мс и NOESY80 мс и для соотношений L/P = 27, 36, 45 и 60 спектры TOCSY-40 мс и

64

NOESY-60 мс. Спектры снимались с разрешением 4096×256 точек, затем линейное предсказание использовалось для увеличения разрешения до 4096 × 1024 точек, затем спектры преобразовывались с окончательным разрешением 4096 × 2048 точек. Серии двумерных TOCSY и NOESY спектров были собраны в два трехмерных массива данных для дальнейшего анализа. После отнесения сигналов атомов основной цепи были выделены 56 атомов, сигналы которых сдвигаются в процессе титрования более чем на 0.05 м.д., в том числе 27 HN , 24 Hα и 5 Hδ Pro атомов. Химические сдвиги этих атомов были использованы при вычислении δ all в соответствии с уравнением (3.2). Трансляционную диффузию ЦТ I измеряли на спектрометре Varian Unity-600 при помощи градиентного спин-эхо эксперимента с подавлением сигнала воды (Water-sLED, [89]) как описано в [56]. Титрование производили добавлением раствора ДФХ . к 1.0 мМ раствору ЦТ I. Трансляционная диффузия была измерена при тех же соотношениях L/P , что и эксперименты по измерению химического сдвига. Зависимость химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксина II от концентрации ДФХ была исследована ранее [56]. Однако в работе [56] были накоплены только одномерные спектры цитотоксина для каждого соотношения L/P , что позволило проследить за изменением только двух не перекрытых сигналов HN Leu 9 и HN Met 26. Поэтому для ЦТ II было проведено новое титрование аналогично тому, как это было описано выше для ЦТ I. Для титрования использовался раствор ЦТ II концентрации 2.63 мМ, к которому добавляли раствор ДФХ до соотношения детергент/белок 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30 и . 45 (моль/моль). При каждом из указанных соотношений был снят двумерный NOESY-170 мс спектр с разрешением 4096×256 точек. Далее спектры были преобразованы и проанализированы как описано выше для ЦТ I, в результате были выделены 26 атомов основной цепи с изменением химического сдвига более чем на 0.05 м.д., в том числе 14 HN и 12 Hα атомов. Химические сдвиги этих атомов были использованы при вычислении δ all в соответствии с уравнением (3.2). Для анализа трансляционной диффузии цитотоксина II использовались данные работы [56].

65

3.5.

Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II

Данные по трансляционной диффузии и химическому сдвигу цитотоксинов I и II, полученные, как описано в разделе 3.4, были проанализированы с помощью моделей, описанных в разделе 3.3 с учетом и без учета эффекта вытесненного объема. Анализ проводили методом наименьших квадратов c минимизацией общей штрафной функции, учитывающей как химический сдвиг, так и трансляционную диффузию: χ2 = χ2 (δ all ) + χ2 (Dt )

(3.50)

Результаты нелинейной регрессии (минимизации штрафной функции (3.50)) в рамках различных моделей приведены в таблицах 6 и 7 для цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II, соответственно. При минимизации варьировались следующие параметры: суммарное изменение химического сдвига ∆δ all , коэффициент трансляционной диффузии в отсутствие липида Df,0 , константа связывания первой молекулы белка с мицеллой k0 , отношение объема молекулы детергента к объему молекулы белка µ (уравнение 3.19), количество молекул белка, связанных с мицеллой N (только для моделей A и B), коэффициент вытеснения детергента связанным белком ∆M (только для моделей B и D) и коэффициент антикооперативности связывания p (уравнение 3.45а, только для моделей C и D). Во всех моделях был фиксирован параметр M0 : количество молекул детергента приходящихся на одну мицеллу в отсутствие белка было принято равным 60. В таблице 6(а) и 7(а) приведены значения штрафной функции и значения варьируемых параметров для моделей с непрерывным N с учетом (модели A и B) и без учета (модели Aφ=0 и Bφ=0 ) эффекта вытесненного объема φ. Как видно из таблицы 7(а), учет вытесненного объема приводит к значительному уменьшению штрафной функции по трансляционной диффузии χ2 (Dt ) (на 30 единиц для модели A и на 8 единиц для модели B). В то же время значение штрафной функции для химического сдвига χ2 (δ all ) остается достаточно высоким (более 28 единиц). Таким образом, введение вытесненного объема в модель для трансляционной диффузии представляется оправданным, но не доста-

66

Таблица 6. Анализ данных по изменению химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксина I при помощи различных моделей. (а) Модели с непрерывным N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) N ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мМ ∆M µM0

Aφ=0 Bφ=0 A B Значения штрафной функции 25.27 23.09 23.82 22.51 12.64 11.41 12.47 11.07 12.62 11.68 11.35 11.44 Значения параметров модели 3.88 ± 0.08 3.11 ± 0.15 3.86 ± 0.08 2.75 ± 0.18 8.85 ± 0.16 8.61 ± 0.16 8.77 ± 0.15 8.47 ± 0.16 1.95 ± 0.03 1.93 ± 0.03 1.92 ± 0.04 1.90 ± 0.04 0.38 ± 0.04 0.31 ± 0.04 0.37 ± 0.04 0.26 ± 0.04 4.57 ± 0.83 7.42 ± 1.38 10.4 ± 1.8 9.7 ± 1.7 6.4 ± 1.2 6.6 ± 1.0

(б) Модель С с различными фиксированными N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мкМ p µM0

CN =3 CN =4 CN =5 CN =6 Значения штрафной функции 48.19 24.24 25.36 25.79 37.67 11.99 10.45 11.67 10.53 12.25 13.91 14.12 Значения параметров модели 9.72 ± 0.62 8.65 ± 0.21 8.11 ± 0.15 8.02 ± 0.14 1.88 ± 0.03 1.93 ± 0.03 1.96 ± 0.03 1.97 ± 0.03 > 4 × 106 277 ± 75 87 ± 26 68 ± 19 < 1 × 10−4 1.19 ± 0.12 2.06 ± 0.19 2.28 ± 0.19 241 ± 40 197 ± 34 171 ± 24 168 ± 23

67

Таблица 6. (Продолжение) (в) Модель D с различными фиксированными N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мкМ p ∆M µM0

DN =3 Значения 21.19 10.06 11.13 8.05 ± 0.34 1.91 ± 0.03 74 ± 80 2.82 ± 2.31 7.77 ± 2.10 3.47 ± 0.49

DN =4 DN =5 DN =6 штрафной функции 22.33 24.30 24.59 10.14 10.75 13.01 12.19 13.55 11.58 8.06 ± 0.34 8.04 ± 0.27 7.81 ± 0.18 1.94 ± 0.03 1.96 ± 0.03 1.93 ± 0.03 75 ± 63 72 ± 52 30 ± 23 2.43 ± 1.20 2.29 ± 0.91 4.54 ± 3.51 3.02 ± 2.25 0.72 ± 2.83 5.83 ± 5.64 3.05 ± 0.42 2.87 ± 0.41 3.09 ± 0.52

точным для описания всех экспериментальных данных. Заметим, что для цитотоксина I введение вытесненного объема в модели A и B не дает столь заметного уменьшения штрафной функции (таблица 6(а)), однако в целях единообразия в анализе данных вытесненный объем был введен в модели для обоих цитотоксинов (таблицы 6(б)–(в) и 7(б)–(в)). Заметим, что значение непрерывно изменяемого параметра N варьировалось от наименьшего 2.75 (модель B для ЦТ I) до наибольшего 4.95 (модель A для ЦТ II). Дальнейший анализ экспериментальных данных проводился при помощи моделей с дискретным N , а именно моделей C и D. Для каждой из моделей параметр N был зафиксирован на одном из четырех значений: N = 3, 4, 5 или 6. Напомним, что модель C учитывает антикооперативность связывания белка с мицеллой p (p 6= 1), но не учитывает вытеснения детергента из мицеллы (∆M = 0). Как видно из сравнения таблицы 7(а) и (б), модель C по сравнению с моделью B позволяет незначительно уменьшить значение общей штрафной функции χ2 для ЦТ II (30.07 для наилучшей модели класса C: CN =5 по сравнению с 36.78 для модели B). Следует заметить, что при этом сильное уменьшение штрафной функции для химического сдвига χ2 (δ all ) (11.88 для модели CN =5 по сравнению с 28.45 для модели B) компенсируется сравнимым ростом

68

Таблица 7. Анализ данных по изменению химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксина II при помощи различных моделей. (а) Модели с непрерывным N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) N ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мМ ∆M µM0

Aφ=0 Bφ=0 A B Значения штрафной функции 73.21 40.74 42.63 36.78 39.13 23.98 37.01 28.45 34.08 16.77 5.62 8.33 Значения параметров модели 4.94 ± 0.07 3.08 ± 0.20 4.95 ± 0.05 3.77 ± 0.81 4.77 ± 0.08 4.60 ± 0.06 4.73 ± 0.06 4.63 ± 0.09 1.87 ± 0.03 1.85 ± 0.02 1.83 ± 0.02 1.80 ± 0.03 0.31 ± 0.05 0.16 ± 0.03 0.29 ± 0.03 0.20 ± 0.07 8.0 ± 1.3 4.2 ± 3.7 4.73 ± 0.80 6.83 ± 0.54 1.17 ± 0.29 1.58 ± 0.52

(б) Модель С с различными фиксированными N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мМ p µM0

CN =3 CN =4 CN =5 Значения штрафной функции 180.84 40.79 30.07 157.59 34.39 11.88 23.25 6.40 18.18 Значения параметров модели 5.53 ± 0.18 4.69 ± 0.06 4.40 ± 0.03 1.79 ± 0.05 1.83 ± 0.02 1.88 ± 0.02 1.7 × 104 0.22 ± 0.06 0.01 ± 0.005 7 ±5.4 × 10 0.00 ± 2.36 1.09 ± 0.08 2.68 ± 0.28 190 ± 110 100 ± 20 106 ± 13

CN =6 39.98 19.66 20.33 4.38 ± 0.03 1.89 ± 0.02 0.01 ± 0.003 3.24 ± 0.35 108 ± 14

69

Таблица 7. (Продолжение) (в) Модель D с различными фиксированными N Модель χ2 χ2 (δ all ) χ2 (Dt ) ∆δ all , м.д. м2 Df,0 , ×10−10 сек k0 , мкМ p ∆M µM0

DN =3 Значения 21.59 9.39 12.20 4.36 ± 0.04 1.80 ± 0.02 2.5 ± 3.9 10.73 ± 9.11 9.70 ± 0.37 2.75 ± 0.25

DN =4 DN =5 DN =6 штрафной функции 17.36 21.68 29.70 9.55 10.02 11.19 7.81 11.66 18.51 4.39 ± 0.04 4.41 ± 0.04 4.42 ± 0.05 1.83 ± 0.01 1.86 ± 0.02 1.88 ± 0.02 7.2 ± 7.1 11 ± 10 15 ± 13 4.22 ± 1.74 2.95 ± 0.89 2.41 ± 0.61 4.68 ± 0.41 1.69 ± 0.49 −0.27 ± 0.61 2.20 ± 0.20 1.90 ± 0.21 1.73 ± 0.24

диффузионного вклада в штрафную функцию χ2 (Dt ) (18.18 для модели CN =5 по сравнению с 8.33 для модели B). Аналогичное сравнение таблиц 6(а) и (б) показывает, что для цитотоксина I переход от модели B к модели CN =5 приводит к небольшому уменьшению χ2 (δ all ) (10.45 по сравнению с 11.07) и увеличению χ2 (Dt ) (13.91 по сравнению с 11.44). Следует так же обратить внимание на найденное оптимальное значение параметра µM0 (последняя строчка таблиц 6(б) и 7(б)): во всех случаях для модели C это значение превышает 100. Напомним, что безразмерный параметр µM0 задает отношение гидродинамического объема свободной мицеллы к гидродинамическому объему связывающегося белка. Исходя из экспериментально полученных значений коэффициентов м2 трансляционной диффузии для цитотоксинов Dt (ЦТ I) = 1.77 × 10−10 сек м2 и Dt (ЦТ II) = 1.71×10−10 сек [56] и свободной мицеллы ДФХ Dt (ДФХ) = −10 м2 1.20 × 10 сек [56] данное отношение должно быть равно 3.21 для ЦТ I и 2.88 для ЦТ II. Таким образом, полученное в результате регрессии значение параметра µM0 выходит далеко за пределы разумных значений. Суммируя результаты анализа, мы можем сделать следующий вывод: модель C позволяет лучше, чем модели A и B, описать изменение химического сдвига, но не позволяет при разумных значениях

70

параметров описать трансляционную диффузию белка. Данный вывод вынуждает нас перейти к анализу экспериментальных данных при помощи наиболее общей модели D, которая учитывает все три рассмотренных выше эффекта: долю объема раствора φ вытесненную детергентом, антикооперативность p связывания молекул белка с мицеллой и вытеснение из мицеллы ∆M молекул детергента каждой связавшейся молекулой белка. Результат анализа представлен в таблицах 6(в) и 7(в). Как видно из таблиц, переход от модели C к модели D приводит к уменьшению всех компонент штрафной функции и возвращает параметр µM0 в область разумных значений. Для цитотоксина I оптимальными являются модели DN =3 и DN =4 которые незначительно различаются по значению штрафных функций в пользу модели с тремя молекулами белка. Для цитотоксина II оптимальной является модель DN =4 , которая существенно лучше моделей с N = 3, 5 и 6. Предсказанная этими моделями зависимость химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии в сравнении с экспериментальными данными показана на рис. 11. Следует обратить внимание на полученную величину эффекта вытеснения детергента из мицеллы ДФХ. Для цитотоксина I параметр ∆M = 7.77 ± 2.10 для модели DN =3 и ∆M = 3.02 ± 2.25 для модели DN =4 (таблица 6(в)). Таким образом, при полном связывании белка с мицеллой белок вытесняет из мицеллы ∆M · N = 12 ÷ 24 молекул детергента, то есть от пятой до третьей части мицеллы (напомним, что количество молекул детергента в свободной мицелле ДФХ для нашего анализа является фиксированной величиной и равно M0 = 60). Аналогично цитотоксин II при полном связывании может вытеснить до 4.68 · 4 ≈ 19 молекул детергента (таблица 7(в)). Принимая радиус мицеллы ДФХ равным 2.3 нм или объем мицеллы равным Vмиц. = 51 нм3 , мы можем оценить, что каждая молекула белка вытесняет из мицеллы объем равный (3.51) ∆V = Vмиц. ∆M M0 что составляет для цитотоксина I приблизительно ∆V (ЦТ I) ≈ 2.5 ÷ 6.6 нм3 , а для цитотоксина II ∆V (ЦТ II) ≈ 4.0 нм3 . Если предположить, что объем вытесненного детергента равен объему погруженной в мицеллу части белка, то полученные значения ∆V могут быть непосредствен-

71

м.д. 8

ЦТ I 6

4

ЦТ II 2

0 0

10

20

30

40

50

60 Lt/Pt

(а) Наилучшая модель для химического сдвига

Dt , 10

-10 2

м /с

1.8 1.6 1.4

ЦТ I

1.2 1

ЦТ II 0

10

20

30

40

50

60 Lt/Pt

(б) Наилучшая модель для трансляционной диффузии Рис. 11. Наилучшие модели для изменения химического сдвига (а) и коэффициента трансляционной диффузии (б) цитотоксинов ЦТ I, ЦТ II при изменении соотношения детергент/белок Lt /Pt .

72

но сопоставлены с данными о структуре белок/детергентного комплекса [56]. Итого, степень вытеснения детергента из мицеллы при полном связывании цитотоксина может достигать третьей части объема свободной мицеллы. Данный эффект наиболее сильно проявляет себя через коэффициент трансляционной диффузии белка и практически не сказывается на зависимости химического сдвига от концентрации детергента. Другим важным параметром, полученным из модели D, является константа связывания первой молекулы белка с мицеллой k0 . Для цитотоксина I она составляет величину k0 (ЦТ I) = 75 ± 63 мкМ, а для цитотоксина II ее значение более чем на порядок меньше: k0 (ЦТ II) = 7.2 ± 7.1 мкМ. Данное различие в способности связываться с мицеллой детергента хорошо коррелирует с различной цитотоксичностью ЦТ I и ЦТ II [4], а так же их воздействием на структуру и динамику липидного бислоя [5], и данными молекулярного моделирования [90]. Следует заметить, что константа связывания белка с детергентной мицеллой kмиц. может быть пересчитана в константу связывания с липидным бислоем kбисл. следующим образом: kбисл. =

1 M0 kмиц.

(3.52)

Подставляя сюда константу связывания цитотоксина II с мицеллой ДФХ, получаем ожидаемую константу связывания с липидным бислоем 2.3 × 103 М−1 . С учетом низкой точности определения константы данным методом, данное значение близко к константе связывания спин-меченого ЦТ II с липидным бислоем 8 ± 3 × 103 М−1 (см. конец § 4 стр. 79 и [2]).

73

§ 4.

Связывание спин-меченого ЦТ II с модельной липидной мембраной

4.1.

Материалы и методы

Получение спин-меченого ЦТ II Спин-меченый по боковой цепи Lys35 аналог ЦТ II (СМЦТ II) получали следующим образом [1]. Для селективного введения спиновых меток на аминогруппы ЦТ II использовали N -оксисукцинимидный эфир 2, 2, 5, 5-тетраметилпирролин-N -оксил-3-карбоновой кислоты, при этом для преимущественного образования мономеченных производных мольное соотношение токсин/реагент составляло 1:1.8. Разделение полученных производных производили ионообменной хроматографией на колонке Spherogel TSK CM-2SW. Фракцию 3, очищенную до гомогенного состояния с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии использовали в дальнейших исследованиях. Для установления положения метки данное спин-меченое производное после пиридилэтилирования и выделения продукта обращенно-фазовой хроматографией подвергали триптическому гидролизу. Анализ продуктов гидролиза методом MALDI-масс-спектрометрии обнаружил продукт с молекулярной массой 1649, соответствующий фрагменту 24–36, содержащему спиновую метку. Отсутствие расщепления после Lys35 свидетельствует о присоединении к нему спиновой метки. Следует отметить, что ацетилирование аналогичного остатка лизина в гомологичном токсине γ кобры Naja nigricollis приводило к незначительному уменьшению его биологической активности [91]. Для сохранности спиновой метки СМЦТ II хранили в замороженном водном растворе при −70 ◦ C. Приготовление липосом Моноламеллярные липосомы диаметром 100 нм состава яичный фосфатидилхолин (ЯФХ)/димиристоилфосфатидилглицерин (ДМФГ) (в соотношении 9:1 моль/моль) готовили следующим образом. Смесь фосфолипидов в требуемой пропорции в виде раствора в хлороформе упаривали досуха на роторном испарителе и остаток растворителя удаляли под вакуумом. После этого добавляли 25 мМоль ацетатный буфер pH 5.5.

74

Полученную встряхиванием липидную дисперсию подвергали не менее 10 циклам замораживания – оттаивания с использованием жидкого азота и образовавшуюся взвесь 11 раз продавливали через поликарбонатный фильтр (Липософаст) с диаметром пор 100 нм, после чего к полученному образцу добавляли EDTA. Регистрация кривой связывания Раствор ЯФХ/ДМФГ липосом, суммарная концентрация липида 0.6 мМоль в 25 мМоль ацетатном буфере pH 5.5, содержащий 1 мМоль EDTA помещали в кювету ЭПР-спектрометра (объем 200 мл). Затем в кювету добавляли порциями по 3 мл раствор 0.1 мМоль СМЦТ II, перемешивали и снимали спектр ЭПР, добавляли новую порцию СМЦТ II и т.д. Референсные ЭПР спектры, соответствующие свободному и мембраносвязанному состоянию цитотоксина, регистрировали в следующих условиях: спектр 50 мкМоль СМЦТ II (рис. 12(а)) был получен в 25 мМоль ацетатном буфере pH 5.5. Спектр 20 мкМоль СМЦТ II в присутствии 2 мМоль ЯФХ/ДМФГ (токсин полностью связан с липосомами, рис. 12(б)), записан в отсутствие ионов. Спектры ЭПР регистрировали при комнатной температуре (∼ 18 ◦ C) на спектрометре Varian E-109, рабочая частота 9.5 ГГц (Х-диапазон), с использованием прямоугольного резонатора E-248. Запись спектров производили при следующих значениях параметров: диапазон сканирования 3310 − 3410 Гс, частота модуляции 100 кГц, мощность СВЧ-поля 15 мВт, время сканирования 8 мин, постоянная времени 1 с. Спектры ЭПР оцифровывали с разрешением 1024 точки на спектр, производили сглаживание шумов, коррекцию базовой линии и центрирование по положению среднего сигнала сверхтонкого расщепления с целью компенсации дрейфа магнитного поля. Долю свободной и мембраносвязанной фракции СМЦТ II определяли по форме спектра S следующим образом:
−1 P = BT B BT S (4.1) здесь столбцы матрицы B содержат два референсных спектра, нормированных на одинаковое количество спиновой метки, двухкомпонентный

75

вектор P содержит доли свободного и мембраносвязанного СМЦТ II. 4.2.

Модель Гуи-Чапмена

Модель Гуи-Чапмена является наиболее распространенным теоретическим описанием кривых связывания белков с липидным бислоем [92, 93, 94, 95]. Ниже приводится вывод обобщенного уравнения Гуи-Чапмена с целью учета двух факторов: собственного заряда липидного бислоя и различия заряда белка в растворе и на поверхности липида. При связывании заряженного белка с нейтральной или заряженной липидной мембраной существенная роль принадлежит электростатическим взаимодействиям. Связавшись с мембраной, белок изменяет ее заряд, добавляя к заряду липида свой собственный. Таким образом, связывание белка с мембраной существенно зависит от потенциала мембраны и ее собственного заряда. Гуи и Чапмен предложили уравнение, которое связывает электрический потенциал мембраны Ψ с плотностью заряда на поверхности мембраны σ. Потенциал зависит от концентрации Cs и зарядов ионов ±zs фонового электролита:   p zs Ψ σ = 80 RT Cs sh (4.2) 2 Ψ0 RT = 25 мв (4.3) Ψ0 = F здесь  = 81 – диэлектрическая проницаемость воды, 0 – электрическая постоянная, R – газовая постоянная, T – температура, F – постоянная Фарадея. Уравнение (4.2), которое можно назвать электростатическим уравнением состояния липидного бислоя, выведено в предположении, что мембрана является бесконечной равномерно заряженной плоскостью и не содержит допущения о малости потенциала мембраны Ψ по сравнению с Ψ0 . Наличие у мембраны электростатического потенциала вызывает отталкивание одноименно заряженных частиц от поверхности мембраны и притяжение к ней частиц противоположного знака. Для белка, концентрация которого на большом удалении от мембраны равна CP f , а заряд в растворе равен zP S , концентрация непосредственно над поверхностью

76

мембраны CP (0) будет составлять: 

Ψ CP (0) = CP f exp −zP S Ψ0

 (4.4)

Обычно концентрация белка много меньше концентрации соли, и влиянием заряда белка на ионную силу раствора можно пренебречь. Физический смысл заряда zP S это работа против электростатических сил, которая должна быть совершена для переноса молекулы белка из раствора на поверхность мембраны, деленная на электростатический потенциал мембраны. Связываться с мембраной может только тот белок, который находится непосредственно над ее поверхностью. При этом для малой степени связывания белка с мембраной r можно пользоваться простейшим соотношением в виде прямой пропорциональности (связывание с константой K) [93]: r CP (0) = (4.5) βK Отметим, что уравнение (4.5) не применимо если имеет место олигомеризация белка на поверхности мембраны. Константа K, имеющая размерность Моль−1 , представляет собой константу связывания белка с мембраной, которая наблюдалась бы в отсутствие электростатического взаимодействия между белком и липидной мембраной. Параметр β есть доля липидной поверхности, доступной белку для связывания. Для больших моноламеллярных липосом, не проницаемых для связывающегося белка, β = 0.5, так как белок может связываться только с внешней поверхностью бислоя. Для вывода уравнения кривой связывания необходимо учесть изменение заряда мембраны при связывании с ней заряженного белка:   e rzP M σ= zL + (4.6) AL β здесь e – элементарный заряд, AL – площадь, занимаемая одной молекулой липида на поверхности мембраны (AL = 68  A2 [93,53]), zL – средний заряд одной молекулы липида, zP M – заряд белка на поверхности мембраны. Физический смысл заряда zP M – это изменение суммарного заряда мембраны при связывании одной молекулы белка. Подчеркнем, что

77

при выводе уравнения кривой связывания мы не предполагаем равенство зарядов белка в растворе zP S и на поверхности мембраны zP M . Уравнения (4.2–4.6) могут быть решены в явном виде. Для этого из них необходимо исключить параметры Ψ, σ и CP (0). В результате получим уравнение, которое опишет кривую связывания белка с мембраной, то есть зависимость степени связывания белка с мембраной r от его концентрации в растворе CP f . Для этого исключим из уравнений (4.2) и (4.6) плотность заряда мембраны σ:    p  zs Ψ e rzP M zL + = 80 RT Cs sh (4.7) AL β 2 Ψ0 и выразим из полученного уравнения электрический потенциал мембраны Ψ:   Ψ 2 rzP M = arsh b zL + (4.8) Ψ0 zs β где b=

AL

√

e 80 RT Cs

(4.9)

Параметр b является безразмерной характеристикой и обычно известен из свойств липидной мембраны и условий проведения эксперимента. В нашем случае AL = 68  A2,  = 81, T = 291 K и 2.04 b=√ Cs

(4.10)

где для получения правильных численных значений концентрация Cs должна быть выражено в Моль. С учетом уравнений (4.4), (4.5) и (4.8) получим выражение для Cpf :    2zP S rzP M r exp arsh b zL + (4.11) CP f = βK zs β Уравнение (4.11) в сочетании с (4.9) или (4.10) задает кривую связывания белка с липидной мембраной, выведенную в рамках модели ГуиЧапмена. 4.3.

Связывание СМЦТ II с липидной мембраной.

Полученная методом ЭПР кривая связывания СМЦТ II с липидной мембраной, содержащей 10% отрицательно заряженного липида показана

78

14

(в)

(a) (б)

r, ммоль/моль

12 10 8 6 4 2 1

2

3

4

5

6

7

8

9

CPf , мкМ

Рис. 12. Спектры ЭПР спин-меченого аналого ЦТ II (СМЦТ II) в водном растворе (а) и в комплексе с модельной липидной мембраной (б) состава ЯФХ/ДМФГ (9:1). (в) Кривая связывания СМЦТ II с липидной мембраной. Сплошная линия получена регрессией к уравнению Гуи-Чапмена (4.11) с параметрами K = 8 × 103 M−1 , zP S = 3.9 и zP M = 4.4. на рис. 12(в). Анализ кривой связывания проводили в рамках модели ГуиЧапмена (4.11) в предположении равенства (zP S = zP M = zP ) или различия (zP S 6= zP M ) зарядов СМЦТ II в растворе и на поверхности мембраны. В предположении равенства зарядов два неизвестных параметра (заряд zP и константа K) однозначно находятся нелинейной регрессией уравнения (4.11) к экспериментальной кривой связывания. Результат регрессии при условии связывания только с наружной стороной мембраны (β = 0.5) приводит в наших условиях (zL = −0.1, zS = 1, b = 15.2) к следующим значениям параметров: заряд цитотоксина zP = +4.2 ± 0.4 и константа связывания K = (4.5 ± 2) × 103 M−1 . Предположение zP S = zP M лежит в основе традиционного метода анализа кривых связывания с липидной мембраной при помощи модели (4.11) [92,93,94,95]. В то же время, если zP S 6= zP M , то определению эксперимента подлежат оба заряда, что увеличивает количество параметров модели и делает практически невозможным анализ отдельно взятой кривой связывания [2]. Например, кривая связывания рис. 12(в) может быть с одинаковой точностью описана одним из следующих наборов параметров: K = 1 M−1 , zP S = 2.2, zP M = 8.1 или K = 102 M−1 , zP S = 2.4,

79

zP M = 5.8 или K = 104 M−1 , zP S = 3.9, zP M = 3.7 и т.д. практически для любого значения константы связывания K. Таким образом, практически невозможно из одной кривой связывания определить два независимых друг от друга значеня для zP S и zP M . В то же время, сделав определенные предпосылки относительно различия этих зарядов, можно ввести поправку в оценку константы связывания. Хорошо известно, что значения зарядов, полученные в предположении zP S = zP M , всегда оказываются меньше формального заряда белка (формальный заряд равен сумме зарядов всех ионогенных групп белка). В частности, формальный заряд СМЦТ II (за вычетом заряда Lys35, замещенного спиновой меткой) должен составлять +9 единиц. Причины такого различия связаны с экранированием заряда белка ионами фонового электролита и конечным размером белковой молекулы, которая не всегда хорошо приближается одиночным точечным зарядом. Условия экранирования зарядов отличаются в водном растворе и на поверхности липидной мембраны. При связывании с липидной мембраной одни боковые цепи могут оказаться вблизи ее поверхности, другие будут удалены от нее и, следовательно, в меньшей степени будут влиять на потенциал мембраны Ψ, что является одной из причин, приводящих к различию зарядов zP S и zP M . Другая причина может заключаться в различном значении pKa боковых цепей ионогенных остатков белка. В частности в молекуле ЦТ II присутствует единственная ионогенная группа, титрующаяся в районе pH 5.5, а именно имидазольное кольцо остатка His31. Показано [56], что для раствора ЦТ II в воде pKa остатка His31 составляет 5.15, в то время как при связывании ЦТ II с мицеллами ДФХ значение pKa возрастает до 5.75. Предположим, что такое же изменение остатка His31 будет наблюдаться и при переходе спин-меченого аналога цитотоксина СМЦТ II из водной фазы на поверхность липосом. Тогда в наших условиях (ацетатный буфер pH 5.5) эффективный заряд остатка His31 при переходе СМЦТ II из водного окружения на поверхность липосом должен увеличиться на 0.5 единицы. Полагая в уравнении (4.11) zP M = zP S + 0.5, получим после нелинейной регрессии к данным рис. 12(в) значение константы связывания K = (8 ± 3) × 103 M−1 и значения зарядов белка zP S = 3.9 ± 0.3 и zP M = 4.4 ± 0.3.

80

Полученное значение константы связывания близко к значению константы связывания первой молекулы ЦТ II с мицеллой ДФХ K = 2.3 × 103 М−1 , которое было получено ранее в конце § 3 (стр. 72). Из значения константы K = (8 ± 3) × 103 M−1 следует оценка изменения свободной энергии связывания СМЦТ II с липидной мембраной ∆G = −RT ln 55.5K − 12 ккал/моль = −19.5 ± 0.5 ккал/моль. Близкое значение свободной энергии ∆G = −15 ккал/моль было получено при анализе связывания ЦТ II с липидной мембраной методом молекулярного моделирования [90].

81

Заключение

В первой части настоящей работы всесторонне изучена структура ЦТ I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение. Во второй петле цитотоксина обнаружена прочно связанная долгоживущая молекула воды, которая стабилизирует структуру петли II цитотоксина при помощи четырех водородных связей. Подобная структура второй петли характерна для большинства изученных цитотоксинов. Отличительной особенностью ЦТ I является «потеря» связанной воды при переходе в липидное окружение мицеллы ДФХ. Это является первым отличием от изученной ранее структуры ЦТ II [55, 56]. Данное различие связано с уникальным для ЦТ I остатком Asp29, который изменяет свою конформацию, чтобы избежать неблагоприятного контакта с гидрофобным окружением мицеллы. Неожиданным для данного цитотоксина является его связывание с мицеллой всеми тремя функциональными петлями, так как предварительные расчеты методом Монте-Карло предсказывали связывание только одной петлей цитотоксина [90]. Данное расхождение было связано с тем, что в моделировании использовалась структура цитотоксина I из яда Naja atra, полученная без учета молекулы связанной воды во второй петле. Моделирование связывания с мембраной с использованием структуры ЦТ I (PDB код 1RL5) показало [5], что ЦТ I связывается с мембраной всеми тремя петлями, хотя и с меньшим значением свободной энергии. Анализ ионогенных групп цитотоксина I, проведенный во второй части данной работы, находится в согласии с полученными структурными данными. Остатки аспарагиновых кислот Asp40 и Asp57 присутствуют во всех цитотоксинах и стабилизируют структуру водородными связями и благоприятными электростатическими взаимодействиями. Остаток Asp29 уникален для ЦТ I. Под его влиянием структура второй петли претерпевает сильные конформационные изменения при связывании с мицеллой ДФХ. По-видимому, именно Asp29 ответственен за то,

82

что константа связывания ЦТ I с мицеллой ДФХ на порядок меньше константы связывания ЦТ II, как установлено в третьем разделе данной представленной работы. Это второе обнаруженное отличие от цитотоксина II, которое так же проявляет себя в меньшей цитотоксичности ЦТ I по отношению к различным группам клеток [4]. Заряженный остаток Glu16 так же отличает ЦТ I от ЦТ II, однако присутствует во многих других аминокислотных последовательностях цитотоксинов, например, в цитотоксине A5 из Naja atra, который способен связываться с αVβ3 интегрином. Здесь можно выдвинуть гипотезу, что аминокислотная последовательность EGK (Glu-Gly-Lys), которая присутствует во всех цитотоксинах, содержащих остаток Glu16, является «перевернутым» RGD-мотивом, который не был обнаружен в интегринсвязывающем цитотоксине A5. Данная гипотеза требует дополнительной теоретической и экспериментальной проверки. Метод анализа трансляционной диффузии и химического сдвига белков, разработанный в третьей части настоящей работы, является довольно сложным математическим построением. Метод учитывает сразу три явления, которые раньше никогда не рассматривались одновременно: эффект вытесненного объема, изменение размера мицеллы и изменение константы связывания белка с мицеллой. Наградой за сложность модели является не только хорошее согласие измеренных параметров с экспериментом (см. рис. 11), но и разумные значения свободных параметров модели. В частности, полученное значение константы связывания цитотоксина II с мицеллой хорошо согласуется с константой связывания токсина с липидным бислоем, измеренной в четвертой части работы. Параметр модели p > 2.5 говорит об антикооперативности связывания молекул обоих токсинов с мицеллой детергента, что опровергает гипотезу формирование комплексов из нескольких молекул цитотоксина в мицелле, по крайней мере для ЦТ I и ЦТ II Naja oxiana. Параметр ∆M характеризует вытеснение детергента связавшимся токсином и при определенных оговорках может служить мерой погруженности белка в мицеллярное окружение. Таким образом методическая часть настоящей работы эффективно дополняет проведенные структурные исследования.

83

Выводы 1. Методом ЯМР высокого разрешения рассчитана пространственная структура цитотоксина I Naja oxiana в двух средах: в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Структуры депонированы в Банк Белковых Структур (PDB) с кодом 1RL5 (в водном растворе) и 1ZAD (в комплексе с мицеллой ДФХ). 2. Показано наличие связанной воды в петле II цитотоксина в водном растворе и ее отсутствие в комплексе с мицеллой ДФХ. Установлено значительное изменение конформации функционально важной петли II при переходе цитотоксина из водного раствора в липидное окружение. 3. Изучены рН-зависимости химических сдвигов цитотоксина I. Показано, что наблюдаемые изменения химических сдвигов и констант pKa , а так же их изменение при переходе из раствора в мицеллу находятся в согласии с полученными пространственными структурами, системой водородных связей и принятой моделью расположения цитотоксина на поверхности липидной мембраны. 4. Предложена математическая модель для описания химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой. 5. На примере цитотоксинов I и II Naja oxiana показано, что совместный анализ химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии позволяет оценить кооперативность/антикооперативность связывания белка с мицеллой, эффект вытеснения детергента из мицеллы и ожидаемую константу связывания белка с липидной мембраной. 6. При помощи спин-меченого аналога цитотоксина II Naja oxiana изучено связывание цитотоксина с липидной мембраной. Оценены значения эффективного заряда и константы связывания цитотоксина с мембраной. Последняя величина находится в согласии с константой, полученной при анализе связывания белка с мицеллой детергента. 7. На примере двух цитотоксинов из яда Naja oxiana продемонстрирована связь структуры и функции для данного класса белков.

84

Список иллюстраций

1 2

Структуры семейства трехпетлевых белков . . . . . . . . . Аминокислотные последовательности цитотоксинов . . . .

12 16

3 4 5 6 7 8 9 10 11

Спектры ЯМР ЦТ I в водном растворе. . . . . . . . . . . . Разница химических сдвигов и аттеньюация сигналов ЦТ I Данные по дейтерообмену и d-связям ЦТ I . . . . . . . . . Структура ЦТ I в воде и в комплексе с ДФХ . . . . . . . Динамика связанной воды во второй петле ЦТ I . . . . . . Стереоизображение структуры петли II ЦТ I . . . . . . . . Связывание белка с мицеллой . . . . . . . . . . . . . . . . Модель A для хим. сдвига и диффузии белка . . . . . . . Наилучшие модели для хим. сдвига и диффузии цитотоксинов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Спектры ЭПР и кривая связывания СМЦТ II с мембраной

26 27 29 32 38 40 46 59

12

71 78

85

Список таблиц

1 2 3 4 5 6 7

Входные данные для расчета структуры . . . . . . . Характеристика структур ЦТ I и ЦТ I/ДФХ . . . . Таблица химических сдвигов основной формы ЦТ I Таблица химических сдвигов ЦТ I/ДФХ . . . . . . Значения pKa боковых цепей ЦТ I . . . . . . . . . . Химический сдвиг и трансляционная диффузия ЦТ Химический сдвиг и трансляционная диффузия ЦТ

. . . . . . . . . . I . II

. . . . . . .

. . . . . . .

30 31 33 35 42 66 68

86

Список используемых сокращений

ЯМР ЭПР ЯЭО NOESY ROESY

— — — — —

TOCSY — COSY СКО м.д. PDB

— — — —

ЦТ I ЦТ II СМЦТ II ДФХ ДФХ-д38 5-ДС 16-ДС ЯФХ ДМФГ

— — — — — — — — —

Ядерный магнитрый резонанс Электронный парамагнитрый резонанс Ядерный эффект оверхаузера Двумерная спектроскопия ЯЭО Двумерная спектроскопия ЯЭО во вращающейся системе координат Тотальная корреляционная спектроскопия (TOtal Cоrrelation SpectroscopY) Корреляционная спектроскопия Среднеквадратичное отклонение Миллионная доля, единица измерения химического сдвига Брукхэйвенский банк белковых структур (Protein Data Bank) Цитотоксин I из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana Цитотоксин II из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana Спин-меченый по Lys35 аналог цитотоксина II Додецилфосфатидилхолин, цвиттерионный детергент ДФХ, со всеми атомами 1 H, замененными на 2 H 5–доксилстеариновая кислота, липидная спиновая метка 16–доксилстеариновая кислота Яичный фосфатидилхолин Димиристоилфосфатидилглицерин

87

Литература

1.

Ю.Н. Уткин, П.В. Дубовский, М.А. Дубинный, В.А. Жаравин, Т.Н. Симонова, Л.И. Барсуков, А.С. Арсеньев, Спин-меченый по lys35 цитотоксин II из яда кобры Naja oxiana для исследования его взаимодействия с фосфолипидными мембранами методом ЭПР, Биоорган. химия 25 (12) (1999) 930–932.

2. М.А. Дубинный, П.В. Дубовский, Ю.Н. Уткин, Т.Н. Симонова, Л.И. Барсуков, А.С. Арсеньев, Изучение методом ЭПР взаимодействия цитотоксина II из яда кобры Naja oxiana с фосфолипидными мембранами, Биоорган. химия 27 (2) (2001) 102–113. 3. P.V. Dubovskii, D.M. Lesovoy, M.A. Dubinnyi, Y.N. Utkin, A.S. Arseniev, Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes., Eur J Biochem 270 (9) (2003) 2038–2046. 4. А.В. Феофанов, Г.В. Шаронов, М.А. Дубинный, М.В. Астапова, И.А. Куделина, П.В. Дубовский, Д.И. Родионов, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев, Сравнительное исследование структуры и активности цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja kaouthia и Naja haje, Биохимия 69 (10) (2004) 1410–1421. 5. P.V. Dubovskii, D.M. Lesovoy, M.A. Dubinnyi, A.G. Konshina, Y.N. Utkin, R.G. Efremov, A.S. Arseniev, Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: comparison of S- and P-type cytotoxins., Biochem J 387(Pt 3) (2005) 807–815. 6. M.A. Dubinnyi, D.M. Lesovoy, P.V. Dubovskii, V.V. Chupin, A.S. Arseniev, Modeling of 31 P-NMR spectra of magnetically oriented phospholipid liposomes: A new analytical solution., Solid State Nucl Magn Reson. 29 (4) (2006) 305–311. 7. M.A. Dubinnyi, P.V. Dubovskii, Y.N. Utkin, T.N. Simonova, L.I. Barsukov, A.S. Arseniev, EPR study of the interaction of

88

cytotoxin II from naja oxiana with phospholipid membranes, in: Open Russian-Swedish Conference «NMR in Protein-Protein and ProteinDNA Recognition», Moscow, Russia, 2000, p. 34. 8. М.А. Дубинный, П.В. Дубовский, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев, Механизм рН-зависимой активации цитотоксина II из яда кобры naja oxiana. X юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине и экологии, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2002, pp. 373–375. 9. М.А. Дубинный, П.В. Дубовский, Ю.Н. Уткин, Н.П. Сырцев, А.С. Арсеньев, Анализ структуры комплекса белок-мицелла методом липидных спиновых меток: новый количественный подход на примере цитотоксина II. VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Россия, Москва-Пущино, 2002, pp. 54–55. 10. Д.М. Лесовой, М.А. Дубинный, П.В. Дубовский, Анализ 31 Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий с помощью программы P-FIT. ХVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005, p. 69. 11. R. M. Kini, Molecular moulds with multiple missions: functional sites in three-finger toxins., Clin Exp Pharmacol Physiol 29 (9) (2002) 815– 822. 12. V. Tsetlin, Snake venom alpha-neurotoxins and other ’three-finger’ proteins., Eur J Biochem. 264 (2) (1999) 281–286. 13. J. P. Changeux, The tiPS lecture. the nicotinic acetylcholine receptor: an allosteric protein prototype of ligand-gated ion channels., Trends Pharmacol Sci. 11 (12) (1990) 485–492. 14. G. A. Grant, V. A. Chiappinelli, kappa-bungarotoxin: complete amino acid sequence of a neuronal nicotinic receptor probe., Biochemistry. 24 (6) (1985) 1532–1537. 15. J. Eastman, E. J. Wilson, C. Cervenansky, T. L. Rosenberry, Fasciculin 2 binds to the peripheral site on acetylcholinesterase and inhibits

89

substrate hydrolysis by slowing a step involving proton transfer during enzyme acylation., J Biol Chem. 270 (34) (1995) 19694–19701. 16. M. H. le Du, P. Marchot, P. E. Bougis, J. C. Fontecilla-Camps, 1.9-A resolution structure of fasciculin 1, an anti-acetylcholinesterase toxin from green mamba snake venom., J Biol Chem. 267 (31) (1992) 22122– 22130. 17. J. R. de Weille, H. Schweitz, P. Maes, A. Tartar, M. Lazdunski, Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel., Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (6) (1991) 2437–2440. 18. J. P. Albrand, M. J. Blackledge, F. Pascaud, M. Hollecker, D. Marion, NMR and restrained molecular dynamics study of the three-dimensional solution structure of toxin FS2, a specific blocker of the L-type calcium channel, isolated from black mamba venom., Biochemistry. 34 (17) (1995) 5923–5937. 19. M. J. Dufton, R. C. Hider, Structure and pharmacology of elapid cytotoxins., Pharmacol Ther 36 (1) (1988) 1–40. 20. T. K. Kumar, G. Jayaraman, C. S. Lee, A. I. Arunkumar, T. Sivaraman, D. Samuel, C. Yu, Snake venom cardiotoxins-structure, dynamics, function and folding., J Biomol Struct Dyn 15 (3) (1997) 431–463. 21. T. Kumar, S. Pandian, G. Jayaraman, H.-J. Peng, C. Yu, Understanding the structure, function and folding of cobra toxins, Proc. Nat. Sci. Counc. (ROC) A 23 (1) (1999) 1–19. 22. R. S. McDowell, M. S. Dennis, A. Louie, M. Shuster, M. G. Mulkerrin, R. A. Lazarus, Mambin, a potent glycoprotein IIb-IIIa antagonist and platelet aggregation inhibitor structurally related to the short neurotoxins., Biochemistry. 31 (20) (1992) 4766–4772. 23. S. Antil-Delbeke, C. Gaillard, T. Tamiya, P. J. Corringer, J. P. Changeux, D. Servent, A. M´enez, Molecular determinants by which a long chain toxin from snake venom interacts with the neuronal alpha 7-nicotinic acetylcholine receptor., J Biol Chem. 275 (38) (2000) 29594– 29601.

90

24. A. Samson, T. Scherf, M. Eisenstein, J. Chill, J. Anglister, The mechanism for acetylcholine receptor inhibition by alpha-neurotoxins and species-specific resistance to alpha-bungarotoxin revealed by NMR., Neuron. 35 (2) (2002) 319–332. 25. L. Pillet, O. Tr´emeau, F. Ducancel, P. Drevet, S. Zinn-Justin, S. Pinkasfeld, J. C. Boulain, A. M´enez, Genetic engineering of snake toxins. role of invariant residues in the structural and functional properties of a curaremimetic toxin, as probed by site-directed mutagenesis., J Biol Chem. 268 (2) (1993) 909–916. 26. O. Tr´emeau, C. Lemaire, P. Drevet, S. Pinkasfeld, F. Ducancel, J. C. Boulain, A. M´enez, Genetic engineering of snake toxins. the functional site of erabutoxin a, as delineated by site-directed mutagenesis, includes variant residues., J Biol Chem. 270 (16) (1995) 9362–9369. 27. E. Karlsson, M. Jolkkonen, E. Mulugeta, P. Onali, A. Adem, Snake toxins with high selectivity for subtypes of muscarinic acetylcholine receptors., Biochimie. 82(9-10) (2000) 793–806. 28. Y. Bourne, P. Taylor, P. Marchot, Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: crystal structure of the complex., Cell 83 (3) (1995) 503– 512. 29. S.-O. Ranaei-Siadat, G.-H. Riazi, M. Sadeghi, L.-S. Chang, S.-R. Lin, P. Eghtesadi-Araghi, G. H. Hakimelahi, A. A. Moosavi-Movahedi, Modification of substrate inhibition of synaptosomal acetylcholinesterase by cardiotoxins., J Biochem Mol Biol 37 (3) (2004) 330–338. 30. P. Marchot, C. N. Prowse, J. Kanter, S. Camp, E. J. Ackermann, Z. Radic, P. E. Bougis, P. Taylor, Expression and activity of mutants of fasciculin, a peptidic acetylcholinesterase inhibitor from mamba venom., J Biol Chem. 272 (6) (1997) 3502–3510. 31. O. Yasuda, S. Morimoto, B. Jiang, H. Kuroda, T. Kimura, S. Sakakibara, K. Fukuo, S. Chen, M. Tamatani, T. Ogihara, FS2. a mamba venom toxin, is a specific blocker of the L-type calcium channels., Artery. 21 (5) (1994) 287–302.

91

32. R. M. Kini, R. A. Caldwell, Q. Y. Wu, C. M. Baumgarten, J. J. Feher, H. J. Evans, Flanking proline residues identify the L-type ca2+ channel binding site of calciseptine and FS2., Biochemistry. 37 (25) (1998) 9058–9063. 33. O. Yasuda, S. Morimoto, Y. Chen, B. Jiang, T. Kimura, S. Sakakibara, E. Koh, K. Fukuo, S. Kitano, T. Ogihara, Calciseptine binding to a 1,4-dihydropyridine recognition site of the L-type calcium channel of rat synaptosomal membranes., Biochem Biophys Res Commun. 194 (2) (1993) 587–594. 34. K. J. Schleifer, Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2., J Comput Aided Mol Des. 11 (5) (1997) 491–501. 35. M. J. Sutcliffe, M. Jaseja, E. I. Hyde, X. Lu, J. A. Williams, Threedimensional structure of the RGD-containing neurotoxin homologue dendroaspin., Nat Struct Biol. 1 (11) (1994) 802–807. 36. J.-P. Xiong, T. Stehle, R. Zhang, A. Joachimiak, M. Frech, S. L. Goodman, M. A. Arnaout, Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha vbeta3 in complex with an arg-gly-asp ligand., Science. 296 (5565) (2002) 151–155. 37. F. J. Joubert, N. Taljaard, Some properties and the complete primary structures of two reduced and S-carboxymethylated polypeptides (S5 C1 and S5 C10 ) from Dendroaspis jamesoni kaimosae (jameson’s mamba) venom., Biochim Biophys Acta. 579 (1) (1979) 228–233. 38. P.-L. Wu, S.-C. Lee, C.-C. Chuang, S. Mori, N. Akakura, W. Wu, Y. Takada, Non-cytotoxic cobra cardiotoxin A5 binds to alpha(v)beta3 integrin and inhibits bone resorption. identification of cardiotoxins as non-RGD integrin-binding proteins of the ly-6 family., J Biol Chem. 281 (12) (2006) 7937–7945. 39. B. Rees, A. Bilwes, J. P. Samama, D. Moras, Cardiotoxin VII4 from Naja mossambica. the refined crystal structure., J Mol Biol 214 (1) (1990) 281–297.

92

¨ 40. J. F. O’Connell, P. E. Bougis, K. Wuthrich, Determination of the nuclear-magnetic-resonance solution structure of cardiotoxin CTX IIb from Naja mossambica., Eur J Biochem 213 (3) (1993) 891–900. 41. B. Gilquin, C. Roumestand, S. Zinn-Justin, A. M´enez, F. Toma, Refined three-dimensional solution structure of a snake cardiotoxin: analysis of the side-chain organization suggests the existence of a possible phospholipid binding site., Biopolymers 33 (11) (1993) 1659–1675. 42. A. Bilwes, B. Rees, D. Moras, R. M´enez, A. M´enez, X-ray structure at 1.55 A of toxin gamma, a cardiotoxin from Naja nigricollis venom. crystal packing reveals a model for insertion into membranes., J Mol Biol 239 (1) (1994) 122–136. 43. M. Dauplais, J. M. Neumann, S. Pinkasfeld, A. M´enez, C. Roumestand, An NMR study of the interaction of cardiotoxin gamma from Naja nigricollis with perdeuterated dodecylphosphocholine micelles., Eur J Biochem 230 (1) (1995) 213–220. 44. W. Jahnke, D. F. Mierke, L. B´eress, H. Kessler, Structure of cobra cardiotoxin CTX I as derived from nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry calculations., J Mol Biol 240 (5) (1994) 445–458. 45. R. Bhaskaran, C. C. Huang, Y. C. Tsai, G. Jayaraman, D. K. Chang, C. Yu, Cardiotoxin II from taiwan cobra venom, Naja atra. structure in solution and comparison among homologous cardiotoxins., J Biol Chem 269 (38) (1994) 23500–23508. 46. G. Jayaraman, T. Krishnaswamy, S. Kumar, C. Yu, Binding of nucleotide triphosphates to cardiotoxin analogue II from the taiwan cobra venom (Naja atra). elucidation of the structural interactions in the dATPcardiotoxin analogue ii complex., J Biol Chem 274 (25) (1999) 17869– 17875. 47. C. S. Lee, T. K. Kumar, L. Y. Lian, J. W. Cheng, C. Yu, Main-chain dynamics of cardiotoxin II from taiwan cobra (Naja atra) as studied by carbon-13 NMR at natural abundance: delineation of the role of functionally important residues., Biochemistry 37 (1) (1998) 155–164.

93

48. Y.-C. Sun, S.-F. Yang, I.-L. Hwang, T.-H. Wu, A 500-ps molecular dynamics simulation trajectory of cardiotoxin II from taiwan cobra venom in solution: correlation with NMR and X-ray crystallography data, J Comput Chem 20 (5) (1999) 546–562. 49. J. Y. Jang, T. Krishnaswamy, S. Kumar, G. Jayaraman, P. W. Yang, C. Yu, Comparison of the hemolytic activity and solution structures of two snake venom cardiotoxin analogues which only differ in their N-terminal amino acid., Biochemistry 36 (48) (1997) 14635–14641. 50. G. Jayaraman, T. K. Kumar, C. C. Tsai, S. Srisailam, S. H. Chou, C. L. Ho, C. Yu, Elucidation of the solution structure of cardiotoxin analogue V from the taiwan cobra (Naja atra)–identification of structural features important for the lethal action of snake venom cardiotoxins., Protein Sci 9 (4) (2000) 637–646. 51. A. K. Singhal, K. Y. Chien, W. G. Wu, G. S. Rule, Solution structure of cardiotoxin V from Naja atra., Biochemistry 32 (31) (1993) 8036–8044. 52. Y. J. Sun, W. G. Wu, C. M. Chiang, A. Y. Hsin, C. D. Hsiao, Crystal structure of cardiotoxin V from taiwan cobra venom: pH-dependent conformational change and a novel membrane-binding motif identified in the three-finger loops of P-type cardiotoxin., Biochemistry 36 (9) (1997) 2403–2413. 53. C. M. Chiang, K. Y. Chien, H. J. Lin, J. F. Lin, H. C. Yeh, P. L. Ho, W. G. Wu, Conformational change and inactivation of membrane phospholipid-related activity of cardiotoxin V from taiwan cobra venom at acidic pH., Biochemistry 35 (28) (1996) 9167–9176. 54. A. G. Konshina, P. E. Volynskii, A. S. Arseniev, R. G. Efremov, [interaction of cardiotoxin A5 with a membrane: role of conformational heterogeneity and hydrophilic properties], Bioorg Khim 29 (6) (2003) 577–588. 55. D. V. Dementieva, E. V. Bocharov, A. S. Arseniev, Two forms of cytotoxin II (cardiotoxin) from Naja oxiana in aqueous solution: spatial structures with tightly bound water molecules., Eur J Biochem 263 (1) (1999) 152–162.

94

56. P. V. Dubovskii, D. V. Dementieva, E. V. Bocharov, Y. N. Utkin, A. S. Arseniev, Membrane binding motif of the P-type cardiotoxin., J Mol Biol 305 (1) (2001) 137–149. 57. R. Bhaskaran, C. C. Huang, D. K. Chang, C. Yu, Cardiotoxin III from the taiwan cobra (Naja atra). determination of structure in solution and comparison with short neurotoxins., J Mol Biol 235 (4) (1994) 1291–1301. 58. S. C. Sue, H. C. Jarrell, J. R. Brisson, W. G. Wu, Dynamic characterization of the water binding loop in the P-type cardiotoxin: implication for the role of the bound water molecule., Biochemistry 40 (43) (2001) 12782–12794. 59. F. Forouhar, W.-N. Huang, J.-H. Liu, K.-Y. Chien, W. Wu, C.-D. Hsiao, Structural basis of membrane-induced cardiotoxin A3 oligomerization., J Biol Chem 278 (24) (2003) 21980–21988. 60. S.-C. Lee, H.-H. Guan, C.-H. Wang, W.-N. Huang, S.-C. Tjong, C.-J. Chen, W. Wu, Structural basis of citrate-dependent and heparan sulfatemediated cell surface retention of cobra cardiotoxin A3., J Biol Chem 280 (10) (2005) 9567–9577. 61. T.-S. Chen, F.-Y. Chung, S.-C. Tjong, K.-S. Goh, W.-N. Huang, K.-Y. Chien, P.-L. Wu, H.-C. Lin, C.-J. Chen, W.-G. Wu, Structural difference between group I and group II cobra cardiotoxins: X-ray, NMR, and CD analysis of the effect of cis-proline conformation on three-fingered toxins., Biochemistry. 44 (20) (2005) 7414–7426. 62. E. Grishin, A. Sukhikh, T. Adamovich., Y. Ovchinnikov, Isolation, properties and sequence determination of the two cytotoxins from the venom of the middle-asian cobra Naja naja oxiana, Bioorg Khim 2 (8) (1976) 1018–1034. 63. J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. lii Palmer, N. J. Skelton, Experimental 1 H NMR methods, Academic Press, 1996, Ch. 6, pp. 301– 409.

95

64. A. Bax, D. Davis, MLEV-17 based two-dimensional homo-nuclear magnetization transfer spectroscopy, J Magn Reson 65 (1985) 355– 360. ¨ 65. C. Griesinger, G. Otting, K. Wuthrich, R. Ernst, Clean TOCSY for 1 H spin system identification in macromolecules, J Am Chem Soc 110 (23) (1988) 7870–7872. 66. L. Mitschang, J. Keeler, A. Davis, K. Oschkinat, Removal of zeroquantum interference in NOESY spectra of proteins by utilizing the natural inhomogeneity of the radiofrequency field, J Biomol NMR 2 (6) (1992) 545–556. 67. M. Piotto, V. Saudek, V. Sklen`arˇ , Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions., J Biomol NMR 2 (6) (1992) 661–665. 68. V. Sklen`arˇ , M. Piotto, R. Leppik, V. Saudek, Gradient-tailored watersuppression for 1 H–15 N HSQC experiments optimized to retail full sensitivity, J Magn Reson, Series A 102 (2) (1993) 241–245. ¨ ¨ 69. C. Bartels, T. Xia, M. Billeter, P. Guntert, K. Wuthrich, The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules, J Biomol NMR 6 (1) (1995) 1–10. 70. F. Delaglio, S. Grzesiek, G. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer, A. Bax, NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes., J Biomol NMR 6 (3) (1995) 277–293. 71. F. Delaglio, Z. Wu, A. Bax, Measurement of homonuclear proton couplings from regular 2D COSY spectra., J Magn Reson 149 (2) (2001) 276–281. ¨ 72. K. Wuthrich, NMR of proteins and nucleic acids, John Willey & Sons, Inc, 1986. ¨ 73. K. Wuthrich, Sequence-specific resonance assignment in proteins, Ch. 8, in: [72], pp. 130–161. ¨ 74. K. Wuthrich, Polypeptide secondary structures in proteins by NMR, Ch. 9, in: [72], pp. 162–175.

96

¨ 75. G. Otting, K. Wuthrich, Studies of protein hydration in aqueous solution by direct NMR observation of individual protein-bound water molecules, J Am Chem Soc 111 (1989) 1871–1875. ¨ 76. A. Bundi, K. Wuthrich, Use of amide 1 H-NMR titration shifts for studies of polypeptide conformation, Biopolymers 18 (2) (1979) 299– 311. ¨ 77. T. Szyperski, W. Antuch, M. Schick, A. Betz, S. R. Stone, K. Wuthrich, Transient hydrogen bonds identified on the surface of the NMR solution structure of hirudin., Biochemistry 33 (31) (1994) 9303–9310. 78. Ч. Кантор, П. Шиммел, Биофизическая химия. Том II. Методы исследования структуры и функции биополимеров, Мир, Москва, 1985. 79. F. Perrin, The brownien movement of an ellipsoide. - the dielectric dispersion of ellipsoidal molecules., J. Phys. Radium 5 (1934) 497–511. 80. F. Perrin, Brownian movement of an ellipsoid (II). - free rotation and depolarisation of fluourescences. - translation and diffusion of ellipsoidal molecules, J. Phys. Radium 7 (1936) 1–11. 81. J. J. Chou, J. L. Baber, A. Bax, Characterization of phospholipid mixed micelles by translational diffusion., J Biomol NMR. 29 (3) (2004) 299– 308. 82. M. Tokuyama, I. Oppenheim, Dynamics of hard-sphere suspensions., Physical Review. E. 50 (1) (1994) R16–R19. 83. M. Tokuyama, I. Oppenheim, On the theory of concentrated hard-sphere suspensions., Physica A. 261 (1–2) (1995) 85–119. 84. B. J¨onsson, H. Wennerstr¨om, P. G. Nilsson, P. Linse, Self-diffusion of small molecules in colloidal systems, Colloid Polym. Sci. 264 (1) (1986) 77–88. 85. P. Venema, P. Struis, J. Leyte, D. Bedeaux, The effective self-diffusion coefficient of solvent molecules in colloidal crystalls, J. Colloid Interface Sci. 141 (2) (1991) 360–373.

97

86. H. J´ohannesson, B. Halle, Solvent diffusion in ordered macrofluids: A stochastic simulation study of the obstruction effect, J. Chem. Phys. 104 (17) (1996) 6807–6817. 87. C. Ferreira, J. L. L´opez, Asymptotic expansions of the Hurwitz-Lerch zeta function, J. Math. Anal. Appl. 298 (1) (2004) 210–224. P 2kπix 88. M. Lerch, Note sur la fonction R(ω, x, s) = ∞ /(ω + k)s , Acta k=0 e Math. 11 (1887) 19–24. 89. A. S. Altieri, D. P. Hinton, R. A. Byrd, Association of biomolecular systems via pulsed field gradient NMR self-diffusion measurements, J. Am. Chem. Soc. 117 (28) (1995) 7566–7567. 90. R. G. Efremov, P. E. Volynsky, D. E. Nolde, P. V. Dubovskii, A. S. Arseniev, Interaction of cardiotoxins with membranes: a molecular modeling study., Biophys J 83 (1) (2002) 144–153. 91. E. Gatineau, M. Takechi, F. Bouet, P. Mansuelle, H. Rochat, A. L. Harvey, T. Montenay-Garestier, A. M´enez, Delineation of the functional site of a snake venom cardiotoxin: preparation, structure, and function of monoacetylated derivatives., Biochemistry 29 (27) (1990) 6480–6489. 92. G. Beschiaschvili, J. Seelig, Peptide binding to lipid bilayers. binding isotherms and zeta-potential of a cyclic somatostatin analogue., Biochemistry. 29 (49) (1990) 10995–11000. 93. G. Beschiaschvili, J. Seelig, Melittin binding to mixed phosphatidylglycerol/phosphatidylcholine membranes., Biochemistry. 29 (1) (1990) 52–58. 94. J. Seelig, Titration calorimetry of lipid-peptide interactions., Biochim Biophys Acta. 1331 (1) (1997) 103–116. 95. G. Schwarz, G. Beschiaschvili, Thermodynamic and kinetic studies on the association of melittin with a phospholipid bilayer., Biochim Biophys Acta. 979 (1) (1989) 82–90.