Зачем нужны трансгенные животные

БИОЛОГИЯ ЗАЧЕМ НУЖНЫ ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ М. Л. СЕМЕНОВА Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

WHY ARE TRANSGENIC ANIMALS NEEDED M. L. SEMENOVA

Almost 20 years have passed since the publication of an article in the “Nature” which reported on the giant mice born after the rat's gene of growth hormone had been introduced into the zygote. Since then, animals have been created which produce human-like medicinal proteins, others which simulate various human diseases, still others with “knocked-out” genes, the latter serving as a model to study functions of various genes.

© Семенова М.Л., 2001

Почти 20 лет прошло после публикации в “Nature”, где сообщалось о гигантских мышах, рожденных после введения гена гормона роста крысы в зиготу. С тех пор были получены животные, продуцирующие лекарственные белки человека, моделирующие различные заболевания человека, и животные с выключенными генами – модели для исследования функций различных генов.

www.issep.rssi.ru

С давних времен человек методом искусственного отбора создавал сорта культурных растений и породы сельскохозяйственных животных для питания и других хозяйственных нужд. Современные методы генетики и селекции позволили многократно ускорить этот процесс. Селекция проводилась для увеличения продуктивности, плодовитости и урожайности, устойчивости к вредителям и заболеваниям, неблагоприятным условиям среды, для улучшения вкуса, внешнего вида, лежкости плодов и овощей, для повышения содержания белка в зерне, жирномолочности коров и многого другого. Однако основой всех этих работ был собственно геном того вида, который использовался в селекционной работе, и все возможности всегда были ограничены этими рамками. В последние десятилетия XX века был предложен способ перешагнуть через этот барьер и придать культурным растениям и сельскохозяйственным животным свойства и признаки, которыми они не обладали ранее. Этот способ – создание трансгенных организмов. В наши дни трансгенные растения и животные уже перестали быть редкостью. Сегодня границы их использования обсуждаются не только в научной литературе, но и в средствах массовой информации. Эта область биотехнологии так или иначе касается многих сторон жизни современного общества, но в данной статье не будут затронуты социальные, этические или юридические аспекты создания и использования трансгенных животных – это предмет отдельного обсуждения. Здесь будет дан только обзор современного состояния этой области, возможности использования трансгенных животных и перспективы развития этого направления исследований на ближайшие годы. В современной биотехнологии широко используют трансгенные микроорганизмы, в геном которых введены различные гены эукариот. Трансгенные растения несут гены, обеспечивающие повышенную соле- и засухоустойчивость, устойчивость к вредителям и болезням [1]. Но если растения с такими качествами могут быть получены и с помощью методов традиционной селекции, хотя и с большей затратой сил и времени, то трансгенные животные часто являются единственной

С Е М Е Н О В А М . Л . З А Ч Е М Н У Ж Н Ы Т РА Н С Г Е Н Н Ы Е Ж И В О Т Н Ы Е

13

БИОЛОГИЯ надеждой тяжелобольных людей на получение необходимых им лекарств. В ранних работах трансгенными животными называли только тех, которые были получены путем микроинъекции чужеродной ДНК в зиготу и которые несут чужеродный ген в составе своего генома, так как других вариантов создания трансгенов еще не было. Часто в этом значении термин “трансгенные животные” употребляется и сейчас. Однако в последнее время к этой категории относят всех животных, полученных в результате генноинженерных воздействий, в том числе животных, созданных при помощи эмбриональных стволовых клеток, и животных с выключенными генами, так называемых нокаутов. Иногда к трансгенным животным относят и тех, которые были подвергнуты соматической трансфекции, то есть которым чужеродный ген введен был непосредственно в определенный орган или ткань взрослого организма. КАК СОЗДАЮТ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В 1982 году на обложку одного из номеров журнала “Nature” поместили фотографию из статьи Р.Д. Пальмитера с соавторами, опубликованной в том номере. На ней рядом сидят две десятинедельные мыши. Одна из них, полученная после введения в зиготу гена гормона роста крысы, в два раза больше другой, контрольной (их вес 41,2 и 21,2 г). Экспрессия гена крысы привела к тому, что трансгенная мышь стала мышью-гигантом. Это была не первая попытка ввести чужой ген в эмбрион, но именно после публикации той статьи началось создание трансгенных животных, обладающих новыми наследственно заданными свойствами. Особо важное место среди этих исследований сразу же заняли работы по получению трансгенных млекопитающих. Это направление биотехнологии возникло, с одной стороны, на основе бурного развития экспериментальной эмбриологии, а с другой – на основе достижений молекулярной генетики. Еще в 60-е годы XX века были разработаны методы получения ранних эмбрионов мыши, их культивирования in vitro на синтетических средах, методы пересадки этих эмбрионов самкам-реципиентам. Позднее они были адаптированы для многих видов крупных сельскохозяйственных животных. В то же время достижения генной инженерии позволили создавать генные конструкции, состоящие из рекомбинантной ДНК определенного гена и различных управляющих последовательностей, регулирующих его работу. Так, Пальмитер с соавторами вводили в зиготы мыши ген гормона роста крысы, подсоединенный к металлотиониновому промотору. После пересадки эмбрионов приемной матери родились трансгенные мышата нормального размера. После окончания вскармливания материнским молоком эти мышата получали корм с

14

высоким содержанием цинка, который стимулировал работу металлотионинового промотора. Ген крысы активировался, продукция пептидного гормона роста резко увеличивалась, и в возрасте 10 недель трансгенные мыши были в два раза крупнее, чем контрольные. Существуют две основные схемы получения трансгенных животных. Первая из них – микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку – зиготу, разработанная для получения трансгенных мышей, позднее стала применяться и для получения крупных животных – продуцентов лекарственных белков человека: кроликов, коз, овец, коров (рис. 1). Первый этап такой работы – это создание генетической конструкции с заданными свойствами. Так, если исследователь хочет создать трансгенное животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках эпителия молочной железы и его продукт выделяется в молоко, то создается конструкция, содержащая рекомбинантную ДНК трансгена и промотор гена β-казеина – белка, входящего в состав молока. В идеальном случае эта конструкция должна работать только в клетках молочной железы и только во время лактации, не оказывая побочного воздействия на организм трансгенного животного. В настоящее время, когда методы работы с эмбрионами млекопитающих достаточно хорошо разработаны и большой процент эмбрионов выживает и нормально развивается после микроинъекции, именно генетическая конструкция является тем фактором, который определяет, будет ли трансгенное животное иметь желаемые свойства или нет. Генная конструкция в составе бактериального вектора клонируется на культуре бактерий Escherichia coli, выделяется и переводится в линеарную форму, которая лучше встраивается в геном эмбриона, чем кольцевая ДНК. На следующем этапе работы генетическую конструкцию инъецируют в одноклеточный эмбрион – зиготу. В зиготе генетический материал, полученный от отца и матери, находится в двух пузырьках, окруженных ядерной мембраной, – в мужском и женском пронуклеусах. Необходимое количество копий генетической конструкции при помощи микропипетки, закрепленной в держателе микроманипулятора. На рис. 2, а видно, как сильно увеличился пронуклеус после инъекции – почти в два раза по сравнению с интактным. Потом эмбрионы пересаживают самке-реципиенту, многие из них нормально имплантируются и развиваются до рождения. Однако далеко не все животные, родившиеся из инъецированных зигот, несут чужеродный ген. А те, которые все-таки являются трансгенными, обычно оказываются мозаичными по введенному гену, то есть несут его не во всех тканях организма. Так что для получения трансгенных животных большое значение имеет молекулярно-генетический анализ родившегося

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 4 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ

6

1

3

7

4

2 8

5 Рис. 1. Этапы получения трансгенных животных методом инъекции генных конструкций в зиготу: 1 – получение зигот для инъецирования (используются индуцированная гормональными инъекциями суперовуляция или оплодотворение ооцитов в культуре in vitro); 2 – введение генной конструкции (микроинъекция в пронуклеус); 3 – пересадка эмбрионов самкам-реципиентам (реципиентами выбираются животные другой породы, отличающейся по окраске шерсти и другим породным признакам); 4 – животные, рожденные из инъецированных эмбрионов: только часть из них содержит трансген. Кроме того, эти животные, как правило, являются гетерозиготами (трансген содержится только в одной из гомологичных хромосом) и мозаиками (трансген содержится не во всех клетках и тканях животного); 5 – проведение молекулярно-генетического анализа для подтверждения присутствия вводимого гена в составе генома животного; 6 – отбор животных, продуцирующих трансгенные гаметы (скрещивание трансгенных животных с животными другой породы, отличающейся по окраске шерсти и другим породным признакам, и анализ их потомства). Селекция трансгенных гомозигот: скрещивание трансгенных животных для получения гомозиготных по введенному гену потомков; 7 – получение стада трансгенных животных; 8 – выделение лекарственного белка из молока и его очистка

а

б

Рис. 2. Методы трансфекции эмбрионов: микроинъекция генетической конструкции в зиготу кролика (а), введение эмбриональных стволовых клеток в бластоцисту норки (б). Диаметр эмбрионов вместе с оболочками 140–150 мкм. Слева на фотографиях видны микроприсоски – они удерживают эмбрион на месте во время проведения процедуры (фотографии любезно предоставлены Л.Е. Андреевой, руководителем Центра по созданию трансгенных животных Института молекулярной генетики РАН)

потомства. На этом этапе следует получить ответы на три вопроса: первый – встроился ли трансген в геном, второй – несут ли трансген половые клетки, третий – экспрессируется ли чужеродный ген. Лучше всего, когда получен трансгенный самец, половые клетки которого содержат чужеродный ген, в этом случае трансген будет передан его детям. Самца можно скрестить со многими самками, в том числе и при помощи искусственного оплодотворения, и быстро получить многочисленное потомство (поколение F1). Животные F1 будут нести трансген во всех клетках организма, но только в одной из двух гомологичных хромосом, то есть они будут гетерозиготны по введенному гену. Для основания трансгенной линии надо получить поколение F2 , скрещивая животных F1 между собой. Остается последний этап работы – анализ гомозигот из поколения F2 на активность трансгена. На этом этапе определяют, экспрессируется ли трансген и является ли эта экспрессия специфической, то есть идет ли она в тех органах и тканях, где ее и предполагалось получить. Если конструкция несла промотор одного из белков молока и предполагалась экспрессия трансгена в клетках молочной железы, то встает еще один вопрос: выделяется ли трансгенный белок в молоко? Когда наконец в результате долгого и сложного пути получены животные, отвечающие

С Е М Е Н О В А М . Л . З А Ч Е М Н У Ж Н Ы Т РА Н С Г Е Н Н Ы Е Ж И В О Т Н Ы Е

15

БИОЛОГИЯ всем этим требованиям, можно считать, что работа по созданию линии трансгенных животных завершена. Теперь их можно размножать, скрещивая между собой – все их потомки наследуют чужеродный ген. Вторая схема получения трансгенных животных (более новая), по-видимому, получит наибольшее распространение при создании крупных трансгенных животных – это схема с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В отличие от метода микроинъекций в зиготу здесь еще на этапе работы с культурой ЭСК можно проанализировать как встраивание трансгена в геном клетки, так и количество встроившихся копий, а иногда и проверить экспрессию введенного трансгена, что дает возможность выбрать линию ЭСК с наилучшими свойствами. Часть этих клеток можно заморозить в жидком азоте и хранить многие годы для последующего создания трансгенных животных. ЧТО ЖЕ ТАКОЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ? Впервые линия эмбриональных стволовых клеток была получена из бластоцист мыши Эвансом, Кауфманом и Мартином в 1981 году. Эти клетки являются полипотентными, то есть в культуре они могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков. У ЭСК не было обнаружено никаких хромосомных аббераций – они сохраняли нормальный генотип соматических клеток. В 1984 году было показано, что ЭСК, введенные в полость бластоцисты (рис. 2, б ), дают начало любым органам и тканям химерных мышей, включая и линию половых клеток, и наследуются потомками химерного животного. На рис. 3 показаны этапы получения трансгенных мышей при помощи ЭСК. Среди всех этих процедур одна из самых трудоемких – поддержание линии ЭСК в недифференцированном состоянии, пригодном для

создания химерных животных. В настоящее время эту технологию чаще всего используют для получения трансгенных мышей, так как до недавнего времени существовали только линии ЭСК мыши. Однако за последние несколько лет такие клеточные линии были получены из бластоцист многих других млекопитающих. Вот постоянно пополняющийся список этих видов: золотистый хомячок (1988), свинья (1990), овца (1990), корова (1992), кролик (1993), крыса (1994), норка (1992), обезьяна (1995) и даже человек (1994). Так что в ближайшие годы с использованием эмбриональных стволовых клеток могут быть созданы животные различных видов. Эта схема получения трансгенных животные выгодна еще и тем, что в этом случае используются не зиготы, как для микроинъекций, а бластоцисты, которые легко вымываются из половых путей самок крупных

1 3

2

4 5

6 7 8

Рис. 3. Этапы получения трансгенных животных методом реконструкции эмбрионов с использованием эмбриональных стволовых клеток: 1 – получение культуры эмбриональных стволовых клеток (это клетки-потомки клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты). Бластоцисты культивируются на подложке их фибробластов, оседают на дно чашки Петри и распластываются. Клетки ВКМ несколько раз перевиваются, и некоторые из них дают начало линиям эмбриональных стволовых клеток; 2 – введение в эмбриональные стволовые клетки генетической конструкции (кроме управляющих последовательностей и вводимого гена конструкция должна нести ген, дающий возможность провести селекцию трансгенных клеток. Часто для этого используется бактериальный ген Neo – ген устойчивости к антибиотику неомицину, кодирующий неомицинтрансферазу. Немодифицированные клетки животных этого гена не имеют и в среде с неомицином погибают). Далее проводится молекулярно-генетический анализ колоний, происходящих из трансгенных клеток (анализируются встраивание введенного гена в геном клеток, количество копий и некоторые другие параметры); 3 – получение бластоцист для микроинъекции: их получают от животных другой линии, отличающейся по окраске шерсти; 4 – конструирование химерных эмбрионов: трансгенные эмбриональные стволовые клетки вводятся в полость бластоцисты; 5 – трансплантация химерных эмбрионов суррогатной матери; 6 – анализ родившихся животных. Часть их является химерами, то есть в состав их организма входят как клетки, происходящие из бластоцисты (на рисунке указаны белым цветом), так и клетки-потомки трансгенных эмбриональных стволовых клеток (на рисунке черные). Некоторые мыши вообще не содержат трансгенных клеток (на рисунке – полностью белое животное). Для скрещивания отбираются те мыши, у которых процент трансгенных клеток выше (на рисунке – почти полностью черные животные). Лучше, когда выбранное животное является самцом – от него быстро можно получить большое количество потомков; 7 – скрещивание химерных самцов с самками альбиносной линии и анализ их потомства. Так выявляются химерные животные, продуцирующие трансгенные гаметы; 8 – скрещивание мышей поколения F1 животных для получения гомозиготных по введенному гену потомков

16

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 4 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ видов млекопитающих нехирургическим путем. Для всех видов сельскохозяйственных животных разработаны методики длительного хранения эмбрионов на стадии бластоцисты в жидком азоте и методы нехирургической трансплантации их суррогатным матерям. СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ С ВЫКЛЮЧЕННЫМИ ГЕНАМИ – ГЕННЫЙ ТАРГЕТИНГ ЭСК открыли новые возможности для создания животных как с дополнительно введенными генами, так и с выключенными генами. Выключение у животного определенного гена называют генным нокаутом или генным таргетингом. На рис. 4 представлена схема гомологичной транслокации – методики, лежащей в основе генного таргетинга. Нормальный ген в ЭСК заменяется на “сломанную” копию, содержащую вставку – последовательность, кодирующую белок неомицинтрансферазу. В результате такой транслокации в клетке происходят два события: во-первых, из-за вставки сдвигается рамка считывания и белок, который кодирует этим геном, не синтезируется, а во-вторых, экспрессия вставочного гена неомицинтрансферазы делает клетку устойчивой к воздействию неомицина. При проведении нокаута в культуре ЭСК процент клеток с а 1

2

3

4

5

6

7

2

3

4

5

6

7

8

neo

neo

12 3 4 567

2 3 4 5 6 7 8

б 1

2

3

4

5

6

7

2

3

4

5

6

7

8

neo

1

2

3

4

neo

5

6

7

8

Рис. 4. Схема проведения генного таргетинга при помощи гомологичной транслокации (синим цветом показана собственная генетическая последовательность клетки, сиреневым и красным – генетическая последовательность вектора: а – метод вставки – вектор встраивается в нокаутируемый ген, б – метод замены – вектор замещает собой нокаутируемый ген

транслокацией очень низок, но только они выживают в селективной среде, содержащей антибиотик неомицин. ДЛЯ ЧЕГО ИСПОЛЬЗУЮТ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ СЕГОДНЯ Трансгенные животные, несущие чужеродный ген гормона роста. Такие животные отчасти уже история трансгеноза млекопитающих. После получения гигантской трансгенной мыши делались попытки в такой же мере увеличить размеры и более крупных млекопитающих, но эти работы оказались неудачными. Животные с повышенным уровнем продукции гормона роста не увеличились в размерах, но у них наблюдались разнообразные нарушения в росте и строении костей скелета, например акромегалия. По-видимому, запас возможного увеличения размера у сельскохозяйственных животных уже был выбран предшествующей многовековой селекцией, которая велась именно на увеличение роста и веса животного. Однако эти работы сыграли свою роль для изучения функционирования чужеродного гена в организме трансгенного животного и нашли применение в создании быстрорастущих трансгенных рыб. Трансгенные животные – биореакторы. Биореакторами называют организмы, продуценты лекарственных белков. Биореакторами могут быть любые живые организмы – бактерии, грибы, растения, животные – и даже клеточные культуры. У каждого из таких организмов-биореакторов есть достоинства и недостатки. Бактерии, например, легко модифицируются методами генной инженерии, быстро размножаются и их удобно использовать в промышленных биотехнологических установках. Таким методом производят генноинженерный инсулин человека – в настоящее время наиболее качественный из получаемых промышленным способом инсулинов. Однако для нормального функционирования белков человека очень важны те изменения, которые происходят на посттрансляционном уровне: гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, карбоксилирование и некоторые другие преобразования. Большая часть биохимических механизмов, обеспечивающих эти процессы, отсутствует у прокариот, и белки, синтезируемые ими с матриц генов человека, не полностью идентичны белкам из клеток человеческого организма. Другая сложность связана с выделением и очисткой лекарственного белка – бактериальные клетки идут в переработку целиком, и поэтому трудно избавиться от всех посторонних примесей в конечном продукте. Трансгенные дрожжевые культуры и культуры клеток человека не имеют этих недостатков, но продуктивность таких систем в настоящее время ниже, чем та, которая уже получена у экспериментальных трансгенных животных.

С Е М Е Н О В А М . Л . З А Ч Е М Н У Ж Н Ы Т РА Н С Г Е Н Н Ы Е Ж И В О Т Н Ы Е

17

БИОЛОГИЯ Несмотря на активное развитие биотехнологии в последние десятилетия, основным источником многих необходимых фармакологии лекарственных белков человека является донорская кровь. Это факторы свертываемости крови – фибрионоген, антитромбины, альбумин, иммуноглобулины и другие белки, без использования которых трудно представить себе современную медицину. Достаточное количество качественных и дешевых лекарственных белков человека могло бы спасти многих пациентов. Эта задача и легла в основу работ по получению трансгенных животных – продуцентов белков человека. Стратегия этих работ такова: получить трансгенное животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках молочной железы и продукт работы этого гена выделяется в молоко. Тогда получение лекарственного белка сведется к процессу, известному человеку уже много тысяч лет, – к дойке. Хотя мы привыкли к тому, что аппаратами механического доения обычно доят коров, но есть аппараты, дающие возможность подоить козу, овцу, свинью, кролика и даже мышь. Трансгенные животные позволят решить и еще одну проблему – проблему очистки лекарственных белков. Даже если после очистки в препарате останутся примеси, это будут нетоксичные для человека белки молока. Итак, в каком же состоянии находится эта отрасль биотехнологии? Сегодня большая часть животных, выделяющих трансгенные продукты в молоко, – это мыши. Мыши с их коротким сроком беременности и роста – удобный объект для анализа экспрессии введенной генной конструкции, на них отрабатывают те методики, которые потом используют для получения крупных трансгенных животных. Вот далеко не полный список белков человека, уже полученных от трансгенных мышей, и их концентрация в молоке: α1-антитрипсин (мг/мл), интерферон (нг/мл), фактор свертываемости крови IX (мкг/мл), сывороточный альбумин (мг/мл), трофобластин (мкг/мл), урокиназа (мг/мл), интерлейкин-2 (мкг/мл), супероксиддисмутаза (мг/мл), некоторые иммуноглобулины и многие другие белки. Список более крупных трансгенных млекопитающих, выделяющих продукт активности чужеродного белка в молоко, значительно короче: кролики – интерлейкин-2 (нг/мл) и тканевый активатор плазминогена (мкг/мл), овцы – α1-антитрипсин (мг/мл) и фактор свертываемости крови IX (нг/мл), козы – тканевый активатор плазминогена (мкг/мл). Отсутствие в этом списке коров, наиболее перспективных продуцентов белков человека, объясняется легко. Первые мыши, выделяющие трансгенный белок в молоко, были получены в 1990 году, а все крупные трансгенные животные – в последние пять лет. Для получения же трансгенной коровы нужен более долгий

18

срок. У коров беременность продолжается девять месяцев, половая зрелость наступает в возрасте 15 месяцев, а продуцентами трансгенного белка являются животные поколения F2. То есть от момента микроинъекции генной конструкции в зиготу до получения первого трансгенного молока должно пройти не менее шести лет и появления коров-биореакторов следует ожидать в ближайшие годы. В настоящее время активно ведутся работы по получению животных, продуцентов рекомбинантных иммуноглобулинов человека – они появятся в ближайшие годы, и область их применения почти безгранична. Так какое же количество трансгенных животных необходимо получить, чтобы обеспечить потребность в лекарственных белках человека? Когда пытаются соотнести возможную продукцию белка человека и потребность в нем, то результаты анализа удивляют. Так, для того чтобы обеспечить всю мировую потребность в факторе свертываемости крови IX, нужно получать в год около 85 кг этого белка, а для фактора свертываемости крови VIII это количество и того меньше – около 7 кг. При уровне продукции трансгена в 1 мг на мл молока (а сегодня это вполне реальный уровень) корова, производящая около 6 тыс. л молока в год, может произвести около 6 кг лекарственного белка. Всю потребность в факторе VIII сможет обеспечить одна или две коровыбиореактора, а для получения фактора IX в количестве, достаточном для всех больных гемофилией в мире, необходимо всего лишь маленькое стадо из 15–20 трансгенных коров. Потребность медицины в других белках, получаемых из крови человека, больше. Так, для фибриногена это около 3 т. Такое количество сможет обеспечить стадо в 500 трансгенных коров – одна животноводческая ферма. Создание животных – генетических моделей наследственных заболеваний человека. Многие болезни имеют наследственные причины. И это касается не только моногенных заболеваний, происходящих из-за мутации в каком-нибудь одном определенном гене. Часто причиной заболевания является целый комплекс нарушений генома: присутствие аллелей, определяющих склонность к заболеванию, гиперфункция каких-либо генов из-за наличия дополнительных копий этого гена или нарушений в его регуляции и по многим другим, но генетически предопределенным причинам. К этой группе относятся большая часть заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем, многие эндокринные заболевания. Часто трудно установить конкретную причину заболевания, соотнести обнаруженные у пациента генетические дефекты с его анамнезом. В последние 10 лет для решения этих вопросов все чаще привлекаются трансгенные модели наследственных заболеваний человека. В табл. 1 представлены некоторые широко

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 4 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ Таблица 1. Трансгенные линии мышей, модели наследственных заболеваний человека Заболевание

Болезнь Альцгеймера

Хорея Гентингтона

Болезнь Херстмана– Штрауслера (церебральная атоксия) Болезнь Дауна

Гены, ответственные за заболевание

Причины заболевания

Мыши, несущие Мыши с выклюген человека ченным геном

Поражения центральной нервной системы и психические заболевания 1. APP Мутация гена, кодирующего белок Есть бета-амилоида 2. APOE*4 3. PSEN1 Присутствие аллели APOE*4 на 19-й хромосоме 4. PSEN2 Мутации генов, кодирующих белок пресинилин1 и пресинилина2 HG Удлинение участка CAG повторов, входящих Есть в состав так называемого гена Гентингтона, локализованного на 4-й хромосоме PRP Мутация PRP гена, приводящая к развитию Есть губчатой энцефалопатии по прионовому типу SOD

Гиперфункция гена супероксиддисмутазы из-за трисомии по 21-й хромосоме Сердечно-сосудистые заболевания Характерное нарушение развития – декстрокардия Нарушение механизмов регуляции кровяного давления

Синдром Картагенера ? Гипертония

Ренин Ангиотензиноген Вазопрессин Врадикинин В2 рецептор Эндотелин 1 Атеросклероз и липид- Липопротеин В Нарушения липидного обмена ный обмен Липопротеин Е Липопротеин А Миодистрофия Дюшенна

Mdx (ген белка миодистрофина)

Заболевания опорно-двигательного аппарата Потеря функции гена из-за точечной делеции

Нет

Есть

Нет

Есть

Нет

Есть**

Нет

Есть Есть Есть Нет

Нет Нет Нет Есть

Нет Есть Есть Есть

Есть Есть Есть Есть

Есть

Есть*

* Линия мышей, несущая спонтанную мутацию, ведущую к потере функции гена. ** Трансгенная линия мышей, несущая человеческий EGFR ген (ген рецептора к фактору роста эпидермальных клеток), – высокий уровень его экспрессии приводит к нарушениям сперматогенеза, неподвижности сперматозоидов и нарушениям развития сердца, как и при синдроме Картагенера.

распространенные заболевания, для которых уже созданы модельные трансгенные линии мышей. После того как обнаружен ген, предположительно ответственный за данное заболевание, могут быть созданы два типа модельных животных: мыши с функционирующим трансгеном и мыши с потерей функции данного гена. Первый тип – это классические трансгенные мыши, в геном которых введен ген человека, ответственный за конкретное заболевание. Если предрасположенность к заболеванию зависит от наличия в геноме одного из аллелей, то для проверки этой гипотезы создаются линии трансгенных мышей, несущих разные аллели данного гена. На этих моделях можно исследовать влияние количества копий гена и уровня его экспрессии на проявление заболевания, а также разрабатывать новые методы лечения. Второй тип модельных животных – это мыши, у которых выключен

ген, аналогичный тому, который вызывает данное заболевание у человека. На этой модели исследуют конкретные функции генов, что особенно важно для анализа причин мультигенных заболеваний. Разработка методов генной терапии на основе изучения трансгенных животных. На первый взгляд кажется, что слова “терапия” и “трансгенные технологии” несовместимы. К любому вмешательству в геном человека нужно подходить с гораздо большей осторожностью, чем к вмешательству в геном других видов животных и растений, но существуют ситуации, когда именно такие методы могут спасти больного. Одна из таких ситуаций – раковое заболевание. Надежды на излечения больных от СПИДа также связывают с генной терапией. При этом используется соматическая трансфекция – метод, когда генетические конструкции вводятся в определенные клетки и ткани организма пациента. В

С Е М Е Н О В А М . Л . З А Ч Е М Н У Ж Н Ы Т РА Н С Г Е Н Н Ы Е Ж И В О Т Н Ы Е

19

БИОЛОГИЯ 1999 году был опубликован обзор по этой тематике [2]. А по данным Американской ассоциации здравоохранения за 1999 год только в США до клинических испытаний было допущено около 200 генотерапевтических разработок. Как и все другие методы лечения, генотерапевтические методы разрабатываются и проходят испытания на модельных трансгенных животных. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ При дальнейшем развитии трансгенных технологий возможно появление совершенно новых отраслей их использования. Многие из этих направлений кажутся совершенно фантастическими, однако именно сегодня разрабатываются стратегические подходы для этих направлений исследований и будущие возможности активно обсуждаются в научных изданиях. В основе большей части этих прогнозов – создание трансгенных животных, у которых одни гены нокаутированы, а другие, наоборот, введены в состав генома. Создание таких мультитрансгенных животных и предполагается в ближайшем будущем. Получение модифицированного молока. Первый вариант – создание животных, продуцирующих молоко, по своему составу максимально приближенное к материнскому молоку человека. Для этого надо выключить несколько генов коровы и ввести в ее геном несколько генов человека. При работе с эмбриональными стволовыми клетками это выглядит вполне выполнимым – возможно, первые такие животные появятся через 10–15 лет. Создание трансгенных животных, источников органов для пересадки человеку. Этот кажущийся совсем фантастическим проект по своей сложности примерно такой же, как и предыдущий, но гораздо более актуальный. В мире существует огромная потребность в донорских органах. Многие больные, годами надеющиеся на пересадку почки или сердца, так и не успевают дождаться своей очереди. Решением этой проблемы могла бы быть пересадка человеку органов животных. Так, например, органы свиньи подходят человеку по своему строению, размеру и многим биохимическим показателям. Но такие пересадки невозможны, так как эти органы будут немедленно отторгнуты иммунной системой пациента. Для того чтобы избежать этого, надо сконструировать трансгенную свинью, у которой нокаутированы собственные гены гистосовместимости

20

и вместо них введены гены гистосовместимости человека. Эти гены располагаются компактно в локусах гистосовместимости, и при проведении генного нокаута можно выключить сразу несколько генов. Первые такие животные, скорее всего, тоже будут получены к концу первого десятилетия XXI века. Клонирование трансгенных животных. Создание трансгенных животных – очень трудоемкий процесс. Так, по статистике одно трансгенное животное удается получить на 40 инъецированных зигот мыши, или на 100 зигот овцы или козы, или на 1500 зигот коровы. Из этих трансгенных животных не более 50% экспрессируют трансгенный белок. При получении животных продуцентов белков человека только у некоторых особей уровень экспрессии трансгена в клетках эпителия молочной железы достаточно высок. Возможен и такой вариант – ген экспрессируется, но трансгенный белок по каким-либо причинам не выделяется в молоко. Если даже удается получить трансгенное животное, идеальное по всем параметрам, то его потомки далеко не всегда наследуют его качества. Поэтому большой интерес биотехнологов вызывают работы по клонированию млекопитающих [3]. Эта методика в будущем даст возможность снова и снова клонировать идеальное животное-продуцента и полностью обеспечить потребности медицины и фармакологии в необходимых человеческих белках. Скорее всего, для трансгенных животных будут найдены и другие области применения, но уже сейчас ясно одно: в XXI веке использование трансгенных животных будет столь же распространенной технологией, как использование микроорганизмов в биотехнологических производствах конца XX века. ЛИТЕРАТУРА 1. Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 6. С. 3–8. 2. Баранов В.С. Генная терапия – медицина XXI века // Там же. 1999. № 3. С. 63–68. 3. Корочкин Л.И. Клонирование животных // Там же. № 4. С. 10–16.

Рецензент статьи Л.И. Корочкин *** Мария Львовна Семенова, кандидат биологических наук, доцент кафедры эмбриологии биологического факультета МГУ. Область научных интересов – биология развития млекопитающих, генная терапия. Автор более 40 публикаций.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 4 , 2 0 0 1