Спектрофотометрическое определение аминокислот в водных растворах: Учебное пособие

М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т

С П Е КТР О Ф О ТО М Е ТР И Ч Е С КО Е О П Р Е Д Е Л Е Н И Е А М И Н О КИ С Л О Т В ВО Д Н Ы Х

Р А С ТВ О Р А Х

У чебноепособи епо специ альностям 011000 – Хи ми я, 040500 – Ф армаци я, 011600 - Би ологи я

В оронеж 2004

2 У твержд ено нау чно-метод и чески м советом хи ми ческого ф аку льтета от 20.12.2003, протокол№ 7.

А вторы : К отова Д .Л ., К ры санова Т .А ., Е ли сеева Т .В .

У чебное пособи е под готовлено на каф ед ре анали ти ческой хи ми и хи ми ческого ф аку льтета В оронежского госу д арственного у ни верси тета. Рекоменд у ется д ля сту д ентов 3 ку рса хи ми ческого ф аку льтета, 1 и 2 ку рсов би ологи ческого и ф армацевти ческого ф аку льтета, а также д ля д и пломни ков,

аспи рантов,

нау чны х

сотру д ни ков,

вы д елени ем, разд елени ем и опред елени ем растворах.

зани маю щ и хся

ами ноки слот в вод ны х

3 С одер ж ан и е М етод э лектронной спектроскопи и

4

1.1.

В вед ени ев э лектронну ю спектроскопи ю . Спектры поглощ ени я

4

1.2.

О сновной законсветопоглощ ени я Бу гера – Л амберта – Бера и при чи ны отклонени яот з акона

6

2.

А нали ти чески евоз можности спектроф отометри и при и сслед овани и растворов органи чески х вещ еств

9

3.

А нали з современны х пред ставлени й о стру кту рны х особенностях и при род евзаи мод ей стви й в си стемевод а – ами ноки слота

20

3.1.

Ф и зи ко-хи ми чески ехарактери сти ки ами ноки слот

20

3.2.

О собенности стру кту рны х взаи мод ействи й в си стемевод а – ами ноки слота

27

4.

М етод ы опред елени я, вы д елени яи разд елени я ами ноки слот

30

5.

О собенности спектроф отометри ческого опред елени я ами ноки слот в вод ном растворе

33

6.

В ы боропти мальны х у слови й спектроф отометри ческого опред елени яами ноки слот

36

7.

Л и терату ра

52

1.

4 1. М Е Т ОД Э Л Е К Т Р ОН Н ОЙ С П Е К Т Р ОС К ОП И И 1.1. В ведение в элект ронную спект роскопию. С пектры поглощения Ч асти цы можно охарактери зовать по и х способности поглощ ать и ли и спу скатьи злу чени е. Э та характери сти ка оказалась настолько важной , что в настоящ ее время су щ еству ет разд ел хи ми и , наз ы ваемы й спектральны й (спектрохи ми чески й) анали з. В основе послед него лежи т и зу чени еспектра э лектромагни тного и злу чени я, которое поглощ ается и ли и злу чается анали зи ру емы м вещ еством. Спектральны е метод ы анали за класси ф и ци ру ю тся по характеру взаи мод ействи я э лектромагни тного и злу чени я с вещ еством (э ми сси онны е и абсорбци онны е). А бсорбци онны й анали з, в свою очеред ь, класси ф и ци ру ется, с од ной стороны , по ти пу и спольз у емой области э лектромагни тного и злу чени я (спектроф отометри я в ви д и мой и У Ф - областях, И К -спектроскопи я), с д ру гой – по ти пу поглощ аю щ и х части ц (атомы и молеку лы ). Э лектромагни тноеи злу чени епред ставляет собой ви д э нерги и , которая распространяется с огромной скоростью . Э та э нерги я су щ еству ет в многочи сленны х ф ормах, и з которы х наи более легко распознаю тся свет и тепловое и злу чени е. М енее очеви д но проявлени е рентгеновского, у льтраф и олетового, ми кроволнового и рад и ои злу чени я. Э лектромагни тны м спектром является граф и ческая зави си мость некоторого и з меряемого свойства и з лу чени я как ф у нкци я частоты и злу чени я. И з спектра можно полу чи ть д ва ви д а важной и нф ормаци и . В опервы х, по ви д у спектра можно качественно и д енти ф и ци ровать хи ми чески е части цы . В о-вторы х, по значени ю и з меряемого свойства и злу чени я можно опред ели ть коли чество при су тству ю щ и х хи ми чески х части ц. Э лектромагни тны й спектр охваты вает огромну ю область д ли н волн и ли э нерги й . О сновны е области спектра, и спользу емы е в спектральном анали з е[1]: И нтервал д ли н волн -4 -13 -10 10 … 0,1 нм, и ли 10 … 10 м 10-2 … 10 нм, и ли 10 -11 – 10-8 м -8 -7 10 … 400 нм, и ли 10 … 4 ·10 м -7 -7 400 … 760 нм, и ли 4 ·10 … 7,6 ·10 м 6 -7 -3 760 … 10 нм, и ли 7,6 ·10 … 10 м -3 10 … 1 м λ>1м

У часток спектра γ - и злу чени е Рентгеновскоеи злу чени е У льтраф и олетовоеи злу чени е В и д и мы й свет И нф ракрасноеи злу чени е М и кроволны и ли СВ Ч Рад и оволны

(1 н м = 10-9 м )

Ф отон и меет опред елённу ю э нерги ю и может вы зы вать переход ы межд у квантовы ми э нергети чески ми состояни ями в атомах, молеку лах и

5 д ру ги х хи ми чески х части цах. Ч тобы вы звать такой переход , э нерги я ф отона д олжна бы тьравна разности межд у э нергети чески ми состояни ями , соответству ю щ и ми д анному переход у . Э нергети чески е состояни я раз ны х хи ми чески х части ц отли чаю тся, поэ тому можно ожи д ать, что и зменени я э нерги и , связанны е с переход ами , также бу д у т раз ли чны . Э то з начи т, что спектр кажд ого вещ ества бу д ет строго и нд и ви д у альны м, и его можно и спольз овать д ля и д енти ф и каци и э того вещ ества. Ф акти чески спектр отражает схему возможны х переход ов, которы е и мею т место межд у разли чны ми э нергети чески ми состояни ями хи ми ческой части цы . Е сли и змеряемы й параметр в спектре может бы ть отнесён к чи слу переход ов, спектр может бы ть и спользован д ля опред елени я концентраци и при су тству ю щ и х части ц. Раз д елени е спектра э лектромагни тного и злу чени я на области обу словлено не только тем, что кажд ой области при су щ свой ти п переход а, но и раз ли чи ем спектральной аппарату ры , необход и мой д ля провед ени я соответству ю щ и х и змерени й в кажд ой области . П о э той при чи неспектральны й анали з чрез вы чай но разнообразен и вклю чает несколько метод ов. М олеку лярно-абсорбци онны е метод ы основаны на и змерени и у меньш ени я и нтенси вности э лектромагни тного и злу чени я, прош ед ш его через анали зи ру емое вещ ество. В з ави си мости от области опти ческого д и апазона, способа и з мерени я и ш и ри ны полосы и змеряемого и злу чени я разли чаю т след у ю щ и е молеку лярноабсорбци онны е метод ы : колори метри ю – сравнени е окраски анали зи ру емого и станд артного раствора вещ ества ви з у альны м способом; ф отометри ю – и змерени е и нтенси вности светового потока, прош ед ш его через раствор вещ ества ф отоэ лектри чески м способом; спектроф отометри ю – и змерени е и нтенси вности монохромати ческого (опред елённой д ли ны волны ) светового потока, прош ед ш его через раствор вещ ества ф отоэ лектри чески м способом. В зави си мости от д ли ны волны раз ли чаю т: спектроф отометри ю в у льтраф и олетовой (У Ф ), ви д и мой (В ) и и нф ракрасной (И К ) области спектра. В оз ни кновени е спектров поглощ ени я в У Ф и ви д и мой области спектра объясняется способностью э лектронов на некоторы х орби талях поглощ ать кванты света и переход и ть на более вы соки е э нергети чески е у ровни . П оэ тому часто таки е спектры назы ваю т э лектронны ми . В И К области кванты света поглощ аю т отд ельны е ф у нкци ональны е гру ппы , атомы которы х при э том и зменяю т у ровни свои х колебательны х и вращ ательны х д ви жени й . И К -спектры поэ тому наз ы ваю т молеку лярны ми (колебательны ми и вращ ательны ми ) [2,3]. Свет поглощ ается раствором и зби рательно: при некоторы х д ли нах волн светопоглощ ени е прои сход и т и нтенси вно, а при некоторы х свет не поглощ ается. И нтенси вно поглощ аю тся кванты света, э нерги я которы х (hν) равна э нерги и возбу жд ени я части цы и вероятность и х поглощ ени я больш ену ля. М олярны й коэ ф ф и ци ент поглощ ени я при э ти х частотах (и ли д ли нах волн) д ости гает больш и х з начени й . Распред елени е по частотам (и ли по д ли нам волн) значени й молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени я

6 назы ваетсяспектром поглощ ени я. О бы чно спектр поглощ ени я вы ражаю т в ви д е граф и ческой зави си мости абсорбци онности (А ) и ли молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени я (ε) от частоты (ν) и ли д ли ны волны (λ) пад аю щ его света. Н аи больш и й и нтерес пред ставляю т след у ю щ и е характери сти ки спектра: чи сло макси му мов (и ли полос поглощ ени я) и и х положени е по ш кале д ли н волн (и ли частот); вы сота макси му ма; ф орма полос поглощ ени я. Cпектральны е ли ни и и мею т разли чну ю ф орму и разну ю (и обязательно конечну ю ) ш и ри ну , что обу словлено свойствами самой поглощ аю щ ей си стемы и внеш ни ми у слови ями (температу ра, д авлени е), а также размером вход ной щ ели реги стри ру ю щ его спектрометра. Ш и ри ной щ ели наз ы ваю т ш и ри ну её конту ра при значени и орд и наты , равной ε max/2. П ри чи ной у ш и рени я ли ни и является то, что э нергети чески е у ровни атомны х и молеку лярны х си стем всегд а раз мы ты . Су щ еству ет три при чи ны неопред елённости положени яэ нергети чески х у ровней : 1) ст олкновительное (ударное) или лоренцевское уш ирение. Столкновени е атомов и молеку л вы з ы ваю т д еф ормаци ю э лектронны х оболочек и воз му щ аю т э нергети чески е у ровни , по крайней мере, валентны х э лектронов. Э то у ш и рени е особенно характерно д ляви д и мой и У Ф области спектра; 2) доплеровское уш ирение. В резу льтате теплового д ви жени я и злу чаю щ и х части ц все спектральны е ли ни и и спы ты ваю т д оплеровскоеу ш и рени е; 3) ест ест венное уш ирение. Д аже если бы у д алось абсолю тно и золи ровать атомы и молеку лы при очень ни зки х температу рах, э нергети чески е у ровни всё равно не и мели бы ну левой ш и ри ны . Ш и ри на у ровней и ш и ри на ли ни и “покоящ ейся” атомной и ли молеку лярной си стемы наз ы ваетсяестественной ш и ри ной. Т аки м образом, чем вы ш е молярны й коэ ф ф и ци ент поглощ ени я и меньш е ш и ри на полосы , тем более ценны ми хи ми ко-анали ти чески ми свойствами облад ает соед и нени е, так как э ти характери сти ки опред еляю т пред елобнару жени яи селекти вность[3]. 1.2. О сновной законсвет опоглощения Бугера – Л ам берт а - Бера и причины отклонения от закона О снова спектроф отометри и – закон Бугер а – Л ам бер т а - Бер а – з акон ослаблени я монохромати ческого света при поглощ ени и его слоем вещ ества может бы тьвы ражен в ф орме: I = I0 ⋅10 -ε ⋅ c⋅ l, (1) -ε ⋅ c⋅ l и ли I /I0 = 10 , (2) A =ε⋅ c⋅ l, (3)

7 гд е I0 , I – и нтенси вности света д о и после его прохожд ени я через поглощ аю щ у ю сред у (э ти и нтенси вности сравни ваю т д ля у чета потерь света на отражени еи рассеяни е); ε - коэ ф ф и ци ент поглощ ени я света, зави сящ и й от д ли ны волны и при род ы вещ ества; при с = 1 моль/л и l = 1 см он назы вается м олярны м коэф ф ициентом поглощения (ед и ни цы и змерени я– л/моль⋅см); c – концентраци явещ ества, поглощ аю щ его свет (моль/л); l - толщ и на светопоглощ аю щ его слоя(см); А – абсорбци онность(А= - lg I /I0). А том, и он и ли молеку ла, поглощ ая квант света, переход и т в более вы сокое э нергети ческое состояни е. О бы чно э то – переход с основного (невоз бу жд енного) у ровня на первы й возбу жд енны й э нергети чески й у ровень. В след стви е поглощ ени я и з лу чени я при прохожд ени и его через слой светопоглощ аю щ его вещ ества и нтенси вность и злу чени яу меньш ается и тем больш е, чем вы ш еконцентраци ясветопоглощ аю щ его вещ ества. В соответстви и су равнени ем (3) з ави си мостьопти ческой плотности от концентраци и отображается прямой ли ни ей , вы ход ящ ей и з начала коорд и нат (ри с.1). A

2

1

3

C

Ри с .1. Зави с и м ос т ь абс ор бци о н н ос т и о т кон цен т р аци и поглощаю щего с вет вещес т ва в р ас т вор е пр и с облю ден и и закон а Бугер а – Л ам бер т а Бер а (1), полож и т ельн ы х (2), и о т р и цат ельн ы х (3) о т клон ен и ях от н его Л и нейная з ави си мость соблю д ается не всегд а. П оэ тому , на практи ке з акон Бу гера-Л амберта-Бера необход и мо при менять со след у ю щ и ми ограни чени ями : 1) Законсправед ли в д лясвета строго опред еленной д ли ны волны ; 2) Т емперату ра при и змерени ях д олжна бы тьпостоянной; 3) К оэ ф ф и ци ент поглощ ени я света (ε) зави си т от показ ателя преломлени я сред ы (д ля того, чтобы показатели преломлени я и сслед у емого раствора и чи стого раствори теля оставали сь

8 од и наковы ми , и змерени я след у ет провод и ть в области мало концентри рованны х растворов); 4) Закон вы полняется д ля части ц од ной при род ы (и змерени е след у ет вести в таком и нтервалеконцентраци й , гд езавед омо не может бы ть реакци й д и ссоци аци и , ассоци аци и , ф лу оресценци и и хи ми чески х реакци й сраствори телем); 5) П у чок света д олжен бы тьпараллельны м. Е сли и сслед овани я провод ят с гомогенной и зотропной сред ой (толщ и на светопоглощ аю щ его слоя (l) = const), то зави си мость абсорбци онности от концентраци и отображаетсяпрямой ли ни ей . Значени е тангенса у гла наклона э той прямой равно коэ ф ф и ци енту поглощ ени я света. О тклонени я от прямой возможны и з-за хи ми чески х реакци й, при вод ящ и х к сд ви гу хи ми ческого равновеси я, которы й, в свою очеред ь, вы з ы вает и з менени е концентраци и поглощ аю щ ей ф ормы вещ ества. К при чи нам отклонени я прямой от ли ней ности относи тся рассеяни е поглощ аю щ его вещ ества в объеме объекта, которое наблю д ается при спектроф отометри и би ологи чески х объектов со сложной пространственной стру кту рой. Т ак же отклонени я могу т появляться и з-за при борной ош и бки , вы зы ваемой нели ней ностью з ави си мости тока ф отоэ лементов от и нтенси вности потока света при малы х (менее 0,1) и больш и х (1,5) з начени ях абсорбци онности раствора (э та опасностьреальна в д альней у льтраф и олетовой области 190 - 220 нм, гд е рассеянны й свет вы з ы вает сд ви гмакси му мов поглощ ени я) [3]. У вели чени е ш и ри ны щ ели спектрального при бора при вод и т к пад ени ю опти ческой плотности и показателя светопоглощ ени я в макси му мах спектральны х ли ни й и и х у вели чени ю в ми ни му мах. Э ти и зменени я мало заметны д ля вещ еств с ш и роки ми спектральны ми полосами . Н еобход и мо, чтобы ш и ри на щ ели бы ла меньш е полу ш и ри ны спектральной полосы . Е сли нельзя и з бежать отклонени й от закона Бу гера-Л амберта-Бера, и зменяя у слови я анали за (анали ти ческу ю д ли ну волны , раствори тель, и нтервал концентраци й), то вы би раю т область, гд е зави си мость абсорбци онности от концентраци и ли ней на при бли женно. Н а прак тик е следует помн ить об оптимальн ы х условиях спек трофотометрическ ого определен ия: 1) при опред елени и в растворе од ного светопоглощ аю щ его вещ ества вы би раю т анали ти ческу ю д ли ну волны на макси му меполосы поглощ ени я. Е сли в спектре несколько полос, вы бор останавли ваю т на более и нтенси вной полосе, что обу славли вает вы соку ю чу встви тельность опред елени я. Более пред почти тельны плоски е макси му мы , так как погреш ностьв у становлени и д ли ны волны зд есьми ни мальна. Н еобход и мо

9 у чи ты вать, что чем у же полоса поглощ ени я, тем меньш е ее си мметри я; чем в более коротковолновой области она расположена, тем больш е ее немонохромати чность. 2) опти мальная абсорбци онность составляет при мерно 0,6...0,7 и ли несколько вы ш е. Н аи больш и ми погреш ностями характери з у ется абсорбци онностьрастворов менее0,05 и более1,5; 3) в работе необход и мо и спольз овать кю веты столщ и ной слоя меньш е чем 5 см, что пони зи т потери на рассеяни есвета; 4) превращ ени е опред еляемого компонента в окраш енное соед и нени е опред еляет точностьспектроф отометри ческого анали за. Т аки есоед и нени я полу чаю т в резу льтате реакци й оки слени я - восстановлени я и комплексообразовани я. Е сли оки сли тельно-восстанови тельны е реакци и протекаю т практи чески д о конца, то реакци и комплексообразовани я осложняю т процесс спектроф отометри ческого опред елени я вещ ества. П оэ тому , и спользу я э ти реакци и , ну жно рассчи ты вать, при каки х з начени ях pH и концентраци и реагента бу д ет д ости гну та необход и мая полнота реакци и . 2. АН АЛ И Т И ЧЕ С К И Е ВОЗМ ОЖ Н ОС Т И CП Е К Т Р ОФ ОТ ОМ Е Т Р И И П Р И И С С Л Е Д ОВАН И И Р АС Т ВОР ОВОР Г АН И ЧЕ С К И Х ВЕ Щ Е С Т В К оли чественны й и качественны й анали з - трад и ци онны е области при менени я молеку лярной спектроскопи и . Спектроф отометри я в ви д и мой и У Ф – области спектра является од ни м и з самы х распространенны х метод ов и сслед овани я органи чески х соед и нени й. Д остои нствами метод а являю тся бы строта, незначи тельное коли чество необход и мого вещ ества и его сохранени ев процессеанали за. Качест венны й анализ вещест ва пред полагает, во-первы х, молеку лярны й анали з - обнару жени е в вещ естве опред еленны х молеку л, во-вторы х, стру кту рны й анали з – обнару жени е отд ельны х стру кту рны х ф рагментов и опред елени еи х взаи много расположени я. П оложени е и и нтенси вность полос поглощ ени я вещ ества опред еляется сод ержащ и ми ся в нем хромоф орны ми гру ппами с сопряженны ми кратны ми связями . П оэ тому и д енти ф и каци ю и сслед у емого вещ ества целесообразно провод и ть только при нали чи и в нем хромоф орны х гру пп. Т ак как и нтенси вность полос чу встви тельна к раствори телю , и д енти ф и ци ровать вещ ество по э лектронному спектру можно только в том же раствори теле, в котором полу чен сравни ваемы й спектр. П олосы в э лектронны х спектрах разли чаю тся по и нтенси вности на несколько поряд ков, поэ тому необход и мо и меть в ви д у возможность при су тстви ясветопоглощ аю щ и х при месей. Спектр и сслед у емого соед и нени я сравни ваю т с при вед енны м в ли терату ре спектром д анного соед и нени я и ли с полу ченны м ранее спектром и звестного образца. О тожд ественности э ти х соед и нени й может сви д етельствовать нали чи е всей совоку пности полос поглощ ени я в обои х

10 спектрах ссовпад аю щ и ми сточностью д о 1 нм положени ями макси му мов. У вели чени е и нтенси вности отд ельны х макси му мов может бы ть вы звано при су тстви ем в растворе вещ ества, и мею щ его более протяженну ю цепь сопряженны х связей. П ри су тстви е в вещ естве при месей , не и мею щ и х кратны х связей, проявляется в у меньш ени и показателей поглощ ени я вещ ества в и сслед у емом спектре. Э тот же э ф ф ект наблю д ается, если в молеку ле и меется больш ая по объему и молеку лярной массе гру ппа атомов, не и мею щ и х кратны х связей и не вли яю щ ая на э лектронны е свойства д ру ги х гру пп [4]. С ледоват ельн о, спект роф от ом ет рия позволяет проводит ь идентиф икацию вещества по спект ру в У Ф - и видим ой област и спект ра при наличии в нем сопряж енны х крат ны х связей и рассчит ы ват ьм олекулярную м ассу поглощающего вещест ва. М олярны й показатель поглощ ени я постоянен д ля молеку л, сод ержащ и х кратны е связи , в то время как у д ельны й показ атель поглощ ени я зави си т от молеку лярной массы вещ ества. М ежд у абсорбци онностью , показ ателем поглощ ени я, толщ и ной слоя, концентраци й и молеку лярной массой вещ ества су щ еству ет зави си мость: A = 1000⋅C⋅ε⋅l/ M

(4)

И з э того соотнош ени я можно найти молеку лярну ю массу поглощ аю щ его вещ ества с ош и бкой опред елени я д анной вели чи ны , не превы ш аю щ ей 2 %. Такж е спект роф от ом етрия позволяет сравниват ьэлектронны е спект ры с результатам и квантово-м ех анических расчетов и относитьполосы к той или иной паре м олекулярны х орбит алей . Э то наблю д ается в тех слу чаях, когд а вну три молеку лярны е взаи мод ействи яв больш и х молеку лах, к которы м относятсялекарственны е вещ ества, би ости му ляторы , краси тели и д ру ги е соед и нени я, настолько си льны , что относи ть полосы поглощ ени я к отд ельны м ф у нкци ональны м гру ппам и отожд ествлять и х с опред еленны м ти пом э лектронны х переход ов неи меет смы сла. Рассмотри м при чи ны возможны х и зменени й в э лектронны х спектрах поглощ ени я. 1. π-π Сопряжени ев э лектронны х спектрах В з аи мод ействи е э лектронов нескольки х кратны х связей , при котором образу ется ед и ное д елокали з ованное π - э лектронное облако, охваты ваю щ ее все атомы э той си стемы связ ей, назы вается π-πсопряжени ем. О сновны м д оказательством сопряжени я являю тся характерны е и з менени я в э лектронном спектре поглощ ени я. П ри сопряжени и д ву х ненасы щ енны х гру пп полосы поглощ ени я смещ аю тся в д ли нноволнову ю сторону по сравнени ю с несопряженны ми хромоф орами .

11 Д ли на волны полосы и её и нтенси вность возрастаю т по мере у вели чени я чи сла сопряженны х гру пп. Н аи более отчетли во хи ми чески е э ф ф екты π-π-сопряжени я проявляю тся в аромати чески х соед и нени ях, сод ержащ и х ци кли чески е си стемы сопряженны х д вой ны х связей. Э ти си стемы мод ели ру ю тся д елокали заци ей π - э лектронов в замкну ты х кольцах и у спеш но рассчи ты ваю тсяметод ами М О Л К А О . 2. р- π-сопряжени ев э лектронны х спектрах В з аи мод ействи е непод еленны х э лектронны х пар с π - э лектронами , при вод ящ ее к образовани ю ед и ного д елокали зованного э лектронного облака, назы вается р-π - сопряжени ем. П о аналоги и с π-π-сопряжени ем у вели чени е размеров ед и ной э лектронной си стемы д олжно при вод и ть к д ли нноволновому смещ ени ю и у вели чени ю и нтенси вности полос поглощ ени я. В заи мод ействи е э лектронов тем больш е, чем больш е з начени е и нтеграла перекры вани я соответству ю щ и х э ти м э лектронам орби талей, которое су щ ественно з ави си т от характера и х ги бри д и заци и . И нтеграл перекры вани я р-и π - орби талей тем больш е, чем вы ш е д оля р характера орби тали непод еленной пары . П оскольку ти п ги бри д и заци и вли яет на р –π - сопряжени е, он вли яет на его спектральны епроявлени я. В отли чи еот π-π-сопряжени яр-π-сопряжени е может бы ть под авлено разли чны ми способами , основанны ми на связы вани и непод еленной э лектронной пары и соответству ю щ его и склю чени я ее и з р-π взаи мод ействи я. Т ак, э лектронны е спектры поглощ ени я р – π сопряженны х азотсод ержащ и х соед и нени й претерпеваю т су щ ественны е и зменени я д аже в слабоки слы х растворах. И нтенси вность соответству ю щ и х полос пад ает с ростом ки слотности , и при некотором з начени и рН раствора полосы совсем и счезаю т, под твержд ая тем самы м у части е э лектронов непод еленны х пар в соответству ю щ и х переход ах. П ад ени еи нтенси вности являетсяобрати мы м, при под щ елачи вани и ки слы х растворов и нтенси вностьи сслед у емой полосы воз растает. 3. Э ф ф екты замести телей в э лектронны х спектрах О тожд ествлени еи и д енти ф и каци я вещ еств по э лектронны м спектрам поглощ ени ятребу ет у чета вли яни янепоглощ аю щ и х замещ аю щ и х гру пп на характери сти ки вещ ества. В органи ческой хи ми и при нято и з у чатьвли яни е з амещ аю щ ей гру ппы на распред елени е э лектронов в молеку ле с точки з рени я и нд у кти вного и мезомерного свойств гру ппы , т.е. рассматри вать и нд у кти вны й э ф ф ект и э ф ф ект сопряжени я э той гру ппы . П оскольку э лектронны е спектры молеку лы характери зу ю т и з менени е э лектронного распред елени я, естественно и вли яни е замести телей на спектральны е

12 характери сти ки и з у чать то же с точки зрени я и нд у кти вного э ф ф екта и э ф ф екта сопряжени я. И нд у кти вны й э ф ф ект замести теля пред ставляет собой рез у льтат вли яни япотенци ального поляз амести теляна π - э лектроны незамещ енной молеку лы . В э том слу чаенесу щ ественна д етальнаяэ лектроннаястру кту ра з амести теля, важна ли ш ьзави си мость возму щ аю щ его потенци ала от э той стру кту ры . Э ф ф ект сопряжени я опред еляется как способностьэ лектронов з амести теля распространяться на область, в которой д елокали зованы π э лектроны молеку лы . О чеви д но, вероятность такого распред елени я з ави си т от э нерги и , ф ормы и размеров орби талей замести теля, так что необход и мо знать его д етальное строени е. Т аки м образом, э ф ф ект р-π сопряжени я является частны м слу чаем мезомерного э ф ф екта. Д ействи е з амести теляможно рассматри ватькак воз му щ ени еπ-э лектронной си стемы незамещ енной молеку лы . В вед ени е замести телей в бензольное кольцо вы зы вает 1 1 д ли нноволновое смещ ени е полосы переход а А 1g--- В 2u при 260 нм и у вели чени е его и нтенси вности . Е стественно пред положи ть, что э ф ф ект сопряжени я д олжен расти с ростом чи сла од и наковы х замести телей, и нд у кти вны й жеэ ф ф ект опред еляется чи слом и взаи мны м расположени ем з амести телей . П о отнош ени ю к ненасы щ енному у глевод ород у замести тели могу т бы ть класси ф и ци рованы как д оноры и акцепторы э лектронов, д оноры з ани маю т орби тали π - си мметри и относи тельно более вы сокой э нерги и . Си ла д онора у вели чи вается по мере у меньш ени я потенци ала и они заци и з амести теля. Н апри мер, гру ппы - N(CH3)2 , - NH2 и - О – и мею т ни зки е потенци алы и они з аци и и являю тсяси льны ми д онорами , - О Н - и - О СН 3 – у меренно си льны ми , алки д ны егру ппы и легки егалогены и мею т вы соки е потенци алы и они заци и и являю тся слабы ми д онорами . А кцепторы и мею т ни зколежащ и е вакантны е орби тали , си ла акцептора у вели чи вается, если у вели чи вается срод ство к э лектрону замести теля. О бы чно акцепторы и мею т ненасы щ енны есвязи (NO2, СО О Н , СО NH2, = С=О , = С=N –). О д на и та же гру ппа (напри мер – СН =СН 2 ) может проявлять как д онорны е, так и акцепторны е свойства в равной степени и ли с преоблад ани ем од ного и з ни х [5]. Количест венны й спект роф от ом ет рический анализ основан на з аконе Бу гера – Л амберта – Бера и свод и тсяк опред елени ю концентраци и вещ ества в растворе по абсорбци онности станд арта (вещ ества с и з вестной концентраци ей) и и сслед у емого образца при некоторой д ли неволны . Спектроф отометри чески й метод позволяет определить несколько свет опоглощающих органических веществ в одном раст воре без предварит ельного разделения. Ч астны й слу чай такой си стемы – анали з смеси д ву х окраш енны х вещ еств. Д ля э того и спольз у ется при нци п ад д и ти вности , пред ложенны й К .Ф и рорд том (абсор бци он н ос т ь m – с оеди н ен и й, подчи н яю щи хс я ос н овн ом у закон у с вет опоглощен и я и н е

13 вс т упаю щи х в хи м и чес кое взаи м одейс т ви е др уг с др угом , р авн а с ум м е абс ор бци о н н ос т ей каж дого и з с оеди н ен и й): m

А = ε 1⋅ с 1 ⋅ l + ε 2⋅ с 2 ⋅ l + εm⋅ с m⋅ l = l ∑ ε i ⋅ c i i =1

(5)

Д ли ны волн, при которы х след у ет провод и ть и змерени я опти ческой плотности , след у ет вы би рать по спектрам поглощ ени я анали зи ру емы х вещ еств, при меняя разли чны е при емы , напри мер, метод макси мальны х разностей. Сначала сни маю т спектры поглощ ени я опред еляемы х компонентов, з атем строят граф и к зави си мости разни цы коэ ф ф и ци ентов светопоглощ ени я от д ли ны волны и наход ят области макси му ма и ми ни му ма. Д ли ны волн, соответству ю щ и е э ти м областям, вы би раю т как анали ти чески е. Ч асто э ти области совпад аю т с областью макси мального поглощ ени я кажд ого и з компонентов. М олярны е коэ ф ф и ци енты поглощ ени я опред еляю тся заранее, поэ тому анали з свод и тся к опред елени ю абсорбци онности при д ву х вы бранны х д ли нах волн. О собы й и нтереспред ставляю т спектральны е у частки , в которы х од но и з органи чески х вещ еств не поглощ ает свет, а д ру гое облад ает и нтенси вны м светопоглощ ени ем. П ри нали чи и такой области повы ш ается точностьопред елени яи нтенси вно поглощ аю щ его свет вещ ества. Е сли д ля од ного компонента закон Бу гера-Л амберта-Бера не вы полняется, то у равнени е Ф и рорд та (5) справед ли во д ля смеси с постоянной концентраци ей э того э лемента. П роверка при нци па ад д и ти вности абсорбци онности может бы ть провед ена сравнени ем найд енны х абсорбци онностей д ля ряд а смесей и звестного состава со з начени ями абсорбци онностей, вы чи сленны ми по у равнени ю Ф и рорд та. П рави льность спектроф отометри чески х д анны х можно оцени ть по резу льтатам и сслед овани я станд артов. Э талоном абсорбци онности за ру бежом являетсяраствор 0,06 г/л K2Cr2 O7 в 0,005 М H2SO4 (область 235350 нм). След у ет у чи ты вать погреш ности отсчета по ш кале д ли н волн, которы е составляю т д о 0,7 % и кю ветны е погреш ности – 0,05-0,2 %. Рабочи й и нтервал абсорбци онностей растворов составляет 0,2 – 1,5. В ели чи на пред ела обнару жени я з ави си т от погреш ности ф она и опред еляется анали ти чески м си гналом, превы ш ени е которого не д олжно слу жи тьмерой ф акти ческой концентраци и вещ ества в растворе. С пект р офо т ом ет р и чески м м ет одом м ож н о опр еделят ь -4 -6 кон цен т р аци и в и н т ер вале 10 – 10 м оль/л, т ак как м оляр н ы е коэф фи ци ен т ы поглощен и я обы чн о леж ат в и н т ер вале 103 - 4⋅103 л/м оль⋅с м . М акси м альн ы ем оляр н ы екоэф фи ци ен т ы с вет о поглощен и ядля о р ган и чес ки х со еди н ен и й с ос т авляю т 1,5⋅105 л/м оль⋅с м . По казат ель поглощен и яε опр еделяет с яс т очн ос т ью 1-5 % [6]. С пектроф от ом ет рический м етод позволяет исследоват ь протолитические реакции и определят ь рК кислот ы (конст ант у ионизации кислот ы ).

14 П ростейш и м слу чаем и зу чени я равновеси я является коли чественны й анали з д ву х од новременно при су тству ю щ и х в растворе ф орм вещ ества. П ри и зменени и общ ей концентраци и поглощ аю щ и х вещ еств э кспери ментаторакти вно вмеш и ваетсяв у становлени еравновеси я. Спектры поглощ ени я органи чески х соед и нени й, пред ставляю щ и х собой ки слоты и ли основани я, зави сят от рН сред ы . Э то вы звано тем, что спектры и онов отли чаю тсяот спектров нейтральны х молеку л. И они з аци ю ки слоты HA (HA ↔ H+ + A-) можно охарактери з овать термод и нами ческой константой и они з аци и э той ки слоты :

KA =

aH+ ⋅ aA− aHA

(6)

и ли послелогари ф ми ровани я: рKA = pH – lg

aA aHA

(7)

Д ля опред елени я константы и они з аци и и ли константы основности необход и мо знать отнош ени е акти вностей ки слоты и сопряженного с ней основани я и наоборот. Спектроф отометри чески й метод и спользу ется, чтобы найти э то соотнош ени е (чащ е д ля опред елени я констант основности ). Главное у слови е его при менени я – разли чное поглощ ени е протони рованного основани яи его непротони рованной ф ормы . П ри спектроф отометри ческом опред елени и pKA ки слоты пред полагается, что вели чи ны pH растворов заранее и з вестны и необход и мо най ти и менно aА и a HA. Д ля э того сни маю т спектры и сслед у емого вещ ества в ряд е бу ф ерны х растворов (концентраци я бу ф ера 0,01 – 0,10 моль/л) сразны ми з начени ями pH (от 2 д о 11) при постоянной толщ и не кю вет и постоянной су ммарной концентраци и Н А и А (то есть к од и наковому объему бу ф ера сраз ны м pH д обавляю т од и наковое и сход ное коли чество Н А и ли А ). И сход яи з у равнени я: aHA A −A = A , aA A − A HA

(8)

гд еА – абсорбци онностьанали зи ру емого раствора, можно рассчи татьpKA: pK A = pH + lg

AA − A A − A HA

(9)

15 Зави си мость абсорбци онности от pH раствора в общ ем ви д е вы ражаетсяслед у ю щ и м образ ом: A A ⋅ 10 − pK A + A HA ⋅ 10 − pH A= (10) 10 −pK A + 10 −pH У равнени е (10) справед ли во д ля лю бой д ли ны волны и является основны м д ляпровед ени я спектроф отометри чески х опред елени й рК А . Д ля вы чи слени я д анной вели чи ны необход и мо знать показ атель поглощ ени я ки слоты (основани я) при какой-ли бо д ли не волны , показатель поглощ ени я сопряженного основани я (ки слоты ) при той же д ли не волны и абсорбци онность раствора и звестной концентраци и с и звестны м з начени ем рН (при той жед ли неволны ). В тех слу чаях, когд а од на и з ф орм преоблад ает в растворе, его поглощ ени е от рН не зави си т (д ля разбавленны х растворов рН раствора при ни мается равны м рН раствори теля). А бсорбци онность зави си т от рН только в у зкой области , гд е концентраци и ф орм сравни мы д ру г с д ру гом. Д ля и змерени я рК А спектроф отометри чески м метод ом рН раствора след у ет и з менятьв пред елах рК A + 2 ≥ pH ≥ pKA – 2. Д ля спектроф отометри ческого опред елени я pKA след у ет у чи ты вать след у ю щ и е д опу щ ени я: реакци я и они з аци и д олжна протекать без побочны х процессов; коэ ф ф и ци енты светопоглощ ени я кажд ой и з ки слотно-основны х ф орм д олжны бы ть нез ави си мы от pH и раз ли чаться в рассматри ваемой области спектра; д олжна опред еляться абсорбци онность растворов, сод ержащ и х од ну из ки слотно-основны х ф орм. Спектроф отометри чески й метод является ед и нственно д осту пны м при и сслед овани и очень слабы х основани й , сопряженны е ки слоты которы х и мею т рК А <1 – 2, когд а потенци ометри ческое ти тровани е невоз можно [6,7]. Н а основании данны х спект роф от ом ет рического определения м ож но рассчитат ь концентрацию вещест ва, которое нах одится в раст воре в присут ст вии поглощающей прим еси с неизвест ны м и х аракт ерист икам и. В э том слу чаеабсорбци онностьвы ражаетсяслед у ю щ и м образом: A = C⋅ε⋅l +Aпри меси

(11)

П ред полагается, что ход зави си мости ε от д ли ны волны (λ) и звестен. Н аи более распространен слу чай, когд а спектральны й ход поглощ ени я при меси можно и з образи тьпрямой ли ни ей : А при меси = а + в⋅λ

(12)

16 П ри э том и спользу ю т метод ”бази с н ой ли н и и ” - на кри вой зави си мости А от д ли ны волны соед и няю т отрез ком прямой ли ни и сосед ни е с и сслед у емы м макси му мом ми ни му мы (ри с.2). К онцентраци ю вещ ества можно рассчи тать по ф орму ле (13), пред полагая, что его поглощ ени епри λ А и λ В = 0. С = А LM / ε⋅l , (13) гд еА LM = AL – AM.

Ри с .2 Вы чи с лен и екон цен т р аци и вещес т ва в пр и с ут с т ви и поглощаю щей с м ес и . 1 – экспер и м ен т альн аякр и вая; 2 – кр и ваяпоглощен и япр и м ес и ; 3 – зави с и м ос т ь ε от λ С пектроф от ом ет рический анализ прим еняет ся при исследовании ком плексов раз личного т ипа, если ком плексообразование сопровож дает ся изм енением спектральны х х аракт ерист ик. П реи му щ ество метод а – возможностьи з у чени я комплексов без вы д елени я и х и з раствора. Су щ еству ет ряд комплексов, образовани е которы х сопровожд ается появлени ем в спектре новы х полос, отсу тству ю щ и х у неассоци и рованны х молеку л. Э ти м свойством облад аю т коорд и наци онны е комплексы переход ны х металлов, окраска которы х обу словлена и зменени ем си мметри и и она металла под вли яни ем молеку л ли ганд ов и появлени ем з апрещ енны х д ля невоз му щ енного и она переход ов. Э ти новы е полосы при су щ и только комплексу и являю тся д оказательством его су щ ествовани я[6]. М ерой сод ержани я комплекса в растворе является абсорбци онность при д ли не волны , соответству ю щ ей полосе поглощ ени я комплексного соед и нени я. Е сли од и н (А ) и ли д ва компонента (А и D) поглощ аю т при э той же д ли не волны , то мерой сод ержани я комплекса бу д ет разность

17 межд у наблю д аемой абсорбци онностью и вы чи сленной по значени ям коэ ф ф и ци ентов э ксти нкци и и концентраци и компонентов: ∆A = A набл. – (εА ⋅ СА + εД ⋅ СD)

(14)

С пектроф от ом ет рический м ет од дает возм ож ностьопределит ь конст анту уст ой чивости ком плекса, котору ю легко вы чи сли ть, зная абсорбци онность при д ли не волны поглощ ени я комплекса и показ атель поглощ ени я[6]. Kр =

∆А ∆A m ∆A n l ⋅ ε K (C A0 − m ) ⋅ (C D0 − n ) l ⋅ε K l ⋅ εK

,

(15)

- показ атель гд е C A0 , C D0 - и сход ны е концентраци и компонентов; ε К поглощ ени я комплекса; m,n – стехи ометри чески е коэ ф ф и ци енты в у равнени и образовани якомплекса. Значения ε К м ож но определит ь, и змери в абсорбци онность д ву х растворов с разны м соотнош ени ем компонентов. Н а практи ке при меняю т частны еслу чаи опред елени ясвойств комплексов простого состава. Д ля молеку лярны х комплексов состава 1:1 вы ражени е (15) можно перепи сатьв ви д е: Kр =

(C

0 A

[ AD ] , − [AD ]) ⋅ C D0

(16)

гд е[AD] = Aλ / (ελ ⋅lλ). Скомби ни ровав д ва у равнени я, полу чи м:

C A0 ⋅ l 1 1 1 = λ + ⋅ 0 λ λ A ε K р ⋅ε С D

(17)

Граф и ческая зави си мость вели чи ны обратной абсорбци онности раствора, у множенной на концентраци ю компонента А и на толщ и ну слоя, от вели чи ны обратной концентраци и компонента D вы ражается прямой ли ни ей. О трез ок, отсекаемы й э той прямой на оси орд и нат, д ает вели чи ну , обратну ю показателю поглощ ени я комплекса, а тангенс у гла наклона 1 . О пред ели в показатель поглощ ени я, можно найти прямой равен K р ⋅ε λ К р. В ели чи ну К р можно найти и по точке пересечени я с осью абсци сс. В э той точкеу равнени е(17) вы гляд и т так:

18 0=

1 1 + λ λ ε ε ⋅ K p (C D0 ) 0

(18)

О тку д а К р = -1 / (СD 0)0 (ри с.3).

Ри с .3. О пр еделен и екон с т ан т ы ус т о йчи вос т и ком плекс н ого с оеди н ен и я С пектроф от ом ет рический м етод прим еняет ся и при изучении х аракт ерист ик х им ической реакции. К оли чественное и зу чени е хи ми ческой реакци и (19) пред полагает э кспери ментальное опред елени е скорости ее протекани я, константы равновеси яи и з менени яэ нтропи и , э нтальпи и , э нерги и Ги ббса си стемы . аА + бБ = м М

+ н Н,

(19)

гд е А , Б – и сход ны е реагенты , М , Н – конечны е реагенты и ли прод у кты реакци и ; а, б, м , н – стехи ометри чески екоэ ф ф и ци енты . Степень протекани я реакци и - х (и ли степень превращ ени я) опред еляется соотнош ени ем: nA = nA 0 + ax, гд е nA 0 – начальное чи сло моль вещ ества А , n A - чи сло моль в более позд ни й момент. Скоростьреакци и вы ражаетсякак скоростьи з менени явели чи ны х: dx 1 dn A = ⋅ dt a dt

19 О пред еленная таки м образом скорость реакци и не зави си т от вы бора реагента, э ти м вы ражени ем можно пользоваться при и зменени и объема и ли ф аз ы . Е сли объем си стемы не меняется в ход е реакци и и можно пренебречь при су тстви ем промежу точны х соед и нени й, то скорость хи ми ческой реакци и опред еляется как скорость и счез новени я од ного и з реаги ру ю щ и х вещ еств и ли появлени и од ного и з прод у ктов реакци и . ϑ=−

dC A = k r ⋅ C Aa , dt

(20)

гд еkr - константа скорости реакци и . П ри и сслед овани и скорости реакци и и з меряю т и зменени е концентраци и и сход ны х и конечны х прод у ктов во времени и вы ражаю т скорость реакци и через концентраци и реагентов и д ру ги х соед и нени й, при су тству ю щ и х в си стеме(катали заторов, бу ф ерны х вещ еств и д р.). Е сли реакци я (19) обрати ма, она характери з у ется константой равновеси я К р , которая опред еляется отнош ени ем констант прямой и обратной реакци й. Зави си мость К р от температу ры д ает возможность рассчи тать термод и нами чески е характери сти ки реакци и , а зави си мость от температу ры скорости реакци и – э нерги ю акти ваци и реакци и . Спектроф отометри чески й метод и з у чени я ки нети ки реакци и свод и тся к опред елени ю концентраци й реагентов в з ави си мости от времени и температу ры . П ри э том необход и мо вы полнени е у слови й коли чественного абсорбци онного анали з а: соблю д ени е закона Б у гера – Л амберта – Бера и отсу тстви е полного перекры вани я полос поглощ ени я и сход ны х и конечны х прод у ктов, постоянство температу ры . Е сли реакци я провод и тся во внеш нем реакторе, то через опред еленны е промежу тки времени необход и мо отби рать пробы реакци онной смеси и и змерять и х абсорбци онность. Э тот способ у д обен д ля мед ленны х реакци й, а также когд а реакци я и д ет только при вы соки х температу рах. Н еобход и мо также, чтобы в кю вете сравнени я пропу скани е не и з менялось во времени , поэ тому можно и спольз овать чи сты й раствори тель в качестве э талона сравнени я. Спектроф отометри чески й метод д ает воз можность опред ели ть скоростьреакци и по и з менени ю абсорбци онности раствора без переход а к концентраци ям компонентов. Д ля раствора, в котором и д ет реакци я (19), абсорбци онность в лю бой момент времени опред еляется след у ю щ и м образом: А = (εАС А + εВС В +εМ С М +εН С Н )⋅ l = 0 [εА (С А - ах) +εВ (С В0 - бх)+ εМ (С М 0 -м х)+ … ]⋅ l (21) И з у равнени я(21) очеви д но, что dA dx =P , dt dt

20 гд еР – константа, А – абсорбци онность. Т аки м образом, и зменени е абсорбци онности в ход е хи ми ческого процесса связано со скоростью реакци и . П оэ тому при ки нети чески х спектроф отометри чески х и змерени ях наход ят абсорбци онность в з ави си мости от времени и строят граф и ки . К асательная к полу ченной кри вой в кажд ы й момент времени д ает скоростьреакци и [6-8]. П ри вы полн ен ии измерен ий в к оличествен н ом спек тральн ом ан ализе н еобходимо соблю дать следую щ ий порядок измерен ий: 1) Сни маю т полны й спектр поглощ ени я вещ ества, вы би раю т анали ти ческу ю д ли ну волны на макси му ме поглощ ени я вещ ества, у чи ты вая, что чем вы ш е коэ ф ф и ци ент поглощ ени я, тем больш и е и зменени я абсорбци онности соответству ю т и зменени ям концентраци и вещ ества и тем меньш евли яни епри месей; 2) Рассчи ты ваю т молярны й коэ ф ф и ци ент поглощ ени я, опред еляю т концентраци ю станд арта и толщ и ну кю вет. 3) Готовят 5-7 станд артны х растворов с и звестны ми концентраци ями , и змеряю т и х абсорбци онности . 4) Строят граф и к зави си мости абсорбци онности от концентраци и при постоянной толщ и некю вет. 5) О пред еляю т концентраци ю и сслед у емого раствора по град у и ровочному граф и ку . 3. АН АЛ И З С ОВР Е М Е Н Н Ы Х П Р Е Д С Т АВЛ Е Н И Й О С Т Р У К Т У Р Н Ы Х ОС ОБ Е Н Н ОС Т Я Х И П Р И Р ОД Е ВЗАИ М ОД Е Й С Т ВИ Й ВС И С Т Е М Е ВОД А – АМ И Н ОК И С Л ОТ А 3.1. Ф изико-х им ические х арактерист ики ам инокислот А ми ноки слоты являю тся амф отерны ми соед и нени ями , способны ми д и ссоци и ровать как по основному , так и по ки слотному ти пу . У чи ты вая ги д ратаци ю и д и ссоци аци ю ф у нкци ональны х гру пп, э тот процесс можно пред стави тьв след у ю щ ем ви д е[9]:

+

Т аки м образ ом, д и ссоци и ру яод новременно сотщ еплени ем и онов H и OH , ами ноки слоты наход ятся в растворе в ви д е би полярны х и онов. Н али чи е послед ни х д оказы вается вы сокой температу рой плавлени я -

21 (200°С), легкостью кри сталли заци и ами ноки слот, хорош ей раствори мостью в вод епо сравнени ю с менееполярны ми раствори телями , а также вы соки ми д и э лектри чески ми постоянны ми и больш и ми д и польны ми моментами , что сви д етельству ет о полном разд елени и положи тельного и отри цательного заряд ов. К и слотно-основны е свойства ами ноки слот прощ е всего объясняю тся на основе теори и Бренстед а - Л оу ри [9]. Согласно э той теори и , ки слотами счи таю тся лю бы е молеку лы и ли и оны , которы е могу т отд авать протон – д оноры протона, а основани ями - молеку лы и ли и оны , способны е при нять протон – акцепторы протона. К и слота и основани е являю тся сопряженной си стемой . Свойство ки слотности и ли основности относи тельно, од но и тоже вещ ество может проявлять себя и как ки слота, и как основани е в з ави си мости от у слови й хи ми ческого взаи мод ействи я. А ми ноки слоты , сод ержащ и е д ве д и ссоци и ру ю щ и е гру ппы , характери зу ю тся д ву мя константами д и ссоци аци и К 1 и К 2 . П ри э том К 2 характери зу ет д и ссоци аци ю основной гру ппы , а К 1 – ки слотной гру ппы . Д и ссоци аци ю ами ноки слот пред ставляю т в след у ю щ ем ви д е[10]: А+↔ А± + Н+

(5)

К 1 = [А ± ].[ Н + ]/[ А + ]

(6)

А±↔ А-+Н+

(7)

К 1 = [А -].[ Н +]/[ А ±],

(8)

гд е А + - кати онами ноки слоты ; А ± - цви ттери он; А - - ани он ами ноки слоты . Д анная схема д и ссоци аци и ами ноки слот составлена на основе у точнени я ф и з и ческой су щ ности процессов д и ссоци аци и цви ттерли тов, к которы м относи тся больш и нство ами ноки слот. Ц ви ттерли ты в си льноки слы х сред ах су щ еству ю т в ви д е кати онов, а в си льнощ елочны х – в ви д е ани онов. В промежу точной области рН цви ттерли ты являю тся соед и нени ями , су щ еству ю щ и ми преи му щ ественно в ви д е би полярны х и онов, э лектри чески нейтральны х, образу ю щ и х вну тренню ю соль. О бразовани е цви ттери онов обу словлено тем, что у цви ттерли тов ки слотная и основная гру ппы расположены бли з ко д ру г к д ру гу . Д и ссоци аци яосновной гру ппы вед ет к появлени ю положи тельного заряд а, которы й оттяги вает э лектроны от карбокси льной гру ппы , ослабляя связ ь протона карбокси льной гру ппы и у си ли вая тем самы м ее д и ссоци аци ю . У казанная д и ссоци аци я сопровожд ается переход ом вод ород а к ами ногру ппесобразовани ем би полярны х и онов.

22 В у равнени и (5) А - д онор протона; А ± - акцептор протона. В у равнени и (7) А ± - д онорпротона; А - - акцептор протона. Л огари ф ми ру я (6) с обратны м знаком и под ставляя рН вместо – lg[Н + ] и рК вместо - lgК 1 полу чи м: +

±

+

рН = рК 1 – lg([А ]/[А ])

(9)

И змени в знак на обратны й , полу чи м: рН = рК 1 + lg([А +]/[А ±])

(10)

У равнени е(9) носи т названи еГенд ерсона – Хассельбаха. А налоги чно д ляу равнени я(8): рН = рК 2 - lg([А +]/[А ±])

(11)

В общ ем ви д е у равнени е Генд ерсона – Хассельбаха, согласно теори и Бренстед а, запи ш ется: рН = рК + lg([акцептор Н +]/[д онор Н + ])

(12)

К роме вели чи н рК 1 и рК 2 д ля ами ноки слот характерно значени е рН , при котором в растворе чи сло кати онов равно чи слу ани онов и зоэ лектри ческая точка, обоз начаемая pI. В и зоэ лектри ческой точке макси мальное коли чество ами ноки слоты наход и тся в ви д е цви ттери онов. Д ля моноами номонокарбоновы х ки слот вели чи ну рН в и з оэ лектри ческой точкеможно опред ели тьи з у равнени я: pI = (рК 1 + рК 2)/2

(13)

О бы чно pI у ами ноки слот лежи т около рН = 6. Е сли ами ноки слота и меет втору ю карбокси льну ю гру ппу , то ее и з оэ лектри ческая точка смещ ена в область более ни з ки х з начени й рН , если втору ю ами ногру ппу – в областьболеевы соки х значени й рН . В озможны еперез аряд ки ами ноки слот опи сы ваю тсяу равнени ями : O

O pK1 H3 N

CH

C

pK 2 H 3N

OH

CH

C

O

R

R

O

O

pK2

pK 3 H2 N

CH R

C

O

H2 N

CH R-

C

O

23 Н еобход и мо отмети ть, что α -СО О Н гру ппы ами ноки слот облад аю т больш ей ки слотностью (рК 1 - от 1,7 д о 2,6), чем карбокси льны е гру ппы соответству ю щ и х карбоновы х ки слот (рК у ксу сной и молочной ки слот составляю т 4,76 и 3,86). Э то объясняетсянали чи ем положи тельного заряд а +

у N H 3 - гру ппы , которы й оттяги вает э лектроны от α - СО О Н гру ппы и у си ли вает её д и ссоци аци ю . α -А ми ногру ппы моноами номонокарбоновы х ки слот облад аю т более слабой основностью , чем ами ногру ппы соответству ю щ и х али ф ати чески х ами нов [12]. В ажны м свойством растворов ами ноки слот является проявлени е и ми бу ф ерной ёмкости , при чём рН растворов несколько отли чается у раз ли чны х ами ноки слот. М акси мальны е з начени я бу ф ерной ёмкости обнару жи ваю тся при з начени ях рН бли зки х к вели чи нам и х рК 1 , т.е. в и нтервале равном 1,3-3,3, и рН равном 8,6-10,6. Н али чи е в части цах +

ами ноки слот при разли чны х рН и они зи рованны х гру пп N H3 , СО О -, полярны х гру ппи ровок - О Н , NH2, СО О Н и неполярны х у глевод ород ны х ф рагментов в боковы х рад и калах при вод и т к сложной карти неги д ратаци и . О бщ епри няты м является, что при растворени и цви ттери онов в вод е наблю д ается э лектростри кци я по при чи не си льного э лектростати ческого при тяжени я и они з и рованны ми гру ппами молеку л вод ы , в резу льтате чего прои сход и т и х у плотнени е. В сеами ноки слоты как би полярны есоед и нени я облад аю т больш и ми д и польны ми моментами . Д и польны й момент цви ттери она ами ноки слот обы чно составляет вели чи ну не меньш е, чем 15 Д ебай [13]. О бщ и м свойством д ля всех ами ноки слот является образовани е вод ород ны х связей межд у ами но- и карбокси льны ми гру ппами . Д ля ами ноки слот, не и мею щ и х акти вны х гру пп в рад и кале, стру кту рообраз овани е и д ет межд у NH2 - и COOH- гру ппами . Стру кту ры такого ти па и мею т сложны й характер, межд у и х слоями д ейству ю т си лы В ан-д ер-В аальса [8,13]. Д ля ами ноки слот, и мею щ и х полярны е гру ппы в боковом рад и кале, незави си мо от размеров молеку л, характерно образовани е трехмерной сетки вод ород ны х связей. В образовани и таки х стру кту рпри ни маю т у части емолеку лы ги д ратной вод ы [14]. Рассмотри м и сслед у емы е ами ноки слоты : т и р ози н (Tyr) (α - ами но β- пара окси ф ени лпропи оновая ки слота), ф ен и лалан и н (Phe) (α–ами но-βф ени лпропи оновая ки слота), а также таки е ами ноки слоты , как: т р и пт оф ан (Trp) (α –ами но-β-и нд оли лпропи оновая ки слота), ги с т и ди н (His) (α-ами но-β-и ми д азолпропи оновая ки слота) и ци с т еи н (Cys) (αами но-β-меркаптопропи оновая ки слота) [11]. И х ф и зи ко-хи ми чески е характери сти ки пред ставлены в табли це1.

24 Tyr

Phe O

O H2 N

CH

C

H2N

OH

CH

C

OH

CH 2

CH2

OH

His

Trp O H 2N

CH

C

OH

CH2

HN

Cys

Т абли ца 1. Ф и з и ко-хи ми чески ехарактери сти ки и спользу емы х ами ноки слот Ам и н оки с лота

Mr

Рас т вор и м ос т ь, г/100 г Н 2О

Tyr

181,2

0,05

Phe Trp His Cys

165,2 204,2 155,2 121,2

tпл, 0С

310 (разл) 2,96 283 1,14 298 4,30 285 Хорош о раствор. 240

pI

pK1 aС ООН

pK2 aNH3 +

5,63

2,20

9,11

5,91 5,88 7,64 5,02

2,58 2,38 1,77 1,71

___

9,49 9,18 10,78

pK3 боко вой цепи 10,07

рК4 им ид .

9,24 11,60 10,90 8,27

___

___

___

5,82 –

25 Н а основани и констант д и ссоци аци и и у равнени й матери ального баланса рассчи тано сод ержани е разли чны х и онны х ф орм аромати чески х и гетероци кли чески х ами ноки слот в растворе при разны х значени ях рН (ри с.4):

α 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

1

2

3

pH 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14

(а) Ф ени лалани н (Phe) 2 – Phe ±

1 – Phe +

3 – Phe –

α 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

2

1

0

1

2

3

4

5

6

3

7

8

9

4

10 11 12 13 14 pH

(б) Т и роз и н (Tyr) 1 – Tyr +

2 - Tyr ± 3 – Tyr - 4 – Tyr 2-

26

1,00

α

0,80 0,60

2

1

4

3

0,40 0,20

pH

0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15

(в)Т ри птоф ан (Trp) 1 – Trp +

100

2 – Trp ±

3 – Trp –

2

3

4 – Trp 2-

α,%

90 80 70 60 50 40

1

4

5

30 20

pH

10 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15

(г)Ги сти д и н (His) 1 – His2+ 2 – His+ 3 – His ± 4 – His – 5 – His 2-

27

(д ) 1 – Cys+

Ц и стеи н (Cys)

2 – Cys ± 3 – Cys – 4 – Cys2-

Ри с. 4 (а-г) Д и аграмма распред елени яи онны х ф орм П ри су тстви е аромати ческого кольца обу словли вает относи тельно ни зку ю раствори мость ами ноки слот (Phe – 30 г/л, Tyr – 0,45 г/л, Trp – 11 г/л при 293 К ). Phe и меет неполярны й рад и кал, Trp – и нд ольны й ци кл, а Tyr - рад и кал с полярной ги д рокси льной гру ппой, хотя э та гру ппа легко отщ епляет протон, ти рози н оказ ы вается слабо и они зи рованны м при рН = 7. В тверд ом состояни и э ти ами ноки слоты наход ятся в ви д е кри сталлов, которы еразлагаю тсяпри сравни тельно вы сокой температу ре(Т > 473K). В нейтральны х вод ны х растворах они и мею т вы соки е з начени я д и э лектри ческой постоянной и больш и е д и польны е моменты . У казанны е свойства сви д етельству ю т о том, что ами ноки слоты кри сталли з у ю тся и з нейтральны х вод ны х растворов в ви д ед и польны х цви ттери онов. 3.2. О собенности ст рукт урны х взаим одей ст вий в систем е вода – ам инокислот а В од а, как и з вестно, отли чается от д ру ги х жи д костей по целому ряд у аномальны х свойств, обу словленны х особенностями ее стру кту ры , благод аря которы м в вод е может образоваться след у ю щ ая стру кту ра: вод ород ны е связи молеку л вод ы полностью замы каю тся на сосед ни е молеку лы вод ы свы и гры ш ем э нерги и сразу 4-х вод ород ны х связей [13,15]. О бразовани е относи тельно прочного каркаса и з молеку л вод ы , связ анны х четы рьмя вод ород ны ми связями , обу словли вает сравни тельно вы соку ю температу ру замерз ани я вод ы , при мерно на 100° вы ш еожи д аемой, и сход я и з сравнени я с жи д костями од ного с нею гомологи ческого ряд а, а также

28 части чное сохранени е такого каркаса после плавлени я льд а. Со стру кту рны ми особенностями вод ы связаны и таки ееехарактери сти ки , как вы сокая д и э лектри ческая постоянная, свойства полярного раствори теля, су щ ественноеи зменени ееестру кту ры вбли з и растворенны х вещ еств. Д ля би ологи чески х си стем важно не только и з менени е стру кту ры вод ы вбли зи поверхности раз д ела, сопровожд аемое у меньш ени ем д оли молеку л, связ анны х 4-мя вод ород ны ми связями . П од обная перестройка вбли зи неполярной поверхности э нергети чески невы год на, что под твержд аетсяд анны ми по мод ельны м си стемам - растворам неполярны х у глевод ород ов в вод е. Н еполярны е у глевод ород ы плохо раствори мы в вод е, при чем, несмотря на у меньш ени е э нтальпи и си стемы , наблю д ается з начи тельная положи тельная свобод ная э нерги и растворени я [16]. П ри растворени и в вод е реги стри ру ю т практи чески од и наковы е з начени я теплоты ги д ратаци и д ля раз ли чны х неполярны х соед и нени й [17], отку д а след у ет, что и з менени е э нерги и связано не с каки м-ли бо специ ф и чески м взаи мод ействи ем неполярны х молеку л с вод ой, а с перестройкой стру кту ры самой вод ы . Н евы год ность под обны х стру кту рны х и зменени й д лявод ы в пограни чны х областях обу словли вает тенд енци ю к вы теснени ю неполярны х соед и нени й и ли гру пп и з вод ы , и х сли пани ю межд у собой и у меньш ени ю поверхности контакта с ни ми [16], что является и сточни ком ги д роф обного вз аи мод ействи я, которое и грает реш аю щ у ю роль в ф орми ровани и конф ормаци и би ополи меров и в и х стаби ли з аци и . Н али чи е ги д роф обны х у частков на поверхности макромолеку лотчасти связано си х важной ролью в составеакти вны х центров ф ерментов при взаи мод ействи и сни ми су бстратов реакци й [18]. И з у чени е растворов малы х концентраци й пред ставляет при нци пи альны й и нтерес д ля пони мани я строени я вод ы и вод ны х растворов вообщ е, так как в таки х растворах стру кту ра вод ы ещ ё не нару ш ена з а счёт э ф ф екта и збы тка растворённого вещ ества, и и зменени я стру кту ры вод ы от д обавлени я посторонни х молеку л проявляю тся в наи более чи стом ви д е. К роме того, при очень малы х концентраци ях наблю д ается и би ологи ческое д ействи е многи х вещ еств (напри мер, явлени еанестез и и и д р.). В работе [19] замечено, что и зменени я спектров поглощ ени я вод ы при растворени и малы х коли честв неэ лектроли тов аналоги чны и зменени ям, наблю д аю щ и мся в спектре чи стой вод ы при пони жени и температу ры . Т акой характер и зменени й спектров сви д етельству ет об у поряд очи вани и вод ы в смы сле у прочнени я вод ород ны х связей межд у молеку лами вод ы . Н аблю д аемы е сд ви ги полос, сви д етельству ю щ и е об у вели чени и си ловой постоянной вод ород ной связ и , согласу ю тся с распространённы м мнени ем об у вели чени и стру кту ри рованности вод ы в растворах неэ лектроли тов. У становлено [19], что при растворени и разнообразны х вещ еств полоса поглощ ени я вод ы с частотой 5180 см-1 смещ аетсяв сторону малы х частот, что сви д етельству ет об “у поряд очи вани и ” стру кту ры вод ы при

29 растворени и неэ лектроли та. Смещ ени е полосы , д ости гну в некоторого наи больш его значени я, прекращ ается при разны х з начени ях концентраци и д ляразны х вещ еств. П рекращ ени е сд ви гов полос показы вает, что, начи ная с некоторой, характерной д ля кажд ого вещ ества концентраци и его в растворе, д альнейш и й рост стру кту ри рованности вод ы прекращ ается. О бъяснени е э ти м резу льтатам, по мнени ю авторов д анной работы , в су щ ествовани и ги д роф обны х взаи мод ействи й межд у неполярны ми гру ппами молеку л неэ лектроли тов в вод ны х растворах. П роцессы , прои сход ящ и е в вод е при д обавлени и малы х концентраци й неэ лектроли тов, можно, с у чётом ги д роф обны х взаи мод ействи й, опи сать след у ю щ и м образом. П ри малы х концентраци ях вокру г кажд ой растворённой в вод е молеку лы вы страи вается неки й у поряд оченны й каркас и з молеку л вод ы ; при у вели чени и чи сла растворённы х молеку л коли чество у поряд оченны х областей вначале возрастает, что при вод и т к концентраци онному сд ви гу макси му мов полос поглощ ени я вод ы . П о д ости жени и некоторы х концентраци й начи нает проявляться ги д роф обное взаи мод ействи е межд у растворённы ми молеку лами . Н овы е молеку лы , попад аю щ и е в раствор, з а счёт взаи много ги д роф обного при тяжени я стремятся к ассоци аци и с д ру ги ми растворённы ми молеку лами ; при э том они встраи ваю тся в у же стру кту ри рованну ю вод у , при легаю щ у ю к растворённы м молеку лам, и , след овательно, д альнейш его у поряд очи вани я вод ы не вы з ы ваю т. К онцентраци и , при которы х прои сход и т резкое з амед лени е д альней ш его у поряд очи вани я раствора, тем меньш е, чем больш есклонностьд анного вещ ества к образовани ю ги д роф обны х связей. В ероятно, при непосред ственном контакте д ву х растворённы х молеку л общ ая поверхность неполярной части цы у меньш ается и тем самы м сни жаетсяу поряд очи ваю щ еед ействи ена вод у [19]. Н еобход и мость очень малы х концентраци й в растворах некоторы х вещ еств д ля и х лекарственного д ействи я может бы ть связана с тем, что в си лу ги д роф обного взаи мод ей стви я молеку л в некоторы х у частках раствора может соз д аваться вы сокая локальная концентраци я растворённы х молеку л при общ ей весьма ни зкой и х концентраци и . В э том слу чае локальная концентраци я, необход и мая д ля лекарственного д ействи я, бу д ет тем меньш е, чем вы ш есклонностьмолеку л к образовани ю ги д роф обны х связ ей [18]. О бъяснени е д ли нноволнового сд ви га, по мнени ю авторов [20], след у ет и скать в у вели чени и степени самоассоци аци и вод ы под возд ействи ем неполярны х гру пп неэ лектроли та. Н аи более вероятны е объяснени я д ействи я неполярны х гру пп на вод у таковы : 1) у меньш ени е трансляци онной под ви жности вод ы благод аря заняти ю пространства, необход и мого д ля перемещ ени й, посторонней молеку лой : молеку лы вод ы при э том легче всту паю т в вод ород ну ю связ ь д ру г с д ру гом и 2) у вели чени е у ни версального ван–д ер–ваальсового взаи мод ействи я в растворепри растворени и неэ лектроли та. У вели чени е степени ассоци аци и вод ы прои сход и т также под д ей стви ем неполярны х вещ еств, напри мер

30 у глевод ород ов, од нако вы ражено оно гораз д о слабее, чем в растворах спи ртов. П олярная часть молеку лы неэ лектроли та, образу я вод ород ну ю связь с молеку лой вод ы , у вели чи вает концентраци ю в ней неполярны х гру пп. П ри растворени и небольш и х молеку л вод а, при спосабли ваясь к размерам растворённой молеку лы “гостьи ”, образу ет наи более под ход ящ у ю из ограни ченного, д и скретного набора стру кту р, свойственны х ассоци атам и з молеку л вод ы , в то время как больш и е молеку лы могу т и зменять геометри ю стру кту ры вод ы непреры вны м образом, пу тём небольш и х д еф ормаци й больш ого коли чества вод ород ны х связей , наход ящ и хсявбли зи растворённой молеку лы [20]. П о мнени ю авторов [21], и спользу ю щ и х теори ю д еф ектов, при некоторой концентраци и неэ лектроли та прои сход и т раз ру ш ени е сетки вод ород ны х связ ей . Сетка Н -связей вы талки вает молеку лы неэ лектроли та к д еф ектам сетки . Э то вы талки вани е тем вы год нее, чем си льнее вы ражен ги д роф обны й э ф ф ект, поскольку в местах д еф ектов молеку лы неэ лектроли та объед и няю тсятак, чтобы ги д роф обны ечасти и мели контакт с вод ой. Д еф ектами сетки вод ород ны х связей вод ы являю тся тепловы е разру ш ени я, при меси и сами молеку лы неэ лектроли та. П ри работе с вод ны ми растворами ами ноки слот и мею т д ело с вод ны ми растворами ш и рокой области концентраци и по растворенному вещ еству (от очень раз бавленны х (10-6 моль/л) д о д остаточно концентри рованны х растворов). В ажной характери сти кой раствора является коорд и наци я молеку л вод ы вокру г ами ноки слоты . Ф у нкци ональны е гру ппы , способны е образовы вать вод ород ны е связи с молеку лами вод ы , вклю чаясь в стру кту ри рованны е си стемы кластеров, нару ш аю т и х у поряд оченность. М етод У Ф -спектроскопи и может бы ть и спользован д ля анали з а стру кту рны х и зменени й вод ной матри цы при образ овани и растворов ами ноки слот сконцентраци ей < 1⋅10-3 моль/л. 4. М Е Т ОД Ы

Р АЗД Е Л Е Н И Я И ОП Р Е Д Е Л Е Н И Я АМ И Н ОК И С Л ОТ

В настоящ ее время насчи ты ваю т около 80 ами ноки слот, вы д еленны х и з разли чны х при род ны х объектов. К роме постоянно и ред ко встречаю щ и хся в белках ами ноки слот, в составе жи вотны х, ми крооргани змов и особенно растени й обнару жены раз нообраз ны е свобод ны еами ноки слоты . Способы вы д елени я ами ноки слот зави сят от того, наход ятся ли цви ттерли ты в свобод ном и ли в связанном состояни и (в белках). Свобод ны е ами ноки слоты чащ е всего и з влекаю т и з би ологи ческого матери ала 75 – 80% - ми вод ны ми растворами э танола и ли метанола. Т ак как в слу чае расти тельны х объектов воз можен переход в спи ртовой э кстракт некоторы х белков, послед ни е д ополни тельно осажд аю т, ли бо

31 и зменяя рН сред ы , ли бо д обавляя к ней те и ли и ны е осад и тели белков. Хорош и ерез у льтаты полу чаю т при э кстракци и свобод ны х ами ноки слот и з би ологи чески х объектов 5%-ны м вод ны м раствором три хлору ксу сной ки слоты , которая является од ни м и з лу чш и х осад и телей белков. О д нако нед остаток у казанного метод а состои т в том, что д ляд альнейш ей работы с ами ноки слотами , сод ержащ и ми ся в такой вы тяжке, необход и мо у д алени е и з неё три хлору ксу сной ки слоты , пред ставляю щ ее д овольно тру д оёмку ю операци ю . Д ля и звлечени я свобод ны х ами ноки слот и з би ологи ческого матери ала при меняю т многи е д ру ги е вещ ества: вод у , под ки сленны й ацетон, разбавленну ю у ксу сну ю ки слоту и т.д . Е сли ами ноки слота наход и тся в связанном состояни и , то вы д ели ть её можно после ги д роли з а белка: ли бо пу тём нагревани я препарата с ки слотами (20% - ны й раствор HCL; 30% - ны й раствор H2 SO4) и ли основани ями (5 М NaOH; 14% - ны й раствор Ba(OH)2 ), ли бо пу тём и нку баци и препарата сф ерментами [22]. Н аи более сложну ю и ответственну ю часть работы по вы д елени ю той и ли и ной ами ноки слоты и з при род ны х объектов пред ставляет процесс отд елени я д анной ами ноки слоты от сопу тству ю щ и х ей д ру ги х ами ноки слот вы тяжки и ли ги д роли зата. Ранее при менявш и еся метод ы ф ракци они ровани я ами ноки слот (разгонка в ваку у ме э ти ловы х э ф и ров ами ноки слот, осажд ени е ами ноки слот в ви д е мед ны х, серебрянны х и д р. солей, и з би рательное растворени е некоторы х ами ноки слот в органи чески х раствори телях) сейчас почти полностью заменены просты м и э ф ф екти вны м хроматограф и чески м метод ом раз д елени я сложны х ами ноки слотны х смесей на и нд и ви д у альны есоставляю щ и е. П ри вы д елени и свобод ны х ами ноки слот и з би ологи ческого матери ала и спольз у ю тся вы су ш енны е насекомы е, напри мер ку колки ту тового ш елкопряд а, являю щ и еся отход ами кокономотального прои з вод ства и сод ержащ и е в несколько раз больш е свобод ны х ами ноки слот, чем д ру ги е объекты при род ного прои схожд ени я. П ри работе с и ны м матери алом (ткани жи вотны х, ф и кси рованны е э танолом при нагревани и и перевед ённы е в су хой порош ок) необход и мо у вели чи ть в 2 – 3 раза коли чество 1% - ной HCl, и д у щ ей на растворени е су хого остатка перед хроматограф и ровани ем. А ми ноки слоты в вы тяжке обнару жи ваю т реакци ей с ни нги д ри ном (три кетоги д ри нд еном). П роявляется и нтенси вное си не – ф и олетовое окраш и вани е, сви д етельству ю щ ее о при су тстви и в и спы ту емой пробеα- ами ноки слот [23]. К роме того, су щ еству ю т цветны е вы сокоспеци ф и чны е реакци и на ами ноки слоты , некоторы е и з ни х д аже наход ят при менени е д ля коли чественного опред елени я ами ноки слот. Н апр и м ер , для опр еделен и я т и р ози н а и с по льзует с я р еакци я М и ллон а. (К нескольки м кри сталлам ти рози на (полу ченного и з ш ёлка и ли коммерческого препарата) при бавляю т 5 мл 2,5%-ного раствора серной ки слоты и перемеш и ваю т д о полного растворени я). П ри ли ваю т 1 мл реакти ва М и ллона, встряхи ваю т и оставляю т стоять при комнатной температу ре. Ч ерез некоторое время

32 раствор окраш и вается в кроваво-красны й цвет. Д ля у скорени я появлени я окраски раствор можно слегка под огреть. Реакти в М и ллона пред ставляет собой смесь ни тратов и ни три тов рту ти (1) и (2), растворённы х в концентри рованной азотной ки слоте. П ри взаи мод ействи и его с ф енольны м яд ром ти роз и на возни кает ни трозоти рози н, рту тное соед и нени екоторого окраш ено в красны й цвет. Д ляопр еделен и яги с т и ди н а и с пользует с яр еакци яП аули . (К 1мл 1%ного раствора су льф ани ловой ки слоты в 5%-ном растворе HCl при бавляю т 2 мл 0,5%-ного раствора ни три та кали я, си льно встряхи ваю т и немед ленно при ли ваю т сначала 2 мл 0,01%-ного раствора ги сти д и на. Затем, после перемеш и вани я сод ержи мого проби рки , при ли ваю т 6 мл 10%-ного раствора карбоната натри я. Раз ви вается и нтенси вная ви ш нёво-красная окраска). Д ляопр еделен и ят р и пт оф ан а – р еакци яГ опки н с а - К оле. (1 мл 0,005%-ного раствора три птоф ана смеш и ваю т в проби рке с равны м объёмом раствора гли окси ловой ки слоты и д обавляю т 10 капель 0,04 М раствора су льф ата мед и . П ри ли ваю т небольш и ми порци ями 2 – 3 мл концентри рованной серной ки слоты , охлажд ая проби рку кажд ы й раз. О ставляю т на 10 ми н при комнатной температу ре и ставят на 5 ми н в ки пящ у ю вод яну ю баню . Разви вается си не-ф и олетовое окраш и вани е [23, 24]. О д нако цветны е реакци и в больш и нстве своём не специ ф и чны , поэ тому коли чественное опред елени е ами ноки слот при помощ и цветны х реакци й невсегд а над ёжно. Су щ еству ет ещ ё ряд метод ов коли чественного опред елени я ами ноки слот. Е сли плотность окраски с ни нги д ри ном ами ноки слотной вы тяжки и змери ть в колори метре и сопостави ть д алее с плотностью окраски , разви ваю щ ей ся при взаи мод ей стви и с ни нги д ри ном смеси ами ноки слот и звестного состава, то можно рассчи тать коли чественное сод ержани е ами ноки слот в и сслед у емой пробе. К арбокси льны е гру ппы ами ноки слот можно коли чественно у честь пу тём ти тровани я и х в спи ртовой сред е. Т ак как в э ти х у слови ях д и ссоци аци я по ами ногру ппе под авлена, ами ноки слоты вед у т себя как карбоновы е ки слоты и прямо ти тру ю тся спи ртовы м раствором щ ёлочи . Разработан, кроме того, метод ти тровани яами ноки слот в вод ной сред е. Ч тобы под ави тьд и ссоци аци ю по ами ногру ппам, к ами ноки слотам д обавляю т раствор ф ормали на. В оз ни кш и е при э том N-д и окси мети л-ами ноки слоты д и ссоци и ру ю т и ти тру ю тся как обы чны е карбоновы е ки слоты . Н аконец, су ммарное сод ержани е ами ноки слот часто опред еляю т пу тём реакци и по ами ногру ппам. Т акже д ля коли чественного опред елени я ами ноки слот при меняю тся хроматограф и чески е метод ы . В бу мажной хроматограф и и образ цы ами ноки слот наносят на бу магу , котору ю под веш и ваю т в сосу д е, на д не которого наход и тся смесь раствори телей. Д ля раз д елени я цви ттерли тов и спольз у ю тся полярны е раствори тели в ви д е смеси вод ы , спи ртов, ки слот и основани й. П олярны е раствори тели образ у ю т с целлю лоз ой

33 непод ви жну ю ф азу . Д алее бу магу обрабаты ваю т ни нги д ри ном в ацетоне и нагреваю т д о 1000 С. П еремещ ени е ами ноки слот, сод ержащ и х коротки е неполярны е цепи и ли полярны е боковы е цепи , прои сход и т мед леннее, чем д ви жени еами ноки слот сд ли нны ми неполярны ми боковы ми цепями [25]. Раз д елени е ами ноки слот возможно с помощ ью э лю ентной хроматограф и и на и онообменны х смолах. О бы чно и спольз у ю т колонки и з су льф и рованного поли сти рольного и онообменни ка с грану лами сф ери ческой ф ормы од и накового раз мера. А ми ноки слоты вы мы ваю тся растворами ци трата натри я при температу ре 500 С и значени ях рН от 3 д о 6. П ервы ми вы ход ят ами ноки слоты с д ву мя карбокси льны ми гру ппами в молеку ле (аспараги новая, глу тами новая ки слота). Затем след у ю т нейтральны е ами ноки слоты с од ной карбокси льной гру ппой и од ной ами ногру ппой в молеку ле. Ц ви ттерли ты с аромати чески ми кольцами (ти роз и н, ф ени лалани н) у д ержи ваю тся д ольш е д ру ги х. П ослед ни ми вы мы ваю тся“основны е” ами ноки слоты – ли зи н, три птоф ан, арги ни н [25]. Сотру д ни ками нау чной ш колы В .А . Д аванкова бы ли пред ложены метод ы разд елени я опти чески х и з омеров ами ноки слот, смесей пепти д ов и ами ноки слот на мод и ф и ци рованны х си ли кагелях и сверхсш и ты х сорбентах “Сти росорб” [26]. А вторами работы [27] пред ложено д ля э кстракци и ами ноки слот (в частности , ли зи на) при менять э кстраги ру ю щ у ю э му льси ю , в качестве органи ческой мембраны - д и -2- э ти лгекси лф осф орну ю ки слоту в и нертном разбави теле, контакти ру ю щ у ю свод ны м раствором. Д ля коли чественного опред елени я ами ноки слот можно при менять метод д и ф ф еренци альной и мпу льсной вольтамперометри и . А ми ноки слоты взаи мод ейству ю т с ф талевы м альд еги д ом в при су тстви и меркаптановы х соед и нени й , образу ю щ и еся и зои нд олы оки сляю тся на граф и товом э лектрод е. В ольтамперограммы полу чаю тся при скани ровани и потенци ала на ф онеборатного бу ф ерного раствора срН 9,2 [28]. Т акже возможно потенци ометри ческое опред елени е ами ноки слот с помощ ью ани он-селекти вны х э лектрод ов пленочного ти па на основе раствора броми д а тетрад еци ламмони я в д и бу ти лф талате. И змерени я Э Д С провод ят при постоянном значени и рН д ля опред еленной ами ноки слоты [29]. 5. ОС ОБ Е Н Н ОС Т И С П Е К Т Р ОФ ОТ ОМ Е Т Р И ЧЕ С К ОГ О ОП Р ЕД Е Л Е Н И Я АМ И Н ОК И С Л ОТ ВВОД Н Ы Х Р АС Т ВОР АХ Спектроф отометри ческое опред елени е ами ноки слот основано на поглощ ени и и х растворов в У Ф – области спектра и з-за нали чи я у цви ттерли тов π - э лектронной си стемы в у глевод ород ном рад и кале. Д ля вод ны х растворов аромати чески х ами ноки слот поглощ ени е в У Ф и ви д и мой областях спектра связано с переход ами валентны х э лектронов од и нарны х и кратны х связей (σ и π э лектроны ) и э лектронов

34 непод еленны х э лектронны х пар (n-э лектроны ). П оложени е полосы поглощ ени я опред еляется разностью э нерги й состояни й, межд у которы ми прои сход и т переход , и может бы ть охарактери зовано д ли ной волны в макси му ме полосы поглощ ени я [4,30]. Т аки е ами ноки слоты , как ф ени лалани н, ти рози н и три птоф ан и мею т в своей стру кту ре бензольное кольцо. След у ет отмети ть, что в спектрепоглощ ени ябензола наблю д аю тся три полосы поглощ ени я при 180, 203, и 256 нм [4]. У становлено, что э ти полосы в спектре сохраняю тся, несколько и зменяя своё положени е и и нтенси вность, д лявсех прои звод ны х бензола. Спектры поглощ ени я ами ноки слот д олжны бы ть запи саны в таки х у слови ях, чтобы опти мальны м образом и спользовать возможности спектроф отометри и , свед я к ми ни му му слу чай ны е и си стемати чески е и скажени я спектра. Д ля у странени я слу чай ны х ош и бок значени е си гнала д олжно су щ ественно превы ш ать у ровень ш у мов от при емни ка и злу чени я. Главной при чи ной си стемати чески х ош и бок является больш ая ш и ри на щ ели при бора, в э том слу чае полоса поглощ ени я оказы вается более ш и рокой и менееи нтенси вной. П овед ени е полос поглощ ени я при и спользовани и разли чны х раствори телей д ает и нф ормаци ю о свойствах поглощ аю щ ей молеку лы , об и х и зменени ях при опти ческом возбу жд ени и и о строени и поглощ аю щ ей сред ы в целом. Главное требовани е к раствори телю – прозрачность в области и сслед у емого поглощ ени я, поэ тому вод а является у ни версальны м раствори телем в спектроф отометри ческом опред елени и ами ноки слот, су щ ественно у меньш аяслу чайны еош и бки анали з а. Реальны е э лектронны е спектры ред ко сод ержат од ну полосу , обы чно наблю д ается несколько перекры ваю щ и хся полос. В и д д ву хполосного спектра зави си т от и х относи тельной и нтенси вности и взаи много расположени я. П ерекры вани е д ву х си мметри чны х бли зко расположенны х полос разной и нтенси вности при вод и т к появлени ю од ной си мметри чной полосы , макси му м которой смещ ен относи тельно его положени я в перви чной более и нтенси вной полосе. Е сли и нтенси вности перекры ваю щ и хся полос равны , су ммарная полоса си мметри чна и и меет макси му м посеред и не. Е сли же полосы у д алены д ру г от д ру га так, что расстояни е межд у макси му мами больш е и х полу ш и ри ны , они ви д ны разд ельно, и и х макси му мы несмещ ены [31,32]. Сред и важнейш и х характери сти к, вли яю щ и х на спектроф отометри ческое опред елени е ами ноки слот в вод ном растворе, необход и мо отмети ть таки е параметры , как рН раствора, его концентраци ю и время у становлени я равновеси я при растворени и цви ттерли та. Спектры поглощ ени я органи чески х соед и нени й, пред ставляю щ и х собой ки слоты и ли основани я, зави сят от рН сред ы . И з вестно, что ами ноки слоты могу т су щ ествовать в разли чны х и онны х ф ормах в з ави си мости от рН раствора [33]. И зменени е ки слотности раствора может

35 при вести к тому , что хи ми чески е превращ ени я пойд у т в нежелательном направлени и . К и слотность раствора может вли ять на положени е макси му ма основной полосы поглощ ени я и при вод и ть к его у ш и рени ю . В современны х и сслед овани ях особое вни мани е у д еляется и зу чени ю д анной проблемы . В работе[34] у становлено у ш и рени еи сд ви гмакси му ма полосы поглощ ени я в болеед ли нноволнову ю областьд лякати она (рН <3) и ани она (рН >7) ци стеи на. А вторы работы [35] вы яви ли смещ ени е макси му ма поглощ ени я ти рози на также в д ли нноволнову ю область спектра при рН больш е 9,2 и показали , что спектры поглощ ени я ами ноки слот при совместном при су тстви и перекры ваю тся. Н евоз можность разд ельного опред елени я ами ноки слот по поглощ ени ю в У Ф – области сд елало целесообразны м и спольз овани евари анта Ф и рорд а. О д ни м и з основны х и сточни ков погреш ности опред елени я показ ателя поглощ ени я ами ноки слот слу жи т погреш ностьопред елени я концентраци и и сслед у емого вещ ества. Д ля опти мальны х значени й абсорбци онности анали зи ру емое вещ ество д олжно и метьконцентраци ю поряд ка 10 -4 моль/л. В целях повы ш ени я точности при готовлени я раствора и сслед у емы й раствор готовят метод ом послед овательны х раз вед ени й . П ри спектроф отометри чески х и сслед овани ях цви ттерли тов след у ет обрати ть вни мани е на возможность образовани я ассоци атов ами ноки слот благод аря вод ород ны м связям протони рованны х ами ногру пп с д и ссоци и рованны ми карбокси льны ми гру ппами сосед ни х молеку л цви ттерли та. Разли чны ми ф и зи ко-хи ми чески ми метод ами у становлено проявлени е в растворах ами ноки слот ги д роф обны х и ги д роф и льны х э ф ф ектов, обу словленны х строени ем э ти х би омолеку л [36,37]. И зменени е в окру жени и молеку л цви ттерли та вли яет на вели чи ну молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени я, поэ тому у вели чени е концентраци и ами ноки слоты вы ш еопред еленного пред ела может при вести к отклонени ю от основного закона светопоглощ ени я[34]. В ремя у становлени я равновеси я, а также время “вы д ержки ” рабочи х растворов ами ноки слот вли яет на опти чески е характери сти ки растворов цви ттерли тов, в частности , может вы з вать у меньш ени е и нтенси вности и у ш и рени е макси му ма поглощ ени я и з-за и з менени я коли чества поглощ аю щ и х части ц, образовани я межмолеку лярны х и вну три молеку лярны х вод ород ны х связей в растворах ами ноки слот и ли переход а ами ноки слоты в мезомерну ю ф орму [13]. Т аки м образом, у чи ты вая особенности повед ени я ами ноки слот в вод ны х растворах, необход и мо рассмотреть при чи ны , вы з ы ваю щ и е отклонени я от основного закона светопоглощ ени я. О собы й и нтерес пред ставляет у становлени е вли яни я рН сред ы , концентраци и и времени у становлени я равновеси я в вод ны х растворах аромати чески х и гетероци кли чески х ами ноки слот на спектральны е характери сти ки растворов цви ттерли тов.

36 6. ВЫ Б ОР ОП Т И М АЛ Ь Н Ы Х У С Л ОВИ Й С П Е К Т Р ОФ ОТ ОМ Е Т Р И ЧЕ С К ОГ О ОП Р Е Д Е Л Е Н И Я АМ И Н ОК И С Л ОТ В ы бор опти мальны х у слови й коли чественного анали за ами ноки слот заклю чается в опред елени и вли яни я рН , времени у становлени яравновеси я при образовани и раствора ами ноки слоты в и нтервале концентраци и , в котором соблю д ается основной закон светопоглощ ени я. След у ет у чи ты вать, что область абсорбци онности , гд е относи тельная ош и бка ее опред елени янепревы ш ает 3%, заклю чена в пред елах 0,2 - 0,8 [4]. Д ля коли чественного опред елени я ами ноки слот (ф ени лалани на, ти роз и на, три птоф ана, ги сти д и на и ци стеи на) наи более у д обен способ град у и ровочного граф и ка. О д нако д ля вод ны х растворов, сод ержащ и х несколько и нд и ви д у альны х ами ноки слот, и з меряемая вели чи на абсорбци онности пред ставляет собой су мму абсорбци онностей опред еляемы х компонентов при у слови и , что межд у э ти ми компонентами нет хи ми ческого и ли д ру гого ти па взаи мод ействи я, которое оказы вало бы вли яни ена спектральны е характери сти ки поглощ аю щ и х вещ еств. П оэ тому д ля коли чественного опред елени я и нд и ви д у альны х аромати чески х и гетероци кли чески х ами ноки слот при и х совместном при су тстви и в растворе целесообраз но и спользовать при нци п ад д и ти вности Ф и рорд та [4, 35,38]. Д ля вы бора анали ти ческой д ли ны волны и и нтервала концентраци й , в котором соблю д ается основной закон светопоглощ ени я, ежед невно по точной навеске готовят станд артны й раствор ами ноки слоты опред еленной концентраци и , и спольз у яф армакопейны еобразцы . Д ляполу чени яраствора ами ноки слоты срН < pI и спользу ю т 0,005 М , 0,050 М и 0,100 М растворы HCl; с pH > pI – 0,1 M и 1 М растворы NaOH. П ри опред елени и ами ноки слот при меняю тся кю веты с толщ и ной поглощ аю щ его слоя 1 см. Спектры поглощ ени я полу ченны х растворов сни маю т при температу ре и змерени я рН раствора. Д ля опред елени я анали ти ческой д ли ны волны полу чаю т полны й спектр поглощ ени я вод ного раствора и сслед у емой ами ноки слоты (зави си мостьабсорбци онности от д ли ны волны ). И змерени я провод ят через 20 нм, и , опред ели в грани цы макси му ма, повторяю т и змерени я через 2 нм. В ы би раю т д ли ну волны , соответству ю щ у ю макси мальному значени ю абсорбци онности . 6.1. О пределение ф енилаланина Д ляспектра вод ного раствора ф ени лалани на характерно нали чи етрех макси му мов поглощ ени я при 191; 205 и 257 нм. М акси мальное з начени е абсорбци онности и более ш и рокая полоса поглощ ени я соответству ет д ли не волны 257 нм (ри с.5). М олярны й коэ ф ф и ци ент светопоглощ ени я составляет вели чи ну ε257 = 0,18·103 ± 0,01·103 л/моль·см.

37 A

λ, н м 191

205

257

Ри с .5. С пект р поглощен и яф ен и лан ан и н а Д ля построени яград у и ровочного граф и ка готовят сери ю станд артны х растворов с концентраци ями 0,5·10-3 - 5,00·10-3 моль/д м3, и спользу я и сход ны й раствор сконцентраци ей 5,00·10-3 моль/д м3. Д ляпри готовлени я станд артного раствора и спольз у ю т навеску ами ноки слоты не менее 50 мг [4]. В э той области концентраци й Phe наблю д ается ли нейная зави си мость межд у абсорбци онностью и концентраци ей , и значени я А лежат в пред еле 0,2 - 0,9. Н а ри с.6 при вед ен град у и ровочны й граф и к д ля опред елени я ф ени лалани на в вод ном растворе.

1,00

Ри с .6. Г р адуи р овочн ы й гр афи к дляопр еделен и я ф ен и лалан и н а

А

0,80 y = 181.27x - 0.0196 R2 = 0.9922

в водн о м р ас т вор е,

0,60

λ = 257 н м , р Н = 5,81,

0,40

С = 0,5·10-3 – 5,0·10-3 м оль/дм 3,

0,20

ε = 0,18·103 ± 0,01·103 л/(м м оль·с м )

C,моль/дм3 0,00 0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006

38 Влиян ие рН раствора н а спек тральн ы е харак теристик и. Н а ри с.7 пред ставлен спектр поглощ ени я д ля растворов ф ени лалани на с разны м з начени ем рН . П оложени е основного макси му ма поглощ ени я (λ = 257 нм) не зави си т от рН раствора в и нтервале 1,0 < рН < 9,0. Значени я рН раствора Phe более 9,5 при вод ят к некоторому у ш и рени ю макси му ма основной полосы поглощ ени яи смещ ени ю его в д ли нноволнову ю область спектра.

pH=1.04 0.1н HCl,pH=1.04

A

pH=2.44 0.005н.HCl,pH=2.44

0,48

pH=13.50 0.1н.NaOH,pH=13.5 pH=10.15

0,43

0.001н.NaOH,pH=10.15

pH=5.21 Phe0.0025 моль/д м3,рН =5.21

0,38

0,33

0,28

λ, н м

250

255

260

265

Ри с .7. С пект р ы поглощен и яр ас т вор ов Phe кон цен т р аци и 2,5·10-3 м оль/дм пр и р азли чн ы хзн ачен и ях р Н

3

Н а ри с.8 при вед ена з ави си мость молярного коэ ф ф и ци ента светопоглощ ени я от рН раствора ф ени лалани на. П остоянство значени й ε наблю д ается в области значени й 5,2 < рН < 9,5. Значени я рН раствора менее 5,2 при вод ят к у меньш ени ю з начени я молярного коэ ф ф и ци ента светопоглощ ени я. В и нтервале 1,0 < рН < 3,5 молярны й коэ ф ф и ци ент такжепостоянен, но при э том и меет меньш еезначени е.

39 м ε∗10−3 ,л/моль*с

184 180 176 172 168 164 0

2

4

6

8

рН

10

Ри с .8. Зави с и м о с т ь м оляр н ого коэфф и ци ен т а с вет опоглощен и я от р Н р ас т вор а Phe. Определен ие времен и устан овлен ия равн овесия в водн ом растворе фен илалан ин а. Д ля опред елени я времени у становлени я равновеси я в растворе ами ноки слоты сни мали ки нети ческу ю кри ву ю образовани я вод ного раствора ф ени лалани на (ри с.9). В течени е 24 часов с момента при готовлени я вод ного раствора ами ноки слоты наблю д ается и зменени е молярного коэ ф ф и ци ента светопоглощ ени я. Т аки м образом, согласно э кспери ментальны м д анны м, равновеси е в растворе при растворени и ф ени лалани на насту пает через 24 часа. Хранени е вод ного раствора ф ени лалани на болеетрех су ток вы зы вает у меньш ени е молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени яи у ш и рени емакси му ма поглощ ени я. Ри с .9. Зави с и м ос т ь м оляр н ого коэф фи ци ен т а с вет опоглощен и яот вр ем ен и вы дер ж ки р ас т вор а ф ен и лалан и н а с кон цен т р аци ей

ε∗10 −3 , л/моль*cм 0,21

0,20

0,19

0,5 ·10-3 м оль/дм 3,

0,18

р Н = 5,81, λ = 257 н м

0,17 0

10

20

30

40

50τ, час 60

40 6.2. О пределение т ирозина Спектр вод ного раствора ти роз и на (ри с.10) пред ставляет собой кри ву ю с тремя макси му мами поглощ ени я при 193; 222 и 274 нм. Н аи более вы раженному макси му му с больш и м з начени ем вели чи ны поглощ ени я соответству ет полоса поглощ ени я при 274 нм. Значени е 3 молярного коэ ф ф и ци ента светопоглощ ени я и меет вели чи ну ε274 = 1,50·10 3 ± 0,41·10 л/моль·см. Д ля при готовлени я станд артны х растворов ти рози на и спольз у ю т и сход ны й раствор с концентраци ей 1,0·10-3 моль/д м3. О бласть ли нейности град у и ровочного граф и ка и опти мальны е значени я абсорбци онности д ля вод ного раствора ти рози на соответству ю т и нтервалу концентраци и ами ноки слоты 0,1·10-3 – 0,7·10-3 моль/д м3 (ри с.11).

А

λ, н м 193

222

274

Ри с .10. С пект р по глощен и ят и р ози н а А

1,0 0,8 0,6

y=1.4029x+0 .0025 R2=0.9831

0,4 0,2

3

3

C*10 ,моль/дм

0,0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

Ри с .11. Г р адуи р овочн ы й гр аф и к для опр еделен и ят и р ози н а в водн ом р ас т вор е, λ = 274 н м , С = 0,10 - 0,70 3 м м оль/дм , р Н = 5,70, 3 3 ε = 1,50·10 ± 0,41·10 л/(м оль·с м )

41 Влиян ие рН раствора н а спек тральн ые харак теристик и. Д ля вод ны х растворов ти рози на в области з начени й 5,5 < рН < 10,0 положени е основного макси му ма поглощ ени я и его и нтенси вность не и зменяю тся (ри с.12,13). Д лярастворов ами ноки слоты срН > 10,0 характерно у ш и рени е и сд ви г макси му ма в д ли нноволнову ю область спектра (λ = 291 нм), у меньш ени е и нтенси вности . Д ля растворов ти рози на с рН <5,5 наблю д ается у меньш ени е вели чи ны поглощ ени я при сохранени и анали ти ческой д ли ны волны .

0,7

А

pH=6.00 0.4 м м о ль/л, рН =6 pH=2,4 pH=2.40 pH=1,2 0.4м м о ль/л,0.005 н .HCl

0,6

pH=13,6

pH=1.20 0.4 м м о ль/л, 0.1н HCl

pH=12,2

0,5

pH=13.60 0.4 м м о ль/л, 0.1 н .NaOH pH=12.20

0.4 м м о ль/л, 0.001 н .NaOh

pH=9,5

0,4

pH=9.50 0.4 м м о ль/л, 2 м

л 0.001 н .NaOH

0,3

0,2

0,1

0 240

λ ,н м

250

260

270

280

290

300

310

320

Ри с .12. С пект р ы поглощен и яр ас т вор о в т и р ози н а с кон цен т р аци ей 0,4 ⋅10 м оль/дм -3

3

пр и р азн ы хзн ачен и ях р Н

42 1,6

Ри с .13. Зави с и м ос т ь м оляр н ого коэф фи ци ен т а поглощен и яот

ε ∗ 10 −3 , л/моль*см

1,2

рН дляр ас т вор ов т и р о зи н а с кон цен т р аци ей 0,4⋅10-3 м оль/дм 3

0,8

0,4

рН

0 0

2

4

6

8

10

12

Определен ие времен и устан овлен ия равн овесия в водн ом растворе тирозин а. Н а ри с.14 при вед ена ки нети ческая кри вая образовани я вод ного раствора ти рози на. Согласно э кспери ментальны м д анны м, равновеси е в растворе ами ноки слоты насту пает в течени е 10 ми ну т. Значени я молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени я не и зменяю тся (значени е его наход ятся в пред елах ош и бки метод а) в течени е 24 часов. В ы д ержи вани е раствора ти роз и на более су ток при вод и т к у меньш ени ю молярного коэ ф ф и ци ента поглощ ени яи у ш и рени ю макси му ма. Ри с .14. Зави с и м о с т ь м о ляр н ого коэф фи ци ен т а поглощен и яо т вр ем ен и вы дер ж и ван и я в р ас т вор е т и р ози н а, р Н = 5,70, λ = 274 н м , с = 0,25·10-3 м о ль/дм 3

−3

ε∗10 , л/(моль* см) 1,60

1,50

1,40

1,30 0

10

20

30

40

50

60 t, час

43 6.3. О пределение т рипт оф ана Н а ри с.15 при вед ен спектр поглощ ени я три птоф ана. Д ля него характерно нали чи е слабы х полос поглощ ени я при 196 и 279 нм и и нтенси вной полосы поглощ ени я с макси му мом 219 нм. В ели чи на ε д ля полосы поглощ ени я в макси му ме поглощ ени я при 219 нм и меет вели чи ну 3 3 ε 279 = 5,63·10 ± 0,17·10 л/моль·см. А

λ, н м

196

219

279

Ри с .15. С пект р поглощен и ят р и пт офан а Д ля опред елени я области концентраци й , в которой соблю д ается основной закон светопоглощ ени я и абсорбци онность и меет опти мальны е з начени я, и спользу ю т раствор с концентраци ей 0,15·10-3 моль/л. Затем метод ом послед овательного разбавлени я полу чаю т станд артны е растворы в области концентраци й 0,04·10-3 – 0,15·10-3 моль/л, д ля которы х вели чи на абсорбци онности ли нейно зави си т от концентраци и и и меет опти мальное з начени е(ри с.16). Ри с .16. Г р адуи р овочн ы й гр аф и к дляопр еделен и я т р и пт оф ан а в водн ом р ас т вор епр и

А

1,0 0,8 0,6

λ = 279 н м ,

0,4

y = 56.34x + 0.0117 R2 = 0.9975

0,2 0,0 0

0,004

0,008

0,012

C*103, моль/дм3 0,016

р Н = 5,77, С = 0,04 – 0,15 м м оль/дм 3, ε = 5,63·103 ± 0,17·103 л/(м м оль·с м )

44 Влиян ие рН раствора н а спек тральн ые харак теристик и. Д ля вод ны х растворов три птоф ана положени е основного макси му ма поглощ ени я и вели чи на εсохраняю тсянеи зменны ми в и нтервале 3,0 < рН <9,2 (ри с.17). Значени я рН раствора более 9,2 при вод ят к возрастани ю вели чи ны поглощ ени я, при э том положени е макси му ма полосы поглощ ени янеи зменяется. −3 ε⋅10 , л/моль ⋅см

8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 0

2

4

6

8

10

рН

12

Ри с .17. Зави с и м ос т ь м о ляр н ого коэф ф и ци ен т а с вет опоглощен и я т р и пт оф ан а от р Н р ас т вор а с кон цен т р аци ей Trp 0,15·103 м оль/дм 3 Определен ие времен и устан овлен ия равн овесия в водн ом растворе трип тофан а. В слу чае образовани я вод ного раствора три птоф ана равновеси енасту пает через 18 часов смомента при готовлени я раствора (ри с.18). П ри хранени и вод ного раствора три птоф ана более трех су ток спектральны е характери сти ки его и зменяю тся (наблю д ается у вели чени е и нтенси вности поглощ ени я и некоторое смещ ени е од ного макси му ма в д ли нноволнову ю областьспектра).

45

Ри с .18. Зави с и м ос т ь м оляр н ого коэффи ци ен т а с вет опогло щен и я

−3

ε⋅10 , л/моль⋅см 5,8 5,6

от вр ем ен и вы дер ж и ван и я р ас т вор а т р и пт оф ан а с кон цен т р аци ей 0,12·103 м оль/дм 3, р Н =5,77,

5,4 5,2 5,0 4,8 0

20

40

60

80

100

120

λ = 279 н м .

τ, час

6.4. О пределение гист идина Д ля спектра поглощ ени я ги сти д и на (ри с.19) характерно нали чи ед ву х макси му мов поглощ ени я при 190 и 210 нм. А нали ти ческой д ли не волны соответству ет макси му м при 210 нм, так как являетсянаи болееш и роки м и характери зу ется больш ей вели чи ной и нтенси вности поглощ ени я. Д ля 3 3 вы бранной д ли ны волны вели чи на εи меет значени еε210 = 4,0·10 ± 0,20·10 л/моль·см. Д ля построени я град у и ровочного граф и ка и спользу ю т и сход ны й раствор ги сти д и на с концентраци ей 0,20·10-3 моль/д м3 . Л и нейность концентраци онной зави си мости вели чи ны абсорбци онности в области 0,20,9 соблю д ается в и нтервале концентраци й ги сти д и на 0,04·10-3 – 0,20·10-3 моль/д м3 (ри с.20).

46 A

λ ,н м 192

210

Ри с . 19. С пект р погло щен и яги с т и ди н а 1,0

A

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 0,00000 0,00004 0,00008

y = 3872,976x + 0,033 2 R = 0,994

C,моль/дм3

Ри с .20. Г р адуи р ово чн ы й гр аф и к для опр еделен и я ги с т и ди н а в водн ом р ас т вор е пр и λ=210 н м , С = 0,04·10-3 – 0,2·103 м оль/дм 3, р Н = 6,01, ε = 4,00·103 ± 0,2·103 л/(м м оль·с м )

0,00012 0,00016 0,00020

Влиян ие рН раствора н а спек тральн ы е харак теристик и. Спектры поглощ ени я при раз ли чны х з начени ях рН при вед ены на ри с.21. А нали ти ческаяд ли на волны (210 нм) сохраняетсяпри и з менени и значени й рН раствора от 3,5 д о 7,5. След у ет отмети ть, что д ля э ти х растворов вели чи на коэ ф ф и ци ента поглощ ени я не зави си т от рН раствора

47 ами ноки слоты (ри с.22). Сни жени е вели чи ны рН д о 2,0 при вод и т к некоторому повы ш ени ю и нтенси вности поглощ ени я. Д альнейш ее сни жени е рН раствора оказы вается вли яни е на ви д спектра поглощ ени я ги сти д и на. Н а спектре ами ноки слоты основная полоса поглощ ени я проявляется в ви д е порога. Д ля полосы при 190 нм наблю д аетсясмещ ени е в д ли нноволнову ю область спектра и у вели чени е и нтенси вности макси му ма. Значени я рН раствора более 7,5 оказы ваю т вли яни е на вели чи ну коэ ф ф и ци ента поглощ ени я. 1,800

A

1,500 1,200

pH=0,35 pH=3,85 pH=5,8 pH=7,53

0,900 0,600 0,300

λ, н м 0,000 180

190

200

210

220

230

240

Ри с .21. С пект р ы поглощен и яр ас т вор ов ги с т и ди н а с кон цен т р аци ей 0,1 м м оль/дм 3 и р азли чн ы м и зн ачен и ям и р Н e *1 0-3 , л /м о л ь*с м 4,5

4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 3,0

4,0

5,0

6,0

рН 7,0

Ри с .22. Зави с и м о с т ь м оляр н ого коэфф и ци ен т а с вет опо глощен и я ги с т и ди н а от р Н с р еды , С = 0,10 м м оль/дм 3, λ = 210 н м

48 Определен ие времен и устан овлен ия равн овесия в растворе гистидин а. Согласно э кспери ментальны м д анны м (ри с.22), равновеси е в растворе при растворени и ги сти д и на насту пает в течени е 72 часов с момента при готовлени я раствора. У вели чени е д ли тельности процесса у становлени я равновеси я при растворени и ги сти д и на может опред еляться образовани ем в растворе мезомерны х ф орм ами ноки слоты . П ереход от од ной ф ормы к д ру гой при образовани и раствора His сопровожд ается и зменени ями в э лектронны х спектрах поглощ ени я, что и проявляется в и зменени и спектральны х характери сти к вод ного раствора ами ноки слоты . ε∗10 −3 , л /м о л ь*с м

5,0

4,7

4,4

4,1

3,8 0

20

40

60

80

100 τ, час

Ри с .22. Зави с и м ос т ь м оляр н ого коэф ф и ци ен т а с вет о погло щен и яо т вр ем ен и вы дер ж и ван и яр ас т во р а ги с т и ди н а (с = 0,25 м м оль/дм 3, λ = 210 н м )

6.5. О пределение цист еина Д ля спектра поглощ ени я ци стеи на (ри с.23) характерно нали чи е од ного макси му ма поглощ ени я при 193 нм. Д ля д анной д ли ны волны вели чи на εи меет значени еε193 = 2,30·103 ± 0,20·103 л/моль·см.

49 A

0,8

0,6

0,4

0,2

λ, н м 0 180

185

190

195

00 2

205

21 0

215

220

225

193

Ри с .23. С пект р поглощен и яци с т еи н а Д ля построени я град у и ровочного граф и ка и спользу ю т и сход ны й раствор ци стеи на с концентраци ей 1,0·10-3 моль/д м3 . Л и нейность концентраци онной зави си мости вели чи ны абсорбци онности в области 0,2 0,9 соблю д ается в и нтервале концентраци й ци стеи на 0,04·10-3 – 0,30·10-3 моль/д м3 (ри с.24).

y = 2599,4x + 0,0733 R2 = 0,989

A 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0000

0,0001

0,0002

0,0003 0,0004 С , м о л ь/дм 3

Ри с .24. Г р адуи р овочн ы й гр афи к дляопр еделен и яци с т еи н а в водн ом р ас т вор епр и λ = 193 н м , С = 0,04 – 0,3 м м оль/дм 3, р Н = 5,02, ε = 2,3·103 ± 0,2·103 л/(м оль·с м )

50 Влиян ие рН раствора н а спек тральн ы е харак теристик и. Смещ ени е макси му ма поглощ ени я при и зменени и рН пред ставлено в табли це2. Т абли ца 2. Зави си мостьд ли ны волны макси му ма поглощ ени яраствора ци стеи на от рН рН

1

3

4

5

6

12

λ max, н м

200

195

193

193

192

199

Д ля растворов ами ноки слоты , в которы х ци стеи н при су тству ет в основном в ф орме кати она (рН < 3) и ли в ф орме ани она (рН > 7), характерно у вели чени е абсорбци онности во всем и сслед ованном и нтервале д ли н волн, у ш и рени е и сд ви г макси му ма полосы поглощ ени я в болеед ли нноволнову ю областьспектра. Д лярастворов ци стеи на срН 3 - 7 ± (область преоблад ани я Cys ) не наблю д ается и з менени й в его спектрах поглощ ени я. Определен ие времен и устан овлен ия равн овесия в растворе цистеин а. Согласно э кспери ментальны м д анны м, равновеси е в растворе при растворени и ци стеи на насту пает в течени е 48 часов с момента при готовлени яраствора. У вели чени е д ли тельности процесса у становлени я равновеси я при растворени и Cys вы з ы вает у меньш ени е и нтенси вности и у ш и рени емакси му ма светопоглощ ени я.

51 Заклю чени е Т аки м образом, при вы боре опти мальны х у слови й коли чественного анали за ами ноки слот след у ет у чи ты вать вли яни я рН сред ы , времени у становлени я равновеси я при образовани и раствора ами ноки слоты в опред еленном и нтервале концентраци и при соблю д ени и основного закона светопоглощ ени я (абсорбци онность д олжна наход и ться в пред елах 0,2 0,8). Д ля коли чественного опред елени я и сслед у емы х ами ноки слот (ф ени лалани на, ти рози на, три птоф ана, ги сти д и на и ци стеи на) след у ет при менять способ град у и ровочного граф и ка. Д ля вод ны х растворов, сод ержащ и х смесь и нд и ви д у альны х аромати чески х и гетероци кли чески х ами ноки слот, вели чи на абсорбци онности бу д ет пред ставлять собой су мму абсорбци онностей опред еляемы х компонентов. Э тот при нци п ад д и ти вности Ф и рорд та вы полняется при отсу тстви и межд у э ти ми компонентами хи ми ческого и ли д ру гого ти па вз аи мод ействи я, оказ ы ваю щ его вли яни я на спектральны е характери сти ки поглощ аю щ и х вещ еств. В д анном у чебном пособи и и злагаю тсяосновы метод а абсорбци онной спектроскопи и (спектроф отометри и ) в современном аспекте. П ри вед ены при меры при менени я абсорбци онно-спектроф отометри ческого метод а д ля и зу чени я равновеси й в растворах ами ноки слот, а также д ан ряд конкретны х при меров опред елени я констант д и ссоци аци и регентов, констант у стойчи вости комплексов и и х состава. П оказано нахожд ени е селекти вны х у слови й опред елени я и зу чаемы х ами ноки слот в вод ны х растворах.

52 7. Л И Т Е РА Т У РА 1. Ску г Д . О сновы анали ти ческой хи ми и / Д . Ску г, Д . У э ст. М .: М и р, 1979. Т .2. 438 с. 2. В аси льев В .П . А нали ти ческая хи ми я/ В .П . В аси льев. М .: В ы сш ая ш кола, 1989. Т .2. 384 с. 3. О сновы анали ти ческой хи ми и . М етод ы хи ми ческого анали за: У чеб. д ляву з ов/ Ю .А . Золотов, Е .Н . Д орохова, В .И . Ф ад еева и д р.; П од ред . Ю .А . Золотова. М .: В ы сш аяш кола, 1999. 494 с. 4. Сверд лова О .В . Э лектронны е спектры в органи ческой хи ми и / О .В . Сверд лова. Л : Х и ми я, 1985. 248 с. 5. Ш терн Э . Э лектроннаяабсорбци оннаяспектроскопи яв органи ческой хи ми и / Э . Ш терн, К . Т и ммонс. М .: М и р, 1974. 296 с. 6. Бернш тейн И .Я . Спектроф отометри чески й анали з в органи ческой хи ми и / И .Я . Бернш тейн, Ю .Л . К ами нски й. Л .: Х и ми я,1975. 232 с. 7. Сайд ов Г.В . П ракти ческое ру ковод ство по молеку лярной спектроскопи и / Г.В . Сайд ов, О .В . Сверд лова. Л .: Л ГУ , 1980. 136 с. 8. Гри горьев Я .М . Спектрохи ми я вну три - и межмолеку лярны х вз аи мод ействи й / Я .М . Гри горьев, О .В . Сверд лова, О .И . Богачева. Л ., 1964. С. 206-228. 9. П оли нгЛ . О бщ аяхи ми я/ Л . П оли нг. М .,1964. С.370-372. 10.Сави цкая Е .М . И онообменная технологи я би ологи чески акти вны х вещ еств / Е .М . Сави цкая, Л .Ф . Я хонтова, П .С. Н ы с. // И онны й обмен. М ., 1981. С. 229-248. 11.Гу рскаяГ.В . Стру кту ра ами ноки слот / Г.В . Гу рская. М .: Н ау ка, 1966. 159 с. 12.Самсонов Г.В . И онны й обмен. Сорбци я органи чески х и онов / Г.В . Самсонов, Е .Б. Т ростянская, Г.Э . Е льки н Г.Э . Л .: Н ау ка, 1969. 336 с. 13.Селеменев В .Ф . О бменны е процессы и межмолеку лярны е вз аи мод ействи я в си стеме и они т – вод а – ами ноки слота: А втореф .д и с… .д окт. хи м. нау к /В .Ф . Селеменев. В оронеж, 1993. 587 с. 14.Hecht D. Correlating hydration shell structure with amino acid hydrophobicity / D. Hecht, L. Tadesse, L. Walters // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 115. P. 3336-3337. 15.Э йзенбергД . Стру кту ра и свойства вод ы / Д .Э йзенберг, В . К ау цман. Л .: Ги д рометеои зд ат, 1975. 289 с. 16.Би рш тейн Т .М . Ги д роф обное взаи мод ействи е неполярны х молеку л /Т .М . Би рш тейн // Состояни е и рольвод ы в би ологи чески х объектах. М .,1967. С. 16-30. 17.Д ости жени я и проблемы теори и сольватаци и : стру кту рнотермод и нами чески е аспекты / В .К . А броси мов, А .Г. К рестов, Г.А . А льпер и д р. М .: Н ау ка, 1998. 247 с.

53 18.Х у рги н Ю .И . Ги д роф обнаяги д ратаци яали ф ати чески х ами ноки слот / Ю .И . Х у рги н, А .А . Баранов, М .М . В оробьев // И звести я А Н СССР. Сер.хи м. 1994. № 11. С. 2031-2033. 19.И К - спектроскопи ческое и зу чени е состояни я вод ы в д и оксане и ацетони три ле / В .А . Си ротки н, Б.Н . Соломонов и д р. // Ж у рн. стру кт.хи ми и . 2000. Т .41,№ 6. С. 1205-1212. 20.И сслед овани е ги д ратаци и α – ами ноки слот метод ом абсорбци онной ми лли метровой спектроскопи и / М .М . В оробьев, А .А . Баранов, В .М . Бели ков и д р. // И звести яА Н СССР. Сер.хи м. 1996. № 3. С.618-622. 21.Ч абан И .А . К онцентраци онны й и нтервал разру ш ени я сетки вод ород ны х связей вод ы в вод ны х растворах неэ лектроли тов / И .А . Ч абан, М .Н . Род ни кова, В .В . Ж акова // Би оф и зи ка. 1996. Т . 41, вы п 2. С. 6. 22.Райхард К . Раствори тели и э ф ф екты сред ы в органи ческой хи ми и / К . Райхард . М .: М и р, 1991. 763 с. 23.К аррер П . К у рс органи ческой хи ми и / П . К аррер. Л .: Госхи ми з д ат, 1962. 1216 с. 24.Н есмеянов А .Н . Н ачала органи ческой хи ми и / А .Н . Н есмеянов, Н .А . Н есмеянов. М .: Х и ми я, 1974. Т .2. 744 с. 25.Ри ман В . И онообменная хроматограф и я в анали ти ческой хи ми и / В . Ри ман, Г. У олтон; П ер. с англ. Н .К . Галки ной , Г.М . К олосовой и д р. М .: М и р,1973. 375 с. 26.Д аванков В .А . Л и ганд ообменная хроматограф и я / В .А . Д аванков, Д ж. Н аврвати л, Х . У олтон. М .: М и р, 1990. 294 с. 27.О пред елени е некоторы х α – ами ноки слот метод ами проточнои нжекци онного и непреры вного проточного анали за с и спользовани ем мембранной э кстракци и / Н .А .Ф и цева, И .И . Стойков, И .М . Ф и цев И .М . и д р. // Ж у рн. анали т. хи ми и . 1998. Т .53, № 7. С. 729-733. 28.О возможности вольтамперометри ческого опред елени я α – ами ноки слот / В .К . Ш вяд ас, И .Ю . Галаев, Н .И . Л япу нова и д р// В естни к М ГУ . Сер.2.Х и ми я, 1984. В ы п.25, № 1. С. 56-58. 29.Ф и зи ко-хи ми чески е основы сорбци онны х и мембранны х метод ов вы д елени яи разд елени яами ноки слот/ В .Ф . Селеменев, В .Ю . Хохлов, О .В . Бобреш ова и д р. М осква: СТ Е Л А Й Т , 2001. 300 с. 30.К ази ци на Л .А . П ри менени е У Ф -, И К -, Я М Р- и масс-спектроскопи и в органи ческой хи ми и / Л .А . К аз и ци на, Н .Б. К у плетская. М .: И зд -во М ГУ , 1979. 240 с. 31.Д ени сов Г.С. М олеку лярная спектроскопи я / Г.С. Д ени сов, Б.С. Т еру ш ки н. Л ., 1981. В ы п.5. С. 232-267. 32.Бахш и ев Н .Г., Глебовски й Д .Н ., Бед ри на М .Е . // Ж у рнал при кл. спектроскопи и . 1983. Т .38, № 5. С. 251-255. 33.Л ени нд жер А . Би охи ми я/ А . Л ени нд жер. М .: Хи ми я. 1985. 946 с.

54 34.Спектроф отометри ческое опред елени е ци стеи на в вод ном растворе/ О .И . Рожнова, Д .Л . К отова, В .Ф . Селеменев, Т .А . К ры санова // Ж у рн. анали т. хи ми и . 1999. Т .54,№ 12. С. 1265-1267. 35.Спектроф отометри ческое опред елени е ф ени лалани на и ти рози на/ В .Ф . Селеменев, В .Ю . Хохлов, Н .Я . К оренман, Е .В . Л овчи новская // Ж у рн. анали т.хи ми и . 1994. Т .49, № 4. С. 446-447. 36.А броси мов В .К . В ли яни е связанны х с ги д ратаци ей α – ами ноки слот стру кту рны х и зменени й вод ы на термод и нами чески е характери сти ки растворени я аргона при 283 – 328 К / В .К . А броси мов, Г.В . Си бри на // Стру кту рная хи ми я. 1990. Т .31, № 3. С. 60. 37.Ги д ратаци онны е характери сти ки аромати чески х ами ноки слот / Д .Л . К отова, Д .С. Бей ли на, В .Ф . Селеменев и д р. // Хи м.- ф арм. жу рнал. 2001. Т .35, № 4.С. 44 – 45. 38.Спектроф отометри ческое опред елени е аромати чески х и гетероци кли чески х ами ноки слот в и х смесях / А .В . К азначеев, О .Н . Хохлова, В .Ф . Селеменев, В .Ю . Хохлов, Н .Я . М окш и на // Ж у рн. анали т.хи ми и . 2000. Т .55, № 4. С. 375-377.

55

А вторы :

К отова Д и ана Л и патьевна К ры санова Т атьяна А натольевна Е ли сеева Т атьяна В и кторовна

Ред актор

Т и хоми рова О .А .