Биотехника размножения: Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий

Петрозаводский государственный университет

БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» для студентов 4 курса специальности 3107 «Зоотехния»

Петрозаводск 2002 1

Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники «Проблемы агропромышленного комплекса» 20 мая 2002 г.

Печатаются по решению редакционно-издательского совета Петрозаводского государственного университета

Составители: И.П.Комлык, канд. с.-х. наук, доцент кафедры зоотехнии В.Ю.Сиротинина, ст. преподаватель кафедры зоотехнии

Электронный вариант тетради находится по адресу: http://www.karelia.ru/psu/Chairs/zootech.html

2

СОДЕРЖАНИЕ Введение……………………………………………

4

Тема 1. Подготовка материалов, применяемых при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных…………………..………………………

5

Тема 2. Методы получения спермы. Порядок подготовки искусственной вагины………..……………………

10

Тема 3. Оценка спермы по внешним признакам. Визуальная оценка активности и концентрации спермиев……………………………………………

13

Тема 4. Определение концентрации спермиев в счетных камерах……………………………………………..

21

Тема 5. Определение резистентности спермиев………….

26

Тема 6. Оценка спермы по интенсивности дыхания……..

27

Тема 7. Определение процента живых спермиев…………

29

Тема 8. Влияние на спермии физических и химических факторов……………………………………………

32

Тема 9. Исследование глубокозамороженного семени…..

37

Тема 10. Учет и отчетность в искусственном осеменении

40

Тема 11. Организация работы по получению, разбавлению и замораживанию спермы быков на племпредприятии «Карельское»……………………….

43

3

Введение Искусственное осеменение – крупнейшее достижение биологической науки ХХ века. В течение последних 50 лет искусственное осеменение является основным зоотехническим методом воспроизводства сельскохозяйственных животных. Он широко используется как для контроля заболеваний скота, передающихся половым путем, так и для улучшения генетических показателей сельскохозяйственных животных. Использование криоконсервантов для глубокого замораживания спермы позволило продлить жизнь спермиев, полученных от высокоценных племенных производителей, открыло возможности для транспортировки семени в отдаленные регионы России и за рубеж. Прогресс эндокринологической науки в области размножения самок сельскохозяйственных животных привел к развитию методов синхронизации эструса с использованием простагландинов или прогестагенов. Это позволило внедрить в зооветеринарную практику метод трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Несмотря на прогресс, достигнутый в области искусственного осеменения, существуют проблемы с использованием замороженного семени в свиноводстве и овцеводстве. Большой интерес представляет изучение морфологии и биохимии спермиев, рассмотрение влияния семенной плазмы на жизнеспособность спермиев, изучение механизмов акросомной реакции и капацитации спермиев. Данные методические указания разработаны для приобретения навыков практической работы в области искусственного осеменения в соответствии с программой курса «Акушерство, гинекология и биотехника размножения».

4

Тема 1. Подготовка материалов, применяемых при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных Приборы и материалы. Колбы, воронки, мензурки разного объема, мерные стаканы и цилиндры, флаконы, баночки с притертыми крышками (100 мл – три, 400 мл - одна), спиртометры, стеклянные палочки; пинцеты, ножницы, корнцанги, влагалищные зеркала, спермоприемники, шприцы-катетеры, ампулы, полиэтиленовые перчатки; сода двууглекислая и кальцинированная, хлористый натрий (в таблетках), спирт 96%-ный, дистиллированная вода; марля, вата белая, фильтровальная бумага; сушильный шкаф, стерилизатор.

Задание 1. Освоить методику обработки инструментов и посуды, приготовления растворов, применяемых при получении, разбавлении, расфасовке спермы и при искусственном осеменении самок сельскохозяйственных животных. 1. Порядок работы при использовании разных методов обеззараживания посуды и инструментов. Порядок мойки посуды и инструментов.

Обеззараживание жаром.

5

Автоклавирование.

Кипячение.

Фламбирование.

Обеззараживание спиртом.

6

Обеззараживание ультрафиолетовым облучением (УФО).

2. Порядок приготовления растворов для использования на пунктах искусственного осеменения. Приготовление 70%-ного спирта.

Приготовление раствора соды: а) кальцинированной

б) двууглекислой

7

Приготовление раствора фурацилина.

Приготовление 1%-ного раствора хлористого натрия.

Приготовление раствора лимоннокислого натрия.

3. Приготовление стерильных ватных тампонов и марлевых салфеток.

8

Задание 2. Перечислите инструменты, применяемые при разных методах искусственного осеменения самок сельскохозяйственных животных, и наиболее эффективные методы их обработки. Опишите технику осеменения коров и телок. 1. Визо-цервикальный метод.

2. Мано-цервикальный метод.

3. Ректо-цервикальный метод.

9

Тема 2. Методы получения спермы. Порядок подготовки искусственной вагины Приборы и материалы. Искусственные вагины в разобранном виде, подставки для искусственных вагин; стерильные марлевые салфетки, ватные тампоны, пропитанные 96%-ным спиртом; 70%-ный спирт, 2,8-3,0%-ный раствор цитрата натрия; пинцеты, корнцанги, ерши для мытья вагин, термометры; мерные стаканы, стеклянные палочки, воронки, сливные чашки; горячая и холодная вода.

Задание 1. Изучить устройство искусственной вагины и правила ее сборки. Цилиндр.

Таблица 1 Размеры цилиндра искусственной вагины для разных видов животных Вид животного Баран Бык Жеребец Хряк

Длина (см) 20 50 54 30-35

Резиновая камера (трубка).

10

Диаметр (см) 5,5 8-9 13 6-9

Эбонитовый краник, резиновая трубка.

Резиновые кольца.

Резиновый держатель для спермоприемника.

Спермоприемник.

Сборка искусственной вагины.

11

Задание 2. Описать порядок подготовки искусственной вагины для получения спермы от быка. Зарисовать правильно собранную вагину. Указать, какие условия должны соблюдаться при взятии спермы.

12

Тема 3. Оценка спермы по внешним признакам. Визуальная оценка активности и концентрации спермиев Приборы и материалы. Микроскопы, нагревательные столики Морозова, предметные и покровные стекла, термометры, мерные цилиндры на 10-15 мл, стеклянные палочки, воронки, сливные чашки, горячая и холодная вода, марлевые салфетки.

Задание 1. Изучить анатомическое строение спермия. У спермия различают головку, шейку, тело и хвост. Головка является носителем наследственной информации. Шейка, тело и хвост – двигательная часть спермия. Таблица 2 Величина спермиев в микронах (1 микрон (μ) = 0,001 мм) Вид животного

Длина спермия

Баран Бык Жеребец Хряк

66-75 65-72 58-60 55-57

Головка дли- ши- тол- Шейка Тело на ри- щина на 8 5 1 1,5 13,6 9 4 1 1,0 10-13 7 4 2 неот10,0 8 4 1 личима 11,0-11,8 от тела

Хвост 42 44-53 42-43 33-38

Приготовление раздавленной капли. На чистое предметное стекло нанести стеклянной палочкой каплю исследуемой спермы, накрыть покровным стеклом. Капля должна быть среднего размера. Если капля слишком маленькая, то под покровным стеклом останутся свободные промежутки или образуются пузырьки воздуха, что будет затруднять исследование. Если капля очень большая, сперма вытекает из-под покровного стекла (стекло плавает), при этом может попасть на объектив, затруднив правильность наводки поля зрения и нарушив тем самым процесс исследования.

13

Микроскопирование спермы. Исследование спермы под микроскопом с несколькими объективами начинают с установки поля зрения при малом увеличении. Затем, переведя револьвер микроскопа, устанавливают объектив нужного увеличения. Резкость при этом сохраняется или требует незначительной регулировки микровинтом микроскопа. Сперма очень чувствительна к температурным колебаниям. При резком ее охлаждении наступает холодовой удар (температурный шок), движение спермиев прекращается, значительная часть их погибает. Чтобы не допустить этого, работу со спермой следует проводить в помещении с температурой 18-250С. Если температура ниже 180С, необходимо пользоваться специальным термостатом или обогревательным столиком. Исследование на подвижность спермы, охлажденной до 00С, проводят обязательно при температуре 38-400С в термостате или на обогревательном столике. Порядок работы 1. Подготовить к работе микроскоп, обогревательный столик Морозова. 2. Приготовить раздавленную каплю спермы быка. 3. При наблюдении под микроскопом за двигающимися и вращающимися вокруг продольной оси спермиями можно видеть, что головка представляет собой вогнуто-выпуклую пластинку овальной формы и несколько суженную со стороны шейки. Короткой и тонкой шейкой головка прикреплена к телу спермия; длина его вдвое больше, чем головка. Внутри шейки, тела и хвоста спермия проходит осевая нить, состоящая из 2 центральных фибрилл и окружающих их 9 тонких фибрилл. В теле спермия параллельно тонким фибриллам расположено наружное кольцо из 9 грубых фибрилл. В хвосте грубые фибриллы отсутствуют. Конец хвоста свободен от оболочки.

14

4. Зарисовать спермии (рис. 1).

Рис. 1. Анатомическое строение спермия. Задание 2. Ознакомиться с органолептическими показателями спермы здоровых производителей разных видов животных. Объем эякулята определяют по делениям цилиндра или мензурки, в которые переливают эякулят. Предварительно их прогревают до 25-300С. Объем эякулята быка и барана можно определить также при помощи теплой стерильной пипетки или шприца. Для определения объема эякулята жеребца и хряка полученную сперму процеживают через сложенную вдвое или вчетверо стерильную марлевую салфетку. На марле остается густой, тягучий секрет пузырьковидных желез. Его объем учитывают отдельно. Так как этот секрет снижает жизнеспособность спермиев при хранении, затрудняет работу со спермой и при искусственном осеменении не нужен, его выбрасывают. У производителей одного вида животных и даже у одного и того же самца объем эякулята подвержен колебаниям, связанным с условиями кормления, содержания и режима полового использования.

15

Таблица 3 Объем эякулята производителей разных видов сельскохозяйственных животных Вид животного Баран Бык Жеребец Хряк

Объем эякулята (мл) минимальный средний максимальный 0,6 1,0-1,5 3-4 2 4-6 10-15 40-50 60-80 200-300 150 250-400 600-1000

Цвет спермы характерен для производителей каждого вида сельскохозяйственных животных и зависит главным образом от насыщенности спермы сперматозоидами. В норме сперма быка белая, иногда желтоватая; сперма барана белая с желтоватым оттенком; сперма жеребца и хряка серовато-белая (наподобие цвета молока, сильно разбавленного водой). Изменение цвета спермы свидетельствует о наличии в ней примесей, снижающих ее качество. Розовый или красноватый цвет эякулята (примесь крови) свидетельствует о наличии свежей травмы половых органов самца. При давней травме эякулят имеет буро-красный цвет. Иногда у производителей во время эрекции могут происходить разрывы мелких капилляров уретрального канала, сперма при этом окрашивается свежей кровью в темно-красный цвет. Зеленоватый цвет спермы указывает на наличие в ней гноя. Интенсивно желтый цвет бывает при попадании в эякулят мочи. Запах спермы. Обычно сперма не имеет особого, специфического запаха. У быка она иногда может пахнуть парным молоком, у барана – жиропотом. Наличие несвойственного запаха (гнилостного) указывает на какой-либо патологический процесс в половых органах самцов, запах аммиака – на попадание мочи в сперму.

16

Консистенция. Нормальная консистенция спермы быка – сливкообразная, барана – сметанообразная, жеребца – водянистая, часто с примесью слизи, хряка – водянистая со студянистоклейкими зернами (секрет куперовых желез). При воспалении пузырьковидных желез в сперме бывают хлопья. Если внешние признаки эякулята значительно отклоняются от нормальных показателей, такую сперму не используют. Задание 3. Записать порядок визуальной оценки спермы по ее активности. 1. Температура воздуха в помещении: 2. Температура в столике Морозова: 3. Кратность увеличения микроскопа: 4. Яркость освещения поля зрения: Задание 4. Описать виды движения спермиев. 1. Прямолинейное поступательное.

2. Манежное.

17

3. Колебательное.

4. Отсутствие движения.

Оценку спермы по подвижности спермиев проводят по десятибалльной системе. Оценка спермы в баллах отражает процент подвижных спермиев. Наивысшую оценку – 10 баллов дают сперме в том случае, если все спермии обладают поступательным движением; при оценке 9 баллов 9 спермиев из 10 обладают прямолинейнопоступательным движением, при оценке 6 баллов – 6 из 10 и так далее. Для искусственного осеменения используют свежеполученную и сохраненную при 00С сперму производителей с подвижностью в баллах: баран - 10-8 бык - 10-8 жеребец - 10-6 хряк - 10-7 Сперма быка, хранившаяся при температуре –1960С в жидком азоте, должна иметь активность не ниже 3 баллов. 18

Задание 5. Изучить порядок оценки концентрации спермиев (по густоте под микроскопом). Описать сперму разной густоты. На рис. 2 отразить различия спермы разной густоты. 1. Густая

2. Средняя

3. Редкая

4. Олигоспермия

5. Аспермия

19

а)

б)

в)

Рис. 2. Сперма быка: а) – густая; б) – средняя; в) – редкая.

20

Задание 6. Оценить представленный эякулят по внешним признакам. Сделать заключение о качестве и целесообразности дальнейшего использования спермы.

Тема 4. Определение концентрации спермиев в счетных камерах Приборы и материалы. Микроскоп, счетная камера Горяева, предметные и покровные стекла, лейкоцитарный и эритроцитарный меланжеры, стеклянные палочки, 3%-ный раствор хлористого натрия, 96%-ный спирт, дистиллированная вода, салфетки.

Густота спермы, определяемая при глазомерной микроскопической оценке, дает приблизительное представление о количестве спермиев в 1 мл эякулята. Это субъективная оценка, ошибка может достигать 25-30%. Для установления рациональной степени разбавления и оптимальной дозы спермы при осеменении самок необходимо знать действительное количество спермиев в эякуляте (объективная оценка). Для этого определяют концентрацию спермы, т.е. количество спермиев (миллиардов) в 1 см3.

21

Концентрация спермы подвержена значительным колебаниям в зависимости от кормления, условий содержания и эксплуатации производителей. В среднем концентрация спермиев в 1 мл спермы производителей сельскохозяйственных животных составляет: барана - 1 млрд. быка - 2-3 млрд. жеребца - 100-150 млн. хряка - 100-200 млн. К разбавлению в искусственных средах допускается сперма с минимальной концентрацией спермиев: барана - 1,0 млрд. быка - 0,7 млрд. жеребца - 0,15 млрд. хряка - 0,1 млрд. Спермии подсчитывают в счетной камере, применяемой для определения числа форменных элементов крови (с сеткой Горяева, Томма или Бюркера). Порядок работы 1. Подготовка счетной камеры. Камеру и покровное стекло предварительно моют и обезжиривают спиртом. Затем сетку счетной камеры накрывают покровным стеклом и притирают его к опорным пластинам камеры до появления радужных колец. 2. Разбавление спермы. При работе со свежеполученной спермой быка используют эритроцитарный меланжер. Верхний конец меланжера соединяют с резиновой трубочкой. Через нее в меланжер набирают сперму до метки 1,0. С конца меланжера салфеткой снимают каплю спермы, а затем набирают до верхней метки (101) 3%-ный раствор хлористого натрия (т.о. проводят разбавление в 100 раз). Разбавленную сперму исследуют с помощью лейкоцитарного меланжера. Сперму набирают до метки 1,0, затем разбавляют 3%-ным раствором хлористого натрия до метки 11, т.е. в 10 раз. Зажимают пальцами оба конца смесителя и встряхивают в течение 2-3 минут до полного смешения спермы с раствором. 22

3. Зарядка счетной камеры. Счетную камеру заряжают разбавленной спермой сразу же после перемешивания. Задержка может привести к грубым ошибкам при подсчете, так как сперматозоиды быстро оседают. Первые 2-3 капли из меланжера выпускают, чтобы удалить раствор из капилляра, где он почти не смешивается со спермой. Следующую каплю пускают под край притертого стекла. Капля вследствие капиллярности втягивается под покровное стекло на сетку, и смесь равномерно распределяется в камере. Неправильно заряженной камеру считают в том случае, если там оказались пузырьки воздуха. 4. Подсчет спермиев. Заряженную камеру кладут на столик микроскопа в строго горизонтальном положении. Сначала отыскивают сетку под малым (120 раз) увеличением, затем переводят на большое (300-600 раз). В поле зрения должен помещаться один большой квадрат сетки. Подождав 2-3 минуты, пока сперматозоиды осядут, приступают к их подсчету. Спермии подсчитывают в 5 больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают головки спермиев внутри малых квадратов, а также на левых и верхних линиях. 5. Вычисление концентрации спермиев. Результаты подсчета суммируют. Концентрацию определяют по формуле: K = (n * D * 400 * 1000) / (80 * 0,1), где K – концентрация спермиев (млрд.) в 1 мл спермы; n – количество спермиев, подсчитанных в 80 малых (5 больших) квадратах; D – степень разбавления спермы. Цифры – постоянные величины: 400 – число малых квадратов на площади в 1 мм2, 1000 – число перевода на миллилитр (мл); 80 – количество малых квадратов; 0,1 – глубина камеры (мм). Для более точного определения концентрации спермиев подсчет следует вести в обеих сетках камеры Горяева и при вычислении брать средний показатель. Расхождение результатов не должно быть более 10%. Если разница превышает 10%, подсчет 23

спермиев повторяют третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%. Задание 1. Оценить сперму по внешним признакам. Дать заключение о пригодности ее для дальнейшего использования при искусственном осеменении.

Задание 2. Определить концентрацию спермы в счетной камере Горяева. Результаты подсчетов записать в соответствующие клетки квадратов. Сетка № 1 1

2

4

24

3

5

Сетка № 2 1

2

4

3

5

Задание 3. Сравнить результаты, полученные при выполнении заданий 1 и 2. Сделать заключение о целесообразности дальнейшего использования представленного эякулята.

25

Тема 5. Определение резистентности спермиев Приборы и материалы. Микроскоп, предметные и покровные стекла, микропипетка на 0,02 мл, градуированные пипетки на 1 и 10 мл, комплект из 2 флаконов на 20 мл каждый, стеклянные палочки, 1%-ный раствор химически чистого хлористого натрия, салфетки.

Спермии в процессе спермиогенеза в извитых канальцах семенников приобретают сравнительно плотную клеточную оболочку, представляющую по химическому составу сложное белковое образование и придающую мужским половым клеткам определенную постоянную форму. Проходя по длинному (40-70 м) каналу придатка семенника, спермии покрываются липоидной оболочкой. Она выполняет защитные функции, предохраняя сперматозоиды от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды, а также придает спермиям отрицательные одноименные электрические заряды. Чем устойчивее эта оболочка, тем более жизнеспособны спермии, тем лучшего качества сперма, выше ее оплодотворяющая способность. Определение резистентности спермиев к многократному разбавлению проводится по методу Смирнова – Поставной. Порядок работы Работу проводят при температуре 18-220С. Во флакон № 1 микропипеткой вносят 0,02 мл испытуемой спермы и малыми порциями добавляют 10 мл 1%-ного раствора хлористого натрия, перемешивая смесь круговыми движениями флакона. Остатки спермы из канала микропипетки смывают во флакон. Стеклянной палочкой каплю смеси наносят на предметное стекло и исследуют на активность спермиев под малым увеличением микроскопа без покровного стекла. Если спермии неподвижны, то резистентность менее 500 (10 мл : 0,02 мл = 500). При наличии спермиев с поступательным движением 0,5 мл смеси из флакона №1 переносят во флакон № 2 и доливают 0,5 мл 1%-ного раствора хлористого натрия. Каплю исследуют на 26

активность спермиев. Если спермии мертвые, резистентность не более 1000. Если спермии двигаются поступательно, во флакон № 2 наливают еще 1 мл раствора хлористого натрия. При добавлении каждой новой порции раствора резистентность увеличивается на 1000. Добавление раствора проводят до тех пор, пока не прекратится поступательное движение спермиев. Считается пригодной для осеменения животных сперма быка и барана с резистентностью спермиев не менее 10-40 тысяч. Задание. Определить резистентность спермиев быка. Сделать вывод о пригодности спермы для осеменения коров.

Тема 6. Оценка спермы по интенсивности дыхания Приборы и материалы. Микроскоп, стеклянная трубка диаметром 0,8-1,0 мм (можно использовать трубку от шприца-катетера), предметные стекла, 2 глазные пипетки, стеклянные палочки, песочные часы, 0,01%-ный раствор метиленовой синьки, белая бумага, салфетки.

Активность спермы оценивают по скорости обесцвечивания (восстановления) метиленовой синьки, смешанной со спермой (методика Н.П.Шергина). При дыхании спермии потребляют кислород, растворенный в смеси, в результате этого синька обесцвечивается. Интенсивность дыхания зависит от концентрации и активности спермиев. Спермии, способные к прямолинейно-поступательному движению, имеют более высокую активность жизненных процессов и дыхания. Следовательно, чем выше концентрация спермиев и чем большее их количество способно к прямолинейнопоступательному движению, тем быстрее расходуется кислород, 27

скорее происходит обесцвечивание метиленовой синьки и, соответственно, выше качество спермы. Оценку качества свежеполученной спермы по скорости обесцвечивания метиленовой синьки проводят при температуре 18-220С, т.к. понижение температуры замедляет интенсивность энергетических процессов и дыхания спермиев. При снижении температуры на 100С интенсивность дыхания уменьшается примерно вдвое, а при 00С почти прекращается. Приготовление 0,01%-ного раствора метиленовой синьки. 0,5 г синьки растворяют в 200 мл 1%-ного раствора хлористого натрия и настаивают три дня. Затем готовят рабочий раствор: к 1 части раствора синьки добавляют 9 частей 1%-ного раствора хлористого натрия. Порядок работы На предметное стекло глазной пипеткой нанести по одной капле краски и спермы и быстро смешать их стеклянной палочкой. Смесь набрать в стеклянную трубочку, чтобы столбик ее был длиной около 2 см. Трубку положить на лист белой бумаги и наблюдать за обесцвечиванием синьки. Обычно она обесцвечивается в середине столбика. На концах столбика могут оставаться голубые кольца, т.к. с концов смесь постоянно обогащается кислородом воздуха. О качестве спермы судят по показателям, приведенным в табл. 4. Таблица 4 Качество спермы Хорошее Среднее Плохое (непригодное для искусственного осеменения)

Время обесцвечивания метиленовой синьки (мин.) спермиями быка барана 5-10 3-7 11-30 8-12 более 30

более 12

Для оценки качества спермы жеребца и хряка этот метод не используется, поскольку обесцвечивание смеси метиленовой синьки со спермой затягивается до 60 минут. 28

Задание 1. Оценить качество спермы быка по времени обесцвечивания. Сделать вывод о пригодности ее для искусственного осеменения.

Задание 2. Визуально оценить сперму быка по густоте и активности. По результатам заданий 1 и 2 сделать вывод о целесообразности ее использования.

Тема 7. Определение процента живых спермиев Приборы и материалы. Микроскоп, обезжиренные предметные стекла, шлифованные покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, раствор эозина, 96%-ный спирт, салфетки.

Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обменные процессы, не пропускает в протоплазму лабораторные краски, поэтому живые спермии не окрашиваются. Мертвые и ослабленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь и, следовательно, окрашиваются этой краской. 29

Наличие в сперме мертвых и патологически измененных спермиев снижает качество спермы. Наличие в сперме патологических (уродливых) форм спермиев выше допустимого называется тератоспермией. Выделяют две группы патологических форм спермиев: 1) с изменением величины и формы головки – гигантские, карликовые, двухголовые, с круглой, грушевидной головкой и др.; 2) с изменениями формы хвоста. Можно также обнаружить спермии с утолщением в области шейки, тела и хвоста в виде протоплазматической капли (незрелые сперматозоиды). Способы подготовки обезжиренных стекол. 1. Чистые стекла выдерживают в смеси спирта и эфира (соотношение 1:1) в течение суток. Затем извлекают и протирают насухо. 2. После тщательного мытья в растворе детергента предметные стекла промывают в дистиллированной воде, протирают, заворачивают в бумагу и выдерживают в сушильном шкафу не менее 30 минут. 3. Полевой способ. На холодную поверхность электроплиты помещают в один слой чистые стекла. После того как стекла раскалятся, плиту выключают. Дают стеклам остыть. Рецепт краски. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,7 г эозина и 3 г цитрата натрия. Порядок работы На обезжиренное предметное стекло нанести 1 каплю семени и 1-2 капли краски эозина. Капли смешать и ребром шлифованного стекла сделать тонкий ровный мазок. Он должен быстро высохнуть на воздухе. Активные спермии, сохранившие избирательную способность мембран, отталкивают краску и не окрашиваются, неактивные окрашиваются в красный или розовый цвет. Просмотреть мазок под микроскопом. В каждом поле зрения следует подсчитать количество нормальных и патологических, или живых и мертвых, спермиев. Рекомендуется подсчитать не менее 500 спермиев. Вычисляют процент неактивных спермиев, он не должен превышать у барана – 14, быка – 18, у жеребца и хряка – 20. 30

Задание 1. Просмотреть препарат под микроскопом при увеличении 300-600 раз и зарисовать в тетрадь одно поле зрения (рис. 3). Отметить эозинотрицательные (активные, живые) и эозинположительные (неактивные, мертвые) спермии.

Рис. 3. Активные и неактивные спермии при увеличении в 300-600 раз. Задание 2. Подсчитать количество окрашенных и неокрашенных спермиев, результаты занести в табл. 5. Сделать вывод о пригодности спермы для искусственного осеменения. Таблица 5 Цвет спермиев Белый

1

2

3

Поля зрения 4 5 6

7

8

Всего

Розовый Всего

31

Тема 8. Влияние на спермии физических и химических факторов Приборы и материалы. Микроскоп, обогревательный столик Морозова, предметные и покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, чашка со льдом или снегом, горячая вода; 1%- и 3%-ные растворы хлористого натрия, дистиллированная вода, 1-2%-ный раствор бикарбоната натрия, 2,8-3,0%-ный раствор цитрата натрия, 1-2%-ный раствор уксусной кислоты, 10%-ные растворы серной кислоты и едкого натра, раствор марганцовокислого калия (1:5000), раствор фурацилина (1:5000), 70%-ный спирт, 5%-ный спиртовой раствор йода; салфетки.

С момента получения спермы спермии, находясь вне организма производителя, подвергаются воздействию ряда факторов окружающей среды. Семенная плазма, представляющая в основном совокупность секретов придаточных половых желез, действием растворенных в ней веществ активизирует спермии и сокращает их жизнь. Кроме того, при разбавлении и хранении спермы на спермии влияют такие факторы, как свет, температура, осмотическое давление, различные химические вещества, которые при определенных условиях могут способствовать удлинению их жизни вне организма самца или, наоборот, оказывать на них губительное действие. 1. Влияние осмотического давления Осмос – диффузия растворенных веществ через проницаемую оболочку, разделяющую раствор и чистый растворитель или два раствора разной концентрации. Давление растворенного вещества называется осмотическим и исчисляется в атмосферах. Сперма животных имеет постоянное осмотическое давление (7 атмосфер), причем осмотическое давление сыворотки спермы и протоплазмы спермиев примерно одинаковое. В том случае, когда осмотическое давление раствора равно осмотическому давлению спермиев, он является изотоническим. Гипотонический и гипертонический растворы губительно влияют на спермии.

32

Порядок работы Приготовить три раздавленных капли спермы, определить активность спермиев. Под покровное стекло внести каплю дистиллированной воды, 1%-ного или 3%-ного раствора хлористого натрия. Сперму просмотреть под микроскопом при большом увеличении. При внесении в сперму дистиллированной воды происходит быстрая гибель спермиев вследствие их гидратации (набухания головки), у части спермиев закручиваются хвосты. Под влиянием 3%-ного раствора хлористого натрия спермии погибают через 1-2 минуты вследствие обезвоживания. Головки спермиев сморщиваются, уменьшаются в размерах. 1%-ный раствор хлористого натрия изотоничен по отношению к спермиям. Задание. Провести исследование влияния осмотического давления на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

33

2. Влияние температуры Температура является важнейшим условием, определяющим жизнеспособность спермиев вне организма. При повышении температуры все жизненные процессы в них усиливаются, при понижении – замедляются. Порядок работы Приготовить две раздавленных капли спермы, определить активность спермиев. Сперму просматривать под микроскопом при малом увеличении. Одно предметное стекло нагреть до 50-550С. Вначале отмечается усиление активности спермиев, затем наступает их гибель. Предметное стекло с другой раздавленной каплей поместить на 1-2 минуты на лед и, протерев нижнюю часть стекла салфеткой, просмотреть под микроскопом. Затем подогреть предметное стекло до 400С на обогревательном столике. В первом случае все спермии будут неподвижны, при повышении температуры часть спермиев восстанавливает подвижность, остальные – мертвые. Задание. Провести исследование влияния температуры окружающей среды на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

34

3. Влияние химических веществ Сперма чрезвычайно чувствительна к различным химическим веществам. Даже следы мыла на руках или посуде губительно действуют на спермии. Поэтому следует тщательно прополаскивать дистиллированной водой посуду и инструменты после мойки и дезинфекции. В помещении пункта искусственного осеменения запрещается хранить медикаменты и дезинфицирующие вещества, а также курить. Порядок работы После оценки активности выявляют влияние различных химических веществ на спермии. Для этого каждый раз на чистое предметное стекло наносят новую каплю спермы и действуют на нее тем или иным испытуемым раствором. Капли перемешивают, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при малом увеличении. Устанавливают время, через которое прекращается движение спермиев. Для изучения влияния йода вокруг капли спермы нанести настойку в виде кольца и, не покрывая покровным стеклом, просматривать под микроскопом. При внесении в сперму 70%-ного спирта, 10%-ных растворов кислоты и щелочи, марганцовокислого калия, фурацилина наступает гибель сперматозоидов через 1-2 минуты. Раствор кислоты малой концентрации вызывает замедление движения спермиев (кислотный анабиоз). При слабо щелочной реакции среды активность спермиев повышается. Из настойки йода улетучивается свободный йод, который вызывает быструю гибель спермиев. Проникновение и накопление йода в сперме подтверждается пожелтением капли. При работе со спермой в лабораториях станций и пунктов искусственного осеменения необходимо соблюдать условия, обеспечивающие длительный срок хранения спермы с сохранением оплодотворяющей способности спермиев.

35

Задание. Провести исследование влияния различных химических веществ и их концентрации на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

36

Тема 9. Исследование глубокозамороженного семени Приборы и материалы. Сосуд Дьюара с замороженной спермой, микроскоп, обогревательный столик Морозова, водяная баня с термометром, корнцанг, пинцет, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, ампулы с 2,8-3,0%-ным цитратом натрия, 70%-ный спирт, салфетки.

Техника безопасности при работе с жидким азотом Жидкий азот – прозрачная, бесцветная, легкоиспаряющаяся жидкость. Массовая плотность его 0,804 кг/л при давлении 760 мм ртутного столба. В обычных условиях химически инертен. Производят его путем сжижения газообразного азота. Доставляют жидкий азот до потребителей с заводовпоставщиков транспортными цистернами различной емкости, установленными на соответствующих автомобилях. Замороженную в жидком азоте сперму производителей закладывают на длительное хранение в сосуды Дьюара емкостью 50 л и стационарные биохранилища на 200-500 л. Транспортировку замороженной спермы на пункты искусственного осеменения и хранение ее там осуществляют в сосудах Дьюара емкостью 5, 20 и 30 л. При попадании на открытые участки тела жидкий азот вызывает ожоги, при испарении большой массы жидкого азота изза снижения концентрации кислорода в воздухе возможны головокружение, обморок или удушье, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать правила безопасности. 1. Общие правила при работе с жидким азотом: тщательная защита лица, глаз, рук; одежда, полностью закрывающая кожный покров тела; вентиляция помещения. 2. Особую осторожность следует соблюдать при оттаивании глубокозамороженной спермы в соломинках и облицованных гранулах, т.к. при плохой герметизации проникший внутрь жидкий азот при оттаивании быстро испаряется, увеличивает давление и разрывает оболочку. 3. Для извлечения из сосудов Дьюара замороженной спермы следует использовать предварительно охлажденные инструмен37

ты, чтобы предотвратить бурное кипение и разбрызгивание жидкого азота. Не следует заглядывать в сосуд Дьюара с целью определения уровня жидкости в нем, для этого используют специальную линейку. При длительном хранении в жидком азоте на станциях и племпредприятиях сперму замораживают до температуры –1960С в однодозовых стеклянных или пластмассовых ампулах, облицованных и необлицованных гранулах, соломинках (пайеттах). Этот способ позволяет хранить сперму многие месяцы и даже годы. Однако для этого требуется строгое соблюдение следующих правил: 1) не допускается преждевременное оттаивание спермы и повторное ее замораживание. Даже кратковременное повышение температуры до –1250С, например, при перекладывании ампул со спермой из стационарного хранилища в транспортный сосуд Дьюара или из одного сосуда в другой, вредно отражается на качестве спермы. Поэтому до использования сперму постоянно хранят в жидком азоте. Нарушение этого правила приводит к гибели спермиев и снижению качества спермы; 2) перед использованием спермы оператор в защитных очках и в перчатках извлекает ампулу (гранулу или соломинку) из сосуда Дьюара и производит оттаивание, предварительно подготовив все необходимые для этой работы инструменты и оборудование. Оттаивание спермы в гранулах. Гранулы бывают трех видов: 1) необлицованные гранулы малого объема, 0,1-0,2 мл (с высокой концентрацией спермиев и с разбавлением дозы изотоническими растворами перед осеменением); 2) необлицованные гранулы большого объема, 0,5-1,0 мл (со средней концентрацией спермиев, разбавления дозы не требуется); 3) гранулы, облицованные в полимерную оболочку (объем 0,25-0,33 мл).

38

Порядок работы 1. Для оттаивания гранул объемом 0,1-0,2 мл одну-две ампулы с раствором цитрата натрия поместить на 1-2 минуты в водяную баню с температурой 38-400С. 2. К горловине сосуда Дьюара быстро подтянуть канистру или марлевый мешочек с гранулами. Стерильным и охлажденным в жидком азоте пинцетом извлечь нужное количество гранул и опустить их в подготовленные ампулы с раствором цитрата натрия. 3. Оттаивать гранулы спермы в течение 8-10 с до полного превращения их в жидкое состояние. После этого ампулы со спермой сразу же вынуть из водяной бани, не допуская дальнейшего нагревания спермы. Одновременно при размораживании быстро опустить канистру, закрыть сосуд крышкой. 4. Ампулы вытереть насухо салфеткой и поставить в штатив, где сперма постепенно приобретает температуру 18-250С. 5. Набрать сперму в инструмент. Сделать мазок, оценить качество спермы. Замороженную сперму быка используют после оттаивания при активности спермиев не ниже 3 баллов. В дозе спермы для осеменения коров и телок должно быть не менее 1012 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением (при всех способах хранения). Задание. Разморозить дозу спермы. Оценить ее качество (активность, густота, концентрация). Сделать выводы о пригодности спермы для осеменения.

39

Тема 10. Учет и отчетность в искусственном осеменении Учет и отчетность должны быть простыми, краткими, но точно отражающими всю производственную деятельность и дающими возможность оперативно контролировать работу пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Задание 1. Ознакомиться с документами учета и отчетности, применяемыми на пунктах искусственного осеменения для учета работы по воспроизводству стада на сельскохозяйственных предприятиях. Обратить внимание на назначение и срок составления каждого документа, какие показатели учитываются и кто ведет записи. 1. Ордер на отправку спермы производителя (форма №3-ио).

2. Информация о ходе искусственного осеменения.

40

3. Отчет об использовании замороженного семени.

4. Акт ректального исследования на стельность (форма №8ио) с приложением (список коров и телок, прошедших ректальное исследование по результатам искусственного осеменения).

5. Журнал искусственного осеменения, запуска и отелов коров и осемененных телок (форма №10-мол).

41

Задание 2. Изучить методы контроля воспроизводства стада (расчет продолжительности межотельного периода и сервиспериода, выхода телят, яловости коров).

42

Тема 11. Организация работы по получению, разбавлению и замораживанию спермы быков на племпредприятии «Карельское» Во время экскурсии на племпредприятие «Карельское» ознакомиться: 1) с организацией содержания и кормления быковпроизводителей; 2) с техникой взятия спермы; 3) с технологией разбавления, замораживания и хранения спермы в неблицованных гранулах; 4) с документами учета количества и качества спермы, хранящейся на племпредприятии.

43

Учебное издание

Биотехника размножения Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» для студентов 4 курса специальности 3107 «Зоотехния»

Составители: Комлык Ирина Петровна Сиротинина Валерия Юрьевна Редактор Т.Н.Музалева Компьютерная верстка И.П.Комлык

ЛР ИД № 02969 от 06.10 2000 Гигиенический сертификат № 10.КЦ. 34.953.П.00136.03.99 от 05.03.99. Подписано в печать 03.07.02. Формат 60х84 1/16. Бумага газетная. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,8. Усл. кр.-отт. 13. Тираж 200 экз. Изд. № 119. Петрозаводский государственный университет Типография Издательства Петрозаводского государственного университета 185640, Петрозаводск, пр. Ленина, 33

44