Малый практикум по микробиологии

М И Н И СТ Е РСТ В О О Б РА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н ЫЙ У Н И В Е РСИ Т Е Т

М О Р ФО Л О Г И Я И К У Л Ь Т И В И Р О В А Н И Е М И К Р О О Р Г А Н И ЗМ О В М А ЛЫЙ П РА К Т И К У М П О М И К РО Б И О ЛО ГИ И по специальности «Б иология» (011600)

В О РО НЕ Ж 2003

2

У т в е рж де но науч но-ме т одич е ским сов е т ом факульт е т а 15 янв аря2003 г., прот окол N 1.

биолого-поч в е нного

Сост ав ит е ли: Ч уриков а В .В . Грабов ич М .Ю .

М алый практикум подгот ов ле н на кафе дре физиологии и биохимии раст е ний биолого-поч в е нного факульт е т а В ороне ж ского государст в е нного унив е рсит е т а. Ре коме ндуе т ся для ст уде нт ов 3 курса биолого-поч в е нного факульт е т а дне в ного от де ле ния.

3

СО ДЕ РЖ АНИЕ ТЕ М А 1. О БЩ ИЕ П РАВ ИЛ А РАБО ТЫ С К У Л Ь ТУ РАМ И М ИК РО О РГАНИЗМ О В . П РИГО ТО В Л Е НИЕ М ИК РО СК О П ИЧ Е СК ИХ П РЕ П АРАТО В … … … … … … … ... 4 Работ а 1. О бщ ие прав ила работ ы с культ урами микроорганизмов … … 4 Работ а 2. М икроскопич е скаят е хника в микробиологии. П ригот ов ле ние микроскопич е ских пре парат ов … … … … … 6 ТЕ М А 2. М О РФ О Л О ГИЯ М ИК РО О РГАНИЗМ О В … … … … … … … … 18 Работ а 3. М орфологиягрибов … … … … … … … … … … … … … … … … … 18 Работ а 4. О снов ные формы бакте рий… … … … … … … … … … … … … … 20 Работ а 5. О пре де ле ние разме ров микробных кле т окс помощ ью окуляр-микроме т ров … … … … … … … … … … … … … … … … .. 22 ТЕ М А 3. НЕ К О ТО РЫ Е О СО БЕ ННО СТИ СТРО Е НИЯ БАК ТЕ РИАЛ Ь НО Й К Л Е ТК И… … … … … … … … … … … … . 24 Работ а 6. О краска бакте рий по Граму… … … … … … … … … … … … … .. 24 Работ а 7. О бнаруж е ние капсул и окраска ж гут иков … … … … … … … … 25 Работ а 8. О краска спор и запасных в клю ч е ний в кле т ках бакте рий… ..27 ТЕ М А 4. К У Л Ь ТИВ ИРО В АНИЕ М ИК РО О РГАНИЗМ О В … … … … … 30 Работ а 9. П ригот ов ле ние пит ат е льных сре д. Ст е рилизац ия… … … … 30 Работ а 10. О пт имизац иямикробиологич е ских и фе рме нт ац ионных проц е ссов в промышле нност и… … … … … … … … … … … … 36 ТЕ М А 5. Э К О Л О ГИЯ М ИК РО О РГАНИЗМ О В … … … … … … … … … . 39 Работ а 11. М икробиологич е ский анализпоч в ы… … … … … … … … … 39 Работ а 12. М икробиологич е ский анализв оды… … … … … … … … … … 42 Работ а 13. М икробиологич е ский анализв оздуха… … … … … … … … … 44 Работ а 14. М икроорганизмы слизист ой полост и рт а, зубного нале т а, кож ных покров ов … … … … … … … … … … … … … … … … … . 46 ТЕ М А 6. Ч ИСТЫ Е ИЭ Л Е К ТИВ НЫ Е К У Л Ь ТУ РЫ М ИК РО О РГАНИЗМ О В … … … … … … … … … … … … … … … . 47 Работ а 15. П олуч е ние эле ктив ной культ уры се нной палоч ки Bacillus subtilis… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 47 Работ а 16. В ыде ле ние бакте рий в ч ист ую культ уру… … … … … … … … 47 Работ а 17. Изуч е ние морфологии, культ уральных и физиологич е ских св ойст в бакте рий, в ыде ле нных в ч ист ую культ уру… … … . 50

4

ТЕ М А 1. О БЩ ИЕ П РАВ ИЛ А РАБО ТЫ С К У Л Ь ТУ РАМ И М ИК РО О РГАНИЗМ О В . П РИГО ТО В Л Е НИЕ М ИК РО СК О П ИЧ Е СК ИХ П РЕ П АРАТО В Работа 1. О бщиеправила работы с к у льту рам и м ик роорганизм ов а) П одгот ов ка лаборат ории и прав ила работ ы в не й Для работ ы с микроорганизмами микробиологич е скую лаборат орию подгот ав лив аю т спе ц иально. К аж дое рабоч е е ме ст о оснащ е но сле дую щ им оборудов ание м: микроскоп, набор красок, бакте риологич е скаяпе т ля, игла, обе зж ире нные пре дме т ные ст е кла, покров ные ст е кла, в анноч ка с мост иком для окраски пре парат ов , промыв алка с в одопров одной в одой, спирт ов ка, спич ки, фильт ров альная бумага, пре паров альные иглы, бю кс с де нат урат ом для от работ анных покров ных ст е кол, склянка для от работ анных пре дме т ных ст е кол, марле в аясалфе т ка, пинц е т и т .д. На уч е бных занят иях в лаборат ории не обходимо приде рж ив ат ься сле дую щ их прав ил: 1. Не в ходит ь в лаборат орию в в е рхне й оде ж де . 2. Работ ат ь в лаборат ории не обходимо в халат е . 3. В поме щ е нии лаборат ории не принимат ь пищ у, в оду, не допускат ь излишних пе ре ходов . 4. Работ ат ь ч ист о и аккурат но; соде рж ат ь рабоч е е ме ст о в опрят ност и. 5. Законч ив работ у с пре парат ом, покров ные ст е кла прост е рилизов ат ь в бю ксах с де нат урат ом, пре дме т ные – в склянках с карболов ой кислот ой. 6. В о избе ж ание в озгорания не заж игат ь одну спирт ов ку от другой, использов ат ь дляэт ой ц е ли спич ки. 7. Не соприкасат ься ме т аллич е скими и другими пре дме т ами с пров одами и конт актными ч аст ями эле ктросе т и. 8. Соблю дат ь прав ила работ ы с химич е скими ре актив ами и красит е лями. 9. В проц е ссе работ ы с в опросами, касаю щ имися оборудов ания, не обходимо обращ ат ьсякде ж урному. 10. В конц е занят ия рабоч е е ме ст о прив е ст и в порядок и сдат ь де ж урному по лаборат ории, после дний сдае т лаборат орию лаборант у. 11. Рабоч ий ст ол сле дуе т де зинфиц иров ат ь до и после оконч ания работ ы (раст в ор хлорамина, де нат урат , 70% изопропилов ый или эт илов ый спирт ).

5

12. М икробиологич е ская лаборат ория долж на пе риодич е ски подв е ргат ься де зинфе кц ии. В оздух мож но де зинфиц иров ат ь пут е м пров е т рив ания или с помощ ью У Ф -ламп. П ол, ст е ны, ст олы и шкафы подв е ргаю т обработ ке пыле сосом и прот ираю т раст в орами различ ных де зинфиц ирую щ их в е щ е ст в . Не обходимо помнит ь, ч т о в не больших поме щ е ниях при в клю ч е нной бакте риц идной лампе находит ьсяне льзя, т .к. У Ф -луч и могут в ызв ат ь т яж е лые пораж е нияглаз. б) П одгот ов ка посуды кработ е М икроорганизмы в лаборат орных услов иях в ыращ ив аю т на пит ат е льных сре дах в пробирках, колбах, ч ашках П е т ри. Ст е клянная посуда спе ц иально гот ов ит ся к посе в у: е е мою т , в т е ч е ние ноч и в ыде рж ив аю т в 1-2 % раст в оре соляной или се рной кислот ы, т щ ат е льно промыв аю т в в оде и в ысушив аю т . Зат е м посуда гот ов ит ся кст е рилизац ии. Для эт ого колбы, пробирки закрыв аю т в ат ными пробками; в ысот а пробки 4,0-4,5 см. П робки долж ны быт ь дост ат оч но плот ными и не пропускат ь микроорганизмы из в оздуха, пе ре уплот не ние пробок не ж е лат е льно. Ч ашки П е т ри и пипе т ки аккурат но зав орач ив аю т в бумагу для сохране ния ст е рильност и. В широкий коне ц пипе т ки до зав орач ив ания закладыв аю т в ат ный т ампон, кот орый пре дохраняе т полост ь пипе т ки от загрязне ния. Дале е пипе т ки зав орач ив аю т в длинные полоски бумаги, нач иная с т ого конц а, кот орый буде т опущ е н в ж идкост ь. П ипе т ки мож но зав орач ив ат ь по одной или не сколько шт ук в ме ст е . Ст е клянные шпат е ли т акж е ст е рилизую т зав е рнут ыми в бумагу по одному или не сколько шт ук. в ) О бщ ие прав ила работ ы с культ урами микроорганизмов 1. В зят ие пробы микроорганизмов дляпригот ов ле нияпре парат а или для пе ре се в а произв одит ся микробиологич е ской пе т ле й (или иглой). Ст е рилизац ию бакте риологич е ской пе т ли пров одят в пламе ни спирт ов ки, прокалив ая докрасна пров олоку и обж игая примыкаю щ ую к не й ч аст ь де рж ат е ля, в в одимую в нут рь пробирки. П рикоснов е ние к культ уре слишком горяч е й пе т ле й мож е т пов ре дит ь кле т ки. П оэт ому пе т лю пе ре д в зят ие м пробы сле дуе т охладит ь, прикоснув шись к в нут ре нне й пов е рхност и пробирки или к пит ат е льной сре де , св ободной от микроорганизмов . 2. П ри работ е с ж идкой культ урой луч ше от бират ь пробу пипе т кой, кот орую после пе ре не се ния пробы на ст е рильный субст рат не обходимо поме щ ат ь в де зинфиц ирую щ ий раст в ор. 3. К рышка ч ашки П е т ри при от боре и в не се нии пробы от крыв ае т ся лишь наст олько, ч т обы в в е ст и пе т лю (пипе т ку). 4. К раяпробирок, используе мых при пе ре се в ах до и после в зят ия

6

пробы, обж игаю т в пламе ни спирт ов ки, зат е м обж игаю т пробку и закрыв аю т е ю пробирку. 5. В сяработ а по пе ре се в у пров одит сябыст ро пе ре д пламе не м спирт ов ки, ч т обы не загрязнит ь иссле дуе мую культ уру пост оронними микроорганизмами. 6. П е ре се в микроорганизмов и в ыде ле ние в ч ист ую культ уру сле дуе т пров одит ь в боксе . 7. П о оконч ании работ ы культ уры микроорганизмов не обходимо пост ав ит ь в т е рмост ат дляинкубац ии. 8. К ульт уры микроорганизмов , подле ж ащ ие в ыбрасыв анию , не обходимо убит ь. Для эт ого сосуды с культ урами (колбы, пробирки, ч ашки П е т ри и т .д.) ав т оклав ирую т и т олько после эт ого мою т . Таков ы основ ные т ре бов ания, кот орые не обходимо в ыполнят ь при работ е с культ урами микроорганизмов . г) П орядокв е де ниядне в ника Ре зульт ат ы в ыполне нного задания заносят в дне в ник, где записыв аю т т е му, урав не ние ре акц ий, в ызыв ае мых микроорганизмами в субст рат е , де лаю т зарисов ки пре парат ов с соот в е т ст в ую щ ими надписями. П ри подгот ов ке к занят иям дополнит е льно к данному руков одст в у мож но пользов ат ься уч е бником и одним из ме т одич е ских пособий, указанных в конц е практикума. Задание : 1. П одгот ов ит ь ч ашки П е т ри, пипе т ки кст е рилизац ии. 2. П одгот ов ит ь пробки дляпробироки колб. 3. Залит ь в дв е пробирки по 9 мл в одопров одной в оды (пипе т кой). 4. Залит ь в дв е колбы по 99 мл в одопров одной в оды (ме рным ц илиндром). М ат е риалы и оборудов ание Бакте риологич е ская пе т ля, бакте риологич е ская игла, пре паров альные иглы, пре дме т ные ст е кла, фильт ров альная бумага, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, бю кс с де нат урат ом, капе льниц а с в одой, спирт ов ка, спич ки, салфе т ка марле в ая, ч ашки П е т ри, пипе т ки на 1 мл, бумага для зав е рт ыв ания ч аше к П е т ри и пипе т ок, колбы на 100 мл, пробирки в шт ат ив е , в ат а, нит ки, нож ниц ы, лине йка, пипе т ка на 10 мл, ме рный ц илиндр на 100 мл, ст акан с в одой. Работа 2. М ик роск опическ ая техник а в м ик робиологии. П риготовлением ик роск опическ их препаратов 1. О с новные т ипы м икрос копирования М икроскоп яв ляе т сяне заме нимым прибором в микробиологич е ских

7

иссле дов аниях. Глаз ч е лов е ка какопт ич е ский прибор име е т большие огранич е ния. Ч е лов е кмож е т ув иде т ь ч аст иц у в е лич иной около 0,1 мм на расст оянии 2,5 см. Разме ры большинст в а микроорганизмов изме ряю т ся микроме т рами (1 мкм = 0,001 мм = 10-3 мм). О бнаруж ит ь т акие организмы, изуч ит ь их морфологию и ст рое ние мож но т олько с помощ ью микроскопа. Назнач е ние сист е мы линзэт ого прибора, располож е нных ме ж ду объ е ктом и глазом, сост оит в т ом, ч т обы ув е лич ит ь изображ е ние иссле дуе мого объ е кта в сот ни (св е т ов ая микроскопия) и де сят ки т ысяч (эле ктронная микроскопия) раз. П омимо увеличения, большое знач е ние в характе рист ике микроскопа име ю т т акж е конт рас т нос т ь и разреш ение. Ч т обы объ е кт мож но было различ ит ь под микроскопом, не обходима опре де ле нная с т епень конт рас т аме ж ду эт им объ е ктом и окруж аю щ им фоном, а дляполуч е ния ч е т кого ув е лич е нного изображ е ния микроскоп долж е н обладат ь дост ат оч ной разре шаю щ е й способност ью , кот ораяпозв олила бы разде льно в оспринимат ь оч е нь близкие т оч ки изображ е ния. Пределом разреш ения назыв ае т ся наиме ньше е расст ояние ме ж ду дв умя т оч ками, при кот ором их е щ е мож но в иде т ь разде льно. Име нно эт им расст ояние м и опре де ляе т ся максимально поле зное ув е лич е ние св е т ов ого микроскопа. В е лич ину пре де льного разре ше ния(d) дае т урав не ние : 0,5 λ d = --------------- , N . Sin α где λ - длина в олны используе мого ист оч ника св е т а, α - полов ина угла линзы объ е ктив а, т .е . угла ме ж ду луч ами, идущ ими от объ е кта ккраям объ е ктив а, а N – показат е ль пре ломле ния сре ды ме ж ду объ е ктом и объ е ктив ом. Знаме нат е ль (N.Sin α), кот орый обыч но назыв аю т ч ислов ой апе рт урой (NA), от раж ае т св ойст в а объ е ктив а. Е сли ме ж ду пре парат ом и объ е ктив ом находит ся в оздух, т о знач е ние NA мож е т дост игат ь приме рно 0,65. П риме няя имме рсионное масло и имме рсионные линзы, мож но ув е лич ит ь знач е ние NA до 1,4. Е сли использов ат ь в идимый св е т с наиме ньше й длиной в олны (около 426 нм), т о максимальное разре ше ние св е т ов ого микроскопа приближ ае т ся к 200 нм (0,002 мкм). Иными слов ами, с помощ ью св е т ов ого микроскопа не льзя получ ит ь разде льные изображ е ниядв ух т оч е к, расст ояние ме ж ду кот орыми ме ньше 200 нм. Сов ре ме нные конст рукц ии микроскопов появ ились, коне ч но, не сразу. П онадобилось много в ре ме ни для т ого, ч т обы пост е пе нные усов е рше нст в ов ания прив е ли к созданию слож ных сов ре ме нных микроскопов .

8

Свет овой м икрос коп Для микробиологич е ских иссле дов аний прозрач ных объ е ктов в проходящ е м св е т е наиболе е удобны микроскопы М БР-1, М БИ, БИО Л АМ . О снов ными эле ме нт ами их конст рукц ии яв ляю т ся шт ат ив и опт ич е ская ч аст ь. Ш т ат ив име е т нож ку подков ообразной формы для придания микроскопу уст ойч ив ост и и основ ание , в кот ором смонт иров ан микроме ханизм и т убусоде рж ат е ль. В в е рхне й ч аст и шт ат ив а (колонка) в спе ц иальных пазах в ст ав ле н ме т аллич е ский т убус. П ре дме т ный ст олик прикре пле н к шт ат ив у на спе ц иальном кроншт е йне . О н име е т пару пруж инных заж имов для закре пле ния пре парат а. В нов ых конст рукц иях микроскопа пре дме т ный ст оликв се гда де лае т ся или в ращ аю щ имся, или ц е нт рируе мым и пе ре ме щ аю щ имся в дв ух в заимно пе рпе ндикулярных направ ле ниях (кре ст ообразный ст олик). К ре ст ообразный ст олик пре дназнач е н для сист е мат ич е ского изуч е ния пре парат а, а т акж е для быст рого обнаруж е ния опре де ле нного ме ст а на пре парат е при пов т орных наблю де ниях. Т уб ус одерж ат ель - в е рхняя ч аст ь шт ат ив а, на кот орой смонт иров ан т убус (наклонный и прямой) и т акназыв ае мый ре в ольв е р с гне здами для в в инч ив ания объ е ктив ов (он в ращ ае т ся в округ св ое й оси, ч т о позв оляе т подв е ст и под от в е рст ие т от или другой объ е ктив ). Тубусоде рж ат е ль мож е т пе ре ме щ ат ься на 50 мм в ращ е ние м макроме т рич е ского в инт а. В не кот орых микроскопах т убус не подв иж е н, а макров инт пе ре ме щ ае т пре дме т ный ст олик. М акроме т рич е ский в инт пре дназнач е н для грубой нав одки. М икров инт обе спе ч ив ае т т онкую фокусиров ку пре парат а. О дин пов орот микров инт а обе спе ч ив ае т пе ре ме щ е ние т убуса на в ысот у 0,1 мм. О пт ичес кая час т ь м икрос копа сост оит из объ е ктив ов , окуляров и осв е т ит е льного уст ройст в а (зе ркало или осв е т ит е ль ст ац ионарного т ипа, конде нсор). О бъ е ктив ы – наиболе е ц е нная и в аж ная ч аст ь микроскопа, опре де ляю щ ая е го опт ич е скую мощ ност ь. К аж дый объ е ктив сост оит из ряда спе ц иально от шлифов анных линз, поме щ е нных в ц илиндрич е скую оправ у. На в е рхне м конц е оправ а име е т в инт ов ую наре зку, при помощ и кот орой объ е ктив прив инч ив ае т сякре в ольв е ру. У в е лич е нное изображ е ние пре дме т а получ ае т ся в близи от в е рхне го конц а т убуса, где оно в оспринимае т ся окуляром и ув е лич ив ае т ся е щ е раз. Таким образом, в глаз наблю дат е ляпопадае т дв аж ды ув е лич е нное изображ е ние пре дме т а. Дост оинст в о объ е ктив а опре де ляе т ся в основ ном е го ув е лич е ние м и показат е ле м апе рт уры (произв е де ние синуса полов ины угла луч е й, в ходящ их в сист е му, и показат е ляпре ломле ниясре ды, находящ е йсяме ж ду покров ным ст е клом и пе ре дне й линзой объ е ктив а). М икроскоп М БР-1 име е т т ри объ е ктив а с ув е лич е ние м x5, x10, x40, х100.

9

П о способу упот ре бле ния объ е ктив ы де лят ся на сухие и имме рсионные (погруж ные ). Сухие объ е ктив ы (х5, х10, х40) приме няю т ся обыч но при не больших ув е лич е ниях (от 56 до 600 раз); в эт ом случ ае ме ж ду объ е ктив ом и пре парат ом находит ся слой в оздуха (показат е ль пре ломле ния е го 1). В в иду разниц ы в показат е лях пре ломле ния ст е кла и в оздуха ч аст ь св е т ов ых луч е й от клоняе т ся и не попадае т в глаз наблю дат е ля. П оэт ому сухие сист е мы не позв оляю т рассмат рив ат ь слишком ме лкие объ е кты. В микробиологич е ской практике ч ащ е использую т ся имме рсионные объ е ктив ы (х100), а име нно маслянопогруж ные (кедров ое масло име е т показат е ль пре ломле ния 1,515). Имме рсионные сист е мы даю т ув е лич е ние в 900-1350 раз. П ри эт ом ме ж ду объ е ктив ом и пре дме т ным (или покров ным) ст е клом поме щ аю т каплю масла (или каплю в оды для в одной имме рсии; в ода име е т показат е ль пре ломле ния 1,33). Создае т ся т аким образом гомоге ннаясре да с близкими показат е лями пре ломле ния (ст е кло пре парат а – масло или в ода – ст е кло объ е ктив а). Благодаря эт ому в се луч и, пре ломляясь и не изме няя св ое го направ ле ния, попадаю т в объ е ктив и обе спе ч ив аю т хорошую в идимост ь ме льч айших объ е ктов . О куляры поме щ аю т ся в в е рхне й ч аст и т убуса; они обознач аю т ся ц ифрами, показыв аю щ ими собст в е нное ув е лич е ние окуляра (х7, х10, х15). Иссле дуе мый пре дме т ув е лич ив ае т ся т олько объ е ктив ом, окуляр ж е ув е лич ив ае т лишь изображ е ние пре дме т а, получ ае мое от объ е ктив а. О бщ е е ув е лич е ние микроскопа опре де ляе т ся умнож е ние м ув е лич е ния объ е ктив а на ув е лич е ние окуляра. К онденс ор - спе ц иальный осв е т ит е ль, поме щ аю щ ийся под ст оликом микроскопа. О н сост оит изне скольких линз, собираю щ их от раж е нный от зе ркала св е т в пуч ок, направ ляе мый на плоскост ь пре парат а. В ниж не й ч аст и конде нсора располож е на суж ив аю щ аяся ирисов ая диафрагма, с помощ ью кот орой мож но ме нят ь апе рт уру конде нсора, а соот в е т ст в е нно и колич е ст в о пропускае мого им св е т а. К онде нсор, как прав ило, пре дназнач е н для работ ы с масляной имме рсие й. О днако и сухие сист е мы объ е ктив ов работ аю т луч ше при использов ании конде нсора, даю щ е го рав номе рное осв е щ е ние по в се му полю зре ния. Л ишь при работ е с объ е ктив ами, име ю щ ими ч ислов ую апе рт уру ме не е 0,20, в ме ст о конде нсора в ст ав ляю т ц илиндрич е скую диафрагму. В большинст в е случ ае в упот ре бляю т сяконде нсоры с ч ислов ой апе рт урой 1,20. П ри микроскопиров ании с дне в ным св е т ом конде нсор долж е н быт ь поднят до уров ня пре дме т ного ст олика, при искусст в е нном – конде нсор опускае т сядо т е х пор, пока при малом ув е лич е нии изображ е ние ист оч ника св е т а не появ ит сяв плоскост и пре парат а. Зеркало от раж ае т падаю щ ий на не го св е т и направ ляе т е го в конде нсор для осв е щ е ния пре парат а. О дна ст орона зе ркала плоская, и е ю пользую т ся при лю бом ист оч нике св е т а и при лю бом ув е лич е нии. Другая, в огнут ая ст орона, используе т ся при малых ув е лич е ниях бе зконде нсора и, какправ ило, при искусст в е нном осв е щ е нии.

10

В не кот орых случ аях зе ркало заме няю т ст ац ионарным осв е т ит е ле м О И-19. Р аб от ас м икрос копом П е ре д работ ой с микроскопом не обходимо уст анов ит ь нормальное осв е щ е ние . Для эт ого пут е м пов орот а ре в ольв е ра ст ав ят объ е ктив с наиме ньшим ув е лич е ние м. О бъ е ктив долж е н находит ься от пов е рхност и пре парат а на расст оянии 1,5 см. Иссле дов ат е ль, наблю дая прямо в объ е ктив (окуляр снят ь), улав лив ае т зе ркалом ист оч ник св е т а с т аким расч е т ом, ч т обы луч и св е т а, от раж ае мые зе ркалом, проходили ч е ре з от в е рст ие диафрагмы, конде нсор и попадали в объ е ктив (ист оч никсв е т а долж е н быт ь в иде н посре дине объ е ктив а). Ст ац ионарный осв е т ит е ль в клю ч аю т в се т ь. К огда св е т уст анов ле н, в ст ав ляю т окуляр, бе рут пре парат , подле ж ащ ий просмот ру, поме щ аю т на пре дме т ный ст олик, закре пляю т заж имами и рассмат рив аю т , пользуясь т е м или иным объ е ктив ом в зав исимост и от пост ав ле нной ц е ли. Р аб от ас им м ерс ионным об ъект ивом . Работ е с имме рсие й долж но пре дше ст в ов ат ь обсле дов ание объ е кта при помощ и сухой сист е мы объ е ктив а, даю щ е й малое ув е лич е ние . П ри эт ом обсле дов ании подбираю т ся нуж ные ме ст а на пре парат е , и т олько после эт ого нач инае т ся работ а с имме рсионным объ е ктив ом. О собе нност и работ ы с имме рсионным объ е ктив ом сост оят в сле дую щ е м. На покров ное ст е кло или не посре дст в е нно на сухой пре парат наносят св е рху каплю кедров ого масла, а зат е м, опуская ост орож но т убус, погруж аю т в не е объ е ктив . О пускат ь имме рсионный объ е ктив и погруж ат ь е го в кедров ое масло сле дуе т с помощ ью макроме т рич е ского в инт а, наблю дая за т е м, ч т обы объ е ктив не коснулся пре парат а и не получ ил пов ре ж де ния (смот ре т ь на пре парат сбоку!). П осле эт ого, глядя в окуляр микроскопа и де йст в уя макров инт ом, ме дле нно поднимаю т т убус микроскопа до появ ле нияв поле зре нияизуч ае мого объ е кта. Дальне йшая фокусиров ка произв одит ся микров инт ом, кот орым пользую т ся в т е ч е ние в се го в ре ме ни микроскопиров ания. П ри эт ом сле дуе т ув е лич ит ь осв е щ е ние , приот крыв диафрагму конде нсора. Для использов ания полной силы имме рсионного объ е ктив а мож но нане ст и каплю кедров ого масла и на пов е рхност ь в е рхне й линзы конде нсора, пре дв арит е льно опуст ив е го в низ. П осле эт ого конде нсор поднимаю т до соприкоснов е ния кедров ого масла на не м с ниж не й пов е рхност ью пре дме т ного ст е кла. П о оконч ании работ ы с имме рсионным объ е ктив ом кедров ое масло удаляю т в ат ой, сле гка смоч е нной ге ксаном или ксилолом, а с пре парат а и конде нсора – ост орож ным накладыв ание м полоски фильт ров альной бумаги на пре парат и конде нсор. О с новные правилапользования м икрос копом . 1. П ри работ е с объ е ктив ом малого ув е лич е ния т убус пе ре дв игат ь т олько макров инт ом.

11

2. П ри работ е с объ е ктив ом большого ув е лич е ния т убус пе ре дв игат ь в нач але макров инт ом; оконч ат е льная фокусиров ка произв одит ся микров инт ом. М икров инт в о избе ж ание порч и в инт ов ой наре зки пов орач ив ат ь не боле е , ч е м на один оборот в т у или другую ст орону. 3. М икроскоп нуж но пре дохранят ь от пыли и сырост и; после работ ы ст ав ит ь в фут ляр под ст е клянный колпакили покрыв ат ь мат е рие й. 4. Сухие объ е ктив ы прот ират ь замше й или флане лью . 5. О куляры нуж но пе риодич е ски прот ират ь марле й или мягкой салфе т кой (эт о от носит ся и к другим ч аст ям микроскопа – конде нсор, зе ркало, пре дме т ный ст олик). 6. Не ост ав лят ь микроскоп после работ ы на объ е ктив е большого ув е лич е ния; ре в ольв е р сле дуе т пе ре в е ст и на малое ув е лич е ние , и на пре дме т ный ст олик под объ е ктив полож ит ь ч ист ую сухую марлю , ч т обы пре дохранит ь объ е ктив от пов ре ж де ний. 7. К онде нсор после работ ы не обходимо опуст ит ь. 8. Не ост ав лят ь т убус микроскопа от крыт ым, т .е . бе зокуляра, т аккак эт о прив одит к накаплив анию в не м пыли и загрязне нию объ е ктив а. 9. П е ре нос микроскопа долж е н осущ е ст в лят ьсясле дую щ им образом: прав ой рукой захв ат ыв аю т т убусоде рж ат е ль, а нож ку шт ат ив а ст ав ят на ладонь ле в ой руки. М икрос копия в т ем ном поле Наблю де ние в т е мном поле осущ е ст в ляе т ся с помощ ью спе ц иального конде нсора, в ст ав ляе мого на ме ст о обыч ного. Те мнопольный конде нсор от лич ае т ся от св е т опольного т е м, ч т о пропускае т т олько оч е нь косые крае в ые луч и ист оч ника св е т а, кот орые в силу их сильного наклона не попадаю т в объ е ктив , в ре зульт ат е ч е го поле зре ния микроскопа оказыв ае т ся т е мным. П ри налич ии на пре парат е каких-либо ч аст иц косые луч и от раж аю т ся от эт их ч аст иц и попадаю т в объ е ктив . На т е мном поле будут в идны св е т ящ ие ся объ е кты, наприме р, кле т ки бакте рий. Я ркост ь их св е ч е ния зав исит от мощ ност и ист оч ника св е т а и т оч ност и е го нав одки. Л уч шим ист оч ником св е т а при эт ом яв ляю т ся т оч е ч ные лампы для микроскопиров ания т ипа О И-7, О И-19. Разре шаю щ ая способност ь микроскопа при использов ании т е мнопольного конде нсора в озраст ае т в 10 раз. О днако эт от т ип микроскопиров ания позв оляе т различ ит ь лишь конт уры объ е ктов (особе нно ме лких). К роме т ого, т е мнопольная микроскопия удобна при изуч е нии различ ных в озде йст в ий на кле т ку, пов ре ж де ния кот орой прив одят к св е ч е нию е е ст руктурных компоне нт ов (ядра, ц ит оплазма и др.). Я ркост ь св е ч е нияпоказыв ае т сост ояние диспе рсност и их коллоидов . Порядок раб от ы с т ем нопольным конденс ором 1. Снимаю т с микроскопа окуляр, объ е ктив и конде нсор, а осв е т ит е льную лампу и микроскоп ст ав ят другпрот ив друга т аким

12

образом, ч т обы при суж е нном от в е рст ии диафрагмы осв е т ит е лясв е т падал на се ре дину зе ркала. 2. В ст ав ляю т обыч ный конде нсор, зе ркало уст анав лив аю т т ак, ч т обы на мат ов ом ст е кле , пост ав ле нном на в е рхний коне ц т убуса микроскопа, в ц е нт ре был в иде н рав номе рно осв е щ е нный круг. 3. В ст ав ляю т объ е ктив х8 и окуляр. П ре парат поме щ аю т на пре дме т ный ст олики уст анав лив аю т е го в фокусе микроскопа. 4. О быч ный конде нсор не много опускаю т (не касаясь зе ркала), снимаю т е го и заме няю т т е мнопольным. На не го наносят каплю кедров ого масла и поднимаю т кв е рху до т е х пор, пока масло не соприкосне т сяс пре дме т ным ст е клом, зат е м фокусирую т микроскоп на объ е кт. 5. П роизв одят ц е нт ров ку конде нсора по от ноше нию к опт ич е ской оси объ е ктив а; эт о осущ е ст в ляе т ся в ращ е ние м дв ух ре гулиров оч ных в инт ов и пруж инного уст ройст в а, для удобст в а пользов ания кот орым кприбору прилагаю т ся дв а клю ч а. В поле зре ния долж но появ ит ься св е т лое кольц о с т е мным пят ном посре дине или т олько св е т лое пят но. П одъ е мом конде нсора добив аю т ся появ ле ния т олько св е т лого пят на (в озмож но ме ньше го разме ра). В инт ами в ыв одят св е т лое пят но на се ре дину полязре ния. 6. П осле эт ой подгот ов ит е льной работ ы в ст ав ляю т объ е ктив х40, диафрагму осв е т ит е ля от крыв аю т наст олько, ч т обы было осв е щ е но в се поле зре ния, и фокусирую т пре парат . Е сли уст анов ка была пров е де на прав ильно, т о на т е мном фоне будут в идны ярко осв е щ е нные объ е кты. П ре дме т ные ст е кла долж ны быт ь т онкими, не т олщ е 1,2 мм. Слой ме ж ду пре дме т ным и покров ным ст е клом т акж е долж е н быт ь какмож но т оньше . Фазово-конт рас т ная м икрос копия Ф азов о-конт раст наямикроскопияв от лич ие от св е т о- и т е мнопольной име е т знач ит е льные пре имущ е ст в а, т аккакпозв оляе т иссле дов ат ь ж ив ые не окраше нные кле т ки и т е м самым в ыяв ит ь ист инные особе нност и наблю дае мого объ е кта. К онт раст ност ь изображ е ния зав исит от ст е пе ни поглощ е ния св е т а различ ными ст руктурными эле ме нт ами объ е кта. Бакте риальные и большинст в о других биологич е ских пре парат ов в в идимом св е т е прозрач ны. Св е т , проходя ч е ре з т акие объ е кты, име е т лишь одно изме не ние : сме щ ае т ся фаза е го коле бания в зав исимост и от т олщ ины и показат е ле й пре ломле ния от де льных ст руктур объ е кта. Сме щ е ние фазы св е т а однако не дае т в идимых изме не ний, и пре парат ы оказыв аю т ся не конт раст ными. Ц е рнике (1934) разработ ал фазов о-конт раст ное приспособле ние к микроскопу, с помощ ью кот орого ч ист о опт ич е ским пут е м мож но

13

обрат ит ь эт и не улов имые глазом сме щ е ния фаз в изме не нии длины в олны, обе спе ч ив аю щ ие конт раст ност ь пре парат а. Ф азов о-конт раст ное приспособле ние кмикроскопу в клю ч ае т : 1) осв е т ит е ль (колле ктор); 2) набор фазов ых объ е ктив ов , от лич аю щ ихся от обыч ных налич ие м кольц е образной фазов ой пласт инки; 3) фазов ый конде нсор с подв иж ным диском, спе ц иальными диафрагмами (от де льно для каж дого объ е ктив а) и ц е нт рирую щ ими в инт ами, сов ме щ аю щ ими изображ е ние диафрагмы конде нсора с фазов ой пласт инкой объ е ктив а; 4) в спомогат е льный микроскоп малого ув е лич е ния в ст ав ляе т ся в ме ст о окуляра; с е го помощ ью ув е лич ив ае т сяизображ е ние кольц е в ой диафрагмы и фазов ой пласт инки при их сов ме щ е нии; 5) не сколько св е т офильт ров . М икроскоп с фазов ым конт раст ом позв оляе т различ ит ь на не окраше нных пре парат ах конт уры оболоч е к, ж гут ики, органоиды и в клю ч е ния. Порядок раб от ы с ф азово-конт рас т ным ус т рой с т вом 1. В микроскопе произв одят заме ну объ е ктив ов и обыч ного конде нсора на фазов о-конт раст ные . 2. П ов орот ом диска конде нсора в в одят нуле в ую диафрагму. 3. С объ е ктив ом х10 добив аю т ся хороше го осв е щ е ния поля зре ния. Для эт ого приме няю т т оч е ч ную лампу для микроскопиров ания. Изображ е ние нит и лампы на апе рт урной диафрагме конде нсора долж но быт ь ч е т ким, и нит ь долж на быт ь ст рого ц е нт риров ана по от ноше нию кц е нт ру диафрагмы. Зат е м в апе рт урную диафрагму в ст ав ляю т мат ов ое ст е кло, на ст олик поме щ аю т пре парат и закрыв аю т ирисов ую диафрагму осв е т ит е ля. К онде нсор ж е поднимаю т или опускаю т до т е х пор, пока не получ ит ся ре зкое изображ е ние пре парат а. Е сли поле зре ния осв е щ е но слишком ярко, т о ст ав ят дополнит е льный св е т офильт р. П ри помощ и пов орот а зе ркала ц е нт рирую т диафрагму и от крыв аю т осв е т ит е ль наст олько, ч т обы осв е щ е нное поле зре ния было не больше поля зре ниямикроскопа. 4. Нуле в ую диафрагму конде нсора заме няю т диафрагмой соот в е т ст в ую щ е го объ е ктив а. Так, при просмот ре пре парат а с объ е ктив ом х40 пов орач ив аю т диск конде нсора до появ ле ния в круглом окошке ц ифры 40. 5. В ынимаю т окуляр и заме няю т е го дополнит е льным микроскопом. П однимая в ыдв иж ную т рубу дополнит е льного микроскопа, укре пляю т е е в т аком полож е нии, при кот ором от ч е т лив о будут в идны кольц е в ая диафрагма конде нсора и фазов ая пласт инка. В ращ е ние м ц е нт ров оч ных в инт ов добив аю т сясов ме щ е нияколе ц . 6. В спомогат е льный микроскоп в ынимаю т и снов а в ст ав ляю т окуляр. В се эт и опе рац ии обе спе ч ив аю т в озмож ност ь в е ст и наблю де ние пре парат а в фазов ом конт раст е .

14

Л ю м инес цент ная м икрос копия Таккакразре шаю щ ая способност ь св е т ов ого микроскопа находит ся в прямой зав исимост и от длины в олны используе мого св е т а, мож но не сколько пов ысит ь разре ше ние , е сли осв е щ ат ь объ е кт ульт рафиоле т ов ыми луч ами. Для корот ков олнов ого ульт рафиоле т а ст е кло не прозрач но, поэт ому линзы в т аком микроскопе долж ны быт ь изгот ов ле ны из кварц а; изображ е ние приходит ся фот ографиров ат ь, т аккакглазульт рафиоле т ов ые луч и не в оспринимае т . Из-за большой ст оимост и оборудов ания и е го слож ност и ульт рафиоле т ов ая микроскопия находит лишь огранич е нное приме не ние . О днако е е модификац ия, т ак назыв ае мая флуоре сц е нт ная микроскопия, ч аст о приме няе т сядляре ше нияряда в аж ных биологич е ских в опросов . Не кот орые химич е ские сое дине ния поглощ аю т ульт рафиоле т ов ые луч и, но ч аст ь поглощ е нной эне ргии испускаю т в в иде св е т а с большими длинами в олн, от носящ ихся уж е кв идимой област и спе ктра. Э т о яв ле ние назыв ае т ся флуоре сц е нц ие й. Е сли облуч ат ь флуоре сц ирую щ ий объ е кт ульт рафиоле т ом, т о он буде т ярко св е т ит ься на т е мном фоне . В эт ом и заклю ч ае т ся принц ип флуоре сц е нт ной микроскопии. Так как флуоре сц ирую щ ий объ е кт испускае т в идимый св е т , кот орый проходит ч е ре змикроскоп, т о в эт ом случ ае изкв арц а долж е н быт ь изгот ов ле н один лишь конде нсор. С помощ ью флуоре сц е нт ной микроскопии мож но спе ц ифич е ски в ыяв лят ь кле т ки опре де ле нного в ида бакте рий в сме шанной популяц ии микробов , е сли эт у популяц ию обработ ат ь флуоре сц ирую щ е й ант исыв орот кой кданной бакте рии. М икрос копия с ис пользованием элект ронного м икрос копа Наряду с в ыше излож е нными прие мами микроскопич е ских иссле дов аний в после дне е в ре мя находит в се больше е приме не ние микроскопиров ание с помощ ью эле ктронных луч е й. П е рв ый эле ктронный микроскоп был сконст руиров ан в 1928-1931 гг. Е .Руска, М .К нолль и Б.Боррис. Э ле ктронная микроскопия основ ана на т ом, ч т о эле ктромагнит ное поле в лияе т на пуч окэле ктронов аналогич но т ому, какст е клянная линза де йст в уе т на луч св е т а. Э ле ктронный луч обладае т св ойст в ами эле ктромагнит ного излуч е ния с оч е нь малой длиной в олны. Е сли эле ктроны ускоре ны в эле ктрич е ском поле напряж е ние м 100 кВ , т о длина т акой в олны сост ав ляе т в се го лишь 0,04 нм, т .е . приме рно в 10000 раз ме ньше , ч е м у в идимого св е т а. Дв иж е ние эле ктронов осущ е ст в ляе т ся в в акууме . Соот в е т ст в е нно и пре дме т ное разре ше ние эле ктронного микроскопа на не сколько порядков в ыше , ч е м у св е т ов ого, дост игае т 20-50 нм. П оле зное ув е лич е ние эле ктронного микроскопа дост игае т 100000х.

15

Сканирую щ ий элект ронный м икрос коп К аксв е т ов ой, т аки эле ктронный, т рансмиссионный микроскоп дае т по сущ е ст в у дв уме рное (плоское ) изображ е ние . Сканирую щ ий эле ктронный микроскоп - модификац ия эле ктронного микроскопа позв оляе т получ ат ь т ре хме рные изображ е ния пов е рхност ной ст руктуры микроскопич е ских объ е ктов . В т аком микроскопе объ е кт, покрыт ый т онким слое м т яж е лого ме т алла, сканируе т ся узким пуч ком эле ктронов наподобие т ого, как эт о де лае т ся в т е ле в изионной т рубке. Э ле ктроны, испускае мые т ой т оч кой объ е кта, на кот орую падае т сканирую щ ий пуч ок, собираю т ся колле ктором, и с помощ ью усилит е ля создае т ся изображ е ние на экране эле ктронно-луч е в ой т рубки. К онт раст обуслов ле н т е м, ч т о колич е ст в о испущ е нных образц ом в т орич ных эле ктронов пропорц ионально углу ме ж ду эле ктронным пуском и пов е рхност ью объ е кта; эт о позв оляе т в ыяв ит ь прост ранст в е нную ст руктуру после дне го. П . Т ех никапригот овления м икрос копичес ких препарат ов 1) Препарат ы ж ивых м икроорганизм ов (раздав ле нная капля с приж изне нной окраской). П ре парат гот ов ят для иссле дов ания микробов в ж ив ом в иде , для наблю де ния за подв иж ност ью и других ц е ле й. На ч ист ое пре дме т ное ст е кло в каплю в одопров одной в оды в носят пе т ле й или иглой, пре дв арит е льно прокале нной в пламе ни спирт ов ки, не большое колич е ст в о иссле дуе мых микробов , разме шив аю т и, не в ыпуская пе т ли из рук, е е т от ч ас ж е ст е рилизую т . П олуч е нную суспе нзию накрыв аю т покров ным ст е клом т ак, ч т обы не образов ались пузырьки в оздуха. Избыт ок в оды удаляю т фильт ров альной бумагой, подносяе е кграням покров ного ст е кла. В нимат е льно сле дят , ч т обы пов е рхност ь покров ного ст е кла была сухой. Ж идкие культ уры (се нной наст ой, нав озная ж иж а, поч в е нная болт ушка, огуре ч ный рассол и т .п.) мож но не разв одит ь к в оде ; каплю иссле дуе мой ж идкост и наносят пипе т кой или пе т ле й на пре дме т ное ст е кло и накрыв аю т покров ным. П ригот ов ле нный пре парат рассмат рив аю т под микроскопом с большим ув е лич е ние м (40 х 15). Приж изненная окрас ка – эт о т акой способ окраски, при кот ором окраше нные организмы длит е льное в ре мяост аю т сяж ив ыми и способными к размнож е нию . Э т им способом ч аст о пользую т ся при работ е с раздав ле нной капле й. Для луч ше й в идимост и микробов под покров ное ст е кло в в одят не большую каплю раст в ора краски: не йт рального красного, ме т иле нов ой сини или фуксина. П ри эт ом микроорганизмы ост аю т ся ж ив ыми. 2) Препарат вис ячая капля. В исяч е й капле й пользую т ся для длит е льных наблю де ний за подв иж ност ью микробов , их разв ит ие м, размнож е ние м, спорообразов ание м. В в исяч е й капле рассмат рив аю т обыч но суспе нзию микробов в ж идкой пит ат е льной сре де или в физиологич е ском раст в оре (0,5 % раст в ор NaCl). Суспе нзия микробов не

16

долж на быт ь слишком густ ой, т ак как эт о зат рудняе т наблю де ние изме не ний, происходящ их в от де льных кле т ках. На покров ное ст е кло наносят пе т ле й каплю иссле дуе мой суспе нзии и пов орач ив аю т е го т ак, ч т обы капля в исе ла на е го ниж не й ст ороне . Зат е м покров ное ст е кло накладыв аю т на пре дме т ное ст е кло с в ышлифов анным углубле ние м посе ре дине . К рая углубле ния пре дме т ного ст е кла не обходимо пре дв арит е льно смазат ь в азе лином, ч т обы капля оказалась ге рме т ич е ски заклю ч е нной в о в лаж ной каме ре . К апля долж на св ободно в исе т ь в углубле нии пре дме т ного ст е кла, не касаясь е го крае в или дна. 3) Препарат ы уб ит ых м икроорганизм ов – эт о фиксиров анные и пост оянные пре парат ы. Ф иксац ияиме е т ц е лью : а) убит ь микробы, б) обе спе ч ит ь их луч ше е прилипание кпре дме т ному ст е клу и т е м самым пре дохранит ь пре парат от смыв ания, в ) сде лат ь микробный мазокболе е в осприимч ив ым кокраске, т аккакме рт в ые кле т ки красят ся луч ше , ч е м ж ив ые . Ф иксац ию сле дуе т пров одит ь оч е нь быст ро, ч т обы не в ызв ат ь наруше ний в ст руктуре кле т ки. Ф иксиров анные пре парат ы име ю т т о пре имущ е ст в о, ч т о позв оляю т получ ит ь боле е ч е т кое и де т альное пре дст ав ле ние о форме и ст рое нии микробной кле т ки; они длит е льно сохраняю т сяи могут быт ь использов аны пов т орно. П ригот ов ле ние фиксиров анных пре парат ов слагае т сяизряда опе рац ий. Пригот овление м азка. На ч ист ое пре дме т ное ст е кло (ст е кла признаю т ся ч ист ыми, е сли в ода ле гко расплыв ае т ся на их пов е рхност и, не образуя капе ль шаров идной формы) ме т аллич е ской пе т ле й, прокале нной в пламе ни спирт ов ки, наносят каплю микробной в зв е си и рав номе рно т онким слое м распре де ляю т е е на пов е рхност и пре дме т ного ст е кла, занимаяплощ адь не боле е 4 кв .см (площ адь покров ного ст е кла). В ыс уш ивание. В ысушив ание мазка произв одят на в оздухе при комнат ной т е мпе рат уре ; дляускоре нияв ысыханияпре парат захв ат ыв ае т ся ме ж ду большим и указат е льным пальц ами мазком в в е рх и ост орож но подсушив ае т сяна пламе ни горе лки в т е плом т оке в оздуха (де рж ат ь в ысоко над пламе не м). Фикс ация. В зав исимост и от т ого, какая ц е ль пре сле дуе т ся при изуч е нии микробов , приме няю т различ ные способы фиксац ии. Так, при изуч е нии ст рое ния бакте риальной кле т ки фиксац ию произв одят химич е скими в е щ е ст в ами (ж идкими или ле т уч ими) – эт илов ым спирт ом, сме сью К арнуа, ж идкост ью Никифоров а, парами осмие в ой кислот ы и др. В о в се х ост альных случ аях мож но приме нят ь боле е прост ой способ фиксац ии – нагре в ание в пламе ни горе лки. Для эт ого пре парат 3-4 раза ме дле нно пров одят ч е ре з в е рхню ю ч аст ь пламе ни спирт ов ки, де рж а пре дме т ное ст е кло мазком в в е рх. Ф иксац ия дост игае т ся нагре в ом пов е рхност и ст е кла. Не сле дуе т пе ре гре в ат ь мазок, т ак как при эт ом происходит грубое изме не ние кле т оч ных ст руктур. О крас ка. Ф иксиров анный пре парат после полного охлаж де ния ст е кла покрыв аю т раст в ором какого-либо красит е ля. П рост ыми и

17

распрост ране нными красит е лями яв ляю т ся раст в оры ме т иле нов ой сини и фуксина, кот орыми и покрыв ае т ся в е сь мазок на опре де ле нное в ре мя. Так, при окраске пре парат а фуксином красит е ль де рж ат на ст е кле 23 минут ы, а при окраске ме т иле нов ой синью – 4-5 минут . М е т иле нов ую синь наносят не посре дст в е нно на мазок. Ф уксин луч ше капат ь на полоску фильт ров альной бумаги, кот орой покрыв аю т мазок. В нимат е льно сле дят , ч т обы красит е ль не подсыхал на ст е кле и фильт ров альная бумага пост оянно была в лаж ной. Пром ывание. К раска смыв ае т сясильной ст руе й в оды до т е х пор, пока после дние порц ии ст е каю щ е й в оды будут сов е рше нно бе сц в е т ны. П ре дме т ное ст е кло в ыт ираю т , а мазок подсушив аю т . П ре парат микроскопирую т бе зпокров ного ст е кла. Зат е м на пре парат накле ив ае т сяэт икет ка с указание м формы бакте рий (кокки, палоч ки и т .д.), фамилия ст уде нт а, изгот ов ив ше го пре парат . Ф иксиров анный пре парат мож е т хранит ься до т ре х ме сяц е в . П ост оянный пре парат от лич ае т ся от фиксиров анного боле е длит е льным сроком хране ния (до не скольких ле т ); эт о обыч ный фиксиров анный пре парат , кот орый накрыв аю т покров ным ст е клом и залив аю т канадским бальзамом. Задание : 1. О знакомит ьсяс различ ными т ипами микроскопа (св е т ов ой микроскоп, т е мнопольный, фазов о-конт раст ный). 2. П ригот ов ит ь из эле ктив ной культ уры се нной палоч ки Bacillus subtilis пре парат ы: раздав ле нная капля, в исяч ая капля. 3. Зарисов ат ь форму и в заимное располож е ние кле т ок. 4. П ригот ов ит ь фиксиров анный пре парат и рассмот ре т ь е го, используяимме рсионный объ е ктив . М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, бакте риологич е ская пе т ля, пре дме т ные и покров ные ст е кла, пре дме т ное ст е кло с лункой, капе льниц а с в одопров одной в одой, спирт ов ка, спич ки, крист аллизат ор с мост иком, пинц е т , фильт ров альнаябумага, промыв алка, салфе т ка, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, кедров ое масло; капе льниц а с раст в ором фуксина (10 г фуксина основ ного раст в оряю т в 100 мл эт анола 90о, добав ляю т 5 гфе нола и 100 мл в оды, ч е ре з 24 ч аса фильт рую т , красит е ль уст ойч ив , не посре дст в е нно пе ре д упот ре бле ние м разв одят в одой в 10 раз); капе льниц а с раст в ором ме т иле нов ой сини (3 г ме т иле нов ой сини раст в оряю т в 100 мл 96о эт илов ого спирт а, раст в ор ост ав ляю т на 2-3 дня, в збалт ыв аю т и фильт рую т . Раст в ор уст ойч ив . П е ре д упот ре бле ние м разбав ляю т красит е ль в одой 1:40).

18

ТЕ М А 2. М О РФ О Л О ГИЯ М ИК РО О РГАНИЗМ О В Работа 3. М орф ология грибов Грибы – обширная группа бе схлорофильных низших раст е ний (микромиц е т ы). Не кот орые в иды микроскопич е ских грибов , в ч аст ност и, дрож ж е в ые и пле сне в ые грибы из классов фикомиц е т ов , аскомиц е т ов и не сов е рше нных грибов , яв ляю т сяобъ е ктами микробиологии. Г риб ы. Те ло гриба – миц е лий – образуе т ся из большого колич е ст в а т онких в е т в ящ ихся нит е й – гиф, диаме т ром от 5 до 50 мкм. Длина гиф мож е т дост игат ь не скольких мм, а в сяколониягриба, какправ ило, хорошо в идна на субст рат е , т .к. занимае т площ адь в не сколько квадрат ных сант име т ров . К олония гриба образуе т пушист ый, нит е в идный, в ат оподобный или порошкообразный нале т на субст рат е . П ле сне в ые грибы от носят ся к эукариот ам, т .е . для них характе рно налич ие хорошо диффе ре нц иров анного ядра. В ц ит оплазме грибов в идны в акуоли, мит охондрии и другие органоиды. Из класса фикомиц е т ов (Phycomycetes) широко распрост ране ны мукоров ые грибы (Mucor). О ни играю т большую роль в мине рализац ии органич е ских в е щ е ст в поч в ы. М укоров ые грибы образую т в е т в ист ый не се пт иров анный (однокле т оч ный) многояде рный миц е лий. П ри в е ге т ат ив ном размнож е нии мукоров ых грибов образую т ся в озв ышаю щ ие ся над субст рат ом в ырост ы миц е лия – спорангиофоры. О конч ание спорангиофора ут олщ е но и от де ле но от ост ального миц е лия пе ре городкой. В спорангии образуе т ся большое колич е ст в о спор. П ри полов ом размнож е нии происходит слияние дв ух от ч ле няю щ ихсяна конц ах гиф кле т ок, назв анных гаме т ангиями. В ре зульт ат е образуе т сязигоспора, в кот орой происходит слияние яде р. В классе сумч ат ых грибов (Ascomycetes) сле дуе т от ме т ит ь пре дст ав ит е ле й дв ух родов : Aspergillus и Penicillium. М иц е лий у них хорошо разв ит ый, се пт иров анный, многокле т оч ный. Размнож аю т ся они глав ным образом бе сполым пут е м при помощ и конидий. П ре дст ав ит е ли рода Aspergillus (ле е ч ная пле се нь) образую т конидиофоры, в озв ышаю щ ие ся над субст рат ом, ут олщ е нные в св ое й в е рхне й ч аст и. О т эт ого ут олщ е ния от ходят палоч ков идные в ырост ы – ст е ригмы, на конц ах кот орых происходит образов ание конидий (конидиоспор). Грибы рода Penicillium образую т в е т в ящ ие ся конидиофоры, от кот орых от ходят ст е ригмы, а на их конц ах образую т ся ц е поч ки спор (конидии). К онидиальный аппарат напоминае т кист ь. П ри полов ом размнож е нии происходит слияние дв ух прот опласт ов , зат е м слияние яде р с образов ание м диплоидной зигот ы. П осле ме йоза из зигот ы образуе т ся сумка с 8 аскоспорами.

19

П ле сне в ые грибы родов Aspergillus и Penicillium име ю т большое знач е ние как продуц е нт ы ц е нных в е щ е ст в – фе рме нт ов , ант ибиот иков , органич е ских кислот . К классу аскомиц е т ов от носят ся т акж е дрож ж е в ые грибы. Э т о однокле т оч ные организмы дов ольно крупных разме ров - от 4 до 12 мкм. Ф орма кле т ок мож е т быт ь круглой, яйц е в идной, лимонообразной и палоч ков идной. О болоч ка дрож ж е й хорошо различ има в св е т ов ой микроскоп. В ц ит оплазме находит ся хорошо диффе ре нц иров анное ядро, в акуоли, мит охондрии, запасные в е щ е ст в а. Размнож аю т ся дрож ж и поч ков ание м, де ле ние м и спорами. П оч кую щ ие ся дрож ж и от носят ся к роду Saccharomyces, де лящ ие ся – к роду Schizosaccharomyces. Спорообразов ание св ойст в е нно пре дст ав ит е лям обоих се ме йст в , однако у многих поч кую щ ихся дрож ж е й оно сов се м не в ыяв ле но. Спорообразов ание у большинст в а дрож ж е й происходит бе сполым пут е м, но наблю дае т сяи полов ой проц е сс. Большинст в о дрож ж е й в раст в орах с сахаром в ызыв ае т спирт ов ое брож е ние , но не кот орые их пре дст ав ит е ли, в ч аст ност и, многие поч в е нные дрож ж и, произв одят пре имущ е ст в е нно окисле ние сахаров ; кроме т ого, они могут окислят ь спирт ы и органич е ские кислот ы. Дрож ж е в ые грибы име ю т огромное практич е ское знач е ние (глав ным образом, пре дст ав ит е ли рода Saccharomyces). О ни широко использую т ся в хле бопе ч е нии, в произв одст в е спирт а, в ина и т .п. Задание : 1. П ригот ов ит ь пре парат ы пле сне в ых грибов изродов Mucor, Aspergillus и Penicillium и рассмот ре т ь при малом и сре дне м ув е лич е нии микроскопа. О т ме т ит ь различ ия в ст рое нии миц е лия и спороносящ их органов ; зарисов ат ь. В от лич ие от ране е описанного способа пре парат ы из культ ур пле се не й гот ов ят ся т ак: проба миц е лия расщ е пляе т ся при помощ и пре паров альных иголок в капле в оды. В се после дую щ ие опе рац ии т е ж е самые . 2. П ригот ов ит ь приж изне нный пре парат дрож ж е й из рода Saccharomyces (пе карские дрож ж и), добав ив к суспе нзии культ уры на пре дме т ном ст е кле каплю раст в ора Л ю голя. Рассмот ре т ь при малом и сре дне м ув е лич е нии микроскопа. О т ме т ит ь форму кле т ок, найт и кле т ки в ст адии поч ков ания. М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, пре дме т ные и покров ные ст е кла, микробиологич е ская пе т ля, пре паров альные иглы (2), капе льниц а с в одой, салфе т ки, фильт ров альная бумага, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, спирт ов ка, ч ашки П е т ри с культ урами пле сне в ых грибов , культ ура дрож ж е й, капе льниц а с раст в ором Л ю голя. Раст в ор Л ю голя: крист аллич е ский йод 1г, йодист ый калий 3г, дист иллиров анная в ода 300 мл. В ст упку е мкост ью 3050 мл поме щ аю т нав е ску йода и йодист ого калия и раст ираю т сме сь пе ст иком. Добав ляю т 1 мл дист иллиров анной в оды и, продолж ая

20

раст ират ь, добав ляю т е щ е 5 мл в оды. Раст в ор колич е ст в е нно пе ре носят в склянку и дов одят общ ий объ е м до 300 мл. Раст в ор годе н не боле е 30 дне й при хране нии в т е мной посуде . Работа 4. О сновны еф орм ы бак терий Бакте рии – эт о наиболе е многоч исле нная группа микроорганизмов , насе ляю щ их поч в у, в одое мы, в ст ре ч аю щ ихся пов се ме ст но и яв ляю щ ихся пост оянными спут никами ж ив от ных и раст е ний. Их роль в природе , практич е ской ж изни ч е лов е ка исклю ч ит е льно в е лика и многообразна. П о морфологии бакте рии пре дст ав ляю т собой не однородную группу микроорганизмов : большинст в о пре дст ав ит е ле й эт ой группы – однокле т оч ные формы, в ст ре ч аю т сяколониальные формы. В се разнообразие бакте рий по форме кле т ок разде ляе т ся на 3 основ ные группы: сфе рич е ские , ц илиндрич е ские (палоч ков идные ) и изв ит ые . Сфе рич е ские бакте рии назыв аю т кокками, они име ю т форму прав ильного или не прав ильного шара: поч ков идную – у гонококков и напоминаю щ ую пламя св е ч и – у пне в мококков . Сре дний диаме т р кокков 0,5-1,5 мкм. В зав исимост и от характе ра де ле ния кле т ки сфе рич е ских бакте рий располагаю т ся поодиноч ке или скопле ниями. Бакте рии, в ст ре ч аю щ ие ся в природе в в иде одиноч ных кле т ок, назыв аю т микрококками. Сфе рич е ские бакте рии, сое дине нные по дв е кле т ки, назыв аю т диплококками. К ле т ки после дних де лят ся в одной плоскост и. К пат оге нным диплококкам от носят ся пне в мококки, ме нингококки, гонококки. Сфе рич е ские бакте рии, сое дине нные в ц е поч ки (т ри и боле е кле т ок), назыв аю т сяст ре пт ококками. П ри де ле нии кле т ок в дв ух в заимно пе рпе ндикулярных плоскост ях образую т ся т е т рады кокков (т е т ракокки), а в т ре х – пакет ы из 8 и боле е кле т ок (сарц ины); т акое располож е ние кле т ок характе рно для бакте рий рода Sarcina. Ст афилококк(Staphyle – гроздь) при размнож е нии де лит ся боле е ч е м в одной плоскост и, в ре зульт ат е образую т ся скопле ния кле т ок, напоминаю щ ие гроздь в инограда. П алоч ков идные , или ц илиндрич е ские , бакте рии различ аю т ся ме ж ду собой разме рами, от ноше ние м длины кле т ок к ширине , оконч ание м кле т ок, способност ью образов ыв ат ь споры. П алоч ков идные бакте рии могут в ст ре ч ат ьсяв в иде диплобакте рий и ст ре пт обакте рий. Изв ит ые бакте рии – эт о палоч ков идные формы, в различ ной ст е пе ни изогнут ые . Различ аю т спириллы, в ибрионы и спирохе т ы. Спириллы (spira – изгиб) име ю т изгибы, рав ные одному или не скольким оборот ам спирали. О борот спирали или шаг в инт а – эт о расст ояние ме ж ду дв умя в е ршинами спирали. В ибрионы име ю т ме не е одного оборот а спирали. Спириллы и в ибрионы дв иж ут ся при помощ и ж гут иков , кот орые располагаю т ся по полю сам. Спирохе т ы (spira – изгиб; shaets – в олосы) в ст руктурном от ноше нии пре дст ав ляю т собой ц ит оплазмат ич е ский ц илиндр, огранич е нный

21

ц ит оплазмат ич е ской ме мбраной (Ц П М ) и кле т оч ной ст е нкой. У спирохе т ме ж ду кле т оч ной ст е нкой и Ц П М располож е ны дв а пуч ка фибрилл, прикре пле нные к ц ит оплазмат ич е скому ц илиндру на конц ах кле т ки, направ ле нные нав ст ре ч у друг другу. Сов окупност ь фибрилл назыв ае т ся аксост иль. К роме пе ре ч исле нных форм, бакте рии могут быт ь иной формы: замкнут ого или не замкнут ого кольц а (т ороид), прав ильной ше ст иугольной зв е зды, име т ь в ырост ы – прост е кобакте рии, в ст ре ч аю т ся ч е рв е образные бакте рии. Длямногих бакте рий характе ре н т рихомный т ип организац ии, при кот ором многоч исле нные ц илиндрич е ские или палоч ков идные кле т ки собраны в нит ь – т рихом. Св ое образной формой от лич аю т сяактиномиц е т ы (“луч ист ые грибы”), кле т ки кот орых способны в е т в ит ься, образуя миц е лий. Актиномиц е т ы широко распрост ране ны в природе . О снов ное ме ст о их обит ания – поч в а, ре ж е – в ода. Наряду с бакте риями и грибами они принимаю т уч аст ие в пре в ращ е нии различ ных в е щ е ст в и, в ч аст ност и, разлагаю т в е сьма т руднодост упный микробам пе ре гной поч в ы. Большинст в о актиномиц е т ов яв ляе т ся сапрофит ами, однако име ю т ся сре ди них и пат оге нные в иды (наприме р, не кот орые в иды микобакте рий – в озбудит е ли т убе ркуле за, дифт е рии). М ногие из актиномиц е т ов – продуц е нт ы ант ибиот ич е ских в е щ е ст в . У актиномиц е т ов различ аю т дв е ч аст и миц е лия – субст рат ный миц е лий, в раст аю щ ий в сре ду, и в оздушный, появ ляю щ ийся поздне е и придаю щ ий колонии пушист ый или бархат ист ый в ид. К олонии, в ыраст аю щ ие на плот ных пит ат е льных сре дах, от лич аю т ся плот ной консист е нц ие й и яркой пигме нт ац ие й (красная, розов ая, фиоле т ов ая, ч е рнаяи др.). У проактиномиц е т миц е лий в ст арых культ урах распадае т ся на палоч ков идные кле т ки. Размнож аю т ся актиномиц е т ы конидиями и спорами. Споры формирую т ся на особых в оздушных гифах – спорофорах, кот орые от ходят не посре дст в е нно от пов е рхност и колонии или образую т ся на глав ных гифах в оздушного миц е лия. Спороносц ы у разных актиномиц е т ов от лич аю т ся по ст рое нию . У одних в идов они прямые , сле гка искрив ле нные , у других – в инт ообразно закруч е нные . Размнож е ние мож е т осущ е ст в лят ься т акж е с помощ ью обрыв ков зре лого в оздушного миц е лия. Актиномиц е т ы классифиц ирую т на основ е ст рое ния и в е лич ины спорофит ов , характе ра образов ания и формы спор, общ е го в ида колоний, их ц в е т а и консист е нц ии на плот ной пит ат е льной сре де . Задание : 1. П ригот ов ит ь пре парат ы бакте рий разных форм. 2. М икроскопиров ат ь и зарисов ат ь пригот ов ле нные пре парат ы. 3. Рассмот ре т ь колонию актиномиц е т ов в ч ашке П е т ри при малом ув е лич е нии микроскопа. 4. П ригот ов ит ь пре парат актиномиц е т ов , микроскопиров ат ь.

22

М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, бакте риологич е ская пе т ля, пре дме т ные и покров ные ст е кла, капе льниц а с в одопров одной в одой, спирт ов ка, спич ки, в анноч ки с мост иком дляокрашив ания, салфе т ки, пинц е т , фильт ров альная бумага, промыв алка, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, ч ист ые культ уры бакте рий разной формы. Работа 5. О пределениеразм еров м ик робны х к леток с пом ощью ок у ляр-м ик ром етров Разме ры кле т ок микроорганизмов коле блю т ся от де сят ых доле й до не скольких микроме т ров (1 мкм = 0,001 или 10-3 мм). Для изме ре ния в е лич ины кле т ок бакте рий пользую т ся особыми приспособле ниями к микроскопу – окуляр-микроме т ром и объ е ктмикроме т ром. О куляр-микроме т р – эт о круглое ст е клышко с де ле ниями (каж дый мм разде ле н на 10 де ле ний). О бъ е кт-микроме т р – эт о ст е клянная пласт инка (лине е ч ка), на кот орой 1 мм разде ле н на 100 де ле ний (одно де ле ние рав но 10 микроме т рам); е ю пользую т ся для опре де ле ния ц е ны де ле ния окулярной лине йки. С эт ой ц е лью окуляр-микроме т р в ст ав ляю т в окуляр микроскопа, для ч е го от в инч ив аю т е го в е рхню ю линзу, а объ е ктмикроме т р поме щ аю т на ст олик микроскопа в ц е нт р поля зре ния и рассмат рив аю т какпре парат ; при эт ом нач ало одного изв идимых де ле ний объ е кт-микроме т ра сов ме щ аю т с нуле м окуляр-микроме т ра; от ме ч аю т ближ айше е кнулю сов паде ние де ле ний на обе их лине йках; подсч ит ыв аю т , сколько объ е ктив ных и окулярных де ле ний укладыв ае т ся на от ре зке от пункта сов паде ния де ле ний до нуля. Наприме р, 2 де ле ния объ е ктмикроме т ра соот в е т ст в ую т 5 де ле ниям окуляр-микроме т ра. Знач ит , ц е на одного де ле нияокуляр-микроме т ра 2 х 10 d = -------------- = 4 мкм. 5 Те пе рь мож но прист упат ь кизме ре нию микробной кле т ки. О бъ е ктмикроме т р снимаю т с пре дме т ного ст олика, заме няю т е го пре парат ом и рассмат рив аю т с т е м ж е окуляром и объ е ктив ом (обыч но 15 х 40). О пре де ляю т , какому ч ислу окулярных де ле ний соот в е т ст в уе т в е лич ина изме ряе мого объ е кта, а зат е м эт о ч исло умнож аю т на пре ж де найде нный коэффиц ие нт (в наше м случ ае – на 4). Наприме р, изме ряе мая кле т ка занимае т 3 де ле ния окуляр-микроме т ра, сле дов ат е льно, е е разме р рав е н 12 мкм. Задание : 1. О пре де лит ь ц е ну одного де ле нияокуляр-микроме т ра. 2. О пре де лит ь разме ры кле т окбакте рий. 3. О пре де лит ь разме ры кле т окдрож ж е в ых грибов .

23

М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, пре дме т ные и покров ные ст е кла, микробиологич е ская пе т ля, пре паров альные иглы, капе льниц а с в одой, салфе т ки, фильт ров альная бумага, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, спирт ов ка, спич ки, в анноч ка с мост иком, промыв алка, окуляр-микроме т р, объ е ктмикроме т р, ч ист ые культ уры бакте рий различ ной формы, культ ура дрож ж е й.

24

ТЕ М А 3. НЕ К О ТО РЫ Е О СО БЕ ННО СТИСТРО Е НИЯ БАК ТЕ РИАЛ Ь НО Й К Л Е ТК И Работа 6. О к раск а бак терий по Грам у Бакте риальнаякле т ка сост оит изпрот опласт а, окруж е нного кле т оч ной оболоч кой. О болоч ка (кле т оч ная ст е нка) – т онч айшая бе сц в е т ная ст руктура, не в идимая в св е т ов ой микроскоп бе з спе ц иальной обработ ки (е е разме ры 0,01-0,04 мкм). П о ст рое нию кле т оч ной оболоч ки в се прокариот ы от не се ны к грамот риц ат е льным и грамполож ит е льным бакте риям. В сост ав кле т оч ной оболоч ки в ходит пе пт идогликан (муре ин), кроме т ого обнаруж е ны т е йхое в ые кислот ы, липопрот е иды, липополисахариды и фосфолипиды. М икоплазмы не име ю т кле т оч ной оболоч ки. У архе бакте рий кле т оч ная оболоч ка в е сьма разнообразна по химич е ским компоне нт ам: у одних бакте рий в сост ав е кле т оч ной оболоч ки – псе в домуре ин, у других – липополисахариды и другие сое дине ния. К ле т оч наяоболоч ка играе т защ ит ную роль, опре де ляе т форму кле т ки. О краска по Граму яв ляе т ся в аж не йшим признаком бакте рий и зав исит от химич е ского сост ав а кле т оч ной ст е нки и физиологии кле т ок микроорганизмов . Бакте рии окрашив аю т ге нц ианв иоле т ом, йодом в йодист ом калии, зат е м обрабат ыв аю т спирт ом. Бакте рии, сохраняю щ ие окраску, носят назв ание грамполож ит е льных, ут рач ив аю щ ие – грамот риц ат е льных. П орядок работы : де лаю т на одном ст е кле т ри мазка грамполож ит е льного, иссле дуе мого и грамот риц ат е льного микроба. П осле в ысыхания и фиксиров ания мазков бакте рий их обрабат ыв аю т красит е лями в сле дую щ е м порядке: 1) ге нц ианв иоле т ом – 1-2 минут ы, 2) йодом в иодист ом калии (раст в ор Л ю голя) – 1-2 минут ы, 3) промыт ь в одой, 4) обработ ат ь 96% спирт ом – 30 се к., 5) промыт ь в одой, 6) разбав ле нным фуксином - 1-2 минут ы, 7) промыт ь в одой, 8) П росушив аю т пре парат и рассмат рив аю т в микроскоп, срав нив ая окраску мазка иссле дуе мой культ уры с окраской грамполож ит е льного микроба (фиоле т ов ый ц ве т ) и грамот риц ат е льного (красный). Задание : П ров е ст и окраску по Граму, используякульт уры кише ч ной палоч ки Escherichia coli (грамот риц ат е льная), сарц ин (грамполож ит е льная) или дрож ж е й.

25

М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, салфе т ка, ст е кла пре дме т ные обе зж ире нные , ст е кла покров ные , в ода, фильт ров альная бумага, микробиологич е ская пе т ля, бю кс с де нат урат ом, склянка с де зинфиц ирую щ им раст в ором, в анноч ка с мост иком, спирт ов ка, спич ки. К ульт ура дрож ж е й и кише ч ной палоч ки. Ге нц ианв иоле т : 1гге нц ианв иоле т а раст в оряю т в 10 мл 96о спирт а и сме шив аю т со 100 мл 5 % раст в ора фе нола. Раст в ор Л ю голя, спирт 96о, в одный карболов ый фуксин Ц иля. Работа 7. О бнару ж ениек апсу л и ок раск а ж гу тик ов На пов е рхност и не кот орых бакте рий обнаруж ив аю т ся капсула и ж гут ики. К апс ула – слизист ый слой, покрыв аю щ ий кле т оч ную ст е нку. О бразов анию капсул способст в уе т большое соде рж ание в пит ат е льной сре де угле в одов при не дост ат ке азот ист ых в е щ е ст в . К апсула яв ляе т ся защ ит ным приспособле ние м в не благоприят ных услов иях и ме ст ом от лож е ниязапасных пит ат е льных в е щ е ст в . Х орошим объ е ктом для изуч е ния капсул мож е т служ ит ь азот обакте р (Azotobacter chroococcum). С эт ой ц е лью пользую т ся не гат ив ной окраской культ уры ж идкой т ушью : на пре дме т ное ст е кло наносят каплю карболов ого фуксина Ц иля (пополам разбав ле нного в одой); зат е м пе т ле й в носят культ уру азот обакте ра и разме шив аю т . Ч е ре з2-3 мин. прибав ляю т каплю разбав ле нной т уши, т щ ат е льно сме шив аю т , размазыв аю т по ст е клу и подсушив аю т . П ри микроскопич е ском изуч е нии пре парат а будут хорошо в идны бе сц в е т ные капсулы с красными кле т ками бакте рий на т е мном фоне пре парат а. Ж гут ики – бе лков ые ст руктуры, обе спе ч ив аю щ ие подв иж ност ь кле т ки. В зав исимост и от колич е ст в а и располож е ния ж гут иков бакте рии де лят сяна ряд групп: М онот рихи (монополярный) – ж гут икна одном конц е кле т ки; М онот рихи (биполярный) – по одному ж гут ику на обоих конц ах; П олит рихи (монополярный) – пуч ки ж гут иков на одном конц е ; П олит рихи (биполярный) - пуч ки ж гут иков на обоих конц ах; П е рит рихи – ж гут ики располож е ны по в се й пов е рхност и кле т ки. Изуч ат ь ж гут ики дов ольно т рудно, т ак как они име ю т не большие разме ры (в диаме т ре 0,1-0,01 мкм), малое сродст в о с красками сост ав ляю щ их их в е щ е ст в и ле гко разрушаю т ся при пригот ов ле нии пре парат ов . О быч но при их окрашив ании пользую т ся прот рав ами, кот орые от кладыв аю т ся на пов е рхност и ж гут иков , ув е лич ив ая их диаме т р и сродст в о ккраскам. О крас ка ж гут иков по м ет оду Т риб ондо-Фиш ет . Ж гут ики ле гко обламыв аю т ся при ле гком в збалт ыв ании культ уры или е сли е е в озраст пре в ышае т 15 ч ас.

26

1. П ри подгот ов ке пре парат а, ост орож но прикасаясь паст е ров ской пипе т кой с запаянным конц ом к молодой агаров ой культ уре , бе рут не большое колич е ст в о бакте рий и опускаю т пипе т ку в пробирку с 2 м л ст ер ил ь н о й во ды . Не в збалт ыв ат ь, бакте рии самост оят е льно пе ре ходят в в оду. 2. На ч ист ое покров ное ст е кло капаю т 1 каплю бакте риальной в зв е си и даю т е й ст е ч ь, а избыт ок в лаги снимаю т фильт ров альной бумагой. П ре парат сушат при 30-40о, пре дохраняя от пыли и фиксирую т 96 % эт ил о вы м спир т о м . 3. П ри окраске в не большой фарфоров ой ч аше ч ке сме шив аю т 5 мл прот рав ы и 0,5 мл краски и нагре в аю т до кипе ния. К аплю наносят на пре парат , окрашив аю т 20-30 се ки хорошо ополаскив аю т , ч т обы смыт ь пле нку, образую щ ую ся на пов е рхност и прот рав ы и осе даю щ ую на пре парат . П ре парат сушат и просмат рив аю т с имме рсие й. К ле т ки бакте рий окрашив аю т ся в т е мно-лилов ый ц в е т , а ж гут ики красят ся слабе е . Задание : 1. П ригот ов ит ь пре парат Azotobacter chroococcum, окрасит ь, рассмот ре т ь и зарисов ат ь капсулы. 2. О красит ь ж гут ики у Spirillum sp., опре де лит ь т ип ж гут иков ания. М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, бакте риологич е ская пе т ля, пре дме т ные и покров ные ст е кла, капе льниц а с в одопров одной в одой, спирт ов ка, спич ки, крист аллизат ор с мост иком, салфе т ки, пинц е т , фильт ров альная бумага, промыв алка, де зинфиц ирую щ ий раст в ор, окуляр-микроме т р, объ е ктмикроме т р, ч ист ые культ уры бакте рий разной формы, наст ой конского нав оза, культ уры азот обакте ра, се нной палоч ки, маслянокислых бакте рий, спирилл. Ф уксин Ц иля: 10 мл насыщ е нного спирт ов ого раст в ора фуксина основ ного сме шив аю т со 100 мл 5 % в одного раст в ора св е ж е пригот ов ле нного фе нола. Сме сь ч е ре з48 ч асов фильт рую т . К расит е ль уст ойч ив . Для окраски пре парат а азот обакте ра фуксин Ц иля разбав ляю т в дв а раза. Тушь: одну ч аст ь т уши сме шив аю т с де в ят ью ч аст ями дист иллиров анной в оды и ст е рилизую т при 1 ат м в т е ч е ние 30 мин. в пробирках, закрыт ых в ат ными пробками. В ме ст о ст е рилизац ии мож но к т уши добав ит ь не сколько капе ль формалина. Тушь в ыде рж ив аю т 2 не де ли дляосаж де нияв змуч е нных ч аст иц . Раст в ор ме т иле нов ого сине го по Л е ффле ру: насыщ е нный спирт ов ый раст в ор ме т иле нов ого сине го 30 мл, дист иллиров анная в ода 100 мл, 1 % в одный раст в ор К О Н – 1 мл. 0,5 % раст в ор не йт рального красного.

27

П ригот ов ле ние прот рав ы: сме шив аю т 2 объ е ма 12 % в одного раст в ора алю миние в ых кв асц ов с 1 объ е мом 10 % в одного раст в ора т аннина, нагре в аю т 30 мин - при 120о. П ри эт ом образуе т ся компле ксное сое дине ние , актив но осаж даю щ е е ся на ж гут иках. Сме сь фильт рую т в горяч е м в иде , а зат е м хранят в холодильнике. Раст в ор для окраски ж гут иков : 20 % раст в ор крист аллв иоле т а на абсолю т ном спирт у, кот орый пе ре д упот ре бле ние м разв одят абсолю т ным спирт ом – 1/200; 1/100; 1/50. Работа 8. О к раск а спор и запасны х вк лю чений в к летк ах бак терий Прот оплас т – эт о ц ит оплазма со в се ми кле т оч ными ст руктурами и в клю ч е ниями. Ц ит оплазма – основ ное соде рж имое кле т ки; пов е рхност ный слой е е – ц ит оплазмат ич е ская ме мбрана – играе т роль осмот ич е ского барье ра. В ц ит оплазме различ аю т нукле оид или диффузное ядро, рибосомы, ме зосомы, хромат офоры, аэросомы и др. У не кот орых бакте рий в ц ит оплазме присут ст в ую т споры и запасные в клю ч е ния. Споры – эт о образов ания, присущ ие лишь палоч ков идным формам бакте рий, – бац иллам (сре ди кокков ых форм какисклю ч е ние споры име ю т Sporosarcina). Рассмот ре т ь споры мож но при наблю де нии бакте рий в ж ив ом сост оянии: благодаря сильному луч е пре ломле нию споры в полне различ имы. Боле е от ч е т лив о их мож но в иде т ь при использов ании спе ц иальных ме т одов окраски. Дов ольно прост ым в исполне нии яв ляе т ся способ окраски, пре длож е нный П е шков ым М .А.: пригот ав лив аю т мазок иссле дуе мой культ уры (наприме р, се нной палоч ки) и фиксирую т е го на пламе ни спирт ов ки. Зат е м на фиксиров анный мазок налив аю т ме т иле нов ую синь Л е ффле ра и дов одят е е до кипе ния, де рж а пре парат над пламе не м горе лки. К ипят ят 15-20 се к! П осле охлаж де ниясмыв аю т в одой и докрашив аю т 30 се к. 0,5-проц е нт ным в одным раст в ором не йт рального красного; промыв аю т дист иллиров анной в одой, в ысушив аю т и микроскопирую т с имме рсие й. В е ге т ат ив ные кле т ки будут окраше ны в розов ый ц в е т , споры – в голубой или синий (в зав исимост и от в озраст а культ уры). Ц ит оплазм ат ичес кие вклю чения – эт о различ ные продукты обме на, появ ляю щ ие ся, какправ ило, в пе риод пре кращ е ния актив ного рост а или при не дост ат ке пит ания. У разных в идов микроорганизмов в клю ч е ния могут име т ь разное происхож де ние : органич е ские в е щ е ст в а (липиды, полисахариды, поли-β-оксимасляная кислот а) и мине ральные (се ра, соли кальц ияи др.). Большинст в о органич е ских сое дине ний пре дст ав ляе т собой запасной фонд в е щ е ст в кле т ки. Г ликоген – ж ив от ный крахмал, соде рж ит ся поч т и в се гда в кле т ках дрож ж е й, се нной палоч ки и не кот орых других в идов бакте рий. Ре актив ом

28

на гликоге н служ ит раст в ор Л ю голя, окрашив аю щ ий е го в красно-бурый ц ве т . Г ранулеза– крахмалоподобное в е щ е ст в о, накаплив аю щ е е сяв кле т ках не кот орых бакте рий в кач е ст в е в клю ч е ний пе ре д спорообразов ание м (наприме р, в кле т ках маслянокислых бакте рий – Clostridium pasteurianum). О бнаруж ив аю т грануле зу т акж е раст в ором Л ю голя. Грануле за окрашив ае т ся йодом в т е мно-синий ц в е т . О краску в е дут т ак: к капле суспе нзии иссле дуе мой культ уры добав ляю т каплю раст в ора Л ю голя и микроскопирую т . В олю т ин – компле ксное запасное в е щ е ст в о, соде рж ащ е е в основ ном полифосфат ы и, кроме т ого, РНК , магний, бе лки, липиды. О бнаруж ив ае т ся при окрашив ании ме т иле нов ой синью : зе рна в олю т ина приобре т аю т фиоле т ов о-красный ц в е т . Х орошими объ е ктами для иссле дов ания яв ляю т сяазот обакте р, молоч нокислые бакте рии (палоч ки), дрож ж и. П орядок работы : 1. М азок иссле дуе мой культ уры на пре дме т ном ст е кле фиксирую т нагре в ание м. 2. О крашив аю т мазок в т е ч е ние 10-30оС в раст в оре ме т иле нов ого сине го по Л е ффле ру или в 1 %-ном (в е с/объ е м) т олуидинов ом сине м. 3. О т мыв аю т красит е ль в одопров одной в одой, подсушив аю т и микроскопирую т . П ри окраске ме т иле нов ым синим гранулы полифосфат а в ыглядят шариками, име ю щ ими ц в е т от сине го до фиоле т ов ого, а в ся ост альная ц ит оплазма окрашив ае т ся в св е т ло-голубой ц в е т . П ри окрашив ании т олуидинов ым синим гранулы име ю т красный ц в е т на фоне голубой ц ит оплазмы. Поли-β-окс им ас ляная кис лот а– запасное в клю ч е ние . П орядок работы : 1. Ф иксиров анный нагре в ание м мазок культ уры на пре дме т ном ст е кле погруж аю т в раст в ор 0,3 % (в е с/объ е м) судана ч е рного В , пригот ов ле нного на эт иле нгликоле . О крашив аю т в т е ч е ние 5-15 минут . 2. К расит е ль слив аю т и пре парат в ысушив аю т на в оздухе , полож ив ст е кло на фильт ров альную бумагу. 3. Не сколько раз погруж аю т и промыв аю т пре дме т ное ст е кло в ксилоле , а зат е м подсушив аю т в пит ыв аю щ им ксилол мат е риалом. 4. Дополнит е льно окрашив аю т пре парат в т е ч е ние 5-10 мин. 0,5 % (в е с/объ е м) в одным сафранином. 5. П ромыв аю т пре дме т ное ст е кло в одопров одной в одой, подсушив аю т и микроскопирую т . В клю ч е ния поли-βоксимасляной кислот ы в ыглядят как ч е рно-синие капе льки, в т о в ре мякакц ит оплазма окраше на в розов ый ц в е т .

29

Задание : 1. П ригот ов ит ь окраше нный по ме т оду П е шков а пре парат ст арой культ уры се нной палоч ки, рассмот ре т ь споры, зарисов ат ь. 2. П ров е ст и окрашив ание запасных в е щ е ст в в кле т ках: грануле зы, в олю т ина, поли-β-оксимасляной кислот ы. 3. Рассмот ре т ь и зарисов ат ь запасные в е щ е ст в а бакте рий (грануле зу, в олю т ин, поли-β-оксимасляную кислот у). М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, салфе т ка, ст е кла пре дме т ные обе зж ире нные , ст е кла покров ные , в ода, фильт ров альная бумага, микробиологич е ская пе т ля, бю кс с де нат урат ом, склянка с де зинфиц ирую щ им раст в ором, в анноч ка с мост иком, спирт ов ка, спич ки. Раст в ор судана ч е рного «В » – 0,3 % раст в ор в эт иле нгликоле . К силол. Раст в ор ме т иле нов ого сине го по Л е фле ру, 1 % раст в ор т олуидинов ого сине го, раст в ор Л ю голя, 0,5 % в одный раст в ор не йт рального красного.

30

ТЕ М А 4. К У Л Ь ТИВ ИРО В АНИЕ М ИК РО О РГАНИЗМ О В Работа 9. П риготовлениепитательны х сред. Стерилизация 1. Т реб ования, предъявляем ые к пит ат ельным с редам В микробиологич е ской практике для в ыращ ив ания микроорганизмов с ц е лью их изуч е ния пользую т ся пит ат е льными сре дами. П ит ат е льная сре да – эт о субст рат , соде рж ащ ий не обходимые для пит ания микробов в е щ е ст в а, а т акж е сре да их обит ания. П оэт ому при подборе пит ат е льных сре д не обходимо уч ит ыв ат ь какт ре бов аниямикроорганизмов в от ноше нии в е щ е ст в , т аки их в озмож ност ь осущ е ст в лят ь в данных услов иях обме н ме ж ду кле т кой и сре дой. П ит ат е льные сре ды, приме няе мые для культ ив иров ания микроорганизмов , долж ны от в е ч ат ь сле дую щ им основ ным т ре бов аниям: 1. У дов ле т в орят ь пот ре бност ь микроорганизмов в угле роде , азот е , зольных эле ме нт ах, а длямногих микробов – в различ ных дополнит е льных в е щ е ст в ах т ипа в ит аминов , аминокислот и других факторах рост а. 2. Сре да долж на быт ь ст е рильной, т .е . ч ист ой, не соде рж ащ е й никаких микробов (кроме эле ктив ной сре ды, описание кот орой прив одит ся ниж е ). 3. М ногие сре ды (бульоны, агаров ые , ж е лат инов ые ) долж ны быт ь прозрач ными, ч т обы ле гч е было изуч ат ь характе р рост а микробов и наблю дат ь за физич е скими изме не ниями, происходящ ими в сре де в ре зульт ат е их ж изне де ят е льност и. 4. К аксре да обит анияпит ат е льный субст рат долж е н опт имально соот в е т ст в ов ат ь пот ре бност ям микроорганизмов в т аких факторах, как в лаж ност ь, аэрац ия, кислот ност ь (рН), окислит е льно-в осст анов ит е льный пот е нц иал, осмот ич е ское дав ле ние и т .д. Различ ные микроорганизмы использую т в кач е ст в е пит ат е льных в е щ е ст в самые разнообразные сое дине ния угле рода, азот а, фосфора и др. эле ме нт ов , прич е м ч аст о сое дине ния, не обходимые для сущ е ст в ов ания одних, сов е рше нно не пригодны для других микробов . О т ноше ние микробов к пе ре ч исле нным в ыше факторам т ож е не одинаков о. Сле дов ат е льно, не мож е т быт ь унив е рсальной пит ат е льной сре ды, одинаков о удов ле т в оряю щ е й пот ре бност и в се х микроорганизмов . П оэт ому при культ ив иров ании микробов гот ов ят пит ат е льные сре ды, соот в е т ст в ую щ ие опре де ле нной физиологич е ской группе или в зав исимост и от пост ав ле нной ц е ли иссле дов ания. 2. Т ипы пит ат ельных с ред Для культ ив иров ания микроорганизмов приме няю т ся разнообразные пит ат е льные сре ды. П о физич е скому сост оянию они могут быт ь ж идкими,

31

плот ными и сыпуч ими. Ж идкие сре ды – эт о от в ары, наст ои, бульоны, соки, приме няе мые для накопле ния биомассы микроорганизмов . П лот ные пит ат е льные сре ды получ аю т ся пут е м прибав ле ния к пит ат е льному субст рат у ж е лат ина или агар-агара. Ж е лат ин – бе лок, получ ае мый пут е м в ыв арки кост е й и хрящ е й, кпит ат е льной сре де ж е лат ин прибав ляю т в колич е ст в е 10-12 %. Ж е лат инов ые плот ные сре ды име ю т т от не дост ат ок, ч т о плав ят ся при дов ольно низкой т е мпе рат уре (24оС), т е мпе рат ура заст ыв анияих 20оС. В эт ом от ноше нии агаров ые сре ды име ю т пре имущ е ст в а. Те мпе рат ура плав ле ния их – около 100оС, а заст ыв ания – около 40оС. Агаров ые плот ные пит ат е льные сре ды получ аю т пут е м добав ле ния кж идкой сре де агар-агара в колич е ст в е 1,5-2 %. Агар-агар – полисахарид, добыв ае мый изне кот орых морских в одоросле й. В микробиологич е ской промышле нност и ч аст о приме няю т сыпуч ие сре ды: от руби, разв аре нное пше но, пропит анное пит ат е льным раст в ором. П о сост ав у в ыде ляю т сре ды нат уральные , полусинт е т ич е ские и синт е т ич е ские . Нат уральные пит ат е льные сре ды пригот ав лив аю т из е ст е ст в е нных продуктов раст ит е льного или ж ив от ного происхож де ния (молоко, яйц а, ов ощ и, фрукты и их от в ары, а т акж е от в ары и наст ои дрож ж е й, поч в ы, мяса, рыбы и др.). П олусинт е т ич е ские пит ат е льные сре ды сост ав ляю т ся из разных в е щ е ст в . О ни могут соде рж ат ь опре де ле нные химич е ские в е щ е ст в а в комбинац ии их с природными продуктами. К ним, наприме р, от носят ся ч ащ е в се го используе мые в лаборат орной практике мясо-пе пт онный бульон (М П Б), мясо-пе пт онный ж е лат ин (М П Ж ), мясо-пе пт онный агар (М П А), бобов о-пе пт онный агар (БП А), рыбо-пе пт онный агар (РП А) и др. О снов ой дляих пригот ов ле нияслуж ит мяснаяв ода: 500 гфарша залив аю т 1 л в оды и ост ав ляю т для экст ракц ии при т е мпе рат уре 37-39оС на 2 ч аса, при t = 30o – на 6 ч асов . Зат е м мясо от ж имаю т ч е ре змарлю и фильт рат и кипят ят в т е ч е ние 5 мин., фильт рую т ч е ре з в ат ный фильт р, долив аю т в одой до 1 л и добав ляю т пе пт он, NaCl. М яс о-пепт онный б ульон (М ПБ ) М ясной бульон – 1 л П е пт он – 10 г; NaCl – 5 г Сода или е дкий нат рий до слабощ е лоч ной ре акц ии по лакмусу (рН от 7 до 8,5). П орядок пригот ов ле ния: мясной бульон от ме ряю т в пот ре бном колич е ст в е и в каст рю ле (колбе ) ст ав ят на эле ктроплит ку. Для усиле ния азот ного пит анияв носят пе пт он (сме сь полипе пт идов – продукт не полного разлож е ния бе лка). С ц е лью пов ыше ния осмот ич е ского дав ле ния раст в ора добав ляю т пов аре нную соль. П ит ат е льную сре ду разв арив аю т до т е х пор (при пост оянном поме шив ании), пока полност ью не исч е знут плот ные ч аст ич ки пе пт она и ж идкост ь ст ане т однородной. Зат е м охлаж даю т и уст анав лив аю т слабощ е лоч ную ре акц ию сре ду: к20 мл сре ды добав ляю т из бю ре т ки 10 % раст в ор NaHCO3 или NaOH (пров е рят ь по лакмусу рН

32

сре ды). Зная колич е ст в о щ е лоч ного раст в ора, поше дше го на подщ е лач ив ание 20 мл сре ды, опре де ляю т пот ре бное колич е ст в о щ е лоч и для подщ е лач ив ания ост ав ше йся сре ды. П осле уст анов ле ния рН сре ды М П Б кипят ят в т е ч е ние получ аса. О бъ е м ост ыв ше го М П Б дов одят зат е м до 1 л и фильт рую т ч е ре збумаж ный фильт р. Е сли бульон получ илсямут ным, т о бе лок от одного яйц а сме шив аю т с 40 мл в оды, в збив аю т и пе ре ме шив аю т с т е плым бульоном. Нагре в аю т М П Б в ав т оклав е (3/4 ат м. 20 мин.). О се даю щ ий бе лок ув ле кае т за собой мут ь, кот орую зат е м от де ляю т на бумаж ном фильт ре . Горяч ую пит ат е льную сре ду разлив аю т ч е ре з в оронку с помощ ью химич е ского ст акана по пробиркам, сле дя при эт ом за т е м, ч т обы не облит ь края и наруж ную пов е рхност ь пробирки. П робирки со сре дой закрыв аю т в ат ными пробками и ст е рилизую т в ав т оклав е в т е ч е ние 30 минут при 1 ат м. М ясной бульон - 1 л П е пт он - 5-10 г NaCl -5 г Агар-агара - 20-40 гр сода до слабощ е лоч ной ре акц ии П орядок пригот ов ле ния т от ж е , ч т о и для М П Б, т олько в ме ст е с пе пт оном добав ляю т е щ е агар-агар, пре дв арит е льно изме льч е нный нож ниц ами. М ПЖ М ясной бульон - 1 л П е пт он - 5-10 г NaCl -5г Ж е лат ин - 100-150 г Сода до слабощ е лоч ной ре акц ии К мясо-пе пт онному бульону прибав ляю т ж е лат ин, даю т е му набухнут ь (20-30 мин) и нагре в аю т до раст в оре ния (при пост оянном поме шив ании). В носят зат е м пов аре нную соль, соду. П о охлаж де нии до 50оС кМ П Ж прибав ляю т в збит ый бе локи нагре в аю т на в одяной бане 30 минут . Горяч ую сре ду фильт рую т ч е ре з бумаж ный фильт р, разлив аю т и ст е рилизую т в ав т оклав е 15 мин. Б ПА Бобов ый бульон - 1 л П е пт он - 10 г Сахароза – 20 г NaCl - 5г Агар-агар – 15 г Сода до слабощ е лоч ной ре акц ии П орядокпригот ов ле ния т от ж е , ч т о и дляМ П А, лишь в ме ст о мясного пригот ов ляе т ся бобов ый бульон. Се ме на бобов ых раст е ний – гороха, фасоли, бобов (луч ше бе лой фасоли) – залив аю т ч е т ыре хкрат ным колич е ст в ом в оды и в арят в т е ч е ние 1 ч аса. В слит ую в ыт яж ку в носят указанные добав ки. П ригот ов ле ние бобов ого и мясного бульонов – М ПА

33

опе рац ия дов ольно длит е льная, поэт ому осущ е ст в ляе т ся заране е лаборант ом. В наст оящ е е в ре мя ч ащ е использую т гот ов ый рыбо-пе пт онный агар (РП А ). Для культ ив иров ания поч в е нных микроорганизмов использую т сре ды, пригот ов ле нные на основ е в ыт яж ки из анализируе мой поч в ы. В кач е ст в е уплот нит е лядобав ляю т агар-агар или кре мне зе м SiO2. П ит ат е льные сре ды гот ов ят обыч но на в одопров одной в оде ; дист иллиров анной в одой пользую т ся лишь при спе ц иальных иссле дов аниях, когда приме няю т ст рогие синт е т ич е ские сре ды. Синт е т ич е ские сре ды – сре ды ст рого опре де ле нного сост ав а, пригот ов ле нные из химич е ских в е щ е ст в . К ним иногда прибав ляю т нич т ож ные колич е ст в а в ит аминов , факторов рост а или в ыт яж ки из природных продуктов для луч ше го разв ит ия микроорганизмов . Так, для в ыращ ив ания бакте рий поч в ы и в оды пользую т ся, наприме р, сре дой М е йе ра. Е е сост ав : глю коза – 1,0 г; в иннокислый аммоний – 1,0 г; KNO3 – 0,5 г; NaCO – 0,5 г; K2HPO4 – 1,0 г; CaCl2 – 0,1 г; MgSO4.7H2O – 0,3 г; NaCl – 0,1 г; FeCl3 – 0,01 г; агар-агар – 12,5 г; в ода – 1000 мл. П о назнач е нию различ аю т эле ктив ные и диф ф еренциальнодиагнос т ичес кие с реды. В практике микробиологич е ских иссле дов аний ч аст о пользую т ся эле ктив ными (накопит е льными) сре дами, пре длож е нными в пе рв ые С.Н.В иноградским. Э т и сре ды пригодны для в ыращ ив ания одного или группы родст в е нных микроорганизмов и мало пригодны или сов се м не пригодны дляразв ит иядругих. Э ле ктив ные сре ды приме няю т ся глав ным образом для в ыде ле ния микроорганизмов из ме ст их е ст е ст в е нного обит ания, где име е т ся много пост оронних форм. В кач е ст в е приме ра мож но прив е ст и прие м в ыращ ив ания се нной палоч ки в эле ктив ной сре де . Се нная палоч ка (Bacillus subtilis) – аэробный, спорообразую щ ий в ид бакте рий. Ч т обы добит ься пре имущ е ст в е нного разв ит ияв се нном наст ое , где име е т сямасса разнообразных микроорганизмов , име нно се нной палоч ки, не обходимо создат ь услов ия, наиболе е полно удов ле т в оряю щ ие в се пот ре бност и данного в ида микроорганизма: 1) обе спе ч ит ь хорошую аэрац ию сре ды; 2) удалит ь пут е м кипяч е ния микроорганизмы, не образую щ ие спор; 3) снабдит ь культ уру не обходимыми пит ат е льными в е щ е ст в ами; 4) создат ь опт имальную для рост а и разв ит ия се нной палоч ки т е мпе рат уру (25-30оС). П орядокработ ы по в ыращ ив анию се нной палоч ки в эле ктив ной сре де : на т е хнич е ских в е сах от в е шив аю т 10-25 г се на, изме льч аю т е го нож ниц ами и поме щ аю т в колбу, залив аю т в одопров одной в одой (200 мл), добав ляю т щ е пот ку ме ла для не йт рализац ии сре ды и кипят ят в т е ч е ние 30 минут . П ри кипяч е нии в раст в ор пе ре ходят пит ат е льные в е щ е ст в а и от мираю т не споров ые микробы и знач ит е льная ч аст ь споров ых; споры ж е се нной палоч ки в ыде рж ив аю т кипяч е ние на прот яж е нии дв ух ч асов . П олуч е нный от в ар налив аю т в колбу слое м не т олщ е 1-2 см (для больше го снабж е ния кислородом), закрыв аю т колбу в ат ной пробкой и поме щ аю т в т е рмост ат для инкубац ии. Ч е ре з

34

не де лю мож но обнаруж ит ь не т олько подв иж ные формы се нной палоч ки, но и кле т ки со спорами и от де льные споры. Д иф ф еренциально диагнос т ичес кие с реды – эт о т акие сре ды, кот орые позв оляю т по в озмож ност и быст ро от лич ит ь (диффе ре нц иров ат ь) в иды микроорганизмов . В т акие сре ды ч аст о в в одят ся красит е лииндикат оры, окрашив аю щ ие колонии микроорганизмов в опре де ле нный ц ве т . 3. Ст ерилизация Ст ерилизацией назыв ае т ся полное унич т ож е ние в мат е риалах, посуде и на инст руме нт ах в се х микробов и их спор. Ч ащ е в се го приме няе т ся ст е рилизац ия нагре в ание м. Сущ е ст в уе т не сколько ме т одов ст е рилизац ии. Наиболе е прост ой прие м ст е рилизац ии – прокалив ание на пламе ни спирт ов ки. Э т им прие мом пользую т ся для ст е рилизац ии игл, пе т е ль, пре дме т ных ст е кол и ме лких ме т аллич е ских инст руме нт ов . Ст е рилизац ия боле е крупных пре дме т ов и ст е клянной посуды (ч аше к П е т ри, пробирок, пипе т ок и пр.) произв одит ся СУ Х ИМ Ж АРО М в сушильных шкафах различ ных т ипов (объ яснит ь уст ройст в о име ю щ е госяв лаборат ории сушильного шкафа с эле ктрообогре в ом). П е ре д поме щ е ние м посуды в сушильный шкаф для ст е рилизац ии ч ашки П е т ри и пипе т ки оборач ив аю т ся бумагой, пробирки и колбы закрыв аю т ся в ат ными пробками. Ст е рилизац ия произв одит ся в т е ч е ние дв ух ч асов при т е мпе рат уре 160-170оС. Для ст е рилизац ии пит ат е льных сре д, в оды, ре зинов ых т рубоки др. пре дме т ов , порт ящ ихся от сухого ж ара, приме няе т ся НАГРЕ ТЫ Й П АР. Ст е рилизац ия произв одит ся или т е куч им паром в кипят ильнике К оха, или насыщ е нным паром под дав ле ние м в ав т оклав е (объ яснит ь уст ройст в о эт их приборов ). В кипят ильнике К оха пров одит сядробнаяст е рилизац ия: в т е ч е ние т ре х дне й подряд по 30-45 минут е ж е дне в но. Дробная ст е рилизац ия пров одит ся с ц е лью боле е полного унич т ож е ния микробов в ст е рилизуе мом мат е риале . Наиболе е наде ж ный способ – ст е рилизац ия насыщ е нным паром под дав ле ние м в ав т оклав е . Для большинст в а сре д ст е рилизац ии в т е ч е ние 2030 минут при одной ат мосфе ре сч ит ае т сяв полне наде ж ной. Пас т еризация – один изме т одов т е рмич е ской ч аст ич ной ст е рилизац ии при от носит е льно не в ысоких т е мпе рат урах приме няе т ся для ж идких сре д, не в ыде рж ив аю щ их большого нагре в а. М е т од был пре длож е н Л .П аст е ром, от сю да е го назв ание . П аст е ризац ия основ ана на т ом, ч т о большинст в о бе сспоров ых микробов погибае т при т е мпе рат уре 60-70оС за 15-30 минут , а при нагре в ании до 70-80оС – за 5-10 минут ; при эт ом спороносные формы сохраняю т ся. Данный ме т од широко используе т ся для от де ле ния спороносных и бе сспоров ых бакте рий в лаборат орной практике, а т акж е в практике молоч ного произв одст в а.

35

П ри паст е ризац ии пробирки с ж идкими сре дами поме щ аю т в в одяную баню . В конт рольную пробирку с в одой погруж аю т т е рмоме т р и от сч е т в ре ме ни в е дут с моме нт а, когда т е рмоме т р покаж е т нуж ную т е мпе рат уру. Е сли эт у опе рац ию произв одят не сколько раз с большими инт е рв алами в ре ме ни (до сут ок), в т е ч е ние кот орого споры успе ю т прораст и, т о дост игае т ся полная ст е рильност ь сре ды. Такой прие м ст е рилизац ии назыв ае т сят индализацией . М ет оды х олодной с т ерилизации приме няю т ся для т е х пит ат е льных сре д, кот орые соде рж ат в св ое м сост ав е ле гко разлагаю щ ие ся в е щ е ст в а и не в ыде рж ив аю т нагре в ания даж е 100оС (сыв орот ки, ант ибиот ики, бе лков ые сре ды и т .п.). Такие сре ды ст е рилизую т сле дую щ ими способами: а) фильт ров ание м; б) с помощ ью ант ибиот иков . Ст е рилизац ия фильт ров ание м основ ана на т ом, ч т о малые поры фильт ра пропускаю т сре ду (раст в ор), но не пропускаю т микроорганизмов . В кач е ст в е фильт ров служ ат ме лкопорист ые пе ре городки, асбе ст ов ые и фарфоров ые фильт ры, а т акж е особые бакте риальные св е ч и, изгот ов ле нные из глины, фарфора (фильт ры Ш аме рляна). Ш ирокое распрост ране ние получ или в после дне е в ре мя фильт ры Зе йт ц а с асбе ст ов ой пласт инкой. Разлив ку сре д после т акой ст е рилизац ии произв одят в ст е рильных услов иях (в боксе ) в заране е прост е рилизов анную посуду. Добав ле ние ант ибиот иков приме няе т ся в т е х случ аях, когда ж е лаю т осв ободит ься от одних групп микроорганизмов при сохране нии других и для уме ньше ния обсе ме не нност и мат е риала. С эт ой ц е лью к сре де с посе в ным мат е риалом прибав ляю т раст в оре нный ант ибиот ик; т аким образом создае т сяэле ктив наясре да. К онт роль ст е рильност и сре д (при лю бом способе ст е рилизац ии, кроме после дне го) осущ е ст в ляе т сят ак: разлит ые сре ды ост ав ляю т на 3-4 дняпри 25-27оС. В случ ае , е сли в них разов ью т ся какие -либо микроорганизмы, сре ду гот ов ят и ст е рилизую т занов о.

1. 2. 3.

4.

Задание : Налит ь в 2 пробирки по 9 мл в одопров одной в оды. Налит ь в 2 колбы по 99 мл в одопров одной в оды. П ригот ов ит ь сле дую щ ие пит ат е льные сре ды: а) РП Б (7 пробирокпо 20 мл); б) РП А (7 пробирокпо 2/3 и 7 пробирокна 1/3 объ е ма); в ) РП Ж (7 пробирок на ½ объ е ма); г) сре да Гисса (7 пробирок); д) сре да с крахмалом (7 пробирок). П ригот ов ле нные сре ды и в оду прост е рилизов ат ь. М ат е риалы и оборудов ание

На одну бригаду: 7 пробирок, 2 колбы на 100 мл, в ат ные пробки, марля, нит ки, нож ниц ы, лине йка, ме рный ц илиндр на 100 мл, ме рные пипе т ки на 1 мл, ст акан с в одой. К олбы дляпригот ов ле ниясре д (0,75 л) –

36

4, ме рный ц илиндр на 500 мл, в е сы, разнов е сы, калька, шпат е ль. Бобов ый от в ар (800 мл) или РП Б (рыбо-пе пт онный бульон), агар-агар, пе пт он, ж е лат ин, NaCl, сода или раст в ор NaOH, глю коза, в иннокислый аммоний, KNO3, Na2CO3, K2HPO4, CaCl2, MgSO4.7H2O, NaCl, FeCl3, индикат орная бумага, ст е клянная палоч ка, яйц о, сахароза, ч ашка П е т ри, фильт ров альная бумага. Работа 10. О птим изация м ик робиологическ их процессов и ф ерм ентационны х процессов в пром ы ш ленности М икробиологич е ским пут е м получ аю т продукты т ре х т ипов : 1) кле т оч ную массу; 2) пе рв ич ные продукты; 3) в т орич ные продукты. Для ре нт абе льност и биот е хнологич е ского произв одст в а не обходимо осущ е ст в лят ь опт имизац ию проц е сса: долж на быт ь в ысокая продуктив ност ь; полная конв е рсия субст рат а в ц е ле в ой продукт; хорошая в оспроизв одимост ь проц е сса. Для т ого, ч т обы осущ е ст в лят ь ре нт абе льное биот е хнологич е ское произв одст в о, не обходимо изуч ит ь динамику рост а культ уры, а т акж е динамику биосинт е за продукта и пот ре бле ния субст рат а; не обходимо опре де лит ь рост лимит ирую щ ий фактор, а т акж е не обходимо подобрат ь синт е т ич е скую сре ду, глав ные компоне нт ы кот орой долж ны быт ь дост упные и не дорогие . 10-60 % ст оимост и продукта фе рме нт ац ии св язаны со ст оимост ью компоне нт ов сре ды и пре ж де в се го со ст оимост ью ист оч ника угле рода. Ч ащ е в се го использую т злаков ый крахмал, ц е ллю лозу, де кст розу, раст ит е льное масло, ме т анол, н-парафины, лактозу. Е сли ст оимост ь оч ист ки фе рме нт ац ионного продукта в е лика, т о в ыгодне е использов ат ь боле е дорогие , но боле е ч ист ые субст рат ы: ме т анол, эт анол или уксусную кислот у. Ф е рме нт ац ию мож е т сильно удорож ит ь ист оч ник азот а. Сч ит аю т , ч т о компле ксные азот ист ые в е щ е ст в а в ыгодне е использов ат ь, ч е м аммоний или е го соли. Э т ап опт имизац ии микробиологич е ского проц е сса – эт о подбор способа культ ив иров ания. О пт имизац ия проц е сса иногда св язана с использов ание м сме шанных культ ур. Наприме р: е сли использую т ц е ллю лозосоде рж ащ е е сырье , т о луч ше использов ат ь сме шанные культ уры. О дни из них ут илизирую т ц е ллю лозу, другие – ге миц е ллю лозу, т ре т ьи – лигнин. В ре зульт ат е происходит полное пот ре бле ние сырья. Использов ание сме шанных культ ур позв оляе т уде ше в ит ь сре ду. П ри использов ании ч ист ых субст рат ов не кот орые микроорганизмы т ре бую т рост ов ых факторов (в ит амины). Но эт о оч е нь удорож ае т произв одст в о. В сме шанной культ уре продуц е нт ы рост ов ых факторов обе спе ч ив аю т нуж даю щ ие ся в них организмы. В промышле нной микробиологии полный проц е сс получ е ния ц е ле в ого продукта подразде ляе т ся на дв е глав ные фазы: фе рме нт ац ию и в ыде ле ние продукта. Ф е рме нт ац ия – эне ргодаю щ ий пут ь ме т аболизма (анаэробные услов ия), в эт ом смысле фе рме нт ац ияаналогич на брож е нию .

37

В промышле нност и эт от т е рмин используе т ся для обознач е ния лю бого проц е сса в ыращ ив ания микроорганизмов , не зав исимо, от аэробност и и анаэробност и. Э т о управ ляе мое культ ив иров ание . В микробиологич е ской промышле нност и различ аю т пе риодич е ское и прот оч ное культ ив иров ание . В периодическ ом процессе в инокулиров анную сре ду в т е ч е ние пе риода фе рме нт ац ии, кроме О 2 (в оздух), в е щ е ст в дляконт ролярН не в носит ся. Э т от проц е сс от носит ся к закрыт ым сист е мам. В проц е ссе культ ив иров ания наблю даю т 4 глав ные фазы рост а: лагфазу, лог-фазу, ст ац ионарную фазу и фазу от мирания. Л аг-ф аза– фаза адапт ац ии бакте рий куслов иям культ ив иров ания, е е мож е т не быт ь, е сли инокулят находит сяв лог-фазе . В лог-ф азе (логариф м ичес кая ф аза) скорост ь ув е лич е ния биомассы пропорц иональна е е колич е ст в у и в ре ме ни. В с т ационарной ф азе колич е ст в о биомассы пост е пе нно ув е лич ив ае т ся или не изме няе т ся в ов се , т о е ст ь колич е ст в о в нов ь образов ав шихся кле т ок и от мираю щ их одинаков о. В эт ой фазе ч аст о образую т сяпродукты, обладаю щ ие биот е хнологич е ской ц е нност ью . Фаза от м ирания характе ризуе т ся т е м, ч т о какие -либо компоне нт ы сре ды исч е рпыв аю т ся. В промышле нност и фе рме нт ац ию обыч но заканч ив аю т в конц е лог-фазы или пе ре д нач алом фазы от мирания. П е риодич е скаяфе рме нт ац иясв язана со сле дую щ ими пробле мами: 1) большие зат рат ы в ре ме ни, св язанные с загрузкой и разгрузкой биоре актора; 2) большие капит алов лож е ния из-за низкой продуктив ност и (ингибиров ание коне ч ным продуктом, исч е рпание м субст рат а); 3) в ариац ии в кач е ст в е продукц ии от фе рме нт ац ии кфе рме нт ац ии; 4) не обходимост ь от де ле ниямикроорганизмов в конц е фе рме нт ац ии; 5) длит е льност ь фе рме нт ац ии (иногда изме ряе т сяднями). Для пе риодич е ской фе рме нт ац ии в лаборат орных услов иях использую т аппарат АК -210. О н пре дназнач е н для обе спе ч е ния основ ных услов ий пров е де ния проц е сса культ ив иров ания не пат оге нных дрож ж е в ых и бакте риальных микроорганизмов , находящ ихся в ж идкой пит ат е льной сре де , в клю ч аяи ж идкие угле в одороды. Аппарат АК -210 мож е т приме нят ься для пров е де ния науч ных микробиологич е ских иссле дов аний в лаборат орных услов иях при изуч е нии в опросов биохимии и физиологии микроорганизмов , в иссле дов ании микробиологич е ской оч ист ки ст оч ных в од, в произв одст в е ме дпре парат ов , а т акж е в пищ е в ой и микробиологич е ской промышле нност и. Прот очный процес с долж е н работ ат ь с в ысокой скорост ью прогона, с подде рж ание м в ысокой плот ност и кле т оки удале ние м ингибирую щ их аге нт ов . П ров е де ние прот оч ной фе рме нт ац ии в ме ст о пе риодич е ской пониж ае т капит алов лож е ния и прив одит кув е лич е нию продуктив ност и. Различ аю т дв а глав ных т ипа прот оч ной фе рме нт ац ии, от носимых к

38

от крыт ым сист е мам: биоре акторы с гомоге нным пе ре ме шив ание м ж идкост и и биоре акторы полного в ыт е сне ния. Б иореакт оры с гом огенным перем еш иванием ж идкос т и. О ни могут работ ат ь какхе мост ат или какт урбидост ат . В хе мост ат е скорост ь пот ока ж идкост и уст анав лив ае т ся на опре де ле нном уров не , а скорост ь рост а культ уры проходит в соот в е т ст в ии со скорост ью пот ока. В сист е му т урбидост ат а в ходит св е т оч ув ст в ит е льное уст ройст в о, изме ряю щ е е поглощ е ние св е т а культ урой в культ ив ат оре ; эле ктрич е ский сигнал из эт ого уст ройст в а управ ляе т скорост ью пот ока. Таким образом, поглощ е ние св е т а культ урой конт ролируе т скорост ь пот ока ж идкост и, а скорост ь рост а культ уры уст анав лив ае т ся в соот в е т ст в ии со скорост ью пот ока. Б иореакт оры полного выт ес нения. П ри эт ом пит ат е льная сре да прот е кае т по т убулярному ре актору бе з пе ре ме шив ания; сост ав пит ат е льных в е щ е ст в , ч исло микроорганизмов , О 2 и продуктив ност ь различ аю т ся в разных ме ст ах. У в хода в ре актор в ме ст е с пит ат е льной сре дой пост оянно подаю т ся кле т ки. П о ходу т рубки культ ура “ст аре е т ”, субст рат исч е рпыв ае т ся, т .е . пов т оряю т ся в се фазы рост а, но не в о в ре ме ни, а в прост ранст в е . Задание : О знакомит ьсяс проц е ссом фе рме нт ац ии в лаборат орных услов иях.

39

ТЕ М А 5. Э К О Л О ГИЯ

М ИК РО О РГАНИЗМ О В

Работа 11. М ик робиологическ ий анализ почвы П оч в а – наиболе е благоприят ная сре да для разв ит ия микроорганизмов . Э т ому способст в уе т налич ие пит ат е льных в е щ е ст в , в лаги, защ ищ е нност ь от солне ч ного св е т а. В 1 гпоч в ы мож е т соде рж ат ься от не скольких миллионов до де сят ков миллиардов микробов . Сущ е ст в ую т различ ные ме т оды уч е т а микроорганизмов . О снов ными яв ляю т ся: 1. М е т од прямого сч е т а кле т ок микроорганизмов под микроскопом: а) уч е т микробов в каме ре Гаряе в а; б) уч е т бакте рий по ме т оду В иноградского - Ш ульгиной. 2. У ч е т микробов пут е м культ ив иров ания. 3. У ч е т бакте рий с помощ ью эле ктронного микроскопа. В се эт и ме т оды име ю т св ои пре имущ е ст в а и не дост ат ки и даю т от носит е льные ре зульт ат ы. Так, ме т одом прямого сч е т а получ аю т зав ыше нные ре зульт ат ы в св язи с т е м, т о просч ит ыв аю т ся ж ив ые и ме рт в ые кле т ки, разгранич ит ь их мож но лишь с помощ ью лю мине сц е нт ной микроскопии. Е щ е боле е в ысокие ц ифры получ аю т с помощ ью эле ктронного микроскопа, кот орый позв оляе т просч ит ат ь объ е кты, не в идимые в св е т ов ой микроскопии. Ч исло ж ив ых кле т ок в субст рат е мож но опре де лит ь посе в ом на плот ную пит ат е льную сре ду в ч ашки П е т ри. На 3-й де нь пров одят подсч е т в ыросших колоний. П ри эт ом исходят из т ого, ч т о каж дая колония образов алась в ре зульт ат е размнож е ния одной кле т ки. Данные , получ е нные эт им способом, оказыв аю т ся ч ащ е в се го заниж е нными, поскольку унив е рсальной сре ды, благоприят ной для разв ит ия в се х бакте рий, находящ ихся в посе в ном мат е риале , не т . В св язи с эт им микроорганизмы узкоспе ц иализиров анные (наприме р, кле т ч ат ков ые , нит рифиц ирую щ ие бакте рии) не будут раст и на эмпирич е ских сре дах (М П Б, М П А, РП Б, РП А). Не смот ря на от ме ч е нный не дост ат ок, после дний ме т од широко приме няе т ся для срав нит е льного опре де ле ния колич е ст в а микроорганизмов в е ст е ст в е нных субст рат ах, в ч аст ност и, в поч в е . Для микробиологич е ского анализа иссле дуе мого уч аст ка бе рут сре дню ю пробу поч в ы (по диагонали уч аст ка в 4-5 т оч ках) в е сом не ме не е 1 кг. О т бор проб пров одят ст е рильным буром, лопат ой или нож ом в ст е рильные полиэт иле нов ые ме шки или ст е клянные банки с корков ыми пробками. Анализне обходимо пров одит ь в де нь в зят ия пробы. Х ране ние , даж е не продолж ит е льное , мож е т прив е ст и кизме не ниям в колич е ст в е нном и кач е ст в е нном сост ав е микроорганизмов . В случ ае ост рой не обходимост и хранит ь образц ы мож но не продолж ит е льное в ре мя в холодильнике при +4 +5оС. П аралле льно с микробиологич е ским анализом пров одят опре де ле ние соде рж анияв оды в пробе , т аккакконе ч ный ре зульт ат рассч ит ыв аю т на 1 г абсолю т но сухой поч в ы.

40

У чет б акт ерий по м ет оду С.Н .В иноградс кого в м одиф икации О .Г .Ш ульгиной П орядок работы . Гот ов ят поч в е нную болт ушку в разв е де нии 1:10, для ч е го 5 г поч в ы в ысыпаю т в колбу с 45 мл ст е рильной в оды. Х орошо в збалт ыв аю т соде рж имое в т е ч е ние 5 мин. и даю т от ст оят ься 2-3 мин. Зат е м с помощ ью ст е рильной пипе т ки бе рут 0,01 мл в зв е си и распре де ляю т каплю рав номе рно на пре дме т ном ст е кле на площ ади 4 см 2 пре паров альной иглой. П лощ адь опре де ляе т ся по т рафаре т у. П осле просушив ания пре парат фиксирую т спирт ом 20 мин. и зат е м окрашив аю т карболов ым эрит розином 30 мин. Э рит розин хорошо окрашив ае т бакте рии и не окрашив ае т ч аст иц ы поч в ы. Ч е ре з 30 мин. красит е ль слив аю т , пре парат просушив аю т и рассмат рив аю т с имме рсионной сист е мой микроскопа. П одсч ит ыв аю т колич е ст в о бакте риальных кле т окв 5 полях зре ния микроскопа (при пров е де нии иссле дов аний в 50 полях зре ния) и бе рут сре дне е . Дале е рассч ит ыв аю т колич е ст в о микроорганизмов в 1 г поч в ы по формуле : А . S мм 2 . 50 мл А = ------------------------------, где S 1 . мм 2 . 0,01 мл . 5 г А – колич е ст в о бакте рий в 1 гпоч в ы, а – сре дне е колич е ст в о микроорганизмов в поле зре ниямикроскопа, S – площ адь мазка (400 мм 2), S1 – площ адь полязре ниямикроскопа, 0,01 мл – объ е м капли суспе нзии, в зят ой для мазка, 50 мл – общ ий объ е м суспе нзии, 5 г – нав е ска поч в ы. П лощ адь поля зре ния микроскопа опре де ляю т с помощ ью объ е кт-микроме т ра. П ри пе ре сч е т е не обходимо уч ит ыв ат ь в лаж ност ь иссле дуе мого образц а поч в ы. У чет м икроорганизм ов наплот ных пит ат ельных с редах П ри использов ании ме т ода агаров ых пласт инокдля колич е ст в е нного уч е т а микробов 1 г поч в ы разв одят ст е рильной в одой в 10000-100000 раз дляудобст в а подсч е т а разв ив шихсяколоний. П орядок работы : П ригот ов ле ние поч в е нной болт ушки при разв е де нии 1:10000. В зв е сив на ч асов ом ст е кле 1 г поч в ы на т е хнич е ских в е сах, в носят е е в колбу с 99 мл ст е рильной в оды и в збалт ыв аю т в т е ч е ние 3-5 минут , не смач ив аяв ат ной пробки. П осле от ст аив анияв т е ч е ние 2 мин. ст е рильной пипе т кой бе рут 1 мл поч в е нной болт ушки и пе ре носят в пробирку с 9 мл ст е рильной в оды (пробирка N 1), т акж е пе ре ме шив аю т 1 мин., даю т от ст оят ься 30 се к., после ч е го из пробирки N 1 бе рут 1 мл поч в е нной болт ушки и пе ре носят в пробирку N 2 с 9 мл ст е рильной в оды и т .д.

41

Схе ма разв е де нияв 10000 раз: 1 гпоч в ы + 99 мл в оды → 100 мл (разв е де ние 1:100) 1 мл + 9 мл в оды 10 мл (разв е де ние 1:1000) 1 мл + 9 мл в оды 10 мл (1:10000) 1 мл (в ч ашку П е т ри). В не кот орых случ аях заме няю т дв а после дних разв е де ния(по 9 мл) на одно в 99 мл Н2О (в колбе ). П олуч ив нуж ное разв е де ние (в 10000-100000 раз и боле е ), бе рут из эт ого после дне го разв е де ния 1 мл поч в е нной болт ушки и в носят в ст е рильную ч ашку П е т ри. Зат е м в т у ж е ч ашку П е т ри в ылив аю т ст е рильный расплав ле нный РП А, име ю щ ий т е мпе рат уру не в ыше 45оС, пре дв арит е льно пров е дя горлышко пробирки ч е ре з пламя спирт ов ки. О ст орож ным кругов ым в ращ е ние м ч ашки агар сразу ж е после е го в не се нияпе ре ме шив аю т с суспе нзие й. Э т от способ посе в а в ч ашки П е т ри под пит ат е льную сре ду назыв ае т ся глубинным. Ч ашки с заст ыв шим агаром пе ре в орач ив аю т в в е рх дном, ч т обы избе ж ат ь попадания на пов е рхност ь агара конде нсац ионной в оды с крышки, и поме щ аю т в т е рмост ат при 25оС, ч е ре з не сколько дне й подсч ит ыв аю т колич е ст в о в ыросших колоний и опре де ляю т , сколько микробов соде рж алось в 1 г иссле дуе мой поч в ы. Для эт ого ч исло в ыросших колоний умнож аю т на ст е пе нь разв е де ния, наприме р, на 10000. П рав ила пе ре се в а: 1. Длякаж дой опе рац ии приме няю т нов ую пипе т ку (ст е рильную ). 2. Бумаж ные пакет ы, в кот орые зав е рнут ы пипе т ки, в скрыв аю т у в е рхне го конц а, не дот рагив аясь руками или какими-либо пре дме т ами до ниж не й ч аст и пипе т ки. 3. П робирки с в одой от крыв аю т на минимальное в ре мя, не обходимое для т ого, ч т обы набрат ь или в не ст и нуж ное колич е ст в о ж идкост и, прич е м пробирку в эт от моме нт де рж ат не в е рт икально, а наклонно. 4. В ат ные пробки на ст ол не кладут , а де рж ат их за в е рхню ю ч аст ь пальц ами прав ой руки: пе ре д закрыв ание м пробирки пробку пров одят ч е ре з пламя спирт ов ки (е сли в ат а загорит ся, погасит ь е е , закрыв ая ладонью ). 5. Соде рж имое пробирки, закрыт ой в ат ной пробкой, пе ре ме шив аю т , не смач ив ая пробку; эт о дост игае т ся пут е м прост укив ания пробиркой по ладони руки. О ч е нь в аж ным моме нт ом работ ы по опре де ле нию ч исле нност и микроорганизмов в субст рат е яв ляе т ся уч е т в ыросших колоний. К олонии бакте рий подсч ит ыв аю т обыч но ч е ре з 3, колонии грибов и дрож ж е й – ч е ре з5-7, а колонии актиномиц е т ов – ч е ре з5-15 сут окинкубац ии. Работ у пров одят , не от крыв ая ч аше к П е т ри. Для эт ого ч ашки П е т ри просмат рив аю т в проходящ е м св е т е и просч ит анные колонии от ме ч аю т ч е рнилами или т ушью на наруж ной ст ороне дна ч ашки П е т ри.

42

М е лкот оч е ч ные колонии просч ит ыв аю т с помощ ью лупы. Для прав ильного уч е т а колич е ст в а бакте рий подсч е т колоний в е дут т олько на т аких ч ашках, где колич е ст в о колоний не ме не е 10 и не боле е 50-100, максимально 200 (е сли колонии ме лкие ). П ри боле е плот ном рост е колоний на ч ашке не обходимо пов т орит ь посе в , ув е лич ив ч исло разв е де ний. Е сли нов ый посе в пров е ст и не в озмож но, т о подсч ит ыв аю т колонии в се кторе , рав ном ¼ площ ади ч ашки, а ре зульт ат ы суммирую т . М ож но т акж е на дно ч ашки налож ит ь круж окфильт ров альной бумаги с в ыре занным радиально се ктором и, пе ре дв игая е го на ч ашке и де лая соот в е т ст в ую щ ие поме т ки на ст е кле , произв е ст и подсч е т колоний. Ч е м больше колоний в ч ашке, т е м ме ньше бе рут площ адь се ктора. Зат е м пров одят расч е т ы колич е ст в а микроорганизмов , соде рж ащ ихся в 1 г поч в ы. Задание : 1. П ров е ст и уч е т бакте рий в поч в е ме т одом В иноградского-Ш ульгиной. 2. П осе ят ь на РП А или БП А в ч ашки П е т ри бакте рии из поч в ы после разв е де ния. М ат е риалы и оборудов ание В е сы, разнов е сы, поч в а в ст аканч ике, шпат е ль, калька для в зв е шив ания, 2 колбы с 99 мл ст е рильной в одопров одной в оды (в оду пре дв арит е льно прокипят ит ь, от ст оят ь, слит ь), 2 пробирки с 9 мл ст е рильной в одопров одной в оды, 5 ст е рильных пипе т окна 1 мл, карандаш по ст е клу, пинц е т , спирт ов ка, спич ки, 1 пробирку с РП А (расплав ле нным), ст е кла пре дме т ные , колба с 45 мл ст е рильной в оды, ст е рильнаяпипе т ка на 1 мл градуиров анная, спирт , карболов ый эрит розин, промыв алка, имме рсионное масло, лине йка или полоски миллиме т ров ой бумаги (10 см). Работа 12. М ик робиологическ ий анализ воды В ода яв ляе т ся е ст е ст в е нной благоприят ной сре дой для разв ит ия микроорганизмов . Ч е м богач е в ода органич е скими в е щ е ст в ами, т е м больше е колич е ст в о микробов соде рж ит ся в не й. В в оду микробы попадаю т , глав ным образом, из поч в ы, с от бросами и в ыде ле ниями ч е лов е ка и ж ив от ных, а т акж е из в оздуха. В в оде в ст ре ч аю т ся самые разнообразные микроорганизмы, глав ным образом, сапрофит ы, в ст ре ч аю т сяи боле зне т в орные микробы. К олич е ст в е нный уч е т микробов в в оде помогае т судит ь о е е пригодност и к упот ре бле нию . Так, для опре де ле ния кач е ст в а в одопров одной в оды сущ е ст в уе т сле дую щ ий крит е рий: 1. В ода яв ляе т сяхороше й, е сли в 1 мл е е соде рж ит сяне боле е 100 микробов . 2. В ода допуст има купот ре бле нию , е сли она соде рж ит от 100 до 500 микробов .

43

3. Налич ие в 1 мл в оды св ыше 500 микробов де лае т в оду не пригодной к упот ре бле нию в не кипяч е ном в иде , и т акая в ода подле ж ит оч ист ке. Боле е загрязне нными яв ляю т сяот крыт ые в одое мы: ре ки, озе ра, пруды и т .д. Ст е пе нь загрязне нност и в одое мов органич е скими ост ат ками и налич ие в них микроорганизмов соот в е т ст в уе т опре де ле нным зонам сапробност и. Различ аю т т ри зоны сапробност и: 1. О лигос апроб ная зона от лич ае т ся не в ысоким соде рж ание м органич е ских в е щ е ст в , колич е ст в о микроорганизмов сост ав ляе т от 10 до 1000 в 1 мл. 2. М езос апроб ная зона пре дст ав ляе т собой боле е загрязне нную в оду, где проходят проц е ссы распада бе лков и угле в одов , в 1 мл в оды соде рж ит ся до 100000 бакте рий. 3. Полис апроб ная зона – зона наиболе е загрязне нной в оды, где происходит анаэробный распад угле в одов . Ч исло бакте рий в 1 мл в оды дост игае т 1000000. М икрофлора в одое мов оч е нь разнообразна по сост ав у, в основ ном, эт о сапрофит ные бакте рии, но могут в ст ре ч ат ься и пат оге нные : т ифозные , дизе нт е рийные и даж е холе рные бакте рии. О днако обнаруж е ние в пробах в оды пат оге нных бакте рий св язано с большими т рудност ями и не в се гда дае т наде ж ный ре зульт ат . В св язи с эт им принят о использов ат ь косв е нные показат е ли в озмож ного инфиц иров ания в оды: коли-т ит р или коли-инде кс. К оли-т ит ром назыв ае т сянаиме ньший объ е м в оды в миллилит рах или в е с т в е рдого в е щ е ст в а в граммах, соде рж ащ ий одну кише ч ную палоч ку (Escherichia coli). К оли-индекс – эт о колич е ст в о кише ч ных палоч е к, кот орое соде рж ит ся в 1000 мл в оды или в 1 кг т в е рдого в е щ е ст в а. О пре де ле ние колич е ст в а кише ч ной палоч ки в в оде пров одит ся бакте риологич е скими лаборат ориями паралле льно с опре де ле ние м общ е й обсе ме не нност и в оды. П орядок работы . П е ре д в ысе в ом иссле дуе мую в оду разв одят ст е рильной в одой 1:10, 1:100 или даж е больше , в зав исимост и от е е загрязне ния. Для эт ого 1 мл иссле дуе мой в оды в носят в пробирку с 9 мл ст е рильной в оды, ост орож но пе ре ме шив аю т (пе рв ое разв е де ние 1:10). Зат е м 1 мл в оды изразв е де ния 1:10 в носят в сле дую щ ую пробирку с 9 мл ст е рильной в оды (1:100) и т .д. К аж дый разпользую т ся нов ой ст е рильной пипе т кой. Изпосле дне го разв е де ния бе рут 1 мл ж идкост и, в носят в ч ашку П е т ри, залив аю т РП А (т е мпе рат ура пит ат е льной сре ды не долж на пре в ышат ь 45-50оС) и ост ав ляю т ч ашку длязаст ыв анияагара. Ч ашки П е т ри с посе в ами поме щ аю т в т е рмост ат дляпроращ ив ания при т е мпе рат уре +25-30оС (дном в в е рх). Ч е ре з не сколько дне й произв одит ся подсч е т в ыросших колоний. Ре зульт ат подсч е т а умнож аю т на разв е де ние и получ аю т соде рж ание бакте рий в 1 мл иссле дуе мой в оды. Задание : посе ят ь в одопров одную в оду, в оду изаквариума или от крыт ого в одое ма на РП А.

44

М ат е риалы и оборудов ание П робирки с 9 мл Н2О – 2; колба со ст ояч е й в одой; пуст ая ст е рильная пробирка; ст е рильные пипе т ки на 1 мл – 5 шт .; ст е рильная ч ашка П е т ри; РП А. Работа 13. М ик робиологическ ий анализ возду ха В оздух не яв ляе т сяблагоприят ной сре дой для разв ит ия микробов , т ак какв не м не т пит ат е льных в е щ е ст в для них. Те м не ме не е в оздух мож е т служ ит ь им в ре ме нной сре дой для сущ е ст в ов ания. П опадаю т в в оздух микробы с пов е рхност и поч в ы с пылью , с различ ными в ыде ле ниями ж ив ых организмов . Наиболе е ч аст о в в оздухе находят ся дрож ж е в ые грибы, споров ые палоч ки и пигме нт ные бакте рии. К олич е ст в е нный и кач е ст в е нный сост ав микрофлоры в оздуха зав исит от в ысот ы и широт ы ме ст ност и, в ре ме ни года, в лаж ност и, насе ле нност и и т .д. Наиболе е загрязне нными яв ляю т ся призе мные слои ат мосфе ры над городами в ле т ний пе риод, особе нно в засушлив ые годы (на в ысот е 500 м – до 3000 т ысяч микробов в 1 м 3 в оздуха). К олич е ст в о микроорганизмов в закрыт ых поме щ е ниях ре зко в озраст ае т зимой, особе нно в ме ст ах скопле ниялю де й (школы, инст ит ут ы, кинот е ат ры и т .д.). Большинст в о микробов , соде рж ащ ихся в в оздухе , от носит ся ксапрофит ам, но могут находит ься и пат оге нные для лю де й, ж ив от ных и раст е ний в иды. О дним изсанит арных показат е ле й загрязне ния в оздуха яв ляе т сяобщ е е ч исло микробов в 1 м 3 в оздуха. Для обнаруж е ния микробов в в оздухе пре длож е но большое колич е ст в о ме т одов и приборов , позв оляю щ их опре де лит ь их общ е е колич е ст в о. О пре де ле ние сост ав а микрофлоры в оздуха пров одит ся ме т одами, в основ у кот орых полож е но дв а принц ипа: осе дание (се диме нт ац ия) и засасыв ание (аспирац ия). О се дание (по К оху) – самый прост е йший ме т од. О н основ ан на осе дании микроорганизмов , капе ле к ж идкост и или пылинок под в лияние м силы т яж е ст и на пов е рхност ь пит ат е льного агара ч ашки П е т ри. Э т от ме т од заклю ч ае т сяв т ом, ч т о ст е рильнаяч ашка П е т ри с плот ной пит ат е льной сре дой (М П А, РП А и др.) от крыв ае т ся в иссле дуе мом ме ст е на 5 минут (уст анов ле но, ч т о за 5 минут на 1 дм 2 горизонт альной пов е рхност и при от сут ст в ии в е т ра осе дае т ст олько микробов , сколько их соде рж ит сяв 10 л в оздуха). П осе в пров одит сяна пов е рхност ь пит ат е льной сре ды. П осле эт ого ч ашка П е т ри закрыв ае т ся крышкой и поме щ ае т ся в т е рмост ат для проращ ив ания при t +25о (ч ашка П е т ри кладе т ся в пе ре в е рнут ом в иде , ч т обы не накапала на сре ду в ода, конде нсирую щ аяся на крышке). Аспирац ионные ме т оды основ аны на пропускании опре де ле нного объ е ма в оздуха ч е ре зст е рильную пит ат е льную сре ду или мало пе нящ ую ся ст е рильную ж идкост ь, сухие ле гко раст в оримые в е щ е ст в а (сахарный пе сок и др.) и ме мбранные фильт ры.

45

Ч е ре з не сколько дне й подсч ит ыв аю т колич е ст в о в ыросших колоний (каж дая колония – эт о пот омст в о одного микроба). П одсч е т произв одят , не от крыв ая ч ашки, пут е м нане се ния т оч е к ч е рнилами на наруж ной ст ороне дна ч ашки. Е сли колоний слишком много, т о для обле гч е ния подсч е т а ч ашку П е т ри с ниж не й ст ороны де лят на не сколько се кторов , в каж дом изкот орых де лаю т подсч е т колоний, а зат е м ц ифры суммирую т . О пре де лив площ адь ч ашки П е т ри и зная колич е ст в о колоний, в ыросших на не й, де лаю т пе ре сч е т на площ адь 1 кв.дм и на 1 м 3 в оздуха. П риме р расч е т а: в ч ашке П е т ри диаме т ром в 10 см 2 в ыросло 25 колоний. 1. О пре де ляе м площ адь пит ат е льной сре ды в ч ашке П е т ри по формуле : S = 3,14 . 5 2 = 78,5 см 2. 2.В ыч исляе м колич е ст в о колоний на площ ади 1 дм 2 (100 см 2) по пропорц ии: 25 колоний - 78,5 см 2 х колоний - 100 см 2 25 . 100 х = ----------------- = 32 колонии, 78,5 2 т .е . на площ ади 1 дм име е т ся32 колонии. 3.П е ре сч ит ыв ае м колич е ст в о бакте рий из10 лит ров в оздуха на 1 см 3 в оздуха, кот орый рав е н 1000 л: Х = 32 . 100 = 3200. Сле дов ат е льно, в 1 м 3 в оздуха соде рж ит ся 3200 бакте риальных кле т ок. Ч т обы судит ь о ст е пе ни загрязне нност и в оздуха, мож но в оспользов ат ьсясле дую щ е й т аблиц е й. К рит е рии длясанит арной оц е нки в оздуха ж илых поме щ е ний (ч исло микроорганизмов в 1 м 3 по А.И.Ш афиру) О ц е нка в оздуха Ч ист ый Грязный

Л е т ний ре ж им М е не е 1500 Боле е 2500

Зимний ре ж им М е не е 4500 Боле е 7000

Сле дуе т помнит ь, ч т о на М П А или РП А в ыраст аю т не в се осе в шие на не го микроорганизмы. Наприме р, на используе мой сре де не будут размнож ат ьсяхе мосинт е зирую щ ие бакте рии. О днако эт им ме т одом мож но получ ит ь срав нимые ре зульт ат ы. Задание : Сде лат ь посе в микроорганизмов изв оздуха ме т одом прямого осаж де ния(по К оху). М ат е риалы и оборудов ание Ст е рильные ч ашки П е т ри, РП А, лине йка, карандаш по ст е клу.

46

Работа 14. М ик роф лора слизистой полости рта, зу бногоналета, к ож ны х пок ровов П олост ь рт а богат а разнообразной микрофлорой. П ост оянная т е мпе рат ура, обилие пищ и, щ е лоч ная ре акц ия – в се эт о создае т благоприят ные услов иядляразв ит иямикроорганизмов . О бнаруж е но боле е 100 в идов микроорганизмов , обит аю щ их в полост и рт а. К ним от носят ся разнообразные ст ре пт ококки, ст афилококки, микобакте рии, споров ые и бе сспоров ые аэробные и анаэробные палоч ки, ац идофильные микроорганизмы, в ибрионы, спириллы, спирохе т ы, дрож ж и, ре ж е актиномиц е т ы. Наибольше е ч исло микробов обнаруж ив ае т ся в зубном нале т е и в пов ре ж де нных (кариозных) зубах. В 1 мл слю ны находят ся миллионы бакте рий, сре ди кот орых могут в ст ре ч ат ься и пат оге нные . О т зараж е ния пре дохраняе т многослойный эпит е лий, покрыв аю щ ий слизист ую оболоч ку. Большая роль в оч ищ е нии от попав ших из в не шне й сре ды микробов принадле ж ит лизоц иму – фе рме нт у, соде рж ащ е муся в слю не . Наиболе е пост оянными обит ат е лями полост и рт а яв ляю т ся длинные т онкие нит е в идные формы (Leptothrix buccalin), т олст ые крупные палоч ки (Bac.maximus buccalis), ме лкая спирохе т а (Spirochaeta microuentium), крупная спирохе т а (Spirochaeta buccalin), диплококки, ст ре пт ококки, микрококки и дрож ж и. П орядок работы . Ст е рильной пе т ле й ост орож но бе рут не большой кусоч е к зубного нале т а, пе ре носят в каплю в оды, т щ ат е льно разме шив аю т и де лаю т мазок. Зат е м е го окрашив аю т ме т иле нов ой сине й или фуксином и рассмат рив аю т с имме рсионным объ е ктив ом. РП А расплав ляю т на в одяной бане и в ылив аю т в ст е рильную ч ашку П е т ри. П осле т ого, как сре да заст ыне т , дот рагив аю т ся конц ами пальц е в до е е пов е рхност и, не в дав лив аяагар. П ри эт ом крышку ч ашки П е т ри не снимаю т , а лишь сле гка приподнимаю т . Зат е м ч ашку поме щ аю т – т е рмост ат на 2-3 дня при t = 2530оС. П о ист е ч е нии эт ого в ре ме ни в т е х ме ст ах, где прикасались руками, в ыраст ут колонии микроорганизмов . Ч т обы показат ь, какое гигие нич е ское знач е ние име е т мыт ье рук, ст ав ят опыт , в кот ором кпов е рхност и агара прикасаю т ся с одной ст ороны ч ист ыми руками, с другой - грязными. П рокале нным пинц е т ом в зят ь один в олос и разлож ит ь е го на пов е рхност и агара (крышку ч ашки П е т ри сле гка приподнят ь). Задание : П ознакомит ьсяс микрофлорой организма ч е лов е ка. Дляэт ого: 1. Сде лат ь мазокзубного нале т а. 2. П ров е ст и посе в с пальц е в рук. 2. П ознакомит ьсяс микрофлорой в олоса. М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп, пе т ли микробиологич е ские , пре дме т ные и покров ные ст е кла, красит е ли, РП А, ст е рильные ч ашки П е т ри, пинц е т .

47

ТЕ М А 6. Ч ИСТЫ Е ИЭ Л Е К ТИВ НЫ Е К У Л Ь ТУ РЫ М ИК РО О РГАНИЗМ О В Работа 15. П олу чениеэлек тивной к у льту ры сенной палочк и Bacillus subtilis В основ е в ыде ле ния эле ктив ной культ уры се нной палоч ки ле ж ит уст ойч ив ост ь е е спор к длит е льному кипяч е нию . Для создания благоприят ных услов ий не обходимо т акж е снабдит ь культ уру пит ат е льными в е щ е ст в ами и обе спе ч ит ь избыт оч ную аэрац ию , т .к. се нная палоч ка яв ляе т ся аэробной формой. У дале ние из сре ды других микроорганизмов дост игае т ся кипяч е ние м сре ды в т е ч е ние в ре ме ни, дост ат оч ного для т ого, ч т обы убит ь в сре де в се в е ге т ат ив ные формы бакте рий и споры ме не е уст ойч ив ых в идов , но не дост ат оч ного для т ого, ч т обы убит ь споры се нной палоч ки. П орядок работы . В колбу поме щ аю т 10 г ме лко наре занного се на, в носят щ е пот ку ме ла для не йт рализац ии сре ды, долив аю т 200 мл в оды и кипят ят в т е ч е ние 15-20 минут . Зат е м от в ар профильт ров ыв аю т ч е ре зв ат у, в лож е нную в в оронку, и разлив аю т в колбы Э рле нме йе ра слое м в 1-2 см для создания аэрац ии. К олбы закрыв аю т в ат ной пробкой, поме щ аю т в кипящ ую в одяную баню и кипят ят е щ е 20 минут . П ри эт ом от мирае т большинст в о не споров ых микробов и ч аст ь споров ых. П осле кипяч е ния зараж аю т сре ду кусоч ками св е ж е го се на. К олбы поме щ аю т в т е рмост ат при t = 28-30оС. Ч е ре з сут ки в о в зят ой из колбы пробе обнаруж ив аю т ся подв иж ные формы се нной палоч ки. В 2-сут оч ной культ уре на пов е рхност и образуе т сяпле нка (зоогле я), сост оящ аяизпалоч е к, сое дине нных в нит и. В боле е ст арых культ урах (6-7 дне в ных) наблю дае т ся образов ание спор. Задание : 1. В ыраст ит ь эле ктив ную культ уру се нной палоч ки. 2. П ригот ов ит ь из эле ктив ной культ уры се нной палоч ки Bacillus subtilis пре парат ы: раздав ле нная капля, в исяч ая капля. 3. Зарисов ат ь форму и в заимное располож е ние кле т ок. 4. Рассмот ре т ь фиксиров анный пре парат , используяимме рсионный объ е ктив . М ат е риалы и оборудов ание К онич е ские колбы на 100 мл, колбы на 500 мл, в е сы, разнов е сы, калька, нож ниц ы, ме л, в оронка, в ат а, в одяная баня, се но, пре дме т ные и покров ные ст е кла, фуксин, ст е кла с лункой. Работа 16. В ы делениебак терий в чисту ю к у льту ру Чис т ая культ ура м икроорганизм а – эт о культ ура, пре дст ав ле нная бакте риями одного в ида. Изуч е ние морфологич е ских, физиологич е ских, биохимич е ских св ойст в микроорганизмов в озмож но лишь в ч ист ой культ уре . Сущ е ст в уе т не сколько ме т одов в ыде ле ния ч ист ой культ уры, основ анных на разных принц ипах: 1) пут е м разбав ле ния в ж идкой

48

пит ат е льной сре де ; 2) в ыде ле ние ч ист ой культ уры зав е домо изодной кле т ки; 3) ме т одом посе в а на плот ную пит ат е льную сре ду. Самым ранним ме т одом в ыде ле ния ч ист ой культ уры микроорганизма яв ляе т ся ме т од разв е де ний, пре длож е нный П аст е ром. Сут ь ме т ода заклю ч ае т сяв т ом, ч т о бе рут ряд пробирокс ж идкой пит ат е льной сре дой и де лаю т пост е пе нное разбав ле ние культ уры до т акого сост ояния, когда в пробирке оказыв ае т ся одна кле т ка. П осле дняя пробирка, в кот орой наблю дае т сярост микроорганизмов , услов но сч ит ае т сяч ист ой. В ыде ле ние ч ист ой культ уры из одной кле т ки под конт роле м микроскопа мож но пров одит ь разными способами; капе льным (по ме т оду Л индне ра) с помощ ью микроманипулят ора и микросе ле ктора. В ыде ле ние ч ист ой культ уры по ме т оду Л индне ра пров одит ся сле дую щ им образом: на ст е рильное покров ное ст е кло ст е рильным ч е рт е ж ным пе ром наносят капли разбав ле нной суспе нзии микроорганизма, поме щ аю т покров ное ст е кло над лункой пре дме т ного ст е кла и просмат рив аю т в микроскоп. П од микроскопом от ме ч аю т капли, в кот орых находит ся одна кле т ка. П ре парат ы поме щ аю т в т е рмост ат . П осле проращ ив ания от ме ч е нные капли снимаю т ст е рильной фильт ров альной бумагой в пробирку со ст е рильной сре дой. Э т от ме т од использую т при работ е с крупными микроорганизмами. М икроманипулят ор – прибор, позв оляю щ ий с помощ ью спе ц иальной микроскопич е ской пипе т ки произв одит ь захв ат одной кле т ки под конт роле м микроскопа. Изв ле ч е нную кле т ку пе ре носят в пробирку со ст е рильной ж идкой сре дой. Используе т ся т акж е микросе ле ктор П е рфилье в а. На ст олике микроскопа смонт иров ан прибор, основ ной ч аст ью кот орого яв ляе т ся прямоугольный капилляр. В капилляр набираю т разбав ле нную суспе нзию кле т оки просмат рив аю т в микроскоп. М е ст о, где располож е на одна кле т ка, удале нная от других, в ыламыв ае т ся и поме щ ае т сяв пробирку со ст е рильной пит ат е льной сре дой. В ч ист ую культ уру микроорганизмы могут быт ь в ыде ле ны из различ ных е ст е ст в е нных субст рат ов пут е м посе в а на плот ную пит ат е льную сре ду. М икроколонию , в ыросшую на пов е рхност и пит ат е льной сре ды, микроскопирую т , пров е ряя е е однородност ь, и описыв аю т , а зат е м пров одят пе ре се в на скоше нный агар, в ст олбикагара и т .д. Э т от ме т од наиболе е прост , и им ч аст о пользую т ся для в ыде ле ния ч ист ой культ уры микроорганизмов . П орядок работы . 1. П ригот ав лив аю т дв е пробирки с РП А, одна из кот орых со скоше нной пов е рхност ью , а в т орая – с прямой. Для эт ого пробирку, ране е наполне нную на 1/3 объ е ма ст е рильной пит ат е льной агаров ой сре дой, нагре в аю т на в одяной бане до полного е е расплав ле ния. Зат е м ост уж аю т в наклонном полож е нии, ч т обы пит ат е льная сре да име ла наибольшую площ адь, но не доходила до в ат ных пробок. 2. П росмат рив аю т ч ашки П е т ри с посе в ами микробов изпоч в ы, в оды и в оздуха, в ыбираю т хорошо от гранич е нную колонию и от ме ч аю т е е карандашом по ст е клу. Де лаю т описание колонии, от ме т ив форму, ц в е т ,

49

характе р пов е рхност и (гладкая, морщ инист ая, бле ст ящ ая, т усклая, сухая). 3. П роизв одят пе ре се в бакте рий из от ме ч е нной колонии на косой РП А шт рихом и на прямой РП А – уколом. Пос ев ш т рих ом . В прав ую руку бе рут бакте риологич е скую пе т лю (как пе ро или карандаш) и прокалив аю т в пламе ни спирт ов ки. Зат е м приот крыв аю т ч ашку П е т ри на ст олько, сколько нуж но дляв в е де ния в не е пе т ли, в в одят пе т лю и касаю т ся е ю края колонии (для охлаж де ния пе т ли), а зат е м – е е се ре дины, ч т обы захв ат ит ь культ уру микроба. В ле в ую руку ме ж ду большим и сре дним пальц ами бе рут пробирку с пит ат е льной сре дой т ак, ч т обы скоше нная пов е рхност ь была хорошо в идна (пробирку де рж ат ь горизонт ально), мизинц е м и бе зымянным пальц ами прав ой руки в ынимаю т пробку из пробирки, обж игаю т края пробирки на спирт ов ке, в в одят пе т лю в пробирку и де лаю т е ю на пов е рхност и агара зигзагообразный шт рих. П е т лю в ынимаю т , край пробирки и в ат ную пробку пров одят ч е ре зпламя спирт ов ки и закрыв аю т пробирку. П робирку ост ав ляю т в т е рмост ат е на не сколько дне й при +25оС. Пос ев уколом в с т олб ик РПА . М ат е риал, подле ж ащ ий посе в у, бе рут иглой, кот орую пот ом от в е сно в в одят в пов е рхност ь пит ат е льной сре ды и продв игаю т до самого дна (пробирку де рж ат дном кве рху). В ынимаю т иглу, обж игаю т и закрыв аю т пробирку пробкой. Пос ев уколом в Р ПЖ . Э т от посе в пров одят для опре де ле ния от ноше ния микроорганизма ккислороду в оздуха и де йст в ия микроба на бе лки – способност ь гидролизов ат ь их, в св язи с ч е м наблю дае т ся разж иж е ние ж е лат ина. П осе в пров одят т акж е , каки укол в РП А. П осе в ы с БП Ж в ыде рж ив аю т при комнат ной т е мпе рат уре или в т е рмост ат е с т е мпе рат урой 20-22оС. Пос ев в ж идкие пит ат ельные с реды. В РП Б и в синт е т ич е скую сре ду посе в в е де т ся сле дую щ им образом: прокале нной пе т ле й бе рут не много иссле дуе мого мат е риала и в носят в пробирку со ст е рильной ж идкой пит ат е льной сре дой с соблю де ние м в се х в ыше указанных прав ил пре дост орож ност и от зараж е ния изв не . П рикасаясь пе т ле й к ст е нке пробирки в т ом ме ст е , где находит сяж идкост ь, сле гка пот ираю т пе т ле й о ст е нку пробирки, ч т обы посе в ной мат е риал попал в пит ат е льную сре ду. П робирку поме щ аю т в т е рмост ат . Задание : 1. П ров е ст и подсч е т бакте рий и грибов в 1 г поч в ы, 1 мл в оды и 1м 3 в оздуха. Сост ав ит ь т аблиц у по ре зульт ат ам, получ е нным в группе , и срав нит ь соде рж ание микроорганизмов в иссле дов анных субст рат ах. 2. В ыбрат ь в лю бой ч ашке П е т ри одну колонию , промикроскопиров ат ь е е при малом ув е лич е нии микроскопа на однородност ь и описат ь: разме р колонии в мм, форма (округлая, не прав ильная, аме бов идная, ризоидная, миц е лиальная); пов е рхност ь колонии (гладкая, ше рохов ат ая, складч ат ая, морщ инист ая); профиль колонии (плоский, в ыпуклый, крат е рообразный, конусов идный); бле ск и прозрач ност ь (бле ст ящ ая, мат ов ая, муч нист ая, прозрач ная), ц в е т колонии (бе сц в е т ная или

50

пигме нт иров анная и окраска); край колонии (ров ный, в олнист ый, лопаст ной, бахромч ат ый); ст руктура колонии (однородная, ме лко-, крупнозе рнист ая, ст руйч ат ая, в олокнист ая); консист е нц ия колонии (опре де ляе т ся прикоснов е ние м пе т ле й). К онсист е нц ия мож е т быт ь плот ной, мягкой, в раст аю щ е й в агар, слизист ой, т ягуч е й, хрупкой. 3. Сде лат ь посе в ы из описанной колонии: а) в пробирку с РП Б; б) в пробирку РП А; в ) на косякРП А; г) в ст олбикРП Ж ; ж ) на сре ду Гисса; з) на сре ду с крахмалом. П робирки с посе в ами подписат ь и поме ст ит ь в т е рмост ат при +25о (кроме пробирки с РП Ж ). М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп с осв е т ит е ле м, спирт ов ка, спич ки, лине йка, карандаш по ст е клу, микробиологич е ская пе т ля, игла, пробирки с косяком РП А, со ст олбиком РП А, с РП Б, сре да Гисса, сре да с крахмалом, лине йка. Работа 17. И зу чением орф ологическ их, к у льту ральны х и ф изиологическ их свой ств м ик робов О пре де ле ние в идов ой принадле ж ност и микроорганизмов оч е нь зат рудне но. Большинст в о признаков , на кот орых основ ыв ае т ся опре де ле ние в ида микроорганизма, изме нч ив о, т е м не ме не е однов ре ме нное изме не ние в се х признаков происходит оч е нь ре дко. П оэт ому при опре де ле нии в ида пользую т сясов окупност ью признаков : 1) морфологич е ских, 2) физиологич е ских, 3) культ уральных. 1. М орфологич е ские признаки: 1) форма кле т ки; 2) т ип рост а (от де льные кле т ки, соч е т аниядипло-, ст ре пт о-, т е т ра- и т .д.); 3) разме ры кле т ки в микроме т рах; 4) форма оконч ания палоч ков идной кле т ки (коне ц закругле нный, сре занный под углом, в огнут ый); 5) подв иж ност ь и т ип ж гут ов ания; 6) налич ие спор и уст ойч ив ост ь их к пов ыше нной т е мпе рат уре (опре де ляе т ся в ре ме не м кипяч е ния суспе нзии микроорганизмов в заполне нном капилляре , в т е ч е ние кот орого споры погибаю т ). М орфологич е ская характе рист ика яв ляе т ся не обходимой, но не дост ат оч ной дляопре де ле нияв идов ой принадле ж ност и. П . К ульт уральные – эт о т акие признаки, кот орые в ыяв ляю т ся при разв ит ии микроорганизмов на опре де ле нной пит ат е льной сре де . 1). Рост культ уры на рыбо-пе пт онном бульоне . Бульонные культ уры микробов бе рут ост орож но, не в збалт ыв аю т и от ме ч аю т сле дую щ ие особе нност и рост а: а) налич ие пле нки на бульоне и е е св ойст в а (кольц е образная или полная, хлопье в идная, т онкая, т олст ая, слизист ая, гладкая, складч ат ая); б) налич ие осадка и е го св ойст в а (плот ный, хлопье в идный, зе рнист ый, т ягуч ий, обильный, скудный); в ) помут не ние и ст е пе нь мут ност и сре ды; г) ц в е т и запах сре ды. 2). Рост культ уры на РП А при посе в е шт рихом. О писание пров одят по оконч ании рост а: а) мощ ност ь рост а (слабый, сре дний, мощ ный); б) форма

51

рост а (огранич е нный, в е т в ист ый); в ) характе р края шт риха (гладкий, в олокнист ый, лопаст ной, зубч ат ый, в олосист ый); г) бле ск шт риха (бле ст ящ ий, мат ов ый); д) профиль рост а шт риха (пле нч ат ый, в ыпуклый); е ) пов е рхност ь шт риха (гладкая, ше рохов ат ая, бугрист ая, складч ат ая); ж ) ц в е т шт риха; з) опт ич е ские признаки (шт рих просв е ч ив аю щ ий или не просв е ч ив аю щ ий); и) консист е нц ия культ уры (т ягуч ая, слизист ая, хрупкая, хрящ е в идная). Ш . Ф изиологич е ские признаки. 1. Х ар ак т ер к о л о н ий пр и глубин н о м по севен а РПА в чашк и П ет р и. В зав исимост и от т ого, куда попадае т микроб, могут образов ыв ат ься колонии т ре х т ипов : пов е рхност ные , глубинные и донные : а) пов е рхност ные колонии яв ляю т ся наиболе е характе рными. П ризнаки для их описания прив е де ны в работ е 16; б) глубинные колонии раст ут в в иде сплю щ е нных ч е ч е в ич е к или лодоч е к с заост ре нными конц ами. Иногда образую т сяколонии в в иде в раст аю щ их в сре ду клоч ков в ат ы; в ) донные колонии в се гда т онкие , прозрач ные , ст е лю т ся по дну и одинаков ы у в се х в идов . 2. Ро ст по ук о л у в РП А. Наблю де ние за рост ом культ уры по уколу позв оляе т в ыяснит ь от ноше ние микроба ккислороду: а) облигат ный аэроб дае т рост лишь на пов е рхност и агара, образуя шляпку; б) факульт ат ив ный аэроб дае т рав номе рный рост по уколу; в ) облигат ный анаэроб – рост лишь в глубине укола. 3. Ро ст по ук о лу в ж ел ат ин дае т пре дст ав ле ние о способност и микроорганизмов в ыде лят ь прот е олит ич е ские фе рме нт ы в о в не шню ю сре ду. О т ме ч аю т , разж иж ае т микроб ж е лат ин или не т , и скорост ь эт ого проц е сса. 4. Ро ст бак т ер ий н а к р ах м ал е. П ри налич ии у бакте рий гидролит ич е ских фе рме нт ов происходит гидролиз крахмала, о кот ором судят по образов анию бе лого оре ола в округ зоны рост а бакте рий при добав ле нии раст в ора Л ю голя. Там, где не т гидролиза крахмала, сре да окрашив ае т сяв синий ц в е т . 5. Ро ст бак т ер ий н а ср едеГисса. П ит ат е льнаясре да соде рж ит различ ные ист оч ники угле рода и индикат ор на рН. П ри не йт ральной рН сре да окраше на в фиоле т ов ый ц в е т , а при подкисле нии ж е лт е е т . Э т о указыв ае т на способност ь бакте рий усв аив ат ь угле в оды с образов ание м органич е ских кислот . IV. О краска бакте рий по Граму. О краска по Граму яв ляе т ся в аж не йшим признаком и зав исит от химич е ского сост ав а и физиологии кле т ок микроорганизмов . Бакте рии окрашив аю т ге нц ианв иоле т ом, йодом в йодист ом калии, зат е м обрабат ыв аю т спирт ом. Бакте рии, сохраняю щ ие окраску, носят назв ание грамполож ит е льных, ут рач ив аю щ ие – грамот риц ат е льных. П орядок работы . Де лаю т на одном ст е кле т ри мазка: 1) иссле дуе мой культ уры (посе ре дине ); 2) грамот риц ат е льного микроба

52

(уксуснокислых бакте рий или кише ч ной палоч ки) – сбоку; 3) грамполож ит е льного микроба (сарц ины) – с другой ст ороны (или дрож ж е й). П осле в ысыхания и фиксиров ания мазков их обрабат ыв аю т сле дую щ ими раст в орами и в сле дую щ е м порядке: 1) ге нц ианв иоле т ом – 12 минут ы, 2) йодом в йодист ом калии (раст в ор Л ю голя) – 1-2 минут ы; 3) промыт ь в одой; 4) обработ ат ь 96% спирт ом – 1,5-1 минут а; 5) промыт ь в одой; 6) разбав ле нным фуксином (1:10) – 1-2 минут ы; 7) промыт ь в одой. П росушив аю т пре парат и рассмат рив аю т в микроскоп, срав нив ая окраску мазка иссле дуе мой культ уры с окраской грамполож ит е льного микроба (фиоле т ов ый ц в е т ) и грамот риц ат е льного (красный). К роме пе ре ч исле нных признаков , для опре де ле ния в ида бакте рий не обходимо уст анов ит ь от ноше ние микроба к ист оч нику С-пит ания, пот ре бност ь в факторах рост а, способност ь к газообразов анию , образов анию спирт а, NH3, H2S, уст ойч ив ост ь к кислот ам и щ е лоч ам, к в ысокой и низкой т е мпе рат уре , в ысушив анию , конц е нт рац ии соле й, к ант ибиот икам и т .д. Е ст е ст в е нно, ч т о на практич е ских занят иях в ыполнит ь в е сь объ е м работ ы по опре де ле нию в ида бакте рий не в озмож но, поэт ому для общ е го ознакомле ния с характе ром работ ы мож но огранич ит ься описание м лишь не кот орых морфологич е ских, культ уральных и физиологич е ских признаков .

1. 2. 3. 4.

Задание : О писат ь признаки посе в ов на РП А, РП Ж , РП Б, сре де Гисса, на сре де с крахмалом. О пре де лит ь морфологич е ские признаки культ уры, пригот ов ив пре парат раздав ле ннаякапляизпосе в ов шт рихом. П ров е ст и окраску бакте рий по Граму. Ре зульт ат ы записат ь в т аблиц у:

Ф орма П оди в иж распо- ност ь лож е ние кле т ок

Спо- О красры ка по РП А РП Б Граму

Х аракте р рост а на сре дах РП А РП Ж Сре да Гисса укоукоС С лом лом саха- мальрозой т озой

О пре де ле ние бакте рий в е дут по К рат кому опре де лит е лю Бе рги.

Сре да с крахмалом

53

М ат е риалы и оборудов ание М икроскоп и осв е т ит е ль, салфе т ка, ст е кла пре дме т ные обе зж ире нные , ст е кла покров ные , в ода, фильт ров альная бумага, микробиологич е ская пе т ля, бю кс с де нат урат ом, склянка с де зинфиц ирую щ им раст в ором, кю в е т а с мост иком, спирт ов ка, спич ки. К ульт ура дрож ж е й (сухие дрож ж и разв одят в не большом колич е ст в е т е плой в оды с сахаром). Ге нц ианв иоле т : 1 г ге нц ианв иоле т а раст в оряю т в 10 мл 96о спирт а и сме шив аю т со 100 мл 5 % раст в ора фе нола. Раст в ор Л ю голя, спирт 96о, в одный карболов ый фуксин Ц иля.

54

Л ит е рат ура 1. Ч уриков а В .В . О снов ы микробиологии и в ирусологии / В .В .Ч уриков а, Д.П .В икторов .- В ороне ж : Изд-в о В ороне ж . ун-т а, 1994.-277с. 2. Руков одст в о кпрактич е ским занят иям по микробиологии: У ч е б. пособие / М .Н.П име нов а, Н.Н.Гре ч ушкина, Л .Г.Азов а и др.- М .: Изд-в о М ГК , 1995.-220с. 3. Те ппе р Е .З. П рактикум по микробиологии: У ч е б. пособие / Е .З.Те ппе р, В .К .Ш ильников а, Г.И.П е ре в е рзе в а.- М .: К олос, 1993.- 174с. 4. Зав арзин Г.А. В в е де ние в природов е дч е скую микробиологию / Г.А.Зав арзин, Н.Н.К олот илов а.- М .: Изд-в о О О О К н. дом «У нив е рсит е т », 2001.- 256с.

http // www.lib.usu.ru М икробиология, бакте рии, культ уральные сре ды, микроскопич е ские пре парат ы, ч ист аякульт ура, ст е рилизац ия, т е хника микроскопиров ания.

55

Сост ав ит е ли:

Ч уриков а В икторияВ икторов на Грабов ич М аргарит а Ю рье в на

Ре дактор

Тихомиров а О .А.