Генетическая инженерия и биобезопасность. Избранные лекции по курсу ''Генетика с основами селекции'': Учебное пособие

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю В О РО Н Е Ж С К И Й Г О С У Д АРС Т В Е Н Н Ы Й У Н И В Е С И Т Е Т

О .С . М аш к ина, А .К . Б уторина Г Е Н Е ТИ ЧЕ С К А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я И Б И О Б Е ЗО ПА С Н О С ТЬ И ЗБРАН Н Ы Е Л Е К ЦИ И по курс у “Г енетикас ос новами с елекции” У ч ебное п особи е п о сп ец и ал ь н о ст и 011600 – би о логи я

В оронеж 2005

2

У тверждено науч но-методич еским советом б иолого-поч венного ф акультета27 октя б ря 2004 года, протокол№ 21

Авторы : М аш кинаО .С . БуторинаА.К .

У ч еб ное пособ ие подготовлено на каф едре генетики, с елекции и теории э волю ции б иолого-поч венного ф акультета В оронежс кого гос ударс твенного универс итета Рекомендуетс я для с тудентов б иолого-поч венного ф акультетадневной , веч ерней и з аоч ной ф ормы об уч ения

3

С О Д Е РЖ АН И Е ВВЕ ДЕ Н И Е . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. Г Е Н Е Т И Ч Е С К АЯ И Н Ж Е Н Е РИ Я . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. К леточ ная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Х ромос омная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Г енная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1. В екторная транс ф ормация . О с новны е э тапы соз дания транс генны х организ мов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1.1. П оня тие о векторе. Т ипы векторов, их конс труирование . . . 1.3.2. М етоды перенос агенов в клетки раз лич ны х организ мов . . . . 1.3.3. К лонирование генов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. С О ЗД АН И Е И С К РИ Н И Н Г БАН К А Г Е Н О В . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1. П ринципы с оз дания б анкагенов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. В ы б ор нужного генаиз клонотеки (с крининг б анкагенов) . . . 3. Г Е Н Н АЯ И Н Ж Е Н Е РИ Я М И К РО О РГ АН И ЗМ О В . . . . . . . . . . . . . . . . 4. Г Е Н Н АЯ И Н Ж Е Н Е РИ Я РАС Т Е Н И Й . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1. Агроб актериальная транс ф ормация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. В екторы наос нове хлороплас тной и митохондриальной Д Н К . . 4.3. П реимущ ес тваи труднос ти ис польз ования рас тений как об ъ ектадля генно-инженерны х ис с ледований .. . . . . . . . . . . . . . . 4.4. Д ос тижения и перс пективы генной инженерии рас тений . . . . . . 4.5. Транс генны е рас тения в с ельском хоз я й с тве . . . . . . . . . . . . . . . . 5. Г Е Н Н АЯ И Н Ж Е Н Е РИ Я Ж И В О Т Н Ы Х . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1. О с новны е направления и дос тижения генной инженерии животны х . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. С пос об ы с оз дания транс генны х животны х . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. К лонирование животны х . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. М Е Д И ЦИ Н С К И Е АС П Е К Т Ы Г Е Н Е ТИ Ч Е С К О Й И Н Ж Е Н Е РИ И Ч Е Л О В Е КА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1. Г енодиагностика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Г енная терапия , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. М етоды генной терапии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. П римеры практич еского применения генной терапии . . . . . . . . . 7. П РО БЛ Е М Ы БИ О БЕ ЗО П АС Н О С Т И Т РАН С Г Е Н Н Ы Х О РГ АН И ЗМ О В . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1. П оня тие о б иоб езопас нос ти. П риродарисков для з доровья ч еловекаи окружаю щ ей с реды , с вя з анны х с ис польз ованием транс генны х организ мов, методы их оценки и с пособ ы предупреждения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2. Г ос ударс твенное регулирование б ез опас нос ти генноинженерной дея тельнос ти в Рос с ии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . РЕ КО М Е Н Д У Е М АЯ Л И Т Е РАТ У РА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 5 5 7 8 10 10 17 18 18 19 20 24 24 24 29 31 32 38 41 41 45 48 52 53 54 56 58 61

61 67 69

4

В В Е ДЕ Н И Е Г енетич ес кая инженерия – наиб олее перс пективное направление с овременной генетики, имею щ ее важное науч ное и практич ес кое з нач ение. В раб отах по генетич ес кой инженерии ис польз ую тс я как методы клас с ич ес кой генетики, так и с амы е с овременны е б олее тонкие методы молекуля рной генетики (такие как вы деление и идентиф икация генов, их с еквенирование, картирование, химич ес кий и ф ерментативны й с интез , генны й нокаут, гиб ридиз ация нуклеиновы х кис лот, генная дактилоскопия и др.). В пособ ии даетс я подроб ное описание некоторы х из них. Г енетич ес кая инженерия , как из вес тно, вы с окотехнологич ны й процес с , ос нованны й на ф ундаментальны х науч ны х з нания х, треб ую щ ий вы с ококвалиф ицированны х кадров и мощ ной науч но-технич ес кой б аз ы . П оэ тому б удущ им с пециалис там в кач естве ос новы для проведения ис с ледований по генетич еской инженерии необ ходимо иметь предс тавление об ос новны х э тапах с оз дания транс генны х организ мов, принципах конс труирования рекД Н К , з нать процедуры по с оз данию и скринингу б анков генов как ис точ ников для получ ения и из уч ения ф ункций желаемы х для перенос агенов. С этими вопрос ами они могутоз накомитьс я в данном пособ ии. В практич еском отнош ении генетич ес кая инженерия с тала одним из наиб олее э ф ф ективны х методов с елекции растений , позволя ю щ им с ущ ес твенно сократить с роки соз дания новы х перс пективны х с ортов и получ ать их направленно путем непосредс твенного внедрения в растения желаемы х генов, минуя процес с гиб ридиз ации. М етоды генетич ес кой инженерии с тали нез аменимы ми в ф армакологии. О ни поз волили получ ать ценны е лекарс твенны е препараты , ис польз уя живы е организ мы в кач ес тве б иореакторов. Г енно-инженерны е методы находя т вс е б олее ш ирокое применение в медицине, с тав ос новой генотерапии (леч ения генами), поз воливш ей из леч ивать многие ранее неиз леч имы е наследс твенны е з аб олевания . В данном уч еб ном пос об ии можно най ти подроб ное опис ание примеров и методов клеточ ной , хромос омной и генной инженерии у микроорганиз мов, рас тений , животны х и ч еловека. И с с ледования по генной инженерии проводя тся в науч ны х лаб оратория х и крупны х ф ирмах в наш ей стране и з а руб ежом дос таточ но ш ироко, поэ тому с пециалис ты в э той об лас ти я вля ю тс я вос треб ованны ми. Э то пос лужило ос нованием для вы деления темы по генетич еской инженерии в с амостоя тельное пособ ие, ч тоб ы с туденты имели воз можнос ть с амос тоя тельно подроб нее и глуб же оз накомитьс я с ней , пос кольку время , отведенное для ее ос вещ ения в лекционном курс е, “Г енетика с ос новами с елекции”огранич ено. П ри напис ании пос об ия уч иты валось также то, ч то поступление в торговую с еть многих генетич ес ки модиф ицированны х продуктов вы з ы ваетоз аб оч еннос ть об щ ес твеннос ти. П оэ тому в пос об ие б ы л вклю ч ен раз дел по б иоб ез опас нос ти в с вя з и с получ ением и ис пользованием генетич ески модиф ицированны х организ мов. О тмеч аетс я , ч то во вс ех гос ударс твах, где

5

проводя тс я ис с ледования по генетич ес кой инженерии, приня ты соответствую щ ие з аконы и другие гос ударс твенны е акты , соз даю щ ие нормативноправовую б аз у для проведения таких ис с ледований . П о Рос с ий с кой Ф едерации указ ана документация , регламентирую щ ая получ ение и ис польз ование генетич ес ки модиф ицированны х продуктов. Э то ос об енно важно, т.к. такая инф ормация в рекомендуемой с тудентам с овременной науч ной литературе полнос тью отс утс твует. П ри напис ании данного пособ ия б ы ла ис польз ована новей ш ая литературапо теме, в том ч ис ле и та, ч то мало дос тупнаш ирокому кругу ч итателей . П оэ тому данное пос об ие может представля ть интерес для студентов-б иологов, ас пирантов, науч ны х с отрудников, вы полня ю щ их ис с ледования по генетич еской инженерии, преподавателей , а также для вс ех желаю щ их пополнить с вои з нания по э той животрепещ ущ ей проб леме современной науки. 1. Г Е Н Е ТИ ЧЕ С К А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я Г енетическ ая инженерия – с овокупнос ть методов с оз дания живы х генетич ески из мененны х организ мов, вклю ч аю щ их ч ужеродны й генетич ес кий материал. Ч ащ е вс его генетич ескую инженерию отождествля ю т с генной инженерией , когда проводя тс я манипуля ции на уровне Д Н К . В этом с луч ае ос ущ ес твля ю т с оздание генетич ес ки из мененны х организ мов в рез ультате целенаправленного перенос а в них ч ужеродны х генов, кодирую щ их нужны е ч еловеку приз наки и с вой с тва. В б олее ш ироком плане под генетич ес кой инженерией понимаю т и клеточ ную , и хромос омную , и генную инженерию , то ес ть генетич еская инженерия вклю ч ает оперирование (манипулирование) не только генами, но и б олее крупны ми ч ас тя ми генома. 1.1. К Л Е ТО ЧН А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я П римером клеточ ной инженерии у животны х я вля етс я получ ение м он оклон аль н ы х ан т и т ел на ос нове вы ращ ивания ги бр и дом . Ги бр и дом а – клеточ ны й гиб рид, получ енны й в рез ультате парасекс уальной (или с оматич ес кой ) гиб ридиз ации. П арас екс уальная гиб ридиз ация или парас екс уальны й процес с – э то ф ормирование клеток-потомков б олее, ч ем отодного родителя , в об ход мей оз а и оплодотворения ; ч ас то встреч аетс я у гриб ов. Ги бр и дом у получ аю т путем с лия ния нормальной антителооб раз ую щ ей клетки иммунной с ис темы (лимф оцита) с миеломной опухолевой клеткой . Д ело в том, ч то В -лимф оциты (В -клетки), с интез ирую щ ие антитела, не могут вос произ водитьс я и расти в культуре. Г иб ридома об ладает с пос об нос тью к с интез у моноклональны х антител и к неогранич енному рос ту наис кус с твенной питательной среде, так как об ъ единя ет в с еб е с вой с тва нормальны х клеток иммунной с ис темы вы раб аты вать с пециф ич ес кие антитела в ответна введение определенного антигена (вещ ес тва, которое вос прини-

6

маетс я организ мом как ч ужеродное и вы з ы ваю щ ее с пециф ич еский иммунны й ответ) и с пос об ность раковы х клеток неогранич енно долго делитьс я в культуре. Г иб ридомы ис польз ую т как эф ф ективное, хотя и оч ень дорогое с редс тво против рака, а также для из готовления вакцин, например, против я щ ура крупного рогатого с кота, овец и с виней . Э тот э нтеровирус предс тавля ет опас нос ть и для ч еловека. В с транах третьего мира я щ ур предс тавля ет э ндемич ес кую б олез нь, принос я щ ую огромны й э кономич ес кий ущ ерб . Д ля получ ения вакцины ис польз уетс я клонированное б елковое антитело этого вирус а. Г иб ридиз ация с оматич еских клеток животны х ис польз уетс я как метод генетич ес кого анализ а для картирования генов, определения их ф ункций . С э той целью , например, проводя т гиб ридиз ацию клеток ч еловека и мы ш и, ч еловекаи хомя ч каи др. П римером генетич ес кой инженерии наклеточ ном и с вя з анном с ним организ менном уровня х я вля етс я получ ение так наз ы ваемы х алл офен н ы х м ы ш ей, то ес ть мы ш ей , с одержащ их генотипич ес ки раз лич ны е ткани, получ енны е от раз ны х родителей . Д ля э того э мб рионы ч ерны х и б елы х мы ш ей , дос тигш ие с тадии вос ьми б ластомеров, из влекали из матки с амки и с помощ ью определенного ф ермента разб ивали на отдельны е б лас томеры . С ливая б ластомеры от двух или б оле з ароды ш ей , с оз давали едины й комплекс ны й э мб рион. Т акие э мб рионы на с тадии гаструлы вводили в матку мы ш и, у которой рождалис ь мы ш атас тканя ми б елого и ч ерного цвета. П римером клеточ ной инженерии у рас тений я вля етс я получ ение с оматич ес ких (парас екс уальны х) гиб ридов путем с лия ния протопластов (клеток, лиш енны х клеточ ной с тенки) раз лич ны х видов и родов. Такой подход поз воля ет с оединить в гиб ридной клетке генетич ескую инф ормацию я дра и цитоплаз мы далеких в с ис тематич ес ком отнош ении организ мов; получ ать ф ормы растений , которы е не с ущ ес твую тв природе или которы е трудно получ ить половы м путем. С оматич еская гиб ридиз ация - с пос об введения важны х цитоплаз матич еских генов, находя щ ихс я в мтД Н К (например, генов цитоплаз матич ес кой мужс кой стерильности) и хлД Н К (например, генов ус той ч ивос ти к герб ицидам, патогенам). С оматич ес кие гиб риды принципиально отлич аю тс я от половы х. П ервы е нас ледую т внея дерны е гены от об оих родительс ких рас тений , вторы е – только по материнс кой линии. В рез ультате с лия ния протоплас тов можно получ ить генетич ес ки раз нооб раз ны е гиб ридны е ф ормы : растения , гетероз иготны е по внея дерны м генам, ч то в с вою оч ередь об ус ловливает воз можнос ть получ ения рас тений с раз лич ны ми комб инация ми цитоплаз матич ес ких генов; циб риды , с одержащ ие я дро одного из родителей и цитоплаз му об оих родителей ; растения с плас томом одного родителя и митохондрионом другого. К роме э того, в рез ультате полной или ч ас тич ной э лиминации хромосом одного из родителей у отдаленны х соматич ес ких гиб ридов может наб лю датьс я б ольш ое генетич ес кое раз нооб раз ие, об ус ловленное я дерны ми генами. М етодом соматич еской гиб ридиз ации получ ены гиб риды между культурны м и диким картоф елем, картоф елем и томатом, араб идопс исом и

7

турнепс ом, турнепс ом и капус той , пш еницей и я ч менем, рис ом и просом и др. 1.2. ХРО М О С О М Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я И с пользование метода хромос омной инженерии в опы тах В .А. С трунникова(1971) имело важное теоретич ес кое и практич ес кое з нач ение. С помощ ью рентгеновс кого об луч ения В .А. С трунников с умел перенес ти на половую W-хромос ому с амки (WZ) тутового ш елкопря да уч ас ток аутос омы (10-й хромосомы ) с геном, об ус ловливаю щ им темную окраску кокона (то ес ть путем транс локации). Г ен, об ус ловливаю щ ий темную окрас ку, нас ледовалс я по женс кой линии и женс кие грены вс егда б ы ли темны е. С амцы (ZZ) и с амки (WZ) в рез ультате раз вивалис ь из грен с раз ной окрас кой , ч то поз волило отб ирать с амцов для промы ш ленного вы ращ ивания , так какони об раз ую ткоконы на25 % продуктивнее, ч ем с амки, ч то давало с оответс твенно б ольш ий вы ход ш елка. П римером хромосомной инженерии я вля етс я также получ ение организ мов с з амещ енны ми хромос омами. В этом с луч ае ос ущ ес твля ю т з амещ ение целы х хромосом или отдельны х ф рагментов. Т акой подход предс тавля ет б ольш ой интерес с точ ки з рения улуч ш ения с ущ ес твую щ их с ортов сельс кохоз я й ственны х рас тений , которы е нес ут комплекс ы генов, определя ю щ их нежелательны е приз наки. Д ля з амещ ения хромосом, нес ущ их такие гены , необ ходимо предварительно с оз дать с ерии м он осом и ков и н улл и сом и ков луч ш их с ортов. О рганиз мы , в диплоидном наб оре которы х отс утс твуетоднахромос ома(2n-1), наз ы ваю тс я м он осом и кам и , парагомологич ны х хромос ом (2n-2) – н улли сом и кам и . В С Ш А, например, серия монос омиков получ ена для с орта пш еницы Ч ай низ С принг С ирс ом, а в Рос с ии для с ортапш еницы Без ос тая 1 – О .И . М ай с тренко и с ортаС аратовская 29 – под руководс твом В .К . Ш умного. П утем б екросс ов с монос омиками с тандартного с орта в теч ение ш ес ти – с еми поколений можно получ ить монос омик по хромосоме, намеч енной для з амещ ения . Затем, проведя с амоопы ление, отб ираю т дисомны е рас тения с двумя з амещ енны ми хромос омами. В с я раб отапроводитс я при с трожай ш ем цитологич ес ком контроле. Н аб аз е монос омиков ос ущ ес твлены также межвидовы е и межродовы е перенос ы хромос ом. О с об ы й интерес предс тавля ет получ ение у з амещ енны х линий транс локаций между хромосомами пш еницы и ее далеких родс твенны х видов. Т аким об раз ом С ирс , например, ос ущ ествил передач у ус той ч ивос ти к лис товой ржавч ине сорту Ч ай низ С принг от э гилопс а Аеgilops umbellulata. С ходны м об раз ом пш енице б ы ли переданы с егменты хромос омы ржи и пы рея , нес ущ ие гены ус той ч ивости к с теб левой ржавч ине и твердой головне. И з вес тны е рус ские с орта оз имой пш еницы Аврора и К авказ содержаттранс лоцированны й с егментхромос омы ржи в хромос оме пш еницы . В Н овос иб ирс ком инс титуте цитологии и генетики С О РАН путем з амещ ения отдельны х хромос ом мя гкой пш еницы хромосомами ржи получ ены ф ормы пш еницы с б олее вы с оким с одержанием б елка в з ерне, ус той ч ивы е к з ас олению , раз лич ны м видам з аб олеваний .

8

1.3. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я Г енная инженерия – э то методы получ ения рекомб инантны х (гиб ридны х) Д Н К из ф рагментов геномов раз ны х организ мов, введение их в клетку и об ес печ ение ус ловий для экс прес с ии ч ужеродны х генов. П ри э том можно ос ущ ествить направленное конструирование (с оз дание) организ мов с з аданны ми (нужны ми ч еловеку) с вой с твами, ч то трудно (или невоз можно) с делать об ы ч ны ми методами – гиб ридиз ацией , мутагенез ом и др. В ос нове методов генной инженерии лежит с пособ нос ть б актериальны х ф ерментов рес трикции (рес триктаз) рас щ епля ть Д Н К на отдельны е, довольно короткие нуклеотидны е пос ледовательности. Е стес твенной ф ункцией рестриктаз я вля етс я з ащ ита б актерии от инф екции вирус ами. Э ти ф ерменты рес трицирую т (т.е. огранич иваю т) воз можнос ть раз множения ф аговой Д Н К в б актерии путем раз рез ания ее на ч ас ти. Ф ерментрестрикции не может рас щ епля ть с вою с об с твенную (б актериальную ) Д Н К , т.к. в с ай тах рес трикции б актериальная Д Н К модиф ицирована метилированием, которое ос ущ ес твля етс я особ ы м ф ерментом – Д Н К -метилаз ой . В б актериальной клетке с ущ ествует с ис тема рес трикции-модиф икации. О пределенны е рестриктаз ы с пециф ич ес ки уз наю т только с вои «миш ени», сос тоя щ ие из 4-6 пн и разрез аю тД Н К в с ередине или нес колько в с тороне от э той пос ледовательнос ти, делая соответс твенно пря мы е или с тупенч аты е раз рез ы в об оих цепя х Д Н К (рис унок 1). В пос леднем с луч ае об раз ую тс я “липкие”(вы с тупаю щ ие одноцепоч еч ны е) концы , которы е б лагодаря комплементарнос ти ос нований могут вновь з амы катьс я с об разованием водородны х с вя з ей . Т .е. концы , с ф ормировавш иес я под дей с твием одной и той же рес триктаз ы , могут гиб ридиз ироватьс я между соб ой . Э то об ес печ ивает воз можнос ть об ъ единения раз лич ны х молекул Д Н К и с оз дание рекомб инантны х (гиб ридны х) молекул Д Н К . Рес триктаз ы б ы ли наз ваны б иологич ес кими ножами, которы ми манипулирую т генны е инженеры или генны е хирурги. HaeIII EcoRI C G A A T T C C A T A G G C C G C G C T T A A G G T A T C C G G C G C G G C T T A A

A A T T C C A T A G G G G T A T C C

“ липк ие” к онц ы

C C G C G G C G

“тупы е” к онц ы

Рис унок1. П ос ледовательнос ть нуклеотидов, содержащ ая с ай ты (с ай ты рестрикции), рас поз наваемы е раз лич ны ми рес триктаз ами

9

П римером рес триктаз , об раз ую щ их “липкие концы ”, я вля ю тс я ш ироко ис польз уемы е в генно-инженерны х раб отах ф ерменты б актериального проис хождения - EcoRI (прис утс твует у E.coli) и BamHI (об наружена в клетках Bacillus amyloliquefaciens). Н апример, EcoRI рас поз нает пос ледовательность из 6 нуклеотидов (GAATTC), делая с тупенч аты е раз рез ы между нуклеотидами G и А (рис унок 1), HaeIII – уз нает4 нуклеотида(GGCC), делая пря мы е разрез ы и об раз уя “тупы е”концы . Д ля с оединения “тупы х” концов к ним ф ерментативны м путем присоединя ю т “липкие” концы . Ф ерменты рес трикции об оз нач аю т по наз ванию организ мов, из которы х они из олированы . И с польз ую т три б уквы из наз вания вида б актерии, например, EcoRI из E.coli, HindIII – из Haemophilus influenzae, HaeIII – из Haemophilus aegyptius и т.д. П ос ле трех б укв курс ивом с ледую т определенны й б уквенны й с имвол, об оз нач аю щ ий генетич ес кую линию или ш тамм, и римс кая циф ра. В нас тоя щ ее время из вес тно б олее 400 рестриктаз , с пос об ны х рас щ епля ть Д Н К в раз лич ны х с ай тах. Ф ормальной датой рождения генной инженерии с ч итаю т1972 г., когда группа Берга в С Ш А с оз дала первую рекомб инантную молекулу Д Н К (рекД Н К ), об ъ единивш ую в с воем с ос таве генетич еский материал из трех ис точ ников: полны й геном онкогенного вирус аоб ез ья н SV40, ч ас ть генома умеренного б актериоф ага λ и гены лактоз ного оперона E. сoli. С конс труированная рекомб инантная молекула не б ы ла ис с ледована ф ункционально, так как у авторов э той раб оты воз никли опас ения , ч то методы генетич ес кой инженерии могут привес ти к воз никновению микроорганиз мов, опас ны х для з доровья ч еловека, например б актерий Е. сoli, с пособ ны х перенес ти онкогенны е вирус ы в киш еч ник ч еловека. П оэ тому международны м науч ны м с ооб щ ес твом б ы ло приня то реш ение проводить такие ис с ледования под с трожай ш им контролем с о с тороны гос ударс тва. О с новны ми з адач ами, с тоя щ ими перед генной инженерией с егодня , я вля ю тс я – б орьб ас б олез ня ми и произ водство продовольс твия . Т ехнология перенос ав геном рас тений , животны х, микроорганиз мов ч ужеродны х генов (т р ан сген ов = целевы х генов) и их передач ав ря ду поколений наз ы вается т р ан сген езом или т р ан сген озом (от англ. transgenesis). П рич ем, их направленны й перенос может ос ущ ествля тьс я между далеко раз об щ енны ми в ф илогенетич еском отнош ении организ мами. Н апример, в геном растения можно вс троить гены животны х, ч еловека, б актерий , других рас тений , в рез ультате ч его клетки нач инаю т вы раб аты вать новы е продукты (нес вой с твенны е данному организ му). О рганиз мы , получ енны е в рез ультате перенос а в их геном (с помощ ью генноинженерны х методов) ч ужеродны х генов, наз ы ваю тс я т р ан сген н ы м и (их ещ е наз ы ваю т ген ет и чески м оди фи ц и р ован н ы м и - Г М ). Э то ф ормы с с ущ ес твенно реконс труированны ми геномами. П роцес с , в рез ультате которого ч ужеродная Д Н К проникает в реципиентную клетку и вы з ы вает у нее нас ледуемы е из менения , наз ы ваю тт р ан сф ор м ац и ей. Т ранс ф ормацию клеток могут ос ущ ес твля ть как молекулы Д Н К, реплицирую щ иес я в клетках

10

внехромосомно (плаз миды ), так и молекулы Д Н К , интегрирую щ иес я в геном клетки (хромосомы ). Е с ли процес с транс ф ормации у б актерий (то есть перенос генов от одного ш тамма б актерий к другому) можно ос ущ ес твить с помощ ью рас творимы х ф рагментов Д Н К , нез авис имо от того, живы е клетки или мертвы е, то попы тки провес ти транс ф ормацию у э укариот с ис польз ованием препаратов тотальной геномной Д Н К не привели к ожидаемы м рез ультатам. Х отя доказ анны м примером ес тес твенной трансф ормации у млекопитаю щ их и у ч еловека я вля етс я внедрение в хромосому клетки-хоз я ина Д Н К онкогенного вирус а. П оложительны е вос произ водимы е э кс периментальны е рез ультаты у э укариотб ы ли получ ены только с помощ ью в ек торной трансф орм ац ии. 1.3.1. В ект орная т рансф орм ац и я. О сновны е эт ап ы создани я т рансгенны х органи зм ов О с новны ми э тапами соз дания транс генны х организ мов я вля ю тс я с ледую щ ие: 1. П олуч ение нужного гена (транс гена), намеч енного для перенос а. Г ен может б ы ть вы делен из ес тес твенны х ис точ ников (из подходя щ его генома) или геномной б иб лиотеки. О н может б ы ть с интез ирован ис кус с твенно: химич еским путем (по имею щ ей с я пос ледовательности нуклеотидов) или ф ерментативны м путем с ис польз ованием механиз ма об ратной транс крипции (с интез кД Н К на матрице мРН К с помощ ью об ратной транс криптаз ы ), получ ен с помощ ью полимераз ной цепной реакции (П ЦР). 2. С оз дание с пециальны х генетич ес ких конс трукций – векторов (перенос ч иков), в с оставе которы х гены (транс гены ) б удутвнедря тьс я в геном другого видаили клонированы в клетках про- или э укариот. К лонирование предполагает получ ением б ольш ого ч ис ла копий ф рагментов Д Н К , идентич ны х исходному. 3. Г енетич ес кая трансф ормация , т.е. перенос и вклю ч ение генетич ес ких векторов (рекД Н К ) в клетки-миш ени хоз я ина(реципиента). 4. М олекуля рная с елекция – отб ор клонов, нес ущ их рекД Н К , ч то ос ущ ес твля етс я с ис польз ованием раз лич ны х маркерны х генов, которы е находя тс я в векторной молекуле наря ду с транс геном. 5. В ы ращ ивание из мененны х клеток в целы е транс генны е организ мы . Рас с мотрим подроб нее некоторы е из э тих процедур. 1.3.1.1. П онят и е овект оре. Ти п ы вект оров, и х конст руи ровани е О б я з ательной генетич ес кой конс трукцией , ис польз уемой в э кс периментах по генной инженерии, я вля етс я вект ор . Вект ор ы – э то молекулы Д Н К , с пособ ны е перенос ить вклю ч енны е в них ч ужеродны е гены в клетку, где э ти молекулы реплицирую тс я автономно или пос ле интеграции с геномом (хромос омой ). Т .е. векторы ис польз ую тс я в генной инженерии для перенос а транс гена от организ ма-донора в организ м-реципиент, а также для клонирования генов. П оч ему нельз я ввес ти ч ужеродны й ф рагмент Д Н К

11

с раз у в клетку э укариот или некоторы х б актерий (б ез вектора)? Э то с вя з ано с тем, ч то при об ы ч ном введении Д Н К в клетку она, как правило, подвергается атаке ф ерментов, которы е раз рез аю тее наотдельны е ф рагменты . Д ля того, ч тоб ы рекД Н К стала с ос тавной ч астью генетич ес кого аппарата клетки, она должна либ о вс троитьс я в ее геном (интегрировать в хромосому) и реплицироватьс я з аего с ч ет, либ о б ы ть с пос об ной к автономной репликации. В ектор должен об ладать с ледую щ ими с вой с твами. 1. С пособ нос ть к автономной (т.е. нез авис имо от хромосомы реципиента) репликации в клетке реципиента. Н апример, для репликации в клетке б актерии, вектор должен с одержать с ай т ori (уч ас ток инициации репликации). 2. Н алич ие с ай та, в котором воз можно вс траивание желаемого ф рагментаД Н К . Д ля этого вектор должен с одержать один, или с амое б ольш ое два уч ас тка (с ай та рес трикции), ч увствительны х к определенной рес триктаз е, которая рас щ епля етвектор и поз воля етвс троить желаемы й транс ген. 3. Н алич ие одного или нес кольких маркерны х генов, б лагодаря которы м клетка-реципиент б удет об ладать новы ми приз наками, поз воля ю щ ими отлич ить транс ф ормированны е клетки (т.е. с одержащ ие рекД Н К ) от ис ходны х. Э то могут б ы ть сел ект и вн ы е ген ы , которы е придаю т клеткам с елективное преимущ ес тво (ус той ч ивос ть к антиб иотикам, герб ицидам). Т акие гены кодирую т ф ерменты , раз руш аю щ ие или модиф ицирую щ ие антиб иотики, герб ициды . В этом с луч ае транс ф орманты отб ираю т на питательны х средах с вы соким с одержанием э тих вещ ес тв. Н апример, в прис утс твии гена лактомаз ы б актериальная клетка приоб ретает ус той ч ивос ть к пенициллину и на с реде с э тим антиб иотиком об раз ует клон (нес ущ ий данны й ген), тогда как об ы ч ны е клетки (б ез э того гена) на данной среде погиб аю т. В кач ес тве маркерны х ис польз ую т и так наз ы ваемы е р еп ор т ер н ы егены , э кс прес с ия которы х не дает с елективны х преимущ еств, но продукты генов удоб ны для тестирования , например, по из менению окрас ки. Т ак, ген GFP контролирует с интез з еленого ф лю орес цирую щ его б елка из медуз ы . П ри об луч ении транс генны х рас тений , с одержащ их э тот б елок, У Ф -луч ами, поя вля етс я з еленое с веч ение. Г ены luxA и luxB, вы деля ю т из Д Н К с ветля ч ков. О ни контролирую т с интез лю циф ераз ы , которая об ес печ ивает переход лю цеф иринов из окис ленной ф ормы в ос новную , ч то и об ес печ ивает свеч ение транс генны х растений , накапливаю щ их э тот б елок. Ш ироко ис польз уемы м в нас тоя щ ее время репортерны м геном я вля етс я ген β-глю коронидаз ы (GUS). Т ранс генны е клетки, э кс прес с ирую щ ие э тот ген, при помещ ении их нас пециф ич ес кий с уб с трат, окраш иваю тс я в голуб ой цвет. 4. Кроме того, для того ч тоб ы ч ужеродны й ген экс прес с ировалс я , необ ходимо его помес тить под с оответс твую щ ий промотор. У э укариотич ес ких организ мов механиз м регуля ции транскрипции б олее с ложны й , ч ем у э укариот. Регуля торны е пос ледовательности э укариотич еских генов отлич аю тс я от прокариотич ес ких, и б актериальная РН К -полимераз а не уз на-

12

етих. П оэ тому для э кс прес с ии э укариотич ес ких генов в клетках прокариот нужно, ч тоб ы гены находилис ь под контролем б актериального промотора (т.е. промотора клетки-хоз я ина). В кач ес тве промотора ш ироко ис польз уетс я промотор гена β-лактомаз ы (ген ус той ч ивости к ампициллину), локализ ованного в векторе рBR322, lac-промотор E. coli и др. Т о ес ть соз даетс я целая генетич еская конс трукция , в с ос тав которой , помимо транс гена, вводя тс я маркерны е гены и с оответс твую щ ие регуля торны е пос ледовательности. В кач естве векторны х молекул могут б ы ть ис польз ованы плаз миды б актерий или дрожжей (просты х э укариотич ес ких организ мов), Д Н К б актериоф агов или вирус ов, ис кус с твенны е хромос омы дрожжей (YAK) и б актерий (BAK). С оз даны также гиб ридны е (ис кус с твенны е) векторы кос миды , об ъ единя ю щ ие преимущ естваплаз мид и ф агов. Пл азм и ды – внехромос омны е генетич еские э лементы про- и э укариот, которы е автономно реплицирую тс я в клетке. П риродны е плаз миды ч ас то с одержат гены , полез ны е для б актерий : придаю щ ие устой ч ивос ть к антиб иотикам, контролирую щ ие с пос об нос ть раз руш ать раз лич ны е труднораз лагаемы е токс ич еские соединения (наф талин, камф ору, толуол, кс илол, раз лич ны е пес тициды и др.). Благодаря э тому, например, б актерии родаPseudomonas с ущ ес твую тв раз лич ны х э кологич еских ниш ах, в неб лагоприя тны х ус ловия х окружаю щ ей с реды , их ис польз ую т для оч ис тки поч вы , воды и з агря з нений токс ич ес кими с оединения ми. С плаз мидами с вя з ана с пос об нос ть ря да поч венны х б актерий вс тупать в с имб иоз с б об овы ми рас тения ми, об ус ловливая их с пос об нос ть к об разованию корневы х клуб еньков, необ ходимы х для ус воения поч венного аз ота. Д ля геннной инженерии б ольш ой интерес предс тавля ю тмногокопий ны е (мультикопий ны е) плаз миды , которы е в клетке предс тавлены б ольш им ч ис лом копий (до 10-200 копий на клетку). И с польз уя их, можно достич ь с верхс интез а нужны х б елковы х продуктов. Ч ащ е вс его векторы конс труирую тнаос нове природны х плаз мид, удаля я целы й ря д лиш них генов. Н апример, ш ироко ис польз уемы й для э тих целей плаз мидны й вектор р BR322 соз дан наос нове плаз миды E.coli. П лаз мидар BR322 имеетс ай т ori (об лас ть, ответс твенную з а репликацию плаз миды ), гены ус той ч ивости к антиб иотикам ампициллину (Ap′) и тетрациклину (Tc′). В гене TC′ имеетс я уникальны й с ай т, раз рез аемы й рестриктаз ой Bam HI (рис унок 2). Д ля рас тений ис польз ую тс я векторы , с конструированны е на ос нове Ti- и Ri- плаз мид поч венны х агроб актерий (рис унок 10). Э ти б актерии поражаю т до 60% двудольны х растений и некоторы е однодольны е рас тения , вы з ы вая ф ормирование опухолей – коронч аты х галлов (Agrobacterium tumefaciens) или об раз ование “кос маты х”корней (A. rhizogenes). В плаз мидах можно клонировать ф рагменты Д Н К раз мером не б олее 10 тпн. Ф аговы е вект ор ы , ч ащ е вс его, с оз даю т на б аз е умеренного б актериоф агаλ, с одержащ его двухцепоч еч ную линей ную молеклулД Н К (рис у нок3). Л евое и правое плеч и ф агаимею твс е гены , необ ходимы е для

13

Рис унок2. С хемас троения плаз миды pBR322 С елективны е маркерны е гены , определя ю щ ие ус той ч ивос ть к антиб иотикам: ампициллину (ApR) и тетрациклину (TcR); В гене TcR имеетс я уникальны й сай т, разрез аемы й рестриктаз ой BamHI; Ori – уч ас ток Д Н К , ответственны й з а репликацию плаз миды в клетках E. coli.

литич ес кого цикла (репликации, раз множения ). С редня я же ч ас ть генома б актериоф ага λ (с одержащ ая гены , контролирую щ ие лиз огению , т.е. его интеграцию в Д Н К б актерии-хозя ина) не с ущ ес твенна для его раз множения и около 50% (≈25тпн) может б ы ть з аменена на ч ужеродны й ф рагмент Д Н К . Т акие модиф ицированны е ф аги проходя т литич ес кий цикл, но лизогения не проис ходит. В екторы на ос нове б актериоф ага λ ис польз ую т для клонирования ф рагментов Д Н К э укариот(т.е. б олее крупны х генов) раз мером до 23 тпн. П рич ем, ф аги б ез вс тавок (< 38 тпн) или, напротив, со с лиш ком б ольш ими вс тавками (> 52 тпн) не раз виваю тс я и не поражаю т б актерии.

Рис унок3. С труктуравектора, соз данного наос нове Д Н К б актериоф агаλ [Ш евелуха, 2003]

14

Косм и да – это векторная плаз мида, предназ нач енная для клонирования б ольш их ф рагментов Д Н К э укариот (до 45тпн) в клетках E. coli. Т ермин об оз нач ает, ч то вектор я вля етс я плаз мидой , внутри которой вставлен cos-уч ас ток ф ага λ (cos-sites), предс тавля ю щ ий с об ой нуклеотидную пос ледовательнос ть, отвеч аю щ ую з а упаковку ф аговой Д Н К в ее протеиновую капс улу (рис унок 4). К ак с ледс твие и плаз мидная Д Н К , вклю ч аю щ ая ч ужеродны е гены , может б ы ть упакована в кос мидах в протеиновую капс улу б актериоф ага.

Рис унок 4. С хемастроения зрелого б актериоф агаλ.

Л иней ная двухцепоч еч ная Д Н К б актериоф ага λ с остоит примерно из 50 тпн. Н а концах Д Н К имею тс я cos-уч ас тки, отвеч аю щ ую з а упаковку ф аговой Д Н К в ее протеиновую капс улу.

Зач ас тую полнораз мерны е гены и мультигенны е комплекс ы (≥100тпн) э укариот с лиш ком велики для встраивания в об ы ч ны е векторы . Д ля перенос а крупны х транс генов и их клонирования ис польз ую т и скусст вен н ы ехр ом осом ы др о ж ж ей (YAK- я ки от англ. yeast artificial chromosomes), вмещ аю щ ие ф рагменты геномной Д Н К длиной от100 тпн до 1 млн пн. Д ля их с оз дания к плаз миде дрожжей “приш иваю т” центромерны е (CEN) пос ледовательнос ти, теломеры (концевы е пос ледовательнос ти), пос ледовательнос ти для автономной репликации (ARS) в дрожжевой клетке, с ай ты рес трикции и с елективны е маркеры (TRPI и URA3 - нез авис имос ть отналич ия триптоф анаи урацилас оответс твенно). Ч ел н очн ы е вект ор ы . Э то векторы (сконс труированны е на ос нове плаз мидной Д Н К ), с пос об ны е реплицироваться в клетках двух и б олее организ мов. Н апример, плаз мида YEp24 с пособ на раз множатьс я в клетках дрожжей и E. coli. В э том с луч ае векторы имею т с пециф ич еские нуклеотидны е пос ледовательнос ти (с пециф ич ны е для дрожжей и E. coli), поз воля ю щ ие реплицироватьс я или в б актерии, или в дрожжевой клетке. С помощ ью ч елноч ного вектора удалос ь ввес ти гены лей коцитарного интерф ерона ч еловека в клетки дрожжей . С конс труирован ш тамм дрожжей , которы й вы деля ет в культуральную среду поч ти ч исты е α-, β- и γинтерф ероны . И нтерф ерон – ценны й лекарс твенны й препарат, ш ироко ис –

15

польз уемы й для б орьб ы с вирус ны ми инф екция ми и другими з аб олевания ми, вклю ч ая з локач ес твенны е опухоли. Т ипич ная с хема опы та по генетич еской инженерии предс тавлена на рис унках 5 и 6. Э кс периментвклю ч аетследую щ ие э тапы . 1,2. Д ля конс труирования рекомб инантной Д Н К (рекД Н К ) векторную Д Н К (например, плаз миду) и ч ужеродную Д Н К , с одержащ ую интерес ую щ ий нас ген (транс ген), раз рез аю тодной и той же рес триктаз ой . О б раз ую тс я одинаковы е “липкие”концы (рис унок 5). К генам, с интез ированны м химич ес ким путем или получ енны м по матрице их мРН К , такие “липкие”концы можно приш ить ис кус с твенно. 3. С меш ивание раз лич ны х по проис хождению ф рагментов Д Н К и с ш ивание их Д Н К -лигаз ой . Л ипкие концы ч ужеродной Д Н К и плаз миды вз аимодей с твую т друг с другом, об раз уя комплементарны е пары ос нований . П роисходит гиб ридиз ация векторной и ч ужеродной Д Н К . “Л ипкие” концы з амы каю тс я с помощ ью водородны х свя з ей , а ковалентны е с ш иваю тс помощ ью ф ерментаД Н К -лигаз ы . 4. Г енетич ес кая транс ф ормация , т.е. перенос и вклю ч ение рекД Н К, с одержащ ей транс ген, в клетки реципиента (например, E. coli). П лаз мида, вс троенная в б актерию , ведет с еб я как вектор (переносч ик) нового гена, которы й реплицируетс я в каждом новом поколении. 5. М олекуля рная с елекция – отб ор транс ф ормантов, т.е. клонов, нес ущ их рекД Н К . В процес с е генетич ес кой транс ф ормации E. coli могутоб раз оватьс я 3 типа клеток: не с одержащ ие пламиду, с одержащ ие плаз миду б ез вс трой ки (б ез рекД Н К ), с одержащ ие плаз миду с рекД Н К . Д ля отб ора транс ф ормантов с реди нетранс ф ормированны х клеток ис польз ую т раз лич ны е маркерны е гены , которы е находя тс я в векторной молекуле наря ду с транс геном.

Рис унок5. С хемаопы тапо генетич еской инженерии (конс труирование рекД Н К )

16

Т ак, плаз мида pBR322 имеет два гена ус той ч ивости к антиб иотикам ампициллину (ApR) и тетрациклину (TcR). О дин из них с лужитдля идентиф икации б актерий , нес ущ их плаз миду (вектор) путем отб ора клеток, ус той ч ивы х к антиб иотику, а другой – для отлич ия гиб ридной плаз миды (рекД Н К ) отродительс кого вектора. В гене TcR имеетс я уникальны й с ай т, раз рез аемы й рестриктаз ой BamHI (рис унок6). П редположим, мы разрез а-

Рис унок 6. С хемаинтеграции ч ужеродной Д Н К в плаз миду pBRR322 и отб ор транс ф ормированны х клонов E. coli, содержащ их плаз миду с рекД Н К [Ай ала, 1987], (поя снение в текс те) ли вектор в гене TcR рес триктазой BamHI и вс троили в него ф рагмент ч ужеродной Д Н К , получ енны й при помощ и той же рес триктаз ы . Г ен TcR инактивируетс я , с ледовательно, у б актерий , нес ущ их плаз миду, ис ч ез ает ус той ч ивос ть к тетрациклину, но сохраня етс я устой ч ивос ть к ампициллину. О тб ор насреде с ампициллином покажет, с одержитли E. coli плаз миду или нет. С одержащ ие плаз миду б актерии б удут рас ти на с реде с ампициллином. Д ля отб ора клеток, нес ущ их ч ужеродную Д Н К (интерес ую щ ий нас

17

ген), б актерии вы ращ иваю т на среде с тетрациклином. Транс ф ормированны е клетки ус той ч ивы к ампициллину, но ч увствительны к тетрациклину (такие колонии отс утс твую т на с реде с тетрациклином), т.к. ген ус той ч ивос ти к тетрациклину раз руш ен в рез ультате инс ерции ф рагмента ч ужеродной Д Н К . С трелкой на рис унке 6 отмеч ены колонии - транс ф орманты , которы е соб ираю тдля опы тов с ампициллинового газ она. 1.3.2. М ет оды п ереноса генов в клет ки разли ч ны х органи зм ов И з вес тны многоч ис ленны е методы , с помощ ью которы х можно внедрить ч ужеродную Д Н К в геном раз лич ны х организ мов. В кач ес тве реципиентов, в геном которы х встраиваю тс я ч ужеродны е гены , ис польз ую т клетки культуры , э мб риональны е клетки млекопитаю щ их, некоторы х растений , дроз оф илы , пронуклеус ы млекопитаю щ их, у рас тений – протоплас ты , из олированны е клетки и ткани, микрос поры , нез релы е з иготич ес кие з ароды ш и, пророс тки. Т рансф ормация э кз огенной Д Н К можетос ущ ес твля тьс я либ о в культуре клеток (in vitro=ex vivo), либ о непос редс твенно в организ ме (in vivo). - М икроинъ екция . С помощ ью тонких микроигл и микроманипуля тора в клетку или пря мо в я дро вводитс я векторная Д Н К с вклю ч енны м в нее транс геном. С помощ ью микроинъ екций ос ущ ес твля етс я транс ф ормация у дрозоф илы , рас тений . - Э лектропорация . Рас тительны е протоплас ты или животны е клетки об раб аты ваю тимпульс ами э лектрич ес кого поля вы с окого напря жения , ч то об ратимо увелич ивает проницаемос ть б иомемб ран. Ч ерез об раз ую щ иес я накороткое время поры ч ужеродная Д Н К проникаетв клетку. - П еренос Д Н К в сос таве липос ом. Л ипосомы – э то искус с твенно с оз данны е с ф ерич еские об раз ования , об олоч ка которы х с остоит из ф ос ф олипидов. Л ипос омы , содержащ ие внутри транс ф ормирую щ ую Д Н К , с пос об ны непосредс твенно с ливатьс я с мемб раной клетки или поглощ атьс я клетками в рез ультате процес с а, подоб ного э ндоцитоз у. В клетке происходитраз руш ение об олоч ки липосом и вы с воб ождение рекД Н К . Э то один из методов, ис польз уемы й для з ащ иты транс ф ормирую щ его генетич еского материала от раз руш ительного дей с твия нуклеаз , прис утс твую щ их вне клеток. М етод применя етс я для введения нуклеиновы х кис лотв культивируемы е животны е клетки, растительны е протоплас ты . - Бомб ардировкамикропуля ми (б аллис тич ес кая транс ф ормация ). Э то один из с амы х э ф ф ективны х методов транс ф ормации однодольны х и хвой ны х рас тений (в которы е не удаетс я ввес ти ч ужеродную Д Н К с помощ ью агроб актерий ), а также транс ф ормации животны х клеток. Т аким путем проводя т генотерапию (т.е. ис правление нас ледс твенны х деф ектов путем введения в геном полноценны х генов) у животны х и ч еловека. Д ля “об стрела”тканей ис польз ую тс я ч астицы из з олота или вольф рама раз мером 0,6-3 мкм, на которы е нанос итс я Д Н К вектора, с одержащ ий транс ген. Э тими ч ас тицами (“микропуля ми”) з аря жаю т“генны е”пуш ки. М икропули раз гоня ю тс я в ус тановке под дей с твием э лектрич ес кого раз ря да или под

18

давлением газ а гелия . П ри дос таточ ной с корос ти э ти ч астицы могут непос редс твенно проникать в я дро, ч то с ильно повы ш ает э ф ф ективнос ть транс ф ормации. Э тим же методом можно трансф ормировать и другие Д Н К -с одержащ ие органеллы – хлороплас ты и митохондрии. Д ля многих двудольны х рас тений э ф ф ективна векторная транс ф ормация на ос нове Ti- и Ri- плаз мид с помощ ью агроб актерий . Э ф ф ективны ми перенос ч иками Д Н К в клетки млекопитаю щ их я вля ю тся “природны е ш прицы ”– вирус ы . 1.3.3. Клони ровани е генов К лонирование генов проводя т с целью получ ения того или иного ф рагмента Д Н К в б ольш ом колич ес тве. Э тот процес с необ ходим для получ ения многоч ис ленны х копий желаемы х генов. К лонирование Д Н К воз можно б лагодаря с пособ нос ти б актериальны х плаз мид и ф агов продолжать нормальное ф ункционирование пос ле вс траивания в их геном ч ужеродной Д Н К . П ос кольку вс троенны е в геном ч ужеродны е пос ледовательнос ти Д Н К не влия ю т на с вой с тва химерны х ш таммов б актерий , практич ес ки лю б ая пос ледовательность Д Н К может б ы ть клонирована таким об разом. Д ля клонирования плаз миду, содержащ ую рекД Н К, вводя тв клетки б актерии (например, E. coli) или дрожжей , где происходит ее многократная репликация . Д ля клонирования неб ольш их ф рагментов Д Н К ис польз ую т плаз миды , ф аговы е Д Н К , а для крупны х - кос миды и ис кус с твенны е хромосомы . К лонирование рекомб инантны х молекул с генами ч еловека или животны х в клетках б актерий дает воз можность в ус ловия х микроб иологич ес кого с интез а получ ать б ольш ое колич ес тво нужны х б елков. Так, ис кус с твенно с интез ированны й ч еловеч еский ген инс улина введен в б актерию , ч то дало воз можнос ть получ ать ч еловеч ес кий инс улин (гормон, ш ироко ис польз уемы й в медицине при леч ении с ахарного диаб ета) в промы ш ленны х колич ествах. Раньш е для леч ения с ахарного диаб ета ис польз овали инс улин животного проис хождения , получ аемы й из поджелудоч ной желез ы крупного рогатого скота. В 1979 г. из 60 млн. б ольны х диаб етом во вс ем мире только 4 млн. получ али э тот гормональны й препарат. О днако, у 5% воз никали аллергич еские реакции, об ус ловленны е антигенной нес овмес тимос тью гормона и клеток ч еловека, т.е. такие б ольны е б ы ли об реч ены на гиб ель. К иш еч ная палоч касо вс троенны м геном инс улина с интез ирует в культуре до 200 г инс улина на 1 литр культуральной с реды , ч то эквивалентно колич еству инс улина, вы деленному из 1600 кг поджелудоч ной желез ы коровы или с виньи и не вы з ы вает аллергии. П риродны е ш таммы б актерий инс улин никогдане продуцировали. 2. С О ЗДА Н И Е И С К РИ Н И Н Г Б А Н К А Г Е Н О В К ак уже отмеч алос ь, вы деление (получ ение) нужного гена (транс гена), намеч енного для перенос а – один из главны х этапов в генетич ес кой инженерии. Г ен можетб ы ть вы делен из ес тес твенны х ис точ ников (из под-

19

ходя щ его генома), с интез ирован химич ес ким путем (по имею щ ей с я пос ледовательности нуклеотидов) или ф ерментативны м путем с ис польз ованием механиз ма об ратной транскрипции (с интез кД Н К на матрице мРН К с помощ ью об ратной транс криптаз ы ), получ ен с помощ ью полимераз ной цепной реакции (П ЦР). Ч ас то нужны й ген вы деля ю тиз бан ка ген ов. 2.1. П ри нц и п ы создани я банка генов Бан к ген ов, или клон от ека (ген ом н ая би бл и от ека) – э то коллекция клонов Д Н К , вклю ч аю щ ая вс е ф рагменты , входя щ ие в с ос тав генома данного вида. Д ля ее с оз дания необ ходимо вы деление вс ей (тотальной ) геномной Д Н К , ее ф рагментация с помощ ью рес триктаз или методом дроб овика (ультразвуком); прис оединение получ енны х ф рагментов к клонирую щ им векторны м молекулам, введение рекомб инантны х Д Н К в реципиентны е б актерии для их пос ледую щ его клонирования . В рез ультате получ аю тклоны с раз ны ми ф рагментами одной молекулы Д Н К . Н аб ор клонированны х ф рагментов генома и наз ы ваетс я бан ком ген ов, а точ нее, - э то произ вольная (с луч ай ная ) коллекция клонированны х ф рагментов Д Н К , предс тавля ю щ ая с об ой с овокупнос ть вс ех нуклеотидны х пос ледовательнос тей Д Н К данного индивида или вида. О днажды получ енная , б иб лиотека генов может храниться и ис польз оватьс я неогранич енно долго. В б иб лиотеке содержится вс я нас ледс твенная инф ормация организ ма. Банк генов – э то не только ис точ ник для получ ения нужного транс гена, но и ис точ ник материала для из уч ения с труктуры , ф ункции и регуля ции индивидуальны х генов, с труктуры и ф ункции б елков. С его помощ ью можно также реш ить проб лему с охранения геноф ондаисч ез аю щ их видов. Г ены э укариот з анимаю т дос таточ но протя женны е уч ас тки Д Н К (до 2,5 млн пн). Д ля клонирования таких крупны х ф рагментов плаз мидны е векторы не подходя т. В э том с луч ае ис польз ую т клонирую щ ие векторы , с оз данны е на ос нове б актериоф ага λ (воз можны й раз мер клонируемого ф рагмента - до 23тпн), кос миды (до 45 тпн) или же ис кус с твенны е хромос омы (от100 до >1000тпн). П ервую геномную б иб лиотеку с оз дали Т . М аниатис с сотрудниками в 1978 г. О ни ис польз овали Д Н К из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках E. coli. Аналогич ны е коллекции, получ енны е из индивидуальны х хромос ом или их ч ас тей , наз ы ваю тся хр ом осом н ы м и би бл и от екам и . Би бл и от еки кДН К с оставля ю т копии Д Н К, комплементарны е РН К (рис унок 7). П ос кольку кД Н К получ аю тиз з релы х мРН К , прош едш их процес с инг, они не с одержат интронов. Биб лиотека кД Н К отражает с пектр генной активнос ти в клетках, из которы х онаб ы лавы делена. С оз дание таких б иб лиотек полез но для с равнения генной активнос ти в клетках раз ны х тканей .

20 п о ли (А ) х во ст м Р НК

5'

3'

Обратная транскри п ци я К о м п лекс м Р НК :кДНК

5' 3'

5' 3'

Е

AAAAAA ТТТТТТ 5'

п рай м ер о ли го (dT) AAAAAA3' ТТТТТТ 5' Р азру шени е м Р НК Р НК -азо й Н AA 3' ТТТТТТ 5'

До страи вани е вто ро й цеп и ДНК -п о ли м еразо й I с и сп о льзо вани ем фрагм енто в Р НК в качестве п рай м еро в 3' 5' AAAAAA ТТТТТТ 5' 3' ДНК -ли газ а сши вает Дву х цеп о чечная фрагм енты ДНК кДНК 5' 3' 3'

5'

Рис унок7. С интез двухцепоч еч ной кД Н К намРН К У э укариот только мРН К с одержит поли-А хвос ты . И с польз уя э то кач ес тво, мРН К вы деля ю т. Затем in vitro кэ той мРН К доб авля ю ткороткую цепь олиго (dT), которая пос ле отжигаслужитпрай мером для дей с твия об ратной транскриптаз ы , с интез ирую щ ей комплементарную цепь Д Н К на молекуле мРН К . Д алее с помощ ью РН К -аз ы Н разруш аю т мРН К в комплекс е мРН К :кД Н К . О с тровки полуразруш енной мРН К с лужат прай мерами для с интез авторой цепи Д Н К с помощ ью Д Н К -полимераз ы I по матрице кД Н К. Ф рагменты новой Д Н К -цепи с ш иваю тс я с помощ ью Д Н К лигаз ы . П ос ле того как молекулы кД Н К с интез ированы , к ним с помощ ью Д Н К -лигаз ы “приш иваю т”липкие концы , пос ле ч его вс траиваю т в клонирую щ ий вектор и перенос я тс я для их раз множения в б актерии. Т аким об раз ом, б иб лиотека генов предс тавля ет с об ой наб ор ф рагментов Д Н К , вс троенны х в вектор. 2.2. В ы бор нуж ногогена и зклонот еки (скри ни нгбанка генов) П оис к нужны х генов в с мес и клонированны х ф рагментов Д Н К б иб лиотеки ос ущ ествля етс я раз лич ны ми с пособ ами; с уть вс ех их с ос тоит в с кринировании б иб лиотек. Рас с мотрим некоторы е из них. 1. Е с ли нам доступен ис комы й ген, мы з наем его мес тоположение, молекуля рную мас с у, то его можно вы делить путем раз деления ф рагментов по молекуля рной мас с е и з аря ду при помощ и гель-э лектроф орез а. Д ля

21

э того ис с ледуемы е об раз цы (с одержащ ие раз лич ны е ф рагменты одной и той же Д Н К ) нанос я тс верху наагароз ны й или полиакриламидны й (П ААГ ) гель. П ри наложении на гель э лектрич ес кого поля ф рагменты нач нут перемещ атьс я вниз (ототрицательного к положительному полю с у, пос кольку молекулы Д Н К отрицательно з аря жены ) с о с коростью , з авис я щ ей от длины (мас с ы ) ф рагмента. Э то с вя з ано с тем, ч то в гелевой среде, с остоя щ ей из пор, молекулы Д Н К раз ного раз мера тратя т раз ное время на преодоление пор. Ч ем меньш е раз мер ф рагментов, тем б ы с трее они движутс я . В рез ультате э лектроф орез а в геле об раз уетс я ря д полос, рас положенны х одна под другой . В ерхние полос ы с оответс твую т ф рагментам, имею щ им б олее крупны е раз меры , а нижние – ф рагментам с б олее мелкими раз мерами. П олос ы вы я вля ю тс я при окраш ивании гелей б ромис ты м э тидием и прос мотре гелей в ультраф иолетовом с вете (рис унок 8). Ч тоб ы определить относ ительную молекуля рную мас с у раз деленны х ф рагментов, одновременно проводя т э лектроф орез маркерны х молекул с из вес тны ми молекуля рны ми мас с ами. Зная , какую мас с у имеет ф рагмент, с одержащ ий интерес ую щ ий нас ген, можно вы делить его из э лектроф оретич ес кого геля и ис польз овать по наз нач ению . 2. Е с ли единс твенны м “пас портом”ис комого гена с лужит его нуклеотидная пос ледовательнос ть, то поис к нужного генав с мес и ф рагментов Д Н К ос ущ ес твля ю тс помощ ью методагиб ридиз ации нуклеиновы х кис лот (так наз ы ваемой in situ – гиб ридиз ации). Д ля этого применя ю т м ол екуляр н ы езон ды . Зо н ды – это ис кус с твенно синтез ированны е меч ены е (из отопами или ф луорес центны ми крас ителя ми – химич ес ки) неб ольш ие (10-30 нуклеотидов) с егменты одноцепоч еч ной Д Н К (или РН К , или ее Д Н К копии), комплементарны е ис комому гену. Зонд – э то с интетич ес кий олигонуклеотид (короткий с егментодноцепоч еч ной Д Н К ) с из вес тной нуклеотидной пос ледовательнос тью , которы й ис польз уется для вы я вления комплементарны х пос ледовательнос тей с помощ ью гиб ридиз ации (т.е. зонды с лужат индикаторами гомологии при гиб ридиз ации с оответствую щ их пос ледовательнос тей ). Д ля ус пеха раб от по генетич ес кой инженерии важно, ч тоб ы кажды й конкретны й з онд представля л копии одной молекулы Д Н К с из вес тной пос ледовательнос тью нуклеотидов, а данны е по Д Н К гиб ридиз ации во всех лабор ат ор и ях м и р а можно б ы ло сравнивать между с об ой . Реакция гиб ридиз ации нуклеиновы х кис лот– ч увс твительны й метод вы я вления с пециф ич ес ких пос ледовательностей нуклеотидов. Г иб ридиз ация in situ – э то отжиг одноцепоч еч ного ф рагментаД Н К накомплементарны й ему уч ас ток другой молекулы Д Н К с об раз ованием двухцепоч еч ной гиб ридной молекулы . О тжиг – процес с вос с тановления (ренатурации) двухцепоч еч ны х молекул Д Н К из одиноч ны х полинуклеотидны х цепей путем пос тепенного охлаждения . П роцедура поис ка нужны х генов в б анке получ ила наз вание бл от т и н га (от англ. blotting - промокание). Бл от т и н г – э то метод перенес ения э лектроф оретич ес ких ф рагментов Д Н К нас пециальную пленку (мемб рану)

22

Рис унок8. С хемаб лоттингапо С ауз ерну: 1 – б уф ер; 2 – ватман; 3 – гель; 4 – нитроцеллю лоз ны й ф ильтр; 5 и 6 – ф ильтровальная б умага; 7 – с текло; 8 – груз (0,5 кг)

23

из нитроцеллю лоз ы , свя з ы ваю щ ую (иммоб илиз ую щ ую ) одноцепоч еч ны е молекулы Д Н К . С аузер н -блот т и н г (по ф амилии предложивш его его автора) ос нован на перемещ ении ф рагментов Д Н К б лагодаря капилля рному э ф ф екту. П роцес с переноса ф рагментов Д Н К , находя щ ихс я в агароз ном геле, на пленку из нитроцеллю лоз ы с помощ ью ф ильтровальной б умаги похож на промокание. Анализ проводя тс ледую щ им об раз ом (рис унок8). - В ы деленную , оч ищ енную , денатурированную и раз б итую на ф рагменты Д Н К помещ аю т на лист агароз ного геля , где происходит э лектроф оретич еское раз деление ф рагментов по мас с е и з аря ду. - Л ис т агароз ного геля , где произ ош ло э лектроф оретич еское ф ракционирование с мес и ф рагментов Д Н К по мас с е и з аря ду, помещ аю т на ф ильтровальную б умагу, с моч енную концентрированны м с олевы м (б уф ерны м) рас твором. - Затем на гель наклады ваю т нитроцеллю лоз ны й ф ильтр, где проис ходит иммоб илиз ация (или адс орб ция , или ф икс ация ) одноцепоч еч ны х ф рагментов Д Н К . - П оверх ф ильтранаклады ваю тс топку лис тов с ухой ф ильтровальной б умаги, которая об ес печ ивает медленны й ток б уф ерного рас твора ч ерез гель (т.е. с лужит с воеоб раз ны м капилля рны м нас осом). С олевой рас твор, проходя ч ерез агароз ны й гель, увлекаетз ас об ой ф рагменты Д Н К , которы е з адерживаю тс я нитроцеллю лоз ой , и с вя зы ваю тся с ней , арас твор впиты ваетс я с ухой ф ильтровальной б умагой . - Д алее Д Н К денатурирую т щ елоч ью , а ф ильтр вы держиваю т в вакууме при температуре 80 0С , в рез ультате ч его одноцепоч еч ны е ф рагменты Д Н К необ ратимо иммоб илиз ую тс я (ф икс ирую тс я ) нанитроцеллю лоз е. П ри э том рас положение полос иммоб илиз ованной Д Н К точ но соответс твуетих рас положению в геле. - Д Н К , с вя з анную с ф ильтром, помещ аю т в рас твор с меч ены м Д Н К з ондом, в котором и проис ходит гиб ридиз ация . Г иб ридиз ироватьс я (об раз овы вать водородны е с вя з и) со с пециф ич ес ким з ондом б удут только комплементарны е ему ф рагменты Д Н К , которы е можно об наружить в виде с ветлы х полос на рентгеновс кой пленке, т.е. радиоавтограф ии нитроцеллю лоз ного ф ильтра(рис унок8). Д ля вы деления и анализ а РН К (например, для вы я с нения того, прис утс твует ли в данном типе клеток мРН К , с ч итанны е с данного гена, т.е. экс прес с ируетс я ген или нет; для определения колич ес тва э той РН К и его из менения в раз витии данного типа клеток; для определения раз мера транс крипта какого-то гена и др.) применя етс я Н озер н -бл от ан ал и з, во многом похожий на С аузер н -блот т и н г. В данном с луч ае молекулы РН К , вы деленны е из клетки, раз деля ю тс я по раз мерам с помощ ью гельэ лектроф орез а, а з атем перенос я тс я на ф ильтр. П ос ле гиб ридиз ации с меч ены м одноцепоч еч ны м з ондом вы я вля ю тс я мес та гиб ридиз ации (гомологии) РН К и з онда.

24

3. Е с ли нуклеотидная пос ледовательнос ть искомого гена(или мРН К ) не из вес тна, но из вес тен б елок, с интез которого он контролирует, то то можно вы делить неб ольш ое колич ество ч ис того б елка, определить аминокис лотную пос ледовательнос ть некоторой его ч ас ти (достаточ но з нание 56 аминокис лотны х остатков). П ольз уя с ь таб лицей генетич ес кого кода, можно ус тановить вс е воз можны е пос ледовательнос ти нуклеотидов в том уч ас тке мРН К (или с амого гена), которы й кодирует данную аминокис лотную пос ледовательнос ть. В э том с луч ае можно с интез ировать з онд для поис канужны х клонов в б иб лиотеке генов. С ущ ес твую т и другие с пособ ы вы деления нужны х генов из клонотеки. 3. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я М И К РО О РГ А Н И ЗМ О В М етоды генной инженерии наиб олее детально раз раб отаны на микроорганиз мах. Н ач алом промы ш ленной генной инженерии микроорганиз мов приня то с ч итать 1980 г, когда в С Ш А б ы л вы дан первы й патент на генно-инженерны й ш тамм микроорганиз ма, с пособ ны й раз лагать неф ть. Е щ е ч ерез 2 годаб ы л раз реш ен для клинич ес кого ис польз ования получ енны й из б актерии первы й лекарственны й препарат– ч еловеч ес кий инс улин. Более 20 ф ирм Я понии и нес колько Американс ких ф ирм раз раб отали другой оч ень важны й медицинс кий препарат– интерф ерон, которы й э ф ф ективен при раз лич ны х вирус ны х з аб олевания х и з локач ес твенны х новооб раз ования х. В наш ей с тране Ю .А. О вч инников и В .Г . Д еб аб ов с сотрудниками получ или микроорганиз мы , э ф ф ективно с интез ирую щ ие интерф ерон ч еловека (до 5 мг интерф ерона на 1л с ус пенз ий б актерий , ч то в 5000 раз б ольш е, ч ем с одержитс я в 1 литре крови доноров). В С Ш А около 63% медицинс ких препаратов произ водитс я с помощ ью б иотехнологич еских методов, в с транах Западной Е вропы – 25%, в Я понии – 7%. П римером генной инженерии я вля етс я также получ ение б актерии Е. соli с о вс троенны м геном с оматотропина – гормона рос та ч еловека, которы й ис польз уется не только в медицинс ких целя х, но и в практич еском животноводс тве, повы ш ая с его помощ ью интенс ивнос ть рос таживотны х. В современной б иотехнологии ш ироко ис польз ую тс я транс генны е микроорганиз мы , продуцирую щ ие лекарс твенны е препараты : антиб иотики, гормоны , ф ерменты , витамины ; вакцины против инф екционны х з аб олеваний ; раз лич ны е диагнос тич еские препараты для диагнос тики нас ледс твенны х и инф екционны х б олез ней (например, В И Ч , вирус ного гепатита и др); для произ водс тванез аменимы х аминокис лот, б иодоб авок и др. 4. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я РА С Т Е Н И Й 4.1. Агробакт ери альная т рансф орм ац и я П римеры об разования транс генны х рас тений в природны х ус ловия х ш ироко извес тны .

25

О пухолевое з аб олевание, из вес тное как коронч аты й галл, опис ал ещ е Арис тотель. В 1907 г. Э . Cмити К . Т аунс енд показ али, ч то э то з аб олевание вы з ы вает поч венная б актерия Agrobacterium tumefaciens. В ы деленная в ч ис той культуре, э та б актерия может приводить к об раз ованию опухолей (как правило, у корневой ш ей ки) у многих голосеменны х и покры тос еменны х рас тений , ч то по с ущ ес тву можетрас с матриватьс я как природная генно-инженерная с ис тема(рис унок9). В 70-х годах Д ж. Ш елл и др. вы я вили, ч то прич иной опухолеоб разования я вля ю тс я так наз ы ваемы е Ti-плаз миды (от англ. tumor inducing- индуцирую щ ая опухоль), об наруженны е в клетках некоторы х ш таммов A. tumefaciens. Ti-плаз мида проникает из клетки б актерии в растение и ч ас ть ее, наз ы ваемая Т -Д Н К (от англ. transferred DNA- перенос я щ ая с я ), ковалентно вс траиваетс я в хромос омы инф ицируемого рас тения . В природе э тот ф рагмент перенос ит гены , которы е с пос об с твую т раз множению агроб актерий и даю тим воз можнос ть параз итировать напораженном рас тении. Г ены , входя щ ие в сос тав T-Д Н К , ф ункционирую т лиш ь пос ле их перенос а в растительную клетку. Будуч и интегрированной с хромосомой , Т Д Н К индуцирует в мес те з аражения неконтролируемы й рос т недиф ф еренцированны х клеток, вы з ы вая об разование опухоли (коронч аты х галлов, напоминаю щ их раковы е клетки животны х), гиперпродукцию ф итогормонов: цитокининов и индолилукс ус ной кис лоты - И У К (аукс ина), а также с интез ря да произ водны х аминокис лот, об ъ единенны х под об щ им термином оп и н ы , которы х нетв з доровы х клетках ни у одного растения . П ри культивировании в ус ловия х in vitro клетки опухоли могутрас ти в отс утс твие с пециальны х гормонов (аукс инов/цитокининов), необ ходимы х для культивирования нормальны х растительны х клеток, пос кольку э ти гормоны клетки опухоли с интез ирую т с ами. О пухоль воз никает вс ледствие наруш ения б аланс а ф итогормонов, от которого з авис ит нормальны й морф огенез рас тения . Т .е. э то рез ультатф ункционирования онкогенов, продуктами которы х я вля ю тс я ф итогормоны (аукс ины и цитокинины ). О пины , вы деля емы е клетками опухоли, б актерия ис польз уетв кач ес тве ис точ ников углеродаи аз отадля с воего рос таи размножения . С амаб актерия в клетку не проникает, а ос тается в межклеточ ном прос транстве и ис польз ует клетки со вс троенной T-Д Н К как ф аб рику, продуцирую щ ую опины . Ti-плаз мидаотнос итс я к клас с у конъ ю гативны х плаз мид. Д оказ ательс твом того, ч то именно Ti-плаз миды , а не гены хромосомы б актерии ответс твенны з а поддержание транс ф ормированного с ос тоя ния клеток коронч аты х галлов, я вля етс я то, ч то ес ли б ы агроб актерии содержали мутантны е Ti-плаз миды , не проис ходило б ы ни з аражения , ни об раз ования коронч аты х галлов, ни с интезаопинов. Ti-плаз миды рас с матриваю тс я как природны е векторы , пос кольку могут передаватьс я от б актерии в клетки рас тений в природны х ус ловия х. Т .е. вз аимоотнош ения б актерий с рас тения ми предс тавля ю т особ ы й вид параз итиз ма, когда б актерия не просто ис польз ует питательны е вещ ества рас тения -хоз я ина, а з ас тавля ет рас тительны е клетки из менить с вой мета -

Рис унок9. “Г енетич ес кая колониз ация ”вы с ш его рас тения б актерией A. tumefaciens (П ируз я н, 1988). A. tumefaciens с ущ ес твуетв риз ос ф ере рас тения . В клетках б актерии наря ду с хромос омой с одержится Ti – плаз мида, которая проникаетв клетку растения и ч асть ее, T-Д Н К , встраиваетс я в геном рас тения, приводя к об раз ованию опухоли и с интез у опинов

27

б олиз м и с интез ировать те вещ ества (опины ), которы е необ ходимы агроб актерия м. Т акие отнош ения A. tumefaciens и рас тения Ш елл наз вал генетич ес кой колониз ацией , которая предс тавля ет соб ой экс перимент по генной инженерии, пос тавленны й с амой природой . Ti-плаз мидаоказ алась идеальны м природны м вектором для введения ч ужеродны х генов в клетки рас тения . Н аее ос нове в ус ловия х э кс перимента с оз даю тс я ис кус с твенны е векторы . Д ля э того генетич ес кую конструкцию , содержащ ую ген, намеч енны й для перенос а, вс траиваю т в T-Д Н К (рис унок10).

Рис унок 10. С хемаагроб актериальной транс ф ормации растительной клетки [Alberts,1994]: О б лас ть T-Д Н К, содержащ ая транс ген (это, например, можетб ы ть ген ус той ч ивос ти к герб ицидам, или вредны м нас екомы м и др.), маркерны й ген (например, ген ус той ч ивос ти к антиб иотику канамицину) и все необ ходимы е регуля торны е пос ледовательнос ти и сай ты рес трикции, вы рез аетс я из рекомб инантной Ti-плаз миды агроб актерии, переноситс я в рас тительную клетку, где вс траиваетс я в хромосому рас тения .

Ч то предс тавля етсоб ой об лас ть T-Д Н К ? Раз мер вс ей Ti-плаз миды с оставля ет 200-250 тпн, раз мер T-Д Н К в раз ны х плаз мидах варьирует от 10 до 30 тпн (ч то сос тавля ет примерно 10% Ti-плаз миды ). Н аT-об лас ти картировано не менее 7 генов, кажды й из которы х регулируетс я соб ственны м промотором (ч то с ходно с генами э укариот). Э ти гены отвеч аю т з а с интез опинов (тип которы х, например, нопалин, октопин, агроцинопин, манопин з авис ит от ш тамма агроб актерии, вы з ы ваю щ его его об раз ование) и подавление диф ф еренцировки клеток (онкогены ) – подавление об раз ования корней и поб егов. Э ти гены ф ункционирую т лиш ь пос ле их перенос а в рас тительную клетку. С концов TД Н К огранич енаправы м и левы м пря мы ми повторами из 25 пн, ч то придаетей сходс тво с моб ильны ми генетич ескими э лементами (рис унок11). П о-

28

э тому лю б ая Д Н К , вставленная между э тими повторами, б удет приня та з а T-Д Н К и перенес енав рас тительную клетку. В ажно отметить, ч то вс е гены (их около 35), ответс твенны е з а перенос и интеграцию T-Д Н К , находя тся не в T-Д Н К , ав об лас ти вирулентнос ти (vir-об лас ть), рис унок11.

Рис унок11. Г енетич ес кая картаTi-плаз миды октопинового типа T-Д Н К (трансф ормирую щ ая Д Н К ) содержит гены ауксина (aux), цитокинина (cyt) и опина (ocs), которы е транскриб ирую тс я и транслирую тс я только в растительны х клетках; vir-об лас ть, с одержащ ая гены , продукты которы х об ес печ иваю твы рез ание и перенос Т -Д Н К в рас тительную клетку; tra-об лас ть, где локализ ованы гены , контролирую щ ие конъ ю гацию б актерий ; ori – сай тинициации репликации, об еспеч иваю щ ий репликацию и с таб ильное поддержание плаз миды в A. tumefaciens; occ – гены , кодирую щ ие ф ерменты катаб олиз маопина; L и R – левая и правая ф ланкирую щ ие пос ледовательнос ти T-Д Н К с оответс твенно.

О днако практич ес кое ис пользование природны х Ti-плаз мид как векторов для перенос а генетич еской инф ормации в растительны е клетки и клонирования генов з атруднено из -з аее б ольш их раз меров (до 250 тпн, тогда как для прокариот вектор pBR322 имеет раз меры вс его 4,4 тпн). У ч ены ми б ы ли раз раб отаны раз лич ны е с тратегии введения ч ужеродны х генов в сос тав T-Д Н К , одна из которы х, наш едш ая ш ирокое применение, – с оз дание б инарной векторной с истемы . В э том с луч ае конс труирую т два вектора, совмес тно вз аимодей с твую щ ие друг с другом, один из которы х с одержит об лас ть T-Д Н К , а другой – гены vir-об лас ти, об ес печ иваю щ ие вс е ф ункции перенос а T-Д Н К в геном рас тительны х клеток. Т ранс гены , кодирую щ ие хоз я й с твенно ценны е приз наки, встраиваю т в T-Д Н К (рис унок 11). Э та же об лас ть с наб жаетс я маркерны ми генами (для отб оратранс ф ормированны х рас тительны х клеток), э укариотич еским промотором (уз наваемы м растительны ми полимераз ами, например 35S-промотор вирус амоз аики цветной капус ты - CAMV) и уникальны ми с ай тами рес трикции (в ко-

29

торы е вс траиваю тс я ч ужеродны е ф рагменты Д Н К ). П рич ем, гены , подавля ю щ ие диф ф еренцировку рас тительны х клеток и вы з ы ваю щ ие раз витие опухоли (онкогены ), инактивирую тс я или вы рез аю тс я , вс ледс твие ч его рос т транс ф ормированны х растений не наруш аетс я . Т аким об разом, плаз мидаи агроб актерия нач али раб отать наполуч ение транс генны х рас тений . В пос ледние годы для с оз дания ис кус ственны х векторов ис польз уетс я Ri-плаз мида (от англ. root inducing – индуцирую щ ая корни), прис утс твую щ ая в ш таммах Agrobacterium rhizogenes. Ri-плаз миды вы годно отлич аю тс я от Ti-плаз мид тем, ч то они я вля ю тс я ес тес твенны ми б ез вредны ми векторами, т.е. пос ле встраивания T-Д Н К в хромосомную Д Н К рас тительны х клеток в об лас ти з аражения наб лю даетс я ус иленное об раз ование кореш ков (“б ородатость”), из которы х легч е регенерировать з доровы е плодовиты е рас тения , ч ем из недиф ф еренцированной ткани опухоли. К ак на практике ос ущ ес твля ю т генетич ескую транс ф ормацию рас тительны х клеток? Н еоб ходимы м ус ловием для инф екции Ti-плаз миды я вля етс я поранение рас тения . П оэ тому агроб актерии, содержащ ие рекомб инантны е плаз миды , нанос я т на срез анную ч асть растения (например, поб ег) или ос ущ ествля ю т с овмес тное культивирование (кокультивирование) агроб актерий и с терильного рас тительного материала (например, с егментов междоуз лий , лис товы х дисков, протоплас тов) напитательны х с редах в ус ловия х in vitro. Н а рис унке 12 приведен типич ны й пример получ ения транс генного растения таб ака путем агроб актериальной транс ф ормации лис товы х дис ков. О днако, несмотря на э ф ф ективнос ть агроб актериальной транс ф ормации, круг хоз я ев агроб актерий огранич ен. Агроб актерии об ладаю т с пос об нос тью интегрировать с вой генетич ес кий материал преимущ ественно в клетки двудольны х рас тений . Альтернативны ми с пос об ами преодоления проб лемы огранич енного круга растений , ч увс твительны х к трас ф ормации, я вля ю тс я методы пря мого перенос а ч ужеродной Д Н К - микроинъ екция , э лектропорация , б омб ардировка микропуля ми (один из с амы х э ф ф ективны х методов для транс ф ормации однодольны х рас тений ) и др. 4.2. В ект оры на основе хлороп ласт ной и м и т охондри альной Д Н К Н е менее перс пективны м для с оз дания векторов я вля етс я ис пользование хлороплас тной (хп) и митохондриальной (мт) Д Н К (т.е. внея дерной , цитоплаз матич еской Д Н К ). Э то с вя з ано с тем, ч то рас тительная клетка может с одержать б ольш ое колич ес тво копий (до 50 ты с .) хп Д Н К или мт Д Н К . П оэ тому перенос ч ужеродны х генов в их с оставе приведетк накоплению б ольш ого колич ес тваб елкового продуктапо сравнению с ф ункционированием э того же гена в с ос таве я дерной Д Н К . К роме того, для б ольш инс тва видов растений с ущ ес твует материнс кое нас ледование цитоплаз матич ес ких генов. П оэ тому ис польз ование генетич ес ких конс трукций на ос нове хпД Н К или мтД Н К ис клю ч ает воз можность прис утс твия в пы льце ч ужеродны х генов и огранич иваетих неконтролируемое рас пространение

30

Рис унок 12. Э тапы получ ения транс генны х растений таб акапутем агроб актериальной транс ф ормации лис товы х дис ков [Alberts,1994]: 1 – из лис татаб акавы рез аю тдиски, которы е помещ аю тв ч аш ки П етри со специальной питательной с редой ; 2 – листовы е диски инкуб ирую т с агроб актерия ми, с одержащ ими рекомб инантны е плазмиды с транс геном; 3 – отб ор транс ф ормантов (вклю ч ивш их в свой геном транс ген) на селективной среде и индукция каллус а(ткани, с ос тоящ ей из активно делящ ихс я недиф ф еренцированны х = дедиф ф еренцированны х клеток); 4 – 5 – регенерация целого рас тения из каллус а лис товы х дис ков: при перенос е каллусной ткани на морф огенную с реду, проис ходитоб разование поб егов (4), а при переносе последних насреду для укоренения раз виваю тс я корни (5); 6 – проб ироч ное рас тение с корня ми перенося т в поч ву, оно содержиттранс ген, придаю щ ий растению новы й приз нак.

(например, генов ус той ч ивос ти к герб ицидам от культурны х рас тений к с орня кам с помощ ью пы льцы ). Т .е. рас тения , получ енны е с их ис польз ованием, б олее б езопас ны для окружаю щ ей с реды по с равнению с об ы ч ны ми транс генны ми рас тения ми. Рас с мотрим преимущ ес тва и особ еннос ти с оздания векторов на ос нове хпД Н К. П ластиды находя тс я в б ольш ом колич ес тве в раз ны х органах и тканя х рас тений . Г еном плас тид (п л аст ом ) – кольцевая молекула двухцепоч еч ной Д Н К раз мером 120-180 тпн. В каждой плас тиде с одержитс я от 10 до 100 пластом. Е динич ная клетка лис та может содержать до 100 плас тид, ас ледовательно, до 10 ты с плас тидны х геномов. В с ос тав кольцевы х молекул входя т гены рРН К и тРН К , а также гены , продукты которы х необ ходимы для ф ункционирования хлороплас тов. Репликация и транскрипция хлоропластного генома ос ущ ес твля етс я автономно от я дерного, ч то дает воз можнос ть ис польз овать хпД Н К в кач ес тве вектора.

31

Е с ли же “с ш ить”б актериальную плаз миду с ф рагментом Д Н К хлороплас та, с одержащ им уч ас тки нач ала репликации, а также уч ас тки инициации и терминации транс крипции, то можно получ ить ч елноч ны й вектор, с пос об ны й реплицироватьс я в прокариотич ес ких клетках и клетках э укариот. П ри проникновении рекомб инантной плаз миды в хлороплас ты (например, при б омб ардировке микропуля ми об раз цов лис та) происходит не только ее репликация , но и экс пресс ия ч ужеродной генетич еской инф ормации. Рас тения , с одержащ ие транс генны е плас томы , наз ы ваю т т р ан сп ласт ом н ы м и (transplastomic). В ажны м отлич ием таких рас тений отклас с ич ес ких транс генны х я вля етс я то, ч то при п л аст и дн ой т р ан сфор м ац и и п о л учаю т клон ы со вст р ойкой т р ан сген а в о дн о и т о ж е м ест о хп ДН К, т .е. и ден т и чн ы е. П ри вс трой ке в я дерны е хромос омы в рез ультате агроб актериальной трансф ормации вс е клоны отлич аю тс я друг от друга по мес ту вс трой ки транс гена, а с ледовательно, и по с тепени его э кс прес с ии. П ос кольку интеграция ч ужеродной Д Н К в плас том происходит в рез ультате гомологич ной рекомб инации, отоб ранны е клоны одинаковы и в них от сут ст вует эф ф ект п ол ож ен и я ген а, характерны й для с луч ай ной вс трой ки транс генапри я дерной трансф ормации растений . В плас тидах не наб лю даетс я сайл ен си н г транс гена (“з амолкание”генов), поэ тому его э кс пресс ия с таб ильно сохраня етс я в пос ледую щ их поколения х. Т ак, в 2001 г. Х . Д аниэ л с с отрудниками с оз дали векторную конструкцию , в которую вс троили транс ген с уб ъ единицы B холерного токс ина (ген CTB). Белок CT-B э ф ф ективно синтез ировалс я в транс плас томны х рас тения х таб ака, с об иралс я в ф ункциональны е олигомеры и б ы л антигенно идентич ен оч ищ енному природному CT-B. Д анны й ч ужеродны й б елок накапливалс я в лис тья х таб ака до уровня 4,1% с уммарного рас творимого б елка, ч то в 400 раз б ольш е продуктивнос ти, дос тигнутой при интеграции транс гена в э дерны й геном этих рас тений . П одоб ны м об раз ом в лаб оратории М алига (1995 г.) б ы ли получ ены транс плас томны е рас тения таб ака, э ф ф ективно экс прес с ирую щ ие ген cry2Aa2 и накапливаю щ ие в хлороплас тах инс ектицидны й токс ин Bt, ч то делает такие растения ус той ч ивы ми к вредны м нас екомы м. 4.3. П реи м ущ ест ва и т рудност и и сп ользовани я раст ени й как объект а для генно-и нж енерны х и сследовани й В ажны м преимущ ес твом рас тений по с равнению с животны ми я вля етс я с пос об нос ть их клеток и протоплас тов при налич ии подходя щ их ус ловий в культуре in vitro раз виватьс я (регенерировать) в целое ф ертильное рас тение - тотипотентнос ть. Т .е. для транс ф ормации можно ис польз овать практич ес ки лю б ую ч ас ть рас тения . Э то свой с тво тотипотентнос ти с оматич ес ких клеток ис польз уетс я для получ ения транс генны х растений , откры вает воз можнос ть для из уч ения ф ункционирования генов, внедренны х в растения , а также для ис польз ования их в с елекции. Т аким об разом, методология генной инженерии в отнош ении рас тений направлена на корен-

32

ное из менение методов традиционной с елекции тем, ч тоб ы желаемы е приз наки рас тений можно б ы ло получ ать путем пря мого введения в них с оответс твую щ их генов вмес то длительной раб оты по с крещ иванию . К ч ис лу с ущ ес твенны х труднос тей генно-инженерны х раб отс рас тения ми относ итс я то об с тоя тельс тво, ч то многие хоз я й с твенно ценны е приз наки имею т полигенны й характер нас ледования , т.е. контролирую тс я не одним, а многими генами. К роме того, геном растений из уч ен хуже, ч ем геном млекопитаю щ их. Э то с вя з ано: 1) с огромны ми раз мерами геномов многих растений (дес я тки и даже с отни млрд. пн); 2) их ч резвы ч ай ной об огащ еннос тью некодирую щ ими, т.е. не с одержащ ими с труктурны е гены , уч ас тками Д Н К (доля из б ы точ ной Д Н К может дос тигать 90 и даже 99% и с реди этих пос ледовательнос тей надо най ти ф ункциональны е уч ас тки – гены ); 3) б ольш им ч ис лом полиплоидны х ф орм (с одержащ их б олее двух геномов на клетку), с реди которы х много аллополиплоидов (имею щ их в я дре нес кольких б лиз ких, но не идентич ны х геномов). Н апример, у ч еловека(2n=46) – 3,2 млрд пн, ау мя гкой (гекс аплоидной ) пш еницы (Triticum aestivum, 2n=6x=42) – в 5 раз б ольш е (≈16 млрд пн), у лилей ны х (Lilium) – в 10 раз б ольш е (50-60 млрд пн), с ос ны (Pinus sylvestris, 2n=2x=24) – в 20 раз б ольш е (≈68 млрд.пн). М ногие виды рас тений имею т мелкие хромосомы (длина хромосом не превы ш ает 3 мкм), а для некоторы х видов до с их пор не ус тановлено точ ное ч ис ло хромос ом. Н ес мотря на указ анны е труднос ти, к нас тоя щ ему времени (в 2002 г.) полностью рас ш иф рован (с еквенирован) геном араб идопс ис а (Arabidopsis thaliana – горч ица малая , или рез уш ка Т аля , 2n=2x=10) двудольного рас тения с маленьким геномом – 125 млн пн, 25 ты с генов и в 2003г. - геномарис а (Oryza sativa, 2n=2x=24) – однодольного рас тения , имею щ его также неб ольш ой геном - 430 млн пн. Араб идопс ис не имеетникакого хоз я й с твенного з нач ения . Н о э то удоб ны й модельны й об ъ ект для генетиков. Е го геном ис польз уетс я в кач ес тве “б аз ового”или “с правоч ного”генома для из уч ения и анализ а геномов других рас тений (с равнительная геномика), а также как донор генов для генноинженерны х раб от. Т екс т каждого из генов и их рас положение на хромос омах с тали дос тупны лю б ому ис с ледователю , ч ей компью тер подклю ч ен к И нтернету. С э той же целью применя ю тс я и сведения о важной продовольс твенной культуре – рис е, я вля ю щ емс я ос новны м ис точ ником пищ и для половины ч еловеч ества. Д оля из вестны х генов в геноме рас тений оч ень мала, поэтому получ ение каждого транс генного растения – рез ультатогромного труда. 4.4. Д ост и ж ени я и п ерсп ект и вы генной и нж енери и раст ени й В нас тоя щ ее время с помощ ью методов генной инженерии в рас тения привнес ены гены , контролирую щ ие многие хоз я й с твенно ценны е приз наки. К их ч ис лу относ я тс я : ус той ч ивос ть к герб ицидам, нас екомы м, вирус ам, б актериальны м и гриб ковы м з аб олевания м, аб иотич еским стрес с ам, с пособ нос ть к длительному хранению ; мужс кой с терильнос ти, модиф икация з апас ны х б елков и вторич ны х метаб олитов, получ ение б елков живот-

33

ного происхождения и вакцин, из менение окраски цветков у декоративны х рас тений . П олуч енны е транс генны е рас тения можно з атем скрещ ивать между с об ой и получ ать гиб риды с двумя и б олее ч ужеродны ми генами. Э то поз воля ет реш ать ш ирокий круг проб лем, об ес печ ивая б ольш ую экономич ескую вы году. О с тановимс я на некоторы х рез ультатах генно-инженерного улуч ш ения рас тений . У ст ойч и вост ь к насеком ы м . Д авно из вес тна тю рингс кая б актерия Bacillus thuringiensis (Bt), продуцирую щ ая б елок, которы й оч ень токс ич ен для многих видов нас екомы х и в то же время б ез опас ен для млекопитаю щ их. Э тот протокс ин (cry-б елок, гены которого локализованы на плаз мидах) в киш еч нике нас екомы х протеолитич ес ки рас щ епля етс я и превращ аетс я в токс ин (дельта-токс ин), уб ивая их. Активированны й токс ин с пециф ич но с вя з ы ваетс я с рецепторами в с редней киш ке нас екомы х, ч то приводит к лиз ис у клеток киш еч ного э пителия . В з аимодей ствие токс ина с рецепторами нас екомого с трого с пециф ич но. В природе най дено б ольш ое колич ес тво ш таммов B. thuringiensis, ч ьи токис ины дей с твую т только на определенны е виды нас екомы х (например, дей с твую тнажуков и не дей ствую т на б аб оч ек и пч ел). Bt-протеин не представля ет угроз ы для теплокровны х животны х и ч еловека, пос кольку у них другие протеолитич ес кие ф ерменты и пищ еварительны й тракт ус троен инач е, ч ем у нас екомы х. Более того, Bt-протеин – вес ьманес той кий б елок, которы й легко денатурирует при нагревании, в кис лой с реде желудка, б ы с тро перевариваетс я желудоч ны ми с оком. В с траивание гена э того б елка в геном рас тений (таб ак, томаты , хлопч атник, кукуруз а, рис , рапс , тополь и др.) дало воз можнос ть получ ить транс генны е рас тения (Bt-рас тения ), не поедаемы е насекомы ми. Э то поз волило отказ атьс я от инс ектицидов. С оз дание транс генного картоф еля , ус той ч ивого к колорадс кому жуку, потреб овало от Американс кой компании «Monsanto» 10 лет. В С еверной Америке картоф ель с вс троенны м геном cry IIIA (с токс ич ны ми для колорадс кого жука свой ствами) получ ил ш ирокое рас прос транение. В нас тоя щ ее время полевы е ис пы тания транс генного картоф еля проводя тс я в Рос с ии. О пы тная пос адка его в откры ты й грунт на изолированны х уч ас тках б ы ла с огласована с М инз дравом, М инс ельхоз ом, Г оскомитетом по охране окружаю щ ей с реды и РАН . У ст ойч и вост ь к герби ц и дам . В б орьб е с с орня ками ис польз ую т химич еские с оединения – герб ициды . О днако многие из них не об ладаю т с елективны м дей ствием, токс ич ны , проя вля ю т мутагенны й э ф ф екти накапливаю тс я в растения х и в поч ве. П утем введения в геном ря дас ортов кукуруз ы , хлопч атника, сои и др. культур генов, об ес печ иваю щ их разруш ение или дез активацию герб ицидов либ о кодирую щ их неч увс твительны е к данному клас с у герб ицидов ф ерменты -миш ени, получ ены транс генны е рас тения , генетич ески ус той ч ивы е к глиф ос ату (коммерч еское наз вание Roundup), глю ф оз инату аммония и др. П олевы е ис пы тания показ али, ч то

34

герб ициды не воз дей ствую т на транс генны е рас тения (они не погиб аю т и с охраня ю тсвои с ортовы е ос об енности), тогдакак сорня ки унич тожаю тс я . С реди вс ех транс генны х культур герб ицидоус той ч ивы е ф ормы с ос тавля ю тподавля ю щ ее б ольш инс тво. Т ак, в 2003 г. в мире под ними б ы ло з аня то 73% площ ади, з ас ея нной генно-инженерны ми с ортами, или 49,7 млн. га. Л идером с реди вс ех транс генны х культур я вля етс я с оя , ус той ч ивая к герб ициду глиф ос ату. Г лиф ос ат(коммерч ес кое название Roundup) относ итс я к герб ицидам нового поколения , для которы х характерна относ ительная б ез опас нос ть для з доровья ч еловека и окружаю щ ей среды . “М иш енью ”глиф ос ата (т.е. ф ерментом, с которы м с вя з ы ваетс я герб ицид) у рас тений я вля етс я ф ермент 5-э нолпирувилш икимат-3-ф осф ат с интетаз а (EPSPS), играю щ ий важную роль в с интез е ароматич еских аминокис лот (тироз ина, ф енилаланина и триптоф ана). П од дей с твием герб ицида у неус той ч ивы х к нему растений наб лю даю тс я с имптомы азотного голодания (из -з а недос татка наз ванны х аминокис лот) и они погиб аю тв теч ение двух недель. П утем перенос а гена cp4 (ген, кодирую щ ий EPSPS и нес ущ ий точ ковую мутацию - “мутацию миш ени”) от поч венной б актерии A. tumefaciens в геном рас тений , б ы ло из менено с родс тво герб ицида с его ф ерментом-миш енью . В рез ультате герб ицид “не уз нает”с вою миш ень, ф ермент сохраня ет активнос ть, а рас тение с тановится ус той ч ивы м к его дей с твию . И менно таким с пос об ом в 1977 г. б ы л получ ен с ортс ои, ус той ч ивы й к Roundup, приз нанны й в С Ш А с ельс кохоз я й с твенны м продуктом года. П рич ем, в получ енной транс генной с ое отс утс твую т с елективны е гены ус той ч ивос ти к антиб иотикам, пос кольку с ам ген ус той ч ивос ти к глиф ос ату можно ис польз овать в кач естве с елективного. Регуляц и я сроков созревани я и хранени я п лодов. С помощ ью генноинженерного подхода можно не только вводить в организ м новы й ч ужеродны й ген, но и з аб локировать (провес ти “адрес ное”раз руш ение), ос лаб ить (или, наоб оротус илить) дей с твие природного гена. Н апример, плоды томата во время соз ревания с одержат з нач ительное колич ес тво с пециального б елка-ф ермента PG (полигалактуроназ ы ), придаю щ его плодам ры хлос ть. Э тотф ерментуч ас твуетв разруш ении пектина – ос новного компонента межклеточ ного пространс тва растительны х тканей . П родуктгена PG с интез ируетс я в период созревания плодов томатов, а увелич ение его колич ес тва приводит к тому, ч то плоды пос тепенно теря ю тупругос ть, с тановя тс я б олее мя гкими и з агниваю т, ч то з нач ительно с окращ ает срок их хранения . Д ля ус транения э того б елка (с целью увелич ения с роков хранения томатов) проводя т отклю ч ение гена PG путем вс траивания в геном томатов антис мы с ловой конс трукции по отнош ению к э тому гену (с одержащ ей перевернутую копию гена). В рез ультате транс крипции получ аетс я антис мы с ловая (перевернутая ) мРН К (так наз ы ваемая ас РН К ), которая комплементарно свя з ы ваетс я с нормальной (с мы с ловой ) мРН К . О б раз уетс я молекула двухцепоч еч ной РН К (дуплекс ), которая уже не может с лужить матрицей для с интез а б елка. С помощ ью этого подхода

35

получ ены первы е коммерч ес кие рас тения томатаFlavr Savr, отлич аю щ иес я пониженной деполимериз ацией пектина клеточ ной с тенки плодов, в рез ультате ч его они дольш е хранилис ь, с охраня я товарны е и пищ евы е кач ес тва з релы х плодов, а с ами рас тения б ы ли б олее ус той ч ивы к гриб ковы м з аб олевания м. Э тотже подход интерес ен и в цветоводс тве для длительного хранения с рез анны х цветов. Т акой же подход применя ю т для регулирования с роков с озревания томатов, ав кач ес тве миш ени в э том с луч ае ис польз ую тген EFE (ethyleneforming enzyme), продуктом которого я вля етс я ф ермент, уч ас твую щ ий в б иос интез е э тилена. Э тилен – это газ ооб раз ны й гормон, одна из ф ункций которого – контроль з апроцес с ом соз ревания плодов. П овы ш ени е урож айност и , регуляц и я скорост и рост а. С помощ ью генной инженерии можно повы ш ать и урожай нос ть с ельс кохоз я й с твенны х культур, нес мотря на то ч то этот приз нак я вля етс я полигенны м. Т ем не менее, можно най ти и применить отдельны е гены , продукты которы х поз воля ю т с ущ ественно ус илить процес с ы рос та и в итоге повы с ить продуктивнос ть рас тения . Т ак, встраивание в геном картоф еля гена ф итохрома B от араб идопс ис а приводило к повы ш ению интенс ивнос ти ф отос интез а и увелич ению урожая клуб ней . П о данны м рос с ий с ких уч ены х (Р.К . С аля ев и др.) из И ркутс кого универс итета, перенос в геном картоф еля гена, кодирую щ его об раз ование ф ермента У Д Ф Г транс ф ераз ы соз реваю щ его з ерна кукуруз ы , с опровождалс я ус илением б иос интез а рос товы х ф итогормонов. Э то поз волило повы с ить урожай клуб ней в 2 раз а, уровень с ухих вещ ес тв в клуб ня х до 27% (у об ы ч ны х с ортов менее 20%), аскорб иновой кис лоты до 9%. Разрез анны е клуб ни не темнели навоздухе. Э тими же уч ены ми б ы ли получ ены б ы с трорас тущ ие транс генны е рас тения ос ины путем введения в них гена ugt из кукуруз ы и acbp302 из араб идопс ис а. П родукты э тих генов влия ю т на скорос ть рос та рас тений ч ерез из менение их гормонального (аукс инового) с татус а. С помощ ью генной инженерии можно доб итьс я п овы ш ен и я качест вен н ы х и п от р еби т ел ь ски х свойст в с ельс кохоз я й с твенной продукции. В едутс я раб оты и получ ены об надеживаю щ ие рез ультаты по с оз данию коф е б ез коф еина, таб акаб ез никотина(полагаю т, ч то курение с игаретиз такого таб ака б удет менее вредны м для з доровья ), арахис а, не с одержащ его характерны х для него аллергенов. В ш лиф ованном рис е, я вля ю щ емс я ос новны м ис точ ником пищ и в ря де тропич еских с тран с многоч ис ленны м нас елением, отс утствует провитамин А (β-каротин). Э то приводит к деф ициту витамина А и с пос об с твует раз витию раз лич ны х з аб олеваний (например, к ухудш ению зрения ), ос об енно у детей . Ш вей царским уч ены м удалос ь раз раб отать генноинженерны й подход с оз дания так наз ы ваемого “зол от ого”р и са. О ни перенес ли в геном рис а генетич ес кую конс трукцию , с одержащ ую сраз у три гена от раз ны х организ мов, необ ходимы х для б иос интез а β-каротина: гены

36

ф итоендес атураз ы и ликопин β-циклаз ы от нарцис с а и ген каротиндес атураз ы отб актерии. Зернатранс генного рис анакапливали в э ндос перме провитамин А в достаточ ном колич ес тве и б ы ли окраш ены в з олотис ты й цвет. В едутс я раб оты по с оз данию транс генны х рас тений лес ны х древес ны х пород с пониженны м с одержанием лигнина. В с оз дании низ колигниновы х деревьев з аинтересована целлю лоз но - б умажная промы ш ленность, т. к. лигнин, которы й с ос тавля ет 15-35% от с ухого вещ ес тва в древес ине при произ водс тве б умаги – “лиш ний ”компонент, аего удаление – дорогос тоя щ ий и э кологич ес ки опас ны й процес с . У ст ойч и вост ь к аби от и ч ески м ст рессам . В с вя з и с раз витием индус триальны х технологий во многих раз виты х с транах мира актуальной с тала раз раб откаметодов, позволя ю щ их вес ти хоз я й ство в ус ловия х вы сокого техногенного з агря з нения окружаю щ ей с реды . О днаиз проб лем – вс е б ольш ее повы ш ение концентрации тя желы х металлов в поч ве. О дин из генно-инженерны х подходов для реш ения э той проб лемы – клонирование и вс траивание в геном рас тений гена, кодирую щ его б елок животного проис хождения – металлотионеина, с пос об ного с вя з ы вать многие тя желы е металлы . В ы делен ген, продукткоторого с вя з ы ваеткадмий . В ажны м направлением генной инженерии я вля етс я с елекция с ортов, ус той ч ивы х к з ас ухе, жаре, повы ш енному з ас олению поч вы . П ос кольку вс е э ти с трес с овы е ф акторы относя тс я краз ря ду ос мотич ес ких, то подходы по вс ем э тим направления м об щ ие. И детраб отанад вы я влением, клонированием и переносом в рас тения транс генов, кодирую щ их об раз ование раз лич ны х ос мопротекторов (ионов протеинов, аминокис лот, с ахаров, полиаминов), регулирую щ их содержание ненас ы щ енны х жирны х кис лот в мемб ранах клеток и т.д. И с с ледования показ али, ч то некоторы е рас тения , в ч ас тности таб ак и томаты , не накапливаю т глицинб етаин (ос мопротектор) и поэ тому вы сокоч увствительны к солевому ш оку. Г . Д жиа с с оавторами в 2002 г. получ ил транс генны е томаты , экс прес с ирую щ ие б етаинальгиддегидрогеназ у (БАД , уч ас твую щ ий в б иос интез е глицинб етаина) леб еды Atriplex hortensis и проя вля ю щ ие дос таточ но вы сокую ус той ч ивос ть к солевому с трес с у. И зм енени е окраски у декорат и вных раст ени й. Г олландс кие уч ены е с оз дали сортголуб ы х (с иних) роз, перенес я в них ген из дельф иниума. Э тот ген контролирует с интез голуб ого пигмента. П олуч ены и ис пы ты ваю тс я транс генны е растения хлопка с окраш енны м волокном. П редполагаетс я , ч то в б удущ ем натуральное хлопковое волокно с танет крепч е, не б удетни мя тьс я , ни с адитьс я и б удетиметь раз лич ную окрас ку б ез ис польз ования химич ес ких крас ителей . М ет аболи ч еская и нж енери я. Н ы неш ний э тап раз вития генетич ес кой инженерии рас тений получ ил наз вание “метаб олич ес кая инженерия ” . П ри этом с тавитс я з адач ане только улуч ш ить те или ины е имею щ иес я кач ес тва растения , как при традиционной с елекции, с колько науч ить рас тение произ водить с оверш енно новы е соединения , ис польз уемы е в медицине, химич ес ком произ водс тве и других об лас тя х. Э тими соединения ми мо-

37

гутб ы ть, например, особ ы е жирны е кислоты , б елки с вы с оким содержанием нез аменимы х аминокис лот, с ъ едоб ны е вакцины и др. Раст ени я – ф абри ка белков. Рас тения я вля ю тс я , б ез ус ловно, наиб олее деш евы ми продуцентами б елков. Т ак, с тоимос ть б елка, получ енного путем с ельс кохоз я й ственного культивирования с ои или кукуруз ы с оставля ет менее 1 долл./кг. И с пользование же микроб ны х клеток в з акры ты х с ис темах (ф ерментерах) и ос об енно культивируемы х клеток животны х в кач ес тве продуцентов ф армацевтич еских б елков об ходитс я в с отни и ты с я ч и раз дороже. К роме того, с интез ируемы е в б актериальны х клетках ч ужеродны е э укариотич ес кие б елки далеко не вс егда имею т правильную третич ную с труктуру (от ч его з авис ит их б иологич ес кая активность) и не могут подвергатьс я пос ттранс ля ционной модиф икации. О тмеч енны е недос татки отс утствую ту рас тений . К нас тоя щ ему времени показ ано, ч то рас тения могут произ водить б елки животного проис хождения . Т ак, вс траивание в геном араб идопс ис а химерного гена, с ос тоя щ его из ч ас ти гена з апас ного 2S-б елка араб идопс ис а и кодирую щ ей ч ас ти для ней ропептида– э нкеф алина, приводило к с интез у химерного б елкав колич ес тве до 200 нг на1г с емя н. Д вас труктурны х б елковы х домена б ы ли с вя з аны пос ледовательностью , уз наваемой трипс ином, ч то давало воз можнос ть в дальней ш ем из олировать ч исты й э нкеф алин, ис польз уемы й в кач ес тве б олеутоля ю щ его и ус покаю щ его с редс тва. Я понс кие уч ены е получ или рас тения картоф еля и таб ака с о встроенны м геном ч еловеч еского интерф ерона альф а, которы й применя ю т для леч ения ч еловекаотгепатитаС и некоторы х ф орм рака. С оз даны растения таб акас ч еловеч ес ким интерлей кином 10 (с тимуля тор иммунитета), растения араб идопс ис а, с интез ирую щ ие витамин Е . П реимущ ес тва таких “б иоф аб рик” оч евидны . М ожно произ водить вещ ес тва, я вля ю щ иес я ранее оч ень редкими и дорогими, практич ес ки в неогранич енны х колич ес твах. Рас тения с тановя тс я продуцентами вакцин, ф армакологич ес ких б елков и антител, ч то поз воля ет з нач ительно удеш евить леч ение раз лич ны х з аб олеваний , в том ч ис ле и онкологич ес ких. Т ак, получ ены транс генны е рас тения , продуцирую щ ие ч еловеч ес кий β-интерф ерон, повы ш аю щ ий иммунитет. П рич ем, такой с пособ получ ения β-интерф еронаоказ алс я гораз до э ф ф ективнее и деш евле, ч ем при ис польз овании микроб иологич еских методов. Раз раб отаны также подходы , поз воля ю щ ие получ ать б актериальны е антигены в рас тения х и ис пользовать их в кач естве вакцин. Т ак, получ ен картоф ель, продуцирую щ ий нетокс ич ны е с уб ъ единицы B-токс инахолеры . Т акие растения могут б ы ть ис польз ованы для получ ения деш евы х “съедобн ы х” вакц и н против холеры . И ммуниз ация такой антихолерной вакциной вполне э ф ф ективно происходит путем преорального приема. С оз даны б ананы , вы раб аты ваю щ ие вакцину против полиомиелита. И ндуц и рованная м уж ская ст ери льност ь раст ени й. В едутс я ис с ледования по получ ению транс генны х рас тений с мужс кой стерильнос тью . Х орош о из вес тно, ч то цитоплаз матич ес кая мужс кая с терильнос ть (ЦМ С ), воз никновение которой об ус ловлено с пециф ич еским вз аимодей ст-

38

вием генов я драи цитоплаз мы , ш ироко ис польз уется в с елекции нагетероз ис при произ водстве гиб ридны х с емя н F1 кукуруз ы , с ахарной с веклы , сорго, льнаи др. О днако не для вс ех культур удалос ь с оз дать традиционны ми с пособ ами с елекции линии с ЦМ С . Д ля с оз дания мужс ки с терильны х транс генны х линий растений в его геном перенос я т ген barnase от б актерии Bacillus amyloliquefaciens, которы й кодирует об раз ование ф ермента РН К -аз ы , уч ас твую щ его в рас щ еплении молекул РН К . Благодаря тканес пециф ич ес кому промотору PTA29 от таб ака э тот ф ермент об раз уетс я у транс генного рас тения только в одном мес те (в пы льнике) и только в одно время (в период цветения ). Д еградация РН К в тканя х пы льникаприводитк отс утс твию с интез а б елка и в конеч ном итоге – об раз ованию нежиз нес пос об ной пы льцы (мужс кой с терильнос ти). И ндуц и рованны й п арт еногенез. В последние годы в практич ес кой с елекции ис польз уетс я ещ е одно направление. О каз алос ь, ч то плоды транс генны х рас тений с б актериальны м геном iaaM (ген контролирует один из э тапов б иос интез а аукс ина), находя щ егос я под промотором гена Def (ген, которы й э кс пресс ируетс я только в плодах), я вл яю т ся п ар т ен о кар п и чески м и , т.е с ф ормировавш имис я б ез опы ления . П артенокарпич ес кие плоды характериз ую тся либ о полны м отс утс твием с емя н, либ о оч ень неб ольш им их колич ес твом, ч то поз воля етреш ить проб лему “лиш них кос точ ек”, например, в арб уз е, цитрус овы х и т.д. К роме того, з авя з ы вание с емя н б ез опы ления оч ень важно при вос произ водс тве рас тений в з имнее время в ус ловия х теплицы . О пы ление – э то оч ень тонкий процес с . П ы льца ф ормируетс я и с пос об на к опы лению только при определенной температуре и влажнос ти воз духа, ч то трудно с об лю сти в ис кус с твенны х ус ловия х. У же получ ены транс генны е растения каб ач ков, которы е в целом не отлич аю тс я отконтрольны х, но с партенокарпич ес кими плодами. 4.5. Трансгенны е раст ени я в сельском хозяйст ве П ервы е транс генны е растения (растения таб ака со вс троенны ми генами из микроорганиз мов) б ы ли получ ены в 1983 году, ч то откры ло необ озримы е перс пективы для с оз дания рас тений с улуч ш енны ми с вой с твами путем перенос ав них с оответствую щ их генов из других видов. П ервы е ус пеш ны е полевы е ис пы тания транс генны х растений таб ака, ус той ч ивы х к вирус ной инф екции, б ы ли проведены в С Ш А уже в 1986 году. П ос ле прохождения вс ех необ ходимы х тес тов на токс ич нос ть, аллергеннос ть, мутагеннос ть и т.д. первы е транс генны е продукты поя вилис ь в продаже в С Ш А в 1994 году. Э то б ы ли томаты Flavr Savr с з амедленны м созреванием, с оз данны е ф ирмой “Calgen”, а также герб ицид-ус той ч ивая с оя компании “Monsanto”. У же ч ерез 1-2 года б иотехнологич ес кие ф ирмы поставили на ры нок целы й ря д генетич ес ки из мененны х рас тений : томатов, кукуруз ы , картоф еля , таб ака, с ои, рапс а, каб ач ков, хлопч атника, с веклы и др. В нас тоя щ ее время транс генны е ф ормы получ ены у 120 видов растений . К олич ес тво ис польз уемы х в с ельс ком хоз я й с тве транс генны х (или ген ет и чески м оди фи ц и р ован н ы х = Г М ) рас тений идет по нарастаю щ ей .

39

С ей ч ас они воз делы ваю тс я в 30 с транах мира, из них лидирую тС Ш А (63% об щ ей площ ади), Аргентина (21%), К анада (6%), Браз илия (4%), К итай (около 4%) и Ю жная Аф рика (около 1%). Н а эти 6 стран приходитс я 99% вс ех пос евны х площ адей транс генны х культур. Г М – рас тения вы ращ иваю т также в И ндии, Авс тралии, И с пании, Румы нии, Болгарии, Г ермании, М екс ике, Ф ранции и др., вс его в 18 с транах, з аметную долю которы х сос тавля ю тразвиваю щ иес я с траны . С кажды м годом площ ади, з аня ты е в мире под Г М - рас тения ми, увелич иваю тс я примерно на10% (рис унок 13). В 1996 году транс генны е рас тения б ы ли вы с ажены на об щ ей площ ади поря дка 1,7 млн. га, в 2000 г. – 44,2 млн. га (ч то превы ш ает раз меры такой с траны как В еликооб ритания ), 2003г. – 67,7 млн. га (ч то составля ет половину пос евны х площ адей Рос с ии). 67,7 52,6 39,9

58,7

44,2

27,8 11 1,7 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

Рис унок 13. Д инамикаувелич ения об щ ей площ ади воз делы вания транс генны х сортов с ельс кохоз я й ственны х культур в мире (млн га) В С Ш А генетич ес ки модиф ицированны е рас тения с оставля ю тс ей ч ас около 50% пос евов кукуруз ы и сои и б олее 30-40% пос евов хлопч атника. Н а рос с ий с ком ры нке раз реш ены для реализ ации транс генны е с орта кукуруз ы , сои, хлопч атника, с ахарной с веклы и картоф еля . По чем у н ам т ак важ н о п ол учен и е и и сп о ль зован и е т р ан сген н ы х р аст ен и й? П режде вс его, э то с вя з ано с б урны м рос том нас еления Земли, ч ис ленность которого в нас тоя щ ее время превы ш ает 6 млрд. ч еловек. Ж ителю Рос с ии в э то трудно поверить, иб о у нас , нач иная с 1993 г., рождаемость неуклонно с окращ аетс я . У велич ение ч ис ла жителей планеты проис ходитз а с ч ет К итая , И ндии, П акис тане, М алай з ии и других раз виваю щ ихс я с транах Аз ии. П араллельно рос ту нас еления уменьш аетс я площ адь з емель, ис польз уемы х для произ водс тва продуктов питания . В итоге, 800 млн. ч еловек (кажды й вос ьмой ) не имею т дос таточ но пищ и, с орок ты с я ч ч еловек умираю т ежедневно от недоедания , и половина из них – дети. К 2010 году ч ис леннос ть нас еления с ос тавитпо раз ны м прогноз ам от8 до 11 миллиардов ч еловек. П итание и медицинс кое об с луживание такого колич ес тва нас еления представля ет с об ой наиб олее важную проб лему, с тоя щ ую перед ч еловеч ес твом.

40

В Рос с ии с о 130 миллионны м нас елением и об ш ирны ми с ельс кохоз я й с твенны ми угодья ми на первы й вз гля д эта проб лема не актуальна. О днако в нас тоя щ ее время на мировом ры нке ф ермеры предпоч итаю т покупать гиб ридны е с емена нового поколения генетич ес ки модиф ицированны х рас тений (Г М Р), об ладаю щ ие улуч ш енны ми агротехнич ес кими и потреб ительс кими с вой с твами, которы е намного дороже с емя н об ы ч ной с елекции, но об ес печ иваю т получ ение гарантированны х урожаев и вы живание в ус ловия х ры ноч ной э кономики. Т ак, в 2002 году транс генны е с орта дали с ельс кохоз я й с твенной продукции на 1,8 млрд тонн б ольш е, ч ем об ы ч ны е на тех же площ адя х, при э том пестицидов ис польз овано на 21 ты с . тонн меньш е, адоходы увелич илис ь на1,5 млрд долларов С Ш А. К роме ф инанс овой приб ы ли вы ращ ивания Г М Р нес ет ощ утимы е с оциальны е и экологич еские вы годы . С ущ ес твенное увелич ение урожая с ельс кохоз я й ственны х культур з а пос ледние дес я тилетия в з нач ительной с тепени достигнуто з асч етхимиз ации, механиз ации и мелиорации, ч то привело к воз никновению ря да экономич еских и э кологич ес ких проб лем, с вя з анны х с з агря з нением окружаю щ ей с реды , истощ ением э нергетич ес ких рес урсов, воз рас танием з атрат на единицу продукции и т.д. К роме того, з нач ительны й прогрес с в улуч ш ении важней ш их с ельс кохоз я й с твенны х культур (например, кардинальное улуч ш ение кач ес тва и повы ш ение ус той ч ивос ти сортов к ф акторам с реды ) с ис польз ованием традиционны х, клас с ич еских с елекции – гиб ридиз ации и отб орав б ольш инс тве с луч аев дос тиг с воего предела. В э той с итуации вы ращ ивание транс генны х рас тений , ус той ч ивы х к б иотич еским и аб иотич ес ким ф акторам, поз воля ет ис польз овать низ коз атратны е технологии произ водс тва б ез удоб рений и пес тицидов, на з емля х низ кого плодородия , в ус ловия х з ас ухи, з ас оления , э кс тремально низ ких или вы с оких температур. Благодаря с окращ ению об раб отки полей пес тицидами, ис польз ованию менее вредны х для окружаю щ ей с реды герб ицидов с нижаетс я химич ес кая з агря з ненность воды и поч вы . П редотвращ аетс я эроз ия поч вы , пос кольку ис пользования Г М Р, ус той ч ивы х к герб ицидам, поз воля ет перей ти на щ адя щ ий б ес пахотны й метод об раб отки поч вы . Н а поля х, з аня ты х транс генны ми с ортами, отмеч ено увелич ение ч ис леннос ти популя ций птиц, полез ны х нас екомы х. В нас тоя щ ее время генная инженерия , поз воля ю щ ая направленно получ ать новы е с ортарас тений с з аданны ми (нужны ми ч еловеку) хоз я й с твенно ценны ми приз наками и с вой ствами, я вля етс я одним из наиб олее перс пективны х и нес тандартны х подходов для реш ения многих з адач с ельс кого хоз я й с тва. В то же время с ледует отметить, ч то их ус пеш ное реш ение воз можно лиш ь при с оч етании методагенной инженерии с традиционны ми методами генетики и с елекции.

41

5. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я Ж И В О Т Н Ы Х 5.1. О сновны е нап равлени я и дост и ж ени я генной и нж енери и ж и вот ны х Т ранс генны е млекопитаю щ ие я вля ю тс я луч ш ей моделью для из уч ения б олез ней ч еловека, с другой с тороны , их планирую т ис польз овать для производс тванеоб ходимы х ч еловеку б иомедицинс ких препаратов. П ервое транс генное животное б ы ло получ ено в 1982 г. Р.Д . П альмитером с соавторами. Э то б ы ла гигантс кая мы ш ь, которой перес адили ген гормона рос та кры с ы . П опы тки увелич ить таким же путем раз меры б олее крупны х млекопитаю щ их оказ алис ь неудач ны ми. Ж ивотны е с повы ш енны м уровнем индукции гормона рос та не увелич ивалис ь в раз мерах, но у них наб лю далис ь з нач ительны е наруш ения в рос те и строении кос тей . Трансгенны е ж и вот ны е – би ореакт оры (“ би ол оги чески е фабр и ки ”). Т ранс генны е животны е получ или ш ирокое рас прос транение как б иореакторы , т.е. продуценты б иологич ес ки активны х лекарс твенны х б елков ч еловека, с екретируемы х в молоко: гормонов, ф ерментов, антител, ф акторов с верты вания крови и рос таи др. Т радиционно такие б елки вы деля ли из донорс кой крови, деф ицит которой и низ кая концентрация э тих б елков не поз воля ли получ ать необ ходимого колич ес тва препаратов, покры ваю щ его з апрос ы ф армакологич ес кого ры нка. Биореакторами могут б ы ть и б актерии, но б актериальны е клетки идут в перераб отку целиком и поэ тому трудно из б авитьс я от пос торонних примес ей в конеч ном продукте. Т ранс генны е животны е поз воля т реш ить и эту проб лему – оч истки лекарственны х б елков. Д аже ес ли пос ле оч ис тки в препарате ос танутс я примес и, э то б удут нетокс ич ны е для ч еловека б елки молока. Кроме того, микроорганиз мы нес пос об ны ос ущ ес твля ть пос ттранс ля ционны е модиф икации с ложны х э укариотич ес ких б елков (гликоз илирование, ацетилирование, ф ос ф орилирование, карб окс илирование и др.), необ ходимы е для их нормального ф ункционирования . И з вестно, ч то произ водимы е микроорганиз мами б елки нередко вы з ы ваю таллергич ес кие реакции. С тратегия раб от в э том направлении такова: получ ить транс генное животное, у которого ч ужой ген экс прес с ируетс я в клетках молоч ной желез ы и его продукт вы деля тс я в молоко. И с польз ование молока целес ооб раз но потому, ч то оно об раз уетс я в организ ме животного в б ольш ом колич ес тве, я вля етс я стерильны м и его можно надаивать по мере надоб нос ти б ез вреда для животного. Н апример, коз а в период лактации может произ вес ти до 800 л молокав год при с одержании в нем рекомб инантного б елка около 5г/л, т.е. около 4 кг э того б елкав год. Т аким об раз ом, относ ительно неб ольш ое с тадо транс генны х коз может продуцировать в с ос таве молока с отни килограммов рекомб инантного б елка в год при его низ кой с тоимос ти. Ч тоб ы получ ить транс генное животное, например коз у, с оз даю т генетич ескую конструкцию , с одержащ ую рекомб инантную Д Н К транс генаи промотор гена β-каз еина – б елка, входя щ его в сос тав молока. Т .е. под промоторами генов, с пециф ич ны х для молоч ны х желез (α-, β-каз еина, α-

42

моторами генов, с пециф ич ны х для молоч ны х желез (α-, β-каз еина, αлактоальб умина или β-лактоглоб улина), вводя т целевы е гены , которы е нараб аты ваю тб иологич ес ки активны е вещ ес тва. Г енетич ескую конс трукцию инъ ецирую т в з иготу. П рич ем, э та конструкция должна раб отать только в клетках молоч ной желез ы и только во время лактации, не оказ ы вая поб оч ного воздей с твия наорганиз м транс генного животного. В 1988 г. впервы е удалос ь получ ить транс генны х овец, продуцирую щ их с молоком ф актор с верты вания крови, необ ходимы й для леч ения лю дей , б ольны х гемоф илией . В пос ледую щ ие годы в мире с оз даны транс генны е мы ш и, кролики, овцы и коз ы , с виньи, коровы , в молоке которы х с екретирую тс я б елки ч еловека (ценней ш ие ф армацевтич ес кие вещ ества): антитрипс ин, антитромб ин, б елок С , с ы вороточ ны й альб умин (ис польз уемы й при операция х), раз лич ны е моноклональны е антитела, эритропоэ тин, инс улиноподоб ны й ф актор роста, интерлей кины и др. Т ак, с помощ ью гена α-антитрипс ина ААТ , помещ енного под контроль промотора гена β-лактоглоб улина, б ы ли получ ены транс генны е овцы , в молоке которы х с одержитс я до 35г/л этого б елка. α-антитрипс ин я вля етс я ингиб итором протеаз ы э лас таз ы . Л ица, у которы х отс утс твует этот б елок, предрас положены к з аб олеванию э мф из емой легких и цирроз ом печ ени в детс ком возрасте, так как у них постепенно рас падаетс я соединительная ткань. Е го внутривенное введение с лужит для б ольны х лекарс твенны м с редс твом. И с польз ование транс генны х животны х поз волит с низ ить б ольш инс тво дорогос тоя щ их вы с окоэ ф ф ективны х препаратов в 10-20 раз и перевес ти многие лекарс тваиз разря даэ литны х в ч ис ло об щ едос тупны х. П ервы е в мире транс генны е животны е (овцы ), продуцирую щ ие с молоком прохимоз ин крупного рогатого с кота б ы ли получ ены в Рос с ии в 1995 году. Х имоз ин – клю ч евой ф ермент с ы роделия , и традиционно его вы деля ю тиз с лиз ис той об олоч ки с ы ч уга з аб иты х молоч ны х теля ти я гня т. В б лижай ш ее время наф армакологич ес кий ры нок пос тупитпервы й лекарс твенны й препарат из молока транс генны х коз – противос верты ваю щ ее с редс тво антитромб ин III ч еловека (ис польз уемы й для предотвращ ения инф арктов и инс ультов), раз раб отанны й американской ф армацевтич ес кой компанией “Genzyme Transgenics Corporation” . Трансгенны е ж и вот ны е с вы клю ч енны м и генам и (генны й нокаут ). Ген н ы й н окаут (от англ. knock out – вы б ить) или генны й таргетинг – э то направленное раз руш ение (вы клю ч ение) определенного гена с помощ ью гомологич ной рекомб инации. Больш ое з нач ение имею т опы ты по с оз данию животны х, продуцирую щ их молоко, макс имально приб лижаю щ еес я по с ос таву к материнс кому молоку ч еловека. Д ля э того нужно вы клю ч ить несколько генов коровы , т.е. получ ить так наз ы ваемы х животны хнокаутов, аз атем ввес ти в ее геном несколько генов ч еловека. К роме того, животны е-нокауты я вля ю тс я удоб ной моделью для ис с ледования ф ункций раз лич ны х генов. С ложность геномамлекопитаю щ их, их э мб рионального раз вития , длительны й период, предш ес твую щ ий раз множению , з атрудня ю т проведение генетич ес кого анализ а. Больш инство

43

ис с ледований в э той об лас ти проводилос ь на мы ш ах. М ы ш ь, относ я щ ая с я к клас с у млекопитаю щ их, имею щ ая короткий с рок б еременности и рос та клас с ич ес кий , удоб ны й об ъ ект генетики. С оз дание линий мы ш ей , гомоз иготны х по направленно инактивированному гену, поз воля ет из уч ать детерминируемы е данны м геном с вой с тванауровне организ ма. С хема получ ения нокаутны х мы ш ей (мутантов с направленно инактивированны ми генами) вы гля дит с ледую щ им об разом: 1. С оз дание генетич ес кой конс трукции (так наз ы ваемого н ац ел ен н ого вект ор а), содержащ ей ф рагмент целевого гена (которы й планирую т инактивировать in vivo), внутрь которого вс траиваю т доминантны й с елективны й маркер. 2. В ведение вектора (ч ащ е вс его э лектропорацией ) в культуру э мб риональны х с тволовы х клеток, отб ор клонов транс ф ормантов на с елективной с реде. С помощ ью П ЦР и б лоттинга по С ауз ерну вы я вля ю т транс ф орманты , об раз овавш иес я в рез ультате гомологич ной рекомб инации, приведш ей к инс ерционно-делеционной инактивации целевого гена. О тб ираемы е клоны гетероз иготны по мутантному гену, т.к. инактивирую щ ая вс трой ка проис ходит в одну из гомологич ны х хромосом. 3. И нъ екция транс ф ормированны х клеток в б лас тоцис ты , которы е з атем помещ аю т в я й цевод с амок. 4. С крещ ивание родивш ихс я химерны х мы ш ей с мы ш ами ис ходной линии, получ ение гетероз иготного потомс тва по целевому мутантному гену; 5) с крещ ивание гетероз игот между соб ой , отб ор в потомс тве гомоз иготны х по мутантному гену мы ш ей . Н а каждом э тапе генотип мутантны х мы ш ей определя ю тс помощ ью П ЦР и б лоттингапо С ауз ерну. Трансгенны е ж и вот ны е как генет и ч ески е м одели наследст венны х заболевани й ч еловека. П о данны м с еквенирования генома у мы ш и и ч еловека содержитс я около 70-80% гомологич ны х генов (геновортологов). Н а э том об ъ екте можно получ ать мутации, ос ущ ествля ть генно-инженерны е манипуля ции и из уч ать механиз мы регуля ции э кс прес с ии генов, проводить с крещ ивание транс генны х животны х и анализ нас ледования в потомс тве, ч то недопус тимо с ч еловеком. Т ранс генны е линии животны х ис польз ую тся для моделирования раз лич ны х генетич ес ких б олез ней ч еловека, ч то имеет огромное з нач ение для медицинс кой генетики. П утем введения в геном мы ш и генов, ответс твенны х з аконкретное з аб олевание ч еловека, созданы “мы ш ины е”модели таких генетич еских б олез ней ч еловека, как б олез нь Альцгей мера(с тарч ес кое с лаб оумие, дегенеративная б олез нь), артрит, атерос клероз , мы ш еч ная дис троф ия (миодис троф ия Д ю ш енна), об раз ование опухолей , гипертония , с ердеч но-с ос удисты е и прионны е з аб олевания и др. Н аос нове из уч ения транс генны х животны х раз раб аты ваю тс я методы генной терапии (с пос об ы леч ения раз лич ны х нас ледс твенны х з аб олеваний ). П ри э том ис польз уетс я с оматич ес кая транс ф екция - метод, когда генетич еские конс трукции вводя тс я в определенны е клетки и ткани организ ма пациента. К ак и вс е другие методы леч ения , генотерапевтич ес кие методы раз раб аты ваю тс я и проходя т ис пы тания на модельны х транс генны х животны х.

44

Трансгенны е ж и вот ны е – и ст оч ни ки органов для п ересадки ч еловеку. Знач ительны й интерес представля етсоз дание транс генны х животны х как ис точ ников органов для перес адки ч еловеку. О рганы с виньи, например, оч ень подходя т ч еловеку по с троению , раз мерам и многим б иохимич ес ким показ ателя м. С виньи с ч итаю тс я наиб олее подходя щ ими животны ми в кач ес тве доноров с ердца для пересадки лю дя м, т.к. с ердце с виньи по раз мерам наиб олее с оответствует с ердцу ч еловека и с ердеч ны е клапаны с виньи уже б олее дес я тилетия ис польз ую тс я при кардиологич еских операция х на лю дя х. К лонирование транс генны х с виней поз волит соз дать пос тоя нны й з апас органов для перес адки лю дя м. Н о перес аживать их б ез генетич еского из менения (транс ф ормации) невоз можно, т.к. э ти органы б удут немедленно отторгнуты иммунной с ис темой пациента. Ч тоб ы этого не произош ло, необ ходимо соз дать транс генную с винью , у которой нокаутированы с оответс твенны е гены гис тонесовмес тимос ти (тканенес овместимос ти), а вмес то них введены гены гис тосовмес тимос ти ч еловека. Э ти гены рас полагаю тс я компактно в локус ах гис тос овместимос ти, и при проведении генного нокаутаможно вы клю ч ить с раз у нес колько генов. В я нваре 2002 г. компания PPL Therapeutics pic об ъ я вилао рождении в С Ш А пометов транс генны х клонов с виньи с отклю ч енны ми генами гис тонес овмес тимос ти. П олуч ение транс генны х промы с ловы х ры б ведется в трех направления х: 1) увелич ения с корости их раз вития и приб авки вес а путем введения в их геном генов гормона рос та; 2) повы ш ения их холодос той кос ти с помощ ью введенного гена AFP, кодирую щ его б елок-антиф риз ; 3) придания ус той ч ивос ти к вирус ны м з аб олевания м с помощ ью противовирус ны х антис мы с ловы х РН К . И нтерес ны и перс пективны раб оты по с оз данию животны х - продуцентов б елка паутины пауков, поскольку проч ность на раз ры в нитей паутины в рас ч ете на площ адь попереч ного с еч ения на поря док превосходит проч нос ть с тальны х канатов. Т ак, перенес я в геном коз гены паука, отвеч аю щ ие з а вы раб отку паутины , американс кие и канадс кие генетики получ или трас генны х животны х, продуцирую щ их “б иос таль”– молоко, содержащ ее б елок, по проч нос ти превос ходя щ ий металл. И так, получ ение транс генны х животны х предс тавля ет интерес не только для ф ундаментальны х ис с ледований , но и для практич еского ис польз ования . О днако, нес мотря на то ч то первы е транс генны е животны е б ы ли получ ены б олее 20 лет наз ад, до сих пор на ры нке нет ни одного генетич ески модиф ицированного животного для ис пользования в хоз я й с твенной дея тельности. Э то с вя з ано с определенны ми технич ес кими (с ложнос ти получ ения и раз множения ), ф инанс овы ми, а иногда и э тич ескими проб лемами. Т ем не менее, ус пехи в генетич еской инженерии животны х оч евидны . Разраб отаны раз лич ны е методы перенос а генов в генетич ес кий материал животны х и получ ены транс генны е ос об и у млекопитаю щ их, низ ш их поз воноч ны х и у б ес позвоноч ны х животны х. У ч ены е науч илис ь не

45

только перенос ить в генетич еский материал животны х отдельны е гены , но и “вы клю ч ать”или з аменя ть некоторы е конкретны е гены . 5.2. Сп особы создани я т рансгенны х ж и вот ны х Е с ли вводить Д Н К в клетки многоклеточ ного организ ма, то рез ультатом транс ф ормации б удет из менение с вой с тв лиш ь неб ольш ого ч ис ла клеток, которы е приоб рели новы й ген или гены . В э том с луч ае животное б удет химерны м (т.е. клетки раз ны х тканей б удут иметь раз ны й генотип). П оэ тому для из менения с вой ств вс его организ ма необ ходимо из меня ть геном половы х клеток или з иготы (оплодотворенной я й цеклетки, представленной одной клеткой ), нес ущ их новы е с вой ства потомкам. В э том с луч ае транс ф ормацию клеток ос ущ ес твля ю т путем микроинъ екции ч ужеродной Д Н К пря мо в я дро или, например, э лектропорацией . Г енетич ес кие конструкции ч ас то с оз даю тс я на ос нове Д Н К вирус ов (например, SV40, вирус аб ы ч ьей папилломы и т.д.), ретровирусов, которы е легко проникаю т в клетку хоз я ина и вс траиваю тся в ее Д Н К путем об ы ч ной инф екции (например, путем инф ицирования рекомб инантны м вирусом э мб риона на ранних с тадия х раз вития ). П ри вирус ной инф екции каждая клетка может получ ить б ольш ое ч ис ло копий ч ужеродного гена. П еренос таким с пос об ом полез ны х генов оказ алс я воз можны м пос ле ос лаб ления путем генно-инженерны х манипуля ций патогенности вирус а для клеток организ ма-реципиента. С ущ ес твую т две ос новны е с хемы соз дания транс генны х животны х. П ервая из них – м и кр ои н ъекц и я чуж ер одн ой ДН К (в с ос таве генетич ес кой конс трукции) в оп лодот вор ен н ую яйц екл ет ку, раз раб отанная для получ ения транс генны х мы ш ей , которая поз днее с тала применя тьс я для получ ения крупны х животны х – продуцентов лекарс твенны х б елков ч еловека: кроликов, коз , овец, коров. О птимальной ф аз ой введения инородного материала я вля етс я с тадия оплодотворенной я й цеклетки до с лия ния пронуклеус ов. П ронуклеус - одно из двух гаплоидны х я дер в я й це млекопитаю щ их в период пос ле проникновения с перматоз оида, но до с лия ния мужского и женского пронуклеус ов в я дро з иготы в процес с е оплодотворения ; мужс кой пронуклеус ф ормируетс я из я дерного материала с перматоз оида, женс кий - из хромосом я й цеклетки. В 1980 г. Д ж. Г ордоном б ы ло показ ано, ч то гены , инъ ецированны е в пронуклеус оплодотворенного я й ца мы ш и, вс траиваю тс я в хромос омы и прис утс твую т во вс ех клетках новорожденного мы ш онка. С э той раб оты нач алас ь э раполуч ения транс генны х животны х. П роцес с получ ения транс генны х мы ш ей с помощ ью микроинъ екции с хематич ес ки показ ан на рис унке 14. О н з аклю ч аетс я в с ледую щ ем. Я й цклетки вы деля ю т из с амок-доноров, у которы х б ы ла индуцирована гиперовуля ция (увелич ение ч ис ла я й цеклеток до 35 вмес то об ы ч ны х 5-10) и проведено с паривание с самцами-произ водителя ми (я й цеводы вс кры ваю т-

46

Рис унок14. П олуч ение линий транс генны х мы ш ей методом микроинъ екций [Г лик, 2002], (поя с нение в текс те) ч ерез 12 ч асов пос ле с паривания , вы деля ю т оплодотворенны е я й цеклетки и помещ аю т их в культуру). Д алее в б ольш ий из двух пронуклеус ов (об ы ч но мужс кой ) инъ ецирую т транс генную конс трукцию . П ос ле транс ф ормации я й цеклетку немедленно имплантирую т в я й цевод (или матку) “приемной ”=” с уррогатной ” матери, которая произ водит потомс тво, или культивирую т в ус ловия х in vitro до с тадии б лас тоцис ты (б лас тоцис та = б лас тула – з ароды ш , э мб рион млекопитаю щ их на одной из ранних с тадий раз вития ), пос ле ч его имплантирую тв матку. Д ля отб оратранс генны х особ ей (нес ущ их введенны й ген) проводя т молекуля рно-генетич еский анализ родивш егося потомс тва. С крещ ивая транс генны х животны х, можно получ ить ч ис ты е (гомоз иготны е) транс генны е линии. Н едостатком традиционной технологии соз дания транс генны х животны х путем микроинъ екции

47

генетич еских конс трукций в пронуклеус я й цеклетки я вля етс я ее трудоемкос ть и малоэ ф ф ективнос ть. Т ак, полного раз вития дос тигает менее 1-5% з игот, транс дуцированны х ч ужеродны м геном. В торая с хема получ ения транс генны х животны х (б олее новая ) – введен и е ген ет и ческой кон ст р укц и и в эм бр и он аль н ы е ст вол овы е кл ет ки (Э С К=ES-клет ки ), вз я ты е из б лас тоцис ты (рис унок15). Э ти клетки я вля -

Рис унок15. П олуч ение транс генны х мы ш ей с помощ ью генетич ес кой модиф икации э мб риональны х с тволовы х (ES) клеток[Г лик, 2002], (поя с нение в текс те)

48

ю тс я недиф ф еренцированны ми, плю рипотентны ми (тотипотентны ми), т.е. с пособ ны диф ф еренцироватьс я в лю б ы е типы клеток, вклю ч ая клетки з ароды ш евой линии. ES-клетки, вы деленны е из э мб рионов настадии б лас тоцис ты , можно культивировать in vitro и пос ле введения в них необ ходимого транс гена путем транс ф екции (т.е. ис кус с твенного введения в клетки вектора, нес ущ его транс ген) либ о инф ицирования рекомб инантны ми вирус ами ввес ти в другой э мб рион на с тадии б лас тоцис ты , а з атем имплантировать в матку “с уррогатной ”матери, произ водя щ ей потомс тво. С крещ ивая животны х-ос нователей , нес ущ их транс ген в клетках з ароды ш евой линии, можно получ ить линии транс генны х животны х. В отлич ие от метода микроинъ екции в оплодотворенную я й цеклетку з дес ь ещ е наэ тапе раб оты с Э С К можно проанализ ировать вс траивание транс гена в геном клетки и проверить его э кс прес с ию , ч то дает воз можность вы б рать линию Э С К с наилуч ш ими с вой с твами. Ч асть этих клеток можно з амороз ить в жидком аз оте и хранить многие годы для пос ледую щ его с оз дания транс генны х животны х. В первы е культивируемы е линии Э С К б ы ли получ ены из б лас тоцис т мы ш и Э ванс ом, К ауф маном и М артином в 1981 году. П оз же они б ы ли получ ены из б лас тоцис т многих других млекопитаю щ их: золотис ты й хомя ч ок (1988); с винья , овца(1990); корова, норка(1992); кролик (1993); кры с а (1994); об ез ья на (1995) и даже ч еловек (1994). Т акой путь получ ения транс генны х животны х вы годен ещ е тем, ч то ис польз ую тс я не з иготы , а б лас тоцис ты , которы е легко вы мы ваю тся из половы х путей с амоккрупны х видов млекопитаю щ их нехирургич ес ким путем. Затем получ аю т химерны е э мб рионов (путем введения транс генны х Э С К в полос ть б лас тоцис ты ), которы е транс плантирую тс я нехирургич еским путем “с уррогатны м”матеря м для рождения транс генны х животны х – ос нователей транс генны х линий . К роме того, Э С К – удоб ны й об ъ ектдля проведения в культуре генного нокаута (вектор з амещ ает с об ой или вс траиваетс я в нокаутируемы й ген). С оз дание транс генны х животны х – оч ень трудоемкий процес с . Т ак, по с татис тике одно транс генное животное удается получ ить на40 инъ ецированны х з иготмы ш и, или на100 з иготовцы или коз ы , или на 1500 з игот коровы . И з этих транс генны х животны х не б олее 50% э кс прес с ирую т – транс генны й б елок, не у вс ех животны х ч ужой ген попадает в половы е клетки, т.е. с пособ ен передаваться потомству. П оэтому б ольш ой интерес вы з ы ваю топы ты по клонированию животны х. 5.3. Клони ровани е ж и вот ны х П од клоном об ы ч но подраз умеваетс я популя ция клеток или организ мов – потомков одной клетки или организ ма, получ енны х неполовы м путем. Т аким об раз ом, вс е ос об и в клоне имею тидентич ны й наб ор генов и должны б ы ть точ ной копией вз я того для раз множения э кз емпля ра (с оответс твую щ его прототипа).

49

Д ля генетиков растений получ ение клонов не с ос тавля ет особ ы х проб лем. К лонирование рас тений ч еренками, поч ками, клуб ня ми в с адоводс тве из вес тно уже б олее 4 ты с . лет. Н ач иная с 70-х годов 20 века для клонирования рас тений in vitro (вне организ ма, на питательной среде) с тали ш ироко ис польз овать неб ольш ие группы и даже отдельны е с оматич ес кие (неполовы е) клетки. Э то с тало возможны м б лагодаря тому, ч то у рас тений (в отлич ие от животны х) по мере их ростав ходе клеточ ной с пециализ ации - диф ф еренцировки - клетки не теря ю тс вой с тво тотипотентнос ти, т.е. с пособ ности реализ овы вать всю генетич ес кую инф ормацию , з аложенную в я дре. П оэ тому практич ес ки лю б ая рас тительная клетка, с охранивш ая в процес с е диф ф еренцировки с вое я дро, может дать нач ало новому организ му. Т ак, с ис польз ованием мерис тематич еской ткани вз рос лы х деревьев карельской б ерез ы воронежс кие уч ены е (Н И И лес ной генетики и с елекции и В Г У ) на протя жении многих лет ус пеш но клонирую т хоз я й ственно ценны е ф ормы с декоративной уз орч атой древес иной , которая ш ироко ис польз уетс я в меб ельной промы ш леннос ти и кустарны х промы с лах. У животны х генетики могутполуч ить подоб ны е клоны в том с луч ае, когда ис польз уемы е ими об ъ екты раз множаю тс я путем партеногенез а, т.е. б ес полы м путем, б ез предш ес твую щ его оплодотворения . У нас в с тране б лес тя щ ие раб оты по клонированию вы полнены на ш елкопря де академиком В .А. С трунниковы м. В ы веденны е ими клоны ш елкопря да (партеноклоны мужского пола, даю щ ие на 20% б ольш е ш елка, ч ем женс кие) из вес тны навесь мир. В ы с ш ие животны е в природе раз множаю тс я только половы м путем. К летки животны х, диф ф еренцируя с ь, лиш аю тс я тотипотентности. С ч итаю т, ч то в ходе клеточ ной диф ф еренцировки у позвоноч ны х происходит или потеря определенны х генны х локус ов или их необ ратимая инактивация . В э том - одно из с ущ ес твенны х их отлич ий отклеток растений и главное препя тс твие для клонирования взрос лы х позвоноч ны х животны х. П оэ тому для клонирования взрос лы х поз воноч ны х в ос новном ис польз ую т малодиф ф еренцированны е (не прош едш ие с пециализ ации) деля щ иес я клетки. Д ля клонирования животны х я дро оплодотворенной я й цеклетки з аменя ю т я дром, вз я ты м от другой особ и (с другой генетич еской инф ормацией ). С об с твенно я дро удаля етс я или инактивируетс я хирургич ес ки. О каз алос ь, ч то тотипотентность (воз можнос ть раз виваться во взрос лую ос об ь) с охраня ю т я дра из клеток оч ень ранних эмб рионов. К огда ч ис ло клеток (б лас томер) э мб рионане превы ш аетвос ьми, они ещ е тотипотентны и каждая из них может дать нач ало новому организ му. Э то поз воля етпроводить ис кус с твенное раз деление 4-8 клеточ ны х э мб рионов на отдельны е клетки, культивировать их in vitro до с тадии б лас тоцис ты и имплантировать в матку “приемной ”(с уррогатной ) матери, где они раз виваю тся до рождения . Т аким путем можно получ ать генотипич ес ки одинаковы е особ и (одноя й цевы х б лиз нецов).

50

Д ругая воз можнос ть з аклю ч аетс я в ис польз овании малодиф ф еренцированны х э мб риональны х стволовы х клеток (Э С К =ES-клетки), получ аемы х из б ластоцис т и характериз ую щ ихс я вы с окой с коростью деления . В э том с луч ае ос ущ ес твля ю т перенос я дра из с тволовой клетки в э нуклеированны е з иготы (т.е. в только ч то оплодотворенную in vitro я й цеклетку, из которой удалены об апронуклеус а), которы е з атем имплантирую тв матку “приемной ”матери. Ч ис ло идентич ны х стволовы х клеток не огранич ено, поскольку их можно клонировать. П оэтому колич ество получ аемы х одноя й цевы х б лиз нецов з авис ит только от дос тупности я й цеклеток и налич ия “приемны х”матерей . С ис польз ованием э мб риональны х клеток б ы л получ ен теленок М ис тер Д жеф ф ерсон, клоны мы ш ей , порос я т, об ез ья наТ етраи др. С енс ационность раб оты доктора Я на В ильмута с с оавторами из Ш отландии (1997г.) з аклю ч аетс я в том, ч то впервы е для клонирования млекопитаю щ их б ы ли ис польз ованы ядр а сом ат и чески х (ди ф фер ен ц и р о ван н ы х) кл ет ок взр о сл ой овц ы (клетки с оединительной ткани – ф иб роб лас ты ) б еломордой породы Ф инс кий дорс ет, вы деленны е из нижней ч ас ти вы мени овцы , находивш ей с я на ч етвертом мес я це б еременности. Беременное животное б ы ло вы б рано из -з а того, ч то при б еременнос ти клетки вы мени активно деля тс я и, с ледовательно, хорош о вы живаю тв культуре. Я дра перес аживалис ь в э нуклеированны е я й цеклетки овец ш отландской ч ерномордой породы , а з атем б ы ли имплантированы в матку “приемной ”матери ч ерноморды х овец. В рез ультате поя вилась всемирно из вестная овца Д олли, генотип и ф енотип (б еломорды й я гненок) которой б ы ли полностью идентич ны исходной матери (рис унок 16). М аркерами в данном с луч ае

Рис унок16. С хемагенетич ес кого клонирования овцы [К ороч кин, 2004], (поя с нение в текс те) с лужили мас ть овец и раз лич ны е микрос ателлиты в с ос таве Д Н К . Э тот экс перимент доказ ы вает, ч то и с оматич ес кие клетки взрос лой ос об и могут б ы ть тотипотентны ми, у них отс утствую т необ ратимы е модиф икации генетич еского материала в ходе нормального раз вития . О днако процент вы -

51

хода нормально раз виты х жиз нес пос об ны х рожденны х животны х б ы л нич тожно мал (только одно нормально с ф ормированное животное из 277 з игот с транс плантированны ми я драми – 0,4%). Больш ая ч ас ть транс плантированны х з ароды ш ей погиб лаещ е в утроб е матери, остальны е клоны имели раз лич ны е патологии. Т ак, некоторы е из новорожденны х б ы ли ненормально велики, ч то, по мнению ис с ледователей , б ы ло с вя з ано с опоз данием в подс адке раз виваю щ ихс я э мб рионов в матку с уррогатной матери. К роме того, клонированная овца Д олли с тарела в нес колько раз б ы с трее с воих "нормально рожденны х" родс твенников. С оглас но одному из наиб олее вероя тны х об ъ я с нений б ы с трого с тарения я вля етс я гипотез а, ч то оно происходит в с илу з апрограммированного огранич ения колич ес тва делений и продолжительнос ти жиз ни каждой с оматич еской клетки вы с ш их организ мов. П о одной из верс ий э то определя етс я длиной концевы х уч астков плеч хромос ом - теломерны х повторов. П ри каждом делении клетки их длина уменьш аетс я , ч то, с оответственно и определя ет ос тавш еес я раз реш енное клетке время жиз ни. П ос кольку в кач ес тве донорской при соз дании Д олли ис польз овалас ь клетка уже вз рос лого животного, которая претерпела до этого по край ней мере несколько делений , теломеры ее хромос ом к тому времени б ы ли несколько укороч ены , ч то и могло определить об щ ий б иологич еский воз рас т клонированного организ ма. К роме того, у овеч ки Д олли б ы ло об наружено прогрес с ирую щ ее з аб олевание легких, и в 2003 году животное приш лос ь умертвить - в возрас те с еми лет. Э тот э кс периментещ е раз подтверждаетиз веч ную ис тину о том, ч то природадалеко не так прос таи одноз нач на, какэ то можетпоказ атьс я . В нас тоя щ ее время перенос я дра с оматич ес кой клетки в э нуклеированную з иготу ус пеш но проведен намы ш ах я понскими уч ены ми. П роцент вы хода рожденны х мы ш ат составил 2-2,8%. Т аким об раз ом, по край ней мере в некоторы х с луч ая х б ы ла доказ ана с пособ нос ть я дер с оматич ес ких клетокоб ес печ ивать нормальное раз витие млекопитаю щ их. И мею тс я сооб щ ения о клонировании свиньи, коровы , кош ки. О днако, продолжительность жиз ни клонированны х животны х ниже нормы . Т ак, овеч ка Д олли дотя нула лиш ь до половины с редней продолжительнос ти жиз ни овец (7 лет). Е е авс тралий с кий “двой ник”– М атильдапогиб лач ерез два года пос ле рождения , “помеш ав”с воему с оз дателю получ ить гигантс кий грант на соз дание клонированной овеч ьей отары . К лонированны е в раз лич ны х лаб оратория х мы ш и характериз ую тс я пониженной жиз нес пос об нос тью и также “вы держиваю т”наэтом с вете не б олее половины с редней продолжительности жиз ни, их об уч аемость по с равнению с “исходны м об раз цом”ос тавля ет желать луч ш его (э то к вопрос у о клонировании гениев! К ак б ы вместо гениев не получ илис ь идиоты !). Н едавними раб отами американских уч ены х доказ ано, ч то у клонированны х таким с пособ ом млекопитаю щ их примерно 4% генов раб отаю тненормально. С ледовательно, невоз можно ожидать точ ного копирования об раз цов. Более того, такие аномалии в раб оте генов непременно приведут к раз витию уродств раз лич ного рода. К роме вс его проч его, ус ловия раз ви-

52

тия в матке раз ны х матерей б удутраз лич атьс я . Э то оз нач ает, ч то в раз ны х ус ловия х развития з ароды ш аодинаковы е гены б удутраб отать по-раз ному. Т .е. вероя тнос ть полного с ходс тва “клонированны х”животны х б удет не оч ень велика. Н е с луч ай но “создатель”Д олли Я н В ильмут вмес те с вы даю щ имс я с пециалис том по э мб риологии млекопитаю щ их Я ниш ем напис али в журнале “Science”з аметку “Н екл он и р уйт ел ю дей!”. Д ей с твительно, допус тим, ч то транс плантировали раз виваю щ иес я я й цеклетки с ч ужеродны ми я драми нес кольким с отня м приемны х матерей (ведь процентвы хода низ кий !), ч тоб ы получ ить хотя б ы одну единс твенную живую копию , например, видного политич ес кого дея теля . А ч то б удет с остальны ми з ароды ш ами? В едь б ольш ая ч асть погиб нет в утроб е матери или раз овьетс я в уродов, ч асть которы х, не дай Бог, родитс я . П редставля ете с еб е – с отни ис кус с твенно получ енны х ч еловеч ес ких уродов. И менно поэ тому из вес тны й уч ены й , ч лен-коррес пондент РАН Л .И . Короч кин рас с матривает клонирование лю дей как прес тупление и вы с тупает з а приня тие Г ос ударс твенной Д умой моратория наманипуля ции с ч еловеч ес кими з ароды ш ами. Дл я чего п р оводят кл он и р ован и е ж и вот н ы х? П оя вление клонов важно для ис пы тания новы х лекарс тв, ус ловий развития младенцев. П олная с хожес ть организ мов дает воз можнос ть с равнивать влия ние на них раз лич ны х препаратов и внеш них ус ловий (например, оценивать мутагеннос ть раз лич ны х химич ес ких соединений ). И с с ледования по клонированию животны х имею т важное ф ундаментальное з нач ение. О ни позволя ю т вы я с нить механиз мы диф ф еренцировки клеток в процес с е онтогенез а и можно ли э тим процес сом управля ть. Э то путь к генотерапии, ис кус с твенному с оз данию органов для транс плантации. Н аконец, такие ис с ледования представля ю т б ольш ой интерес для размножения транс генны х животны х, которы е могутутеря ть ч ужеродны й ген в процес с е полового раз множения . П ервы й клон транс генны х с ельс кохоз я й с твенны х животны х б ы л получ ен в 1997 г. на овцах методом пересадки я дер эмб риональны х ф иб роб лас тов, нес ущ их в с воем геноме ген ф актора с верты вания крови ч еловека FIX. П ервое раз множение транс генны х животны х с ис пользованием соматич ес кого клонирования б ы ло вы полнено в 1999 г. накоз ах. И с польз уя я дра э мб риональны х клеток (CFF6-1) плода коз , транс генны х по гену антитромб ина III ч еловека (rhAT), б ы л получ ен клон из трех транс генны х животны х, идентич нос ть которы х доказ анаметодом С ауз ерн – б лоттинг. 6. М Е ДИ Ц И Н С К И Е А С ПЕ К ТЫ Г Е Н Е ТИ ЧЕ С К О Й И Н Ж Е Н Е РИ И ЧЕ Л О В Е К А М едицинс кие ас пекты генетич ес кой инженерии ч еловека з атрагиваю тв ос новном 2 круга проб лем – диагнос тику з аб олеваний и генную терапию .

53

6.1. Г еноди агност и ка Ген оди агн о ст и ка – с овокупность методов по вы я влению из менений в с труктуре генома. Г енодиагностика- относ ительно новы й раз дел диагнос тики, получ ивш ий раз витие в пос ледние дес я тилетия . У с пехи с овременной медицины во многом з авис я т от того, насколько рано и точ но можно диагнос тировать наиб олее рас прос траненны е генетич ес кие и инф екционны е з аб олевания , а также новооб раз ования . Н апример, проф илактику и леч ение лю б ого инф екционного з аб олевания з нач ительно об легч аетрання я диагнос тикаи точ ная идентиф икация вы з вавш его его патогенного микроорганиз ма. Т радиционно для проведения диагнос тич еской процедуры с нач ала вы ращ иваю т культуру потенциально патогенного микроорганиз маи лиш ь з атем анализ ирую тс пектр его ф из иологич ес ких с вой с тв. Х отя подоб ны е тесты вес ьмаэ ф ф ективны и об ладаю тдос таточ но вы сокой с пециф ич нос тью , они ч асто з анимаю т много времени и я вля ю тс я дорогос тоя щ ими. Э то относ итс я к идентиф икации и б актерий , и параз итич ес ких микроорганиз мов. К роме того, вес ьмаогранич енавоз можнос ть вы я вления тех патогенны х микроорганиз мов, которы е плохо рас тут в культуре, либ о вооб щ е не поддаю тся культивированию . К их ч ис лу относ я тс я , например, об лигатны е внутриклеточ ны е параз иты Chlamydia trachomatis, которы е вы з ы ваю т хламидиоз , б олез нь, передаю щ ую с я половы м путем. Г енная инженерия ввела в практику Д Н К -диагнос тику, ос нованную навы я влении с пециф ич ес ких нуклеотидны х пос ледовательнос тей в б иологич ес ких об раз цах методом гиб ридиз ации (Д Н К -Д Н К , Д Н К -РН К ) или полимераз ной цепной реакции (П ЦР). Г иб ридиз ация нуклетновы х кис лот ос нована на применении з ондов, ис польз ую щ ихс я для вы я вления комплементарны х пос ледовательностей (ис комого уч ас тка Д Н К ). И с польз ование метода полимераз ной цепной реакции (П ЦР) для мультипликации тес тируемой Д Н К об ес печ ивает вы с окую ч увс твительнос ть э тих з ондов. Зонды применя ю тс я : 1) в клинич ес кой микроб иологии для об наружения генов или нуклеотидны х пос ледовательностей , с пециф ич ны х для воз б удителя инф екционного з аб олевания , определения патогенны х микроорганиз мов – б актерий , вирус ов и прос тей ш их. С помощ ью э того методаможно об наружить в тканя х единич ны е б актериальны е клетки или ч ас тицы : хламидии, вирус гепатита С , воз б удителей туб еркулез а и др.; 2) для диагностики нас ледс твенны х з аб олеваний путем нахождения с пециф ич ес ких из менений в генах. П реимущ ес тва Д Н К -диагностики – б ы с трота (воз можнос ть рутинного применения ), надежнос ть, вы сокая ч увс твительность и с пециф ич нос ть, Д и агност и ка наследст венны х заболевани й. М ногооб раз ие ф орм нас ледс твенны х б олез ней (а их уже из вес тно около 5 ты с .), из менч ивос ть их клинич еских проя влений и ч ас то отс утс твие радикального леч ения делаю т ос об енно актуальной разраб отку точ ны х ранних (пре- и пос тнатальны х) методов диагнос тики этих б олез ней , а также вы я вления нос ителей генов нас ледс твенны х з аб олеваний . А это прежде вс его Д Н К -диагнос тика

54

и молекуля рная цитогенетика. Г иб ридиз ационны е з онды с пособ ны вы я вля ть раз лич ия в тес тируемы х пос ледовательнос тя х, с ос тавля ю щ их даже один нуклеотид. П одоб ны е з онды с ущ ествую тдля диагнос тирования б олее 1000 нас ледс твенны х з аб олеваний , в том ч ис ле, ф енилкетонурии, с ерповидно-клеточ ной анемии, деф ицита α-антитрипс ина, мы ш еч ной дис троф ии, б олез ни Альцгей мераи др. О дно из наиб олее продвинуты х направлений – Д Н К -диагнос тика и леч ение муковис цидоз а (кистоз ного ф иб роз а поджелудоч ной желез ы ) - с амого ч астого нас ледс твенного з аб олевания в европеоидны х популя ция х, атакже гемоф илий . Г иб ридиз ационны е з онды к минис ателлитам, метод П ЦР с тали э ф ф ективны м с редс твом в ген ом н ой дакт и ло скоп и и , т.е метода вы я вления индивидуальны х раз лич ий и ос об енностей у лю дей на уровне с труктуры Д Н К . Г еномная дактилос копия ш ироко применя етс я в об ласти криминалис тики и с удеб но-медицинс кой экс пертиз ы (для идентиф икации лич нос ти). М етод ос нован на том, ч то Д Н К каждого ч еловека об раз ует уникальны й наб ор гиб ридиз ационны х полос . П ри э том в кач естве з ондов об ы ч но ис польз ую т минис ателлитны е Д Н К ч еловека, которы е не кодирую т никаких б елков и отлич аю тс я вы с окой вариаб ельностью . Анализ амплиф ицированны х с помощ ью П ЦР уч ас тков мтД Н К поз волил идентиф ицировать ос танки пос леднего рус ского царя Н иколая II и его с емьи. 6.2. Г енная т ерап и я В нас тоя щ ее время нет с пособ ов для ис правления деф ектов генетич ес кого материала ч еловека, я вля ю щ ихс я прич иной раз вития нас ледс твенной патологии. П ри вс ех нас ледс твенны х з аб олевания х ш ироко применя етс я с имптоматич ес кое леч ение, с помощ ью которого удаетс я в той или иной мере с низ ить тя жес ть клинич ес кой картины б олез ни. О но вклю ч ает применение раз лич ны х лекарственны х препаратов, ф из иотерапевтич еское леч ение, климатолеч ение и др. П ри некоторы х нас ледс твенны х б олез ня х такое леч ение я вля етс я единс твенно возможны м с пос об ом об легч ения раз вивш ей с я с имптоматики. Больш ие перс пективы в леч ении нас ледс твенны х з аб олеваний ч еловекаоткры вает ген н ая т ер ап и я (ген от ер ап и я), воз можнос ти которой сегодня интенс ивно из уч аю т, э кс периментируя на раз лич ны х б иологич ес ких моделя х (клетках б актерий , рас тений , животны х, ч еловекаи др.) и ис польз уя в клинич ес кой практике. Ген н ая т ер ап и я – это ус транение генетич ес ких деф ектов (коррекция нас ледс твенны х патологий ) путем введения в с оматич ес кие клетки полноценны х (ф ункционально активны х) генов вмес то (или помимо) поврежденного (мутантного) гена. Э то с пос об ы леч ения раз лич ны х з аб олеваний , ос нованны е на введении в организ м ч ужеродной генетич ес кой инф ормации с целью получ ения терапевтич ес кого э ф ф екта. Т .е. генотерапия направлена на компенс ацию наруш енны х ф ункций клетки на генетич еском уровне. П рич ем, таким с пос об ом воз можно леч ение не только генетич ес ких, но и других неинф екционны х и инф екционны х з аб олеваний (рак,

55

С П И Д и т.п.), поэ тому методы генной терапии раз лич ны . В с луч ае генетич ес ких б олез ней генная терапия ос ущ ес твля етс я путем введения нормального гена(транс гена, находя щ егос я в с ос таве генно-инженерной конс трукции) в ту ткань, где э тотген должен ф ункционировать. К рай не желательно, ч тоб ы введение с опровождалос ь з амещ ением мутантного аллеля . О днако технич ески э то пока не удаетс я , и об ы ч но доб авленны е в клетки гены ф ункционирую тнаф оне мутантны х в с илу с воей доминантнос ти. К ак уже отмеч алос ь, опис ано около 5 ты с . нас ледс твенны х з аб олеваний у ч еловека, но только примерно для ты с я ч и из них най дены и картированы повреждаемы е гены . С оглас но последним данны м, деф екты в 770 генах вы з ы ваю т моногенны е з аб олевания (мы ш еч ная дис троф ия Д ю ш енна, ф енилкетонурия , хорея Г ентингтона, б олез нь Г ош е - лиз ос омная б олез нь накопления , гемоф илии А и В и др.). Больш ая ч асть э тих генов клонирована и ведетс я поис к методов их ис пользования для генной терапии. В том с луч ае, когда б олез нь с вя з ана с отс утс твием или малы м колич еством б елкового продукта (ч то характерно для дей с твия рецесс ивного мутантного гена) ис польз уетс я так наз ы ваемая з амес тительная терапия : в клетку вводитс я неповрежденны й ген и с оз даю тс я ус ловия для его э кс прес с ии (наря ду с э кс прес с ией мутантного гена) с целью получ ения дос таточ ного колич ес тва нормального б елка-продукта. П ри корректирую щ ей терапии деф ектны й ген реально з аменя ется в геноме нормальной копией (например, путем з амены пары нуклеотидов, с вя з анной с данны м деф ектом в мутантном гене, на“правильную ”пару). Больш инс тво же генетич еских б олез ней я вля ю тс я полигенны ми (атерос клероз , рак, артрит и др.). В э том с луч ае предлагаетс я не ис правля ть генетич еские деф екты , а вводить такие гены , которы е ос лаб ля ю т пос ледс твия этих деф ектов. Н апример, генная терапия некоторы х видов рака раз виваетс я по линии повы ш ения иммунного ответапо отнош ению к раковы м клеткам и по линии индуцирования гиб ели раковы х клеток путем дос тавки к ним таких вещ ес тв, которы е в процес с е метаб олиз ма об раз ую т токс ич ес кие для них молекулы . В с луч ае, когда опухоль б ы ла вы з вана с уперэ кс прес с ией онкогена K-RAS, ее дальней ш ее раз витие удалос ь предотвратить введением в клетки ретровирус ного вектора, об ес печ иваю щ его с интез антис мы с ловой РН К , комплементарной к мРН К онкогена. Белок p53 я вля етс я с упрес с ором и подавля ет раз витие опухолей , а его деф ектнос ть вы з ы ваетрак. Л еч ение таких б ольны х з аклю ч аетс я в введении неповрежденного гена – с упрес сора р 53 в опухолевы е клетки (деф ектны е по гену р 53), ч то приводитк их гиб ели. В ирус ны е инф екции могут рас с матриватьс я как приоб ретенны е генетич еские з аб олевания , поскольку некоторы е из них (вирус Э нш тей наБарр, вирус гепатита В ) могут вы з вать раз витие рака у инф ицированны х индивидуумов. Г енная терапия таких лю дей может з аклю ч атьс я во введении в определенны е ткани генов с антивирус ны м э ф ф ектом, ч тоб ы предотвратить их онкотранс ф ормацию . В ы я вление таких тканей (клеток) определя ет ус пех генной терапии. Н апример, из вес тно, ч то ос новной миш енью

56

для вирус а иммунодеф ицита ч еловека (В И Ч ) я вля ю тс я CD4 лимф оциты , которы е можно легко вы деля ть из организ ма, вводить в них нужны й ген (например, антис мы с ловой РН К для вирус ной мРН К ) и воз вращ ать об ратно. Цель манипуля ций – предотвратить в клетках раз витие вирус а(я вление предложено наз ы вать внутриклеточ ны м иммунитетом). 6.3. М ет оды генной т ерап и и П ринципиальны й с мы с л генной терапии з аклю ч аетс я в з амещ ении мутантного б елка клеток ч еловека (с которы м с вя з ано развитие б олез ни) на с оответствую щ ий нормальны й б елок, которы й б удет с интез ироватьс я в таких клетках. Д ля леч ения з аб олевания на молекуля рном уровне применя ю т два ос новны х подхода. 1. Г енная терапия ex vivo - введение “з дорового”гена (генов) в вы деленны е из организ маб ольного и культивируемы е in vitro соматич ес кие клетки (т.е. в клетки-миш ени вне организ ма) с пос ледую щ ей имплантацией транс ф ормированны х клеток об ратно в организ м (в органы или кровоток). 2. Г енная терапия in vivo - введение генанепос редственно в ткань или орган б ольного с генетич еским деф ектом, рис унок 17. Д ля получ ения терапевтич еского э ф ф ектанеоб ходимо ввес ти гены в б ольш ое ч ис ло клеток ткани-миш ени, для ч его б олее подходя т методы ex vivo. Д ля перенос а генов ч ащ е вс его ис польз ую т относ ительно легко дос тупны е клетки: ф иб роб лас ты , лимф оциты , клетки печ ени - гепатоциты , каратиноциты , э ндотелиальны е и мы ш еч ны е клетки, с тволовы е клетки кос тного моз га. Т акие клетки можно из влеч ь из организ ма, вклю ч ить в них нужную генную конс трукцию , провес ти отб ор и культивирование in vitro транс ф ормированны х клеток, а з атем вновь ввес ти их (реимплантировать) в организ м б ольного. П ри э том у реципиента не раз виваетс я нежелательного иммунного ответа, но с амапроцедурая вля етс я вес ьмадорогос тоя щ ей и трудоемкой . О с ущ ествление э тих раб от воз можно лиш ь в крупны х с пециализ ированны х центрах, треб ует б ольш их материальны х з атрат и вы с оких б иотехнологий . В нас тоя щ ее время в клиниках экс периментирую тс Tлимф оцитами (ос тры й комб инированны й иммунодеф ицит, вы з ванны е деф ектом в гене ADA), миоб лас тами (мы ш еч ная дис троф ия Д ю ш енна: деф ект в гене дис троф ина), ф иб роб ластами (гемоф илия – деф екты в генах ф акторов IX или VIII), клетками э пителия б ронхов (муковис цидоз – деф ектв гене CF-транс мемб ранного ф актора) и гепатоцитами (с емей ная гиперхолес теринемия – деф ект в гене рецептора липопротеинов низ кой плотнос ти). П рич ем, “з доровы е”гены необ я з ательно вводя тв те клетки, где они в норме экс прес с ирую тс я . Н апример, ф акторы IX и VIII с интез ирую тс я в гепатоцитах, но в леч еб ны х целя х их гены вводя тв ф иб роб лас ты . В том с луч ае, когда клетки с деф ицитны м геном нельз я из влекать и культивировать, проводя т транс геноз in vivo (инъ екции в ткань рекД Н К , рекомб инантного вирус а, липос ом с Д Н К и др.). Э то оч ень перс пективны й подход, рас с ч итанны й на мас совое леч ение ш ироко рас прос траненны х з а-

57

б олеваний , однако пока он апроб ирован только для леч ения мус ковис цидоз а.

Рис унок 17. Д ве с тратегии генотерапии: введение терапевтич ес ких генов в клетки-миш ени вне организ ма(а) или внутри организ ма(б ) [Ры б ч ин, 1999] Каки есущ ест вую т си ст ем ы п ер ен оса чуж ер одн ы х ген ов? Д ля э той цели ис пы ты ваю тс я плаз мидны е и вирус ны е (ретровирус ны е, аденовирус ны е) векторы (комплекс вирус ная Д Н К -ген ч еловека), инъ екция ч ис той Д Н К , б омб ардировка микропуля ми, транс ген в с ос таве липосомного комплекс а, транс плантация клеток и др. П режде ч ем прис тупать к генной терапии ч еловека, каждая конкретная с ис тема (определенны й ген, вектор, ткань, с пособ введения вектора в

58

клетки ткани и клеток в организ м) должна б ы ть апроб ирована в аналогич ны х ус ловия х на животны х. Э то необ ходимо для того, ч тоб ы уб едитьс я , ч то новы й ген можно вводить в клетки определенны х тканей и ч то он с охранитс я достаточ но долго, б удет э кс прес с ироватьс я в клетках на необ ходимом уровне и не прич инитвреда(клетке или вс ему организ му). 6.4. П ри м еры п ракт и ч ескогоп ри м енени я генной т ерап и и П ервая ус пеш ная попы тка применить генотерапию в клинич ес кой практике б ы ла предприня та в 1990 году в С Ш А для из леч ивания у 4летнего реб енка иммунодеф ицита, об ус ловленного мутацией в гене аденоз индез аминаз ы (ген ADA). П ри э том з аб олевании в крови накапливаетс я в вы с окой концентрации 2’-дезокс иаденоз ин, оказ ы ваю щ ий токс ич ес кое воз дей с твие на Т - и B-лимф оциты . П ациенты не перенося т контактов с лю б ой инф екцией из -з а тотального отс утс твия иммунитета. У б ольного реб енкаиз влекали клетки Т -лимф оциты крови, культивировали в проб ирке и при помощ и ретровирус ного вектора вводили неповрежденны й ген (нормальную копию гена ADA), кодирую щ ий аденоз индез аминаз у. Рекомб инантны е клетки вы рас тили до об щ его колич ества в нес колько миллиардов и ввели в кровь пациентке. Н апротя жении 10,5 мес я цев пациентке б ы ло с делано 8 аутологич ны х вливаний транс ф ормированны х лимф оцитов и пос ле полугодового переры ва программу реинф уз ии повторя ли кажды е 35- мес я цев. У же пос ле первого цикла ч ис ло Т -лимф оцитов нормализ овалос ь, концентрация ADA в циркулирую щ их клетках крови увелич илас ь с 1 до 20-25% нормального уровня и рез ко улуч ш илис ь ос новны е иммунны е характерис тики. Н а протя жении б олее ч ем 6 мес пос ле прекращ ения мас с ированны х вливаний в кровотоке пациентки ус той ч иво с охраня лос ь вы с окое ч ис ло корректированны х Т -лимф оцитов, ч то поз волило в дальней ш ем с низ ить колич ес тво вводимы х клеток и з нач ительно увелич ить промежуток между этими процедурами. Э то с об ы тие сч итаетс я “днем рождения генной терапии”. С 1990 г. стал из даватьс я журнал “Г енная терапия ”. Х орош ие перс пективы с ущ ествую т для из леч ения генноинженерны ми методами лизосомны х б олез ней накопления . Н а с егодня ш ний день поддаю тс я из леч ению с помощ ью транс генез а уже около 10 б олез ней ч еловека. Ря д ис с ледователей в раз ны х с транах полагаю т, ч то с егодня наиб олее реальна генотерапия муковис цидоз а. Э то тя желое, рецесс ивно нас ледуемое з аб олевание (поражаю щ ее в с транах Е вропы одного из 2500 новорожденны х), об ус ловленное деф ектами в гене CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator), которы е приводя тк поражению э кз окринны х желез и проя вля ю тс я ч ащ е вс его в виде б ронхолегоч ны х из менений . В протоках некоторы х органов (ос об енно в легких и поджелудоч ной желез е) с капливаетс я с лиз ь. О на с тановится ис точ ником б актериальной инф екции, которая с трудом поддаетс я леч ению антиб иотиками. П родолжительнос ть жиз ни б ольны х мус ковис цидоз ом сос тавля ет в нас тоя щ ее время 25-30 лет. Н адея тьс я наб олее б ы с тры й ус пех генотерапии поз воля етдоступнос ть ле-

59

гоч ной ткани для ингаля ций ; тем б олее ч то, по имею щ имс я данны м, для терапевтич еского э ф ф екта достаточ но вс его 5 - 10% нормально ф ункционирую щ их клеток. С реди воз можны х векторов для дос тавки корригирую щ их Д Н К к клеткам и тканя м-миш еня м при генотерапии муковис цидоз а рас с матриваю тс я вирус ны е, плаз мидны е и липос омны е конс трукции. Н апример, для леч ения легоч ной ф ормы муковис цидоза леч еб ны й ген, вклю ч енны й в липос омы , вводя тв ды хательны е пути в ф орме аэ роз оля . О днако до клинич еских ис пы таний предс тоит ещ е реш ить непрос ты е вопрос ы вз аимодей с твия генетич еских препаратов с клетками, устой ч ивос ти э ф ф ектаи т.д. В нас тоя щ ее время ус пеш но раз раб аты ваю тс я , в том ч ис ле и в наш ей с тране, генно-инженерны е подходы леч ения мы ш еч ной дистроф ии Д ю ш енна. М ы ш еч ная дис троф ия Д ю ш енна – з аб олевание, с цепленное с Х хромос омой , приводитк ранней инвалиднос ти и летальному ис ходу в воз рас те до 20 летодного из кажды х 3500 новорожденны х мальч иков. П рич иной з аб олевания я вля ю тся мутации (преимущ ес твенно делеции) гена (локализ ованного в Х -хромосоме), отвеч аю щ его з а с интез дис троф ина – мы ш еч ного б елка, играю щ его клю ч евую роль в поддержании с труктурной целос тнос ти, об ес печ ении нормальной троф ики и ф ормирования клеточ ного материала попереч но-полосаты х мы ш ц. О тс утствие дис троф ина приводит к прогрес с ирую щ ей дегенерации с келетны х и сердеч ны х мы ш ц. О дин из воз можны х подходов к терапии этой б олез ни – вос с тановление э кс прес с ии дис троф ина путем транс плантации миоб ластов в мы ш цы . М иоб лас ты я вля ю тс я предш ественниками клеток с келетны х мы ш ц и рас с матриваю тс я как клеточ ны й вектор б лагодаря с воей уникальной с пособ нос ти с ливатьс я с мы ш еч ны ми волокнами или об разовы вать новы е. М иоб лас ты легко вы деля ю тс я из мы ш еч ной ткани, хорош о вы ращ иваю тс я в культуре, сохраня я при э том с пособ нос ть к диф ф еренцировке. С таб ильная э кс прес с ия введенны х (нормальны х) генов в я драх транс плантированны х миоб ластов наб лю даетс я до 6 мес . О пис ан положительны й терапевтич еский э ф ф ект, когда21 мальч ику в воз рас те 6-14 лет, имею щ им э то з аб олевание, транс плантировали в мы ш цы нормальны е миоб лас ты , вз я ты е от б ратьев или отца и вы ращ енны е в культуре до нужного колич ес тва. И нъ екции произ водилис ь в раз ны е мы ш цы об еих нижних конеч нос тей . Ранее неподвижны й реб енок приоб ретал с пособ ность двигаться ! В опы тах с мы ш ами введенны е в кровоток миоб лас ты , содержащ ие ген гормонарос тач еловека, вош ли в с остав мы ш еч ной ткани и экс прес с ировали э тот ген, ч то поз воля етрас с матривать воз можнос ти ис польз ования миоб ластов для дос тавки генов, кодирую щ ие другие гормоны , рос товы е ф акторы , противоопухолевы е агенты . Д ругой генно-инженерны й подход леч ения мы ш еч ной дис троф ии Д ю ш енна– ген дис троф инавводя тнепос редс твенно в с келетны е мы ш цы с мы ш еч ной дис троф ией путем инъ екции. П роцедура должна неоднократно повторя ться . В екторная Д Н К попадаетв кровь и раз нос итс я по вс ему организ му. В опы тах намы ш ах показ ано, ч то увелич ение колич ествагенадис -

60

троф инапроисходило не только в с келетны х мы ш цах, но также в диаф рагме и в с ердце, поражение которы х – одна из ч ас ты х прич ин с мерти. Г ен дис троф ина э кс прес с ируетс я и оказ ы вает терапевтич ес кий э ф ф ект. У же ч ерез 20 дней пос ле б аллистич еской транс ф екции попереч ны е раз меры мы ш еч ны х волокон (с одержащ их дос тавленны й ген) приб лижалис ь к нормальны м. Д ля с ня тия с имптомов з аб олевания необ ходимо вос с тановить экс прес с ию дис троф инапримерно в 20-30% мы ш еч ны х волокнах. П ри леч ении “с емей ной гиперхолес теринемии” , об ус ловленной мутацией б елка-рецептора, которы й в клетках печ ени должен с вя з ы вать ч ас тицу, перенос я щ ую холес терин в плаз ме крови, у б ольного отс екаю т 200300 г печ ени. Г епатоциты (клетки печ ени) культивирую т и подвергаю т транс ф ормации в лаб ораторны х ус ловия х. В них вводя т нормальны й ген, ис польз уя в кач естве векторааденовирус или путем б омб ардировки клеток из с пециальной “генной пуш ки”з олоты ми пульками, т.е. ч астицами з олота с нанес енны ми на них ф рагментами Д Н К , вклю ч аю щ ими леч еб ны й ген. Т ранс ф ормированны е гепатоциты вводя тб ольному об ратно в печ ень ч ерез кровенос ны е с ос уды . С ходная процедура ос ущ ествля етс я при леч ении врожденного иммунодеф ицита, б олез ни Г ош е, для некоторы х ф орм рака. В пос леднем с луч ае в клетки дос тавля етс я ген-с упрес с ор опухоли p-53. В нас тоя щ ее время раз раб аты ваетс я ря д подходов для леч ения некоторы х опухолей генно-инженерны ми методами. Т ак, например, для леч ения меланом ис польз ую т инф ильтрирую щ ие опухоль лимф оциты , в которы е введен ген ф акторанекроз аопухоли. П ри введении таких лимф оцитов в пораженны й организ м наб лю дается леч еб ны й э ф ф ект. И мею тс я данны е о воз можнос ти леч ения опухолей головного моз гапри ис польз овании ретровирус ны х векторов, которы е перенос я т об ладаю щ ий леч еб ны м э ф ф ектом транс ген только в деля щ иес я клетки опухоли, но не з атрагиваю т при э том деля щ иес я клетки. В международны х документах В с емирной организ ации з дравоохранения , Ю Н Е С К О , С овета Е вропы и других приз наетс я э тич ес ки допустимой только генотерапия с оматич ес ких, но не з ароды ш евы х клеток, пос кольку прогноз отдаленны х пос ледс твий и поб оч ны х э ф ф ектов пос ледней невоз можен. С вою роль должны с ы грать и методы вы ращ ивания и ис с ледования э мб рионального материалавне организ ма(in vitro). В С М И 2001 г. поя вилис ь с енс ационны е с ооб щ ения о рождении в С Ш А первы х генетич ес ки модиф ицированны х детей . Г енно-инженерны й подход ис польз ован для преодоления врожденного б ес плодия женщ ин, вы з ванного деф ектом митохондрий . И з вестно, ч то инактивация в рез ультате мутаций митохондриальны х генов я вля етс я прич иной раз лич ны х патологич ес ких с ос тоя ний – от нас ледственной с лепоты и глухоты до диаб ета и с тарч ес кого с лаб оумия . В с е митохондриальны е з аб олевания (так же, как и с ами митохондрии) нас ледую тс я по материнс кой линии. Г енетич ес ки модиф ицированны е дети поя вилис ь у об реч енны х наб ес плодие матерей б лагодаря перенос у в их я й цеклетки Д Н К недеф ектны х митохондрий . Д ля э того в я й цеклетку женщ ины , с традаю щ ей б ес плодием, тонч ай ш ей пипет-

61

кой вводитс я с перматоз оид мужа и капелька цитоплаз мы из я й цеклетки з доровой женщ ины -донора. П еренес енны е митохондрии донора приживаю тс я в я й цеклетке, вос с танавливаю т нормальны й уровень э нергетич еского метаб олиз маклетки и об ес печ иваю тее дальней ш ее нормальное раз витие в матке матери, куда подвергш ая с я микрооперации я й цеклетка воз вращ аетс я . И з 15 детей , ис кус с твенно з ач аты х с помощ ью такого подхода, 13 живут в С Ш А, 1 реб енок в В еликооб ритании, 1 – во Ф ранции. И з уч ение мтД Н К двух младенцев показ ало, ч то в их клетках дей с твительно прис утс твую тмитохондрии как родной матери, так и женщ ины -донора. Т аким об раз ом, в б удущ ем генная терапия может с тать одним из ведущ их направлений в леч ении нас ледственно патологии ч еловекав с вя з и с воз можнос тью ис правля ть ф ункции генетич ес кого аппарата б ольного, нормализ уя , таким об раз ом, его ф енотип. 7. ПРО Б Л Е М Ы Б И О Б Е ЗО ПА С Н О С ТИ ТРА Н С Г Е Н Н Ы Х О РГ А Н И ЗМ О В 7.1. П онят и е оби обезоп асност и . П ри рода ри сков для здоровья ч еловека и окруж аю щ ей среды , связанны х с и сп ользовани ем т рансгенны х органи зм ов, м ет оды оц енки и сп особы п редуп реж дени я Г енетич ес кая инженерия – передовое направление науки. В оз можнос ть манипулировать генами – одно из велич ай ш их дос тижений б иологии XX века, но оно наклады ваетна уч еного б ольш ую ответственнос ть з авоз можны е экологич ес кие пос ледс твия такого манипулирования , которы е необ ходимо уч иты вать наря ду с рос том э кономич ес кой вы годы отполуч ения транс генны х организ мов. Н ельз я з акры вать глаз а на то, ч то генетич ес кая инженерия может привес ти и к рез ультатам, опас ны м для ч еловека. П ри об ъ единении раз нородны х генов могут воз никнуть молекулы Д Н К с непредсказ уемы ми с вой с твами. О соб енно опас ны опы ты , которы е могут привес ти к поя влению ф орм б олез нетворны х б актерий , ус той ч ивы х к антиб иотикам и другим медикаментам, а также опы ты с вирус ами, вы з ы ваю щ ие з локач ес твенны е опухоли. П оэ тому в лаб оратория х, з анимаю щ ихс я генной инженерией , необ ходимо с об лю дение с трогих мер, предотвращ аю щ их получ ение опас ны х рез ультатов. Т акие меры с ей ч ас разраб отаны уч ены ми раз ны х с тран и должны об я з ательно соб лю датьс я . С оз навая с ерьез ную ответс твеннос ть перед ч еловеч ес твом з авмеш ательс тво в природу организ мов, уч ены е, з анимаю щ иес я генной инженерией , с пос об с твовали раз витию нового науч ного направления – би обезоп асн ост и . Главн ая задача э того направления – оценить, не нес етли ис польз ование Г М О нежелательное воз дей ствие на окружаю щ ую с реду, з доровье ч еловека и животны х, аглавн ая ц ел ь – откры ть путь к ис польз ованию дос тижений с овременной б иотехнологии, гарантируя при э том б езопас ность. П од би обезоп асн ост ь ю понимаетс я з ащ ищ еннос ть ч еловека, об щ ес тва, цивилиз ации и окружаю щ ей с реды от вредного воз дей с твия , опас ного для

62

жиз ни и з доровья лю дей токс ич ны х и аллергенны х б иологич ес ких вещ ес тв и с оединений , содержащ ихс я в природны х или генно-инженерномодиф ицированны х б иологич ес ких об ъ ектах и получ енны х из них продуктов. В 1974 г. одиннадцать ведущ их молекуля рны х б иологов мираво главе с отцом генной инженерии американцем П . Бергом, с оз давш им первую рекомб инантную молекулу Д Н К , об ратилис ь к мировому с ооб щ ес тву с пис ьмом ч ерез журнал “Science”, в котором предложили отказ атьс я отэ кс периментов с рекомб инантны ми Д Н К до проведения международной конф еренции по э той проб леме. О днако уже в 1975 г. на конф еренции в Ас иломаре (С Ш А) уч ены е приш ли к вы воду, ч то э кс перименты в об ласти б иотехнологии, генной инженерии не б олее опас ны , ч ем аналогич ны е раб оты в других отрас ля х, но в них, как и вез де, необ ходим с трогий контроль з а с об лю дением мер б иоб езопас нос ти. В 1976 г. в С Ш А б ы ли приня ты первы е правила, регламентирую щ ие раб оту с рекомб инантны ми микроорганиз мами. В ажнос ть контроля з а ис пользованием новы х методов б иотехнологии с вя з ана с оз аб оч еннос тью об щ ественности тем, ч тоб ы не воз никла проб лема«б иологич ес кого Ч ерноб ы ля ». В ч ем могут з аклю ч атьс я прич ины и какова природа рисков от ис польз ования генетич ески модиф ицированны х организ мов (Г М О )? М ожно вы делить три группы таких прич ин: 1. О б щ еб иологич еские. 2. В оз дей с твие наз доровье ч еловека. 3. Загря з нение окружаю щ ей с реды . 1. И з вестно, ч то вс траивание транс генов проис ходит с луч ай ны м об раз ом, т.е. новы е гены могутвстроитьс я в лю б ую ч ас ть я дерного генома, в рез ультате ч его ф ункционирование других б лиз лежащ их генов можетб ы ть наруш ено, вплоть до их “з амолкания ”(с ай ленс инга), или, наоб орот, с уперэкс прес с ии. В пос леднем с луч ае с орта растений , об раз ую щ ие какие-либ о токс ич ны е с оединения (например, с оланины картоф еля ) в концентрация х, б ез вредны х для з доровья ч еловека, могут ус илить их с интез до уровня , превы ш аю щ его предельно допус тимы е з нач ения . К роме того, привнес енны й ген может вс троитьс я в об лас ть Д Н К , уже з аня тую другим геном, в рез ультате ч его продукт данного генаоб разовы ватьс я не б удет, ч то может привес ти к наруш ению определенной ф ункции в организ ме. П равда, вероя тнос ть э тих соб ы тий с лиш ком мала, т.к. ос новную ч асть в геноме э укариотич ес ких организ мов з анимает из б ы точ ная (некодирую щ ая ) Д Н К . Н а долю же структурны х генов и их регуля торны х э лементов приходитс я вс его около 10%. Т .е. структурны е гены в молекуле Д Н К рас положены не плотно один з а другим (как кадры на ф отопленке), а ч ерез б ольш ие промежутки, з аня ты е некодирую щ ими пос ледовательнос тя ми нуклеотидов. Более того, даже в пределах с труктурного гена имею тс я некодирую щ ие уч ас тки (интроны ), которы е вы рез аю тс я в ходе с оз ревания мРН К .

63

- В нас тоя щ ее время не хватает данны х о ф ункционировании из мененной Д Н К и воз можнос ти неб лагоприя тны х мутаций . - И с пользование генетич ес ки однородны х Г М О можетпривес ти к их одновременной гиб ели в рез ультате патогенного воз дей с твия гриб ов, вирус ов и пес тицидов. - Г М О могут б ы ть перенес ены нас екомы ми, птицами в другие рай оны . Э то в с вою оч ередь может вы з вать из менение ф лоры и ф ауны э тих рай онов. 2. В оз можнос ть поб оч ны х э ф ф ектов от из менения с ос тава пищ и ч еловека. - В оз никновение мутаций у Г М О и, в с вя з и с э тим, об раз ование новы х вещ еств в пищ е. - Раз витие неиз вес тны х аллергич еских реакций в рез ультате с интез а новы х для Г М О б елков-продуктов. - С нижение питательной ценнос ти продуктов питания , получ аемы х из Г М О . - В оз можнос ть перенос а транс генов в другие организ мы : вертикальны й перенос генов от Г М О диким с ородич ам культурного вида или гориз онтальны й перенос генов, например селективны х генов ус той ч ивос ти к антиб иотикам от генетич ес ки модиф ицированного рас тения микроорганиз мам пищ еварительного тракта (в том ч ис ле б олез нетворны м). В э том с луч ае гены и их продукты , б ез об идны е у Г М О , могут оказ атьс я вес ьма опас ны ми в другой генетич еской и экологич ес кой среде. Т ак, одним из главны х возражений против употреб ления “т р ан сген н ы х”п и щ евы х п р одукт ов (или их ещ е наз ы ваю тген ет и чески м оди фи ц и р о ван н ы м и и ст очн и кам и п и щ и – ГМ И ) я вля етс я налич ие во многих из них генов ус той ч ивости к антиб иотику (в ч ас тности, к канамицину), которы е с одержалис ь в ис ходной конс трукции Д Н К в кач естве с елективны х. П редполагаетс я , ч то э ти гены ус той ч ивос ти могутпри переваривании пищ и передаватьс я э ндогенной микроф лоре, в том ч ис ле патогенной , в рез ультате ч его микроб ы могут приоб рес ти рез ис тентность к данному антиб иотику. О днако в реальнос ти вероя тнос ть такого с об ы тия нич тожно мала(онаоцениваетс я как приб лиз ительно 10-17). Н е с тоитз аб ы вать, ч то вс траиваемы е в рас тения гены ус той ч ивос ти “нас троены ”для э кс прес с ии лиш ь в э укариотич ес ких, но не б актериальны х клетках. Т ем не менее, протес ты об щ ес твеннос ти с делали с вое дело: генны е инженеры уже давно разраб аты ваю т подходы , ч тоб ы ис клю ч ить прис утс твие “подоз рительны х”генов в транс генны х рас тения х. В б ольш инс тве с луч аев маркерны е гены устой ч ивости к антиб иотикам з аменя ю тна гены ус той ч ивос ти к герб ицидам. П равда, применение “герб ицидны х”генов также вс треч ает воз ражение, но уже з ащ итников окружаю щ ей среды . У же с ей ч ас предложено несколько с пособ ов из б ирательной э лиминации маркерного гена пос ле получ ения желаемого транс генного рас тения , когда он ф актич ески уже не нужен. П ерс пективны м в э том плане я вля етс я з амена с елективны х генов на репортерны е при отб оре транс генны х ф орм рас тений .

64

С тратегия оценки б ез опас нос ти генетич ес ки модиф ицированны х ис точ ников пищ и ос нована на принципе “сущ ест вен н ой экви вал ен т н ост и ”, раз раб отанном OECD (О рганиз ацией экономич еского сотруднич ес тва и раз вития ). С оглас но э тому принципу, оцениваетс я не уровень б ез опас нос ти новы х продуктов питания как таковой , а его из менение в сравнении с традиционны ми пищ евы ми аналогами, имею щ ими длительную ис торию б ез опас ного ис польз ования . В едь потенциально опас ны ми для з доровья ч еловека и окружаю щ ей с реды могутб ы ть и с орта, породы , ш таммы организ мов, вы веденны е с помощ ью традиционной с елекции. Д ля того ч тоб ы вы ч ленить э ф ф ект именно генетич еской модиф икации, необ ходимо с равнивать генетич ес ки модиф ицированны й организ м с ис ходны м, об ы ч ны м с ортом. Т .е. проводя т тщ ательны й с равнительны й анализ генетич ески модиф ицированного организ ма и ис ходного (немодиф ицированного) организ ма. Д ля э того с опоставля ю т агрономич ес кие показ атели, продукты вс троенны х генов, с ос тав клю ч евы х химич ес ких компонентов, проф иль ос новны х метаб олитов и др. П ри оценке воз можной токс ич ности или аллергеннос ти транс генны х рас тений применя ю т те же жес ткие с тандарты , как и для получ енны х традиционны м путем новы х с ортов культурны х рас тений или новы х видов продуктов питания . Анализ “с ущ ес твенной ”э квивалентности Г М О и ис ходной линии наиб олее актуален для видов растений , которы е в принципе могут б ы ть опас ны ми для здоровья ч еловека: картоф ель, томаты (из -з атокс ич ны х гликоалкалоидов), хлопок (из -з атокс ич ного гос с ипола) и другие. Ч тоб ы транс генны й с орт б ы л допущ ен к хоз я й с твенному ис польз ованию , он не должен с ущ ественно отлич атьс я от исходного, кроме как по привнес енному в рез ультате транс генез априз наку или по приз накам, которы е б ы ли целью генетич ес кой модиф икации. 3. К ф акторам з агря з нения окружаю щ ей с реды в рез ультате ис польз ования Г М О можно отнес ти вз аимодей с твие Г М О с дикими родственны ми видами и ч ас то непредс каз уемы е из менения окружаю щ ей среды (например, риск переноса генов ус той ч ивос ти к герб ицидам от транс генны х рас тений к их диким с ородич ам-с орня кам). В других с луч ая х такие из менения можно с прогноз ировать. Т ак, доктор Э нн К апуч инс ки опис ы вает воз можны е пос ледствия от с крещ ивания модиф ицированны х ры б со вс троенны м гормоном роста, которы е б ы с трее рос ли и активнее раз множалис ь, с родс твенны ми им нормальны ми организ мами. О днако вы живаемость их потомс тваб ы ланиже, ч ем у нормальны х с об ратьев. П роб лема воз можного ущ ерб а для окружаю щ ей среды имеет нес колько ас пектов. Т ак, опас нос ть Г М Р для окружаю щ ей с реды может воз никнуть вс ледствие поя вления у них повы ш енной конкурентнос пос об нос ти (например, з а сч ет приоб ретенной ус той ч ивости к холоду, жаре, з ас ухе, з ас олению , б олез ня м и вредителя м), рез ультатом которой может с тать с окращ ение б иораз нооб раз ия рас тений и б ы с трое истощ ение поч вы , а ус той ч ивость к нас екомы м-вредителя м с пос об на наруш ить природное равновес ие.

65

В оз можнос ть поя вления с уперс орня ков и с упервредителей также ф игурирует с реди ос новны х проб лем, когдарас с матриваю тэ кологич ес кие рис ки, с вя з анны е с Г М О . Т ак, с ущ ествуетопас ение, ч то устой ч ивы е к герб ицидам культурны е рас тения могут при межвидовом опы лении передавать эти гены б лиз кородс твенны м с орня кам, которы е могутпревратитьс я в неис треб имы е с уперс орня ки (superweeds). С орня ки – э то группарас тений с определенны м наб ором адаптивны х приз наков, которы е помогаю т им с ущ ес твовать в окружаю щ ей с реде, в том ч ис ле с реди пос евов культурны х рас тений , нес мотря на жес ткую конкуренцию с о с тороны других организ мов, а также пос тоя нное воз дей ствие с о с тороны ч еловека, которы й вс еми воз можны ми с редс твами пы таетс я их из вес ти. К ак с ч итаю т с пециалис ты , вероя тнос ть такого соб ы тия оч ень мала. К роме того, в практике с ельского хоз я й с тва уже давно ис польз уетс я ря д ус той ч ивы х к герб ицидам с ортов, получ енны х путем об ы ч ной с елекции. П ри этом никакой э кологич ес кой катас троф ы ш ирокое ис польз ование таких ус той ч ивы х с ортов до с их пор не вы з вало. Т ем не менее, генны е инженеры активно раз раб аты ваю т подходы для ис клю ч ения подоб ной опас нос ти. К их ч ис лу относ ится , например, введение генов ус той ч ивос ти не в я дерны й , ав хлороплас тны й геном. Э то может предотвратить нежелательное рас прос транение генов с помощ ью пы льцы , т.к. хлороплас ты нас ледую тс я по материнс кой линии. К роме того, при оценке рис ка неб лагоприя тны х экологич еских э ф ф ектов Г М О об я з ательно анализ ируетс я с ам транс генны й приз нак на предмет его адаптивнос ти, атакже вероя тности его перенос адиким сородич ам. Н ежелательное с ледс твие ис пользования транс генны х рас тений с генами инс ектицидов з аклю ч аетс я в том, ч то пы льца э тих растений может б ы ть токс ич ной для полез ны х нас екомы х, которы е данной пы льцой питаю тс я . Н екоторы е э кс периментальны е данны е говоря т о том, ч то такая опас нос ть дей с твительно с ущ ествует. О днако и здес ь уже предложены и ис пы таны адекватны е генно-инженерны е реш ения . Н апример, ис польз ование транс генез а ч ерез хлоропластную Д Н К или промоторов, не раб отаю щ их в пы льце. М ожно конс татировать, ч то практич ес ки для вс ех вы двигаемы х воз ражений против ис польз ования транс генны х рас тений науканаходитадекватны е и эф ф ективны е ответы . Ч то кас аетс я практич ес ких рез ультатов проведения генноинженерны х ис с ледований , то наиб ольш ая оз аб оч енность у нас еления , ос об енно европей с ких стран, вы з ы вает воз можнос ть ис пользования транс генны х пищ евы х продуктов (Г М И ), которы е пос тупаю тнары нок. О б щ ес твенны е деб аты в Западной Е вропе привели к неприя тию продукции б иотехнологии, но ч то характерно, не вс ей , а именно агроб иотехнологии – генетич ес ки модиф ицированны х с /х рас тений , пищ и и кормов. П ромы ш ленная б иотехнология и ф армакологич ес кое направление ос талис ь как б ы “невидимы ми”для ш ироких мас с . Г лавны м аргументом, ис польз ованны м об щ ес твенны ми организ ация ми “Г ринпис ”, “Д руз ья з емли” и т.д. я вля лас ь “увереннос ть”в прогнозируемом неб лагоприя тном воз дей -

66

с твии Г М Р на окружаю щ ую среду. В рез ультате нач иная с октя б ря 1998 г. ф актич ески б ы л введен мораторий на ш ирокомас ш таб ное вы ращ ивание и раз мещ ение на ры нке тех Г М О , которы е не б ы ли ещ е з арегис трированы . Д о этого уже б ы ли раз реш ены 18 Г М Р, вклю ч ая мас лич ны й рапс , кукуруз у, цикорий , гвоз дику и таб ак. Д ис кус с ия об опас ности Г М Р, проводимая в Е вропей с ком С ою з е (Е С ) отодвинулаЕ С намного лет наз ад по сравнению с о с транами – лидерами б иотехнологии, к которы м относ я тся С Ш А, Аргентина, К анадаи др. С итуация ос тавалас ь б ез из менений до конца2002 г. и ее экономич еские пос ледствия для Е С уже с каз алис ь. Е С с тановитс я менее конкурентнос пособ ны м в новом с екторе мирового с ельс кого хоз я й ства – агроб иотехнологии, ф армацевтич еской промы ш леннос ти; упущ ена вы года в улуч ш ении э кологии; предприниматели терпя т уб ы тки; отс утствие вложений в новую об лас ть ведети к потере науч ны х кадров. В 2002 г. с итуация нач ала меня тьс я : Е вропей с кая К омис с ия прис тупила к разраб отке новой стратегич ес кой линии: “Н ауки о жиз ни и б иотехнология – С тратегия для Е вропы ”, ав ноя б ре 2002 г. парламент Е С проголос овал з а поддержку ис с ледований в сф ере б иотехнологии и регулирования Г М О ; новая директивасоз далаю ридич ес кую ос нову для вы пускаГ М О в окружаю щ ую среду и нары нок. О днако негативное отнош ение Е вропы оказ ало з аметное влия ние на поз ицию об щ ес твеннос ти других стран – Рос с ии, например. О б ес покоеннос ть об щ ес твенности рас тет, невз ирая на инф ормацию уч ены х о проведенной науч ной оценке, показ ы ваю щ ей дос товерно минимальны й рис к Г М Р для окружаю щ ей с реды , на подтвержденную вс ес торонними проверками б ез опас ность пищ и из генетич ес ки модиф ицированны х ис точ ников. С оз дание Г М Р – вы с око технологич ны й процес с , ос нованны й на ф ундаментальны х науч ны х з нания х, треб ую щ их вы соко квалиф ицированны х кадров и мощ ной с овременной инс трументальной б аз ы . Т ранс генное рас тение соз даетс я в науч ны х лаб оратория х, проходитс тадию ис пы таний в теплицах и в полевы х ус ловия х, з атем гос ударс твенное сортоис пы тание, регис трацию и, наконец, вы ходит нары нок: для вы ращ ивания в окружаю щ ей с реде; употреб ления в пищ у непос редственно или в перераб отанном виде; в кач ес тве кормов для животны х, или как ис точ ник лекарств – “с ъ едоб ны х”вакцин. С 1975 г. одновременно с б урны м развитием генной инженерии раз виваетс я новое направление, с вя з анное с живы ми из мененны ми организ мами – б иоб ез опас нос ть. С овмес тны ми многолетними ус илия ми международны х организ аций (Ю Н Е П ), э кс пертов из раз ны х с тран, в т.ч . Рос с ии, б ы ли разраб отаны б аз овы е поня тия , основны е положения и методич ес кие указ ания по оценке б иоб ез опас нос ти Г М Р. В т ечен и е20 л ет , п р ош едш и х с м ом ен т а вы хода ГМ Р н а р ы н ок, н ебы ло вы явл ен о н и одн ого до ст овер н о го от р и ц ат ел ь н ого воздейст ви я и х н а окр уж аю щ ую ср едуи здор овь ечеловека и ж и вот н ы х н и в хо деи сп ы т ан и й, н и п р и ком м ер ческом и сп ол ь зован и и .

67

7.2. Г осударст венное регули ровани е безоп асност и генно-и нж енерной деят ельност и в Росси и В о вс ех гос ударствах с развитой генно-инженерной дея тельнос тью в науке и произ водс тве в настоя щ ее время приня ты з аконы и другие гос ударственны е акты , соз даю щ ие нормативно-правовую б аз у для генноинженерны х ис с ледований . Как ж еобесп ечи вает ся би обезоп асн о ст ь в Р осси и ? Н ач алом вклю ч ения Рос с ии в мировую с ис тему б иоб ез опас нос ти с ч итаю т ратиф икацию с траной “К онвенции о б иораз нооб раз ии”в 1995 г. С э того момента нач алос ь ф ормирование национальной с истемы б иоб ез опас нос ти (Н С Б) как ч ас ти с истемы национальной б ез опас нос ти с траны , при э том уч иты вались международны е рекомендации. О тправная точ кас оз дания дей с твую щ ей в нас тоя щ ий моментН С Б – вс тупление в с илу Ф едерального з аконаРФ “О гос ударс твенном регулировании в об ласти генно-инженерной дея тельнос ти”(1996г.). Законом ус тановлены ч еты ре уровня рис ка воз можного потенциального вредного воз дей с твия генно-инженерной дея тельнос ти наз доровье ч еловека, в соответс твии с которы ми ус танавливаю тс я треб ования по с трогому с об лю дению ус ловий при их ос ущ ествлении. В с е раб оты генно-инженерного плана подраз деля ю тс я на два типа – ведущ иес я в “з акры ты х”или “откры ты х”с ис темах. Раб оты в “з акры ты х”с ис темах подраз деля ю тс я нач еты ре категории: I. Раб ота не представля ет опас ности з доровью ч еловека. М еры б езопас нос ти с равнимы с теми, которы е ус тановлены при раб оте с непатогенны ми микроорганиз мами. II. Раб отапредс тавля ет нез нач ительную опас нос ть з доровью ч еловека. М еры б езопас нос ти сравнимы с теми, которы е ус тановлены при раб оте с микроорганиз мами, потенциально патогенны ми лиш ь при определенны х об с тоя тельс твах. III. Раб ота представля ет умеренны й рис к з доровью ч еловека. М еры б ез опас ности с равнимы с теми, которы е ус тановлены при раб оте с микроорганиз мами, потенциально с пособ ны ми к передач е инф екционны х з аб олеваний . IV. Раб отапредс тавля етз нач ительную опас нос ть з доровью ч еловека. М еры б ез опас ности с равнимы с теми, которы е установлены при раб оте с патогенами, вы з ы ваю щ ими особ о опас ны е б олез ни. Г енно-инженерная дея тельнос ть в ус ловия х “откры ты х”с ис тем приравниваетс я к третьему и ч етвертому уровня м рис ка. Закон содержит треб ования к лицам, которы е ос ущ ес твля ю т генно-инженерную дея тельнос ть, главны ми из которы х я вля ю тс я об я з ательная проф ес с иональная подготовка и с остоя ние з доровья , с оответс твую щ ие треб ования правил б ез опас нос ти генно-инженерной дея тельности; налич ие с оответс твую щ их помещ ений , отвеч аю щ их тем же правилам; об я з ательное получ ение разреш ения (лиценз ий ) при раб отах, с оответствую щ их третьему и ч етвертому уровня м рис ка.

68

Н а гос ударственном уровне с ис тема б иоб ез опас нос ти должна раб отать непреры вно. В Рос с ии кажды й пос тупаю щ ий на продовольс твенны й ры нок Г М И проходитполную процедуру гос ударс твенной регис трации. Н а Ф едеральном уровне Н С Б об ес печ иваетс я с ледую щ им об разом: М инпромнауки Рос с ии нес ет ответс твеннос ть з а б иоб езопас нос ть Г М О , в т.ч . транс генны х рас тений ; М инз драв Рос с ии отвеч ает з а б езопас нос ть пищ евы х продуктов из Г М И ; М инс ельхоз Рос с ии – з а б ез опас нос ть кормов. Г лавная ф ункция э того уровня – приня тие реш ений о гос ударственной регис трации Г М О перед первы м вы пуском в Рос с ии в окружаю щ ую с реду, промы ш ленны м ис польз ованием или импортом. П олевы е ис пы тания транс генны х рас тений проводя тс я на с пециально об орудованны х, з арегис трированны х, с трого охраня емы х опы тны х уч ас тках (10 уч ас тков в раз ны х агроклиматич ес ких з онах Рос с ии). К аждое полевое ис пы тание Г М Р об я з ательно регис трируетс я в М В К Г И Д (межведомс твенной комис с ии по проб лемам генно-инженерной дея тельнос ти, в сос тав которой входит19 предс тавителей минис терств и ведомс тв, вклю ч енны х в круг проб лем генной инженерии), раз раб аты ваетс я индивидуальная программа ис пы таний Г М Р на б иоб ез опас нос ть, в ходе ис пы таний проводитс я инс пекция . Т акой поря док гарантирует з ащ иту от нес анкционированного рас прос транения Г М Р в окружаю щ ей с реде и получ ение необ ходимы х науч ны х данны х о б иоб ез опас ности Г М Р в полевы х ус ловия х. П олевы е ис пы тания в Рос с ии нач алис ь в 1994 г. В 2002 г. б ы ло ис пы тано вс его 28 Г М Р, из них 23 раз раб отки отеч ественны х б иотехнологов: транс генны е я б лони, груш и, с адовая з емля ника, картоф ель, мас лич ны й рапс . С вой с тва у рос с ий с ких Г М Р раз нооб раз ны – от ус той ч ивого к колорадскому жуку картоф еля до с адовой з емля ники с генами с уперс ладкого б елкатауматина. В Рос с ии главны м направлением трансф ормации я вля етс я ус той ч ивос ть к вредителя м и б олез ня м – с 2001 г. проходитполевы е ис пы тания на б иоб ез опас нос ть транс генны й картоф ель на ос нове рос с ий с кого с орта Л уговской , ус той ч ивы й к колорадс кому жуку (раз раб отка Центра “Биоинженерия ”РАН ). О ценку рисков Г М Р проводитс оз данны й в 2001 г. Э кс пертны й с овет М инпромнауки Рос с ии по вопрос ам б иоб езопас нос ти, а б ез опас нос ти кормов, получ енны х из Г М О , нач иная с 2002 г. – Э кс пертны й с овет М инс ельхоз аРос с ии. Рос с ий с кая с ис темаоценки б ез опас нос ти Г М И для пищ и отлич ается отприня той в С Ш А и К анаде: оцениваетс я не только сос тавное соответствие Г М И традиционному продукту, но также проводитс я медикоб иологич ес кая оценка, а также оценка технологич еских параметров пищ и. Т .е. применя етс я такой же подход, как при проверке новой пищ и в рационе питания . С 1999 г. М инз драв Рос с ии з арегис трировал Г М с ою , картоф ель, кукуруз у, с ахарную свеклу как ис точ ники для ис пользования в пищ евой

69

промы ш леннос ти и реализ ации нас елению продуктов, получ енны х на их ос нове. С 2002 г. в Рос с ии введена об я з ательная маркировка пищ евой продукции, ес ли она с одержит б олее 5% компонентов, получ енны х из Г М И . Т аким об раз ом, достигаетс я важней ш ий для потреб ителя момент– инф ормирование, а с ледовательно, и право вы б ора. Д ля маркировки продуктов питания , с одержащ их генетич ески модиф ицированную Д Н К (Г М Д Н К = рекД Н К ), раз раб отаны надежны е, инф ормативны е и ч увствительны е методы , ос нованны е на полимераз ной цепной реакции (П ЦР). С помощ ью П ЦР-анализ а можно проводить как кач ес твенны й , так и колич ес твенны й анализ Г М Д Н К в продуктах питания . В то же время , маркировка – э то только инф ормация о продукте, онане играетникакой роли с точ ки з рения б ез опас ности пищ и из Г М И для ч еловека. Безопас нос ть об ес печ иваетс я компетентной проверкой . Д ля б ольш ей ос ведомленности нас еления в э той об лас ти в Рос с ии вы пус каетс я И нф ормационны й дай джес т “Г енно - инженерны е технологии” , в 2001 г. нач атвы пус к И нф ормационного б ю ллетеня М В К Г И Д , в декаб ре 2001 г. для откры того дос тупав глоб альной с ети Internet откры т инф ормационны й Web-с ай тМ К В К Г И Д (http://www.iacgea.ru). C момента первого создания и ис польз ования Г М Р рас тений прош ло поч ти 20 лет. Ч то же из менилос ь з аэ ти годы ? М ировое науч ное сооб щ ество, инвес торы и потреб ители приш ли к з аклю ч ению , ч то именно достижения молекуля рной б иологии и генной инженерии, б иоинф орматики и б иотехнологии б удутопределя ть об раз жиз ни ч еловеч ес твав 21-ом столетии. О С Н О В Н АЯ Л И Т Е РАТ У РА 1. Г еном, клонирование, происхождение ч еловека/ Л .И . Короч кин [и др.]. – Ф ря з ино : В ек2. – 2004. – 224с. 2. Г лик Б. М олекуля рная б иотехнология : П ринципы и применение. / Б. Г лик, Д ж. П астернак. - М . : М ир, 2002.- 589с . 3. Ж имулев И .Ф . О б щ ая и молекуля рная генетика / И .Ф . Ж имулев. - Н овос иб ирс к: И з д-во Н овос иб . ун-та, 2002. - 458 с. 4. Л утова Л .А. Биотехнология вы с ш их рас тений / Л .А. Л утова. - С П б : И з д-во С П б . ун-та, 2003. - 228с . 5. Ры б ч ин В .Н . О с новы генетич ес кой инженерии / В .Н . Ры б ч ин. – С П б . : И з д-во С П б Г Т У , 1999. - 521с . 6. С ельс кохоз я й с твенная б иотехнология / В .С . Ш евелуха [и др.]. - М . : В ы с ш . ш к., 2003. - 469 с. 7. Щ елкунов С .Н . Г енетич ес кая инженерия / С .Н . Щ елкунов. – Н овос иб ирск : С иб . унив. из д-во, 2004. – 496с . Д О П О Л Н И Т Е Л Ь Н АЯ Л И Т Е РАТ У РА 1. Аб елев Г .И . М оноклональны е антитела / Г .И . Аб елев // С орос овс кий об раз овательны й журнал. - 1998. - № 1. - С .16-20.

70

2. Ай ала Ф . С овременная генетика / Ф . Ай ала, Д ж. К ай гер. - М . : М ир, 1987, том 1. - 295с .; М . : М ир, 1988, тома2 и 3. 3. Алиханя н С .И . О б щ ая генетика / С .И . Алиханя н, А.П . Акиф ьев, Л .С . Ч ернин. - М . : В ы с ш ая ш кола, 1985. - 446с . 4. Баранов В .С . Г енная терапия – медицинаXXI века/ В .С . Баранов // С оросовский об раз овательны й журнал. - 1999. - № 3. - С . 63-68. 5. Баранов В .С . С овременное сос тоя ние и перс пективы генной терапии миодис троф ии Д ю ш енна в мире и Рос с ии / В .С . Баранов, А.Н . Баранов, А.В . Зеленин // Г енетика. - 2001. - Т .37, № 8. - С . 1046-1054. 6. Бурья нов Я .И . У с пехи и перс пективы генно-инженерной б иотехнологии растений / Я .И . Бурья нов // Ф из иология растений , 1999. - Т .46, № 6. - С . 930-944. 7. БуторинаА.К . Л екции по генетике ч еловека. У ч еб ное пос об ие по курс у “Ч еловек”/ А.К . Буторина, В .Н . К алаев. - В оронеж: В Г У , 2003. - 79с . 8. Г енетикараз вития рас тений / Л .А. Л утова[и др.]. – С П б : Н аука, 2000. 539с . 9. Г инцб ург А.Л . Г енодиагнос тика инф екционны х з аб олеваний / А.Л . Г инцб ург // М икроб иология , э пидемиология и иммуноб иология . - 1998. -№ 3. - С . 86-94. 10.Г леб а Ю .Ю . Биотехнология рас тений / Ю .Ю . Г леб а // С орос овс кий об раз овательны й журнал.- 1998. - № 6. - С . 3-8. 11.Г ольдман И .Л . Т ранс генны е коз ы в мировой ф арминдустрии XXI века/ И .Л . Г ольдман, С .Г . К адулин, С .В . Раз ин // Г енетика. - 2002. - Т .38, № 1. - С . 5-21. 12.Е рмиш ин А.П . Г енетич ески модиф ицированны е организ мы . М иф ы и реальнос ть / А.П . Е рмиш ин. – М инс к : Т ехнология , 2004. – 118с. 13.Захаров И .А. Цитодукция у ч еловека: первы е генетич ески модиф ицированны е дети / И .А. Захаров // В ес тник В О Г иС . - 2001. - № 17. http://www.bionet.nsc.ru/vogis 14.Зеленин А.В . Г еном рас тений / А.В . Зеленин // В ес тник РАН . – 2003. – т.73, № 9. – С . 797-806. 15.Зеленин А.В . В ведение в геномику рас тений / А.В . Зеленин, Е .Д . Бадаева, О .В . М уравенко // М олекуля рная б иология . – 2001.- Т .35, № 3.С .339-348. 16.И нге-В еч томов С .Г . Г енетика с ос новами с елекции / С .Г . И нгеВ еч томов. - М .: В ы с ш ая ш кола, 1989. - 592с . 17.К оню хов Б.В . К лонирование поз воноч ны х: ус пехи и проб лемы / Б.В . К оню хов // Г енетика.- 1997. - Т.33. - С . 1605-1620. 18.К ороч кин Л .И . К лонирование животны х / Л .И . К ороч кин // С оросовский об раз овательны й журнал. - 1999. - № 4. - С . 10-16. 19.К уч ук Н .В . Г енетич ес кая инженерия вы с ш их рас тений / Н .В . К уч ук. – К иев : Н ауковаД умка, 1997. - 152с . 20.К уликов А.М . Г енетич ески-модиф ицированны е организ мы и рис ки их ис польз ования / А.М . К уликов // Ф из иология рас тений . – 2005. – Т .52, № 1. – С . 115-128.

71

21.Л ещ инс кая И .Б. Г енетич еская инженерия / И .Б. Л ещ инс кая // С оросовский об раз овательны й журнал. - 1996. - № 1. - С . 32-39. 22.Л утова Л .А. Г енетич ес кая инженерия рас тений : с верш ения и надежды / Л .А. Л утова// С оросовс кий об раз овательны й журнал. - 2000. - Т .6, № 10. - С . 10-17. 23.М аш кина О .С . Г енетич еская инженерия лес ны х древес ны х растения / О .С . М аш кина, А.К . Буторина // Г енетика. - 2003. - Т .39, № 3. - С . 309317. 24.М олекуля рная б иология клетки / Б. Алб ертс [и др.]. - М . : М ир, 1994. Т .1, с тр. 253-348, 485-502; т.2, с тр. 93-253. 25.М утовин Г .Р. О с новы клинич ес кой генетики / Г .Р. М утовин. - М . : В ы с ш . ш к., 2001. - 234 с. 26.П ируз я н Э .С . О с новы генетич ес кой инженерии рас тений / Э .С . П ируз я н. - М . : Н аука, 1988. - 304с . 27.Романов Г .А. Г енетич ес кая инженерия растений и пути реш ения проб лемы б иоб ез опас нос ти / Г .А. Романов // Ф из иология рас тений . - 2000, Т .47, № 3. - С . 343-353. 28.С еменова М .Л . Зач ем нужны транс генны е животны е / М .Л . С еменова// С оросовский об раз овательны й журнал. - 2001. - Т .7, № 4. - С . 13-20. 29.С ингер М . Г ены и геномы / М . С ингер, П . Берг. - М . : М ир, 1998. Т .1.373 с .; т.2 – 391 с . 30.Ф аворова О .О . Л еч ение генами – ф антас тика или реальность? / О .О . Ф аворова// С орос овс кий об разовательны й журнал. - 1997. - № 2. - С . 2127. 31.Ф едеральны й з акон “О гос ударственном регулировании в об лас ти генно-инженерной дея тельнос ти”/ Росс ий с кая газ ета.- И ю ль, 1996. № 86-Ф З. 32.Ш умны й В .К . Г енная и хромос омная инженерия для рас тений / В .К . Ш умны й // В ес тник РАН . - 2001. - Т .71, № 8. - С . 725-732. 33.Ш умны й В .К . П роб лемы генетики рас тений / В .К . Ш умны й // В ес тник В О Г иС . - 2004. - Т.8. - № 2. - С . 32-39. 34.Щ ипков В .П . О б щ ая и медицинс кая генетика / В .П . Щ ипков, Г .Н . Кривош еина. – М . : Академия , 2003. – 253с . 35.Molecular biology of the cell / B. Alberts [et. al.] – New York – London : Garland Publishing Inc., 1994. – 1294 p. 36.Jaenisch R., Don’t clone humans! / R. Jaenisch, I.Wilmut // Science. - 2001. V.291. - P. 2552. Авторы : О льгаС ергеевнаМ аш кина, Анас тас ия К онс тантиновнаБуторина Редактор О .А. Т ихомирова